ES2964573T3 - FRET exacta en bloque - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para obtener información cuantitativa sobre cambios promedio en la distancia donante-aceptor dentro de una molécula o entre moléculas usando transferencia de energía por resonancia de Forster en conjunto (eFRET), y a un sistema de medición que comprende un controlador adaptado para realizar el mismo, en el que la El método comprende los pasos de realizar una medición de eFRET para al menos una muestra marcada con donante, aceptor y al menos donante-aceptor, en donde cada muestra comprende copias de moléculas marcadas respectivas y en donde cada medición de eFRET se realiza usando múltiples etiquetas marcadas respectivas. copias de moléculas, bajo una primera y una segunda condición, corrigiendo los resultados obtenidos para efectos específicos del fluoróforo, específicos de la condición y entre condiciones, determinando eficiencias de eFRET específicas de la condición basándose en los resultados corregidos y determinando información cuantitativa sobre la distancia donante-aceptor. cambios dentro de la molécula entre la primera y la segunda condición en función de la eficiencia eFRET específica de la condición respectiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

FRET exacta en bloque

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para obtener información cuantitativa de los cambios promedio en la distancia donante-aceptor dentro de una molécula, entre moléculas o dentro/entre complejos de moléculas utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET, del inglésensemble Forster Resonance Energy Transfer,en lo sucesivo también llamada quantumFRET), y un sistema de medición que comprende un controlador adaptado para realizar el mismo. El método comprende las etapas de realizar una medición de la eFRET para al menos una primera muestra con un primer colorante fluorescente, preferentemente una muestra marcada con donante, una segunda muestra con un segundo colorante fluorescente, preferentemente una muestra marcada con aceptor, y una tercera muestra que comprende ambos colorantes, una muestra marcada con donante y con aceptor. Preferentemente, cada muestra comprende copias de la molécula marcadas respectivas y en donde cada medición de la eFRET se realiza preferentemente utilizando múltiples copias de la molécula marcadas respectivas en una primera y una segunda condición. En caso de que cada muestra comprenda copias de la molécula marcadas, se prefiere corregir los resultados obtenidos para los efectos específicos de cada condición y/o entre condiciones, y determinar las eficacias de la eFRET específicas de cada condición en función de los resultados corregidos. A continuación, se determina la información cuantitativa de los cambios en la distancia donante-aceptor dentro de la molécula o entre moléculas entre la primera y la segunda condición en función de las respectivas eficacias de la eFRET.

En particular, el método y el sistema de la presente invención proporcionan una medición cuantitativa de alto rendimiento de la distancia o del cambio de distancia dentro o entre biomoléculas, especialmente durante los cambios en el entorno que incluyen, pero sin limitación, cambios en el pH, fuerza iónica, temperatura, adición de caótropos, composición del tampón, adición de ligandos, adición de compañeros de unión, adición de detergentes o combinaciones de los mismos.

Antecedentes

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o de Forster (FRET, del inglésForster or fluorescence resonance energy transfer),descrita por primera vez por Theodor Forster en 1946, es un fenómeno físico en el que un fluoróforo donante en su estado excitado transfiere su energía de excitación de forma no radiactiva a un fluoróforo aceptor que se encuentra muy cerca del donante, provocando así que el aceptor emita su fluorescencia. Dado que la FREt es muy sensible a la distancia entre el donante y el aceptor, los pares de aceptor y donante basados en la FRET se pueden utilizar como biosensores y, en especial, como reglas espectroscópicas para controlar diversas actividades bioquímicas que producen cambios en las distancias moleculares, tal como interacciones proteína-proteína, cambios conformacionales, concentraciones de iones intracelulares y actividades enzimáticas.

La FRET puede ocurrir entre dos fluoróforos que están muy cerca uno del otro y que tienen una superposición sustancial, por ejemplo, de al menos un 30 %, entre los espectros de emisión del donante y de absorción del aceptor. La FRET se caracteriza por la eficacia de la FRET (E, en este último también indicado como eficacia de la FRET exacta,Ereai),que se refiere al porcentaje de transferencia de energía del donante al aceptor en un estado dado y puede describirse cuantitativamente de la siguiente manera:

en donderindica la distancia entre los dipolos donante y aceptor, yRola distancia a la que laEde la FRET es del 50 %. Dado que la eficacia de la FRET disminuye a la sexta potencia a medida que aumenta la distancia entre el donante y el aceptor, la FRET es extremadamente sensible a pequeños cambios en la distancia, por ejemplo, con un intervalo de distancia de 1 a 10 nm y una resolución espacial en el intervalo de unos pocos Ángstrom que incluso se puede observar en tiempo real. Esto ha hecho que la FRET sea interesante para diferentes áreas de investigación, incluida la química, bioquímica, biología molecular y biología celular, y permite incluso la investigación de moléculas diana en células vivas, es decir, en su contexto fisiológico.

Los biosensores basados en la FRET se pueden clasificar en biosensores intermoleculares, en los que el donante y el aceptor se fusionan con diferentes moléculas, y se producen cambios de la FRET cuando las moléculas independientes se acercan mucho y se convierten en biosensores intramoleculares, en los que el donante y el aceptor se unen a la misma molécula y en los que los cambios conformacionales en la molécula inducen cambios en la FRET.

Mediante la unión, por ejemplo, de un aceptor a una primera molécula y un donante a una segunda molécula, la FRET se puede utilizar para detectar la localización conjunta y/o interacciones entre dichas moléculas y, de manera ideal, incluso para estimar la distancia entre ellas. Otros ejemplos de aplicaciones de la FRET incluyen la detección de interacción, homodimerización, heterodimerización y/u oligomerización de proteínas, y la dilucidación de vías de transducción de señales. La FRET se puede utilizar incluso para investigar interacciones proteína-proteína, proteínaácido nucleico y ácido nucleico-ácido nucleico, por ejemplo, y también se puede combinar con otras técnicas, tales como la microscopía de fluorescencia o confocal.

De manera alternativa, el donante y el aceptor se pueden localizar en la misma molécula, por ejemplo, mediante hibridación o unión. Por lo tanto, la FRET se puede utilizar, por ejemplo, para cuantificar ácidos nucleicos mediante PCR cuantitativa en tiempo real mediante la adición de moléculas marcadas con donante y aceptor que se unen de manera específica al mismo ADN diana durante un ciclo de PCR, en donde la unión de dichas moléculas marcadas al ADN en estrecha proximidad entre sí permite la FRET, aumentando la señal de la FRET en función de la concentración de ADN diana. De manera adicional, la información sobre los cambios conformacionales se puede obtener utilizando biosensores intramoleculares basados en FRET. Dado que un cambio en la configuración de una molécula, tal como una proteína, por ejemplo, a través de la asociación con otras proteínas, la unión de un ligando y/o la actividad catalítica, se asocia con un cambio en determinadas distancias interatómicas dentro de dicha proteína, dichos cambios se pueden rastrear mediante el marcaje de las unidades estructurales implicadas con uno o más pares de donanteaceptor. Con el nuevo método y sistema de la presente invención, se pueden investigar los dominios de unión y se pueden evaluar los efectos de los (nuevos) sustratos para diferentes enzimas o posibles agonistas de receptores de manera cuantitativa y con un alto rendimiento, por ejemplo, en el contexto del descubrimiento de fármacos.

Como las actividades bioquímicas que producen cambios en las distancias moleculares están directamente correlacionadas con la eficacia de la FRET, se han desarrollado métodos para medir el cambio de eficacia de la FRET de varias maneras, incluidos los cambios en la intensidad de la fluorescencia de los fluoróforos donantes, el cambio de intensidad de fluorescencia de los fluoróforos aceptores, la vida útil de la fluorescencia del donante o una combinación de los mismos. Sin embargo, los resultados de las mediciones de la FRET pueden variar sustancialmente. Las razones incluyen, por ejemplo, la presencia de señales de intensidad falsas positivas relativamente elevada debido a la superposición necesaria del espectro de emisión y excitación del donante y el aceptor. Como la fluorescencia emitida después de la transferencia de energía suele ser comparativamente débil, una relación señal/ruido desfavorable puede impedir los análisis. De manera adicional, el grado de marcaje puede variar sustancialmente entre experimentos y, en consecuencia, también la relación de falsos positivos a la señal deseada experimentalmente.

En la técnica anterior, la FRET se utiliza principalmente en un contexto de una sola molécula para la cuantificación precisa de la distancia, generalmente en el mundo académico, y en mediciones de conjuntos solo para resultados cualitativos, tanto en la industria como en el mundo académico. En los ensayos de conjuntos basados en FRET de la técnica anterior que se utilizan para controlar las interacciones, tanto el ligando como el compañero de unión están marcados, y la unión generalmente se evalúa solo cualitativamente.

En experimentos de FRET con una sola molécula (smFRET, del ingléssingle molecule FRET),se aplican varias correcciones a los datos brutos para obtener información exacta de la distancia, pero las mediciones necesitan inmovilización superficial o mediciones de larga duración. Los experimentos de FRET con una sola molécula también necesitan configuraciones muy costosas, en un laboratorio especial de LASER y solo pueden utilizarlo expertos muy especializados. Por lo tanto, este tipo de experimentos generalmente solo se pueden utilizar en laboratorios especiales en universidades y no son atractivos ni útiles para la industria.

Por ejemplo, la FRET con una sola molécula (smFRET) generalmente se basa en el análisis de una biomolécula a la vez utilizando una solución líquida altamente diluida que comprende la molécula en estudio, por ejemplo, estando la concentración de dicha molécula en un intervalo picomolar. Debido a la baja concentración de la molécula, se puede garantizar que una molécula pasa por el foco de un láser de un microscopio confocal modificado. Por ejemplo, el microscopio confocal modificado puede comprender un láser, cuya luz se enfoca con una lente objetivo y una apertura numérica alta para generar un punto de excitación limitado por difracción en un volumen de muestra muy pequeño que comprende la molécula en estudio, tal como un volumen de muestra pequeño en el intervalo de un femtolitro. La señal emitida por la molécula en estudio que se difunde a través del foco láser una a una debido a la difusión se puede entones recoger por la lente objetivo, filtrar para detectar la señal de fondo usando un agujero estenopeico, por ejemplo, y dividir en los respectivos canales detectores de luz donante y aceptora utilizando, por ejemplo, un espejo dicromático. Sin embargo, como la smFRET se basa en mediciones basadas en difusión, los análisis de la smFRET pueden llevar mucho tiempo con un solo experimento para una molécula en estudio en una configuración que necesita, por ejemplo, hasta 30 minutos. Como los enfoques de la smFRET consumen bastante tiempo, el uso de la smFRET se ha limitado a aplicaciones de alto rendimiento en la industria, por ejemplo. El método TIRF-FRET alternativo, que también puede utilizarse con una sola molécula, tiene limitaciones con respecto a la inmovilización superficial de moléculas.

Además, otros métodos para la detección de cambios conformacionales, por ejemplo, rayos X y Cryo-EM (microscopía electrónica criogénica), que tienen un bajo rendimiento, son caros y necesitan una preparación de las muestras muy compleja y larga.

Por tanto, todavía existe una necesidad de tener a mano soluciones alternativas para la medición de la distancia o el cambio de distancia a nivel molecular con un alto rendimiento basado en mediciones de distancia intramoleculares y/o intermoleculares cuantitativas exactas mediante FRET.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En general, de acuerdo con la presente invención, la distancia o el cambio de distancia se puede determinar a través de la transferencia de energía entre dos colorantes fluorescentes (fluoróforos), proteínas, en general sustancias que emiten luz fluorescente cuando se excitan fluorescentemente, que están unidas a la(s) molécula(s) de interés, mediante el uso de la transferencia de energía entre dos o más fluoróforos, transferencia de energía por resonancia de Forster ("FRET"). La eficacia de la transferencia de energía contiene información de la distancia de al menos un par de fluoróforos. La eficacia de la transferencia de energía de la presente invención se basa preferentemente en una entidad marcada con fluorescencia, que puede ser una proteína, ADN o cualquier otra (bio)molécula o complejo supramolecular. Por razones de claridad, simplemente se llama molécula o biomolécula. El resultado cuantitativo es la eficacia de la transferencia de energía de una biomolécula o la relación de dos eficacias de la transferencia de energía de la misma biomolécula en dos estados conformacionales potencialmente diferentes, por ejemplo, con y sin compañero de unión o con dos compañeros de unión diferentes. Para el segundo caso, dada una muestra con una eficacia de transferencia de energía conocida, utilizando la relación de la eficacia de la transferencia de energía, se puede calcular la eficacia de la transferencia de energía desconocida.

Teniendo el conocimiento adicional del radio de Forster de un par de fluoróforos, se puede calcular las distancias entre fluoróforos mediante la medición de la eficacia de la transferencia de energía. En el caso de la medición de la relación de la eficacia de la transferencia de energía, la información adicional de la eficacia de la transferencia de energía o de la distancia de uno de los estados conformacionales se puede utilizar de manera que se puedan calcular las distancias cuantitativas entre el par de fluoróforos en las diferentes configuraciones.

Además, teniendo el conocimiento del radio de Forster de un par de fluoróforos, teniendo conocimiento de la estructura 3D de la biomolécula marcada con el par de fluoróforos y teniendo conocimiento de las posiciones de marcaje de los fluoróforos en la estructura 3D de la biomolécula, el ligando indujo el cambio de distancia entre los fluoróforos y, por lo tanto, se puede cuantificar el cambio en la estructura 3D de la biomolécula marcada, preferentemente con resolución nanométrica, más preferentemente con resolución Ángstrom.

Mediante la utilización del método de la presente invención, se puede acelerar significativamente la selección de ligandos para compañeros de unión que conducen o no a un cambio en la configuración. En especial porque la naturaleza cuantitativa del resultado permite la clasificación de la distancia/cambio de distancia inducidos por ligando en las selecciones.

En otras palabras, la presente invención se basa en particular en el descubrimiento de que se puede obtener una medición cuantitativa de conjunto de las eficacias de la FRET para una molécula marcada, por ejemplo, una proteína, en dos condiciones, por ejemplo, con y sin compañero de unión o con dos compañeros de unión diferentes. Esto tiene la ventaja de que, dada una molécula con una eficacia de la FRET conocida en una de las dos condiciones, la eficacia de la segunda FRET desconocida en la otra condición se puede calcular en función de la relación de la eficacia de la FRET obtenida mediante la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET). Además, si se conocen la distancia del par donante-aceptor en una configuración y el radio de Forster de dicho par, las distancias entre dicho donante y aceptor se pueden calcular en otras condiciones y, por lo tanto, para otras configuraciones mediante la relación de eficacia de la eFRET de la presente invención.

Otro enfoque es agrupar diferentes compañeros de unión mediante el cambio conformacional que evocan. Para este enfoque, no es necesario tener ningún conocimiento previo de la estructura de la proteína o de la distancia exacta entre los sitios de marcaje en una determinada condición y todavía se puede juzgar si un ligando se une mediante el mismo mecanismo que otro ligando. Este es, por ejemplo, una pregunta importante en la búsqueda de aglutinantes alostéricos, que son difíciles de detectar.

La presente invención proporciona una pluralidad de ventajas sobre la técnica anterior. Por ejemplo, con métodos y sistemas de la presente invención, es posible medir cambios conformacionales de biomoléculas con resolución ángstrom en solución libre de una manera fácil de utilizar y económica. Por ejemplo, las mediciones de la FRET de conjunto conocidas de la técnica anterior solo producen datos cuantitativos después de utilizar varios métodos de corrección. Hasta ahora, las mediciones de la FRET de conjunto se han corregido para tener en cuenta el fondo y los artefactos de medición del llamado "filtrado" de la luz de excitación y emisión. Otra corrección vital, la corrección gamma, que corrige el diferente brillo observado del fluoróforo donante y aceptor se ha abordado con diferentes enfoques, entre ellos utilizando (1) un compuesto de referencia con una eficacia de la FRET predefinida, (2) fotoblanqueo del aceptor y (3) el uso de compuestos de referencia con diferentes, pero no necesariamente conocidas, eficacias de la FRET.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere utilizar el (2) fotoblanqueo del aceptor y/o un nuevo enfoque, por ejemplo, (4) cambio de la eficacia de la transferencia de energía inducido por ligando, en el que la biomolécula se puede utilizar como su propio compuesto de referencia.

Además, los inventores de la presente invención también señalaron que existe un problema pendiente en las mediciones de la FRET de conjunto que está relacionado con la presencia de biomoléculas marcadas de forma incompleta, especialmente las marcadas solo con donante. Estas moléculas pueden sesgar la eficacia de la FRET medida con un factor que depende de la relación de marcaje. Alternativamente a (a) la eliminación de moléculas marcadas solo con donante y (b) la corrección de la eficacia de la FRET utilizando concentraciones medidas, la presente invención propone preferentemente otro nuevo enfoque, por ejemplo, (c) tomar la relación de eficacias FRET sesgadas, que es idéntica a la relación de la eficacia de la FRET no sesgada y mucho menos propensa a las imprecisiones de medición.

Además, ya que tanto la sección transversal de absorbancia como el rendimiento cuántico son normalmente sensibles al ambiente y a la temperatura, las mediciones de acuerdo con la presente invención se realizan preferentemente a (al menos) una temperatura predeterminada y preferentemente con control ambiental.

Las ideas básicas de la presente invención pueden resumirse como sigue. La presente invención comprende preferentemente una rutina simple de marcaje y medición que abarca preferentemente al menos uno de: (1) corrección de fondo, (2) corrección de fugas para la emisión del donante erróneamente cuantificada como emisión del aceptor (véase, por ejemplo,cf),(3) corrección de la excitación directa para moléculas aceptoras que se excitan directamente por la luz de excitación del donante (véase, por ejemplo,CEdir),(4) corrección gamma (<y>) que corrige las diferencias en el brillo observado del donante y el aceptor que proceden de las diferencias en el rendimiento cuántico y las eficacias de detección, (5) una forma de mitigar los efectos del marcaje incompleto en la eficacia de la FRET medida, así como (6) control de la temperatura. Estas correcciones permiten mediciones cuantitativas de la eficacia de la FRET en un conjunto de moléculas marcadas de forma incompleta.

De manera adicional, el método de la presente invención proporciona un conjunto claro de instrucciones para el marcaje y las mediciones, pero también un conjunto de atajos que pueden ser adecuados para determinados colorantes o combinaciones de colorantes.

Las ideas generales de la presente invención pueden resumirse como sigue:

Si no hay un par donante/aceptor de fluorescencia intrínseca adecuado en la biomolécula, entonces, la biomolécula se marca preferentemente con el llamado fluoróforo donante o con el llamado fluoróforo aceptor, o ambos, donde la distancia entre el llamado aceptor y el llamado donante debe estar en el intervalo para que se produzca la FRET. Preferentemente, se preparan entonces tres muestras fluorogénicas. La tercera es preferentemente la biomolécula marcada tanto con el denominado fluoróforo donante como con el denominado aceptor. Las primera y segunda muestras comprenden preferentemente un fluoróforo donante y un fluoróforo aceptor, respectivamente, que se miden como fluoróforos libres o se funcionalizan en una biomolécula, preferentemente la biomolécula en cuestión.

