ES2965201T3 - Uso de ácidos biliares y sales biliares como agentes antibacterianos para la inhibición de la conjugación bacteriana y la transferencia horizontal de genes - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para inhibir la conjugación bacteriana, la transferencia horizontal de genes bacterianos o el crecimiento bacteriano. Los métodos comprenden poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido biliar o una sal biliar, donde la cantidad eficaz no afecta la viabilidad de las bacterias. También se describe un método para aumentar la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos, así como métodos para descontaminar un alojamiento para animales de granja o una superficie médica y métodos para tratar el agua. También se describen composiciones eficaces para inhibir la conjugación bacteriana, la transferencia horizontal de genes bacterianos y el crecimiento bacteriano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de ácidos biliares y sales biliares como agentes antibacterianos para la inhibición de la conjugación bacteriana y la transferencia horizontal de genes

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a ácidos y sales biliares o composiciones que los comprenden y, más particularmente, al uso de los mismos para la inhibición de la conjugación bacteriana o la transferencia horizontal de genes bacterianos, y además para la interrupción de la adquisición de resistencia a los antibióticos.

La resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos es uno de los retos más difíciles de la medicina moderna. En septiembre de 2013, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) emitieron un informe de amenazas, nombrando infecciones conClostridium diffícile, Enterobacteriaceaeresistentes a antibióticos carbapenémicos (CRE) yNeisseria gonorrhoeaeresistentes a los fármacos entre los problemas médicos más urgentes (Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2013: Centers for Disease Control and Prevention, 16 de septiembre, 2013).

La tasa inicial de resistencia bacteriana a los nuevos fármacos suele ser de aproximadamente 1%. Sin embargo, el uso moderno de antibióticos ha provocado un aumento masivo en el número de bacterias resistentes. Los estudios muestran que entre 8 y 12 años después de su uso ubicuo, las cepas resistentes a múltiples fármacos se generalizan. Las cepas resistentes a múltiples fármacos de algunas bacterias han alcanzado tal proporción que prácticamente no hay antibióticos disponibles para el tratamiento y su fenotipo natural es resistente a múltiples fármacos [Nathan C., Nature (2004) 431 (7011): 899-902].

Si bien los patógenos se han vuelto multirresistentes o extremadamente resistentes a los fármacos, las compañías farmacéuticas están reduciendo drásticamente sus programas de descubrimiento de fármacos, lo que tiene graves consecuencias para la salud pública y falta de una terapia antibiótica adecuada [Perry J.A. et al., Current Opinion in Microbiology (2014) 21: 45-50]. Hoy en día, está claro que combatir el problema requiere una comprensión de los principios y factores biológicos que conducen a la evolución, divergencia y propagación de los genes de resistencia a los agentes antimicrobianos (AMR).

Varios mecanismos bacterianos han evolucionado para adquirir resistencia a los antibióticos. Estos mecanismos implican la modificación del material genético existente o la adquisición de material genético nuevo de otra fuente. El mecanismo principal es la adquisición de genes AMR mediante conjugación bacteriana mediante transferencia de plásmidos. Este es un proceso mediante el cual el material genético se transfiere de una célula donante a una célula receptora. La transferencia de estos genes conjugativos requiere maquinaria sofisticada que garantice la movilización del ADN y la formación de parejas de apareamiento. Estos genes pueden estar codificados por un plásmido replicante autónomo o por elementos conjugativos integrativos (ICE) insertados en el cromosoma de la bacteria. La conjugación en bacterias gramnegativas está mediada por la transferencia de plásmidos conjugativos a través de una estructura tubular diseñada (un pilus, que representa un subconjunto de la familia del sistema de secreción tipo cuatro) desde una bacteria donante a una célula receptora que puede ser una especie pariente lejano [Cabezon E. et al., FEMS Microbiology Reviews (2015) 39(1): 81-95].

La resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos también es un problema importante en entornos agrícolas, tales como las granjas lecheras, avícolas y de pavos. En los animales de granja, los agentes antimicrobianos se utilizan para la terapia y prevención de infecciones bacterianas, así como para promover el crecimiento. Las infecciones bacterianas en las aves de corral incluyenEscherichia coli (E. coli), Salmonella entérica (S. entérica), Enterococcus faecalisasí como otros patógenos. El control de estas infecciones es imperativo ya que S.enterica,por ejemplo, puede colonizar el tracto intestinal de un pollo sin causar necesariamente síntomas obvios de enfermedad en el pollo. Sin embargo, las bacterias (incluidas las cepas resistentes) pueden invadir otros tejidos de los pollos y finalmente llegar al tracto reproductivo y a los ovarios, lo que conduce a la puesta de huevos contaminados. Asimismo, en el momento del sacrificio, las cepas bacterianas del intestino, tales comoE. coliySalmonella,ensucian fácilmente los cadáveres de las aves de corral y, como resultado, las carnes de aves de corral pueden contaminarse con bacterias, incluidas cepas bacterianas resistentes [van der Bogaard, J. Antimicrob. Chemother. (2001) 47(6): 763-771]. La terapia con antibióticos aumenta significativamente el riesgo de generar cepas bacterianas resistentes tanto en seres humanos como en animales.

Las sales biliares, los principales componentes de la bilis, son sustancias biológicas parecidas a detergentes que se sintetizan en el hígado a partir del colesterol. Las sales biliares se almacenan en la vesícula biliar y se liberan al duodeno durante la digestión para realizar su función fisiológica, es decir, la solubilización de las grasas provenientes de la dieta. Las sales biliares también poseen una fuerte actividad antimicrobiana, ya que pueden desorganizar la estructura de la membrana celular así como provocar daños en el ADN. Por tanto, las bacterias que inhiben el tracto intestinal tienen que tener mecanismos intrínsecos de resistencia para hacer frente a las sales biliares. Así, las bacterias intestinales, tales comoLactobacillusyBifídobacterium,muestran una variedad de proteínas dedicadas al drenaje de sales biliares o protones, para modificar el metabolismo del azúcar o para prevenir el plegamiento incorrecto de las proteínas [Ruiz et al., Frontiers in Microbiology (2013) Volumen 4: 396]. Otros enteropatógenos muy ubicuos comoE. coli, ShigellaySalmonellason resistentes a la bilis.

De acuerdo a Kishinaka et al. [Steroids, (1994) 59(8):485-9], la exposición deClostridium perfringens,una bacteria grampositiva formadora de esporas que se encuentra en la carne y en la carne de ave cruda, así como en los intestinos de seres humanos y animales, a concentraciones variables de ácido quenodesoxicólico conjugado con taurina o glicina exhibe una viabilidad bacteriana significativamente reducida.

J.D. Anderson: Journal of Medicinal Microbiology, Vol.8(1), 1975: 83-88, describe sales biliares, es decir, taurocolato de sodio o glicocolato de sodio, para inhibir la conjugación bacteriana e inhibir la transferencia de resistencia a los antibióticos entre poblaciones de cepas deE. colidonantes y receptoras. En particular, enseña que un 0,5% p/v de glicocolato de sodio inhibe la conjugación y la transferencia del factor R enE. coliy enfatiza que las soluciones de glicocolato de sodio eran sólo moderadamente inhibidoras a esta concentración.

Sumario de la invención

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la conjugación bacteriana, método que comprende poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de las bacterias, inhibiendo así la conjugación bacteriana.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la transferencia horizontal de genes bacterianos, método que comprende poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de las bacterias, inhibiendo de este modo la transferencia horizontal de genes bacterianos.

Según un aspecto no reivindicado de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona un método para inhibir el crecimiento bacteriano, método que comprende poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de las bacterias, inhibiendo así el crecimiento bacteriano.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método in vitro para aumentar la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos, método que comprende poner en contacto las bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde las bacterias son resistentes al ácido o a la sal biliar, aumentando así la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos.

Según un aspecto no reivindicado de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un agente antimicrobiano envasado por separado de un ácido o una sal biliar.

Según un aspecto no reivindicado de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona un artículo de fabricación que comprende un desinfectante envasado por separado de un ácido o una sal biliar.

Según un aspecto no reivindicado de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona una composición que comprende un desinfectante y un ácido o una sal biliar.

Según un aspecto no reivindicado de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona una composición que comprende un agente antimicrobiano y un ácido o una sal biliar.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la adhesión de bacterias a una superficie, método que comprende aplicar la composición de algunas realizaciones de la invención a una superficie que tiene las bacterias.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la formación de una biopelícula, método que comprende aplicar la composición de algunas realizaciones de la invención a una superficie que tiene la biopelícula.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para descontaminar un alojamiento para animales de granja, método que comprende aplicar la composición de algunas realizaciones de la invención a una superficie en el alojamiento para animales de granja.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para descontaminar una superficie médica que tiene una biopelícula, método que comprende aplicar la composición de algunas realizaciones de la invención a la superficie médica que tiene la biopelícula.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para tratar agua que tiene una biopelícula, método que comprende aplicar la composición de algunas realizaciones de la invención al agua que tiene la biopelícula.

Según un aspecto no reivindicado de algunas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona un método para analizar la disminución de la frecuencia de conjugación de bacterias, método que comprende: (a) poner en contacto una bacteria resistente al ácido o sal biliar con un ácido o sal biliar; (b) incubar las bacterias de la etapa (a) con otras bacterias; y (c) medir la frecuencia de conjugación entre las bacterias de la etapa (a) y las otras bacterias, en donde la disminución de la frecuencia de conjugación se determina cuando se mide una frecuencia de conjugación más baja en comparación con la frecuencia de conjugación en ausencia del ácido biliar.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias son resistentes a los ácidos o a las sales biliares.

Según algunas realizaciones de la invención, la cantidad eficaz o afecta a la viabilidad de las bacterias. Según algunas realizaciones de la invención, la cantidad eficaz inhibe la conjugación bacteriana.

