ES2965349T3 - Anticuerpos, usos de los mismos y conjugados de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA y comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en SEQ ID NO:33, en donde SEQ ID NO:33 es: EVQLVQSGX9E X11KKPGASVKV SCKX24SGYTFT EYTIHWVX38QA X41 GKGLEWIGN INPNX55GGTTY NOKFEDRX68TX70 TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAV YYCAAGW NFDYWGOGTT VTVSS en el que: X9 es A o P X11 es V o L X24 es A o T X38 es R o K X41 es P o H X55 es N o Q X68 es V o A; y X70 es I o L por lo que el dominio variable de cadena pesada comprende hasta 3 modificaciones de secuencia de aminoácidos entre las posiciones 1-30, 36-49, 67-98 y 105-115 de SEQ ID NO: 33. La invención también proporciona compuestos que incluyen el anticuerpo o su porción de unión a antígeno, tales como conjugados, y su uso en el tratamiento o diagnóstico de enfermedades, en particular cánceres, particularmente cáncer de próstata. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos, usos de los mismos y conjugados de los mismos
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos humanizados que se unen a PSMA, a usos de los anticuerpos y a compuestos que incluyen los anticuerpos, por ejemplo, conjugados de los anticuerpos; por ejemplo, conjugados de anticuerpo-fármaco. Los anticuerpos y conjugados de la invención encuentran utilidad en el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades, en particular, cánceres, particularmente el cáncer de próstata.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La especificidad de los anticuerpos para antígenos específicos sobre la superficie de células y moléculas diana ha conducido a su uso generalizado como portadores de una diversidad de agentes diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, los anticuerpos conjugados con marcajes y grupos informadores, tales como fluoróforos, isótopos radioactivos y enzimas, encuentran utilidad en aplicaciones de marcaje y obtención de imágenes, mientras que la conjugación con agentes citotóxicos y fármacos quimioterapéuticos permite la administración dirigida de dichos agentes a tejidos o estructuras específicos, por ejemplo, tipos celulares o factores de crecimiento particulares, minimizando el impacto sobre el tejido sano normal y reduciendo significativamente los efectos secundarios asociados a los tratamientos quimioterapéuticos. Los conjugados de anticuerpo-fármaco presentan amplias aplicaciones terapéuticas potenciales en varios campos de la patología.
El cáncer de próstata, también conocido como carcinoma de la próstata, es el desarrollo de cáncer en la próstata, una glándula del sistema reproductor masculino. Globalmente es el segundo tipo más común de cáncer y la quinta causa más importante de muerte relacionada con cáncer en varones. La terapia de primera línea para el cáncer de próstata avanzado es la privación de andrógenos. Tras la progresión, la quimioterapia ofrece beneficios, aunque las respuestas son transitorias y no existe ningún tratamiento que haya mostrado una supervivencia incrementada más allá de la quimioterapia inicial. El cáncer de próstata metastásico responde mal a la quimioterapia convencional. De esta manera, sigue existiendo una necesidad de mejores tratamientos.
La expresión del antígeno membranal específico de próstata (PSMA, por sus siglas en inglés) está estrechamente asociado al cáncer de próstata y con otros tumores sólidos. El PSMA está presente sobre la superficie celular de algunas células epiteliales prostáticas normales, células tubulares proximales normales, intestino delgado proximal y algunos astrocitos (presentes en el cerebro). El PSMA está regulado positivamente/sobreexpresado en las células de cáncer de próstata (CaP). Los niveles de expresión de PSMA se incrementan con el avance del cáncer de próstata y los niveles de PSMA elevados en cáncer de próstata de estadio temprano son predictivos de una probabilidad incrementada de recurrencia. Una proporción significativa de tumores sólidos expresa PSMA en su neovasculatura tumoral, mientras que el endotelio vascular normal es negativo para PSMA. Se ha observado que el nivel de PSMA incrementa la disponibilidad de folato mediante la hidrólisis del folato asociado a glutamato. Se ha planteado que el PSMA estimula el desarrollo del cáncer de próstata mediante el incremento de los niveles de folato disponibles para que las células de cáncer sobrevivan y crezcan.
Se han generado anteriormente anticuerpos anti-PSMA (ver, por ejemplo, el documento n.° WO98/03973) y se han preparado anticuerpos modificados con inmunogenicidad reducida en seres humanos (ver, por ejemplo, el documento n.° WO2004/098535). Un ejemplo de un anticuerpo monoclonal IgG desinmunizado que se une a PSMA es J591. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de dominio variable del anticuerpo<j>591 murino se proporciona en la presente memoria como la SEC ID n.° 23 y la cadena ligera correspondiente se proporciona en la presente memoria como la SEC ID n.° 24. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de dominio variable del anticuerpo desinmunizado J591 se proporciona en la presente memoria como la SEC ID n.° 25, y la cadena ligera correspondiente se proporciona en la presente memoria como la SEC ID n.° 26. Se ha utilizado J591 desinmunizado en forma marcada radioactivamente a nivel clínico y se ha mostrado que resulta bien tolerada y que no es inmunogénica (ver Tagawa et al., Cancer, 2010, 116(4), 1075-1083).
Se dan a conocer ejemplos adicionales de anticuerpos que se unen a PSMA en el documento n.° WO03/034903 y los miembros de su familia, incluyendo la patente US n.° 8.470.330b. Por ejemplo, el anticuerpo "AB-PG1-XG1-006" presenta secuencias de cadena pesada y ligera, SEC ID n.° 15 y SEC ID n.° 17, en dichas publicaciones (proporcionadas en la presente memoria como SEC ID n.° 35 y n.° 36) y el anticuerpo "AB-PG1-XG1-026" presenta secuencias de cadena pesada y ligera, SEC ID n.° 19 y SEC ID n.° 21, en dichas publicaciones (proporcionadas en la presente memoria como SEC ID n.° 37 y n.° 38).
El documento n.° WO 2011/069019 describe un monómero de minicuerpo que se une a PSMA. El monómero de minicuerpo del documento n.° WO 2011/069019 está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, una secuencia de scFv que puede unirse a PSMA, una secuencia artificial de bisagra y una secuencia CH3 de IgG humana. El documento n.° WO 2011/069019 también describe un monómero de CysDB que se une a PSMA. El monómero de CysDB del documento n.° WO 2011/069019 puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, una secuencia de scFv que puede unirse a PSMA y una cola de cisteínas. El documento n.° WO 2011/069019 también describe métodos para el diagnóstico o el tratamiento de un cáncer asociado a la expresión de PSMA en un sujeto.
El documento n.° WO 2014/064423 describe conjugados específicos que contienen auristatinas y una proteína o péptido de unión, yy procedimiento para la preparación de las mismas. Los conjugados del documento n.° WO 2014/064423 utilizan tecnología de conectores específica que proporciona ventajas respecto a los conjugados de anticuerpo-fármaco conocidos. El documento n° W o 2014/064423 describe, además, conjugados específicos de fármacos y una proteína o péptido de unión en la que se encuentra presente más de una copia del fármaco.
Además, de presentar buena afinidad de unión para la diana, baja unión fuera de diana y baja inmunogenicidad, un anticuerpo que deba ser un candidato a fármaco (sea por sí mismo o conjugado con otro componente activo) debería presentar una buena estabilidad. Es decir, debe presentar una baja tendencia a desnaturalizarse o a agregarse, o a disociarse en fragmentos componentes. Dado dicho conjunto de exigentes propiedades, sigue existiendo una necesidad de desarrollar anticuerpos anti-PSMA beneficiosos adicionales.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos humanizados que se unen a PSMA. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA y que comprende un dominio variable de cadena pesada y n dominio variable de cadena ligera según la reivindicación 1.
La presente invención proporciona, además, un polinucleótido según la reivindicación 2.
La presente invención proporciona, además, un vector según la reivindicación 3.
La presente invención proporciona, además, una célula huésped según la reivindicación 4.
La presente invención proporciona, además, un conjugado de anticuerpo según la reivindicación 5.
La presente invención proporciona, además, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo para la utilización según la reivindicación 12 o 13.
La presente invención proporciona, además, un método para detectar la presencia de antígeno PSMA en una muestra según la reivindicación 15.
Los anticuerpos y partes de unión a antígeno de la invención presentan una unión fuerte a PSMA, baja inmunogenicidad y buena estabilidad. Los anticuerpos con buena estabilidad resultan ventajosos, ya que presentan menor tendencia a desnaturalizarse o agregarse, o disociarse en fragmentos componentes. Como resultado, pueden residir dentro de la circulación en una conformación nativa durante más tiempo. La fragmentación reducida es una ventaja, ya que un anticuerpo fragmentado (o conjugado de anticuerpo-fármaco) pierde su capacidad de unirse al antígeno diana. Los fármacos citotóxicos tienden a ser hidrofóbicos, y de esta manera, muestran una tendencia a agregarse en solución. Una tendencia reducida a agregarse también es una ventaja para un conjugado de anticuerpofármaco. Los agregados pueden inducir una respuesta inmunitaria, es decir, pueden ser inmunogénicos. Un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo o parte de unión a antígeno de la invención presenta una buena estabilidad y una tendencia reducida a agregarse en solución.
Los anticuerpos y partes de unión a antígeno de la invención muestran buena selectividad, potencia y/o actividad elevada. Los anticuerpos que muestran elevadas selectividad, potencia y actividad resultan especialmente preferentes.
Los anticuerpos y partes de unión a antígeno de la invención también muestran una buena eficiencia de expresión. La eficacia de expresión del anticuerpo es un factor importante en la producción de un anticuerpo o conjugado de anticuerpo-fármaco. Por ejemplo, la obtención de una expresión estable y de alto rendimiento de un anticuerpo es importante para el uso diagnóstico o terapéutico, en el que se requieren grandes cantidades del anticuerpo incluso para llevar a cabo un ensayo clínico. El nivel de expresión de las cadenas ligeras o pesadas y su facilidad de manipulación durante la expresión y purificación pueden influir, de esta manera, en el anticuerpo seleccionado para la producción. Los anticuerpos que se expresan bien con alta solubilidad y baja tendencia a agregarse resultan preferentes.
Cualesquiera referencias en la descripción a métodos de tratamiento se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la estructura de los vectores de expresión pANT para (a) dominios de anticuerpo de cadena pesada y ligera, y (b) antígeno PSMA humano.
La figura 2 muestra la expresión de PSMA en una línea celular transfectada.
La figura 3 muestra la unión competitiva de anticuerpos de la invención y anticuerpos de la técnica anterior a antígeno PSMA según análisis de FACS (los anticuerpos denominados J591 - quiméricos, VH4/VK3, VH5/VK3, VH5/VK4 y J591-Deimm en la figura 4 no se encuentran comprendidos dentro del alcance según la invención reivindicada).
La figura 4 muestra la distribución de proporciones de fármaco a anticuerpo (PFA) para un conjugado de anticuerpo-fármaco preparado utilizando un anticuerpo de la invención.
La figura 5 muestra respuestas de viabilidad celular de células LNCaP al tratarlas con un conjugado de anticuerpofármaco preparado utilizando un anticuerpo de la invención.
La figura<6>muestra respuestas de viabilidad celular de células LNCaP al tratarlas con un conjugado de anticuerpofármaco diferente preparado utilizando un anticuerpo de la invención.
Las figuras 7 a 14 muestran los cambios en volumen tumoral durante el tiempo en un modelo de xenoinjertoin vivoen respuesta a la administración de conjugados de anticuerpo-fármaco utilizando un anticuerpo de la invención. Las figuras 15 a 21 muestra las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de fragmentos de anticuerpo de cadena pesada y ligera de la invención y de la técnica anterior, y las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del antígeno PSMA (SEC ID n.° 1-3, 5-8, 10-12, 14-17, 19-32 y 35-38 no se encuentran comprendidas dentro del alcance según la invención reivindicada).
La figura 22 muestra una alineación de secuencias de cadena pesada y ligera de la invención con secuencias de la técnica anterior.
La figura 23 muestra gráficos de primera derivada de datos de puntos de fusión en bruto obtenidos para los anticuerpos (A) AB-03, (B) AB-P1 y (C) AB-P2.
Descripción detallada
El anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada de dominio variable de SEC ID n.° 13 y un dominio variable de cadena ligera de SEC ID n.° 18 (denominado "VH4/VK4").
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanizados que se unen a PSMA (por ejemplo, PSMA humana) con una constante de equilibrio de disociación (Kd) de<10>'8 M o inferior, por ejemplo, de<10>'9 M o inferior, por ejemplo, de 750*10'12 M o inferior, por ejemplo, de 500*10'12 M o inferior. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a una célula de cáncer de próstata humana.
Los anticuerpos de la invención presentan una estabilidad mejorada en comparación con determinados anticuerpos anti-PSMA humanizados (o desinmunizados) anteriores. De esta manera, los anticuerpos de la invención presentan menor tendencia a desnaturalizarse o agregarse, o a disociarse en fragmentos componentes. Se plantea la hipótesis de que, como resultado, siguen en circulación en una conformación nativa durante más tiempo. Una tendencia reducida a agregarse es una ventaja particular para un conjugado de anticuerpo-fármaco y para reactivos que producen dichos conjugados; los fármacos citotóxicos tienden a ser hidrofóbicos y, de esta manera, los reactivos de conjugación y los conjugados de anticuerpo-fármaco con fármacos citotóxicos presentan una tendencia a agregarse en solución, lo que reduce significativamente su eficacia. Un anticuerpo fragmentado (incluyendo el caso de que sea parte de un conjugado de anticuerpo-fármaco) pierde su capacidad de unirse al antígeno diana. De esta manera, también resulta ventajoso un anticuerpo con una susceptibilidad reducida a la fragmentación.
Un anticuerpo de la invención puede presentar una cadena pesada de isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE. Resultan especialmente preferentes IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Alternativamente, puede presentar una región constante de IgG alterada, por ejemplo, para incrementar o reducir la unión a receptores de Fc o para incrementar o reducir la unión para complementar, por ejemplo, la región constante de IgG puede ser IgG4k o IgG1k. Un anticuerpo de la invención puede presentar una cadena ligera de anticuerpo que sea una cadena ligera kappa.
Un compuesto de la invención puede ser un anticuerpo de longitud completa (p. ej., un anticuerpo IgG4 o IgG1). Alternativamente, puede incluir solo una parte de unión a antígeno. Por ejemplo, un compuesto de la invención puede ser un Fab, F(ab'), F(ab')<2>, una cadena Fd, un fragmento Fv o un Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés), un Fv unido mediante disulfuro (sdFv), un fragmento que comprenda únicamente un dominio VH, incluyendo nanocuerpos o fragmentos de camellos, llamas o similares. La invención proporciona, además, anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos (dos o más moléculas de anticuerpo diferentes unidas entre sí, proporcionando dos o más especificidades), incluyendo por lo menos un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo tal como se ha indicado anteriormente en la presente memoria. La parte de unión a antígeno puede ser, por ejemplo, un minicuerpo compuesto de diferentes permutaciones de fragmentos scFv o diacuerpos y fragmentos Fc o dominios C<h>, tales como proteínas de fusión scFv-Fc, scFv-Fc-scFv, (Fab'ScFv)<2>, scDiacuerpo-Fc, scDiacuerpo-CH3,<sc>F<v>-C<h>3,<sc>F<v>-C<h>2-C<h>3, etc. Puede producirse un fragmento de anticuerpo mediante corte enzimático, o técnicas sintéticas o recombinantes.
Una línea celular de mamífero puede producir un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la invención, especialmente células CHO o NS0. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos o partes de unión a antígeno de los mismos de la invención encuentran utilidad como agentes diagnósticos o terapéuticosin vivoein vitro.
En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos codificantes de los anticuerpos humanizados o partes de unión a antígeno de los mismos, de la invención. De acuerdo con lo anterior, los vectores de expresión recombinantes que incluyen ácidos nucleicos codificantes del anticuerpo de la invención, y células huésped transfectadas con dichos vectores, también se encuentran comprendidos en la invención, al igual que métodos de preparación de los anticuerpos de la invención mediante el cultivo de dichas células huésped. Por ejemplo, los anticuerpos o partes de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden estar codificados por ácidos nucleicos de cadena pesada de IgG humana y de cadena ligera kappa humana con secuencias indicadas en la SEC ID n.° 4 (cadena pesada) o la SEC ID n.° 9 (cadena ligera), o variantes de las mismas.
Por ejemplo, puede determinarse que un ácido nucleico variante se encuentra comprendido dentro del alcance de la invención en donde ello incluye secuencias que contienen o son sustancialmente idénticas a SEC ID n.° 4 o SEC ID n.° 9, por ejemplo, según se determine por su capacidad de hibridarse bajo condiciones restrictivas a un ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, un ácido nucleico de SEC ID n.° 4 o SEC ID n.° 9. El término "hibridar" se refiere a la unión, duplexado o hibridación de una molécula con una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones de hibridación restrictivas en el caso de que esa secuencia se encuentre presente en una mezcla compleja (p. ej., ADN o ARN celular total o de una biblioteca), en el que la secuencia de nucleótidos particular se detecta como por lo menos aproximadamente 10 veces superior al nivel de fondo. Las condiciones de hibridación restrictivas se seleccionan para que sean, por ejemplo, 5 °C a 10 °C inferiores al punto de fusión térmica (Tf) de la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Por ejemplo, las condiciones de hibridación restrictivas pueden ser:
• formamida desionizada al 50 %
• 2x solución salina, citrato sódico (SSC, por sus siglas en inglés) *
• tampón Na<2>HPOV NaH<2>PO<4>50 mM, pH 7,0
• EDTA 1 mM
• ADN/ARN diana (1 mg/ml cada uno)
• sonda (aprox.<2 0>a<2 0 0>ng/ml)
Temperatura: 37 °C a 42 °C; tiempo de hibridación: 5 minutos a 16 horas
* SSC: 1x SSC=NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7,0.