Después se miden las tres muestras fluorogénicas, preferentemente a una temperatura predeterminada. Preferentemente, también se puede medir a dos temperaturas diferentes y el cambio conformacional inducido por la unión se caracteriza en función de las mediciones a estas temperaturas diferentes.

Las dos temperaturas diferentes pueden estar al mismo tiempo pero en diferentes lugares, por ejemplo, en un gradiente de temperatura, y/o en diferentes momentos y diferentes lugares o en diferentes momentos en el mismo lugar/muestra.

La eficacia aparente de la FRET de la muestra doblemente marcada se puede calcular con factores de corrección obtenidos de la medición de las tres muestras fluorogénicas. La eficacia real y exacta de la FRET, Ereal, y la eficacia aparente, Eap, de la FRET después de las correcciones se relacionan de la siguiente manera:

C<da>y C<d>son las concentraciones de la biomolécula doblemente marcada y de la biomolécula marcada solo con donante, respectivamente. Es importante tener en cuenta que el marcaje generalmente no es completo, lo que significa que normalmente habrá biomoléculas marcadas solo con donante dentro de la muestra de biomoléculas doblemente marcadas.

Esto muestra, por ejemplo, que la eficacia aparente de la FRET depende del éxito del marcaje de la muestra doblemente marcada. Esta dependencia se puede eliminar mediante la cuantificación de las concentraciones o de la relación de las concentraciones de las biomoléculas correctamente marcadas con doble marcador y las biomoléculas marcadas erróneamente que solo llevan un fluoróforo donante o mediante una etapa de purificación adicional que elimina las biomoléculas marcadas erróneamente solo con el donante de la muestra con doble marcador o, preferentemente, mediante la cuantificación de la relación de las eficacias de la FRET de dos estados diferentes de biomoléculas, tal como con y sin un ligando unido.

La eficacia absoluta de la FRET puede ser tan precisa como la medición de la concentración o tan exacta como la purificación adicional. La relación de las eficacias de la FRET de una medición bruta o de conjunto puede ser tan precisa como las mediciones de una sola molécula.

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De acuerdo con una realización preferida, la presente invención se refiere a un método para obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de una molécula utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET), comprendiendo el método las etapas de: obtención de una muestra donante, comprendiendo dicha muestra donante al menos un donante y/o copias de dicha molécula marcadas con donante, una muestra aceptora, comprendiendo dicha muestra aceptora al menos un aceptor y/o copias de dicha molécula marcadas con aceptor, y una muestra marcada con aceptor-donante que comprende copias de dicha molécula marcadas con aceptor-donante. Las mediciones de la FRET de conjunto (eFRET) se realizan para la muestra marcada con donante-aceptor en una primera y una segunda condición para obtener para esta muestra un primer resultado de la eFRET en la primera condición y un segundo resultado de la eFRET en la segunda condición. Las mediciones de la FRET de conjunto también se realizan preferentemente para la muestra donante y la muestra aceptora en al menos una condición, preferentemente en al menos una de las condiciones primera y segunda, preferentemente en ambas condiciones primera y segunda. Por lo tanto, se realizan al menos cuatro mediciones, preferentemente, seis.

La medición de la eFRET de la muestra marcada con donante-aceptor se realiza con múltiples copias de la molécula respectivas. Los resultados obtenidos de la primera y segunda eFRET se corrigen preferentemente, por ejemplo, considerando los efectos de las fugas, los efectos de la excitación directa y/o las correcciones gamma. Normalmente estos efectos son específicos del fluoróforo. En caso de que la primera y la segunda muestra comprendan moléculas marcadas, las correcciones también pueden agruparse en efectos específicos de la condición y entre condiciones. En particular, los efectos de la eFRET específicos de la condición o del fluoróforo se determinan preferentemente en función de la muestra donante y la muestra aceptora, en donde los efectos entre condiciones se determinan preferentemente en función de la muestra donante-aceptor. La información cuantitativa se puede determinar en función de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de la molécula en la primera y la segunda condición utilizando las eficacias de la eFRET específicas de la condición. Se realizan etapas similares si se determina la información cuantitativa de los cambios de distancia promedio entre el donante y el receptor entre una primera y una segunda molécula.

Preferentemente, la etapa de obtener al menos la muestra marcada donante-aceptor, y opcionalmente la muestra aceptora con copias de dicha molécula marcadas con aceptor y la muestra donante con copias de dicha molécula marcadas con donante, comprende las etapas de: obtención de al menos una primera, una segunda y una tercera muestra que comprenden múltiples copias de la molécula cada una; marcaje de las copias de la molécula comprendidas en la primera muestra con el donante; marcaje de las copias de la molécula comprendidas en la segunda muestra con el aceptor; y marcaje de las copias de la molécula comprendidas en la tercera muestra con el donante y el aceptor.

Preferentemente, el donante es un fluoróforo y en donde el aceptor es preferentemente otro fluoróforo. Opcionalmente o como alternativa, se prefiere que el donante tenga un espectro de emisión de fluorescencia y el aceptor un espectro de excitación, y en donde el espectro de emisión de fluorescencia del donante se solape con el espectro de excitación del aceptor. En otras palabras, la longitud de onda de emisión del llamado fluoróforo donante debe superponerse con el espectro de excitación del llamado fluoróforo aceptor y los dos fluoróforos deben tener diferentes longitudes de onda de excitación y emisión. La FRET se puede medir preferentemente a temperatura ambiente y preferentemente en soluciones acuosas en el estado natural de la biomolécula (por ejemplo, no es necesaria la cristalización).

Preferentemente, la etapa de realizar una medición de la eFRET para cada una de dichas muestras en cada condición comprende para cada medición de la eFRET las etapas de: transmitir luz con una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante, preferentemente de una fuente de luz monocromática, preferentemente un LED, a la muestra respectiva para excitar al donante y transmitir luz con una longitud de onda dentro del espectro de excitación del aceptor, preferentemente de una fuente de luz monocromática, preferentemente un LED, a la muestra respectiva para excitar al aceptor. Opcionalmente, se prefiere que la luz se transmita a la muestra respectiva en al menos un ciclo de iluminación, preferentemente de 1 a 50o ciclos de iluminación, en donde un ciclo de iluminación tiene al menos uno, preferentemente 2, impulsos de luz o más en el intervalo entre 10 ms y 1 s, preferentemente impulsos de luz con luz que tiene alternativamente una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante y del aceptor, respectivamente.

Preferentemente, la etapa de realizar una medición de la eFRET para cada una de dichas muestras en la primera y la segunda condición comprende para cada medición de la eFRET la etapa de: si el aceptor es un fluoróforo: medir la emisión del aceptor después de la excitación con dos longitudes de onda diferentes, preferentemente la emisión de fluorescencia del aceptor, y medir la emisión del donante, preferentemente la emisión de fluorescencia del donante. Opcionalmente, se prefiere que se promedien las emisiones medidas del aceptor y/o se promedien las emisiones medidas del donante. Opcionalmente, la emisión medida del aceptor y del donante, respectivamente, se promedia durante el al menos un ciclo de iluminación.

Preferentemente, el primer y el segundo resultado de la eFRET comprenden valores de medición respectivos de la emisión del aceptor después de la excitación del donante(Fda),de la emisión del aceptor después de la excitación del aceptor(Faa),y/o de la emisión del donante después de la excitación del donante(Fdd).Opcionalmente, se prefiere que los respectivos valores de medición se obtengan deFdapara la muestra donante, la muestra aceptora y la muestra marcada con donante-aceptor,Faapara la muestra marcada con aceptor y donante-aceptor, y deFddpara la muestra marcada con donante y con donante-aceptor.

Preferentemente, en donde la primera y la segunda condición difieren entre sí i) por la presencia de una molécula adicional en una de las dos condiciones, en donde la molécula adicional preferentemente interactúa con la molécula, y/o ii) en al menos un, preferentemente uno, parámetro seleccionado del grupo que consiste en temperatura, pH, contenido de sal, composición del tampón, adición de caótropos, excipientes y fuerza iónica.

La etapa de corregir el primer y segundo resultados de la eFRET obtenidos comprende las etapas de determinar los factores de corrección específicos del fluoróforo y/o los factores de corrección específicos de la condición, por ejemplo, utilizando los respectivos primero y segundo resultados de la eFRET. Por ejemplo, los resultados primero y segundo de la eFRET se corrigen preferentemente con los respectivos factores de corrección específicos de la condición, y preferentemente se determina un factor de corrección entre condiciones con el primer y segundo resultados de la eFRET corregidos específicos de la condición. En función de la muestra donante y de la muestra aceptora, que pueden comprender copias de la molécula correspondientes marcadas con donante y de la molécula marcadas con aceptor, respectivamente, se pueden obtener los primeros y segundos resultados de la eFRET corregidos específicos de la condición.

En caso de que se utilicen fluoróforos puros en lugar de las copias marcadas con donante o aceptor, se obtienen factores de corrección específicos de fluoróforo. Además, la presente invención preferentemente también utiliza el factor de corrección entre condiciones. De acuerdo con la presente invención, la etapa de determinar los factores de corrección con el primer y segundo resultado de la eFRET respectivos comprende las etapas de: determinar un coeficiente de fugacf,y/o determinar un coeficiente de excitación directaCEdr. El Cfse determina en función de la relación deFdayFdd,en donde dichoFdayFddse obtienen preferentemente para la muestra del donante en las condiciones respectivas, y/ocsdirse determina en función de la relación deFdayFaa,en donde dichaFdayFaase obtienen para la muestra aceptora en la condición respectiva.

Preferentemente, la etapa de corregir el primer y segundo resultado de la eFRET con los respectivos factores de corrección comprende la etapa de determinar unaFdacorregida(FDAcor)para la muestra marcada con donante-aceptor restando de laFdalaFddcorregida porCfy laFaacorregida porCEdir,en donde dichasFda, FddyFaase miden para la muestra marcada con donante-aceptor en la condición respectiva.

La etapa de determinar un factor de corrección entre condiciones utilizando el primer y segundo resultado de la eFRET corregidos comprende la etapa de determinar un factor de corrección<y>basado en la relación negativa de i) la diferencia deFDAcorentre la primera y la segunda condición y ii) la diferencia deFddde la muestra marcada con donante-aceptor entre la primera y la segunda condición. Preferentemente, Fdd y FDAcor son primero normalizadas por las muestras Faa, para mitigar los efectos de la diferencia de concentración.

Preferentemente, la etapa de determinar las eficacias de la eFRET en función del primer y segundo resultado de la eFRET corregidos respectivamente comprende las etapas de: determinar la respectivaFddcorregido con y para la muestra marcada con donante-aceptor en la condición respectiva, y determinar las eficacias de la eFRET en función de la relación de i) la respectivaFDAcory ii) la suma de la respectivaFDAcory la respectivaFddcorregida con<y>.

Preferentemente, la etapa de determinar la información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donanteaceptor dentro de la molécula en la primera y la segunda condición utilizando las eficacias de la eFRET comprende la etapa de obtener información de un radio de Forster específico del donante-aceptor,Ro,y en una distancia donanteaceptor dentro de la molécula en la primera o la segunda condiciónr.

Preferentemente, el método se lleva a cabo por un ordenador.

La presente invención se refiere además a un programa informático que comprende instrucciones que, cuando el programa es ejecutado por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo el método de acuerdo con la invención.

La presente invención se refiere además a un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones que, cuando se ejecutan por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo el método de acuerdo con la invención.

La presente invención se refiere además a un sistema de medición que comprende un controlador adaptado para obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia entre el donante y el aceptor dentro de una molécula utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET), de acuerdo con cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en donde dicho sistema de medición comprende además: medios para acomodar un recipiente, preferentemente una placa de micropocillos o un capilar, que comprende una muestra marcada con donante que comprende copias de dicha molécula marcadas con donante, una muestra marcada con aceptor que comprende copias de dicha molécula marcadas con aceptor y/o una muestra marcada con aceptor-donante que comprende copias de dicha molécula marcadas con aceptor-donante; una fuente de luz monocromática, preferentemente un LED o un diodo emisor de luz superluminiscente (SLED o SLD, que combina la alta potencia y brillo de los diodos láser con la baja consistencia de los diodos emisores de luz convencionales) y un detector de luz, preferentemente un tubo fotomultiplicador (TFM), un dispositivo acoplado a cargas (CCD, del ingléscharge-coupled device),un semiconductor de óxido de metal complementario (CMOS, del ingléscomplementar/metal oxide semiconductor)o un fotomultiplicador de silicio (FMSi); preferentemente un filtro, un espejo dicrónico, un espejo policromado y/o una lente objetivo; medios para realizar una medición de la eFRET utilizando múltiples copias de la molécula respectiva; y medios de control adaptados para controlar los medios para acomodar el recipiente; controlar la fuente de luz monocromática para transmitir luz desde la fuente de luz monocromática al recipiente; controlar el detector de luz para detectar señales del recipiente; preferentemente controlando la temperatura; y controlar dichos medios para realizar la medición de la eFRET.

La presente invención se refiere además al uso de un sistema de medición de la presente invención para obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia entre el donante y el aceptor dentro de una molécula usando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET), preferentemente de acuerdo con el método de la invención.

La luz puede dirigirse al recipiente en forma de un haz de luz "libre" que se dirige mediante el uso de medios ópticos, por ejemplo, lentes, espejos, etc. Además, un experto en la materia también aprecia que las fibras de luz, por ejemplo, las fibras de luz que mantienen la polarización o las fibras de luz que no mantienen la polarización, pueden utilizarse en algún lugar entre la fuente de luz y el recipiente y/o entre la fuente de luz y el detector.

Preferentemente, la medición comprende las etapas de obtener una señal de salida analógica obtenida del detector de luz; y procesar la señal de salida analógica obtenida. Preferentemente, la etapa de procesar la señal de salida analógica obtenida comprende la etapa de digitalizar la señal de salida analógica obtenida en una señal de salida digitalizada.

La digitalización de la señal de salida analógica (completa) del detector proporciona determinadas ventajas sobre la técnica anterior que se indicarán con más detalle a continuación. En particular, los datos de salida digitalizados resultantes pueden considerarse como una señal bruta digitalizada, que es, sin embargo, más fácil de manipular posteriormente en función de la intensidad de la luz detectada por el detector. En resumen, los datos de salida digitalizados pueden procesarse posteriormente con medios de proceso analógicos o procesarse como por medios de proceso digitales, por ejemplo, para discriminar máximos individuales para fotones individuales. Preferentemente, la etapa de procesar la señal de salida comprende además la(s) etapa(s) de i) procesar la señal de salida digitalizada como una señal de impulso de fotón único digitalizada, preferentemente en caso de que la intensidad de la luz detectada emitida desde el recipiente sea inferior a 2 millones de fotones detectados por segundo; y/o ii) procesar la señal de salida digitalizada como valores discretos de una señal analógica, preferentemente en caso de que la intensidad de la luz detectada sea superior a 2 millones de fotones detectados por segundo. Preferentemente, la etapa de procesar la señal de salida obtenida comprende la etapa i) o la etapa ii), y en donde el tiempo para decidir si procesar la señal de salida digitalizada como una señal digitalizada de acuerdo con la etapa i) es inferior a 1 segundo, preferentemente máximo 0,05 s, preferentemente mediante un FPGA(Field Programmable Gate Array,matriz de puertas programable en el campo). Además, ambas señales, es decir, la señal de recuento de fotones y la señal de valor discreto, pueden procesarse de manera simultánea. Como esto, la decisión de procesar de acuerdo con la etapa i) o ii) puede tomarse después de la medición.

Preferentemente, la etapa de procesar la señal de salida obtenida comprende además la(s) etapa(s) de almacenar la señal de salida digitalizada procesada obtenida de la etapa i) o de la etapa ii); o almacenar las señales de salida digitalizadas procesadas obtenidas de la etapa i) y de la etapa ii); y procesar adicionalmente una de las señales de salida almacenadas.

A modo de ejemplo, la forma en que se procesa la señal, si se procesa como una señal de recuento de fotones y/o una señal analógica, no está predeterminada por el detector que detecta el fotón, por ejemplo, como lo estaría cuando se utiliza un detector de recuento de fotones dedicado, sino en una etapa posterior por algoritmos en, por ejemplo, una FPGA (Field Programmable Gate Array), un ASIC(application-specific integrated circuit,circuito integrado de aplicación específica) u otros medios programabas. Preferentemente, estos algoritmos se pueden cambiar, por ejemplo, mejorar, sin cambiar el equipo informático. Por ejemplo, un límite de 2 millones de fotones en el que el algoritmo cambia de marcar la señal como señal de recuento de fotones a marcarla como señal analógica, se puede actualizar y/o cambiar por medios de soportes físicos y/o programas informáticos. Por ejemplo, el límite se puede cambiar de 2 millones de fotones detectados por segundo a, por ejemplo, 1 millón de fotones detectados por segundo o a 4 millones de fotones detectados por segundo. Esto es preferible con respecto a las soluciones existentes en las que el equipo informático, por ejemplo, el contador de fotones, tiene que ser intercambiado para alterar el límite mencionado anteriormente.

Se realizaron varios experimentos que ilustran que el esquema de medición de la presente invención produce datos cuantitativos de alta calidad, comparables en calidad a los datos de la smFRET mucho más elaborados, costosos y lentos del estado de la técnica, y a los métodos basados en rayos X o Cryo-EM, que tienen un rendimiento mucho menor, son mucho más caros y necesitan una preparación de muestras muy compleja y larga.

Breve descripción de los dibujos

En lo sucesivo, se describen en detalle realizaciones preferidas de la presente invención con respecto a las figuras. Las figuras muestran:

Figura 1: Dependencia de la eficacia de la FRET de la distancia entre los dipolos.

(A) Curva sigmoidal que describe la dependencia de la eficacia de la FRET en la distancia entre el donante (D) y el aceptor (A).

(B) Las configuraciones de las moléculas, tales como proteínas, se pueden medir cuantitativamente utilizando la eFRET de acuerdo con la presente invención. A modo de ejemplo, se representa una proteína en una primera configuración (izquierda; configuración cerrada) y una segunda configuración (derecha; configuración abierta), respectivamente. Las transiciones de las configuraciones de la molécula pueden ocurrir dependiendo de un cambio respectivo de dos condiciones.

(C) Espectros de absorción y emisión de donante y aceptor en el caso de Alexa546 (D) y Alexa647 (A). La FRET ocurre en la superposición espectral entre la emisión del D y la absorción del A. La excitación directa (Dir) puede producirse en la superposición de los espectros de absorción del D y el A. La fuga (f) puede ocurrir en la superposición de los espectros de emisión entre el D y el A. Se representan a modo de ejemplo dos filtros de adquisición opcionales.

