ES2965358T3 - Tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones, métodos, usos y kits para tratar el cáncer. La presente invención se refiere a métodos para minimizar la progresión del cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno, minimizando así la progresión del cáncer en el sujeto. En particular, los métodos proporcionan un medio para tratar el cáncer reduciendo el número de células madre cancerosas en el sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones para uso en el tratamiento del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas.

Antecedentes de la invención

A pesar de las mejoras en las terapias para el tratamiento del cáncer, la tasa de mortalidad por cáncer en todo el mundo sigue siendo alta y aún se necesitan estrategias para prevenir la recurrencia del cáncer. Las estrategias terapéuticas actuales contra el cáncer frecuentemente resultan en el fracaso del tratamiento, a menudo debido al desarrollo de múltiples neoplasias malignas y/o resistencia a la quimioterapia y la radioterapia.

La solicitud internacional WO 2011/047434 describe composiciones farmacéuticas que comprenden quimotripsinógeno y tripsinógeno para tratar el cáncer. No aborda específicamente el problema de las células madre cancerosas.

Las células madre cancerosas (CSC) son células iniciadoras de tumores inmortales que tienen la capacidad de autorrenovarse y tienen capacidad pluripotente (Reya et al., (2001). Nature 414:105-111). Las CSCs se encuentran en múltiples tumores malignos, incluida la leucemia y muchos tumores sólidos y, dadas sus propiedades similares a las de las células madre, se cree que son la base para el inicio, el desarrollo, la metástasis y la recurrencia del tumor. Tang DG. Cell Res 2012; 22: 457-72).

Las CSCs representan solo una pequeña fracción de las células cancerosas dentro de un tumor y pueden permanecer inactivas durante períodos de tiempo prolongados, evadiendo así las terapias convencionales (p. ej., quimioterapia y radioterapia) que fijan como objetivo células altamente proliferativas (Chikamatsu et al., (2011) Head Neck. 34(3):336-43). En consecuencia, una prioridad para mejorar el tratamiento del cáncer y reducir el riesgo de recaída del cáncer es desarrollar nuevas estrategias que se fijen selectivamente como objetivo la erradicación de las CSC sin afectar a las células madre normales.

La referencia a cualquier técnica anterior en la memoria descriptiva no es un reconocimiento o sugerencia de que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general común en cualquier jurisdicción o que se pueda esperar razonablemente que esta técnica anterior se entienda, se considere relevante y/o se combine con otras piezas de la técnica anterior por un experto en la técnica.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a composiciones para uso en minimizar la progresión del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer, y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones para uso en el tratamiento de enfermedades residuales mínimas reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer, y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones para uso en la prevención de la recurrencia del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

Aún en un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones para uso en la prevención de metástasis de cáncer, reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que va a recibir un tratamiento contra el cáncer, que está recibiendo un tratamiento contra el cáncer o que ha recibido un tratamiento contra el cáncer, y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones para uso en la prevención del cáncer o retrasar la aparición del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto, en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

La presente invención proporciona composiciones para uso en tratamientos médicos. Sin embargo, se entiende que la invención no abarca el método de tratamiento respectivo llevado a cabo en un sujeto humano o animal.

El sujeto a tratar puede haber recibido un tratamiento contra el cáncer. Además, el sujeto puede no tener cáncer detectable en el momento en que se administra el quimotripsinógeno y el tripsinógeno, por ejemplo, el cáncer puede haber disminuido sustancialmente en tamaño, masa u otra medida física como consecuencia del tratamiento previo en el momento en que se administra el quimotripsinógeno y el tripsinógeno al sujeto.

De acuerdo con la invención, se puede reducir el número de células madre cancerosas en el sujeto o evitar que aumente en número. Alternativamente, las células madre cancerosas pueden diferenciarse. La identificación de células madre cancerosas o el grado de diferenciación se puede determinar mediante cualquier método descrito en el presente documento usando marcadores como se describe en el presente documento, particularmente la Tabla 1.

Un sujeto o individuo que se considera en riesgo de cáncer puede ser un individuo que tiene antecedentes familiares de cáncer, tiene uno o más biomarcadores asociados con el cáncer. Según la invención, se determina que un sujeto a tratar tiene células madre cancerosas.

Preferiblemente, la identificación de la presencia de células madre cancerosas se produce en el sitio de un tumor existente o en el sitio de intervención terapéutica. Típicamente, la intervención terapéutica es la resección quirúrgica, quimioterapia o radioterapia.

Preferiblemente, las células madre cancerosas se identifican usando uno o más marcadores como se describe en el presente documento, tal como en la Tabla 1. Por ejemplo, los marcadores de CSC específicos para el páncreas incluyen CD326. CD44 y CxCR4 y marcadores de CSC específicos para el colon: CD326 y CD44 y se analizan mediante inmunofluorescencia o citometría de flujo.

Típicamente, la composición para uso de acuerdo con la invención comprende, además, un diluyente, excipiente o soporte farmacéuticamente aceptable.

En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan quimotripsinógeno y tripsinógeno para administración en una proporción en peso en el intervalo de o aproximadamente 1:1 a o aproximadamente 10:1. de o aproximadamente 4:1 a o aproximadamente 8:1. en o aproximadamente 5:1 a o aproximadamente 7:1. o en aproximadamente 6:1. Además, cualquier composición descrita anteriormente tiene quimotripsinógeno y tripsinógeno en una relación en peso en el intervalo de o aproximadamente 1:1 a o aproximadamente 10 : 1. en o aproximadamente 4:1 a o aproximadamente 8:1. en o aproximadamente 5:1 a o aproximadamente 7:1. o en aproximadamente 6:1.

En cualquier aspecto de la invención, se proporcionan quimotripsinógeno y tripsinógeno para administración intravenosa, subcutánea o intramuscular.

En cualquier aspecto de la invención, el quimotripsinógeno y el tripsinógeno pueden administrarse simultánea o secuencialmente.

En cualquier aspecto de la invención, se puede identificar que un sujeto a tratar tiene cáncer o está en riesgo de desarrollarlo. Preferiblemente, el cáncer es cualquiera de los descritos en el presente documento.

En cualquier aspecto de la invención, la composición no contiene ni utiliza amilasa.

En cualquier aspecto, realización o forma de la invención descrita en el presente documento, la cantidad de quimotripsinógeno administrado puede ser mayor que o igual a 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3.5 mg/kg, 5 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 135 mg/kg, 250 mg/kg o 500 mg/kg.

En cualquier aspecto, realización o forma de la invención descrita en el presente documento, la cantidad de tripsinógeno administrado puede ser mayor que o igual a 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.8 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg.

En cualquier aspecto, realización o forma de la invención descrita en el presente documento, la cantidad de quimotripsinógeno administrada a un ser humano puede ser mayor que o igual a 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.4 mg/kg, 1.2 mg/kg. mg/kg, 3.5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg.

En cualquier aspecto, realización o forma de la invención descrita en el presente documento, la cantidad de tripsinógeno administrado a un ser humano puede ser mayor que o igual a 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.6 mg/kg, 1.5 mg/kg, 3 mg/kg o 6 mg/kg.

Preferiblemente, en cualquier aspecto, realización o forma de la invención descrito en el presente documento, la cantidad de quimotripsinógeno administrado puede estar en el intervalo de 1 mg/kg a 41 mg/kg, 1.5 mg/kg a 500 mg/kg, 2 mg/kg a 250 mg/kg, 3.5 mg/kg a 135 mg/kg, 5 mg/kg o 15 mg/kg a 45 mg/kg.

Preferiblemente, en cualquier aspecto, realización o forma de la invención descrito en el presente documento, la cantidad de tripsinógeno administrado puede ser mayor que 0.2 mg/kg a 7 mg/kg, 0.25 mg/kg a 80 mg/kg, 0.4 mg/kg a 40 mg/kg, 0.6 mg/kg a 20 mg/kg, 0.8 mg/kg a 8 mg/kg o 2.5 mg/kg a 8 mg/kg.

En cualquier composición para uso de la invención anterior, la composición puede adaptarse para administrar los mg o mg/kg relevantes de quimotripsinógeno y tripsinógeno al sujeto.

Como se usa en el presente documento, excepto cuando el contexto requiera lo contrario, el término "comprenden" y las variaciones del término, tales como "que comprende", "comprende" y "comprendido", no pretenden excluir aditivos, componentes, números enteros o etapas adicionales.

Aspectos adicionales de la presente invención y realizaciones adicionales de los aspectos descritos en los párrafos anteriores resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción, dada a modo de ejemplo y con referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1:Ensayo MTT para determinar la CI<50>para tripsinógeno/quimotripsinógeno. Se muestra la tasa de proliferación celular frente a la concentración de tratamiento para las CSCs HCT-1 16 de colon y las CSCs BxPC3 pancreáticas tratadas con concentraciones variables de tripsinógeno/quimotripsinógeno (1:6) o interferón alfa (IFN).

Figura 2:Ensayo del ciclo celular para la línea celular de cáncer de páncreas humano BxPC3. Los paneles a y b muestran los resultados de los ensayos para no CSCs pancreáticas; los paneles c y d muestran resultados de ensayos para CSCs pancreáticas.

Figura 3:Ensayo del ciclo celular para la línea celular de cáncer de colon humano HCT-116. Los paneles a y b muestran los resultados de los ensayos para no CSCs de colon; los paneles c y d muestran resultados de ensayos para CSCs de colon.

Figura 4:Ensayo de aldehído deshidrogenasa para la línea celular pancreática humana BxPC3. El porcentaje de células ALDH positivas en CSCs y no CSCs pancreáticas se muestra después del tratamiento de las células con control, PRP, PRP+IFN o IFN.

Figura 5:Resultados del gráfico de puntos de la clasificación por citometría de flujo de CSCs pancreáticas sobre la base de la expresión en la superficie celular de los marcadores CD 326. CD 44 y CxCR4 después del tratamiento de las células con PRP, PRP+IFN o IFN.

Figura 6:Histograma que muestra la expresión de marcadores de CSC en CSCs pancreáticas: se muestra el porcentaje de células que tienen los tres marcadores CD326. CD44. CxCR4 para las CSCs tratadas con PRP, PRP+IFN o IFN y para las que no son CSCs. Se muestran los resultados de dos ensayos separados.

Figura 7:Histograma que representa los resultados de la clasificación por citometría de flujo de CSCs de colon. El porcentaje de CSC HCT-116 que son positivas para ALDH y expresan marcadores CD44 y CD326 se muestra para las células después del tratamiento con PRP, IFN o PRP+IFN.

Figura 8:Histograma que representa el porcentaje de CSCs HCT-116 positivas para ALDH que expresan los marcadores CD44 o CD326 después del tratamiento con PRP.

Figura 9:Imágenes representativas de microscopía óptica que muestran la formación de esferas de CSCs BxPC3 pancreáticas en los días 2 y 5 después del tratamiento con PRP, INF o PRP+IFN.

Figura 10:Imágenes representativas de microscopía óptica de la formación de esferas por CSC HCT-166 de colon en los días 2 y 5 después del tratamiento con PRP, INF o PRP+IFN.

Figura 11:Imágenes representativas de microscopía óptica de esferas de neuroblastoma se formaron cuando se cultivaron células SK-N-SH en condiciones de CSC (Paneles A y C). La adición de PRP al medio previene la formación de esferas de neuroblastoma (Paneles B y D). Ampliación original: 10x para los paneles A y B; 20x para los paneles C y D. E y F: número de esferas primarias (E) y secundarias (F) en células BxPC3 y SK-N-SH no tratadas y tratadas con PRP.

