ES2966291T3 - Organismos alguicidas - Google Patents

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ES2966291T3 ES17868136T ES17868136T ES2966291T3 ES 2966291 T3 ES2966291 T3 ES 2966291T3 ES 17868136 T ES17868136 T ES 17868136T ES 17868136 T ES17868136 T ES 17868136T ES 2966291 T3 ES2966291 T3 ES 2966291T3
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Abstract

Se proporcionan composiciones derivadas de Beauveria bassiana, Brevibacillus brevis, Streptomyces spororaveus, Paenibacillus elgii o Streptomyces sp. fermentación, que tiene propiedades alguicidas, y método de uso del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Organismos alguicidas
Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas
Esta aplicación reivindica prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. de serie 62/416,796 presentada el 3 de noviembre de 2016 bajo 35 U.S.C. 119(e).
Campo técnico de la invención
La presente descripción se refiere a composiciones y métodos para controlar diversas algas.
Antecedentes de la invención
La proliferación de algas tóxicas se ha generalizado en lagos, embalses y ríos de todo el mundo. La proliferación de algas provoca la muerte del ganado y amenaza la salud humana y los ecosistemas acuáticos. Aunque se han propuesto varios enfoques para eliminar la proliferación de algas, esos enfoques difícilmente tuvieron éxito. No existe una forma completa de eliminarlos. Por lo tanto, existe la necesidad de diversos enfoques para diseñar múltiples estrategias.
Resumen de la invención
La proliferación de algas en el agua se ha convertido en un problema ambiental mundial. Recientemente, las bacterias alguicidas han atraído amplia atención como posibles agentes para inhibir la proliferación de algas en el agua. Por ejemplo, el documento núm. US2014/221207A1 describe composiciones que comprenden una cepa deBurkholderiacomo un ingrediente activo, que puede tener actividad alguicida, en donde la composición puede comprender adicionalmente otro microorganismo, tal como un agente derivado deBacillus sp., Brevibacillus sp.,yStreptomyces sp.Los documentos núms. KR 100468 053 B1, KR 1998 0065146 A y Zhang, B. y otros en PLo S ONE, 2014, 9 (3), 1-10 titulado "Streptomyces alboflavus RPS and its novel and high algicidal activity against harmful algal bloom species Phaeocystis globosa" enseñan los efectos alguicidas de algunas cepas deStreptomyces.
Se proporcionan compuestos aislados y composiciones derivadas de la fermentación deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomycessp. q 004 (NRRL-67409) que tienen propiedades alguicidas.
Específicamente, la presente invención se refiere a una composición alguicida que comprende: un caldo de células completas, filtrado, sobrenadante o extracto recogido de la fermentación de Beauveria bassiana 0379 (NRRL-67406), Brevibacillus brevis HNYM3, 0989 (NRRL-B67408), Streptomyces spororaveus F18, P842 (NRRL-B67410), Paenibacillus elgii SD17, P858 (NRRL-B67407), o Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409).
Además, la invención se refiere a un método para inhibir el crecimiento de un alga que comprende las etapas de: introducir la composición alguicida de la invención en una ubicación donde se desea la inhibición, en cantidades eficaces para inhibir dichas algas.
En un aspecto particular, los productos de la fermentación de tales organismos pueden modular o inhibir una o más especies de algas tales comoChlamydomonas reinhardtii, Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaenasp.,Oscilatoria tenuis, Microcystis aeruginosa, Naviculasp.,Spirogyrasp., oCharasp.
Además se proporciona un método para modular o inhibir al menos una especie de alga en un lugar con una cantidad de una suspensión de células o caldo de células completas que tiene células derivadas de una o más de las siguientes especies:Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409), en donde dichas especies producen una o más sustancias que controlan las algas, o un sobrenadante, filtrado, fracción de células, uno o más metabolitos, uno o más compuestos y/o extracto derivado de los mismos, eficaces para modular dichas algas tales comoChlamydomonas reinhardtii,Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaenasp.,Oscillatoria tenuis, Microcystis aeruginosa,Naviculasp.,Spirogyrasp., oCharasp.
En un aspecto, la presente descripción se refiere a la aplicación de un caldo de células completas, sobrenadante, filtrado o fracción de células en una ubicación en una cantidad eficaz para controlar la infestación de algas. La ubicación puede ser una masa de agua o pintura, o sobre superficies de hormigón, pavimento, losa, porcelana, vinilo, ladrillo, estuco, fibra de vidrio y aluminio. Estas superficies pueden estar pintadas o sin pintar. Generalmente el alguicida se aplica sobre la superficie hasta que esté húmeda o hasta que se observe escurrimiento.
Además, la composición expuesta anteriormente puede aplicarse en combinación con un antibiótico o agente antifúngico, particularmente un antibiótico eficaz contra las bacterias transmitidas por el suelo. Se describe, pero no forma parte de la invención, una combinación que comprende las sustancias expuestas anteriormente y otro antibiótico eficaz contra las bacterias transmitidas por el suelo. Estas combinaciones también pueden ser composiciones. Se describe, pero no forma parte de la invención, el uso de estas sustancias y antibióticos en la formulación de estas combinaciones.
Aún más, la composición expuesta anteriormente puede formularse como polvos espolvoreables (DP), polvos solubles (SP), gránulos solubles en agua (SG), gránulos dispersables en agua (WG), polvos humectables (WP), gránulos (GR) (de liberación rápida o lenta), concentrados solubles (SL), líquidos miscibles en aceite (OL), líquidos de volumen ultrabajo (UL), concentrados emulsionables (EC), concentrados dispersables (DC), emulsiones (tanto de aceite en agua (EW) como de agua en aceite (EO)), microemulsiones (ME), concentrados en suspensión (SC), concentrado en suspensión a base de aceite (OD), aerosoles, formulaciones de nebulización/humo, suspensiones en cápsulas (CS) y formulaciones para el tratamiento de semillas.
Breve descripción de las figuras
Para una comprensión más completa de las características y ventajas de la presente descripción, se hace ahora referencia a la descripción detallada de la invención junto con las figuras adjuntas y en las que:
La Figura 1 indica las respuestas a las dosis deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406) enPseucokirchneriella subcapitataen placas de 96 pocillos.
La Figura 2 indica las respuestas a las dosis deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406) enAnabaenasp. en una placa de 96 pocillos.
La Figura 3 indica la respuesta a las dosis deBeauveria brevisHNYM3, 0989 (NRRL-B67408) enPseucokirchneriella subcapitataen placas de 96 pocillos.
La Figura 4 indica la respuesta a las dosis deBeauveria brevisHNYM3, 0989 (NRRL-B67408) enAnabaenasp. en una placa de 96 pocillos.
La Figura 5 indica la respuesta a las dosis deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) enPseucokirchneriella subcapitataen placas de 96 pocillos
La Figura 6 indica la respuesta a las dosis deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) enAnabaenasp. en una placa de 96 pocillos.
La Figura 7 indica la respuesta a las dosis dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) enPseucokirchneriella subcapitataen placas de 96 pocillos.
La Figura 8 indica la respuesta a las dosis dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) enAnabaenasp. en una placa de 96 pocillos.
La Figura 9 indica la respuesta a las dosis deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) enPseucokirchneriella subcapitataen placas de 96 pocillos.
La Figura 10 indica la respuesta a las dosis deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) enAnabaenasp. en una placa de 96 pocillos.
Descripción detallada de la invención
A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se conoce comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción pueden también usarse en la práctica o las pruebas de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen ahora. Sin embargo, la invención se define por las reivindicaciones.
Debe notarse que como se usa en la presente descripción y las reivindicaciones anexas, las formas del singular "un," "uno" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo dicte claramente de cualquier otra manera. Por ejemplo, "una sustancia" también abarca "sustancias".
Como se define en la presente descripción, el término "modular" se usa con el significado de alterar la cantidad de infestación de algas o la tasa de propagación de la infestación de algas, o matar, ser letal o tóxico para las algas en una ubicación. "Modular la infestación de algas" también abarca modular los efectos de dicha infestación.
Como se usa en la presente descripción, "alga" se refiere a cualquiera de varios organismos fotosintéticos, eucariotas, principalmente acuáticos, cuyo tamaño varía desde formas unicelulares hasta las algas gigantes. El término puede referirse además a los protistas fotosintéticos responsables de gran parte de la fotosíntesis en la Tierra. Como grupo, las algas son polifiléticas. En consecuencia, el término puede referirse a cualquier protista considerado alga de los siguientes grupos: alveoladas, cloraracniofitas, criptomonas, euglénidas, glaucofitas, haptofitas, algas rojas tales como rodófitas, estramenopilos y viridaeplantae. El término se refiere a las algas verdes, amarillo verdosas, marrones y rojas en los eucariotas. El término también puede referirse a las cianobacterias en los procariotas. El término también se refiere a las algas verdes, las algas azules y las algas rojas. En una modalidad, las algas son filamentosas o verdes planctónicas o cianobacterias.
Como se define en la presente descripción, "derivado de" y "obtenido de" significa aislado u obtenido directamente de una fuente particular o alternativamente que tiene características de identificación de una sustancia u organismo aislado u obtenido directamente de una fuente particular. Estos términos se usan indistintamente en toda la descripción.
Como se define en la presente descripción, "derivado deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillus brevis HNYM3,O989(NRRL-B67408), Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomyces sp.Q004 (NRRL-67409)" significa un caldo de células que comprende células deBeauveria bassianaO379 (N<r>R<l>-67406),Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (n Rr L-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409), una suspensión de células que comprende células deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillus brevisHN<y>M3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409), así como también una fracción de células, sobrenadante, filtrado o extracto recogido de la fermentación. El extracto puede derivarse no solo de una suspensión de células o caldo de células completas sino también de un filtrado, sobrenadante o fracción derivada de dicho caldo de células completas o suspensión de células.
Como se define en la presente descripción, un "compuesto aislado" está esencialmente libre de otros compuestos o sustancias, por ejemplo, al menos aproximadamente 20 % puro, preferentemente al menos aproximadamente 40 % puro, con mayor preferencia aproximadamente 60 % puro, aún con mayor preferencia aproximadamente 80 % puro, con la máxima preferencia aproximadamente 90 % puro, e incluso con la máxima preferencia aproximadamente 95 % puro, según se determina mediante métodos analíticos, que incluyen, pero no se limitan a, métodos cromatográficos, métodos electroforéticos.
