ES2967340T3

ES2967340T3 - Ferrofluido oleoso biocompatible y procedimiento de preparación

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Publication number: ES2967340T3
Application number: ES20862002T
Authority: ES
Inventors: Stéphane Mornet; Clément Vecco-Garda; Sylvie Crauste-Manciet; Olivier Sandre; Franck Couillaud; Pauline Jeanjean; Coralie Genevois
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux; Universite de Bordeaux; Institut Polytechnique de Bordeaux
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux; Universite de Bordeaux; Institut Polytechnique de Bordeaux
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2024-04-29
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: EP4065174A1; CN115003337B; EP4065174C0; US20230005647A1; WO2021105620A1; FR3103376B1; CN115003337A; KR20220104717A; FR3103376A1; JP2023503168A; JP7678434B2; EP4065174B1

Abstract

La invención se refiere a un ferrofluido oleoso biocompatible que comprende nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y una fase oleosa que comprende al menos un éster de ácido graso, caracterizado porque dichas nanopartículas magnéticas están funcionalizadas en superficie con moléculas de uno o más fosfolípidos, y en particular un ferrofluido oleoso biocompatible. ferrofluido que comprende nanopartículas magnéticas basadas en óxido de hierro y una fase oleosa que comprende al menos un éster de ácido graso, en donde dichas nanopartículas magnéticas basadas en óxido de hierro forman una dispersión coloidal en dicha fase oleosa a partir de una temperatura en el rango de 20 a 80°C, caracterizado porque dichas nanopartículas magnéticas están funcionalizadas en superficie con moléculas de uno o más fosfolípidos que no cubren completamente la superficie de las nanopartículas magnéticas basadas en óxido de hierro, y en particular que proporcionan un grado de cobertura de la superficie de las nanopartículas magnéticas basadas en óxido de hierro de manera que el éster o éster de ácido graso presente en la fase oleosa tenga acceso a la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro. La invención también se refiere al proceso para preparar un ferrofluido oleoso biocompatible de este tipo, y su uso como agente de contraste para imágenes por resonancia magnética o en el contexto de un tratamiento de hipertermia para un cáncer. Por último, la invención se refiere a una nanoemulsión que comprende un ferrofluido oleoso biocompatible de este tipo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ferrofluido oleoso biocompatible y procedimiento de preparación

La invención se refiere a un ferrofluido oleoso biocompatible que comprende nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro dispersas en una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, estando las nanopartículas magnéticas funcionalizadas en la superficie por uno o varios fosfolípidos. La invención también se refiere al procedimiento de preparación de dicho ferrofluido oleoso biocompatible, y a su utilización como agente de contraste o como parte de un tratamiento contra el cáncer mediante hipertermia desencadenada por inducción magnética. Finalmente, la invención se refiere a una nanoemulsión que comprende dicho ferrofluido oleoso biocompatible.

Un ferrofluido está constituido por una dispersión cinéticamente estable de nanopartículas superparamagnéticas en un líquido portador, que puede ser un disolvente acuoso u orgánico, o un aceite. Un ferrofluido se vuelve magnético cuando se aplica un campo magnético externo estático. Un ferrofluido es susceptible de moverse o deformarse bajo la acción del campo magnético. Para su utilización en una hipertermia desencadenada por inducción magnética, las partículas magnéticas se utilizan como medio de calentamiento bajo la acción de un campo magnético alterno externo.

Dependiendo de la utilización de estos ferrofluidos, las nanopartículas magnéticas se dispersan en un medio acuoso, en un medio oleoso o en una emulsión.

Actualmente, los ferrofluidos acuosos son conocidos particularmente por su utilización como agentes de contraste en RMN y en la terapia de tumores sólidos mediante hipertermia magnetoinducida. Por ejemplo, como parte de la terapia Nano Therm® desarrollada por la empresa MagForce AG®, se inyectan nanopartículas de óxido de hierro en suspensión acuosa en el tumor y se aglomeran en el tejido objetivo. Las nanopartículas generan desprendimiento de calor cuando se aplica un campo magnético externo, lo que provoca la destrucción de las células tumorales. Este tratamiento puede aplicarse como complemento de una quimioterapia o una radioterapia.

Un ferrofluido eficaz debe permitir la destrucción de un gran volumen de tumor en un corto tiempo de tratamiento por magnetoinducción y con una baja concentración de nanopartículas. Sin embargo, el rendimiento calorífico del medio acuoso dispersante es inferior al de un medio oleoso (esté incluido o no en una emulsión). En efecto, generalmente, la capacidad calorífica del aceite es mucho menor que la del agua, y su conductividad térmica también es mucho menor. También, para mejorar la eficacia de la composición de ferrofluido en el tratamiento de hipertermia magnética, sería preferible utilizar una composición oleosa de ferrofluido, o al menos una dispersión de nanopartículas magnéticas en el seno de una fase oleosa de una emulsión.

Por otro lado, la inyección por vía sistémica de ferrofluido acuoso en un paciente plantea el problema de la cantidad de partículas magnéticas presentes en el objetivo, que debe ser suficiente para compensar la pérdida de calor en el medio vivo, que es un medio acuoso termorregulado a 37 °C. La mejora de la eficacia de dicho tratamiento en una administración sistémica requeriría la inyección de una gran cantidad de nanopartículas inyectadas, muy por encima de las dosis recomendadas (del orden de 0,8 mg de Fe/kg para los agentes de contraste de óxido de hierro), combinada con una acumulación suficiente en la zona patológica gracias a una farmacocinética favorable y un direccionamiento eficaz.

Las nanoemulsiones de ferrofluido o las suspensiones oleosas de ferrofluido son conocidas principalmente por su utilización como agentes de contraste en RMN y para el tratamiento del cáncer mediante hipertermia magnética. Un ejemplo de ferrofluido en emulsión utilizado como agente de contraste se recoge en la solicitud FR 3001 154, que describe una nanoemulsión de aceite en agua que comprende una fase acuosa, una fase lipídica que comprende un aceite, glicéridos de ácidos grasos saturados C6-C18 y partículas magnéticas a base de un compuesto de hierro recubierto con uno o varios ácidos grasos C8-C22, y tensioactivos que comprenden al menos un lípido anfifílico y al menos un ligando de direccionamiento. Dicha nanoemulsión contiene aditivos, tales como tensioactivos, necesarios para estabilizar la nanoemulsión, que pueden alterar la biocompatibilidad de la composición de ferrofluido. Ahora bien, una biocompatibilidad excelente es esencial para su utilización medicinal. En este contexto, la Solicitante ha tratado de mejorar la biocompatibilidad de las composiciones de ferrofluido utilizadas con fines medicinales y su eficacia (particularmente, la transferencia de calor mediante la reducción de la velocidad de disipación del calor en el medio vivo cuando se utiliza en una hipertermia desencadenada por inducción magnética) para la utilización prevista, a la vez que tiene estabilidad química y coloidal a una temperatura que permite convertir la energía magnética de las nanopartículas en energía térmica, y preferentemente compatible con un modo de administración mediante inyección. Las composiciones de ferrofluido de la invención pueden contemplarse para diferentes aplicaciones medicinales, y particularmente para el tratamiento del cáncer mediante hipertermia magnética o como agente de contraste.

Para mejorar la eficacia de los ferrofluidos, la Solicitante estaba más particularmente interesada en los ferrofluidos oleosos, particularmente para su aplicación en hipertermia magnética o como agente de contraste, así como en las emulsiones de ferrofluido.

Al ser las nanopartículas de óxido de hierro biocompatibles, la Solicitante ha tratado de mejorar la biocompatibilidad del medio en el que se dispersan estas nanopartículas. En particular, la Solicitante ha tratado de utilizar únicamente aditivos y un líquido portador biocompatibles, y de desterrar todos aquellos que no son biocompatibles y que, por tanto, podrían ser tóxicos para el paciente.

En este contexto, la invención propone novedosos ferrofluidos oleosos biocompatibles que comprenden nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, en los que dichas nanopartículas magnéticas están funcionalizadas en la superficie por moléculas de uno o varios fosfolípidos. De manera ventajosa, en los ferrofluidos oleosos según la invención, las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro están dispersas, preferentemente en forma de una dispersión coloidal, en la fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso.

En efecto, la formación de agregados magnéticos puede reducir la eficacia de calentamiento de las nanopartículas por inducción (es decir, por la acción de un campo magnético alterno). También, debe prestarse especial atención a la dispersión de estas nanopartículas, para evitar en la medida de lo posible la formación de agregados, y particularmente de agregados de gran tamaño.

También, la estabilidad coloidal es una condición necesaria para mejorar el rendimiento de las composiciones de ferrofluido, ya sea para su utilización en hipertermia magnética, como agente de contraste o en cualquier otra aplicación terapéutica. En general, las nanopartículas de óxido de hierro se estabilizan cinéticamente desde el punto de vista coloidal en las composiciones oleosas y en las emulsiones mediante tensioactivos o agentes de dispersión, lo que evita la formación de agregados de nanopartículas magnéticas que podrían perjudicar su eficacia de calentamiento, particularmente debido a las interacciones magnéticas dipolares. En las condiciones de temperatura de utilización, las nanopartículas magnéticas no deben flocular bajo la acción de un campo magnético alterno o estático aplicado, y deben permanecer monofásicas. Ahora bien, los tensioactivos o los agentes de dispersión son, muy a menudo, poco o nada biocompatibles.

Por tanto, la Solicitante trató de determinar las condiciones de dispersibilidad de las nanopartículas a diferentes temperaturas para su aplicación en hipertermia sin utilizar tensioactivos ni agentes de dispersión (ni ningún otro aditivo no biocompatible). A continuación, la Solicitante trabajó en la química de superficie de las nanopartículas de óxido metálico empleadas. En efecto, la Solicitante ha observado que una funcionalización química de la superficie elegida con buen criterio, combinada con la presencia de ciertos componentes en la fase oleosa, permite mejorar significativamente la estabilización coloidal de las composiciones oleosas de ferrofluido en unas condiciones de temperatura compatibles con una inyección.

Así, la invención se refiere, de manera preferida, a un ferrofluido oleoso biocompatible que comprende nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, formando dichas nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro una dispersión coloidal en dicha fase oleosa a partir de una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 80 °C, caracterizado por que dichas nanopartículas magnéticas están funcionalizadas en la superficie por moléculas de uno o varios fosfolípidos que no recubren completamente la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y, particularmente, que aseguran una tasa de recubrimiento de la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro tal que el éster o los ésteres de ácido graso presentes en la fase oleosa tienen acceso a la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro.

El ferrofluido oleoso biocompatible según la invención presenta ventajosamente una u otra de las siguientes características, solas o en combinación, incluso todas las siguientes características:

- el ferrofluido oleoso está exento de agua y/o de tensioactivos;

- las moléculas de fosfolípido(s) aseguran un recubrimiento del 19 al 76 %, preferentemente del 29 al 76 % y más preferentemente del 34 al 50 %, de la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro; - la densidad superficial de funcionalización (también conocida como densidad superficial de injerto) en las moléculas de fosfolípido(s) está comprendida en el intervalo de 0,32 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, preferentemente de 0,48 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2; y más preferentemente de 0,56 moléculas/nm2 a 0,79 moléculas/nm2;

- el o los fosfolípidos contienen al menos una cadena grasa, preferentemente 2 cadenas grasas, en particular cadenas de hidrocarburos, saturados o mono- o poliinsaturados, ramificados o preferentemente lineales, C6-C30, y preferentemente C8-C24, incluso C10-C22, y en particular, C18;

- la fase oleosa comprende al menos un 70 % en masa de éster(es) de ácido graso, preferentemente, la fase oleosa comprende del 80 % al 95 % en masa de éster(es) de ácido graso, con respecto a la masa total de la fase oleosa;

- el éster o los ésteres de ácido graso de la fase oleosa se eligen entre triglicéridos de ácido graso saturados C6-C12, preferentemente C6-C10, propilenglicoles de ácido graso saturados C6-C12, preferentemente C6-C10, utilizados solos o en mezclas;

- el contenido de nanopartículas magnéticas está comprendido en el intervalo del 0,01 % al 50 % en masa, preferentemente del 0,1 % al 10% en masa, con respecto a la masa total de ferrofluido oleoso; en cuanto al contenido de nanopartículas magnéticas, comprende únicamente nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y no incluye la funcionalización;

- las nanopartículas magnéticas tienen forma de esferoide, de poliedros tales como nanocubos, bipirámides o nanoestrellas, de tableta, de nanobastoncillo, de nanodisco o de nanoflor;

- el o los fosfolípidos presentan una cabeza polar -O(O)P(OH)O' y, se eligen preferentemente entre sales del ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatídico y del ácido 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatídico;

- el ferrofluido oleoso biocompatible comprende además un principio activo lipófilo, en particular, elegido entre antineoplásicos, tales como paclitaxel, docetaxel o carmustina.

Las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro funcionalizadas, como se definen en el marco de la invención, independientemente de la variante de realización, también son parte integrante de la invención.

La invención también se refiere a un procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención.

El procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención permite dispersar nanopartículas magnéticas sin utilizar aditivos que puedan perjudicar la biocompatibilidad del ferrofluido oleoso. Así, ventajosamente, el procedimiento excluye la utilización de cualquier compuesto que puedan inducir toxicidad para el paciente distinta de la actividad medicinal asociada a la presencia de un agente antineoplásico o de un tratamiento por inducción destinado a destruir las células cancerosas. Preferentemente, los fluidos y disolventes utilizados son biocompatibles y no se utiliza ningún aditivo no biocompatible. Ventajosamente, en el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso según la invención no se utiliza ningún tensioactivo ni agente de dispersión.

Para obtener un ferrofluido oleoso que no contenga tensioactivos ni agentes de dispersión y que comprenda nanopartículas magnéticas en forma de una suspensión coloidal a una temperatura compatible con una inyección, los inventores han desarrollado un procedimiento particular que comprende la formación de una capa de solvatación de las nanopartículas magnéticas.

La Solicitante ha desarrollado un procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible que permite optimizar y controlar el grado de funcionalización de las nanopartículas magnéticas por parte de moléculas de fosfolípido(s). En efecto, durante su investigación, la Solicitante observó que la elección de la molécula o moléculas de fosfolípido(s) y el grado de funcionalización influían en la estabilidad y la eficacia del ferrofluido oleoso biocompatible.

Así, el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención comprende las siguientes etapas sucesivas:

a- disponer de una dispersión acuosa de nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro, en un disolvente acuoso, que puede ser agua o una mezcla de agua y disolvente(s) miscible(s) con agua,

b - eliminar el disolvente acuoso de la dispersión acuosa de nanopartículas magnéticas,

c - obtener un sol coloidal de nanopartículas magnéticas mediante la adición de un disolvente o una mezcla de disolventes orgánicos volátilesS2,

d - funcionalizar la superficie de dichas nanopartículas magnéticas del sol coloidal con moléculas de al menos un fosfolípido,

e - eliminar dicho o dichos disolventes orgánicos volátilesS2y dispersar las nanopartículas magnéticas funcionalizadas en una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso.

El procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención contiene ventajosamente además una etapa c2, posterior a la etapa c y anterior a la etapa d, de adición de ácido. Esta etapa permite aumentar la afinidad de la cabeza polar de las moléculas de fosfolípido(s) con la superficie de las nanopartículas magnéticas para una funcionalización más eficaz.

La invención también se refiere a un medicamento, y en particular a un medicamento para el tratamiento del cáncer, que comprende un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido mediante el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención.

La invención también se refiere a un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido según el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, para su utilización durante un tratamiento del cáncer mediante hipertermia desencadenada por inducción magnética. La invención también se refiere a un método de tratamiento terapéutico del cáncer mediante hipertermia magnética que comprende la inyección intratumoral de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, o de un ferrofluido oleoso biocompatible obtenido según el procedimiento de preparación según la invención, seguido de la aplicación de un campo magnético alterno externo.