Figura 2: Comparación de las configuraciones de la FRET de una sola molécula (sm) y eFRET (quantumFRET).

(A) Configuración de smFRET: La fuente de luz, aquí representada como dos láseres, emite impulsos alternos de alta frecuencia de luz roja y verde, que se combinan por un espejo dicrónico, seguido de la desviación de la luz por un espejo policromático hacia un objetivo con una gran apertura numérica. La gran apertura numérica se utiliza para generar un punto de excitación limitado por difracción en el volumen de la muestra. Las señales, por ejemplo, de fluorescencia, procedentes de las copias de la molécula que se difunden a través del volumen de excitación de femtolitros, se recogen por dicho objetivo, y pasan por dicho espejo policrómico y una lente objetivo. Utilizando un agujero estenopeico, la señal de fluorescencia recogida se filtra en segundo plano, se divide en fluorescencia verde y roja usando un espejo dicroico, y, después, se detecta mediante un detector de luz respectivo, por ejemplo, un detector de recuento de fotones de con fotodiodo de avalancha (APD, del inglésAvalanche photodiode).

(B) Configuración de la eFRET: La fuente de luz, preferentemente dos LED, emite luz verde y roja. La amplia longitud de onda de la luz emitida por los LED se corrige preferentemente con un filtro, o por una lente objetivo, y se combina mediante un espejo dicrónico, seguido por la desviación de la luz mediante un espejo policromático en una lente objetivo y en un volumen de muestra. Las señales, por ejemplo, de fluorescencia, procedentes de las copias de la molécula dentro del volumen de excitación, se recogen mediante dicha lente objetivo, pasan dicho filtro policromático y se dividen a través de un espejo dicrónico en fluorescencia verde y roja, que luego se detecta mediante un detector de luz respectivo, preferentemente un tubo fotomultiplicador (TFM) o un fotomultiplicador con silicio (FMSi).

(C) Histograma ES que representa la eficacia (E;eje de abscisas)frente a la estequiometría (S;eje de ordenadas)basado en la smFRET, en donde se pueden distinguir copias marcadas con A, D, y A y D a lo largo de la diagonal del gráfico.

(D) Señales obtenidas de una medición de la eFRET.Fddresume las señales de copias de la molécula marcadas con D y marcadas con A y D;Faaresume las señales de copias de la molécula marcadas con A, y A y D; yFdaresume las señales de las copias de la molécula marcadas con A y D, así como las señales de ruido, por ejemplo, debido a fugas y/o excitación directa.

Figura 3: Las estructuras cristalinas de las proteínas investigadas de manera ilustrativa se muestran en configuración abierta (apo) y cerrada (holo), en donde los puntos indican las posiciones del par de fluoróforos. Las distancias entre los fluoróforos donantes y aceptores (líneas discontinuas) se miden a partir de los carbonos de la cadena principal peptídica.Erepresenta la eficacia de la FRET exacta de una sola molécula en la configuración respectiva. El amarillo representa un ligando de la proteína respectiva.

(A) La proteína MalE47 tiene dos mutaciones en su cadena principal (A141C y T36C), lo que da como resultado una distancia entre pares de fluoróforos de 3,6 nm en su configuración abierta (ID de PDB: 1lls) y de 4,2 nm en su configuración cerrada (ID de PDB: 1anf).

(B) La proteína MalE50 tiene dos mutaciones cerca de su sitio de unión (S353C y T29C), lo que da como resultado una distancia entre pares de fluoróforos de 6,1 nm en su configuración abierta y de 5,2 nm en su configuración cerrada.

(C) La proteína SBD2-1 tiene dos mutaciones cerca de su sitio de unión (T369C y S451), lo que da como resultado una distancia entre pares de fluoróforos de 4,9 nm en su configuración abierta (ID de PDB: 4kr5) y de 4,0 nm en su configuración cerrada. (ID de PDB: 4kqp).

Figura 4: Conversión de datos de la smFRET SBD2-1.

(A) Histogramas ES sin procesar en la configuración abierta (apo) y cerrada (holo) de las proteínas. Además, se representan histogramas ES para copias de proteínas marcadas con D y marcadas con A, respectivamente, así como de fondo, en donde se midió el tampón de formación de imágenes en ausencia de la proteína.

(B) Datos convertidos de smFRET a eFRET análoga.

(C) Datos convertidos Apo (izquierda) y Holo (derecha) corregidos para señales de ruido, por ejemplo, debido a diferencias en el brillo de fondo, fugas y/o excitación directa. Después de dicha normalización, lo que dio lugar aFaacgí;se obtuvo un factor de corrección Y de 0,87. Las eficacias resultantes exactas de la eFRET,Ereai (Eex)fueron 0,096 y 0,137 para la configuración apo y holo, respectivamente. La relaciónEexobtenida fue de 1,438.

(D) Eficacias exactas de la smFRET(Eexsm)de las mediciones de apo(Eexsm =0,528) y de holo(Eexsm =0,749) representadas en (A) después del procesamiento de los datos de la smFRET. La relaciónEexsmobtenida fue de 1,445.

Figura 4-2: Resultado de la comparación del procesamiento de datos de la eFRET y la smFRET.

(A) Factores de corrección de interferencia. f y f_real indican el coeficiente de fuga obtenido de la eFRET y la smFRET, respectivamente; dir y dir_real el coeficiente de excitación directa obtenido de la eFRET y la smFRET, respectivamente.

(B) Factores de corrección gamma por réplica y proteína modelo, gamma indica el factor de corrección gamma obtenido a partir de la eFRET, gamma* el factor de corrección gamma obtenido a partir de la eFRET corregido con factores de corrección smFRET (f_real y dir_real, véase (A)), y gamma_real indica el factor de corrección gamma obtenido de la smFRET.

(C) Relaciones de E por réplica y proteína modelo. La relación de E indica la relación de E obtenida de la eFRET, la relación de E* la relación de E obtenida de la eFRET corregida con factores de corrección de la smFRET (f_real, dir_real, véase (A); gamma_real, véase (B)); y la relación de E real indica la relación de E obtenida de la smFRET.

Figura 5: Se representan diagramas de cajas de datos brutos por proteína y tipo de señal. Las configuraciones apo se indican con un punto; las configuraciones holo se representan con un triángulo. Las eficacias brutas de la eFRET(Egiobai bruta)se obtuvieron utilizando laFddy laFda.Los factores Z resultantes fueron 0,97 para SBD2-1 (grupo izquierdo), 0,925 para MalE50 (grupo central) y 0,89 para MalE47 (grupo derecho).

Figura6:Coeficiente de fugacf.

(A) Mediciones de copias de la molécula marcadas solo con D representadas por proteína y tipo de señal. Las configuraciones apo se indican con un punto; las configuraciones holo se representan con un triángulo. La tercera réplica se midió solo en su configuración abierta.

(B)Cf (Coeficiente f)para cada capilar.

Figura 7: Coeficiente de excitación directaCEdir.

(A) Mediciones de copias de la molécula marcadas solo con A representadas por proteína y tipo de señal. Las configuraciones apo se indican con un punto; las configuraciones holo se representan con un triángulo. La tercera réplica se midió solo en su configuración abierta.

(B)CEdir (Coeficiente dir)para cada capilar.

Figura 8: Normalización deFddyFdacorregidas.

(A) Diagrama de cajas deFddcorregida antes y después de la normalización(Fd d oyFDDnorm)por proteína.

(B) Diagrama de cajas deFda (FRET)yFdanormalizada(FRETnorm)por proteína. Figura 9: Procesamiento de datos y comparación entre datos normalizados y no normalizados para la determinación de relaciones de E exactas(FRET exacta (E)).

(A) Factores de corrección y obtenidos a partir de los datos que se muestran en la figura 8.

(B) Eficacias exactas de la eFRET(Ereal)obtenida con los factores de corrección y no normalizados y normalizados que se muestran en (A).

(C) Relaciones deErealobtenidas deErealnormalizadas y no normalizadas mostradas en (B).

(D) Mediciones de la smFRET de las configuraciones apo y holo por proteína y eficacias exactas de la FRET respectivas. Las relaciones de FRET resultantes(relación real)fueron 1,43 para SBD2-1, 0,87 para MalE47 y 1,36 para MalE50.

Figura 10: Valoración solo de donantes y relaciones de Eex resultantes.

(A) Eficacias de la eFRET de MalE47 y MalE50 por etapa de valoración, en donde1:1se refiere a una mezcla uno a uno de copias de la molécula marcadas solo con D y marcadas con D y A;1:2se refiere a una mezcla de una a dos de copias de la molécula marcadas con D y marcadas con D y A;1:3se refiere a una mezcla de uno a tres de copias de la molécula marcadas solo con D y marcadas con D y A.E_prse refiere a la eficacia de la FRET de proximidad corregida por fuga y/o excitación directa.E_exse refiere a laErea,en donde adicionalmente a la corrección como en el caso de laE_prse aplicó el factor de corrección y no normalizado representado en (B).ex_normse refiere aEreai,en donde adicionalmente a la corrección como en el caso deE_prse aplicó el factor de corrección Y normalizado representado en (B).

(B) Comparación de los factores de corrección Y normalizados y no normalizados por proteína y etapa de valoración.

(C) Comparación de las relaciones deErealnormalizadas y no normalizadas por proteína y etapa de valoración.

Figura 11: Las eficacias de la transferencia de energía corregidas que están influenciadas por la cantidad de proteína marcada solo con donante para MalE47 (grupo superior) y MalE50 (grupo inferior).

Figura 12: Las relaciones de la eficacia energética, que son independientes de la cantidad de moléculas marcadas solo con donantes presentes para MalE47 (grupo izquierdo) y MalE50 (grupo derecho).

Figura 13: Un diagrama de flujo esquemático que ilustra las etapas del método de la presente invención con una proteína marcada ilustrativa.

Descripción detallada

En lo sucesivo, los principios generales de la presente invención se analizarán con mayor detalle y se analizarán en función de ejemplos ilustrativos o realizaciones preferidas de la presente invención.

En particular, la presente invención se refiere en un primer aspecto a un método para obtener información cuantitativa sobre los cambios promedio en la distancia donante-aceptor dentro de una molécula, entre moléculas, dentro de un complejo de moléculas o entre complejos de moléculas utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET), En lo sucesivo, se hace referencia a molécula(s) que se entiende que cubre cualquier tipo de moléculas, por ejemplo, biomoléculas o complejos moleculares. El método comprende las etapas de: obtener al menos una muestra donante, en donde dicha muestra donante comprende al menos copias de un donante libre y/o copias de dicha molécula marcadas con donante. Se prefiere utilizar una muestra con donante libre, es decir, donante que no está unido a una molécula o una muestra purificada marcada con donante, es decir, una muestra en la que se elimina el donante libre restante. Sin embargo, dado que una muestra no puede purificarse al 100%, también se pueden utilizar muestras donantes que comprenden donante libre y copias marcadas con donante. Lo mismo ocurre con una muestra aceptora, es decir, la muestra aceptora comprende al menos copias de un aceptor libre y/o copias de dicha molécula marcadas con aceptor. Además, se obtiene una muestra marcada con donante-aceptor que comprende copias de dicha molécula marcadas con donante-aceptor. Se prefiere realizar una medición de la eFRET para cada una de dichas muestras en una primera y una segunda condición para obtener para cada una de las muestras un primer resultado de la eFRET en la primera condición y un segundo resultado de la eFRET en la segunda condición, en donde cada medición de la eFRET se realiza con múltiples copias de la molécula respectivas. Resumiendo, esto da como resultado seis mediciones de la eFRET. En caso de que la muestra donante comprenda solo donante libre, también puede ser suficiente realizar una sola medición de la eFRET para dicha muestra, ya sea en la primera o segunda condición. También en caso de que la muestra aceptora comprenda solo aceptor libre, puede ser suficiente realizar una sola medición de la eFRET para dicha muestra, ya sea en la primera o segunda condición. Por lo tanto, se pueden realizar solo cuatro mediciones de la eFRET, ya que se puede omitir la medición de la eFRET de una muestra donante y una muestra aceptora. También sería posible omitir solo una de las mediciones de la eFRET de la muestra donante y de la muestra aceptora, lo que daría como resultado cinco mediciones de la eFRET. A continuación, los resultados de la primera y segunda eFRET se corrigen para los efectos específicos del fluoróforo, específicos de la condición y/o entre condiciones. Por ejemplo, la determinación de las eficacias de la eFRET específicas de la condición se basa preferentemente en el primer y segundo resultado de la eFRET corregidos respectivamente. La información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor se puede determinar dentro de la molécula en la primera y la segunda condición utilizando dichas eficacias de la eFRET específicas de la condición.

Como se menciona anteriormente, el término molécula tal como se utiliza en la presente solicitud no se limita a un tipo específico de molécula, por ejemplo, una molécula puede ser un ácido nucleico, una proteína, un polímero orgánico o un complejo de los mismos. De manera adicional, dicha molécula puede ser una molécula de origen natural, modificada bioquímica y/o sintéticamente, una molécula sintética o una combinación de las mismas. En el presente documento, el término "ácido nucleico" comprende ADN y ARN, así como PNA y LNA, y otros "ácidos nucleicos" no naturales, en donde ADN se refiere a ácido desoxirribonucleico y ARN a ácido ribonucleico. Tanto el ADN como el ARN están formados por nucleótidos que consisten en una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos y al menos un grupo fosfato. El término "ADN" abarca, por ejemplo, ADN genómico y ADNc, y el término "ARN" comprende, por ejemplo, ARNm, ARNt, miARN, ARNncl, ARNr, ARNas, ARNnh, ARNip, ARNpno, ARNpn, ARNip y ribozimas. En el presente documento, el término "proteína" abarca cualquier tipo de secuencia de aminoácidos. Una secuencia de aminoácidos se refiere a una cadena de aminoácidos, que están unidos a través de enlaces peptídicos, y tiene al menos 5 aminoácidos de largo, más preferentemente, al menos 10 aminoácidos, aún más preferentemente al menos 50, 100, 200 o 500 aminoácidos. Por lo tanto, el término "proteína" cubre péptidos cortos, tales como oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, fragmentos de proteínas, es decir, partes de proteínas, tales como partes biológicamente activas o antigénicas, incluidos los epítopos, así como complejos proteicos que incluyen oligoproteínas y/o agregados proteicos. En cuanto a la función de la proteína, no hay limitación.

Para obtener información cuantitativa sobre los cambios conformacionales de la molécula en estudio utilizando el método de acuerdo con la presente invención, se obtienen varias copias de la molécula. Si, por ejemplo, la molécula en estudio es una determinada proteína A, se utilizan varias copias de la misma (por lo tanto, un conjunto), es decir, varias proteínas A, en el método de acuerdo con la invención. Preferentemente, dichas copias de la molécula son completamente o casi completamente idénticas, en donde casi completamente idénticas se refiere a diferencias menores en las copias, por ejemplo, debido a la variación biológica, por ejemplo, mutaciones. Por lo tanto, dos copias de la molécula en estudio pueden diferir hasta en 10 posiciones, preferentemente en menos de 5 posiciones, más preferentemente en menos de 2 posiciones. En el presente documento, el término "posición" se refiere a una base o un par de bases en el caso de que la molécula en estudio sea un ácido nucleico y/o a aminoácidos en el caso de que la molécula en estudio sea una proteína. De manera alternativa, dos copias de la molécula en estudio pueden diferir hasta en un 5 % de las posiciones, preferentemente en menos de un 2,5 % de las posiciones, más preferentemente en menos de un 1 % de las posiciones. Se pueden determinar diferencias en las posiciones entre las copias de la molécula, por ejemplo, mediante alineamientos de secuencias.

Preferentemente, la molécula en estudio se obtiene en un fluido, preferentemente un líquido, tal como una solución. Mediante la elección del tipo y/o la composición del fluido de acuerdo con las características de la respectiva molécula en estudio, se puede, por ejemplo, mantener la función y/o la actividad de la molécula durante el análisis y/o evitar la degradación no deseada y/o los cambios conformacionales. Por lo tanto, la solución puede comprender, por ejemplo, un tampón. El tampón puede elegirse de manera individual para cada molécula en estudio y en vista de las condiciones experimentales a ensayar. Preferentemente, el tampón está libre de moléculas de extinción, reduce la posibilidad de que las copias de la molécula se adhieran al recipiente de medición y/o reduce el riesgo de agregación, por ejemplo, de copias de la molécula. La presente invención, sin embargo, no se limita a moléculas "libres" en un líquido. Como se analiza posteriormente, las moléculas pueden proporcionarse en una superficie externa de una célula, dentro de una célula, dentro de la membrana de una célula, en la superficie de una microesfera o en la superficie del recipiente de medición, por ejemplo, en el fondo del micropocillo o en la pared capilar. Por ejemplo, la célula puede ser una célula eucariota o una célula procariota. Las moléculas también se pueden proporcionar en la superficie externa de un virus o partícula similar a un virus, dentro de un virus o partícula similar a un virus.

De acuerdo con el método de la invención se obtiene una muestra, en donde la muestra comprende múltiples copias de la molécula, preferentemente en una solución. Dicha muestra tiene preferentemente un volumen entre 0,1 pl y 200 pl, más preferentemente entre 1 pl y 50 pl y/o comprende dichas múltiples copias de la molécula en una concentración entre 10 pM y 10 pM, preferentemente en el intervalo de 1 nM a 1 pM y más preferentemente aproximadamente 50 nM. En caso de que la concentración de la molécula sea mayor, la muestra que comprende las copias de la molécula se diluye preferentemente a dicha concentración utilizando, por ejemplo, un tampón. De manera más específica, se obtiene al menos una muestra, preferentemente tres, cada una de las cuales comprende múltiples copias de la molécula marcadas específicamente para la muestra con un donante, un aceptor o ambos.

El donante es preferentemente un fluoróforo, por ejemplo, un primer fluoróforo (que también se denomina colorante fluorescente o simplemente colorante en la presente solicitud). Un fluoróforo se refiere a un compuesto fluorescente que puede (re)emitir luz tras la excitación con luz. Los fluoróforos adecuados para la (e)FRET pueden tener un intervalo espectral de ultravioleta a infrarrojo (IR), por ejemplo, de aproximadamente 250 nm a 850 nm. Debido a sus elevados coeficientes de extinción, los fluoróforos rojos y del infrarrojo cercano emiten a menudo una fluorescencia comparativamente intensa pero, en consecuencia, suelen tener una vida útil de fluorescencia comparativamente corta (<4 ns). De manera adicional, los aminoácidos fluorescentes, es decir, tirosina, triptófano, cisteína y/o lisina, que están presentes endógenamente en (oligo)péptidos y/o proteínas, se pueden utilizar como fluoróforos.

El aceptor es preferentemente un fluoróforo (colorante fluorescente, colorante), por ejemplo, un segundo fluoróforo. En cuanto al fluoróforo, lo mismo se aplica a lo descrito anteriormente en el caso de que el donante sea un fluoróforo. Por tanto, se prefiere que el donante sea un fluoróforo y el aceptor sea un fluoróforo.

