ES2967620T3 - Alfa-glucosidasa ácida altamente potente con carbohidratos potenciados - Google Patents

Abstract

Composición de alfa glucosidasa humana recombinante (rhGAA) derivada de células CHO que contiene una composición de glucanos más optimizada que consiste en una mayor cantidad de rhGAA que contiene N-glicanos que transportan manosa-6-fosfato (M6P) o bis-M6P que los rhGAA convencionales, junto con baja cantidad de glicanos con alto contenido de manosa no fosforilados y baja cantidad de galactosa terminal en oligosacáridos complejos. Se describen composiciones que contienen rhGAA y métodos de uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Alfa-glucosidasa ácida altamente potente con carbohidratos potenciados

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención

La presente invención implica los campos de la medicina, la genética y la bioquímica de glicoproteínas recombinantes y, específicamente, se refiere a composiciones de alfa-glucosidasa humana recombinante (rhGAA) que tienen un contenido total mayor de glicanos que portan manosa-6-fosfato que seleccionan como diana de manera eficiente CIMPR en células musculares y posteriormente suministran rhGAA a los lisosomas, donde pueden disminuir los niveles anómalamente altos de glicógeno acumulado. La rhGAA de la invención presenta un direccionamiento superior a células musculares y un suministro posterior a lisosomas en comparación con los productos de rhGAA convencionales y presenta otras propiedades farmacocinéticas que la hacen particularmente efectiva para la terapia de reemplazo enzimático de sujetos que tienen la enfermedad de Pompe.

Descripción de la técnica relacionada

Las terapias de reemplazo enzimático existentes para la enfermedad de Pompe usan productos de rhGAA convencionales que tienen un contenido total bajo de glicanos que portan M6P y bis-M6P. Los productos convencionales se conocen bajo los nombres Lumizyme@, Myozyme@ y Alglucosidase alfa. “Lumizyme” y “Myozyme” son formas convencionales de rhGAA producidas o comercializadas como productos biológicos por Genzyme y aprobadas por la Food and Drug Administration de los Estados Unidos y se describen mediante la referencia a la Physician’s Desk Reference (2014) o mediante los productos denominados “Lumizyme®” o “Myozyme®” aprobados para su uso en los Estados Unidos por la FDA desde el 1 de octubre de 2014. Alglucosidase Alfa se identifica como el nombre químico [199-arginina-223-histidina]prepro-a-glucosidasa (humana); fórmula molecular, C<4758>H<7262>N<1274>O<1369>S<35>; número CAS 420794-05-0. Estos productos se administran a sujetos con la enfermedad de Pompe, también conocida como enfermedad de almacenamiento de glicógeno tipo II (GSD-II) o enfermedad de deficiencia de maltasa ácida. La terapia de reemplazo enzimático pretende tratar la enfermedad de Pompe reemplazando la GAA ausente en lisosomas administrando rhGAA, restaurando así la capacidad de la célula de romper el glicógeno lisosomal.

La enfermedad de Pompe es un enfermedad almacenamiento lisosomal heredada que resulta de una deficiencia en la actividad a-glucosidasa ácida (GAA). Una persona que tiene la enfermedad de Pompe carece de o tiene niveles reducidos de alfa-glucosidasa ácida (GAA), la enzima que rompe el glicógeno, y una sustancia que usa el cuerpo como fuente de energía. Esta deficiencia enzimática provoca una acumulación de glicógeno en exceso en los lisosomas, que son orgánulos intracelulares que contienen enzimas que rompen de manera ordinaria el glicógeno y otros desechos o productos residuales celulares. La acumulación de glicógeno en ciertos tejidos de un sujeto que tiene la enfermedad de Pompe, especialmente los músculos, altera la capacidad de las células de funcionar normalmente. En la enfermedad de Pompe, el glicógeno no se metaboliza apropiadamente y se acumula progresivamente en los lisosomas, especialmente en células de músculos esqueléticos y, en la forma de aparición infantil de la enfermedad, en células de músculos cardiacos. La acumulación de glicógeno daña las células musculares y nerviosas así como aquellas en otros tejidos afectados.