La invención también se refiere a una nanoemulsión de aceite en agua que comprende del 10%al 30%en masa de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, o de un ferrofluido oleoso biocompatible obtenido según el procedimiento de preparación según la invención, a una fase acuosa, y al menos, a un tensioactivo. Dicha nanoemulsión puede comprender además agentes de dispersión y/o ligandos de direccionamiento. Preferentemente, la nanoemulsión es biocompatible.

La invención también se refiere a la preparación de una nanoemulsión según la invención. Este procedimiento comprende las siguientes etapas sucesivas:

i - disponer de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido según el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención,

ii - disponer de una fase acuosa que comprenda al menos un tensioactivo, y

iii - mezclar la fase acuosa y el ferrofluido oleoso biocompatible para formar una nanoemulsión.

La nanoemulsión según la invención, o la nanoemulsión obtenida según el procedimiento según la invención, puede utilizarse en una administración sistémica para el tratamiento del cáncer. Así, la invención también se refiere a un medicamento, en particular para el tratamiento del cáncer, que comprende una nanoemulsión según la invención, u obtenida según el procedimiento de preparación de una nanoemulsión según la invención. La invención también se refiere a una nanoemulsión según la invención, u obtenida según el procedimiento de preparación de una nanoemulsión según la invención, para su utilización durante el tratamiento del cáncer mediante hipertermia magnética. La invención también se refiere a un método de tratamiento terapéutico del cáncer mediante hipertermia magnética que comprende la inyección sistémica de una nanoemulsión según la invención, o de una nanoemulsión obtenida según el procedimiento de preparación según la invención, seguido de la aplicación de un campo magnético.

Finalmente, la invención se refiere a un producto de contraste, en particular para RMN (imágenes por resonancia magnética) que comprende un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, o una nanoemulsión que comprende el ferrofluido oleoso según la invención.

Otras diversas características surgen de la descripción realizada a continuación con referencia a los dibujos adjuntos que muestran, como ejemplos no limitativos, formas de realización del objeto de la invención.

[Fig. 1] La figura 1 es una representación esquemática 1) de un ferrofluido según la invención y 2) de una nanoemulsión según la invención.

[Fig. 2] La figura 2 representa los análisis de espectroscopia infrarroja de reflexión difusa (DRIFT) de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas y de nanopartículas magnéticas funcionalizadas con DOPA.

[Fig. 3] La figura 3 representa los rendimientos de quimisorción de DOPA determinados mediante mediciones por ATG para diferentes cantidades aplicadas a las nanopartículas esferoidales FF1 en presencia de ácido.

[Fig. 4] La figura 4 representa los termogramas de nanopartículas funcionalizadas con un 2000 % de la cantidad necesaria para formar una monocapa de DOPS a los 7 min y 30 min de reacción.

[Figs. 5A-C] Las figuras 5A, 5B y 5C representan los perfiles cinéticos de temperatura de las dispersiones de nanopartículas esferoidales FF1 y de morfología de nanoflores FF2 y FF3, respectivamente, sometidas a una inducción magnética (de par de campo/frecuencia de: (Fig. 5A) 755 kHz, 10,2 kA/m, (Fig. 5B) 473,5 kHz, 13,36 kA/m y (Fig. 5C) 473,5 kHz, 13,36 kA/m) dispersas en agua o en Miglyol M840® tras la funcionalización con DOPA, con unas densidades de recubrimiento teóricas de las moléculas de fosfolípido(s) de 0,81, 1,29 y 1,10 moléculas/nm2, respectivamente (temperatura de regulación Tü = 37°C y CFe2O3 = 5 g/l, donde CFe2O3 es la concentración en masa de Fe2O3). En el inserto de la figura 5A, hay una ampliación del perfil de temperatura en el intervalo [0; 10 s].

[Figs. 6A-C] Las figuras 6A, 6B y 6C representan los perfiles cinéticos de temperatura de las dispersiones de nanopartículas de morfología de nanoflores FF2 y FF3 dispersadas en agua o en Miglyol M840® tras la funcionalización por DOPA con una densidad de recubrimiento superficial nominal de moléculas de fosfolípido(s) de 1,29 y 1,10 moléculas/nm2, respectivamente, sometidas, cada una de las dispersiones, a dos ciclos de inducción magnética (de par de campo/frecuencia de: (Fig. 6A) dispersión de nanopartículas FF2 a 473,5 kHz, 13,36 kA/m, (Fig. 6B) dispersión de nanopartículas FF2 a 344,5 kHz, 16,23 kA/m y (Fig. 6C) dispersión de nanopartículas FF3 a 473,5 kHz, 13,36 kA/m, temperatura de regulación T0 = 37 °C y CFe2O3 = 5 g/l).

[Fig. 7A-B] Las figuras 7A y 7B muestran los perfiles cinéticos de temperatura y los valores de potencia térmica disipada por las nanopartículas (representada por el valor de la SAR, tasa de absorción específica, o en inglés, "spécifie absorption rate") de las dispersiones de nanopartículas de morfología de nanoflores FF3 en función del volumen del medio de dispersión: (Fig. 7A) en agua o (Fig. 7B) en Miglyol M840®tras la funcionalización con DOPA para una densidad de recubrimiento superficial nominal de moléculas de fosfolípido(s) de 1,10 moléculas/nm2, sometidas, cada una de las dispersiones, a una inducción magnética con un par de campo/frecuencia de 473,5 kHz, 13,36 kA/m, una temperatura de regulación T0 = 37 °C y una concentración en masa de óxido de hierro CFe2O3 = 5 g/l.

[Fig. 7C] La figura 7C representa los perfiles cinéticos de temperatura correspondientes a 1 |jl de dispersión de nanopartículas FF3 a 5 g/l en agua y en Miglyol M840®, depositada directamente en el extremo de la sonda de temperatura por inducción magnética (denominada AMF: 473,5 kHz; 13,36 kA/m, To = 25 °C, temperatura ambiente de la sala).

[Fig. 8] La figura 8 representa el perfil cinético de temperatura de las nanopartículas FF3 dispersas en Miglyol M840®, tras la funcionalización con DOPA para una densidad de recubrimiento superficial nominal de moléculas de fosfolípido(s) de 1,10 moléculas/nm2, una concentración en masa de óxido de hierro Fe2O3 de 300 g/l y para un volumen de 1 j l depositado en el extremo de la sonda de temperatura (T0 = 25 °C, temperatura ambiente de la sala).

[Fig. 9] La figura 9 representa los perfiles cinéticos de temperatura de las nanoemulsiones (1) y (4) (CFe2O3 = 12 g/l) que contienen las nanopartículas esferoidales FF1 dispersas en Miglyol M840 emulsionado en la fase acuosa, por inducción a 473,5 KHz, 13,36 kA/m (temperatura de regulación T0 = 37 °C) durante 20 segundos.

[Fig. 10A-B] La figura 10A muestra las imágenes de bioluminiscencia obtenidas tras la inyección intratumoral del ferrofluido oleoso descrito en el ejemplo 6, en un tumor subcutáneo de ratón (dos inyecciones de 1 j l de ferrofluido oleoso a 300 g/l en el mismo sitio de inyección) antes (T0) y 24 horas después (T24) del tratamiento por inducción (473,5 KHz, 13,36 kA/m). La figura 10B muestra las imágenes de fluorescencia (FRI,fluorescence réflectance imaging)y de bioluminiscencia (BLI) del tumorex vivomás de 24 horas después del tratamiento por inducción. [Fig. 11A-B] La figura 11A muestra las imágenes de bioluminiscencia obtenidas tras la inyección intratumoral del ferrofluido oleoso descrito en el ejemplo 6, en un tumor subcutáneo de ratón (tres inyecciones de 1 j l de ferrofluido oleoso a 300 g/l en diferentes localizaciones del tumor) antes (T0) y 24 horas después (T24) del tratamiento por inducción (473,5 KHz, 13,36 kA/m). La figura 11B muestra las imágenes de fluorescencia (FRI) y bioluminiscencia (BLI) del tumorex vivomás de 24 horas después del tratamiento por inducción.

Ferrofluido oleoso biocompatible

La invención se refiere a un ferrofluido oleoso biocompatible que comprende nanopartículas magnéticas funcionalizadas en suspensión en una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, como se esquematiza en la figura 1.

Las nanopartículas magnéticas funcionalizadas utilizadas en el marco de la invención son nanopartículas a base de óxido de hierro que están funcionalizadas en la superficie por moléculas de al menos un fosfolípido. El óxido de hierro tiene la ventaja de ser biocompatible. Ventajosamente, las nanopartículas utilizadas en el marco de la invención no contienen ningún elemento metálico que pueda ser tóxico, tal como cobalto o manganeso.

En el marco de la invención, el término "nanopartículas" se refiere a partículas de tamaño elemental nanométrico, es decir, con un tamaño elemental medio superior a 1 nm e inferior a 100 nm que presentan, preferentemente, una distribución monomodal de tamaños con una desviación estándar inferior al 30 % en número con respecto al valor medio. Por tamaño elemental se entiende la mayor dimensión de la nanopartícula. En el marco de la invención, el tamaño elemental de una nanopartícula magnética funcionalizada corresponde a la dimensión de la nanopartícula a base de óxido de hierro como tal, y no incluye la funcionalización con la molécula o moléculas de fosfolípido(s). Preferentemente dentro del marco de la invención, las nanopartículas magnéticas tienen un tamaño elemental medio inferior a 30 nm, preferentemente inferior a 25 nm. Preferentemente, las nanopartículas magnéticas utilizadas en el marco de la invención tienen un tamaño elemental medio superior a 3 nm, preferentemente superior a 5 nm. Preferentemente, las nanopartículas magnéticas funcionalizadas tienen un tamaño elemental medio comprendido en el intervalo de 5 a 34 nm, preferentemente de 7 a 24 nm.

Por "tamaño elemental medio" se entiende el tamaño medio de las nanopartículas inorgánicas sin el recubrimiento de fosfolípidos y no agregadas. El tamaño elemental medio es la media aritmética de los tamaños elementales medidos en un conjunto de nanopartículas, en particular sobre un conjunto de 200 nanopartículas. El tamaño elemental de las nanopartículas puede medirse mediante microscopia electrónica de transmisión (MET), tras la eliminación de la fase oleosa.

En los ferrofluidos oleosos según la invención, las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro funcionalizadas de acuerdo con la invención forman una dispersión coloidal en la fase oleosa utilizada, a partir de una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 80 °C, preferentemente a partir de una temperatura igual a 60 o 70 °C, preferentemente, a partir de una temperatura igual a 37 °C, e incluso más preferentemente a partir de una temperatura igual a 20 o 25 °C. Clásicamente, se entiende por dispersión coloidal partículas sólidas dispersas en una fase líquida estable, durante al menos 24 horas, es decir, que no sedimentan ni se agregan. La estabilidad coloidal de las dispersiones de ferrofluidos magnéticos en función de la temperatura del medio puede caracterizarse cualitativamente por su limpidez y su translucidez, por oposición a una suspensión de agregados o de floculados que presenta un carácter turbio, nebuloso u opaco. Se puede realizar una evaluación cuantitativa midiendo la transmitancia a 800 nm. A modo de ejemplo, las dispersiones de nanopartículas con una concentración en masa de 0,2 g/l de Fe2O3 -<y>con un tamaño comprendido entre 5 y 15nm se califican como inestables cuando dichas dispersiones han perdido al menos un 30 % de su transmitancia a 800 nm con respecto a la de una dispersión estable de la misma concentración. Estas mediciones de la transmitancia pueden realizarse con un espectrofotómetro VARIAN Cary 500 equipado con un controlador de temperatura.

La estabilidad coloidal en función de la tasa de recubrimiento superficial de moléculas de fosfolípidos también puede cualificarse mediante mediciones de la difusión dinámica de la luz (DLS), que permiten obtener el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas teniendo en cuenta la esfera de solvatación de las nanopartículas. Así, para las nanopartículas de 10 nm, en condiciones óptimas pueden medirse unos diámetros hidrodinámicos de 40 nm a 50 nm, de aproximadamente 100 nm para condiciones en el límite del intervalo de estabilidad, y muy superiores a 100 nm cuando las dispersiones no son estables.

Se emplean otras técnicas para obtener información sobre las nanopartículas, tales como la difracción de rayos X (DRX), que permite obtener el tamaño del dominio de coherencia cristalino según los protocolos descritos en los ejemplos.

Las nanopartículas utilizadas en el marco de la invención pueden adoptar diversas formas, tales como en forma de esferoide, de poliedro, tal como nanocubos, bipirámides o nanoestrellas, de tableta, de nanobastoncillo, de nanodisco o de nanoflor. Las nanopartículas denominadas nanoflores poseen una morfología típica en forma de flor, resultado del ensamblaje de nanocristalitos epitaxiales que forman múltiples florecillas.

En el marco de la invención, "esferoide" significa esférico o casi esférico, es decir, que presente un índice de esfericidad (es decir, la relación entre su diámetro mayor y su diámetro menor) inferior a 1,2.

Según un primer modo de realización preferido de la invención, las nanopartículas magnéticas funcionalizadas tienen forma esferoidal, y en particular esférica o cuasi esférica. Según este modo de realización, las nanopartículas magnéticas tienen por tanto un tamaño elemental medio comprendido en el intervalo de 5 a 20 nm, preferentemente de 7 a 15 nm.

Según un segundo modo de realización preferido de la invención, las nanopartículas magnéticas funcionalizadas utilizadas en el marco de la invención están en forma de nanoflor, preferentemente monocristalina o cuasimonocristalina. Según este modo de realización, las nanopartículas magnéticas tienen por tanto un tamaño elemental medio comprendido en el intervalo de 10 a 34 nm, preferentemente de 10 a 24 nm.

En el marco de la invención, las nanopartículas empleadas son nanopartículas a base de óxido de hierro funcionalizadas en la superficie por moléculas de al menos un fosfolípido. Según un modo de realización particular, las nanopartículas magnéticas son nanopartículas compuestas únicamente por óxido de hierro, cuya superficie está funcionalizada por moléculas de fosfolípido(s).

En el marco de la invención, se entiende por nanopartículas "a base de óxido de hierro" nanopartículas constituidas esencialmente por óxido de hierro, incluso constituidas exclusivamente de óxido de hierro.

Las nanopartículas de óxido de hierro pueden ser nanopartículas ferrimagnéticas, y normalmente partículas de magnetita (Fe3O4) o de maghemita (Y-Fe2O3) o de cualquier otro sesquióxido cúbico de fórmula [Fe3+]Td[Fe3+1+2z/3Fe2+1_zVz/3]ohO4 (Td y Oh representan, respectivamente, los sitios tetraédricos y octaédricos de la espinela, y V las vacantes catiónicas) en el que z varía de 0 a 1. Preferentemente, las nanopartículas de óxido de hierro son nanopartículas de maghemita, es decir, un sesquióxido cúbico de fórmula [Fe3+]Td[Fe3+1+2z/3Fe2+1-zVz/3]ohO4 con z = 1.

En el marco de la invención, las nanopartículas magnéticas del ferrofluido oleoso biocompatible están funcionalizadas en la superficie por uno o varios fosfolípidos, es decir, las moléculas de fosfolípido(s) idénticas o diferentes están unidas por un enlace químico a la superficie de cada nanopartícula magnética. Estos enlaces químicos son preferentemente enlaces de coordinación o de complejación establecidos con la cabeza polar de las moléculas fosfolipídicas y un sitio de hierro de la superficie. En particular, la cabeza fosfolipídica, particularmente del tipo -O(O)P(OH)O-, está unida por uno o varios enlaces de coordinación a las nanopartículas a base de óxido de hierro.

Por "fosfolípido" se entiende, clásicamente, una molécula compuesta por una cabeza polar de tipo fosfato y una o varias cadenas grasas. Preferentemente, las moléculas de fosfolípido se unen a la superficie de la nanopartícula a través de su cabeza polar.

Preferentemente, las nanopartículas magnéticas del ferrofluido oleoso biocompatible están funcionalizadas en la superficie por un único tipo de fosfolípido. Aunque no es preferido, puede contemplarse la funcionalización de las nanopartículas magnéticas con dos o más fosfolípidos diferentes.