Si tanto el donante como el aceptor son fluoróforos, se prefiere que el donante, por ejemplo, el primer fluoróforo y el aceptor, por ejemplo, el segundo fluoróforo, sean fluoróforos diferentes. Esto tiene la ventaja de que se puede obtener una señal de FRET debido a la aparición de fluorescencia del aceptor estimulada por el donante. De manera adicional, se puede utilizar un solo fluoróforo fotoconvertible, por ejemplo, un fluoróforo que se comporta de forma comparable a la proteína fluorescente Eos deLobophyllia hemprichii.Por lo tanto, la fluorescencia del fluoróforo podría cambiar de verde (aproximadamente 516 nm) a rojo (aproximadamente 581 nm) tras la irradiación UV (aproximadamente 390 nm), en donde las variantes verde y roja de Eos pueden generar FRET

Además, se prefiere que el donante tenga un espectro de emisión y el aceptor un espectro de excitación, y que el espectro de emisión del donante se solape con el espectro de excitación del aceptor. Esto es ventajoso ya que se necesita la superposición de los espectros para que se produzca la FRET. En otras palabras, esto es ventajoso ya que el donante transfiere energía de forma no radiactiva al aceptor.

De manera más específica, se prefiere que el donante tenga un espectro de emisión de fluorescencia y el aceptor un espectro de excitación, y que el espectro de emisión de fluorescencia del donante se solape con el espectro de excitación del aceptor. Esto es ventajoso ya que una emisión de fluorescencia del donante puede excitar una emisión del aceptor.

En caso de que el donante y el aceptor sean fluoróforos, los pares de fluoróforos preferidos incluyen, por ejemplo, los colorantes Alexa 546 y Alexa 647, otros colorantes Alexa y Atto, proteína fluorescente ciano (PFC) y proteína fluorescente amarilla (PFA), proteína verde fluorescente (PFV), y rodamina y derivados, fluoresceína y derivados, y colorantes de cianina tales como Cy3, cy5, cy5.5, cy7 y derivados de los mismos, así como europio y aloficocianina.

El método de acuerdo con la invención comprende preferentemente la etapa de obtener al menos una muestra donante que comprende preferentemente copias de dicha molécula marcadas con donante, una muestra aceptora que comprende preferentemente copias de dicha molécula marcadas con aceptor y una muestra marcada con aceptordonante que comprende copias de dicha molécula marcadas con aceptor-donante. En lugar de proporcionar copias de la molécula marcadas con donante y marcadas con aceptor, también es posible utilizar muestras donantes y/o aceptoras que contengan el fluoróforo (puro) en un estado "libre". Además, en caso de que se deban medir distancias intramoleculares, las copias marcadas con donante-aceptor se proporcionan de copias de una molécula, es decir, copias de la misma molécula se marcan con el donante y el aceptor. En el caso de mediciones de distancia intermolecular, se prefiere marcar copias de una primera molécula con el donante y copias de una segunda molécula con el aceptor.

En particular, se obtienen preferentemente al menos tres muestras, es decir, al menos una primera, una segunda y una tercera muestra, en donde al menos la tercera muestra comprende múltiples copias de la(s) molécula(s). La primera y la segunda muestra pueden contener solo colorante fluorescente donante y colorante fluorescente aceptor, respectivamente. De acuerdo con una realización preferida, la primera muestra comprende copias de la molécula que están marcadas con el donante y la segunda muestra comprende copias de la molécula que están marcadas con el aceptor. Las copias de la(s) molécula(s) comprendidas en la tercera muestra están preferentemente marcadas tanto con el donante como con el aceptor. Por lo tanto, al menos tres muestras se obtienen preferentemente utilizando un solo par donante-aceptor, en donde dichas al menos tres muestras comprenden preferentemente la molécula en estudio marcada con i) el donante en un sitio de marcaje del donante específico dentro de la molécula, ii) el aceptor en un sitio de marcaje del aceptor específico dentro de la molécula, o iii) ambos, respectivamente. De acuerdo con una realización preferida adicional, la molécula comprende al menos dos lados de marcaje que no son específicos para el donante y el aceptor, es decir, el donante puede marcar uno cualquiera de los al menos dos sitios de marcaje y el aceptor también puede marcar cualquiera de los al menos dos sitios de marcaje. Por lo tanto, el marcaje de los al menos dos sitios de marcaje se realiza aleatoriamente por el donante y el aceptor.

Opcionalmente, se obtienen más muestras. Esto podría ser ventajoso para obtener información cuantitativa de los cambios promedio en la distancia donante-aceptor dentro de una molécula utilizando la eFRET e i) más de un par donante-aceptor y/o ii) un solo par donante-aceptor con más de un sitio de marcaje con donante o aceptor dentro de la molécula y/o iii) una combinación de los mismos.

El marcaje se puede realizar mediante el uso de (bio)química adecuada. Por ejemplo, la molécula en estudio puede ser una proteína que puede estar marcada con his. A continuación, se puede utilizar un colorante basado en Ni-NTA para marcar la proteína en el marcador his. De manera alternativa, las respectivas copias de proteínas se pueden marcar aleatoriamente, por ejemplo, con colorantes Alexa 546 y Alexa 647 mediante química de maleimida. Otras estrategias de marcaje incluyen el uso de aminoácidos no naturales y métodos de marcaje biortogonal, tales como la química Click o el marcaje a través de marcadores, codificado en la estructura de la proteína, tal como el marcador his antes mencionado, pero también incluye marcadores comosnap-tagoavi-tag.De manera alternativa, si se utiliza un fluoróforo fotoconvertible, el marcaje se puede realizar en una sola etapa de marcaje seguido de irradiación UV para la fotoconversión aleatoria del fluoróforo en fluoróforos aceptores y donantes, respectivamente.

Preferentemente, se utiliza el mismo lote de marcaje para las mediciones de la eFRET, por ejemplo, de la molécula que es una proteína en presencia o ausencia de un posible compañero de unión como primera y segunda condición, respectivamente. De manera adicional, tras el marcaje, las copias de la molécula marcadas se purifican preferentemente antes de realizar una medición de la eFRET, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Por lo tanto, las señales de ruido se pueden reducir en la eFRET.

De acuerdo con el método de la invención, se realiza una medición de la eFRET para cada una de las al menos tres muestras (marcadas), es decir, al menos una muestra donante, una muestra aceptora y una muestra marcada con donante-aceptor, en una primera y una segunda condición.

Dicha primera y segunda condición pueden diferir entre sí por la presencia de una molécula adicional en una de las dos condiciones, en donde la molécula adicional preferentemente interacciona con la molécula. Por lo tanto, se puede determinar si la configuración de la molécula en estudio está influenciada y/o afectada por la presencia de la molécula adicional. Esto puede ocurrir en caso de que la molécula en estudio y la molécula adicional sean, por ejemplo, receptor y ligando, enzima y sustrato, enzima y coenzima, o enzima y cofactor. Esto es, por ejemplo, especialmente ventajoso en el contexto de la detección de fármacos. Opcionalmente o como alternativa, también se puede variar la concentración de la molécula en estudio o de la molécula adicional entre la primera y la segunda condición y/o añadir otra molécula adicional en una de las dos condiciones. Esto puede ser útil para determinar las afinidades de unión entre la molécula y la molécula adicional y/o el impacto de la presencia de dicha otra molécula adicional en la afinidad de unión entre la molécula y la molécula adicional.

Opcionalmente o como alternativa, dicha primera y segunda condición pueden diferir entre sí en al menos un parámetro seleccionado del grupo que consiste en temperatura, pH, contenido de sal, composición del tampón, la adición de caótropos, la adición de excipientes, fuerza iónica y la presencia de compañeros de unión. Se prefiere que la primera y la segunda condición difieran entre sí en solo un parámetro de dicho grupo. Esto es ventajoso para evaluar si el parámetro modificado influye en la configuración de la molécula en estudio. Por ejemplo, así se puede determinar a qué temperatura comienza la agregación de la molécula en estudio y/o en caso de presencia de una molécula más en ambas condiciones, cómo un cambio de temperatura afecta a la unión de la molécula y dicha molécula adicional.

Cabe destacar que, también se puede realizar una medición de la eFRET para cada una de las al menos tres muestras marcadas, es decir, al menos una muestra marcada con donante, una con aceptor y una con donante-aceptor, en más que sólo la primera y la segunda condición. Esto es especialmente ventajoso en el caso de enfoques de detección, por ejemplo, en donde se van a investigar varios posibles compañeros de interacción y/o unión de una molécula en estudio. En un entorno experimental de este tipo, una primera condición puede referirse a la molécula en ausencia de cualquier posible compañero de unión, una segunda condición a la presencia de un primer posible compañero de unión, una tercera condición a la presencia de un segundo posible compañero de unión, una cuarta condición a la presencia de un tercer posible compañero de unión, una quinta condición a la presencia del segundo y del tercer posibles compañeros de unión, y así sucesivamente. Sin embargo, en cuanto a la tercera, cuarta, quinta, etc. condición se aplica lo mismo que se divulga en el presente documento con respecto a la (primera o) segunda condición.

De acuerdo con el método de la invención, se realiza una medición de la eFRET para cada una de las al menos tres muestras fluorogénicas (marcadas) y al menos en una primera y una segunda condición para la muestra marcada con donante-aceptor, en total se realizan preferentemente seis mediciones de eFRET, pero al menos cuatro.

Para la eFRET, el donante debe excitarse directamente y el aceptor debe excitarse directa o indirectamente a través del donante. Por consiguiente, la luz que tiene una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante se transmite preferentemente a la muestra respectiva para excitar al donante. De manera adicional, también la luz que tiene una longitud de onda dentro del espectro de excitación del aceptor se transmite preferentemente a la muestra respectiva para excitar al aceptor.

En particular, se prefiere que la luz se transmita a la muestra respectiva desde una fuente de luz monocromática, preferentemente de un LED, para excitar al donante y/o al aceptor. En especial, se prefiere un LED ya que tiene la ventaja de ser mucho más económico que otras fuentes de luz monocromática tales como un láser.

Se prefiere además que, si el aceptor es un fluoróforo, se mida la emisión del aceptor,preferentemente la emisión de fluorescencia del aceptor.Por tanto, en caso de que el donante y el aceptor estén muy cerca uno del otro, el donante excitado puede excitar al aceptor mediante transferencia de energía no radiactiva y se puede observar una señal de la eFRET, es decir, tras la excitación del donante una emisión del aceptor.

De manera adicional, se prefiere transmitir luz que tenga una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante y luz que tenga una longitud de onda dentro del espectro de excitación del aceptor de manera alterna a la muestra respectiva para una medición de la eFRET. En particular, se utiliza preferentemente un esquema alterno. De acuerdo con la presente invención, las dos longitudes de onda de las fuentes de luz pueden emitirse de manera simultánea o posterior. Esto tiene la ventaja de que pueden obtenerse fácilmente factores de corrección para determinar distancias moleculares exactas y/o para obtener información cuantitativa de las distancias promedio donante-aceptor dentro de una molécula.

Por tanto, el método de acuerdo con la presente invención comprende preferentemente una etapa de transmitir luz a la muestra respectiva en al menos un ciclo de iluminación, preferentemente de 1 a 500 ciclos de iluminación, en donde un ciclo de iluminación tiene preferentemente 2 impulsos de luz entre 10 ms y 1 s, preferentemente impulsos de luz con luz que tiene alternativamente una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante y del aceptor, respectivamente.

Por ejemplo, una muestra se puede iluminar de acuerdo con el siguiente ciclo de iluminación: iluminar la muestra con luz de excitación del intervalo de longitud de onda más bajo (más corto) para excitar al donante, durante dicha iluminación con luz de excitación del donante: registrar la luz emitida en los intervalos de longitud de onda de emisión del donante y del aceptor (las señales se denominan en el presente documento como"Fdd"y"Fda",respectivamente), apagar la iluminación, iluminar la muestra con luz de excitación del intervalo de longitud de onda más elevado (más largo) para excitar el aceptor, durante dicha iluminación con luz de excitación del aceptor: registrar la luz emitida en el intervalo de longitud de onda de emisión más elevado (más largo) (emisión del aceptor, en el presente documento denominada"Fa a"),apagar la iluminación. Dicho ciclo puede repetirse varias veces, preferentemente de 2 a 100 veces. Cabe destacar que, el orden de las dos etapas de iluminación, y la respectiva etapa de registro subsiguiente, se puede cambiar en cualquier ciclo de iluminación.

Por lo tanto, se prefiere que la luz de un LED se transmita a múltiples copias de la molécula marcadas comprendidas en una muestra dada en al menos un ciclo de iluminación.

Como una medición de la eFRET se realiza preferentemente utilizando al menos un ciclo de iluminación, pero preferentemente utilizando una pluralidad de ciclos de iluminación, la emisión medida del aceptor y del donante, respectivamente, se promedia preferentemente en dichos ciclos de iluminación.

De acuerdo con el método de la invención, una medición de la eFRET para cada una de dichas muestras se realiza preferentemente en una primera y una segunda condición para obtener para cada una de las muestras un primer resultado de la eFRET en la primera condición y un segundo resultado de la eFRET en la segunda condición, en donde cada medición de la eFRET se realiza con múltiples copias de la molécula respectivas.

Dado que una medición de la eFRET se basa en la detección de emisiones, preferentemente emisión de fluorescencia, de una muestra respectiva en dos intervalos de longitud de onda de emisión, el primer y el segundo resultado de la eFRET comprenden preferentemente valores de medición respectivos de la emisión del aceptor después de la excitación del donante(Fda),la emisión del aceptor después de la excitación del aceptor(Faa),y/o la emisión del donante después de la excitación del donante(Fdd).

Se prefiere particularmente que los respectivos valores de medición se obtengan deFdapara la muestra donante, la muestra aceptora y la muestra marcada con donante-aceptor, deFaapara la muestra aceptora y la muestra marcada con donante-aceptor, y deFddpara la muestra donante y la muestra marcada con donante-aceptor. Por lo tanto, un resultado de la eFRET específico de la condición comprende preferentemente siete valores de medición de emisión, lo que es ventajoso para reducir el tiempo de medición necesario por condición.

Corrección de fondo

De manera adicional, se prefiere que los resultados de la eFRET primero y segundo obtenidos se corrijan para las señales de fondo. Por consiguiente, preferentemente se realiza una medición de fondo utilizando una muestra que no comprende ninguna copia de la molécula en estudio. Preferentemente, dicha medición de fondo se realiza utilizando una muestra adicional que corresponde a las muestras en estudio, por ejemplo, al menos la muestra donante o muestra marcada con donante, la muestra aceptora o muestra marcada con aceptor, y la muestra marcada con donanteaceptor, excepto las respectivas copias de la molécula marcadas. Por lo tanto, preferentemente los mismos componentes distintos de la molécula en estudio, tales como tampón, sales, etc., están comprendidos en dicha muestra adicional como en las muestras en estudio, preferentemente incluso en las mismas concentraciones. En caso de que la primera y la segunda condición difieran entre sí por la presencia de una molécula adicional, tal como un posible compañero de unión de la molécula en estudio, la muestra adicional utilizada para la medición de fondo preferentemente comprende además dicha molécula adicional, preferentemente en la misma concentración que al menos una de las muestras en estudio. Por lo tanto, se puede aumentar la sensibilidad y exactitud del método inventivo.

Como tal medición de fondo es independiente de la molécula en estudio, solo se puede realizar una vez para una composición de muestra dada (es decir, un tampón dado, pH, etc. como las muestras en estudio pero sin la respectiva molécula de interés). Por lo tanto, los resultados obtenidos de dicha medición de fondo se almacenan preferentemente, por ejemplo, en una base de datos, de donde se pueden obtener si es necesario. Esto es ventajoso ya que evita mediciones de fondo repetidas de una composición de muestra dada en ausencia de la molécula en estudio y, por lo tanto, puede acelerar, por ejemplo, una detección de alto rendimiento para moléculas potencialmente interactuantes.

De acuerdo con el método de la invención, se corrigen el primer y el segundo resultado de la eFRET obtenidos, preferentemente para efectos específicos del fluoróforo, específicos de la condición y/o entre condiciones. Esto es ventajoso para aumentar aún más la exactitud y la sensibilidad del método inventivo.

De manera más específica, se prefiere que la etapa de corregir el primer y segundo resultado de la eFRET obtenidos para efectos específicos del fluoróforo, preferentemente, específicos de la condición y/o entre condiciones, comprende las etapas de determinar los factores de corrección específicos del fluoróforo y/o de la condición utilizando el primer y segundo resultado eFRET respectivos de la muestra donante y la muestra aceptora, corregir el primer y el segundo resultado de la eFRET de la muestra marcada con donante-aceptor utilizando los respectivos factores de corrección específicos del fluoróforo y/o de la condición, así como determinar un factor de corrección entre condiciones usando el primer y segundo resultado de la eFRET corregidos específicos de la condición de la muestra marcada con donantereceptor, y corregir el primer y segundo resultados corregidos de la eFRET de la muestra marcada con donanteaceptor utilizando el factor de corrección entre condiciones.

En particular, el método de la presente invención puede basarse en factores de corrección específicos del fluoróforo. En este caso, el respectivo primer y segundo resultado de la eFRET comprenden preferentemente las etapas de determinar un coeficiente de fugacf,y/o determinar un coeficiente de excitación directaCEdir.Esto es ventajoso para corregir la interferencia entre los canales de detección antes de determinar las eficacias de la eFRET. El método de la presente invención también puede considerar factores de corrección específicos de la condición, preferentemente en los casos donde la muestra donante se mide en dos condiciones diferentes y/o la muestra aceptora se mide en dos condiciones diferentes. Por tanto, la etapa de determinar los factores de corrección específicos de la condición con el primer y segundo resultado de la eFRET respectivos comprende preferentemente las etapas de determinar un coeficiente de fugaCfespecífico de la condición, y/o de determinar un coeficiente de excitación directaCEdirespecífico de la condición. Esto es ventajoso para corregir la interferencia entre los canales de detección antes de determinar las eficacias de la eFRET específicas de la condición. Los coeficientes específicos de la condición suelen ser normalmente específicos del fluoróforo.

Los coeficientes de fuga y/o de excitación directa se pueden determinar en función de las muestras con un solo marcador, por ejemplo, preferentemente muestras marcadas con donante y con aceptor, pero también en función del fluoróforo donante y el fluoróforo aceptor que no están marcados. Por ejemplo, usando muestra de donante excitada en longitudes de onda de excitación de donante, se puede evaluar la fuga de la emisión del donante en el canal o canales aceptores. De manera adicional, con una muestra aceptora excitada con la longitud de onda de excitación del donante y con la longitud de onda de excitación del aceptor, puede evaluarse la excitación directa del aceptor.