CONJUGADOS
La invención proporciona, además, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, Fab, según la invención, conjugado mediante un conector con una carga que puede ser otra molécula funcional, por ejemplo, un agente terapéutico, diagnóstico o de marcaje, y/o un polímero. Puede encontrarse presente una molécula única de otra molécula funcional, o pueden encontrarse presentes dos o más moléculas. Con frecuencia resulta preferente que los conjugados de anticuerpo-fármaco contengan múltiples copias del fármaco. La molécula funcional puede ser, por ejemplo, otro péptido o proteína, p. ej., un fragmento Fab'. La inclusión de una o más moléculas de fármaco, por ejemplo, un agente citotóxico o una toxina, resulta preferente. Las auristatinas y maitansinoides son fármacos citotóxicos habituales. Entre los agentes de marcaje (que debe entenderse que incluyen los agentes de obtención de imágenes) pueden incluirse, por ejemplo, un radionucleido, un agente fluorescente (por ejemplo, una sonda fluorescente derivatizada con amina, tal como 5-dimetilaminonaftalén-1-(N-(2-aminoetil)sulfonamida-dansil etilendiamina, cadaverina Oregon Green® 488 (número de catálogo 0-10465, Molecular Probes), dansilcadaverina, N-(2-aminoetil)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naftalimida, sal dipotásica (amarillo lucifer etilendiamina) o rodamina B etilendiamina (número de catálogo L 2424, Molecular Probes), o una sonda fluorescente derivatizada con tiol, por ejemplo, L-cistina BODIPY® FL (número de catálogo B-20340, Molecular Probes). El agente de marcaje también puede ser un pigmento, un agente de contraste, un agente bioluminiscente, un enzima, un agente potenciador o una nanopartícula. También puede utilizarse biotina.
En algunas realizaciones, se conjuga un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo con un agente terapéutico. Un "agente terapéutico" tal como se utiliza en la presente memoria es un átomo, molécula o compuesto que resulta útil en el tratamiento de una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por una expresión incrementada de PSMA. Entre los ejemplos de agentes terapéuticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fármacos, agentes quimioterapéuticos, anticuerpos terapéuticos y fragmentos de anticuerpos, toxinas, isótopos radioactivos, enzimas (por ejemplo, enzimas para escindir profármacos para formar un agente citotóxico en el sitio de unión del constructo de unión a antígeno), nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, oligonucleótidos antisentido, quelantes, compuestos de boro, agentes fotoactivos y pigmentos, y nanopartículas.
En algunas realizaciones, un enfoque terapéutico incluye radioinmunoterapia mediante la unión de un marcaje radioactivo apropiado, tal como, yodo-131, un emisor beta, tal como itrio-90, lutecio-177, cobre-67, astato-211, plomo-212/bismuto-212, actinio-225/bismuto-213, y torio, que puede producir daños celulares y la muerte en un tejido diana.
En algunas realizaciones, se utilizan nanopartículas en aplicaciones terapéuticas como portadores farmacológicos que, al conjugarse con un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, transportan agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos hormonales, agentes radioterapéuticos, toxinas o cualquier otro agente citotóxico o anticáncer conocido de la técnica hasta células cancerosas que sobreexpresan PSMA. Cualquiera de los anticuerpos o partes de unión a antígeno de los mismos indicados en la presente memoria pueden conjugarse adicionalmente con uno o más agentes terapéuticos adicionales, marcadores detectables, nanopartículas, portadores o una combinación de los mismos. Por ejemplo, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo puede marcarse radioactivamente con yodo-131 y conjugarse con un portador lipídico, de manera que el conjugado anti-PSMA-lípido forma una micela. La micela puede incorporar uno o más marcadores terapéuticos o detectables. Alternativamente, además del portador, el constructo de unión a antígeno puede marcarse radioactivamente con yodo-131 (por ejemplo, en un residuo de tirosina) y conjugarse con un fármaco (por ejemplo, en el grupo amino epsilón de un residuo de lisina) y el portador puede incorporarse en un marcador terapéutico o detectable adicional.
En algunas realizaciones, las partes de unión a antígeno de la invención se conjugan con un agente terapéutico. Aunque dichas partes de unión a antígeno pueden presentar una semivida de circulación más corta que un anticuerpo de longitud completa, en algunas realizaciones, dichos formatos pueden mostrar una penetración tumoral mejorada basándose en su menor tamaño y resultar terapéuticamente eficaces al armarlos apropiadamente con un fármaco citotóxico o isótopo radioactivo. En algunas realizaciones, puede utilizarse un enfoque de conjugado de anticuerpofármaco. En algunas realizaciones, el tratamiento con dichos fragmentos armados con un fármaco citotóxico o radionucleido resulta en menos toxicidad no específica, ya que se eliminarán más rápidamente del cuerpo.
En algunas realizaciones, se conjuga un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo con un marcador detectable. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "marcador detectable" incluye un átomo, molécula o compuesto que resulta útil en el diagnóstico, detectar o visualizar una localización y/o cantidad de un antígeno PSMA en una célula, tejido, órgano o similar. Entre los marcadores detectables que pueden utilizarse de acuerdo con las realizaciones en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, sustancias radioactivas (por ejemplo, isótopos radioactivos, radionucleidos, marcajes radioactivos o trazadores radioactivos), pigmentos, agentes de contraste, compuestos o moléculas fluorescentes, compuestos o moléculas bioluminiscentes, enzimas y agentes potenciadores (por ejemplo, iones paramagnéticos). Además, algunas nanopartículas, por ejemplo, puntos cuánticos y nanopartículas metálicas, es conocido de la técnica que resultan adecuados para la utilización como un agente de detección. En algunas realizaciones, el marcador detectable es verde indocianina (ICG), zirconio-89, IR800 y/o otro pigmento del infrarrojo cercano.
Entre las sustancias radioactivas ejemplares que pueden utilizarse como marcadores detectables de acuerdo con las realizaciones en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos,<18>F,<18>F-FAC,<32>P,<33>P,<45>Ti,<47>Sc,<52>Fe,<59>Fe,<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu,<67>Ga,<68>Ga,<75>Sc<, 77>As,<86>Y,<90>Y,<89>Sr,<89>Zr,<94>Tc,<94>Tc,<99>mTc<, 99>Mo,<105>Pd,<105>Rh,<111>Ag,<111>In,<123>1<124>1125I<131>1<142>Pr,<143>Pr,<149>Pm,<153>Sm,<154>-<158>Gd,<161>Tb, 166Dy<166>Ho,<169>Er,<175>Lu,<177>Lu,<186>Re,<188>Re,<189>Re,<194>Ir,<198>Au,<199>Au,<211>At,<211>Pb,<212>Bi,<212>Pb,<213>Bi, 223Ra y<225>Ac. Entre las sustancias iónicas paramagnéticas ejemplares que pueden utilizarse como marcadores detectables se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, iones de metales de transición y lantánidos (por ejemplo, metales con números atómicos de 6-9, 21-29, 42, 43, 44 o 57 a 71). Entre dichos metales se incluyen iones de Cr, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb y Lu.
Entre los agentes de contraste ejemplares que pueden utilizarse como marcadores detectables de acuerdo con las realizaciones de la exposición se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, bario, diatrizoato, aceite etiodizado, citrato de galio, ácido yocármico, ácido yocetámico, yodamida, yodipamida, ácido yodoxámico, yogulamida, yohexilo, yopamidol, ácido yopanoico, ácido yoprocémico, ácido yosefámico, ácido yosérico, yosulamida, meglumina, ácido yosemético, yotasul, ácido yotétrico, ácido yotalámico, ácido yotróxico, ácido yoxáglico, ácido yoxotrizoico, ipodato, meglumina, metrizamida, metrizoato, propiliodona, cloruro taloso, o combinaciones de los mismos.
Entre los compuestos o moléculas bioluminiscentes y fluorescentes que pueden utilizarse como marcadores detectables de acuerdo con las realizaciones de la exposición se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC; por sus siglas en inglés), OREGON GREENTM, rodamina, rojo Texas, isotiocianato de tetrarrodamina (TRITC), Cy3, Cy5 y similares, marcadores fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés), ficoeritrina y similares), compuestos fluorescentes autoinhibidos que resultan activados por proteasas asociadas a tumor, enzimas (por ejemplo, luciferasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y similares), nanopartículas, biotina, digoxigenina o una combinación de los mismos.
Entre los enzimas que pueden utilizarse como marcadores detectables de acuerdo con las realizaciones de la exposición se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, glucosa oxidasa, p-galactosidasa, p-glucuronidasa o p-lactamasa. Dichos enzimas pueden utilizarse en combinación con un cromógeno, un compuesto fluorogénico o un compuesto luminogénico para generar una señal detectable.
Los conectores adecuados para unir la carga al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo son los indicados en el apartado sobre Reactivos de conjugación, posteriormente. El conector resulta ventajosamente degradable, tal como se indica posteriormente. En algunas realizaciones preferentes, el conector incluye un polímero, tal como se indica posteriormente.
Los conjugados preferentes según la invención son aquellos en los que la unión de la carga al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se realiza mediante una parte de unión que presenta la fórmula general:
en la que Pr representa dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, cada “Un” representa un nucleófilo presente o unido al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, cada uno de A y B representa independientemente un alquileno C i<-4>o cadena de alquenileno y W representa un grupo aceptor de electrones o un grupo obtenido mediante la reducción de un grupo aceptor de electrones.
Un grupo aceptor de electronesWpuede ser, por ejemplo, un grupo ceto -CO-, un grupo éster -O-CO-, o un grupo sulfona -SO2-. Preferentemente,Wrepresenta uno de dichos grupos o un grupo obtenible mediante reducción de uno de dichos grupos tal como se indica posteriormente. Preferentemente,Wrepresenta un grupo ceto o un grupo obtenible mediante reducción de un grupo ceto, especialmente un grupo CH.OH.
Preferentemente, la agrupación presenta la fórmula siguiente:
especialmente:
Los grupos nucleofílicos en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo los proporcionan, por ejemplo, los residuos de cisteína, lisina o histidina, y Nu puede, por ejemplo, ser un átomo de azufre o un grupo de amina. En una realización preferente de la invención, cada Nu representa un átomo de azufre presente en un residuo de cisteína presente en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo según la invención generalmente contendrá cuatro enlaces disulfuro entre cadenas. Cada uno de ellos puede reducirse para proporcionar grupos tiol libres que actúan como nucleófilos. En el caso de que cada uno de dichos enlaces disulfuro forme un puente en la fórmula I, anteriormente, se producirá un conjugado con una proporción de fármaco-anticuerpo (PFA) de 4. En otra realización, cada Nu representa un grupo imidazol presente en un residuo de histidina presente en una etiqueta polihistidina unida a dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo.
El conjugado de la invención puede presentar, por ejemplo, la fórmula general siguiente:
(((Dq-Lk1)r-P1)p-Lk2-Lk3)e-Ab (III)
en la que D representa la carga;
q representa un número entero entre<1>y<1 0>;
Lk1 representa un conector;
r representa un número entero entre<1>y<1 0>;
P1 representa un enlace o un grupo c-valente -P2-NH- en el que "c" es un valor entre 2 y 11, y P2 es un grupo que contiene por lo menos una unidad etileno: -CH2-CH2- o unidad etilenglicol: -O-CH2-CH2-;
p representa un número entero entre<1>y<1 0>;
Lk2 representa un enlace o un conector d-valente en el que d es un valor entre 2 y 11 y que consiste en 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato;
Lk3 representa un conector de la fórmula general siguiente:
-CO-Ph-Y-Z- (AII)
en la que "Ph" es un grupo fenilo sustituido opcionalmente; Y representa un grupo CO o un grupo CH.OH, y "Z" representa un grupo de la fórmula siguiente:
A -------
en la que cada uno de "A" y "B" representa un grupo alquileno o alquenileno C<1>-<4>;
"Ab" representa el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la invención, unido mediante Lk<3>a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, y
"e" representa un número entero entre<1>y<2>, en el que "s" es el número de enlaces disulfuro presentes en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo antes de la conjugación con Lk3.
Los significados de "q", "r", "e", "c" y "d" determinan el número total de grupos "D" presentes. Este número puede ser, por ejemplo, de hasta 20, por ejemplo de hasta 15, por ejemplo de hasta 10, por ejemplo de 1, 2, 3 o 4.
REACTIVOS DE CONJUGACION
Pueden prepararse conjugados según la invención mediante la reacción de un reactivo de conjugación con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo según la invención. La conjugación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otro modo, aunque preferentemente se lleva a cabo mediante acoplamiento químico. Normalmente, el reactivo de conjugación comprenderá un grupo funcional capaz de reaccionar covalentemente con por lo menos un electrófilo o, especialmente, un nucleófilo presente en el anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, en el que el grupo funcional se une a una carga mediante un conector. Se conocen muchos reactivos de conjugación que pueden utilizarse para conjugar una carga con un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, y puede utilizarse cualquiera de ellos para preparar un conjugado según la invención.
Por ejemplo, el reactivo puede contener un grupo maleimida, un grupo de química click, por ejemplo, un grupo azida o alquino, un grupo amina, un grupo carboxilo o un grupo éster activo. Entre otros posibles enfoques se incluyen la utilización de anticuerpos que se han manipulado recombinantemente con un aminoácido específicamente para la conjugación, tal como cisteínas manipuladas o aminoácidos no naturales, y la conjugación enzimática mediante una reacción enzimática específica, tal como con transglutaminasa. El sitio de reacción en el anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo puede ser de naturaleza nucleofílica o electrofílica. Los sitios de conjugación de proteína comunes se encuentran en residuos aminoácidos de lisina o cisteína o en fracciones de carbohidrato. Alternativamente, la conjugación puede ocurrir en una etiqueta polihistidina que se ha unido al anticuerpo o a una parte de unión a antígeno del mismo.
Un reactivo de conjugación ventajosamente es capaz de reaccionar con un nucleófilo en el anticuerpo o en una parte de unión a antígeno del mismo y, por lo tanto, de unirse químicamente al mismo. De esta manera, el reactivo de conjugación habitualmente incluye por lo menos un grupo saliente que se pierde en la reacción con un nucleófilo. El reactivo de conjugación puede incluir, por ejemplo, dos o más grupos salientes. Preferentemente, el reactivo de conjugación es capaz de reaccionar con dos nucleófilos. Ventajosamente, el reactivo de conjugación comprende por lo menos dos grupos salientes. En el caso de que haya presentes dos o más grupos salientes, estos pueden ser iguales o diferentes. Alternativamente, un reactivo de conjugación podría contener un único grupo que sea químicamente equivalente a dos grupos salientes y en el que el grupo único sea capaz de reaccionar con dos nucleófilos.
Un grupo de reactivos se basa en las bis-halo- o bis-tio-maleimidas y derivados de las mismas, tal como se indica en Smith et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1960-1965 y Schumacher et al., Bioconj. Chem., 2011,22, 132-136. Estos reactivos contienen la agrupación funcional:
en la que cada "L" es un grupo saliente. El átomo de nitrógeno del anillo maleimida podría portar la carga, directa o indirectamente.
De manera similar, podrían utilizarse maleimidas que contienen un único grupo saliente "L":
Nuevamente, el átomo de nitrógeno del anillo maleimida puede portar la carga, directa o indirectamente.
Además, podrían utilizarse maleimidas que carezcan de un grupo saliente:
Nuevamente, el átomo de nitrógeno del anillo maleimida puede portar la carga, directa o indirectamente.
En una realización preferente, el reactivo de conjugación contiene la agrupación funcional:
en la que "W" representa un grupo aceptor de electrones, por ejemplo, un grupo ceto, un grupo éster -O-CO-, un grupo sulfona -SO2-, o un grupo ciano; "A" representa una cadena alquileno o alquenileno C1-5; "B" representa un enlace o una cadena alquileno o alquenileno C1-4, y cada "L" representa independientemente un grupo saliente o ambas "L" juntas representan un grupo saliente. Los reactivos de este tipo se describen en Bioconj. Chem 1990(1), 36 50, Bioconj. Chem 1990(1), 51-59 y J. Am. Chem. Soc. 110, 5211-5212. En el caso de que reactivos que contienen dichos grupos reaccionen con el anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, se pierde un primer grupo saliente "L" para formarin situun reactivo de conjugación que contiene una agrupación funcional de fórmula:
en la que "m" es un valor entre 0 y 4, que reaccionar con un primer nucleófilo. A continuación, se pierde el segundo grupo saliente "L" y ocurre la reacción con un segundo nucleófilo. Como alternativa a la utilización de un reactivo que contiene la agrupación funcional CI como material de partida, pueden utilizarse reactivos que contienen la agrupación funcional CI' como material de partida.
Preferentemente, "W" representa un grupo ceto. Preferentemente, "A" representa -CH2- y "B" representa un enlace. Las agrupaciones funcionales particularmente preferentes de fórmula CI y CI' presentan las fórmulas:
Por ejemplo, el grupo puede presentar la fórmula siguiente:
b ’)
Otro grupo de reactivos de conjugación contiene la agrupación funcional:
~W-CR4R4'-CR4L.L' (CII)
en la que "W" presenta el significado y significados preferentes proporcionados anteriormente, y:
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, R4' representa un átomo de hidrógeno y cada "L" representa independientemente un grupo saliente, o ambas "L" juntas representan un grupo saliente, o
cada R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-4, "L" representa un grupo saliente y R4'y "L'" juntos representan un enlace.