En el marco de la invención, las moléculas de fosfolípido(s) contienen al menos una cadena grasa, preferentemente al menos dos cadenas grasas, y en particular, dos cadenas grasas. Estas cadenas grasas son normalmente cadenas de hidrocarburos, saturados o insaturados, lineales o ramificados, y que comprenden de 6 a 30 átomos de carbono. Estas cadenas grasas pueden ser diferentes o, preferentemente, idénticas para cada fosfolípido utilizado. Preferentemente, la o las cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) son lineales. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la Solicitante opina que estas cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) se intercalan con las cadenas grasas de los ésteres de ácido graso en la fase oleosa, permitiendo así la creación de una esfera de solvatación. La ausencia de ramificaciones en las cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) facilita esta intercalación.

Las cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) pueden ser saturadas o mono- o poliinsaturadas. Ventajosamente, las cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) son monoinsaturadas.

Las cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) contienen ventajosamente de 6 a 30 átomos de carbono, preferentemente de 8 a 24 átomos de carbono, preferentemente de 10 a 22 átomos de carbono, y en particular, 18 átomos de carbono.

En el marco de la invención, la funcionalización de las nanopartículas magnéticas tiene lugar, preferentemente, a través de la cabeza polar de las moléculas de fosfolípido(s): un enlace químico entre los sitios de óxido de hierro presentes en la superficie de las nanopartículas magnéticas y la cabeza polar de las moléculas de fosfolípido(s) proporciona un fuerte anclaje y una funcionalización sólida. Así, esta funcionalización de la superficie permite conferir una buena estabilidad química y no se deteriora en las condiciones fisiológicas y de almacenamiento.

La cabeza polar de las moléculas de fosfolípido(s) utilizadas para funcionalizar la superficie de las nanopartículas magnéticas del ferrofluido oleoso según la invención son fragmentos de fosfatos, y tienen preferentemente un bajo impedimento estérico. Las investigaciones de la Solicitante han demostrado que un bajo impedimento estérico permite controlar mejor la cinética y el grado de funcionalización. Como ejemplos de cabeza polar de las moléculas de fosfolípido(s) que pueden unirse a la superficie de las nanopartículas magnéticas según la invención, se pueden mencionar los fragmentos de fosfatos resultantes del ácido fosfórico, fosfatidiletanolamina, fosfatidiletanol, fosfotioetanol o sus sales. De una manera particularmente preferida, la cabeza polar es el grupo -O(O)P(OH)O-. Las moléculas de fosfolípido(s) pueden elegirse ventajosamente entre formas salinas de glicerofosfolípidos, como por ejemplo, ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatídico (DOPA), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-L-serina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina, ácido 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatídico (DSPA), fosfatidilinositol, 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfotioetanol, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[3-(2-piridilditio)propionato], o resultantes de esfingolípidos como la esfingomielina. La DOPA y la DSPA en forma aniónica son particularmente preferidas.

De manera preferida, las moléculas de fosfolípido(s) aseguran un recubrimiento del 19 al 76 %, preferentemente del 29 al 76 % y más preferentemente del 34 al 50 %, de la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro.

La densidad superficial de funcionalización de las nanopartículas magnéticas por las moléculas de fosfolípido(s) está comprendida en el intervalo de 0,32 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, preferentemente de 0,48 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, y más preferentemente de 0,56 moléculas/nm2 a 0,79 moléculas/nm2. La densidad de funcionalización puede determinarse, como en los ejemplos, mediante análisis termogravimétrico (ATG).

Según un modo de realización, las nanopartículas tienen una morfología esferoidal, y la densidad superficial de funcionalización de estas nanopartículas por las moléculas de fosfolípido(s) está comprendida en el intervalo de 0,32 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, preferentemente de 0,48 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, y más preferentemente de 0,56 moléculas/nm2 a 0,79 moléculas/nm2.

Según un modo de realización particularmente preferido, los ferrofluidos según la invención presentan las siguientes características:

- las nanopartículas magnéticas tienen una morfología esferoidal, preferentemente con un tamaño elemental medio comprendido en el intervalo de 5 a 20 nm, preferentemente de 7 a 15 nm,

- la cabeza polar de las moléculas de fosfolípido es el grupo -O(O)P(OH)O_; y, preferentemente, las nanopartículas están funcionalizadas con el anión fosfato del ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatídico o del ácido 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatídico,

- la densidad superficial de recubrimiento de las nanopartículas magnéticas por las moléculas de fosfolípido(s) está comprendida en el intervalo de 0,32 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, preferentemente de 0,48 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, y más preferentemente de 0,56 moléculas/nm2 a 0,79 moléculas/nm2, - el éster de ácido graso se elige entre los triglicéridos de los ácidos caproico, cáprico y caprílico, y los ésteres de propilenglicol del ácido caproico, cáprico y caprílico, y sus mezclas,

- la fase oleosa comprende al menos un 70 % en masa de éster(es) de ácido graso, preferentemente, la fase oleosa comprende del 80 % al 95 % en masa de éster(es) de ácido graso, con respecto a la masa total de la fase oleosa,

- el éster o los ésteres de ácido graso de la fase oleosa se eligen entre triglicéridos de ácido graso saturados C6-C12, preferentemente C6-C10, propilenglicoles de ácido graso saturados C6-C12, preferentemente C6-C10, utilizados solos o en mezclas.

Según otro modo de realización, las nanopartículas tienen una morfología de nanoflor.

Según un primer modo de realización, las nanopartículas magnéticas funcionalizadas presentes en el ferrofluido oleoso biocompatible según la invención son nanopartículas de maghemita funcionalizadas en la superficie por moléculas de un fosfolípido que tiene una cabeza polar de fosfatidilserina y al menos una, y preferentemente dos, cadenas grasas lineales, insaturadas y preferentemente monoinsaturadas, C10-C22, y particularmente C18. Preferentemente según este modo de realización, las nanopartículas de maghemita están funcionalizadas en la superficie con 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidil-L-serina. Según este modo de realización, la densidad superficial de recubrimiento eficaz con moléculas de fosfolípido(s) sobre cada nanopartícula está comprendida, por ejemplo, en el intervalo de 0,48 a 1,22 moléculas/nm2, y preferentemente de 0,56 a 0,79 moléculas/nm2.

Según un segundo modo de realización preferido, las nanopartículas magnéticas presentes en el ferrofluido oleoso biocompatible según la invención son nanopartículas de maghemita funcionalizadas en la superficie con un fosfolípido que tiene una cabeza polar -O(O)P(OH)O y al menos una, y preferentemente dos, cadenas grasas lineales, insaturadas y preferentemente monoinsaturadas, C10-C22, y particularmente C18. Preferentemente según este modo de realización, las nanopartículas de maghemita están funcionalizadas en la superficie con la forma salina del ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatídico. Según este modo de realización, la densidad superficial de recubrimiento de las moléculas de fosfolípido(s) sobre cada nanopartícula está comprendida ventajosamente en el intervalo de 0,32 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, preferentemente de 0,48 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, y más preferentemente de 0,56 moléculas/nm2 a 0,79 moléculas/nm2.

Preferentemente, el contenido de nanopartículas magnéticas (esto incluye únicamente las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y no incluye la funcionalización) en el ferrofluido oleoso está comprendido en el intervalo del 0,01 al 50 % en masa con respecto a la masa total de ferrofluido oleoso, preferentemente del 0,1 al 10 % en masa. En otras palabras, el contenido en masa de nanopartículas magnéticas por litro de ferrofluido oleoso biocompatible está comprendido ventajosamente en el intervalo de 0,01 g/l a 500 g/l, preferentemente de 1 g/l a 100 g/l.

En el marco de la invención, las nanopartículas magnéticas funcionalizadas están dispersas o suspendidas en una fase oleosa, y forman una dispersión coloidal. Esta fase oleosa está ventajosamente exenta de agua, es decir, contiene menos de un 0,1 % en masa de agua, preferentemente menos del 0,05 % en masa de agua, y mejor aún menos del 0,01 % en masa de agua con respecto a la masa total de la fase oleosa.

La fase oleosa comprende al menos un éster de ácido graso, y preferentemente al menos un 70 % en masa de éster(es) de ácido graso, preferentemente del 80 % al 95 % en masa de éster(es) de ácido graso, con respecto a la masa total de la fase oleosa.

En el marco de la invención, los ésteres de ácido graso son ésteres de un ácido carboxílico con una cadena alifática que comprende de 4 a 36 átomos de carbono.

Las cadenas grasas de los ésteres de ácido graso pueden ser mono- o poliinsaturadas, o saturadas. También puede utilizarse una mezcla de ésteres de ácidos grasos saturados e insaturados en el marco de la invención.

Las cadenas grasas de los ésteres de ácidos grasos pueden ser ramificadas o, preferentemente, lineales. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, la Solicitante opina que estas cadenas grasas de los ésteres de ácido graso se intercalan con las cadenas grasas de las moléculas de fosfolípido(s) de las nanopartículas funcionalizadas, permitiendo así la creación de una esfera de solvatación. La ausencia de ramificaciones en las cadenas grasas de los ésteres de ácidos grasos facilita esta intercalación.

Preferentemente dentro del marco de la invención, los ésteres de ácido graso se eligen entre ésteres de ácidos grasos saturados C6-C18, preferentemente C6-C12, y en particular, C6-C10. Preferentemente, los ésteres de ácido graso se eligen entre ésteres de ácido graso saturados C6-C12, y en particular, C6-C10. A modo de ejemplos, el ácido graso del éster de ácido graso puede elegirse entre ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico y ácido docosahexaenoico. Preferentemente dentro del marco de la invención, los ésteres de ácido graso se eligen entre triglicéridos de ácido graso saturados C6-C18, preferentemente C6-C12, y en particular, C6-C10, y propilenglicoles de ácido graso saturados C6-C12, y en particular, C6-C10, utilizados solos o en mezclas. Preferentemente, los ésteres de ácido graso se eligen entre triglicéridos de ácido graso saturados C6-C12, y en particular, C6-C10, y propilenglicoles de ácido graso saturados C6-C12, y en particular, C6-C10, utilizados solos o en mezclas.

Como ejemplos de ésteres de ácido graso que pueden utilizarse en el marco de la invención, se pueden mencionar los triglicéridos de ácidos grasos saturados, tales como los triglicéridos de los ácidos caproico, cáprico o caprílico, o los propilenglicoles de ácidos grasos saturados, tales como dicaprilocaprato de propilenglicol, utilizados solos o en mezclas.

Según un primer modo de realización, la fase oleosa comprende un único éster de ácido graso elegido entre triglicéridos de ácidos grasos C6-C10 y propilenglicoles de ácidos grasos C6-C10. Según este modo de realización, el éster de ácido graso se elige ventajosamente entre los triglicéridos de los ácidos caproico, cáprico y caprílico, y los ésteres de propilenglicol del ácido caproico, cáprico y caprílico.

Según un segundo modo de realización, la fase oleosa comprende una mezcla de ésteres de ácidos grasos, en particular 2 ó 3 ésteres de ácidos grasos. Según este modo de realización, los ésteres de ácido graso se eligen ventajosamente entre los del ácido caprílico, el ácido cáprico y el ácido láurico.

La fase oleosa puede contener además uno o varios aceites distintos de dicho éster de ácido graso y, opcionalmente, uno o varios aditivos lipófilos. Ventajosamente, estos aceites y aditivos lipófilos adicionales son biocompatibles y no generan toxicidad alguna para el paciente cuando se le administra el ferrofluido oleoso según la invención. Según un modo de realización particular, el ferrofluido oleoso según la invención no comprende ningún tensioactivo ni agente de dispersión.

En el marco de la invención puede utilizarse cualquier aceite biocompatible.

A modo de ejemplos, la fase oleosa del ferrofluido oleoso biocompatible puede comprender un aceite elegido entre aceite de soja, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de algodón, aceite de amapola, aceite de coco, aceite de nuez de coco, aceite de semillas de lino, aceite de girasol, aceite de triglicéridos de ácidos grasos saturados C6-C12 y aceites de pescado.

Según un modo de realización preferido de la invención, la fase oleosa comprende al menos un éster de ácido graso y al menos un aceite, y preferentemente, un único aceite distinto del éster de ácido graso. Según este modo de realización, el éster de ácido graso se elige preferentemente entre los triglicéridos de los ácidos cáprico o caprílico, dicaprilocaprato de propilenglicol, utilizados solos o en mezclas.

Preferentemente, la fase oleosa del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención comprende menos del 30 % en masa de aceite(s) distinto(s) del al menos un éster de ácido graso con respecto a la masa total de la fase oleosa, y preferentemente del 20 al 5 % en masa.

El ferrofluido oleoso biocompatible puede comprender además otros aditivos lipófilos biocompatibles. Como ejemplos de aditivos lipófilos biocompatibles, pueden mencionarse los principios activos lipófilos, tales como los principios activos lipófilos antineoplásicos como paclitaxel, docetaxel o carmustina. Otros aditivos lipófilos biocompatibles, conocidos en el estado de la técnica, pueden utilizarse en el marco de la invención y no se detallarán aquí.

Preferentemente, el porcentaje en masa de nanopartículas magnéticas en la fase oleosa está comprendido en el intervalo del 0,01 % al 50 %, preferentemente del 0,1 % al 10 % con respecto a la masa total de ferrofluido oleoso. Ventajosamente, el ferrofluido oleoso biocompatible según la invención es estable: las nanopartículas magnéticas están bien dispersadas, no floculan a partir de una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 80 °C y, en particular, a partir de 37 °C e incluso mejor a partir de 25, incluso a 20 °C. Las dispersiones coloidales se obtienen a la presión atmosférica (1013,25 hPa). Cuando se dice que dichas nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro funcionalizadas forman una dispersión coloidal en dicha fase oleosa a partir de una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 80 °C, esto no significa que se consiga la dispersión coloidal en todo este intervalo de temperaturas. Esto significa que la estabilidad se consigue al menos a una temperatura del intervalo, y en particular, a lo largo de al menos una parte del intervalo, particularmente en el intervalo de altas temperaturas, donde todas las nanopartículas descritas se dispersan y desprenden todo su calor bajo una inducción magnética. Sin embargo, es preferible que las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro funcionalizadas formen una dispersión coloidal en dicha fase oleosa a la temperatura ambiente, y particularmente cuando la temperatura está comprendida en el intervalo de 20-25 °C. Ventajosamente, la estabilidad de estas dispersiones coloidales se mantiene durante al menos 24 horas, preferentemente durante al menos 1 mes tras su obtención. El carácter coloidal de la dispersión y su estabilidad se pueden verificar, en el aire ambiental y a la presión atmosférica (1013,25 hPa) particularmente, durante un periodo de 24 horas.

En el marco de la invención, el intervalo de temperaturas en el que el ferrofluido oleoso biocompatible es estable, depende de la densidad superficial de funcionalización de las moléculas de fosfolípido(s), de su naturaleza química y del tamaño y la morfología de las nanopartículas magnéticas.

Procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención

La invención también se refiere al procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, como se ha detallado anteriormente. Este procedimiento comprende las siguientes etapas sucesivas: a- disponer de una dispersión acuosa de nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro, en un disolvente acuoso, que puede ser agua o una mezcla de agua y disolvente(s) miscible(s) con agua,

En la etapa a, las nanopartículas magnéticas no están funcionalizadas con las moléculas de fosfolípido(s), tales como las descritas anteriormente para las nanopartículas funcionalizadas del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención. Estas nanopartículas, tras una etapa de funcionalización de la superficie (etapa d), corresponden a las nanopartículas funcionalizadas del ferrofluido oleoso según la invención. Estas nanopartículas no funcionalizadas comprenden, por tanto, óxidos de hierro, preferentemente están compuestas únicamente por óxido de hierro, y en particular, se eligen entre los óxidos de hierro descritos para las nanopartículas magnéticas funcionalizadas del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención. En un medio acuoso, dichos óxidos de hierro pueden hidrolizarse en la superficie de la nanopartícula, generando sitios de hidroxilo de hierro en la superficie. Cuando se dispersan en una fase acuosa, estas nanopartículas de óxido de hierro presentan entonces en su superficie cargas electrostáticas positivas o negativas, en función de los valores de pH del medio. Por otro lado, estas nanopartículas no funcionalizadas tienen la misma forma que las nanopartículas funcionalizadas del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención.