Figura 12:Resultados del análisis qRT-PCR para la expresión de genes relacionados con EMT después del tratamiento con PRP (gris claro). Los datos se normalizan a 1 para CSC no tratada utilizando GAPDH como control interno y se representan gráficamente como media ± EMT (n = 3).

Figura 13:Resultados del análisis qRT-PCR para la expresión de genes relacionados con CSC después del tratamiento con PRP (gris claro). Los datos se normalizan a 1 para CSC no tratada utilizando GAPDH como control interno y se representan gráficamente como media ± EMT (n = 3).

Figura 14:A. Diseño de estudioin vivopara evaluar la actividad antitumoral del PRP contra CSCs. Las barras perpendiculares representan la inyección en bolo de PRP. B. Diseño de estudioin vivopara evaluar la capacidad del PRP para inhibir el inicio de la capacidad tumoral de las CSCs pancreáticas. C. Diseñoin vivode estudio para evaluar el potencial metastásico de las CSCsin vivo.Las barras perpendiculares representan la inyección en bolo de PRP.

Figura 15:Imágenes de tumores extirpados de ratones, 9.5 semanas después de la inoculación con CSCs. Grupo control, n=10; grupo de prevención, n=8; grupo de prevención tratamiento n= 6.

Figura 16:Porcentaje de incidencia de tumores en ratones después de la inoculación con CSCs. La incidencia de tumores se midió 9.5 semanas después de la inoculación. La incidencia porcentual en los grupos de prevención y prevención tratamiento se muestra como una proporción de la incidencia observada en ratones de control (sin prevención ni tratamiento). P = 0.039

Figura 17:Volumen del tumor medio (mm2) en ratones ± ET, al finalizar el tratamiento (9.5 semanas después de la inoculación). La diferencia en el peso del tumor entre el grupo de control y el grupo de prevención tratamiento fue estadísticamente significativa.p < 0.05.

Figura 18:A. Gráfico que representa los volúmenes de tumores en cada grupo experimental (control, grupo de prevención y grupo de prevención tratamiento), medidos cada 2 días después de la inoculación de CSC. El eje X indica el número de días desde el desarrollo del tumor. El día 0 corresponde a 30 días desde la inoculación de CSC. B. Gráfico que representa los volúmenes de tumores en cada grupo experimental (control, grupo de prevención y grupo de prevención tratamiento), medidos cada 2 días (T/C basado en tasa) después de la inoculación de CSC. El eje X indica el número de días desde el desarrollo del tumor. El día 0 corresponde a 30 días desde la inoculación de CSC. Los asteriscos designan significación estadística, p < 0.05.

Figura 19:Índice de tumorigénesis (TIn) ± ET en los grupos control, prevención y prevención tratamiento 9.5 semanas después de la inoculación de CSC. TIn es una medida de la incidencia y el peso del tumor. La diferencia en el TIn entre el grupo de control y el de prevención y el de prevención tratamiento fue estadísticamente significativo,p < 0.01.

Figura 20:Imágenes representativas que muestran tinción con H&E. En el modelo de xenoinjerto subcutáneo, se extirparon y fijaron tumores de ratones en los grupos de control, prevención y prevención tratamiento. Los tejidos tumorales BxPC3 se incluyeron en parafina, se seccionaron con un espesor de 5 gm y se tiñeron con H&E (izquierda: aumento, 20x; centro: aumento, 10x; derecha: aumento, x40).

Figura 21:Imágenes representativas que muestran la tinción con tricomas de Masson de tumores BxPC3 en el modelo de xenoinjerto subcutáneo. Se muestra la tinción de tumores de ratones en los grupos de control, prevención y prevención tratamiento.

Figura 22:Niveles de expresión de genes relacionados con EMT en CSCs después del tratamiento con PRP. A: expresión de genes normalmente regulados negativamente durante la EMT pero regulados positivamente después del tratamiento con PRP. B: expresión de genes normalmente regulados positivamente durante la EMT pero regulados negativamente después del tratamiento con PRP.

Figura 23:El efecto del tratamiento con PRP sobre los niveles de expresión de genes asociados con la diferenciación celular en CSCs.

Figura 24:El efecto del tratamiento con PRP sobre los niveles de expresión de genes supresores de tumores en CSC.

Figura 25:El efecto del tratamiento con PRP sobre los niveles de expresión en CSCs de genes asociados con metástasis e invasión (A) y adhesión celular (B).

Figura 26:El efecto del tratamiento con PRP sobre los niveles de expresión en CSCs de genes que codifican citocinas.

Figura 27:El efecto del tratamiento con PRP sobre la expresión de genes marcadores de CSC.

Figura 28:El efecto del tratamiento con PRP sobre la expresión de genes relacionados con MAPK en CSCs.

Descripción detallada de las realizaciones

Se entenderá que la invención descrita y definida en esta memoria descriptiva se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas diferentes combinaciones constituyen diversos aspectos alternativos de la invención. El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Ahora se hará referencia en detalle a ciertas realizaciones de la invención. Si bien la invención se describirá junto con las realizaciones, se entenderá que la intención no es limitar la invención a esas realizaciones. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que puedan incluirse dentro del alcance de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones.

Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita de manera alguna a los métodos y materiales descritos. Para fines de interpretación de esta memoria descriptiva, las expresiones y los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa.

Las estrategias terapéuticas actuales contra el cáncer tienen graves limitaciones que frecuentemente conducen al fracaso del tratamiento. La evidencia acumulada sugiere que la base de estos fracasos se debe a la incapacidad de las terapias actuales de eliminar las CSCs, lo que significa que los pacientes corren riesgo de recurrencia y metástasis. Además, existe evidencia que sugiere que las poblaciones de CSC son más resistentes a las terapias convencionales contra el cáncer que las poblaciones que no tienen CSC. Por tanto, la eliminación de las CSC es fundamental en el tratamiento de enfermedades malignas.

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que al proporcionar una combinación de las (pro)enzimas pancreáticas quimotripsinógeno y tripsinógeno, es posible reducir la proliferación de CSCs, reducir la población de CSCs en una población de células cancerosas, inhibir la formación de esferas y reducir la expresión de genes en CSCs asociados con la transición de un fenotipo epitelial a mesenquimatoso. En consecuencia, los presentes inventores han identificado un enfoque novedoso para fijar como objetivo las CSCs en una población de células cancerosas. Este hallazgo tiene aplicaciones importantes para el tratamiento de personas que han recibido previamente un tratamiento contra el cáncer, particularmente dado que las terapias convencionales contra el cáncer a menudo no logran erradicar las CSCs diana y existe una alta probabilidad de recurrencia del cáncer, a pesar de un tratamiento aparentemente exitoso del cáncer.

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición para uso para minimizar la progresión del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer, y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

El quimotripsinógeno (que aquí se puede abreviar como 'C') es una forma proenzimática de la enzima quimotripsina, que escinde preferentemente proteínas en los siguientes aminoácidos: tirosina, triptófano, fenilalanina y leucina. La quimotripsina puede incluir o hacer referencia a quimotripsina A, quimotripsina B (incluidas las formas B1 y B2), quimotripsina C, a-quimarofto, avazyme, quimar, quimotest, enzeon, quimar, quimotrasa, a-quimar, a-quimotripsina A, aquimotripsina. La quimotripsina C se puede formar a partir del quimotripsinógeno C del cerdo o de la subunidad II de la procarboxipeptidasa A del ganado, y preferentemente escinde proteínas en los siguientes aminoácidos: tirosina, triptófano, fenilalanina, leucina, metionina, glutamina y asparagina. El quimotripsinógeno incluye quimotripsinógeno A, quimotripsinógeno B1 y quimotripsinógeno B2.

El tripsinógeno (que aquí se puede abreviar como "T") es una forma proenzimática de tripsina, que escinde preferentemente proteínas en arginina y lisina. Se puede hacer referencia a la tripsina, o incluir a-tripsina, p-tripsina, cocoonasa, parenzima, parenzimol, triptar, tripuro, pseudotripsina, triptasa, tripcelim, hidrolasa del receptor de esperma. La p-tripsina se puede formar a partir de tripsinógeno mediante la escisión de un enlace peptídico. Otras escisiones de enlaces peptídicos producen a y otras isoformas. Se pueden aislar múltiples tripsinas catiónicas y aniónicas del páncreas de muchos vertebrados y de especies inferiores, incluidos cangrejos de río, insectos (cocoonasa) y microorganismos(Streptomyces griseus).En los procesos normales durante la digestión, el tripsinógeno inactivo es activado por la enteropeptidasa presente en la mucosa intestinal para formar la enzima tripsina, que al ser una serina proteasa actúa para escindir los enlaces peptídicos en el lado carboxilo de los aminoácidos/proteínas básicos.

Como se describió anteriormente, la forma de proenzima proporciona esencialmente una forma inactivada de la enzima que se activain situ(p. ej., por activaciónin vivooin vitro).Por ejemplo, la activación de la proenzima (conversión de proenzima en enzima activa) puede ocurrir al entrar en contacto con la CSC. Se cree que las proenzimas tripsinógeno y quimotripsinógeno se activan selectivamente en las enzimas tripsina y quimotripsina al contacto con células cancerosas y no al contacto con células sanas. El uso de proenzimas reduce los problemas asociados con el suministro,in s itu ,una enzima activa, como reacciones indeseables o inactivación de la enzima antes de alcanzar la diana prevista de una célula cancerosa.

Sin desear estar ligados a teoría alguna, los inventores creen que la combinación de las proenzimas quimotripsinógeno y tripsinógeno actúa para inhibir la producción de factores de crecimiento y factores estimulantes angiogénicos que contribuyen al nicho tumoral y, en consecuencia, reducen el potencial de injerto tumoral. Además, las proenzimas proteasas inducen la diferenciación de las CSCs, reduciendo así la población total de CSCs y reduciendo la probabilidad de recurrencia o metástasis del tumor. Por ejemplo, los inventores han demostrado que el quimotripsinógeno y el tripsinógeno, cuando se proporcionan a las CSCs en condiciones apropiadas, reducen la proliferación de las CSCs, reducen la población de CSCs en una población de células cancerosas, inhiben la formación de esferas y reducen la expresión de genes en las CSCs asociadas con la transición de un fenotipo epitelial a mesenquimatoso. Teniendo esto en cuenta, el uso de quimotripsinógeno y tripsinógeno tiene una utilidad particular para minimizar la progresión, recurrencia o metástasis del cáncer en sujetos que han recibido un tratamiento para el cáncer, particularmente teniendo en cuenta que los tratamientos convencionales contra el cáncer normalmente no fijan como objetivo ni minimizan las CSCs.

Como se utiliza en el presente documento, "minimizar la progresión del cáncer" significa tratar al sujeto para prevenir o retrasar la recurrencia o metástasis de un tumor. Minimizar la progresión del cáncer incluye prevenir o retrasar la recurrencia del cáncer, después de un tratamiento del cáncer. La recurrencia que se previene incluye una recurrencia, por ejemplo, en el lecho del tumor, después de la escisión quirúrgica. Alternativamente, la recurrencia incluye metástasis del cáncer en otra parte del cuerpo. Las expresiones "prevención de la recurrencia" y "prevención de la recaída", tal como se utilizan en este documento, son intercambiables.