Como se define en la presente descripción, "caldo de cultivo completo" o "caldo de células completas" se refiere a un cultivo líquido que contiene tanto células como medios de fermentación. También puede obtenerse un caldo de células completas a partir de bacterias cultivadas en una placa, al recoger las células de la placa y suspenderlas en agua u otro líquido. Los términos "caldo de cultivo completo" y "caldo de células completas" se usan indistintamente. Como se define en la presente descripción, "sobrenadante" se refiere al líquido que queda cuando las células crecen en caldo o se recogen en otro líquido de una placa de agar y se eliminan mediante centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios conocidos en la técnica.
Como se define en la presente descripción, "filtrado" se refiere a líquido de un caldo de cultivo completo que ha pasado a través de una membrana.
Como se define en la presente descripción, "extracto" se refiere a una sustancia líquida extraída de las células mediante un solvente (agua, detergente, amortiguador, solvente orgánico) y separada de las células mediante centrifugación, filtración, partición de fases u otro método.
Como se define en la presente descripción, microorganismo "inactivado" se refiere a microbios muertos o microbios que no se encuentran en la etapa de crecimiento activo (por ejemplo, esporas). Las formas no limitantes de inactivación incluyen muerte térmica o muerte química. En una modalidad, los microbios pueden lisarse.
Las composiciones de la presente descripción se derivan deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillusbrevis HNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409). La composición puede ser una suspensión de células o caldo de células completas y también un filtrado, sobrenadante o fracción derivada de dicho caldo de células completas o suspensión de células.
Como se indicó anteriormente, las composiciones se derivan de un organismo que tiene las características de identificación deBeauveria bassianao 379 (NRRL-67406), BrevibacillusbrevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (n Rr L-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409). Los métodos no de acuerdo con la invención comprenden cultivar estos organismos y opcionalmente obtener los compuestos al aislar estos compuestos de las células de estos organismos. En particular, los organismos se cultivan en un medio nutritivo mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Los organismos pueden cultivarse mediante cultivo en matraz en agitación, fermentación a pequeña o gran escala (que incluyen, pero no se limitan a, fermentaciones continuas, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y en condiciones que permitan el crecimiento celular. El cultivo puede tener lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles a partir de fuentes comerciales o preparadas de acuerdo con composiciones publicadas. Una modalidad particular se describe en los ejemplosabajoy en la patente de Estados Unidos núm. 6194194.
Después del cultivo, las células pueden concentrarse y subsecuentemente suspenderse en un amortiguador para obtener una suspensión de células. Puede usarse una suspensión de células muertas. Las células vivas en la suspensión celular pueden destruirse mediante al menos uno de los siguientes: irradiación, calentamiento, secado o tratamiento de las células con otros medios químicos o físicos. No se requiere una suspensión de células muertas para tener actividad contra especies de algas.
De la suspensión pueden extraerse sustancias moduladoras y especialmente tóxicas para las algas. El extracto puede fraccionarse mediante cromatografía. Las fracciones cromatográficas pueden analizarse para detectar actividad tóxica contra algas, tales comoChlamydomonas reinhardtii, Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaena sp., Oscilatoria tenuis, Microcystis aeruginosa, Navicula sp., Spirogyra sp.,oChara sp.mediante el uso de métodos conocidos en la técnica; un método particular se describe en los ejemplos,abajo.Este proceso puede repetirse una o más veces mediante el uso del mismo o de diferentes métodos cromatográficos.
En una modalidad, las composiciones pueden comprender cultivos en caldo de células completas, cultivos líquidos o suspensiones recogidas de la fermentación deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomyces sp.Q004 (NRRL-67409).
Las composiciones expuestas anteriormente pueden formularse de cualquier manera. Los ejemplos de formulaciones incluyen, pero no se limitan a, concentrados emulsionables (EC), polvos humectables (WP), líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones concentradas de volumen ultrabajo (ULV), polvos solubles (SP), microencapsulación, gránulos dispersos en agua, fluidos (FL), microemulsiones (ME), nanoemulsiones (NE), etc. En cualquier formulación descrita en la presente descripción, el por ciento del ingrediente activo está dentro del intervalo de 0,01 % a 99,99 %. Otra modalidad es un caldo de células completas no formulado o un caldo de células completas concentrado.
Las composiciones también pueden elegirse entre varios tipos de formulaciones, que incluyen polvos espolvoreables (DP), polvos solubles (SP), gránulos solubles en agua (SG), gránulos dispersables en agua (WG), polvos humectables (WP), gránulos (GR) (de liberación rápida o lenta), concentrados solubles (SL), líquidos miscibles en aceite (OL), líquidos de volumen ultrabajo (UL), concentrados emulsionables (EC), concentrados dispersables (DC), emulsiones (ambas de aceite en agua (EW) y agua en aceite (EO)), microemulsiones (ME), concentrados en suspensión (SC), concentrado en suspensión a base de aceite (OD), aerosoles, formulaciones de nebulización/humo, suspensiones en cápsulas (CS) y formulaciones para el tratamiento de semillas. El tipo de formulación elegido en cualquier caso dependerá del propósito particular previsto y de las propiedades físicas, químicas y biológicas de los microbios.
En otra modalidad, las composiciones pueden estar en la forma de un líquido, gel o sólido. Puede prepararse una composición sólida al suspender un portador sólido en una solución de ingrediente(s) activo(s) y secar la suspensión en condiciones suaves, tales como evaporación a temperatura ambiente o evaporación al vacío a 65 °C o menos. Una composición puede comprender ingrediente(s) activo(s) encapsulado(s) en gel. Dichos materiales encapsulados en gel pueden prepararse al mezclar un agente formador de gel (por ejemplo, gelatina, celulosa o lignina) con un cultivo o suspensión de microorganismo(s) vivo(s) o inactivado(s) o un filtrado libre de células o una fracción de células de un cultivo o suspensión, o un cultivo, célula o fracción de células liofilizados o por pulverización o en una solución de compuestos alguicidas usados en el método de la invención; e inducir la formación de gel del agente. Aún en otra modalidad, la composición puede comprender adicionalmente un surfactante para usarse con fines de emulsificación, dispersión, humectación, extensión, integración, control de la desintegración, estabilización de ingredientes activos y mejora de la fluidez o inhibición de la oxidación. En una modalidad particular, el surfactante es un surfactante no iónico no fitotóxico que pertenece preferentemente a la Lista 4B de la Agencia de Protección Ambiental (EPA). En otra modalidad particular, el surfactante no iónico es monolaurato de polioxietileno (20). La concentración de surfactantes puede variar entre 0,1-35 % de la formulación total, el intervalo preferido es 5-25 %. La elección de agentes dispersantes y emulsionantes, tales como agentes dispersantes y emulsionantes no iónicos, aniónicos, anfóteros y catiónicos, y la cantidad empleada se determina por la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de las composiciones de la presente invención.
Las composiciones también pueden incluir, pero no se limitan a, antibióticos aminoglucósidos que incluyen varias moléculas (por ejemplo, kanamicina, neomicina, gentamicina, derivado G418 y paromicina) que son tóxicas para células vegetales, fúngicas y animales (Nap y otros, 1992) así como también neomicina fosfotransferasa II bacteriana y aerocianidina, aerocavina, 3,6-dihidroxi-indoxazeno y monobactam SB-26.180.
En una modalidad, las composiciones y las sustancias expuestas anteriormente pueden usarse para modular o inhibir la cantidad de infestación de algas en un lugar tal como una masa de agua cerrada o abierta, o sobre una superficie sólida tal como plástico, hormigón, madera, fibra de vidrio, tuberías hechas de hierro y cloruro de polivinilo, superficies recubiertas con materiales de recubrimiento y/o pinturas.
En otra modalidad, las composiciones inhiben el crecimiento de algas tales comoChlamydomonas reinhardtii,Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaena sp., Oscilatoria tenuis, Microcystis aeruginosa, Navicula sp., Spirogyra sp., Chara sp,o cualquiera de sus combinaciones
Se describe la aplicación de un control alguicida eficaz mediante un sobrenadante, filtrado o extracto que contiene un metabolito activo, o un compuesto producido u obtenido o derivado de un sobrenadante, filtrado o extracto deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406),Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409). La cepa o sobrenadante o filtrado o extracto, metabolito y/o compuesto se aplican, solos o en combinación con otra sustancia alguicida, en un control eficaz de algas. Una cantidad eficaz se define como aquellas cantidades de células de microorganismos, sobrenadante, filtrado o extracto, metabolito y/o compuesto solos o en combinación con o sin otra sustancia alguicida que es suficiente para modular la infestación de algas. La tasa eficaz puede verse afectada por las especies de algas presentes, la etapa de crecimiento de la plaga, la densidad de población de la plaga y factores ambientales tales como la temperatura, la velocidad del viento, la lluvia, la hora del día y la estacionalidad. La cantidad que estará dentro de un intervalo eficaz en un caso particular puede determinarse mediante pruebas de laboratorio o de campo como las que se enumeran en los presentes ejemplos. Aún en otra modalidad, la composición expuesta en la presente descripción también puede combinarse con otro microorganismo y/o pesticida(por ejemplo,fungicida, alguicida). Otro microorganismo puede incluir, pero no se limita a, un agente derivado deBacillussp. (por ejemplo,Bacillus firmus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis), Paecilomycessp.(P. lilacinus), Pasteuriasp. (P.penetrans), Pseudomonassp.,Brevabacillussp.,Lecanicilliumsp.,Ampelomycessp.,Pseudozymasp.,Streptomycessp. (S.bikiniensis, S. costaricanus, S. avermitilis), Burkholderiasp.,Trichodermasp.,Gliocladiumsp.,avermectina, Myrotheciumsp.,Paecilomycesspp.,Sphingobacteriumsp.,Arthrobotryssp.,Chlorosplrnium, Neobulgaria, Daldinia, Aspergillus, Chaetomium, Lysobacterspp,Lachnum papyraceum, Verticillium suchlasporium, Arthrobotrys oligospora, Verticillium chlamydosporium, Hirsutella rhossiliensis, Pochonia chlamydosporia, Pleurotus ostreatus, Omphalotus olearius, Lampteromyces japonicas, Brevudimonassp., oMuscodorsp.