Estas nanopartículas magnéticas no funcionalizadas están suspendidas en un medio acuoso. El medio acuoso puede estar compuesto, particularmente, de agua opcionalmente mezclada con uno o varios disolventes miscibles en agua, tales como metanol, etanol, isopropanol, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, acetonitrilo, acetona o acetato de etilo. Preferentemente, el medio acuoso está compuesto únicamente por agua y puede comprender opcionalmente contraiones espectadores resultantes de la estabilización del ferrofluido en un medio ácido (como el nitrato o el perclorato y su forma ácida a pH 2,5) o en un medio básico (como el potasio, el tetrametilamonio y su base correspondiente a pH 10).

La concentración de nanopartículas magnéticas en la dispersión acuosa no es limitante. Ventajosamente, es superior a 1 g/l, preferentemente, superior a 10 g/l, incluso superior a 100 g/l.

Preferentemente, la dispersión acuosa de nanopartículas no funcionalizadas está constituida únicamente por un disolvente acuoso y nanopartículas no funcionalizadas. Aunque no es preferido, la dispersión acuosa de nanopartículas no funcionalizadas también puede contener aditivos hidrófilos, tales como agentes estabilizantes estéricos macromoleculares como poli(vinilpirrolidona), dextrano, poli(óxido de etileno) funcionalizados, o tensioactivos como p-octilglucósido, tween® 80, dodecilsulfato de sodio.

La dispersión acuosa de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas a base de óxido de hierro puede prepararse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia.

La etapa b del procedimiento de preparación del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención consiste en eliminar el disolvente acuoso de la dispersión acuosa de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas. En otras palabras, esta etapa consiste en eliminar el agua utilizada como disolvente (o cualquier otro disolvente miscible en agua que pueda estar presente en el medio acuoso) de la dispersión acuosa de nanopartículas no funcionalizadas, así como el agua fisisorbida para obtener agregados de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas, sin disolvente.

Para ello, pueden emplearse diferentes técnicas conocidas en el estado de la técnica:

- utilización de un imán para separar las nanopartículas metálicas del medio acuoso, retirando el medio por aspiración o pipeteo, por ejemplo,

- extracción en una columna magnética,

- ultrafiltración,

- centrifugación,

- lavados sucesivos con un disolvente orgánico miscible en agua, tal como metanol, etanol, isopropanol, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, acetonitrilo, acetona o acetato de etilo,

- liofilización,

- pervaporación.

Preferentemente, la eliminación del agua y del disolvente o disolventes miscibles en agua opcionalmente presentes se realiza tras la floculación de las nanopartículas. La floculación se obtiene neutralizando el medio o añadiendo un disolvente miscible en agua, tal como acetona o etanol. A continuación, el medio acuoso que comprende el agua se separa de las nanopartículas floculadas: se emplea, por ejemplo, un imán para retener los agregados de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas, mientras que el medio es aspirado o bombeado mediante una bomba de membrana, por ejemplo.

A continuación, independientemente del método utilizado para eliminar el disolvente acuoso, los lavados sucesivos con un disolvente orgánico polar volátil miscible con agua (en lo sucesivo, denominadoS1), tal como etanol, pueden permitir eliminar toda el agua fisisorbida de las nanopartículas.

Ventajosamente, esta etapa de eliminación del agua permite recuperar las nanopartículas magnéticas no funcionalizadas con un contenido de agua inferior al 0,25 %, preferentemente inferior al 0,025 % en masa con respecto a la masa de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas según su superficie desarrollada.

La etapa c del procedimiento de preparación consiste en preparar un sol coloidal de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas.

En el marco de la invención, se entiende por "sol coloidal" una dispersión coloidal homogénea de partículas sólidas en un medio líquido continuo.

El sol coloidal de nanopartículas no funcionalizadas puede producirse dispersando las nanopartículas no funcionalizadas en un medio dispersante.

La dispersión puede lograrse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, tal una como agitación vorticial y una homogeneización en un baño de ultrasonidos.

Preferentemente, el medio dispersante también permite solubilizar el fosfolípido o fosfolípidos utilizados posteriormente para funcionalizar la superficie de las nanopartículas magnéticas. También, el medio dispersante comprende, incluso está constituido exclusivamente por, uno o varios disolventes orgánicos volátiles (denominados disolventesS2). En efecto, dichos disolventes orgánicos volátiles no sólo permiten dispersar las nanopartículas no funcionalizadas, sino también la solubilización de los fosfolípidos que se utilizarán en la etapa d de funcionalización: así, la cinética, el rendimiento de la reacción de funcionalización de la superficie y el control de la tasa de injerto de fosfolípidos mejoran considerablemente.

De manera preferida, el medio dispersante utilizado y, en particular, el disolvente o disolventes orgánicos volátilesS2, es biocompatible. Así, si aún quedan restos de este medio dispersante en el ferrofluido oleoso según la invención, no se generará toxicidad alguna para el paciente.

Preferentemente, el medio dispersante utilizado es volátil con el fin de facilitar su eliminación por evaporación a presión reducida durante la etapa e del procedimiento. Así, en caso de que el medio dispersante no sea biocompatible, no se le atribuye ninguna toxicidad.

Como ejemplos de medio dispersante de tipo disolvente orgánico volátilS2, se pueden mencionar el cloroformo solo o en mezcla con metanol (en una relación 2:1 v/v, por ejemplo), éter dietílico, heptano, diclorometano, isopropanol. Según un modo de realización particular, el medio dispersante está constituido por un único disolvente orgánico volátilS2, preferentemente polar. Según este modo de realización, el medio dispersante es ventajosamente cloroformo.

Preferentemente, la concentración de nanopartículas magnéticas en el sol coloidal está comprendida en el intervalo del 0,1 al 50% en masa con respecto a la masa total del sol coloidal, preferentemente del 1 al 10% en masa. Dichas concentraciones de nanopartículas magnéticas permiten ventajosamente un buen rendimiento de producción y un control de la tasa de injerto en términos de distribución de las moléculas de fosfolípido(s) en la superficie de las nanopartículas magnéticas tras la etapa de funcionalización.

Puede realizarse una etapa opcional c2, realizada después de la etapa c y antes de la etapa d, particularmente para favorecer la complejación de la cabeza polar fosfatídica de las moléculas de fosfolípido(s) con los sitios de hierro presentes en la superficie de las nanopartículas magnéticas, con vistas a la etapa de funcionalización de las nanopartículas (etapa d). Para hacer esto, se añade un ácido orgánico al sol coloidal de nanopartículas magnéticas no funcionalizadas. Preferentemente, se utiliza un ácido orgánico débil. Por ácido débil se entiende un ácido cuya reacción de disociación en agua no es total. Esto mejora la cinética de quimisorción de las moléculas de fosfolípido(s).

Ventajosamente, el ácido orgánico utilizado para esta etapa es biocompatible.

Preferentemente, el ácido orgánico utilizado para esta etapa opcional c2 se elige entre los ácidos orgánicos débiles miscibles en el disolvente orgánico volátilS2utilizado en la etapa c para obtener el sol coloidal, y ventajosamente a menos del 10 % en volumen.

Como ejemplos de ácidos orgánicos que pueden utilizarse para activar las nanopartículas magnéticas no funcionalizadas con moléculas de fosfolípido(s), pueden mencionarse ácido acético, ácido láctico, ácido propanoico y/o ácido butanoico.

La etapa d del procedimiento de preparación del ferrofluido oleoso biocompatible consiste en funcionalizar la superficie de las nanopartículas magnéticas del sol coloidal con al menos un fosfolípido. Para ello, el sol coloidal se pone en contacto con el o los fosfolípidos. Por ejemplo, puede añadirse una solución de fosfolípido(s) al sol coloidal con agitación mecánica y a la presión ambiental. Puede utilizarse cualquier técnica conocida para la formación de soles coloidales.

La solución de fosfolípido(s) utilizada puede comprender uno o varios fosfolípidos, según la funcionalización deseada de las nanopartículas magnéticas, y al menos un disolvente en el que el fosfolípido o los fosfolípidos sean solubles, denominado en lo sucesivo disolventeS3. De manera ventajosa, el (los) fosfolípido(s) portan una función fosfato, en forma salificada, particularmente con un catión alcalino, tal como un átomo de sodio, para favorecer la coordinación/complejación de la función fosfato de la cabeza polar de dicho fosfolípido, sobre las nanopartículas magnéticas.

Los fosfolípidos están generalmente en forma de sal por razones de estabilidad.

El disolventeS3puede ser un disolvente orgánico. Preferentemente, este disolventeS3es volátil.

Como ejemplos de disolventesS3adecuados pueden mencionarse cloroformo, solo o en una mezcla con metanol (por ejemplo, en una relación 2:1 v:v), éter dietílico, heptano, diclorometano, isopropanol.

Preferentemente, este disolvente (o mezcla de disolventes)S3es el mismo que el disolvente orgánico volátilS2utilizado como medio dispersante en el sol coloidal de nanopartículas magnéticas.

Los fosfolípidos empleados en esta solución de fosfolípidos son los detallados para las moléculas de fosfolípido(s) que funcionalizan las nanopartículas magnéticas del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención.

El contenido de fosfolípidos en la dispersión de nanopartículas magnéticas en los disolventes orgánicosS2yS3depende de la superficie total desarrollada por las nanopartículas magnéticas utilizadas, del fosfolípido utilizado y de su superficie desarrollada, de los ésteres de ácido graso utilizados. Ventajosamente, el contenido de fosfolípidos en el medio de reacción está comprendido entre el 0,005 y el 10% en masa, preferentemente del 0,05 al 2,5% en masa con respecto a la masa total de sol coloidal.

Según un primer modo de realización, las moléculas de fosfolípido(s) están presentes en exceso con respecto a la superficie desarrollada por las nanopartículas magnéticas no funcionalizadas, preferentemente correspondiente al 1000 % de la cantidad necesaria para formar una monocapa saturada de fosfolípidos. En efecto, un exceso de fosfolípidos permite desplazar el equilibrio de la reacción y aumentar la cinética de quimisorción de los fosfolípidos a la superficie de las nanopartículas magnéticas. Dicho exceso es ventajoso cuando esta reacción de funcionalización no es cinéticamente favorable, por ejemplo, cuando la cabeza polar de fosfato de las moléculas de fosfolípido(s) utilizadas está estéricamente impedida. El tiempo de reacción de las moléculas de fosfolípido(s) contenidas en el sol coloidal es entonces el parámetro a considerar según el exceso de moléculas de fosfolípido(s). La reacción se detiene añadiendo un disolvente, lo que provoca la floculación de las nanopartículas y la precipitación del exceso de moléculas de fosfolípido(s), como el etanol, por ejemplo. Así, por ejemplo, para un exceso del 2000 % de fosfolípidos con cabeza polar impedida, tal como la fosfatidilserina, el tiempo de quimisorción necesario para dispersar las nanopartículas magnéticas en los aceites descritos en el marco de la invención se elige en el intervalo de 5 a 30 minutos, preferentemente de 6 a 10 minutos, e incluso mejor de 7 a 8 minutos. Según este modo de realización, el procedimiento comprende una etapa posterior de eliminación del exceso de moléculas de fosfolípido(s), por ejemplo, mediante lavados sucesivos, preferentemente con una mezcla de disolventes orgánicos, tal como una mezcla de etanol/cloroformo (3:1), así como una última etapa para eliminar del cloroformo con etanol.

Según un segundo modo de realización, la cantidad de moléculas de fosfolípido(s) utilizada está presente en defecto con respecto a la superficie desarrollada de las nanopartículas magnéticas no funcionalizadas, preferentemente en un porcentaje que varía del 38% al 100% de la cantidad necesaria para formar una monocapa saturada de fosfolípido(s), y en particular que varía del 38% a menos del 100%. En efecto, un defecto de moléculas de fosfolípido(s) permite controlar el grado de funcionalización de las nanopartículas magnéticas por las moléculas de fosfolípido(s). Dicho defecto es ventajoso cuando la reacción de funcionalización es cinéticamente muy favorable, por ejemplo, cuando el fosfolípido utilizado tiene una cabeza polar -O(O)P(OH)O-,M+, siendo M un átomo de un metal alcalino, particularmente un átomo de sodio

Al final de la etapa de funcionalización d, el porcentaje de recubrimiento y/o la densidad superficial de funcionalización de las nanopartículas magnéticas es como la descrita para las nanopartículas magnéticas funcionalizadas del ferrofluido oleoso biocompatible según la invención. Las condiciones del procedimiento según la invención son adaptadas por el experto en la materia para obtener dichos porcentajes de recubrimiento y/o dichas densidades superficiales de funcionalización.

Una vez conseguida la funcionalización de las nanopartículas magnéticas, el medio dispersante del sol coloidal y casi todo el disolventeS3se elimina de la solución de fosfolípido(s) empleada (etapa e), por ejemplo, mediante evaporación bajo un flujo de un gas inerte (nitrógeno o argón) para evitar la oxidación de los fosfolípidos, con el fin de obtener agregados de nanopartículas magnéticas funcionalizadas con moléculas de fosfolípidos.

Finalmente, estas nanopartículas funcionalizadas se dispersan en una fase oleosa que comprende al menos un éster de ácido graso (etapa e). Los posibles restos de disolventesS2yS3, y principalmente etanol, se evaporan a presión reducida, por ejemplo, en un rotavapor a 80 °C durante 30 minutos efectivos. La fase oleosa y el éster de ácido graso son como los descritos para el ferrofluido oleoso biocompatible según la invención. Esta dispersión en forma coloidal en la fase oleosa se produce de bien espontáneamente a la temperatura ambiente, o bien con un calentamiento a una temperatura que varía de 30 a 80 °C, determinándose esta temperatura según la tasa de injerto, las moléculas de fosfolípido(s), el aceite y el éster de ácido graso empleados. Dicho calentamiento puede tener lugar durante la etapa e) o durante el calentamiento posterior para obtener la dispersión coloidal.

Utilización de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención

La invención también se refiere a la utilización de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido según el procedimiento de preparación según la invención.

El ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido según el procedimiento de la invención, puede utilizarse como medicamento, en particular para el tratamiento del cáncer, particularmente para el tratamiento de nódulos o tumores sólidos benignos o malignos, por hipertermia magnetoinducida.

Ventajosamente, este medicamento para tratar el cáncer está constituido, según un primer modo de realización, únicamente por ferrofluido oleoso biocompatible. Alternativamente, según un segundo modo de realización no preferido, el medicamento comprende el ferrofluido oleoso biocompatible, así como agentes antineoplásicos lipófilos. Con el fin de tratar a un paciente que padece cáncer, se realiza una administración intratumoral de ferrofluido oleoso biocompatible mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia, a continuación, se aplica un campo magnético alterno externo con el fin de provocar un calentamiento de las nanopartículas magnéticas comprendidas en el ferrofluido oleoso biocompatible. Este calentamiento localizado se disipa por todo el volumen de la fase oleosa del ferrofluido oleoso, permitiendo entonces la destrucción de las células tumorales.

Según un modo de realización particular, este calentamiento va acompañado de la liberación de un agente terapéutico contenido en un soporte termosensible, o puede utilizarse para activar un agente terapéutico termoactivable o para inducir la expresión génica de un gen bajo el control transcripcional de un promotor termosensible o para ejercer un efecto sinérgico con otro agente terapéutico coadministrado de forma independiente en el marco de protocolos de quimioterapia y/o de radioterapia.