Según algunas realizaciones de la invención, la cantidad eficaz inhibe la transferencia horizontal de genes bacterianos. Según algunas realizaciones de la invención, la cantidad eficaz inhibe el crecimiento bacteriano.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias son resistentes a los antibióticos.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias son bacterias gramnegativas.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias son bacterias enteropatógenas.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias son bacterias comensales o patógenas para seres humanos o animales.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias se seleccionan del grupo que consiste enSalmonella, Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella, Shigella, Clostridium difficile, Enterococcus faecalis, Helicobacter, Listeria monocytogenesyCampilobacter.

Según algunas realizaciones de la divulgación, el agente antimicrobiano es un antibiótico.

Según algunas realizaciones de la divulgación, el desinfectante se selecciona del grupo que consiste en un compuesto fenólico, yodo o un yodóforo, cloro, un compuesto de amonio cuaternario, un compuesto oxidante y un desinfectante basado en alcohol.

Según algunas realizaciones de la invención, el ácido biliar se selecciona entre ácido glicocólico o una sal del mismo. Según algunas realizaciones de la invención, la composición se formula como un líquido, un aerosol, un gel o un polvo. Según algunas realizaciones de la invención, la composición de algunas realizaciones de la invención se utiliza para inhibir la conjugación bacteriana.

Según algunas realizaciones de la invención, la composición de algunas realizaciones de la invención se utiliza para aumentar la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos.

Según algunas realizaciones de la invención, el animal de granja se selecciona del grupo que consiste en un pollo, un pavo, una vaca, un cerdo, un caballo, una oveja y una cabra.

Según algunas realizaciones de la invención, el animal de granja es un animal criado para la industria alimentaria. Según algunas realizaciones de la invención, la superficie comprende al menos una de entre una jaula, un cajón, un suelo, una pared, un techo, un estante, una tela, un dispositivo de ordeño o una superficie para yacer.

Según algunas realizaciones de la invención, la superficie médica se selecciona del grupo que consiste en un endoscopio, un catéter, un filtro, una grapa quirúrgica, un marcapasos, un stent y un dispositivo implantable.

Según algunas realizaciones de la invención, la superficie comprende bacterias resistentes al ácido o a la sal biliar. Según algunas realizaciones de la invención, el agua se selecciona del grupo que consiste en agua residual, agua de piscina, agua potable, agua dulce, agua de mar y salmuera.

Según algunas realizaciones de la invención, el agua residual se encuentra en una planta de tratamiento de aguas residuales.

Según algunas realizaciones de la invención, las otras bacterias comprenden bacterias de la misma o diferente especie con respecto a las bacterias resistentes al ácido o a la sal biliar.

Según algunas realizaciones de la invención, las bacterias son resistentes a los antibióticos.

Según la invención, el ácido biliar es ácido glicocólico o una sal del mismo.

A menos que se defina lo contrario, todas las expresiones y los términos técnicos y/o científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o prueba de las realizaciones de la invención se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

La FIG. 1 representa que el plásmido pESI confiere un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) a tetraciclina, sulfametoxazol y trimetoprima. Experimentos de apareamiento entre la cepa J5-3 deE. colisin plásmido y la cepa S.Infantis119944. Crecimiento bacteriano del donante (S.Infantis119944), receptor (E.coliJ5-3 resistente a rifampicina) y dos aislados transconjugantes seleccionados al azar cultivados en placas LB bajo diferentes selecciones. Se utilizó desoxicolato de xilosa lisina (XLD) para distinguir entre el donante de salmonella (aparece como colonias negras) y E.coli(aparece como colonias amarillas). La cepa receptora E.coliJ5-3 alberga resistencia cromosómica a la rifampicina y, por lo tanto, los transconjugantes que adquirieron el plásmido se volverán resistentes a la rifampicina y a los otros tres antibióticos (tetraciclina, sulfametoxazol y trimetoprima codificados en el plásmido).

La FIG. 2 es un gráfico que representa que la conjugación de pESI está reprimida por la bilis. La frecuencia de conjugación (transconjugantes obtenidos/unidades formadoras de colonias [UFC] del donante) entre S.Infantis119944 (donante) yE. coliORN172 (receptor) se determinó en concentraciones crecientes de sales biliares. Las barras muestran la media y el error estándar de la media (SEM) de cuatro experimentos de apareamiento independientes. Se implementó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con el ensayo de comparación múltiple de Dunnett para determinar la significación estadística. *, P< 0,001; *, P< 0,0001.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra que la conjugación bacteriana es reprimida por la bilis. La frecuencia de conjugación (transconjugantes obtenidos/UFC del donante) entreE. colique alberga pRL27 y pN3 (donante) yE. coliJ5-3 (receptor) se determinó en LB y en presencia de 4% de sales biliares. Las barras muestran la media y el error estándar de la media (SEM) de cuatro experimentos de apareamiento independientes.

La FIG. 4 es un gráfico que representa que las composiciones de ácido cólico y ácido litocólico al 2% sin y con taurina reducen significativamente la conjugación bacteriana. La frecuencia de conjugación entre S.Infantis119944 yE. coliORN172 se determinó en placas de agar LB suplementadas con 2% (p/v) de taurina, ácido litocólico, ácido cólico, ácido litocólico taurina y ácido cólico taurina. Las barras muestran la media y el SEM de cuatro experimentos de apareamiento independientes. Es de destacar que una composición de 2% de ácido litocólico y taurina previene la conjugación bacteriana.

La FIG. 5 es un gráfico que representa que la conjugación bacteriana se reprime por una composición de taurina y ácido litocólico. La frecuencia de conjugación entreE. colique alberga pRP4, pRK2, pN3, pCVM y pRL27 (donante) yE. coliJ5-3 u ORN172 (receptor) se determinó en LB y en presencia de una composición que comprende 0,5, 1 ó 2% de taurina y ácido litocólico.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a ácidos y sales biliares o composiciones que los comprenden y, más particularmente, al uso de los mismos para la inhibición de la conjugación bacteriana o la transferencia horizontal de genes bacterianos, y además para la interrupción de la adquisición de resistencia a los antibióticos.

Los principios y el funcionamiento de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los dibujos y las descripciones adjuntas.

Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención tiene que entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles establecidos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención es susceptible de otras realizaciones o de practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras. Además, tiene que entenderse que la fraseología y terminología empleadas en el presente documento tienen fines de descripción y no deben considerarse limitantes.

La escasez de nuevos fármacos antimicrobianos y la rápida propagación de la resistencia a los agentes antimicrobianos entre patógenos bacterianos conducen a la evolución de cepas multirresistentes, lo que ejerce una presión cada vez mayor sobre el sistema de atención médica. Aunque el mercado de fármacos antibacterianos supera los 25 mil millones de dólares de EE.UU. al año, las compañías farmacéuticas han reducido drásticamente sus programas de descubrimiento de fármacos, lo que ha tenido graves consecuencias para la salud pública y una falta de terapia antibiótica adecuada [Perry JA, et al. (2014) supra].

Por tanto, la resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos es un reto importante en la medicina moderna. Varios mecanismos bacterianos han evolucionado para adquirir resistencia. Estos incluyen la modificación del material genético existente y la adquisición de nuevo material genético de otra fuente. El mecanismo principal es la adquisición de genes de resistencia a los agentes antimicrobianos (AMR) mediante conjugación bacteriana vía transferencia de plásmidos. La conjugación implica la transferencia de material genético (p. ej., ADN) a través del pilus sexual y requiere contacto de célula con célula. En consecuencia, los fragmentos de ADN que contienen genes de AMR de donantes bacterianos resistentes pueden transferirse a bacterias susceptibles y hacer que bacterias previamente vulnerables expresen resistencia codificada por estos genes de AMR recién adquiridos. Por tanto, la búsqueda de inhibidores específicos de la conjugación es de especial interés en la lucha contra las superbacterias y la aparición de bacterias multirresistentes.

Al llevar la presente invención a la práctica, sorprendentemente los presentes inventores han descubierto que para inhibir la conjugación de bacterias pueden usarse ácidos y sales biliares. Específicamente, los presentes inventores han descubierto que la frecuencia de conjugación, pero no la viabilidad bacteriana, entreSalmonella entérica(p. ej. S.Infantis119944) y E.coli(p. ej., E.coliORN172) fue inhibida drásticamente por la bilis de una manera dependiente de la dosis (Figura 2). Además, los presentes inventores descubrieron que el ácido cólico así como el ácido litocólico causaron una disminución significativa de la frecuencia de conjugación (Figura 4). Además, la adición de taurina a estos ácidos biliares, y especialmente al ácido litocólico, provocó una disminución adicional de la frecuencia de conjugación, llevando la frecuencia de conjugación a casi cero (Figura 4). Es importante destacar que el efecto inhibidor de la bilis sobre la frecuencia de conjunción bacteriana no se limitó a pESI (Figura 2) y también se demostró para pRL27 y pN3 (Figura 3), así como para pRP4, pRK2, pN3, pCVM y pRL27 (Figura 5). En conjunto, los presentes inventores descubrieron una nueva composición que puede interferir con el proceso de conjugación bacteriana y con la transferencia horizontal de genes bacterianos y, por lo tanto, puede usarse para disminuir la propagación de genes de AMR entre bacterias. Esta composición puede ser beneficiosa en aplicaciones terapéuticas y de prevención en lugares que incluyen clínicas, hospitales, infraestructuras alimentarias y agrícolas (incluidas granjas de animales), así como en entornos acuáticos, tales como plantas de tratamiento de aguas residuales, para combatir la propagación de bacterias resistentes y otros patógenos.

Así, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la conjugación bacteriana, método que comprende poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de las bacterias, inhibiendo así la conjugación bacteriana.

Según otro aspecto, se proporciona un método in vitro para inhibir la transferencia horizontal de genes bacterianos, método que comprende poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de las bacterias, inhibiendo de este modo la transferencia horizontal de genes bacterianos.

Según un aspecto no reivindicado, se proporciona un método para inhibir el crecimiento bacteriano, método que comprende poner en contacto las bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de las bacterias, inhibiendo de ese modo el crecimiento bacteriano.