Otro grupo de reactivos de conjugación incluye la agrupación funcional siguiente:
~W-(CH=CH)p-(CH2)2-L (CIII)
o
~W-(CH=CH)p-CH=CH2 (CIN')
en la que "W" presenta el significado y significados preferentes proporcionados anteriormente y "p" representa 0 o un número entero entre 1 y 4, preferentemente 0. Un reactivo especialmente preferente de este tipo incluye la agrupación funcional:
~NH-CO-Ar-CO-(CH<2>)<2>-L (CIIIa)
o
~NH-CO-Ar-CO-CH=CH<2>(CIIIa')
en la que "Ar" representa un arilo sustituido opcionalmente, especialmente un grupo fenilo.
Un grupo saliente "L" puede ser, por ejemplo, -SP, -OP, -SO<2>P, -OSO<2>P, -N+PR2R3, halógeno, -O0, en el que "P" representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo (preferentemente alquilo C<1>-<6>), arilo (preferentemente fenilo), o alquilarilo (preferentemente alquilfenilo C1-6), o es un grupo que incluye una parte -(CH2cH 2O)n-, en la que "n" es un número igual o dos o superior, especialmente 6 o superior, y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-4, o un grupo P, y 0 representa un grupo arilo sustituido, especialmente fenilo, que contiene por lo menos un sustituyente, por ejemplo, -CN, -CF3, -NO2, -CO2R', -COH, -CH2O<h>, -COR', -OR', -OCOR', -OCO<2>R', -SR', -SOR, -SO<2>R', -NHCOR', -NR'COR', -NHCO<2>R', -N R W R ', -NO, -NHOH, -NR'OH, -CH=N-NR'COR', -N+R'<3>, halógeno, especialmente cloro o, especialmente, flúor, -C=CR' y -CH=CR'<2>, en los que cada "R'" representa un átomo de hidrógeno o un alquilo (preferentemente, alquilo C<1>-<6>), arilo (preferentemente fenilo) o alquilarilo (preferentemente alquilfenilo C<1>-<6>). La presencia de sustituyentes aceptores de electrones resulta preferente. Los reactivos de conjugación en los que "P" representa un grupo que incluye una parte -(CH2CH2O)n- en la que "n" es un número igual a dos o superior son el objeto de la solicitud copendiente de los presentes inventores, n.° GB 1418186.1, de la que la solicitud n.° PCT/GB2015/052952, actualmente publicada como el documento n.° WO2016/059377, reivindica prioridad. La presentes solicitud da a conocer lo siguiente:
"El grupo saliente puede incluir, por ejemplo, -(CH2CH2O)n-R1, en donde R1 es un grupo de terminación de cadena. Puede utilizarse un abanico muy amplio de grupos de terminación de cadena. R1 puede ser, por ejemplo, un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, especialmente un grupo alquilo C1-4, particularmente un grupo metilo, o un grupo arilo sustituido opcionalmente, por ejemplo un grupo fenilo sustituido opcionalmente, por ejemplo, un grupo tolilo. Alternativamente, el grupo de terminación de cadena puede incluir un grupo funcional, tal como un grupo carboxilo o un grupo amina. Dichos grupos de terminación de cadena pueden presentar, por ejemplo, la fórmula -CH2CH2CO2H o -CH2CH2NH2, y pueden prepararse mediante funcionalización de la unidad terminal de una cadena -(CH<2>CH<2>O V .
Alternativamente, en lugar de estar terminado con un grupo de terminación de cadena, el grupo -(CH2CH2O)npuede presentar dos puntos de unión dentro del reactivo de conjugación, de manera que estén presentes químicamente el equivalente de dos grupos salientes, capaces de unir los dos nucleófilos.
La parte -(CH2CH2O)n- del grupo saliente se basa en PEG, polietilenglicol. El PEG puede ser de cadena lineal o ramificada, y puede estar derivatizado o funcionalizado de cualquier manera. "n" es un número igual a 2 o superior, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Por ejemplo, "n" puede ser un valor entre 5 y 9. Alternativamente, "n" puede ser un número igual a 10 o superior. No existe ningún límite superior particular para "n". "n" puede ser, por ejemplo, 150 o inferior, por ejemplo 120 o inferior, por ejemplo 100 o inferior. Por ejemplo, "n" puede ser un valor entre 2 y 150, por ejemplo entre 7 y 150, por ejemplo entre 7 y 120. La parte PEG -(CH<2>CH<2>O V de un grupo saliente puede presentar, por ejemplo, un peso molecular entre 1 y 5 kDa; puede ser, por ejemplo de 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa o 5 kDa. Si se desea, un grupo saliente puede contener dos o más partes -(CH<2>CH<2>O V separadas por uno o más espaciadores. Un grupo saliente en un reactivo según la invención presenta convenientemente la fórmula -SP, -OP, -SO<2>P, -OSO<2>P, -N+PR2R3, en donde "P" es un grupo que incluye una parte -(CH2CH2O)n- y cada uno de R2 y R3 representa independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo C1-4, o un grupo "P". Preferentemente, cada uno de R2 y R3 representa un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo o, especialmente, un átomo de hidrógeno. Alternativamente, el reactivo de conjugación puede incluir un grupo de fórmula -S-P-S-; -O-P-O-; -SO2-P-SO2-; -OSO2-P-OSO2- y - N+R2R3-P-N+R2R3-. Entre los grupos específicos de este tipo se incluyen -S-(CH2CH2O)n-S-, -O-(CH<2>CH<2>OVO-; -SO<2>-(CH<2>CH<2>O)n-SO<2>-; -OSO<2>-(CH<2>CH<2>O)n-OSO<2>-, o -N+R2R3-(CH<2>CH<2>O)n-N+R2R3-. También pueden incluir grupos del tipo:
en el que cualquier grupo de enlace adecuado, por ejemplo un grupo alquilo, porta el grupo -(CH<2>CH<2>O)n-. Dichos grupos divalentes son químicamente equivalentes a dos grupos salientes capaces de reaccionar con dos nucleófilos. Un grupo saliente "L" especialmente preferente en un reactivo de conjugación es -SP o -SO2P, especialmente -SO2P. Dentro de este grupo, una realización preferente es una en la que "P" representa un fenilo o, especialmente, un grupo tosilo. Otra realización preferente es una en la que "P" representa un grupo que incluye una parte -(CH2CH2O)n-, especialmente una en la que "n" presenta uno de los valores mencionados anteriormente, especialmente 7. Un grupo saliente "L" especialmente preferente es -SO2-(CH2CH2O)n-H/Me, especialmente -SO2-(CH2CH2O)7-H/Me. A lo largo de toda la presente especificación, cualquier referencia a un grupo saliente "L" debe entenderse que incluye una referencia específica a dichos grupos preferentes, especialmente -SO<2>-(CH<2>CH<2>O)n-H/Me, y más especialmente, -SO2-(CH2CH2O)7-H/Me.
Los reactivos de conjugación pueden contener más de un grupo funcional. Por ejemplo, un reactivo puede contener una agrupación funcional de tipo C en la parte superior en un extremo de la molécula, y una o más agrupaciones funcionales adicionales, capaces de conjugarse con el anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, o cualquier otra molécula, en otro sitio de la molécula. Dichas estructuras se describen en, por ejemplo, Belcheva et al, J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 9(3), 207-226 y resultan útiles en la síntesis de conjugados que contienen múltiples proteínas.
Los reactivos de conjugación que contienen la unidad de fórmula CI/CI' pueden presentar la fórmula (CIc) o (CIc') o, en donde "W" representa un grupo ciano, (CId) o (CId'):
en donde "D" representa una carga y "Q" representa un grupo de enlace.
Los reactivos de conjugación preferentes incluyen lo siguiente:
o
o
D-Q-NH-CO-Ar-CO-(CH<2>)<2>-L (CIIIb)
o
D-Q-NH-CO-Ar-CO-CH=CH<2>(CIIIb')
en las que "D" representa la carga y "Q" representa un grupo de enlace.
El reactivo de conjugación puede presentar, por ejemplo, la fórmula general siguiente:
((Dq-Lk1)r-P1)z-Lk2-Lk3-(L)2 (II)
en la que "D" representa la carga,
q representa un número entero entre 1 y 10;
Lk1 representa un conector;
r representa un número entero entre 1 y 10;
P1 representa un enlace o un grupo c-valente -P2-NH- en el que "c" es un valor entre 2 y 11, y P2 es un grupo que contiene por lo menos una unidad etileno: -CH<2>-CH<2>- o unidad etilenglicol: -O-CH<2>-CH<2>-;
"z" representa un número entero entre 1 y 10;
Lk2 representa un enlace o un conector d-valente en el que d es un valor entre 2 y 11 y que consiste en 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato;
Lk3 representa un conector de la fórmula general siguiente:
-CO-Ph-Y-Z- (EII)
en la que "Ph" es un grupo fenilo sustituido opcionalmente; Y representa un grupo CO o un grupo CH(OH), y "Z" representa un grupo de la fórmula si uiente:
en la que cada uno de "A" y "B" representa un grupo alquileno o alquenileno C<1-4>, y
en donde "L" es un grupo saliente, por ejemplo uno de los indicados posteriormente.
Puede utilizarse cualquier grupo de enlace adecuado "Q" o Lk1. En una realización, Q o Lk1 puede ser, por ejemplo, un enlace directo, un grupo alquileno (preferentemente, un grupo alquileno C<1-10>), o un grupo arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, cualquiera de los cuales puede estar terminado interrumpido por uno o más átomos de oxígeno, átomos e azufre, grupos -NR" (en los que R" representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferentemente, alquilo C<1-6>), arilo (preferentemente fenilo) o alquilarilo (preferentemente alquilfenilo C<1-6>), grupos ceto, grupos -OCO-, grupos -COO-, -O-CO-O, -O-CO-NR"-, -NR"COO-, -<c>O<n>R"- y/o -NR"CO-. Dichos grupos arilo y heteroarilo "Q" forman una realización preferente de la invención. Entre los grupos arilo adecuados se incluyen grupos fenilo y naftilo, mientras que entre los grupos heteroarilo adecuados se incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina. Son grupos de enlace especialmente adecuados Q o Lk1, los grupos heteroarilo o, especialmente, los grupos arilo, especialmente los grupos fenilo. Estos pueden presentar un grupo de enlace al agente terapéutico "D", por ejemplo, un grupo que es o que contiene un grupo -NR"-CO- o -CO-NR"-, por ejemplo, un grupo -NH-CO- o -CO-NH-.
Entre los sustituyentes que pueden estar presentes en un arilo sustituido opcionalmente, especialmente fenilo o grupo heteroarilo se incluyen, por ejemplo, uno o más de los mismos sustituyentes, o sustituyentes diferentes, seleccionados de alquilo (preferentemente alquilo C<1-4>, especialmente metilo, sustituido opcionalmente con OH o CO<2>H), -CN, -NO<2>, -CF<3>, NR"<2>, -CO<2>R", -COH, -CH<2>OH, -COR", -OR", -OCOR", -OCO<2>R", -SR", -SOR", -SO<2>R", -NR"COR", -NR".CO<2>R", -NO, -NHOH, -NR".OH, -CH=N-NR".CO R", -N+R"<3>, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C=CR" y -CH=CR"<2>, en los que cada "R" " representa independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferentemente, alquilo C<1-6>), arilo (preferentemente fenilo) o alquilarilo (preferentemente alquilfenilo C<1-6>). La presencia de sustituyentes aceptores de electrones resulta especialmente preferente. Entre los sustituyentes preferentes se incluyen, por ejemplo, -CN, -CF<3>, -NO<2>, -OR", -OCOR", -SR", -NR"COR", -NHOH y -NR"CO<2>R".
En otra realización, un conector Q o Lk1, o cualquier otro conector en un conjugado según la invención, puede contener un grupo degradable, es decir, puede contener un grupo que se rompe bajo condiciones fisiológicas, separando la carga del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo al que se encuentra unido. Alternativamente, puede ser un conector que no es escindible bajo condiciones fisiológicas.
Los conectores degradables adecuados se analizan en mayor detalle posteriormente.
Los significados de "q", "r", "z", "c" y "d" determinan el número total de grupos "D" presentes. Este número puede ser, por ejemplo, de hasta 20, por ejemplo de hasta 15, por ejemplo de hasta 10, por ejemplo de 1, 2, 3 o 4.
Conectores
Los conjugados de la invención y reactivos de conjugación adecuados para prepararlos contienen un conector que une el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo con la carga. Dicho conector puede ser no degradable o degradable bajo condiciones fisiológicas. Los conjugados ventajosamente comprenden un conector degradable que contiene un grupo que se rompe bajo condiciones fisiológicas, separando la carga del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo al que se encuentra unido, o al que se encontrará finalmente unido. En el caso de que el conector se escinda bajo condiciones fisiológicas, preferentemente resulta escindible bajo las condiciones intracelulares. En el caso de que la diana sea intracelular, preferentemente el conector es sustancialmente insensible a las condiciones extracelulares (es decir, para que la administración en la diana intracelular de una dosis suficiente del agente terapéutico no resulte imposible). Los conectores degradables adecuados se analizan en mayor detalle posteriormente.
En el caso de que un conector, por ejemplo Q o Lk1, contenga un grupo degradable, este es generalmente insensible a las condiciones hidrolíticas, por ejemplo, puede ser un grupo que se degrada bajo determinados valores de pH (p. ej., condiciones ácidas). Pueden encontrarse condiciones hidrolíticas/ácidas, por ejemplo, en los endosomas o lisosomas. Entre los ejemplos de grupos susceptibles de hidrólisis bajo condiciones ácidas se incluyen hidrazonas, semicarbazonas, tiosemicarbazonas, amidas cis-aconíticas, ortoésteres y cetales. Entre los ejemplos de grupos susceptibles a las condiciones hidrolíticas se incluyen:
Por ejemplo, un conector, por ejemplo, Q o Lk1, puede ser:
en cuyo caso está preferentemente unido a grupos "D" y P1", tal como se muestra:
Un conector también puede ser susceptible a la degradación bajo condiciones reductoras. Por ejemplo, puede contener un grupo disulfuro que sea escindible por exposición a agentes reductores biológicos, tales como tioles. Entre los ejemplos de grupos disulfuro se incluyen:
en los que R', R", Rii¡ y Riii¡ son, cada uno independientemente, hidrógeno o alquilo C i-4. En una realización preferente, un conector, por ejemplo, Q o Lk1, es o inclu e:
Por ejemplo, puede ser:
en cuyo caso el conector preferentemente se une a grupos "D" y P1", tal como se muestra:
Un conector, por ejemplo Q o Lk1, puede contener, además, un grupo que es susceptible a degradación enzimática, por ejemplo, puede ser susceptible a la escisión por una proteasa (p. ej., una proteasa lisosómica o endosómica) o peptidasa. Por ejemplo, puede contener un grupo peptidilo que comprende por lo menos un, por ejemplo por lo menos dos, o por lo menos tres residuos aminoácidos (p. ej., Phe-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Val-Ala, Val-Cit o Phe-Lys). Por ejemplo, puede ser una cadena de aminoácidos que presenta entre 1 y 5, por ejemplo entre 2 y 4 aminoácidos. Otro ejemplo de un grupo susceptible a la degradación enzimática es:
en donde "AA" representa una secuencia de aminoácidos, especialmente una que contiene 1 o dos residuos aminoácidos, especialmente una secuencia de aminoácidos específica de proteasa de dos residuos, tal como Val-Cit. En una realización preferente, un conector, por ejemplo, Q o Lk1, es o incluye:
Por ejemplo, puede ser:
en cuyo caso está preferentemente unido a los grupos de carga "D" y "P1", tal como se muestra a continuación:
En una realización, un conector, por ejemplo Q o Lk1, porta una única carga (es decir, q=1 en los reactivos de conjugación de la fórmula (II)). Los conectores específicos (EVa), (EVd) y (EVe) mostrados anteriormente son de este tipo. En otra realización, el conector porta múltiples cargas (es decir, q>1, por ejemplo, 2, 3 o 4 en reactivos de conjugación de la fórmula (II) y el conector se utiliza como un medio para incorporar más de una copia del agente terapéutico en un conjugado de la invención. En una realización, lo anterior puede conseguirse mediante la utilización de un conector de ramificación Lk1 y/o Lk2, que puede, por ejemplo, incorporar un aspartato o glutamato o residuo similar. Lo anterior introduce un elemento de ramificación de fórmula:
en la que "b" es 1,2 o 3, en donde b=1 es aspartato y b=2 es glutamato, y en donde b=3 representa una realización preferente Cada una de las fracciones acilo en la fórmula EVi puede acoplarse con una carga mediante un conector adecuado Lk1a, en donde Lk1a es cualquier conector adecuado, por ejemplo, un conector degradable que incorpora uno de los enlaces mencionados anteriormente. En realizaciones particulares, Lk1a representa el grupo (EVa), (EVd) o (EVe) mostrados anteriormente. El grupo amino del aspartato o glutamato, o residuo similar, puede unirse a P1 por cualquier medio adecuado, por ejemplo, el enlace puede ser mediante un enlace amida, p. ej., el grupo ramificado, anteriormente, puede conectarse con P1 mediante un grupo -CO-CH2-, de esta manera:
Si se desea, el aspartato o glutamato, o residuo similar, puede acoplarse con residuos adicionales de aspartato y/o glutamato y/o similares, por ejemplo:
y de esta manera sucesivamente, proporcionando el potencial de incorporar muchas unidades del agente terapéutico. Tal como anteriormente, cada unidad de carga puede unirse a un aspartato/glutamato, o residuo similar, mediante cualquier conector adecuado Lk1a.