En otra modalidad, la composición puede además usarse en combinación (tal como en una mezcla de composiciones, o una aplicación simultánea o secuencial) con uno o más de los siguientes: 3-(4-cloro-2,6-dimetilfenil)-4-hidroxi-8-oxa-1-azaspiro[4,5]dec-3-en-2-ona; 3-(4-cloro-2,4-dimetil[1,1-bifenil]-3-il)-4-hidroxi-8-oxa-1-azaspiro-[4,5]dec-3-en-2-ona; 4-[[(6-cloro-3-piridinil)metil]metilamino]-2(5H)-furanona; 4-[[(6-cloro-3-piridinil)metil]ciclopropilamino]-2(5H)-furanona; 3-cloro-N2-[(lS)-1-metil-2-(metilsulfonil)etil]-N1-[2-metil-4-[1,2,2,2-tetrafluoro-1-(trifluorometil)etil]fenil]-1,2-bencenodicarboxamida; 2-ciano-N-etil-4-fluoro-3-metoxibencenosulfonamida; 2-ciano-N-etil-3-metoxi-bencenosulfonamida; 2-ciano-3-difluorometoxi-N-etil-4-fluorobencenosulfonamida; 2-ciano-3-fluorometoxi-N-etil-bencenosulfonamida; 2-ciano-6-fluoro-3-metoxi-N,N-dimetilbencenosulfonamida; 2-ciano-N-etil-6-fluoro-3-metoxi-N-metil-bencenosulfonamida; 2-ciano-3-difluorometoxi-N,N-dimetilbencenosulfon-amida; 3-(difluorometil)-N-[2-(3,3-dimetilbutil)fenil]-1-metil-1H-pirazol-4-carboxamida; N-etil-2,2-dimetilpropionamida-2-(2,6-dicloro-a,a,a,-trifluoro-p-tolil)hidrazona; N-etil-2,2-dicloro-1-metilciclopropanocarboxamida-2-(2,6-dicloro-a,a,a,-trifluoro-p-tolil)hidrazona nicotina; tiocarbonato de O-{(E-)-[2-(4-cloro-fenil)-2-ciano-1-(2-trifluorometilfenil)-vinil]}S-metilo; (E)-N1-[(2-cloro-1,3-tiazol-5-ilmetil)]-N2-ciano-Nl-metilacetamidina; 1-(6-cloropiridin-3-ilmetil)-7-metii-8-nitro-1,2,3,5,6,7-hexahidro-imidazo[1,2-a]piridin-5-ol; mesilato de 4-[4-clorofenil-(2-butilidina-hidrazono)metil)]fenilo; y N-etil-2,2-dicloro-1-metilciclopropanocarboxamida-2-(2,6-dicloro-a,a,a,-trifluoro-ptolil)hidrazona.
En la presente descripción, puede usarse el siguiente surfactante junto con la fermentación de microorganismos mencionados anteriormente para promover la emulsificación, dispersión, solubilización y penetración.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes no iónicos incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitano, ésteres de ácidos grasos de polioxialquileno sorbitano, ésteres de ácidos grasos de polioxialquileno, ésteres de ácidos grasos de glicerol, ésteres de ácidos grasos de polioxialquileno glicerol, ésteres de ácidos grasos de poliglicerol, ésteres de ácidos grasos de polioxialquileno poliglicerol, ésteres de ácidos grasos de sacarosa, ésteres de ácidos de resina, ésteres de ácidos de resina de polioxialquileno, éteres de polioxialquileno alquilo, éteres de polioxialquileno alquilfenilo, alquil(poli)glicósidos y polioxialquilenalquil(poli)glicósidos. Preferentemente, puede usarse un surfactante no iónico que contiene un grupo éter que no tiene átomo de nitrógeno y un surfactante no iónico que contiene un grupo éster.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes aniónicos incluyen surfactantes que contienen grupos éster carboxílico, sulfónico, sulfúrico y que contienen grupos éster fosfórico, y surfactantes que contienen grupos éster carboxílico y fosfórico.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes carboxílicos incluyen ácidos grasos que tienen de 6-30 átomos de carbono o sales de los mismos, sales de ácido carboxílico polihídrico, sales de ácido carboxílico de éter polioxialquileno alquilo, sales de ácido carboxílico de éter polioxialquileno alquilamida, sales de ácido rodínico, sales de ácido dimérico, sales de ácido polimérico y sales de ácidos grasos de aceite de resina.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes sulfónicos incluyen sales de ácido alquilbencenosulfónico, sales de ácido alquilsulfónico, sales de ácido alquilnaftalenosulfónico, sales de ácido naftalenosulfónico, sales de ácido sulfónico de éter difenilo, condensados de ácido alquilnaftalenosulfónico y condensado de ácido naftalenosulfónico.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes que contienen grupos éster sulfúrico incluyen sales de éster alquilsulfúrico (sales de ácido alquilsulfúrico), sales de éster polioxialquileno alquilsulfúrico (sales de ácido polioxialquileno alquilsulfúrico), sales de ácido sulfúrico de éter de polioxialquileno alquil fenilo, sales de éster de ácido triestirenado fenol sulfúrico, sales de éster de polioxialquileno distirenado fenol sulfúrico y sales de ácido alquilpoliglicósido sulfúrico.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes que contienen grupos éster de ácido fosfórico incluyen sales de éster de ácido alquil fosfórico, sales de éster de ácido alquilfenilfosfórico, sales de éster de ácido polioxialquileno alquilfosfórico y sales de éster de ácido polioxialquileno alquilfenilfosfórico.
Los ejemplos no limitantes de las sales incluyen sales metálicas (tales como sales de Na, K, Ca, Mg y Zn), sales de amonio, sales de alcanol amina y sales de amina alifática.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes anfóteros incluyen surfactantes que contienen grupos aminoácidos, que contienen grupos betaína, que contienen grupos imidazolina y que contienen grupos óxido de amina.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes que contienen grupos aminoácidos incluyen sales de acilaminoácidos, sales de ácido acilsarcosina, sales de ácido aciloilmetilaminopropiónico, sales de ácido alquilaminopropiónico y sales de ácido acilamida etilhidroxietilmetilcarboxílico.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes que contienen grupo betaína incluyen alquildimetilbetaína, alquilhidroxietilbetaína, acilamida propilhidroxipropilamonio sulfobetaína, acilamida propilhidroxipropilamonio sulfobetaína y amida del ácido ricinoleico propil dimetilcarboxi metilamonio betaína.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes que contienen grupo imidazolina incluyen alquilcarboxi metilhidroxi etilimidazolinio betaína y alquiletoxi carboxi metilimidazolinio betaína.
Los ejemplos no limitantes de surfactantes que contienen grupos óxido de amina incluyen óxido de alquildimetilamina, óxido de alquildietanolamina y óxido de alquilamidapropilamina.
Puede usarse un tipo de los surfactantes mencionados anteriormente y puede usarse una mezcla de dos o más tipos de los surfactantes mencionados anteriormente. En el caso de que uno de estos surfactantes comprende un grupo polioxialquileno, el grupo polioxialquileno puede ser un grupo polioxietileno y el número molar promedio de grupos polioxietileno añadidos puede ser de 1 a 50.
Como surfactante, puede usarse al menos un compuesto seleccionado de surfactantes no iónicos que contienen grupos éster, surfactantes no iónicos que contienen grupos éter que no tienen átomo de nitrógeno, surfactantes anfóteros, surfactantes aniónicos carboxílicos y surfactantes aniónicos fosfóricos.
Los siguientes componentes fertilizantes pueden usarse junto con la fermentación de microorganismos antes mencionada. Los ejemplos específicos de los mismos pueden ser compuestos inorgánicos u orgánicos que pueden aportar elementos tales como N, P, K, Ca, Mg, S, B, Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, Cl, Si y Na, en particular N, P, X, Ca y Mg. Los ejemplos de tales compuestos inorgánicos incluyen nitrato de amonio, nitrato de potasio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, nitrato de sodio, urea y carbonato de amonio, fosfato de potasio, superfosfato de calcio, fertilizante de fosfato fundido (3MgO.CaO.P<2>O<5>.3CaSiO<2>), sulfato de potasio, cloruro de potasio, nitrato de cal, cal apagada, carbonato de cal, sulfato de magnesio, hidróxido de magnesio y carbonato de magnesio. Los ejemplos de compuestos orgánicos incluyen excrementos de aves, estiércol de vaca, compost de corteza, aminoácidos, peptona, soluciones de aminoácidos, extractos de fermentación, sales de calcio de ácidos orgánicos (tales como ácido cítrico, ácido glucónico y ácido succínico) y sales de calcio de ácidos grasos (tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido caprílico, ácido cáprico y ácido caproico). Estos componentes fertilizantes pueden usarse junto con el surfactante. En el caso de que los componentes del fertilizante se apliquen suficientemente como fertilizante basal al suelo, como se observa en el cultivo al aire libre de una planta de arroz o de hortalizas, no es necesario mezclar los componentes del fertilizante.
Ejemplos
La composición y los métodos establecidos en la presente descripción se ilustrarán con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes. Los ejemplos son ilustrativos de diversas modalidades únicamente y no limitan la invención reivindicada con respecto a los materiales, condiciones, relaciones de peso, parámetros del proceso y similares mencionados en la presente descripción.
Ejemplo 1.
Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) es un hongo que se descubrió como un éxito inicial enPesudokirchnneriella subcapitatay su actividad se verificó tanto enPesudokirchnneriella subcapitatacomo enChamydomonas reinhardtii.El microbio se identificó por su secuencia ITS comoBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406).Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) tiene la actividad más amplia de cualquier alguicida exitoso verificado. Tiene actividad en todas las especies en las que se ha evaluado y tiene más de 75 % de actividad en todas las especies exceptoMicrocystis aeruginosa.Sin embargo, las LC50 paraBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406) son algo más altas que los otros éxitos principales, particularmente para las algas verdes, que se muestran en la Tabla 1.
Cuando se prueba en un sistema que simula un campo de arroz infestado de algas,Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) tuvo un control moderado deAnabaena sp.,pero no hay control del contenido general de clorofila A.
Tabla 1 Resumen de es ectro LC50 deBeauveria bassianaO379 NRRL-67406
Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) se aisló, evaluó e identificó como un éxito inicial. La actividad se verificó enChlamydomonas reinhardtii.