De manera más específica, el coeficiente de fugaCfse determina en función de la proporción deFdayFdd,en donde dichaFdayFddse obtienen para la muestra donante, preferentemente para la muestra marcada con donante o el fluoróforo donante, preferentemente en las respectivas condiciones. La determinación delCf,como se describe en el presente documento, es ventajosa ya que describe la emisión del donante que se filtra a través de los canales y/o filtros de detección del aceptor y, por lo tanto, se detecta como emisión del aceptor. En particular, el coeficiente de fugaCfse determina preferentemente en función de la muestra donante de acuerdo con la fórmula (II):

en dondeFdaindica la respectiva emisión del aceptor después de la excitación del donante, yFddla respectiva emisión del donante después de la excitación del donante.

Opcionalmente o como alternativa, el coeficiente de excitación directaCEdirse determina preferentemente en función de la relación deFdayFaa,en donde dichaFdayFaase obtienen para la muestra aceptora, preferentemente en las respectivas condiciones. La determinación delCEdir,como se describe en el presente documento, es ventajosa ya que describe la emisión del aceptor después de la excitación directa por la luz de excitación del donante y, por lo tanto, sin que tenga lugar ninguna<f>R<e>T. En particular, elCEdirse determina preferentemente en función de la muestra aceptora, preferentemente en la muestra marcada con aceptor o en función del fluoróforo aceptor libre, de acuerdo con la fórmula (III):

en dondeFdaindica la respectiva emisión del aceptor después de la excitación del donante, yFaala respectiva emisión del aceptor después de la excitación del aceptor.

Preferentemente, la etapa de corregir el primer y segundo resultado de la eFRET con los respectivos factores de corrección comprende la etapa de determinar unaFdacorregida(FDAeor o Fda Corregida)para la muestra marcada con donante-aceptor restando de laFdalaFddcorregida porCfy laFaacorregida porCEdir,en donde dichasFda, FddyFaase miden para la muestra marcada con donante-aceptor en la condición respectiva. Por lo tanto, unaFdacorregida(Fdacoc)para la muestra marcada con donante-aceptor se obtiene preferentemente de acuerdo con la siguiente fórmula:

La etapa de determinar el factor de corrección entre condiciones utilizando el primer y segundo resultado de la eFRET corregidos comprende la etapa de determinar un factor de correcciónybasado en la relación negativa de i) la diferencia deFDAeorentre la primera y la segunda condición y ii) la diferencia deFddde la muestra marcada con donante-aceptor entre la primera y la segunda condición.

De manera más específica, el factor de corrección y se calcula utilizando la muestra doblemente marcada, es decir, la muestra marcada con donante-receptor, y mediante el cálculo de la siguiente relación:

en donde

y en donde

Cabe destacar que, para calcular el factor de corrección y no se necesita ninguna otra medición de la eFRET, sólo una etapa de cálculo adicional.

De manera adicional, los datos obtenidos se normalizan preferentemente con laFaapara mitigar los efectos de diferentes concentraciones de copias de la molécula en las muestras respectivas debido a errores de pipeteo. Por lo tanto, las señales Fxxcondición v se reemplazan por Fxxcondición v/FAAcondici°n v en las fórmulas anteriores.

Tal que:

rcondición 1 / P condición 1 _ IT condición 2 / p condición 2

^D Ai t AA i r DA i-PAA

y

AFdd<p^^condición 1>j<[n’^ ^ condición i>Fdd<condición X>J<p ^^ co n d ic ió n 2>

Esto es una desventaja cuando el rendimiento cuántico del aceptor cambia significativamente entre las dos condiciones.

De manera alternativa, el aceptor también se puede fotoblanquear parcialmente. A continuación, también se puede observar una señal de eFRET, es decir, una emisión donante debida a la excitación por emisión del aceptor. En un entorno experimental de este tipo, la condición 1 y la condición 2 se refieren a la situación antes y después del fotoblanqueo, respectivamente. Dicho entorno experimental utiliza una etapa de fotoblanqueo y una medición adicional de F<dd>y F<da>después del fotoblanqueo. Las fórmulas anteriores se modifican en el sentido de que "condición 1" y "condición 2" se reemplazan por "antes del fotoblanqueo" y "después del fotoblanqueo", respectivamente. Sin embargo, no es necesario preparar más muestras. Además, dicho entorno experimental tiene la ventaja de que las diferencias en las concentraciones de las copias de la molécula en las muestras no deben corregirse. De manera adicional, el cálculo del factor de corrección v con fotoblanqueo tiene la ventaja de que el factor de corrección v se puede calcular para diferentes condiciones por separado. Mientras que para la corrección v utilizando dos condiciones diferentes, se asume una v constante, utilizando fotoblanqueo, las muestras de todas las condiciones pueden someterse a fotoblanqueo aceptor y, por lo tanto, para todas las condiciones puede determinarse una v independiente.

De acuerdo con el método de la invención, las eficacias de la eFRET específicas de la condición se determinan en función del primer y segundo resultado de la eFRET corregidos respectivamente.

Por consiguiente,Fddcorregida por v(Fddcgí) específica de la condición para la muestra marcada con donante-aceptor en la condición respectiva se determina preferentemente de la siguiente manera:

A continuación, las eficacias de la eFRET específicas de la condición se determinan preferentemente en función de la relación de i) la respectivaFdacgíy ii) la suma de las respectivasFdacgíy la respectivaFddcorregida por v. De manera más específica, una eficacia de la eFRET específica de la condición se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula (IX):

en dondeEapse refiere a la eficacia aparente de la eFRET, es decir, medida, de la molécula en estudio en una condición dada, que incluye las condiciones antes mencionadas (por ejemplo, presencia de ligando, pH, etc.), pero también al lote de marcaje de la molécula marcada con donante-aceptor.

La eficacia aparente de la eFRET y la eficacia exacta(Ereai)de la eFRET de la transferencia de energía están relacionadas entre sí de la siguiente manera:

en dondecdase refiere a la concentración de las copias de la molécula doblemente marcadas, es decir, las copias de la molécula marcadas con aceptor-donante, y en dondecdse refiere a la concentración de las copias de la molécula marcadas con donante en la muestra respectiva. En este caso, la eficacia exacta Ereal de la eFRET depende sólo de la condición (por ejemplo, presencia de ligando, pH, etc.), pero no del lote de marcaje de la molécula marcada con donante-aceptor y es una propiedad física de la molécula en estudio.

De acuerdo con el método de la invención, la información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donanteaceptor dentro de la molécula o entre dos moléculas en la primera y la segunda condición se determina utilizando las eficacias de la eFRET específicas de la condición. Por consiguiente, preferentemente se calcula una relación de las eficacias aparentes de la eFRET específicas de la condición obtenidas. Esto tiene la ventaja de que dicho enfoque basado en relaciones es, en gran parte o incluso completamente, independiente de las eficacias de marcaje y representa una medida cuantitativa, en caso de que se utilice el mismo lote de marcaje de dicha molécula para obtener la eficacia aparente de la FRET por condición.

De manera más específica, la eficacia exacta(Ereai)de la eFRET de la transferencia de energía se puede utilizar para determinar la distancia entre el donante y el aceptor dentro de la molécula en estudio o entre las moléculas en estudio. Por consiguiente, se obtiene preferentemente la información de un radio de ForsterR0específico del donante-aceptor y de una distancia donante-aceptorrdentro de la molécula en la primera o la segunda condición.

El término "radio de Forster" (es decir,Ro)se refiere a la distancia a la que se produce el 50 % de la FRET y es específico para un par donante-aceptor determinado. Se puede obtener información de un radio de Forster de un par donante-aceptor dado, por ejemplo, para muchos pares de fluoróforos de uso común, de fuentes de datos disponibles públicamente, tales como bases de datos y publicaciones. Por lo general, se calcula suponiendo una orientación aleatoria de (inter)fluoróforos.

La información de la distancia de un respectivo par donante-aceptor en al menos un estado conformacional, por ejemplo, de una proteína receptora con y/o sin ligando unido, se puede obtener mediante cristalografía de rayos X, por ejemplo, y está disponible públicamente para muchas moléculas.

Por lo tanto, se obtiene preferentemente la información de un radio de Forster específico de un par donante-aceptor y de una distancia donante-aceptorrdentro de la molécula en la primera o la segunda condición, preferentemente de, por ejemplo fuentes de datos disponibles públicamente, tales como bases de datos y/o publicaciones y/o de trabajos anteriores. El uso de dicha información tiene la ventaja de que las distancias donante-aceptor dentro de una molécula también se pueden determinar para otros estados conformacionales utilizando la relación de eficacias de la eFRET de acuerdo con el método inventivo. Por tanto, por ejemplo, se pueden acelerar significativamente los enfoques de detección de moléculas que interactúan con la molécula en estudio, lo que provoca un cambio conformacional en la molécula en estudio, por ejemplo, en el caso de pruebas de detección de fármacos.

En función de la relación de lasEapespecíficas de la condición, la relación respectiva deEreaientonces se puede determinar de la siguiente manera:

E (ip condición1E real condición 1

E

np condición2É real condición2

De acuerdo con la fórmula (I),Ereaiestá relacionado con la distancia donante-aceptor dentro de una molécula en una condición dada y el radio de Forster específico de donante-aceptor. Por lo tanto, se puede obtener información cuantitativa de la distancia donante-aceptor dentro de la molécula en estudio en una condición adicional. Preferentemente, se obtiene información de la distancia donante-aceptor dentro de la molécula en estudio en la primera o segunda condición y, por lo tanto, utilizando las siguientes fórmulas (XII) y (XIII), se puede obtener información de la distancia donante-aceptor en la otra respectiva primera y segunda condición.

En lo sucesivo, las fórmulas (XII) y (XIII) se muestran a modo ilustrativo para determinar la información cuantitativa de la distancia donante-aceptor dentro de la molécula en estudio en la segunda condición utilizando la información obtenida de la distancia donante-aceptor en la primera condición, el radio de Forster específico del par donanteaceptor, y la relación de lasEapespecíficas de la condición obtenidas.

E op condición1r2+ go

E r f R$

op condición 2

y

La Ereal también se puede utilizar para distinguir entre diferentes modos de unión de ligandos según el cambio de configuración que provocan. Un ejemplo sería una proteína que sufre un cambio conformacional cuando procesa un ligando de origen natural, tal como el ATP (por ejemplo, abierto ^ cerrado con ATP unido ^ hidrólisis y expulsión de ATP ^ abierto). Un inhibidor de dicha enzima puede funcionar mediante la unión al sitio de unión del a Tp , lo que conduce a una configuración cercana constante (inhibidor competitivo), o a una parte diferente de la enzima, dando lugar a una configuración abierta constante, que no permite la unión estable del ligando natural (inhibición alostérica). En el flujo de trabajo de descubrimiento de fármacos, el conocimiento del mecanismo de unión es una información muy valiosa que a menudo solo se puede obtener de manera fiable mediante métodos de estructura de alta resolución que necesitan mucho tiempo y que no se pueden modificar con flujos de trabajo de alto rendimiento (rayos X, RMN, Cryo-EM) o ensayos de competencia propensos a errores que arrojan resultados difíciles de interpretar. La presente invención puede proporcionar un método fiable que está preparado para un alto rendimiento sin tener presente una molécula competidora.

La Ereal y la presente invención en general también se pueden utilizar para caracterizar inhibidores de interacciones proteína-proteína así como enlazadores que crean interacciones proteína-proteínade novo(tales como PROTAC). Por ejemplo, un PROTAC que conduce a una unión más estrecha de las proteínas probablemente conduciría a una mayor Ereal que un PROTAC que solo conecta dos proteínas de manera laxa.

El método inventivo se lleva a cabo preferentemente mediante un ordenador.

La presente invención se refiere en un aspecto adicional a un programa informático que comprende instrucciones que, cuando el programa es ejecutado por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La presente invención se refiere en un aspecto adicional a un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones que, cuando se ejecutan por un ordenador, hacen que el ordenador lleve a cabo el método de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Opcionalmente o como alternativa, el soporte de datos legible por ordenador comprende el programa informático de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.

En el presente documento, se entiende que el soporte de datos legible por ordenador abarca un medio de almacenamiento (de larga duración) legible por ordenador, tal como un SSD, disco duro (HDD), memoria USB, tarjeta SD o cualquier otra memoria que también se pueda ubicar en una nube, así como una memoria de acceso aleatorio para almacenamiento temporal.

La presente invención también se refiere a un sistema de medición que comprende un controlador adaptado para obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de una molécula utilizando eFRET,preferentemente de acuerdo con el método como se indica anteriormente.Por ejemplo, el sistema de medición puede comprender un soporte de datos legible por ordenador de acuerdo con la invención, que comprende preferentemente el programa informático de acuerdo con un aspecto de la invención que el controlador está adaptado para ejecutar.

El sistema de medición comprende medios adicionales para acomodar un recipiente, preferentemente una placa de micropocillos o un capilar, que comprende una muestra donante que comprende copias de dicha molécula marcadas con donante o fluoróforo donante libre, una muestra aceptora que comprende copias de dicha molécula marcadas con aceptor o fluoróforo aceptor libre, y/o una muestra marcada con aceptor-donante que comprende copias de dicha molécula marcadas con aceptor-donante; una fuente de luz monocromática, preferentemente un LED, y un detector de luz, preferentemente un TFM o un fotomultiplicador de silicio FMSi; preferentemente un filtro, un espejo dicrónico, un espejo policrónico y/o una lente objetivo; medios para realizar una medición de la eFRET utilizando múltiples copias de la molécula respectiva; y medios de control adaptados para controlar los medios para acomodar el recipiente; controlar la fuente de luz monocromática para transmitir luz desde la fuente de luz monocromática al recipiente; controlar el detector de luz para detectar señales del recipiente; y controlar dichos medios para realizar la medición de la eFRET.

La presente invención se refiere en otro aspecto al uso de un sistema de medición, por ejemplo, como se indica anteriormente, para obtener información cuantitativa de los cambios promedio en la distancia donante-aceptor dentro de una molécula utilizando la eFRET.

Se describirán otros aspectos y ventajas de la presente invención en los siguientes ejemplos, que se dan con fines ilustrativos y no a modo de limitación.

La presente invención se discutirá más específicamente con respecto a dos ejemplos no limitantes, a saber, la aplicación del método de la presente invención en soluciones libres y la aplicación del método de la presente invención en muestras donde la biomolécula marcada está en la superficie externa de una célula o incluso dentro de una célula.

En general, la medición se basa preferentemente en la detección de la fluorescencia de una muestra fluorogénica en dos intervalos de longitud de onda de excitación y en dos intervalos de longitud de onda de emisión. La configuración de la medición comprende preferentemente una cámara de muestra (por ejemplo, un capilar o una placa de microtitulación), preferentemente una fuente de luz que emita diferentes intervalos de longitud de onda, en donde preferentemente se utilizan dos fuentes de luz diferentes para los dos intervalos de longitud de onda diferentes. La configuración de la medición preferentemente también comprende varias lentes, filtros y/o espejos dicroicos para redirigir, combinar y separar la luz, así como al menos un detector, preferentemente dos detectores (véanse, por ejemplo, las figuras 2A y 2B). Las fuentes de luz y la detección están preferentemente controladas por el tiempo. La presente invención no se limita a dos fuentes de luz y/o dos detectores. Por ejemplo, para la FRET multicolor se pueden utilizar más fuentes de luz y/o más detectores.

El recipiente en el que se mide la biomolécula puede ser un capilar, una placa de micropocillos, tubos, cubeta o cualquier otro recipiente.

(A) Aplicación del método inventivo en solución libre

Preferentemente, se crean tres muestras fluorogénicas utilizando la química de marcaje adecuada. Las muestras incluyen preferentemente una (primera) muestra que está marcada solo con un fluoróforo donante (preferentemente en la molécula de interés, o puede sustituirse el fluoróforo libre), una (segunda) muestra que está marcada solo con un fluoróforo aceptor (preferentemente en la molécula de interés, o puede sustituirse el fluoróforo libre) y una muestra que está marcada con ambos fluoróforos.

Preferentemente, las tres muestras se someten preferentemente a una "rutina de medición única" a (al menos una) temperatura predefinida, preferentemente en dos estados diferentes (por ejemplo, con y sin ligando unido). Esto significa que, preferentemente, se preparan seis muestras y para cada una de ellas se realiza una única medición. Sin embargo, si se sabe que un fluoróforo muestra una dependencia muy baja de su espectro e intensidad de fluorescencia respecto al entorno, también es concebible realizar las mediciones de un solo fluoróforo con una solución de fluoróforo en lugar de una proteína marcada. Esto podría conducir a desviaciones en el resultado final.

Se prefiere además realizar una medición de fondo con un recipiente de medición lleno con el tampón acuoso utilizado para la muestra (idealmente con y sin ligando). Después se evalúan los datos.

Descripción básica de una sola medición:

(1) La muestra fluorogénica se coloca en un recipiente de medición, por ejemplo, un capilar de vidrio o pocillo de una placa de microtitulación.

(2) La muestra se ilumina de la siguiente manera:

a. La muestra se ilumina con luz de excitación del intervalo de longitud de onda más bajo (más corto) (excitación del donante). Durante este tiempo, se registra la luz emitida en ambos intervalos de longitud de onda de emisión (para la emisión del donante y del aceptor, donde estas señales se denominan Fdd y Fda, respectivamente).

b. La iluminación se apaga. Preferentemente, esta etapa es lo suficientemente larga para que tanto los detectores como la fuente de luz se apaguen correctamente y no se registre ninguna señal por encima del fondo. Esta etapa es opcional.

c. La muestra se ilumina con luz de excitación del intervalo de longitud de onda más alto (más largo) (excitación del aceptor). Durante este tiempo, se registra la luz emitida en el intervalo de longitud de onda de emisión más alto (más largo) (emisión del aceptor). Esta señal se denomina F<aa>. d. La iluminación se apaga de nuevo (véase (b)).

e. El ciclo se puede repetir varias veces. Obsérvese que el orden de iluminación no es importante y se puede cambiar.

f. Si hay varios ciclos, la señal de todos los ciclos se puede promediar. La medición de varios ciclos puede ser ventajosa, ya que permite comprobar si se produce un fotoblanqueo significativo durante el tiempo de medición. Si se produce un blanqueamiento medible durante los ciclos, la información de cómo cambia el equilibrio entre los diferentes canales se puede utilizar para factores de corrección.

g. La duración de los ciclos de iluminación es preferentemente inferior a 10 segundos, preferentemente está en el intervalo de 10 ms a 5 s, más preferentemente en el intervalo de 100 ms a 2 s, más preferentemente en el intervalo de 100 ms a 1 segundo.

Descripción de la evaluación de los datos:

(1) Preferentemente, se promedian los datos de los ciclos de iluminación. Se prefiere además descartar cualquier punto de datos para el que la iluminación y la detección no se encuentran todavía en un estado estable.

(2) A continuación, cada muestra se corrige preferentemente restando la señal de fondo. La señal de fondo de cada canal (por ejemplo, excitación del donante-emisión del donante) se registra con un recipiente de medición lleno, idealmente con el mismo tampón con el que se realiza la medición; las alternativas incluyen agua. En lo sucesivo, todas las señales han sido corregidas de fondo.