Tradicionalmente, dependiendo de la edad de aparición, la enfermedad de Pompe se reconoce clínicamente o bien como forma infantil prematura o bien como forma de aparición tardía. La edad de aparición tiende a ir en paralelo con la gravedad de la mutación genética que provoca la enfermedad de Pompe. Las mutaciones genéticas más graves provocan una pérdida completa de actividad GAA manifiesta como enfermedad de aparición prematura durante la infancia. Las mutaciones genéticas que disminuyen la actividad GAA pero no la eliminan completamente están asociadas con formas de la enfermedad de Pompe que tienen una aparición y una progresión retardadas. La enfermedad de Pompe de aparición infantil se manifiesta poco después del nacimiento y está caracterizada por debilidad muscular, insuficiencia respiratoria y fallo cardiaco. Si no se trata, es habitualmente fatal en el plazo de dos años. La enfermedad de Pompe de aparición juvenil y adulta se manifiesta más tarde en la vida y progresa habitualmente más lentamente que la enfermedad de aparición infantil. Esta forma de la enfermedad, aunque generalmente no afecta al corazón, también puede dar como resultado la muerte, debido a un debilitamiento de los músculos esqueléticos y aquellos implicados en la respiración.

El tratamiento no paliativo actual de la enfermedad de Pompe implica la terapia de reemplazo enzimático (ERT) que usa GAA humana recombinante (rhGAA) tal como Lumizyme® o Myozyme®. La rhGAA se administra en un intento por reemplazar o suplementar la GAA ausente o defectuosa en un sujeto que tiene la enfermedad de Pompe. Sin embargo, dado que la mayoría de la rhGAA en los productos de rhGAA convencionales no selecciona como diana el tejido muscular, se elimina de manera no productiva tras la administración.

Esto sucede porque las rhGAA convencionales carecen de un contenido total alto de glicanos que portan M6P y bis-M6P que dirijan una molécula de rhGAA al CIMPR en células musculares diana, donde se transporta posteriormente al interior de los lisosomas de la célula. Esta absorción celular de rhGAA para la terapia de reemplazo enzimático es facilitada por el carbohidrato especializado, manosa-6-fosfato (M6P), que se une al receptor de manosa-6-fosfato independiente de catión (CIMPR) presente en las superficies celulares para el suministro posterior de la enzima exógena a los lisosomas.

Hay siete sitios de glicosilación ligados a N potenciales en la rhGAA. Dado que cada sitio de glicosilación es heterogéneo en el tipo de oligosacáridos ligados a N (N-glicanos) presentes, la rhGAA consiste en una mezcla compleja de proteínas con N-glicanos que tienen afinidades de unión variables para el receptor de M6P y otros receptores de carbohidratos. La rhGAA que contiene N-glicanos con alto contenido de manosa que tienen un grupo M6P (mono-M6P) se une al CIMPR con afinidad baja (-6.000 nM), mientras que la rhGAA que contiene dos grupos M6P en el mismo N-glicano (bis-M6P) se une con afinidad alta (-2 nM). Estructuras representativas para glicanos mono-M6P y bis-M6P, no fosforilados, se muestran mediante la Fig. 1A. El grupo manosa-6-P se muestra mediante la Fig. 1B. Una vez dentro del lisosoma, la rhGAA puede degradar enzimáticamente el glicógeno acumulado. Sin embargo, las rhGAA convencionales tienen niveles totales bajos de glicanos que portan M6P y bis-M6P y, por tanto, seleccionan como diana las células musculares pobremente danto como resultado un suministro inferior de rhGAA a los lisosomas. La mayoría de las moléculas de rhGAA en estos productos convencionales no tienen N-glicanos fosforilados, careciendo de ese modo de afinidad por el CIMPR. Los glicanos con alto contenido de manosa no fosforilados pueden aclararse también mediante el receptor de manosa, lo que da como resultado un aclaramiento no productivo de la ERT (Fig. 2).