La evaluación inicial se realizó mediante la dosificación de 750 ul de fase logarítmica temprana de los cultivos dePesudokirchnneriella subcapitataoChamydomonas reinhardtii(medio de Bristol o medio de Bold 3N modificado, respectivamente, pH 6,2) con 100 pl de sobrenadante libre de células en una placa de 48 pocillos. Se dosificaron dos pocillos por tratamiento. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes de espectro completo durante tres días. Los aislados evaluados enPesudokirchnneriella subcapitatase calificaron mediante la medición de la fluorescencia de la clorofila A (Ex: 440 nm, Em: 680 nm) para cada pocillo. Cualquier aislado que produjera una reducción de 75 % en clorofila A en comparación con un control no tratado se consideró un éxito. Los aislados evaluados enChlamydomonas reinhardtiise calificaron visualmente al comparar los pocillos tratados con los no tratados. Los aislados que dieron como resultado pocillos que parecían 75 % menos verdes que los pocillos no tratados se consideraron exitosos.
Identificación de la especie de microbio. El ADN se extrajo deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406) mediante el uso del mini kit Qigen DNeasy Plant. La amplificación por PCR se realizó al día siguiente, mediante el uso de los cebadores ITS1 e ITS4. Se confirmó la presencia de una banda en un gel de agarosa y la reacción de PCR se limpió mediante el uso del kit de limpieza de PCR Mo Bio UltraClean y se envió a Davis Sequencing. Las secuencias se alinearon mediante el uso de BioEdit y la secuencia de consenso resultante se buscó en la base de datos de nucleótidos BLAST. El microbio se identificó comoBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406).
Pruebas de espectro. Microalgas.Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) se probó en un amplio espectro de especies de algas. Como parte de las pruebas de espectro,Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) se probó enPesudokirchnerella subcapitatadespués de pasar del medio V8 al medio MBI-1 (M1).Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) tiene el espectro de actividad más amplio de cualquiera de los alguicidas exitosos verificados. Es activo en todas las especies en las que se ha probado, aunque su actividad enMicrocystis areuginosaes menos de 75 % de inhibición, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2 Actividad del es ectro deBeauveria bassianaO379 NRRL-67406 en microalgas
La prueba de espectro en especies de microalgas se llevó a cabo de una manera muy similar a la evaluación inicial enPseudokirchneriella subcapitata.La prueba se llevó a cabo en placas de 48 pocillos con 100 ul de sobrenadante libre de células dosificados en 750 ul de cultivo de algas. En lugar de una prueba inicial seguida de dos verificaciones, se probaron simultáneamente dos fermentaciones separadas para realizar las pruebas de espectro. Si se observaba una inhibición superior a 75 % en cada fermentación, el aislado se consideraba "activo" en ese espectro de especies. Si una o ambas fermentaciones producían entre 50 % y 75 % de inhibición, el aislado se consideraba "algo activo" en el espectro de especies.
Macroalgas.Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) se probó en dos especies de macroalgas,Spirogyra sp.yChara sp.Las pruebas se calificaron visualmente. Las fermentaciones se probaron enChara sp.y las calificaciones de 4 o más se consideraron activas. Se muestra en la Tabla 3. Se probó una fermentación deSpirogyra sp.en cuatro réplicas. Al menos tres de las cuatro réplicas deben mostrar una fuerte actividad para ser considerada un éxito, como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 3 Actividad del es ectro deBeauveria bassianaO379 NRRL-67406) enChara sp.
Tabla 4 Actividad del es ectro deBeauveria bassianaO379 NRRL-67406) enSpirogyra sp.
La prueba de espectro enChara sp.se realizó al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene 9 mililitros de agua de mejillón y 1 ml de sobrenadante libre de células. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las ramitas uniformemente amarillentas o doradas se calificaron con "2", las ramitas parcialmente amarillentas o doradas se calificaron con "1" y las ramitas sanas se calificaron con "0". Se probaron tres réplicas para cada muestra. Las tres calificaciones se sumaron. Una calificación de "4" o más se consideró "activa". Una calificación de "3" se consideró "algo activa". Solo se probó una fermentación paraSpirogyra sp.Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 ul de medio EREM en placas de 48 pocillos, luego las placas se dosificaron con 100 ul de sobrenadante libre de células, cuatro réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para determinar la salud de las hebras. Los aislados se consideraron activos si todas las hebras murieron en tres de las cuatro réplicas.
Respuestas a las dosis. Se determinaron varias respuestas a las dosis del sobrenadante libre de células deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406). Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron mediante el uso de placas de 96 pocillos, como se muestra en la Figura 1 y la Figura 2. Las respuestas a las dosis de macroalgas se realizaron en placas de 48 pocillos(Spirogyra sp.)o en tubos de centrífuga Falcon de 15 ml(Charasp.), que se muestran en la Tabla 5 y la Tabla 6.
Tabla 5: Respuesta a las dosis deBeauveria bassiana O379 (NRRL-67406)enSpirogyra sp.en una placa de 48 ocillos.
Tabla 6: Respuesta a las dos i s deBeauveria bassianaO379 NRRL-67406 enChara^ sp.en tubos de 15 ml.
Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron en placas de 96 pocillos con 250 ul de cultivo de algas en fase logarítmica temprana dosificados con varios volúmenes de sobrenadante libre de células deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406). Se dosificaron dos pocillos para cada volumen. Los ensayos se incubaron bajo luces fluorescentes durante tres días. Los ensayos se calificaron al transferir 200 ul de cada pocillo a una placa de 96 pocillos negra y luego leer la fluorescencia de clorofila A en un lector de microplacas (Ex: 440 nm, Em: 680 nm). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar las unidades de fluorescencia relativas de los pocillos tratados con las de los pocillos no tratados.
Las respuestas a las dosis enChara sp.se realizaron al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene varias diluciones de sobrenadante libre de células deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406) en agua de mejillón. Hubo dos réplicas por tratamiento. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las respuestas a las dosis enSpirogyra sp.se realizaron en placas de 48 pocillos. Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 ul de medio EREM en placas de 48 pocillos, y luego las placas se dosificaron con varios volúmenes de sobrenadante libre de células, dos réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para comprobar la salud de las hebras. Los pocilios en los que todas las células estaban muertas se calificaron con "+", los pocillos en los que algunas células estaban muertas y otras vivas se calificaron con "+/-" y los pocillos con hebras sanas se calificaron con "-".
Ensayo de algas de arroz.Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) se probó en un bioensayo destinado a simular una infestación de algas en un campo de arroz. El ensayo se realizó en vasos de plástico transparente que contenían pequeñas macetas de arroz. Los vasos se llenaron con 100 ml de un cultivo mixto deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Los vasos se trataron con 5 ml (5 % v/v) de sobrenadante libre de células deBeauveria bassianaO379 (NRRL-67406) y se incubaron bajo luces durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A (presente en todas las especies de algas) y ficocianina (presente únicamente en cianobacterias). El % de inhibiciones se calculó al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
T l 7: inhi i i n l r fil A fi i nin r l n l rr z.
Beauveria bassianaO379 (NRRL-67406) inhibió el crecimiento deAnabaena sp.en aproximadamente 75 % el día cuatro y en aproximadamente 60 % el día 7. Sin embargo, la clorofila A total aumentó ambos días. Para el día 14, los cambios en las concentraciones de pigmento eran inconsistentes entre las réplicas. No se observaron efectos negativos en ninguna de las plantas tratadas.
Se preparó un cultivo mixto de algas al combinar 1,6 litros de 1/8 de medio de Hoagland con 100 ml de cada uno de cultivos maduros deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Se añadieron 100 ml del cultivo en vasos de plástico transparente que contenían macetas de 5,5 x 5,5 cm de dos semanas de antigüedad deOryza sativacultivado en un suelo agregado arcilloso. Dos vasos se trataron con 5 ml deBeauveria bassiana O379 (NRRL-67406),dos vasos se trataron con 1 ppm de cobre (de Pondmaster Aquatic Algaecide) y tres vasos se dejaron sin tratar. Los vasos se incubaron bajo luces de espectro completo durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A y ficocianina mediante el uso de un espectrofotómetro. Se pipetearon muestras de tres mililitros del cultivo en cubetas de plástico con lados transparentes y se leyó la fluorescencia a Ex: 440 nm Em: 680 nm para clorofila A, y a Ex: 630 nm Ex: 660 nm para ficocianina. El % de inhibiciones se calculó al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
Ejemplo 2.
Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se descubrió como un éxito verificado enChlaymdomonas reinhardtiiy se identificó por 16S rRNA comoBrevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408). El sobrenadante fermentado deBrevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se probó en un amplio espectro de especies de algas y se descubrió que tiene un espectro de actividad muy amplio. La única especie probada sobre la que no tiene actividad son las algas verdesScenedesmus quadricata.Tiene más de 75 % de actividad en todas las especies restantes exceptoOscillatoria tenius.Las LC50 paraBrevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) son moderadamente bajas, como se muestra en la Tabla 8.
Cuando se prueba en un sistema que simula un campo de arroz infestado de algas,Brevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) no funcionó; no hubo cambios notables en el contenido de clorofila A y hubo un aumento notable en el contenido de ficocianina cuatro y siete días después del tratamiento. Esto sugiere queBrevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) estaba promoviendo el crecimiento deAnabaena sp.en esta prueba, aunque se ha visto que controla la misma especie en dosis bajasin vitro.
Tabte 8: Resumen de es ectroLC50 de Brevibacillus brevisHNYM3 O989 NRRL-B67408).
Beauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se aisló del suelo, se recogió de agar V8 y se cultivó en medio V8 para la evaluación inicial.Beauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se identificó como un éxito inicial enChlamydomonas reinhardtiiy se comprobó su actividad.
La evaluación inicial se realizó mediante la dosificación de 750 ul de fase logarítmica temprana del cultivo deChamydomonas reinhardtii(Medio de Bold 3N modificado, pH 6,2) con 100 pl de sobrenadante libre de células en una placa de 48 pocillos. Se dosificaron dos pocillos por tratamiento. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes de espectro completo durante tres días. Los aislados evaluados enChlamydomonas reinhardtiise calificaron visualmente al comparar los pocillos tratados con los no tratados. Los aislados que dieron como resultado pocillos que parecían 75 % menos verdes que los pocillos no tratados se consideraron exitosos.
Identificación del nombre de la especie de microbio. El ADN se extrajo deBeauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) mediante el uso del kit de aislamiento de ADN microbiano MoBio UltraClean el 12/3/2012 y la Pc R se realizó mediante el uso de los cebadores FD1/RD1 al día siguiente. El producto de la PCR se purificó mediante el uso del kit de limpieza de PCR MoBio UltraClean y se envió a Davis Sequencing. Se ensambló una secuencia de consenso mediante el uso de BioEdit y se buscó en la base de datos de nucleótidos BLAST y EZtaxon. El microbio se identificó comoBrevibacillus brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408).