(3) A partir de la muestra que contiene solo colorante fluorescente donante, se calcula el coeficiente de fuga, cf.

Este coeficiente describe la luz fluorescente que emite el fluoróforo donante, pero se filtra a través de los filtros de fluoróforo aceptor y, por lo tanto, se detecta como fluorescencia del aceptor. Se calcula dividiendo el canal de excitación del donante de emisión del aceptor, Fda, por el canal de excitación del donante de emisión del donante, Fdd, para una muestra de solo donante. Preferentemente, esto se lleva a cabo con una biomolécula marcada solo con donante en ambos estados de unión diferentes. Pero también se puede hacer en un solo estado de unión o incluso con colorante libre. Aún en otras palabras, cf es la relación de las eficacias de detección del fluoróforo donante para los dos canales de detección diferentes. Por tanto, el espectro de emisión del donante juega un papel y el conjunto de filtros/alineación de la configuración. Aún en otras palabras, cf es la relación de las eficacias de detección del fluoróforo donante para los dos canales de detección diferentes. Por tanto, el espectro de emisión del donante juega un papel y el conjunto de filtros/alineación de la configuración.

Muestra de solo donante:

(4) A partir de la muestra que se marcó con colorante fluorescente aceptor único, se calcula el coeficiente de excitación directa, cEdir. Este coeficiente describe la luz emitida por el fluoróforo aceptor después de excitarse directamente por la luz de excitación de los fluoróforos donantes (sin que se produzca transferencia de energía). Se calcula dividiendo el canal de excitación del donante de emisión del aceptor, Fda, por el canal de excitación del aceptor después de la emisión del aceptor, F<aa>, para una muestra de solo aceptor. Preferentemente, esto se lleva a cabo con una biomolécula marcada solo con aceptor en ambos estados de unión diferentes. Pero también se puede hacer en un solo estado de unión o incluso con colorante libre. Aún en otras palabras, cEdir es la relación de las eficacias de excitación del fluoróforo aceptor para las dos longitudes de onda de excitación diferentes. Por tanto, influyen el espectro de excitación del aceptor, el conjunto de filtros/alineación de la configuración y las intensidades de excitación utilizadas.

Muestra de solo aceptor:

_ _ F DA

CEdir — 7 ;

F a a

(5) La muestra marcada con ambos fluoróforos se corrige por fuga y excitación directa. Preferentemente, esta corrección se realiza con los factores de corrección de los correspondientes estados de unión.

Muestra doblemente marcada:

F d A corregida — F d a Cf I’ d d CE^ir F a a

(6) El factor de corrección<y>se puede calcular al menos de dos maneras utilizando la muestra con doblemente marcada. En el primer caso, se forma la relación de las diferencias de (a) señal de FRET Fda corregida normalizada por la señal aceptora de esa muestra y (b) emisión del donante después de la excitación del donante F<dd>normalizada por la señal aceptora de esa muestra:

hFpA

a.Y = ~ &FddconAF as1 u

DA s2

//

F p

a A s 2

da = Fdas1/Fa

AF<dd>= Fdds1/Faas1- Fdds2/Fa/ 2

y

o

<con A F Dy4 —>Fdas1 Fdas2

AF<dd>—<f>dds1 -<f>dds2

y

en donde los superíndices "s1" y "s2" se refieren a la primera y segunda condición (estado 1 o condición 1; estado 2 o condición 2; véanse las fórmulas V-VII-2 anteriores).

b. La señal de diferencia se calcula entre muestras en diferentes estados, por ejemplo, ligando unido y sin ligando unido (o dos ligandos unidos diferentes).

i. Para mitigar los efectos de las diferentes concentraciones de las dos muestras, los datos se pueden normalizar utilizando la emisión del aceptor después de la excitación del aceptor Faa. Esto es una desventaja cuando el rendimiento cuántico del aceptor cambia significativamente entre los dos estados.

ii. Se prefiere además utilizar el mismo lote marcado para los dos experimentos. Obsérvese que los datos necesarios para calcular el factor de corrección<y>utilizando dos estados de unión de ligando diferentes no necesitan una medición adicional, sólo una etapa de evaluación adicional. c. De forma alternativa, el aceptor puede fotoblanquearse parcialmente, lo que también conduce a una diferencia en la señal de FRET y, por lo tanto, a una diferencia en la señal del donante. Entonces el estado 1 s1 y el estado 2 s2 corresponden al antes y después del fotoblanqueo. En este caso, como se utiliza la misma muestra, no se necesita normalización. Faa se puede establecer de manera artificial en 1, en este caso para utilizar las fórmulas en (a).

i. En este caso, tener concentraciones iguales no es una preocupación. Sin embargo, teóricamente puede producirse fotodaño más allá del blanqueamiento del fluoróforo rojo, por ejemplo, a través de especies reactivas del oxígeno.

ii. El cálculo del factor de corrección<y>mediante fotoblanqueo tiene la ventaja de que el factor de corrección y se puede calcular para diferentes estados de biomoléculas (por ejemplo, con y sin ligando) por separado. Es decir, también cuando solo se puede medir un estado de unión. iii. Es necesaria una etapa adicional de fotoblanqueo y una medición adicional utilizando este tipo de corrección<y>. Sin embargo, no es necesario preparar una muestra adicional. Si la muestra se blanquea considerablemente durante los ciclos de iluminación antes mencionados, esta información también se puede utilizar para calcular y.

A continuación, las eficacias aparentes de la FRET de la muestra con y sin ligando (o con dos ligandos diferentes) se pueden calcular a partir de la muestra doblemente marcada utilizando la señal F<da>corregida y el factor de corrección gamma:

Muestra doblemente marcada:

cda y cd son las concentraciones de la biomolécula doblemente marcada y de la biomolécula marcada con solo donante, respectivamente.

A partir de ahí, la relación de eficacias reales de la FRET se calcula utilizando:

E apl _ E reall

Eap2 F reai2

Siendo Eap la eficacia aparente de la FRET como se calculó anteriormente y Ereai la eficacia real de la transferencia de energía, una propiedad física de la molécula marcada en cuestión.

(9) La distancia de la distancia entre fluoróforos ri se puede calcular utilizando el radio de Forster Ro y una distancia r2 conocida:

R q6

Ereal r6 R06

Eap2 ^ _<r t 6 R0>6

<E a p l _ ^>R06

- (r26 fio6) - fi„6

i

Este cálculo se puede realizar donde el radio de Forster Ro no cambia con la unión del ligando. Este es el caso si el índice de refracción del medio, el espectro de emisión del donante, el espectro de excitación del aceptor, la orientación del fluoróforo y el rendimiento cuántico del donante no cambian con la unión del ligando. Fuera de estos, el rendimiento cuántico del donante y la orientación del fluoróforo son los que tienen más probabilidades de cambiar.

(B) Aplicación de los métodos inventivos en los que la biomolécula marcada está en la superficie externa de una célula

El método de la presente invención también se puede utilizar en caso de que una biomolécula marcada se encuentre en la superficie externa de una célula, por ejemplo, en la superficie externa de células eucariotas, procariotas, arquea, bacterianas, humanas o de levadura. Las etapas del método son similares al caso indicado anteriormente donde las proteínas están en solución libre.

Breve descripción de una secuencia de medición:

Se crean tres muestras fluorogénicas utilizando un método de química de marcaje, de bioquímica o de biología molecular adecuado (por ejemplo, plásmido para expresar una proteína con PFV). Las muestras incluyen preferentemente una muestra marcada/expresada con solo un fluoróforo donante/proteína de fusión (preferentemente en la molécula de interés, o puede sustituirse el fluoróforo libre), una muestra marcada/expresada con solo un fluoróforo aceptor/proteína de fusión (preferentemente en la molécula de interés, o puede sustituirse el fluoróforo libre) y una muestra marcada/expresada con ambos fluoróforos/proteínas de fusión.

Preferentemente, las tres muestras se someten a la "rutina de medición única" a (al menos una) temperatura predefinida, preferentemente en dos estados diferentes (por ejemplo, con y sin ligando unido). Esto significa que, preferentemente, se preparan seis muestras y para cada una de ellas se realiza una única medición. De nuevo, si se sabe que un fluoróforo muestra una dependencia muy baja de su espectro e intensidad de fluorescencia respecto al entorno, es concebible realizar las mediciones de un solo fluoróforo con una solución de fluoróforo en lugar de una proteína marcada. Esto podría conducir a desviaciones en el resultado final. En este caso, sólo se realizan cuatro o cinco mediciones.

De manera adicional, una medición de fondo se realiza preferentemente con un recipiente de medición lleno del tampón acuoso utilizado para la muestra (idealmente con y sin ligando). Después se evalúan los datos.

Descripción básica de una sola medición:

(1) La muestra fluorogénica se coloca en el recipiente de medición, por ejemplo, un capilar de vidrio o pocillo de una placa de microtitulación.

(2) La muestra se ilumina de la siguiente manera:

a. La muestra se ilumina con luz de excitación del intervalo de longitud de onda inferior (excitación del donante). Durante este tiempo, se registra la luz emitida en ambos intervalos de longitud de onda de emisión (para la emisión del donante y del aceptor, donde estas señales se denominan Fdd y Fda, respectivamente).

b. La iluminación se apaga. Preferentemente, esta etapa es lo suficientemente larga para que tanto los detectores como la fuente de luz se apaguen correctamente y no se registre ninguna señal por encima del fondo. Esta etapa es opcional.

c. La muestra se ilumina con luz de excitación del intervalo de longitud de onda superior (excitación del aceptor). Durante este tiempo, se registra la luz emitida en el intervalo de longitud de onda de emisión más elevado (emisión del aceptor). Esta señal se denomina Faa.

d. La iluminación se apaga de nuevo (véase (b)).

e. El ciclo se puede repetir varias veces. Obsérvese que el orden de iluminación no es importante y puede cambiarse.

f. Si hay varios ciclos, la señal de todos los ciclos se puede promediar. La medición de varios ciclos puede ser ventajosa, ya que permite comprobar si se produce un fotoblanqueo significativo durante el tiempo de medición. Si se produce un blanqueamiento medible durante los ciclos, la información de cómo cambia el equilibrio entre los diferentes canales se puede utilizar para factores de corrección.

g. la duración de los ciclos de iluminación es preferentemente inferior a 10 segundos, preferentemente está en el intervalo de 10 ms a 5 s, más preferentemente en el intervalo de 100 ms a 2 s, más preferentemente en el intervalo de 100 ms a 1 segundo.

La evaluación de los datos es preferentemente similar o incluso idéntica al caso indicado anteriormente donde las proteínas se proporcionan en solución libre.

Ejemplos

En el presente documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente divulgación; también se pueden utilizar otros métodos y materiales adecuados conocidos en la materia. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

I. Antecedentes

Los experimentos descritos a continuación se realizaron a modo ilustrativo utilizando una proteína de unión a maltosa y una proteína de dominio de unión a sustrato. La proteína de unión a maltosa (MalE o MBP, del inglésmaltose-binding protein)deEscherichia coliy la proteína de dominio de unión a sustrato (SBD, del ingléssubstrate-binding-domain)deLactococcus lactisson proteínas que son responsables de la absorción de nutrientes. Estas proteínas no tienen ninguna cisteína endógena. Sin embargo, mediante el intercambio dirigido de un aminoácido endógeno colocado en una superficie de la proteína por una cisteína, la proteína respectiva se puede marcar específicamente con fluoróforo a través de dicha(s) cisteína(s) utilizando, por ejemplo, química de la maleimida.

MalE es una proteína transportadora periplásmica implicada en el suministro de azúcar del organismo. Se une a la maltosa y sus derivados, transfiriéndolos posteriormente a un transportador de membrana, que transfiere el azúcar al citoplasma de la célula. En el presente documento, se utilizaron dos mutantes de MalE, es decir, MalE47 con una mutación A141C-T36C en la cadena principal de la proteína y MalE50 con una mutación S353C-L29C cerca de un sitio de unión. En el caso de MalE47, la distancia entre las dos mutaciones A141C y T36C aumentó de 3,6 nm en la configuración abierta (configuración apo, es decir, sin azúcar unido como ligando) a 4,2 nm en la configuración cerrada (configuración hola, es decir, con azúcar unido como ligando; Figura 3A). En el caso de MalE50, la distancia entre las dos mutaciones S353C y L29C disminuyó de 6,1 nm en la configuración abierta a 5,2 nm en la configuración cerrada (Figura 3B).

SBD está implicada en el transporte de glutamina y asparagina en la célula. Las SBD están ancladas a los importadores ABC en la membrana celular. La SBD utilizado en el presente documento consistía en dos subunidades SBD completamente funcionales (SBD1 y SBD2) fusionadas. SBD1 puede unirse glutamina y asparagina, mientras que SBD2 se une solo a la glutamina. De manera más específica, se utilizó SBD2-1, un mutante T369C-S451C de SBD2 fusionado a una subunidad SBD1, en donde las mutaciones T369C y S451C estaban ubicadas cerca de un sitio de unión. Como en el caso de MalE50, la distancia entre las dos mutaciones disminuyó de 4,9 nm en la configuración abierta a 4 nm en la configuración cerrada (Figura 3C).

II. Materiales

En lo sucesivo, se enumeran brevemente ejemplos no limitantes de materiales que se utilizaron en determinados ejemplos para llevar a cabo el método de la presente invención.

1. Productos químicos

Nombre (n.° de catálogo) Proveedor

Fracción V de albúmina de suero bovino, sin ácidos grasos (A8806-5G) Sigma Aldrich

GE Ni-Sepharose 6 Fast Flow (17-5318) GE Healthcare Glicerina, ROTIPURAN, mín. 99,5 % (3783.2) Carl Roth

(continuación)

Nombre (n.° de catálogo) Proveedor

Imidazol, mín. 99 % (3899.2) Carl Roth

Cloruro de potasio, mín. 99,5 % (6781.3) Carl Roth

SOLUCIÓN DE L-GLUTAMINA 200 MM (G7513-100ML) Sigma Aldrich Monohidrato de maltosa (1059100500) Sigma Aldrich SOLUCIÓN SALINA TAMPONADA CON FOSFATO, 7,4, SIN POTASIO,

COMPRIMIDOS (1113.1)<Carl Roth>

HCL (9787.1) Carl Roth

TRIS-HCI (9090.2) Carl Roth

Pluronic®F-127 (9003-11-6) Sigma Aldrich

2.Consumibles

Nombre (n.° de catálogo) Proveedor

Fluoróforos Alexa Fluor™546 C5 Maleimida (A10258) Thermo Fischer Scientific Alexa Fluor™647 C2 Maleimida (A20347) Thermo Fischer Scientific Portamuestras Capilares Premium Monolith NT.115 (MO-K025) Nanotemper technologies Cubreobjetos de microscopio de alta precisión (0107242) Marienfeld Tubos de

reacciónTubos MProtein LoBind (0030108094) Eppendorf

Columna Columna de cromatografía Poly-Prep Bio-Rad

3. Tampones

Nombre Composición

PL1 Tris-HCl 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM

PL2 Tris-HCl 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM, glicerol al 50 %

PL3 Tris-HCl 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM, imidazol 500 mM, glicerol al 5 %

Tampón de formación

de imágenesTris-HCl 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM, plurónico al 0,1 %

Holo Tris-HCl 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM, plurónico al 0,1 %, maltosa 2 mM

Apo Tris-HCl 50 mM pH 7,4, KCl 50 mM, plurónico al 0,1 %

III. Métodos

1. Moléculas y mareaje

Las proteínas MalE y SBD marcadas con His se marcaron con colorante Alexa 546 (fluoróforo donante; D) y Alexa 647 (fluoróforo aceptor; A), respectivamente, utilizando química de maleimida. En resumen, se incubaron aproximadamente 100 ng de proteína, 49 j l de tampón PL1 y 1 j l de DTT (1 M) en hielo durante 30 a 60 minutos para reducir las cisteínas. Una columna de cromatografía Bio-Rad Poly-Prep se lavó dos veces con agua milliQ, seguido de la colocación de 160 j l de resina Ni Sepharose 6 Fast Flow en la membrana de la columna. El etanol contenido en la resina se lavó con dos volúmenes de columna (VC) de agua milliQ. Posteriormente, la resina se equilibró con dos VC de tampón PL1. Quedó aproximadamente 1 ml de tampón en la columna antes de que se añadieran las proteínas a la columna y se fijaran con la resina, seguido de una etapa de lavado para eliminar el DTT restante con dos VC de tampón PL1. Quedaron aproximadamente 0,5 ml de tampón en la columna. Para la preparación del colorante, se diluyeron 25 nmol de Alexa 647 y 80 nmol de Alexa 546 en 5 j l de DMSO para el marcaje de A y D, y para el marcaje de solo A y solo D, se diluyeron 25 nmol del colorante respectivo en 5 j l de DMSO. La mezcla de colorantes respectiva se añadió a las proteínas en la columna y se mezcló pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. La columna se selló con parafilm y se incubó durante la noche a 4 °C. Los colorantes restantes se eliminaron mediante una etapa de lavado utilizando un VC de PL1 seguido de dos VC de tampón PL2. Las proteínas marcadas se eluyeron con 500 j l de tampón PL3, se recogieron en un tubo de ensayo de baja unión y se purificaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño para eliminar el imidazol, el glicerol y los fluoróforos restantes.

Por lo tanto, para una proteína respectiva se obtuvieron proteínas marcadas solo con A, proteínas marcadas solo con D y proteínas marcadas con A y D; también denominadas en lo sucesivo como proteínas marcadas con A, proteínas marcadas con D y proteínas marcadas con AD respectivas.

2.smFRET

2.1 Manipulación de las muestras

Las proteínas marcadas se diluyeron en tampón de formación de imágenes hasta una concentración final de 200 pM (solución madre). El portaobjetos se estabilizó durante 2 minutos con 100 |jl de BSA 1 mg/ml en tampón PBS y los restos se desecharon posteriormente con una pipeta. La solución madre de proteína se mezcló 1:1 con el tampón Holo o Apo seguido de la colocación de una gota de 100 j l en el portaobjetos estabilizado.

2.2Adquisición de datos

Las submuestras se midieron en modo de excitación láser (ALEX, del ingléslaser excitation)de manera alterna utilizando un microscopio confocal con una duración de 50 js por fuente de luz. Las fuentes de luz fueron láseres o.c. de 532 y 640 nm con una potencia de láser establecida en 60 mW y 25 mW, respectivamente, para asegurar una estequiometría S de aproximadamente 0,5. Se registraron tres trazados de tiempo de intensidad(Fda, Fdd,yFaa). 2.3 Búsqueda en ráfagas

El programa informático ALEX-suite comprende dos algoritmos de búsqueda de ráfagas para el análisis de la FRET. Se utilizó el algoritmo All Photon Burst Search (APBS) para calcular las eficacias de la FRET y S de proteínas marcadas solo con D y solo con A (Eggelinget al.,1998, PN<a>S, 95(4):1556-1561). Esto permitió la determinación de los coeficientes de fuga y de excitación directa. De manera adicional, se utilizó el algoritmo Dual Channel Burst Search (DCBS) para calcular las eficacias de la FRET para proteínas marcadas con AD mediante la aplicación de los respectivos factores de corrección determinados (Niret al.,2006, J PHYS CHEM B, 110(44):22103-22124). También se utilizó el algoritmo DCBS para la estimación de los factores de corrección<y>.