El otro tipo de N-glicanos, carbohidratos complejos, que contienen galactosa y ácidos siálicos también están presentes en la rhGAA. Dado que los N-glicanos complejos no están fosforilados, no tienen afinidad por el CIMPR. Sin embargo, los N-glicanos de tipo complejo con residuos galactosa expuestos tienen una afinidad de moderada a alta por el receptor de asialoglicoproteína en hepatocitos del hígado, lo que conduce a un aclaramiento no productivo rápido de la rhGAA (Fig. 2).

La glicosilación de GAA o rhGAA puede modificarse enzimáticamentein vitromediante la fosfotransferasa y las enzimas de descubrimiento descritas por Canfield,et al.,patente estadounidense n.° 6.534.300, para generar grupos M6P. La glicosilación enzimática no puede controlarse de manera adecuada y produce rhGAA que tiene propiedades inmunológicas y farmacológicas no deseables. La rhGAA modificada enzimáticamente puede contener solo N-glicanos con alto contenido de manosa que podrían todos potencialmente fosforilarse enzimáticamentein vitrocon una enzima fosfotransferasa/de descubrimiento y puede contener en promedio 5-6 grupos M6P por GAA. Los patrones de glicosilación producido mediante el tratamiento enzimáticoin vitrode GAA son problemáticos porque los residuos manosa terminales adicionales, particularmente los residuos manosa terminales no fosforilados, afectan negativamente a la farmacocinética de la rhGAA modificada. Cuando un producto modificado enzimáticamente de este tipo se administrain vivo,estos grupos manosa aumentan el aclaramiento no productivo de la GAA, aumentan las absorción de la GAA modificada enzimáticamente mediante células inmunitarias y reducen la eficacia terapéutica de la rhGAA debido a que menos de la GAA alcanza tejidos seleccionados como diana, tales como miocitos de músculos cardiacos o esqueléticos. Por ejemplo, los residuos manosa no fosforilados terminales son ligandos conocidos para receptores de manosa en el hígado y el bazo, lo que conduce a un rápido aclaramiento de la rhGAA modificada enzimáticamente y un direccionamiento reducido de rhGAA a tejido seleccionado como diana. Además, el patrón de glicosilación de GAA modificada enzimáticamente que tiene N-glicanos con alto contenido de manosa con residuos manos no fosforilados terminales se asemeja al de glicoproteínas producidas en levaduras, mohos y funcionan aumentado el riesgo de desencadenar respuestas inmunes o alérgicas, tales como reacciones de hipersensibilidad o alérgicas (anafilácticas) graves potencialmente mortales, para la rhGAA modificada enzimáticamente.

Como se ha explicado anteriormente, los productos de rhGAA convencionales tales como Lumizyme® tienen niveles bajos de glicanos monofosforilados y glicanos bisfosforilados incluso menores. Con el fin de que una terapia para la enfermedad de Pompe sea eficaz, la rhGAA tiene que suministrarse a los lisosomas en células musculares. La cantidad total baja de grupos de selección como diana de mono-M6P y bis-M6P en rhGAA convencional limita la absorción celular por medio del CIMPR y el suministro lisosomal, haciendo por tanto que la terapia de reemplazo enzimático convencional sea ineficiente. Por ejemplo, aunque los productos de rhGAA convencionales a 20 mg/kg o dosis mayores mejoran algunos aspectos de la enfermedad de Pompe, no son capaces de reducir adecuadamente el glicógeno acumulado en muchos tejidos diana, particularmente músculos esqueléticos para invertir la progresión de la enfermedad.

Debido a la ineficiencia de suministrar terapias de reemplazo enzimático convencionales a los lisosomas, tales terapias están asociadas a menudo con otros problemas, incluyendo la generación de respuestas inmunitarias a GAA. Una gran porción de la GAA en una rhGAA convencional no contiene glicanos que portan mono- o bis-M6P, que direccionan la rhGAA a células musculares. El sistema inmune de un sujeto está expuesto a esta GAA no fosforilada en exceso y puede generar respuestas inmunitarias perjudiciales que reconocen GAA. La inducción de una respuestas inmunitarias a la GAA no fosforilada que no entra en los tejidos diana y se suministra a los lisosomas aumenta el riesgo de fallo del tratamiento debido a la inactivación inmunológica de la rhGAA administrada y aumenta el riesgo de que el paciente experimente reacciones autoinmunes o alérgicas perjudiciales al tratamiento con rhGAA. La rhGAA según la invención contiene significativamente menos de esta rhGAA no fosforilada, no direccionada, reduciendo así la exposición del sistema inmune de un paciente a la misma.