Pruebas de espectro. Microalgas.Beauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se probó en un amplio espectro de especies de algas.Scenedesmus quadricataes la única especie en la que no está activo, y fuera de las especies restantesOscilatoria teniuses la única especie sobre la que tiene menos de 75 % de control.
Tabla 9: Actividad del es ectro deBeauveria brevisHNYM3 O989 NRRL-B67408 en microalgas.
La prueba de espectro en especies de microalgas se llevó a cabo de una manera muy similar a la evaluación inicial enPseudokirchneriella subcapitata.La prueba se llevó a cabo en placas de 48 pocillos con 100 pl de sobrenadante libre de células dosificados en 750 pl de cultivo de algas. En lugar de una prueba inicial seguida de dos verificaciones, se probaron simultáneamente dos fermentaciones separadas para realizar las pruebas de espectro. Si se observaba una inhibición superior a 75 % en cada fermentación, el aislado se consideraba "activo" en ese espectro de especies. Si una o ambas fermentaciones producían entre 50 % y 75 % de inhibición, el aislado se consideraba "algo activo" en el espectro de especies.
Macroalgas.Beauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se probó en dos especies de macroalgas,Spirogyra sp.yChara sp.Las pruebas se calificaron visualmente. Las fermentaciones se probaron enChara sp.y las calificaciones de 4 o más se consideraron activas. Se probó una fermentación deSpirogyra sp.en cuatro réplicas. Al menos tres de las cuatro réplicas deben mostrar una fuerte actividad para ser consideradas un éxito.
Tabla 10: Actividad del es ectro deBeauveria brevisHNYM3 Q989 NRRL-B67408) enChara sp.
Tabla 11: Actividad del espectro deBeauveria ^brevisHNYM3 O989 NRRL-B67408) en Spirogyra sp.
La prueba de espectro enChara sp.se realizó al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 mililitros que contiene 9 mililitros de agua de mejillón y 1 mililitro de sobrenadante libre de células. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las ramitas uniformemente amarillentas o doradas se calificaron con "2", las ramitas parcialmente amarillentas o doradas se calificaron con "1" y las ramitas sanas se calificaron con "0". Se probaron tres réplicas para cada muestra. Las tres calificaciones se sumaron. Una calificación de "4" o más se consideró "activa". Una calificación de "3" se consideró "algo activa". Solo se probó una fermentación paraSpirogyra sp.Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 pl de medio EREM en placas de 48 pocillos, luego las placas se dosificaron con 100 pl de sobrenadante libre de células, cuatro réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para determinar la salud de las hebras. Los aislados se consideraron activos si las hebras morían en tres de las cuatro réplicas.
Respuestas a las dosis. Se determinaron varias respuestas a las dosis de sobrenadante libre de células deBeauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408). Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron mediante el uso de placas de 96 pocillos. (Figura 3 y Figura 4) Las respuestas a las dosis de macroalgas se realizaron en placas de 48 pocillos(Spirogyra sp.)o en tubos de centrífuga Falcon de 15 ml(Chara sp.).(Tabla 12 y Tabla 13) Tabla 12: Respuesta a las dosis deBeauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) enSpirogyra sp.en una placa de 48 ocillos.
Tabla 13: Respuesta a las dosis deBeauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) enChara sp.en tubos de 15 ml.
Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron en placas de 96 pocillos con 250 pl de cultivo de algas en fase logarítmica temprana dosificados con varios volúmenes de sobrenadante libre de células deBeauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408). Se dosificaron dos pocillos para cada volumen. Los ensayos se incubaron bajo luces fluorescentes durante tres días. Los ensayos se calificaron al transferir 200 ul de cada pocillo a una placa de 96 pocillos negra y luego leer la fluorescencia de clorofila A en un lector de microplacas (Ex: 440 nm, Em: 680 nm). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar las unidades de fluorescencia relativas de los pocillos tratados con las de los pocillos no tratados.
Las respuestas a las dosis enChara sp.se realizaron al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene varias diluciones de sobrenadante libre de células deBeauveria bassiana O379 (NRRL-67406)en agua de mejillón. Hubo dos réplicas por tratamiento. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las respuestas a las dosis enSpirogyra sp.se realizaron en placas de 48 pocillos. Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 ul de medio EREM en placas de 48 pocillos, y luego las placas se dosificaron con varios volúmenes de sobrenadante libre de células, dos réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para comprobar la salud de las hebras. Los pocillos en los que todas las células estaban muertas se calificaron con "+", los pocillos en los que algunas células estaban muertas y otras vivas se calificaron con "+/-" y los pocillos con hebras sanas se calificaron con "-".
Ensayo de algas de arroz.Beauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) se probó en un bioensayo destinado a simular una infestación de algas en un campo de arroz. El ensayo se realizó en vasos de plástico transparente que contenían pequeñas macetas de arroz. Los vasos se llenaron con 100 ml de un cultivo mixto deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Los vasos se trataron con 5 ml (5 % v/v) de sobrenadante libre de células deBeauveria brevisHNYM3, O989 (NRRL-B67408) y se incubó bajo luces durante un total de 14 días. En los días 4, 7 y 14, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A (presente en todas las especies de algas) y ficocianina (presente únicamente en cianobacterias). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados. (Tabla 14)
Tabte arroz.
No se observaron reducciones significativas en la clorofila A en ninguno de los tres momentos. Los días 4 y 7 después del tratamiento, hubo aumentos en los niveles de ficocianina en ambas réplicas. No se observaron efectos negativos en las plantas de arroz en ninguna de las réplicas.
Se preparó un cultivo mixto de algas al combinar 1,6 l de medio de Hoagland 1/8 con 100 ml de cada uno de cultivos maduros deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Se añadieron 100 ml del cultivo en vasos de plástico transparente que contenían macetas de 5,5 x 5,5 cm de dos semanas de antigüedad deOryza sativacultivado en un suelo agregado arcilloso. Dos vasos se trataron con 5 ml de O989, dos vasos se trataron con 1 ppm de cobre (de Pondmaster Aquatic Algaecide) y los tres vasos se dejaron sin tratar. Los vasos se incubaron bajo luces de espectro completo durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A y ficocianina mediante el uso de un espectrofotómetro. Se pipetearon muestras de tres mililitros del cultivo en cubetas de plástico con lados transparentes y se leyó la fluorescencia a Ex: 440 nm Em: 680 nm para clorofila A, y a Ex: 630 nm Ex: 660 nm para ficocianina. Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
Ejemplo 3.
Streptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) se descubrió como un éxito verificado enChlamydomonas reinhardtiiy se identificó mediante análisis de 16s rRNA como un miembro de la familia deStreptomyces lavendulaecon la especie más cercana siendoStreptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410) yStreptomyces norjiriensis.Se encontró que tiene un amplio espectro de actividad en especies representativas de microalgas y macroalgas, solo carece de actividad enScenedesmus quadricatayOscilatoria tenius.Aunque existe cierta inconsistencia entre las fermentaciones,Streptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) es activa en concentraciones muy bajas para algunas algas; una dosis de 0,05 % v/v de P842 puede producir un control de 99 % deChlamydomonas reihnardtii.
En una prueba destinada a simular un campo de arroz infestado de algas,Streptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) tuvo una mayor inhibición de la clorofila A que 1 ppm de cobre siete días después del tratamiento, aunque hubo un aumento del pigmento de algas verde azulado ficocianina, lo que sugiere que se promovió el crecimiento deAnabaena sp.
Tabla - 67410)
Se aislóStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) del suelo. El actinomiceto se recogió del agar R2A y se fermentó para su evaluación.Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409)se identificó como un éxito inicial enChlamydomonas reinhardtiiy se comprobó su actividad.
La evaluación inicial se realizó mediante la dosificación de 750 pl de fase logarítmica temprana del cultivo deChamydomonas reinhardtii(Medio de Bold 3N modificado, pH 6,2) con 100 pl de sobrenadante libre de células en una placa de 48 pocillos. Se dosificaron dos pocillos por tratamiento. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes de espectro completo durante tres días. Cualquier aislado que produjera una reducción de 75 % en clorofila A en comparación con un control no tratado se consideró un éxito. Los aislados evaluados enChlamydomonas reinhardtiise calificaron visualmente al comparar los pocillos tratados con los no tratados. Los aislados que dieron como resultado pocillos que parecían 75 % menos verdes que los pocillos no tratados se consideraron exitosos.
Identificación de la especie de microbio. El ADN se extrajo deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) mediante el uso del kit de aislamiento de ADN microbiano MoBio UltraClean y la PCR se realizó el mismo día mediante el uso de los cebadores FD1/RD1. El producto de la PCR se purificó mediante el uso del kit de limpieza de PCR MoBio UltraClean y se envió a Davis Sequencing. Se construyó una secuencia de consenso en BioEdit y se buscó en la base de datos de nucleótidos BLAST y EZtaxon.
Streptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) se identificó como un miembro de la familia deStreptomyces lavendulaecon coincidencias más cercanas aStreptomyces spororaveusF18, P842 (NRRL-B67410) yStreptomyces norjiriensis.
Pruebas de espectro. Microalgas.Streptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) se probó en un amplio espectro de especies de microalgas. Tiene un espectro de actividad moderadamente amplio, con fuerte actividad enPseudokircherneriellasubcapitata,Anabaena sp.,yMicrocystis aeruginosa.Es algo activo sobre las diatomeasNavicula sp.No es activo enScenedesmus quadricataoOscillatoria tenius.
Tabla 16: A ivi l rr m r vF1 P 42 NRRL-B 741 n microalgas
La prueba de espectro en especies de microalgas se llevó a cabo de manera muy similar a las pruebas iniciales enPseudokirchneriella subcapitata.La prueba se llevó a cabo en placas de 48 pocillos con 100 j l de sobrenadante libre de células dosificados en 750 j l de cultivo de algas. En lugar de una prueba inicial seguida de dos verificaciones, se probaron simultáneamente dos fermentaciones separadas para realizar las pruebas de espectro. Si se observaba una inhibición superior a 75 % en cada fermentación, el aislado se consideraba "activo" en ese espectro de especies. Si una o ambas fermentaciones producían entre 50 % y 75 % de inhibición, el aislado se consideraba "algo activo" en el espectro de especies.
Macroalgas.Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409)se probó en dos especies de macroalgas,Spirogyra sp.yChara sp.Las pruebas se calificaron visualmente. Las fermentaciones se probaron enChara sp.y las calificaciones de 4 o más se consideraron activas. Se probó una fermentación deSpirogyra sp.en cuatro réplicas. Al menos tres de las cuatro réplicas deben mostrar una fuerte actividad para ser consideradas un éxito.