Según una realización, el término "ácido biliar" se refiere a cualquier ácido biliar natural (p. ej., un ácido biliar de origen animal o de origen microbiano), ácido biliar sintetizado químicamente, ácido biliar preparado usando fitosterol o materiales de partida microbianos, o derivados de los mismos. Los ácidos biliares ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido hiodesoxicólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido 7-alfa-deshidroxilato quenodesoxicólico, ácido dihidroxitaurínico y ácido trihidroxitaurínico.

Según la invención, el ácido biliar comprende ácido glicocólico.

El término "sal biliar" se refiere a sales de ácidos biliares así como a derivados conjugados de ácidos biliares.

Según una realización, la sal biliar incluye un catión seleccionado del grupo que consiste en sodio (Na<+>), potasio (K<+>), litio (Li<+>), magnesio (Mg<2+>), calcio (Ca<2+>), bario (Ba<2+>), estroncio (Sr<2+>) y amonio (NH<4+>).

Los términos "conjugado" o "conjugación" se refieren a la conjugación química (y es distinta del proceso de conjugación biológica que se describe a continuación) para la formación de un enlace covalente. La conjugación de un ácido biliar es catalizada mediante una reacción enzimática que convierte el ácido biliar en un tioéster de acil-CoA y luego transfiere el resto de ácido biliar del tioéster de acil-CoA a glicina o taurina para formar el conjugado de ácido biliar respectivo. Estas adiciones aumentan sustancialmente la acidez de las moléculas y su solubilidad en agua.

Según una realización, el término sal biliar incluye ácidos biliares (p. ej., ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido litocólico, ácido taurocólico, ácido glicocólico) conjugados con un aminoácido (por ejemplo, glicina o taurina).

Según la invención, la sal biliar es glicocolato.

Según un aspecto no reivindicado, la sal biliar incluye ácido litocólico conjugado con glicina o taurina: glicina-ácido litocólico y taurina-ácido litocólico, respectivamente, o un derivado de los mismos.

La síntesis de ácidos biliares o sus sales se puede llevar a cabo utilizando cualquier método conocido en la técnica, tales como los descritos en la Patente Europea No. EP 2407475 y la Patente de EE. UU. No. 5.079.240.

Se apreciará que cualquier referencia a un ácido biliar utilizado en el presente documento incluye una referencia a un compuesto idéntico preparado de forma natural o sintética.

Además, cualquier referencia a un "ácido biliar" o "sal biliar" como se usa en el presente documento incluye la referencia a un ácido/sal biliar, o una mezcla de dos ácidos/sales biliares, tres ácidos/sales biliares, cuatro ácidos/sales biliares o más (es decir, al menos un ácido o una sal biliar). Además, tiene que entenderse que cualquier referencia plural a "ácidos biliares" o "sales biliares" tal como se usan en el presente documento incluye la referencia a uno o más de dichos componentes.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz" se refieren a una dosis suficiente para inhibir la conjugación bacteriana, la transferencia de genes bacterianos o el crecimiento bacteriano. Esto puede variar según el tipo de bacterias objetivo y la superficie en la que residen. Un experto en la técnica puede determinar una cantidad eficaz, especialmente en vista de la divulgación proporcionada a continuación.

Según una realización, la cantidad eficaz no afecta a la viabilidad (es decir, la capacidad de vivir) de las bacterias. La viabilidad bacteriana se puede determinar usando cualquier método conocido en la técnica, tal como, pero no limitados a, tinción de viabilidad celular y BacLight™ (como se trata en Stiefel P et al., BMC Microbiol. (2015) 15:36.

Según una realización, la cantidad eficaz no es tóxica. Por lo tanto, según una realización específica, el ácido o la sal biliar (o la composición que los comprende como se trata más adelante) de la invención se proporciona en una cantidad eficaz que no es dañina ni venenosa (p. ej., no causa la muerte de un organismo). La determinación de que un agente no es tóxico se puede realizar siguiendo las regulaciones del FSA Food Code 2009: Annex 3 - Public Health Reasons/Administrative Guidelines - Chapter 7, Poisonous or Toxic Materials.

La expresión "crecimiento bacteriano", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un aumento en el número o un aumento de la masa bacteriana durante un período de tiempo predeterminado.

Según una realización específica, la inhibición del crecimiento bacteriano según los presentes métodos se refiere al crecimiento de bacterias que son resistentes a los ácidos biliares y/o son una variante resistente a fármacos (p. ej., resistentes a antibióticos como se trata en detalle más adelante).

La expresión "conjugación bacteriana" como se usa en el presente documento se refiere a la transferencia directa de material genético entre al menos dos células bacterianas (también denominada conjugación biológica en contraposición a la conjugación química descrita anteriormente). Normalmente, la conjugación bacteriana requiere el contacto de célula con célula. Las bacterias pueden ser de la misma especie o de especies diferentes.

Según una realización, la conjugación bacteriana permite la transferencia de material genético de célula a célula (p. ej., mediante plásmido o elemento integrativo y conjugativo (ICE)), así como de factores bacterianos adicionales, p. ej., moléculas pequeñas tales como las proteínas citoplasmáticas.

La expresión "transferencia horizontal de genes bacterianos" como se usa en el presente documento se refiere a la transferencia directa de material genético entre al menos dos células bacterianas, en donde la transferencia genética no se realiza mediante transmisión vertical (es decir, no es la transmisión de ADN de un padre a su descendencia). La transferencia horizontal de genes normalmente se efectúa mediante contacto de célula con célula (p. ej., mediante conjugación bacteriana). Sin embargo, la transferencia horizontal de genes puede no implicar contacto de célula con célula y puede verse afectada por transformación o transducción.

Normalmente, la transferencia de material genético (p. ej., ADN) entre bacterias se realiza mediante contacto directo de célula con célula o mediante una conexión tipo puente entre dos células bacterianas. En general, una estructura de pilus de la célula donante se une a una célula receptora uniendo las dos células y permitiendo la transferencia de material genético (p. ej., un plásmido o ICE) desde la célula donante a una célula receptora. Una vez que una célula bacteriana adquiere el material genético, se convierte en un donante viable y puede transferir el material genético a otras células receptoras. El material genético transferido suele ser beneficioso para las bacterias receptoras; dicho beneficio puede incluir, por ejemplo, resistencia a los antibióticos, tolerancia a los xenobióticos o la capacidad de utilizar nuevos metabolitos. La conjugación es la ruta central por la cual los genes de resistencia a los antibióticos y otros factores de virulencia se propagan en las bacterias. Esto conduce al desarrollo de variantes resistentes a múltiples fármacos y a la patogenicidad de cepas previamente inocuas.

Como se mencionó, la transferencia de material genético (p. ej., ADN) entre bacterias puede verse afectada por transformación en la que el material genético pasa a través del medio intermedio y es absorbido por la bacteria receptora. Alternativamente, la transferencia de material genético (p. ej., ADN) entre bacterias puede realizarse mediante transducción en la que se inyecta ADN extraño en las bacterias receptoras, por ejemplo, mediante un virus bacteriófago.

Como se usa en el presente documento, el término "inhibir" se refiere a prevenir, detener o reducir la aparición de conjugación bacteriana, transferencia horizontal de genes bacterianos o crecimiento bacteriano.

Según una realización, la inhibición de la conjugación bacteriana es al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con bacterias no tratadas por el ácido o la sal biliar de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que para evaluar la inhibición de la conjugación bacteriana se pueden usar diversas metodologías y ensayos.

Según una realización, la evaluación de la inhibición de la conjugación bacteriana se lleva a cabo evaluando la frecuencia de conjugación, p. ej., calculando la relación entre las UFC transconjugantes obtenidas y el número de donantes bacterianos que se usaron en el ensayo de conjugación (como se describe con más detalle a continuación y en la sección de Ejemplos que sigue).

Según una realización, la inhibición de la transferencia genética horizontal bacteriana es de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con bacterias no tratadas con el ácido o la sal biliar de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que para evaluar la inhibición de la transferencia horizontal de genes bacterianos se pueden usar diversas metodologías y ensayos.

Según una realización, la evaluación de la inhibición de la transferencia horizontal de genes bacterianos se lleva a cabo, p. ej., mediante PCR, transferencia Southern, métodos de composición de secuencias o por métodos de homología. Se enseñan métodos adicionales en Mándoiu et al., ISBRA 2008, LNBI 4983, págs. 26-37, 2008.

Según una realización, la inhibición del crecimiento bacteriano es al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con las bacterias no tratadas por el ácido o la sal biliar de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar la inhibición del crecimiento bacteriano.

Según una realización, la evaluación de la inhibición del crecimiento bacteriano se lleva a cabo, p. ej., contando directamente el número de células, la masa celular o el número de colonias (p. ej., usando un microscopio, citometría de flujo), o midiendo la turbidez o la absorción de nutrientes.

Según una realización, la inhibición de la conjugación bacteriana o la transferencia horizontal de genes bloquea la transferencia genética entre bacterias, incluida la transferencia de, por ejemplo, genes resistentes a antibióticos (p. ej.tetA, ampC),factores de adhesión (p. ej., grupos de fimbrias), factores de invasión (p. ej., sistema de secreción tipo 3), toxinas (p. ej., stx), genes metabólicos (p. ej., genesmalutilizados para el metabolismo de la maltosa), factores de virulencia (p. ej.ybt)y tolerancia a genes de estrés ambiental (p. ej. genesmer).

Según una realización, la inhibición de la conjugación bacteriana o la transferencia horizontal de genes bloquea la transferencia genética entre bacterias, incluida la adquisición de genes de resistencia a antibióticos [p. ej. aquellos que codifican resistencia a múltiples fármacos (MDR) a, por ejemplo, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT); plactamasas(bla,TEM, CTX-M-3); tetraciclina (teta), sulfametoxazol (suri); trimetoprima(dfrA),peroxidasa de hidrógeno (qacEA1), mercurio (mer), etc.].