Logísticamente, dosis más grandes imponen cargas adicionales al sujeto así como a los profesionales médicos que tratan al sujeto, tal como el alargamiento del tiempo de infusión necesario para administrar rhGAA por vía intravenosa. Esto se debe a que las rhGAA convencionales contienen un contenido mayor de rhGAA no fosforilada que no selecciona como diana el CIMPR en células musculares. La rhGAA que no se une al CIMPR en células musculares y entonces entra en el lisosoma no degrada enzimáticamente el glicógeno en el mismo. Cuando se administran dosis equivalentes de una rhGAA convencional y la rhGAA según la invención, más rhGAA en la composición según la invención se une a CIMPR en células musculares y entonces se suministra al lisosoma. La rhGAA de la invención proporcionar a un doctor la opción de administrar una cantidad menor de rhGAA al tiempo que se suministra lo mismo o más de rhGAA al lisosoma.

Los proceso de fabricación actuales usados para elaborar rhGAA convencional, tal como Myozyme@, Lumizyme@ o Alglucosidase Alfa, no han aumentado significativamente el contenido de M6P o bis-M6P porque el procesamiento de carbohidratos celular es complejo de manera natural y extremadamente difícil de manipular. En vista de estas deficiencias de los productos de rhGAA convencionales, los inventores han buscado diligentemente e identificado modos para direccionar eficientemente rhGAA a células musculares y suministrarla al lisosoma, minimizar el aclaramiento no productivo de rhGAA una vez administrada y por tanto direccionar de manera más productiva rhGAA a tejido muscular.

MCVIE-WYLIE A JET AL,“Biochemical and pharmacological characterization of different recombinant acid alphaglucosidase preparations evaluated for the treatment of Pompe disease”, MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM, ACADEMIC PRESS, ÁMSTERDAM, NL, vol. 94, n.° 4, doi:10.1016/J.YMGME.2008.04.009, ISSN 1096-7192, (20080801) describen un estudio que evaluó las eficacias relativas en un modelo de ratón deficiente en GAA de enfermedad de Pompe de una forma producida mediante células CHO convencionales de rhGAA (CHO-GAA), rhGAA producida en la leche de conejos transgénicos (tgGAA) y una forma modificada mediante ingeniería de carbohidratos de la enzima que contiene niveles altos de M6P (HP-GAA).

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En respuesta a los problemas asociados con el direccionamiento y la administración de formas convencionales de rhGAA y a las dificultadas asociadas con la producción de tales formas bien direccionadas de rhGAA, los inventores han investigado y desarrollado procedimientos para elaborar rhGAA que selecciona como diana más eficientemente el CIMPR y la suministran a lisosomas en tejidos musculares porque tiene un contenido mayor de glicano M6P que las composiciones de rhGAA convencionales. Además, la rhGAA de la invención tiene N-glicanos de tipo complejo bien procesados que minimizan el aclaramiento no productivo de la rhGAA mediante tejidos no diana.

Teniendo en cuenta los problemas asociados con los tratamientos de reemplazo enzimático actuales que usan productos de rhGAA convencionales tales como Lumizyme®, a través de un estudio y una investigación diligentes, los inventores han desarrollado un método para producir rhGAA en células CHO que tienen un contenido total significativamente mayor de glicanos mono-M6P y bis-M6P que seleccionan como diana CIMPR en células musculares y entonces suministran la rhGAA a los lisosomas.

La rhGAA producida mediante este método también tiene propiedades farmacocinéticas ventajosas en virtud de su patrón de glicosilación global que aumenta la absorción en el tejido diana y disminuye el aclaramiento no productivo tras la administración a un sujeto que tiene enfermedad de Pompe.