Tabla 17: Actividad del rr m r vF1 P 42 NRRL-B67410) enChara sp.
Tabla 18: Actividad del espectro^r m r vF1 P 42 NRRL-B67410) enSpirogyra sp.
La prueba de espectro enChara sp.se realizó al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene 9 ml de agua de mejillón y 1 ml de sobrenadante libre de células. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las ramitas uniformemente amarillentas o doradas se calificaron con "2", las ramitas parcialmente amarillentas o doradas se calificaron con "1" y las ramitas sanas se calificaron con "0". Se probaron tres réplicas para cada muestra. Las tres calificaciones se sumaron. Una calificación de "4" o más se consideró "activa". Una calificación de "3" se consideró "algo activa". Solo se probó una fermentación paraSpirogyra sp.Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 j l de medio EREM en placas de 48 pocillos, luego las placas se dosificaron con 100 j l de sobrenadante libre de células, cuatro réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para determinar la salud de las hebras. Los aislados se consideraron activos si las hebras mueren en tres de las cuatro réplicas.
Respuestas a las dosis. Se determinaron varias respuestas a las dosis del sobrenadante libre de células deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410). Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron mediante el uso de placas de 96 pocillos. (Figura 5 y Figura 6) Las respuestas a las dosis de macroalgas se realizaron en placas de 48 pocillos(Spirogyra sp.)o en tubos de centrífuga Falcon de 15 ml(Chara sp.).(Tabla 19 y Tabla 20)
Tabla 19: Respuesta a las dosis deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) enSpirogyra sp.en una l 4 ill .
Tabla 20: Respuesta a las dosis deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) enChara sp.en tubos de 15 ml.
Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron en placas de 96 pocillos con 250 ul de cultivo de algas en fase logarítmica temprana dosificados con varios volúmenes de sobrenadante libre de células deStreptomyces sp. Q004 (NRRL-67409).Se dosificaron dos pocillos para cada volumen. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes durante tres días. Los ensayos se calificaron al transferir 200 j l de cada pocillo a una placa de 96 pocillos negra y luego leer la fluorescencia de clorofila A en un lector de microplacas (Ex: 440 nm, Em: 680 nm). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar las unidades de fluorescencia relativas de los pocillos tratados con las de los pocillos no tratados.
Las respuestas a las dosis enChara sp.se realizaron al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene varias diluciones de sobrenadante libre de células deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) en agua de mejillón. Hubo dos réplicas por tratamiento. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente.
Las respuestas a las dosis enSpirogyra sp.se realizaron en placas de 48 pocillos. Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 pl de medio EREM en placas de 48 pocillos y luego se dosificaron las placas con varios volúmenes de sobrenadante libre de células, dos réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para comprobar la salud de las hebras. Los pocillos en los que todas las células estaban muertas se calificaron con "+", los pocillos en los que algunas células estaban muertas y otras vivas se calificaron con "+/-" y los pocillos con hebras sanas se calificaron con "-".
Ensayo de algas de arroz. Se probóStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410) en un bioensayo destinado a simular una infestación de algas en un campo de arroz. El ensayo se realizó en vasos de plástico transparente que contenían pequeñas macetas de arroz. Los vasos se llenaron con 100 ml de un cultivo mixto deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Los vasos se trataron con 5 ml (5 % v/v) de sobrenadante libre de células deStreptomyces sp.Q004 (NRRL-67409) y se incubaron bajo luces durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A (presente en todas las especies de algas) y ficocianina (presente únicamente en cianobacterias). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
El día 4, el control de clorofila A no fue consistente entre las réplicas, pero hubo más de 50 % de inhibición en uno de los vasos. El día 7 hubo un control consistente de la clorofila A en aproximadamente 64 % de inhibición; sin embargo, hubo un aumento en la ficocianina. Esto sugiere que el contenido de especies de algas verde azulesAnabaena sp.había aumentado pero el contenido total de algas disminuyó. Esto difiere mucho del cobre, en el que hubo pocos cambios en el contenido de clorofila A el día 7, pero hubo una enorme disminución en la ficocianina.
Se preparó un cultivo mixto de algas al combinar 1,6 l de medio de Hoagland 1/8 con 100 ml de cada uno de cultivos maduros deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Se añadieron 100 ml del cultivo en vasos de plástico transparente que contenían macetas de 5,5 x 5,5 cm de dos semanas de antigüedad deOryza sativacultivado en un suelo agregado arcilloso. Dos vasos se trataron con 5 ml deStreptomyces sporoaveusF18, P842 (NRRL-B67410), dos vasos se trataron con 1 ppm de cobre (de Pondmaster Aquatic Algaecide) y tres vasos se dejaron sin tratar. Los vasos se incubaron bajo luces de espectro completo durante un total de 14 días. En los días 4, 7 y 14, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A y ficocianina mediante el uso de un espectrofotómetro. Se pipetearon muestras de 3 ml del cultivo en cubetas de plástico con lados transparentes y se leyó la fluorescencia a Ex: 440 nm Em: 680 nm para clorofila A, y a Ex: 630 nm Ex: 660 nm para ficocianina. Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
Ejemplo 4.
Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) se descubrió como un éxito verificado enChlamydomonas reinhardtiiy se identificó comoPaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407). El aislado se probó en un amplio espectro de especies de algas y se encontró que tenía un espectro de actividad generalmente amplio.Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) está activo en todas las especies analizadas exceptoScededesmus quadricatayOscilatoria tenius.Mientras realizaba pruebas de espectro, se encontró quePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) tenía menos de 75 % de inhibición dePseudokirchneriella subcapitataa una dosis de 12 % v/v, sin embargo, en una respuesta a las dosis en la misma especie, una fermentación diferente dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) tuvo una inhibición de 95 % hasta una dosis de 0,8 % v/v. Esto, así como también de los diferentes resultados enAnabaena sp.entre fermentaciones, sugiere que las fermentaciones dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) no son muy consistentes, pero existe la posibilidad de que el sobrenadante sea activo en dosis muy bajas.
Cuando se probó en un sistema diseñado para imitar un campo de arroz infestado de algas,Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) tuvo un desempeño de manera similar a 1 ppm de cobre en términos de inhibición de clorofila A y ficocianina que cualquiera de los otros alguicidas exitosos durante los días tres y siete después del tratamiento.
Tabl 22: R m n r LP ni ill ^ l iiD17 P NRRL-B 7407).
Se aislóPaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) de musgo y suelo.Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) se evaluó enChlaymdomonas reinhardtiiy se identificó como un éxito inicial. Se verificó su actividad.
La evaluación inicial se realizó mediante la dosificación de 750 pl de fase logarítmica temprana del cultivo deChamydomonas reinhardtii(Medio de Bold 3N modificado, pH 6,2) con 100 pl de sobrenadante libre de células en una placa de 48 pocillos. Se dosificaron dos pocillos por tratamiento. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes de espectro completo durante tres días. Cualquier aislado que produjera una reducción de 75 % en clorofila A en comparación con un control no tratado se consideró un éxito. Los aislados evaluados enChlamydomonas reinhardtiise calificaron visualmente al comparar los pocillos tratados con los no tratados. Los aislados que dieron como resultado pocillos que parecían 75 % menos verdes que los pocillos no tratados se consideraron exitosos.
Identificación del nombre de la especie de microbio. 16S rRNA dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) se amplificó mediante PCR de colonias mediante el uso de los cebadores FD1/RD1. Se envió a Davis Sequencing y las secuencias se alinearon en BioEdit. La secuencia de consenso resultante se buscó en la base de datos de nucleótidos BLAST y en EZtaxon. El microbio se identificó comoPaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407). Pruebas de espectro. Microalgas.Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) se probó en un amplio espectro de especies de microalgas. El espectro de actividad resultante es moderadamente amplio con una fuerte actividad enAnabaena sp., Microcystis aeruginosa,yNaviculasp.; actividad más débil enPseudokirchneriella subcapitata;y no hay actividad enScenedesmus quadricataoOscilatoria tenius.
Tabla 2 : A ivi l rP ni ill l iiD17 P NRRL-B 74 7 n mi roalgas.
La prueba de espectro en especies de microalgas se llevó a cabo de una manera muy similar a la evaluación inicial enPseudokirchneriella subcapitata.La prueba se llevó a cabo en placas de 48 pocillos con 100 pl de sobrenadante libre de células dosificados en 750 pl de cultivo de algas. En lugar de una prueba inicial seguida de dos verificaciones, se probaron simultáneamente dos fermentaciones separadas para realizar las pruebas de espectro. Si se observaba una inhibición superior a 75 % en cada fermentación, el aislado se consideraba "activo" en ese espectro de especies. Si una o ambas fermentaciones producían entre 50 % y 75 % de inhibición, el aislado se consideraba "algo activo" en el espectro de especies.
Macroalgas.Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) se probó en dos especies de macroalgas,Spirogyra sp.yChara sp.Las pruebas se calificaron visualmente. Se probó una fermentación enChara sp.y las calificaciones de 4 o más se consideraron activas. Se probó una fermentación deSpirogyra sp.en cuatro réplicas. Al menos tres de las cuatro réplicas deben mostrar una fuerte actividad para ser consideradas un éxito.
Tabla 24: Actividad del es ectro dePaenibacillus el iiSD17 P858 NRRL-B67407) enChara sp.
Tabla 25: Actividad del espectro dePaenibacillus el iiSD17 P858 NRRL-B67407) en Spirogyra sp.
La prueba de espectro enChara sp.se realizó al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene 9 ml de agua de mejillón y 1 ml de sobrenadante libre de células. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las ramitas uniformemente amarillentas o doradas se calificaron con "2", las ramitas parcialmente amarillentas o doradas se calificaron con "1" y las ramitas sanas se calificaron con "0". Se probaron tres réplicas para cada muestra. Las tres calificaciones se sumaron. Una calificación de "4" o más se consideró "activa". Una calificación de "3" se consideró "algo activa". Solo se probó una fermentación paraSpirogyra sp.Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 pl de medio EREM en placas de 48 pocillos, luego las placas se dosificaron con 100 pl de sobrenadante libre de células, cuatro réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para comprobar la salud de las hebras. Los aislados se consideran activos si las hebras mueren en tres de las cuatro réplicas.