Según una realización, la inhibición de la conjugación bacteriana bloquea la transferencia genética entre bacterias, incluida la transferencia de plásmidos. Los plásmidos ejemplares que transfieren material genético (p. ej., genes de resistencia a antibióticos (<a>R<g>)) entre bacterias incluyen, pero no se limitan a, pESI, pRL27, pN3, pRP4, pRK2, pN3, pCVM y pRL27.

El término "bacteria", tal como se utiliza en el presente documento, generalmente se refiere a un género de microorganismos procarióticos clasificados científicamente como tales. La mayoría de las bacterias se pueden clasificar como bacterias grampositivas o gramnegativas.

Las bacterias grampositivas se relacionan con bacterias unidas por una sola unidad de membrana lipídica y contienen una capa gruesa (20-80 nm) de peptidoglicano, que retiene la tinción violeta cristal en una técnica de tinción de Gram. Las bacterias grampositivas ejemplares incluyen, pero no se limitan a,Actinomices israelli, Bacillusespecies,Bacillus antracis, Clostridium, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus, Erysipelothrix rhusiopathiae, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Staphylococcus,yStreptococcus.

Las bacterias gramnegativas se refieren a bacterias unidas por una membrana citoplasmática y una membrana celular externa, que contiene solo una fina capa de peptidoglicano entre las dos membranas, la cual no puede retener la tinción violeta cristal en una técnica de tinción de Gram. Las bacterias gramnegativas ejemplares incluyen, pero no se limitan a,Aerobacter, Aeromonas, Acinetobacter, Agrobacterium, Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Calymmatobacterium, Campylobacter, Citrobacter, Chlamydia, Chlamydophila, Enterobacter, Enterobacter aerogenes, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella, Haemophilus, Hafnia, Helicobacter, Klebsiella, Klebsiella pneumoniae, Legionella, Leptospira, Morganella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Pasteurella multocida, Plesiomonas, Prevotella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Porphyromonas, Rickettsia, Salmonella, Serratia, Shigella, Stentorophomonas, Streptobacillus, Streptobacillus moniliformis, Treponema, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Xanthomonas, Veillonella, VibrioyYersinia.

Según una realización, las bacterias son resistentes a los ácidos o a las sales biliares (es decir, no son matadas por los ácidos o las sales biliares; normalmente dichas bacterias adquieren genes de resistencia a la bilis). Normalmente, las bacterias que residen en el tracto gastrointestinal (p. ej., en la vesícula biliar, los conductos biliares, el intestino delgado, el intestino grueso y el hígado), donde las concentraciones de bilis son altas, exhiben resistencia a los ácidos/sales biliares.

Según una realización, las bacterias son bacterias entéricas (es decir, bacterias que se encuentran normalmente en el intestino de los animales). Las bacterias entéricas ejemplares incluyen, pero no se limitan a,Salmonella, Shigella, Vibrio, Campylobacter Proteus, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Pseudomonas, Klebsiella, Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptidococcus, Peptostreptococcus, EscherichiayBifidobacteria.

Las bacterias según la presente invención pueden incluir bacterias comensales o patógenas que causan infecciones en seres humanos o animales, ambas de las cuales pueden adquirir resistencia a los antibióticos.

Según una realización, las bacterias son bacterias patógenas.

Según otra realización, las bacterias son bacterias enteropatógenas. Las bacterias enteropatógenas ejemplares incluyen, pero no se limitan a,Salmonella enterica(p. ej. S.Typhiy S.Typhimurium), Shigella (S. flexneriy S.disenteriae), Vibrio cholerae/parahaemolyticus, Escherichia(p. ej.E. coli,p. ej.E. coli0157:H7),Campylobacter jejuni, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Klebsiellaspp.,Proteosspp.,Clostridium difficile, Bacillus cereusyHelicobacter pylori.

Según una realización, las bacterias son resistentes a un tratamiento antimicrobiano, tal como a un antibiótico. Los antibióticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, penicilina, ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, minociclina, doxiciclina, vancomicina, bacitracina, kanamicina, neomicina, gentamicina, eritromicina, espectinomicina, zeomicina, estreptomicina, fluoroquinolonas y cefalosporinas. Ejemplos de cefalosporinas incluyen cefalotina, cefapirina, cefazolina, cefalexina, cefradina, cefadroxilo, cefamandol, cefoxitina, cefaclor, cefuroxima, cefonicida, ceforanida, cefotaxima, moxalactama, ceftrizoxima, ceftriaxona, cefoperazona.

Según otra realización, las bacterias son resistentes a múltiples tratamientos antimicrobianos (es decir, resistentes a múltiples fármacos (MDR)).

Al inhibir la conjugación bacteriana y/o la transferencia horizontal de genes, el ácido o la sal biliar de algunas realizaciones de la invención se pueden usar para reducir la propagación de genes de resistencia a antibióticos y factores de virulencia entre bacterias mediante, p. ej., la propagación de genes de resistencia a antibióticos y factores de virulencia entre bacterias mediante, p. ej., conjugación y, en consecuencia, aumentan la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento.

Así, según otro aspecto de la invención, se proporciona un método in vitro para aumentar la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos, método que comprende poner en contacto las bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde las bacterias son resistentes al ácido o a la sal biliar, aumentando así la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos.

Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "que aumenta la susceptibilidad de las bacterias" se refiere a bacterias que son más susceptibles a un tratamiento con antibióticos en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con las bacterias no tratadas con el ácido o la sal biliar de la invención.

Las bacterias que son más susceptibles al tratamiento exhibirán una menor viabilidad tras el tratamiento con antibióticos. Los métodos para determinar el crecimiento de bacterias son bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, el crecimiento de una especie o cepa bacteriana diana puede determinarse mediante el crecimiento en un cultivo, tal como un cultivo líquido. En este sentido, a medida que las bacterias se multiplican y aumentan en número, aumenta la densidad óptica del cultivo líquido (debido a la presencia de un número cada vez mayor de células bacterianas). Por tanto, un aumento de la densidad óptica indica crecimiento bacteriano, mientras que una disminución de la densidad óptica indica una disminución del crecimiento bacteriano. Por ejemplo, la densidad óptica (p. ej., a 600 nm) se puede determinar dentro de los pocilios de una placa de múltiples pocilios (p. ej., una placa de 96 pocilios) utilizando un lector de placas automatizado.

Como se usa en el presente documento, la expresión "poner en contacto" se refiere a la colocación del ácido o la sal biliar (o composiciones que comprenden los mismos como se trata a continuación) de la presente invención de manera que estén en contacto directo o indirecto con las células bacterianas de tal manera que el ácido o la sal biliar es capaz de inhibir o prevenir la conjugación bacteriana. Por tanto, la presente invención contempla aplicar el ácido o la sal biliar de la presente invención a una superficie deseable (p. ej., una en la que puedan crecer células bacterianas) y/o directamente a las células bacterianas (p. ej., a una superficie en la que se han ejemplificado células bacterianas).

El contacto del ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) con una superficie se puede efectuar usando cualquier método conocido en la técnica que incluyen pulverizar, extender, humedecer, inmersión, inmersión breve, pintar o adherir. Las composiciones de la presente invención se pueden unir como monocapas o capas múltiples.

El contacto de las bacterias con ácidos o sales biliares se puede realizar en cualquier superficie en la que se propaguen las bacterias.

Las bacterias pueden vivir y proliferar como células individuales en el medio ambiente (p. ej., en superficies) o pueden crecer como comunidades multicelulares muy organizadas encerradas en una matriz polimérica de autoproducida en estrecha asociación con superficies e interfaces, denominadas biopelículas. Las biopelículas son una preocupación importante en muchas industrias, incluidas la agricultura, la alimentación, la farmacéutica, la medicina y la bioingeniería, y causan, entre una amplia gama de efectos negativos, infecciones microbianas.

Las biopelículas se adhieren tanto a superficies vivas como no vivas y pueden ser heterogéneas (es decir, compuestas por múltiples especies de microorganismos) o pueden estar compuestas por un solo tipo de organismo. Las biopelículas son muy difíciles de eliminar ya que los microbios que crecen en su interior están muy organizados y pueden resistir ambientes hostiles, tales como altas temperaturas y agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos).

En los seres humanos, las biopelículas son una causa de infecciones sistémicas (p. ej., infecciones nosocomiales) y son una preocupación importante cuando se introducen productos en el cuerpo (p. ej., lentes de contacto, catéteres venosos centrales, válvulas cardíacas mecánicas y marcapasos).

En entornos agrícolas, las biopelículas pueden provocar contaminación e infección en los animales (por ej., que también pueden transmitirse a los seres humanos, como se describe a continuación). Por ejemplo, las biopelículas pueden crecer en equipos agrícolas (p. ej., equipos de ordeño y depósitos), áreas de alojamiento (p. ej., jaulas, gallineros, graneros), dispositivos de alimentación y suministro de agua (p. ej., regaderas o bebederos) y áreas de almacenamiento. Por lo tanto, se pueden formar biopelículas en diversos materiales tales como, pero no limitados a, plástico, vidrio, acero inoxidable, metal, caucho y otros. Algunas de estas bacterias son patógenas para seres humanos o animales. Además, las cepas de bacterias resistentes a los agentes antimicrobianos son un problema importante. Por ejemplo, en los animales de granja, el control de las infecciones bacterianas es imperativo, ya que las bacterias (incluidas las cepas resistentes) pueden llegar a los huevos, la carne y la leche, generando productos alimenticios contaminados.

Como se mencionó anteriormente, el principal mecanismo por el cual las bacterias adquieren resistencia es mediante la adquisición de genes de resistencia a los agentes antimicrobianos (AMR) mediante conjugación bacteriana y/o transferencia horizontal de genes (p. ej., mediante transferencia de plásmidos) y/o transferencia horizontal de genes.

Así, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la adhesión de bacterias a una superficie, método que comprende aplicar el ácido o la sal biliar (o composiciones que comprenden los mismos como se trata más adelante) de la presente invención a una superficie que tiene bacterias.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método in vitro para inhibir la formación de biopelículas, método que comprende aplicar el ácido o la sal biliar (o composiciones que comprenden los mismos como se trata más adelante) de la presente invención a una superficie que tiene una biopelícula.