Normalmente, el campo magnético alterno aplicado está en el intervalo de 5 a 25 kA/m, mientras que la frecuencia está en el intervalo de 100 a 750 kHz. La duración del par de campo/frecuencia aplicado depende de la dosis térmica por unidad de volumen disipada para un ferrofluido oleoso con una concentración en masa dada de óxido de hierro en función del volumen tumoral que se va a tratar. Estos protocolos de tratamiento por hipertermia están calibrados para diferentes pares de campo-frecuencia según el tipo de tratamiento buscado, que requiere dosis térmicas diferentes, como la termoablación, la liberación de un agente terapéutico, la activación de un agente terapéutico termoactivable o la inducción de la expresión génica de un gen bajo control transcripcional de un promotor termosensible.

Según un primer modo de realización, el ferrofluido oleoso biocompatible se utiliza como único medicamento en este tratamiento.

Según un segundo modo de realización, particularmente cuando el ferrofluido oleoso no comprende un medicamento quimioterapéutico, el ferrofluido oleoso biocompatible se utiliza en combinación con otro medicamento quimioterapéutico, tales como paclitaxel, docetaxel o carmustina, contenido preferentemente en el aceite magnético. También puede contemplarse la coinyección de formulaciones inyectables que contengan principios activos termosensibles, como Thermodox®.

El ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido según el procedimiento según la invención, también puede utilizarse como producto de contraste para la obtención de imágenes médicas, tal como la RMN, imágenes de fluorescencia óptica en el infrarrojo cercano (PIR) y enfoques endoscópicos locales por fibra.

En el caso de una utilización en la obtención de imágenes de fluorescencia, el ferrofluido oleoso administrado al paciente comprende preferentemente fluoróforos lipófilos.

La invención también se refiere a un método de obtención de imágenes del cuerpo entero o de una parte del cuerpo de un individuo que comprende una etapa de obtención de una o varias imágenes de dicho cuerpo entero o parte del cuerpo entero mediante una técnica de obtención de imágenes médicas, conteniendo dicho cuerpo entero o dicha parte del cuerpo el producto de contraste que comprende el ferrofluido oleoso biocompatible.

Ventajosamente, los ferrofluidos oleosos según la invención están dispersos en forma coloidal, al menos a la temperatura alcanzada durante el tratamiento por inducción: las nanopartículas magnéticas están entonces bien dispersadas, no forman agregados ni floculan con el tiempo.

Aún más ventajosamente, los ferrofluidos son estables, en particular, durante al menos 24 horas, ventajosamente durante al menos 1 mes, a una temperatura comprendida en el intervalo de 20-40 °C a la presión atmosférica y, particularmente a la temperatura ambiente (20 °C) o fisiológica (37 °C). Es posible diferenciar entre la estabilidad a corto plazo (periodo inferior o igual a 24 h), que se evaluará en el aire ambiental, y la estabilidad a largo plazo (periodo superior a 24 h). La estabilidad a largo plazo podrá evaluarse particularmente almacenando el ferrofluido en una atmósfera inerte, tal como argón o nitrógeno, protegido de la luz y a la temperatura a la que se desea evaluar la estabilidad, particularmente a 20 °C o 37 °C.

En caso de que los ferrofluidos según la invención correspondan a una dispersión coloidal, únicamente a una temperatura superior a la temperatura ambiente, particularmente a una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 40 °C, podría ser necesario almacenar los ferrofluidos en recipientes o cámaras con control termostático, o calentarlos antes de su utilización a una temperatura que permita obtener una dispersión coloidal. También pueden administrarse por inyección utilizando perfusiones termostatizadas o kits o dispositivos de calentamiento para mantener el ferrofluido a una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 40 °C a la que la estabilidad coloidal sea satisfactoria.

Nanoemulsión que comprende un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención

La invención también se refiere a una nanoemulsión de ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenida según el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso según la invención, como se esquematiza en la figura 1.

Por "nanoemulsión" se entiende una emulsión en la que las gotitas de la fase dispersa en la fase continua tienen un tamaño nanométrico, es decir, comprendido entre 100 nm y menos de 300 nm.

En el marco de la invención, la nanoemulsión puede ser una emulsión simple de tipo aceite en agua o agua en aceite, o una emulsión múltiple de tipo agua en aceite en agua. Preferentemente, la nanoemulsión según la invención es una nanoemulsión de aceite en agua.

Según un primer modo de realización, la fase lipófila de la nanoemulsión está constituida únicamente por el ferrofluido oleoso biocompatible.

Según un segundo modo de realización, la fase lipófila de la nanoemulsión comprende el ferrofluido oleoso biocompatible en combinación con uno o varios de otros compuestos lipófilos elegidos particularmente entre aceites, fluoróforos lipófilos, perfluorocarbonos, principios activos lipófilos, como por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, etopósido, carmustina.

Por otro lado, para mejorar su farmacocinética, la interfase de las gotitas lipídicas magnéticas puede contener uno o varios lípidos PEGilados (fosfolípidos) y/o ligandos de direccionamiento (anticuerpos, péptidos, aptámeros).

Los compuestos lipófilos distintos de los principios activos antineoplásicos que pueden utilizarse en la nanoemulsión según la invención son preferentemente biocompatibles y no generan ninguna toxicidad.

Puede utilizarse cualquier aceite biocompatible conocido en el estado de la técnica. Como ejemplos de aceites que pueden utilizarse en el marco de la invención como otro componente lipídico de la nanoemulsión, se pueden mencionar aceite de soja, aceite de oliva, aceite de sésamo, aceite de algodón, aceite de amapola, aceite de coco, aceite de nuez de coco, aceite de semillas de lino, aceite de girasol, aceites de triglicéridos de ácidos grasos como Miglyol 812N® o Labrafac® WL 1349, aceites de propilenglicol de ácidos grasos como Miglyol 840® o Labrafac® PG y aceites de pescado.

Cuando la nanoemulsión comprende un aceite o una mezcla de aceites además del ferrofluido oleoso biocompatible, este o estos están presentes en un contenido comprendido, en general, en el intervalo del 10 al 35% en masa, preferentemente del 20 al 30 % en masa con respecto a la masa total de nanoemulsión.

Entre los fluoróforos lipófilos que pueden utilizarse en el marco de la invención, se pueden mencionar los análogos fluorescentes de fosfolípidos y de esfingomielina, las cianinas como el verde de indocianina (ICG) y las carbocianinas lipófilas.

Cuando la nanoemulsión comprende fluoróforos lipófilos, éstos están presentes preferentemente en un contenido comprendido en el intervalo del 0,0001 al 0,02%o en masa, preferentemente del 0,001 al 0,01%o en masa, con respecto a la masa total de nanoemulsión.

Se sabe que los ligandos de direccionamiento permiten reconocer el objetivo biológico mediante una interacción molecular, mejorando así la especificidad de la mezcla administrada. Como ejemplos de ligandos de direccionamiento pueden mencionarse los agentes a base de aminoácidos, como el ácido fólico, azúcares como la manosa o la FDG (fluoro-desoxi-glucosa utilizada habitualmente en la obtención de imágenes de PET), secuencias peptídicas como el péptido cíclico RGD dirigido contra las integrinas o el TATE (Tyr3)-octreotato con alta afinidad por los receptores de somatostatina de tipo 2, compuestos sintéticos como la racloprida, que actúan como antagonistas de los receptores dopaminérgicos D2, anticuerpos en diferentes formatos, como anticuerpos de camélidos (nanocuerpos) o fragmentos de anticuerpos recombinantes seleccionados por métodos de cribado por expresión en fago, como el scFv dirigido contra el PSMA o los anticuerpos anti PD1/PDX1 utilizados en inmunoterapias, aptámeros seleccionados por métodos de cribado SELEX dirigidos contra los receptores de membrana de las células cancerosas.

La fase acuosa de la nanoemulsión según la invención está constituida normalmente por agua, opcionalmente en combinación con uno o varios disolventes miscibles en agua, como etanol y propilenglicol. La fase acuosa de la nanoemulsión también puede comprender sales (cloruro de sodio o de potasio) o tampones.

Además, la nanoemulsión puede comprender uno o varios tensioactivos, también conocidos como agentes de dispersión, preferentemente biocompatibles. Estos tensioactivos y agentes de dispersión están entonces presentes en la interfase de fase acuosa/fase lipófila de la nanoemulsión.

Como ejemplos de tensioactivos y agentes de dispersión que pueden ser adecuados en el marco de la invención, se pueden mencionar las lecitinas de huevo o de soja, ácidos biliares como desoxicolato de sodio, aceite de ricino polioxietilenado, polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 80, monolaurato de sorbitán (span ® 20, span ® 40, span ® 60 y/o span ® 80), poloxámeros, copolímeros en bloque de PEG.

Cuando éstos están presentes, el contenido de tensioactivos y/o de agentes de dispersión está contenido normalmente en el intervalo del 1 al 5% en masa, preferentemente del 1,8 al 3,8% en masa, con respecto a la masa total de la nanoemulsión.

Ventajosamente, las nanoemulsiones según la invención son estables a la temperatura ambiente (20 °C) a la presión atmosférica. En particular, las nanoemulsiones según la invención son estables durante al menos 24 horas, preferentemente durante al menos 6 meses a la temperatura ambiente (20 °C) y a la presión atmosférica.

En el marco de la invención, la estabilidad coloidal de la nanoemulsión se determina evaluando la distribución granulométrica de las partículas mediante difusión dinámica de la luz (DLS), como se detalla en los ejemplos.

Procedimiento de preparación de una nanoemulsión según la invención

La invención se refiere también a un procedimiento de preparación de una nanoemulsión según la invención.

Dicho procedimiento de preparación de la nanoemulsión comprende las siguientes etapas sucesivas:

i. disponer de una fase lipófila que comprende un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención, u obtenido según el procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso biocompatible según la invención,

ii. disponer de una fase acuosa,

iii. mezclar la fase lipófila y la fase acuosa para formar una nanoemulsión.

En particular, preferentemente, la mezcla de la etapa iii se llevará a cabo a una temperatura en la que el ferrofluido oleoso según la invención se encuentre en forma de una dispersión coloidal. La fase lipófila que comprende el ferrofluido oleoso biocompatible según la invención podrá, igualmente, calentarse a esta temperatura antes de mezclarse con la fase acuosa.

El procedimiento de preparación de la nanoemulsión según la invención puede comprender una etapa opcional i2, posterior a la etapa i y anterior a la etapa iii, para poner en contacto el ferrofluido oleoso biocompatible con uno o varios compuestos elegidos entre aceites, fluoróforos lipófilos, ligandos de direccionamiento, tensioactivos lipófilos, farmacóforos, tales como los descritos anteriormente, con el fin de obtener la fase lipófila de la nanoemulsión. Esta etapa opcional puede llevarse a cabo mezclando a la temperatura y presión ambientales mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia.

En la etapa ii, la fase acuosa puede comprender uno o varios tensioactivos, tales como los descritos anteriormente, cuando esté(n) presente(s).

En la etapa iii, la mezcla de las fases acuosa y lipófila suele realizarse a gran velocidad mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, las fases lipófila y acuosa, opcionalmente calentadas previamente, en particular a una temperatura comprendida en el intervalo de 60 a 70 °C, se mezclan en primer lugar a gran velocidad para formar una emulsión gruesa, a continuación, se homogeneizan mediante un homogeneizador ultrasónico o una homogeneización a alta presión.

La fase acuosa, la fase lipófila, y cualquier tensioactivo(s) presente(s), son tales como los descritos para la nanoemulsión según la invención.

Utilización de una nanoemulsión según la invención

La invención también se refiere a la utilización de una nanoemulsión según la invención, o de una nanoemulsión obtenida según el procedimiento de la invención.

Una nanoemulsión según la invención puede utilizarse como medicamento, en particular, en el tratamiento del cáncer por hipertermia magnetoinducida. Para ello, la nanoemulsión se administra por vía sistémica, seguido de la aplicación de un campo magnético alterno externo. En ese caso, el campo magnético se aplica en el momento en que la acumulación del producto en el tumor ha alcanzado su máximo. Este periodo de espera entre la inyección y la aplicación del campo magnético alterno se estima utilizando imágenes ópticas (con o sin fibra), mediante RMN o ultrasonidos (para las formulaciones a base de perfluorocarbonos). Para una administración intratumoral, el campo magnético se puede aplicar tras la inyección. Las características de la magnetoinducción (valores del par de campo/frecuencia y periodo de aplicación) para las nanoemulsiones pueden adaptarse en función de las dosis térmicas buscadas. El calentamiento de las gotitas de aceite magnético puede ir acompañado de la liberación de un agente terapéutico, o puede utilizarse para activar un agente terapéutico termoactivable o para inducir la expresión génica de un gen bajo el control transcripcional de un promotor termosensible o para ejercer un efecto sinérgico con otro agente terapéutico coadministrado de forma independiente en el marco de protocolos de quimioterapia y/o de radioterapia.

Según un primer modo de realización, la nanoemulsión se utiliza como único medicamento en este tratamiento. Según un segundo modo de realización, particularmente cuando la nanoemulsión no comprende un medicamento quimioterapéutico, la nanoemulsión se utiliza en combinación con otro medicamento quimioterapéutico de naturaleza lipófila, tal como los taxanos (paclitaxel y docetaxel) o la carmustina. También puede contemplarse la coinyección de formulaciones inyectables que contengan principios activos termosensibles, como Thermodox®.

Los volúmenes y las concentraciones de ferrofluido oleoso administrados, así como el número de inyección(es) y el tiempo entre cada inyección, si procede, dependen particularmente del tumor tratado (localización, volumen) y del paciente (edad, condición física), y son determinados por el profesional.

La nanoemulsión según la invención, u obtenida según el procedimiento según la invención, también puede utilizarse como producto de contraste para la obtención de imágenes médicas, tales como la RMN, ultrasonidos o imágenes de fluorescencia óptica en el infrarrojo cercano (NIR), enfoques locales con fibra mediante endoscopia. En el caso de una utilización en la obtención de imágenes de fluorescencia, la nanoemulsión administrada al paciente comprende preferentemente fluoróforos lipófilos.

La invención también se refiere a un método de obtención de imágenes del cuerpo entero o de una parte del cuerpo de un individuo que comprende una etapa de obtención de una o varias imágenes de dicho cuerpo entero o parte del cuerpo entero mediante una técnica de obtención de imágenes médicas, comprendiendo dicho cuerpo entero o dicha parte del cuerpo el producto de contraste que comprende la nanoemulsión.

Kits

La invención también se refiere a un kit que comprende un recipiente en el que se coloca el ferrofluido oleoso según la invención, o la nanoemulsión según la invención. El kit también puede comprender las nanopartículas magnéticas funcionalizadas en la superficie con moléculas de uno o varios fosfolípido(s) tales como las descritas según la invención, solas en un recipiente, y opcionalmente, la fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, para formar el ferrofluido oleoso en un recipiente aparte. A continuación, se puede reconstituir el ferrofluido o la nanoemulsión a partir del kit, justo antes de su utilización o administración. El kit también puede comprender las condiciones de utilización en términos de pares de campo/frecuencia aplicables y la correspondiente dosis térmica disipada por unidad de volumen de ferrofluido a una concentración dada. Cabe señalar que la concentración de hierro también está certificada a título indicativo.

Ejemplos

Materiales y métodos:

A) Fosfolípidos ensayados:

Los fosfolípidos utilizados para preparar los ferrofluidos oleosos de los ejemplos siguientes son:

- 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) con la siguiente fórmula Quím. 1:

[Quím. 1]

- ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatídico (DOPA) con la siguiente fórmula Quím. 2 (en su forma de sal sódica):

[Quím. 2]

- ácido 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatídico (DSPA) con la siguiente fórmula Quím. 3 (en su forma de sal sódica):

[Quím. 3.]

y

- 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (DOPS) con la siguiente fórmula Quím. 4 (en su forma de sal sódica): [Quím. 4]

B) Composición de las fases oleosas:

Las fases oleosas utilizadas en los ejemplos son mezclas de triglicéridos de ácidos grasos o propilenglicoles de ácidos grasos: Miglyol 812N® y Miglyol 840®, respectivamente. La siguiente tabla 1 muestra los ácidos grasos que componen los triglicéridos o los propilenglicoles de ácidos grasos que componen estos aceites (los porcentajes son porcentajes en masa con respecto al peso total del aceite).