La presente invención también se refiere a la prevención del desarrollo de cáncer en un individuo. Por ejemplo, se puede considerar que el individuo para quien se requiere prevención del cáncer tiene riesgo de desarrollar cáncer, pero aún no tiene cáncer detectable. Un individuo en riesgo de desarrollar cáncer puede ser un individuo con antecedentes familiares de cáncer y/o un individuo para quien las pruebas genéticas u otras pruebas indican un alto riesgo o una alta probabilidad de desarrollar cáncer. El individuo puede tener células madre cancerosas pero aún no tiene ningún tumor detectable. Se entenderá que prevenir el desarrollo del cáncer incluye retrasar la aparición del cáncer en un sujeto.

El tratamiento recibido previamente por el sujeto puede ser cualquier tratamiento convencional contra el cáncer, incluyendo quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia y/o escisión quirúrgica del tumor. En una realización, el tratamiento recibido por el sujeto es la escisión quirúrgica del tumor. En otra realización, por ejemplo en el tratamiento de tumores no sólidos, el sujeto ha recibido quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia, o una combinación de las mismas. Aún en una realización adicional, el sujeto ha recibido una intervención quirúrgica, quimioterapéutica y radioterapéutica antes de que se le administre quimotripsinógeno y tripsinógeno de acuerdo con la presente invención. Cualquier método para reducir el volumen o la masa de un tumor se contempla como un tratamiento recibido previamente por el sujeto.

El sujeto que ha recibido el tratamiento contra el cáncer puede estar en remisión parcial o completa. En otras palabras, el sujeto, que ha recibido un tratamiento contra el cáncer, como se describió anteriormente, puede tener una reducción del 50 % o más en los parámetros medibles de crecimiento del tumor como se puede encontrar en el examen físico, el estudio radiológico o mediante los niveles de biomarcadores de un análisis de sangre u orina. Alternativamente, cuando el sujeto está en remisión completa, hay una desaparición completa de todas las manifestaciones detectables de la enfermedad, de modo que el sujeto no tiene signo detectable de cáncer alguno. El sujeto puede tener signos de cáncer sustancialmente indetectables. Un cáncer que es "sustancialmente indetectable" generalmente se refiere a una circunstancia en donde la terapia ha agotado el tamaño, volumen u otra medida física de un cáncer de modo que el uso de técnicas de detección estándares relevantes, como la formación de imágenesin vivo,el cáncer, como consecuencia de la terapia, no es claramente detectable.

Una limitación clave de las terapias convencionales contra el cáncer es que incluso después de la escisión quirúrgica del tumor y las terapias adyuvantes (como la quimioterapia), es probable que quede una enfermedad residual mínima. La enfermedad residual mínima (ERM) se refiere al pequeño número de células cancerosas que quedan en un paciente después del tratamiento. Típicamente, estas células son difíciles de detectar o no pueden detectarse en absoluto, de modo que se dice que el paciente no tiene cáncer detectable alguno. Sin embargo, la ERM es una causa importante de recaída del cáncer y se cree que la presencia de CSCs, incluso después de un tratamiento extenso, es el factor clave que contribuye a la ERM.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una composición para uso en el tratamiento de una enfermedad residual mínima reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

Una composición para uso de acuerdo con la invención reduce la proliferación de células madre cancerosas. El objetivo o resultado del tratamiento con quimotripsinógeno y tripsinógeno puede ser reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor primario; inhibir (es decir, retardar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, retardar hasta cierto punto y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento del tumor; y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno.

La eficacia del tratamiento se puede medir evaluando la duración de la supervivencia, el tiempo transcurrido hasta la progresión de la enfermedad, las tasas de respuesta (TR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

En una realización, la composición es particularmente útil para retrasar la progresión de la enfermedad.

En una realización, la composición es particularmente útil para prolongar la supervivencia del sujeto, incluida la supervivencia general así como la supervivencia libre de progresión.

En una realización, la composición es particularmente útil para proporcionar una respuesta completa a la terapia mediante la cual todos los signos de cáncer en respuesta al tratamiento han desaparecido. Esto no siempre significa que el cáncer se haya curado.

En una realización, la composición es particularmente útil para proporcionar una respuesta parcial a la terapia mediante la cual ha habido una disminución en el tamaño de uno o más tumores o lesiones, o en la extensión del cáncer en el cuerpo, en respuesta al tratamiento.

Las composiciones para uso de acuerdo con la presente invención también incluyen el tratamiento fijado como objetivo de CSCs antes de que un sujeto reciba un tratamiento convencional contra el cáncer. El experto apreciará que este enfoque tiene una aplicación particular para cánceres hematológicos, en donde no es posible extirpar quirúrgicamente un tumor. Como tal, la invención tiene como objetivo sensibilizar a un sujeto antes del tratamiento contra el cáncer, proporcionando una composición para administración a un sujeto antes de que el sujeto reciba tratamiento contra el cáncer.

Aún más, la presente invención también tiene como objetivo el tratamiento fijado como objetivo de CSCs al mismo tiempo que un sujeto recibe un tratamiento convencional contra el cáncer. Como tal, la composición para uso de acuerdo con la invención puede prevenir la probabilidad de enfermedad residual mínima al finalizar el tratamiento o el retraso o la recurrencia del cáncer, en donde la composición se proporciona para administración al sujeto simultáneamente con el tratamiento convencional contra el cáncer.

La identificación de células madre cancerosas puede realizarse mediante la detección de uno o más marcadores. Marcadores ejemplares se muestran en la Tabla 1 que figura a continuación.

Las células madre cancerosas se pueden aislar de un tejido o muestra usando cualquier método descrito en el presente documento. Las células madre cancerosas de una muestra del tumor o del estroma tumoral se pueden identificar seccionando al menos parte de la muestra, etiquetadas (preferiblemente inmunomarcadas) para uno o más marcadores de células madre cancerosas y analizadas mediante inmunofluorescencia.

El "sujeto" incluye un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano o un animal doméstico, de zoológico o de compañía. Si bien se contempla particularmente que las composiciones para uso de la invención sean adecuadas para el tratamiento médico de seres humanos, también son aplicables al tratamiento veterinario, incluido el tratamiento de animales de compañía tales como perros y gatos, y animales domésticos tales como caballos, vacas y ovejas, o animales de zoológico tales como félidos, cánidos, bóvidos y ungulados. Un sujeto puede padecer cáncer u otro trastorno, o puede no padecer cáncer u otro trastorno (es decir, estar libre de enfermedad detectable).

El peso corporal típico de un sujeto humano puede ser mayor que o igual a 60. 65. 70. 75. 80. 85. 90. 95. 100. 105 o 110 kg.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de composición, o agente o compuesto en la composición, capaz de minimizar la progresión, tratar, prevenir la recurrencia o mejorar el cáncer o su propagación (metástasis). Una cantidad terapéuticamente eficaz puede determinarse empíricamente y de forma rutinaria en relación con el tratamiento del cáncer, y dará como resultado una mayor esperanza de vida.

La presente invención proporciona composiciones para uso en tratamientos médicos. Sin embargo, se entiende que la invención no abarca el método de tratamiento respectivo llevado a cabo en un sujeto humano o animal.

Como se describe en el presente documento, los usos médicos de las composiciones para uso de la invención incluyen minimizar la progresión, prevenir la recurrencia o tratar enfermedades residuales mínimas asociadas con neoplasias y afecciones relacionadas, cánceres, tumores, afecciones malignas y metastásicas. Los tejidos y órganos asociados con tumores sólidos y metástasis que pueden tratarse con una composición de la invención incluyen, pero no se limitan a tracto biliar, vejiga, sangre, cerebro, mama, cuello uterino, colon, endometrio, esófago, cabeza, cuello, riñón, laringe, hígado, pulmón, médula, melanina, ovario, páncreas, próstata, recto, riñón, retina, piel, estómago, testículos, tiroides, tracto urinario y útero.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención son útiles para minimizar la progresión incluyendo prevenir la recurrencia de cánceres y carcinomas metastásicos de los siguientes tipos: cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer de intestino, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de mama, melanoma maligno, neuroblastoma o cáncer de pulmón. Preferiblemente, el cáncer es cáncer de páncreas, cáncer de colon o cáncer de ovario. Más preferiblemente, el cáncer es cáncer de páncreas.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden proporcionar un enfoque de efectos múltiples para tratar el cáncer, por ejemplo aumentando la apoptosis en células tumorales, aumentando la adhesión, diferenciación e inmunogenicidad de célula a célula (fijación de objetivo y eliminación por parte del sistema inmunológico). Por tanto, es beneficioso realizar el tratamiento en ausencia de otros tratamientos que puedan suprimir o dañar el sistema inmunológico.

El tripsinógeno y quimotripsinógeno proporcionados para su uso en cualquier aspecto de la invención pueden aislarse, purificarse, purificarse sustancialmente, ser recombinantes o sintéticos.

Las proenzimas tripsinógeno y quimotripsinógeno pueden ser precursores de las enzimas seleccionadas de las clases de quimotripsina 3.4.21.1 o 3.4.21.2 o tripsina de la clase 3.4.21.4. o seleccionadas de cualquier otra fuente adecuada (clases agrupadas de acuerdo con la clasificación del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular). Estas enzimas están disponibles comercialmente y pueden ser de origen humano, bovino o porcino.

En ciertos aspectos, el quimotripsinógeno y el tripsinógeno pueden administrarse simultánea o secuencialmente. Cuando se administran simultáneamente, el quimotripsinógeno y el tripsinógeno pueden incluirse en la misma composición farmacéutica. Cuando se combinan en la misma formulación farmacéutica, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno puede estar en el intervalo de entre 1:1 a o aproximadamente 10:1. en o aproximadamente 4:1 a o aproximadamente 8:1. en o aproximadamente 5:1 a o aproximadamente 7:1. o aproximadamente 6:1. En una realización, la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el intervalo de entre 5:1 a 7:1. preferiblemente 6:1.