Como se usa en el presente documento, la frase "que inhibe la adhesión" se refiere a prevenir, reducir o eliminar la unión bacteriana a una superficie (p. ej., reduciendo la tasa de crecimiento en una superficie o reduciendo la formación de biopelícula).

Según una realización, el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) de la presente invención inhibe la adhesión bacteriana en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% medida mediante ensayos de adhesión bacteriana. Los ensayos de adhesión bacteriana ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ensayo de microplacas de poliestireno de alto rendimiento, ensayo cualitativo de adhesión de bacterias y ensayo microscópico fluorescente para la formación de biopelículas en portaobjetos de vidrio. Se apreciará que las composiciones de algunas realizaciones de la presente invención también inhiben la agregación bacteriana (es decir, agregación no a una superficie).

Como se usa en el presente documento, el término "biopelícula" se refiere a una capa de microorganismos que se adhieren a una superficie (p. ej., como microorganismos dispersos y/o en colonias) junto con los polímeros que secretan. En consecuencia, la biopelícula normalmente está formada por polisacáridos y otras macromoléculas.

Según una realización, el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) de la presente invención inhibe la formación de biopelículas en 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con la formación de biopelículas en ausencia del ácido o la sal biliar de la invención. La formación de biopelículas se puede determinar, p. ej., mediante ensayos de biopelículas. Los ensayos ejemplares que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, tinciones colorimétricas y metabólicas tales como el ensayo del colorante cristal violeta (CV) descrito en O'Toole, J Vis Exp. (2011) 47: 2437.

El término "superficie" se define en el presente documento como cualquier superficie que pueda estar cubierta, al menos en parte, por una biopelícula. La presente invención contempla la inhibición de la adhesión bacteriana o la formación de biopelículas a una amplia variedad de superficies que incluyen, pero no se limitan a, telas, fibras, espumas, películas, hormigones, mamposterías, vidrio, metales, plásticos, cauchos, polímeros, combinaciones de los mismos y similares.

La presente divulgación contempla la inhibición de la adhesión bacteriana o la formación de biopelículas sobre superficies orgánicas, superficies inorgánicas o combinaciones de las mismas.

Según una realización, la superficie es una superficie de alojamiento de animales de granja susceptible a la formación de biopelículas (como se trata más adelante).

Según una realización, la superficie es una superficie de un dispositivo médico susceptible a la formación de biopelículas (como se trata a continuación).

Según una realización, la superficie es una superficie de una planta o dispositivo de tratamiento de agua susceptible a la formación de biopelículas (como se trata a continuación).

Según una realización, la superficie está comprendida en un dispositivo que es susceptible a la formación de biopelículas. Los dispositivos ejemplares cuyas superficies se contemplan en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cascos de embarcaciones, superficies de automóviles, superficies de aviones, membranas, filtros, equipos industriales, biorreactores, fermentadores y piscinas.

Según una realización, la superficie no comprende bacterias (y dicho tratamiento se efectúa como medida preventiva).

Según otra realización, la superficie ya tiene bacterias adheridas a ella.

Como se mencionó, el método de la presente invención se lleva a cabo aplicando el ácido o la sal biliar (o composiciones que comprenden los mismos como se trata más adelante) de la presente invención a una superficie.

La aplicación de las composiciones a una superficie se puede realizar usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo pulverizar, extender, humectar, inmersión, inmersión breve, pintar, soldar ultrasónicamente, soldar, unir o adherir. Las composiciones de la presente invención se pueden unir como monocapas o capas múltiples.

Por lo tanto, según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para descontaminar un alojamiento de animales de granja, método que comprende aplicar el ácido o la sal biliar (o una composición que comprende los mismos como se describe en detalle más adelante) a una superficie en el alojamiento de animales de granja.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "animal de granja" se refiere a animales que incluyen, pero no se limitan a, ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, caballos, burros, pollos, pavos, patos, gansos y conejos.

Según una realización, el animal de granja se cría para la industria alimentaria (p. ej., para leche, huevos, carne).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "alojamiento de animales de granja" se refiere a cualquier área en la que se reproducen, crían, transportan o sacrifican animales de granja. Por ejemplo, un alojamiento para animales de granja puede incluir una operación de alimentación de animales (también denominada "granjas industriales"), graneros abiertos, graneros interiores, cajones, jaulas, establos, gallineros y camiones (p. ej., utilizados para el transporte de animales de granja). Además, la expresión "alojamiento de animales de granja" incluye zonas de ordeño (p. ej., de vacas, ovejas y cabras) y zonas de puesta de huevos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "descontaminar" se refiere al proceso de limpieza de una superficie para eliminar contaminantes bacterianos o para eliminar la formación de los mismos (p. ej., evitando la formación de biopelículas).

Según una realización, la descontaminación de un alojamiento para animales de granja se efectúa de manera que la reducción del número de bacterias o de una biopelícula sea de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con un alojamiento para animales de granja no tratados con el ácido o la sal biliar de la invención. Los expertos en la técnica comprenderán que se pueden utilizar diversas metodologías y ensayos para evaluar la descontaminación. Por ejemplo, se puede recoger una muestra con una esponja o una torunda, la muestra se puede sembrar en placas de agar, las placas pueden incubarse (p. ej., en condiciones aeróbicas a 37 °C durante al menos 24 horas) y las colonias se pueden contar (p. ej., usando una cuadrícula de recuento).

Según una realización, la superficie a descontaminar incluye al menos uno de una jaula, un cajón, un suelo, una pared, un techo, una puerta, un estante, una tela, un dispositivo de ordeño, un depósito de recogida (p. ej., un depósito de ordeño), un dispositivo o utensilio para comer (p. ej., un pesebre, un recipiente para comer, un recipiente de agua o un bebedero) o una superficie para tumbarse.

La descontaminación se puede efectuar mediante una única administración del ácido o sal biliar (o una composición que comprende los mismos como se describe en detalle más adelante) o mediante administraciones múltiples (p. ej., dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más administraciones). Cuando se emplean administraciones múltiples, estas pueden llevarse a cabo en un solo día o durante varios días, semanas, meses o años (p. ej., en días consecutivos o durante un período de tiempo prolongado). Un experto en la técnica es capaz de tomar dicha decisión teniendo en cuenta el área a tratar y el tipo de contaminación bacteriana a tratar o prevenir.

La descontaminación se puede efectuar aplicando el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) usando cualquier método conocido en la técnica que incluye pulverizar, extender, humedecer, inmersión, inmersión breve, pintar o adherir. Las composiciones de la presente invención se pueden unir como monocapas o capas múltiples.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para descontaminar una superficie médica que tiene una contaminación bacteriana o una biopelícula, método que comprende aplicar el ácido o la sal biliar (o la composición que comprende los mismos como se describe en detalle más adelante) a la superficie médica que tiene contaminación bacteriana o una biopelícula.

Según una realización, la descontaminación de una superficie médica tiene un efecto tal que la reducción del número de bacterias o de la biopelícula es de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con una superficie médica que tiene contaminación bacteriana o una biopelícula no tratada con el ácido o la sal biliar (o la composición que los comprende) de la invención. Los expertos en la técnica comprenderán que para evaluar la descontaminación se pueden usar diversas metodologías y ensayos, como se trató anteriormente.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "dispositivo médico" se refiere a cualquier implante, instrumento, aparato, implemento, máquina, dispositivo o cualquier otro objeto similar o relacionado (incluido cualquier componente o accesorio), que esté destinado a ser utilizado en el diagnóstico, tratamiento, curación o prevención de enfermedades u otras afecciones. Dicho dispositivo médico está destinado a ser utilizado en seres humanos u otros animales y se prevé que afecte a la estructura o cualquier función del cuerpo. Dicho dispositivo médico no logra sus propósitos principales a través de la acción química y no depende de ser metabolizado para lograr sus propósitos principales.

Un implante se refiere a cualquier objeto destinado a ser colocado en un cuerpo humano que no sea un tejido vivo. El implante puede ser temporal o permanente. Un implante puede ser un artículo que comprende componentes artificiales, tales como catéteres o marcapasos. Los implantes también pueden incluir objetos de origen natural que han sido procesados para desvitalizar sus tejidos vivos. Por ejemplo, los injertos óseos que se han procesado de modo que se eliminen sus células vivas (acelularizados), pero se conserve su forma para que sirva como plantilla para el crecimiento interno de hueso de un huésped. Como otro ejemplo, el coral natural se puede procesar para producir preparaciones de hidroxiapatita que se pueden aplicar al cuerpo para ciertas terapias ortopédicas y dentales.

Por lo tanto, la presente invención prevé descontaminar superficies médicas con el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden) de la presente invención para prevenir la conjugación bacteriana, reducir la adquisición de resistencia antimicrobiana y aumentar la susceptibilidad de la biopelícula a un tratamiento antimicrobiano (p. ej., antibióticos) para reducir/eliminar cualquier posible infección que se sepa que se produce después de la implantación. Las infecciones relacionadas con dispositivos generalmente resultan de la introducción de microorganismos, principalmente bacterias, durante el procedimiento de inserción o implantación del dispositivo, o de la adhesión de organismos transmitidos por la sangre al dispositivo recién insertado y su posterior propagación en su superficie. Por lo tanto, aplicar (p. ej., recubrir) al dispositivo médico las composiciones de la presente invención inhibirá la conjugación bacteriana en la biopelícula (es decir, de una o más especies microbianas), evitará la contaminación relacionada con el dispositivo médico y, en consecuencia, mejorará el efecto del tratamiento antimicrobiano (cuando se administran para combatir infecciones), que incluye, pero no se limita a, a los antibióticos.