De una manera similar, los aminoácidos lisina, serina, treonina, cisteína, arginina o tirosina, o residuo similar, puede introducirse para formar un grupo de ramificación; de esta manera:
en el que "b" es 4 para la lisina, y
en el que "b" es 1 para la serina.
Polímeros
Los conjugados de la presente invención pueden contener un oligómero o polímero (conjuntamente denominado en la presente memoria "polímero", por conveniencia), junto con el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, según la invención. Por ejemplo, el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo puede conjugarse con un polímero mediante un conector. Alternativamente, el conector mismo puede incluir un polímero, y este puede conjugarse con el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. Un polímero es especialmente un polímero sintético soluble en agua, particularmente polialquilenglicol. Un polímero puede ser, por ejemplo, un polialquilenglicol, una polivinilpirrolidona, un poliacrilato, po rejemplo, poliacriloíl morfolina, un polimetacrilato, una polioxazolina, un alcohol polivinílico, una poliacrilamida o polimetacrilamida, por ejemplo, policarboximetacrilamida o un copolímero de HPMA. Además, el polímero puede ser un polímero que es susceptible a la degradación enzimática o hidrolítica. Entre dichos polímeros, por ejemplo, se incluyen poliésteres, poliacetales, poli(ortoésteres), policarbonatos, poli(iminocarbonatos) y poliamidas, tales como poli(aminoácidos). Un polímero puede ser un homopolímero, copolímero aleatorio o un copolímero definido estructuralmente, tal como un copolímero en bloque, por ejemplo, puede ser un copolímero en bloque derivado de dos o más óxidos de alquileno, o de poli(óxido de alquileno) y un poliéster, poliacetal, poli(ortoéster) o un poli(aminoácido). Entre los polímeros polifuncionales que podrían utilizarse se incluyen copolímeros de éter divinílico-anhídrido maleico y estireno-anhídrido maleico.
También pueden utilizarse polímeros naturales, por ejemplo, polisacáridos, tales como quitina, dextrano, dextrina, quitosano, almidón, celulosa, glucógeno, poli(ácido sialílico), ácido hialurónico y derivados de los mismos. También pueden utilizarse polímeros, tales como ácido poliglutámico, al igual que polímeros híbridos derivados de monómeros naturales, tales como sacáridos o aminoácidos, y monómeros sintéticos, tales como óxido de etileno o ácido metacrílico.
En el caso de que el polímero sea un polialquilenglicol, preferentemente es uno que contenga unidades C<2>y/o C<3>, y es especialmente un polietilenglicol. Un polímero, particularmente un polialquilenglicol, puede contener una única cadena lineal, o puede presentar una morfología ramificada compuesta de muchas cadenas pequeñas o grandes. Los denominados "Pluronics" son una clase importante de copolímeros en bloque de PEG. Se derivan de bloques de óxido de etileno y óxido de propileno. Pueden utilizarse polialquilenglicoles sustituidos, o con terminación de cadena, por ejemplo metoxipolietilenglicol.
El polímero puede ser, por ejemplo, un polímero peine producido mediante el método descrito en el documento n.° WO 2004/113394, el contenido del cual se incorpora en la presente memoria como referencia. Por ejemplo, el polímero puede ser un polímero peine que presenta la fórmula general siguiente:
(F)f-(G)g-(H)h
en la que:
"F", en donde esté presente, puede obtenerse mediante polimerización por adición de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son como se define en "G";
"G" puede obtenerse mediante polimerización por adición de una pluralidad de monómeros que son lineales, ramificados o en forma de estrella, sustituidos o no sustituidos, y que presentan una fracción olefínicamente insaturada;
"H", en donde esté presente, puede obtenerse mediante polimerización por adición de uno o más monómeros olefínicamente insaturados que no son como se define en "G";
"f" y "h" son números enteros entre 0 y 500;
"g" es un número entero entre 0 y 1000;
en donde está presente por lo menos uno de "F" y "G".
Un polímero opcionalmente puede derivatizarse o funcionalizarse de cualquier manera deseada. Pueden unirse grupos reactivos en el extremo o grupo terminal del polímero, o a lo largo de la cadena del polímero mediante conectores colgantes; en este caso, el polímero es, por ejemplo, una poliacrilamida, polimetacrilamida, poliacrilato, polimetacrilato o un copolímero de anhídrido maleico. Si se desea, el polímero puede acoplarse con un soporte sólido mediante métodos convencionales.
El peso molecular óptimo del polímero evidentemente dependerá de la aplicación deseada. Pueden utilizarse polímeros de cadena larga, por ejemplo, el peso molecular medio en número puede ser de hasta aproximadamente 75.000, por ejemplo de hasta 50.000, 40.000 o 30.000 g/mol. Por ejemplo, el peso molecular medio en número puede estar comprendido en el intervalo de entre 500 g/mol y aproximadamente 75.000 g/mol. Sin embargo, los oligómeros muy pequeños, que consiste en cadenas de PEG discretas con, por ejemplo, tan solo 2 unidades repetidas, por ejemplo entre 2 y 50 unidades repetidas, resultan útiles para algunas aplicaciones, y están presentes en una realización preferente de la invención. Por ejemplo, puede utilizarse un polímero que puede contener entre 2 y 48, por ejemplo entre 2 y 36, por ejemplo entre 2 y 24 unidades. Por ejemplo, pueden utilizarse PEG de cadena lineal o ramificada con 12, 20, 24, 36, 40 o 48 unidades repetidas. En el caso de que se desee que el conjugado deje la circulación y penetre en un tejido, por ejemplo, para el uso en el tratamiento de la inflamación causada por neoplasia maligna, infección o enfermedad autoinmune, o por traumatismo, puede resultar ventajoso el uso de un polímero de peso molecular inferior, del orden de hasta 30.000 g/mol. Para aplicaciones en las que el conjugado está destinado a mantenerse en circulación, puede resultar ventajoso el uso de un polímero de peso molecular más alto, por ejemplo comprendido en el intervalo de entre 20.000 y 75.000 g/mol.
Preferentemente, el polímero es un polímero sintético, y preferentemente es un polímero soluble en agua. La utilización de un polietilenglicol soluble en agua resulta particularmente preferente para muchas aplicaciones.
La solicitud copendiente de los presentes inventores n.° GB 1418986.4 de la que la solicitud n.° PCT/GB2015/052953 reivindica prioridad, publicada como el documento n.° WO2016/063006, se refiere a la utilización de conectores que contienen PEG de una estructura particular, y estos pueden utilizarse en la presente invención. La solicitud da a conocer lo siguiente:
"La invención proporciona un conjugado de una proteína o péptido con un agente terapéutico, diagnóstico o de marcaje, en el que dicho conjugado contiene una parte de unión de proteína o péptido y una parte de polietilenglicol, en donde dicha parte de unión de proteína o péptido presenta la fórmula general siguiente:
en la que "Pr" representa dicha proteína o péptido, cada "Nu" representa un nucleófilo presente o unido a la proteína o péptido, cada uno de "A" o "B" representa independientemente una cadena de alquileno o alquenileno C<1-4>y "W " representa un grupo aceptor de electrones o un grupo obtenido mediante reducción de un grupo aceptor de electrones, y en el que dicha parte polietilenglicol es o incluye una cadena de polietilenglicol colgante que presenta n grupo terminal de fórmula -CH<2>CH<2>OR en la que R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo, o un grupo arilo sustituido opcionalmente, especialmente un grupo fenilo, especialmente un grupo fenilo no sustituido.
La invención proporciona, además, un reactivo de conjugación capaz de reaccionar con una proteína o péptido, y que incluye un agente terapéutico, diagnóstico o de marcaje y una parte polietilenglicol, en donde dicho reactivo de conjugación incluye un grupo con la fórmula siguiente:
en la que "W" representa un grupo aceptor de electrones, "A" y "B" presentan os significados proporcionados anteriormente; "m" es un valor entre 0 y 4 y cada "L" representa independientemente un grupo saliente, y en el que dicha parte polietilenglicol es o incluye una cadena polietilenglicol colgante que presenta un grupo terminal de fórmula -CH<2>CH2OR en la que R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C1-4, especialmente un grupo metilo, o un grupo arilo sustituido opcionalmente, especialmente un grupo fenilo, especialmente un grupo fenilo no sustituido.
La invención proporciona, además, un procedimiento para la preparación de un conjugado según la invención, que comprende hacer reaccionar una proteína o péptido con un reactivo de conjugación según la invención.
El conjugado de la invención puede representarse esquemáticamente mediante la fórmula siguiente:
en la que "D" representa el agente terapéutico, diagnóstico o de marcaje; "F' " representa el grupo de fórmula I y PEG representa la cadena polietilenglicol colgante que presenta un grupo terminal de fórmula -CH<2>CH<2>OR.
El reactivo de la invención puede representarse esquemáticamente mediante la fórmula siguiente:
en la que "D" representa el agente terapéutico, diagnóstico o de marcaje; "F' " representa el grupo de fórmula II o II' y PEG representa la cadena polietilenglicol colgante que presenta un grupo terminal de fórmula -CH2CH2OR. El grupo funcional "F" es capaz de reaccionar con dos nucleófilos presentes en una proteína o péptido tal como se explica posteriormente.
Una parte polietilenglicol (PEG) de los conjugados y reactivos de la invención es o incluye una cadena de PEG colgante que presenta un grupo terminal de fórmula -CH<2>CH<2>OR en la que R representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, por ejemplo un grupo alquilo C<1-4>, especialmente un grupo metilo, o un grupo arilo sustituido opcionalmente, especialmente un grupo fenilo, especialmente un grupo fenilo no sustituido. Preferentemente, R es un grupo metilo o un átomo de hidrógeno.
El tamaño global de la parte PEG evidentemente dependerá de la aplicación deseada. Para algunas aplicaciones, pueden utilizarse PEG de peso molecular elevado, por ejemplo, el peso molecular medio en número puede ser de hasta aproximadamente 75.000, por ejemplo de hasta 50.000, 40.000 o 30.000 g/mol. Por ejemplo, el peso molecular medio en número puede estar comprendido en el intervalo de entre 500 g/mol y aproximadamente 75.000 g/mol. Sin embargo, las partes PEG más pequeñas pueden resultar preferentes para algunas aplicaciones.
En una realización preferente, la totalidad de los PEG en la parte PEG está presente en la cadena de PEG colgante. En otra realización, también puede estar presente PEG en el esqueleto de la molécula, lo que se comenta en mayor detalle posteriormente.
Al igual que con la parte PEG, el tamaño de la cadena PEG colgante dependerá de la aplicación deseada. Para algunas aplicaciones, pueden utilizarse cadenas de PEG de peso molecular elevado, por ejemplo, el peso molecular medio en número puede ser de hasta aproximadamente 75.000, por ejemplo de hasta 50.000, 40.000 o 30.000 g/mol. Por ejemplo, el peso molecular medio en número puede estar comprendido en el intervalo de entre 500 g/mol y aproximadamente 75.000 g/mol. Sin embargo, para muchas aplicaciones, pueden utilizarse cadenas de PEG colgantes más pequeñas. Por ejemplo, dicha cadena PEG puede presentar un peso molecular de hasta 3.000 g/mol. Sin embargo, los oligómeros muy pequeños, consistentes en cadenas de PEG discretas con, por ejemplo, tan solo 2 unidades repetidas, por ejemplo entre 2 y 50 unidades repetidas, resultan útiles para algunas aplicaciones, y están presentes como dicha cadena de PEG en una realización preferente de la invención. La cadena de PEG colgante puede ser de cadena lineal o ramificada. Pueden utilizarse cadenas de PEG, por ejemplo, pueden utilizarse cadenas lineales o ramificadas con 12, 20, 24, 36, 40 o 48 unidades repetidas.
PROCEDIMIENTOS DE CONJUGACIÓN
Los reactivos de conjugación que contienen un grupo funcional capaz de reaccionar con el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la invención pueden hacerse reaccionar con el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo para formar un conjugado, y dicha reacción forma un aspecto adicional de la invención. En una realización preferente de dicho aspecto adicional de la invención, se hace reaccionar un reactivo de conjugación que presenta una de las estructuras CI, CI', CII o CIII indicadas anteriormente (incluyendo la totalidad de las subestructuras preferentes) con el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo para formar un conjugado. El producto inmediato del procedimiento de conjugación utilizando uno de dichos reactivos es un conjugado que contiene un grupo aceptor de electrones "W". Sin embargo, el procedimiento de conjugación es reversible bajo condiciones adecuadas. Podría resultar deseable para algunas aplicaciones, por ejemplo, en las que se requiere la liberación rápida de la carga, aunque puede resultar indeseable para otras aplicaciones la liberación rápida de la carga. Por lo tanto, puede resultar deseable estabilizar los conjugados mediante reacción de la fracción aceptora de electrones "W" para proporcionar una fracción que evite la liberación de la carga. De acuerdo con lo anterior, el procedimiento descrito anteriormente puede comprender una etapa opcional adicional de reducción del grupo aceptor de electrones "W" en el conjugado. La utilización de un borohidruro, por ejemplo, borohidruro sódico, cianoborohidruro sódico, borohidruro potásico o triacetoxiborohidruro sódico, como agente reductor resulta particularmente preferente. Entre otros agentes reductores que pueden utilizarse se incluyen, por ejemplo, cloruro de estaño (II), alcóxidos, tales como alcóxido de aluminio, e hidruro de litio y aluminio.
De esta manera, por ejemplo, puede reducirse una fracción "W" que contiene un grupo ceto para formar una fracción que contiene un grupo CH(OH); puede obtenerse un grupo éter mediante la reacción de un grupo hidroxi con un agente eterificante; puede obtenerse un grupo éster mediante la reacción de un grupo hidroxi con un agente acilante; puede prepararse un grupo amina a partir de una cetona mediante aminación reductora, o puede formarse una amida mediante acilación de una amina. Puede reducirse una sulfona en sulfóxido, sulfuro o tiol éter. Puede reducirse un grupo ciano para formar un grupo amina.
Una característica clave de la utilización de reactivos de conjugación de fórmula CI o CII descrita anteriormente es que un grupo saliente a-metileno y un doble enlace se conjugan cruzadamente con una función aceptora de electrones que sirve como fracción activadora de Michael. Si el grupo saliente tiene tendencia a la eliminación en el reactivo de funcionalidad cruzada en lugar del desplazamiento directo y el grupo aceptor de electrones es una fracción activadora adecuada para la reacción de Michael, entonces puede ocurrir la bis-alquilación intramolecular secuencial mediante reacciones consecutivas de Michael y de retro-Michael. La fracción saliente sirve para enmascarar un doble enlace conjugado latente que no resulta expuesto hasta después de ocurrir la primera alquilación, proporcionando un reactivo de fórmula CI', y la bis-alquilación resulta de las reacciones secuenciales e interactivas de Michael y retro-Michael. Los agentes alquilantes de funcionalidad cruzada pueden contener múltiples enlaces conjugados con el doble enlace o entre el grupo saliente y el grupo aceptor de electrones.
En donde la unión al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo se realiza mediante dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, el procedimiento puede llevarse a cabo mediante reducción in situ del enlace disulfuro, seguido de la reacción del producto reducido con el reactivo de conjugación que presenta una de las estructuras C indicadas anteriormente. Preferentemente, el enlace disulfuro se reduce y se elimina cualquier exceso de agente reductor, por ejemplo, mediante intercambio de tampones, antes de introducir el reactivo de conjugación. El enlace disulfuro puede reducirse, por ejemplo, con ditiotreitol, mercaptoetanol o tris-carboxietilfosfina utilizando métodos convencionales.
Las reacciones de conjugación podrían llevarse a cabo bajo condiciones similares a los procedimientos de conjugación conocidos, incluyendo las condiciones dadas a conocer en la técnica anterior. Por ejemplo, al utilizar reactivos de conjugación que presentan una de las estructuras C indicadas anteriormente, podrían llevarse a cabo la reacción de conjugación según la invención bajo condiciones de reacción similares a las indicadas en el documento n.° WO 2005/007197, n.°WO 2009/047500, n.° WO2010/100430, n.° WO 2014/064423 y n.°WO 2014/064424. El procedimiento puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un solvente o mezcla de solventes en la que son solubles todos los reactivos. Por ejemplo, puede dejarse que la proteína reaccione directamente con el reactivo de conjugación de polímero en un medio de reacción acuoso. Dicho medio de reacción también puede estar tamponado, según los requisitos de pH del nucleófilo. El pH óptimo para la reacción generalmente será de como mínimo 4,5, habitualmente de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,5, preferentemente de entre aproximadamente 6,0 y 7,5. Las condiciones de reacción óptimas evidentemente dependerá de los reactivos específicos utilizados.
Las temperaturas de reacción de entre 3 °C y 40 °C generalmente resultan adecuadas al utilizar un medio de reacción acuoso. Las reacciones llevadas a cabo en medios orgánicos (por ejemplo, THF, acetato de etilo, acetona, acetonitrilo, DMF o DMSO) habitualmente se llevan a cabo a temperaturas de hasta la temperatura ambiente. En una realización preferente, la reacción se lleva a cabo en un tampón acuoso que podría contener una proporción de solvente orgánico, por ejemplo hasta 20 % en volumen de solvente orgánico, habitualmente entre 5 % y 20 % en volumen de solvente orgánico.