En un aspecto, las formulaciones farmacéuticas comprenden solo quimotripsinógeno y tripsinógeno como agentes activos. En realizaciones alternativas, se incluyen agentes activos adicionales en la composición. Por ejemplo, además de las proenzimas pancreáticas quimotripsinógeno y tripsinógeno, las composiciones pueden incluir otras terapias conocidas para el tratamiento del cáncer.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden formularse, por ejemplo, empleando vehículos o diluyentes sólidos o líquidos convencionales, así como aditivos farmacéuticos de un tipo apropiado para el modo de administración deseado (por ejemplo, excipientes, aglutinantes, conservantes, estabilizantes, aromas, etc.) de acuerdo con técnicas tales como las bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención y las preparaciones o formulaciones de las mismas se pueden preparar mezclando entre sí los componentes de la composición, incluidos quimotripsinógeno y tripsinógeno. La mezcladura se puede realizar de forma secuencial o simultánea.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. T odos los métodos incluyen la etapa de asociar los agentes activos y/o la proenzima proteasa con el soporte, que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones farmacéuticas se preparan asociando de manera uniforme e íntima los agentes activos y/o proenzimas de proteasa con un soporte líquido o un soporte sólido finamente dividido o ambos, y luego, si es necesario, dando forma al producto en la formulación deseada. Los agentes activos y/o proenzimas de proteasa se proporcionan en una forma de dosificación unitaria en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado sobre el proceso o condición de enfermedades después de una administración única o repetida.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, pastillas, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas al uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y sabrosas. Los comprimidos contienen la proenzima proteasa y el agente activo del primer y segundo aspecto mezclados con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin revestir o pueden estar revestidos mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar así una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material retardador tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También pueden revestirse para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para una liberación controlada.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en donde la proenzima proteasa y el agente activo del primer y segundo aspecto se mezclan con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en donde la proenzima proteasa y el agente activo del primer y segundo aspecto se mezclan con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Suspensiones acuosas contienen el agente activo y la proenzima proteasa mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Excipientes de este tipo son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinil-pirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como mono-oleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo mono-oleato de polietilensorbitán. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo p-hidroxibenzoato de etilo o n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el agente activo y la proenzima proteasa en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes como los recogidos anteriormente y agentes aromatizantes para proporcionar una preparación oral sabrosa. Estos pueden conservarse añadiendo un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan la proenzima proteasa y el agente activo del primer y segundo aspecto en mezcla con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo parafina líquida o mezclas de estos. Agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas que se producen de forma natural, por ejemplo goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos que se producen de forma natural, por ejemplo de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo mono-oleato de polioxietilensorbitán. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Se pueden formular jarabes y elixires con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol o sacarosa. También pueden contener un demulcente, un conservante y agentes aromatizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando aquellos agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. Las composiciones farmacéuticas del primer y segundo aspectos también pueden ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1.3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas para uso de la invención se formulan como supositorios para la administración rectal del fármaco. Estas formulaciones se pueden preparar mezclando la proenzima proteasa y el agente activo del primer y segundo aspecto con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura del recto y, por tanto, se funde en el recto para liberar el fármaco. Materiales de este tipo incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles. La administración rectal se puede utilizar para eliminar el efecto de primer paso enterohepático en el tracto gastrointestinal relacionado con la administración oral de enzimas.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención también pueden formularse en liposomas. Como se sabe en la técnica, los liposomas se derivan generalmente de fosfolípidos u otras sustancias lipídicas. Los liposomas están formados por cristales líquidos hidratados mono- o multi-lamelares que se encuentran dispersos en un medio acuoso. Se puede utilizar cualquier lípido no tóxico, fisiológicamente aceptable y metabolizable capaz de formar liposomas. La formulación de liposomas puede contener estabilizadores, conservantes, excipientes y similares. Los lípidos preferidos son los fosfolípidos y las fosfatidilcolinas, tanto naturales como sintéticos. Métodos para formar liposomas se conocen en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración. Las proenzimas de proteasa y los agentes activos, y opcionalmente el agente activo adicional, de la composición farmacéutica se pueden proporcionar como componentes separados en el recipiente, envase o dispensador, para tomarse por separado o juntos al mismo tiempo o en diferentes momentos.

Un nivel de dosificación apropiado para las composiciones farmacéuticas de la invención será generalmente de aproximadamente 0.01 a 500 mg por kg de peso corporal del paciente por día, que se puede administrar en dosis únicas o múltiples. Puede ser de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg/kg por día; o aproximadamente 0.5 a aproximadamente 100 mg/kg por día. Un nivel de dosificación adecuado puede ser de aproximadamente 0.01 a 250 mg/kg por día, aproximadamente de 0.05 a 100 mg/kg por día o aproximadamente de 0.1 a 50 mg/kg por día. Dentro de este intervalo, la dosis puede ser de 0.05 a 0.5. 0.5 a 5 o 5 a 50 mg/kg por día.

Para administración oral, las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en forma de comprimidos que contienen 1.0-4000 miligramos de la proenzima proteasa, particularmente 1.0.5.0. 10.0. 15.0.20.0. 25.0. 50.0.75.0. 100.0.

150.0. 200.0. 250.0. 300.0. 400.0. 500.0. 750.0. 1000. 1500. 2000. 2500. 3000. 3500 y 4000 miligramos de proenzimas proteasas para el ajuste sintomático de la dosis al paciente a tratar. Las composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento se pueden administrar en un régimen de 1 a 4 veces por día, una o dos veces por día, o una vez por día, con requisitos de administración reducidos que generalmente conducen a un mayor cumplimiento.

La dosificación puede variar ampliamente dependiendo de si se administra una única forma de administración de la composición. Una administración única adecuada para una realización de las composiciones farmacéuticas para su uso como se describe en el presente documento puede comprender:

• tripsinógeno en una cantidad entre 1 - 100 mg, particularmente entre 2 - 50 mg, más particularmente (en mg) 1.0. 2.5.

5.0. 7.5. 10.0. 15.0. 20.0. 25.0. 30.0. 40.0. 50.0; y

• quimotripsinógeno en una cantidad de entre 1-100 mg, particularmente 2-50 mg, más particularmente (en mg) 1.0.

2.5. 5.0. 7.5. 10.0. 15.0. 20.0. 25.0. 30.0. 40.0.50.0.

Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier paciente en particular pueden variarse y dependerán de una diversidad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y momento de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y el huésped sometido a terapia.

Los niveles de dosificación adecuados para los diversos componentes (si están presentes) de una realización de las composiciones farmacéuticas para su uso como se describe en el presente documento pueden comprender:

• quimotripsinógeno en una cantidad de al menos 0.2 mg/kg, o en un intervalo de 0.2 a 5 mg/kg, en un intervalo de 0.5 2.0 mg/kg, o aproximadamente 0.8 mg/kg;

• tripsinógeno en una cantidad inferior a 0.5 mg/kg, o en un intervalo de 0.01-0.4 mg/kg, o en un intervalo de 0.05-0.20 mg/kg, o aproximadamente 0.1 mg/kg.

Concentraciones adecuadas para los diversos componentes (si están presentes) de las composiciones farmacéuticas para su uso como se describe en el presente documento, que pueden ser particularmente efectivas si están presentes en o cerca de la superficie de una célula tumoral, pueden comprender:

• quimotripsinógeno en una concentración de al menos 0.5 mg/ml, o en un intervalo de 1-2 mg/ml;

• tripsinógeno en una concentración inferior a 0.25 mg/ml, o en un intervalo de 0.1-0.2 mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas para uso de la invención se pueden administrar por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, tal como en forma de comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos; sublingualmente; bucalmente; parenteralmente, tal como mediante técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular o intracisternal (p. ej., como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); por vía nasal, tal como mediante aerosol para inhalación; tópicamente, tal como en forma de crema o ungüento; o por vía rectal, tal como en forma de supositorios; en formulaciones unitarias de dosificación que contienen vehículos o diluyentes no tóxicos y farmacéuticamente aceptables. Pueden, por ejemplo, administrarse en una forma adecuada para liberación inmediata o liberación prolongada, por ejemplo, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutáneos, esferoides encapsulados o bombas osmóticas.

Puede ser preferible administrar el quimotripsinógeno y el tripsinógeno directamente al lecho del tumor o a los tejidos circundantes, por ejemplo después de la escisión de la masa tumoral. En realizaciones alternativas, el quimotripsinógeno y el tripsinógeno se proporcionan como una dosis sistémica, que puede ser más adecuada para cánceres hematológicos. La descripción anterior describe en general la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se realizaron una serie de estudiosin vitropara estudiar el efecto de las proenzimas pancreáticas sobre la proliferación y diferenciación de las CSCs.

A. Materiales y Métodos

Soluciones de tratamiento y control

Se preparó una solución madre de 6 mg/ml de quimotripsinógeno A y 1 mg/ml de tripsinógeno en PBS y se almacenó a -20 °C hasta que fue necesario. Para cada experimento, la solución madre se diluyó aún más en medio de cultivo para obtener las concentraciones deseadas (véase la Tabla 2).

Como control positivo se utilizó el agente antiproliferativo Interferón alfa (IFN) a una concentración de 10000 UI/ml (INTRON® A Interferón alfa-2b).

También se usó una solución que comprendía quimotripsinógeno A/tripsinógeno e IFN para evaluar el efecto combinado de estos reactivos.

Líneas celulares

Las líneas celulares de cáncer de páncreas humano BxPC3 y la línea celular de cáncer de colon humano HCT-116 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvieron en medio RPMI 1640 (para BxPC3) y medio de Eagle modificado por Dulbecco (para HCT-1 16) (Sigma-Aldrich) complementado con FBS al 10 % .

La línea celular de neuroblastoma SK-N-SH (ATCC® HTB-11™ derivada de neuroblastoma en el sitio metastásico, médula ósea), se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) y se mantuvo en medio esencial mínimo de Eagle complementado con FBS al 10 %.

El pase celular se realizó utilizando el reactivo de reemplazo de tripsina TrypLE™ (Life Technologies).

Aislamiento de CSCs

Las líneas celulares de cáncer de colon BxPC3 pancreático y HCT-116 se cultivaron en medio formador de esferas en placas de fijación ultrabaja. Después de 1 semana, las células formaron esferas y las células madre cancerosas se aislaron utilizando el ensayo ALDEFLu Or (StemCell Technologies) y los siguientes marcadores: CD326. CD44 y CxCR4 (BxPC3) y CD326 y CD44 (para HCT-116) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. (FACS). La subpoblación enriquecida de CSCs se cultivó con un medio formador de esferas específico en placas de fijación ultrabaja (Corning) como se describió anteriormente en Charafe-Jauffret et al. (2010) Clin Cancer Res.16(1):45-55. Un método similar se describe en Ramírez et al. (2014) Oncotarget, 5(11): 3590-3606.

Determinación de la concentración óptima de tripsinógeno/quimotripsinógeno para usar en ensayos posterioresLa viabilidad y proliferación celular se evaluaron utilizando el ensayo MTT (bromuro de 3-(4.5-dimetiltiazolil-2)-2.5-difeniltetrazolio) (Sigma). Brevemente, las células (2x103 células/pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h y luego se trataron con diferentes soluciones de tripsinógeno/quimotripsinógeno (véase la Tabla 2), IFN (control) y tripsinógeno/quimotripsinógeno IFN.

Tres días después, se repitió el tratamiento y las células se mantuvieron durante 3 días adicionales. Las células se mantuvieron con el tratamiento durante seis días. A continuación, las células se procesaron como sigue, se añadieron 10 pL de reactivo MTT 2 mM a cada uno de los pocillos y las células se incubaron a 37 °C durante 4 horas. Luego se añadieron 100 pL de reactivo detergente y las células se dejaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2 horas. La absorbancia se registró a 570 nm.

Los valores de CI<50>se calcularon a partir de cuatro curvas logísticas paramétricas mediante Interpolación lineal utilizando el software Sigma Plot. Todos los experimentos se sembraron en pocillos por triplicado y se llevaron a cabo al menos dos veces.

El efecto de los fármacos contra el cáncer sobre la viabilidad y proliferación celular se evaluó mediante el ensayo MTT (bromuro de 3-(4.5-dimetiltiazolil-2)-2.5-difeniltetrazolio) (Sigma).

Tabla 2. Composición y concentración de las soluciones de tratamiento

Ensayo del Ciclo Celular

La distribución del ciclo celular se midió en las células control y tratadas. Después del tratamiento, las células se recogieron en tubos de 15 ml y se lavaron una vez en 5 ml de PBS frío. Para fijar las células, las células se agitaron suavemente mientras se añadían gota a gota 200 gl de etanol al 70 % y se incubaban al menos durante 20 min a 4 °C en la oscuridad. Después de la fijación, el etanol se descartó mediante centrifugación y las células se tiñeron mediante la adición de una solución que contenía PI y RNasa y se incubaron en la oscuridad durante 45 minutos. Las muestras se procesaron inmediatamente utilizando un citómetro de flujo FACSAria III (Becton Dickinson, BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) del Centro Científico Instrumental (Universidad de Granada). Se recopilaron al menos 10.000 eventos en cada histograma cerrado final. El análisis del ciclo celular se realizó utilizando el algoritmo de Dean y Jett (Multicycle, Phoenix Flow Systems, San Diego, CA).