Por tanto, según la presente invención, se proporciona una composición que comprende rhGAA tal como se define en la reivindicación 1 adjunta. Aspectos preferidos de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

Los inventores muestran que la rhGAA de la invención, tal como se ejemplifica mediante la rhGAA designada ATB-200, es más potente en y más eficiente a la hora de seleccionar como diana tejidos musculares esqueléticos que la rhGAA convencional tal como Lumizyme®. La rhGAA según la invención tiene una capacidad superior para seleccionar como diana de manera productiva tejidos musculares en pacientes que tienen la enfermedad de Pompe y reducir el aclaramiento no productivo de rhGAA tal como se ilustra mediante la Fig. 2.

La rhGAA superior según la invención puede completarse adicionalmente o combinarse con chaperonas o conjugarse con otros grupos que seleccionan como diana el CIMPR en tejido muscular, tal como porciones de IGF2 que se unen a este receptor. Los ejemplos más adelante muestran que la rhGAA de la invención, ejemplificada mediante rhGAA ATB-200, supera el estándar de atención existente para terapia de reemplazo enzimático proporcionando un aclaramiento de glicógeno significativamente mejor en músculo esquelético en comparación con el régimen existente que usa el producto de rhGAA convencional Lumizyme®.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

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Fig. 1 La Fig. 1A muestra un glicano con alto contenido de mañosa no fosforilada, un glicano mono-M6P y un glicano bis-M6P. La Fig. 1B muestra la estructura química del grupo M6P.

Fig. 2 La Fig. 2A describe el direccionamiento productivo de rhGAA por medio de glicanos que portan M6P a tejidos diana (por ejemplo, tejidos musculares de un sujeto con enfermedad de Pompe). La Fig. 2B describe el aclaramiento de fármaco no productivo con respecto a tejidos no diana (por ejemplo, hígado y bazo) o mediante la unión de glicanos no M6P a tejidos no diana.

Fig. 3 La Fig. 3A representa gráficamente un receptor CIMPR (también conocido como receptor de IGF2) y dominios de este receptor. La Fig. 3B es una tabla que muestra la afinidad de unión (nMolar) de glicanos que portan bis- y mono-M6P para CIMPR, la afinidad de unión de glicanos de tipo con alto contenido de manosa a receptores de manosa, y la afinidad de unión de glicano complejo desialado para receptores de asialioglicoproteína. La rhGAA que tiene glicanos que portan M6P y bis-M6P puede unirse de manera productiva a CIMPR en células diana musculares. La rhGAA que tiene glicanos con alto contenido de manosa y glicanos desialilados puede unirse de manera no productiva a células no diana que portan los receptores correspondientes.

Fig. 4 Las Figs. 4A y 4B, respectivamente, muestran los resultados de cromatografía de afinidad de CIMPR de Lumizyme@ y Myozyme@. Las líneas discontinuas hacen referencia al gradiente de elución de M6P. La elución con M6P desplaza las moléculas de GAA unidas por medio de un glicano que contiene M6P a CIMPR. Como se muestra en la Fig. 4A, el 78% de la actividad GAA en Lumizyme@ se eluyó antes de la adición de M6P. La Fig. 4B muestra que el 73% de la actividad GAA en Myozyme@ se eluyó antes de la adición de M6P. Solo el 22% o el 27% de la rhGAA en Lumizyme@ o Myozyme, respectivamente, se eluyó con M6P. Estas figuras muestran que la mayoría de la rhGAA en estos dos productos de rhGAA convencionales carece de glicanos que tienen M6P necesario para seleccionar como diana CIMPR en tejidos musculares diana.

Fig. 5 Un constructo de ADN para transformar células CHO con ADN que codifica rhGAA. Células CHO se transformaron con un constructo de ADN que codifica rhGAA (SEQ ID NO: 4).

Fig. 6 Las Figs. 6A y 6B muestran los resultados de cromatografía de afinidad de CIMPR de Myozyme y rhGAA ATB-200. Como resulta evidente a partir de la Fig. 6B, aproximadamente el 70% de la rhGAA en rhGAA ATB-200 contenía M6P.