T l 1

continuación

C) Determinación del hierro:

El hierro se determina mediante espectroscopia UV visible disolviendo las nanopartículas de óxido de hierro en una solución de ácido clorhídrico (HCl) 5 M. Tras la completa disolución de las nanopartículas en HCl 5 M, se mide la absorbancia a 350 nm para determinar la concentración de hierro. La concentración de hierro se determina según la fórmula: A350nm = e.l.[Fe]. El coeficiente de extinción molar £ es de 2960 l-1.mol.cm-1.

D) Tamaño de las nanopartículas:

D1) Medición por difusión dinámica de la luz (DLS)

El radio hidrodinámico de las nanopartículas se determina mediante difusión dinámica de la luz utilizando un aparato Cordouan Vasco equipado con un láser con una longitud de onda de 658 nm y un ángulo de 135°, los datos se adquieren durante un periodo de 60 s.

D2) Medición por difracción de rayos X (DRX)

El tamaño de los cristalitos se determina por DRX utilizando la siguiente fórmula de Scherrer Math. 1, donde r es el diámetro medio de los cristalitos, A la longitud de onda de los rayos X (A(Cu Ka) = 1,5406 A), p la anchura a media altura del pico más intenso y © el ángulo de Bragg:

[Math. 1]

D3) Medición por microscopia electrónica de transmisión (MET)

El tamaño elemental medio de las nanopartículas se determina mediante microscopia electrónica de transmisión midiendo el tamaño de 200 nanopartículas con un programa informático de procesamiento de imágenes (ImageJ Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU.), https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2019.), obtenidas con un microscopio Philips CM120 que funciona a 120 kV y está equipado con una cámara Ultra scan USC1000 (2k * 2k).

E) Caracterización de superficie:

E1) Análisis termogravimétrico (ATG)

Se colocan aproximadamente 10 mg de nanopartículas, previamente secadas a presión reducida a 70 °C, en un crisol de platino y se analizan con una termobalanza Tag2400 de Setaram. La muestra se calienta a 600 °C en aire a una velocidad de ascenso de 5 °C/min.

E2) Espectroscopia infrarroja de reflexión difusa

La espectroscopia infrarroja de reflexión difusa (DRIFT) se realiza con un espectrómetro Bruker IFS Equinox 55. Las nanopartículas funcionalizadas se secan en un horno a 70 °C después de las etapas de lavado. A continuación, las nanopartículas se trituran en KBr anhidro (3 % en masa).

E3) Determinación de las densidades superficiales de funcionalización y de las tasas de recubrimiento teóricas (también conocidas como nominales) y reales

La superficie desarrollada por molécula de fosfolípido proyectada sobre una superficie depende del volumen ocupado por la cabeza polar en comparación con el de las cadenas lipídicas. En el caso de los fosfolípidos, el volumen de impedimento de las dos partes (polar e hidrófoba) es equivalente, por lo que un lípido cabe en un cilindro y no en un cono. Es esta particularidad la que les permite ensamblarse en membranas vesiculares y no en micelas. Los valores de impedimento superficial de los fosfolípidos están comprendidos generalmente entre 60 y 65 A2, en función del entorno en el que se encuentren, solos o en mezcla, del número de insaturaciones, de las interacciones con una superficie sólida (membrana lipídica soportada) o en un medio líquido (vesícula) y de diferentes parámetros fisicoquímicos como la temperatura. El valor de referencia de una molécula de fosfolípido que comprende una cabeza de fosfatidilo -O(O)P(OH)0-, Na+ (como en el caso del DOPA y el DSPA) es de 62 A2, lo que corresponde al impedimento molecular en el seno de una monocapa saturada contenida en una membrana lipídica. Este valor de densidad superficial molecular corresponde al encontrado para las membranas lipídicas (bicapas de fosfolípidos) cuando se considera una monocapa. Existen, por supuesto, ligeras diferencias cuando la función OH está sustituida. Así, la dioleoilfosfatidilserina, la superficie molecular desarrollada es del orden de 65 Á2/molécula, y para la dioleoilfosfatidiletanolamina se mide generalmente entre 60 y 65 Á2 Por lo tanto, se eligió que fuera de 62 Á2 Este valor de 62 Á2 se utiliza, en el marco de la invención, para calcular los porcentajes de recubrimiento de la superficie de las nanopartículas y para calcular las densidades superficiales de funcionalización en moléculas de fosfolípido, sea cual sea el fosfolípido considerado.

Se denomina "tasa de recubrimiento nominal o teórica" de fosfolípido al porcentaje molar que representa la cantidad de lípido implicada con respecto a la cantidad necesaria para formar una monocapa, calculada a partir del tamaño medio de las nanopartículas medido por MET y la superficie de referencia de la cabeza polar del fosfolípido implicado. Cuando las nanopartículas son esferoidales, se considera que el tamaño medio de las nanopartículas medido por MET se toma como diámetro para evaluar la superficie media desarrollada por las partículas. Para las nanoflores, debido a su rugosidad superficial, su superficie desarrollada se estimó iterando recubrimientos de sílice de diferentes espesores mediante el procedimiento de sol-gel (vía de síntesis Stober). Este método nos permitió estimar así una superficie un 15 % mayor que la de una esfera lisa del mismo diámetro.

Las mediciones de ATG permiten determinar la cantidad de moléculas de fosfolípidos realmente presentes en las nanopartículas por unidad de superficie a partir de la pérdida de masa total medida entre 200 °C y 600 °C, de la masa molar de los residuos orgánicos descompuestos durante la combustión completa con respecto a la superficie desarrollada por las nanopartículas implicadas. El rendimiento de injerto representa la relación entre la cantidad de moléculas de fosfolípidos quimisorbidas en la superficie de las nanopartículas y la cantidad nominal implicada en la reacción.

F) Síntesis de nanopartículas de óxido de hierro

F1) Síntesis de nanopartículas FF1 por coprecipitación alcalina

Se vierte una masa de 31,41 g de FeCh.4 H2O (0,158 mol) disueltos en 170 ml de ácido clorhídrico 1,5 M en un vaso de precipitados que contiene 85,4 g de FeCh.6 H2O (0,316 mol) disueltos en 3,5 l de agua (relación estequiométrica inicial Fe2+/Fe3+ = 0,5). Con una agitación mecánica enérgica, se añaden rápidamente 300 ml de una solución de amoniaco (28-30%, m/m). El medio se deja en agitación durante 15min. Los floculados de nanopartículas de magnetita se decantan utilizando un imán permanente, a continuación se elimina el sobrenadante. Tras 2 etapas sucesivas de lavado con agua, la superficie de las nanopartículas se oxida añadiendo un volumen de 200 ml de HNO3 2 M, y después se deja en agitación durante 15min. Después de decantar y eliminar el sobrenadante, el núcleo de las nanopartículas se oxida a maghemita añadiendo 600 ml de una solución de nitrato de hierro 0,33 M. El medio de reacción se lleva a ebullición durante 30 min. Después de decantar y eliminar el sobrenadante, se añaden 200 ml de ácido nítrico 2 M. A continuación, el floculado se decanta magnéticamente y se lava 3 veces con acetona para eliminar el exceso de ácido. Finalmente, el floculado se peptiza en 200 ml de agua. Tras evaporar el exceso de acetona, el ferrofluido se lleva hasta un volumen de 1 l con agua. A continuación, la dispersión de nanopartículas de maghemita se denomina FF1. Al final de la síntesis, el ferrofluido presenta una concentración en masa de óxido de hierro de 69 g/l y desarrolla una superficie por unidad de volumen de 11316 m2/l. El tamaño elemental medio de las nanopartículas esferoidales así obtenidas, determinado por MET, es de 7,5 nm ± 2 nm, y de 6,9 nm cuando se mide por DRX. El radio hidrodinámico medido es Dh = 38 nm.

F2) Síntesis de nanopartículas de FF2 utilizando poliol

Se disuelven una masa de 1,082 g de FeCh.4 H2O (5,44 mmol) y una masa de 0,398 g de FeCh.6 H2O (1,47 mmol) en 80 g de una mezcla de dietilenglicol (DEG) y N-metildietanolamina (NMDEA) (relación 1:1), v/v). Esta solución se mezcla durante 1 hora bajo flujo de nitrógeno con agitación hasta la completa disolución de los precursores. Se disuelve una masa de 0,64 g de NaOH (16 mmol) en 40 g de una mezcla de NMDEA/DEG (1:1, v/v) bajo flujo de nitrógeno. La solución de NaOH se añade a la solución que contiene los precursores, y la mezcla se calienta a 220 °C, a 2 °C/min, durante 4 h. Las nanopartículas obtenidas se sedimentan magnéticamente y se lavan con una mezcla de etanol y acetato de etilo (1:1), v/v) tres veces para eliminar las impurezas orgánicas e inorgánicas. Se realiza un lavado con ácido nítrico al 10 %. Se solubilizan 8,25 g de Fe3(NO3)3.9 H2O (20,4 mmol) en 20 ml de agua, y la solución se añade a las nanopartículas. La dispersión de nanopartículas se calienta a 80 °C durante 45 minutos para obtener maghemita. Tras decantar y eliminar el sobrenadante, las nanopartículas se lavan con ácido nítrico al 10 %, después con acetona y finalmente con éter dietílico. Al final, las nanopartículas se vuelven a dispersar en el agua. A continuación, la dispersión de estas nanopartículas de maghemita se denomina entonces FF2. Al final de la síntesis, el ferrofluido presenta una concentración en masa de óxido de hierro de 20 g/l y desarrolla una superficie de 1574 m2/l. El tamaño elemental medio de las nanopartículas con morfología de nanoflor así obtenidas se midió en 15,4 nm ± 3 nm por el método de MET y en 16 nm por DRX. El radio hidrodinámico medido es Dh = 26 nm.

Síntesis de las nanopartículas FF3 utilizando poliol

La síntesis de las nanopartículas FF3 se realiza en las mismas condiciones operativas que las descritas para la obtención de las nanopartículas FF2, salvo porque el ascenso de la temperatura a 220 °C, a 2 °C/min, durante 4 h se lleva a cabo esta vez en unas condiciones de reacción con aislamiento térmico. Para hacer esto, se colocó lana de vidrio alrededor del globo en contacto con las paredes del reactor al aire libre y por encima del calentador del globo para limitar las pérdidas de calor, permitiendo así un mejor control cinético de la rampa de temperatura. El tamaño elemental medio de las nanopartículas con morfología de nanoflor obtenidas por el método de MET es de 18,5 nm ± 3,1 nm.

G) Estabilidad coloidal de las dispersiones oleosas

La estabilidad coloidal de las dispersiones se observa en función de la temperatura en una primera aproximación, a continuación, visualmente, midiendo la transmitancia a 800 nm con un espectrofotómetro VARIAN Cary 500 equipado con un controlador de temperatura. La calidad de las dispersiones de nanopartículas también se verifica mediante DLS (método D1). En cuanto a las tablas de los ejemplos, la mención "+" significa que el carácter coloidal se obtiene dispersando las nanopartículas en la fase oleosa a la temperatura correspondiente, y que este carácter coloidal sigue presente al menos 24 horas después de su obtención, tiempo transcurrido al menos entre la preparación de la dispersión y la medición de la transmitancia.

Ejemplo 1: dispersión de las nanopartículas FF1, FF2 y FF3 en cloroformo

El objetivo de este ejemplo es transferir nanopartículas de los ferrofluidos acuosos FF1, FF2 y FF3 a cloroformo sin utilizar tensioactivos para permitir la realización de los injertos de fosfolípidos por quimisorción. Para hacer esto, se añade 1 ml de una solución de amoniaco (28-30 % m/m) a 35,4 ml de FF1 a 69 g/l de Y-Fe2O3. Los floculados de nanopartículas se decantan utilizando un imán permanente, a continuación se elimina el sobrenadante. Las nanopartículas agregadas se lavan 2 veces con agua. Después, las nanopartículas agregadas se lavan 5 veces con etanol. Finalmente, se añade un volumen de 80 ml de cloroformo a las nanopartículas, y las nanopartículas se vuelven a dispersar en un baño de ultrasonidos durante 3 minutos. La concentración final es de 30,5 g/l de Y-Fe2O3 en cloroformo. El protocolo es idéntico para los ferrofluidos FF2 y FF3.

Ejemplo 2: preparación de ferrofluidos oleosos biocompatibles resultantes de la funcionalización, en presencia de ácido, de nanopartículas magnéticas por moléculas de fosfolípidos que presentan una cabeza polar no impedida.

Ejemplo 2.1. : dispersiones de nanopartículas funcionalizadas con moléculas de fosfolípido monoinsaturado Ejemplo 2.1.1: dispersión de nanopartículas magnéticas del ferrofluido FF1 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840®

En este ejemplo, se prepara una dispersión de nanopartículas magnéticas de FF1 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840®. El impedimento superficial de referencia de una molécula de fosfolípido es de 62 A2, lo que corresponde al impedimento molecular en el seno de una monocapa saturada contenida en una membrana lipídica. El protocolo de funcionalización para nanopartículas con una tasa de recubrimiento nominal (correspondiente a la cantidad de lípido utilizada con respecto a la cantidad necesaria para formar una monocapa) del 55 % (es decir, 0,89 molécula/nm2) con respecto a la cantidad necesaria para formar una monocapa de DOPA es el siguiente: Se diluye un volumen de 16,4 ml de nanopartículas magnéticas ([Y-Fe2O3] = 30,5 g/l, superficie desarrollada = 82 m2) dispersadas en cloroformo, preparadas en el ejemplo 1, en un volumen de 47,7 ml de una solución de ácido acético en cloroformo (1:9, v/v). A esta dispersión se añade con vórtice un volumen de 3,51 ml de DOPA (25 mg/ml en cloroformo, 45,2 m2). Tras 14 horas de reacción a 4 °C, se añade etanol al medio hasta que las nanopartículas floculen y, el conjunto se decanta magnéticamente. El floculado magnético se lava con 3 volúmenes de 100 ml de una mezcla de cloroformo/etanol (1:3, v/v) y después con 2 volúmenes de 100 ml de etanol. Después del último lavado, las nanopartículas se secan bajo un flujo de nitrógeno y se añade un volumen de 15 ml de Miglyol M840® a las nanopartículas. Las nanopartículas se dispersan a partir de 35 °C en el aceite tras un calentamiento al baño maría.

Análogamente, trabajando a una concentración constante de DOPA (1,25 mg/ml) se puede conseguir un intervalo de tasas de recubrimiento nominal de DOPA fijada de entre el 20 % y el 150 % con respecto a la monocapa, lo que corresponde a una densidad de injerto teórica comprendida entre 0,33 DOPA/nm2 y 2,42 DOPA/nm2. Para ciertos valores de nominales de densidad, las nanopartículas se dispersan espontáneamente a la temperatura ambiente (20 °C).

La tasa de recubrimiento nominal con DOPA se calcula según la siguiente ecuación Math. 2.

[Math. 2]

N

tasa de recubrimiento = 100*pl<*>0,62

4ir<*>N mp<->R2

donde NPL corresponde al número de moléculas de fosfolípido, NNP al número de nanopartículas y R es el radio de la nanopartícula en nm.

Se evaluó la estabilidad de las dispersiones de nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840® a diferentes temperaturas y con diferentes tasas de recubrimiento, tal como se resume en la siguiente tabla 3. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida). Estos criterios de cribado pueden evaluarse de forma práctica mediante observaciones visuales en perfecta concordancia con las mediciones de la transmitancia a 800 nm. Las mediciones de ATG permitieron determinar la cantidad real de DOPA por unidad de superficie y el rendimiento del injerto. Las densidades superficiales nominal y real de DOPA, así como la estabilidad coloidal de las nanopartículas en M840® a 20 °C y 37 °C, se resumen en la siguiente tabla 2.

[Tabla 2]

* Dh: diámetro hidrodinámico medido por DLS a 20 °C.