Análisis de marcadores CSC mediante citometría de flujo

Se mantuvieron células de cáncer de colon BxPC3 y HCT-116 de páncreas clasificadas con ALDEFLUOR durante 6 días en cultivo y se trataron dos veces (día 2 y día 5) con quimotripsinógeno: 0.42 mg/ml - tripsinógeno: 0.07 mg/ml.

Las CSCs tratadas y no tratadas se disociaron usando T ryple y se lavaron dos veces en PBS complementado con albúmina sérica bovina al 1 % (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). El receptor Fc de la superficie celular se bloqueó usando IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) en hielo durante 15 min. Las células se tiñeron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos monoclonales anti-CD44-PE y anti-CD326 FITC y CxCR4-APC (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey). Después del lavado, las células se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSAria III (Becton Dickinson, BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) del Centro Científico Instrumental (Universidad de Granada).

Formación de esferas CSC en presencia de tripsinógeno/quimotripsinógeno

Células SK-N-SH se separaron del matraz de cultivo y se cultivaron en medio acondicionado enriquecido con CSC en presencia de tripsinógeno/quimotripsinógeno (0.07:0.42 mg/ml). La formación de esferas se controló todos los días bajo microscopía óptica y se tomaron fotografías el día 6.

Las líneas celulares de cáncer de colon BxPC3 de páncreas y HCT-116 se separaron del matraz de cultivo y se cultivaron en medio acondicionado enriquecido con CSC en presencia de:

1. Tripsinógeno/quimotripsinógeno (0.07 mg/ml: 0.42 mg/ml)

2. Tripsinógeno/Quimotripsinógeno (0.07 mg/ml: 0.42 mg/ml) más IFN (10000 Ul/ml); o

3. IFN (10000 UI/ml)

La formación de esferas se controló todos los días bajo microscopía óptica y se tomaron fotografías los días 2 y 5.

Para el ensayo de formación de esferas secundarias, las células de las esferas primarias se recogieron mediante centrifugación, luego se disociaron con Tryple y se rompieron mecánicamente con una pipeta. Se sembraron 103 células individuales y se resuspendieron en medio de cultivo de esferas en placas de 24 pocillos de adherencia ultrabaja. Las esferas de > 75 gM de diámetro se contaron después de 6 días mediante microscopía óptica.

RT-PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total de las diferentes líneas celulares se extrajo de cultivos duplicados al 80 % confluentes utilizando el reactivo TRIZOL siguiendo las instrucciones del fabricante (Life Technologies). El ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa del ARN total utilizando el sistema de transcripción inversa (Promega) y el ensayo qRT-PCR se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Promega) y cebadores aleatorios. Cada reacción se realizó por triplicado a partir de dos diluciones de ADNc. Se utilizó el método del ciclo de umbral comparativo (Ct) para calcular el factor de amplificación según lo especificado por el fabricante. Se utilizó GADPH humano como patrón interno para normalizar las variaciones en la calidad del ARN en las cantidades de ADNc de entrada. Las secuencias de cebadores para determinar la expresión de genes asociados con la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) se enumeran en la T abla 3.

Tabla 3:Secuencias de cebadores utilizadas para determinar los niveles de expresión de genes asociados con la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT)

Tabla 4:Secuencias de cebadores utilizadas para determinar los niveles de expresión de genes asociados con la pluripotencia

Estudios de micromatrices

Se analizó con las matrices de PCR RT2 Profiler™ (Qiagen) la expresión de genes implicados en la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) o relacionados con la expresión de CSC procesados siguiendo las instrucciones del fabricante.

Un conjunto de controles presentes en cada una de las matrices permitió el análisis de datos utilizando el método AACT de cuantificación relativa y evaluación del rendimiento de la transcripción inversa, la contaminación del ADN genómico y el rendimiento de la PCR.

Las matrices de PCR RT2 Profilerr™ utilizadas fueron:

1. La matriz de PCR RT2 Profiler™ transición epitelial a mesenquimal humana (EMT, por sus siglas en inglés), que perfila la expresión de 84 genes clave que cambian su expresión durante la EMT o regulan los cambios en la expresión genética durante la EMT. La matriz incluye receptores de superficie celular, matriz extracelular y genes citoesqueléticos que median en la adhesión, migración, motilidad y morfogénesis celular; genes que controlan la diferenciación, el desarrollo, el crecimiento y la proliferación celular; así como genes de factores de transcripción y transducción de señales que causan la EMT y todos sus procesos asociados.

2. La matriz de PCR RT2 Profiler™ de células madre del cáncer humano perfila la expresión de 84 genes vinculados a células madre cancerosas (CSCs). Los genes perfilados con esta matriz incluyen marcadores moleculares de CSC y genes que regulan la proliferación, la autorrenovación y la pluripotencia de CSC para ayudar a garantizar la estabilidad de los aislados de CSC en cultivo. También se incluyen genes implicados en la división celular asimétrica de CSC, migración y metástasis, y vías de transducción de señales relevantes.

B. Resultados

Determinación de la CI50 por ensayo MTT

El ensayo MTT se basa en la reducción de MTT (bromuro de 3-(4.5-dimetiltiazolil-2)-2.5-difeniltetrazolio) por células metabólicamente activas. El formazán púrpura intracelular resultante puede solubilizarse y cuantificarse por medios espectrofotométricos.

La Figura 1 muestra las curvas de respuesta a diversas concentraciones de tripsinógeno/quimotripsinógeno y tripsinógeno/quimotripsinógeno IFN.

Los datos demuestran que la concentración óptima de tripsinógeno/quimotripsinógeno A es tripsinógeno 0.07 mg/ml y quimotripsinógeno A 0.42 mg/ml (una relación de 1:6); sin embargo, también se utilizan proporciones de entre 1:1 y aproximadamente 1:10 de tripsinógeno/quimotripsinógeno. Se espera que reduzca la actividad metabólica celular e inhiba la proliferación celular. Estas concentraciones de tripsinógeno 0.07 mg/ml y quimotripsinógeno A 0.42 mg/ml se usaron en experimentos posteriores y se denominan "PRP" en experimentos posteriores. Los datos también demuestran que la combinación de IFN y tripsinógeno/quimotripsinógeno mejora significativamente el efecto antiproliferativo del tripsinógeno/quimotripsinógeno.

Ensayo del ciclo celular

Ensayos del ciclo celular se realizaron en células que se cultivaron en condiciones de formación de esferas (CSCs) y en células adherentes (no CSCs). Las células se trataron una vez con IFN (10000 UI/ml), PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno 0.07 mg/ml:0.42 mg/ml) y PRP+IFN (tripsinógeno/quimotripsinógeno 0.07 mg/ml:0.42 mg/ml más IFN 10000 UI/ml) y después de 4 días procesados para el ensayo del ciclo celular.

El número de células en la fase G1/G0 fue similar en las CSCs y no CSCs pancreáticas (72.8 % frente a 82.4 %) y en las CSCs y no CSCs de colon (77.1 % frente a 79.9 %). El tratamiento con PRP no pareció cambiar el número de células en G1/G0 en CSC pancreática (82.4 % frente a 89.4 %) o en CSC de colon (79.9 % frente a 78.8 %) (Figura 2a-c; Figura 3ac).

El tratamiento con PRP resultó en una ligera disminución en el número de células en la fase S en comparación con el control (3.25 % frente a 7.95 %), efecto que se potenció con la adición de IFN (2.25 %) (Figura 2d). No hubo diferencias marcadas en el ciclo celular en las CSCs de colon después del tratamiento con PRP (Figura 3d).

Estos resultados sugieren que el tripsinógeno/quimotripsinógeno disminuye la capacidad de las CSCs pancreáticas para proliferar y reduce la fase S en las CSCs pancreáticas.

Ensayo de ALDEFLUOR

Los mecanismos de supervivencia de las CSC incluyen un aumento de la actividad metabólica a través de la aldehído deshidrogenasa (ALDH). Por este motivo, la ALDH ha sido descrita como un marcador para la identificación de células madre cancerosas (Huang et al. (2009). Cancer Res Vol.69 (N° 8): 3382-3389). Células ALDH positivas se pueden detectar con el reactivo ALDEFLUOR mediante citometría de flujo. El ensayo de Aldefluor se basa en la conversión de un sustrato fluorescente no tóxico para el sustrato ALDH en el producto de reacción fluorescente. El sustrato no tóxico para ALDH puede difundirse libremente hacia células intactas y viables. El aminoacetaldehído BODIPY se convierte en el producto fluorescente aminoacetato BODIPY mediante la actividad ALDH. Se han encontrado células positivas para ALDH en diversos tejidos cancerosos, incluidos de mama, hígado, colon, páncreas, próstata, pulmón, ovario y leucemia mielógena aguda, y están relacionadas con la resistencia a la quimioterapia del cáncer (Siclari y Qin (2010) J Orthop Surg Res 5 (78))).

La Figura 4 muestra los resultados del ensayo de ALDH en CSCs y no CSCs pancreáticas.

El porcentaje de células ALDH positivas en muestras no CSC fue aproximadamente del 12 %. Para las células cultivadas en condiciones de formación de esferas, aproximadamente el 50 % de las células fueron positivas para ALDH. El tratamiento de células con PRP redujo significativamente la población de células ALDH positivas (del 47.2 % al 17.5 %) en las CSCs pancreáticas. La adición de IFN aumentó aún más el efecto del PRP (13.8 %). Estos resultados indican que el tripsinógeno/quimotripsinógeno reduce la población de CSC en el cáncer de páncreas.

Expresión de marcadores CSC en tripsinógeno/células tratadas con quimotripsinógeno

Se cultivaron células de cáncer de páncreas en condiciones de formación de esferas para enriquecer la subpoblación de CSCs. Luego, las CSCs pancreáticas se trataron con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno 0.07 mg/ml: 0.42 mg/ml), PRP IFN e IFN y los marcadores de CSC pancreáticos específicos CD 326. Cd 44 y CxCR4 se midieron mediante citometría de flujo.

Los resultados de la citometría de flujo demuestran que el porcentaje de células que expresan los tres marcadores CSC disminuye significativamente después del tratamiento con PRP (del 56.6 % al 8.8 %). El tratamiento con PRP IFN redujo la población de células que expresaban esos marcadores al 4.3 % (Figuras 5 y 6). Estos resultados sugieren que el tratamiento con PRP reduce la población de CSC en el cáncer de páncreas.

Se cultivaron células de cáncer de colon en condiciones de formación de esferas para enriquecer la subpoblación de CSC. Luego, las CSCs de colon se trataron con PRP, PRP+IFN e IFN. Las células se marcaron con ALDH junto con los marcadores CSC específicos del colon: CD326 y CD44 y se analizaron mediante citometría de flujo.

Los resultados de la citometría de flujo (Figuras 7 y 8) demuestran que el porcentaje de células que eran positivas para ALDH y expresaban ambos marcadores CSC específicos del colon disminuyó significativamente después del tratamiento con PRP (del 64.8 % al 31.05 %). El tratamiento con PRP+ INF redujo la población de células que expresaban esos marcadores al 40.8 % (Figura 7). El porcentaje de células que eran ALDH+ y expresaban marcadores CD44 o CD326 disminuyó significativamente después del tratamiento con PRP (del 35.5 % al 8.1 % para las células ALDH+CD44+ y del 43.9 al 7.1 % para las células ALDH+CD326+ - Figura 8).