2.4 Corrección de fondo

La corrección de fondo se realizó de acuerdo con Hohlbeinet al.,(2014; Chemical Society Reviews, 43(4): 1156-1171). En resumen, las intensidades de fondo se estimaron mediante el cálculo de la tasa media de recuento paraFda, FddyFaa,respectivamente, si el recuento total de fotones era inferior a 10 recuentos por ms. Esta tasa de recuento media se multiplicó por la longitud de cada ráfaga y el resultado se restó de la señal.

2.5Coeficientes de fuga y de excitación directa

Los coeficientes de fuga y de excitación directa se determinaron de acuerdo con Hohlbeinet al.(2014; CHEM SOC REV, 43(4):1156-1171) mediante la aplicación de un umbral para las proteínas marcadas solo con D y solo con A. Para las proteínas marcadas solo con D, el umbral se fijó en S >0,95 y para solo con A, E >0,85 y S <0,2. Se ajustó una curva gaussiana unidimensional sobre las proteínas marcadas solo con D y solo con A. Mediante la estimación del máximo de cada curva gaussiana (j), se estimaron los coeficientes de fuga y de excitación directa de la siguiente manera: factor de corrección = jI(1-|j ).Fdase corrigió como se describió anteriormente para obtenerFdacgí.

2.6 Factor de corrección y

Se utilizaron S y el máximo deE(de mediciones apo y holo) para determinar los respectivos factores de corrección<y>. Por consiguiente, las mediciones de apo y holo se corrigieron para tener en cuenta los efectos de fondo y de interferencia. A continuación, mediante el trazado de 1/S contraEa partir de ambas mediciones y el ajuste de una función lineal entre las mediciones, se obtuvieron la pendiente ( ! ) y la intersección (O). El factor de corrección<y>se calculó posteriormente como<y>= (Q-1)/(Q+I-1), y despuésEapse calculó como se describió anteriormente.

3. eFRET

3.1 Manipulación de las muestras

Las proteínas marcadas se diluyeron en tampón de formación de imágenes hasta una concentración final de 100 nM (solución madre). La solución madre de proteínas y el tampón Apo se mezclaron en una relación 1:1 y se mezclaron mediante pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Los capilares Premium Monolith se llenaron con la mezcla y se colocaron en la bandeja del dispositivo eFRET ocupando las posiciones 1 a 8. En cuanto al tampón Holo, se aplica lo mismo, excepto que se ocupan las posiciones 9 a 16.

3.2 Adquisición de datos

Las muestras se midieron en un modo de excitación alterna en un dispositivo de eFRET. Las fuentes de luz se proporcionaron mediante LED ajustados a 15 mA para el LED verde y 3,5 mA para el LED rojo. La exploración capilar se llevó a cabo utilizandoFddmediante la exploración de cada capilar para su posición x y z. La posición respectiva con la mayor fluorescencia en ambos ejes se guardó para la medición. El tiempo de medición de cada capilar se fijó para que durara 2 segundos con una tasa de muestreo de 4.000 puntos de datos por segundo. El ciclo de excitación alterna se fijó en 25 ms para cada fuente de luz con un período de descanso intermedio de 1 ms. Se registraron las tres intensidades de fluorescencia:Fda, FddyFaa.En este punto, los primeros 10 ms y los últimos 5 ms de las respectivas señales registradas se excluyeron para garantizar una señal estable. Los 400 puntos de datos provenientes de la respectiva señal restante de 10 ms se promediaron y se almacenaron paraFda, FddyFaa,respectivamente.

3.3 Corrección de fondo

La intensidad de la señal de fondo se estimó mediante la medición de solo el tampón de formación de imágenes. No se realizó una exploración capilar ya que esto podría haber afectado la estimación de las coordenadas capilares. Por consiguiente, se utilizaron las posiciones de las mediciones anteriores de la eFRET. Las señales de fondo medidas obtenidas paraFda, Fdd,yFaase almacenaron para cada capilar y posteriormente se restaron de las respectivas mediciones de la FRET.

3.4 Coeficientes de fuga y de excitación directa

El coeficiente de fugacfse estimó mediante la medición de las respectivas proteínas marcadas con D. Después de una exploración capilar, las señales obtenidas paraFda, FddyFaa,respectivamente, se almacenaron para cada capilar. Después de la corrección de fondo, se calculó elcfpara cada capilar como se describe anteriormente.

El coeficiente de excitación directacEdirse estimó mediante la medición de las respectivas proteínas marcadas con A. No se realizó ninguna exploración capilar ya que esto se hizo automáticamente utilizandoFdd.Se utilizaron posiciones guardadas de mediciones anteriores (es decir, la medición respectiva utilizada para la estimación decf).Después de la corrección de fondo y de fugas, se calculócEdirpara cada capilar como se describe anteriormente.

3.5 Factor de corrección y

El factor de correcciónyse determinó como se describió anteriormente utilizando señales corregidas para efectos de fondo y de interferencia respectivos. Se aplicó una etapa de normalización, en dondeFdayFddcgíse dividieron por FAAcor capilarmente para obtener señalesFDAnormy FDDcornormpara apo y holo (capilares 1 a 8 y 9 a 16, respectivamente), que después se promediaron, seguido del cálculo de los deltas.

3.6 Relación de Eap

Eapy las relaciones deEapse determinaron como se ha descrito anteriormente.Eapse calculó utilizando el factor de correcciónyno normalizado o el factor de correcciónynormalizado, en donde esto último dio como resultadoEapnormy una respectiva relación deEapnorm.

3.7 Valoración solo de D

Se realizó una valoración en dos etapas utilizando proteínas marcadas con D. Se utilizaron tres recipientes, de los cuales el primero contenía proteína marcada solo con D diluida en tampón de formación de imágenes a una concentración de 100 nM. A partir de ahí, se tomó una muestra y se mezcló en el segundo recipiente con tampón de formación de imágenes en una relación 1:1, lo que dio como resultado una concentración total de 50 nM. Esta etapa se repitió para el tercer recipiente dando como resultado una concentración final de 25 nM. A continuación, se mezcló el contenido respectivo de los tres recipientes en una relación de 1:1 con proteínas marcadas con DA 100 nM, lo que dio como resultado una concentración de proteína final de 200 nM para el primer recipiente; 150 nM para el segundo recipiente y 125 para el tercer recipiente. A continuación, todas las concentraciones de proteína obtenidas se igualaron mediante dilución hasta una concentración de proteína final de 100 nM. A modo de comparación, se utilizó un cuarto recipiente que contenía 100 nM de proteína marcada con DA. El contenido respectivo de estos cuatro recipientes se denomina en lo sucesivo también solución madre de proteína respectiva (véase anteriormente).

4. Conversión de datos de smFRET en datos de eFRET

El resultado de las mediciones de la smFRET consistió en una enumeración de ráfagas registradas con su respectiva metainformación, tales comoEy valores de S, longitud de ráfaga y recuentos de fotones detectados para F<da>,FddyFaa,respectivamente. La conversión de datos de smFRET en datos de eFRET se realizó mediante la eliminación de la información que no estaba presente en las mediciones de la eFRET, tales como valores S, longitudes de ráfaga, etc... Por lo tanto, la información restante en los datos de eFRET era información deFda, FddyFaa.Como las mediciones de la eFRET no pueden distinguir acontecimientos de ráfaga única, se añadieron todos los recuentos de fotones de cada ráfaga detectada paraFda, FddyFaa,respectivamente. Por tanto,Ey los valores S de las ráfagas detectadas se eliminaron y la señal de fluorescencia respectiva se dividió enFda, FddyFaa,respectivamente.

IV. Resultados y análisis

Una pluralidad de experimentos mostró que las correcciones de la presente invención funcionan y proporcionan resultados fiables. En particular, en determinados ejemplos (1) una muestra doblemente marcada, (2) una muestra marcada solo con donante y (3) una muestra marcada solo con aceptor se midieron en una configuración de molécula única de última generación (smFRET). Mediante la suma de las intensidades medidas en la configuración de una sola molécula, los datos del conjunto podrían simularse. Con ese dato, los factores de corrección específicos para esta configuración (potencia de excitación, conjuntos de filtros, alineación óptica) podrían calcularse, mientras que, al mismo tiempo, se utilizó exactamente el mismo conjunto de datos para analizar los datos de molécula única de última generación.

Por ejemplo, la relación de eficacia de la transferencia de energía del dominio de unión a sustrato 2-1 deLactococcus lactis(SBD2-1) con y sin ligando se midió en 1,445 con smFRET exacta y 1,438 usando la canalización de datos de la presente invención con exactamente los mismos datos resumidos (véase, por ejemplo, la figura 4). La diferencia es inferior al 0,5 % y se puede atribuir al ruido y a los efectos del blanqueamiento, que es más común en una configuración con una potencia de láser elevada, tal como una configuración smFRET, que en una configuración construida para medir la fluorescencia del conjunto. La aparición de blanqueamiento durante el tiempo de difusión de moléculas individuales a través del punto láser confocal se muestra como una línea recta entre los acontecimientos FRET (Figura 4A, dos histogramas E-S más a la derecha, en el centro) y los acontecimientos solo de donantes (los mismos gráficos, esquina superior izquierda). En particular, En la figura 4 se muestra lo siguiente:

(A): Datos de una sola molécula en la vista muy común del histograma S-E. En esta vista, la eficacia de la transferencia de energía está en el eje de abscisas y la estequiometría se representa en el eje de ordenadas.

En (B) y (C), los datos se añadieron para producir grupos de intensidad de diferentes filtros, que después se pueden pasar a través de la misma canalización de datos que los datos de conjunto.

En (D) se muestran los histogramas de la eficacia de la FRET de los datos que se muestran en (A), con las líneas rojas punteadas que representan la media de la distribución.

Además, se midieron tres proteínas diferentes (SBD2-1, MalE-50 y MalE47) en una configuración de eFRET de demostración funcional que recopila conjuntos de datos completos de muchas muestras en segundos o minutos. Las soluciones con y sin ligando se colocaron en capilares de vidrio que se iluminaron con LED de luz verde y roja. La luz de emisión se dividió mediante un espejo dicromático y se registró usando dos detectores (véase, por ejemplo, 2B). La relación de transferencia de energía se cuantificó utilizando el conjunto completo de correcciones indicadas anteriormente y se comparó con el resultado de la smFRET. Los datos se desviaron entre un 4 % y un 6 % en comparación con la smFRET. Esto está en el intervalo en el que difieren las configuraciones de la smFRET de última generación (con una mayor eficacia de transferencia de energía que se correlaciona con las desviaciones estándar más bajas; véase, por ejemplo, Doi: 10.1038/s41592-018-0085-0).

Medición de conjunto

in li n n li n R l i n in li n n li n R l i n

Tabla 1

En la tabla 1 se muestra la comparación de las eficacias de la FRET de una sola molécula (smFRET) con mediciones de conjunto (eFRET o quantumFRET) utilizando las correcciones que forman parte de la presente invención. Si bien las eficacias aparentes de la transferencia de energía difieren bastante debido a la presencia de proteínas marcadas solo con donantes, la relación de eficacias está muy bien dentro de la precisión de las mediciones smFRET, mientras que se tarda solo unos segundos en comparación con 1 a 2 h para los datos de una sola molécula.

Experimentos adicionales demuestran que el método de la presente invención conduce a relaciones de eficacia de la transferencia de energía sólidas, independiente de la eficacia de marcaje y las contribuciones potenciales de la biomolécula marcada solo con donante, algo que otros métodos de conjunto no abordan. En particular, se utilizaron dos construcciones de proteínas previamente caracterizadas MalE47 y MalE50 y se añadieron cantidades variables de proteínas marcadas solo con donante a una muestra (ya incompleta) doblemente marcada. Si bien las eficacias energéticas corregidas cambiaron drásticamente con una relación decreciente cda/(cda cd) hasta la mitad de su valor original (corregido por fondo, interferencia (fugas y excitación directa) y brillo(y))(Figura 11), se demostró que larelaciónde la eficacia de la transferencia de energía permanece constante y, por lo tanto, es una medida cuantitativa que no depende de la eficacia del marcaje (Figura 12). La variación entre las mediciones fue mínima y potencialmente más baja que las mediciones de la smFRET.

En particular, en la figura 11 se ilustra las eficacias de la transferencia de energía corregidas que están influenciadas por la cantidad de proteína marcada solo con donante para MalE47 (grupo superior) y MalE50 (grupo inferior). Ambas proteínas son proteínas de unión a maltosa con mutaciones específicas. Apo representa las proteínas sin maltosa, es decir, en una configuración vacía, mientras que holo representa las proteínas unidas a maltosa. Como se esperaba, las eficacias aparentes de la transferencia de energía disminuyen aproximadamente a la mitad a medida que la relación de proteína marcada correctamente se reduce a la mitad (comparación de la muestra pura con una dilución 1:1).

En la figura 12 se muestran las relaciones de la eficacia energética, que son independientes de la cantidad de moléculas marcadas solo con donantes presentes para MalE47 (grupo izquierdo) y MalE50 (grupo derecho). Estas relaciones son los mismos datos que se muestran en la figura 10

1. Validación experimental de los factores de corrección de eFRET utilizando smFRET

1.1 Coeficiente de fuga cf

Los datos obtenidos de las mediciones de la smFRET se convirtieron en datos de eFRET. Los datos de smFRET y eFRET se corrigieron en segundo plano restando las respectivas señales de fondo. Elcfobtenido tuvo un valor medio de 0,067 para eFRET (nueva figura 4-2 A, gráfico izquierdo), y un valor medio de 0,059 para smFRET (Figura 4-2A, gráfico central izquierdo).

Para smFRET, los valores decffueron comparables con 0,0651 para las proteínas marcadas con DA, 0,0618 para las proteínas marcadas con A, 0,0601 para las proteínas marcadas con D y 0,0619 para el fondo. Por lo tanto, elcfobtenido de las proteínas marcadas con D se eligió como el coeficiente de fuga que se utilizará en lo sucesivo (es decir, también para las proteínas marcadas con A) debido a su alta densidad de señal en comparación con el fondo, su precisión en comparación con los datos de smFRET y los resultados comparables obtenidos para los diferentes valores decf.

1.2 Coeficiente de excitación directa cEdir

ElcEdirse obtuvo utilizando un gráfico Channel-S(ChS). Para mediciones de fondo y marcadas solo con A, se detectó una señal paraFddque contribuyó a la fuga observada paraFda.Por consiguiente, la fuente de la señal enFdaparece ser una mezcla de excitación directa y fuga. En comparación, el gráfico ChS para proteínas marcadas solo con D no mostró ninguna mezcla de señales. Por consiguiente, La determinación delcEdirdebe comprender una corrección por fuga. Por lo tanto, el cálculo corregido delcEdirse utilizó como se describió anteriormente. Esto dio como resultado una desviación delcEdirdel 3 % con respecto alcEdirreal(dir_real,nueva figura 4A, gráfico medio izquierdo e izquierdo) y, por lo tanto, una diferencia entre los dos coeficientes estimados como en el caso de los valores delcfdescritos en la sección anterior.

1.3 Factor de corrección y

El factor de correcciónyse obtuvo en función de las mediciones de las proteínas marcadas con DA en su respectiva configuración abierta y cerrada corregidas por fuga y excitación directa. En general, la obtención del factor de correcciónybasado en las diferencias entreFDAcoryFDDcorpuede verse muy afectado por las diferencias en la concentración exacta de proteína entre las mediciones de apo y holo. Por tanto, para disminuir los efectos potenciales de las diferencias de concentración, se realizó una etapa de normalización. Por consiguiente,FDDcoryFDAcorse dividieron porFaa,ya queFaano registró ningún acontecimiento FRET y, por lo tanto, fue aparentemente un buen indicador de dichas diferencias de concentración.

Los factores de correcciónyobtenidos para smFRET y eFRET presentaron una diferencia comparable de aproximadamente un 27 %. No se observó ninguna mejora significativa en los factores de correccióny(gamma*; mejora del 0,3 %; nueva figura 4 B) tras la aplicación de los factores de corrección obtenidos a partir de smFRET a los datos de eFRET. Por lo tanto, la variación observada no se vio afectada significativamente por las diferencias en los factores de corrección de interferencia utilizados en los enfoques smFRET y eFRET.

1.4 Relación de Eap

Se utilizaron ambos factores de correcciónypara determinar laEapde la configuración abierta y cerrada, respectivamente. Los valores resultantes fueron aproximadamente una quinta parte de los respectivos valores deEapde la smFRET. Las relaciones deEapobtenidas revelaron una diferencia de aproximadamente un 3 % entre los enfoques smFRET y eFRET (nueva figura 4C).

De manera adicional, se comprobó la influencia de los diferentes factores de corrección y. Por lo tanto, se utilizaron los factores de correcciónyobtenidos a partir de smFRET para determinar las relaciones deEapde eFRET (relación de E*; nueva figura 4C). Sin embargo, la relación de E* no mostró una mejora significativa en comparación con la relación deEapa partir de eFRET, lo que apoya la solidez del enfoque de la eFRET divulgado en el presente documento.

1.5 Discusión

Los resultados obtenidos con el enfoque de la eFRET mostraron una variación comparable a la de la smFRET. Sin embargo, las diferencias en el factor de correcciónyentre réplicas en smFRET fueron considerables. Esto podría deberse, por ejemplo, a las dos razones siguientes. En primer lugar, la smFRET utiliza un enfoque basado en máximos deEy S obtenidos a partir de mediciones apo y holo, que es sensible incluso a cambios mínimos de señal. De manera adicional, los máximos de la FRET medidos no tenían forma gaussiana, que podría haber afectado aún más la determinación del factor de corrección y. En segundo lugar, la smFRET necesita una solución picomolar de una proteína dada. Por lo tanto, la smFRET puede verse fácilmente afectada por el ruido de fondo. En cambio, las mediciones de la eFRET necesitan una concentración de proteína más elevada, por ejemplo, nanomolar, y, por lo tanto, cualquier contribución de fondo es menos predominante y comparativamente fácil de estimar utilizando, por ejemplo, una muestra de agua - un enfoque que no se puede utilizar en el caso de la smFRET.