** Los valores de transmitancia se determinaron en dispersiones con 0,2 g/l de Fe2O3.

La quimisorción del DOPA en las nanopartículas se confirmó mediante DRIFT (figura 2) con la presencia de una banda entre 1070 cm-1 y 1170 cm-1 y 1200 cm-1 correspondiente a las vibraciones de los enlaces P-OH y P-O, respectivamente. El análisis del ATG permite confirmar también la quimisorción del DOPA en las nanopartículas. Los análisis del ATG permitieron determinar los rendimientos de injerto reales comprendidos entre el 49 % y el 97,5 % en todo el intervalo, y del 51 % al 80 % en el ámbito de la estabilidad coloidal (figura 3). Estos altos rendimientos son ventajosos porque permiten minimizar la utilización de moléculas de fosfolípidos.

Ejemplo 2.1.2: dispersión de nanopartículas magnéticas del ferrofluido FF1 funcionalizadas con DOPA en Miglyol 812N ®

El protocolo utilizado es el mismo que el descrito en el ejemplo 2.1.1, salvo porque las nanopartículas modificadas se vuelven a dispersar en Miglyol 812N®. El intervalo se realizó en las mismas condiciones, es decir, a una concentración constante de DOPA (1,25 mg/ml).

Se evaluó la estabilidad de las nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DOPA en Miglyol 812N® a diferentes temperaturas y diferentes tasas de recubrimiento nominal, tal como se resume en la siguiente tabla 3. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida).

[Tabla 3]

continuación

Ejemplo 2.1.3: dispersión de nanopartículas magnéticas del ferrofluido FF2 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840®

El protocolo de quimisorción del DOPA es idéntico al descrito en el ejemplo 2.1.1, salvo porque se utilizan nanopartículas de ferrofluido FF2.

Se evaluó la estabilidad de las nanopartículas resultantes de FF2 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840 ® a diferentes temperaturas y diferentes tasas de recubrimiento nominal, tal como se resume en la siguiente tabla 4. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida). Los valores del diámetro hidrodinámico (DH) de las nanopartículas en el ferrofluido FF2 se midieron mediante una DLS externa (VASCO-FLEX, Cordouan Technologies) para diferentes tasas de injerto de DOPA, a 60 °C por inducción aplicando un campo magnético alterno externo (755 kHz, 10,2 kA.irr1).

[Tabla 4]

Ejemplo 2.1.4: dispersión de nanopartículas magnéticas del ferrofluido FF3 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840®

El protocolo de quimisorción del DOPA para dispersar nanopartículas magnéticas en Miglyol M840® es idéntico al descrito en el ejemplo 2.1.1, salvo porque se utilizan las nanopartículas del ferrofluido FF3 aplicando una tasa de recubrimiento nominal de 1,10 moléculas/nm2 Se prepararon dos dispersiones con unas concentraciones en masa de 5 g/l y 300 g/l para las mediciones de SAR (tasa de absorción específica, o en inglés, "spécifie absorption rate") y los experimentos de termoablación de tumoresin vivoen ratones (ejemplo 6).

Ejemplo 2.2: preparación de una dispersión de nanopartículas funcionalizadas con moléculas de fosfolípido que presentan una cabeza polar sustituida: dispersión en Miglyol M840® de nanopartículas magnéticas de ferrofluido FF1 funcionalizadas con DOPE.

El protocolo utilizado es el mismo que el descrito en el ejemplo 2.1.1, excepto por la naturaleza del fosfolípido empleado. El intervalo se realiza en las mismas condiciones, es decir, a una concentración constante de DOPE (1,25 mg/ml).

Se evaluó la estabilidad de las dispersiones de nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DOPE en Miglyol M840®. Los resultados se resumen a continuación en la tabla 5. Estos resultados se dan en función de la temperatura y de la tasa de recubrimiento. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida).

[Tabla 5]

Con una tasa de recubrimiento del 52 %, las nanopartículas funcionalizadas son dispersables a partir de 35 °C. A 70 °C, el intervalo de capacidad se amplía a entre el 48 y el 61 % de tasa de recubrimiento nominal. La presencia de un sustituyente en la cabeza polar afecta a la cinética de quimisorción con respecto a las del DOPA y reduce el intervalo de estabilidad coloidal en términos de composición de la superficie y temperatura.

Ejemplo 2.3. : preparación de una dispersión de nanopartículas funcionalizadas con moléculas de fosfolípido saturado con cabeza polar no sustituida: dispersión en Miglyol M840® de nanopartículas magnéticas de ferrofluido FF1 funcionalizadas con DSPA.

El protocolo utilizado es el mismo que el descrito en el ejemplo 2.1.1, excepto por la naturaleza del fosfolípido empleado. El intervalo se realiza en las mismas condiciones, es decir, a una concentración constante de DSPA (1,25 mg/ml).

Se evaluó la estabilidad de las nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DSPA en Miglyol M840® a diferentes temperaturas y con diferentes tasas de recubrimiento, tal como se resume en la siguiente tabla 6. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida).

[Tabla 6]

La temperatura de dispersión de las nanopartículas magnéticas, es decir, la temperatura por encima de la cual la dispersión de las nanopartículas magnéticas es límpida, depende de la cantidad de DSPA empleada. La temperatura de dispersión de las nanopartículas magnéticas se determinó mediante mediciones de la transmisión a 800 nm en una temperatura, según el protocolo detallado anteriormente.

Las nanopartículas de FF1 funcionalizadas con DSPA son dispersables a unas temperaturas superiores a la ambiental en los aceites biocompatibles, a partir de 35 °C con una tasa de recubrimiento nominal del 24 %. La temperatura de dispersión en Miglyol M840® aumenta con la tasa de recubrimiento con moléculas de fosfolípido.Ejemplo 3: preparación de ferrofluidos oleosos biocompatibles resultantes de la funcionalización de las nanopartículas magnéticas con moléculas de fosfolípido en ausencia de ácido

Ejemplo 3.1. : preparación de ferrofluidos oleosos biocompatibles mediante la funcionalización superficial de nanopartículas utilizando moléculas de fosfolípido que presentan cabezas de fosfato sustituidas: el caso de las nanopartículas magnéticas resultantes de FF1 modificadas con DOPS en Miglyol M840®

El impedimento estérico que ofrecen ciertas cabezas polares de fosfolípidos sustituidos tiene el efecto de ralentizar la cinética de quimisorción en la superficie del óxido de hierro. No obstante, esta cinética puede acelerarse aumentando la concentración de fosfolípido, es decir, introduciendo un exceso de dichas moléculas de fosfolípido con respecto a una monocapa de moléculas de fosfolípido. En ese caso, el tiempo de reacción se convierte en el parámetro clave para controlar el número de moléculas de fosfolípido injertadas por nanopartícula.

Se añade con vórtice un volumen de 14,2 ml de DOPS (25 mg/ml en cloroformo) a 1,64 ml de nanopartículas magnéticas FF1 ([Fe2O3] = 30,5 g/l) dispersas en cloroformo. La reacción de quimisorción se detiene, en diferentes momentos de la reacción, añadiendo etanol para inhibir la reacción y provocar la floculación de las nanopartículas y la precipitación del exceso de moléculas de fosfolípido. A continuación, la suspensión se decanta con un imán. El floculado se lava tres veces con 50 ml de etanol. Durante el último lavado, las nanopartículas se secan bajo un flujo de nitrógeno y se añade un volumen de 15 ml de Miglyol M840® a las nanopartículas. Las nanopartículas se dispersan espontáneamente en el aceite.

Se evaluó la estabilidad de las nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DOPS en Miglyol M840® tras diferentes tiempos de reacción que dieron lugar a diferentes tasas de recubrimiento, tal como se resume en la siguiente tabla 7. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida).

[Tabla 7]

El ATG permite hacer un seguimiento de la cinética de quimisorción del DOPS a lo largo del tiempo. La tabla 8 y la figura 4 muestran las variaciones en la densidad de injerto real de las nanopartículas funcionalizadas con un exceso de DOPS del 2000 %, es decir, tras 7 min de reacción, lavado y secado, o tras 30 minutos de reacción, lavado y secado. La figura 4 representa los termogramas de las nanopartículas funcionalizadas con un exceso de DOPS del 20 % a los 7 min y 30 min de reacción, así obtenidos.

[Tabla 8]

Ejemplo 3.2. : preparación de ferrofluidos oleosos biocompatibles mediante la funcionalización superficial de nanopartículas utilizando moléculas de fosfolípido que presentan cabezas de fosfato no sustituidas: el caso de las nanopartículas magnéticas resultantes de FF1 modificadas con DOPA en Miglyol M840®

El protocolo para preparar nanopartículas que presentan un defecto de fosfolípidos del 50 % (es decir, dDOPA/nm2 = 0,81 DOPA.nm-2) es el siguiente: se diluyen 16,4 ml de nanopartículas magnéticas FF1 ([y-Fe2O3] = 30,5 g/l) dispersadas en cloroformo en 44 ml de cloroformo. A esta dispersión se añade con vórtice un volumen de 3,18 ml de DOPA (25 mg/ml en cloroformo). Tras 14 horas de reacción a 4 °C, se añade etanol hasta que las nanopartículas floculan, seguido de una decantación magnética. El floculado se lava con una mezcla de cloroformo/etanol (1:3, v/v) y después con etanol. Durante el último lavado, las nanopartículas se secan bajo un flujo de nitrógeno y se añade un volumen de 15 ml de Miglyol M840® a las nanopartículas. Las nanopartículas se dispersan espontáneamente en el aceite.

Análogamente, un intervalo de tasas de recubrimiento nominales de DOPA de entre el 5 % y el 96 % en defecto con respecto al impedimento molecular en el seno de una monocapa de una membrana lipídica, correspondiente a una densidad de recubrimiento comprendida entre 0,08 DOPA/nm2y 1,55 DOPA/nm2, puede realizarse trabajando a una concentración constante de DOPA (1,25 mg/ml).

Se evaluó la estabilidad de las nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840® sin la adición de ácido durante la reacción, a diferentes temperaturas y con diferentes tasas de recubrimiento, tal como se resume en la siguiente tabla 9. Los criterios para determinar la calidad de las dispersiones son: - = no dispersable (medio turbio), = sol coloidal estable en el tiempo (dispersión límpida).

[Tabla 9]

Ejemplo 4: comparación de ferrofluidos oleosos y acuosos resultantes de FF1, FF2 y FF3

Se prepararon dispersiones de nanopartículas con una concentración en masa de óxido de hierro de 5 g/kg de disolvente en las fases oleosas biocompatibles o en medio acuoso, para medir y comparar su calentamiento por inducción magnética. La temperatura de las muestras se mide utilizando una fibra óptica (OTG-M420), OpsenTM) y la temperatura de las muestras se regula a 37 °C.

Los campos magnéticos alternos son generados por dos dispositivos diferentes, con el fin de acceder a diferentes pares de campo/frecuencia. El primer dispositivo es el DM3 de nB nanoScale Biomagnetics, que ofrece las siguientes condiciones: 473,5 kHz y 13,36 kA. m-1, 344,5 kHz y 16,23 kA. m-1, 217 kHz et 20,09 kA. m-1 y 146 kHz, 21,96 kA. m-1.

Un segundo dispositivo, constituido por una bobina de inducción alimentada por un generador Minimax JunioTM 1TS de 3,5 kW, permite acceder a una condición adicional: 755 kHz, 10,2 kA.m-1.

Las mediciones de la velocidad de calentamiento por inducción magnética permiten determinar la potencia térmica de las nanopartículas por unidad de masa de líquido magnético, lo que se conoce como SAR(Spécifie Adsorption Rate).La sAr se determina según la siguiente fórmula Math. 3:

[Math. 3]

m, Al

SAR =— — C —

nif^ p ^ Al

donde Cp representa la capacidad calorífica del medio de dispersión en J.(g.K)-1 (Cagua = 4,18 J.g-1.K-1 y Caceite “ 2 J.g-1.K-1), itis la masa de disolvente, itinp la masa de nanopartículas y AT/At es la pendiente en el origen (37 °C) de la tangente de la curva de evolución de la temperatura en función del tiempo.

Los perfiles de temperatura de las dispersiones acuosas magnéticas FF1, FF2 y FF3 con una concentración en masa de óxido de hierro igual a 5 g/l, comparados con los perfiles obtenidos con las nanopartículas obtenidas en los ejemplos 2.1.1, 2.1.3 y 2.1.4, resultantes, respectivamente, de FF1, FF2 y FF3 funcionalizadas con DOPA, con unas densidades de recubrimiento teóricas de 0,81, 1,29 y 1,10 moléculas/nm2, respectivamente, y dispersadas en Miglyol M840® por inducción magnética, se representan en las figuras 5A, 5B y 5C, respectivamente, para dos pares de campo/frecuencia ((Fig. 5A) 755 kHz, 10,2 kA/m, (Fig. 5B) 473,5 kHz, 13,36 kA/m, (Fig. 5C) 473,5 kHz, 13,36 kA/m). En 10 segundos, la temperatura del ferrofluido acuoso FF1 aumenta 0,12 °C, mientras que para las nanopartículas resultantes de FF1 funcionalizadas con DOPA y dispersadas en Miglyol M840®, el aumento es de 0,5 °C, lo que corresponde a un aumento de temperatura de más de un factor 4. Durante un periodo de inducción de 100 segundos, se mide este mismo aumento, es decir, un aumento de temperatura de más de 4,8 °C en la fase oleosa y únicamente de 1,2 °C en la fase acuosa. Con respecto a FF2, en 10 segundos, la temperatura de la dispersión acuosa FF2 aumenta 0,8 °C, mientras que para las dispersiones de FF2 funcionalizadas con DOPA y dispersadas en Miglyol M840®, el aumento de temperatura es 5,8 veces mayor, es decir, 5,2 °C. Se observó un aumento aún mayor en las dispersiones de FF3 en aceite: en 10 segundos, se mide un aumento de temperatura de 3 °C para el ferrofluido acuoso, mientras que el aumento de la temperatura es 12 veces mayor, es decir, 36 °C, para el ferrofluido oleoso. Por lo tanto, la dispersión oleosa de FF3 presenta unas propiedades de calentamiento mucho mejores con respecto a la dispersión acuosa de FF3, con un aumento muy rápido de la temperatura.

Los valores de la SAR medidos en los dos medios (acuoso y oleoso) para los tres tipos de nanopartículas FF1, FF2 y FF3 se recogen en la siguiente tabla 10:

[Tabla 10]

Los valores de la SAR a 37 °C para la dispersión FF1 por inducción a 755 kHz, 10,2 kA/m se duplican entre el medio acuoso y el oleoso. Los valores de la SAR a 37 °C para los dos tipos de nanopartículas magnéticas con morfología de nanoflor resultantes de las dispersiones FF2 y f F3 sometidas a inducción a 473,5 kHz, 13,36 kA/m se multiplican por un factor de 2,6 y 8,8, respectivamente, entre el medio acuoso y el oleoso.

También se evaluó la estabilidad de estos ferrofluidos oleosos sometidos a varios ciclos de inducción magnética. Las dispersiones oleosa y acuosa de FF2 se sometieron a 4 ciclos sucesivos de calentamiento/enfriamiento (AT > 10K, es decir, de 37 °C a más de 47 °C) por inducción magnética para 2 pares de campo/frecuencia diferentes (2 ciclos a 344,5 kHz, 16,23 kA.m-1 seguido de 2 ciclos a 473,5 kHz, 13,36 kA.m-1).

Las dispersiones oleosa y acuosa de FF3 se sometieron a 2 ciclos sucesivos de calentamiento/enfriamiento (AT > 40K, es decir, de 37 °C a más de 77 °C) de 2 ciclos de inducción magnética para un par de campo/frecuencia de 473,5 kHz, 13,36 kA.m-1.

En las figuras 6A, 6B y 6C se representan, respectivamente, los perfiles de temperatura de dispersiones de nanopartículas FF2 y FF3 dispersadas en agua (5 g/kg) y de las mismas nanopartículas funcionalizadas con DOPA (para unas densidades de recubrimiento teóricas respectivas de 1,29 y 1,10 moléculas/nm2), condición ácida, ejemplos 2.1.3 y 2.1.4) en Miglyol M840 (5 g/kg) cuando se aplicó el campo magnético alterno. En la figura 6A se realizan 2 ciclos de calentamiento por inducción a 473,5 kHz, 13,36 kA.m-1 y enfriamiento (T0 = 37 °C). En la figura 6B se realizan 2 ciclos de calentamiento por inducción a 344,5 kHz, 16,23 kA.m-1 y enfriamiento (T0 = 37 °C). En la figura 6C se realizan dos ciclos de calentamiento por inducción a 473,5 kHz, 13,36 kA.m-1 y enfriamiento (To = 37 °C).