El anticuerpo o parte de unión a antígeno puede conjugarse eficazmente utilizando un equivalente estequiométrico o un ligero exceso de reactivo de conjugación. Sin embargo, también resulta posible llevar a cabo la reacción de conjugación con un exceso de reactivo de conjugación, y ello puede resultar deseable para algunas proteínas. El reactivo en exceso puede eliminarse fácilmente por medios convencionales, por ejemplo intercambio iónico o cromatografía de HPLc , durante la posterior purificación del conjugado.
Evidentemente, resulta posible conjugar más de un reactivo de conjugación con el anticuerpo o parte de unión a antígeno, en el caso de que el anticuerpo contenga suficientes puntos de unión adecuados. Por ejemplo, en un anticuerpo que contenga dos enlaces disulfuro diferentes, o en un anticuerpo que contenga un enlace disulfuro y que también porte una etiqueta polihistidina, resulta posible conjugar dos moléculas del reactivo por cada molécula de anticuerpo. Los anticuerpos generalmente contienen 4 enlaces disulfuro adecuados y resulta posible mediante una selección adecuada de las condiciones de reacción, conjugar un conector que porte una carga con cada enlace disulfuro. En el caso de que cada conector porte una única carga, ello proporciona un conjugado con una proporción de fármaco-anticuerpo (PFA) de 4. Pueden unirse copias adicionales de la carga mediante la utilización de conectores ramificados, tal como se ha indicado anteriormente.
En el caso de que se conjugue el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con un metal radioactivo o ion paramagnético, en algunas realizaciones, el metal radioactivo o ion paramagnético puede hacerse reaccionar con un reactivo que presenta una cola larga con uno o más grupos quelantes unidos a la cola larga para la unión de dichos iones. En algunas realizaciones, el reactivo puede portar un grupo reactivo diseñado para anclar de manera covalente el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. La cola larga puede ser un polímero, tal como polilisina, polisacárido, polietilenglicol (PEG) u otra cadena derivatizada o derivatizable que presente grupos colgantes a los que podría unirse un grupo quelante para la unión de los iones. Entre los ejemplos de grupos quelantes que podrían utilizarse según las realizaciones en la presente memoria se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, ácido etilendiaminotetracético (EDTA), ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA), d OtA, NOTA, NODAGA, NETA, deferoxamina (Df, que también puede denominarse DFO), porfirinas, poliaminas, éteres corona, bistiosemicarbazonas, polioximas y grupos similares. Los mismos quelatos, en complejo con metales no radioactivos, tales como manganeso, hierro y gadolinio, resultan útiles para resonancia magnética nuclear (RMN) al utilizarlos junto con el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo y portadores indicados en la presente memoria. Resultan útiles quelatos macrocíclicos tales como NOTA, NODAGA, DOTA y TETA con una diversidad de metales y radiometales, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, radionucleidos de galio, itrio y cobre, respectivamente. Pueden utilizarse otros quelatos de tipo anillo, tales como poliéteres macrocíclicos, que resultan de interés para la unión estable de radionucleidos, tales como radio-223 para RAIT. En determinadas realizaciones, pueden utilizarse fracciones quelantes para unir un agente de obtención de imágenes de PET, tal como un complejo de aluminio-18F o de zirconio-89, a una molécula de reconocimiento para la utilización en el análisis PET.
UTILIDAD Y COMPOSICIONES
Los anticuerpos y partes de unión a antígeno de los mismos de la invención, y los conjugados de la invención, encuentran utilidad en el tratamiento, la prevención o el diagnóstico de enfermedades y afecciones mediadas por PSMA o caracterizadas por una expresión incrementada de PSMA. Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo o un conjugado de la invención para la utilización en el diagnóstico o terapia, específicamente para la utilización en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por una expresión incrementada de PSMA. La invención también encuentra utilidad en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por una expresión incrementada de PSMA, que comprende administrar un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo o un conjugado de la invención en un sujeto que lo necesita, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad o afección. En la presente memoria se describe, además, la utilización de un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo, o un conjugado, según la invención, para la utilización en la preparación de un medicamento destinado al diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por una expresión incrementada de PSMA.
En algunas realizaciones, la enfermedad mediada por PSMA es un cáncer, tal como cáncer de próstata o un cáncer no de próstata (incluyendo los cánceres no de próstata descritos en otros sitios en la presente memoria). Un cáncer no de próstata preferentemente se selecciona del grupo que consiste en cáncer de vejiga, incluyendo el carcinoma de células transicionales; el cáncer pancreático, incluyendo el carcinoma del conducto pancreático; el cáncer de pulmón, incluyendo el carcinoma pulmonar no microcítico; el cáncer renal, incluyendo el carcinoma de células renales convencional; el sarcoma, incluyendo el sarcoma de tejidos blandos; el cáncer hepático, incluyendo el adenocarcinoma metastásico; el cáncer de mama, incluyendo el carcinoma mamario; el cáncer cerebral, incluyendo el glioblastoma multiforme; el carcinoma neuroendocrino; el cáncer de colon, incluyendo el carcinoma colónico; el cáncer testicular, incluyendo el carcinoma embrionario testicular, y el melanoma, incluyendo el melanoma maligno. Los tratamientos más eficaces del cáncer generalmente requieren la coadministración de varios fármacos. De esta manera, resulta preferente que el agente activo de la invención se administre en combinación con por lo menos un agente quimioterapéutico adicional.
En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona un método de utilización de anticuerpos o partes de unión a antígeno de los mismos o conjugados de la invención para la detecciónin vitrooin vivode la presencia del antígeno PSMA en una muestra, p. ej., para el diagnóstico de una enfermedad relacionada con PSMA (por ejemplo, una enfermedad humana relacionada con PSMA). En algunos métodos, lo anterior se consigue poniendo en contacto una muestra que debe someterse a ensayo, junto con una muestra de control, con un anticuerpo de la invención o una parte de unión a antígeno del mismo de la invención (incluyendo una molécula biespecífica o multiespecífica) bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y el PSMA. Dicho ensayo puede llevarse a caboin vitro.A continuación, se detecta la formación de complejos (p. ej., mediante ELISA) en las muestras de ensayo y cualquier incremento estadísticamente significativo en la formación de complejos entre las muestras de ensayo y de control es indicativo de la presencia de PSMA en la muestra de ensayo.
En otras realizaciones, la presente invención puede utilizarse en un método de diagnóstico de una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por una expresión incrementada de PSMA, que comprende administrar un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo o un conjugado de la invención conjugado con un agente diagnóstico en un sujeto que presenta, o que se sospecha que presenta, una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por la expresión incrementada de PSMA; exponer el sujeto a un método de obtención de imágenes para visualizar el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo o conjugado marcado, y determinar que el sujeto presenta una enfermedad o afección mediada por PSMA o caracterizada por una expresión incrementada de PSMA.
Para los fines de diagnósticoin vivo,un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo de la invención preferentemente se encuentra en la forma de un conjugado en el que el anticuerpo está marcado con un marcador detectable, tal como se ha descrito anteriormente. Entre los marcadores detectables se incluyen los marcadores radioactivos o los fluorescentes. Entre los marcajes radioactivos que pueden utilizarse en el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno se incluyen, por ejemplo, actinio (225Ac), astato (211At), bismuto (213Bi o 212Bi), carbono (14C), cobalto (57Co), cobre (67Cu), flúor (18F), galio (68Ga o 67Ga), holmio (166Ho), indio (115In, 113In, 112In, o 111In), yodo (131I, 125I, 123I, o 121I), plomo (212Pb), lutecio (177Lu), paladio (103Pd), fósforo (32P), platino (195Pt), renio (186Re o 188Re), rodio (105Rh), rutenio (97Ru), samario (153Sm), escandio (47Sc), tecnecio (99Tc), iterbio (169Yb o 175Yb), o itrio (90Y). Los marcadores fluorescentes adecuados para el uso con anticuerpos y fragmentos de anticuerpos también son conocidos de la técnica.
Una vez marcado con un radionucleido apropiado (p. ej., el emisor de positrones yodo-124, cobre-64, flúor-18, galio-68 y/o zirconio-89 para la obtención de imágenes de PET) o fluoróforo (para la obtención de imágenes de fluorescencia), puede utilizarse el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo para la obtención de imágenes preclínicas y/o para la obtención de imágenes preclínicas del paciente. El anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo también puede utilizarse como posibles agentes de obtención de imágenes de SPECT simplemente modificando el marcaje radioactivo en radionucleidos emisores de fotones individuales, tales como indio-111, yodo-123 y lutecio-177.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o diagnóstica que comprende un anticuerpo o una parte de unión a antígeno del mismo según la invención, o un conjugado según la invención, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. La composición puede, además, si se desea, un ingrediente activo adicional.
EJEMPLOS
Se utilizaron reactivos disponibles comercialmente a los que se hace referencia en los Ejemplos, siguiendo las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario. La fuente de las células en los Ejemplos y a lo largo de la especificación se identifica en cada ocasión mediante los números de acceso ECACC o ATC<c>. ECACC son las siglas en inglés de "European Collection of Cell Cultures", Salisbury, Inglaterra, mientras que ATCC son las siglas en inglés de "American Type Culture Collection", Manassas, EE. UU. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Los métodos y materiales ejemplares se describen a continuación, aunque también pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria, en la práctica o ensayo de la presente invención.
EJEMPLO 1: GENERACIÓN DE ANTICUERPOS
Se seleccionaron cinco cadenas pesadas y cuatro secuencias de cadena ligera (designadas VH1 a VH5 y Vk1 a Vk4, respectivamente). Sus secuencias de aminoácidos son SEC ID n.° 10 a n.° 14 y n.° 15 a n.° 18, respectivamente, y sus secuencias de ácidos nucleicos son SEC ID n.° 1 a n.° 5 y n.° 6 a n.° 9, respectivamente. También se seleccionaron anticuerpos de la técnica anterior de comparación: las secuencias de región V de cadena pesada y ligera de mJ591 (secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 23 y n.° 24, respectivamente, y secuencias de ácidos nucleicos SEC ID n.° 19 y n.° 20, respectivamente) y de J591 desinmunizado (secuencias de aminoácidos SEC ID n.° 25 y n.° 26, respectivamente, y secuencias de ácidos nucleicos SEC ID n.° 21 y n.° 22, respectivamente).
Se sintetizó ADN codificante de regiones V variantes y se subclonaron en vectores de expresión de anticuerpo pANT (figura 1a) con regiones V de cadena pesada y ligera clonadas en pANT17.2 y pANT13.2, respectivamente. Los genes de región V de cadena pesada se clonaron en pANT17.2 mediante los sitiosMluIeHindIIIen el mismo marco de lectura del gen de cadena pesada<y>1 humana (alotipo G1m3 (G1m(f))) y genes de región V de cadena ligera se clonaron en pANT13.2 mediante los sitiosBssHIlyBamHIen el mismo marco de lectura que el gen de región constante de cadena ligera kappa humana (alotipo Km3). La transcripción de ambos genes de cadena pesada y ligera se encontraba bajo el control del promotor I/E del CMV (documentos n.° US5168062 y n.° US5385839, University of Iowa) y el plásmido pANT17 contenido en un minigéndhfrmutante (Simonsen y Levinson, 1983, PNAS 80:2495-2499) bajo el control de un promotor de SV40 y secuencia poliA para la selección en células eucarióticas. Tanto pANT17.2 como pANT13.2 contenían un gen de p-lactamasa (ApR) para la selección procariótica y un origen de pMB1 de replicación para la propagación en células procarióticas. Todos los plásmidos se propagaron enE. coliXL1-blue (Stratagene, n.° de cat. 200130). Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera seguidamente se cotransfectaron establemente en células NS0 mediante electroporación y se seleccionaron los clones expresantes de anticuerpo mediante la inclusión de metotrexato en el medio de cultivo. Todas las combinaciones de cadenas VH y V<k>quiméricas y desinmunizadas (es decir, un total de 20 emparejamientos para las variantes humanizadas de mJ591) se transfectaron en células NS0 y los anticuerpos secretados se purificaron mediante cromatografía de proteína A a partir de los sobrenadantes de cultivo tal como se ha indicado anteriormente.
Los anticuerpos que se prepararon se muestran en la Tabla 1:
Tabla 1:
(continuación)
Antes de la purificación, tanto los tubos como la columna de proteína A se despirogenaron utilizando NaOH 0,4 M. La columna se reequilibró con 20 volúmenes de columna de 1x PBS, pH 7,4. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo celular, se ajustaron a 1x PBS, pH 7,4, utilizando 10x PBS y se esterilizaron mediante filtración. El sobrenadante filtrado se bombeó por la columna a un caudal de 0,5 ml/min. La columna se lavó con 1x PBS, pH 7,4, y se eluyó la IgG utilizando citrato sódico 0,1 M estéril, pH 3, con fracciones de 0,9 ml recogidas y neutralizadas con 0,1 ml de Tris-HCl 1 M estéril, pH 9. Bajo condiciones estériles, se intercambió el tampón del producto en PBS, pH 7,4, para eliminar cualquier tampón de elución. El material purificado con proteína A posteriormente se sometió a ensayo en una columna de CET preparativa HiLoad™ 26/60 Superdex™ de 200 pg (GE Healthcare) utilizando un PBS modificado (fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5) como la fase móvil. El anticuerpo se eluyó en la fracción monomérica seguido de la agrupación, concentración y esterilización mediante filtración de las fracciones de los picos. Tras la concentración, los anticuerpos se cuantificaron a partir de la DO280 nm utilizando un coeficiente de extinción, CE (0,1 %) basándose en la secuencia de aminoácidos predicha de cada anticuerpo.
Ejemplo 2:Generación de líneas celulares NS0 expresantes de PSMA
Se optimizaron los codones para el antígeno PSMA humano de longitud completa (FOLH1_HUMAN, número de acceso de ECACC Q04609) (A<d>N SEC ID n.° 31, secuencia de aminoácidos SEC ID n.° 32), se sintetizó y se subclonó en el vector de expresión pANT17.2 mediante los sitiosBglIIyEagI(eliminando el casete de expresión de cadena pesada de IgG1) (figura 1b). La transcripción del gen de PSMA se encontraba bajo el control del promotor I/E del CMV (documentos n.° US5168062y n.° US5385839, University of lowa) y el plásmido pANT17.2 contenía un minigendhfrmutante (Simonsen y Levinson 1983, PNAS 80:2495-2499) bajo el control de un promotor de SV40 y secuencia poliA para la selección en células eucarióticas. El plásmido pANT17.2 también contenía un gen de plactamasa (ApR) para la selección procariótica y un origen de replicación de pMB1 para la propagación en células procarióticas. Todos los plásmidos se propagaron enE. coliXL1-blue (Stratagene, n.° de cat. 200130). A continuación, el constructo de expresión de PSMA se cotransfectó establemente en células NS0 mediante electroporación y se seleccionaron los clones expresantes de anticuerpo mediante la inclusión de metotrexato en el medio de cultivo. Los clones expresantes de PSMA se analizaron mediante un ensayo basado en FACS.
Se sintetizó el ADN codificante de un anticuerpo de unión a PSMA de control (J415 desinmunizado, SEC ID n.° 27 a n.° 30) y se subclonó en los vectores de expresión pANT17.2 y pANT13.2 tal como se ha descrito anteriormente (ver el documento n.° US7.045.0605). Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera seguidamente se cotransfectaron establemente en células NS0 mediante electroporación y se seleccionaron los clones expresantes de anticuerpo mediante la inclusión de metotrexato en el medio de cultivo. El anticuerpo secretado se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo celular mediante cromatografía de proteína A. Se utilizó el anticuerpo purificado para evaluar la expresión de PSMA de las líneas celulares NS0 transfectadas tal como se describe posteriormente.
La expresión del antígeno PSMA en las células NS0 se evaluó en un ELISA de unión de FACS utilizando J415 desinmunizado como anticuerpo de referencia. Se recolectaron las células NS0 de expresión nula o expresantes de PSMA (5x105 células por tinción), se lavaron una vez con PBS de Dulbecco (PAA Laboratories, Yeovil, Reino Unido), se resuspendieron en tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %/ azida sódica al 0,05 %, suero de cabra al 2,5 %) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las células bloqueadas se resuspendieron en un pocillo con 50 pl de J591 desinmunizado (5 pg/ml) o un control negativo de isotipo correspondiente (5 pg/ml) diluido en tampón de FACS (PBS que contenía BSA al 1 %/ azida sódica al 0,05 %) y se incubó sobre hielo durante 1 hora. Tras la incubación, las células se lavaron 2x con tampón de FACS y después se resuspendieron en 50 pl/pocillo de anticuerpo antihumano-PE (Sigma) diluido 1: 100 en tampón de FACS y se incubó sobre hielo durante 1 hora. Tras la incubación, las células se lavaron 2x con tampón de FACS, se transfirieron a tubos de FACS y se analizaron en un instrumento FACScalibur de Becton Dickinson (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido), recogiendo 15000 sucesos por tubo. Tal como se muestra en la figura 2, se identificó una línea celular principal (6/2F4) que mostró una expresión significativa de PSMA en comparación con la línea celular nula no transfectada.
