ES2965475T3

ES2965475T3 - Métodos y composiciones basados en HLA y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2965475T3
Application number: ES18707815T
Authority: ES
Inventors: Jennifer Abelin; Rob Oslund; Nir Hacohen; Dominik Barthelme; Michael Rooney
Original assignee: Biontech US Inc
Current assignee: Biontech US Inc
Priority date: 2017-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2024-04-15
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: KR102565256B1; US20200096521A1; CN110809716B; WO2018148671A1; CN116693695A; DK3580561T3; US11965892B2; SI3580561T1; US20200105378A1; FI3580561T3; HUE065174T2; JP2020511121A; JP2023126614A; EP4287191A3; EP3580561B1; CA3053133A1; KR20230119735A; BR112019016657A2; KR102800807B1; RU2019128435A

Abstract

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para aislar péptidos HLA de células. La presente divulgación proporciona una plataforma universal y métodos para perfilar el peptidoma HLA, lo que permite la identificación de péptidos HLA presentados endógenamente a partir de líneas celulares que expresan cualquier posible construcción de clase I o II. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones basados en HLA y usos de los mismos

Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica la prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/457,978, presentada el 12 de febrero de 2017 y la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/461,162, presentada el 20 de febrero de 2017.

Antecedentes de la invención

El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es un complejo de genes que codifica los genes del antígeno leucocitario humano (HLA). Los genes de HLA se expresan como heterodímeros proteicos que se presentan en la superficie de las células humanas a las células T circulantes. Los genes de HLA son muy polimórficos, lo que les permite ajustar el sistema inmunológico adaptativo. Las respuestas inmunitarias adaptativas dependen, en parte, de la capacidad de las células T para identificar y eliminar células que presentan antígenos peptídicos asociados a enfermedades unidos a heterodímeros del antígeno leucocitario humano (HLA).

En los seres humanos, las proteínas endógenas y exógenas pueden procesarse a péptidos por el proteasoma y por proteasas y peptidasas citosólicas y endosomales/lisosomales y presentarse por dos clases de proteínas de la superficie celular codificadas por el MHC. Estas proteínas de la superficie celular se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA de clase I y clase II), y el grupo de péptidos que se unen a ellas y provocan respuestas inmunitarias se denominan epítopos de HLA. Los epítopos de h La son un componente clave que permite al sistema inmunológico detectar señales de peligro, tales como la infección por patógenos y la transformación de lo propio. Las células T CD8+ circulantes reconocen epítopos del MHC de clase I (HLA-A, HLA-B y HLA-C) derivados de vías de procesamiento endógenas y presentados en casi todas las células nucleadas. Las células T CD4+ reconocen epítopos del MHC de clase II (HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP) presentados en las células presentadoras de antígeno (APC), tales como las células dendríticas y los macrófagos. La presentación del péptido por HLA de clase II activa las células T auxiliares, lo que promueve subsecuentemente la diferenciación de las células B y la producción de anticuerpos, así como también las respuestas de CTL. Las células T auxiliares activadas también secretan citocinas y quimiocinas que activan e inducen la diferenciación de otras células T.

Los genes que codifican los heterodímeros de HLA son muy polimórficos, con más de 12000 variantes alélicas de clase I y 4000 de clase II identificadas en toda la población humana. De los haplotipos de HLA maternos y paternos, un individuo puede heredar diferentes alelos para cada uno de los loci de HLA de clase I y clase II. Las moléculas de HLA de clase I son heterodímeros formados por una cadena a pesada, codificada por genes de HLA de clase I, y la p-2-microglobulina (B2M). Las moléculas de HLA de clase II son heterodímeros de cadena a y p, ambas codificadas por los genes de HLA de clase II. Debido a las combinaciones de pares de cadenas a y p, la población de heterodímeros de HLA es muy compleja. Además, se estima que cada heterodímero de HLA se une a miles de péptidos con preferencias de unión específicas de alelo. De hecho, se estima que cada alelo de HLA se une y presenta ~1000 - 10000 péptidos únicos a las células T; <0,1 % de ~10 millones de péptidos de 9 mer potenciales a partir de genes que codifican proteínas humanas. Dada la diversidad en la unión a h La , la predicción exacta de si es probable que un péptido se una a un alelo de HLA específico es un gran desafío. Se sabe menos sobre las características de unión a péptidos específicos de alelos de las moléculas de HLA de clase II debido a la heterogeneidad de los pares de cadenas a y p, la complejidad de los datos que limitan la capacidad de asignar con confianza epítopos de unión centrales y la falta de anticuerpos específicos de alelo de calidad para inmunoprecipitación, requeridos para análisis bioquímicos de alta resolución. Además, el análisis de epítopos peptídicos derivados de un alelo de HLA dado genera ambigüedad cuando se presentan múltiples alelos de HLA en una superficie celular.

Comprender las preferencias de unión de cada heterodímero de HLA es clave para predecir con éxito qué neoantígenos probablemente provocarán respuestas de células T específicas de tumor. Evidentemente, existe una necesidad de métodos para identificar y aislar péptidos asociados a HLA de clase I y clase II específicos (por ejemplo, péptidos neoantigénicos). La metodología y las moléculas aisladas son útiles, por ejemplo, para la investigación de péptidos asociados a HLA, así como también para el desarrollo de agentes terapéuticos, que incluyen pero sin limitarse a, agentes terapéuticos de base inmunitaria.

Trolle y otros (documento J. Immunol., 196, 1480-1487, 2016) describen un método en donde las células expresan una proteína HLA etiquetada con aceptor de afinidad; Hawkins y otros (documento J Proteome Research, 7, 1445 1457, 2008) describen la expresión de una proteína HLA etiquetada con aceptor de afinidad soluble ("HLAs"); y Jiang y otros (documento Proc. Nat. Acc. Sci., 107, 13258-13263, 2010) describen la expresión simultánea de dominios extracelulares del MHC-II HLA-DR1, como un heterodímero secretado y la expresión en la superficie de un péptido antigénico conocido por su unión a HDL-DR1, enSaccharomyces cerevisiae.

Resumen

Los métodos y composiciones descritos en la presente descripción son útiles en una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden usarse para identificar péptidos antigénicos inmunogénicos y pueden usarse para desarrollar fármacos, tales como fármacos de medicina personalizada.

La presente invención proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico, que comprende: (a) expresar una proteína HLA etiquetada con aceptor de afinidad en células humanas, en donde la proteína HLA etiquetada con aceptor de afinidad es una proteína HLA de clase II que comprende una secuencia codificada por un alelo de HLA de clase II expresado por un sujeto humano, en donde la proteína HLA de clase II etiquetada con aceptor de afinidad está codificada por un ácido polinucleico recombinante que comprende: (i) una secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II expresado por el sujeto humano unido a, (ii) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad; (b) identificar un péptido o complejo específico del alelo de HLA de clase II de los complejos de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y (c) desarrollar un agente terapéutico en base a una o más secuencias de un péptido o complejo específico del alelo de HLA de clase II identificado, en donde el agente terapéutico comprende: (i) uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, (ii) un polinucleótido que codifica el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, (iii) una o más células presentadoras de antígeno (APC) que comprenden el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, (iv) un receptor de células T (TCR) específico para un HLA en complejo con el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, o (v) una célula que comprende un TCR o un receptor de células T quimérico (CAR) específico para un HLA en complejo con el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias. La presente invención es como se expone en las reivindicaciones. Otras descripciones en la presente descripción que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones son para ayudar al experto en la comprensión y práctica de la invención descrita. Para evitar dudas, cabe señalar que la presente invención no se extiende a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal.

En la presente descripción se describe un método para caracterizar complejos HLA-péptido que comprende: proporcionar una población de células, en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante unida operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad; expresar el HLA etiquetado con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido en la al menos una célula; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y caracterizar los complejos HLA-péptido. En algunos casos, el alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad codificado es un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad soluble.

En algunos casos, la caracterización comprende caracterizar un péptido unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para dos o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, los dos o más alelos de HLA de clase II comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 alelos de HLA de clase II. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio transmembrana. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio intracelular. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido no se secretan. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles. En algunos casos, el método comprende además generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA. En algunos casos, el alelo de HLA de clase II recombinante es un único alelo de HLA de clase II recombinante.

En algunos casos, el método comprende: proporcionar una población de células, cada una de las cuales comprende una o más células que comprenden un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde el HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende un polipéptido recombinante diferente codificado por un alelo de HLA diferente unido operativamente a un péptido aceptor de afinidad; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido; y caracterizar un péptido o una porción del mismo unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento.

En algunos casos, el método comprende introducir uno o más péptidos en la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con el uno o más péptidos o expresar el uno o más péptidos en la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ADN. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ARN, opcionalmente en donde el ARN es ARNm. En algunos casos, el enriquecimiento no comprende el uso de un reactivo tetramérico.

En algunos casos, la caracterización comprende determinar la secuencia de un péptido o una porción del mismo unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento, opcionalmente determinar si un péptido o una porción del mismo está modificado. En algunos casos, la determinación comprende análisis bioquímico, análisis de espectrometría de masas, análisis MS, análisis MS/MS, análisis LC-MS/m S o una de sus combinaciones. En algunos casos, la caracterización comprende evaluar una afinidad de unión o estabilidad de un péptido o una porción del mismo unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, la caracterización comprende determinar si un péptido o una porción del mismo unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento contiene una o más mutaciones. En algunos casos, la caracterización comprende evaluar asociaciones de péptidos con moléculas de HLA en los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con una enfermedad o afección. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos derivados de un fármaco polipeptídico, tal como un producto biológico (por ejemplo, un fármaco de tipo anticuerpo).

En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer, una infección con un agente infeccioso o una reacción autoinmunitaria. En algunos casos, el método comprende introducir el agente infeccioso o porciones del mismo en una o más células de la población de células. En algunos casos, el método comprende introducir un fármaco polipeptídico, tal como un producto biológico (por ejemplo, un fármaco de tipo anticuerpo) o porciones del mismo en una o más células de la población de células. En algunos casos, el método comprende caracterizar uno o más péptidos de los complejos HLA-péptido, opcionalmente en donde los péptidos son de una o más proteínas diana del agente infeccioso o el fármaco polipeptídico. En algunos casos, el método comprende caracterizar una o más regiones de los péptidos de la una o más proteínas diana del agente infeccioso o el fármaco polipeptídico.

En algunos casos, el método comprende identificar péptidos de los complejos HLA-péptido derivados de un agente infeccioso. En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias. En algunos casos, el alelo de HLA de clase II recombinante es compatible con un sujeto con una enfermedad o afección.

En algunos casos, el péptido del complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido puede activar una célula T de un sujeto cuando se presenta por una célula presentadora de antígeno. En algunos casos, la caracterización comprende comparar complejos HLA-péptido de células cancerosas con complejos HLA-péptido de células no cancerosas. En algunos casos, la población de células comprende una pluralidad de poblaciones de células, cada población de células expresa un alelo de HLA de clase II recombinante diferente. En algunos casos, cada población de células de la pluralidad está en un mismo contenedor o en uno independiente.

En algunos casos, el método comprende además aislar los péptidos de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la caracterización. En algunos casos, un complejo HLA-péptido se aísla mediante el uso de un anticuerpo anti-HLA. En algunos casos, un complejo HLA-péptido con o sin una etiqueta de afinidad se aísla mediante el uso de un anticuerpo anti-HLA. En algunos casos, un HLA soluble (HLAs) con o sin una etiqueta de afinidad se aísla del medio de un cultivo celular. En algunos casos, un HLA soluble (HLAs) con o sin una etiqueta de afinidad se aísla mediante el uso de un anticuerpo anti-HLA. Por ejemplo, un HLA, tal como un HLA soluble (HLAs) con o sin una etiqueta de afinidad, puede aislarse mediante el uso de una perla o columna que contiene un anticuerpo anti-HLA. En algunos casos, los péptidos se aíslan mediante el uso de anticuerpos anti-HLA. En algunos casos, un HLA soluble (HLAs) con o sin una etiqueta de afinidad se aísla mediante el uso de un anticuerpo anti-HLA. En algunos casos, un HLA soluble (HLAs) con o sin una etiqueta de afinidad se aísla mediante el uso de una columna que contiene un anticuerpo anti-HLA. En algunos casos, el método comprende además eliminar uno o más aminoácidos de un extremo terminal de un péptido unido a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido.

En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular. En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante codifica un HLA de clase I. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante codifica un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de HLA de clase II o una de sus combinaciones. En algunos casos, cada secuencia codifica al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes.

En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, uno o más de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes están unidos operativamente a una secuencia que codifica un primer péptido aceptor de afinidad y uno o más de los al menos dos alelos de HLA de clase II diferentes están unidos operativamente a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica una etiqueta de afinidad. En algunos casos, el método comprende administrar al menos un segundo ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente unido operativamente al mismo péptido aceptor de afinidad o a uno diferente.

En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se localiza en un sitio extracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia interna de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante, tal como una secuencia de lazo flexible. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante mediante un enlazador. En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método no comprende lisar las células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad comprende una secuencia de etiqueta que comprende un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta<n>E, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5, etiqueta de sortasa, una etiqueta que forma un enlace peptídico covalente con una perla, o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de afinidad se une específicamente a la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, la molécula de afinidad comprende una molécula que se une a la biotina. Por ejemplo, la molécula de afinidad puede comprender estreptavidina, NeutrAvidina, que incluye homólogos de proteínas de otros organismos y derivados de los mismos.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la molécula de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la superficie sólida es una perla. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad que se une específicamente al péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del HLA de clase II recombinante codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción extracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica para una porción N-terminal del alelo de HLA de clase II recombinante.

En algunos casos, proporcionar comprende poner en contacto la población de células con el ácido polinucleico. En algunos casos, el contacto comprende transfectar o transducir. En algunos casos, proporcionar comprende poner en contacto la población de células con un vector que comprende el ácido polinucleico. En algunos casos, el vector es un vector viral. En algunos casos, el ácido polinucleico se integra de forma estable al genoma de la población de células.

En algunos casos, la secuencia que codifica el HLA de clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase I mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la secuencia que codifica el HLA de clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad es diferente del primer péptido aceptor de afinidad y se selecciona del grupo que consiste en péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 y una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de ácido polinucleico que codifica un enlazador escindible. En algunos casos, el enlazador escindible es un sitio de omisión ribosomal o un elemento del sitio de entrada ribosomal interno (IRES). En algunos casos, el sitio de omisión ribosomal o IRES se escinde cuando se expresa en las células. En algunos casos, el sitio de omisión ribosomal se selecciona del grupo que consiste en F2A, T2A, P2A y E2A. En algunos casos, el elemento IRES se selecciona de secuencias IRES celulares o virales comunes.

En algunos casos, la determinación comprende realizar análisis bioquímicos o espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas en tándem. En algunos casos, la determinación comprende obtener una secuencia peptídica que corresponde a un espectro MS/MS de uno o más péptidos aislados a partir de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos de una base de datos de péptidos; en donde una o más secuencias obtenidas identifican la secuencia del uno o más péptidos. En algunos casos, la base de datos de péptidos es una base de datos de péptidos sin especificidad enzimática, tal como una base de datos sin modificaciones o una base de datos con modificaciones. En algunos casos, el método comprende además buscar en la base de datos de péptidos mediante el uso de una estrategia de búsqueda en base de datos inversa. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una línea celular humana. En algunos casos, la población de células es una línea celular de ratón. En algunos casos, la población de células es una línea celular c Ho . En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO y THP1.

En algunos casos, la población de células se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-<y>, agentes que alteran el procesamiento de antígenos (tales como inhibidores de peptidasa, inhibidores de proteasoma e inhibidores de TAP) o una de sus combinaciones. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan una vía metabólica o un estado metabólico de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan el proteoma celular de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan la expresión o transcripción celular (por ejemplo, AIRE o una proteína de unión a CREB o moduladores de la misma) de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan un factor de transcripción de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan la expresión o transcripción celular de un HLA de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan la expresión o transcripción celular del proteoma de las células.

En algunos casos, la población de células comprende al menos 105 células, al menos 106 células o al menos 107 células. En algunos casos, la población de células es una población de células dendríticas, macrófagos, células cancerosas o células B. En algunos casos, la población de células comprende células tumorales. En algunos casos, la población de células se pone en contacto con un agente antes de aislar dichos complejos HLA-péptido de la una o más células. En algunos casos, dicho agente es una citocina inflamatoria, un agente químico, un adyuvante, un agente terapéutico o radiación.

En algunos casos, el alelo de HLA es un alelo de HLA mutado. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. En algunos casos, el método comprende además realizar un ensayo de expresión del alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el ensayo comprende ensayo comprende secuenciar un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar el ARN del alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar la proteína del alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, o una de sus combinaciones. En algunos casos, el ensayo de expresión puede comprender un ensayo de transferencia Western, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), espectrometría de masas (MS), un ensayo de hibridación de micromatrices, un ensayo de RNA-seq, un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa, un ensayo LAMP, un ensayo de reacción en cadena de la ligasa, un ensayo de transferencia Southern, un ensayo de transferencia Northern o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para diferentes alelos de HLA. En algunos casos, cada alelo de HLA diferente comprende una secuencia de código de barras única. En algunos casos, cada ácido polinucleico que codifica un alelo de HLA diferente comprende una secuencia de código de barras única. En la presente descripción se proporciona una base de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenida al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una combinación de dos o más bases de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenidas al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción repetidamente, mediante el uso cada vez de un alelo de HLA diferente. En la presente descripción se proporciona un método para generar un algoritmo de predicción para identificar péptidos de unión específica de alelo de HLA, que comprende entrenar una máquina con una base de datos de secuencias peptídicas descrita en la presente descripción o una combinación descrita en la presente descripción.

En algunos casos, la máquina combina uno o más modelos lineales, máquinas de vectores de soporte, árboles de decisión y redes neuronales. En algunos casos, una variable usada para entrenar la máquina comprende una o más variables seleccionadas del grupo que consiste en secuencia peptídica, propiedades físicas de los aminoácidos, propiedades físicas de los péptidos, nivel de expresión de la proteína de origen de un péptido dentro de una célula, estabilidad de proteínas, tasa de traducción de proteínas, sitios de ubiquitinación, tasa de degradación de proteínas, eficiencias de traducción del perfil ribosómico, capacidad de escisión de proteínas, localización de proteínas, motivos de la proteína del huésped que facilitan el transporte de TAP, la proteína del huésped se somete a autofagia, motivos que favorecen el estancamiento ribosomal y características de las proteínas que favorecen NMD.

En algunos casos, los motivos que favorecen el estancamiento ribosomal comprenden tramos de poliprolina o polilisina. En algunos casos, las características de las proteínas que favorecen n Md se seleccionan del grupo que consiste en una UTR 3' larga, un codón de parada mayor que 50 ácidos nucleicos aguas arriba de la última unión exón:exón y capacidad de escisión de péptidos.

En la presente descripción se proporciona un método para identificar péptidos de unión específica de alelo de HLA que comprende analizar la secuencia de un péptido con una máquina que se ha entrenado con una base de datos de secuencias peptídicas obtenida al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción para el alelo de HLA. En algunos casos, el método comprende determinar el nivel de expresión de la proteína de origen del péptido dentro de una célula; y en donde la expresión de la proteína de origen es una variable predictiva usada por la máquina. En algunos casos, el nivel de expresión se determina por medición de la cantidad de proteína de origen o la cantidad de ARN que codifica dicha proteína de origen.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un ácido polinucleico recombinante que comprende dos o más secuencias, cada una de las cuales codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde las secuencias que codifican los HLA etiquetados con aceptor de afinidad comprenden una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase I recombinante diferente, una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, una secuencia que codifica la p2 microglobulina; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un ácido polinucleico recombinante que comprende dos o más secuencias, cada una de las cuales comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde las secuencias que codifican los HLA etiquetados con aceptor de afinidad comprenden una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase II recombinante, una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente. En algunos casos, el ácido polinucleico recombinante se aísla. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en H<l>A-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.

En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica la molécula aceptora de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el alelo de HLA recombinante mediante un enlazador.

En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad se expresan a partir del mismo polinucleótido. En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad se expresan a partir de diferentes polinucleótidos. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se une específicamente a una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprenden dos o más péptidos aceptores de afinidad. En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprenden tres o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde al menos dos de las tres o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprenden el mismo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, los dos o más péptidos aceptores de afinidad son únicos para cada una de las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se selecciona del grupo que consiste en péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta<n>E, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 y una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente a una molécula de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con una secuencia de aminoácidos del HLA de clase II recombinante. En algunos casos, para dos o más de los ácidos polinucleicos recombinantes: la secuencia que codifica el HLA etiquetado con aceptor de afinidad se integra de forma estable al genoma de una célula. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad comprende una etiqueta de HA. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica el HLA recombinante y el péptido aceptor de afinidad mediante un enlazador.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende dos o más moléculas polipeptídicas aisladas codificadas por el ácido polinucleico de una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una población de células que comprende dos o más moléculas polipeptídicas codificadas por el ácido polinucleico de una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una población de células que comprende una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una población de células que comprende una o más células que comprenden una composición descrita en la presente descripción.

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos y uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular. En algunos casos, la composición se formula mediante el uso de péptidos o ácidos polinucleicos que codifican péptidos específicos para un tipo HLA de un paciente. En la presente descripción se proporciona un método para producir una célula que comprende transducir o transfectar dos o más células con los dos o más ácidos polinucleicos de una composición descrita en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una célula que comprende una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En algunos casos, la célula presenta el péptido como un complejo HLA-péptido. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción.

En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria de células T. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de células T CD8. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta de células T CD4. En algunos casos, la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria humoral.

En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En algunos casos, la enfermedad es cáncer. En algunos casos, la enfermedad es una infección por un agente infeccioso. En algunos casos, el agente infeccioso es un patógeno, opcionalmente un virus o una bacteria, o un parásito.

En algunos casos, el virus se selecciona del grupo que consiste en: virus BK (BKV), virus del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovirus (CMV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de Epstein-Barr (EBV), un adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotrófico de células T humanas (HTLV-1), un virus de la influenza, RSV, HPV, rabia, virus de la rubéola paperas, poliovirus, fiebre amarilla, hepatitis A, hepatitis B, rotavirus, virus de la varicela, virus del papiloma humano (HPV), viruela, zóster y cualquiera de sus combinaciones.

En algunos casos, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en: Klebsiella spp., Tropheryma Whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis y Mycobacterium tuberculosis, tifoidea, neumococo, meningococo, haemophilus B, ántrax, toxoide tetánico, meningococo del grupo B, bcg, cólera y cualquiera de sus combinaciones.

En algunos casos, el parásito es un helminto o un protozoo. En algunos casos, el parásito se selecciona del grupo que consiste en: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp. y cualquiera de sus combinaciones.

En la presente descripción se proporciona un método para enriquecer péptidos inmunogénicos que comprende: proporcionar una población de células que comprende una o más células que expresan un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde el HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende un péptido aceptor de afinidad unido operativamente a un HLA recombinante codificado por un alelo de HLA recombinante; y enriquecer los complejos HLA-péptido que comprenden el HLA etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el método comprende además determinar la secuencia de péptidos inmunogénicos aislados a partir de los complejos HLA-péptido. En algunos casos, la determinación comprende usar LC-MS/MS.

En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una célula que comprende una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico para un sujeto con una enfermedad o afección que comprende proporcionar una población de células derivadas de un sujeto con una enfermedad o afección, expresar en una o más células de la población de células un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad mediante la introducción en la una o más células de un ácido polinucleico que codifica una secuencia que comprende: una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante unida operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la una o más células; enriquecer y caracterizar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y, opcionalmente, desarrollar un agente terapéutico en base a la caracterización.

En la presente descripción se proporciona un método para identificar al menos un antígeno inmunogénico específico del sujeto y preparar una composición inmunogénica específica del sujeto que incluye el al menos un antígeno inmunogénico específico del sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad y el al menos un antígeno inmunogénico específico del sujeto es específico para el sujeto y la enfermedad del sujeto, dicho método comprende: proporcionar una población de células derivadas de un sujeto con una enfermedad o afección, expresar en una o más células de la población de células del sujeto, un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad mediante la introducción en la una o más células de un ácido polinucleico que codifica una secuencia que comprende: una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante unida operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la una o más células; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido de la una o más células; identificar un péptido inmunogénico de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos que es específico del sujeto y de la enfermedad del sujeto; y formular una composición inmunogénica específica del sujeto en base a uno o más de los péptidos inmunogénicos específicos del sujeto identificados.

En algunos casos, la composición inmunogénica terapéutica o específica del sujeto comprende un péptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos o un o un polinucleótido que codifica el polipéptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos. En algunos casos, la composición inmunogénica terapéutica o específica del sujeto comprende una célula T que expresa un receptor de células T (TCR) que se une específicamente al polipéptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido enriquecidos. En algunos casos, la composición inmunogénica específica del sujeto comprende una célula T con receptor de antígeno quimérico (CAR) que expresa un receptor que se une específicamente al polipéptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos.

En algunos casos, el método comprende además administrar al sujeto otro agente terapéutico, opcionalmente, un inhibidor de puntos de regulación inmunológica. En algunos casos, el método comprende además administrar al sujeto un adyuvante, opcionalmente, poli-ICLC.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno es cáncer. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es una infección. En algunos casos, la infección es causada por un agente infeccioso. En algunos casos, el agente infeccioso es un patógeno, un virus, una bacteria o un parásito.

En algunos casos, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en:Klebsiella spp., Tropheryma Whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosisyMycobacterium tuberculosis,tifoidea, neumococo, meningococo, haemophilus B, ántrax, toxoide tetánico, meningococo del grupo B, bcg, cólera y sus combinaciones. En algunos casos, el parásito es un helminto o un protozoo. En algunos casos, el parásito se selecciona del grupo que consiste en:Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp.y cualquiera de sus combinaciones.

En la presente descripción se proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico para un sujeto con una enfermedad o afección que comprende: proporcionar una población de células, en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica los al menos dos HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad comprende una primera secuencia recombinante que comprende una secuencia que codifica un primer alelo de HLA de clase II unida operativamente a una secuencia que codifica un primer péptido aceptor de afinidad; y una segunda secuencia recombinante que comprende una secuencia que codifica un segundo alelo de HLA de clase II unida operativamente a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad; expresar los al menos dos HLA etiquetados con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la al menos una célula; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; e identificar un péptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos; y formular una composición inmunogénica en base a uno o más de los péptidos identificados, en donde el primer y el segundo alelos de HLA de clase II recombinantes son compatibles con un haplotipo de HLA de un sujeto. En algunos casos, el sujeto tiene una enfermedad o afección.

En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es diferente del segundo alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el primer péptido aceptor de afinidad es el mismo que el segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el método comprende caracterizar un péptido unido al primer y/o segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, los al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio transmembrana. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio intracelular. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido no se excretan. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles.

En algunos casos, el método comprende además generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA. En algunos casos, el método comprende introducir uno o más péptidos exógenos a la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con el uno o más péptidos exógenos o expresar el uno o más péptidos exógenos en la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos exógenos.

En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ADN. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ARN, opcionalmente en donde el ARN es ARNm.

En algunos casos, el enriquecimiento no comprende el uso de un reactivo tetramérico. En algunos casos, el método comprende determinar la secuencia de un péptido o una porción del mismo unida al primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, la determinación comprende análisis bioquímico, análisis de espectrometría de masas, análisis MS, análisis MS/MS, análisis LC-MS/MS o una de sus combinaciones.

En algunos casos, el método comprende evaluar una afinidad de unión o estabilidad de un péptido o una porción del mismo unido al primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende determinar si un péptido o una porción del mismo unido al primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento contiene una o más mutaciones. En algunos casos, el método comprende evaluar asociaciones de péptidos con moléculas de HLA en el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con una enfermedad o afección.

En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer o una infección con un agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende introducir el agente infeccioso o porciones del mismo en una o más células de la población de células. En algunos casos, el método comprende caracterizar uno o más péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA-péptido, opcionalmente en donde los péptidos son de una o más proteínas diana del agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende caracterizar una o más regiones de los péptidos de la una o más proteínas diana del agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende identificar péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA-péptido derivados de un agente infeccioso.

En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias. En algunos casos, el péptido del primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido puede activar una célula T de un sujeto cuando se presenta por una célula presentadora de antígeno. En algunos casos, el método comprende comparar complejos HLA-péptido de células enfermas con complejos HLA-péptido de células no enfermas. En algunos casos, el método comprende además aislar péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la identificación. En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular.

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células expresa los alelos de HLA endógenos normalmente expresados por la población de células. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica los al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad codifica un HLA de clase I. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es un primer alelo de HLA de clase I y el segundo alelo de HLA de clase II recombinante es un segundo alelo de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica los al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad codifica un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de HLA de clase II o una de sus combinaciones. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es un primer alelo de HLA de clase II y el segundo alelo de HLA de clase II recombinante es un segundo alelo de HLA de clase II.

En algunos casos, cada una de la primera secuencia y la segunda secuencia está unida operativamente. En algunos casos, la primera secuencia y la segunda secuencia están comprendidas en diferentes moléculas polinucleotídicas. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II mediante un enlazador.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método no comprende lisar las células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad comprende una secuencia de etiqueta que comprende un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad con el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de afinidad se une específicamente a la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la molécula de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la superficie sólida es una perla. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad que se une específicamente al primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del primer y/o segundo HLA de clase II codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción extracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción N-terminal del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II.

En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es una primera cadena a de HLA de clase I y el segundo alelo de HLA de clase II recombinante es una segunda cadena a de HLA de clase I.

En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un tercer péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el tercer péptido aceptor de afinidad es diferente del primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II y/o una cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una primera cadena a de HLA de clase II y una segunda cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica una primera cadena a de HLA de clase II y una segunda cadena a de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una primera cadena p de HLA de clase II y una segunda cadena p de HLA de clase II.

En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica una primera cadena p de HLA de clase II y una segunda cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II o la cadena a de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un tercer péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el tercer péptido aceptor de afinidad es diferente del primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el tercer péptido aceptor de afinidad es diferente del primer péptido aceptor de afinidad y se selecciona del grupo que consiste en péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 y una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, el método comprende realizar análisis bioquímicos o espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas en tándem. En algunos casos, el método comprende obtener una secuencia peptídica que corresponde a un espectro MS/MS de uno o más péptidos aislados a partir de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos de una base de datos de péptidos; en donde una o más secuencias obtenidas identifican la secuencia del uno o más péptidos.

En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO y THP1. En algunos casos, la línea celular se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-<y>o una de sus combinaciones. En algunos casos, la población de células comprende al menos 105 células, al menos 106 células o al menos 107 células. En algunos casos, la población de células es una población de células dendríticas, macrófagos, células cancerosas o células B. En algunos casos, la población de células comprende células tumorales.

En algunos casos, la población de células se pone en contacto con un agente antes de aislar el primer y/o el segundo complejos HLA-péptido de la una o más células. En algunos casos, el agente es una citocina inflamatoria, un agente químico, un adyuvante, un agente terapéutico o radiación.

En algunos casos, el primer y segundo alelo de HLA es un alelo de HLA mutado. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer o segundo alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. En algunos casos, el método comprende además realizar un ensayo de expresión del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad.

En algunos casos, el ensayo comprende secuenciar el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar el ARN que codifica el ARN del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar la proteína del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, o una de sus combinaciones. En algunos casos, el primer y segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad comprenden una secuencia de código de barras única. En algunos casos, la primera secuencia y la segunda secuencia comprenden una secuencia de código de barras única.

Breve descripción de las figuras

Las características de la presente descripción se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente descripción se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone casos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la descripción, y las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1A es un esquema representativo de un proceso de inmunopurificación universal y generación de datos. Se introducen moléculas de HLA de clase I y/o clase II en cualquier célula, que incluye una célula que no expresa HLA de clase I o clase II) de manera que se exprese(n) alelo(s) de HLA de clase I o clase II específico(s) en la célula. Las poblaciones de células que expresan HLA manipulado genéticamente se recolectan, se lisan y sus complejos HLA-péptido se etiquetan por ejemplo, se biotinilan) y se inmunopurifican (por ejemplo, mediante el uso de la interacción biotina-estreptavidina). Los péptidos asociados a HLA específicos para un único HLA pueden eluirse de sus complejos etiquetados (por ejemplo, biotinilados) y evaluarse (por ejemplo, secuenciarse mediante el uso de LC-MS/MS de alta resolución).

La Figura 1B es un esquema de estructuras de moléculas de HLA de clase II -DP, -DQ y -DR. Las moléculas de HLA-DR son heterodímeros que contienen una cadena a constante y una cadena p variable. Las moléculas de HLA-DQ y HLA-DP son heterodímeros que contienen cadenas a variables y cadenas p variables.

La Figura 2 es un esquema representativo de construcciones diseñadas para la expresión de HLA de clase I y II en líneas celulares cultivadas. Las construcciones HLA-A*02:01 representan un diseño de HLA de clase I que implementa péptidos aceptores de biotina (BAP) para la biotinilación y la inmunopurificación. Las construccionesHLA-DRB1 *11:01representan un diseño de HLA de clase II que implementa péptidos aceptores de biotina (BAP) para la biotinilación y la inmunopurificación.

La Figura 3 es un esquema de un vector lentiviral ilustrativo que puede usarse para generar líneas celulares estables que expresan construcciones de HLA de clase I y clase II.

La Figura 4A es un esquema representativo de una introducción basada en transfección de construcciones deHLAde clase I o clase II para la IP universal y la secuenciación de péptidos asociados a HLA por LC-MS/MS. La Figura 4B es un esquema representativo de una introducción basada en transfección de construcciones deHLAde clase I o clase II seguida de un proceso de selección, por ejemplo, inclusión de un gen de resistencia a antibiótico. Después, las células seleccionadas pueden enviarse a IP universal y secuenciación de péptidos asociados a HlA por LC-MS/MS.

La Figura 5 es un esquema de inmunopurificación universal para HLA de clase I y clase II. Las células, tales como HEK293T (riñón embrionario humano), se transfectan o se transducen para expresar un único alelo deHLAde clase I o clase II con una etiqueta de afinidad para la inmunopurificación. Las células que expresan HLA etiquetado se recolectan, se lisan y sus complejos HLA-péptido se biotinilan e inmunopurifican mediante el uso de la interacción biotina-estreptavidina. Los péptidos asociados a HLA específicos para un único HLA se eluyen de sus complejos biotinilados y se analizan (por ejemplo, se secuencian mediante el uso de LC-MS/MS de alta resolución).

La Figura 6A es una transferencia Western (anti-biotinilación) que compara las transfecciones simulada, de GFP y de plásmido vacío con construcciones HLA-A*02:01 para inmunoprecipitación basada en biotinilación que demuestra la expresión de alelos deHLAde clase I en células HEK293T.

La Figura 6B es un gel teñido con Ponceau usado como control de carga para el análisis de transferencia Western.

La Figura 6C es una representación esquemática de las construcciones deHLAde clase I usadas para generar las células HEK293T manipuladas representadas en la Figura 6Ay la Figura 6B.

La Figura 7A son imágenes de transferencia Western (parte superior) y control de carga (parte inferior) de un experimento de evolución temporal de la biotinilación que demuestra que la biotinilación de HLA-BAP marcado en el extremo C- y N-terminal se completa en 10 minutos para las células que expresan HLA-BAP de clase I y clase II. Los resultados muestran la optimización de la transfección y biotinilación de alelos deHLA-BAPde clase I y clase II expresados por células HEK293T.

La Figura 7B es una transferencia Western contra el anti-BAP (parte superior) y control de carga (parte inferior) de células que expresan las construcciones deHLAde clase I y clase II marcadas con BAP en los extremos N- y C-terminal.

La Figura 7C es una representación esquemática de las construcciones de clase I (HLA-A*02:01) y de clase II HLA-DRp*11:01) marcadas con BAP en los extremos N- y C-terminal usadas para la optimización de la transfección y la biotinilación.

La Figura 8A es una imagen de transferencia Western (anti-estreptavidina para el marcador BAP y anti-HA para el marcador HA) y controles de carga (Ponceau S) que muestra la expresión de las construcciones de HLA de clase I y clase II biotiniladas usadas para la inmunoprecipitación de HLA en células HEK293T. Los lisados se analizaron antes de la adición de biotina (-Biotina), después de la adición de biotina (+Entrada de biotina) y después de la biotinilación y subsecuente arrastre con perlas de estreptavidina (+Biotina FT). La reducción de la señal en el carril Biotina Ft demuestra que el MHC biotinilado se elimina del lisado y se une a las perlas de estreptavidina.

La Figura 8B es una imagen de transferencia Western (anti-estreptavidina para el marcador BAP y anti-HA para el marcador HA) y controles de carga (Ponceau S) que muestra la expresión de las construcciones de HLA de clase I y clase II biotiniladas usadas para la inmunoprecipitación de HLA en células HeLa (cáncer de cuello uterino humano). Los lisados se analizaron antes de la adición de biotina (-Biotina), después de la adición de biotina (+Entrada de biotina) y después de la biotinilación y subsecuente arrastre con perlas de estreptavidina (+Biotina FT). La reducción de la señal en el carril Biotina FT demuestra que el MHC biotinilado se elimina del lisado y se une a las perlas de estreptavidina.

La Figura 8C es una imagen de transferencia Western (anti-estreptavidina para el marcador BAP y anti-HA para el marcador HA) y controles de carga (Ponceau S) que muestra la expresión de las construcciones de HLA de clase I y clase II biotiniladas usadas para la inmunoprecipitación de HLA en células A375 (melanoma maligno humano). Los lisados se analizaron antes de la adición de biotina (-Biotina), después de la adición de biotina (+Entrada de biotina) y después de la biotinilación y subsecuente arrastre con perlas de estreptavidina (+Biotina FT). La reducción de la señal en el carril Biotina FT demuestra que el MHC biotinilado se elimina del lisado y se une a las perlas de estreptavidina.

La Figura 8D es una imagen de transferencia Western (anti-estreptavidina para el marcador BAP y anti-HA para el marcador HA) y controles de carga (Ponceau S) que muestra la expresión de las construcciones de HLA de clase I y clase II biotiniladas usadas para la inmunoprecipitación de HLA en células Expi293 (de riñón embrionario humano manipuladas genéticamente para cultivo de alta densidad y expresión de proteínas). Los lisados se analizaron antes de la adición de biotina (-Biotina), después de la adición de biotina (+Entrada de biotina) y después de la biotinilación y subsecuente arrastre con perlas de estreptavidina (+Biotina FT). La reducción de la señal en el carril Biotina FT demuestra que el MHC biotinilado se elimina del lisado y se une a las perlas de estreptavidina.

La Figura 9A es un gráfico de barras de un análisis LC-MS/MS ilustrativo de péptidos asociados a HLA aislados mediante el uso del proceso de inmunoprecipitación universal (IP universal) de HLA. Se muestra una representación de gráfico de barras del total de péptidos asociados a HLA únicos identificados a partir de múltiples tipos de células (A375; gris, HEK293T; naranja, HeLa; azul) que expresan las construcciones deHLAde clase I y clase II con etiqueta de afinidad usadas en el proceso de IP universal.

La Figura 9B es un gráfico de barras que muestra datos representativos del perfil de péptidos monoalélicos de HLA de clase I por LC-MS/MS. Cada barra representa el número total de péptidos asociados a HLA únicos identificados a partir de experimentos monoalélicos de clase I que implementaron las construcciones de HLA con etiqueta de afinidad.

La Figura 9C es un gráfico de barras que muestra datos representativos del perfil de péptidos monoalélicos de HLA de clase II por LC-MS/MS. Cada barra representa el número total de péptidos asociados a HLA únicos identificados a partir de experimentos monoalélicos de clase II que implementaron las construcciones de HLA con etiqueta de afinidad.

La Figura 10A es un esquema ilustrativo de las características de los péptidos asociados a HLA de clase I y clase II descubiertos mediante el uso del proceso de IP universal. Se muestra una representación ilustrativa del logo de secuencias de los péptidos asociados a HLA-A*02:01 de clase I y los péptidos asociados a HLA-DRp*11:01 de clase II aislados y secuenciados mediante el uso de la plataforma de IP universal.