Respuestas a las dosis. Se determinaron varias respuestas a las dosis del sobrenadante libre de células dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407). Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron mediante el uso de placas de 96 pocillos. (Figura 7 y Figura 8) Las respuestas a las dosis de macroalgas se realizaron en placas de 48 pocillos(Spirogyra sp.)o en tubos de centrífuga Falcon de 15 ml(Chara sp.).(Tabla 26 y Tabla 27).
Tenga en cuenta que durante las pruebas de espectro, se determinó quePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) solo era "algo activo" en una dosis de 12 % v/v, pero en esta prueba, produjo una inhibición de 95 % hasta una dosis de 0,8 %. Esto sugiere que la actividad dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) varía notablemente entre fermentaciones.
Tabla 26: Respuesta a las dosis dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) enSpirogyra sp.en una placa de
Tabla 27: Res l iP ni ill l iiD17 P NRRL-B 74 7 n h r . n ubos de 15 ml.
Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron en placas de 96 pocillos con 250 pl de cultivo de algas en fase logarítmica temprana dosificados con varios volúmenes de sobrenadante libre de células dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407). Se dosificaron dos pocillos para cada volumen. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes durante tres días. Los ensayos se calificaron al transferir 200 pl de cada pocillo a una placa de 96 pocillos negra y luego leer la fluorescencia de clorofila A en un lector de microplacas (Ex: 440 nm, Em: 680 nm). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar las unidades de fluorescencia relativas de los pocillos tratados con las de los pocillos no tratados.
Las respuestas a las dosis enChara sp.se realizaron al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene varias diluciones de sobrenadante libre de células P858 en agua de mejillón. Hubo dos réplicas por tratamiento. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente.
Las respuestas a las dosis enSpirogyra sp.se realizaron en placas de 48 pocillos. Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 pl de medio EREM en placas de 48 pocillos y luego se dosificaron las placas con varios volúmenes de sobrenadante libre de células, dos réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para determinar la salud de las hebras. Los pocillos en los que todas las células estaban muertas se calificaron con "+", los pocillos en los que algunas células estaban muertas y otras vivas se calificaron con "+/-" y los pocillos con hebras sanas se calificaron con "-".
Ensayo de algas de arroz.Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) se probó en un bioensayo destinado a simular una infestación de algas en un campo de arroz. El ensayo se realizó en vasos de plástico transparente que contenían pequeñas macetas de arroz. Los vasos se llenaron con 100 ml de un cultivo mixto deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Los vasos se trataron con 5 ml (5 % v/v) de sobrenadante libre de células dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) y se incubaron bajo luces durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A (presente en todas las especies de algas) y ficocianina (presente únicamente en cianobacterias). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
La actividad dePaenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) en este ensayo fue similar a la actividad de 1 ppm de cobre. Cuatro días después del tratamiento, ambos tenían una inhibición superior a 50 % de la clorofila A y una inhibición aproximadamente superior a 75 % de la ficocianina. El día siete no hubo control de clorofila A para ninguno de los alguicidas, pero se continuó el control de ficocianina. Sin embargo,Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407) produjo solo un control de 60 % del pigmento cianobacteriano, mientras que el cobre tuvo más de 95 % de control. El cobre continuó controlando la ficocianina el día 14, mientras que el control de P858 cesó antes de esa fecha.
Se preparó un cultivo mixto de algas al combinar 1,6 l de medio de Hoagland 1/8 con 100 ml de cada uno de cultivos maduros deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Se añadieron 100 ml del cultivo en vasos de plástico transparente que contenían macetas de 5,5 x 5,5 cm de dos semanas de antigüedad deOryza sativacultivado en un suelo agregado arcilloso. Dos vasos se trataron con 5 ml dePaenibacillus elgiiSD17,<p>858 (NRRL-B67407), dos vasos se trataron con 1 ppm de cobre (de Pondmaster Aquatic Algaecide) y tres vasos se dejaron sin tratar. Los vasos se incubaron bajo luces de espectro completo durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A y ficocianina mediante el uso de un espectrofotómetro. Las muestras de mililitros del cultivo se pipetearon en cubetas de plástico con lados transparentes y se leyeron para determinar la fluorescencia a Ex: 440 nm Em: 680 nm para clorofila A, y a Ex: 630 nm Ex: 660 nm para ficocianina. Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
Ejemplo 5.
Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) se identificó como un éxito verificado enChlamydomonas reinhardtiiy se identificó mediante secuenciación de 16S rRNA como un miembro del grupoStreptomyces lavendulae,probablementeStreptomyces spororaveusoStreptomyces nojiriensis. Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) se probó en un amplio espectro de especies de algas y se encontró que tenía un espectro de actividad algo amplio. Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409) es activo en todas las especies evaluadas excepto enScenedesmus quadricata, Anabaenasp., yOscilatoria tenius.Si bien esto le da al aislado un espectro algo amplio en comparación con la mayoría de los alguicidas verificados, tiene el espectro más estrecho de los cinco principales alguicidas. Adicionalmente, Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409) tiene LC50 comparativamente altas para la mayoría de las especies de algas.
En una prueba destinada a simular un campo de arroz infestado de algas,Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) demostró cierta inhibición de la clorofila A en los días tres y siete, aunque esta actividad no fue consistente entre las réplicas.Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) aumentó constantemente la concentración del pigmento cianobacteriano ficocianina en esta prueba durante los días tres y siete.
-
Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409)se identificó como un éxito inicial enChlamydomonas reinhardtiiy se comprobó su actividad.
La evaluación inicial se realizó mediante la dosificación de 750 pl de fase logarítmica temprana del cultivo deChamydomonas reinhardtii(Medio de Bold 3N modificado, pH 6,2) con 100 pl de sobrenadante libre de células en una placa de 48 pocillos. Se dosificaron dos pocillos por tratamiento. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes de espectro completo durante tres días. Cualquier aislado que produjera una reducción de 75 % en clorofila A en comparación con un control no tratado se consideró un éxito. Los aislados evaluados enChlamydomonas reinhardtiise calificaron visualmente al comparar los pocillos tratados con los no tratados. Los aislados que dieron como resultado pocillos que parecían 75 % menos verdes que los pocillos no tratados se consideraron exitosos.
Identificación de la especie de microbio. El ADN se extrajo deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) mediante el uso del kit de aislamiento de ADN microbiano MoBio UltraClean y la PCR se realizó el mismo día mediante el uso de los cebadores FD1 y RD1. La reacción de PCR se purificó mediante el uso del kit de limpieza de PCR MoBio UltraClean y se envió a Davis Sequencing. Las secuencias se alinearon en BioEdit y se generó una secuencia de consenso. Se buscó la secuencia de consenso en la base de datos de nucleótidos BLAST y EZtaxon.
Streptomyces sp. Q004 (NRRL-67409) se identificó como un miembro del grupoStreptomyces lavendulaecon coincidencias más cercanas aStreptomyces spororaveusyStreptomyces nojiriensis.
Pruebas de espectro. Microalgas.Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) se probó en un amplio espectro de especies de microalgas. De los cinco primeros alguicidas exitosos,Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) tiene el espectro más estrecho, sin actividad enScenedesmus quadricata, Anabaena sp.,oOscilatoria tenius,y menos de 75 % de inhibición deNavicula sp.
Ta - as
La prueba de espectro en especies de microalgas se llevó a cabo de manera muy similar a las pruebas iniciales enPseudokirchneriella subcapitata.La prueba se llevó a cabo en placas de 48 pocillos con 100 pl de sobrenadante libre de células dosificados en 750 pl de cultivo de algas. En lugar de una prueba inicial seguida de dos verificaciones, se probaron simultáneamente dos fermentaciones separadas para realizar las pruebas de espectro. Si se observaba una inhibición superior a 75 % en cada fermentación, el aislado se consideraba "activo" en ese espectro de especies. Si una o ambas fermentaciones producían entre 50 % y 75 % de inhibición, el aislado se consideraba "algo activo" en el espectro de especies.
Macroalgas.Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) se probó en dos especies de macroalgas,Spirogyra sp.yChara sp.Las pruebas se calificaron visualmente. Se probaron dos fermentaciones enChara sp.y las calificaciones de 4 o más se consideraron activas. Se probó una fermentación deSpirogyra sp.en cuatro réplicas. Al menos tres de las cuatro réplicas deben mostrar una fuerte actividad para ser consideradas un éxito.
Tabla 31: Activid l rr m. 4 NRRL- 7409) enChara sp.
Tabla 32: Actividad del e rr m. 4 NRRL-67409) enSpirogyra sp.
La prueba de espectro enChara sp.se realizó al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene 9 ml de agua de mejillón y 1 ml de sobrenadante libre de células. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente. Las ramitas uniformemente amarillentas o doradas se calificaron con "2", las ramitas parcialmente amarillentas o doradas se calificaron con "1" y las ramitas sanas se calificaron con "0". Se probaron tres réplicas para cada muestra. Las tres calificaciones se sumaron. Una calificación de "4" o más se consideró "activa". Una calificación de "3" se consideró "algo activa". Solo se probó una fermentación paraSpirogyra sp.Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 pl de medio EREM en placas de 48 pocillos, luego las placas se dosificaron con 100 pl de sobrenadante libre de células, cuatro réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para comprobar la salud de las hebras. Los aislados se consideran activos si las hebras mueren en tres de las cuatro réplicas.
Respuestas a las dosis. Se determinaron varias respuestas a las dosis del sobrenadante libre de células deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409). Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron mediante el uso de placas de 96 pocilios. (Figura 9 y Figura 10) Las respuestas a las dosis de macroalgas se realizaron en placas de 48 pocilios(Spirogyra sp.)o en tubos de centrífuga Falcon de 15 ml(Chara sp.).(Tabla 33 y Tabla 34)
Tabla 33: Respuesta a las dosis deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) enSpirogyra sp.en una placa de 48 ocillos.
Tabla 34: Res l ir m. 4 NRRL- 74 nh r .n ubos de 15 ml.
Las respuestas a las dosis de microalgas se realizaron en placas de 96 pocillos con 250 pl de cultivo de algas en fase logarítmica temprana dosificados con varios volúmenes de sobrenadante libre de células deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409). Se dosificaron dos pocillos para cada volumen. Las placas se incubaron bajo luces fluorescentes durante tres días. Los ensayos se calificaron al transferir 200 pl de cada pocillo a una placa de 96 pocillos negra y luego leer la fluorescencia de clorofila A en un lector de microplacas (Ex: 440 nm, Em: 680 nm). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar las unidades de fluorescencia relativas de los pocillos tratados con las de los pocillos no tratados.