Ejemplo 3:Análisis de Anticuerpo Humanizados
Se evaluó la unión de variantes de J591 derivadas de NS0 contra el antígeno PSMA en un ELISA de FACS de competición contra J591 quimérico parental y los anticuerpos de referencia J591 desinmunizados. El anticuerpo J591 desinmunizado se marcó fluorescentemente con el kit de marcaje de anticuerpo AlexaFluor 488 (Molecular Probes, Paisley, Reino Unido). Se recolectaron las células NS0 expresantes de PSMA (clon 6/2F4, 3x105 células por tinción), se lavaron una vez con PBS de Dulbecco (PAA Laboratories, Yeovil, Reino Unido), se resuspendieron en tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %/ azida sódica al 0,05 %, suero de cabra al 2,5 %) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los anticuerpos humanizados de ensayo a diversas concentraciones se premezclaron con una concentración constante de anticuerpo J591 desinmunizado y marcado con Alexa-fluor 488 (concentración final de 0,5 ^g/ml). A continuación, se resuspendieron células bloqueadas a razón de 150 ^l/pocillo de las mezclas prediluidas de anticuerpo y se incubaron sobre hielo durante 1 hora. Tras la incubación, las células se lavaron 2x con PBS que contenía BSA al 1 %/ azida sódica al 0,05 %, se transfirieron a tubos de FACS y se analizaron en un instrumento FACScalibur de Becton Dickinson (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido), recogiendo 15000 sucesos por tubo. Los datos se analizaron mediante representación gráfica de la media geométrica de intensidad de fluorescencia frente a la concentración del anticuerpo de ensayo. Tal como se muestra en la figura 3, todas las variantes de PSMA humanizadas principales mostraron perfiles de unión competitiva similares a los anticuerpos J591_m quiméricos y desinmunizados.
Ejemplo 4:Síntesis de reactivos de conjugación que comprenden cargas citotóxicas de auristatina.
Se prepararon reactivos bis-sulfona1y2tal como se describe en el documento n.° WO2014/064423. Se preparó el reactivo 2 de una manera análoga al reactivo1,utilizando una forma bis-sulfuro que se oxidó a bis-sulfona una vez se había unido MMAF.
Ejemplo 5:Síntesis de un reactivo de conjugación que comprenden una carga citotóxica de maintansina.
Se preparó el reactivo de conjugación5bis-sulfona PEG(24)-val-ala-PAB-AHX-DM1 de una manera análoga al reactivo1del Ejemplo 4, tal como se describe en el documento n.° WO2014064424, mediante el acoplamiento de bissulfona-PEG(24)-ácido con val-ala-PAB-AHX-DM1.
Ejemplo 6:Síntesis de reactivos de conjugación7que comprende una carga citotóxica de maintansina.
Etapa 1: Síntesis de compuesto 8
A una solución bajo agitación de ácido 4-[2,2-bis[(p-tolilsulfonil)-metil]acetil]benzoico (1,50 g, Nature Protocols, 2006, 1(54), 2241-2252) en dimetilformamida (D<m>F, 70 ml) se añadió alfa-metoxi-omega-mercapto hepta(etilenglicol) (3,20 g) y trietilamina (2,50 ml). La mezcla de reacción resultante se sometió a agitación bajo una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente. Tras 19 h, se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua (2,4 ml) y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto8en forma de un aceite incoloro transparente espeso (1,77 g). m/z [M+H]+ 901.
Etapa 2: Síntesis de reactivo9
A una solución bajo agitación de8(1,32 g) en metanol: agua (18 ml, 9:1 v/v) a temperatura ambiente se añadió Oxone® (2,70 g). Tras 2,5 h, se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (3x10 ml), se filtró por una columna de sulfato de magnesio y se lavó con diclorometano (2x7 ml). Se agrupó el eluyente y los lavados y se eliminaron los volátiles al vacío, proporcionando un aceite amarillo pálido transparente espeso (1,29 g). Una parte del residuo (700 mg) se disolvió en agua:acetonitrilo (1,50 ml, 3:1 v/v) y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua: acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el reactivo9en forma de un aceite incoloro transparente espeso (524 mg). m/z [M+H]+ 965.
Etapa 3: Síntesis de compuesto10.
Una solución de Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH (36 mg) en DMF (2 ml) se enfrió a 0 °C bajo una atmósfera de argón y se añadió hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris-(dimetilamino)fosfonio (BOP) (41 mg), seguido de NH2-PEG(24u)-OMe (100 mg) y N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) (19 ^l). Se dejó que la solución se calentase hasta la temperatura ambiente y tras 22 h, se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en diclorometano (1 ml) y se purificó mediante cromatografía de columna de fase normal, eluyendo con diclorometano:metanol (100:0 v/v a 80:20 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío, proporcionando Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe] en forma de un aceite incoloro (84 mg). Se añadió piperidina (49 ^l) a una solución del compuesto Fmoc-L-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe] (74 mg) en DMF (2 ml) bajo una atmósfera de argón y la solución resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 22 h, seguido de la eliminación de los volátiles al vacío. El residuo resultante se trituró con hexano (3x0,7 ml). Se decantó el solvente orgánico cada vez y el residuo resultante se secó al vacío, proporcionando el compuesto10en forma de un sólido blanco (61 mg). m/z [M+H]+ (1274, 70 %), [M+2H]2+ (638, 100 %).
Etapa 4: Síntesis de compuesto11
Una solución de compuesto9(26,6 mg) en DMF (550 ^l) se enfrió a 0 °C bajo una atmósfera de argón a la que se añadió HATU (10,5 mg) y la solución se sometió a agitación durante 0,5 h a 0 °C. A lo anterior se añadió una solución de reactivo10(32 mg) en DMF (550 ^l). La solución resultante se sometió a agitación durante 5 min a 0 °C antes de añadir NMM (2,9 ^l) y HATU (10,5 mg). La solución de reacción se dejó bajo agitación a 0 °C durante 2 h antes de calentarla hasta la temperatura ambiente y someterla a agitación durante 3,5 h adicionales. Después de este tiempo, se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 1,2 ml) y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y el solvente acuoso se eliminó mediante liofilización, proporcionando bis-mPEG(7u)sulfonapropanoíl-benzamida-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe] en forma de un aceite incoloro (30,5 mg, 55 %). RMN 1H (400 MHz, MeOH-<54>) 8,19 (2H, d), 8,04 (2H, d), 4,83 - 4,71 (1H, m), 4,58 (1H, dd), 3,92 - 3,83 (6H, m), 3,78 - 3,56 (140H, m), 3,57-3,51 (6H, m), 3,40 (4H, dd), 3,36 (3H, s), 3,35 (6H, s), 2,41 (2H, t), 2,24 -2,13 (1H, m), 2,10 - 1,98 (1H, m), 1,45 (9H, s); m/z [M+Na]+(2243, 50 %), [M+H]+(2221, 40 %), [M+Na+2H]3+ (747, 100 %). Una solución de bismPEG(7u)sulfona-propanoíl-benzamida-Glu-[OtBu]-[PEG(24u)-OMe] (30 mg) en diclorometano (2 ml) bajo una atmósfera de argón se enfrió a 0 °C a la que se añadió ácido trifluoroacético (500 ^l) y la solución resultante se sometió a agitación durante 1,5 h. Se dejó que la mezcla de reacción se calentase hasta la temperatura ambiente y se sometió a agitación durante 1 h adicional. Después de este tiempo, se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1, 0,6 ml) y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto11en forma de un aceite incoloro (20 mg). RMN 1H (400 MHz, MeOH-<54>) 8,19 (2H, d), 8,04 (2H, d), 4,81 - 4,72 (1H, m), 4,59 (1H, dd), 3,92 - 3,84 (6H, m), 3,67 - 3,50 (146H, m), 3,40 (4H, dd), 3,36 (3H, s), 3,35 (6H, s), 2,48 (2H, t), 2,26 - 2,15 (1H, m), 2,15 - 2,03 (1H, m); m/z [M+H]+ (2165, 55 %), [M+2H]2+ (1083, 60 %), [M+2H+Na]3+ (729, 100 %).
Etapa 5: Síntesis de reactivo7.
Una solución de compuesto11(15,0 mg) en DMF (600 ^l) se enfrió a 0 °C bajo una atmósfera de argón. Se añadió HATU (2,9 mg) y la solución se sometió a agitación durante 0,5 h a 0 °C. A lo anterior se añadió una solución de valala-PAB-AHX-DM1 (Concortis/Levena Biopharma, 9,2 mg) y Nm M (0,8 ^l) en DMF (600 ^l), que se había sometido a agitación a temperatura ambiente durante 0,5 h. Tras 5 min, se añadió una cantidad adicional de HATU (0,7 mg) y NMM (0,8 ^l) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a 0 °C. Tras 3 h, se añadió una cantidad adicional de HATU (0,7 mg) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a 0 °C. Tras 2 h adicionales, la reacción se almacenó a - 20 °C durante 16 h. La solución de reacción se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua: acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo:ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto 7 en forma de un aceite incoloro transparente espeso (14,3 mg). RMN 1H (600 MHz, MeOH-d<4>) (señales características seleccionadas) 5,69 (1H, dd,), 6,59 (1H, dd), 6,68 (1H, s), 6,69 (1H, d), 7,10 (1H, s), 7,28 (2H, d), 7,57 (2H, d), 8,01 (2H, d), 8,16 (2H, d).
Ejemplo7:Síntesis de reactivo de conjugación12que comprende una carga citotóxica de auristatina.
Se sintetizó el reactivo 12 de manera análoga al reactivo 1 del Ejemplo 4 a partir de compuesto 11 y sal de TFA de val-cit-PAB-MMAE (Concortis/Levena Biopharma) que presentaba la estructura a continuación:
El reactivo12se aisló en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]+(3270, 12 %), [M+2H]2+ (1636, 50 %), [M+3H]3+ (1091, 100 %).
Ejemplo 8:Síntesis de reactivo de conjugación13que comprende una carga citotóxica de auristatina.
A la sal de TFA de val-cit-PAB-MMAE (25,0 mg) se añadió una solución de reactivo9(15,6 mg) en DMF (1,5 ml) y se sometió a agitación bajo una atmósfera de nitrógeno inerte a temperatura ambiente durante 5 min. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadieron alícuotas de HATU (6,1 mg) y NMM (1,8 ^l) cada 20 min durante un total de 5 adiciones. Tras 1,5 h, la mezcla de reacción se calentó hasta la temperatura ambiente. Tras 2 h, se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se disolvió en agua y acetonitrilo (v/v; 1/1,0,6 ml) y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05% y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05% (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el reactivo13en forma de unos polvos blancos (22,4 mg). m/z [M+2H]2+ 1035.
Ejemplo 9:Síntesis de reactivo de conjugación14que comprende una carga citotóxica de auristatina.
Etapa 1: Síntesis de compuesto15.
Se disolvió Boc-L-Glu (134,9 mg) y BOP (724 mg) en DMF anhidro (4 ml) y se sometieron a agitación a 0 °C bajo una atmósfera de nitrógeno. A continuación, dicha solución se añadió a una solución de H2N-PEG(12u)-Me (685 mg) y NMM (179,8 ^l) en DMF (3 ml), que había sido previamente sometida a agitación durante 75 min. A continuación, la solución agrupada se sometió a agitación bajo nitrógeno a 0 °C durante 4,5 h. Se añadió BOP adicional (241 mg) y NMM (60 ^l) y la mezcla de reacción se dejó en reposo durante 24 h a 4 °C. Se eliminaron los volátiles al vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %:ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 65:35 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización. El material se purificó nuevamente mediante cromatografía flash de fase normal eluyendo con acetato de etilo/metanol 100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto15en forma de un aceite incoloro (450 mg). m/z [M+H]+ (1331, 100 %), [M+2H]2+ (666, 100 %).
Etapa 2: Síntesis de compuesto16.
Se disolvió el compuesto15(450 mg) en diclorometano (25 ml) al que se añadió ácido trifluoroacético (2,5 ml). La solución se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 5 h. Después de este tiempo se eliminaron los volátiles al vacío. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 60:40 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto16en forma de un sólido incoloro transparente (320 mg). m/z [M+H]+ (1253, 10 %), [M+H]2+ (617, 100 %).
Etapa 3: Síntesis de compuesto17.
A una solución bajo agitación de Fmoc-L-Glu-(OtBu)-OH (36,6 mg) en DMF anhidro (2 ml) se añadió HATU (37,30 mg). La mezcla de reacción se sometió a agitación a 0 °C bajo una atmósfera de nitrógeno durante 1 h y después se añadió a una solución de compuesto16(103,5 mg) y NMM (19,2 ^l) en DMF (1 ml). Se añadió DMF adicional (1 ml). Se dejó que la solución se calentase hasta la temperatura ambiente durante 5 h. Se eliminaron los volátiles al vacío. El aceite amarillo pálido resultante se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 50:50 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto17en forma de un sólido blanco (173 mg). m/z [M+H]+ (1638, 100 %), [M+Na]+ (1661, 60 %).
Etapa 4: Síntesis de compuesto18.
A una solución bajo agitación de compuesto17(173 mg) en DMF anhidro (3,2 ml) se añadió piperidina (104,4 ^l). La solución se sometió a agitación a temperatura ambiente bajo argón durante 1,5 h. Se eliminaron los volátiles al vacío y el residuo se trituró repetidamente con hexano (5x10 ml). El producto se secó al vacío, proporcionando el compuesto18(152 mg) en forma de un aceite incoloro transparente. m/z [M+H] (1417, 85 %), [M+2H]2+ (709, 100 %), [M+Na]+ (1439, 30 %)
Etapa 5: Síntesis de compuesto19.
A una solución bajo agitación de compuesto9(114 mg) en DMF anhidro (3 ml) se añadió HATU (51,4 mg). La mezcla de reacción se sometió a agitación a 0 °C durante 0,5 h; a continuación, se añadió a una solución de compuesto18(152,0 mg) en DMF (3 ml), seguido de NMM (14,8 ^l). La mezcla de reacción se sometió a agitación en un baño de hielo durante 3,5 h, seguido de la eliminación de los volátiles al vacío. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1% y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1% (100:0 v/v a 55:45 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto19en forma de un aceite incoloro transparente (160,6 mg). m/z [M+H]+ (2367, 95 %), [M+2H]2+ (1184, 80 %).
Etapa<6>: Síntesis de compuesto20.
A una solución bajo agitación de compuesto19(156 mg) en diclorometano anhidro<( 6>ml) se añadió ácido trifluoroacético<( 6>ml). La mezcla de reacción se sometió a agitación a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de la eliminación de los volátiles al vacío, la disolución del residuo en agua (25 ml) y la liofilización, proporcionando el compuesto20en forma de un aceite incoloro transparente (156 mg). m/z [M+H] (2307, 90 %), [M+<2>H]2+ (1153,<100>%).
Etapa 7: Síntesis de reactivo14.
Se sintetizó el reactivo14de manera análoga al reactivo1del Ejemplo 4 a partir de compuesto20y sal de TFA de val-cit-PAB-MMAE. El reactivo14se aisló en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]+ (3410, 40 %), [M+2H]2+ (1706, 60 %), [M+3H]3+ (1137, 85 %), [M+4H]4+ (854, 70 %).
Ejemplo 10: Síntesis de reactivo de conjugación21que comprende una carga citotóxica de auristatina.
Etapa 1: Síntesis de compuesto22.
A una solución bajo agitación de Fmoc-L-Glu-(O/Bu)-OH (2 g) en DMF anhidro (18 ml) se añadió HOBt (666 mg) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) (768 ^l). La mezcla de reacción se sometió a agitación a 0 °C durante 1o min y, a continuación, durante 2,5 h a temperatura ambiente. Se añadieron H-L-Glu-(O/Bu)-OH (1,19 g) y DIPEA (2,46 ml) y la mezcla de reacción se sometió a agitación durante 18 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml) y se acidificó a pH 2,0 mediante la adición de ácido clorhídrico diluido. Se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo (3x100 ml) y se agruparon las fases orgánicas y se lavaron con agua (2x50 ml) y solución hipersalina saturada (1x50 ml). La capa de acetato de etilo se secó sobre sulfato sódico durante 2 h, se filtró y el filtrado se concentró al vacío. El producto se aisló mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v):agua: acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1 % (100:0 v/v a 80:20 v/v). El solvente orgánico se eliminó al vacío y el solvente acuoso se eliminó mediante liofilización, proporcionando el compuesto22en forma de un sólido blanco (875 mg). m/z [M+H]+ (611, 85 %), [M+Na]+ (633, 55 %), [2M+Na]+ (1243, 55 %).
Etapa 2: Síntesis de compuesto23.
A una solución agitada del compuesto22(510 mg) y NH2-PEG(24u)-OMe (1 g) en DMF anhidro (5 mL) se añadió DIPEA (43.8 ^L) and HATU (47.6 mg). La mezcla de reacción se sometió a agitación a 0 °C durante 10 min y, a continuación, durante 16 h a temperatura ambiente. La solución se concentró al vacío a 2 ml y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido fórmico al 0,1% y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido fórmico al 0,1% (100:0 v/v a 83:17 v/v). El solvente orgánico se eliminó al vacío y el solvente acuoso se eliminó mediante liofilización, proporcionando el compuesto23en forma de un sólido blanco (644 mg). m/z [M+H]+ (1681,40 %), [M+Na]+ (1703, 55 %), [M+2H]2+ (841,55 %).
Etapa 3: Síntesis de compuesto24.
A una solución agitada del compuesto23(193 mg) en DMF anhidro (900 pL) se añadió piperidina (34 pL) y se agitó la reacción de mezcla por 1 h a temperatura ambiente. La solución se concentró al vacío a sequedad y el residuo se trituró con éter dietílico (2x2,5 ml). El producto se secó al vacío, proporcionando el compuesto24en forma de un sólido blanquecino (166 mg).
Etapa 4: Síntesis de compuesto25.
Se sintetizó el reactivo25de manera análoga al reactivo19del Ejemplo 9 a partir de compuesto24y compuesto9. Se aisló el reactivo25en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]+ (2407, 25 %), [M+Na]+ (2429, 70 %).
Etapa 5: Síntesis de reactivo26.