Las superficies médicas a las que pueden aplicarse (p. ej., recubrirse) las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, vasos sanguíneos artificiales, catéteres y otros dispositivos para la extracción o administración de fluidos a pacientes, corazones artificiales, riñones artificiales, clavos ortopédicos, prótesis de articulaciones, placas e implantes; catéteres y otros tubos (incluidos tubos urológicos y biliares, tubos endotraqueales, catéteres venosos centrales de inserción periférica, catéteres de diálisis, catéteres venosos centrales tunelizados de larga duración, catéteres venosos periféricos, catéteres venosos centrales de corta duración, catéteres arteriales, catéteres pulmonares, catéteres de Swan-Ganz , catéteres urinarios, catéteres peritoneales), dispositivos urinarios (incluidos dispositivos urinarios de larga duración, dispositivos urinarios de unión de tejidos, esfínteres urinarios artificiales, dilatadores urinarios), derivaciones (incluidas derivaciones ventriculares o arteriovenosas); prótesis (incluidos implantes mamarios, prótesis de pene, prótesis de injertos vasculares, dispositivos de reparación de aneurismas, válvulas cardíacas mecánicas, articulaciones artificiales, laringes artificiales, implantes otológicos), dispositivos anastomóticos, puertos de catéter vascular, stents vasculares, pinzas, grapas quirúrgicas, dispositivos embólicos, tubos de drenaje de heridas, lentes oculares, implantes dentales, derivaciones para hidrocefalia, marcapasos y desfibriladores implantables, conectores sin agujas, prótesis de voz y similares.

Otra posible aplicación de las composiciones de ácidos y sales biliares de la presente invención es aplicarlas a superficies que se encuentran en los entornos médico y dental. Dichas superficies incluyen los aspectos internos y externos de diversos instrumentos y dispositivos, ya sean desechables o destinados a usos repetidos. Dichas superficies incluyen todo el espectro de artículos adaptados para uso médico, incluidos, pero no limitados a, endoscopios, bisturíes, agujas, tijeras y otros dispositivos utilizados en procedimientos quirúrgicos, terapéuticos o de diagnóstico invasivos y filtros de sangre. Otros ejemplos resultarán fácilmente evidentes para los profesionales de estas técnicas.

Las superficies que se encuentran en el entorno médico también incluyen los aspectos internos y externos de piezas de equipo médico, equipo médico usado o transportado por el personal en el entorno de atención médica. Dichas superficies pueden incluir superficies destinadas a actuar como barreras biológicas contra organismos infecciosos en entornos médicos, tales como guantes, delantales y caretas. Los materiales comúnmente utilizados para barreras biológicas son materiales termoplásticos o poliméricos tales como polietileno, dacrón, nailon, poliésteres, politetrafluoroetileno, poliuretano, látex, silicona y vinilo. Otras superficies pueden incluir encimeras y accesorios en áreas utilizadas para procedimientos médicos o para preparar aparatos, tubos y botes médicos utilizados en tratamientos respiratorios, incluida la administración de oxígeno, de fármacos solubilizados en nebulizadores y agentes anestésicos. Otras de tales superficies pueden incluir mangos y cables para equipos médicos o dentales que no están destinados a ser esterilizados. Además, tales superficies pueden incluir aquellas superficies externas no estériles de tubos y otros aparatos que se encuentran en áreas donde comúnmente se encuentran sangre o fluidos corporales u otros biomateriales peligrosos.

Estas composiciones de ácidos y sales biliares de la invención también se pueden incorporar en combinación con un agente antimicrobiano (p. ej., un agente antibiótico) sobre superficies de dispositivos médicos. Esta combinación matará suficientes bacterias y evitará infecciones relacionadas con el dispositivo.

Superficies adicionales que pueden tratarse según las enseñanzas de la presente invención incluyen lentes de contacto.

Las superficies médicas según la presente invención también pueden incluir artículos de laboratorio que incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos microscópicos, campanas de cultivo, placas Petri o cualquier otro tipo adecuado de depósito o recipiente de cultivo de tejidos conocido en la técnica.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar agua que tiene contaminación o una biopelícula bacteriana, método que comprende aplicar el ácido o la sal biliar (o una composición que comprende los mismos como se describe en detalle más adelante) al agua que tiene la contaminación o biopelícula bacteriana.

El término "tratar", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al proceso de limpieza del agua para eliminar contaminantes bacterianos o la formación de los mismos (p. ej., evitando la formación de biopelículas).

Según una realización, el agua se selecciona del grupo que consiste en agua residual, agua de piscina, agua potable, agua dulce, agua de mar y salmuera.

Según una forma de realización, el agua residual se encuentra en una planta de tratamiento de aguas residuales.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "planta de tratamiento de aguas residuales" se refiere a cualquier sistema capaz de eliminar contaminantes de aguas residuales procedentes, p. ej., de aguas residuales domésticas o agrícolas.

El tratamiento de la planta de tratamiento de aguas residuales según la presente invención se puede efectuar aplicando el ácido o la sal biliar (o composiciones que comprenden los mismos como se tratan más adelante) usando cualquier método conocido en la técnica que incluye pulverizar, extender, humedecer, inmersión, inmersión breve, pintar o adherir (como se trata a continuación). Por consiguiente, las composiciones de la presente invención se pueden proporcionar a cualquier superficie de la planta de tratamiento de aguas residuales, que incluyen, por ejemplo, depósitos, bombas, filtros y rejillas, que normalmente se utilizan para tratar las aguas residuales. Además, el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) se pueden agregar directamente al agua residual o al lodo.

Según una realización, el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) se usan junto con otros desinfectantes típicamente usados en plantas de tratamiento de aguas residuales, tales como, pero sin limitarse a, ozono, cloro, luz ultravioleta o hipoclorito de sodio.

Asimismo, el ácido o la sal biliar (o composiciones que los comprenden como se trata a continuación) se pueden usar para tratar agua de piscina, agua potable, agua dulce, agua de mar y salmuera, usando cualquier método conocido en la técnica, tales como los descritos anteriormente para plantas de tratamiento de aguas residuales.

Según una realización, el tratamiento del agua tiene un efecto tal que la reducción del número de bacterias o de la biopelícula es de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con el agua no tratada con el ácido o la sal biliar (o la composición que los comprende) de la invención. Los expertos en la técnica entenderán que se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar el tratamiento del agua, como se trató anteriormente.

El ácido o la sal biliar de algunas realizaciones de la invención se pueden utilizar per se, o como parte de una composición.

Según una realización, la composición comprende un ácido o una sal biliar y un desinfectante.

La composición que comprende la sal y el desinfectante puede estar en un único recipiente o en recipientes separados: p. ej., un ácido o sal biliar envasados por separado del desinfectante; o un ácido biliar o sal y el desinfectante en un solo recipiente.

Según una realización, la composición comprende un ácido o una sal biliar y un reactivo de limpieza.

La composición que comprende la sal biliar y el reactivo de limpieza puede estar en un único recipiente o en recipientes separados: p. ej., un ácido o sal biliar envasados por separado del reactivo de limpieza; o un ácido o sal biliar y el reactivo de limpieza en un solo recipiente.

Según otra realización, la composición comprende un ácido o una sal biliar y un agente antimicrobiano.

La composición que comprende la sal biliar y el agente antimicrobiano puede estar en un solo recipiente o en recipientes separados: p. ej., un ácido o sal biliar envasados por separado del agente antimicrobiano; o un ácido o sal biliar y el agente antimicrobiano en un solo recipiente.

La cantidad de ácido o sal biliar (es decir, glicocólico o glicocolato) que se utilizará en la composición de la invención está en el intervalo de 1-5% p/v.

Según una realización, el ácido o la sal biliar comprende taurina en una concentración del 0,01 al 10% p/v. Según una realización específica, la concentración de taurina en la composición es al menos aproximadamente 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8% o 10% p/v.

Según una realización, el ácido o la sal biliar comprende glicina en una concentración del 0,01 al 10% p/v. Según una realización específica, la concentración de glicina en la composición es al menos aproximadamente 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8% o 10% p/v.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente antimicrobiano" se refiere a un compuesto que mata microorganismos o inhibe su crecimiento. El agente antimicrobiano puede incluir un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente antiviral, un agente antiprotozoario, un agente antiparasitario o una combinación de los mismos. El agente antimicrobiano puede incluir un compuesto inorgánico, un compuesto orgánico (p. ej., una pequeña molécula orgánica), una proteína, un anticuerpo, un ADN, un carbohidrato o combinaciones de los mismos.

Según una realización, el agente antimicrobiano es un agente antibacteriano tal como un antibiótico. Los antibióticos ejemplo incluyen, pero no se limitan a, penicilinas (p. ej., amoxicilina y amoxicilina-clavulanato), ácido clavulánico, trimetoprim-sulfametoxazol, fluoroquinolonas (p. ej., ofloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina), cefalosporinas (p. ej., cefuroxima, cefaclor, cefprozil), loracarbef, cefindir, cefixima, cefpodoxima proxetilo, ceflbuteno y ceftriaxona), macrólidos, azálidos (p. ej., eritromicina, claritromicina y azitromicina), sulfonamidas, ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, minociclina, doxiciclina, vancomicina, bacitracina, kanamicina, neomicina, gentamicina, eritromicina, espectinomicina, zeomicina, estreptomicina y combinaciones de los mismos.

Los agentes antifúngicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, terbinafina, clotrimazol, econazol, nistatina, sulfuro de selenio y ketoconazol.

Los agentes antivirales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aciclovir, famciclovir y valaciclovir.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "desinfectante" se refiere a una sustancia que se aplica a objetos no vivos para matar o inhibir el crecimiento de microorganismos (p. ej., bacterias) que se encuentran en los objetos.

Según una realización, el desinfectante comprende un alcohol, un cloro, un compuesto de cloro, un aldehido, un agente oxidante, yodo, un yodóforo, ozono, un compuesto fenólico, un compuesto de amonio cuaternario, o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización específica, el desinfectante comprende compuestos fenólicos (p. ej., Pine-sol, One Stroke, Osyl), yodo o yodóforos (p. ej., Betadine y Weladol), compuestos de cloro (p. ej., Clorox, lejía genérica), compuestos de amonio cuaternario. (p. ej., Roccal D Plus), compuestos basados en alcoholes (p. ej., Terralin), compuestos oxidantes (p. ej., Virkon S, Oxy-Sept 333), compuestos tipo aldehído (p. ej., Cidex®, Endosporine®), compuestos de ácido peracético (PAA) (p. ej., Nu Cidex®, Anioxyde 1000®, Hydraseptic®, Peralkan®).