2.Adquisición y procesamiento de los datos de eFRET

2.1 Datos brutos

Los datos brutos respaldaron el comportamiento esperado de las proteínas: SBD2-1 y MalE50 se diseñaron para mostrar un aumento en sus respectivasEapde la configuración abierta a la cerrada (Figura 3). Esto se reflejó en una pérdida deFdd,una ganancia deFda,y, por tanto, un aumento enEap.En cambio, MalE47 se diseñó para presentar una disminución enEapde la configuración abierta a la cerrada. De manera correspondiente, se observó una ganancia deFdd,una pérdida deFday, por lo tanto, una pérdida enEap.De nuevo,Faapodría utilizarse como control de calidad ya que las señales registradas no mostraron una diferencia significativa entre las mediciones apo y holo. Cabe destacar que, SBD2-1 fue la única excepción que mostró una diferencia significativa enFaaentre las mediciones apo y holo. Sin embargo, dicha diferencia de señal disminuyó una vez calculada laEap.Esta observación fue apoyada por elevados factores Z, que fueron 0,97 para SBD2-1, 0,925 para MalE50 y 0,89 para MalE47.

2.2Factores de corrección de fondo y de interferencia

Las etapas de corrección de interferencia y de fondo se realizaron capilarmente para tener en cuenta los patrones de señal específicos de la posición capilar y/o las diferencias de concentración.

MalE50 y SBD2-1 revelaron uncfligeramente diferente entre las dos configuraciones en contraste con MalE47. Por lo tanto, un factor de corrección dependiente de la configuración parecía ser ventajoso, es decir, apo se corrige con el respectivo factor de corrección de apo y holo se corrige con el respectivo factor de corrección de holo.

MalE47 mostró una diferencia significativa decEdirentre las dos configuraciones, mientras que los resultados obtenidos para SBD2-1 fueron ambiguos. Sin embargo, MalE50 no mostró una diferencia significativa decEdirentre apo y holo. En conjunto, las diferencias en los coeficientes de fuga y de excitación directa fueron inferiores al 0,5 % y no deberían afectar significativamente a la corrección deFda.

2.3 Corrección y normalización de Fdd y Fda

La determinación del factor de correcciónynecesita unaFddcorregida por fondo, así como unaFdacorregida por interferencia y efectos de fondo. En la figura 7 se muestran los valores brutos detectados paraFda, Fddy F<aa>.Fdano normalizada tuvo una varianza reducida en comparación conFdaobtenida en la conversión de datos smFRET (Figura 5) debido a las correcciones de fondo y de interferencia aplicadas (Figura 8). Por otro lado,Fddcgítodavía mostró una variación notable entre las réplicas después de la corrección de fondo (véase, por ejemplo, la medición de MalE50, en donde la variación para apo es mucho mayor que para holo). Se podría esperar que los factores de correcciónyresultantes fueran significativamente diferentes entre las réplicas debido a laFddcgínecesaria para su determinación. Sin embargo, aunque dicha diferencia de señal fue compensada parcialmente después de la etapa de normalización deFaacgí,todavía mostró una variación considerable en comparación con laFdanormalizada ya que solo se aplicó una etapa de corrección de fondo aFddcgí.

Por lo tanto, una corrección de varias etapas aplicada aFdaes muy ventajosa en comparación con una corrección de una sola etapa solo para la corrección de fondo.

2.4 Relaciones exactas de la eficacia de la FRET

Los factores de correcciónyse calcularon utilizandoFddcgíyFdano normalizadas y normalizadas, y se comparó su contribución aEapy las relaciones deEap.

Los factores de correcciónydeFdayFddno normalizadas mostraron una mayor diferencia entre réplicas en comparación con los factores de correcciónydeFdayFddnormalizadas (Figura 9). Por consiguiente, tambiénEapno normalizada mostró una mayor diferencia entre réplicas, mientras queEapobtenida en la conversión de datos smFRET no mostró una diferencia significativa entre réplicas (Figura 5).

FdayFddnormalizadas no mostraron una variación significativa entre réplicas, lo que dio como resultado factores de correcciónycomprables (Figura 8), aunque afectando aEap.Sin embargo, estas diferencias aparentemente solo tuvieron un impacto menor en la determinación de las relaciones deEap.Por ejemplo, MalE47 que tenía la mayor variación entre sus valores deEapnormalizados presentó las relaciones deEapcon solo aproximadamente un 0,2 % de diferencia entre réplicas. También las relaciones deEapnormalizadas de SBD2-1 y MalE47 tenían solo aproximadamente un 0,2 % y un 0,1 % de diferencia entre réplicas, respectivamente.

De manera importante, las relaciones deEapnormalizadas eran comparables a las relaciones deEapobtenidas con la smFRET con diferencias entre aproximadamente un 6%, un 4% y un 4% para SBD2-1, MalE47 y MalE50, respectivamente, que está en el mismo intervalo en el que difieren los resultados de diferentes laboratorios de la smFRET cuando miden exactamente la misma muestra.

3 Validación de la solidez de las mediciones de la eFRET

Como la determinación de las eficacias de la FRET depende de las moléculas marcadas solo con D de la muestra de FRET, se utilizó una valoración de solo D para determinar el impacto en los factores de correcciónyy laEapy las relaciones deEapresultantes.

Los valores deEapobtenidos aumentaron a medida que disminuyó la concentración de la proteína marcada solo con D (Figura 10). Esto no se observó en el caso de laEapno normalizada ya que la determinación del factor de correcciónYpuede ser sensible a las diferencias en las concentraciones. Sin embargo, laEapnormalizada aumentó a medida que disminuía la concentración de la proteína marcada solo con D debido a los factores de correcciónynormalizados comparables (por ejemplo, error del 16 % para MalE47 y del 18 % para MalE50). En comparación, los factores de correcciónyno normalizados tuvieron un error de hasta un 80 %.

De manera importante, las relaciones deEapnormalizadas obtenidas fueron comparables con los valores que tenían un error inferior al 1 % para MalE50 y al 0,8 % para MalE47, por ejemplo. Por tanto, las relaciones deEapnormalizadas fueron coherentes y reproducibles. Sin embargo, las relaciones deEapde la eFRET tenían un error coherente en comparación con las relaciones deEapde la smFRET de aproximadamente un 5 %. Este error no se debió a las proteínas marcadas solo con D, ya que el experimento de valoración con solo D reveló relaciones deEapsimilares, aunque todavía con un error comparable del 5 %. En cambio, dicho error podría tener su origen en componentes del equipo informático del dispositivo y/o efectos biofísicos no considerados, tales como el blanqueamiento de fluoróforos.

Se pueden distinguir dos casos de uso para las interacciones proteína-proteína: (1) interacciones proteína-proteína de origen natural para las cuales se desea un inhibidor, (2) interacciones de origen no natural o que solo ocurren débilmente que deben fortalecerse o crearsede novo,por ejemplo, a través de PROTAC. En ambos casos, eFRET y Ereal se pueden utilizar para la caracterización. Con la capacidad de mitigar los efectos de fondo, fuga y excitación directa, así como el brillo desigual del fluoróforo (<y>), Ereal está sujeto a un ruido significativamente menor que otros métodos FRET de conjunto tal como alphaScreen. También se ha demostrado que diferentes PROTAC unen proteínas de forma más flexible (las proteínas no están en estrecho contacto) o más estrechamente (el PROTAC fortalece los enlaces en la superficie de la proteína). Se espera que dichas diferencias se muestren en diferentes valore de Ereal.

V. Conclusión

La eFRET exacta, como se demuestra en el presente documento, representa un enfoque sólido para medir la configuración inter e intraproteica y se puede utilizar para la detección de alto rendimiento para identificar nuevos fármacos candidatos y/o para caracterizar los cambios conformacionales de una proteína en diferentes condiciones, tal como en presencia de un ligando.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un métodoin vitropara obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de una molécula utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET), comprendiendo el método las etapas de:

- proporcionar una muestra donante, en donde dicha muestra donante comprende al menos un donante y/o copias de dicha molécula marcadas con donante;

- proporcionar una muestra aceptora que comprende al menos un aceptor y/o copias de dicha molécula marcadas con aceptor; y

- proporcionar al menos una muestra marcada con donante-aceptor que comprende copias de dicha molécula marcadas con donante-aceptor;

- realizar una medición de la eFRET para la muestra marcada con donante-aceptor en una primera condición y una segunda condición para obtener para estas muestras un primer resultado de la eFRET en la primera condición y un segundo resultado de la eFRET en la segunda condición, en donde las mediciones de la eFRET de la muestra marcada con donante-aceptor se realizan utilizando múltiples copias de la molécula respectiva;

- realizar al menos una medición de la eFRET para la muestra donante en al menos una condición para obtener para esta muestra un primer resultado de la eFRET y calcular un coeficiente de fuga(cf)de dicha muestra donante, - realizar al menos una medición de la eFRET para la muestra aceptora en al menos una condición para obtener para esta muestra un primer resultado de la eFRET y calcular un coeficiente de excitación directa(cEdir),en donde el primer y/o el segundo resultado de la eFRET comprenden valores de medición respectivos de la - emisión del aceptor después de la excitación del donante (Fda(A)),

- emisión del aceptor después de la excitación del aceptor (Faa(A)) y/o

- emisión del donante después de la excitación del donante (Fdd(D)),

- emisión del donante después de la excitación del aceptor (Fda(D))

en donde dicho coeficiente de fuga(cf)se determina en función de la relación de Fda(D) y Fdd(D), y dicho coeficiente de excitación directa(cEdir)se determina en función de la relación de Fda(A) y Faa(A),

- corregir los resultados de la eFRET marcados con donante-aceptor en función del coeficiente de fuga(cf)y el coeficiente de excitación directa(cEdir);

- calcular un factor de correcciónybasado en la(s) muestra(s) marcada(s) con donante-aceptor, en donde el factor de correcciónyse basa en la relación negativa de i) la diferencia deFdaentre la primera y la segunda condición y ii) la diferencia deFddde la muestra marcada con donante-aceptor entre la primera y la segunda condición; - determinar las eficacias de la eFRET específicas de la condición en función de los resultados de la eFRET marcados con donante-receptor corregidos y mediante el uso del factor de corrección y; y

- determinar información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de la molécula en la primera y la segunda condición utilizando las eficacias de la eFRET específicas de la condición.

2. Un métodoin vitropara obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor entre una primera molécula y una segunda molécula utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET), comprendiendo el método las etapas de:

- proporcionar una muestra donante, en donde dicha muestra donante comprende al menos un donante y/o copias de dicha primera molécula marcadas con donante;

- proporcionar una muestra aceptora que comprende al menos un aceptor y/o copias de dicha segunda molécula marcadas con aceptor; y

- proporcionar al menos una muestra marcada con donante-aceptor que comprende copias de dicha primera molécula marcadas con donante y copias de dicha segunda molécula marcadas con aceptor;

- realizar una medición de la eFRET para la muestra marcada con donante-aceptor en una primera condición y una segunda condición para obtener para estas muestras un primer resultado de la eFRET en la primera condición y un segundo resultado de la eFRET en la segunda condición, en donde las mediciones de la eFRET de la muestra marcada con donante-aceptor se realizan utilizando múltiples copias de la molécula respectiva;

- realizar al menos una medición de la eFRET para la muestra donante en al menos una condición para obtener para esta muestra un primer resultado de la eFRET y calcular un coeficiente de fuga(cf)de dicha muestra donante; - realizar al menos una medición de la eFRET para la muestra aceptora en al menos una condición para obtener para esta muestra un primer resultado de la eFRET y calcular un coeficiente de excitación directa(cEdir);

en donde el primer y/o el segundo resultado de la eFRET comprenden valores de medición respectivos de la - emisión del aceptor después de la excitación del donante (F<da>(A)),

- emisión del aceptor después de la excitación del aceptor (F<aa>(A)) y/o

- emisión del donante después de la excitación del donante (Fdd(D)),

- emisión del donante después de la excitación del aceptor (F<da>(D))

en donde dicho coeficiente de fuga(cf)se determina en función de la relación de Fda(D) y Fdd(D); y dicho coeficiente de excitación directa(cEdir)se determina en función de la relación de F<da>(A) y F<aa>(A);

- corregir los resultados de la eFRET marcados con donante-aceptor en función del coeficiente de fuga(cf)y el coeficiente de excitación directa(cEdir);

- calcular un factor de correcciónybasado en la(s) muestra(s) marcada(s) con donante-aceptor, en donde el factor de correcciónyse basa en la relación negativa de i) la diferencia deFdaentre la primera y la segunda condición y ii) la diferencia deFddde la muestra marcada con donante-aceptor entre la primera y la segunda condición; - determinar las eficacias de la eFRET específicas de la condición en función de los resultados de la eFRET marcados con donante-receptor corregidos y mediante el uso del factor de correccióny;y

- determinar información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de la primera y segunda molécula en la primera y la segunda condición utilizando las eficacias de la eFRET específicas de la condición.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la etapa de proporcionar al menos la muestra donante, la muestra aceptora y la muestra marcada con donante-aceptor comprende las etapas de:

- proporcionar al menos una primera, una segunda y una tercera muestra que comprenden múltiples copias de la molécula cada una,

- marcar copias de la molécula comprendidas en la primera muestra con el donante;

- marcar copias de la molécula comprendidas en la segunda muestra con el aceptor; y

- marcar copias de la molécula comprendidas en la tercera muestra con el donante y el aceptor,

en donde el donante es preferentemente un fluoróforo y en donde el aceptor es preferentemente un fluoróforo.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el donante tiene un espectro de emisión de fluorescencia y el aceptor un espectro de excitación, y en donde el espectro de emisión de fluorescencia del donante se solapa con el espectro de excitación del aceptor.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la etapa de realizar una medición de la eFRET para dichas muestras en la primera y/o la segunda condición comprende para cada medición de la eFRET las etapas de:

- transmitir luz con una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante, preferentemente de una fuente de luz cuasimonocromática, preferentemente un LED, a la muestra respectiva para excitar al donante, y - transmitir luz con una longitud de onda dentro del espectro de excitación del aceptor, preferentemente de una fuente de luz cuasimonocromática, preferentemente un LED, a la muestra respectiva para excitar al aceptor.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la luz se transmite a la muestra respectiva en al menos un ciclo de iluminación, preferentemente de 1 a 1000 ciclos de iluminación, en donde un ciclo de iluminación tiene preferentemente al menos 1 impulso de luz, preferentemente 2 impulsos de luz o incluso más entre 10 ms y 1 s, preferentemente impulsos de luz con luz que tiene alternativamente una longitud de onda dentro del espectro de excitación del donante y del aceptor, respectivamente, en donde la emisión medida del aceptor y del donante se promedia preferentemente a lo largo de los ciclos de iluminación.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

en donde dichasFdayFddpara determinar el coeficiente de fuga(cf)se obtienen para la muestra donante en la condición respectiva, y/o

en donde dichasFdayFaapara determinar el coeficiente de excitación directa(cEdir)se obtienen para la muestra aceptora en la condición respectiva.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la primera y la segunda condición difieren entre sí

i) por la presencia de una molécula adicional en una de las dos condiciones, en donde la molécula adicional preferentemente interactúa con la molécula, y/o

ii) en al menos un, preferentemente uno, parámetro seleccionado del grupo que consiste en temperatura, pH, contenido de sal, composición del tampón, la adición de caótropos, excipientes, temperatura y fuerza iónica.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el método comprende además las etapas de:

- determinar factores de corrección específicos de la condición utilizando el primer y segundo resultado de la eFRET respectivos en la primera y segunda condición,

- corregir el primer y segundo resultado de la eFRET utilizando los respectivos factores de corrección específicos de la condición,

- determinar un factor de corrección entre condiciones utilizando el primer y el segundo resultado de la eFRET corregidos específicos de la condición, y

- corregir el primer y segundo resultado de la eFRET corregidos específicos de la condición utilizando el factor de corrección entre condiciones.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la etapa de determinar los factores de corrección específicos de la condición utilizando el primer y segundo resultado de la eFRET respectivos comprende las etapas de:

- determinar un coeficiente de fugaCfespecífico de la condición y/o

- determinar un coeficiente de excitación directaCEdirespecífico de la condición.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde la etapa de corregir los resultados primero y segundo de la eFRET comprende la etapa de:

determinar unaFdacorregida(FDAcor)para la muestra marcada con donante-aceptor restando de laFdalaFddescalada por elCfyFaaescalada por elCEdr,en donde dichasFda, FddyFaa semiden para la muestra marcada con donante-aceptor en la condición respectiva.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la etapa de determinar un factor de corrección entre condiciones utilizando los resultados primero y segundo de la eFRET corregidos comprende la etapa de:

determinar el factor de correcciónybasado en la relación negativa de i) la diferencia deFdacgíentre la primera y la segunda condición y ii) la diferencia deFddde la muestra marcada con donante-aceptor entre la primera y la segunda condición.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la etapa de determinar las eficacias de la eFRET en función del primer y segundo resultado de la eFRET corregidos respectivamente comprende las etapas de:

- determinar laFddcorregida poryrespectiva para la muestra marcada con donante-aceptor en la condición respectiva, y

- determinar las eficacias de la eFRET en función de la relación de i) laFdacgírespectiva y ii) la suma de laFdacgírespectiva y laFddcorregida poryrespectiva.

14. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la etapa de determinar la información cuantitativa de los cambios de distancia promedio entre donante-aceptor comprende la etapa de:

obtener información de un radio de Forster específico del donante-aceptor,Ro,y de una distancia donante-receptor, r, en la primera o la segunda condición.

15. Un sistema de medición que comprende un controlador adaptado para obtener información cuantitativa de la distancia promedio donante-aceptor o de los cambios en la distancia promedio donante-aceptor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicho sistema de medición comprende:

- medios para acomodar recipientes, preferentemente una placa de micropocillos o capilares, en donde un recipiente comprende una muestra donante, una muestra aceptora o una muestra marcada con donante-aceptor;

- al menos una fuente de luz, preferentemente una fuente de luz cuasimonocromática, preferentemente un LED; - al menos un detector de luz, preferentemente un TFM o FMSi;

- preferentemente un filtro, un espejo dicroico, un espejo policromado y/o una lente objetivo;

- medios para realizar una medición de la eFRET utilizando múltiples copias de la molécula respectivas al menos en la muestra marcada con donante-aceptor; y

- medios de control adaptados para

controlar los medios para acomodar el recipiente;

controlar la al menos una fuente de luz para transmitir luz desde la fuente de luz al recipiente;

controlar el al menos un detector de luz para detectar señales del recipiente; y

controlar dichos medios para realizar la medición de la eFRET.

16. Uso de un sistema de medición de acuerdo con la reivindicación 15 para obtener información cuantitativa de los cambios promedio de la distancia donante-aceptor dentro de una molécula utilizando la transferencia de energía por resonancia de Forster de conjunto (eFRET) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

17. Un programa informático en combinación con un sistema de medición de acuerdo con la reivindicación 15, comprendiendo dicho programa informático instrucciones que, cuando el programa es ejecutado por un ordenador, hacen que el sistema de medición lleve a cabo el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

18. Un soporte de datos legible por ordenador que comprende instrucciones que, cuando se ejecutan por un ordenador del sistema de medición de acuerdo con la reivindicación 15, hacen que el ordenador y el sistema de medición lleven a cabo el método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.