Formación de esferas CSC en presencia de tripsinógeno/quimotripsinógeno

Se testó la capacidad de PRP de suprimir la formación de esferas. Se añadieron al medio PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno 0.07 mg/ml: 0.42 mg/ml), IFN (10000 UI/ml) y PRP+IFN el día 0. cuando las células cancerosas se cultivaron en condiciones de esfera (medio condicionado y pocillos de cultivo de baja fijación).

La Figura 9 muestra imágenes de los cultivos de células pancreáticas los días 2 y 6. Las imágenes del día 2 muestran que la adición de PRP al medio reduce significativamente el número y el tamaño de las esferas de CSC pancreáticas. Además, la morfología de las esferas formadas es marcadamente diferente (siendo regulares en las células de control no tratadas mientras que irregulares en las células tratadas con PRP).

Las imágenes del día 5 muestran diferencias clave entre las células tratadas con tripsinógeno/quimotripsinógeno A y las células de control. Las células tratadas con PRP y PRP IFN no forman esferas. Las células parecen estar disociadas y rotas.

Los resultados con las células de cáncer de colon fueron diferentes. La Figura 10 muestra que la adición de PRP inhibió la formación de esferas incluso en el día 2. Las células parecen dispersas pero no muertas. El día 5 la esfera aún no se había formado y las células no estaban agregadas.

Estos resultados indican que el tripsinógeno/quimotripsinógeno inhibe notablemente la formación de esferoides por parte de las CSCs.

Formación de esferas de neuroblastoma CSC en presencia de PRP

Se añadió PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno 0.07 mg/ml: 0.42 mg/ml) al medio celular el día 2 y el día 4. cuando las células cancerosas se cultivaron en condiciones de esfera (medio condicionado y pocillos de cultivo con poca adherencia).

La Figura 11 muestra imágenes de los cultivos celulares el día 6. El neuroblastoma tratado con PRP no forma esferas de CSC: las células crecen en suspensión pero no forman grupos de células (Figura 11 B y D). Las CSC de esfera de neuroblastoma se muestran en los paneles A y C, cuando las células se mantuvieron en condiciones de control en ausencia de PRP.

Formación de esferas secundarias

Se realizó un ensayo de formación de esferas secundarias disociando esferas primarias formadas por células tratadas con PRP y comparándolas con células de control no tratadas. La Figura 11E muestra que para las líneas celulares cancerosas BxPC3 y SK-N-SH, no se pudieron contar esferas secundarias después del tratamiento con PRP. Por el contrario, las células de control no tratadas pudieron recuperar la capacidad de formar grupos de células.

PRP destruye las esferas primarias y también suprime la capacidad de las CSC para formar esferas secundarias. Como las esferas tumorales se definen como colonias de células no adherentes derivadas clonalmente derivadas de una sola célula madre tumoral, los resultados obtenidos demuestran que el tratamiento con PRP tiene un efecto directo sobre la población de células madre cancerosas.

EMTy expresión génica asociada a pluripotencia.

Se analizó la expresión de genes relacionados con el proceso EMT y/o pluripotencia en CSC pancreáticas tratadas con PRP (Tripsinógeno/Quimotripsinógeno A 0.07 mg/ml:0.42 mg/ml), y se comparó con CSCs no tratadas. Los resultados de qRT-PCR muestran que genes relacionados con EMT como SnAIL,SLUG, VIMENTINAyN-CADHERINAtuvo una expresión disminuida después del tratamiento (Figura 12). La expresión deE-CADHERINAaumentó después del tratamiento. Estos resultados sugieren que el tratamiento con PRP puede reducir la conversión de un fenotipo epitelial a mesenquimatoso.

Para determinar si el tratamiento con PRP altera la expresión de los marcadores de CSC, se analizaron varios genes de pluripotencia mediante qRT-PCR (los cebadores utilizados se describen en la Tabla 4). Los resultados muestran que la expresión de los genesOCT4. CMYCyKLF4disminuyó ligeramente después del tratamiento con tripsinógeno/quimotripsinógeno A en comparación con las CSCs no tratadas. En cambio, la expresión deNANOGyCD133aumentó después del tratamiento, lo que indica que el efecto del PRP no está mediado por estos dos genes (Figura 13).

Estudios de micromatrices

Los siguientes resultados se relacionan con los cambios en la expresión génica en las CSCs después del tratamiento con PRP.

a) Genes de expresión asociados a EMT

Para estudiar el efecto del PRP en el proceso de EMT, se analizó la expresión de varios genes clave involucrados en la EMT en CSCs tratadas y se comparó con el perfil de expresión génica de CSCs de control no tratadas. Los resultados se muestran como la regulación de veces (arriba o abajo) en comparación con las células de control.

La Figura 22A muestra el cambio en la expresión génica de genes seleccionados que normalmente están regulados negativamente durante el proceso de EMT. La Figura 22A muestra que después del tratamiento con PRP, la expresión de E-cadherina aumentó 4.28 veces, lo que indica que el tratamiento con PRP induce la expresión de este gen. Además, el factor tipo Kruppel 17 (KLF17) también fue regulado positivamente por el tratamiento con PRP, alcanzando una regulación positiva de 5.9. Anteriormente se había informado que KLF17 suprime directamente la EMT, la angiogénesis, la invasión y la metástasis. La expresión de otros genes también aumentó después del tratamiento con PRP (p. ej., MST1R: 1.6928 veces; TFPI2: 4.4272 veces y NUDT13: 2.3692 veces), lo que sugiere que el PRP tiene un efecto anti-EMT.

Se analizaron genes que normalmente están regulados positivamente durante la EMT y los resultados se resumen en la Figura 22B. 13 genes que se ha descrito que inducen EMT fueron regulados negativamente después del tratamiento con PRP. Por ejemplo, el factor de transcripción Snail, que típicamente está regulado positivamente en las células metastásicas que se someten a EMT, se regulaba negativamente después del tratamiento con PRP (SNAI1: -1.9678 y SNAI2: -1.8604). El inhibidor de la serina proteasa SERPINE1 se redujo significativamente (regulación negativa de 4.6 veces) después del tratamiento con PRP. La expresión de las integrinas ITGA5 e ITGAV también se reguló a la baja (regulación a la baja de 2.5697 y 1.0193. respectivamente). Se ha informado que ITGA5 fomenta la invasión del tumor y anteriormente se ha correlacionado una mayor expresión de este gen con un tiempo de supervivencia más corto en pacientes con cáncer. ITGAV también está implicado en la regulación de la angiogénesis y la progresión del cáncer.

En conclusión, el tratamiento con PRP tiene un efecto significativo en la expresión de genes que participan en el proceso de EMT, al inducir la expresión de genes normalmente regulados negativamente durante la EMT y reduciendo la expresión de genes normalmente regulados positivamente durante la EMT. Los resultados indican el potencial terapéutico del PRP para reducir la progresión del tumor y la metástasis, además de reprimir la población de CSC.

b) Expresión de genes implicados en la diferenciación de células madre

La expresión de genes clave implicados en la diferenciación pancreática se analizó en CSCs pancreáticas. La expresión de genes en CSCs tratadas con PRP se comparó con la expresión de genes en CSCs de control no tratadas. Los resultados se muestran como la regulación de veces (hacia arriba o hacia abajo) en comparación con las células de control.

Los resultados obtenidos se resumen en la Figura 23 y coincidieron con los estudios que muestran que el tratamiento con PRP induce la diferenciación celular. 7 genes relacionados con la diferenciación se regularon positivamente después del tratamiento con PRP, incluida la expresión del factor de crecimiento epidérmico (EGF), que aumentó 8.9 veces en comparación con las células de control.

c) Expresión de Genes Supresores de Tumores

La Figura 24 muestra la regulación positiva de 11 genes con funciones supresoras de tumores previamente informadas, después del tratamiento con PRP.

La expresión del factor de transcripción FOXP1 aumentó 6.04 veces después del tratamiento con PRP. Además, la expresión de TWIST2 aumentó (5.2737 veces) después del tratamiento con PRP. Otro gen supresor de tumores que fue regulado positivamente como consecuencia de los tratamientos con PRP fue THY1 (aumento de 3.622 veces).

Se descubrió que SPARC, una proteína extracelular implicada en la deposición y el modelado de la matriz extracelular que está regulada negativamente en muchos tipos de tumores, estaba regulada positivamente (3.611 veces) después del tratamiento con PRP. La expresión de SIRT1 también aumentó 2 veces en las células tratadas. SIRT1 codifica un miembro de la familia de proteínas sirtuinas y se ha informado que inhibe la proliferación de células de cáncer de páncreas que expresan el factor regulado positivamente del adenocarcinoma de páncreas (PAUF).

d) Expresión de genes relacionados con metástasis e invasión

El nivel de expresión de 9 genes implicados en la metástasis y la invasión celular se determinó después del tratamiento con PRP (Figura 25A). Los resultados muestran que el tratamiento con PRP dio como resultado una regulación negativa significativa de estos genes. Por ejemplo, la expresión de osteopontina (SPP1) se redujo 10 veces. SPP1 es una proteína calcificada asociada a la ECM similar a una quimiocina que se ha informado que desempeña un papel crucial en la determinación del potencial metastásico de diversos cánceres.

La señalización a través de receptores del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR, por sus siglas en inglés) está implicada en múltiples procesos asociados a tumores. La expresión de PDGFR está regulada positivamente en muchos tumores; por ejemplo, las células endoteliales de tumores metastásicos en modelos de carcinoma de páncreas cultivados ortotópicamente mostraron una alta expresión de PDGFR. Después del tratamiento con PRP, la expresión de PDGFRB se redujo 3.1093 veces, lo que indica que el PRP tiene un efecto antimetastásico. Además, la expresión del gen FN1 que codifica la fibronectina también se redujo significativamente después del tratamiento con PRP (regulación negativa de 3.2 veces). La fibronectina participa en los procesos de adhesión y migración celular, incluida la metástasis.

e) Expresión de genes relacionados con la adhesión celular

La Figura 25B muestra la regulación positiva de genes implicados en la adhesión celular. La expresión de E-cadherina y p-catenina aumentó (4.3 y 4 veces, respectivamente) después del tratamiento con PRP, de acuerdo con estudios previos. La E-cadherina y la p-catenina tienen funciones conocidas en la EMT. Los resultados indican que el PRP inhibe la EMT al mejorar directamente la expresión de E-cadherina y p-catenina en CSCs.

f) Expresión de genes que codifican citocinas

Se investigó el impacto del tratamiento con PRP en la expresión de genes que codifican citocinas en las CSCs pancreáticas. La Figura 26 muestra la regulación negativa de genes que codifican citocinas asociadas con la proliferación, migración e invasión celular en el cáncer.

Se ha demostrado que IL-8 y los receptores de IL-8 están sobre-expresados en el cáncer de páncreas pero suprimidos en los tejidos pancreáticos normales, lo que sugiere que la IL-8 desempeña un papel importante en la invasividad del cáncer de páncreas humano. Además, también se ha informado que la IL-8 fomenta la EMT mediante la modulación del microentorno del tumor. Los resultados presentados aquí muestran que la expresión de IL-8 se reguló negativamente (4.5 veces) después del tratamiento con PRP. La disminución en la expresión del gen IL-8 detectada después del tratamiento con PRP respalda aún más la observación de que el PRP ejerce un efecto anti-CSC.