Los valores de la SAR medidos para estas dispersiones acuosas y oleosas se detallan en la siguiente tabla 11. [Tabla 11]

Los valores de la SAR a 37 °C de las nanopartículas magnéticas resultantes de las dispersiones FF2 se multiplican por un factor de aproximadamente 3, respectivamente, entre el medio acuoso y oleoso para las dos condiciones de campo/frecuencia de 344 kHz, 16,23 kA.m-1 y 473,5 kHz, 13,36 kA.m-1. Para un tiempo de inducción de 10 segundos, la temperatura de la dispersión acuosa de FF2 aumenta aproximadamente 1 °C, mientras que para las mismas nanopartículas resultantes de FF2 funcionalizadas con DOPA y dispersadas en Miglyol M840®, el aumento de la temperatura es aproximadamente de 6 a 7 veces mayor.

Los valores de la SAR a 37 °C de las nanopartículas magnéticas resultantes de las dispersiones FF3 se multiplican por un factor de aproximadamente 8,3, a 9,4, entre el medio acuoso y oleoso para las dos condiciones de campo/frecuencia de 473,5 kHz, 13,36 kA.m-1. Para un tiempo de inducción de 10 segundos, la temperatura de la dispersión acuosa de FF3 aumenta aproximadamente 3,5 °C, mientras que para las mismas nanopartículas resultantes de FF3 funcionalizadas con DOPA y dispersadas en Miglyol M840®, el aumento de la temperatura es aproximadamente de 11 a 12 veces mayor. Los ferrofluidos oleosos tienen, por tanto, el potencial de reducir drásticamente los tiempos de tratamiento por inducción.

La realización de varios ciclos de calentamiento por inducción demostró que las dispersiones soportaban el aumento local de temperatura de las nanopartículas sin que se produjera ningún cambio en las propiedades de las nanopartículas ni de la fase oleosa. No hay degradación de las moléculas de fosfolípido en la superficie de las nanopartículas. Esta propiedad puede resultar interesante a la hora de considerar la necesidad de multiplicar las secuencias del tratamiento de hipertermia magnetoinducida.

También se midieron los valores de la SAR variando el volumen de dispersión de las nanopartículas FF3 (5 g/kg) de 500 |jl a 1 |jl, en agua y en aceite (Miglyol M840®) a partir de los perfiles de temperatura representados en las figuras 7A, 7B y 7C.

El poder termógeno de las dispersiones, así como el valor de la meseta de temperatura, disminuyen con el volumen de las dispersiones debido a las pérdidas térmicas, que se vuelven cada vez más preponderantes a medida que aumenta la relación superficie/volumen. Para las dispersiones oleosas, las pérdidas térmicas son mucho menores que en el caso del ferrofluido acuoso debido a su menor conductividad térmica y a la ausencia de fenómenos endotérmicos como la evaporación. Para unos volúmenes de 200 y 500 jl, la potencia calorífica todavía es bastante elevada, 9 veces mayor que la de las dispersiones acuosas, y no se observa ningún escalón de temperatura para estas condiciones de medición. Los escalones de temperatura de 85 °C y 75 °C se alcanzaron con bastante rapidez (2-3 minutos) para los volúmenes de 50 y 10 jl, respectivamente, debido a que los valores de la SAR seguían siendo muy elevados. Los valores de meseta y, sobre todo, los valores de la SAR siguen siendo más elevados, por un factor de aproximadamente 5 a 10, con respecto a los de las dispersiones acuosas de FF3. La dispersión FF3 en Miglyol M840® muestra así unos valores de la SAR muy elevados incluso para volúmenes pequeños de hasta 10 jl. El valor de la SAR para un volumen de 1 j l se mide depositando el ferrofluido directamente en el extremo de la sonda. La temperatura inicial es, por tanto, la temperatura ambiente (T0 = 25 °C). La SAR de 65 W/g sólo es medible para la dispersión de FF3 en Miglyol M840®. La evaporación del agua, manifestada por un descenso de 7 °C en la temperatura del medio, es demasiado rápida para medir la SAR de la dispersión acuosa FF3 para este volumen. La figura 8 representa el perfil cinético de temperatura para un volumen de 1 j l de dispersión FF3 dispersada en Miglyol M840® utilizada para los experimentos con animales de termoablación de tumores mediante hipertermia magnética presentados en el ejemplo 6. La dispersión de la concentración en masa de óxido de hierro Fe2O3 es de 300 g/l (T0 = 25°C, temperatura ambiente) presenta un perfil cinético de calentamiento con un aumento de temperatura de 75 °C en 20 s para un valor de la SAR de 53 W/g. Esta dispersión, concentrada a 300 g/l, permite aumentos locales de temperatura muy rápidos, incluso para volúmenes muy pequeños, del orden de jl, que puede contribuir a mejorar la precisión del tratamiento de termoablación de tumores de pequeños volúmenes.Ejemplo 5: preparación de nanoemulsiones a partir de ferrofluido oleoso

Las nanopartículas magnéticas FF1 funcionalizadas con DOPA obtenidas en el apartado 2.1.1 con una densidad de recubrimiento de 1,12 moléculas/nm2 se dispersan en la fase oleosa constituida por Miglyol 840. La fase oleosa que contiene las nanopartículas de óxido de hierro dispersas se utiliza directamente sola, en cuyo caso constituye el 100 % de la fase oleosa de la nanoemulsión, o puede diluirse previamente con Miglyol 840 para constituir 1/3 o 2/3 de la masa total de la fase lipófila de la nanoemulsión.

Las nanoemulsiones se preparan mezclando opcionalmente la fase lipófila (Miglyol 840) con el ferrofluido oleoso para obtener una mezcla homogénea en la que se dispersa la lecitina de huevo E80 en caliente (70 °C). La fase acuosa, previamente calentada a la misma temperatura, se mezcla con el cotensioactivo (polisorbato 80). La emulsificación y la homogeneización se consiguen en una única etapa mediante la inversión de fases utilizando un homogeneizador ultrasónico durante 10 minutos. Tras obtener la nanoemulsión, ésta se mantiene estable después de bajar la temperatura, particularmente a una temperatura de 20 °C.

En las siguientes tablas 12 a 16 siguientes se detallan ejemplos de composiciones de nanoemulsiones 1 a 5, en las que los porcentajes son porcentajes en masa con respecto al peso total de la nanoemulsión.

[Tabla 12]

[Tabla 13]

[Tabla 14]

[Tabla 15]

[Tabla 16]

Las mediciones del potencial zeta (PZ) se realizan diluyendo la muestra a 1/1000 en agua desionizada. El valor de PZ se determina mediante electroforesis y detección con láser Doppler utilizando un aparato Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments SA), Worcestershier, Reino Unido). Las características granulométricas (diámetro hidrodinámico medio, índice de polidispersidad (PDI) y potencial zeta (PZ) de los ejemplos se indican en la siguiente tabla 17:

[Tabla 17]

En la figura 9 se compara el poder termógeno de las nanoemulsiones 1 y 4, que presentan la misma concentración de óxido de hierro en el ferrofluido FF1 (CFe2O3 = 12 g/l, T0 = 37 °C) por inducción a 473,5 KHz, 13,36 kA/m.

Con la misma concentración de ferrofluido pero con un mayor porcentaje de fase oleosa, se mejora el calentamiento (comparación de las nanoemulsiones 1 y 4).

Ejemplo 6: termoablación de tumores subcutáneos mediante hipertermia magnética

Se ha evaluado la eficacia del ferrofluido oleoso según el ejemplo 2.1.4, compuesto por nanopartículas magnéticas FF3 funcionalizadas con DOPA en Miglyol M840®, para la termoablación por hipertermia magnética de tumores en ratones.

Para controlar la distribución del producto en el medio tumoral, previamente se incorporó en el ferrofluido oleoso un fluoróforo lipófilo que emite en el infrarrojo cercano: yoduro de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (DiR). El máximo de emisión de este fluoróforo está en 780 nm.

Los ratones del ensayo son ratones albinos B6 (B6N-Tyrc-Brd/BrdCrCrl) portadores de un tumor RM1-CMV-LucF implantado subcutáneamente en una pata. Los volúmenes tumorales se estimaron a partir de las dimensiones L y l medidas con un calibre digital y se calcularon mediante la fórmula de Feldman: Volumen = n/6 *f* (L x l)3/2 conf= 1,58 para los ratones hembra. Los diferentes volúmenes se estimaron así en aproximadamente 170±20mm3 dependiendo del espécimen.

Teniendo en cuenta el tamaño de los tumores, los experimentos se llevaron a cabo mediante microinyecciones intratumorales de ferrofluido oleoso con una concentración de óxido de hierro de 300 pg/pl. Los ferrofluidos oleosos se inyectaron directamente en el tumor. Las inyecciones se realizaron con una jeringa Hamilton de 10 pl provista de una aguja biselada (calibre 26), bajo anestesia con isoflurano y, a continuación, se coloca a los ratones en una cama caliente bajo las bobinas de inducción. Se realizó un único tratamiento de inducción a 473,5 kHz y 13,36 kA.irr1 durante 15 minutos para cada ratón.

En un primer experimento, se realizó una inyección intratumoral de 2 pl de ferrofluido oleoso FF3 (300 pg/pl en óxido de hierro, es decir, una masa de 600 pg) a una profundidad de 2,5 mm en un nuevo espécimen, dividida en dos dosis de 1 pl con un minuto de espera entre las dos inyecciones (realizadas en el mismo punto de inyección). Después de la última inyección, se aplica de nuevo un tiempo de espera de un minuto antes de retirar la aguja. La dosis térmica disipada por las nanopartículas en el volumen tumoral (Qv) puede calcularse, como primera aproximación, según la fórmula: Q<v>= mP (Fe2O3) * SAR(1 pl) * t / Vtumor. En estas condiciones operativas, la dosis térmica Qv = 0,17 J/mm3. Se tomaron imágenes de bioluminiscencia y de fluorescencia tras la inyección, antes del tratamiento de inducción y 24 h después. Como se ilustra en la figura 10A, se observa claramente una zona de termoablación en el centro del tumor. Durante la aplicación del campo magnético alterno, la diferencia de temperatura medida por la cámara térmica fue de 3 °C. El crecimiento tumoral, medido por integración de la bioluminiscencia 24 h después, se ha ralentizado. Las imágenes de fluorescenciaex vivotras la resección del tumor muestran la localización de la zona de inyección del ferrofluido. La imagen de bioluminiscenciaex vivoindica una pérdida de viabilidad de las células cancerosas en el lugar donde se inyectó el ferrofluido (figura 10B).

En un segundo experimento, se realizaron inyecciones múltiples de tres veces 1 |jl de ferrofluido oleoso FF3 (300 jg /jl, es decir, una masa de 900 jg ) a una profundidad de 2,5 mm, distribuidas en tres zonas distintas del tumor (figura 11A). En cada inyección, se aplicó un tiempo de espera de un minuto antes de retirar la aguja. En estas condiciones operativas, la dosis térmica Qv = 0,25 J/mm3 24 h después de la aplicación del campo magnético alterno (AT “ 20 °C), se pueden distinguir fácilmente las zonas en las que se ha resecado el tumor en las proximidades de las zonas en las que se inyectó el ferrofluido. Las medicionesex vivoconfirman la resecación parcial del tumor en las zonas tratadas (figura 11B).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Ferrofluido oleoso biocompatible que comprende nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, caracterizado por que dichas nanopartículas magnéticas están funcionalizadas en la superficie por moléculas de uno o varios fosfolípidos.

2. Ferrofluido oleoso biocompatible según la reivindicación 1 que comprende nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro y una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso, formando dichas nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro una dispersión coloidal en dicha fase oleosa a partir de una temperatura comprendida en el intervalo de 20 a 80 °C, caracterizado por que dichas nanopartículas magnéticas están funcionalizadas en la superficie por moléculas de uno o varios fosfolípidos que no recubren completamente la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro, y, en particular, que aseguran una tasa de recubrimiento de la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro tal que el éster o los ésteres de ácido graso presentes en la fase oleosa tengan acceso a la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro.

3. Ferrofluido oleoso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que está exento de agua y/o de tensioactivos.

4. Ferrofluido oleoso según una de las reivindicaciones 1 a 3, las moléculas de fosfolípido(s) aseguran un recubrimiento del 19 al 76 %, preferentemente del 29 al 76 % y más preferentemente del 34 al 50 %, de la superficie de las nanopartículas magnéticas a base de óxido de hierro.

5. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la densidad superficial de injerto de las nanopartículas magnéticas por las moléculas de fosfolípido(s) sobre ellas está comprendido en el intervalo de 0,32 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2, preferentemente de 0,48 moléculas/nm2 a 1,22 moléculas/nm2 y más preferentemente de 0,56 moléculas/nm2 a 0,79 moléculas/nm2.

6. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el fosfolípido o los fosfolípidos contienen al menos una cadena grasa, preferentemente 2 cadenas grasas, en particular cadenas de hidrocarburos, saturados o mono- o poliinsaturados, ramificados o preferentemente lineales, C6-C30, y preferentemente C8-C24, incluso C10-C22, y en particular C18.

7. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la fase oleosa comprende al menos un 70 % en masa de éster(es) de ácido graso, preferentemente, la fase oleosa comprende del 80 % al 95 % en masa de éster(es) de ácido graso, con respecto a la masa total de la fase oleosa.

8. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el éster o los ésteres de ácido graso de la fase oleosa se eligen entre triglicéridos de ácido graso saturados C6-C12, preferentemente C6-C10, propilenglicoles de ácido graso saturados C6-C12, preferentemente C6-C10, utilizados solos o en mezclas.

9. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el contenido de nanopartículas magnéticas está comprendido en el intervalo del 0,01 % al 50 % en masa, preferentemente del 0,1 % al 10 % en masa, con respecto a la masa total de ferrofluido oleoso.

10. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las nanopartículas magnéticas tienen forma de esferoide, de poliedro, tal como nanocubos, bipirámides o nanoestrellas, de tableta, de nanobastoncillo, de nanodisco o de nanoflor.

11. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el o los fosfolípidos presentan una cabeza polar -O(O)P(OH)O- y, es o son, preferentemente, elegidos entre sales del ácido 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatídico y del ácido 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatídico.

12. Ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además un principio activo lipófilo, en particular, elegido entre antineoplásicos, tales como paclitaxel, docetaxel o carmustina.

13. Procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende las siguientes etapas sucesivas:

c - obtener un sol coloidal de nanopartículas magnéticas mediante la adición de un disolvente o una mezcla de disolventes orgánicos volátiles (S2),

e - eliminar dicho o dichos disolventes orgánicos volátiles (S2) y dispersar las nanopartículas magnéticas funcionalizadas en una fase oleosa que contiene al menos un éster de ácido graso.

14. Procedimiento de preparación de un ferrofluido oleoso según la reivindicación 13, que comprende una etapa c2, posterior a la etapa c y anterior a la etapa d, de adición de ácido.

15. Medicamento que comprende un ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o un ferrofluido oleoso obtenido según el procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14.

16. Nanoemulsión de aceite en agua que comprende del 10 % al 30 % en masa de un ferrofluido oleoso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o de un ferrofluido oleoso obtenido según el procedimiento de preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, a una fase acuosa, y al menos, a un tensioactivo.

17. Producto de contraste que comprende un ferrofluido oleoso biocompatible según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Ferrofluido oleoso biocompatible según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o ferrofluido oleoso biocompatible obtenido según el procedimiento según las reivindicaciones 13 o 14, para su utilización durante un tratamiento del cáncer mediante hipertermia desencadenada por inducción magnética.