La Figura 10B es un gráfico de barras que muestra las distribuciones de longitud de péptidos asociados a HLA que comparan los péptidos asociados a HLA de clase I (rojo; HLA-A*02:01) y clase II (azul; HLA-DRp*11:01) identificados mediante el proceso de IP universal. Las distribuciones de longitud de los péptidos asociados a HLA de clase I y clase II identificados mediante el uso de IP universal siguen las tendencias previstas.

La Figura 11A es una representación esquemática de las construcciones deHLAde clase II que se manipularon para la expresión por diferentes tipos de células para el proceso de IP universal.

La Figura 11B es una representación esquemática de los complejos de HLA de clase II que pueden formarse tras la expresión de la construcción mostrada en la Figura 11A en líneas celulares que expresan subunidades de cadena a y cadena p de HLA de clase II endógeno. Los complejos HLA de clase II están formados por pares de cadena a y cadena p, cada una de las cuales se etiqueta con un identificador de afinidad diferente.

La Figura 12A es una representación esquemática de una estrategia de IP universal en serie que puede usarse para la deconvolución de los pares de cadena a y cadena p de HLA de clase II representados en la Figura 11B y asignaciones de unión a péptidos inequívocas a complejos HLA de clase II específicos y demuestra la validación de la IP universal en serie de complejos HLA de clase II que contienen múltiples etiquetas de afinidad. Las células que expresan construcciones de HLA de clase II etiquetadas con doble afinidad se lisan, se biotinilan y se incuban con perlas acopladas a anticuerpos anti-HA. Los complejos HLA de clase II con subunidades etiquetadas con HA se aíslan, se lavan y eluyen mediante el uso de un péptido HA (por ejemplo, YPYDVPDYA). Después, la elución se incuba con perlas acopladas a NeutrAvidina o estreptavidina para aislar los complejos HLA de clase II etiquetados con HA y etiquetados con biotina. Después, los péptidos unidos a complejos HLA de clase II con doble etiqueta se eluyen y se secuencian por LC-MS/MS.

La Figura 12B es una validación por transferencia Western de la estrategia de IP universal en serie en HEK293T que expresa construcciones HLA-DRB*11:01 con doble etiqueta. Se usó un anticuerpo anti-HA para seguir el proceso de enriquecimiento en serie. Se muestra un control de carga (gel teñido con Ponceau S).

La Figura 12C representa los resultados de un experimento de control negativo ilustrativo donde las células que expresan la construcción HLA-DRB*11:01 de clase II etiquetada con doble afinidad se lisaron y se incubaron con perlas acopladas a anticuerpos anti-HA sin biotinilación. Se muestra que una transferencia Western y un control de carga (gel teñido con Ponceau S) demuestran la especificidad del proceso de IP universal en serie. No se observó enriquecimiento cuando se eliminó la etapa de biotinilación del protocolo de IP universal en serie.

La Figura 13 es una representación esquemática de unos experimentos de recorte de HLA de clase II de visión general que permiten la identificación de epítopos de unión centrales. Las moléculas de HLA de clase II se unen a conjuntos anidados de péptidos, por lo general de 12-18 aminoácidos de longitud, generados a partir de la misma proteína de origen. Los péptidos más largos sobresalen de los lados N- y C-terminal de las moléculas de HLA de clase II, mientras que el epítopo central interactúa más fuertemente con el surco de unión al péptido. Los péptidos unidos a moléculas de HLA de clase II se recortan mediante el uso de peptidasas específicas para los extremos N- y C-terminal. Después del recorte, los epítopos peptídicos centrales se secuencian mediante el uso de LC-MS/MS.

La Figura 14A es una representación esquemática de un enfoque de obtención de perfiles de peptidomas de HLA monoalélicos que implementa una etiqueta de afinidad de biotina. Un caso ilustrativo de la presente descripción hace uso del péptido aceptor de biotina (BAP) que se biotinila en un residuo de lisina (K) mediante una enzima BirA. La secuencia peptídica de BAP contiene un residuo de lisina que se biotinila tras la adición de la enzima BirA, biotina y ATP. El producto biotinilado muestra una alta afinidad por estreptavidina/NeutrAvidina. Pueden usarse perlas de estreptavidina/NeutrAvidina para enriquecer la secuencia peptídica de BAP biotinilado. La Figura 14B es una representación esquemática de la inmunopurificación basada en biotina de moléculas de HLA manipuladas genéticamente. Un alelo de HLA específico con una secuencia BAP en el extremo N- o C-terminal de la proteína HLA se introduce en una célula, por ejemplo, por transfección o transducción de un plásmido. Debe tenerse en cuenta que el plásmido contiene un código de barras de ADN que permite que un método basado en PCR monitoree la línea celular para cada alelo. Las longitudes de los códigos de barras pueden ser de al menos 5 pares de bases, al menos 10 pares de bases, al menos 15 pares de bases, al menos 20 pares de bases o más. Las células que expresan las proteínas HLA-BAP se lisan y biotinilan. Los complejos HLA-BAP-péptido se inmunopurifican a partir de la mezcla de lisado compleja, que puede someterse a análisis LC-MS/MS para la identificación de péptidos.

La Figura 15 es una representación esquemática de una aplicación ilustrativa de la plataforma de IP universal para la validación y el descubrimiento de epítopos diana. Se manipula una línea celular de interés para expresar una construcción de HLA etiquetado (por ejemplo, con BAP) específico de alelo. Las células que expresan las moléculas de HLA etiquetado (por ejemplo, con BAP) se manipulan genéticamente para expresar un único epítopo o múltiples epítopos. Las células que expresan epítopos se lisan y los complejos HLA-BAP-péptido se inmunopurifican. Los antígenos peptídicos aislados pueden examinarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, secuenciarse por LC-MS/MS, y los fragmentos peptídicos generados a partir de los epítopos introducidos pueden usarse como una lectura de alto rendimiento para el procesamiento y presentación de antígenos compatibles con alelos de HLA.

La Figura 16 es una representación esquemática de la producción en formato múltiple de alelos de HLA dentro del proceso de IP universal. Se pueden expresar múltiples alelos de clase I y clase II a partir de una única construcción de HLA. Por ejemplo, pueden incluirse múltiples cadenas pesadas en una construcción de clase I y pueden incluirse múltiples cadenas p y/o a en una construcción de clase II. Al incluir múltiples alelos de HLA en una única construcción, se pueden suministrar y expresar múltiples moléculas de HLA en una línea celular de interés. La producción en formato múltiple de alelos permite la compatibilidad con los tipos de HLA del paciente y lecturas personalizadas de antígenos peptídicos con la aplicación del proceso de IP universal y el análisis subsecuente de complejos y/o péptidos por ejemplo, lectura de LC-MS/MS.

La Figura 17 son esquemas de enfoques multialélicos y monoalélicos en la obtención de perfiles de ligandos de HLA. En un enfoque multialélico, los ligandos de HLA inmunoprecipitan junto con heterodímeros de HLA directamente del material del paciente o de líneas celulares (parte superior). Debido a que estas células expresan naturalmente múltiples alelos de HLA, los péptidos identificados a partir de tales enfoques multialélicos deben deconvolucionarse para asignar la unión a un heterodímero de HLA específico si se conocen los tipos de HLA. En un enfoque monoalélico, los ligandos de HLA inmunoprecipitan junto con los heterodímeros de HLA de líneas celulares modificadas genéticamente para la expresión de un único alelo de HLA (parte inferior). Por lo tanto, los péptidos identificados a partir de enfoques monoalélicos no requieren deconvolución para las asignaciones de unión al heterodímero de HLA.

La Figura 18A es un diagrama que muestra el péptido neoantigénico mutado presentado en MHC.

La Figura 18B es un método esquemático para desarrollar una terapia personalizada dirigida a neoantígenos como se describe en la presente descripción.

La Figura 19 muestra un esquema que muestra diferentes enfoques experimentales de diferentes perfiles de ligandos de HLA. El ensayo bioquímico de unión péptido:MHC (p:MHC) es lento y de bajo rendimiento y no proporciona información sobre el procesamiento. La espectrometría de masas multialélica es de alto rendimiento y tiene la capacidad de aprender reglas de procesamiento; sin embargo, requiere la imputaciónin silicopara asignar péptidos a los alelos. La espectrometría de masas monoalélica proporciona un enfoque rápido, imparcial y limpio para definir motivos de unión a péptidos en diversos alelos de MHC. La espectrometría de masas monoalélica puede llenar rápida y sistemáticamente los vacíos de cobertura declarados y hace posible aprovechar las preferencias de longitud de los péptidos específicos de alelos.

La Figura 20A muestra una tabla de péptidos de unión a HLA ilustrativos para los alelos A*01:01, B*51:01, A*29:02 y B*54:01 descubiertos mediante el uso de un enfoque monoalélico. El enfoque monoalélico descubre péptidos de unión a HLA con baja puntuación en NetMHCpan pero que se validan bioquímicamente como aglutinantes fuertes.

La Figura 20B es un gráfico de barras que muestra las tasas de asignación incorrecta en 100 deconvoluciones simuladas. Se generó un genotipo de HLA de paciente de seis alelos aleatorios (2 alelos de cada uno de HLA-A, HLA-B y HLA-C, muestreo a las frecuencias alélicas de Estados Unidos). Para cada alelo, se tomaron muestras de 500 péptidos del experimento monoalélico relevante y se combinaron para crear un conjunto de datos multialélico simulado de 3000 péptidos. Cada péptido se asignó al alelo que produce la mejor puntuación de calificación de % de NetMHCpan para determinar el porcentaje de péptidos asignados incorrectamente por NetMHCpan. Este proceso se repitió 100 veces.

La Figura 21 es una ilustración esquemática del predictor de presentación de MHC para diversos alelos individuales de MHC de clase I mediante el uso de datos de MS. El entrenamiento y la evaluación del modelo se realizan con proteínas de origen que no se superponen. Los péptidos observados en MS se asignan a entrenamiento/prueba en dependencia de la proteína de origen. El enfoque de evaluación emplea un exceso de 5000:1 de señuelos respecto a aglutinantes verdaderos.

La Figura 22 es un gráfico de barras que muestra predicciones significativamente mejoradas tanto en términos de procesamiento como de unión específica de alelo.

Descripción detallada

La siguiente descripción y ejemplos ilustran casos de la descripción en detalle. Debe entenderse que esta descripción no se limita a los casos particulares descritos en la presente descripción y, como tal, pueden variar. Los expertos en la técnica reconocerán que existen numerosas variaciones y modificaciones de esta descripción, que se abarcan dentro de su alcance.

Todos los términos deben entenderse tal como los entendería un experto en la técnica. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente el experto en la técnica a la que pertenece la presente descripción.

Los encabezamientos de sección que se usan en la presente descripción son solo para propósitos de organización y no se deben interpretar como limitativos de la materia descrita.

Aunque se pueden describir diversas características de la presente descripción en el contexto de un único caso, las características también pueden proporcionarse por separado o en cualquier combinación adecuada. Por el contrario, aunque la presente descripción puede describirse en la presente descripción en el contexto de casos independientes para mayor claridad, la descripción también puede implementarse en un único caso.

Las siguientes definiciones complementan las de la técnica y están dirigidas a la presente solicitud y no deben imputarse a ningún caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a cualquier patente o solicitud de propiedad común. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción pueden usarse en la práctica para la prueba de la presente descripción, en la presente descripción se describen materiales y métodos ilustrativos. En consecuencia, la terminología usada en la presente descripción es solamente con el propósito de describir casos particulares y no se pretende que sea limitante.

Definiciones

En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera. Debe destacarse que, como se usa en la descripción, las formas singulares "un," "una" y "el/la" incluyen referencias del plural a menos que el contexto claramente lo establezca de cualquier otra forma. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique de cualquier otra forma. Además, el uso del término "que incluye" así como también otras formas, tales como "incluyen", "incluye" e "incluido", no es limitante.

Los términos "uno o más" o "al menos uno", tal como uno o más o al menos un(os) miembro(s) de un grupo de miembros, son claros per se, por medio de ejemplificación adicional, el término abarca, entre otros, un referencia a cualquiera de dichos miembros, o a cualquiera de dos o más de dichos miembros, tales como, por ejemplo, >3, >4, >5, >6 o >7 etc. cualesquiera de dichos miembros, y hasta la totalidad de dichos miembros.

La referencia en la descripción a "algunos casos", "un caso", "un caso" u "otros casos" significa que un rasgo, estructura o característica descrita en relación con los casos está incluida en al menos algunos casos, pero no necesariamente en todos los casos, de la presente descripción.

Como se usa en esta descripción y reivindicaciones, las palabras “que comprende” (y cualquier forma de que comprende, tal como, “comprender” y “comprende”), “que tiene” (y cualquier forma de que tiene, tal como “tener” y “tiene”), “que incluyen” (y cualquier forma de que incluyen, tal como “incluye” e “incluir”), o “que contiene” (y cualquier forma de que contiene, tal como “contiene” y “contener”) son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos no mencionados o etapas del método adicionales. Se contempla que cualquier caso analizado en esta descripción puede implementarse con respecto a cualquier método o composición de la descripción y viceversa. Además, las composiciones de la descripción pueden usarse para lograr los métodos de la descripción.

Se entiende que el término "alrededor de" o "aproximadamente" como se usa en la presente descripción cuando se refiere a un valor medible tal como un parámetro, una cantidad, una duración temporal, y similares, abarca las variaciones de /-20 % o menos, /-10 % o menos, /-5 % o menos, o /-1 % o menos del valor especificado, en tanto tales variaciones sean apropiadas para realizar la presente descripción. Debe entenderse que el valor al que se refiere el modificador "alrededor de" o "aproximadamente" también se describe específicamente.

El término "respuesta inmunitaria" incluye respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o mediadas por células B que están influenciadas por la modulación de la coestimulación de las células T. Las respuestas inmunitarias ilustrativas incluyen respuestas de células T, por ejemplo, producción de citocinas y citotoxicidad celular. Además, el término respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que se ven afectadas indirectamente por la activación de las células T, por ejemplo, producción de anticuerpos (respuestas humorales) y activación de células sensibles a citocinas, por ejemplo, macrófagos.

Por "receptor" debe entenderse una molécula biológica o un grupo de moléculas que puede unirse a un ligando. Un receptor puede servir para transmitir información en una célula, una formación celular o un organismo. El receptor comprende al menos una unidad receptora y puede contener dos o más unidades receptoras, donde cada unidad receptora puede consistir en una molécula de proteína, por ejemplo, una molécula de glicoproteína. El receptor tiene una estructura que se complementa con la estructura de un ligando y puede formar complejo con el ligando como pareja de unión. La información de señalización puede transmitirse mediante cambios conformacionales del receptor después de la unión con el ligando en la superficie de una célula. De acuerdo con la presente descripción, un receptor puede referirse a proteínas MHC de clases I y II que pueden formar un complejo receptor/ligando con un ligando, por ejemplo, un péptido o fragmento peptídico de longitud adecuada.

Una secuencia de "código de barras" puede ser una secuencia de ácido nucleico que puede codificar un elemento de información acerca de una secuencia, tal como la identidad de una secuencia a la que está unido el código de barras o la identidad de una muestra de la que se deriva una secuencia.

Por "ligando" se entiende una molécula que puede formar un complejo con un receptor. De acuerdo con la presente descripción, se entiende por ligando, por ejemplo, un péptido o fragmento peptídico que tiene en su secuencia de aminoácidos una longitud adecuada y motivos de unión adecuados, de modo que el péptido o fragmento peptídico puede formar una complejo con proteínas MHC de clase I o MHC de clase II.

Un "antígeno" es una molécula que puede estimular una respuesta inmunitaria y puede producirse por células cancerosas o agentes infecciosos o una enfermedad autoinmunitaria. Los antígenos reconocidos por las células T, ya sean linfocitos T auxiliares (células T auxiliares (T<h>)) o linfocitos T citotóxicos (CTL), no se reconocen como proteínas intactas, sino más bien como péptidos pequeños que se asocian con proteínas MHC de clase I o clase II en la superficie de las células. Durante el curso de una respuesta inmunitaria natural, los antígenos que se reconocen en asociación con las moléculas de MHC de clase II en las células presentadoras de antígeno (APC) se adquieren desde el exterior de la célula, se internalizan y se procesan a péptidos pequeños que se asocian con las moléculas de MHC de clase II. Las APC también pueden presentar antígenos peptídicos de forma cruzada al procesar antígenos exógenos y presentar los antígenos procesados en moléculas de MHC de clase I. Los antígenos que dan lugar a proteínas que se reconocen en asociación con moléculas de MHC de clase I son generalmente proteínas que se producen dentro de las células, y estos antígenos se procesan y se asocian con moléculas de MHC de clase I. Ahora se entiende que los péptidos que se asocian con moléculas de MHC de clase I o clase II dadas se caracterizan por tener un motivo de unión común, y se han determinado los motivos de unión para un gran número de moléculas de MHC de clase I y II diferentes. También pueden sintetizarse péptidos sintéticos, que corresponden a la secuencia de aminoácidos de un antígeno dado y que contienen un motivo de unión para una molécula de MHC de clase I o II dada. Después, estos péptidos pueden añadirse a las APC apropiadas, y las APC pueden usarse para estimular una respuesta de células T auxiliares o CTLin vitrooin vivo.Los motivos de unión, los métodos para sintetizar los péptidos y los métodos para estimular una respuesta de células T auxiliares o CTL son todos conocidos y están fácilmente disponibles para un experto en la técnica.

El término "péptido" se usa indistintamente con "péptido mutante" y "péptido neoantigénico" en la presente descripción. De manera similar, el término "polipéptido" se usa indistintamente con "polipéptido mutante" y "polipéptido neoantigénico" en la presente descripción. Por "neoantígeno" o "neoepítopo" se entiende una clase de antígenos tumorales o epítopos tumorales que surgen de mutaciones específicas de tumor en la proteína expresada. La presente descripción incluye además péptidos que comprenden mutaciones específicas de tumor, péptidos que comprenden mutaciones específicas de tumor conocidas y polipéptidos mutantes o fragmentos de los mismos identificados mediante el método de la presente descripción. Estos péptidos y polipéptidos se denominan en la presente descripción "péptidos neoantigénicos" o "polipéptidos neoantigénicos". Los polipéptidos o péptidos pueden tener una variedad de longitudes, ya sea en sus formas neutras (sin carga) o en formas que son sales, y libres de modificaciones tales como glicosilación, oxidación de cadenas laterales, fosforilación o cualquier modificación postraduccional o que contengan estas modificaciones, sujetas a la condición de que la modificación no destruya la actividad biológica de los polipéptidos como se describe en la presente descripción. En algunos casos, los péptidos neoantigénicos de la presente descripción pueden incluir: para MHC de clase I, 22 residuos o menos de longitud, por ejemplo, de alrededor de 8 a alrededor de 22 residuos, de alrededor de 8 a alrededor de 15 residuos, o 9 o 10 residuos; para MHC de clase II, 40 residuos o menos de longitud, por ejemplo, de alrededor de 8 a alrededor de 40 residuos de longitud, de alrededor de 8 a alrededor de 24 residuos de longitud, de alrededor de 12 a alrededor de 19 residuos, o de alrededor de 14 a alrededor de 18 residuos. En algunos casos, un péptido neoantigénico o polipéptido neoantigénico comprende un neoepítopo.

El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico que puede unirse específicamente a un anticuerpo, péptido de anticuerpo y/o molécula similar a un anticuerpo (que incluye, pero sin limitarse a, un receptor de células T) como se define en la presente descripción. Los determinantes epitópicos consisten típicamente en grupos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específicas.

Por "epítopo de células T" se entiende una secuencia peptídica que puede unirse a las moléculas MHC de clase I o II en forma de una molécula de MHC o complejo MHC presentador de péptidos y después, en esta forma, ser reconocida por y unirse a linfocitos T citotóxicos o células T auxiliares, respectivamente.

El término "anticuerpo" como se usa en la presente descripción incluye IgG (que incluye IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (que incluye IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgM e IgY, y pretende incluir anticuerpos completos, que incluyen anticuerpos completos de cadena simple y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab' y F(ab')<2>, Fd (que consiste en VH y CH1), fragmento variable de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple, fragmento variable unido por puentes disulfuro (dsFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal. Los fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, que incluyen anticuerpos de cadena simple, pueden comprender la(s) región(ones) variable(s) sola(s) o en combinación con la totalidad o parte de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluye cualquier combinación de región(ones) variable(s) y de región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, policlonales, quiméricos, humanizados y monoclonales y policlonales humanos que, por ejemplo, se unen específicamente a un polipéptido asociado a HLA o a un complejo HLA-péptido. Un experto en la técnica reconocerá que una variedad de técnicas de inmunoafinidad son adecuadas para enriquecer proteínas solubles, tales como complejos HLA-péptido solubles o polipéptidos asociados a HLA unidos a membrana por ejemplo, que se han escindido proteolíticamente de la membrana. Estas incluyen técnicas en las que (1) uno o más anticuerpos que pueden unirse específicamente a la proteína soluble se inmovilizan en un sustrato fijo o móvil-(por ejemplo, pocillos de plástico o resina, látex o perlas paramagnéticas), y (2) se pasa una solución que contiene la proteína soluble de una muestra biológica sobre el sustrato recubierto de anticuerpo, lo que permite que la proteína soluble se una a los anticuerpos. El sustrato con el anticuerpo y la proteína soluble unida se separa de la solución y, opcionalmente, el anticuerpo y la proteína soluble se disocian, por ejemplo por variación del pH y/o la fuerza iónica y/o la composición iónica de la solución que baña los anticuerpos. Alternativamente, pueden usarse técnicas de inmunoprecipitación en las que el anticuerpo y la proteína soluble se combinan y se les permite formar agregados macromoleculares. Los agregados macromoleculares pueden separarse de la solución mediante técnicas de exclusión por tamaño o por centrifugación. El término "inmunopurificación (IP)" (o purificación por inmunoafinidad o inmunoprecipitación) es un proceso bien conocido en la técnica y se usa ampliamente para el aislamiento de un antígeno deseado a partir de una muestra. En general, el proceso implica poner en contacto una muestra que contiene un antígeno deseado con una matriz de afinidad que comprende un anticuerpo contra el antígeno unido covalentemente a una fase sólida. El antígeno de la muestra se une a la matriz de afinidad a través de un enlace inmunoquímico. Después, la matriz de afinidad se lava para eliminar cualquier especie no unida. El antígeno se elimina de la matriz de afinidad mediante la alteración de la composición química de una solución en contacto con la matriz de afinidad. La inmunopurificación puede realizarse en una columna que contiene la matriz de afinidad, en cuyo caso la solución es un eluyente. Alternativamente, la inmunopurificación puede realizarse en un proceso por lotes, en cuyo caso la matriz de afinidad se mantiene como una suspensión en la solución. Una etapa importante en el proceso es la eliminación del antígeno de la matriz. Esto se logra comúnmente al aumentar la fuerza iónica de la solución en contacto con la matriz de afinidad, por ejemplo, mediante la adición de una sal inorgánica. Una alteración del pH también puede ser eficaz para disociar el enlace inmunoquímico entre el antígeno y la matriz de afinidad.

Por "agente" se entiende cualquier compuesto químico de molécula pequeña, anticuerpo, molécula de ácido nucleico 0 polipéptido, o fragmentos de los mismos.

Por "alteración" o "cambio" se entiende un aumento o una disminución. Una alteración puede ser tan pequeña como 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 % o en 40 %, 50 %, 60 % o incluso tanto como 70 %, 75 %, 80 %, 90 % o 100 %.

Por "muestra biológica" se entiende cualquier tejido, célula, fluido u otro material derivado de un organismo. Como se usa en la presente descripción, el término "muestra" incluye una muestra biológica tal como cualquier tejido, célula, fluido u otro material derivado de un organismo. Por "se une específicamente" se entiende un compuesto (por ejemplo, péptido) que reconoce y se une a una molécula (por ejemplo, polipéptido), pero que no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica.

Por "reactivo de captura" se entiende un reactivo que se une específicamente a una molécula (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido) para seleccionar o aislar la molécula (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido).

Como se usa en la presente descripción, los términos "determinar", "evaluar", "ensayar", "medir", "detectar" y sus equivalentes gramaticales se refieren a determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas y, como tales, el término "determinar" se usa indistintamente en la presente descripción con "ensayar", "medir" y similares. Cuando se pretende una determinación cuantitativa, se usa la frase "determinar una cantidad" de un analito y similares. Cuando se pretende realizar una determinación cualitativa y/o cuantitativa, se usa la frase "determinar un nivel" de un analito o "detectar" un analito.

Por "fragmento" se entiende una porción de una proteína o ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una proteína o ácido nucleico de referencia. En algunos casos, la porción retiene al menos 50 %, 75 % u 80 %, o 90 %, 95 % o incluso 99 % de la actividad biológica de la proteína o ácido nucleico de referencia descrito en la presente descripción.

Los términos "aislado", "purificado" o "biológicamente puro" y sus equivalentes gramaticales se refieren a material que está libre en grados variables de componentes que normalmente lo acompañan tal como se encuentran en su estado nativo. "Aislar" indica un grado de separación de la fuente o el entorno original. "Purificar" indica un grado de separación que es superior al aislamiento. Una proteína "purificada" o "biológicamente pura" está suficientemente libre de otros materiales de manera que cualquier impureza no afecte materialmente las propiedades biológicas de la proteína ni cause otras consecuencias adversas. Es decir, un ácido nucleico o polipéptido de la presente descripción está purificado si está sustancialmente libre de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente mediante el uso de técnicas de química analítica, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alta resolución. El término "purificado" puede indicar que un ácido nucleico o una proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. Para una proteína que puede someterse a modificaciones, por ejemplo, fosforilación o glicosilación, diferentes modificaciones pueden dar lugar a diferentes proteínas aisladas, que pueden purificarse por separado.

Por un polipéptido "aislado" (por ejemplo, un péptido de un complejo HLA-péptido) o complejo polipeptídico (por ejemplo, un complejo HLA-péptido) se entiende un polipéptido o complejo polipeptídico de la presente descripción que se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Típicamente, el polipéptido o complejo polipeptídico está aislado cuando está al menos 60 %, en peso, libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas naturales con las que se asocia naturalmente. La preparación puede ser al menos 75 %, al menos 90 % o al menos 99 % en peso de un polipéptido o complejo polipeptídico de la presente descripción. Un polipéptido aislado o complejo polipeptídico de la presente descripción puede obtenerse, por ejemplo, mediante extracción a partir de una fuente natural, mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido o uno o más componentes de un complejo polipeptídico, o mediante síntesis química del polipéptido o uno o más componentes del complejo polipeptídico. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC.

El término "vectores" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar o mediar la expresión de un ácido nucleico heterólogo. Un plásmido es una especie del género abarcado por el término "vector". Un vector se refiere típicamente a una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación y otras entidades necesarias para la replicación y/o el mantenimiento en una célula huésped. Los vectores que pueden dirigir la expresión de genes y/o secuencia de ácido nucleico a la que se unen operativamente se denominan en la presente descripción "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad con frecuencia tienen la forma de "plásmidos" que se refieren a moléculas circulares de ADN bicatenario que, en su forma de vector, no están unidas al cromosoma, y comprenden típicamente entidades para la expresión estable o transitoria del ADN codificado. Otros vectores de expresión que pueden usarse en los métodos descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, episomas, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, bacteriófagos o vectores virales, y tales vectores pueden integrarse en el genoma del huésped o replicarse de forma autónoma en la célula. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. También pueden usarse otras formas de vectores de expresión conocidas por los expertos en la técnica que cumplen funciones equivalentes, por ejemplo, vectores extracromosómicos autorreplicantes o vectores que pueden integrarse en un genoma huésped. Los vectores ilustrativos son aquellos que pueden replicarse en forma autónoma y/o expresar los ácidos nucleicos a los que se unen.

Por "perfil molecular" se entiende una caracterización de la expresión o nivel de expresión de dos o más marcadores (por ejemplo, polipéptidos o polinucleótidos).

Un "separador" o "enlazador" como se usa en referencia a una proteína de fusión se refiere a un péptido que une las proteínas que comprenden una proteína de fusión. Generalmente, un separador no tiene actividad biológica específica más que unir o conservar cierta distancia mínima u otra relación espacial entre las proteínas o las secuencias de ARN. Sin embargo, en algunos casos, los aminoácidos constituyentes de un separador pueden seleccionarse para influir en alguna propiedad de la molécula, tal como el plegamiento, la carga neta o la hidrofobicidad de la molécula. Los expertos en la técnica conocen bien los enlazadores adecuados para el uso en un caso de la presente descripción e incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores de carbono heterocíclicos o enlazadores peptídicos. El enlazador se usa para separar dos péptidos antigénicos a una distancia suficiente para garantizar que, en algunos casos, cada péptido antigénico se pliegue adecuadamente. Las secuencias enlazadoras peptídicas ilustrativas adoptan una conformación extendida flexible y no exhiben tendencia a desarrollar una estructura secundaria ordenada. Los aminoácidos típicos en regiones proteicas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Se esperaría que prácticamente cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contengan Gly, Asn y Ser satisfaga los criterios anteriores para una secuencia enlazadora. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, también pueden usarse en la secuencia enlazadora. Aún otras secuencias de aminoácidos que pueden usarse como enlazadores se describen en los documentos de Maratea y otros, (1985), Gene 40: 39-46; Murphy y otros, (1986) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 83: 8258-62; patente de Estados Unidos núm. 4,935,233; y patente de Estados Unidos núm. 4,751,180.

El término "neoplasia" se refiere a cualquier enfermedad que es causada o que da como resultado niveles inapropiadamente altos de división celular, niveles inapropiadamente bajos de apoptosis, o ambos. El glioblastoma es un ejemplo no limitante de una neoplasia o cáncer. Los términos "cáncer" o "tumor" o "trastorno hiperproliferativo" se refiere a la presencia de células que poseen características típicas de células causantes de cáncer, tales como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, la velocidad de crecimiento y proliferación rápida, y ciertas características morfológicas típicas. Las células cancerosas con frecuencia tienen forma de un tumor, pero dichas células pueden existir solas dentro de un animal, o pueden ser una célula cancerosa no tumorigénica, tal como una célula leucémica. Los cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células B, por ejemplo, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedades de la cadena pesada tales como, por ejemplo, enfermedad de cadena alfa, enfermedad de cadena gamma y enfermedad de cadena mu, gammapatía monoclonal benigna y amiloidosis inmunocítica, melanomas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios, cáncer colorrectal, cáncer de próstata (por ejemplo, cáncer de próstata metastásico, resistente a hormonas), cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de cerebro o del sistema nervioso central, cáncer del sistema nervioso periférico, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero o endometrio, cáncer de la cavidad bucal o faringe, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer testicular, cáncer de vías biliares, cáncer de intestino delgado o de apéndice, cáncer de glándulas salivales, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula suprarrenal, osteosarcoma, condrosarcoma, cáncer de tejidos hematológicos y similares. Otros ejemplos no limitantes de tipos de cánceres aplicables a los métodos abarcados en la presente descripción incluyen sarcomas y carcinomas humanos, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, condroma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, cáncer de hígado, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de huesos, tumor cerebral, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemias, por ejemplo, leucemia linfocítica aguda y leucemia mielocítica aguda (mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia); leucemia crónica (leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica); y policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad no hodgkiniana), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y enfermedad de la cadena pesada. En algunos casos, el cáncer es un cáncer epitelial tal como, pero sin limitarse a, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cánceres ginecológicos, cáncer renal, cáncer de laringe, cáncer de pulmón, cáncer bucal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de piel. En otros casos, el cáncer es cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón o cáncer de colon. Aún en otros casos, el cáncer epitelial es cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células renales no papilar, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de ovario (por ejemplo, carcinoma seroso de ovario) o carcinoma de mama. Los cánceres epiteliales se pueden caracterizar de diversas formas adicionales, que incluyen, pero sin limitarse a, serosos, endometrioides, mucinosos, de células claras, de Brenner o indiferenciados. En algunos casos, la presente descripción se usa en el tratamiento, diagnóstico y/o pronóstico de linfoma o sus subtipos, que incluyen, pero sin limitarse a, linfoma de células del manto. Los trastornos linfoproliferativos también se consideran enfermedades proliferativas.

Debe entenderse que el término "vacuna" significa una composición para generar inmunidad para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades (por ejemplo, neoplasia/tumor/agentes infecciosos/enfermedades autoinmunitarias). En consecuencia, las vacunas son medicamentos que comprenden antígenos y se destinan al uso en seres humanos o animales para generar una defensa específica y una sustancia protectora mediante vacunación. Una "composición vacunal" puede incluir un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Aspectos de la presente descripción se refieren al uso de la tecnología en la preparación de una vacuna basada en antígeno. En estos casos, se entiende que la vacuna hace referencia a uno o más péptidos antigénicos específicos de una enfermedad (o los ácidos nucleicos correspondientes que los codifican). En algunos casos, la vacuna basada en antígeno contiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, al menos 30 o más péptidos antigénicos. En algunos casos, la vacuna basada en antígeno contiene de 2 a 100, 2 a 75, 2 a 50, 2 a 25, 2 a 20, 2 a 19, 2 a 18, 2 a 17, 2 a 16, 2 a 15, 2 a 14, 2 a 13, 2 a 12, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 3 a 100, 3 a 75, 3 a 50, 3 a 25, 3 a 20, 3 a 19, 3 a 18, 3 a 17, 3 a 16, 3 a 15, 3 a 14, 3 a 13, 3 a 12, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 4 a 100, 4 a 75, 4 a 50, 4 a 25, 4 a 20, 4 a 19, 4 a 18, 4 a 17, 4 a 16, 4 a 15, 4 a 14, 4 a 13, 4 a 12, 4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 5 a 100, 5 a 75, 5 a 50, 5 a 25, 5 a 20, 5 a 19, 5 a 18, 5 a 17, 5 a 16, 5 a 15, 5 a 14, 5 a 13, 5 a 12, 5 a 10, 5a 9, 5 a 8 o 5 a 7 péptidos antigénicos. En algunos casos, la vacuna basada en antígeno contiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 péptidos antigénicos. En algunos casos, los péptidos antigénicos son péptidos neoantigénicos. En algunos casos, los péptidos antigénicos comprenden uno o más neoepítopos.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aprobado o que puede aprobarse por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en mamíferos, que incluyen los seres humanos. El término “excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un excipiente, portador o diluyente que puede administrarse a un sujeto, junto con un agente, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficientes para suministrar una cantidad terapéutica del agente. Una "sal farmacéuticamente aceptable" de antígenos combinados específicos de una enfermedad como se menciona en la presente descripción puede ser una sal de ácido o base que se considera generalmente en la técnica adecuada para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos o animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación. Tales sales incluyen sales de ácidos minerales y orgánicos de residuos básicos tales como aminas; así como también sales de álcali u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos. Las sales farmacéuticas específicas incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos tales como clorhídrico, fosfórico, bromhídrico, málico, glicólico, fumárico, sulfúrico, sulfámico, sulfanílico, fórmico, toluenosulfónico, metanosulfónico, bencenosulfónico, etanodisulfónico, 2-hidroxietilsulfónico, nítrico, benzoico, 2-acetoxibenzoico, cítrico, tartárico, láctico, esteárico, salicílico, glutámico, ascórbico, pamoico, succínico, fumárico, maleico, propiónico, hidroximaleico, yodhídrico, fenilacético, alcanoico tal como acético, HOOC-(CH2)n-COOH donde n es 0-4, y similares. De manera similar, los cationes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sodio, potasio, calcio, aluminio, litio y amonio. Los expertos en la técnica reconocerán a partir de esta descripción y del conocimiento en la técnica esas sales farmacéuticamente aceptables adicionales para los antígenos combinados específicos de una enfermedad proporcionados en la presente descripción, que incluyen las enumeradas en el documento Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 17, Mack Publishing Company, Easton, PA, pág. 1418 (1985). En general, una sal de ácido o base farmacéuticamente aceptable puede sintetizarse a partir de un compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante cualquier método químico convencional. En resumen, tales sales pueden prepararse mediante la reacción de las formas de ácido o base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en un solvente orgánico apropiado.

Las moléculas de ácidos nucleicos útiles en los métodos de la descripción incluyen cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un polipéptido de la descripción o un fragmento del mismo. No es necesario que dichas moléculas de ácidos nucleicos sean 100 % idénticas a una secuencia de ácido nucleico endógena, pero típicamente exhibirán una identidad sustancial. Los polinucleótidos que tienen identidad sustancial con una secuencia endógena típicamente pueden hibridarse con al menos una hebra de una molécula de ácido nucleico bicatenaria. Por "hibridarse" se entiende aparearse para formar una molécula bicatenaria entre secuencias polinucleotídicas complementarias, o porciones de las mismas, en diversas condiciones de rigurosidad. (Ver, por ejemplo los documentos, Wahl, G. M. y S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol.

152:507). Por ejemplo, la concentración de sales rigurosa normalmente puede ser menor que alrededor de 750 mM de NaCl y 75 mM de citrato trisódico, menor que alrededor de 500 mM de NaCl y 50 mM de citrato trisódico, o menor que alrededor de 250 mM de NaCl y 25 mM de citrato trisódico. La hibridación a baja rigurosidad puede obtenerse en ausencia de solvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que la hibridación a alta rigurosidad puede obtenerse en presencia de al menos alrededor de 35 % de formamida o en presencia de al menos alrededor de 50 % de formamida. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente pueden incluir temperaturas de al menos alrededor de 30 °C, al menos alrededor de 37 °C o al menos alrededor de 42 °C. Los expertos en la técnica conocen bien cómo variar parámetros adicionales, tales como, el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio (SDS), y la inclusión o exclusión de ADN portador. Los diversos niveles de rigurosidad se logran mediante la combinación de estas diversas condiciones según sea necesario. En un caso ilustrativo, la hibridación puede producirse a 30 °C en 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato trisódico y 1 % de SDS. En otro caso ilustrativo, la hibridación puede producirse a 37 °C en 500 mM de NaCl, 50 mM de citrato trisódico, 1 % de SDS, 35 % de formamida y 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón (ADNes) desnaturalizado. En otro caso ilustrativo, la hibridación puede producirse a 42 °C en 250 mM de NaCl, 25 mM de citrato trisódico, 1 % de SDS, 50 % de formamida y 200 pg/ml de ADNes. Las variaciones útiles de estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Para la mayoría de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridación también pueden variar en rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad del lavado se pueden definir por la concentración de sales y por la temperatura. Como se indicó anteriormente, la rigurosidad del lavado se puede aumentar mediante la disminución de la concentración de sales o el aumento de la temperatura. Por ejemplo, la concentración de sales rigurosa para las etapas de lavado puede ser menor que alrededor de 30 mM de NaCl y 3 mM de citrato trisódico, o menor que alrededor de 15 mM de NaCl y 1,5 mM de citrato trisódico. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado pueden incluir una temperatura de al menos alrededor de 25 °C, de al menos alrededor de 42 °C o al menos alrededor de 68 °C. En casos ilustrativos, las etapas de lavado pueden producirse a 25 °C en 30 mM de NaCl, 3 mM de citrato trisódico y 0,1 % de SDS. En otros casos ilustrativos, las etapas de lavado pueden producirse a 42 °C en 15 mM de NaCI, 1,5 mM de citrato trisódico y 0,1%de SDS. En otro caso ilustrativo, las etapas de lavado pueden producirse a 68 °C en 15 mM de NaCl, 1,5 mM de citrato trisódico y 0,1 % de SDS. Variaciones adicionales de estas condiciones serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas de hibridación y se describen, por ejemplo, en los documentos de Benton y Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel y otros (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); y Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.

Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido o molécula de ácido nucleico que exhibe al menos 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente descripción) o una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente descripción). Una secuencia de este tipo es al menos 60 %, 80 % u 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso 99 % o más idéntica al nivel de aminoácidos o ácido nucleico a la secuencia usada para la comparación. La identidad de secuencia se mide típicamente mediante el uso de un programa informático de análisis de secuencias (por ejemplo, el paquete de programas de análisis de secuencias del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis.

53705, programas BLAST, BESTF<i>T, GAP o PILEUP/PRETT<y>B<o>X). Dicho programa informático hace coincidir secuencias idénticas o similares al asignar grados de homología a varias sustituciones, eliminaciones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque ilustrativo para determinar el grado de identidad, puede usarse un programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e-3 y e-m° que indica una secuencia estrechamente relacionada. Por "referencia" se entiende un estándar de comparación.