Se sintetizó el reactivo26de manera análoga al reactivo20del Ejemplo 9 a partir de reactivo25. Se aisló el reactivo26en forma de un aceite incoloro. m/z [M+H]+ (2294, 20 %), [M+Na]+ (2317, 10 %).
Etapa 6: Síntesis de reactivo21.
A una solución bajo agitación de reactivo26(28,1 mg), sal TFA de val-cit-PAB-MMAE (30,6 mg) y HATU (13,9 mg) en DMF anhidro (1,5 ml) se añadió NMM (6,7 pl) y la mezcla de reacción se sometió a agitación a 0°C durante 5 h. La solución se diluyó con agua (1 ml) y se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua: acetonitrilo al 5 %: TFA al 0,1 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: TFA al 0,1 % (100:0 v/v a 60:40 v/v). El solvente orgánico se eliminó al vacío y el solvente acuoso se eliminó mediante liofilización, proporcionando el reactivo21en forma de un sólido blanco (36,1 mg). m/z [M+2H]2+ (2253, 40 %), [M+3H]3+ (1502, 60%),[M+4H]4+ (1127, 100 %).
Ejemplo 11:Protocolo general de conjugación de reactivos con anticuerpos anti-PSMA para producir conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) con RFA 4.
Una solución de anticuerpo anti-PSMA (p. ej., AB-03) a una concentración de 5,2 mg/ml en tampón de reacción (fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 20 mM, pH 7,5) se calentó a 40 °C durante 15 min. Se añadió TCEP (6 equiv. por cada mAb) a la solución de mAb, se mezcló suavemente y se incubó a 40 °C durante 1 h antes de dejar que se enfriase a 22 °C. Se disolvieron los reactivos de conjugación1,2,5,7,12,13,14y21en MeCN o DMF, proporcionando una solución madre 1,6 mM. La solución de mAb reducida se diluyó a 4,2 mg/ml con tampón de reacción. Se añadió reactivo de conjugación (6 equiv. por cada mAb) a la solución de mAb; la reacción se mezcló suavemente y se incubó a 22 °C durante 6 a 22 h. Tras la incubación, la reacción se trató con N-acetil-L-cisteína 50 mM (20 equiv. en exceso respecto al reactivo) a 22 °C durante 1 h.
Las muestras de reacción pueden analizarse mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) utilizando una columna TOSOH TSK-gel butilo-NPR. La superficie de cada pico obtenida para cada variante separada de relación de fármaco a anticuerpo (RFA) (identificada por la relación del máximo de absorción de UV para fármaco y anticuerpo y orden de elución del pico) se representó gráficamente en forma de histograma. Los resultados de las conjugaciones<con los reactivos 1 y 2, que dan lugar a los CAF 3 y>4<, respectivamente, se muestran en las figuras 4A y 4B,>respectivamente. El producto principal de cada reacción era el conjugado de RFA 4.
Las mezclas de reacción se purificaron mediante Cih preparativa utilizando resina ToyoPearl Phenyl 650S equilibrada con tampón A: fosfato sódico 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,0 y tampón B: 80 % fosfato sódico 50 mM y 20 % isopropanol, pH 7,0. Se añadió un volumen igual de NaCl 4,0 M en fosfato sódico 50 mM, pH 7,0, a la mezcla de conjugación, que a continuación se inyectó en la columna y posteriormente se eluyó utilizando un gradiente de tampón B de 0 % a 100 %. Se recogieron las fracciones de los picos eluidos y se analizaron mediante CIH analítica. Se agruparon las fracciones que contenían RFA 4, se intercambió el tampón por PBS, pH 7,4, y se concentró en concentradores VivaSpin 20 (nivel de corte de peso molecular (MWCO, por sus siglas en inglés) de 10 kDa, membrana de PES). Se cuantificó la muestra final mediante ensayo de Bradford previamente a una evaluación ulterior. Los reactivos de<conjugación 1, 2,>5<, Z , 12, 13, 14 y 21 produjeron los CAF 3, 4 , 6, 27, 28, 29, 30 y 31, respectivamente.>
Ejemplo 12: Conjugación de anticuerpo anti-PSMA con el reactivo maleimida mc-vc-PAB-MMAE para producir el conjugado32con PFA 4 promedio.
Se calentó a 40 °C durante 15 min anticuerpo anti-PSMA AB-03 a una concentración de 5,2 mg/ml en tampón de reacción, se añadió TCEP (2 eq.) a la solución de mAb, se mezcló suavemente y después se incubó a 40 °C durante 1 h y se dejó enfriar a 22 °C. El reactivo de maleimida, mc-val-cit-PAB-MMAE (Concortis/Levena Biopharma) se disolvió en MeCN, proporcionando una solución madre 2,1 mM. La solución de mAb reducida se diluyó a 4,2 mg/ml con tampón de reacción. Se añadió mc-val-cit-PAB-MMAE (4 eq. por mAb) a la solución de mAb, la reacción se mezcló suavemente y se incubó a 22 °C durante 1 h. La reacción se trató con N-acetil-L-cisteína 50 mM (20 eq. en exceso respecto al reactivo) y se dejó que transcurriese a 22 °C durante 1 h. La mezcla de conjugación en bruto se analizó mediante cromatografía de interacción hidrofóbica. Se diafiltró la reacción en bruto (Vivaspin 20, 10 kDa, membrana de PES) para eliminar los reactivos y concentrar el conjugado. Se intercambió el tampón de la muestra concentrada por DPBS, pH 7,1 a 7,5, y después se filtró a esterilidad (membranas de PVDF de 0,22 pm).
Ejemplo 13:Conjugación de anticuerpos AB-P1 y AB-P2 con mc-vc-PAB-MMAE para producir conjugados33y34de RFA media 4 (ejemplo no comprendido dentro del alcance de la invención reivindicada).
La conjugación se llevó a cabo de una manera análoga a la producción de conjugado32del Ejemplo 12.
Ejemplo 14:Análisis in vitro de eliminación celular de un anticuerpo anti-PSMA RFA3preparado a partir del reactivo de conjugación1bis-sulfona-PEG(24u)-val-cit-PAB-MMAE.
La pérdida de viabilidad de las células tumorales tras el tratamiento con fármacos citotóxicos o CAF in vitro puede medirse mediante el cultivo de líneas celulares en la presencia de concentraciones crecientes de fármacos o<c>A<f>y la cuantificación de la pérdida de actividad de proliferación o metabólica utilizando el reactivo de luminiscencia CellTiter Glo® (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res. 2008; 68:9280-9290). El protocolo describe la inoculación celular, el tratamiento con fármaco y la determinación de la viabilidad celular en referencia a las células no tratadas basándose en la síntesis de ATP, que está directamente relacionado con el número de células presente en el pocillo.
Se desprendieron las células LNCaP (clon FGC) y C4-2 positivas para PSMA, así como las células PC-3 negativas para PSMA, con TrypLE y se resuspendieron en medio completo. Las células se contaron utilizando cámaras de recuento de Neubauer desechables y se ajustó la densidad celular a 10*104 células/ml para LNCaP, 2*104 células/ml para C4-2 y 1*104 células/ml para PC-3, respectivamente. Se sembraron células (100 pl/pocillo) en placas de 96 pocilios blancas de paredes opacas de cultivo de tejidos tratadas (C4-2) o recubiertas con poli-D-lisina (LNCaP y PC-3), y se incubaron durante 24 h a 37 °C y con 5 % de CO<2>. Las líneas celulares tumorales LNCaP (Cr L-1740 y PC-3 (CRL-1435) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células LNCaP y C4-2 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía glutamina 2 mM (Life Technologies®), suero bovino fetal al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Se cultivaron las células PC-3 en F-12K de Ham (Life Technologies®), suero de feto bovino al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina (Invitrogen). Se mantuvieron las células tal como se describe en las hojas de información de producto y siguiendo las recomendaciones generales de la ATCC para el cultivo de tejidos. Las células se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones de la ATCC y referencias citadas en las mismas, por ejemplo, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, por R. lan Freshney 3a edición, publicado por Alan R. Liss, N.Y. 1994, o 5a edición, publicada por Wiley-Liss, N.Y. 2005.
El ensayo de viabilidad celular se llevó a cabo utilizando el reactivo de luminiscencia Cell-Titer Glo® siguiendo las instrucciones del fabricante (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Lewis Phillips G.D, Cancer Res. 2008; 68:9280-9290). Se registró la luminiscencia utilizando un lector de placas (p. ej., el lector de placas Spectramax M3 de Molecular Devices) y los datos se analizaron posteriormente utilizando un modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros.
En caso de representarse gráficamente, la viabilidad se expresó como % de las células no tratadas y se calculó utilizando la fórmula siguiente:
Se representó gráficamente el % de viabilidad (eje Y) frente al logaritmo de la concentración de fármaco en nM (eje X) para extrapolar los valores de IC<50>para todos los conjugados, así como los fármacos libres.
Se determinó la actividadin vitrodel RFA3mediante la medición del efecto de inhibición del crecimiento celular de la línea celular de cáncer sobreexpresante de receptor de PSMA, LNCaP. También se incluyó en el estudio un conjugado de mAb-fármaco no ligante de RFA 4 de control, a fin de demostrar la eliminación celular selectiva de antígeno. El control de no unión era un CAF de trastuzumab preparado a partir del reactivo de conjugación1mediante el método utilizado para preparar3. El trastuzumab se une a la diana HER-2, que no está presente, o que está presente a niveles muy bajos, sobre las células LNCap. De esta manera, el CAF de trastuzumab no está dirigido específicamente a estAS células y solo debería presentar un efecto citotóxico no específico.
Se llevaron a cabo diluciones en serie de CAF o fármaco libre (MMAE) por triplicado mediante pipeteado en una placa de 96 pocillos entre las columnas 3 y 10 con diluciones de 2 a 2,5 veces para MMAE o el conjugado de RFA 4 de MMAE, respectivamente, en medio de cultivo celular como diluyente. Las células LNCaP se trataron con las concentraciones de fármaco libre o conjugado de fármaco mostradas en la Tabla 2. Posteriormente, las células se incubaron con el fármaco (volumen total 200 pl/pocillo) a 37 °C y con 5 % de CO<2>durante 96 h adicionales.
Tabla 2
Se muestran los resultados en la figura 5 y se muestran los valores de IC<50>en la Tabla 3, que ilustra las respuestas de viabilidad celular al tratamiento con CAF3o fármaco libre dentro de las células LNCaP. El CAF3es activo dentro de la línea celular LNCaP positiva para PSMA, mientras que el CAF de control de trastuzumab no ligante muestra un efecto citotóxico nulo o reducido sobre dichas células. Los datos de CAF de trastuzumab no permitieron determinar un valor de IC<50>.
Tabla 3
Ejemplo 15:Análisis in vitro de la eliminación celular de un CAF anti-PSMA6preparado a partir del reactivo de conjugación5bis-sulfona-PEG(24u)-val-ala-PAB-AHX-DM1.
Se determinó la actividad in vitro del CAF6de RFA 4 tal como se ha indicado para el CAF3en el Ejemplo 14. Se llevaron a cabo diluciones en serie de CAF por triplicado mediante pipeteado en una placa de 96 pocillos entre las columnas 3 y 10 con diluciones de 2,5 a 3 veces para el CAF6o el conjugado de control de trastuzumab, respectivamente, utilizando medio de cultivo celular como un diluyente. Al igual que dentro del Ejemplo 14, se utilizó un CAF de trastuzumab de control no ligante para demostrar la eliminación celular selectiva de antígeno por el CAF6. Se preparó el control no ligante a partir del reactivo de conjugación5mediante el mismo método utilizado para preparar6. El trastuzumab se une a la diana HER-2, que no está presente, o que está presente a niveles muy bajos, sobre las células LNCap. De esta manera, el CAF de trastuzumab no está dirigido específicamente a dichas células y solo debería presentar un efecto citotóxico no específico.
La línea celular positiva para PSMA, LNCaP se trató con las concentraciones de fármaco libre o conjugado mostradas en la Tabla 4.
Tabla 4
Los resultados se muestran en la figura 6, que ilustra las respuestas de viabilidad celular al tratamiento con CAF 6 o CAF de control de trastuzumab en las células LNCaP. Se expresa la viabilidad como % de células no tratadas. Se representó gráficamente el % de viabilidad (eje Y) frente al logaritmo de la concentración de fármaco en nM (eje X) para determinar los valores de IC<50>para ambos conjugados. Los valores de IC<50>se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5:
Tal como se muestra en la figura 6 y en la Tabla 5, el CAF6es activo en la línea celular LNCaP positiva para PSMA.
Ejemplo 16:Análisis de conjugados de anticuerpo-fármaco y cargas libres mediante ensayo in vitro de viabilidad celular.
Se determinaron las eficaciasin vitrode los CAF27,28,29,30y31, preparados tal como se describe en el Ejemplo 11, y los CAF32,33y34, preparados tal como se describe en los Ejemplos 12 y 13, respectivamente, mediante la medición de su efecto inhibitorio sobre el crecimiento celular de las líneas celulares de cáncer sobreexpresantes de PSMA, tal como se describe en el Ejemplo 14.
Se prepararon diluciones en serie de ocho puntos de CAF o fármacos libres en el medio de cultivo relevante. La totalidad de las tres líneas celulares se trató con concentraciones de CAF de entre 50 y 0,00064 nM. Se utilizó MMAE a una concentración de entre 500 y 0,0064 nM sobre células C4-2 y de entre 10.000 y 0,128 nM sobre tanto células LNCaP como PC-3. Se eliminó el medio de la placa que contenía las células adherentes y se sustituyó por 100 pl/pocillo de los compuestos diluidos en serie. A continuación, las células se incubaron a 37 °C y con 5 % de CO<2>durante 96 h adicionales.
Tal como se muestra en la Tabla 6, en el intervalo de concentraciones sometido a ensayo, todos los CAF fueron capaces de inhibir específicamente la proliferación de las células LNCaP y C4-2 expresantes de PSMA, mostrando un efecto muy limitado sobre las células PC-3 negativas para PSMA.
Tabla 6. Valores de IC<50>que muestran el efecto antiproliferativo de los CAF y cargas libres sobre las células LNCaP,
C4-2 y<p>C-3 (control negativo).
Ejemplo 17:Evaluación de conjugados de anticuerpo-fármaco (CAF) y cargas libres en un estudio de eficacia in vivo.
Se utilizaron ratones hembra sanos con inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) (C.B-17/Icr-Prkdcscid,Charles River Laboratories). Los animales se mantuvieron en estado de salud SPF según las directrices de FELASA en salas de alojamiento bajo condiciones ambientales controladas. Los recintos para los animales se diseñaron para proporcionar un espacio estéril adecuado con material de cama, alimento y agua, y enriquecimiento ambiental y social.
Se iniciaron xenoinjertos con células de carcinoma prostético humano C4-2 mediante inyección subcutánea en ratones SCID. El día de la inducción tumoral, cada ratón de ensayo recibió 107 células C4-2 en 200 pl de RPMI 1640 en el flanco derecho. Se midieron los tumores en dos dimensiones utilizando un pie de rey y se calculó el volumen utilizando la fórmula siguiente:
iÑ2 x l
Volumen tumoral (mm3) —------------2
en la que w=anchura y Nongitud, en mm, del tumor.
Dieciocho días después de la implantación tumoral, designada como el día 1 del estudio, los animales fueron clasificados en grupos cada uno de los cuales consistía en cinco ratones con volúmenes tumorales medios de grupo de entre 100 y 200 mm3. El tratamiento se inició el día 1 en todos los grupos. Los grupos de tratamiento recibieron una inyección intravenosa (i.v.) el día 1 de 6 mg/kg de los conjugados de anticuerpo-fármaco27,28,30,31,29,32y también de los conjugados de anticuerpo-fármaco33y34. Se administró PBS en los ratones del grupo de control de tratamiento con vehículo.
Se realizó un seguimiento individual de los ratones y cada animal fue eutanizado cuando su tumor alcanzaba el volumen de criterio de valoración de 2000 mm3. Se evaluó la tolerabilidad del tratamiento mediante mediciones del peso corporal y la observación frecuente para signos clínicos de efectos secundarios relacionados con el tratamiento.
Se calculó el cambio porcentual de volumen tumoral para cada ratón el día 57 y se expresó como % de la media ± error estándar. Todos los regímenes resultaron bien tolerados y pudieron evaluarse para eficacia. Los resultados se muestran en las figuras 7 a 14, que muestran el cambio en porcentaje del volumen tumoral para los conjugados de anticuerpo-fármaco27,28,30,31,29,32y también de los conjugados de anticuerpo-fármaco33y CAF34. En cada caso, las figuras muestran los cambios de volumen tumoral durante el tiempo en respuesta a la administración de conjugado de anticuerpo-fármaco. Los valores se expresan como % de la media ± error estándar.
Ejemplo 18:Comparación de la estabilidad de los anticuerpos anti-PSMA mediante la prueba de estrés térmico.
Se incubaron muestras de anticuerpo (0,5 mg/ml en PBS) a 75 °C durante 30 min, seguido de la incubación en un baño de hielo durante 5 min antes del análisis para su grado de agregación. El análisis de las soluciones de anticuerpos se llevó a cabo mediante cromatografía de exclusión por tamaños (CET) y mediante mediciones de la turbidez.
CET:
se llevó a cabo la CET utilizando una columna TOSOH Bioscience TSK gel Super SW 3000. Se realizó un seguimiento de la absorbancia de UV a 280 nm durante una elución isocrática con tampón de fosfato potásico 0,2 M, pH 6,8 (cloruro potásico 0,2 M e isopropanol al 15 %). Los tiempos de elución y el número de picos indican si la muestra contiene anticuerpo agregado, degradado o nativo. El % de superficie bajo la curva (Abs280) se utilizó para determinar la cantidad de cada especie presente en el análisis de CET.