El tratamiento de las CSCs con PRP disminuyó drásticamente la expresión de la fosfoproteína-1 secretada (SPP1. regulación negativa de 10 veces). Se ha informado que SPP1 fomenta la supervivencia de las células cancerosas y regula la angiogénesis y la inflamación asociadas a tumores. Además, el tratamiento con PRP indujo la regulación negativa de la glicoproteína de membrana CD31/PECAM-1. una proteína que se ha encontrado en muchas células tumorales, como los gliomas cerebrales humanos, el carcinoma de cuello uterino, el cáncer de pulmón y el cáncer de mama.

g) Expresión de genes marcadores CSC

El tratamiento con PRP de CSC pancreáticas indujo la regulación negativa de 6 genes reconocidos como marcadores de CSC (Figura 27), incluidos CD38. CD45. Oct-04 y KLF4.

h) Expresión de genes asociados a la vía MAPKIERK

El tratamiento con PRP de CSCs pancreáticas indujo la regulación negativa de varios genes relacionados con MAPK. Los resultados se muestran en la Figura 28.

ConcIusión

Los resultados de los estudiosin vitroanteriores muestran que:

1. El tratamiento con PRP destruye las esferas primarias y suprime la capacidad de las CSCs de formar esferas secundarias y, por lo tanto, tiene un efecto directo sobre la población de células madre cancerosas;

2. PRP tiene un potente efecto anti-EMT en las CSCa;

3. PRP tiene un efecto antimetastásico, potenciando la expresión de factores que fomentan la adhesión celular y reduciendo la expresión de factores asociados con los procesos de migración en las CSCs;

4. PRP potencia la expresión de genes supresores de tumores relevantes en CSCs;

5. PRP modula la expresión de genes marcadores de CSC;

6. PRP puede inducir la diferenciación de CSCs; y

7. PRP regula negativamente la expresión de citocinas asociadas con la proliferación, migración e invasión de celular en el cáncer.

Estos resultados refuerzan el potencial terapéutico del PRP como fármaco anti-CSC, anti-EMT, anti-metástasis y antitumoral.

Ejemplo 2

Fase 1- Estudio in vivo estudio de la actividad antitumoral de PRP contra las CSCs

A. Diseño experimental:

1- Grupo control (n=10): ratones no tratados (inoculados con solución salina fisiológica)

2- Grupo de prevención: los ratones se tratan con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A), antes de la inoculación con CSCs (n=10). El PRP se disolvió en solución salina fisiológica y se administra en una única dosis inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3 semanas.

3- Grupo Prevención Tratamiento: los ratones se tratan con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A), antes y después de la inoculación de CSC (n=10). PRP disuelto en solución salina fisiológica se administra en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3 semanas. El tratamiento se mantiene durante 3-4 meses.

4- Grupo de tratamiento: los ratones se tratan con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A), solo después de la inoculación de CSC. PRP disuelto en solución salina fisiológica se administra en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3-4 meses.

Fase 2- Estudio de la capacidad de PRP de inhibir el inicio de la capacidad tumoral de las CSCs pancreáticasPara determinar si el tratamiento con PRP puede reducir la capacidad de iniciación de tumores de las CSCs pancreáticas, se realiza el siguiente conjunto de experimentos. Se llevan a cabo experimentos de xenoinjerto en donde se induce la formación de tumores mediante la inyección de CSC pancreáticas previamente tratadasin vitrocon PRP. Se realiza una evaluación de la formación de tumores y un estudio de las características del tumor.

A. Diseño experimental:

1- Grupo control (n=8). A ratones NSG se les inyectan CSCs pancreáticas no tratadas.

2- Grupo CI50 PRP (n=8). A los ratones se les inyectan CSCs pancreáticas tratadas con la CI50 de PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) durante 3-6 días.

3- Grupo 2x CI50 PRP (n=8). A los ratones se les inyectan CSCs pancreáticas tratadas con 2 veces la CI50 de PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) durante 3 a 6 días.

4- Gupo 5x CI50 PRP (n=8). A los ratones se les inyectan CSCs pancreáticas tratadas con 5 veces la CI50 de PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) durante 3 a 6 días.

Fase 3- Ensayo in vivo de metástasis experimental

Para determinar si PRP se puede utilizar como agente anti-metástasis, se realiza un ensayo experimental de metástasis utilizando ratones inmunodeficientes. El modelo de metástasisin vivohace uso de CSC-L2T (subpoblación enriquecida obtenida de transfectados con BxPC3in vitrocon luciferasa y la proteína roja fluorescente td-Tomato) que se inyecta directamente en la circulación de ratones NSG (ratones NOD scid gamma) a través de las venas de su cola. La progresión metastásica se controla mediante IVIS (Sistema de Formación de Imágenes In Vivo de Spectrum Preclinical). Los ratones se tratan con PRP antes y después de la inyección de CSC-L2T de acuerdo con el siguiente diseño experimental:

A. Diseño experimental:

1 - Grupo de control (n=8): se inoculan ratones no tratados con solución salina fisiológica.

2- Grupo de prevención: Los ratones se tratan con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) antes de la inoculación de CSC-L2T. PRP disuelto en solución salina fisiológica se administra en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3 semanas.

3- Grupo de prevención tratamiento: los ratones se tratan con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) antes y después de la inoculación de CSC-L2T. PRP disuelto en solución salina fisiológica se administra en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3 semanas. El tratamiento se mantiene durante 3-4 meses.

4- Grupo de tratamiento: los ratones se tratan con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) solo después de la inoculación con CSCs-L2T. El PRP disuelto en solución salina fisiológica se administra en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3-4 meses.

Material y Métodos

Fase 1 y 2

Aislamiento de CSCs

Las células madre cancerosas de la línea celular de cáncer de páncreas (adenocarcinoma) BxPC3 se aíslan utilizando el ensayo ALDEFLUOR (StemCell Technologies) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y la subpoblación enriquecida de CSC se cultivará con el medio formador de esferas específico de la solicitante (documento PCT/ES2015/070606) en placas de fijación ultrabajas (Corning).

Estudios de xenoinjertos antitumorales in vivo

Para establecer tumores de xenoinjerto se utilizaron ratones inmunodeficientes NSG de seis a ocho semanas de edad. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Granada. Los ratones se alojaron y mantuvieron a una temperatura de 20 °C a 24 °C, 50 % de humedad relativa, un ciclo de luz y oscuridad de 14 a 10 h con comida y aguaad libitum.

Para la fase 2. las CSCs pancreáticas se tratan durante 3 y 6 días con CI<50>.2 veces CI<50>y 5 veces CI<50>del PRP. La viabilidad celular se determina antes de la inoculación de CSCs tratadas con PRP en el modelo de ratones NSG.

Los tumores de la línea celular de cáncer de páncreas BxPC3 se generaron mediante inyecciones subcutáneas de 100 500 células viables/ratón* utilizando agujas de calibre 26. Luego, los animales (n = 10 por grupo) se asignan aleatoriamente como grupos de control y de tratamiento (grupos 1-4) y se tratan de acuerdo con el procedimiento experimental descrito anteriormente (Figura 14 A y B).

El peso del tumor se calculó de acuerdo con la fórmula: TW (mg) = volumen del tumor (mm3) = d2 x D/2. en donde d y D son los diámetros más corto y más largo, respectivamente. Los bloques incluidos en parafina de todos los tumores se seccionan a 5 pm. Cada una de las muestras se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) para análisis histopatológico.

Tratamiento PRPin vivo

Se administró PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) disuelto en solución salina fisiológica en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante el período de tratamiento. La dosis administrada a los grupos 2 y 3 fue de 83.3 mg/kg de tripsinógeno y 500 mg/kg de quimotripsinógeno A. El tripsinógeno y el quimotripsinógeno A se administraron en combinación y se administraron en una única inyección. El volumen de dosificación fue de 10 mL/kg. El volumen de solución de dosificación administrada a cada animal se calculó y ajustó en función del peso corporal individual medido inmediatamente antes de la dosificación.

Los tratamientos se administraron durante 3 semanas antes de la inducción del tumor (grupo de prevención) o durante 3 semanas antes de la inducción del tumor y durante al menos 4 semanas (preferiblemente hasta 9.5 semanas) después de la inducción (grupo de prevención tratamiento).

Ensayo preliminar de metástasis

Los ratones fueron sacrificados con una dosis letal de pentobarbital sódico (100 mg/kg de peso corporal). Se extraen los órganos torácicos, se lava el pulmón con PBS frío y se pesa. Se extirpan otros órganos viscerales y se inspeccionan para detectar la presencia de metástasis. El pulmón se fija en formalina y se incluye en parafina. Se analizan secciones de pulmón teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) para detectar la presencia de nódulos metastásicos.

Medición del efecto de PRP sobre el crecimiento tumoral

El efecto de PRP sobre el crecimiento del tumor se determinó calculando la relación de inhibición del crecimiento del tumor, T/C. La T/C se determinó utilizando dos métodos diferentes: el primero midió el volumen del tumor al final del tratamiento y el segundo midió la tasa de crecimiento del tumor durante el transcurso del tratamiento.

En el primer método, se calculó la relación entre el volumen medio de los tumores de control (C) frente al volumen medio de los tumores tratados (T) en el último día de tratamiento. T/C < 0.45 es el punto de corte de consenso para indicar la eficacia de un tratamiento determinado.

En el segundo método, se utilizó el T/C basado en tasas descrito por Hather et al., (2014). Este método se basa en ajustar la curva de crecimiento de cada tumor a un modelo exponencial. El T/C basado en tasas utiliza todos los datos disponibles, por lo que puede tener en cuenta diferencias aleatorias en el volumen inicial. Además, ajustar todos los datos reduce el efecto del ruido de medición y permite que las estimaciones de T/C basadas en tasas sean más precisas. También se calcula un valor p utilizando una prueba t bilateral con varianzas desiguales aplicadas a las tasas de crecimiento tumoral estimadas. El cálculo del valor p asume que las tasas de crecimiento del tumor estimadas se distribuyen normalmente dentro de cada grupo de tratamiento. Se eligió un umbral de 0.4 porque es un límite común para determinar si la actividad antitumoral es suficiente para tener importancia práctica. Por lo tanto, se evaluó la evolución del crecimiento del tumor midiendo el volumen del tumor cada 2 días durante 36 días y los datos se analizaron utilizando una hoja de cálculo de Excel que calcula la tasa T/C (Figura 18). El T/C basado en la tasa fue de 0.54 (p= 0.17) para el grupo pretratado y de 0.13 (p=0.001) para el grupo pretratado y tratado. Lo que indica que el tratamiento de seguimiento con PRP inhibe significativamente el crecimiento del tumor.

Efecto de PRP sobre la incidencia de tumores y el peso

El índice de tumorigénesis (TIn) es un índice que refleja la incidencia relativa del tumor y el peso del tumor en un sujeto. El TIn se puede utilizar para medir la malignidad o la agresividad del tumor.

Fase 3

Transfecciones de lentivirus

Células 293T se co-transfectan con un vector lentiviral que codifica la luciferasa de luciérnaga y la proteína fluorescente roja td-Tomato (L2T) 26. un vector de empaquetamiento (psPAX2) y un vector de envoltura (pCMV-VSVG) usando reactivo de transfección lipofectamina (Life Technologies). Las partículas virales producidas a partir de células 293T se recogen y se utilizan para infectar células BxPC3. Brevemente, el sobrenadante se recupera después de 48 h de las células transfectadas con 293T y se filtra mediante una membrana de poro de 0.45 gm y se añade a las células sembradas con BxPC3 suplementadas con 4 gg/mL de polibreno (Sigma-Aldrich). Después de la infección viral, las células td-Tomato+ se seleccionan para la integración estable de los transfectos mediante FACS.