El término "sujeto" o "paciente" se refiere a un animal que es el objeto de tratamiento, observación o experimentación. Solo a manera de ejemplo, un sujeto incluye, pero no se limita a, un mamífero, que incluye, pero sin limitarse a, un ser humano o un mamífero no humano, tal como un primate no humano, murino, bovino, equino, canino, ovino o felino.

Los términos "trata", "tratado", "tratar", "tratamiento" y similares pretenden referirse a reducir, prevenir o mejorar un trastorno y/o los síntomas asociados con este (por ejemplo, una neoplasia o tumor o agente infeccioso o una enfermedad autoinmunitaria). "Tratar" puede referirse a la administración de la terapia a un sujeto después del inicio, o sospecha del inicio, de una enfermedad (por ejemplo, cáncer o infección por un agente infeccioso o una enfermedad autoinmunitaria). "Tratar" incluye los conceptos de "aliviar", que se refiere a disminuir la frecuencia de aparición o reaparición, o la gravedad, de cualquier síntoma u otros efectos nocivos relacionados con la enfermedad y/o los efectos secundarios asociados con la terapia. El término "tratar" también abarca el concepto de "manejar" que se refiere a reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno en un paciente, por ejemplo, extender la vida o prolongar la capacidad de supervivencia de un paciente con la enfermedad, o retrasar su reaparición, por ejemplo, alargar el período de remisión en un paciente que había padecido la enfermedad. Se aprecia que, aunque no se excluye, el tratamiento de un trastorno o afección no requiere que el trastorno, afección o los síntomas asociados con este se eliminen por completo.

El término "prevenir", "que previene", "prevención" y sus equivalentes gramaticales como se usa en la presente descripción, significa evitar o retrasar la aparición de síntomas asociados con una enfermedad o afección en un sujeto que no ha desarrollado tales síntomas en el momento en que comienza la administración de un agente o compuesto.

El término "efecto terapéutico" se refiere a cierto grado de alivio de uno o más de los síntomas de un trastorno (por ejemplo, una neoplasia, tumor o infección por un agente infeccioso o una enfermedad autoinmunitaria) o su patología asociada. "Cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente descripción, se refiere a una cantidad de un agente que es eficaz, tras la administración de dosis únicas o múltiples a la célula o al sujeto, para prolongar la capacidad de supervivencia del paciente con dicho trastorno, reducir uno o más signos o síntomas del trastorno, prevenirlos o retrasarlos, y similares, más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. "Cantidad terapéuticamente eficaz" pretende calificar la cantidad requerida para lograr un efecto terapéutico. Un médico o veterinario experto en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la "cantidad terapéuticamente eficaz" (por ejemplo, ED<50>) de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario puede iniciar las dosis de los compuestos de la presente descripción empleadas en una composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En la presente descripción, enfermedad, afección y trastorno se usan indistintamente.

En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el alelo de HLA comprende además una etiqueta peptídica, una etiqueta de afinidad, una etiqueta epitópica o una etiqueta aceptora de afinidad que puede usarse para inmunopurificar el HLA-proteína. Los expertos en la técnica reconocerán que los términos "etiqueta peptídica", "etiqueta de afinidad", "etiqueta epitópica" o "etiqueta aceptora de afinidad" se usan indistintamente en la presente descripción. Como se usa en la presente descripción, el término "etiqueta aceptora de afinidad" se refiere a una secuencia de aminoácidos que permite que la proteína etiquetada se detecte o purifique fácilmente, por ejemplo, mediante purificación por afinidad. Generalmente (pero no es necesario) se coloca una etiqueta aceptora de afinidad en o cerca del extremo N- o C-terminal de un alelo de HLA. En la técnica se conocen bien diversas etiquetas peptídicas. Los ejemplos no limitantes incluyen etiqueta de polihistidina (por ejemplo, de 4 a 15 residuos de His consecutivos, tal como 8 residuos de His consecutivos); etiqueta de polihistidina-glicina; etiqueta de HA (por ejemplo, Campo y otros, Mol. Cell. Biol., 8:2159, 1988); etiqueta c-myc (por ejemplo, Evans y otros, Mol. Cell. Biol., 5:3610, 1985); etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple (por ejemplo, documento de Paborsky y otros, Protein Engineering, 3:547, 1990); etiqueta FLAG (por ejemplo, documento de Hopp y otros, BioTechnology, 6:1204, 1988; patente de Estados Unidos núm. 4,703,004 y 4,851,341); etiqueta epitópica KT3 (por ejemplo, documento de Martine y otros, Science, 255:192, 1992); etiqueta epitópica de tubulina (por ejemplo, documento de Skinner, Biol. Chem., 266:15173, 1991); etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7 (por ejemplo, documento de Lutz-Freyemuth y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393, 1990); etiqueta de estreptavidina (StrepTag.TM. o StrepTagII.TM.; ver, por ejemplo, documento de Schmidt y otros, J. Mol. Biol, 255(5):753-766, 1996 o la patente de Estados Unidos núm. 5,506,121; también disponible comercialmente en Sigma-Genosys); o una etiqueta epitópica de VSV-G derivada de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular; o una etiqueta V5 derivada de un pequeño epítopo (Pk) que se encuentra en las proteínas P y V del paramixovirus del virus 5 del simio (SV5). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad es una "etiqueta epitópica", que es un tipo de etiqueta peptídica que añade un epítopo reconocible (sitio de unión al anticuerpo) al HLA-proteína para proporcionar la unión del anticuerpo correspondiente, de esta manera permite la identificación o purificación por afinidad de la proteína etiquetada. Un ejemplo no limitante de una etiqueta epitópica es la proteína A o la proteína G, que se une a IgG. En algunos casos, la matriz de la resina de cromatografía IgG Sepharose 6 Fast Flow está acoplada covalentemente a la IgG humana. Esta resina permite altos regímenes de flujo, para una purificación rápida y conveniente de una proteína etiquetada con proteína A. El experto conoce y puede prever muchos otros restos de etiquetas, y se contemplan en la presente descripción. Puede usarse cualquier etiqueta peptídica siempre que pueda expresarse como un elemento de un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

Como se usa en la presente descripción, el término "molécula de afinidad" se refiere a una molécula o un ligando que se une con especificidad química a un péptido aceptor de afinidad. La especificidad química es la capacidad del sitio de unión de una proteína para unirse a ligandos específicos. Cuantos menos ligandos pueda unir una proteína, mayor será su especificidad. La especificidad describe la fortaleza de la unión entre una proteína dada y un ligando. Esta relación puede describirse mediante una constante de disociación (K<d>), que caracteriza el equilibrio entre los estados unido y no unido del sistema proteína-ligando.

La expresión "complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido" se refiere a un complejo que comprende un péptido asociado a h La de clase I o clase II o una porción del mismo unido específicamente a un único péptido HLA recombinante alélico de clase I o clase II que comprende un péptido aceptor de afinidad.

Los términos "unión específica" o "que se une específicamente" cuando se usan en referencia a la interacción de una molécula de afinidad y una etiqueta aceptora de afinidad o un epítopo y un péptido HLA significan que la interacción depende de la presencia de una estructura particular(es decir,el determinante antigénico o epítopo) en la proteína; en otras palabras, la molécula de afinidad es reconocida por y se une a una estructura peptídica aceptora de afinidad específica en lugar de a proteínas en general.

Como se usa en la presente descripción, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fortaleza de la unión entre dos miembros de un par de unión, por ejemplo, una "etiqueta aceptora de afinidad" y una "molécula de afinidad" y un péptido de unión a HLA y un HLA clase I o II. La kD es la constante de disociación y tiene unidades de molaridad. La constante de afinidad es el inverso de la constante de disociación. A veces se usa una constante de afinidad como término genérico para describir esta entidad química. Es una medida directa de la energía de unión. La afinidad puede determinarse experimentalmente, por ejemplo por resonancia de plasmón superficial (SPR) mediante el uso de unidades Biacore SPR disponibles comercialmente. La afinidad también puede expresarse como la concentración inhibidora 50 (IC<50>), aquella concentración a la que se desplaza el 50 % del péptido. Igualmente, ln(IC<50>) se refiere al logaritmo natural de la IC<50>. La Kdis se refiere a la constante de velocidad de disociación, por ejemplo, para la disociación de una molécula de afinidad del complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido.

En algunos casos, un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprende el péptido aceptor de biotina (BAP) y se inmunopurifica a partir de mezclas celulares complejas mediante el uso de perlas de estreptavidina/NeutrAvidina. La unión biotina-avidina/estreptavidina es la interacción no covalente más fuerte conocida en la naturaleza. Esta propiedad se explota como herramienta biológica para una amplia variedad de aplicaciones, tales como la inmunopurificación de una proteína a la que se une covalentemente la biotina. En un caso ilustrativo, la secuencia de ácido nucleico que codifica el alelo de HLA implementa el péptido aceptor de biotina (BAP) como una etiqueta aceptora de afinidad para la inmunopurificación. BAP se puede biotinilar específicamentein vivooin vitroen un único residuo de lisina dentro de la etiqueta (por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núm. 5,723,584; 5,874,239; y 5,932,433; y la patente del Reino Unido núm. GB2370039). Típicamente BAP tiene 15 aminoácidos de longitud y contiene una única lisina como residuo aceptor de biotina. En algunos casos, BAP se coloca en o cerca del extremo N- o C-terminal de un péptido HLA monoalélico. En algunos casos, BAP se coloca entre un dominio de cadena pesada y un dominio de p2 microglobulina de un péptido HLA de clase I. En algunos casos, BAP se coloca entre el dominio de la cadena p y el dominio de la cadena a de un péptido HLA de clase II. En algunos casos, BAP se coloca en regiones de lazo entre los dominios a1, a2 y a3 de la cadena pesada del HLA de clase I, o entre los dominios a l y a2 y p1 y p2 de la cadena a y la cadena p, respectivamente, del HLA de clase II. En la Figura 2 se describen construcciones ilustrativas diseñadas para la expresión de HLA de clase I y II que implementan BAP para biotinilación e inmunopurificación.

Como se usa en la presente descripción, el término "biotina" se refiere al compuesto biotina en sí y análogos, derivados y variantes del mismo. Por lo tanto, el término "biotina" incluye biotina (ácido cis-hexahidro-2-oxo-1H-tieno[3,4]imidazol-4-pentanoico) y cualquier derivado y análogo de la misma, que incluyen compuestos similares a la biotina. Dichos compuestos incluyen, por ejemplo, biotina-e-N-lisina, biocitina hidrazida, derivados amino o sulfhidrilo de 2-iminobiotina y éster de N-hidroxisuccinimida del ácido biotinil-E-aminocaproico, sulfosuccinimidaiminobiotina, biotinbromoacetilhidrazida, p-diazobenzoilbiocitina, 3-(N-maleimidopropionil)biocitina, destiobiotina y similares. El término "biotina" comprende además variantes de biotina que pueden unirse específicamente a uno o más de un resto de rizavidina, avidina, estreptavidina, tamavidina u otros péptidos similares a la avidina.

Enfoques de obtención de perfiles de ligandos de HLA

El ensayo bioquímico de unión de péptido-MHC para el descubrimiento de epítopos de HLA fue la base de NetMHC, el predictor específico de alelo que usa redes neuronales artificiales; sin embargo, el ensayo bioquímico de unión p:MHC lento es un método de bajo rendimiento (Figura 19). Los ligandos de HLA procesados y presentados endógenamente cuyos perfiles se elaboran a partir de líneas celulares y materiales derivados de pacientes comúnmente son multialélicos, lo que significa que los datos de LC-MS/MS generados a partir de estas muestras contienen una población mixta de ligandos que pueden unirse a uno de los múltiples alelos de HLA expresados simultáneamente, como se muestra en la Figura 17 y la Figura 19. Los conjuntos de datos multialélicos requieren deconvolución para determinar qué péptidos se unen a los diferentes heterodímeros de HLA presentados por un individuo. Por lo tanto, los ligandos de conjuntos de datos multialélicos deben asignarse a sus correspondientes heterodímeros de HLA mediante el uso de (1) predictores de unión entrenados con datos preexistentes o (2) algoritmos de deconvolución que aprovechan la superposición entre los alelos de HLA representados en grandes conjuntos de datos de ligandos. Es importante tener en cuenta que solo los conjuntos de datos de LC-MS/MS con información de tipificación de HLA disponible pueden deconvolucionarse con confianza. De hecho, casi el 40 % de los ligandos procesados naturalmente unidos a complejos HLA de clase I informados en estudios multialélicos en la base de datos Immune Epitope Database (IEDB) carecen de asignaciones específicas de alelos de HLA, ya sea debido a la falta de información de tipificación de HLA o a la incapacidad de deconvolucionar, lo que dificulta el uso de este subconjunto de datos para la predicción de epítopos específicos de alelos. Además, es difícil identificar péptidos unidos a heterodímeros de HLA de clase I raros y a muchos heterodímeros de HLA de clase II porque no hay suficientes datos anotados para la deconvolución. El enfoque de generación de datos multialélicos también limita el descubrimiento de nuevos motivos de unión, ya que su deconvolución se basa en conocimientos preexistentes. Aunque existen advertencias sobre la utilización de conjuntos de datos multialélicos para predicciones de epítopos específicos de alelos, estos son inmensamente valiosos para determinar patrones de presentación de ligandos que requieren la coexpresión de múltiples alelos y para validar algoritmos de predicción de epítopos.

Un enfoque ortogonal para la generación de datos multialélicos y la subsecuente deconvolución es la creación de conjuntos de datos monoalélicos a partir de los cuales se identifican poblaciones de péptidos presentadas por un único alelo de HLA (Figura 17 y Figura 19). Un método para generar datos monoalélicos utiliza líneas celulares que son deficientes en la expresión de HLA. Estas células pueden transfectarse o transducirse con alelos de HLA únicos, de modo que los perfiles de los ligandos pueden obtenerse por LC-MS/MS para generar bibliotecas de ligandos específicos de alelos. Los péptidos unidos a moléculas de HLA solubles (HLAs) también pueden aislarse de medios celulares y obtenerse su perfil por LC-MS/MS para producir datos monoalélicos. Una ventaja importante de los conjuntos de datos monoalélicos es que no requieren deconvolución y permiten asignaciones confiables de péptidoalelo de HLA sin datos preexistentes. Los enfoques monoalélicos también proporcionan rápidamente datos para alelos de HLA que no se han caracterizado previamente - una tarea que los datos multialélicos solo pueden realizar si hay suficiente superposición entre grandes conjuntos de datos. Adicionalmente, se pueden descubrir fácilmente nuevos motivos de unión a péptidos mediante el uso de sistemas monoalélicos, ya que no se requieren conocimientos previos para realizar asignaciones confiables de unión a HLA. Los datos monoalélicos pueden incluso aprovecharse para asignar ligandos a partir de conjuntos de datos multialélicos cuando los métodos de deconvolución no logran hacerlo.

El factor limitante del enfoque monoalélico disponible actualmente es que requiere una línea celular deficiente en HLA. Una característica innovadora clave de la presente descripción es que no se requiere una línea celular deficiente en HLA para la generación de datos monoalélicos. Las construcciones con etiqueta de afinidad proporcionadas en la presente descripción pueden colocarse en cualquier línea celular que presente complejos HLA-péptido endógenos para aislar el alelo de interés mediante el uso de la etiqueta de afinidad. Otra ventaja de la presente descripción es que pueden usarse los mismos reactivos para cualquier alelo de clase II en la biblioteca siempre y cuando tenga la misma etiqueta de afinidad, lo que hace que el método descrito en la presente descripción sea escalable (automatizado). En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con una enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer. En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección.

En algunos casos, el método comprende además aislar los péptidos de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la caracterización. En algunos casos, los péptidos se aíslan mediante el uso de anticuerpos anti-HLA. En algunos casos, los HLA solubles (HLAs) con etiquetas de afinidad se aíslan mediante el uso de anticuerpos anti-HLA. En algunos casos, los HLA solubles (HLAs) con etiquetas de afinidad se aíslan mediante el uso de una columna que contiene un anticuerpo anti-HLA.

Métodos y Composiciones

En la presente descripción se proporciona un método para caracterizar complejos HLA-péptido que comprende: proporcionar una población de células, en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante unida operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad; expresar el HLA etiquetado con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido en la al menos una célula; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y caracterizar los complejos HLA-péptido.

En algunos casos, la caracterización comprende caracterizar un péptido del complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para diferentes alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, el método comprende usar más de un alelo de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, la población de células se deriva de un sujeto (por ejemplo, un paciente que tiene una enfermedad). En algunos casos, la población de células son líneas celulares negativas para clase I y/o clase II. En algunos casos, el método comprende además generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA.

En la presente descripción se proporciona un método para generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA que comprende: proporcionar una primera y una segunda población de células, cada una de las cuales comprende una o más células que comprenden un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde el HLA etiquetado con aceptor de afinidad de secuencia comprende un polipéptido recombinante diferente codificado por un alelo de HLA diferente unido operativamente a un péptido aceptor de afinidad; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; caracterizar un péptido o una porción del mismo unido a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento; y generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA.

En algunos casos, el enriquecimiento no comprende el uso de un reactivo tetramérico.

En algunos casos, la caracterización comprende determinar la secuencia de un péptido o una porción del mismo unida a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, la caracterización comprende determinar si el péptido o una porción del mismo está modificado (por ejemplo, modificación postraduccional). En algunos casos, la determinación comprende análisis bioquímico. En algunos casos, la determinación comprende análisis de espectrometría de masas. En algunos casos, la espectrometría de masas es análisis MS, análisis MS/MS, análisis LC-MS/MS o una de sus combinaciones. En algunos casos, el análisis MS se usa para determinar la masa de un péptido intacto. Por ejemplo, la determinación puede comprender determinar una masa de un péptido intacto (por ejemplo, análisis MS). En algunos casos, se usa el análisis MS/MS para determinar una masa de fragmentos peptídicos. Por ejemplo, la determinación puede comprender determinar una masa de fragmentos peptídicos, que pueden usarse para determinar una secuencia de aminoácidos de un péptido o porción del mismo (por ejemplo, análisis MS/MS). En algunos casos, la masa de fragmentos peptídicos se usa para determinar una secuencia de aminoácidos dentro del péptido. En algunos casos, el análisis LC-MS/MS se usa para separar mezclas de péptidos complejas. Por ejemplo, la determinación puede comprender separar mezclas de péptidos complejas, tal como por cromatografía líquida, y determinar una masa de un péptido intacto, una masa de fragmentos peptídicos o una de sus combinaciones (por ejemplo, análisis LC-MS/MS). Estos datos pueden usarse, por ejemplo, para la secuenciación de péptidos.

En algunos casos, la caracterización comprende evaluar una afinidad de unión o estabilidad de un péptido o una porción del mismo unido a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, la caracterización comprende determinar si un péptido o una porción del mismo unido a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento contiene una o más mutaciones. En algunos casos, la caracterización comprende determinar si el péptido o una porción del mismo está modificado (por ejemplo, modificación postraduccional). En algunos casos, la caracterización comprende evaluar asociaciones de péptidos de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con alelos de HLA.

En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con una enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer. En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección.

En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias.

En algunos casos, el alelo de HLA de clase II recombinante es compatible con un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, una célula presentadora de antígeno que comprende el péptido o un mutante del mismo unido a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido tiene reactividad con una célula T que expresa un receptor de células T de un sujeto. En algunos casos, la caracterización comprende comparar complejos HLA-péptido de células cancerosas con complejos HLA-péptido de células no cancerosas.

En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la desactivación de un alelo de HLA de clase II comprende la eliminación de la función del alelo de HLA de clase II. En algunos casos, la desactivación del alelo de HLA de clase II se logra a través de la edición de genes. En algunos casos, la edición de genes se realiza mediante la administración de una nucleasa a un individuo que lo necesita, en donde la nucleasa se dirige al alelo de HLA de clase I o al alelo de clase II a desactivar. En algunos casos, la nucleasa es una proteína asociada a CRISPR (por ejemplo, proteínas Cas, por ejemplo, Cas9), una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN) o una meganucleasa. En algunos casos, la edición de genes se logra mediante la administración de un sistema CRISPR-Cas9 a un individuo que lo necesita. En algunos casos, se usa cualquier nucleasa adecuada que induzca una mella o ruptura bicatenaria en un sitio de reconocimiento deseado. En algunos casos, se usa una nucleasa nativa o natural. En algunos casos, se usa una nucleasa modificada o manipulada.

En algunos casos, la población de células tiene atenuados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene atenuados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene atenuados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene atenuados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene atenuados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene atenuados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la atenuación de un alelo de HLA de clase II comprende una reducción en la expresión del alelo de HLA de clase II. En algunos casos, la atenuación del alelo de HLA de clase I o del alelo de clase II se logra mediante la administración a un individuo que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARN de interferencia pequeño (ARNip) bicatenario, un microARN (miARN), un ARN de horquilla corta (ARNhc), en donde el ARNip, miARN, ARNhc se dirige al alelo de HLA de clase I o al alelo de clase II a atenuar. En algunos casos, la expresión del alelo de HLA de clase II se reduce en alrededor de 99 %, alrededor de 95 %, alrededor de 90 %, alrededor de 85 %, alrededor de 80 %, alrededor de 75 %, alrededor de 70 %, alrededor de 65 %, alrededor de 60 %, alrededor de 55 %, alrededor de 50 %, alrededor de 45 %, alrededor de 40 %, alrededor de 35 %, alrededor de 30 %, alrededor de 25 % o alrededor de 20 % en comparación con cuando el alelo de HLA de clase I o el alelo de clase II no se ha atenuado.

En algunos casos, la población de células comprende células que se han enriquecido o clasificado para la expresión en la superficie celular de un alelo de HLA de clase I, un alelo de HLA de clase II o una de sus combinaciones, tal como mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos casos, se usa la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar la población de células. En algunos casos, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se usa para clasificar la población de células en cuanto a la expresión en la superficie celular de un alelo de HLA de clase I, un alelo de HLA de clase II o una de sus combinaciones. En algunos casos, FACS se usa para enriquecer o clasificar células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular.

En algunos casos, la población de células comprende una pluralidad de poblaciones de células, cada una de las cuales expresa un alelo de HLA de clase II recombinante diferente. En algunos casos, cada población de células de la pluralidad está en un contenedor independiente.

En algunos casos, el método comprende además aislar los péptidos de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la caracterización. En algunos casos, el método comprende además recortar un extremo terminal del péptido unido a los complejos HLA-péptido (Figura 13).

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante codifica un HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante codifica un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C. En algunos casos, el HLA de clase I es un grupo de clase I-b no clásico. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el HLA de clase I es un grupo de clase I-b no clásico seleccionado del grupo que consiste en HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de HLA de clase II o una de sus combinaciones.

En algunos casos, cada secuencia que codifica un alelo de HLA de clase I y/o clase II diferente está unida operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante que codifica una porción extracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante que codifica una porción intracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante.

En algunos casos, la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante mediante un enlazador.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

En algunos casos, el método no comprende lisar la una o más células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad puede comprender un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de afinidad se une específicamente a la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la molécula de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la superficie sólida es una perla.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad que se une específicamente al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del HLA de clase II recombinante codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción extracelular de los complejos HLA-péptido. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción N-terminal de los complejos HLA-péptido.

En algunos casos, proporcionar comprende poner en contacto la población de células con el ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el contacto comprende transfectar o transducir. En algunos casos, proporcionar comprende poner en contacto la población de células con un vector o plásmido que comprende el ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el vector es un vector viral.

Puede usarse cualquier ensayo bioquímico adecuado para determinar un HLA expresado en una célula (por ejemplo, una línea celular manipulada). Los métodos ilustrativos para determinar la identidad de un alelo de HLA expresado en una célula (por ejemplo, una línea celular manipulada) incluyen análisis de transferencia Western, por ejemplo, para determinar la clase de un alelo de HLA (clase I o clase II), análisis de secuencia, por ejemplo, secuenciación de alelos individuales (por ejemplo, mediante el uso de diferentes cebadores para la identificación de diferentes alelos de secuencia similar). En algunos casos, un ácido polinucleico que codifica un alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. La secuencia de código de barras puede usarse para identificar un alelo de HLA expresado en una célula. En algunos casos, la secuencia de código de barras es exclusiva de un único HLA. En algunos casos, la secuencia de código de barras es exclusiva de un único alelo de HLA de clase II.

En algunos casos, el ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad se integra de forma estable en el genoma de la población de células. En algunos casos, la secuencia que codifica un HLA de clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, la secuencia que codifica un HLA de clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad es diferente del primer péptido aceptor de afinidad y puede comprender un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta cmyc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAg , etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones.

En algunos casos, la determinación comprende realizar espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas en tándem. En algunos casos, la determinación comprende obtener una secuencia peptídica que corresponde a un espectro MS/MS de uno o más péptidos aislados a partir de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos de una base de datos de péptidos; en donde una o más secuencias obtenidas identifican la secuencia del uno o más péptidos.

En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO y THP1. En algunos casos, la línea celular se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-<y>, un agente que altera el procesamiento de antígenos (por ejemplo, inhibidores de peptidasa, inhibidor de proteasoma, inhibidor de TAP, etc.) o una de sus combinaciones. En algunos casos, la base de datos de péptidos es una base de datos de péptidos sin especificidad enzimática, tal como una base de datos sin modificaciones o una base de datos con modificaciones (por ejemplo, fosforilación o cisteinilación). En algunos casos, la base de datos de péptidos es una base de datos de polipéptidos. En algunos casos, la base de datos de polipéptidos es una base de datos de proteínas. En algunos casos, el método comprende además buscar en la base de datos de péptidos mediante el uso de una estrategia de búsqueda en base de datos inversa. En algunos casos, el método comprende además buscar en una base de datos de proteínas mediante el uso de una estrategia de búsqueda en base de datos inversa. En algunos casos, se realiza una búsqueda denovo,por ejemplo, para descubrir nuevos péptidos que no están incluidos en una base de datos normal de péptidos o proteínas.

En algunos casos, la población de células comprende al menos 105 células, al menos 106 células o al menos 107 células. En algunos casos, la población de células es una población de células dendríticas, macrófagos, células cancerosas o células B. En algunos casos, la población de células comprende células tumorales o células infectadas por un agente infeccioso o una porción del mismo.

En algunos casos, la población de células se pone en contacto con un agente antes de aislar dichos complejos HLA-péptido de la una o más células. En algunos casos, dicho agente es una citocina inflamatoria, un agente químico, un adyuvante, un agente terapéutico o radiación.

En algunos casos, el alelo de HLA es un alelo de HLA mutado.

En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para diferentes alelos de HLA.

En la presente descripción se proporciona una base de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenida al llevar a cabo los métodos descritos en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una combinación de dos o más bases de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenidas al llevar a cabo los métodos descritos en la presente descripción repetidamente, mediante el uso cada vez de un alelo de HLA diferente. En la presente descripción se proporciona un método para generar un algoritmo de predicción para identificar péptidos de unión específica de alelo de HLA, que comprende entrenar una máquina con una base de datos de secuencias peptídicas como se describe en la presente descripción. En algunos casos, la máquina combina uno o más modelos lineales, máquinas de vectores de soporte, árboles de decisión y redes neuronales.

La generación de un algoritmo de predicción por entrenamiento de una máquina es una técnica bien conocida. Lo más importante en el entrenamiento de la máquina es la calidad de la base de datos usada para el entrenamiento. Típicamente, la máquina combina uno o más modelos lineales, máquinas de vectores de soporte, árboles de decisión y/o una red neuronal.

En algunos casos, una variable usada para entrenar la máquina o algoritmo comprende una o más variables seleccionadas del grupo que consiste en secuencia peptídica, propiedades físicas de los aminoácidos, propiedades físicas de los péptidos, nivel de expresión de la proteína de origen de un péptido dentro de una célula, estabilidad de proteínas, tasa de traducción de proteínas, sitios de ubiquitinación, tasa de degradación de proteínas, eficiencias de traducción del perfil ribosómico, capacidad de escisión de proteínas, localización de proteínas, motivos de la proteína del huésped que facilitan el transporte de TAP, la proteína del huésped se somete a autofagia, motivos que favorecen el estancamiento ribosomal (por ejemplo, tramos de poliprolina o polilisina), y características de las proteínas que favorecen NMD (por ejemplo, UTR 3' larga, codón de parada >50 nt aguas arriba de la última unión exón:exón y capacidad de escisión de péptidos).

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un primer y un segundo ácido polinucleico recombinante, cada uno de los cuales comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende (a) una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase I recombinante diferente, (b) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, (c) una secuencia que codifica p2 microglobulina; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un primer y un segundo ácido polinucleico recombinante, cada uno de los cuales comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende (a) una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase II recombinante, (b) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, (c) una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente.

En algunos casos, se aíslan el primer y segundo ácidos polinucleicos recombinantes.

En algunos casos, la secuencia codifica un alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C. En algunos casos, el HLA de clase I es un grupo de clase I-b no clásico. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el HLA de clase I es un grupo de clase I-b no clásico seleccionado del grupo que consiste en HLA-E, HLA-F y HLA-G.

En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia de la secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente que codifica una porción extracelular del alelo de HLA recombinante diferente. En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica una molécula aceptora de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente. En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia de la secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente que codifica una porción intracelular del alelo de HLA recombinante diferente. En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente. En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente mediante un enlazador. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se une específicamente a una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad del primer y segundo ácidos polinucleicos recombinantes es diferente.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado puede comprender un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAg , etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente a una molécula de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con una secuencia de aminoácidos del HLA de clase II recombinante codificado. En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad se integra de forma estable en el genoma de una célula. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad comprende una etiqueta de HA. En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad puede comprender un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica detubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, tanto para el primer como para el segundo ácido polinucleico recombinante: la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica un HLA recombinante diferente y el péptido aceptor de afinidad mediante un enlazador. En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de ácido polinucleico que codifica un enlazador escindible. En algunos casos, el enlazador escindible es un sitio de omisión ribosomal o un elemento del sitio de entrada ribosomal interno (IRES). En algunos casos, el sitio de omisión ribosomal o IRES se escinde cuando se expresa en las células. En algunos casos, el sitio de omisión ribosomal se selecciona del grupo que consiste en F2A, T2A, P2A y E2A. En algunos casos, el elemento IRES se selecciona de secuencias IRES celulares o virales comunes.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una primera y una segunda molécula polipeptídica aislada codificada por el primer y el segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una primera y una segunda célula que comprende una primera y una segunda molécula polipeptídica codificada por el primer y el segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una primera y una segunda célula que comprende el primer y el segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una composición que comprende una primera y una segunda población de células que comprenden una o más células que comprenden el primer y el segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de una composición descrita en la presente descripción.

En algunos casos, la primera y la segunda población de células expresan uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la primera y la segunda población de células se manipulan de modo que carezcan de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la primera y la segunda población de células se manipulan de modo que carezcan de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la primera y la segunda población de células se manipulan de modo que carezcan de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la primera y la segunda población de células se manipulan de modo que carezcan de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la primera y la segunda población de células se manipulan de modo que carezcan de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos.

En la presente descripción se proporciona un método para producir una célula que comprende transducir o transfectar una primera y una segunda célula con el primer y el segundo ácidos polinucleicos, respectivamente, de una composición descrita en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción.

Sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA)

El sistema inmunológico puede clasificarse en dos subsistemas funcionales: el sistema inmunológico innato y el adaptativo. El sistema inmunológico innato es la primera línea de defensa contra las infecciones, y este sistema neutraliza rápidamente la mayoría de los patógenos potenciales antes de que puedan causar, por ejemplo, una infección perceptible. El sistema inmunológico adaptativo reacciona a las estructuras moleculares, denominadas antígenos, del organismo intruso. A diferencia del sistema inmunológico innato, el sistema inmunológico adaptativo es muy específico contra un patógeno. La inmunidad adaptativa también puede proporcionar una protección duradera; por ejemplo, alguien que se recupera del sarampión ahora está protegido contra el sarampión de por vida. Hay dos tipos de reacciones inmunitarias adaptativas, que incluyen la reacción inmunitaria humoral y la reacción inmunitaria mediada por células. En la reacción inmunitaria humoral, los anticuerpos secretados por las células B en los fluidos corporales se unen a antígenos derivados del patógeno, lo que conduce a la eliminación del patógeno a través de una variedad de mecanismos, por ejemplo, la lisis mediada por el complemento. En la reacción inmunitaria mediada por células se activan las células T que pueden destruir otras células. Por ejemplo, si las proteínas asociadas con una enfermedad están presentes en una célula, estas se fragmentan proteolíticamente en péptidos dentro de la célula. Después, proteínas celulares específicas se unen al antígeno o péptido formado de esta manera y los transportan a la superficie de la célula, donde se presentan a los mecanismos de defensa molecular, en las células T, del cuerpo. Las células T citotóxicas reconocen estos antígenos y destruyen las células que albergan los antígenos.

El término "complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)", "moléculas de MHC" o "proteínas MHC" se refiere a proteínas que pueden unirse a péptidos resultantes de la escisión proteolítica de antígenos proteicos y que representan epítopos potenciales de células T, transportarlos a la superficie celular y presentarlos allí a células específicas, por ejemplo, en linfocitos T citotóxicos o células T auxiliares. El MHC humano también se denomina complejo HLA. Por lo tanto, la expresión "sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA)", "moléculas de HLA" o "proteínas HLA" se refiere a un complejo de genes que codifican las proteínas MHC en seres humanos. El término MHC se conoce como el complejo "H-2" en especies murinas. Los expertos en la técnica reconocerán que los términos "complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)", "moléculas de MHC", "proteínas MHC" y "sistema de antígenos leucocitarios humanos (HLA)", "moléculas de HLA", "proteínas HLA" se usan indistintamente en la presente descripción.

Las proteínas HLA se clasifican en dos tipos, denominadas HLA de clase I y HLA de clase II. Las estructuras de las proteínas de las dos clases de HLA son muy similares; sin embargo, tienen funciones muy diferentes. Las proteínas HLA de clase I están presentes en la superficie de casi todas las células del cuerpo, que incluyen la mayoría de las células tumorales. Las proteínas HLA de clase I están cargadas de antígenos que por lo general se originan a partir de proteínas endógenas o de patógenos presentes dentro de las células, y después se presentan a linfocitos T vírgenes o citotóxicos (CTL). Las proteínas HLA de clase II están presentes en las células presentadoras de antígeno (APC), que incluyen, pero sin limitarse a, células dendríticas, células B y macrófagos. Presentan principalmente péptidos, que se procesan a partir de fuentes externas de antígenos,es decirfuera de las células, a las células T auxiliares. La mayoría de los péptidos que se unen a las proteínas HLA de clase I se originan a partir de proteínas citoplasmáticas producidas en las células huésped sanas del propio organismo y normalmente no estimulan una reacción inmunitaria.

Las moléculas de HLA de clase I consisten en una cadena pesada y una cadena ligera y pueden unirse a un péptido de alrededor de 7 a 13 aminoácidos (por ejemplo, alrededor de 8 a 11 aminoácidos, o 9 o 10 aminoácidos), si este péptido tiene motivos de unión adecuados, y presentarlo a linfocitos T citotóxicos. Los péptidos que se unen a moléculas de HLA de clase I se originan a partir de un antígeno proteico endógeno. La cadena pesada de las moléculas de HLA de clase I puede ser un monómero HLA-A, HLA-B o HLA-C, y la cadena ligera es p-2-microglobulina. El HLA de clase I aparece como una cadena a compuesta por tres dominios: a1, a2 y a3. Esta cadena se denomina a menudo cadena pesada de clase I, y en la presente descripción se denomina cadena alfa de clase I. La a1 descansa sobre una unidad de la molécula p2 microglobulina no HLA (codificada en el cromosoma 15 humano). El dominio a3 es transmembrana, que ancla la molécula HLA de clase I a la membrana celular. El péptido que se presenta se sujeta al piso del surco de unión al péptido, en la región central del heterodímero a1/a2 (una molécula compuesta por dos subunidades no idénticas). Los HLA-A, HLA-B o HLA-C de clase I son muy polimórficos. El HLA de clase Ib exhibe polimorfismo, patrones de expresión y presentación de antígenos limitados. Este grupo se subdivide en un grupo codificado dentro de los loci de HLA, por ejemplo, HLA-E, HLA-F, HLA-G, así como también los que no, por ejemplo, ligandos de estrés tales como ULBp , Rae1 y H60. El antígeno/ligando de muchas de estas moléculas sigue siendo desconocido, pero pueden interactuar con cada una de las células T CD8+, células NKT y células NK.

En algunos casos, la presente descripción utiliza un alelo HLA-E de clase I no clásico. HLA-E es una molécula de clase I no clásica reconocida por las células asesinas naturales (NK) y células T CD8+. HLA-E se expresa en casi todos los tejidos, que incluyen pulmón, hígado, piel y células placentarias. La expresión de HLA-E también se detecta en tumores sólidos (por ejemplo, osteosarcoma y melanoma). HLA-E se une al TCR expresado en células T CD8+, lo que da como resultado la activación de las células T. También se sabe que HLA-E se une al receptor CD94/NKG2 expresado en células NK y células T CD8+. CD94 puede parearse con varias isoformas diferentes de NKG2 para formar receptores con potencial para inhibir (NKG2A, NKG2B) o promover (NKG2C) la activación celular. HLA-E puede unirse a un péptido derivado de los residuos de aminoácidos 3-11 de las secuencias líder de la mayoría de las moléculas de HLA-A, -B, -C y -G, pero no puede unirse a su propio péptido líder. También se ha demostrado que HLA-E presenta péptidos derivados de proteínas endógenas similares a los alelos HLA-A, -B y -C. En condiciones fisiológicas, el acoplamiento de CD94/NKG2A con HLA-E, cargado con péptidos de las secuencias líder de HLA de clase I, por lo general induce señales inhibidoras. El citomegalovirus (CMV) utiliza el mecanismo para escapar de la vigilancia inmunitaria de las células NK por medio de la expresión de la glicoproteína UL40, que imita al líder de HLA-A. Sin embargo, también se informa que las células T CD8+ pueden reconocer el HLA-E cargado con el péptido UL40 derivado de la cepa de CMV Toledo y desempeñar un papel en la defensa contra el CMV. Una serie de estudios revelaron varias funciones importantes del HLA-E en enfermedades infecciosas y cáncer.

Los antígenos peptídicos se unen a las moléculas de HLA de clase I mediante unión por afinidad competitiva dentro del retículo endoplasmático, antes de presentarse en la superficie celular. Aquí, la afinidad de un antígeno peptídico individual está directamente relacionada con su secuencia de aminoácidos y la presencia de motivos de unión específicos en posiciones definidas dentro de la secuencia de aminoácidos. Si se conoce la secuencia de dicho péptido, es posible manipular el sistema inmunológico contra células enfermas mediante el uso de, por ejemplo, vacunas peptídicas.

Las moléculas de HLA de clase II tienen dos cadenas, a y p, cada una tiene dos dominios - a l y a2 y p1 y p2 - cada cadena tiene un dominio transmembrana, a2 y p2, respectivamente, que ancla la molécula de HLA de clase II a la membrana celular. El surco de unión al péptido está formado por el heterodímero de a l y p1. El péptido unido a las moléculas de HLA de clase II por lo general procede de un antígeno proteico extracelular exógeno. La cadena a y la cadena p están en los monómeros HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP (Figura 1B). Las moléculas de HLA de clase II tienen seis isotipos. Las moléculas clásicas presentan péptidos a los linfocitos CD4+. Las moléculas no clásicas, auxiliares, con funciones intracelulares, no están expuestas en las membranas celulares, sino en las membranas internas de los lisosomas, normalmente cargando los péptidos antigénicos en las moléculas clásicas de HLA de clase II.