Resultados:
Los resultados de las mediciones de CET se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7:
A partir de este análisis de CET, puede observarse que los anticuerpos AB-22, AB-P1 y AB-P2 son menos estables que AB-03, mostrando una tendencia mucho mayor a agregarse con el calentamiento y el enfriamiento.
Ejemplo 19:Comparación de la estabilidad de los anticuerpos anti-PSMA mediante ensayo de desplazamiento térmico.
Se diluyeron los anticuerpos a 1,5 mg/ml con DPBS, pH 7,1 a 7,5, y se determinaron las concentraciones mediante la medición de la DO a 280 nm utilizando un instrumento Nanodrop. Se llevó a cabo el análisis de CET antes del análisis de desplazamiento térmico para confirmar que más de 99 % de cada anticuerpo estaba presente en su forma nativa.
Se configuró un instrumento de RT-PCR (StepOnePlus, Applied Biosystems) para un ensayo de desplazamiento térmico basado en la fluorescencia utilizando el pigmento Sypro Orange como informador de fluorescencia. El ensayo se configuró en una placa de PCR de 96 pocillos con cinco réplicas por muestra de anticuerpo y un volumen de reacción final de 20 pl en cada pocillo. Se pipetearon 13,5 pl de DPBS en cada pocillo, seguido de la adición de 4 pl del anticuerpo. Finalmente, el reactivo Sypro Orange se diluyó en DPBS a partir de 5000x (solución madre) a 40x y se añadieron 2,5 pl de la solución 40x a cada pocillo. También se incluyeron en la placa cinco réplicas de un blanco, sustituyendo los 4 pl de la muestra de anticuerpo por 4 pl de DPBS Se mezclaron las mezclas de ensayo utilizando una pipeta multicanal. Se selló la placa con una película transparente óptica, se centrifugó durante 1 min a 1000 rpm y se introdujo en el instrumento de RT-PCR. Las muestras se calentaron utilizando un modo de rampa continua a una tasa de rampa de 1 % de 25 °C hasta 99 °C. Se recogieron los datos de fluorescencia en toda la rampa de temperatura utilizando un filtro de excitación a 470 nm y un filtro de emisión a 610 nm. El tiempo de ensayo total fue de aproximadamente 45 min. Las curvas de fusión generadas por el software del instrumento durante el despliegue térmico de los anticuerpos resultaron de la representación gráfica de la fluorescencia frente a la temperatura. La temperatura de fusión (Tf) es la temperatura a la que la mitad de las moléculas de anticuerpo están desplegadas (indicado por un incremento de 50 % de la fluorescencia) y puede determinarse a partir del punto de inflexión de la curva de fusión. Las Tf se calculan convencionalmente mediante la representación gráfica de un gráfico de la derivada. Este es el cambio de fluorescencia dividido por el cambio en el tiempo (la tasa de cambio) representado en el eje Y, frente a la temperatura en el eje X. Se determinaron los valores de Tf de cada anticuerpo a partir del valor máximo de los picos obtenidos de este gráfico. El análisis de las curvas de fusión obtenidas se llevó a cabo utilizando el software GraphPad Prism (v.5.04).
Se determinó que la necesidad de corrección de la fluorescencia de fondo (causado por componentes del tampón y el pigmento libre) era muy reducida y se utilizaron los datos en bruto directamente para representar gráficamente la derivada, ya que se determinó que la corrección de fondo de la fluorescencia presentaba poco efecto sobre los valores ajustados de Tf. Tal como se muestra en la figura 23, se observaron dos picos para cada uno de los tres anticuerpos sometidos a ensayo como resultado de su estructura de dominios múltiples. El primer pico de transición (Tf1) representa el despliegue de los dominios CH2 y Fab, y el segundo pico de transición (Tf2) representa el despliegue del dominio CH3. Los valores de Tf1 y Tf2 de los anticuerpos AB-03, AB-P1 y AB-P2 se proporcionan en la Tabla 8. Estos datos de Tf muestran que, aunque los dominios Fab y CH2 de los tres anticuerpos muestran un nivel similar de estabilidad, el dominio CH3 de AB-03 es mucho más estable que AB-P1 y AB-P2, ya que la temperatura de fusión es aproximadamente 12 °C a 15 °C más alta.
Tabla 8:
Ejemplo 20:Síntesis de reactivo de conjugación35que comprende amido-6'-p-ciclodextrina y una carga citotóxica de maintansinoide.
Etapa 1: Síntesis de compuesto36.
A una solución de Fmoc-Glu-(OtBu)-OH (55 mg) en DMF (1 ml) se añadió una solución de HATU (116 mg) en DMF (1 ml), NMM (34 ^l) y una solución de hidrocloruro de 6-monodesoxi-6-monoamino-p-ciclodextrina (150 mg) en DMF (2 ml). Tras someter a agitación la mezcla de reacción durante 16 h a temperatura ambiente, se añadió NMM (13 ^l) seguido tras 1 h adicional de hidrocloruro de 6-monodesoxi-6-monoamino-p-ciclodextrina (8 mg) en DMF (200 ^l). Tras 3 h, se eliminaron los volátiles al vacío. Se disolvió el residuo en DMF (5 ml) y se añadió piperidina (151 ^l) a la solución, que se sometió a agitación durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se concentró la solución de reacción al vacío y el aceite resultante precipitó en dietiletillo (4x200 ml) a temperatura ambiente y se filtró, proporcionando el compuesto36en forma de un sólido blanco. m/z [M+H]+ (1320, 50 %).
Etapa 2: Síntesis de compuesto37.
A una solución de reactivo9(156 mg) en DMF (2 ml), se añadió una solución de HATU (141 mg) en DMF (1 ml), NMM (41 ^l) y una solución de compuesto36(196 mg) en DMF (2,5 ml). Tras someter a agitación durante 2,5 h a 0 °C, se añadió reactivo adicional9(19 mg) en DMF (500 ^l). Tras 20 min, la solución se concentró al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el compuesto37en forma de un aceite incoloro (76 mg). m/z [M+H]+ (2267, 20 %), [M+2H]2+ (1134, 100 %).
Etapa 3: Síntesis de compuesto38.
A una suspensión de compuesto37(33 mg) en THF:cloroformo (5 ml, 1:4 v/v) se añadió ácido p-toluenosulfónico (14 mg) y la suspensión resultante se sometió a agitación a temperatura ambiente. Tras 3,5 horas, se eliminaron los volátiles al vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). El solvente orgánico se eliminó al vacío y el solvente acuoso se eliminó mediante liofilización, proporcionando el compuesto38en forma de un aceite incoloro (26 mg). m/z [M+H]+ (2212, 25 %), [M+2H]2+ (1106, 100 %).
Etapa 4: Síntesis de reactivo35.
A una solución bajo agitación de compuesto38(18 mg) en DMF (250 j l) bajo una atmósfera inerte de argón a temperatura ambiente se añadió HATU (6 mg). Tras 1 h, se añadió HATU (6 mg) y NMM (1,1 j l) adicional y la solución se dejó bajo agitación durante 0,5 h adicionales. Se preparó una solución separada de sal t Fa de Val-Ala-PAB-AHX-DM1 (Concortis/Levena Biopharma, 7,5 mg) y NMM (1,7 j l ) en DMF (100 j l) y se sometió a ensayo durante 20 min a temperatura ambiente antes de agrupar las dos soluciones. Se añadió HATU (6 mg) y NMM (1,7 j l ) adicional y la solución se sometió a agitación a temperatura ambiente. Tras 2 h, se añadió HATU adicional (6 mg) y la solución se dejó bajo agitación durante 4 h adicionales a temperatura ambiente antes de añadir NMM (1,7 j l ) adicional. Tras 3,5 h, se eliminaron los volátiles al vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía de columna C18 de fase inversa, eluyendo con tampón A (v/v): agua:acetonitrilo al 5 %: ácido trifluoroacético al 0,05 % y tampón B (v/v): acetonitrilo: ácido trifluoroacético al 0,05 % (100:0 v/v a 0:100 v/v). Se eliminó el solvente orgánico al vacío y se eliminó el solvente acuoso mediante liofilización, proporcionando el reactivo35(2,7 mg). m/z [M+Na+2H]3+ (1100, 65 %).
[M+3H]3+ (1094, 100 %).
Se entenderá que pueden prepararse compuestos similares utilizando anillos de ciclodextrina adicionales, por ejemplo, 3a-ciclodextrina.
Ejemplo 21:Conjugación de anticuerpo anti-PSMA con reactivo35para producir el conjugado de anticuerpo-fármaco39con RFA media de 4.
Se conjugó el reactivo de conjugación35con anticuerpo anti-PSMA, proporcionando el CAF39. El anticuerpo anti-PSMA AB03 a una concentración de 5,2 mg/ml en fosfato sódico 20 mM, pH 7,5 (que contenía NaCl 150 mM y EDTA 20 mm) se calentó a 40 °C en un bloque térmico durante 15 min. Se añadió TCEP (6 eq. por cada mAb) a la solución de mAb, se mezcló suavemente y se incubó a 40 °C durante 1 h antes de dejar enfriar a 22 °C. El reactivo de conjugación35se disolvió en DMF, proporcionando una solución 1,5 mM. La solución de mAb reducida se diluyó a 4,4 mg/ml con fosfato sódico 20 mM, pH 7,5 (que contenía NaCl 150 mM y EDTA 20 mM). Se añadió reactivo de conjugación (5,6 eq. por cada mAb) a la solución de mAb; se mezcló suavemente la reacción y se incubó a 22 °C durante 6 a 22 h. Después de este tiempo, la reacción se trató con N-acetil-L-cisteína 50 mM (20 equiv. de exceso respecto al reactivo) a 22 °C durante 1 h. La mezcla de conjugación en bruto se analizó mediante cromatografía de interacción hidrofóbica. La reacción en bruto se mezcló con un volumen igual de fosfato sódico 50 mM, pH 7 (NaCl 4 M) y la solución resultante se cargó en una columna de CIH ToyoPearl Phenyl-650S equilibrada con fosfato sódico 50 mM, pH 7 (NaCl 2 M). Se eluyó el CAF de la columna con un gradiente de fosfato sódico 50 mM, pH 7 (isopropanol al 20 %). Las fracciones que contenían CAF de RFA 4 se agruparon y se concentraron (Vivaspin 20, membrana de PES de 10 kDa). Se intercambió el tampón de la muestra concentrada por PBS, pH 7,1 a 7,5, y se filtró a esterilidad (membranas de PVDF de 0,22 jm ). Las asignaciones de RFA se basaron en las relaciones de absorción A248/A280. Se calculó la RFA media de los conjugados a partir de las superficies relativas de pico de las especies CAF individuales tras el análisis de CIH a 280 nm.
Ejemplo 22:Análisis del conjugado de anticuerpo-fármaco39mediante ensayoin vitrode viabilidad celular.
Se determinó la eficaciain vitrodel conjugado de anticuerpo-fármaco39preparado en el Ejemplo 21, mediante medición del efecto inhibitorio del conjugado sobre el crecimiento celular de una línea celular de cáncer sobreexpresante diana.
La pérdida de viabilidad de las células tumorales tras el tratamiento con CAF o cargas libresin vitropuede medirse mediante el cultivo de las líneas celulares en la presencia de concentraciones crecientes de compuestos y la cuantificación de la pérdida de proliferación o actividad metabólica utilizando el reactivo de luminiscencia Cell-Titer Glo® (Promega). El protocolo describe la inoculación celular, tratamiento con fármaco y determinación de la viabilidad celular en referencia a las células no tratadas basándose en la síntesis de ATP, que se correlaciona directamente con el número de células presente en el pocillo.
Las características de la línea celular, así como las densidades de inoculación para los ensayos se indica en la tabla, a continuación.
Se contaron las células utilizando cámaras de recuento Neubauer desechables y se ajustó la densidad celular tal como se detalle en la tabla, a continuación. Se sembraron células LNCaP a razón de 50 pl/pocillo en placas de 96 pocilios blancas de paredes opacas de cultivo de tejidos tratadas y se incubaron durante 24 h a 37 °C y con 5 % de CO<2>.
Se prepararon ocho diluciones puntuales en serie en el medio de cultivo pertinente. Se ajustó el intervalo de titulación para cada combinación de compuesto/línea celular. Para las células LNCaP, se eliminó el medio de cultivo y se sustituyó por 100 pl/pocillo de diluciones 1x CAF. A continuación, se incubaron las células a 37 °C con 5 % de CO<2>durante 96 h adicionales.
El ensayo de viabilidad celular se llevó a cabo utilizando el reactivo de luminiscencia Cell-Titer Glo® (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se registró la luminiscencia utilizando un lector de placas SpectramaxM3 de Molecular Devices y los datos se analizaron posteriormente utilizando el modelo de regresión no lineal de cuatro parámetros de GraphPad Prism. La viabilidad se expresa en % de células no tratadas y se calculó utilizando la fórmula siguiente:
% de viabilidad
Se representó gráficamente el % de viabilidad frente al logaritmo de la concentración de fármaco, en nM, para extrapolar el valor de IC<50>para el conjugado. El intervalo de concentraciones utilizado para el conjugado era de 50 nM a 3,1 pM y el valor de IC<50>obtenido era de 1,3 nM.
El valor de IC<50>obtenido para el conjugado 39 muestra que el CAF de la invención presenta potentes propiedades de eliminación celularin vitro.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES i . Anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que se une a PSMA y comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en SEC ID n.° 13 y en el que el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en SEC ID n.° 18.
  2. 2. Polinucleótido codificante de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1.
  3. 3. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2.
  4. 4. Célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 3.
  5. 5. Conjugado de anticuerpo que comprende un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 y una carga, por ejemplo, un agente terapéutico, diagnóstico o de marcaje, y/o un polímero.
  6. 6. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 5, en el que la carga se une al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo mediante una parte de unión que presenta la fórmula general siguiente:
    en la que Pr representa dicho anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, cada Nu representa un nucleófilo presente o unido al anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, cada uno de A y B representa independientemente una cadena de alquileno o alquenileno C i-4 y W representa un grupo aceptor de electrones o un grupo obtenido mediante la reducción de un grupo aceptor de electrones, por ejemplo, un grupo ceto, -CO-.
  7. 7. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 6, en el que la parte de unión presenta la fórmula siguiente:
  8. 8. Conjugado de anticuerpo según la reivindicación 5 o 6, que presenta la fórmula general siguiente: (((Dq-Lk1)r-P1)p-Lk2-Lk3)e-Ab (III) en la que D representa la carga; q representa un número entero entre 1 y 10; Lk1 representa un conector; r representa un número entero entre 1 y 10; P1 representa un enlace o un grupo c-valente -P2-NH- en el que "c" es un valor entre 2 y 11, y P2 es un grupo que contiene por lo menos una unidad etileno, -CH2-CH2- o una unidad etilenglicol, -O-CH2-CH2-; p representa un número entero entre 1 y 10; Lk2 representa un enlace o un conector d-valente en el que d es un valor entre 2 y 11 y que consiste en 1 a 9 residuos de aspartato y/o glutamato; Lk3 representa un conector de la fórmula general siguiente: -CO-Ph-Y-Z- (AII) en la que Ph es un grupo fenilo sustituido opcionalmente; Y representa un grupo CO o un grupo CH.OH, y "Z" representa un grupo de la fórmula siguiente: A-----
    en la que cada uno de "A" y "B" representa un grupo alquileno o alquenileno C i-4; Ab representa el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, unido mediante Lk3 a través de dos átomos de azufre derivados de un enlace disulfuro en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, y e representa un número entero entre 1 y s, en el que s es el número de enlaces disulfuro presentes en el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo antes de la conjugación con Lk3.
  9. 9. Conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la carga es o incluye una auristatina o un maitansinoide.
  10. 10. Conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que incluye un isótopo radioactivo, por ejemplo seleccionado del grupo que consiste en yodo-131, itrio-90, lutecio-177, cobre-67, astato-211, plomo-212/bismuto-212, actinio-225/bismuto-213 y torio.
  11. 11. Conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en el que la carga es o incluye un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en por lo menos uno de una sustancia radioactiva, un pigmento, un agente de contraste, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un enzima, un agente potenciador o una nanopartícula.
  12. 12. Anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, o un conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, para la utilización en diagnóstico o terapia.
  13. 13. Anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, o un conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, para la utilización, tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por PSMA ocaracterizada poruna expresión incrementada de PSMA.
  14. 14. Anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, o un conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, para la utilización según la reivindicación 13, en el que la enfermedad mediada por PSMA es un cáncer, tal como cáncer de próstata, o un cáncer no de próstata, por ejemplo un cáncer no de próstata seleccionado del grupo que consiste en cáncer de vejiga, incluyendo el carcinoma de células transicionales; cáncer pancreático, incluyendo el carcinoma del conducto pancreático; cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón no microcítico; cáncer renal, incluyendo el carcinoma de células renales convencional; sarcoma, incluyendo el sarcoma de tejidos blandos; cáncer hepático, incluyendo el adenocarcinoma metastásico; cáncer de mama, incluyendo el carcinoma mamario; cáncer cerebral, incluyendo el glioblastoma multiforme; carcinoma neuroendocrino; cáncer de colon, incluyendo el carcinoma colónico; cáncer testicular, incluyendo el carcinoma embrionario testicular, y melanoma, incluyendo el melanoma maligno.
  15. 15. Método para la detección de la presencia del antígeno PSMA en una muestra utilizando el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o un conjugado de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11.
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