Según una realización, el desinfectante puede comprender formaldehído, orto-ftalaldehído, glutaraldehído, dihidrógeno-citrato de plata, poliaminopropilbiguanida, bicarbonato de sodio, ácido láctico, blanqueador con cloro o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender metanol, etanol, n-propanol, 1-propanol, 2-propanol, isopropanol o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender un hipoclorito, dióxido de cloro, un dicloroisocianurato, un monocloroisocianurato, una hidantoína halogenada o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, dicloroisocianurato de sodio, clorito de sodio, sal sódica de N-cloro-4-metilbencenosulfonamida, alcohol 2,4-dicorobencílico o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender ácido perfórmico, permanganato de potasio, peroximonosulfato de potasio o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender fenol, o-fenilfenol, cloroxilenol, hexaclorofeno, timol, amilmetacresol o una mezcla de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender cloruro de benzalconio, bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de bencetonio, ácido bórico, verde brillante, gluconato de clorhexidina, tintura de yodo, providona yodada, mercurocromo, miel de manuka, dihidrocloruro de octenidina, polihexametilen biguamida, bálsamo del Perú, o una mezcla de dos o más de ellos.

Según una realización, el desinfectante puede comprender un peróxido, tal como peróxido de hidrógeno, peróxidos orgánicos, peroxiácidos, hidroperóxidos orgánicos, peróxidos inorgánicos tales como sales de peróxido, peróxidos ácidos y mezclas de dos o más de los mismos.

Según una realización, el desinfectante forma parte de un reactivo de limpieza.

Las composiciones de la invención pueden comprender además ácido acético, ácido sulfúrico o una mezcla de los mismos.

Las composiciones de algunas realizaciones de la invención pueden comprender además uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en: agua, un tampón de citrato, ácido cítrico, un agente estabilizante, un tensioactivo (p. ej., para proporcionar a la composición acuosa propiedades tensioactivas), un agente para ajustar el pH, uno o más inhibidores de la corrosión (p. ej., para proporcionar propiedades inhibidoras de la corrosión), y/o uno o más agentes quelantes (p. ej., para proporcionar capacidad de quelación, p. ej., para ablandar el agua).

Según una realización, la composición comprende agua que incluye, p. ej., agua del grifo, agua desionizada, agua destilada, agua purificada por ósmosis o una mezcla de dos o más de las mismas.

Según una realización, el tensioactivo puede comprender cualquier compuesto que reduzca la tensión superficial o proporcione una mayor humectabilidad. El tensioactivo puede comprender uno o más detergentes, agentes humectantes, emulsionantes, agentes espumantes y/o dispersantes. El tensioactivo puede comprender uno o más compuestos orgánicos que contienen tanto grupos hidrófobos como grupos hidrófilos. El tensioactivo puede comprender tanto un componente insoluble en agua como un componente soluble en agua. El tensioactivo puede comprender uno o más compuestos aniónicos, catiónicos, con doble carga aniónica y catiónica y/o no iónicos. El tensioactivo puede comprender una o más alcanolaminas, alquilarilsulfonatos, óxidos de amina, poli(oxialquilenos), copolímeros de bloque que comprenden unidades repetidas de óxido de alquileno, etoxilatos de alcoholes carboxilados, alcoholes etoxilados, alquilfenoles, alquilfenoles etoxilados, aminas etoxiladas, amidas etoxiladas, oxiranos, ácidos grasos etoxilados, ésteres grasos etoxilados, aceites etoxilados, ésteres grasos, amidas de ácidos grasos, ésteres de glicerol, ésteres de glicol, sorbitán, ésteres de sorbitán, imidazolinas, lecitina, lignina, glicéridos (p. ej., mono, di y/o triglicéridos), sulfonatos de olefinas, ésteres de fosfato, ácidos grasos y/o alcoholes etoxilados y/o propoxilados, ésteres de sacarosa, sulfatos y/o alcoholes y/o alcoholes etoxilados de ésteres grasos, sulfonatos de dodecilo y/o tridecilbencenos, sulfosuccinatos, ácidos dodecil y/o tridecilbencenosulfónicos, mezclas de dos o más de los mismos, y similares. El tensioactivo puede comprender etanolamina, trietanolamina, óxido de octildimetilamina, nonilfenoxi poli(etilenoxi)etanol, polialquilenglicol o una mezcla de dos o más de los mismos.

Como se mencionó anteriormente, las composiciones de algunas realizaciones de la invención pueden comprender un antibiótico.

Las composiciones de algunas realizaciones de la invención pueden comprender además una enzima antibiopelículas. Las enzimas antibiopelículas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, celulasa, beta-N-acetilgluconasa, dispersina B, papaína y ADNasa 1.

La composición de la invención se puede preparar como uno o más de un líquido (p. ej., una solución desinfectante, una solución de inmersión o un remojo), un gel, una pasta, un aerosol, una microcápsula, un gránulo o un polvo (p. ej., polvo seco).

Por consiguiente, la composición se puede usar para recubrir, pulverizar, nebulizar, remojar, dispersar, reducir a polvo, lavar, limpiar frotando, inmersión y/o enjuague.

La composición de la invención puede comprender además componentes adicionales, tales como vehículos, tensioactivos, emulsionantes, agentes secantes, agentes formadores de película y combinaciones de los mismos. Los tipos y concentraciones de los componentes adicionales se pueden seleccionar basándose en la formulación prevista y el uso de la composición, y pueden ser determinados por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente en EE.UU. no. 2015/366210). Por ejemplo, si se pretende utilizar una composición en forma de polvo, puede comprender un soporte sólido, tal como talco, arcilla, tiza, ceniza volcánica u otro ingrediente inerte (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente en EE.UU. no. 2015/366210).

Según una realización, la composición puede formularse como una formulación microencapsulada o una formulación que proporciona una liberación retardada. La microencapsulación se puede lograr con uno o más agentes formadores de película o perlas preformadas (p. ej., perlas de polímero de liberación selectiva) (véase, p. ej., la Solicitud de Patente en EE.UU. no. 2015/366210).

Las composiciones de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador. El envase puede comprender, por ejemplo, una lámina de metal o plástico. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de uso. El envase o dispositivo dispensador también puede ir acompañado de un aviso en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de la composición, aviso que refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones para uso por seres humanos o uso veterinario. Dicho aviso, por ejemplo, puede incluir etiquetas aprobadas por la Food and Drug Administration de EE. UU. para fármacos o de un prospecto de producto aprobado.

Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, se puede formular una cantidad eficaz usando cultivos celulares (p. ej. cultivos y ensayos bacterianos in vitro) para lograr una concentración o título deseado. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares in vitro se pueden utilizar para formular una gama de concentraciones para su uso en descontaminación. Las concentraciones pueden variar según la superficie a tratar y el tipo de bacteria. La formulación exacta puede ser determinada por un experto en la técnica.

Según un aspecto no reivindicado, se proporciona un método para ensayar la disminución de la frecuencia de conjugación de bacterias, método que comprende:

(a) Poner en contacto bacterias resistentes a ácidos o sales biliares con un ácido o una sal biliar;

(b) Incubar las bacterias de la etapa (a) con otras bacterias; y

(c) Medir la frecuencia de conjugación entre las bacterias de la etapa (a) y las otras bacterias, en donde se determina la disminución de la frecuencia de conjugación cuando se mide una frecuencia de conjugación más baja en comparación con la frecuencia de conjugación en ausencia del ácido biliar.

Según una realización, la frecuencia de conjugación se calcula como la relación entre las unidades formadoras de colonias (UFC) transconjugantes obtenidas y el número de donantes bacterianos que se usaron en el ensayo de conjugación.

Un transconjugante se refiere a bacterias que han aceptado un material genético (p. ej., ADN plasmídico) de otras bacterias donantes mediante conjugación bacteriana.

Según una realización, las otras bacterias comprenden bacterias de la misma o diferente especie con respecto a las bacterias resistentes al ácido o a la sal biliar.

Según una realización, las otras bacterias son resistentes a los ácidos o a las sales biliares.

Según una realización, la disminución de la frecuencia de conjugación es de al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con bacterias no tratadas con el ácido o la sal biliar de la invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%.

Los términos y expresiones "comprende(n)", "que comprende(n)", "incluye(n)", "que incluye(n)", "que tiene(n)" y sus conjugados significan "que incluye(n) pero no se limita(n) a".

La expresión "que consiste(n) en" significa "que incluye(n) y se limita(n) a".

La expresión "que consiste(n) esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas del producto, composición, método o estructura reivindicada.

Tal como se utiliza en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el(la)" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluidas mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, se pueden presentar varias realizaciones de esta invención en un formato de rango. Debe entenderse que la descripción en formato de rango es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un rango ha revelado específicamente todos los subrangos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese rango. Por ejemplo, se debe considerar que la descripción de un rango tal como de 1 a 6 tiene subrangos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese rango, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del rango.

Siempre que en el presente documento se indique un rango numérico, se pretende incluir cualquier número citado (fraccional o integral) dentro del rango indicado. Las frases "que varían/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varían/varía de" un primer número indicado "a" un segundo número indicado se utilizan en el presente documento de forma intercambiable y pretenden incluir el primer y el segundo número indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada, incluidos, pero no limitados a, aquellos modos, medios, técnicas y procedimientos conocidos o fácilmente desarrollados a partir de modos, medios, técnicas y procedimientos por profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Se aprecia que ciertas características de la invención, que, para mayor claridad, se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, diversas características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una única realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no tienen que considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se delinearon anteriormente y como se reivindican en la sección de reivindicaciones más adelante encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de forma no limitativa.

En general, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "Una guía práctica para la clonación molecular", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías establecidas en las Patentes de EE. UU. Nos.