En el HLA de clase II, los fagocitos tales como los macrófagos y las células dendríticas inmaduras adquieren las entidades por fagocitosis en fagosomas - aunque las células B exhiben la endocitosis más general en endosomas -que se fusionan con los lisosomas cuyas enzimas ácidas escinden la proteína absorbida en forma de muchos péptidos diferentes. La autofagia es otra fuente de péptidos HLA de clase II. Por medio de dinámicas fisicoquímicas en interacción molecular con las variantes de HLA de clase II transmitidas por el huésped, codificadas en el genoma del huésped, un péptido particular exhibe inmunodominancia y se carga en moléculas de HLA de clase II. Estos se transportan y externalizan en la superficie celular. Los genes de HLA de subclase II más estudiados son: HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1.

La presentación de péptidos por moléculas de HLA de clase II a las células T auxiliares CD4+ se requiere para las respuestas inmunitarias a antígenos extraños (Roche y Furuta, 2015). Una vez activadas, las células T CD4+ promueven la diferenciación de las células B y la producción de anticuerpos, así como también las respuestas de las células T CD8+ (CTL). Las células T CD4+ también secretan citocinas y quimiocinas que activan e inducen la diferenciación de otras células inmunitarias. Las moléculas de HLA de clase II son heterodímeros de cadenas a y p que interactúan para formar un surco de unión al péptido que es más abierto que los surcos de unión al péptido de clase I (Unanue y otros, 2016). Se cree que los péptidos unidos a moléculas de HLA de clase II tienen un núcleo de unión de 9 aminoácidos con residuos flanqueantes en el lado N o C-terminal que sobresalen del surco (Jardetzky y otros, 1996; Stern y otros, 1994). Estos péptidos por lo general tienen 12-16 aminoácidos de longitud y, a menudo, contienen 3-4 residuos de anclaje en las posiciones P1, P4, P6/7 y P9 del registro de unión (Rossjohn y otros, 2015).

Los alelos de HLA se expresan de forma codominante, lo que significa que los alelos (variantes) heredados de ambos padres se expresan por igual. Por ejemplo, cada persona porta 2 alelos de cada uno de los 3 genes de clase I (HLA-A, HLA-B y HLA-C), y por lo tanto puede expresar seis tipos diferentes de HLA de clase II. En el locus de HLA de clase II, cada persona hereda un par de genes de HLA-DP (DPA1 y DPB1, que codifican las cadenas a y p), una pareja de genes de HLA-DQ (DQA1 y DQB1, para las cadenas a y p), un gen de HLA-DRa (DRA1), y uno o más genes de HLA-DRp (DRB1 y DRB3, -4 o -5). Eso significa que un individuo heterocigoto puede heredar seis u ocho alelos de HLA de clase II funcionales, tres o más de cada padre. Por lo tanto, los genes de HLA son muy polimórficos; existen muchos alelos diferentes en los diferentes individuos dentro de una población. Los genes que codifican las proteínas HLA tienen muchas variaciones posibles, lo que permite que el sistema inmunológico de cada persona reaccione ante una amplia variedad de invasores extraños. Algunos genes de HLA tienen cientos de versiones identificadas (alelos), a cada una de las cuales se le asigna un número particular. En algunos casos, los alelos de HLA de clase I son HLA-A*02:01, HLA-B*14:02, HLA-A*23:01, HLA-E*01:01 (no clásico). En algunos casos, los alelos de HLA de clase II son HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 yHLA-DRB*07:01.

Los alelos de HLA específicos del sujeto o el genotipo de HLA de un sujeto pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En casos ilustrativos, los genotipos de HLA se determinan mediante cualquier método descrito en la solicitud de patente internacional número PCT/US2014/068746, publicado el 11 de junio de 2015 como WO2015085147. En resumen, los métodos incluyen determinar los tipos de genes polimórficos que pueden comprender generar una alineación de lecturas extraídas de un conjunto de datos de secuenciación con un conjunto de referencia de genes que comprende variantes alélicas del gen polimórfico, determinar una primera probabilidad posterior o una puntuación derivada de probabilidad posterior para cada variante alélica en la alineación, identificar la variante alélica con una primera probabilidad posterior máxima o una puntuación derivada de probabilidad posterior como una primera variante alélica, identificar una o más lecturas superpuestas que se alinearon con la primera variante alélica y una o más variantes alélicas diferentes, determinar una segunda probabilidad posterior o puntuación derivada de probabilidad posterior para la una o más variantes alélicas adicionales mediante el uso de un factor de ponderación, identificar una segunda variante alélica mediante la selección de la variante alélica con una segunda probabilidad posterior máxima o puntuación derivada de probabilidad posterior, la primera y segunda variante alélica definen el tipo de gen para el gen polimórfico, y proporcionar una salida de la primera y segunda variante alélica.

Como se describe en la presente descripción, existe una gran cantidad de evidencia, tanto en animales como en seres humanos, de que los epítopos mutados son efectivos para inducir una respuesta inmunitaria y que los casos de regresión tumoral espontánea o supervivencia a largo plazo se correlacionan con las respuestas de las células T CD8+ a los epítopos mutados (documentos de Buckwalter y Srivastava PK. "It is the antigen(s), stupid" and other lessons from over a decade of vaccitherapy of human cancer. Seminars in immunology 20:296-300 (2008); Karanikas y otros, High frequency of cytolytic T lymphocytes directed against a tumor-specific mutated antigen detectable with HLAtetramers in the blood of a lung carcinoma patientwith long survival. Cancer Res. 61:3718-3724 (2001); Lennerz y otros, The response of autologous T cells to a human melanoma is dominated by mutated neoantigens. Proc Natl Acad Sci U S A . 102:16013 (2005)) y que la "inmunoedición" puede rastrearse hasta alteraciones en la expresión de antígenos mutados dominantes en ratones y hombres (documentos de Matsushita y otros, Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting Nature 482:400 (2012); DuPage y otros, Expression of tumor-specific antigens underlies cancer immunoediting Nature 482:405 (2012); y Sampson y otros, Immunologic escape after prolonged progression-free survival with epidermal growth factor receptor variant III peptide vaccination in patients with newly diagnosed glioblastoma J Clin Oncol. 28:4722-4729 (2010)).

La tecnología de secuenciación ha revelado que cada tumor contiene múltiples mutaciones específicas del paciente que alteran el contenido de proteínas codificantes de un gen. Tales mutaciones crean proteínas alteradas, que van desde cambios de un único aminoácido (causados por mutaciones con pérdida de sentido) hasta la adición de regiones largas de secuencia de aminoácidos novedosa debido a desplazamientos de marco, lectura sin parada en los codones de terminación o traducción de regiones intrónicas (mutaciones de marco de lectura abierto novedosas; neoORF). Estas proteínas mutadas son dianas valiosas para la respuesta inmunitaria del huésped al tumor ya que, a diferencia de las proteínas nativas, no están sujetas a los efectos inmunodepresores de la autotolerancia. Por lo tanto, es más probable que las proteínas mutadas sean inmunogénicas y también sean más específicas para las células tumorales en comparación con las células normales del paciente.

El término "célula T" incluye células T CD4+ y células T CD8+. El término célula T también incluye células T auxiliares de tipo 1 y células T auxiliares de tipo 2. Las células T, como se usa en la presente descripción, generalmente se clasifican por función y antígenos de superficie celular (antígenos de diferenciación de grupos, o CD), que también facilitan la unión del receptor de células T al antígeno, en dos clases principales: células T auxiliares (T<h>) y linfocitos T citotóxicos (CTL).

Las células T auxiliares (T<h>) maduras expresan la proteína de superficie CD4 y se denominan células T CD4+. Después, del desarrollo de las células T, las células T vírgenes maduras abandonan el timo y comienzan a diseminarse por todo el cuerpo, que incluyen los ganglios linfáticos. Las células T vírgenes son aquellas células T que nunca se han expuesto al antígeno al que están programadas para responder. Al igual que todas las células T, expresan el complejo receptor de células T-CD3. El receptor de células T (TCR) consiste en regiones constantes y variables. La región variable determina a qué antígeno puede responder la célula T. Las células T CD4+ tienen TCR con afinidad por el MHC de clase II, y el CD4 está implicado en la determinación de la afinidad por MHC durante la maduración en el timo. Las proteínas MHC de clase II generalmente solo se encuentran en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC) especializadas. Las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas son principalmente células dendríticas, macrófagos y células B, aunque las células dendríticas son el único grupo de células que expresa MHC de clase II de forma constitutiva (en todo momento). Algunas APC también unen antígenos nativos (o no procesados) a su superficie, tales como las células dendríticas foliculares, pero los antígenos sin procesar no interactúan con las células T y no están implicados en su activación. Los antígenos peptídicos que se unen a las proteínas MHC de clase I típicamente son más cortos que los antígenos peptídicos que se unen a las proteínas MHC de clase II.

Los linfocitos T citotóxicos (CTL), también conocidos como células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o células T asesinas, se refieren a linfocitos que inducen la apoptosis en células diana. Los CTL forman conjugados específicos de antígeno con células diana por medio de la interacción de los TCR con el antígeno (Ag) procesado en las superficies de las células diana, lo que da como resultado la apoptosis de la célula diana. Los cuerpos apoptóticos son eliminados por los macrófagos. El término "respuesta de CTL" se usa para referirse a la respuesta inmunitaria primaria mediada por células CTL. Los linfocitos T citotóxicos tienen receptores de células T (TCR) y moléculas CD8 en su superficie. Los receptores de células T pueden reconocer y unir péptidos en complejo con las moléculas de HLA de clase I. Cada linfocito T citotóxico expresa un receptor de células T único que puede unirse a complejos MHC/péptido específicos. La mayoría de las células T citotóxicas expresan receptores de células T (TCR) que pueden reconocer un antígeno específico. Para que el TCR se una a la molécula de MHC de clase I, el primero debe ir acompañado de una glicoproteína llamada<c>D8, que se une a la porción constante de la molécula de MHC de clase I. Por lo tanto, estas células T se denominan células T CD8+. La afinidad entre CD8 y la molécula de MHC mantiene a la célula T y a la célula diana unidas estrechamente durante la activación específica de antígeno. Las células T CD8+ se reconocen como células T una vez que se activan y generalmente se clasifican con una función citotóxica predefinida dentro del sistema inmunológico. Sin embargo, las células T CD8+ también tienen la capacidad de producir algunas citocinas.

Los "receptores de células T (TCR)" son receptores de superficie celular que participan en la activación de las células T en respuesta a la presentación de antígeno. El TCR generalmente está formado por dos cadenas, alfa y beta, que se ensamblan para formar un heterodímero y se asocian con las subunidades transductoras de CD3 para formar el complejo receptor de células T presente en la superficie celular. Cada cadena alfa y beta del TCR consiste en una región N-terminal variable (V) y constante (C) similar a inmunoglobulina, un dominio transmembrana hidrófobo y una región citoplasmática corta. En cuanto a las moléculas de inmunoglobulina, las regiones variables de las cadenas alfa y beta se generan mediante recombinación V(D)J, lo que crea una gran diversidad de especificidades antigénicas dentro de la población de células T. Sin embargo, a diferencia de las inmunoglobulinas que reconocen antígenos intactos, las células T se activan mediante fragmentos peptídicos procesados en asociación con una molécula de MHC, lo que introduce una dimensión adicional al reconocimiento de antígenos por parte de las células T, conocida como restricción por MHC. El reconocimiento de las disparidades del MHC entre el donante y el receptor a través del receptor de células T conduce a la proliferación de células T y al potencial desarrollo de GVHD. Se ha demostrado que la expresión normal en la superficie del TCR depende de la síntesis y ensamblaje coordinados de los siete componentes del complejo (Ashwell y Klusner 1990). La inactivación de TCRa o TCRp puede dar como resultado la eliminación del TCR de la superficie de las células T, lo que previene el reconocimiento del aloantígeno y, por los tanto, la GVHD. Sin embargo, la alteración del TCR generalmente da como resultado la eliminación del componente de señalización CD3 y altera los medios para la expansión posterior de las células T.

El término "peptidoma HLA" se refiere a un conjunto de péptidos que interactúa específicamente con una clase de HLA particular y puede abarcar miles de secuencias diferentes. Los peptidomas HLA incluyen una diversidad de péptidos, derivados de proteínas tanto normales como anormales expresadas en las células. Por lo tanto, los peptidomas HLA pueden estudiarse para identificar péptidos específicos del cáncer, para el desarrollo de agentes inmunoterapéuticos contra tumores y como fuente de información sobre los esquemas de síntesis y degradación de proteínas dentro de las células cancerosas. En algunos casos, el peptidoma HLA es un conjunto de moléculas de HLA solubles (HLAs). En algunos casos, el peptidoma HLA es un conjunto de HLA de membrana (HLAm).

El término "célula presentadora de antígeno" o "APC" incluye células presentadoras de antígeno profesionales (por ejemplo, linfocitos B, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células de Langerhans), así como también otras células presentadoras de antígeno (por ejemplo, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos, oligodendrocitos, células epiteliales del timo, células epiteliales de tiroides, células gliales (cerebro), células beta pancreáticas y células endoteliales vasculares). Una "célula presentadora de antígeno" o "APC" es una célula que expresa las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y puede presentar un antígeno extraño en complejo con MHC en su superficie.

Proceso de IP universal: Plataforma universal de identificación de complejos HLA monoalélico-péptido

Las respuestas inmunitarias adaptativas dependen, en parte, de la capacidad de las células T CD8+ citotóxicas para identificar y eliminar células que presentan antígenos asociados a enfermedades unidos a moléculas de antígeno leucocitario humano (HLA) de clase I. Las proteínas HLA de clase I (HLA-A, B y C) se expresan en la superficie de casi todas las células nucleadas del cuerpo humano y se requieren para la presentación de péptidos cortos para la detección por receptores de células T CD8+. Los péptidos unidos a HLA surgen de proteínas endógenas o extrañas que se escinden por el proteosoma y las peptidasas del ER antes de su carga y presentación por las proteínas HLA de clase I. Los genes de HLA son los genes más polimórficos de la población humana, con más de 10000 variantes alélicas de HLA de clase I identificadas hasta la fecha (Robinson y otros, 2015). Se estima que cada alelo de HLA se une a y presenta ~1000-10 000 péptidos únicos a las células T; <0,1 % de ~10 millones de péptidos de 9mer potenciales de genes que codifican proteínas humanas (Bassani-Sternberg y otros, 2015; Hunt y otros, 1992; Rammensee y otros, 1995, 1999; Rock y otros; Vita y otros, 2015; Walz y otros, 2015).

A diferencia de la clase I, las proteínas HLA de clase II (HLA-DR, DQ y DP) solo se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC) y en las células de tejidos epitelial, vascular y conectivo en respuesta a señales inflamatorias. La presentación de péptidos, con mayor frecuencia derivados de proteínas exógenas, por parte de moléculas de HLA de clase II a las células T CD4+ se requiere para las respuestas inmunitarias frente a antígenos extraños (Roche y Furuta, 2015). Una vez activadas, las células T CD4+ promueven la diferenciación de células B y la producción de anticuerpos, así como también las respuestas de células T CD8+. Las células T CD4+ también secretan citocinas y quimiocinas que activan e inducen la diferenciación de otras células inmunitarias. Las moléculas de HLA de clase II son heterodímeros de cadenas a y p que interactúan para formar un surco de unión al péptido que es más abierto que los surcos de unión al péptido de clase I (Unanue y otros, 2016). Se cree que los péptidos unidos a moléculas de HLA de clase II tienen un núcleo de unión de 9 aminoácidos con residuos flanqueantes en el lado N o C-terminal que sobresalen del surco (Jardetzky y otros, 1996; Stern y otros, 1994). Estos péptidos por lo general tienen 12-16 aminoácidos de longitud y, a menudo, contienen 3-4 residuos de anclaje en las posiciones P1, P4, P6/7 y P9 del registro de unión (Rossjohn y otros, 2015). Se sabe menos sobre las características de unión a péptidos específicos de alelos de las moléculas de HLA de clase II debido a la heterogeneidad de los pares de cadenas a y p, la complejidad de los datos que limitan la capacidad de asignar con confianza epítopos de unión centrales y la falta de anticuerpos específicos de alelo de calidad para inmunoprecipitación, requeridos para análisis bioquímicos de alta resolución.

Las reglas de unión a péptidos se han estudiado exhaustivamente para un subconjunto de alelos de HLA (Vita y otros, 2015) y se han codificado en algoritmos avanzados basados en redes neuronales que predicen la unión (Hoof y otros, 2009; Lundegaard y otros, 2008). Sin embargo, varios factores limitan el poder de predecir los péptidos presentados en los alelos de HLA. En primer lugar, la procedencia de los datos de los péptidos con los que se entrenan estos algoritmos es diversa, desde el cribado de bibliotecas de péptidos hasta la degradación de Edman y secuenciación basada en espectrometría de masas de péptidos procesados y presentados endógenamente (Boen y otros, 2000; Rammensee y otros, 1995, 1999; Vita y otros, 2015). Las identificaciones de péptidos basadas en espectrometría de masas constituyen alrededor del 30 % de la identificación total en IEDB. La espectrometría de masas se ha convertido en un método deseado de secuenciación de péptidos asociados a HLA debido al trabajo pionero de Donald F. Hunt y sus colegas (Cobbold y otros, 2013; Hunt y otros, 1992; Meadows y otros, 1997; Mohammed y otros, 2008; Zarling y otros, 2000, 2006), así como también mejoras en la instrumentación demostradas por muchos grupos durante las últimas dos décadas (Bassani-Sternberg y otros, 2015; Caron y otros, 2015; Mommen y otros, 2014). En segundo lugar, muchos algoritmos de predicción existentes se han centrado en predecir la unión, pero es posible que no tengan en cuenta completamente los procesos endógenos que generan y transportan los péptidos antes de la unión (Larsen y otros, 2007). En tercer lugar, el número de péptidos de unión para muchos alelos de HLA es demasiado pequeño para desarrollar un predictor confiable. Sin embargo, hasta ahora, la generación de conjuntos de datos de recursos de alta calidad se ha visto obstaculizada por protocolos ineficientes que requieren cantidades prohibitivamente grandes de material celular de entrada y la falta de herramientas de búsqueda en bases de datos para la secuenciación de HLA-péptido (Caron y otros, 2015; Hoof y otros, 2009; Lundegaard y otros, 2008; Vita y otros, 2015).

En la presente descripción se describe una estrategia de enriquecimiento bioquímico única para complejos péptido-HLA de clase I y II a partir de células vivas y lisado celular. Las moléculas de HLA que contienen una secuencia de etiqueta N-terminal o C-terminal (por ejemplo, BAP o HA) pueden marcarse en la superficie celular o en el lisado celular. Por ejemplo, las moléculas de HLA que contienen una secuencia de péptido aceptor de biotina (BAP) N-terminal o C-terminal pueden marcarse enzimáticamente con biotina en la superficie celular o en el lisado celular. Por ejemplo, las moléculas de HLA que contienen una secuencia de Ha N-terminal o C-terminal pueden enriquecerse a partir de mezclas celulares complejas mediante el uso de un anticuerpo específico contra HA. En un caso ilustrativo, los complejos HLA marcado con biotina-péptido se enriquecen a partir de mezclas celulares complejas mediante el uso de perlas de estreptavidina/NeutrAvidina y los complejos HLA-péptido enriquecidos se analizan o caracterizan. En un caso ilustrativo, los complejos HLA marcado con HA-péptido se enriquecen a partir de mezclas celulares complejas mediante el uso de un anticuerpo específico contra HA y los complejos HLA-péptido enriquecidos se analizan o caracterizan. Por ejemplo, los péptidos asociados pueden eluirse y secuenciarse por LC-MS/Ms . Es importante destacar que los métodos descritos en la presente descripción proporcionan una plataforma universal para analizar y caracterizar complejos HLA-péptido. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente descripción proporcionan una plataforma universal para la identificación de péptidos presentados endógenamente a partir de líneas celulares que expresan todas las construcciones II posibles.

En la presente descripción se describen líneas celulares únicas que expresan alelos de HLA de clase I y clase II que permiten asignaciones inequívocas de péptido:alelo (Shimizu y DeMars, 1989; Shimizu y otros, 1986). Esta es una mejora con respecto a los métodos actuales de detección de péptidos unidos a HLA, ya que la mayoría de los estudios basados en MS implican eluir y secuenciar una mezcla desordenada de ligandos unidos a múltiples moléculas de HLA-A, B y C, que requieren predicciones de afinidad y, a veces, deconvolución para las asignaciones de alelos. (Bassani-Sternberg y Gfeller, 2016). Los estudios con líneas celulares transfectadas con HLA soluble han hecho posible la obtención de epítopos de unión a péptidos para un solo alelo HLA, pero los experimentos más completos hasta la fecha han identificado solo <200 péptidos únicos y han requerido varios órdenes de magnitud más de material celular inicial (Hawkins y otros, 2008). Al eliminar la incertidumbre de las asignaciones de péptido:HLA, los métodos descritos en la presente descripción facilitan evaluaciones más profundas y precisas de los ligandomas HLA-péptido y las reglas relacionadas con el procesamiento y la presentación de antígenos peptídicos mediante el uso de menos material celular que los esfuerzos anteriores.

Los métodos y composiciones descritos en la presente descripción incluyen, por ejemplo, cadena p variable marcada químicamente (biotinilación) para diferenciar entre heterodímeros de HLA de clase II presentados por las células, lo que permite un mapeo de epítopos mejorado. En los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse construcciones de HLA de clase I y clase II que contienen una etiqueta, tal como una secuencia peptídica aceptora de biotina (BAP), en el extremo N- o C-terminal. El etiquetado de afinidad N- y C-terminal permite la inmunopurificación selectiva del alelo de HLA a partir de células que expresan HLA endógeno. El etiquetado de afinidad N-terminal permite la inmunopurificación selectiva del alelo de HLA de los complejos presentados en la superficie celular. Por ejemplo, después de la transfección o transducción, la biotinilación N-terminal permite la diferenciación entre los complejos<h>L<a>presentados en la superficie celular frente a todos los complejos HLA-péptido en lisados celulares. Por ejemplo, la biotinilación de complejos HLA-péptido en superficies celulares intactas (sin lisis) permite métodos imparciales de secuenciación por espectrometría de masas (MS) de péptidos procesados y presentados endógenamente. Los métodos de enriquecimiento descritos en la presente descripción, tales como los métodos de enriquecimiento por inmunoprecipitación, permiten un análisis de alto rendimiento de muestras celulares.

En algunos casos, la caracterización comprende caracterizar un péptido unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento.

En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para dos o más alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, los dos o más alelos de HLA de clase I y/o clase II comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 alelos de HLA de clase I y/o clase II.

En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio transmembrana. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio intracelular. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no se excretan. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido no son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles.

En algunos casos, el método comprende además generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA.

En algunos casos, el alelo de HLA de clase II recombinante es un único alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el método comprende: proporcionar una población de células, cada una de las cuales comprende una o más células que comprenden un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde el HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende un polipéptido recombinante diferente codificado por un alelo de HLA diferente unido operativamente a un péptido aceptor de afinidad; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido; y caracterizar un péptido o una porción del mismo unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento.

En algunos casos, el método comprende introducir uno o más péptidos en la población de células.

En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con el uno o más péptidos o expresar el uno o más péptidos en la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ADN. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ARN, opcionalmente en donde el ARN es ARNm.

En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con una enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer, una infección con un agente infeccioso o una reacción autoinmunitaria. En algunos casos, el método comprende introducir el agente infeccioso o porciones del mismo en una o más células de la población de células. En algunos casos, el método comprende caracterizar uno o más péptidos de los complejos HLA-péptido, opcionalmente en donde los péptidos son de una o más proteínas diana del agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende caracterizar una o más regiones de los péptidos de la una o más proteínas diana del agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende identificar péptidos de los complejos HLA-péptido derivados de un agente infeccioso.

En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias. En algunos casos, el alelo de HLA de clase II recombinante es compatible con un sujeto con una enfermedad o afección.

En algunos casos, el método comprende el cribado para la detección de hipersensibilidad a fármacos (por ejemplo, productos biológicos). En algunos casos, el método comprende evaluar si un producto biológico administrado (por ejemplo, un fármaco proteico, peptídico o de tipo anticuerpo), un fragmento de un producto biológico administrado o un fragmento biológico procesado se presenta a las células T. Estos epítopos pueden causar efectos adversos en el sujeto y, por lo tanto, se debe monitorear cómo se procesan los productos biológicos administrados en el sujeto. Por ejemplo, un fármaco contra el VIH (por ejemplo, Abacavir) puede unirse a moléculas de HLA y cambiar los motivos de unión a péptidos para ciertos alelos de HLA (por ejemplo, HLA-B5701).

En algunos casos, el péptido del complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido puede activar una célula T de un sujeto cuando se presenta por una célula presentadora de antígeno. En algunos casos, la caracterización comprende comparar complejos HLA-péptido de células cancerosas con complejos HLA-péptido de células no cancerosas.

En algunos casos, la población de células comprende una pluralidad de poblaciones de células, cada población de células expresa un alelo de HLA de clase II recombinante diferente. En algunos casos, cada población de células de la pluralidad está en un mismo contenedor o en uno independiente.

En algunos casos, el método comprende además aislar los péptidos de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la caracterización. En algunos casos, el método comprende además eliminar uno o más aminoácidos de un extremo terminal de un péptido unido a un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido.

En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular. En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I.

En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante codifica un HLA de clase I. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante codifica un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de HLA de clase II o una de sus combinaciones.

En algunos casos, cada secuencia codifica al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes están unidos operativamente a una secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el método comprende administrar al menos un segundo ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente unido operativamente al mismo péptido aceptor de afinidad o a uno diferente.

En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del alelo de HLA de clase II recombinante.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II recombinante mediante un enlazador.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método no comprende lisar las células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad comprende una secuencia de etiqueta que comprende un péptido aceptor de biotina (bAp ), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta<n>E, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de afinidad se une específicamente a la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la molécula de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la superficie sólida es una perla. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad que se une específicamente al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del HLA de clase II recombinante codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción extracelular del alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica para una porción N-terminal del alelo de HLA de clase II recombinante.

En algunos casos, la secuencia que codifica el HLA de clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase I mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la secuencia que codifica el HLA de clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II mediante un enlazador.

En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad es diferente del primer péptido aceptor de afinidad y se selecciona del grupo que consiste en péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLA<g>, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 y una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, la determinación comprende realizar análisis bioquímicos o espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas en tándem. En algunos casos, la determinación comprende obtener una secuencia peptídica que corresponde a un espectro MS/MS de uno o más péptidos aislados a partir de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos de una base de datos de péptidos; en donde una o más secuencias obtenidas identifican la secuencia del uno o más péptidos.

En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO y THP1. En algunos casos, la línea celular se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-<y>, agentes que alteran el procesamiento de antígenos (tales como inhibidores de peptidasas, inhibidores de proteasoma e inhibidores de TAP) o una de sus combinaciones.

En algunos casos, la base de datos de péptidos es una base de datos de péptidos sin especificidad enzimática, tal como una base de datos sin modificaciones o una base de datos con modificaciones. En algunos casos, el método comprende además buscar en la base de datos de péptidos mediante el uso de una estrategia de búsqueda en base de datos inversa.

En algunos casos, el alelo de HLA es un alelo de HLA mutado.

En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. En algunos casos, el método comprende además realizar un ensayo de expresión del alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el ensayo comprende ensayo comprende secuenciar un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar el a Rn del alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar la proteína del alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, o una de sus combinaciones.

En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para diferentes alelos de HLA. En algunos casos, cada alelo de HLA diferente comprende una secuencia de código de barras única. En algunos casos, cada ácido polinucleico que codifica un alelo de HLA diferente comprende una secuencia de código de barras única. En la presente descripción se proporciona una base de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenida al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una combinación de dos o más bases de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenidas al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción repetidamente, mediante el uso cada vez de un alelo de HLA diferente. En la presente descripción se proporciona un método para generar un algoritmo de predicción para identificar péptidos de unión específica de alelo de HLA, que comprende entrenar una máquina con una base de datos de secuencias peptídicas descrita en la presente descripción o una combinación descrita en la presente descripción. En algunos casos, la máquina combina uno o más modelos lineales, máquinas de vectores de soporte, árboles de decisión y redes neuronales. En algunos casos, una variable usada para entrenar la máquina comprende una o más variables seleccionadas del grupo que consiste en secuencia peptídica, propiedades físicas de los aminoácidos, propiedades físicas de los péptidos, nivel de expresión de la proteína de origen de un péptido dentro de una célula, estabilidad de proteínas, tasa de traducción de proteínas, sitios de ubiquitinación, tasa de degradación de proteínas, eficiencias de traducción del perfil ribosómico, capacidad de escisión de proteínas, localización de proteínas, motivos de la proteína del huésped que facilitan el transporte de TAP, la proteína del huésped se somete a autofagia, motivos que favorecen el estancamiento ribosomal y características de las proteínas que favorecen NMD. En algunos casos, los motivos que favorecen el estancamiento ribosomal comprenden tramos de poliprolina o polilisina. En algunos casos, las características de las proteínas que favorecen NMD se seleccionan del grupo que consiste en una UTR 3' larga, un codón de parada mayor que 50 nt aguas arriba de la última unión exón:exón y capacidad de escisión de péptidos. En la presente descripción se proporciona un método para identificar péptidos de unión específica de alelo de HLA que comprende analizar la secuencia de un péptido con una máquina que se ha entrenado con una base de datos de secuencias peptídicas obtenida al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción para el alelo de HLA. En algunos casos, el método comprende determinar el nivel de expresión de la proteína de origen del péptido dentro de una célula; y en donde la expresión de la proteína de origen es una variable predictiva usada por la máquina. En algunos casos, el nivel de expresión se determina por medición de la cantidad de proteína de origen o la cantidad de ARN que codifica dicha proteína de origen.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un ácido polinucleico recombinante que comprende dos o más secuencias, cada una de las cuales codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde las secuencias que codifican los HLA etiquetados con aceptor de afinidad comprenden (a) una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase I recombinante diferente, (b) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, (c) una secuencia que codifica p2 microglobulina; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un ácido polinucleico recombinante que comprende dos o más secuencias, cada una de las cuales comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde las secuencias que codifican los HLA etiquetados con aceptor de afinidad comprenden (a) una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase II recombinante, (b) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, (c) una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente. En algunos casos, el ácido polinucleico recombinante se aísla. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en H<l>A-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.

En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica la molécula aceptora de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del alelo de HLA recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA recombinante.

En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el alelo de HLA recombinante mediante un enlazador.

En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad se expresan a partir del mismo polinucleótido. En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad se expresan a partir de diferentes polinucleótidos.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se une específicamente a una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprenden dos o más péptidos aceptores de afinidad. En algunos casos, las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprenden tres o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde al menos dos de las tres o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprenden el mismo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, los dos o más péptidos aceptores de afinidad son únicos para cada una de las dos o más secuencias que codifican un HLA etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se selecciona del grupo que consiste en péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 y una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente a una molécula de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con una secuencia de aminoácidos del HLA de clase II recombinante.

En algunos casos, para dos o más de los ácidos polinucleicos recombinantes: la secuencia que codifica el HLA etiquetado con aceptor de afinidad se integra de forma estable al genoma de una célula.

En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad comprende una etiqueta de HA. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica el HLA recombinante y el péptido aceptor de afinidad mediante un enlazador. En algunos casos, el enlazador comprende una secuencia de ácido polinucleico que codifica un enlazador escindible. En algunos casos, el enlazador escindible es un sitio de omisión ribosomal o un elemento del sitio de entrada ribosomal interno (IRES). En algunos casos, el sitio de omisión ribosomal o IRES se escinde cuando se expresa en las células. En algunos casos, el sitio de omisión ribosomal se selecciona del grupo que consiste en F2A, T2A, P2A y E2A. En algunos casos, el elemento IRES se selecciona de secuencias IRES celulares o virales comunes.

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos y uno o más alelos de HLA de clase II endógenos.

En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular. En algunos casos, la composición se formula mediante el uso de péptidos o ácidos polinucleicos que codifican péptidos específicos para un tipo HLA de un paciente.

En la presente descripción se proporciona un método para producir una célula que comprende transducir o transfectar dos o más células con los dos o más ácidos polinucleicos de una composición descrita en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una célula que comprende una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En algunos casos, la célula presenta el péptido como un complejo HLA-péptido. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar a un mamífero que tiene una enfermedad que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de una célula que comprende un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido descrito en la presente descripción.

En algunos casos, la enfermedad es cáncer. En algunos casos, la enfermedad es una infección por un agente infeccioso. En algunos casos, el agente infeccioso es un patógeno, opcionalmente un virus o una bacteria, o un parásito. En algunos casos, el virus se selecciona del grupo que consiste en: Virus BK (BKV), virus del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovirus (CMV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de Epstein-Barr (EBV), un adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotrófico de células T humanas (HTLV-1), un virus de la influenza, RSV, HPV, rabia, virus de la rubéola paperas, poliovirus, fiebre amarilla, hepatitis A, hepatitis B, rotavirus, virus de la varicela, virus del papiloma humano (HPV), viruela, zóster y cualquiera de sus combinaciones. En algunos casos, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en: Klebsiella spp., Tropheryma Whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosis y Mycobacterium tuberculosis, tifoidea, neumococo, meningococo, haemophilus B, ántrax, toxoide tetánico, meningococo del grupo B, bcg, cólera y cualquiera de sus combinaciones. En algunos casos, el parásito es un helminto o un protozoo. En algunos casos, el parásito se selecciona del grupo que consiste en: Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp. y cualquiera de sus combinaciones.

Enriquecimiento de complejos HLA-péptido

Los genes que codifican las glicoproteínas HLA de clase I y clase II se encuentran entre las secuencias codificantes más polimórficas del genoma humano. Sin embargo, existen regiones relativamente constantes o invariables para cada una de las cadenas pesadas de HLA de clase I y las cadenas a y p de HLA de clase II a las que pueden dirigirse los anticuerpos para capturar selectivamente cualquier cadena pesada de HLA de clase I o cadena a o p de HLA de clase II. Sin embargo, dado que las cadenas a y p normalmente se asocian entre síin vivo,la inmunopurificación de la cadena a de un HLA soluble intacto puede coprecipitar la cadena p y viceversa. Los anticuerpos anti-HLA de clase II con el propósito de enriquecer en los polipéptidos asociados a HLA pueden reconocer epítopos conservados presentados en la cadena a o p.

El método de enriquecimiento que emplea anticuerpos específicos de alelo de HLA o que utiliza reactivos específicos no HLA se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos HLA-C típicamente se expresan en los individuos en niveles más bajos que HLA-A y HLA-B. En consecuencia, para mejorar la detección de HLA-C mediante el uso de anticuerpos, puede ser ventajoso proporcionar una inmunopurificación específica de HLA-C mediante el uso de un anticuerpo específico de HLA-C, además de otros métodos de purificación. Están disponibles comercialmente numerosos ejemplos de anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen específicamente a cadenas de HLA individuales.

En la presente descripción se proporciona un proceso de inmunopurificación (IP) universal para enriquecer en uno o más complejos polipeptídicos de HLA monoalélico. Ilustrativo de un método de este tipo para enriquecer un polipéptido asociado a HLA es un método que comprende una etapa de inmunopurificación. El proceso de IP universal comprende construcciones de IP universal que consisten en una construcción de ADN que codifica alelos de HLA de clase II con etiqueta de afinidad que se expresan a partir de un vector de expresión por medio de transfección o transducción celular. Un ejemplo no limitante de un vector de expresión es un vector lentiviral.

Las células transfectadas o transducidas con construcciones de IP universal se expandieron o seleccionaron y después se expandieron antes de los análisis de secuencia por LC-MS/MS. Las poblaciones de células adecuadas para la transfección o transducción incluyen, por ejemplo, líneas celulares deficientes en clase I en las que se expresa un único alelo de HLA de clase I, líneas celulares deficientes en clase II en las que se expresa un único par de alelos de HLA de clase II, o líneas celulares deficientes en clase I y clase II en las que se expresa un único alelo de HLA de clase I y/o un único par de alelos de clase II. Como caso ilustrativo, la línea celular B deficiente de clase I es B721.221. En algunos casos, las células son A375, o HEK293T, HeLa o expi293. Sin embargo, es evidente para un experto que pueden generarse otras poblaciones de células que sean deficientes en clase I y/o clase II. En la técnica se conocen métodos para generar células deficientes en clase I y/o clase II, así como también líneas celulares deficientes en clase I y/o clase II, y un método ilustrativo para eliminar/inactivar genes de clase II endógenos incluye la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9 en, por ejemplo, células THP-1. En algunos casos, las poblaciones de células son células presentadoras de antígeno profesionales, tales como macrófagos, células B y células dendríticas. Las células pueden ser células B o células dendríticas. En algunos casos, las células son células tumorales o células de una línea celular tumoral. En algunos casos, las células son células aisladas de un paciente. En algunos casos, las células contienen un agente infeccioso o una porción del mismo.

En algunos casos, las construcciones de IP universal comprenden construcciones de HLA de clase II que comprenden una etiqueta aceptora de afinidad y una molécula de afinidad. En algunos casos, las construcciones de IP universal comprenden al menos una etiqueta aceptora de afinidad de unión específica y una molécula de afinidad. En algunos casos, una etiqueta aceptora de afinidad es etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta cmyc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAg , etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G derivada de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular o una etiqueta de V5 derivada de un epítopo pequeño (Pk) que se encuentra en las proteínas P y V del paramixovirus de virus del simio 5 (SV5). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad puede incluir múltiples repeticiones de la secuencia de etiqueta (por ejemplo etiqueta de polihistidina 3x, etiqueta FLAG 3x). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad puede incluir múltiples repeticiones de la secuencia de etiqueta (por ejemplo etiqueta de polihistidina 3x, etiqueta FLAg 3x). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad es una "etiqueta epitópica", que es un tipo de etiqueta peptídica que añade un epítopo reconocible (sitio de unión al anticuerpo) al HLA-proteína para proporcionar la unión del anticuerpo correspondiente, de esta manera permite la identificación o purificación por afinidad de la proteína etiquetada. Un ejemplo no limitante de una etiqueta epitópica es la proteína A o la proteína G, que se une a IgG. En algunos casos, las etiquetas aceptoras de afinidad incluyen la secuencia del péptido aceptor de biotina (BAP) o del péptido hemaglutinina (HA) de influenza humana. El experto conoce y puede imaginar otros numerosos restos de etiquetas, y se contemplan en la presente descripción. Puede usarse cualquier etiqueta peptídica siempre que pueda expresarse como un elemento de un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

Las etiquetas de afinidad pueden colocarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del alelo de HLA. Una secuencia de escisión, tal como F2A, o un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) puede colocarse entre la cadena a y la p2-microglobulina (clase I) o entre la cadena a y la cadena p (clase II). En algunos casos, un único alelo deHLAde clase I es HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 y HLA-B*14:02, o HLA-E*01:01, y un alelo deHLAde clase II es HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 y HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01, o HLA-DRB*07:01. En algunos casos, la secuencia de escisión es una secuencia T2A, P2A, E2A o F2A. Por ejemplo, la secuencia de escisión puede ser E G R G S L L T C G D V E E N P G P (T2A), A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (P2A), Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (E2A) o V K Q T LNFDLLKLAGDVESNPGP(F2A).

En algunos casos, la inmunopurificación del complejo HLA-péptido se basa en biotina. En algunos casos, la inmunopurificación del complejo HLA-péptido se basa en estreptavidina o neutravidina. En algunos casos, los complejos HLA-péptido también pueden enriquecerse a partir de una muestra biológica mediante técnicas de cromatografía, tales como HPLC. En algunos casos, el agotamiento de proteínas séricas de alta abundancia puede usarse para enriquecer los complejos HLA-péptido. En algunos casos, los métodos para eliminar proteínas séricas abundantes incluyen ligandos colorantes (para albúmina), proteínas A y G (para Y-globulinas) o anticuerpos específicos que se unen con alta afinidad y agotan selectivamente estas especies de la muestra (Govorukhina, Reijmers y otros, 2006). Tales estrategias aumentarían la cantidad de secuencias peptídicas derivadas de HLA identificadas en un único análisis de espectrometría de masas.

El grado de enriquecimiento conveniente para optimizar la resolución de secuencias de HLA particulares de una muestra biológica dependerá de la concentración inicial de la secuencia de HLA en la muestra biológica y de la concentración y naturaleza de otras proteínas no HLA en la muestra.