Las respuestas a las dosis enChara sp.se realizaron al colocar una ramita deCharaen un tubo Falcon de 15 ml que contiene varias diluciones de sobrenadante libre de células deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) en agua de mejillón. Hubo dos réplicas por tratamiento. Después de cinco días, los tubos se calificaron visualmente.
Las respuestas a las dosis enSpirogyra sp.se realizaron en placas de 48 pocillos. Las hebras deSpirogyrase transfirieron a 750 pl de medio EREM en placas de 48 pocillos y luego se dosificaron las placas con varios volúmenes de sobrenadante libre de células, dos réplicas por tratamiento. Después de tres días, las placas se calificaron visualmente para comprobar la salud de las hebras. Los pocillos en los que todas las células estaban muertas se calificaron con "+", los pocillos en los que algunas células estaban muertas y otras vivas se calificaron con "+/-" y los pocillos con hebras sanas se calificaron con "-".
Ensayo de algas de arroz.Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) se probó en un bioensayo destinado a simular una infestación de algas en un campo de arroz. El ensayo se realizó en vasos de plástico transparente que contenían pequeñas macetas de arroz. Los vasos se llenaron con 100 ml de un cultivo mixto deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Los vasos se trataron con 5 ml (5 % v/v) de sobrenadante libre de células deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) y se incubaron bajo luces durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A (presente en todas las especies de algas) y ficocianina (presente únicamente en cianobacterias). Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
T l : inhi i i n l r fil A fi i nin r l n l rr z.
Streptomycessp. Q004 (NRRL-67409) tuvo cierto control de clorofila A los días 7 y 4 después del tratamiento, pero esto no fue consistente entre las réplicas. Hubo un aumento en la ficocianina para ambas réplicas en los días 7 y 4, lo que sugiere queStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409) estimuló el crecimiento deAnabaena sp.
Se preparó un cultivo mixto de algas al combinar 1,6 l de medio de Hoagland 1/8 con 100 ml de cada uno de cultivos maduros deChlamydomonas reinhardtii, Anabaena sp., Navicula sp.,ySpirogyra sp.Se añadieron 100 ml del cultivo en vasos de plástico transparente que contenían macetas de 5,5 x 5,5 cm de dos semanas de antigüedad deOryza sativacultivado en un suelo agregado arcilloso. Dos vasos se trataron con 5 ml deStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409), dos vasos se trataron con 1 ppm de cobre (de Pondmaster Aquatic Algaecide) y tres vasos se dejaron sin tratar. Los vasos se incubaron bajo luces de espectro completo durante un total de 14 días. Los días 4, 7 y 14 después del tratamiento, los vasos se calificaron según las fluorescencias de clorofila A y ficocianina mediante el uso de un espectrofotómetro. Se pipetearon muestras de 3 ml del cultivo en cubetas de plástico con lados transparentes y se leyó la fluorescencia a Ex: 440 nm Em: 680 nm para clorofila A, y a Ex: 630 nm Ex: 660 nm para ficocianina. Los % de inhibiciones se calcularon al comparar los vasos tratados con un promedio de tres vasos no tratados.
Resumen de los ejemplos
Los ejemplos 1-5 se resumen en la tabla más abajo.
Tabla 36
Asiento del material biológico
El siguiente material biológico se ha asentado según los términos del Tratado de Budapest en la Colección de Cultivos de Investigación Agrícola (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos, y se le ha asignado el siguiente número:
Asiento________________________ Número de acceso Fecha de asiento
Beauveria bassianaO379 NRRL 67406 30 de marzo de 2017Paenibacillus elgiiSD17, P858 NRRL B-67407 30 de marzo de 2017Brevibacillus brevisHNYM3, O989 NRRL B-67408 30 de marzo de 2017Streptomyces sp.Q004 NRRL B-67409 30 de marzo de 2017Streptomyces spororaveusF18, P842 NRRL B-67410 30 de marzo de 2017 Las cepas se han asentado en condiciones que garantizan que el acceso al cultivo estará disponible durante la tramitación de esta solicitud de patente y

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición alguicida que comprende: un caldo de células completas, filtrado, sobrenadante o extracto recogido de la fermentación deBeauveria bassiana0379 (NRRL- 67406),Brevibacillus brevisHNYM3, 0989 (NRRL-B67408),Streptomyces spororaveusF18, P842 (N<r>R<l>-B67410),Paenibacillus elgiiSD17, P858 (NRRL-B67407), oStreptomycessp. Q004 (NRRL-67409).
2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 comprende además un portador, diluyente, adyuvante o surfactante.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas algas comprenden Chlamydomonas reinhardtii, Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaena sp., Oscillatoria tenuis, Microcystis aeruginosa, Navicula sp., Spirogyra sp., o Chara sp.
4. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha composición está en polvos espolvoreables, polvos solubles, gránulos solubles en agua, gránulos dispersables en agua, polvos humectables, gránulos, concentrados solubles, líquidos miscibles en aceite, líquidos de volumen ultrabajo, concentrados emulsionables, concentrados dispersables, emulsiones, microemulsiones, concentrados en suspensión, concentrado en suspensión a base de aceite, aerosoles, nebulización/humo, suspensiones en cápsulas o formulaciones para el tratamiento de semillas.
5. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además un alguicida químico o biológico.
6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho alguicida biológico comprende Bacillus firmus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Paecilomyces lilacinus, Pasteuria penetrans, Pseudomonas sp., Brevabacillus sp., Lecanicillium sp., Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces bikiniensis, Streptomyces costaricanus, Streptomyces avermitilis, Burkholderia sp., Trichoderma sp., Gliocladium sp., avermectina, Myrothecium sp., Paecilomyces spp., Sphingobacterium sp., Arthrobotrys sp., Chlorosplrnium, Neobulgaria, Daldinia, Aspergillus, Chaetomium, Lysobacter spp, Lachnum papyraceum, Verticillium suchlasporium, Arthrobotrys oligospora, Verticillium chlamydosporium, Hirsutella rhossiliensis, Pochonia chlamydosporia, Pleurotus ostreatus, Omphalotus olearius, Lampteromyces japonicas, Brevudimonas sp., o Muscodor sp.
7. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho alguicida químico comprende 3-(4-cloro-2,6-dimetilfenil)-4-hidroxi-8-oxa-1-azaspiro[4,5]dec-3-en-2-ona; 3-(4'-cloro-2,4- dimetil[1,1'-bifenil]-3-il)-4-hidroxi-8-oxa-1-azaspiro-[4,5]dec-3-en-2-ona; 4-[[(6-cloro- 3-piridinil)metil]metilamino]-2(5H)-furanona; 4-[[(6-cloro-3-piridinil)metil]ciclopropilamino]-2(5H)-furanona; 3-cloro-N2-[(1S)-1-metil-2-(metilsulfonil)etil]-N 1-[2-metil-4-[1,2,2,2-tetrafluoro-1-(trifluorometil)etil]fenil]-1,2-bencenodicarboxamida; 2-ciano-N-etil-4-fluoro-3-metoxibencenosulfonamida; 2-ciano- N-etil-3-metoxi-bencenosulfonamida; 2-ciano-3-difluorometoxi-N-etil-4-fluorobencenosulfonamida; 2-ciano-3-fluorometoxi-N-etil-bencenosulfonamida; 2-ciano-6-fluoro-3-metoxi-N,N-dimetilbencenosulfonamida; 2-ciano-N-etil-6-fluoro-3-metoxi-N-metil-bencenosulfonamida; 2-ciano-3-difluorometoxi-N,N-dimetilbencenosulfon-amida; 3-(difluorometil)-N-[2-(3,3-dimetilbutil)fenil]-1 -metil- 1H-pirazol-4-carboxamida; N-etil-2,2-dimetilpropionamida-2-(2,6-dicloro-D,D,D,-trifluoro-p-tolil)hidrazona; N-etil- 2,2-dicloro-1-metilciclopropano-carboxamida-2-(2,6-dicloro-D,D,D,-trifluoro-p-tolil)hidrazona nicotina; tiocarbonato de 0-{(E-)-[2-(4-cloro-fenil)-2-ciano-1-(2-trifluorometilfenil)-vinil]}S-metilo; (E)-N1-[(2-cloro-1,3-tiazol-5-ilmetil)]-N2-ciano-N1-metilacetamidina; 1-(6-cloropiridin-3-ilmetil)-7-metil-8-nitro-1,2,3,5,6,7-hexahidro-imidazo[1,2-a]piridin-5-ol; mesilato de 4-[4-clorofenil-(2-butilidina-hidrazono)metil)]fenilo; o N-etil-2,2-dicloro-1-metilciclopropanocarboxamida-2-(2,6-dicloro-trifluoro-p-tolil)hidrazona.
8. Un método para inhibir el crecimiento de un alga que comprende las etapas de:
introducir la composición de acuerdo con la reivindicación 1 en una ubicación donde se desea la inhibición, en cantidades eficaces para inhibir dichas algas.
9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha ubicación es un líquido que comprende una masa de agua o pintura.
10. El método de la reivindicación 8, en donde dicha ubicación es una superficie sólida seleccionada del grupo que consiste en plástico, hormigón, madera, fibra de vidrio, tuberías hechas de hierro y cloruro de polivinilo y superficies cubiertas con materiales de recubrimiento y/o pintura.
11. El método de la reivindicación 8, en donde dichas algas comprenden Chlamydomonas reinhardtii, Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaena sp., Oscillatoria tenuis, Microcystis aeruginosa, Navicula sp., Spirogyra sp., o Chara sp.
12. Un método para inhibir el crecimiento de un alga que comprende las etapas de:
introducir la composición de acuerdo con la reivindicación 5 en una ubicación donde se desea la inhibición, en cantidades eficaces para inhibir dichas algas.
13. El método de la reivindicación 12, en donde dicha ubicación es un líquido que comprende una masa de agua o pintura.
14. El método de la reivindicación 12, en donde dicha ubicación es una superficie sólida seleccionada del grupo que consiste en plástico, hormigón, madera, fibra de vidrio, tuberías hechas de hierro y cloruro de polivinilo y superficies cubiertas con materiales de recubrimiento y/o pintura.
15. El método de la reivindicación 12, en donde dichas algas comprenden Chlamydomonas reinhardtii, Pesudokirchneriella subacpitata, Scenedesmus quadricata, Anabaena sp., Oscillatoria tenuis, Microcystis aeruginosa, Navicula sp., Spirogyra sp., o Chara sp.
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