Ensayo experimental de metástasis pulmonar in vivo

Se inyectan BxPC3 CSC-L2T en la vena de la cola de ratones NSG hembra de 4 a 6 semanas de edad (n = 8 por grupo). La bioluminiscencia se controla mediante IVIS el día 0 y semanalmente mediante la inyección intraperitoneal de 150 mg/kg de D-luciferina (Thermo Fisher). Después de 4 semanas, se sacrifica a los ratones y se extirpan los pulmones, se fotografían para determinar la expresión de td-Tomato y se analiza la actividad de luciferasa lavando los pulmones con 150 gg/mL de D-luciferina diluida en PBS. Los pulmones extirpados también se utilizan para la tinción con hematoxilina y eosina y el análisis de microscopía confocal.

Tratamiento PRP in vivo

PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) disuelto en solución salina fisiológica se administra en una única dosis por inyección i.v. en bolo cada dos días durante 3-4 meses.

Análisis histológico

Los pulmones se sumergen en paraformaldehído al 4 % en PBS 0.1 M durante 4 h a 4 °C, se lavan en PBS 0.1 M y se incluyen en parafina en un procesador de tejidos automático (TP1020. Leica, Alemania). Los bloques de parafina se cortan en secciones de 4 mm para teñirlos. Las secciones se desparafinan con xileno y se hidratan con concentraciones de alcohol decrecientes (absolutas al 70 %), y se tiñen con hematoxilina-eosina. Luego, las secciones se deshidratan con concentraciones crecientes de alcohol (al 95 % a absoluto), se aclaran con xileno y se montan con medio de montaje. La observación bajo microscopía óptica y la adquisición de imágenes digitales se realizan con un microscopio invertido (Nikon H550s).

Análisis inmunohistoquímico

Los pulmones se sumergen en formalina al 10 % a temperatura ambiente durante la noche, se lavan en PBS 0.1 M y se conservan en sacarosa al 30 % en PBS durante 24 h. Luego, el material se empapa en compuesto OCT (Sakura Finitek Europe B.V., Países Bajos), se congela en nitrógeno líquido y los bloques se almacenan a -40 °C hasta su uso. Los bloques OCT se cortan en secciones de 8 mm y se recogen en portaobjetos SuperFrost (Menzel-Glasser, Alemania). Las secciones se hidratan con PBS y se montan con medio de montaje con DAPI. La observación bajo microscopía fluorescente y la adquisición de imágenes digitales se realizarán con un microscopio confocal (Nikon A1).

Resultados

Los resultados preliminares de los experimentos de la Fase 1 se obtuvieron 4 semanas y 9.5 semanas después de la inoculación de CSC. Los resultados demuestran la eficacia antitumoral de PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) contra tumores inducidos por BxPC3 en CSCs pancreáticas humanas.

Las Figuras 15 a 19 muestran los resultados del estudio de Fase 1. 9.5 semanas después del comienzo del ensayo (es decir, 67 días después de la inoculación de CSC).

La Figura 15 proporciona imágenes de tumores extirpados de ratones en los grupos 1.2 y 3.

La Figura 16 muestra el % de incidencia de tumores en los grupos 1. 2 y 3: 9 de 10 ratones de control desarrollaron un tumor después de la inyección subcutánea de la población enriquecida con CSC de BxPC3 pancreática (este valor se interpretó como una incidencia de tumores del 100 %). En ambos grupos 2 y 3 (es decir, prevención y prevención tratamiento), menos del 50 % de los ratones desarrollaron tumores (41 % en el grupo 2; 50 % en el grupo 3). Estos resultados muestran que el tratamiento preventivo con PRP (tripsinógeno/quimotripsinógeno A) antes de la inoculación de CSC tiene un claro efecto supresor sobre el injerto de tumor de CSC pancreático.

Se evaluó el efecto del tratamiento con PRP en la reducción del crecimiento tumoral y los resultados se muestran en las Figuras 17 y 18. La Figura 17 muestra el volumen de cada tumor en el último día de tratamiento junto con el valor T/C (calculado usando el método 1) para ratones del grupo 2 y 3. Estos resultados muestran que el tratamiento preventivo con PRP (grupo 2) y prevención tratamiento (grupo 3) disminuyen la captación del tumor y perjudican el crecimiento del tumor en comparación con los animales control no tratados (T/C = 0.64 en el grupo 2 y T/C = 0.40 en grupo 3).

El T/C basado en tasas para los dos grupos experimentales se muestra en la Figura 18. El T/C basado en tasas fue de 0.54 (p=0.17) para el grupo de prevención (grupo 2) y de 0.13 (p=0.001) para el grupo de prevención tratamiento. (grupo 3). Estos resultados muestran que el tratamiento de seguimiento con PRP inhibe significativamente el crecimiento del tumor, como lo demuestra el volumen reducido de tumores en este grupo de tratamiento. Específicamente, para los ratones del grupo 2. el volumen del tumor fue solo el 54 % del volumen observado en los tumores de los ratones de control. En los ratones del grupo 3. el volumen del tumor era solo el 13 % del de los tumores en los ratones de control.

En conjunto, los resultados presentados en las Figuras 17 y 18 muestran una incidencia significativamente reducida de desarrollo de tumores y un volumen reducido de cualquier tumor que se desarrolle en ratones que reciben PRP como preventivo y en ratones que reciben PRP tanto preventivo como post-inoculación (tratamiento) de CSC.

La Figura 19 muestra que se observaron diferencias significativas en TIn (p<0.01) cuando los ratones recibieron PRP preventivo o cuando recibieron tanto PRP preventivo como PRP después de la inoculación de CSC, lo que indica el efecto antitumoral del PRP.

Las Figuras 20 y 21 muestran la tinción con H&E y la tinción con tricomas de Masson, respectivamente, de secciones de tumores que se extirparon de ratones en los grupos de control, prevención y prevención tratamiento. Las imágenes representativas muestran diferencias notables en la densidad de los tumores, con una densidad significativamente reducida y un aumento de los huecos entre las células observadas en los tumores de los grupos de prevención y de prevención tratamiento. Además, la presencia de tejido fibrótico en tumores de ratones que recibieron PRP (tanto en el grupo de prevención como en el de prevención tratamiento) se redujo significativamente en comparación con los ratones de control.

En conclusión, los datos demuestran el efecto antitumoral de PRP como preventivo y terapéutico. PRP perjudicó el injerto de tumores de CSC en ratones y redujo sustancialmente la progresión de aquellos tumores que se iniciaron después de la inoculación de CSC.

Ejemplo 3

El tratamiento del cáncer usando la invención se puede implementar de acuerdo con lo siguiente.

A una persona diagnosticada con cáncer de colon se le puede extirpar la mayor parte de la masa tumoral mediante cirugía (laparoscópica o convencional). Después de la resección de la masa tumoral, al individuo se le administra quimotripsinógeno y tripsinógeno, opcionalmente en combinación con quimioterapia o radioterapia. Antes de la administración, la presencia de células madre de cáncer de colon puede determinarse identificando células en el individuo, o cerca del sitio de resección, que expresan marcadores característicos de las células madre de cáncer de colon. Marcadores ejemplares pueden ser CD326 y CD44 o cualquier otro marcador descrito en el presente documento (véase la Tabla 1). Luego se controla al individuo para detectar recurrencia en el sitio del tumor original y aparición de metástasis en sitios conocidos de metástasis de cáncer de colon. El resultado es la prevención o el retraso de la recurrencia o metástasis.

A una persona diagnosticada con cáncer de páncreas se le puede extirpar la mayor parte de la masa tumoral mediante cirugía (laparoscópica o convencional). Después de la resección de la masa tumoral, al individuo se le administra quimotripsinógeno y tripsinógeno, opcionalmente en combinación con quimioterapia o radioterapia. Antes de la administración, la presencia de células madre de cáncer de páncreas puede determinarse identificando células en el individuo, o cerca del sitio de resección, que expresan marcadores característicos de las células madre de cáncer de páncreas. Los marcadores ejemplares pueden ser CD326. CD44 y CxCR4 o cualquier otro marcador descrito en el presente documento (véase la Tabla 1). Luego se controla al individuo para detectar recurrencia en el sitio del tumor original y aparición de metástasis en sitios conocidos de metástasis de cáncer de páncreas. El resultado es la prevención o el retraso de la recurrencia o metástasis.

Se pueden aplicar métodos similares a otros cánceres, preferiblemente tumores sólidos, tales como cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o cualquier otro cáncer descrito en el presente documento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para uso en minimizar la progresión del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno, preferiblemente en donde el sujeto se encuentra en remisión parcial o completa.

2. Una composición para uso en el tratamiento de una enfermedad residual mínima reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

3. Una composición para uso en la prevención de la recurrencia del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que ha recibido un tratamiento contra el cáncer y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

4. Una composición para uso en la prevención o inhibición de la metástasis del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto que va a recibir un tratamiento contra el cáncer, que está recibiendo un tratamiento contra el cáncer o que ha recibido un tratamiento contra el cáncer, y en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición cantidades terapéuticamente eficaces de quimotripsinógeno y tripsinógeno.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento contra el cáncer se selecciona del grupo que consiste en escisión quirúrgica del tumor, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o una combinación de las mismas.

6. Una composición para uso en la prevención del cáncer o retrasar la aparición del cáncer reduciendo la proliferación de células madre cancerosas en un sujeto, en donde se determina que el sujeto tiene células madre cancerosas, comprendiendo la composición una cantidad terapéuticamente eficaz de quimotripsinógeno y tripsinógeno, preferiblemente en donde el sujeto es uno que se identifica como en riesgo de cáncer, preferiblemente, en donde el riesgo de cáncer se determina en base a antecedentes médicos familiares, o biomarcadores asociados con el riesgo de cáncer, o una combinación de los mismos.

7. La composición para uso de la reivindicación 6. en donde al sujeto no se le ha diagnosticado cáncer.

8. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el individuo no tiene cáncer detectable en el momento en que se administra la composición.

9. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición está adaptada para administrar quimotripsinógeno y tripsinógeno en una relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno de entre mayor que 1:1 pero menor que o igual a 10:1. preferiblemente en donde la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el intervalo de 4:1 a 8:1. más preferiblemente en donde la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno está en el intervalo de 5:1 a 7:1.

10. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 9. en donde la relación en peso de quimotripsinógeno:tripsinógeno es 6:1.

11. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se determina la presencia de células madre cancerosas en el sujeto y esa determinación se realiza identificando células que expresan uno o más marcadores de células madre cancerosas.

12. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 11. en donde los marcadores de células madre cancerosas se seleccionan de uno o más de:

(a) CD34+,CD38-,HLA-DR,CD71-,CD90-,CD117-y CD123+;

(b) AEE+CD44+CD24-/bajoLinaje-y ALDH-1alto.

(c) CD133+, CD49f+ y CD90+;

(d) CD133+, BCRP1+, A2B5+y SSEA-1+;

(e) CD133+ y ABCG2alto;

(f) CD133+, CD44+, CD166+, EpCAM+, CD24+ o CD326+y CD44+;

(g) CD138-;

(h) CD44+, a2p1alto y CD133+; y

(i) CD133+, CD44+, EpCAM+, CD24+ o CD326+, CD44+ y CxCR4+.

13. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde se reduce o se evita que el número de células madre cancerosas en el sujeto aumente después de la administración del quimotripsinógeno y tripsinógeno.

14. La composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las células madre cancerosas se diferencian tras la administración del quimotripsinógeno y el tripsinógeno.

15. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14. en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de colon, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de piel, cáncer de esófago, cáncer de pulmón y cáncer de mama, preferiblemente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de colon, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de piel, cáncer de esófago, cáncer de pulmón y cáncer de mama.