Para enriquecer los complejos HLA-péptido dentro de una muestra biológica, pueden usarse técnicas clásicas de purificación de proteínas solas o en combinación con los métodos del proceso de IP universal proporcionados en la presente descripción. Las técnicas clásicas de separación (purificación) de proteínas se basan en; diferencias de tamaño (ultrafiltración, filtración en gel o cromatografía de exclusión por tamaño); diferencias de carga (pi) (cromatografía de intercambio aniónico/catiónico o cromatografía de interacciones hidrófobas); y combinaciones de diferencias de tamaño y carga (electroforesis 1D o 2D). Las opciones de inmunopurificación incluyen el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales que se unen específicamente a las proteínas HLA. Otras opciones de purificación por afinidad de proteínas implican el uso de proteínas conocidas por unirse a HLA, estas incluyen; CD8, que se une al dominio a3 de todas las proteínas HLA de clase I; CD4 que se une a todas las proteínas HLA de clase ll; receptores autólogos de células T; y péptidos antigénicos que se unen a HLA con alta afinidad (pueden usarse algoritmos de modelado por ordenador para predecir las características de unión de péptido/HLA). Cualquiera de estas opciones de proteínas de alta afinidad por HLA puede inmovilizarse sobre un soporte sólido insoluble para preparar una matriz de afinidad que puede usarse para capturar el HLA de una muestra biológica líquida. Las condiciones de elución adecuadas darán como resultado la concentración y purificación (aislamiento) del contenido de HLA de la muestra.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método no comprende lisar las células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el enriquecimiento no comprende el uso de un reactivo tetramérico.

Antígenos específicos de una enfermedad

En algunos casos, el tamaño de al menos una molécula de péptido antigénico puede comprender, pero no se limita a, alrededor de 8, alrededor de 9, alrededor de 10, alrededor de 11, alrededor de 12, alrededor de 13, alrededor de 14, alrededor de 15, alrededor de 16, alrededor de 17, alrededor de 18, alrededor de 19, alrededor de 20, alrededor de 21, alrededor de 22, alrededor de 23, alrededor de 24, alrededor de 25, alrededor de 26, alrededor de 27, alrededor de 28, alrededor de 29, alrededor de 30, alrededor de 31, alrededor de 32, alrededor de 33, alrededor de 34, alrededor de 35, alrededor de 36, alrededor de 37, alrededor de 38, alrededor de 39, alrededor de 40, alrededor de 41, alrededor de 42, alrededor de 43, alrededor de 44, alrededor de 45, alrededor de 46, alrededor de 47, alrededor de 48, alrededor de 49, alrededor de 50, alrededor de 60, alrededor de 70, alrededor de 80, alrededor de 90, alrededor de 100, alrededor de 110, alrededor de 120 o más residuos de moléculas de amino, y cualquier intervalo que pueda obtenerse en los mismos.

En algunos casos, las moléculas de péptidos antigénicos son iguales a o menores que 50 aminoácidos. En algunos casos, las moléculas de péptidos antigénicos son iguales a alrededor de 20 a alrededor de 30 aminoácidos. Un péptido más largo puede diseñarse de varias maneras. Por ejemplo, cuando se predicen o se conocen las regiones de unión a HLA, un péptido más largo puede consistir en: péptidos de unión individuales con una extensión de 0-10 aminoácidos hacia los extremos N- y C-terminal de cada producto génico correspondiente. Un péptido más largo también puede consistir en una concatenación de algunos o todos los péptidos de unión con secuencias extendidas para cada uno. En otro caso, cuando la secuenciación revela una secuencia de epítopo larga (>10 residuos) presente en el tejido enfermo (por ejemplo debido a un desplazamiento del marco, lectura sin parada o inclusión de intrones que conduce a una nueva secuencia peptídica), un péptido más largo puede consistir en el tramo completo de nuevos aminoácidos específicos de una enfermedad. En ambos casos, el uso de un péptido más largo requiere un procesamiento endógeno por parte de células presentadoras de antígeno profesionales, tales como las células dendríticas, y puede conducir a una presentación de antígeno más eficaz y a la inducción de respuestas de células T. En algunos casos, la secuencia extendida se altera para mejorar las propiedades bioquímicas del polipéptido (propiedades tales como solubilidad o estabilidad) o para mejorar la posibilidad de un procesamiento proteasómico eficiente del péptido.

Los péptidos y polipéptidos antigénicos pueden unirse a una proteína HLA. En algunos casos, los péptidos antigénicos pueden unirse a una proteína HLA con mayor afinidad que un péptido nativo/de tipo salvaje correspondiente. El péptido antigénico puede tener una IC50 de alrededor de menos de 1000 nM, alrededor de menos de 500 nM, alrededor de menos de 250 nM, alrededor de menos de 200 nM, alrededor de menos de 150 nM, alrededor de menos de 100 nM o alrededor de menos de 50 nM. En algunos casos, los péptidos antigénicos no inducen una respuesta autoinmunitaria y/o invocan tolerancia inmunológica cuando se administran a un sujeto.

La presente descripción también proporciona composiciones que comprenden una pluralidad de péptidos antigénicos. La referencia a péptidos antigénicos incluye cualquier modalidad de suministro adecuada que pueda dar como resultado la introducción del péptido en la célula de un sujeto (por ejemplo, ácido nucleico). En algunos casos, la composición comprende al menos 3 o más péptidos antigénicos. En algunos casos, la composición contiene al menos alrededor de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 o 50 péptidos distintos. En algunos casos, la composición contiene al menos 20 péptidos distintos. En algunos casos, la composición contiene a lo máximo 20 péptidos distintos. De acuerdo con la presente descripción, 2 o más de los péptidos distintos pueden derivarse del mismo polipéptido. Por ejemplo, si una mutación antigénica codifica un polipéptido, dos o más de los péptidos antigénicos pueden derivarse del polipéptido. En un caso, los dos o más péptidos antigénicos derivados del polipéptido pueden comprender una matriz en mosaico que abarca el polipéptido (por ejemplo, los péptidos antigénicos pueden comprender una serie de péptidos antigénicos superpuestos que abarcan una parte, o la totalidad, del polipéptido). Los péptidos antigénicos pueden derivarse de cualquier gen codificante de proteínas. Los péptidos antigénicos pueden derivarse de mutaciones en cáncer humano o de un agente infeccioso o una enfermedad autoinmunitaria.

Los péptidos, polipéptidos y análogos antigénicos pueden modificarse además de modo que contengan restos químicos adicionales que normalmente no forman parte de la proteína. Esos restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, la vida media biológica, la absorción de la proteína o la afinidad de unión. Los restos pueden también reducir o eliminar cualquier efecto secundario conveniente de las proteínas y similares. Una visión general de esos restos puede encontrarse en el documento Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, Mack Publishing Co., Easton, PA (2000). Por ejemplo, los péptidos y polipéptidos antigénicos que tienen la actividad deseada pueden modificarse según sea necesario para proporcionar ciertos atributos deseados, por ejemplo características farmacológicas mejoradas, mientras se aumenta o al menos se retiene sustancialmente toda la actividad biológica del péptido no modificado para unirse a la molécula de MHC deseada y activar la célula T apropiada. Por ejemplo, el péptido y los polipéptidos antigénicos pueden estar sujetos a diversos cambios, tales como sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, donde tales cambios podrían proporcionar ciertas ventajas en su uso, tales como una unión al MHC mejorada. Tales sustituciones conservadoras pueden abarcar la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que sea biológica y/o químicamente similar, por ejemplo, un residuo hidrófobo por otro, o un residuo polar por otro. El efecto de las sustituciones de un único aminoácido también se puede investigar mediante el uso de D-aminoácidos. Tales modificaciones pueden realizarse mediante el uso de procedimientos de síntesis de péptidos bien conocidos, como se describe, por ejemplo, en los documentos de Merrifield, Science 232:341-347 (1986), Barany & Merrifield, The Peptides, Gross & Meienhofer, eds. (Nueva York, Academic Press), pág. 1-284 (1979); y Stewart & Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (Rockford, III., Pierce), 2da ed. (1984).

El péptido antigénico también puede modificarse al extender o disminuir la secuencia de aminoácidos del compuesto, por ejemplo, mediante la adición o eliminación de aminoácidos. Los péptidos, polipéptidos o análogos antigénicos también pueden modificarse mediante la alteración del orden o la composición de ciertos residuos. El experto apreciará que ciertos residuos de aminoácidos esenciales para la actividad biológica, por ejemplo, aquellos en sitios de contacto críticos o residuos conservados, generalmente no pueden alterarse sin un efecto adverso sobre la actividad biológica. Los aminoácidos no críticos no necesitan limitarse a los que se encuentran naturalmente en las proteínas, tales como los L-a-aminoácidos, o sus isómeros D, sino que también pueden incluir aminoácidos no naturales, tales como p-Y-6-aminoácidos, así como también muchos derivados de L-a-aminoácidos.

Un péptido antigénico puede optimizarse mediante el uso de una serie de péptidos con sustituciones de un único aminoácido para determinar el efecto de la carga electrostática, la hidrofobicidad, etc. sobre la unión al MHC. Por ejemplo, puede realizarse una serie de sustituciones de aminoácidos cargados positivamente (por ejemplo, Lys o Arg) o cargados negativamente (por ejemplo, glu) a lo largo de la longitud del péptido, lo que revela diferentes patrones de sensibilidad hacia diversas moléculas de MHC y receptores de células T. Además, pueden emplearse múltiples sustituciones mediante el uso de restos pequeños relativamente neutros tales como Ala, Gly, Pro o residuos similares. Las sustituciones pueden ser homooligómeros o heterooligómeros. El número y los tipos de residuos que se sustituyen o añaden dependen de la separación necesaria entre los puntos de contacto esenciales y ciertos atributos funcionales que se buscan (por ejemplo, hidrofobicidad versus hidrofilicidad). Mediante tales sustituciones también puede lograrse una mayor afinidad de unión por una molécula de MHC o un receptor de células T, en comparación con la afinidad del péptido original. En cualquier caso, tales sustituciones deberían emplear residuos de aminoácidos u otros fragmentos moleculares elegidos para evitar, por ejemplo, interferencia estérica y de carga que podría alterar la unión. Típicamente, las sustituciones de aminoácidos son de residuos únicos. Se pueden combinar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquiera de sus combinaciones para llegar a un péptido final.

Un péptido antigénico puede modificarse para proporcionar los atributos deseados. Por ejemplo, la capacidad de los péptidos para inducir la actividad de CTL puede mejorarse mediante enlace a una secuencia que contiene al menos un epítopo que puede inducir una respuesta de células T auxiliares. En algunos casos, los conjugados de péptidos inmunogénicos/T auxiliares están unidos por una molécula separadora. En algunos casos, un separador comprende moléculas neutras relativamente pequeñas, tales como aminoácidos o miméticos de aminoácidos, sustancialmente sin carga en condiciones fisiológicas. Los separadores pueden seleccionarse de, por ejemplo, Ala, Gly u otros separadores neutros de aminoácidos no polares o aminoácidos polares neutros. Se debe entender que no es necesario que el separador opcionalmente presente esté compuesto por los mismos residuos y, por lo tanto, puede ser un hetero- u homooligómero. El péptido antigénico puede unirse al péptido de T auxiliar directamente o por medio de un separador en el extremo amino o carboxi del péptido. El extremo amino terminal del péptido antigénico o del péptido de T auxiliar puede estar acilado. Los péptidos de T auxiliar ilustrativos incluyen el toxoide tetánico 830-843, la influenza 307-319, el circumsporozoito de malaria 382-398 y 378-389.

Líneas celulares con HLA monoalélico

Puede generarse una línea celular monoalélica que expresa un único alelo de HLA de clase I, un único par de alelos de HLA de clase II o un único alelo de HLA de clase I y un único par de alelos de HLA de clase II mediante la transducción o transfección de una población de células adecuada con un ácido polinucleico, por ejemplo, un vector que codifica un único alelo de HLA. Las poblaciones de células adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares deficientes en clase I en las que se expresa un único alelo de HLA de clase I, líneas celulares deficientes en clase II en las que se expresa un único par de alelos de HLA de clase II, o líneas celulares deficientes en clase I y clase II en las que se expresa un único alelo de HLA de clase I y/o un único par de alelos de clase II. Como caso ilustrativo, la línea celular B deficiente de clase I es B721.221. Sin embargo, es evidente para un experto que pueden generarse otras poblaciones de células que sean deficientes en clase I y/o clase II. Un método ilustrativo para eliminar/inactivar genes de clase II endógenos incluye la edición del genoma mediada por CRISPR-Cas9 en, por ejemplo, células THP-1. En algunos casos, las poblaciones de células son células presentadoras de antígeno profesionales, tales como macrófagos, células B y células dendríticas. Las células pueden ser células B o células dendríticas. En algunos casos, las células son células tumorales o células de una línea celular tumoral. En algunos casos, las células son células aisladas de un paciente. En algunos casos, las células contienen un agente infeccioso o una porción del mismo. En algunos casos, la población de células comprende al menos 107 células. En algunos casos, la población de células se modifica adicionalmente, tal como mediante el aumento o la disminución de la expresión y/o actividad de al menos un gen. En algunos casos, el gen codifica un miembro del inmunoproteasoma. Se sabe que el inmunoproteasoma está implicado en el procesamiento de péptidos de unión a HLA de clase I e incluye las subunidades LMP2 (p1i),<m>E<c>L-1 (p2i) y LMP7 (p5i). El inmunoproteasoma también puede inducirse por interferón gamma. En consecuencia, en algunos casos, la población de células puede ponerse en contacto con una o más citocinas, factores de crecimiento u otras proteínas. Las células pueden estimularse con citocinas inflamatorias tales como interferón gamma, IL-10, IL-6 y/o TNF-a. La población de células también puede someterse a diversas condiciones ambientales, tales como estrés (estrés por calor, falta de oxígeno, falta de glucosa, agentes que dañan el ADN, etc.). En algunos casos, las células se ponen en contacto con uno o más fármacos quimioterápicos, radiación, terapias dirigidas e inmunoterapia. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para estudiar el efecto de diversos genes o condiciones sobre el procesamiento y la presentación de péptidos HLA. En algunos casos, las condiciones usadas se seleccionan de manera que sean compatibles con el estado del paciente para el cual se va a identificar la población de péptidos HLA.

Un único alelo de HLA de la presente descripción puede codificarse y expresarse mediante el uso de un sistema basado en virus (por ejemplo, un sistema de adenovirus, un vector de virus adenoasociado (AAV), un poxvirus o un lentivirus). Los plásmidos que pueden usarse para el suministro de virus adenoasociados, adenovirus y lentivirus se han descrito previamente (ver por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,955,808 y 6,943,019, y la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20080254008). Entre los vectores que pueden usarse en la práctica de la presente descripción, la integración en el genoma huésped de una célula es posible con métodos de transferencia de genes de retrovirus, lo que a menudo da como resultado una expresión a largo plazo del transgén insertado. En un caso ilustrativo, el retrovirus es un lentivirus. Adicionalmente, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes. El tropismo de un retrovirus puede alterarse mediante la incorporación de proteínas de envoltura extrañas, lo que expande la población diana potencial de células diana. También puede manipularse un retrovirus para permitir la expresión condicional del transgén insertado, de manera que el lentivirus solo infecte ciertos tipos de células. Pueden usarse promotores específicos del tipo de célula para dirigirse a la expresión en tipos de células específicos. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales (y por lo tanto, en la práctica de la presente descripción pueden usarse tanto vectores lentivirales como retrovirales). Por otra parte, los vectores lentivirales pueden transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen títulos virales elevados. En la Figura 3 se muestra un vector lentiviral ilustrativo que puede usarse para generar líneas celulares estables transducidas para expresar HLA de clase I y clase II.

La selección de un sistema retroviral de transferencia de genes puede depender del tejido diana. Los vectores retrovirales están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis y tienen capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas que actúan en cis son suficientes para la replicación y el empaquetado de los vectores, que después se usan para integrar el ácido nucleico deseado en la célula diana para proporcionar una expresión permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados que pueden usarse en la práctica de la presente descripción incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones (ver, por ejemplo, los documentos de Buchscher y otros, (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann y otros, (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommnerfelt y otros, (1990) Virol.

176:58-59; Wilson y otros, (1998) J. Virol. 63:2374-2378; Miller y otros, (1991) J. Virol. 65:2220-2224; documento PCT/US94/05700). Además, en la práctica de la presente descripción es útil un vector lentiviral mínimo no relacionado con primates, tal como un vector lentiviral basado en el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) (ver, por ejemplo,el documento de Balagaan, (2006) J Gene Med; 8: 275 - 285, publicado en línea el 21 de noviembre de 2005 en Wiley InterScience DOI: 10.1002/jgm.845). Los vectores pueden tener un promotor de citomegalovirus (CMV) que controle la expresión del gen diana. En consecuencia, la presente descripción contempla entre los vectores útiles en la práctica de la presente descripción: vectores virales, que incluyen vectores retrovirales y vectores lentivirales.

Cualquier alelo de HLA puede expresarse en la población de células. En un caso ilustrativo, el alelo de HLA es un alelo de HLA de clase I. En algunos casos, el alelo de HLA de clase I es un alelo HLA-A o un alelo HLA-B. En algunos casos, el alelo de HLA es un alelo de HLA de clase II. Las secuencias de alelos de HLA de clase I y clase II pueden encontrarse en la base de datos IPD-IMGT/HLA. Los alelos de HLA ilustrativos incluyen, pero no se limitan a,HLA-A*02:01, HLA-B*14:02,HLA-A*23:01, HLA-MI*01:01, HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02, HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 y HLA-DRB *07:01.

En algunos casos, el alelo de HLA se selecciona de manera que corresponda a un genotipo de interés. En algunos casos, el alelo de HLA es un alelo de HLA mutado, que puede ser un alelo de origen no natural o un alelo de origen natural en un paciente afectado. Los métodos descritos en la presente descripción tienen la ventaja adicional de identificar péptidos de unión a HLA para alelos de HLA asociados con diversos trastornos, así como también alelos que están presentes con baja frecuencia. En consecuencia, en algunos casos, el alelo de HLA está presente con una frecuencia de menos del 1 % dentro de una población, tal como dentro de la población caucásica.

En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el alelo de HLA comprende además una etiqueta aceptora de afinidad que puede usarse para inmunopurificar el HLA-proteína. Las etiquetas adecuadas se conocen bien en la técnica. En algunos casos, una etiqueta aceptora de afinidad es etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G derivada de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular o una etiqueta de V5 derivada de un epítopo pequeño (Pk) que se encuentra en las proteínas P y V del paramixovirus de virus del simio 5 (SV5). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad es una "etiqueta epitópica", que es un tipo de etiqueta peptídica que añade un epítopo reconocible (sitio de unión al anticuerpo) al HLA-proteína para proporcionar la unión del anticuerpo correspondiente, de esta manera permite la identificación o purificación por afinidad de la proteína etiquetada. Un ejemplo no limitante de una etiqueta epitópica es la proteína A o la proteína G, que se une a IgG. En algunos casos, las etiquetas aceptoras de afinidad incluyen la secuencia del péptido aceptor de biotina (BAP) o del péptido hemaglutinina (HA) de influenza humana. El experto conoce y puede imaginar otros numerosos restos de etiquetas, y se contemplan en la presente descripción. Puede usarse cualquier etiqueta peptídica siempre que pueda expresarse como un elemento de un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

Los métodos proporcionados en la presente descripción comprenden aislar complejos HLA-péptido de las células transfectadas o transducidas con construcciones de HLA de IP universal. En algunos casos, los complejos pueden aislarse mediante el uso de técnicas de inmunoprecipitación estándar conocidas en la técnica con anticuerpos disponibles comercialmente. Las células se pueden lisar primero. Los complejos HLA de clase I-péptido pueden aislarse mediante el uso de anticuerpos específicos de HLA de clase I, tales como el anticuerpo W6/32, mientras que los complejos de HLA de clase II-péptido pueden aislarse mediante el uso de anticuerpos específicos de HLA de clase II, tales como el anticuerpo monoclonal M5/114.15.2. En algunos casos, el único (o un par de) alelo(s) de HLA se expresa(n) como una proteína de fusión con una etiqueta peptídica y los complejos HLA-péptido se aíslan mediante el uso de moléculas de unión que reconocen las etiquetas peptídicas.

Los métodos comprenden además aislar péptidos de dichos complejos HLA-péptido y secuenciar los péptidos. Los péptidos se aíslan del complejo mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, tal como elución con ácido. Si bien puede usarse cualquier método de secuenciación, en algunos casos se utilizan métodos que emplean espectrometría de masas, tales como cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS o LC-MS/MS, o alternativamente HPLC-MS o HPLC-MS/MS). El experto conoce bien estos métodos de secuenciación y se reseñan en el documento de Medzihradszky KF y Chalkley Rj . Mass Spectrom Rev. 2015 enero-febrero;34(1):43-63.

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos o una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células comprende células que se han enriquecido o clasificado, tal como mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). En algunos casos, se usa la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para clasificar la población de células. En algunos casos, la población de células se clasifica previamente mediante FACS en cuanto a la expresión en la superficie celular de HLA de clase II o de HLA de clase I y de clase II. Por ejemplo, puede usarse FACS para clasificar la población de células en cuanto a la expresión en la superficie celular de un alelo de HLA de clase I, un alelo de HLA de clase II o una de sus combinaciones.

Bibliotecas de construcciones de HLA etiquetado con aceptor de afinidad

El término "biblioteca", como se usa en la presente descripción, se refiere a una colección de moléculas de ácidos nucleicos (circulares o lineales). En un caso, una biblioteca puede comprender una pluralidad (es decir, dos o más) de moléculas de ácidos nucleicos, que pueden ser de un organismo, órgano, tejido o célula de origen común. En algunos casos, una biblioteca es representativa de la totalidad o una porción o una porción significativa del contenido de ácidos nucleicos de un organismo (una biblioteca "genómica"), o un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos representativas de la totalidad o una porción o una porción significativa de las moléculas de ácidos nucleicos expresadas (una biblioteca de ADNc o segmentos derivados de los mismos) en una célula, tejido, órgano u organismo. Una biblioteca también puede comprender secuencias aleatorias obtenidas mediante síntesis de novo, mutagénesis de una o más secuencias y similares. Tales bibliotecas pueden estar contenidas en uno o más vectores. Una biblioteca de construcciones de HLA etiquetado con aceptor de afinidad como se proporciona en la presente descripción comprende una secuencia de ADN que codifica elementos de un alelo de<h>L<a>, un péptido aceptor de afinidad o un enlazador. Las técnicas de biología molecular apropiadas pueden encontrarse en el documento de Sambrook y otros, (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Se han descrito varios métodos para facilitar la clonación de segmentos de ácidos nucleicos, por ejemplo, como en las siguientes referencias: Ferguson, J., y otros, Gene 16:191 (1981) y Hashimoto-Gotoh, T., y otros, Gene 41:125 (1986). El experto en las técnicas aplicables generalmente entenderá otros términos usados en los campos de la tecnología de ácidos nucleicos recombinantes y la biología molecular y celular como se usa en la presente descripción.

Los diversos elementos o dominios de un alelo de HLA recombinante pueden disponerse en cualquier orden entre los extremos N-terminal y C-terminal del alelo de HLA recombinante. Un elemento o dominio que está más cerca del extremo N-terminal de un polipéptido recombinante codificado a partir de un alelo de HLA recombinante que otro elemento o dominio se dice que es "N-terminal" del otro elemento o dominio. De manera similar, un elemento o dominio que está más cerca del extremo C-terminal de un polipéptido recombinante codificado a partir de un alelo de HLA recombinante que otro elemento o dominio se dice que es "C-terminal" del otro elemento o dominio. A menos que se indique expresamente de cualquier otra manera, no es necesario que diferentes elementos o dominios de un polipéptido recombinante codificado a partir de un alelo de HLA recombinante sean adyacentes (es decir, sin uno o más elementos o dominios intermedios). En algunos casos, diferentes elementos o dominios de un polipéptido recombinante codificado a partir de un alelo de HLA recombinante pueden ser adyacentes.

Un polipéptido recombinante codificado a partir de un alelo de HLA recombinante puede incluir uno o más elementos opcionales, tales como uno o más enlazadores, etiquetas peptídicas (tales como etiquetas epitópicas) o sitio(s) de reconocimiento de proteasas. En algunos casos, una etiqueta peptídica es un péptido aceptor de afinidad. Un enlazador es una serie relativamente corta de aminoácidos que separa otros elementos o dominios de la proteína recombinante. En algunos casos, un enlazador tiene una longitud de 1 a 100 aminoácidos; por ejemplo, de 5 a 75, de 10 a 60, de 15 a 50, de 15 a 40 o de 1 a 50 aminoácidos de longitud.

Los métodos para expresar proteínas en sistemas de expresión heterólogos se conocen bien en la técnica. Típicamente, una molécula de ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de una proteína de interés (tal como un péptido etiquetado con aceptor de afinidad de HLA de clase II recombinante) se obtiene mediante el uso de métodos tales como los descritos en la presente descripción. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína se clona en un vector de expresión que es adecuado para la célula huésped particular de interés mediante el uso de procedimientos de ADN recombinante estándar. Los vectores de expresión incluyen (entre otros elementos) secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores) que pueden unirse operativamente a la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína deseada para causar la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula huésped. Juntas, las secuencias reguladoras y la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína son un "casete de expresión". Los vectores de expresión también pueden incluir un origen de replicación, genes marcadores que proporcionan selección fenotípica en células transformadas, uno o más promotores adicionales y una región polienlazadora que contiene varios sitios de restricción para la inserción de secuencias de ácido nucleico heterólogas.

Los vectores de expresión útiles para la expresión de proteína(s) heteróloga(s) en una multitud de células huésped se conocen bien en la técnica, y en la presente descripción se proporcionan algunos ejemplos específicos. La célula huésped se transfecta con (o se infecta con un virus que contiene) el vector de expresión mediante el uso de cualquier método adecuado para la célula huésped particular. Tales métodos de transfección también se conocen bien en la técnica y en la presente descripción se describen métodos ilustrativos no limitantes. La célula huésped transfectada o transducida puede expresar la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico correspondiente en el casete de expresión.

En algunos casos, las construcciones de HLA de clase II comprenden una etiqueta aceptora de afinidad y una molécula de afinidad en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal. En algunos casos, las construcciones de HLA de clase II comprenden al menos una etiqueta aceptora de afinidad de unión específica y una molécula de afinidad. En algunos casos, una etiqueta aceptora de afinidad es etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta cmyc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G derivada de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular o una etiqueta de V5 derivada de un epítopo pequeño (Pk) que se encuentra en las proteínas P y V del paramixovirus de virus del simio 5 (SV5). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad puede incluir múltiples repeticiones de la secuencia de etiqueta (por ejemplo etiqueta de polihistidina 3x, etiqueta FLAG 3x). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad puede incluir múltiples repeticiones de la secuencia de etiqueta (por ejemplo etiqueta de polihistidina 3x, etiqueta FLAg 3x). En algunos casos, la etiqueta aceptora de afinidad es una "etiqueta epitópica", que es un tipo de etiqueta peptídica que añade un epítopo reconocible (sitio de unión al anticuerpo) al HLA-proteína para proporcionar la unión del anticuerpo correspondiente, de esta manera permite la identificación o purificación por afinidad de la proteína etiquetada. Un ejemplo no limitante de una etiqueta epitópica es la proteína A o la proteína G, que se une a IgG.

En algunos casos, las etiquetas aceptoras de afinidad incluyen la secuencia del péptido aceptor de biotina (BAP) o del péptido hemaglutinina (HA) de influenza humana. El experto conoce y puede imaginar otros numerosos restos de etiquetas, y se contemplan en la presente descripción. Puede usarse cualquier etiqueta peptídica siempre que pueda expresarse como un elemento de un complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

Las etiquetas de afinidad pueden colocarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del alelo de HLA. En algunos casos, la etiqueta de afinidad se coloca en el extremo C-terminal del alelo de HLA para permitir la localización del HLA-péptido en la superficie celular frente al ER. En algunos casos, la etiqueta de afinidad se coloca en el extremo N-terminal del alelo de HLA para permitir aislamientos de un único HLA a partir de líneas celulares que expresan múltiples alelos de HLA endógenos. En otro caso más, la etiqueta de afinidad se añade a cadenas p variables para inmunopurificar heterodímeros de HLA de clase II específicos.

En algunos casos, puede colocarse una secuencia de escisión, tal como F2A, o un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) entre la cadena a y la p2-microglobulina (clase I) o entre la cadena a y la cadena p (clase II). En algunos casos, un único alelo de HLA de clase I es HLA-A*02:01, HLA-A*23:01 y HLA-B* 14:02, o HLA-E*01:01, y el alelo de HLAde clase II es HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 y HLA-DRB*11:01, HLA-DRB*15:01 o BLA-DRB*07:01. En la Figura 2, la Figura 6C y la Figura 7C se representan construcciones de HLA etiquetado con aceptor de afinidad ilustrativas no limitantes.

Métodos terapéuticos

Se ha descrito la inmunoterapia personalizada mediante el uso de péptidos específicos de tumores (documento de Ott y otros, Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 28 (2014) 559-569). Elegir de manera eficiente qué péptidos particulares utilizar como inmunógeno requiere la capacidad de predecir qué péptidos específicos de tumores se unirían de manera eficiente a los alelos de HLA presentes en un paciente. Una de las barreras críticas para el desarrollo de una inmunoterapia curativa y específica de tumor es la identificación y selección de antígenos tumorales restringidos y muy específicos para evitar la autoinmunidad. Los neoantígenos tumorales, que surgen como resultado de cambios genéticos (por ejemplo, inversiones, translocaciones, eliminaciones, mutaciones con pérdida de sentido, mutaciones en el sitio de corte y empalme, etc.) dentro de las células malignas, representan la mayoría de la clase de antígenos específicos de tumor. Rara vez se han usado neoantígenos en vacunas contra el cáncer o composiciones inmunogénicas debido a dificultades técnicas para identificarlos, seleccionar antígenos optimizados y producir neoantígenos para el uso en una composición vacunal o inmunogénica. Estos problemas pueden abordarse mediante: identificación de mutaciones en neoplasias/tumores que están presentes a nivel de ADN en el tumor pero no en muestras de la línea germinal correspondiente de una alta proporción de sujetos que tienen cáncer; análisis de las mutaciones identificadas con uno o más algoritmos de predicción de la unión péptido-MHC para generar una pluralidad de epítopos de células T neoantigénicos que se expresan dentro de la neoplasia/tumor y que se unen a una alta proporción de alelos de HLA del paciente; y sintetizar la pluralidad de péptidos neoantigénicos seleccionados de los conjuntos de todos los péptidos neoantigénicos y péptidos de unión predichos para el uso en una composición vacunal o inmunogénica contra el cáncer adecuada para tratar una alta proporción de sujetos que tienen cáncer (Figura 18A y Figura 18B).

Por ejemplo, la traducción de la información de secuenciación de péptidos en una vacuna terapéutica puede incluir la predicción de péptidos mutados que pueden unirse a moléculas de HLA de una alta proporción de individuos. Elegir de manera eficiente qué mutaciones particulares utilizar como inmunógeno requiere la capacidad de predecir qué péptidos mutados se unirían de manera eficiente a una alta proporción de los alelos de HLA del paciente. Recientemente, los enfoques de aprendizaje basados en redes neuronales con péptidos que se unen y que no se unen validados han mejorado la exactitud de los algoritmos de predicción para los principales alelos de HLA-A y -B. Sin embargo, incluso mediante el uso de algoritmos avanzados basados en redes neuronales para codificar las reglas de unión HLA-péptido, varios factores limitan el poder de predecir los péptidos presentados en los alelos de HLA.

Por ejemplo, la traducción de la información de secuenciación de péptidos en una vacuna terapéutica puede incluir formular el fármaco como una vacuna multiepítopo de péptidos largos. Dirigirse a tantos epítopos mutados como sea prácticamente posible aprovecha la enorme capacidad del sistema inmunológico, previene la oportunidad de escape inmunológico mediante la modulación negativa de un producto génico inmunodirigido y compensa la conocida inexactitud de los enfoques de predicción de epítopos. Los péptidos sintéticos proporcionan un medio útil para preparar múltiples inmunógenos de manera eficiente y traducir rápidamente la identificación de epítopos mutantes en una vacuna eficaz. Los péptidos pueden sintetizarse químicamente fácilmente y purificarse fácilmente mediante el uso de reactivos libres de bacterias o sustancias de origen animal contaminantes. El tamaño pequeño permite un enfoque claro en la región mutada de la proteína y también reduce la competencia antigénica irrelevante de otros componentes (proteína no mutada o antígenos de vectores virales).

Por ejemplo, la traducción de la información de secuenciación de péptidos en una vacuna terapéutica puede incluir una combinación con un adyuvante de vacuna potente. Las vacunas eficaces pueden requerir un adyuvante potente para iniciar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, poli-ICLC, un agonista de TLR3 y los dominios ARN helicasa de MDA5 y RIG3, han demostrado varias propiedades convenientes para un adyuvante de vacuna. Estas propiedades incluyen la inducción de la activación local y sistémica de las células inmunitariasin vivo,producción de quimiocinas y citocinas estimuladoras y estimulación de la presentación de antígenos por DC. Además, el poli-ICLC puede inducir respuestas CD4+ y CD8+ duraderas en seres humanos. Es importante destacar que se observaron sorprendentes similitudes en la regulación positiva de las vías transcripcionales y de transducción de señales en sujetos vacunados con poli-ICLC y en voluntarios que habían recibido la vacuna contra la fiebre amarilla, muy eficaz y con capacidad de replicación. Además, >90 % de las pacientes con carcinoma de ovario inmunizadas con poli-ICLC en combinación con una vacuna de péptido NYESO-1 (además de Montanide) mostraron inducción de células T CD4+ y CD8+, así como también respuestas de anticuerpos al péptido en un estudio fase 1 reciente. Al mismo tiempo, el poli-ICLC se ha evaluado exhaustivamente en más de 25 ensayos clínicos hasta la fecha y ha exhibido un perfil de toxicidad relativamente benigno.

En algunos casos, los péptidos inmunogénicos pueden identificarse a partir de células de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, los péptidos inmunogénicos pueden ser específicos de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, los péptidos inmunogénicos pueden unirse a un HLA que es compatible con un haplotipo de HLA de un sujeto con una enfermedad o afección.

En algunos casos, puede expresarse una biblioteca de péptidos en las células. En algunos casos, las células comprenden los péptidos a identificar o caracterizar. En algunos casos, los péptidos a identificar o caracterizar son péptidos endógenos. En algunos casos, los péptidos son péptidos exógenos. Por ejemplo, los péptidos a identificar o caracterizar se pueden expresar a partir de una pluralidad de secuencias que codifican una biblioteca de péptidos. Antes de la descripción de la presente descripción, la mayoría de los estudios de LC-MS/MS del peptidoma de HLA han usado células que expresan múltiples moléculas de HLA, lo que requiere que los péptidos se asignen a 1 de hasta 6 alelos de clase I mediante el uso de predictores bioinformáticos preexistentes o "deconvolución" (Bassani-Sternberg y Gfeller, 2016). Por lo tanto, los péptidos que no coinciden estrechamente con motivos conocidos no pueden considerarse con confianza como aglutinantes de un determinado alelo deHLA.

En la presente descripción se proporcionan métodos de predicción de péptidos, tales como péptidos mutados, que pueden unirse a moléculas de HLA de los individuos. En algunos casos, la solicitud proporciona métodos para identificar a partir de un conjunto dado de antígenos que comprende péptidos los péptidos más adecuados para preparar una composición inmunogénica para un sujeto, dicho método comprende seleccionar a partir de un conjunto dado de péptidos la pluralidad de péptidos que pueden unirse a una proteína HLA del sujeto, en donde dicha capacidad para unirse a una proteína HLA se determina mediante el análisis de la secuencia de los péptidos con una máquina que se ha entrenado con bases de datos de secuencias peptídicas correspondientes a los péptidos de unión a HLA específicos para cada uno de los alelos de HLA de dicho sujeto. En la presente descripción se proporcionan métodos para identificar un conjunto dado de antígenos que comprenden péptidos los péptidos más adecuados para preparar una composición inmunogénica para un sujeto, dicho método comprende seleccionar a partir de un conjunto dado de péptidos la pluralidad de péptidos determinados como que pueden unirse a una proteína HLA del sujeto, la capacidad para unirse a una proteína HLA se determina mediante el análisis de la secuencia de los péptidos con una máquina que se ha entrenado con una base de datos de secuencias peptídicas obtenida al llevar a cabo los métodos descritos anteriormente en la presente descripción. Por lo tanto, en algunos casos, la presente descripción proporciona métodos para identificar una pluralidad de péptidos específicos del sujeto para preparar una composición inmunogénica específica del sujeto, en donde el sujeto tiene un tumor y los péptidos específicos del sujeto son específicos del sujeto y del tumor del sujeto, dicho método comprende: secuenciar una muestra del tumor del sujeto y una muestra no tumoral del sujeto; determinar en base a la secuenciación de ácidos nucleicos: mutaciones no silentes presentes en el genoma de las células cancerosas del sujeto pero no en el tejido normal del sujeto, y el genotipo HLA del sujeto; y seleccionar de las mutaciones no silentes identificadas la pluralidad de péptidos específicos del sujeto, cada uno tiene un epítopo tumoral diferente que es un epítopo específico del tumor del sujeto y cada uno se identifica como que puede unirse a una proteína HLA del sujeto, según se determina mediante el análisis de la secuencia de los péptidos derivados de las mutaciones no silentes en los métodos para predecir la unión a HLA descritos en la presente descripción.

En algunos casos, en la presente descripción se describe un método para caracterizar complejos HLA-péptido específicos de un individuo.

En algunos casos, se usa un método para caracterizar complejos HLA-péptido específicos de un individuo para desarrollar un agente inmunoterapéutico en un individuo que lo necesita, tal como un sujeto con una afección o enfermedad.

En la presente descripción se proporciona un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido identificado de acuerdo con un método descrito. En la presente descripción se proporciona un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido con una secuencia de un péptido identificada de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para proporcionar inmunidad antitumoral en un mamífero que comprende administrar al mamífero una célula que comprende un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia del péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En algunos casos, la célula presenta el péptido como un complejo HLA-péptido.

En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un péptido que comprende la secuencia de un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una célula que comprende un péptido que comprende la secuencia de un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una célula que comprende un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un péptido que comprende la secuencia de un péptido identificado de acuerdo con un método descrito en la presente descripción. En algunos casos, en donde la enfermedad o trastorno es cáncer. En algunos casos, el método comprende además administrar un inhibidor de puntos de regulación inmunológica al sujeto.

En la presente descripción, en algunos casos, se describen métodos para desarrollar un agente inmunoterapéutico para un individuo que lo necesita mediante la caracterización de complejos HLA-péptido que comprenden: a) proporcionar una población de células derivadas del individuo que lo necesita en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende: i) una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante unida operativamente a ii) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad; b) expresar el HLA etiquetado con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la al menos una célula; c) enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; caracterizar complejos HLA-péptido específicos para el individuo que los necesita; y d) desarrollar el agente inmunoterapéutico basado en un complejo HLA-péptido específico para el individuo que lo necesita; en donde el individuo tiene una enfermedad o afección.

En algunos casos, el agente inmunoterapéutico es un ácido nucleico o un péptido terapéutico.

En algunos casos, el método comprende introducir uno o más péptidos en la población de células. En algunos casos, el método comprende poner en contacto la población de células con el uno o más péptidos o expresar el uno o más péptidos en la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos.

En algunos casos, el método comprende introducir uno o más HLA específicos para el paciente. En algunos casos, el método comprende introducir todos los HLA específicos del paciente. En algunos casos, los HLA específicos del paciente pueden introducirse como un único alelo. En algunos casos, pueden introducirse múltiples HLA específicos del paciente. En algunos casos, el método comprende desarrollar un agente inmunoterapéutico basado en péptidos identificados en relación con los HLA específicos del paciente]. En algunos casos, la población de células se deriva del individuo que lo necesita.

En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con la enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer o una infección con un agente infeccioso o una enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, el método comprende introducir el agente infeccioso o porciones del mismo en una o más células de la población de células. En algunos casos, el método comprende caracterizar uno o más péptidos de los complejos HLA-péptido específicos del individuo que lo necesita, opcionalmente en donde los péptidos son de una o más proteínas diana del agente infeccioso o de la enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, el método comprende caracterizar una o más regiones de los péptidos de la una o más proteínas diana del agente infeccioso o de la enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, el método comprende identificar péptidos de los complejos HLA-péptido derivados de un agente infeccioso o una enfermedad autoinmunitaria.