4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", volúmenes I-III, Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology", volúmenes I-III, Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía científica y de patentes; véanse, por ejemplo, las Patentes de e E. UU. Nos.

3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization", Hames B. D. y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation", Hames, B. D. y Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture", Freshney R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning", Perbal B., (1984) y "Methods in Enzymology "Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); a lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales. Se cree que los procedimientos contenidos en el mismo son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector.

Materiales generales y condiciones experimentales

Experimentos de apareamiento

La transferencia de pESI por conjugación se realizó utilizando la cepa S.Infantis(119944) como donante y una cepa deE. coliK-12, ORN172, resistente a la kanamicina, como receptora en placas de agar LB durante 16 horas. La conjugación se ensayó después de que ambas cepas se cultivaron en LB durante 16 horas con aireación y se recogió 1 mL de cada cepa mediante centrifugación y se resuspendió en 100 pL de medio LB. Se mezclaron cantidades iguales (10 pL; aproximadamente 2 x 109 UFC) de cada cultivo y se colocaron en placas de agar LB suplementadas con diferentes concentraciones de bilis. Los transconjugantes resultantes se rasparon de la placa, se resuspendieron en caldo LB y se sembraron diluciones en serie en placas de agar LB suplementadas con tetraciclina (para seleccionar pESI) y kanamicina (para seleccionar la cepa receptora). La frecuencia de conjugación se calculó como la relación entre los transconjugantes de E.coliobtenidos (UFC resistentes a tetraciclina y kanamicina) y el número de donantes (S.Infantis119944) que se utilizó en el experimento.

Todos los reactivos de los componentes biliares se adquirieron en Sigma-Aldrich Israel. Las diferentes formulaciones utilizadas: Coleato de sodio (bilis cruda de buey) en concentraciones de 1, 2 y 4%; taurina al 2%; ácido litocólico al 2%; ácido cólico al 2%; ácido litocólico taurina al 2%; ácido cólico taurina al 2%; glicina al 4%; y ácido quenodesoxicólico al 4%.

Ejemplo 1

La contribución de los plásmidos conjugativos a la resistencia y virulencia bacteriana

Recientemente, los presentes inventores han identificado que la aparición de unaSalmonella entéricaserovar Infantis (S. Infantis) resistente a múltiples fármacos en Israel se vio facilitada por la adquisición de un gran plásmido conjugativo denominado pESI [Aviv G. et al. (2014) Environ Microbiol 16: 977-994; Gal-Mor O. et al. (2010) Emerg Infect Dis 16: 1754-1757]. Este plásmido codifica múltiples genes de tolerancia química y resistencia a los antibióticos (ARG) que confieren resistencia a múltiples fármacos (MDR) a la tetraciclina(tetA),sulfametoxazol(surI),trimetoprima(dfrA),peroxidasa de hidrógeno (qacEA1) y mercurio(mer)y codifica varios factores de virulencia, tales como la fimbria única acompañante-ujier(feaeipf)y el operón yersiniabactina(ybt).Varios experimentos han demostrado que la presencia de pESI en bacterias no solo confiere un fenotipo m Dr (Figura 1), sino que también mejora la formación de biopelículas, la adherencia y la invasión de células huésped de aves y mamíferos y aumenta la virulencia de su huésped bacteriano in vivo [Aviv G. et al. (2014), supra]. Además, el hecho de que la cepa MDR S. Infantis haya surgido en las aves de corral antes de ser transmitida a los seres humanos [Gal-Mor O. et al. (2010), supra] enfatizan aún más el papel potencial del sector agrícola en la aparición de nuevos patógenos MDR. Análisis recientes que ensayaron la presencia de pESI en los aislados actuales de S. Infantis de fuentes alimentarias, clínicas y avícolas han mostrado que pESI estaba presente en todos (49/49) los aislados ensayados [Aviv G et al., (2016) MBio 7], lo que indica que es muy estable en este huésped.

Ejemplo 2

La conjugación bacteriana es inhibida por la bilis

Salmonella enterica,como muchos otros patógenos entéricos, es resistente a la bilis. Sin embargo, cuando se realizaron experimentos de conjugación en el laboratorio entre S. Infantis 119944 (donante) yE. coliORN172 (receptor), se encontró que la frecuencia de conjugación, pero no la viabilidad bacteriana, era drásticamente inhibida por la bilis. En estos experimentos, se mostró que la transferencia del plásmido de S. Infantis, pESI, es drásticamente inhibida en una forma dosis-respuesta en presencia de bilis (Figura 2).

Para verificar el efecto inhibidor de la bilis sobre la conjugación bacteriana y validar que esta actividad no es específica del plásmido pESI de S. Infantis únicamente, los presentes inventores examinaron la frecuencia de conjugación de dos plásmidos de huésped amplio adicionales (pRL27 y pN3) de diferentes grupos de incompatibilidad en presencia de bilis al 4%. Nuevamente, aunque la bilis no comprometió la viabilidad bacteriana, se encontró que reducía drásticamente la frecuencia de conjugación de pRL27 y pN3 en 30 y 43 veces, respectivamente (Figura 3).

Ejemplo 3 (ejemplo de referencia)

Una composición de taurina y ácido litocólico es muy eficaz para inhibir la conjugación bacteriana

Las sales biliares de ser humano exportadas son el producto de ácidos biliares primarios (ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico y ácido litocólico) conjugados con glicina o taurina, antes de ser secretados por el hígado. Para caracterizar el potencial de estos compuestos para inhibir la conjugación bacteriana, se realizaron experimentos de conjugación utilizando placas de agar LB que contenían 2% de diferentes ácidos biliares, glicina, taurina y diferentes mezclas de estos compuestos. Estos experimentos mostraron que tanto el ácido cólico como el ácido litocólico causaron una disminución significativa de la frecuencia de conjugación (Figura 4). Además, se encontró que la adición de taurina a estos ácidos biliares, y especialmente al ácido litocólico, provocó una disminución adicional de la frecuencia de conjugación cerca del nivel de detección (es decir, la frecuencia de conjugación era casi cero) (Figura 4). Por otro lado, se encontró que la presencia de taurina sola inhibe la conjugación en menor grado (Figura 4). Por lo tanto, se concluyó que una solución al 2% (p/v) de ácido litocólico (ácido 3a-hidroxi-5p-colan-24-oico) y taurina (ácido 2-aminoetanosulfónico) es un compuesto potente para inhibir la conjugación bacteriana. Cabe destacar que los ácidos litocólicos así como la taurina no tuvieron ningún efecto sobre la velocidad de crecimiento de cepas de S. Infantis y la E.coli,lo que indica que su actividad es específica contra la conjugación, sin efecto bactericida. Por el contrario, la presencia de 2% de glicina y ácido quenodesoxicólico inhibió el crecimiento de estas bacterias y, por lo tanto, no se produjeron transconjugantes en presencia de estos reactivos (datos no mostrados).

Para confirmar aún más el efecto inhibidor del ácido litocólico y la taurina sobre la conjugación de plásmidos, se determinó la frecuencia de conjugación de cinco plásmidos diferentes de diversos grupos de incompatibilidad en presencia de una composición que comprendía 0, 0,5, 1 y 2% de ácido litocólico y taurina. Claramente, la frecuencia de conjugación de los cinco plásmidos se vio significativamente dañada hasta 275 veces en presencia de ácido litocólico y taurina al 2% (Figura 5), lo que indicó que este compuesto es un reactivo eficaz para inhibir la conjugación de plásmidos resistentes a los antibióticos.

En resumen, los resultados actuales ilustraron que una composición que comprende ácido litocólico (ácido 3a-hidroxi-5p-colan-24-oico) y taurina (ácido 2-aminoetanosulfónico) al 2% es muy eficaz para inhibir la conjugación bacteriana, sin afectar a la viabilidad bacteriana. Por lo tanto, esta composición se puede utilizar como profiláctico para reducir la diseminación de ARG mediante conjugación bacteriana. Además, estos resultados demostraron que la conjugación de plásmidos puede ser inhibida por pequeñas moléculas bioactivas y, por lo tanto, dicho enfoque puede ser útil para combatir la diseminación de la resistencia a los antibióticos.

Aunque la invención se ha descrito junto con realizaciones específicas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones resultarán evidentes para los expertos en la técnica. En consecuencia, se pretende abarcar todas las alternativas, modificaciones y variaciones que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro de inhibición de la conjugación bacteriana o de la transferencia horizontal de genes bacterianos, método in vitro que comprende poner en contacto bacterias con una cantidad eficaz de un ácido o una sal biliar, en donde dicho ácido biliar comprende ácido glicocólico o una sal del mismo, en donde dicha cantidad eficaz no afecta a la viabilidad de dichas bacterias y comprende dicho ácido o sal biliar en una concentración de 1-5% peso/volumen (p/v), inhibiendo así la conjugación bacteriana o la transferencia horizontal de genes bacterianos.

2. El método in vitro según la reivindicación 1, en donde dichas bacterias son resistentes a dicho ácido biliar o dicha sal biliar.

3. El método in vitro según las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicho método aumenta la susceptibilidad de las bacterias al tratamiento con antibióticos.

4. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichas bacterias:

Son resistentes a los antibióticos;

Son bacterias gramnegativas;

Son bacterias enteropatógenas; y/o

Son bacterias comensales o patógenas para seres humanos o animales.

5. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho contacto se realiza mediante recubrimiento, pulverización, nebulización, remojo, dispersión, reducción a polvo, lavado, limpieza por frotamiento, inmersión breve, enjuague, extensión, humectación, inmersión, pintura o adhesión a una superficie.

6. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho contacto se realiza aplicando el ácido o la sal biliar a una superficie.

7. El método in vitro según la reivindicación 6, en donde dicha superficie se selecciona del grupo que consiste en una tela, una fibra, una espuma, una película, un hormigón, una mampostería, un vidrio, un metal, un plástico, un caucho, un polímero o combinaciones de los mismos.

8. El método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, en donde dicho ácido biliar o dicha sal biliar está unido a dicha superficie.