En algunos casos, el agente infeccioso es un patógeno. En algunos casos, el patógeno es un virus, una bacteria o un parásito.

En algunos casos, el virus se selecciona del grupo que consiste en: virus BK (BKV), virus del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovirus (CMV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de Epstein-Barr (EBV), un adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotrófico de células T humanas (HTLV-1), un virus de la influenza, RSV, HPV, rabia, virus de la rubéola paperas, poliovirus, fiebre amarilla, hepatitis A, hepatitis B, rotavirus, virus de la varicela, virus del papiloma humano (HPV), viruela, zóster y sus combinaciones.

En algunos casos, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en:Klebsiella spp, Tropheryma Whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosisyMycobacterium tuberculosis.En algunos casos, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en: tifoidea, neumococo, meningococo, haemophilus B, ántrax, toxoide tetánico, meningococo del grupo B, bcg, cólera y sus combinaciones.

En algunos casos, el parásito es un helminto o un protozoo. En algunos casos, el parásito se selecciona del grupo que consiste en:Leishmania spp.(por ejemplo,L. major, L. infantum, L. braziliensis, L. donovani, L. chagasi, L.

mexicana), Plasmodium spp.(por ejemplo,P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae), Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanusySchistosoma spp. (S. mansoni, S. haematobium, S. japonicum).

En algunos casos, el agente inmunoterapéutico es un receptor manipulado. En algunos casos, el receptor manipulado es un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor de células T (TCR) o un receptor de células B (BCR), una terapia adoptiva de células T (ACT) o un derivado de la misma. En otros aspectos, el receptor manipulado es un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos aspectos, el CAR es un CAR de primera generación. En otros aspectos, el CAR es un CAR de segunda generación. En otros aspectos más, el CAR es un CAR de tercera generación.

En algunos aspectos, el CAR comprende una porción extracelular, una porción transmembrana y una porción intracelular. En algunos aspectos, la porción intracelular comprende al menos un dominio coestimulador de células T. En algunos aspectos, el dominio coestimulador de células T se selecciona del grupo que consiste en CD27, CD28, TNFRS9 (4-1BB), TNFRSF4 (OX40), TNFRSF8 (CD30), CD40LG (CD40L), ICOS, ITGB2 (LFA-1), CD2, CD7, KLRC2 (NKG2C), TNFRS18 (GITR), TNFRSF14 (HVEM) o cualquiera de sus combinaciones.

En algunos aspectos, el receptor manipulado se une a una diana. En algunos aspectos, la unión es específica para un péptido identificado a partir del método de caracterización de complejos HLA-péptido específicos de un individuo que padece una enfermedad o afección.

En algunos aspectos, el agente inmunoterapéutico es una célula como se describe en detalle en la presente descripción. En algunos aspectos, el agente inmunoterapéutico es una célula que comprende un receptor que se une específicamente a un péptido identificado a partir del método que caracteriza complejos HLA-péptido específicos de un individuo que padece una enfermedad o afección. En algunos aspectos, el agente inmunoterapéutico es una célula usada en combinación con los péptidos/ácidos nucleicos de esta descripción. En algunos casos, la célula es una célula del paciente. En algunos casos, la célula es una célula T. En algunos casos, la célula es un linfocito infiltrante de tumor.

En algunos aspectos, un sujeto con una afección o enfermedad se trata en base a un repertorio de receptores de células T del sujeto. En algunos casos, se selecciona una vacuna antigénica en base a un repertorio de receptores de células T del sujeto. En algunos casos, un sujeto se trata con células T que expresan TCR específicos para un antígeno o péptido identificado mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. En algunos casos, un sujeto se trata con un antígeno o péptido identificado mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción específicos para TCR, por ejemplo, TCR específicos del sujeto. En algunos casos, un sujeto se trata con un antígeno o péptido identificado mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción específicos para células T que expresan TCR, por ejemplo, TCR específicos del sujeto. En algunos casos, un sujeto se trata con un antígeno o péptido identificado mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción específicos para TCR específicos del sujeto.

En algunos casos, se selecciona una composición de antígeno inmunogénico o una vacuna en base a los TCR identificados en un sujeto. En un caso, se usa la identificación de un repertorio de células T y la evaluación en ensayos funcionales para determinar una composición inmunogénica o vacuna a administrar a un sujeto con una afección o enfermedad. En algunos casos, la composición inmunogénica es una vacuna antigénica. En algunos casos, la vacuna antigénica comprende péptidos antigénicos específicos del sujeto. En algunos casos, los péptidos antigénicos a incluir en una vacuna antigénica se seleccionan en base a una cuantificación de los TCR específicos del sujeto que se unen a los antígenos. En algunos casos, los péptidos antigénicos se seleccionan en base a la afinidad de unión del péptido a un TCR. En algunos casos, la selección se basa en una combinación tanto de la cantidad como de la afinidad de unión. Por ejemplo, un TCR que se une fuertemente a un antígeno en un ensayo funcional, pero que no está muy representado en un repertorio de TCR, puede ser un buen candidato para una vacuna antigénica porque las células T que expresan el TCR se amplificarían ventajosamente.

En algunos casos, los antígenos se seleccionan para administrarlos a un sujeto en base a su unión a los TCR. En algunos casos, las células T, tales como las células T de un sujeto con una enfermedad o afección, pueden expandirse. Las células T expandidas que expresan TCR específicos para un péptido antigénico inmunogénico identificado mediante el uso del método descrito en la presente descripción se pueden volver a administrar a un sujeto. En algunos casos, se transducen o transfectan células adecuadas, por ejemplo, PBMC, con polinucleótidos para la expresión de TCR específicos para un péptido antigénico inmunogénico identificado mediante el uso del método descrito en la presente descripción y administrado a un sujeto. Las células T que expresan TCR específicos para un péptido antigénico inmunogénico identificado mediante el uso del método descrito en la presente descripción se pueden expandir y volver a administrar a un sujeto. En algunos casos, las células T que expresan TCR específicos para un péptido antigénico inmunogénico identificado mediante el uso del método descrito en la presente descripción que dan como resultado actividad citolítica cuando se incuban con tejido enfermo autólogo se pueden expandir y administrar a un sujeto. En algunos casos, las células T usadas en ensayos funcionales que dan como resultado la unión a un péptido antigénico inmunogénico identificado mediante el uso del método descrito en la presente descripción se puede expandir y administrar a un sujeto. En algunos casos, los TCR cuya unión a péptidos antigénicos inmunogénicos específicos del sujeto identificados mediante el uso del método descrito en la presente descripción se ha determinado se pueden expresar en células T y administrar a un sujeto.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden implicar la transferencia adoptiva de células del sistema inmunológico, tales como células T, específicas para antígenos seleccionados, tales como antígenos asociados a tumores o patógenos. Se pueden emplear diversas estrategias para modificar genéticamente las células T mediante la alteración de la especificidad del receptor de células T (TCR), por ejemplo, mediante la introducción de nuevas cadenas a y p de TCR con especificidad para un péptido antigénico inmunogénico identificado mediante el uso del método descrito en la presente descripción (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 8,697,854; las publicaciones de patentes PCT: WO2003020763, WO2004033685, WO2004044004, WO2005114215, WO2006000830, WO2008038002, WO2008039818, WO2004074322, WO2005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173; la patente de Estados Unidos núm.

8,088,379).

Los receptores de antígeno quiméricos (CAR) pueden usarse para generar células inmunosensibles, tales como células T, específicas para dianas seleccionadas, tales como péptidos antigénicos inmunogénicos identificados mediante el uso del método descrito en la presente descripción, con una amplia variedad de construcciones quiméricas de receptores (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 5,843,728; 5,851,828; 5,912, 170; 6,004,811; 6,284,240; 6,392,013; 6,410,014; 6,753,162; 8,211,422; y, la publicación PCT WO9215322). Las construcciones de CAR alternativas pueden caracterizarse como pertenecientes a generaciones sucesivas. Los CAR de primera generación típicamente consisten en un fragmento variable de cadena simple de un anticuerpo específico para un antígeno, que comprende por ejemplo una VL unida a una VH de un anticuerpo específico, unida mediante un enlazador flexible, por ejemplo por un dominio bisagra de CD8a y un dominio transmembrana de CD8a, a los dominios transmembrana y de señalización intracelular de CD3Z o FcRy o scFv-FcRy (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,741,465; la patente de Estados Unidos núm. 5,912,172; la patente de Estados Unidos núm.

5,906,936). Los CAR de segunda generación incorporan los dominios intracelulares de una o más moléculas coestimuladoras, tales como CD28, OX40 (CD134) o 4-1BB (CD137) dentro del endodominio, por ejemplo, scFv-CD28/OX40/4-lBB-CD3 (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 8,911,993; 8,916,381; 8,975,071; 9, 101,584; 9, 102,760; 9,102,761). Los CAR de tercera generación incluyen una combinación de endodominios coestimuladores, tales como los dominios de señalización de cadena CD3C, CD97, GDI la-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CDS, OX40, 4-1BB o CD28, por ejemplo, scFv-CD28-4-lBB-CD3C o scFv-CD28-OX40-CD3Q (ver, por ejemplo,la patente de Estados Unidos núm. 8,906,682; la patente de Estados Unidos núm. 8,399,645; la patente de Estados Unidos núm. 5,686,281; la publicación PCT núm. WO2014134165; la publicación P<c>T núm. WO2012079000). En algunos casos, la coestimulación puede coordinarse mediante la expresión de los CAR en células T específicas de antígeno, elegidas para activarse y expandirse tras, por ejemplo, la interacción con el antígeno en células presentadoras de antígeno profesionales, con coestimulación. Se pueden proporcionar receptores manipulados adicionales en las células inmunosensibles, por ejemplo,para mejorar el direccionamiento de un ataque de células T y/o minimizar los efectos secundarios.

Pueden usarse técnicas alternativas para transformar células inmunosensibles diana, tales como fusión de protoplastos, lipofección, transfección o electroporación. Puede usarse una amplia variedad de vectores, tales como vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, plásmidos o transposones, tales como un transposón Bella Durmiente (ver las patentes de Estados Unidos núms. 6,489,458; 7,148,203; 7,160,682; 7,985,739; 8,227,432), que puede usarse para introducir CAR, por ejemplo mediante el uso de la señalización de CAR específicos de antígeno de 2da generación a través de CD3Z y CD28 o CD137. Los vectores virales pueden incluir, por ejemplo, vectores basados en VIH, SV40, EBV, HSV o BPV.

Las células que son diana de la transformación pueden incluir, por ejemplo, células T, células asesinas naturales (NK), linfocitos T citotóxicos (CTL), células T reguladoras, células madre embrionarias humanas, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) o una célula madre pluripotente a partir de la cual se pueden diferenciar células linfoides. Las células T que expresan un CAR deseado pueden seleccionarse, por ejemplo, a través de cocultivo con células activadoras y propagadoras (APC) irradiadas con<y>, que coexpresan el antígeno del cáncer y las moléculas coestimuladoras. Las células T con CAR manipuladas se pueden expandir, por ejemplo, mediante cocultivo con APC en presencia de factores solubles, tales como IL-2 e IL-21. Esta expansión puede llevarse a cabo, por ejemplo, para proporcionar células T con CAR de memoria (que, por ejemplo, se ensayan mediante matriz digital no enzimática y/o citometría de flujo de paneles múltiples). De esta manera, pueden proporcionarse células T con CAR que tienen actividad citotóxica específica contra tumores portadores de antígenos (opcionalmente junto con la producción de quimiocinas deseadas tales como interferón-Y). Este tipo de células T con CAR puede usarse, por ejemplo, en modelos animales, por ejemplo para amenazar xenoinjertos tumorales.

Se pueden adaptar enfoques tales como los anteriores para proporcionar métodos para tratar y/o aumentar la supervivencia de un sujeto que tiene una enfermedad, tal como una neoplasia o una infección por patógeno, por ejemplo mediante la administración de una cantidad eficaz de una célula inmunosensible que comprende un receptor que reconoce antígenos que se une a un antígeno seleccionado, en donde la unión activa la célula inmunosensible, de esta manera se trata o previene la enfermedad (tal como una neoplasia, una infección por patógeno, un trastorno autoinmunitario o una reacción al trasplante alogénico). La administración de la dosis en terapias de células T con CAR puede implicar, por ejemplo, la administración de desde 106 hasta 109 células/kg, con o sin un ciclo de linfoagotamiento, por ejemplo con ciclofosfamida.

Para protegerse contra posibles reacciones adversas, las células inmunosensibles manipuladas pueden equiparse con un interruptor de seguridad transgénico, en forma de un transgén que hace que las células sean vulnerables a la exposición a una señal específica. Por ejemplo, el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple puede usarse de esta manera, por ejemplo mediante su introducción en linfocitos T alogénicos usados como infusiones de linfocitos de donantes después de un trasplante de células madre. En tales células, la administración de un profármaco tipo nucleósido tal como ganciclovir o aciclovir causa la muerte celular. Las construcciones de interruptor de seguridad alternativas incluyen caspasa 9 inducible activada, por ejemplo, mediante la administración de un dimerizador de molécula pequeña que reúne dos moléculas de icasp9 no funcionales para formar la enzima activa. Se ha descrito una amplia variedad de enfoques alternativos para implementar controles de proliferación celular (ver, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos núm. 20130071414; la publicación de patente PCT WO2011146862; la publicación de patente PCT WO201401 1987; la publicación de patente PCT WO2013040371). En un perfeccionamiento adicional de las terapias adoptivas, la edición del genoma puede usarse para adaptar las células inmunosensibles a implementaciones alternativas, por ejemplo, al proporcionar células T con CAR editados. Los métodos de terapia celular también pueden implicar la activación y expansión ex vivo de células T. En algunos casos, las células T pueden activarse antes de administrarlas a un sujeto que lo necesite. Ejemplos de este tipo de tratamientos incluyen el uso de células linfocitarias infiltrantes de tumores (TIL) (ver la patente de Estados Unidos núm. 5,126,132), células T citotóxicas (ver la patente de Estados Unidos núm. 6,255,073; y la patente de Estados Unidos núm. 5,846,827), células de ganglios linfáticos expandidas que drenan a tumor (ver la patente de Estados Unidos núm. 6,251,385), y diversas otras preparaciones de linfocitos (ver la patente de Estados Unidos núm.

6,194,207; la patente de Estados Unidos núm. 5,443,983; la patente de Estados Unidos núm. 6,040,177; y la patente de Estados Unidos núm. 5,766,920).

Una población de células T activadasex vivopuede estar en un estado que orqueste al máximo una respuesta inmunitaria contra el cáncer, enfermedades infecciosas u otros estados patológicos, por ejemplo, un estado patológico autoinmunitario. Para la activación, pueden suministrarse al menos dos señales a las células T. La primera señal normalmente se suministra a través del receptor de células T (TCR) en la superficie de las células T. La primera señal del TCR normalmente se activa tras la interacción del TCR con antígenos peptídicos expresados junto con un complejo MHC en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC). La segunda señal normalmente se suministra a través de receptores coestimuladores en la superficie de las células T. Los receptores coestimuladores generalmente se activan por ligandos o citocinas correspondientes expresados en la superficie de las APC.

Se contempla que las células T específicas de los péptidos antigénicos inmunogénicos identificados mediante el uso del método descrito en la presente descripción pueden obtenerse y usarse en métodos para tratar o prevenir enfermedades. Con respecto a esto, la descripción proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una población de células que comprende células específicas de péptidos antigénicos inmunogénicos identificados mediante el uso del método descrito en la presente descripción en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad en el sujeto. En algunos casos, un método para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto comprende administrar una población de células enriquecida en células T reactivas a la enfermedad a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero. Las células pueden ser células alogénicas o autólogas al sujeto.

La descripción proporciona además un método para inducir una respuesta inmunitaria específica de una enfermedad en un sujeto, vacunar contra una enfermedad, tratar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad en un sujeto mediante la administración al sujeto de un péptido antigénico o una vacuna.

El péptido o composición de la descripción puede administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta de CTL. Un péptido antigénico o una composición vacunal puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, un agente quimioterapéutico o bioterapéutico, radiación o inmunoterapia. Puede administrarse cualquier tratamiento terapéutico adecuado para una enfermedad particular. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos y bioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, aldesleucina, altretamina, amifostina, asparaginasa, bleomicina, capecitabina, carboplatino, carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatino, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorrubicina, dronabinol, epoetina alfa, etopósido, filgrastim, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, granisetrón, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, interferón alfa, irinotecán, lansoprazol, levamisol, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, omeprazol, ondansetrón, paclitaxel (Taxol®), pilocarpina, procloroperazina, rituximab, tamoxifeno, taxol, clorhidrato de topotecán, trastuzumab, vinblastina, vincristina y tartrato de vinorelbina. Además, al sujeto se le puede administrar adicionalmente un agente antiinmunosupresor o inmunoestimulador. Por ejemplo, al sujeto se le puede administrar adicionalmente un anticuerpo anti-CTLA o anti-PD-1 o anti-PD-Ll.

Un experto en la técnica puede determinar la cantidad de cada péptido a incluir en una composición vacunal y el régimen de dosificación. Por ejemplo, puede prepararse un péptido o su variante para inyección intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección intradérmica (i.d.), inyección intraperitoneal (i.p.), inyección intramuscular (i.m.). Los métodos ilustrativos de inyección de péptidos incluyen s.c, i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos ilustrativos de inyección de ADN incluyen i.d., i.m., s.c, i.p. e i.v. Otros métodos de administración de la composición vacunal son conocidos por los expertos en la técnica.

Se puede compilar una composición farmacéutica de manera que la selección, el número y/o la cantidad de péptidos presentes en la composición sean específicos de una enfermedad y/o del paciente. Por ejemplo, la selección exacta de péptidos puede guiarse por patrones de expresión de las proteínas originales en un tejido dado para evitar efectos secundarios. La selección puede depender del tipo específico de enfermedad, el estado de la enfermedad, los regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmunológico del paciente y el haplotipo HLA del paciente. Además, la vacuna de acuerdo con la presente descripción puede contener componentes individualizados, de acuerdo con las necesidades personales del paciente particular. Los ejemplos incluyen variar las cantidades de péptidos de acuerdo con la expresión del antígeno relacionado en el paciente particular, los efectos secundarios no deseados debidos a alergias personales u otros tratamientos, y los ajustes para tratamientos secundarios después de una primera ronda o esquema de tratamiento.

Producción de antígenos específicos de una enfermedad

La presente descripción se basa, al menos en parte, en la capacidad de presentar al sistema inmunológico del paciente uno o más antígenos específicos de una enfermedad. Un experto en la técnica apreciará a partir de esta descripción y los conocimientos en la técnica que existe una variedad de formas para producir tales antígenos específicos de una enfermedad. En general, tales antígenos específicos de una enfermedad pueden producirse ya seain vitrooin vivo.Pueden producirse antígenos específicos de una enfermedadin vitrocomo péptidos o polipéptidos, que después pueden formularse en una composición vacunal o inmunogénica y administrarse a un sujeto. Como se describe con más detalle en la presente descripción, tal producciónin vitropuede producirse mediante una variedad de métodos conocidos por un experto en la técnica tales como, por ejemplo, síntesis de péptidos o expresión de un péptido/polipéptido a partir de una molécula de ADN o ARN en cualquiera de una variedad de sistemas de expresión bacterianos, eucariotas o de virus recombinantes, seguido de la purificación del péptido/polipéptido expresado. Alternativamente, los antígenos específicos de una enfermedad pueden producirsein vivomediante la introducción de moléculas (por ejemplo, ADN, ARN, sistemas de expresión viral y similares) que codifican antígenos específicos de una enfermedad en un sujeto, con lo cual se expresan los antígenos específicos de una enfermedad codificados. Los métodos de producción de antígenosin vitroein vivotambién se describen con más detalle en la presente descripción en lo que se refiere a composiciones farmacéuticas y métodos de suministro de la terapia.

En algunos casos, la presente descripción incluye péptidos antigénicos modificados. Una modificación puede incluir una modificación química covalente que no altere la secuencia de aminoácidos primaria del propio péptido antigénico. Las modificaciones pueden producir péptidos con propiedades deseadas, por ejemplo, prolongación de la vida mediain vivo, aumento de la estabilidad, reducción del aclaramiento, alteración de la inmunogenicidad o alergenicidad, habilitación de la generación de anticuerpos particulares, direccionamiento celular, captación de antígenos, procesamiento de antígenos, afinidad por MHC, estabilidad del MHC o presentación de antígenos. Los cambios en un péptido antigénico que pueden llevarse a cabo incluyen, pero no se limitan a, conjugación con una proteína portadora, conjugación con un ligando, conjugación con un anticuerpo, PEGilación, polisialilación, HESilación, miméticos de PEG recombinantes, fusión con Fc, fusión con albúmina, unión a nanopartículas, encapsulación en nanopartículas, fusión con colesterol, fusión con hierro, acilación, amidación, glicosilación, oxidación de cadenas laterales, fosforilación, biotinilación, la adición de un material activo de superficie, la adición de miméticos de aminoácidos o la adición de aminoácidos no naturales.

Los problemas asociados con la vida media plasmática corta o la susceptibilidad a la degradación por proteasas pueden superarse mediante diversas modificaciones, que incluyen la conjugación o unión de la secuencia polipeptídica a cualquiera de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo,polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos (ver, por ejemplo, típicamente por medio de un resto enlazador unido covalentemente tanto a la proteína como al polímero no proteico, por ejemplo, un PEG). Se ha demostrado que tales biomoléculas conjugadas con PEG poseen propiedades clínicamente útiles, que incluyen una mejor estabilidad física y térmica, protección contra la susceptibilidad a la degradación enzimática, mayor solubilidad y mayor vida media en circulaciónin vivoy disminución del aclaramiento, reducción de la inmunogenicidad y la antigenicidad y reducción de la toxicidad.

Los PEG adecuados para la conjugación con una secuencia polipeptídica son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R(O-CH<2>-CH<2>)nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o un alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos. El PEG conjugado con la secuencia polipeptídica puede ser lineal o ramificado. La presente descripción contempla los derivados de PEG ramificados, los "PEG en estrella" y los PEG de múltiples brazos.

La presente descripción también contempla composiciones de conjugados en donde los PEG tienen diferentes valores de n y, por lo tanto, los diversos PEG diferentes están presentes en proporciones específicas. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden una mezcla de conjugados donde n=l, 2, 3 y 4. En algunas composiciones, el porcentaje de conjugados donde n=l es 18-25 %, el porcentaje de conjugados donde n=2 es 50-66 %, el porcentaje de conjugados donde n=3 es 12-16 % y el porcentaje de conjugados donde n=4 es hasta 5 %. Tales composiciones pueden producirse mediante condiciones de reacción y métodos de purificación conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de intercambio catiónico para separar conjugados, y después se identifica una fracción que contiene el conjugado que tiene, por ejemplo, el número deseado de PEG unidos, purificado libre de secuencias de proteínas no modificadas y de conjugados que tienen otros números de PEG unidos.

El PEG puede unirse a un polipéptido de la presente descripción por medio de un grupo reactivo terminal (un "separador"). El separador es, por ejemplo, un grupo reactivo terminal que media un enlace entre los grupos amino o carboxilo libres de una o más de las secuencias polipeptídicas y polietilenglicol. El PEG que tiene el separador que puede unirse al grupo amino libre incluye polietilenglicol de N-hidroxisuccinilimida que puede prepararse mediante la activación de éster de polietilenglicol del ácido succínico con N-hidroxisuccinilimida. Otro polietilenglicol activado que puede unirse a un grupo amino libre es 2,4-bis(O-metoxipolietilenglicol)-6-cloro-s-triazina que puede prepararse mediante la reacción del éter monometílico de polietilenglicol con cloruro cianúrico. El polietilenglicol activado que está unido al grupo carboxilo libre incluye polioxietilendiamina.

La conjugación de una o más de las secuencias polipeptídicas de la presente descripción con PEG que tiene un separador puede llevarse a cabo mediante diversos métodos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación puede llevarse a cabo en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura de 4 °C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, mediante el uso de una relación molar de reactivo a proteína de 4: 1 a 30: 1. Las condiciones de reacción pueden seleccionarse para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado de sustitución deseado. En general, baja temperatura, bajo pH (por ejemplo, pH=5) y el tiempo de reacción corto tienden a disminuir el número de PEG unidos, mientras que la temperatura alta, el pH de neutro a alto (por ejemplo, pH>7) y un tiempo de reacción más largo tienden a aumentar el número de PEG unidos. Pueden usarse diversos medios conocidos en la técnica para terminar la reacción. En algunos casos, la reacción se termina por acidificación de la mezcla de reacción y congelación a, por ejemplo, -20 °C.

La presente descripción también contempla el uso de miméticos de PEG. Se han desarrollado miméticos de PEG recombinantes que retienen los atributos de PEG (por ejemplo, vida media sérica mejorada) mientras confieren varias propiedades ventajosas adicionales. A manera de ejemplo, pueden producirse de forma recombinante cadenas polipeptídicas simples (que comprenden, por ejemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser y Thr) que pueden formar una conformación extendida similar al PEG ya fusionadas al péptido o fármaco proteico de interés (por ejemplo, la tecnología XTEN de Amunix; Mountain View, CA). Esto evita la necesidad de una etapa de conjugación adicional durante el proceso de fabricación. Por otra parte, las técnicas de biología molecular establecidas permiten el control de la composición de las cadenas laterales de las cadenas polipeptídicas, lo que permite optimizar la inmunogenicidad y las propiedades de fabricación.

La glicosilación puede afectar las propiedades físicas de las proteínas y también puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización subcelular de las proteínas. La glicosilación adecuada puede ser importante para la actividad biológica. De hecho, algunos genes de organismos eucariotas, cuando se expresan en bacterias (por ejemplo, E. coli) que carecen de procesos celulares para glicosilar proteínas, producen proteínas que se recuperan con poca o ninguna actividad en virtud de su falta de glicosilación. La adición de sitios de glicosilación puede lograrse mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración del polipéptido puede realizarse, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina (para sitios de glicosilación con enlace a O) o residuos de asparagina (para sitios de glicosilación con enlace a N). Las estructuras de los oligosacáridos con enlace a N y O y los residuos de azúcar que se encuentran en cada tipo pueden ser diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (en adelante denominado ácido siálico). El ácido siálico por lo general es el residuo terminal de los oligosacáridos con enlace a N y O y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glicoproteína. Los casos de la presente descripción comprenden la generación y uso de variantes de N-glicosilación.

Las secuencias polipeptídicas de la presente descripción pueden alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel de ADN, particularmente por mutación del ADN que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de manera que se generen codones que se traducirán a los aminoácidos deseados. Otro medio para aumentar el número de restos de carbohidratos en el polipéptido es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. La eliminación de carbohidratos puede lograrse química o enzimáticamente, o mediante sustitución de codones que codifican residuos de aminoácidos que están glicosilados. Se conocen técnicas de desglicosilación química y la escisión enzimática de restos de carbohidratos en polipéptidos puede lograrse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglucosidasas.

Los componentes y moléculas adicionales adecuados para la conjugación incluyen, por ejemplo, moléculas dirigidas al sistema linfático, tiroglobulina; albúminas tales como albúmina sérica humana (HAS); toxoide tetánico; toxoide diftérico; poliaminoácidos tales como poli(D-lisina:ácido D-glutámico); polipéptidos VP6 de rotavirus; hemaglutinina del virus de la influenza, nucleoproteína del virus de la influenza; hemocianina de lapa californiana (KLH); y proteína central y antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; o cualquier combinación de los anteriores.

La fusión de albúmina con uno o más polipéptidos de la presente descripción puede lograrse, por ejemplo, mediante manipulación genética, de manera que el ADN que codifica HSA, o un fragmento del mismo, se une al ADN que codifica la una o más secuencias polipeptídicas. Posteriormente, se puede transformar o transfectar un huésped adecuado con las secuencias de nucleótidos fusionadas en forma de, por ejemplo, un plásmido adecuado, para expresar un polipéptido de fusión. La expresión puede efectuarsein vitroa partir de, por ejemplo, células procariotas o eucariotas, oin vivoa partir de, por ejemplo, un organismo transgénico. En algunos casos de la presente descripción, la expresión de la proteína de fusión se realiza en líneas celulares de mamífero, por ejemplo, líneas celulares CHO. La transformación se usa ampliamente en la presente descripción para referirse a la alteración genética de una célula como resultado de la captación directa, incorporación y expresión de material genético exógeno (ADN exógeno) de su entorno e incorporado a través de la(s) membrana(s) celular(es). La transformación se produce naturalmente en algunas especies de bacterias, pero también puede efectuarse por medios artificiales en otras células. Además, la propia albúmina puede modificarse para extender su vida media en circulación. La fusión de la albúmina modificada con uno o más polipéptidos puede lograrse mediante las técnicas de manipulación genética descritas anteriormente o mediante conjugación química; la molécula de fusión resultante tiene una vida media que excede la de las fusiones con albúmina no modificada. (Ver el documento WO2011/051489). Se han desarrollado varias estrategias de unión a la albúmina como alternativas a la fusión directa, que incluyen la unión de la albúmina a través de una cadena de ácido graso conjugada (acilación). Debido a que la albúmina sérica es una proteína transportadora de ácidos grasos, estos ligandos naturales con actividad de unión a la albúmina se han usado para extender la vida media de proteínas terapéuticas pequeñas. Por ejemplo, la insulina detemir (LEVEMIR), un producto aprobado para la diabetes, comprende una cadena de miristilo conjugada con una insulina modificada genéticamente, lo que da como resultado un análogo de insulina de acción prolongada.

Otro tipo de modificación es conjugar (por ejemplo, por enlace) uno o más componentes o moléculas adicionales en el extremo N- y/o C-terminal de una secuencia polipeptídica, tal como otra proteína (por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga a la proteína en cuestión), o una molécula portadora. Por lo tanto, puede proporcionarse una secuencia polipeptídica ilustrativa como un conjugado con otro componente o molécula.

Una modificación conjugada puede dar como resultado una secuencia polipeptídica que retiene actividad con una función o actividad adicional o complementaria de la segunda molécula. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica puede conjugarse con una molécula, por ejemplo, para facilitar la solubilidad, el almacenamiento, vida media o estabilidadin vivoo en almacenamiento, reducción de la inmunogenicidad, liberación retardada o controladain vivo,etc. Otras funciones o actividades incluyen un conjugado que reduce la toxicidad con relación a una secuencia polipeptídica no conjugada, un conjugado que se dirige a un tipo de célula u órgano de manera más eficiente que una secuencia polipeptídica no conjugada, o un fármaco para contrarrestar aún más las causas o efectos asociados con un trastorno o enfermedad como se expone en la presente descripción (por ejemplo, diabetes).

Un polipéptido también puede conjugarse con macromoléculas grandes de metabolización lenta, tales como proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, perlas de celulosa; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de virus inactivo; toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide de difteria, tétanos, cólera, moléculas de leucotoxina; bacterias inactivadas; y células dendríticas.

Los componentes y moléculas candidatos adicionales para la conjugación incluyen aquellos adecuados para el aislamiento o la purificación. Ejemplos particulares no limitantes incluyen moléculas de unión, tales como biotina (par de unión específica biotina-avidina), un anticuerpo, un receptor, un ligando, una lectina, o moléculas que comprenden un soporte sólido, que incluyen, por ejemplo, perlas de plástico o poliestireno, placas o perlas, perlas magnéticas, tiras reactivas y membranas. Pueden usarse métodos de purificación como la cromatografía de intercambio catiónico para separar los conjugados por diferencia de carga, lo que separa eficazmente los conjugados en sus diversos pesos moleculares. El contenido de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio catiónico puede identificarse por peso molecular mediante el uso de métodos convencionales, por ejemplo, espectroscopía de masas, SDS-PAGE u otros métodos conocidos para separar entidades moleculares por peso molecular.

En algunos casos, el extremo amino o carboxilo terminal de una secuencia polipeptídica de la presente descripción puede fusionarse con una región Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, Fc humano) para formar un conjugado de fusión (o molécula de fusión). Se ha demostrado que los conjugados de fusión a Fc aumentan la vida media sistémica de los productos biofarmacéuticos y, por lo tanto, el producto biofarmacéutico puede requerir una administración menos frecuente.

El Fc se une al receptor de Fc neonatal (FcRn) en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y, al unirse, la molécula de fusión a Fc queda protegida de la degradación y se vuelve a liberar a la circulación, lo que mantiene a la molécula en circulación por más tiempo. Se cree que esta unión a Fc es el mecanismo por el cual la IgG endógena retiene su larga vida media plasmática. La tecnología de fusión a Fc más reciente enlaza una única copia de un producto biofarmacéutico a la región Fc de un anticuerpo para optimizar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del producto biofarmacéutico en comparación con los conjugados de fusión a Fc tradicionales.

La presente descripción contempla el uso de otras modificaciones, actualmente conocidas o desarrolladas en el futuro, de los polipéptidos para mejorar una o más propiedades. Uno de tales métodos para prolongar la vida media en circulación, aumentar la estabilidad, reducir el aclaramiento o alterar la inmunogenicidad o alergenicidad de un polipéptido de la presente descripción implica la modificación de las secuencias polipeptídicas mediante hesilación, que utiliza derivados de hidroxietil almidón unidos a otras moléculas para modificar las características de la molécula. Diversos aspectos de la hesilación se describen, por ejemplo, en las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 2007/0134197 y 2006/0258607.

Síntesis de péptidos/polipéptidosin vitro

Las proteínas o péptidos pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica, que incluye la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos a través de técnicas de biología molecular estándar, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales, traducciónin vitroo la síntesis química de proteínas o péptidos.

Los péptidos pueden sintetizarse químicamente fácilmente mediante el uso de reactivos que están libres de bacterias o sustancias de origen animal contaminantes (documento de Merrifield RB: Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc.85:2149-54, 1963). En algunos casos, los péptidos antigénicos se preparan mediante (1) síntesis paralela en fase sólida en instrumentos multicanal mediante el uso de condiciones uniformes de síntesis y escisión; (2) purificación en una columna de RP-HPLC con extracción de la columna; y nuevo lavado, pero no reemplazo, entre péptidos; seguido de (3) análisis con un conjunto limitado de los ensayos más informativos. La huella de las buenas prácticas de fabricación (GMP) puede definirse en torno al conjunto de péptidos para un paciente individual, por lo que se requieren procedimientos de recambio de conjunto solo entre síntesis de péptidos para diferentes pacientes.

Alternativamente, un ácido nucleico (por ejemplo, un polinucleótido) que codifica un péptido antigénico de la presente descripción puede usarse para producir el péptido antigénicoin vitro.El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, PNA, CNA, ARN, formas de polinucleótidos monocatenarios y/o bicatenarios, o nativos o estabilizados, tales como, por ejemplo, polinucleótidos con una cadena principal de fosforotiato, o sus combinaciones y puede contener intrones siempre que codifiquen el péptido. En un caso se usa traducciónin vitropara producir el péptido. Existen muchos sistemas ilustrativos que un experto en la técnica podría utilizar (por ejemplo, Kit Retic Lysate IVT, Life Technologies, Waltham, MA). También puede prepararse un vector de expresión que puede expresar un polipéptido. Los vectores de expresión para diferentes tipos de células se conocen bien en la técnica y pueden seleccionarse sin experimentación excesiva. Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, tal como un plásmido, en la orientación adecuada y en el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el oligonucleótido puede unirse a las secuencias de nucleótidos de control reguladoras de la transcripción y la traducción apropiadas que se reconocen por el huésped deseado (por ejemplo,bacterias), aunque tales controles generalmente están disponibles en el vector de expresión. Después, el vector se introduce en la bacteria huésped para su clonación mediante el uso de técnicas estándar (ver, por ejemplo,documento de Sambrook y otros, (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

También se contemplan vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos aislados, así como también células huésped que contienen los vectores de expresión. Los péptidos antigénicos pueden proporcionarse en forma de moléculas de ARN o ADNc que codifican los péptidos antigénicos deseados. Uno o más péptidos antigénicos de la descripción pueden codificarse mediante un único vector de expresión.

En algunas modalidades, los polinucleótidos comprenden la secuencia codificante del péptido antigénico específico de una enfermedad fusionado en el mismo marco de lectura con un polinucleótido que ayuda, por ejemplo, en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula huésped (por ejemplo, una secuencia líder que funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte del polipéptido desde la célula). El polipéptido que tiene una secuencia líder es una pre-proteína y puede tener una secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido.

En algunos casos, los polinucleótidos pueden comprender la secuencia codificante del péptido antigénico específico de una enfermedad fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia marcadora que permite, por ejemplo, la purificación del polipéptido codificado, que después puede incorporarse en una composición vacunal o inmunogénica contra la enfermedad personalizada. Por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina suministrada por el vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado con el marcador en el caso de un huésped bacteriano, o la secuencia marcadora puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) derivada de la proteína hemaglutinina de influenza, cuando se usa un huésped mamífero (por ejemplo células COS-7). Las etiquetas adicionales incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de calmodulina, etiquetas FLAG, etiquetas Myc, etiquetas S, etiquetas SBP, etiquetas Softag 1, Softag 3, etiquetas de V5, etiquetas Xpress, Isopeptag, SpyTag, etiquetas de proteína portadora de biotina-carboxilo (BCCP), etiquetas GST, etiquetas de proteínas fluorescentes (por ejemplo, etiquetas de proteína fluorescente verde), etiquetas de proteína de unión a maltosa, etiquetas Nus, etiqueta Strep-tag, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta TC, etiqueta Ty y similares.

En algunos casos, los polinucleótidos pueden comprender la secuencia codificante de uno o más péptidos antigénicos específicos de una enfermedad fusionados en el mismo marco de lectura para crear una única construcción de péptidos antigénicos concatamerizados que puede producir múltiples péptidos antigénicos.

En algunos casos, pueden proporcionarse moléculas de ácidos nucleicos aisladas que tienen una secuencia de nucleótidos idéntica al menos 60 % idéntica, al menos 65 % idéntica, al menos 70 % idéntica, al menos 75 % idéntica, al menos 80 % idéntica, al menos 85 % idéntica, al menos 90 % idéntica, al menos un 95 % idéntica o al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a un polinucleótido que codifica un péptido antigénico específico de una enfermedad de la presente descripción.

Los péptidos antigénicos aislados específicos de una enfermedad descritos en la presente descripción pueden producirsein vitro(por ejemplo, en el laboratorio) mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Tales métodos se extienden desde los métodos directos sintéticos para la proteína hasta la construcción de la secuencia de ADN que codifica las secuencias aisladas de polipéptido y la expresión de esas secuencias en un huésped adecuado transformado. En algunos casos, una secuencia de ADN se construye mediante el uso de tecnología recombinante por aislamiento o síntesis de una secuencia de ADN que codifica una proteína de tipo salvaje de interés. De forma opcional, la secuencia se puede mutar por mutagénesis sitio-específica para proporcionar análogos funcionales de éstos. Ver, por ejemplo, documento de Zoeller y otros, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) y la patente de Estados Unidos núm. 4,588,585.

En algunos casos una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de interés se construirá por síntesis química mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos. Tales oligonucleótidos pueden diseñarse en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado y seleccionar aquellos codones que se favorecen en la célula huésped en la que se produce el polipéptido recombinante de interés. Los métodos estándares se pueden aplicar para sintetizar una secuencia aislada del polinucleótido que codifica un polipéptido aislado de interés. Por ejemplo, una secuencia completa de aminoácido puede usarse para construir un gen pos-traducido. Además, se puede sintetizar un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido aislado en particular. Por ejemplo, varios oligonucleótidos pequeños que codifican para porciones del polipéptido conveniente pueden sintetizarse y ligarse después. Típicamente los oligonucleótidos individuales contienen extremos salientes 5' o 3' para el ensamblaje complementario

Una vez ensambladas (por ejemplo,por síntesis, mutagénesis sitio dirigida u otro método), las secuencias polinucleotídicas que codifican un polipéptido de interés aislado particular se insertan en un vector de expresión y opcionalmente se unen operativamente a una secuencia de control de la expresión apropiada para la expresión de la proteína en un huésped deseado. El ensamblaje correcto se puede confirmar por la secuenciación de nucleótidos, el mapeo de restricción, y la expresión de un polipéptido biológicamente activo en un huésped adecuado. Como se conoce bien en la técnica, para obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen puede unirse operativamente a las secuencias de control de la expresión transcripcionales y traduccionales que son funcionales en el huésped de expresión elegido.

Pueden usarse vectores de expresión recombinantes para amplificar y expresar el ADN que codifica los péptidos antigénicos específicos de una enfermedad. Los vectores de expresión recombinante son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintéticos o derivados de ADNc que codifican un péptido antigénico específico de una enfermedad o un análogo bioequivalente unido operativamente a elementos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados derivados de genes de mamíferos, microbios, virus o insectos. Una unidad transcripcional generalmente comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores de la transcripción, (2) una secuencia estructural o codificante, que se transcribe a ARNm y se traduce a proteína, y (3) las secuencias apropiadas de iniciación de la transcripción y la traducción y de terminación, como se describe en detalle en la presente descripción. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia del operador para controlar la transcripción. La capacidad de replicarse en un huésped, por lo general se confiere por un origen de replicación, y se puede incorporar además un gen de selección para facilitar el reconocimiento de los transformantes. Las regiones de ADN se unen operativamente cuando ellas están relacionadas entre sí de forma funcional. Por ejemplo, el ADN de un péptido señal (líder de secreción) se enlaza operativamente al ADN para un polipéptido si este se expresa como un precursor que participa en la secreción del polipéptido; un promotor se une operativamente a una secuencia de codificación si este controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma se une operativamente a una secuencia de codificación si esta se coloca para permitir la traducción. Generalmente, unido operativamente significa contiguo, y, en el caso de líderes de secreción, significa contigua y en marco de lectura. Los elementos estructurales destinados para el uso en los sistemas de expresión de levadura incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Por otra parte, donde la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, esta puede incluir un residuo de metionina N-terminal. Este residuo de forma opcional puede ser posteriormente escindido a partir de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

Los vectores de expresión útiles para los huéspedes eucariotas, especialmente mamíferos o seres humanos incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de la expresión de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresión útiles para los huésped bacterianos incluyen los plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de Escherichia coli, incluyendo pCR 1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos del más amplio intervalo de huéspedes, tales como M13 y fagos filamentosos con ADN de cadena sencilla.

Las células huésped adecuadas para la expresión de un polipéptido incluyen células procariotas, de levaduras, de insectos o de eucariotas superiores bajo el control de los promotores apropiados. Las procariotas incluyen organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilos. Las células de eucariotas superiores incluyen líneas celulares establecidas originadas de mamífero. Se podrían también emplear los sistemas de traducción libres de célula. Los vectores de clonación y expresión apropiados para el uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y mamíferos se conocen bien en la técnica (ver documento de Pouwels y otros, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).

Varios sistemas de cultivo de células de mamíferos o de insectos también se emplean ventajosamente para expresar la proteína recombinante. La expresión de las proteínas recombinantes en las células de mamíferos puede realizarse porque tales proteínas son en general correctamente plegadas, apropiadamente modificadas y completamente funcionales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos adecuadas incluyen las líneas COS-7 de células de riñón de mono, descritas porGluzman (Cell 23:175, 1981), y otras líneas celulares que pueden expresar un vector adecuado que incluyen, por ejemplo, las líneas celulares de células L, C127, 3T3, ovario de hámster chino (CHO), 293, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamíferos pueden comprender elementos no transcritos tales como un origen de replicación, un promotor adecuado y potenciador unido al gen para que se exprese, y otras secuencias no transcritas que flanquean 5' o 3', y secuencias no traducidas 5' o 3', sitios de unión al ribosoma, tal como sean necesarios, un sitio de poliadenilación, sitio donador y sitios aceptores, y las secuencias transcripcional de terminación. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se reseñan en documento de Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).

Las proteínas producidas por un huésped transformado pueden purificarse de acuerdo con cualquier método adecuado. Tales métodos estándar incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y por tamaño, y similares), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Las etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de unión a maltosa, secuencia de envoltura de la influenza, glutatión-S-transferasa y similares pueden unirse a la proteína para permitir la fácil purificación por el paso a través de una columna de afinidad apropiada. Las proteínas aisladas también se pueden caracterizar físicamente mediante técnicas tales como la proteólisis, la resonancia magnética nuclear y la cristalografía de rayos X. Por ejemplo, los sobrenadantes de los sistemas que secretan la proteína recombinante en los medios de cultivo se pueden concentrar primero mediante el uso de un filtro de concentración de proteína disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. A continuación de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una adecuada matriz de purificación. Por otra parte, una resina de intercambio aniónico se puede emplear, por ejemplo, una matriz o sustrato que tiene grupos colgantes de dietilaminoetil (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrana, celulosa u otros tipos comúnmente empleadas en la purificación de proteínas. Por otra parte, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los adecuados intercambiadores de cationes incluyen diversas matrices insolubles que comprenden los grupos sulfopropil o carboximetilcelulosa. Por último, una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) que emplean medios hidrófobos de RP-HPLC, por ejemplo,gel de sílice que tiene grupos metilo u otros alifáticos colgantes, pueden emplearse para purificar adicionalmente una composición de proteína-Fc de células madre cancerosas. Algunas o todas las etapas de purificación precedentes, en diversas combinaciones, se pueden también emplear para proporcionar una proteína recombinante homogénea. La proteína recombinante producida en cultivo bacteriano puede aislarse, por ejemplo, por la extracción inicial a partir de los sedimentos celulares, seguido de una o más etapas de concentración, precipitación por sales, cromatografía de intercambio iónico acuoso o de exclusión por tamaño. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se puede emplear para las etapas finales de purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de una proteína recombinante se pueden romper por cualquier método conveniente, que incluyen ciclo de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o el uso de agentes que lisan células.

Síntesis de péptidos/polipéptidosin vivo

La presente descripción también contempla el uso de moléculas de ácidos nucleicos como vehículos para suministrar péptidos/polipéptidos antigénicos al sujeto que los necesitain vivo,en forma de, por ejemplo,vacunas de ADN/ARN (ver, por ejemplo, los documentos WO2012/159643 y WO2012/159754).

En algunos casos, pueden administrarse antígenos a un paciente que lo necesita mediante el uso de un plásmido.

Estos son plásmidos que por lo general consisten en un promotor viral fuerte para controlar la transcripción y traducciónin vivodel gen (o el ADN complementario) de interés (documento de Mor, y otros, (1995). The Journal of Immunology 155 (4): 2039-2046). A veces puede incluirse el intrón A para mejorar la estabilidad del ARNm y, por lo tanto, aumentar la expresión de proteínas (documento de Leitner, y otros, (1997). The Journal of Immunology 159 (12): 6112-6119). Los plásmidos también incluyen una fuerte señal de poliadenilación/terminación de la transcripción, tales como las secuencias de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina o de la betaglobulina de conejo (documentos de Alarcón y otros, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343 410; Robinson y otros, (2000). Adv. Virus Res. Advances in Virus Research 55: 1-74; Bohm y otros, (1996). Journal of Immunological Methods 193 (1): 29-40.). A veces se construyen vectores multicistrónicos para expresar más de un inmunógeno, o para expresar un inmunógeno y una proteína inmunoestimuladora (documento de Lewis y otros, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88)

Los plásmidos pueden introducirse en tejidos animales mediante una serie de métodos diferentes. Los dos enfoques más populares son la inyección de ADN en solución salina, mediante el uso de una aguja hipodérmica estándar y el suministro con pistola de genes. Una representación esquemática de la construcción de un plásmido de vacuna de ADN y su suministro subsecuente mediante estos métodos en un huésped se ilustra en Scientific American (documento de Weiner y otros, (1999) Scientific American 281 (1): 34-41). La inyección de solución salina normalmente se realiza por vía intramuscular (IM) en el músculo esquelético o por vía intradérmica (ID), con suministro del ADN a los espacios extracelulares. Esto puede facilitarse mediante electroporación al dañar temporalmente las fibras musculares con miotoxinas tales como la bupivacaína; o mediante el uso de soluciones hipertónicas de solución salina o sacarosa (documento de Alarcón y otros, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410). Las respuestas inmunitarias a este método de administración pueden verse afectadas por muchos factores, que incluyen el tipo de aguja, la alineación de la aguja, la velocidad de inyección, el volumen de inyección, el tipo de músculo y la edad, el sexo y la condición fisiológica del animal que se inyecta (documento de Alarcón y otros, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410).

El suministro por pistola de genes, el otro método de suministro usado comúnmente, acelera balísticamente el ADN plasmídico (ADNp) que se ha adsorbido en micropartículas de oro o tungsteno en las células diana, mediante el uso de helio comprimido como acelerante (documentos de Alarcón y otros, (1999). Adv. Parasitol. Advances in Parasitology 42: 343-410; Lewis y otros, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88).

Los métodos de suministro alternativos pueden incluir la instilación en aerosol de ADN desnudo en superficies mucosas, tales como la mucosa nasal y pulmonar (documento de Lewis y otros, (1999). Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88) y administración tópica de ADNp en el ojo y la mucosa vaginal (documento de Lewis y otros, (1999) Advances in Virus Research (Academic Press) 54: 129-88). El suministro a la superficie de la mucosa también se ha logrado mediante el uso de preparaciones de ADN-liposomas catiónicos, microesferas biodegradables, vectores de Shigella o Listeria atenuados para administración oral a la mucosa intestinal y vectores adenovirales recombinantes. El ADN o el ARN también pueden suministrarse a las células tras una leve alteración mecánica de la membrana celular, que permeabiliza temporalmente las células. Esta leve alteración mecánica de la membrana puede lograrse al forzar suavemente el paso de las células a través de una pequeña abertura (documento Ex vivo Cytosolic Delivery of Functional Macromolecules to Immune Cells, Share y otros, PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.011880313 de abril de 2015).

En algunos casos, una composición vacunal o inmunogénica específica de una enfermedad puede incluir plásmidos de ADN independientes que codifican, por ejemplo, uno o más péptidos/polipéptidos antigénicos identificados de acuerdo con la descripción. Como se analiza en la presente descripción, la elección exacta de los vectores de expresión puede depender del péptido/polipéptido a expresar, y está dentro de la habilidad del experto. Se espera que la persistencia esperada de las construcciones de ADN (por ejemplo, en una forma episomal, no replicante y no integrada en las células musculares) proporcione una mayor duración de la protección.

Uno o más péptidos antigénicos de la presente descripción pueden codificarse y expresarsein vivomediante el uso de un sistema basado en virus (por ejemplo, un sistema de adenovirus, un vector de virus adenoasociado (AAV), un poxvirus o un lentivirus). En un caso, la composición vacunal o inmunogénica contra la enfermedad puede incluir un vector basado en virus para su uso en un paciente humano que lo necesita, tal como, por ejemplo, un adenovirus (ver, por ejemplo, documento de Baden y otros. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis. 15 de enero de 2013;207(2):240-7). Los plásmidos que pueden usarse para el suministro de virus adenoasociados, adenovirus y lentivirus se han descrito previamente (ver por ejemplo,las patentes de Estados Unidos núms. 6,955,808 y 6,943,019, y la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20080254008).

Los péptidos y polipéptidos de la descripción también se pueden expresar mediante un vector, por ejemplo,una molécula de ácido nucleico como se analiza en la presente descripción, por ejemplo,ARN o un plásmido de ADN, un vector viral como un poxvirus, por ejemplo, ortopoxvirus, avipoxvirus o adenovirus, AAV o lentivirus. Este enfoque implica el uso de un vector para expresar secuencias de nucleótidos que codifican el péptido de la descripción. Tras la introducción en un huésped infectado de forma aguda o de forma crónica o en un huésped no infectado, el vector expresa el péptido inmunogénico y de esta manera provoca una respuesta CTL del huésped.

Entre los vectores que pueden usarse en la práctica de la descripción, la integración en el genoma huésped de una célula es posible con métodos de transferencia de genes de retrovirus, lo que a menudo da como resultado una expresión a largo plazo del transgén insertado. En algunos casos, el retrovirus es un lentivirus. Adicionalmente, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos de células y tejidos diana diferentes. El tropismo de un retrovirus puede alterarse mediante la incorporación de proteínas de envoltura extrañas, lo que expande la población diana potencial de células diana. También puede manipularse un retrovirus para permitir la expresión condicional del transgén insertado, de manera que el lentivirus solo infecte ciertos tipos de células. Pueden usarse promotores específicos del tipo de célula para dirigirse a la expresión en tipos de células específicos. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales (y por lo tanto, en la práctica de la descripción pueden usarse tanto vectores lentivirales como retrovirales). Por otra parte, los vectores lentivirales pueden transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen títulos virales elevados. Por lo tanto, la selección de un sistema retroviral de transferencia de genes puede depender del tejido diana. Los vectores retrovirales están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis y tienen capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas que actúan en cis son suficientes para la replicación y el empaquetado de los vectores, que después se usan para integrar el ácido nucleico deseado en la célula diana para proporcionar una expresión permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados que pueden usarse en la práctica de la descripción incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones (ver, por ejemplo, documentos de Buchscher y otros, (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann y otros, (1992) J. Virol.66: 1635-1640; Sommnerfelt y otros, (1990) Virol. 176:58-59; Wilson y otros, (1998) J. Virol.63:2374-2378; Miller y otros, (1991) J. Virol.65:2220-2224; documento PCT/US94/05700).

También es útil en la práctica de la descripción un vector lentiviral mínimo no relacionado con primates, tal como un vector lentiviral basado en el virus de la anemia infecciosa equina (EIAV) (ver, por ejemplo, documento de Balagaan, (2006) J Gene Med; 8: 275-285, publicado en línea el 21 de noviembre de 2005 en Wiley InterScience (www.interscience.wiley.com). DOI: 10.1002/jgm.845). Los vectores pueden tener un promotor de citomegalovirus (CMV) que controle la expresión del gen diana. En consecuencia, la descripción contempla entre los vectores útiles en la práctica de la descripción: vectores virales, que incluyen vectores retrovirales y vectores lentivirales.

Se han descrito vectores lentivirales en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, ver, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos núm. 20120295960 y las patentes de Estados Unidos núms. 7303910 y 7351585. También se han descrito vectores lentivirales para el suministro al cerebro, ver, por ejemplo,las publicaciones de patente de Estados Unidos núms. US20110293571; US20040013648, US20070025970, US20090111106 y la patente de Estados Unidos núm. US7259015. En otro caso, se usan vectores lentivirales para suministrar vectores al cerebro de quienes se tratan por una enfermedad. En cuanto a los sistemas de vectores lentivirales útiles en la práctica de la descripción, se menciona las patentes de Estados Unidos núms. 6428953, 6165782, 6013516, 5994136, 6312682, y 7,198,784 y documentos citados en las mismas. En un caso en la presente descripción el suministro es por medio de un lentivirus. Zou y otros administraron alrededor de 10 pl de un lentivirus recombinante que tiene un título de 1 ^ 109 unidades de transducción (TU)/ml mediante un catéter intratecal. Este tipo de dosis se pueden adaptar o extrapolar al uso de un vector retroviral o lentiviral en la presente descripción. Para la transducción en tejidos tales como el cerebro, es necesario usar volúmenes muy pequeños, por lo que la preparación viral se concentra mediante ultracentrifugación. Pueden usarse otros métodos de concentración tales como ultrafiltración o unión y elución de una matriz. En otros casos la cantidad de lentivirus administrada puede ser de 1*105 o alrededor de 1*105 unidades formadoras de placa (PFU), 5*105 o alrededor de 5*105 PFU, 1*106 o alrededor de 1.*106 PFU, 5*106 o alrededor de 5*106 PFU, 1*107 o alrededor de 1x107 PFU, 5*107 o alrededor de 5*107 PFU, 1*108 o alrededor de 1*108 PFU, 5*108 o alrededor de 5*108 PFU, 1*109 o alrededor de 1*109PFU, 5*109 o alrededor de 5*109PFU, 1*101° o alrededor de 1*101° PFU o 5*101° o alrededor de 5*101° PFU como dosis única total para un ser humano promedio de 75 kg o ajustada por el peso, talla y especie del sujeto. Un experto en la técnica puede determinar la dosis adecuada. Las dosis adecuadas para un virus pueden determinarse empíricamente.

También es útil en la práctica de la descripción un vector adenoviral. Una ventaja es la capacidad de los adenovirus recombinantes para transferir y expresar genes recombinantes de manera eficiente en una variedad de células y tejidos de mamíferosin vitroein vivo,lo que da como resultado la alta expresión de los ácidos nucleicos transferidos. Además, la capacidad de infectar productivamente células inactivas expande la utilidad de los vectores adenovirales recombinantes. Además, los altos niveles de expresión garantizan que los productos de los ácidos nucleicos se expresarán a niveles suficientes para generar una respuesta inmunitaria (ver por ejemplo, las patente de Estados Unidos núm. 7,029,848). En cuanto a los vectores adenovirales útiles en la práctica de la descripción, se hace mención de la patente de Estados Unidos núm. 6,955,808. El vector adenoviral usado puede seleccionarse del grupo que consiste en los vectores Ad5, Ad35, Ad11, C6 y C7. Se ha publicado la secuencia del genoma del adenovirus 5 ("Ad5"). (documento de Chroboczek, J., Bieber, F. y Jacrot, B. (1992) The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virology 186, 280-285). Los vectores Ad35 se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 6,974,695, 6,913,922 y 6,869,794. Los vectores Ad11 se describen en la patente de Estados Unidos núm. 6,913,922. Los vectores adenovirales C6 se describen en las patentes de Estados Unidos núms. 6,780,407; 6,537,594; 6,309,647; 6,265,189; 6,156,567; 6,090,393; 5,942,235 y 5,833,975. Los vectores C7 se describen en la patente de Estados Unidos núm. 6,277,558. También pueden usarse vectores adenovirales que tienen E1 defectuoso o eliminado, E3 defectuoso o eliminado y/o E4 defectuoso o eliminado. Ciertos adenovirus que tienen mutaciones en la región E1 tienen un margen de seguridad mejorado porque los mutantes de adenovirus con E1 defectuoso tienen una replicación defectuosa en células no permisivas o, como mínimo, están muy atenuados. Los adenovirus que tienen mutaciones en la región E3 pueden tener mejorada la inmunogenicidad al alterar el mecanismo por el cual los adenovirus regulan negativamente las moléculas de MHC de clase I. Los adenovirus que tienen mutaciones de E4 pueden tener una inmunogenicidad reducida del vector adenoviral debido a la supresión de la expresión génica tardía. Dichos vectores pueden ser particularmente útiles cuando se desea una revacunación repetida que utiliza el mismo vector. Pueden usarse vectores adenovirales que están eliminados o mutados en E1, E3, E4, E1 y E3, y E1 y E4 de acuerdo con la presente descripción. Además, de acuerdo con la presente descripción también pueden usarse vectores adenovirales "destripados", en los que todos los genes virales están eliminados. Tales vectores requieren un virus auxiliar para su replicación y requieren una línea celular 293 humana especial que expresa tanto E1a como Cre, una condición que no existe en el ambiente natural. Tales vectores "destripados" no son inmunogénicos y, por lo tanto, los vectores pueden inocularse múltiples veces para la revacunación. Los vectores adenovirales "destripados" pueden usarse para la inserción de insertos/genes heterólogos tales como los transgenes de la presente descripción, e incluso pueden usarse para el suministro conjunto de un gran número de insertos/genes heterólogos. En algunos casos, el suministro es por medio de un adenovirus, que puede ser con una única dosis de refuerzo. En algunos casos, el adenovirus se suministra por medio de múltiples dosis. En términos de suministroin vivo,el AAV tiene ventajas sobre otros vectores virales debido a su baja toxicidad y baja probabilidad de causar mutagénesis por inserción porque no se integran en el genoma del huésped. El AAV tiene un límite de empaquetamiento de 4,5 o 4,75 Kb. Las construcciones de más de 4,5 o 4,75 Kb dan como resultado una producción de virus significativamente reducida. Hay muchos promotores que pueden usarse para controlar la expresión de moléculas de ácidos nucleicos. ITR de AAV puede servir como promotor y es ventajoso para eliminar la necesidad de un elemento promotor adicional. Para una expresión ubicua, pueden usarse los siguientes promotores: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, cadenas pesadas o ligeras de ferritina, etc. Para la expresión cerebral, pueden usarse los siguientes promotores: SinapsinaI para todas las neuronas, CaMKIIalfa para neuronas excitadoras, GAD67 o GAD65 o VGAT para neuronas GABAérgicas, etc. Los promotores usados para controlar la síntesis de ARN pueden incluir: Promotores de Pol III tales como U6 o H1. Puede usarse el uso de un promotor de Pol II y casetes intrónicos para expresar el ARN guía (ARNg). Con respecto a los vectores AAV útiles en la práctica de la descripción, se hace mención de las patentes de Estados Unidos núms. 5658785, 7115391, 7172893, 6953690, 6936466, 6924128, 6893865, 6793926, 6537540, 6475769 y 6258595 y documentos citados en las mismas. En cuanto a AAV, el AAV puede ser AAV1, AAV2, AAV5 o cualquiera de sus combinaciones. Puede seleccionarse el AAV con respecto a las células a las que se dirigirá; por ejemplo, pueden seleccionarse los serotipos de AAV 1, 2, 5 o una cápside híbrida AAV1, AAV2, a AV5 o cualquiera de sus combinaciones para dirigirse a células cerebrales o neuronales; y puede seleccionarse AAV4 para dirigirse al tejido cardíaco. El AAV8 es útil para el suministro al hígado. En algunos casos el suministro es por medio de un AAV. La dosis puede ajustarse para equilibrar el beneficio terapéutico con cualquier efecto secundario.

En algunos casos, puede lograrse la activación efectiva de una respuesta inmunitaria celular para una composición vacunal o inmunogénica contra una enfermedad mediante la expresión de los antígenos relevantes en una composición vacunal o inmunogénica en un microorganismo no patógeno. Ejemplos bien conocidos de tales microorganismos son Mycobacterium bovis BCG, Salmonella y Pseudomona (ver, la patente de Estados Unidos núm. 6,991,797).

En algunos casos, se usa un Poxvirus en la composición vacunal o inmunogénica contra una enfermedad. Estos incluyen ortopoxvirus, avipox, vaccinia, MVA, NYVAC, viruela del canario, ALVAC, viruela aviar, TROVAC, etc. (ver por ejemplo, documentos de Verardi y otros, Hum Vaccin Immunother. julio de 2012;8(7):961-70; y Moss, Vaccine.

2013; 31(39): 4220-4222). Los vectores de expresión poxvirus se describieron en 1982 y rápidamente se usaron ampliamente para el desarrollo de vacunas, así como también para la investigación en numerosos campos. Las ventajas de los vectores incluyen una construcción sencilla, la capacidad de acomodar grandes cantidades de ADN extraño y altos niveles de expresión. Información sobre los poxvirus que pueden usarse en la práctica de la descripción, tales como poxvirus de la subfamilia Chordopoxvirinae (poxvirus de vertebrados), por ejemplo, ortopoxvirus y avipoxvirus, por ejemplo, virus vaccinia (por ejemplo, cepa Wyeth, cepa WR (por ejemplo, ATCC® VR-1354), cepa Copenhague, N<y>V<a>C, NYVAC.1, NY<v>A<c>.2, MVA,<m>V<a>-BN), virus de la viruela del canario (por ejemplo, cepa Wheatley C93, ALVAC), virus de la viruela aviar (por ejemplo, cepa FP9, cepa Webster, TROVAC), viruela de la paloma, viruela de las palomas, viruela de las codornices y viruela del mapache, entre otros, recombinantes sintéticos o no naturales de los mismos, usos de los mismos y los métodos para preparar y usar tales recombinantes pueden encontrarse en la bibliografía científica y de patentes.

En algunos casos, el virus vaccinia se usa en la composición vacunal o inmunogénica contra una enfermedad para expresar un antígeno. (documento de Rolph y otros, Recombinant viruses as vaccines and immunological tools. Curr Opin Immunol 9:517-524, 1997). El virus vaccinia recombinante puede replicarse dentro del citoplasma de la célula huésped infectada y, por lo tanto, el polipéptido de interés puede inducir una respuesta inmunitaria. Además, los poxvirus se han usado ampliamente como vectores de composición vacunal o inmunogénica debido a su capacidad para dirigirse a antígenos codificados para su procesamiento mediante la vía del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I mediante la infección directa de células inmunitarias, en particular células presentadoras de antígeno, pero también debido a su capacidad de ser autoadyuvante.

En algunos casos, ALVAC se usa como vector en una composición vacunal o inmunogénica contra una enfermedad. ALVAC es un virus de la viruela del canario que puede modificarse para expresar transgenes extraños y se ha usado como método de vacunación contra antígenos tanto procariotas como eucariotas (documentos de Horig H, Lee DS, Conkright W, y otros. Phase I clinical trial of a recombinant canarypoxvirus (ALVAC) vaccine expressing human carcinoembryonic antigen and the B7.1 co-stimulatory molecule. Cancer Immunol Immunother 2000;49:504-14; von Mehren M, Arlen P, Tsang KY, y otros. Pilot study of a dual gene recombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen (CEA) and B7.1 transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas. Clin Cancer Res 2000;6:2219-28; Musey L, Ding Y, Elizaga M, y otros. HIV-1 vaccination administered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cell immunity in HIV-1-uninfected individuals. J Immunol 2003;171:1094-101; Paoletti E. Applications of pox virus vectors to vaccination: an update. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:11349-53; la patente de Estados Unidos núm. 7,255,862). En un ensayo clínico de fase I, un virus ALVAC que expresa el antígeno tumoral CEA mostró un excelente perfil de seguridad y dio como resultado un aumento de las respuestas de células T específicas de CEA en pacientes seleccionados; sin embargo, no se observaron respuestas clínicas objetivas (documento de Marshall<j>L, Hawkins MJ, Tsang KY, y otros. Phase I study in cancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine that expresses human carcinoembryonic antigen. J Clin Oncol 1999;17:332-7).

En algunos casos, puede usarse un virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) como vector viral para una composición vacunal antigénica o una inmunogénica. MVA es un miembro de la familia Orthopoxvirus y se ha generado por alrededor de 570 pases seriados en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del virus Vaccinia (CVA) (para una reseña, ver Mayr, A., y otros, Infection 3, 6-14, 1975). Como consecuencia de estos pases, el virus MVA resultante contiene 31 kilobases menos de información genómica en comparación con el CVA y está muy restringido a las células huésped (documento de Meyer, H. y otros, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991). MVA se caracteriza por su extrema atenuación, específicamente, por una virulencia o capacidad infecciosa disminuida, pero aún conserva una excelente inmunogenicidad. Cuando se evaluó en una variedad de modelos animales, se demostró que MVA es avirulento, incluso en individuos inmunodeprimidos. Además, MVA-BN®-HER2 es una inmunoterapia candidata diseñada para el tratamiento del cáncer de mama positivo para HER-2 y actualmente se encuentra en ensayos clínicos. (documento de Mandl y otros, Cancer Immunol Immunother. Enero de 2012; 61(1): 19-29). Se han descrito métodos para preparar y usar MVA recombinante (por ejemplo, ver las patentes de Estados Unidos núms. 8,309,098 y 5,185,146

En algunos casos, se administran partículas virales recombinantes de la composición vacunal o inmunogénica a pacientes que lo necesitan.

En la presente descripción se proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico para un sujeto con una enfermedad o afección que comprende proporcionar una población de células derivadas de un sujeto con una enfermedad o afección, expresar en una o más células de la población de células un alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad mediante la introducción en la una o más células de un ácido polinucleico que codifica una secuencia que comprende: una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase II recombinante unida operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la una o más células; enriquecer y caracterizar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y, opcionalmente desarrollar un agente terapéutico en base a la caracterización.

En algunos casos, la composición inmunogénica terapéutica o específica del sujeto comprende un péptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos o un o un polinucleótido que codifica el polipéptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos.

En algunos casos, la composición inmunogénica terapéutica o específica del sujeto comprende una célula T que expresa un receptor de células T (TCR) que se une específicamente al polipéptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos. En algunos casos, la composición inmunogénica específica del sujeto comprende una célula T con receptor de antígeno quimérico (CAR) que expresa un receptor que se une específicamente al polipéptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos. En algunos casos, el método comprende además administrar al sujeto otro agente terapéutico, opcionalmente, un inhibidor de puntos de regulación inmunológica. En algunos casos, el método comprende además administrar al sujeto un adyuvante, opcionalmente, poli-ICLC.

En algunos casos, la enfermedad o trastorno es cáncer. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es una enfermedad autoinmunitaria. En algunos casos, la enfermedad o trastorno es una infección. En algunos casos, la infección es causada por un agente infeccioso. En algunos casos, el agente infeccioso es un patógeno, un virus, una bacteria o un parásito. En algunos casos, el virus se selecciona del grupo que consiste en: Virus BK (BKV), virus del dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4, DENV-5), citomegalovirus (CMV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de Epstein-Barr (EBV), un adenovirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotrófico de células T humanas (HTLV-1), un virus de la influenza, RSV, HPV, rabia, virus de la rubéola paperas, poliovirus, fiebre amarilla, hepatitis A, hepatitis B, rotavirus, virus de la varicela, virus del papiloma humano (HPV), viruela, zóster y cualquiera de sus combinaciones. En algunos casos, la bacteria se selecciona del grupo que consiste en:Klebsiella spp., Tropheryma Whipplei, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepromatosisyMycobacterium tuberculosis,tifoidea, neumococo, meningococo, haemophilus B, ántrax, toxoide tetánico, meningococo del grupo B, bcg, cólera y sus combinaciones. En algunos casos, el parásito es un helminto o un protozoo. En algunos casos, el parásito se selecciona del grupo que consiste en:Leishmania spp., Plasmodium spp., Trypanosoma cruzi, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Necator americanus, Schistosoma spp.y cualquiera de sus combinaciones.

En la presente descripción se proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico para un sujeto con una enfermedad o afección que comprende: proporcionar una población de células, en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica los al menos dos HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad comprende una primera secuencia recombinante que comprende una secuencia que codifica un primer alelo de HLA de clase II unida operativamente a una secuencia que codifica un primer péptido aceptor de afinidad; y una segunda secuencia recombinante que comprende una secuencia que codifica un segundo alelo de HLA de clase II unida operativamente a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad; expresar los al menos dos HLA etiquetados con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la al menos una célula; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; e identificar un péptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos; y formular una composición inmunogénica en base a uno o más de los péptidos identificados, en donde el primer y el segundo alelos de HLA de clase II recombinantes son compatibles con un haplotipo de HLA de un sujeto.

En algunos casos, el sujeto tiene una enfermedad o afección. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es diferente del segundo alelo de HLA de clase II recombinante. En algunos casos, el primer péptido aceptor de afinidad es el mismo que el segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el método comprende caracterizar un péptido unido al primer y/o segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido del enriquecimiento. En algunos casos, los al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio transmembrana. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio intracelular. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no se excretan. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles. En algunos casos, el método comprende además generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA. En algunos casos, el método comprende introducir uno o más péptidos exógenos a la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con el uno o más péptidos exógenos o expresar el uno o más péptidos exógenos en la población de células. En algunos casos, la introducción comprende poner en contacto la población de células con uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos exógenos. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ADN. En algunos casos, el uno o más ácidos nucleicos que codifican el uno o más péptidos es ARN, opcionalmente en donde el ARN es ARNm. En algunos casos, el enriquecimiento no comprende el uso de un reactivo tetramérico. En algunos casos, el método comprende determinar la secuencia de un péptido o una porción del mismo unida al primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, la determinación comprende análisis bioquímico, análisis de espectrometría de masas, análisis MS, análisis MS/MS, análisis LC-MS/MS o una de sus combinaciones. En algunos casos, el método comprende evaluar una afinidad de unión o estabilidad de un péptido o una porción del mismo unido al primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento.

En algunos casos, el método comprende determinar si un péptido o una porción del mismo unido al primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento contiene una o más mutaciones. En algunos casos, el método comprende evaluar asociaciones de péptidos con moléculas de HLA en el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

En algunos casos, el método comprende expresar una biblioteca de péptidos en la población de células, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método comprende poner en contacto con la población de células una biblioteca de péptidos o una biblioteca de secuencias que codifican péptidos, de esta manera se forma una biblioteca de complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la biblioteca comprende una biblioteca de péptidos asociados con una enfermedad o afección. En algunos casos, la enfermedad o afección es cáncer o una infección con un agente infeccioso.

En algunos casos, el método comprende introducir el agente infeccioso o porciones del mismo en una o más células de la población de células. En algunos casos, el método comprende caracterizar uno o más péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA-péptido, opcionalmente en donde los péptidos son de una o más proteínas diana del agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende caracterizar una o más regiones de los péptidos de la una o más proteínas diana del agente infeccioso. En algunos casos, el método comprende identificar péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA-péptido derivados de un agente infeccioso.

En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias.

En algunos casos, el péptido del primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido puede activar una célula T de un sujeto cuando se presenta por una célula presentadora de antígeno. En algunos casos, el método comprende comparar complejos HLA-péptido de células enfermas con complejos HLA-péptido de células no enfermas.

En algunos casos, el método comprende además aislar péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la identificación.

En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase II en la superficie celular. En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I.

En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II.

En algunos casos, la secuencia que codifica los al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad codifica un HLA de clase I. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es un primer alelo de HLA de clase I y el segundo alelo de HLA de clase II recombinante es un segundo alelo de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica los al menos dos alelos de HLA de clase II etiquetados con aceptor de afinidad codifica un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de h La de clase II o una de sus combinaciones. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es un primer alelo de HLA de clase II y el segundo alelo de<h>L<a>de clase II recombinante es un segundo alelo de HLA de clase II.

En algunos casos, cada una de la primera secuencia y la segunda secuencia está unida operativamente. En algunos casos, la primera secuencia y la segunda secuencia están comprendidas en diferentes moléculas polinucleotídicas. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método no comprende lisar las células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad comprende una secuencia de etiqueta que comprende un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta cmyc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLA<g>, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad con el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de afinidad se une específicamente a la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la molécula de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la superficie sólida es una perla.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad que se une específicamente al primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del primer y/o segundo HLA de clase II codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción extracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica con una porción N-terminal del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II.

En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase II recombinante es una primera cadena a de HLA de clase I y el segundo alelo de HLA de clase II recombinante es una segunda cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un tercer péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el tercer péptido aceptor de afinidad es diferente del primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II y/o una cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una primera cadena a de HLA de clase II y una segunda cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica una primera cadena a de HLA de clase II y una segunda cadena a de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase II comprende una secuencia que codifica una primera cadena p de HLA de clase II y una segunda cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica una primera cadena p de HLA de clase II y una segunda cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II o la cadena a de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un tercer péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el tercer péptido aceptor de afinidad es diferente del primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el método comprende realizar análisis bioquímicos o espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas en tándem.

En algunos casos, el método comprende obtener una secuencia peptídica que corresponde a un espectro MS/MS de uno o más péptidos aislados a partir de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos de una base de datos de péptidos; en donde una o más secuencias obtenidas identifican la secuencia del uno o más péptidos.

En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 OS, ExpiCHO, CHO y THP1.

En algunos casos, la línea celular se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-y o una de sus combinaciones.

En algunos casos, la población de células comprende al menos 105 células, al menos 106 células o al menos 107 células. En algunos casos, la población de células es una población de células dendríticas, macrófagos, células cancerosas o células B. En algunos casos, la población de células comprende células tumorales.

En algunos casos, el primer y segundo alelo de HLA es un alelo de HLA mutado. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer o segundo alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. En algunos casos, el método comprende además realizar un ensayo de expresión del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el ensayo comprende secuenciar el primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar el ARN que codifica el ARN del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar la proteína del primer y/o segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad, o una de sus combinaciones. En algunos casos, el primer y segundo alelo de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad comprenden una secuencia de código de barras única. En algunos casos, la primera secuencia y la segunda secuencia comprenden una secuencia de código de barras única.

Ejemplos

Los ejemplos que se proporcionan más abajo son solo para propósitos ilustrativos. Los ejemplos descritos en la presente descripción que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones son para ayudar al experto en la comprensión y práctica de la invención descrita.

Ejemplo 1. Proceso de IP universal: Plataforma universal de identificación de complejos HLA monoalélico-péptido Las construcciones de inmunopurificación (IP) universal descritas en la presente descripción consisten en una construcción de ADN que codifica alelos de HLA de clase I o clase II con etiqueta de afinidad que se expresan a partir de un vector de expresión de mamífero por medio de transfección o transducción celular (Figura 1A y Figura 1B). En la Figura 2 se muestran construcciones de HLA de clase I y clase II ilustrativas. Las etiquetas de afinidad ilustrativas incluyen la secuencia peptídica del péptido aceptor de biotina (BAP) o de la hemaglutinina (HA) de influenza humana. Las etiquetas de afinidad pueden colocarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del alelo de HLA. Una secuencia de escisión, tal como F2A que se muestra en la Figura 2, o un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) puede colocarse entre la cadena a y la p2-microglobulina (clase I) o entre la cadena a y la cadena p (clase II). Los vectores ilustrativos incluyen un vector lentiviral como se muestra en la Figura 3. Se incorporan genes de resistencia de anticuerpos, tales como la resistencia a puromicina (Puro), en las construcciones para permitir la selección después de la transfección o transducción. Las células transfectadas o transducidas con construcciones de IP universal se expanden (Figura 4A) o se seleccionan y después se expanden (Figura 4B) antes de los análisis LC-MS/MS. En la Figura 5 se muestran esquemas de la plataforma de inmunopurificación universal para HLA de clase I y clase II.

Ejemplo 2. Cultivo celular e inmunopurificación y secuenciación de HLA-péptido

Se generaron células con HLA monoalélico mediante la transducción de células B721.221, A375, JEG-3, K562, Jurkat o HEK293T, HeLa o expi293 con un vector retroviral que codifica un único alelo deHLAde clase I (por ejemplo,HLA-A*02:01, HLA-A*23:01y HLA-B*14:02, o HLA-E*01:01) o alelo deHLAde clase II (por ejemplo,HLA-DRB*01:01, HLA-DRB*01:02 y HLA-DRB*11:01, o HLA-DRB*15:01, o HLA-DRB*07:01) como se describió previamente (Reche y otros, 2006). Los tipos de HLA de clase I o II de las líneas celulares se confirmaron mediante tipificación molecular estándar. Las células se cultivaron y se realizó la inmunopurificación de HLA-péptido.

En las figuras se muestra la prueba de concepto de la transducción de alelos de HLA de clase I (Figura 6C) en células HEK293T. 6A-6C. Se realizaron transducciones simulada, de GFP y de plásmido vacío con construcciones HLA-A*02:01 para la inmunopurificación universal basada en biotinilación y la biotinilación se confirmó en una transferencia Western (Figura 6A). Se usó un gel teñido con Ponceau como control de carga para el análisis de transferencia Western (Figura 6B). En las Figuras se muestran la optimización de la transfección y biotinilación de los alelos de HLA de clase I y clase II-BAP (Figura 7C) expresados en células HEK293T. 7A-7C. Un experimento de evolución temporal de la biotinilación demostró que la biotinilación de HLA-BAP marcado en el extremo C- y N-terminal se completó en 10 minutos para las células que expresan HLA de clase I y de clase II-BAP (Figura 7a y Figura 7B).

La proceso de IP universal descrito en la presente descripción se evaluó en múltiples tipos de células (Figuras 8A-8D). Las construcciones de IP universal para HLA de clase I y clase II se transfectaron en células HEK293T (riñón embrionario humano) (Figura 8A), HeLa (cáncer de cuello uterino humano) (Figura 8B), A375 (melanoma maligno humano) (Figura 8C) y Expi293 (riñón embrionario humano modificado genéticamente para cultivo de alta densidad y expresión de proteínas) (Figura 8D). Las transferencias Western se realizaron mediante el uso de antiestreptavidina para el marcador BAP y anti-HA para el marcador HA, y se usó un gel teñido con Ponceau como control de carga para las transferencias Western. Las transferencias Western confirmaron las expresiones de construcciones de clase I y clase II en todos los tipos de células evaluadas (Figuras 8A-8D).

A continuación se describen los materiales y métodos usados en este ejemplo.

IP universal de alelos de HLA de clase I y clase II (biotina)

Las células se transfectaron o transdujeron para expresar las construcciones de IP universal siguiendo métodos estándar. Después, de la transducción, las células se resuspenden en el medio y se transfieren a tubos Falcon de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se eliminó el medio. Después, las células se resuspendieron en 1,5 ml de PBS frío y se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Después, los tubos se centrifugaron (550 x g a 4 °C) durante 5 minutos. Se eliminó el PBS y después las células se resuspendieron en 1,2 ml de tampón de lisis. Las células se resuspendieron en el tampón seguido de la adición de benzonasa. Los tubos se incubaron en hielo con mezclado ocasional. Después, de 15 minutos de incubación en hielo, los tubos se centrifugaron (15000 x g a 4 °C) durante 20 minutos. Los sobrenadantes (500 jl) se transfirieron a otro tubo de 1,5 ml (prelavado) para la biotinilación. La biotinilación de los lisados celulares se logró mediante la adición de biotina, ATP y BirA a cada muestra. Después, la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se colocó en hielo antes de la inmunoprecipitación.

La inmunoprecipitación con perlas de NeutrAvidina o estreptavidina se realizó mediante la adición de suspensión de resina de agarosa prelavada de estreptavidina o NeutrAvidina al lisado biotinilado. Después, la muestra se coloca en un rotador de tubos y se incuba durante 30 minutos a 4 °C. Después, de la incubación de 30 minutos, las perlas se sedimentan por centrifugación (1500 x g, Imin, 4 °C) y el sobrenadante se elimina y se desecha. Después, las perlas se resuspendieron en 1 ml de tampón de lavado. Después, las perlas se sedimentaron por centrifugación (1500 x g, 1 min, 4 °C) y el tampón de lavado se eliminó y se desechó. Esta etapa se repitió para dar un total de cuatro lavados en tampón de lavado. Las perlas sedimentadas se resuspendieron en 1 ml de tampón Tris, se sedimentaron por centrifugación (1500 * g,1 min, 4 °C) y se eliminó el tampón Tris. Esta etapa se repitió para dar un total de cuatro lavados en tampón Tris. Se realizó un lavado final en agua de calidad MS mediante la resuspensión de las perlas en 1 ml de agua de calidad de espectrometría de masas y centrifugación (1500 x g, 1 min, 4 °C) para sedimentar las perlas. El sobrenadante se eliminó y las perlas se almacenaron a -80 °C o se sometieron inmediatamente a elución del HLA-péptido y desalinización.

IP universal en serie de alelos de HLA de clase II (etiquetados con HA y biotina)

Las células se transfectaron o transdujeron para expresar las construcciones de IP universal siguiendo los protocolos estándar. Después, de la transducción, las células se resuspenden en el medio y se transfieren a tubos Falcon de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min y se eliminó el medio. Después, las células se resuspendieron en 1,5 ml de PBS frío y se transfirieron a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Después, los tubos se centrifugaron (550 x g a 4 °C) durante 5 minutos. Se eliminó el PBS y después las células se resuspendieron en 1,2 ml de tampón de lisis. Las células se resuspendieron en el tampón seguido de la adición de benzonasa. Los tubos se incubaron en hielo con mezclado ocasional. Después, de 15 minutos de incubación en hielo, los tubos se centrifugaron (15 000 x g a 4 °C) durante 20 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a otro tubo de 1,5 ml (prelavado) para la biotinilación. La biotinilación de los lisados celulares se logró mediante la adición de biotina, ATP y BirA a cada muestra. Después, la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se colocó en hielo antes de la inmunoprecipitación.

La inmunoprecipitación de alelos de clase II etiquetados con HA se llevó a cabo mediante la adición de resina de agarosa con proteína G prelavada que estaba preunida con anticuerpo anti-HA. Después, la muestra se incubó durante 60 minutos a 4 °C en un rotador de tubos. Después, de la incubación de 60 min, las perlas se sedimentan por centrifugación (1500 x g, Imin, 4 °C) y el sobrenadante se eliminó y desechó. Las perlas se lavaron dos veces con tampón de lisis y se resuspendieron en tampón de lisis que contenía péptido HA libre y se incubaron durante 15 minutos a 4 °C en un rotador de tubos. Después, las perlas se sedimentaron por centrifugación (1500 x g, Imin, 4 °C) y el sobrenadante se transfirió a un Eppendorf de 1,5 ml que contenía 200 ul de perlas de agarosa con NeutrAvidina o estreptavidina prelavadas. Después, la muestra se colocó en un rotador de tubos y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. Después, de la incubación de 30 min, las perlas se sedimentan por centrifugación (1500 x g, Imin, 4 °C) y el sobrenadante se eliminó y desechó. Después, las perlas se resuspendieron en 1 ml de tampón de lavado. Después, las perlas se sedimentaron por centrifugación (1500 x g, lmin, 4 °C) y el tampón de lavado se eliminó y desechó. Esta etapa se repitió para dar un total de cuatro lavados en tampón de lavado. Las perlas sedimentadas se resuspendieron en 1 ml de tampón Tris, se sedimentaron por centrifugación (1500 x g, Imin, 4 °C) y se eliminó el tampón de lavado. Esta etapa se repitió para dar un total de cuatro lavados en el tampón Tris. Se realizó un lavado final en agua de calidad MS mediante la resuspensión de las perlas en 1 ml de agua de calidad de espectrometría de masas y centrifugación (1500 x g, Imin, 4 °C) para sedimentar las perlas. El sobrenadante se eliminó y las perlas se almacenaron a -80 °C o se sometieron inmediatamente a elución del HLA-péptido y desalinización.

Elución y desalinización de HLA-péptido

Los péptidos se eluyeron de los complejos HLA y se desalinizaron en puntas Empore C18 StageTips (3M, 2315) ensambladas en el propio laboratorio (Rappsilber y otros, 2007). La carga de muestras, los lavados y la elución se realizaron en una centrífuga de mesa a una velocidad máxima de 1500-3000 x g. Las puntas StageTips se equilibraron con dos lavados de metanol, dos lavados de acetonitrilo/ácido fórmico y dos lavados de ácido fórmico. En un tubo, las perlas secas de IP de péptidos asociados a HLA se descongelaron a 4 °C, se reconstituyeron en una mezcla de ACN/ácido fórmico y se cargaron en las puntas StageTips. Las perlas se lavaron con ácido fórmico y los péptidos se eluyeron posteriormente mediante el uso de dos rondas de incubaciones de 5 minutos en ácido acético al 10 %. Los volúmenes combinados de lavado y elución se combinaron y cargaron en puntas StageTips. Los tubos que contenían las perlas de IP se lavaron nuevamente con ácido fórmico y este volumen también se cargó en puntas StageTips. Los péptidos se lavaron dos veces en puntas StageTips o cartuchos de desalinización con ácido fórmico. Los péptidos se eluyeron mediante el uso de un gradiente escalonado de mezclas de ACN y ácido fórmico. Las eluciones escalonadas se combinaron y secaron hasta su terminación.

Ejemplo 3. Secuenciación de péptidos asociados a HLA de clase I y clase II por LC-MS/MS

Todos los análisis de nano LC-ESI-MS/MS emplearon las mismas condiciones de separación de LC que se describen más abajo. Las muestras se separaron por cromatografía mediante el uso de un Proxeon Easy Nano LC 1000 (Thermo Scientific, San José, CA) equipado con un capilar PicoFrit de 75 pm de diámetro interior con un emisor de 10 pm empaquetado bajo presión a ~20 cm con perlas de Reprosil C18 (tamaño de partícula de 1,9 pm, tamaño de los poros de 200 A, Dr. Maisch GmBH) y se calentó a 50 °C durante la separación.

Las muestras se cargaron en una mezcla de CAN y ácido fórmico y los péptidos se eluyeron con un gradiente lineal de 7-30 % de tampón B (ya sea 0,1 % de FA o 0,5 % de AcOH y 80 % o 90 % de ACN) durante 82 min, 30-90 % de tampón B durante 6 min y después se mantuvo a 90 % de tampón B durante 15 min a 200 nl/min (tampón A, 0,1 % de Fa y 3 % de ACN) para producir ~13 (FA), ver anchos de los picos. Durante la adquisición dependiente de los datos, los péptidos eluidos se introdujeron en un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific) equipado con una fuente de nanoelectropulverización a 2,2 kV. Se adquirió un MS de escaneo completo con una resolución de 30000 de 300 a 1800 m/z. Cada escaneo completo fue seguido por los 10 mejores escaneos MS2 dependientes de datos con una resolución de 15000, mediante el uso de un ancho de aislamiento de 0,7 m/z. En la Figura 9A se muestran los números de péptidos totales asociados a HLA únicos identificados a partir de múltiples tipos de células que expresan las construcciones de HLA de clase I y clase II con etiqueta de afinidad usadas en el proceso de IP universal. El número de péptidos únicos del perfil de péptidos monoalélicos de HLA de clase I se muestra en la Figura 9B. El número de péptidos únicos del perfil de péptidos monoalélicos de HLA de clase II se muestra en la Figura 9C. El análisis LC-MS/MS de péptidos asociados a HLA reveló las características de los péptidos asociados a HLA de clase I y clase II (Figuras 10A y 10B). En la Figura 10A se muestran las representaciones de logo de secuencia de péptidos asociados a HLA-A*02:01 de clase I y péptidos asociados a HM-DRp*11:01 de clase II aislados y secuenciados. Las comparaciones de la distribución de longitud de los péptidos asociados a HLA-A*02:01 de clase I (rojo) y los péptidos asociados a HM-DRp*11:01 de clase II (azul) mostraron que los péptidos asociados a HLA tanto de clase I como de clase II siguieron las tendencias esperadas (Figura 10B).

Se evaluaron 70 alelos de HLA de clase I y 47 alelos de HLA de clase II para un enfoque monoalélico como se describe en la presente descripción. Se generaron 70 alelos de HLA de clase I únicos con etiquetas de afinidad (Tabla 1A) y 47 alelos de HLA de clase II únicos con etiquetas de afinidad (Tabla 2A). La Tabla. 1B muestra los detalles de 96 experimentos únicos mediante el uso de los 70 alelos únicos de HLA de clase I (en algunos casos, el mismo alelo se colocó en múltiples líneas celulares). La Tabla. 2B muestra los detalles de 54 experimentos únicos realizados mediante el uso de los 47 alelos únicos de HLA de clase II (en algunos casos, el mismo alelo se colocó en múltiples líneas celulares).

Tabla 1A. 70 alelos únicos de HLA de clase I

T l 1B. Bi li lín ll r r ll HLA l I

Tabla 2A.47 alelos únicos de HLA de clase II

T l 2B. Bi li lín ll r r ll HLA l II

Ejemplo 4. IP universal en tándem de complejos HLA de clase II con múltiples etiquetas de afinidad

Los complejos HLA de clase II están formados por pares de cadena a y cadena p, cada una de las cuales puede etiquetarse con una etiqueta de afinidad diferente. Una IP en serie que usa ambas etiquetas de afinidad permite la deconvolución del par de cadena a y cadena p y asignaciones inequívocas de unión de péptidos a complejos HLA de clase II. En la Figura 11A se muestra una representación esquemática de construcciones de HLA de clase II manipuladas para la expresión por diferentes tipos de células para el proceso de IP universal. En la Figura 11B se muestran representaciones esquemáticas de los posibles complejos HLA de clase II que pueden formarse tras la expresión de las construcciones de la Figura 11A en líneas celulares que expresan las subunidades de cadena a y cadena p de HLA de clase II endógeno.

En la Figura 12A se representan esquemas de una estrategia de IP universal en serie que puede usarse para la deconvolución de pares de cadena a y cadena p y asignaciones inequívocas de unión de péptidos a complejos HLA de clase II específicos. Las células que expresaban construcciones de HLA de clase Ii con etiquetas de doble afinidad se lisaron, biotinilaron e incubaron con perlas acopladas a anticuerpos anti-HA. Se aislaron, lavaron y eluyeron complejos HLA de clase II con subunidades etiquetadas con HA (YPYDVPDYA). Después, la elución se incubó con perlas acopladas a NeutrAvidina o estreptavidina para aislar los complejos HLA de clase II etiquetados con HA y etiquetados con biotina. Después, los péptidos unidos a complejos HLA de clase II con doble etiqueta se eluyen y secuencian por LC-MS/MS. Una transferencia Western y un control de carga (gel teñido con Ponceau S) demostraron la especificidad del proceso de IP universal en serie. Una transferencia Western validó la estrategia de IP universal en serie en HEK293T que expresa construcciones HLA-DRB*11:01 con doble etiqueta (Figura 12B). Se usó un anticuerpo anti-HA para seguir el proceso de enriquecimiento en serie. Se usó un gel teñido con Ponceau S como control de carga de transferencia Western. En la Figura 12C se muestra una transferencia Western de un experimento de control negativo donde las células que expresan una construcción de HLA de clase II con doble etiqueta de afinidad HLA-DRB*11:01 se lisaron y se incubaron con perlas acopladas a anticuerpos anti-HA sin biotinilación. Como se muestra en la Figura 12C, no se observó enriquecimiento cuando se eliminó la etapa de biotinilación del protocolo de IP universal en serie.

Ejemplo 5. Un enfoque de obtención de perfiles de peptidomas de HLA monoalélicos que implementa una etiqueta de afinidad de biotina.

En la Figura 14A y la Figura 14B se muestra una representación esquemática de un enfoque de obtención de perfiles de peptidomas de HLA monoalélicos que implementa una etiqueta de afinidad de biotina. Un caso ilustrativo de la presente descripción hace uso del péptido aceptor de biotina (BAP) que se biotinila en un residuo de lisina (K) mediante una enzima BirA. La secuencia peptídica de BAP contiene un residuo de lisina que se biotinila tras la adición de la enzima BirA, biotina y ATP. El producto biotinilado muestra una alta afinidad por estreptavidina/NeutrAvidina. Pueden usarse perlas de estreptavidina/NeutrAvidina para enriquecer la secuencia peptídica de BAP biotinilado.

Ejemplo 6. Plataforma de descubrimiento de epítopos diana

Una línea celular de interés (por ejemplo, 2HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat, Hep G2, SH-SY5Y, CACO-2, U937, U-2 o S, ExpiCHO, CHO o t Hp 1) o células primarias (por ejemplo, células de un sujeto con una enfermedad o afección) puede transfectarse/transducirse con una construcción de HLA de clase I o II que contiene una etiqueta (por ejemplo, secuencia BAP) en el extremo N- o C-terminal con o sin selección para enriquecer las células que expresan HLA (Figura 15). Después, las células pueden transfectarse o transducirse con un segundo plásmido que contiene un fragmento de epítopo o una cadena de epítopos que pueden expresarse y presentarse en la molécula de HLA marcada con etiqueta. Alternativamente, tanto el plásmido del alelo de HLA como el plásmido del epítopo pueden cosuministrarse en las células seguido de expansión y/o selección. Estas células manipuladas después se lisan, se biotinilan y la molécula de HLA se enriquece a partir del lisado (por ejemplo, mediante el uso de perlas de estreptavidina). Los péptidos se eluyen de la molécula de HLA y se analizan, por ejemplo, por LC-MS/MS. Este método permite el análisis de cómo los diferentes alelos procesan y presentan los epítopos. Este método también puede utilizarse para mejorar el suministro y el diseño de epítopos.

Ejemplo 7. Producción de alelos en formato múltiple

Se puede diseñar una construcción de ADN para expresar múltiples cadenas pesadas de clase I o múltiples cadenas pesadas de clase II ( o ® que contienen una o más etiquetas (Figura 16). Cada construcción de HLA puede expresarse a partir de la misma construcción genética que incluye una secuencia de omisión ribosomal (F2A, T2A, P2A, etc.) o un elemento IRES. Una línea celular deseada puede transducirse o transfectarse con este plásmido para inducir la expresión de múltiples alelos de HLA que se etiquetan y se enriquecen subsecuentemente. Alternativamente, una línea celular puede transducirse o transfectarse con múltiples plásmidos, cada uno de los cuales contiene un único alelo de HLA. Después, los péptidos unidos a los alelos de HLA pueden analizarse, por ejemplo, por LC-MS/MS. Esta plataforma permite la generación de líneas celulares con múltiples alelos. Esto puede usarse, por ejemplo, para hacer compatible con el tipo de HLA de un paciente. Esto permitirá la generación de patrones de epítopos peptídicos para diferentes combinaciones de alelos.

Ejemplo 8. Predicción mejorada del procesamiento y unión específica de alelo

NetMHC es un método específico de alelo que entrena un predictor independiente para el conjunto de datos de unión de cada alelo, y NetMHCpan es un método para todos los alelos cuyas entradas son vectores que codifican tanto un péptido como una subsecuencia de una molécula de MHC particular. La opinión generalizada es que NetMHC funciona mejor en alelos con muchos ligandos ensayados, mientras que NetMHCpan funciona mejor en alelos menos caracterizados. Sin embargo, se ha demostrado que NetMHCpan no es exacto cuando no se incluyeron datos relevantes en los conjuntos de entrenamiento.

El enfoque monoalélico como se describe en la presente descripción (Figura 21) descubrió péptidos de unión a HLA con baja puntuación de NetMHCpan pero que se validaron bioquímicamente como aglutinantes fuertes. La Figura 20A muestra péptidos de unión a HLA ilustrativos para los alelos A*01:01, B*51:01, A*29:02 y B*54:01 descubiertos mediante el uso del enfoque monoalélico descrito en la presente descripción. La Figura 20B muestra las tasas de asignación incorrecta en 100 deconvoluciones simuladas. Se generó un genotipo de HLA de paciente de seis alelos aleatorios (2 alelos de cada uno de HLA-A, HLA-B y HLA-C, muestreo a las frecuencias alélicas de Estados Unidos). Para cada alelo, se tomaron muestras de 500 péptidos del experimento monoalélico relevante y se combinaron para crear un conjunto de datos multialélico simulado de 3000 péptidos. Cada péptido se asignó al alelo que produce la mejor puntuación de calificación de % de NetMHCpan para determinar el porcentaje de péptidos asignados incorrectamente por NetMHCpan. Este proceso se repitió 100 veces. Como se muestra en la Figura 22, tanto la predicción del procesamiento como de la unión específica de alelo mejoraron significativamente.

Párrafos de la descripción

En la presente descripción se proporciona un método para caracterizar complejos HLA-péptido que comprende: proporcionar una población de células, en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase I o clase II recombinante unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad; expresar el HLA etiquetado con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la al menos una célula; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y caracterizar los complejos HLA-péptido. En algunos casos, el alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad codificado es un alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad soluble.

En algunos casos, la caracterización comprende caracterizar un péptido unido al complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para dos o más alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, los dos o más alelos de HLA de clase I y/o clase II comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio transmembrana. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio intracelular. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no se secretan. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan. En algunos casos, los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles. En algunos casos, los complejos<h>L<a>etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles. En algunos casos, el método comprende además generar una base de datos de péptidos específicos de alelos de HLA. En algunos casos, el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es un único alelo de HLA de clase I o clase II recombinante.

En algunos casos, el método comprende identificar péptidos de los complejos HLA-péptido derivados de un agente infeccioso. En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias. En algunos casos, el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es compatible con un sujeto con una enfermedad o afección.

En algunos casos, el péptido del complejo HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido puede activar una célula T de un sujeto cuando se presenta por una célula presentadora de antígeno. En algunos casos, la caracterización comprende comparar complejos HLA-péptido de células cancerosas con complejos HLA-péptido de células no cancerosas. En algunos casos, la población de células comprende una pluralidad de poblaciones de células, cada población de células expresa un alelo de HLA de clase I o clase II recombinante diferente. En algunos casos, cada población de células de la pluralidad está en un mismo contenedor o en uno independiente.

En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase I o clase II en la superficie celular. En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante codifica un HLA de clase I. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante codifica un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de HLA de clase II o una de sus combinaciones. En algunos casos, cada secuencia codifica al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes.

En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, uno o más de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes están unidos operativamente a una secuencia que codifica un primer péptido aceptor de afinidad y uno o más de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes están unidos operativamente a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad diferente. En algunos casos, cada uno de los al menos dos alelos de HLA de clase I y/o clase II diferentes está unido operativamente a una secuencia que codifica una etiqueta de afinidad. En algunos casos, el método comprende administrar al menos un segundo ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica un alelo de HLA recombinante diferente unido operativamente al mismo péptido aceptor de afinidad o a uno diferente.

En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se localiza en un sitio extracelular del alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia interna de la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante, tal como una secuencia de lazo flexible. En algunos casos, la secuencia que codifica el péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el alelo de HLA de clase I o clase II recombinante mediante un enlazador. En algunos casos, el enriquecimiento comprende enriquecer las células intactas que expresan los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido. En algunos casos, el método no comprende lisar las células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el método comprende además lisar la una o más células antes del enriquecimiento. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad con los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido, en donde la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente al péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del HLA de clase I o clase II recombinante codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica para una porción extracelular del alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica para una porción N-terminal del alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, proporcionar comprende poner en contacto la población de células con el ácido polinucleico. En algunos casos, el contacto comprende transfectar o transducir. En algunos casos, proporcionar comprende poner en contacto la población de células con un vector que comprende el ácido polinucleico. En algunos casos, el vector es un vector viral. En algunos casos, el ácido polinucleico se integra de forma estable al genoma de la población de células.

En algunos casos, la secuencia que codifica el HLA de clase I o clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase I mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la secuencia que codifica el HLA de clase I o clase II recombinante comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena a de HLA de clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, la determinación comprende realizar análisis bioquímicos o espectrometría de masas, tal como espectrometría de masas en tándem. En algunos casos, la determinación comprende obtener una secuencia peptídica que corresponde a un espectro MS/MS de uno o más péptidos aislados a partir de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos de una base de datos de péptidos; en donde una o más secuencias obtenidas identifican la secuencia del uno o más péptidos. En algunos casos, la base de datos de péptidos es una base de datos de péptidos sin especificidad enzimática, tal como una base de datos sin modificaciones o una base de datos con modificaciones. En algunos casos, el método comprende además buscar en la base de datos de péptidos mediante el uso de una estrategia de búsqueda en base de datos inversa.

En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una línea celular humana. En algunos casos, la población de células es una línea celular de ratón. En algunos casos, la población de células es una línea celular CHO. En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K<5 6 2>, Jurkat y THP1. En algunos casos, la población de células se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-y, agentes que alteran el procesamiento de antígenos (tales como inhibidores de peptidasa, inhibidores de proteasoma e inhibidores de tAp ) o una de sus combinaciones. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan una vía metabólica o un estado metabólico de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan el proteoma celular de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan la expresión o transcripción celular (por ejemplo, AIRE o una proteína de unión a CREB o moduladores de la misma) de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan un factor de transcripción de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan la expresión o transcripción celular de un HLA de las células. En algunos casos, la población de células se trata con uno o más reactivos que modulan o regulan la expresión o transcripción celular del proteoma de las células.

En algunos casos, el alelo de HLA es un alelo de HLA mutado. En algunos casos, la secuencia que codifica el alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. En algunos casos, el método comprende además realizar un ensayo de expresión del alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad. En algunos casos, el ensayo comprende el ensayo comprende secuenciar un alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar ARN del alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar proteína del alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad, o una de sus combinaciones. En algunos casos, el ensayo de expresión puede comprender un ensayo de transferencia Western, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), espectrometría de masas (MS), un ensayo de hibridación de micromatrices, un ensayo de RNA-seq, un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa, un ensayo LAMP, un ensayo de reacción en cadena de la ligasa, un ensayo de transferencia Southern, un ensayo de transferencia Northern o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

En algunos casos, el método comprende llevar a cabo las etapas del método para diferentes alelos de HLA. En algunos casos, cada alelo de HLA diferente comprende una secuencia de código de barras única. En algunos casos, cada ácido polinucleico que codifica un alelo de HLA diferente comprende una secuencia de código de barras única.

En la presente descripción se proporciona una base de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenida al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción. En la presente descripción se proporciona una combinación de dos o más bases de datos de secuencias peptídicas de unión específica de alelo de HLA obtenidas al llevar a cabo un método descrito en la presente descripción repetidamente, mediante el uso cada vez de un alelo de HLA diferente. En la presente descripción se proporciona un método para generar un algoritmo de predicción para identificar péptidos de unión específica de alelo de HLA, que comprende entrenar una máquina con una base de datos de secuencias peptídicas descrita en la presente descripción o una combinación descrita en la presente descripción.

En algunos casos, los motivos que favorecen el estancamiento ribosomal comprenden tramos de poliprolina o polilisina. En algunos casos, las características de las proteínas que favorecen<n>M<d>se seleccionan del grupo que consiste en una UTR 3' larga, un codón de parada mayor que 50 nt aguas arriba de la última unión exón:exón y capacidad de escisión de péptidos.

En la presente descripción se proporciona una composición que comprende un ácido polinucleico recombinante que comprende dos o más secuencias, cada una de las cuales comprende una secuencia que codifica un HLA etiquetado con aceptor de afinidad, en donde las secuencias que codifican los HLA etiquetados con aceptor de afinidad comprenden una secuencia que codifica un alelo de cadena a de HLA de clase II recombinante, una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad y, opcionalmente, una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II; en donde las secuencias de (a) y (b), y opcionalmente (c), están unidas operativamente. En algunos casos, el ácido polinucleico recombinante se aísla. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HlA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP.

En algunos casos, el péptido aceptor de afinidad codificado se selecciona del grupo que consiste en péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta n E, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 y una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une específicamente a una molécula de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con una secuencia de aminoácidos del HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, para dos o más de los ácidos polinucleicos recombinantes: la secuencia que codifica el HLA etiquetado con aceptor de afinidad se integra de forma estable al genoma de una célula. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el segundo péptido aceptor de afinidad comprende una etiqueta de HA. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina o la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica el HLA recombinante y el péptido aceptor de afinidad mediante un enlazador.

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA de clase I o clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células se manipula de manera que carezca de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos y uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase I o clase II en la superficie celular. En algunos casos, la composición se formula mediante el uso de péptidos o ácidos polinucleicos que codifican péptidos específicos para un tipo HLA de un paciente. En la presente descripción se proporciona un método para producir una célula que comprende transducir o transfectar dos o más células con los dos o más ácidos polinucleicos de una composición descrita en la presente descripción.

En la presente descripción se proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico para un sujeto con una enfermedad o afección que comprende proporcionar una población de células derivadas de un sujeto con una enfermedad o afección, expresar en una o más células de la población de células un alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad mediante la introducción en la una o más células de un ácido polinucleico que codifica una secuencia que comprende: una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase I o clase II recombinante unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la una o más células; enriquecer y caracterizar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y, opcionalmente, desarrollar un agente terapéutico en base a la caracterización.

En la presente descripción se proporciona un método para identificar al menos un antígeno inmunogénico específico del sujeto y preparar una composición inmunogénica específica del sujeto que incluye el al menos un antígeno inmunogénico específico del sujeto, en donde el sujeto tiene una enfermedad y el al menos un antígeno inmunogénico específico del sujeto es específico del sujeto y la enfermedad del sujeto, dicho método comprende: proporcionar una población de células derivadas de un sujeto con una enfermedad o afección, expresar en una o más células de la población de células del sujeto, un alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad mediante la introducción en la una o más células de un ácido polinucleico que codifica una secuencia que comprende: una secuencia que codifica un alelo de HLA de clase I o clase II recombinante unido operativamente a una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en la una o más células; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido de la una o más células; identificar un péptido inmunogénico de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecido que es específico del sujeto y de la enfermedad del sujeto; y formular una composición inmunogénica específica del sujeto en base a uno o más de los péptidos inmunogénicos específicos del sujeto identificados.

En la presente descripción se proporciona un método para desarrollar un agente terapéutico para un sujeto con una enfermedad o afección que comprende: proporcionar una población de células, en donde una o más células de la población de células comprenden un ácido polinucleico que comprende una secuencia que codifica al menos dos alelos de HLA de clase I o clase II etiquetados con aceptor de afinidad, en donde la secuencia que codifica los al menos dos HLA de clase I o clase II etiquetados con aceptor de afinidad comprende una primera secuencia recombinante que comprende una secuencia que codifica un primer alelo de<h>L<a>de clase I o clase II unida operativamente a una secuencia que codifica un primer péptido aceptor de afinidad; y una segunda secuencia recombinante que comprende una secuencia que codifica un segundo alelo de HLA de clase I o clase II unido operativamente a una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad; expresar los al menos dos HLA etiquetados con aceptor de afinidad en al menos una célula de la una o más células de la población de células, de esta manera se forman complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido en al menos una célula; enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; e identificar un péptido de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido enriquecidos; y formular una composición inmunogénica en base a uno o más de los péptidos identificados, en donde el primer y el segundo alelos de HLA de clase I o clase II recombinantes son compatibles con un haplotipo de HLA de un sujeto. En algunos casos, el sujeto tiene una enfermedad o afección.

En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es diferente del segundo alelo de HLA de clase I o clase II recombinante. En algunos casos, el primer péptido aceptor de afinidad es el mismo que el segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el método comprende caracterizar un péptido unido al primer y/o segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido del enriquecimiento. En algunos casos, los al menos dos alelos de HLA de clase I o clase II etiquetados con aceptor de afinidad comprenden al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 alelos de HLA de clase I y/o clase II. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio transmembrana. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido comprenden un dominio intracelular. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no se excretan. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan. En algunos casos, el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido no son complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido solubles.

En algunos casos, la población de células es de una muestra biológica de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunos casos, la población de células es una línea celular. En algunos casos, la población de células es una población de células primarias. En algunos casos, el péptido del primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido puede activar una célula T de un sujeto cuando se presenta por una célula presentadora de antígeno. En algunos casos, el método comprende comparar complejos HLA-péptido de células enfermas con complejos HLA-péptido de células no enfermas. En algunos casos, el método comprende además aislar péptidos del primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido antes de la identificación. En algunos casos, la población de células es una población de células que expresan poco HLA de clase I o clase II en la superficie celular.

En algunos casos, la población de células expresa uno o más alelos de HLA endógenos. En algunos casos, la población de células expresa los alelos de HLA endógenos normalmente expresados por la población de células. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de uno o más alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células es una población manipulada de células que carecen de alelos de HLA de clase I endógenos y de alelos de HLA de clase II endógenos. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de uno o más alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la población de células tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase I y tiene desactivados los genes de todos los alelos de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica los al menos dos alelos de HLA de clase I o clase II etiquetados con aceptor de afinidad codifican un HLA de clase I. En algunos casos, el HLA de clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F y HLA-G. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es un primer alelo de HLA de clase I y el segundo alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es un segundo alelo de HLA de clase I. En algunos casos, la secuencia que codifica los al menos dos alelos de HLA de clase I o clase II etiquetados con aceptor de afinidad codifican un HLA de clase II. En algunos casos, el HLA de clase II se selecciona del grupo que consiste en HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. En algunos casos, el HLA de clase II comprende una cadena a de HLA de clase II, una cadena p de HLA de clase II o una de sus combinaciones. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es un primer alelo de HLA de clase II y el segundo alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es un segundo alelo de HLA de clase II.

En algunos casos, cada una de la primera secuencia y la segunda secuencia está unida operativamente. En algunos casos, la primera secuencia y la segunda secuencia están comprendidas en diferentes moléculas polinucleotídicas. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción extracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad codificado se expresa extracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo N-terminal de la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a una secuencia que codifica una porción intracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II. En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad codificado se expresa intracelularmente. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente al extremo C-terminal de la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad está unida operativamente a la secuencia que codifica el primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II mediante un enlazador.

En algunos casos, el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad comprende una secuencia de etiqueta que comprende un péptido aceptor de biotina (BAP), etiqueta de polihistidina, etiqueta de polihistidina-glicina, etiqueta de poliarginina, etiqueta de poliaspartato, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta c-myc, etiqueta de glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple, etiqueta FLAG, etiqueta epitópica KT3, etiqueta epitópica de tubulina, etiqueta peptídica de la proteína del gen 10 de T7, etiqueta de estreptavidina, etiqueta del péptido de unión a estreptavidina (SPB), etiqueta Strep-tag, etiqueta Strep-tag II, etiqueta de proteína de unión a albúmina (ABP), etiqueta de fosfatasa alcalina (AP), etiqueta de virus de la lengua azul (etiqueta B), etiqueta de péptido de unión a calmodulina (CBP), etiqueta de cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etiqueta de dominio de unión a colina (CBD), etiqueta de dominio de unión a quitina (CBD), etiqueta de dominio de unión a celulosa (CBP), etiqueta de dihidrofolato reductasa (DHFR), etiqueta de proteína de unión a galactosa (GBP), proteína de unión a maltosa (MBP), glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta Glu-Glu (EE), etiqueta de hemaglutinina (HA) de influenza humana, etiqueta de peroxidasa de rábano picante (HRP), etiqueta NE, etiqueta HSV, etiqueta de cetoesteroide isomerasa (KSI), etiqueta KT3, etiqueta LacZ, etiqueta de luciferasa, etiqueta NusA, etiqueta de dominio PDZ, AviTag, etiqueta de calmodulina, etiqueta E, etiqueta S, etiqueta SBP, Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, etiqueta Profinity eXact, etiqueta de proteína C, etiqueta S1, etiqueta S, etiqueta de proteína portadora de biotina-carboxi (BCCP), etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP), etiqueta de modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO), etiqueta de purificación por afinidad en tándem (TAP), HaloTag, etiqueta Nus, etiqueta de tiorredoxina, etiqueta de Fc, etiqueta CYD, etiqueta de HPC, etiqueta de TrpE, etiqueta de ubiquitina, etiqueta epitópica de VSV-G, etiqueta de V5 o una de sus combinaciones; opcionalmente, en donde el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad comprende dos o más repeticiones de una secuencia de etiqueta.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad con el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido, en donde la molécula de afinidad se une específicamente a la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas. En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la molécula de afinidad se une a una superficie sólida. En algunos casos, la superficie sólida es una perla.

En algunos casos, el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar el primer y/o el segundo complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido con una molécula de unión al péptido aceptor de afinidad que se une específicamente al primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la molécula de unión al péptido aceptor de afinidad no interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos del primer y/o segundo HLA de clase I o clase II codificado. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica para una porción extracelular del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II. En algunos casos, el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de afinidad específica para una porción N-terminal del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II.

En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase I o clase II comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase I. En algunos casos, el primer alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es una primera cadena a de HLA de clase I y el segundo alelo de HLA de clase I o clase II recombinante es una segunda cadena a de HLA de clase I.

En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica la p2 microglobulina en la una o más células. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase I o clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase I o clase II mediante un enlazador. En algunos casos, la secuencia que codifica la p2 microglobulina se conecta a una secuencia que codifica un tercer péptido aceptor de afinidad.

En algunos casos, el tercer péptido aceptor de afinidad es diferente del primer y/o segundo péptido aceptor de afinidad. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase I o clase II comprende una secuencia que codifica una cadena a de HLA de clase II y/o una cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase I o clase II comprende una secuencia que codifica una primera cadena a de HLA de clase II y una segunda cadena a de HLA de clase II. En algunos casos, el método comprende además expresar una secuencia que codifica una cadena p de HLA de clase II en la una o más células.

En algunos casos, la secuencia que codifica una primera cadena a de HLA de clase II y una segunda cadena a de HLA de clase II se conecta a la secuencia que codifica la cadena p de HLA de clase II. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer y/o segundo HLA de clase I o clase II comprende una secuencia que codifica una primera cadena p de HLA de clase II y una segunda cadena p de HLA de clase II.

En algunos casos, la población de células es una línea celular seleccionada de HEK293T, expi293, HeLa, A375, 721.221, JEG-3, K562, Jurkat y THP1. En algunos casos, la línea celular se trata con una o más citocinas, inhibidores de puntos de regulación, fármacos epigenéticamente activos, IFN-<y>o una de sus combinaciones. En algunos casos, la población de células comprende al menos 105 células, al menos 106 células o al menos 107 células. En algunos casos, la población de células es una población de células dendríticas, macrófagos, células cancerosas o células B. En algunos casos, la población de células comprende células tumorales.

En algunos casos, el primer y segundo alelo de HLA es un alelo de HLA mutado. En algunos casos, la secuencia que codifica el primer o segundo alelo de HLA comprende una secuencia de código de barras. En algunos casos, el método comprende además realizar un ensayo de expresión del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad.

En algunos casos, el ensayo comprende secuenciar el primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar el ARN que codifica el ARN del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad, detectar la proteína del primer y/o segundo alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con un segundo aceptor de afinidad, o una de sus combinaciones. En algunos casos, el primer y segundo alelo de HLA de clase I o clase II etiquetado con aceptor de afinidad comprende una secuencia de código de barras única. En algunos casos, la primera secuencia y la segunda secuencia comprenden una secuencia de código de barras única.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para desarrollar un agente terapéutico, que comprende:

(a) expresar una proteína HLA etiquetada con aceptor de afinidad en células humanas, en donde la proteína HLA etiquetada con aceptor de afinidad es una proteína HLA de clase II que comprende una secuencia codificada por un alelo de HLA de clase II expresado por un sujeto humano, en donde la proteína HLA de clase II etiquetada con aceptor de afinidad está codificada por un ácido polinucleico recombinante que comprende:

(i) una secuencia que codifica el alelo de HLA de clase II expresado por el sujeto humano unida a, (ii) una secuencia que codifica un péptido aceptor de afinidad,

de esta manera se forman complejos HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad-péptido que se expresan en las células humanas; en donde los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido se incorporan a una membrana celular cuando se expresan;

(b) identificar un péptido o complejo específico del alelo de HLA de clase II de los complejos de HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad-péptido; y

(c) desarrollar un agente terapéutico en base a una o más secuencias de un péptido o complejo específico del alelo de HLA de clase II identificado, en donde el agente terapéutico comprende: (i) uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, (ii) un polinucleótido que codifica el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, (iii) una o más APC que comprenden el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, (iv) un receptor de células T (TCR) específico para un HLA en complejo con el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias, o (v) una célula que comprende un TCR o un receptor de células T quimérico (CAR) específico para un HLA en complejo con el uno o más péptidos que comprenden la una o más secuencias.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el método comprende aislar o enriquecer los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido a partir de células lisadas o aislar células que expresan complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el enriquecimiento comprende inmunoprecipitar los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

4. El método de la reivindicación 2, en donde el enriquecimiento comprende poner en contacto una molécula de unión específica al péptido aceptor de afinidad con las células que expresan complejos HLA de clase II etiquetado con aceptor de afinidad-péptido.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el péptido aceptor de afinidad es BAP (proteína aceptora de biotina).

6. El método de la reivindicación 5, en donde la molécula de unión específica al péptido aceptor de afinidad es biotina o un anticuerpo específico para el péptido aceptor de afinidad.

7. El método de la reivindicación 5, en donde el enriquecimiento comprende además poner en contacto una molécula de afinidad específica con la molécula de unión específica al péptido aceptor de afinidad.

8. El método de la reivindicación 7, en donde la molécula de afinidad es estreptavidina, NeutrAvidina o un derivado de las mismas.

9. El método de la reivindicación 1, en donde las células humanas son células primarias presentadoras de antígenos o una línea celular presentadora de antígenos.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido polinucleico recombinante comprende: una primera secuencia que codifica un primer HLA etiquetado con aceptor de afinidad y una segunda secuencia que codifica un segundo HLA etiquetado con aceptor de afinidad,

en donde la primera secuencia comprende

(a) una secuencia de un primer alelo de HLA que codifica un primer HLA unido a

(b) una secuencia que codifica un primer péptido aceptor de afinidad;

en donde la segunda secuencia comprende

(c) una secuencia de un segundo alelo de HLA que codifica un segundo HLA unido a

(d) una secuencia que codifica un segundo péptido aceptor de afinidad;

en donde el primer alelo de HLA y el segundo alelo de HLA son alelos de HLA diferentes.

11. El método de la reivindicación 1, en donde los péptidos de los complejos HLA etiquetado con aceptor de afinidadpéptido son péptidos endógenos.