Fig. 7 Purificación de rhGAA ATB-200, realización 1 y 2.

Fig. 8 Perfiles de elución en Polywax de Lumizyme@ y rhGAA ATB-200.

Fig. 9 Sumario de estructuras de N-glicano de Lumizyme@ en comparación con tres preparaciones diferentes de ATB200 rhGAA, identificadas como BP-rhGAA, ATB200-1 y ATB200-2.

Fig. 10 La Fig. 10A compara la afinidad de unión a CIMPR de rhGAA ATB-200 (trazo izquierdo) con la de Lumizyme@ (trazo derecho). La Fig. 10B describe el contenido de Bis-M6P de Lumizyme@ y rhGAA ATB-200.

Fig. 11 La Fig. 11A compara la actividad rhGAA de ATB-200 (trazo izquierdo) con la actividad rhGAA de Lumizyme® (trazo derecho) dentro de fibroblastos normales a diversas concentraciones de GAA. La Fig. 11B compara la actividad rhGAA de ATB-200 (trazo izquierdo) con la actividad rhGAA de Lumizyme® (trazo derecho) dentro de fibroblastos de un sujeto que tiene la enfermedad de Pompe a diversas concentraciones de GAA. La Fig. 11C compara (Kabsorción) de fibroblastos de sujetos normales y sujetos con enfermedad de Pompe.

Fig. 12 La Fig. 12A muestra la cantidad de glicógeno en relación con proteína en músculo cardiaco tras el contacto con vehículo (control negativo), con 20 mg/ml de Alglucosidase alfa, o con 5, 10 o 20 mg/kg de rhGAA ATB-200. La Fig. 12B muestra la cantidad de glicógeno en relación con proteína en músculo cuádriceps tras el contacto con vehículo (control negativo), con 20 mg/ml de Lumizyme@, o con 5, 10 o 20 mg/kg de rhGAA ATB-200. La Fig. 12C muestra la cantidad de glicógeno en relación con proteína en músculo tríceps tras el contacto con vehículo (control negativo), con 20 mg/ml de Lumizyme®, o con 5, 10 o 20 mg/kg de rhGAA ATB-200. La rhGAA ATB-200 produjo reducciones de glicógeno significativas en músculo cuádriceps y tríceps en comparación con el control negativo y en comparación con Lumizyme®.

Fig. 13 La estabilidad de rhGAA ATB-200 se mejora en presencia de chaperona AT2221. El primer trazo, izquierdo, en la Fig. 13A muestra el porcentaje de proteína rhGAA ATB-200 desplegada a diversas temperaturas a pH 7,4 (pH de la sangre). El último trazo, derecho, muestra el porcentaje de proteína rhGAA ATB-200 desplegada a diversas temperaturas a pH 5,2 (pH del lisosoma). Los tres trazos intermedios muestran los efectos de 10 gg, 30 gg o 100 gg de chaperona AT2221 sobre el plegado de la proteína. Estos datos muestran que AT2221 impide el despliegue de rhGAA ATB-200 al pH de la sangre en comparación con la muestra control. La mejora de Tm a pH neutro mediante AT2221 se resume en la Figura 13B.

Fig. 14 Esta tabla muestra que la combinación de rhGAA ATB-200 y chaperona AT2221 proporcionó un aclaramiento de glicógeno significativamente mejor en ratones deficientes en GAA que los tratamientos con Lumizyme@ y AT2221 o controles de o bien Lumizyme® o bien rhGAA ATB200 sin la chaperona AT2221.

Fig. 15 Glicógeno residual en músculo cuádriceps tras el tratamiento con Lumizyme, rhGAA ATB-200, o rhGAA ATB-200 y diversas concentraciones de la chaperona AT2221.

Fig. 16 Mejora de la patología de músculo esquelético en ratones tratados con ATB200 Miglustat (AT2221) con respecto a aquellos tratados con ERT sola. Tinción de glicógeno PAS (Fig. 16A) y EM (Fig. 16 B) de tejido muscular de ratones deficientes en GAA tratados con rhGAA convencional o rhGAA ATB-200 y miglustat (AT-2221). Fig. 16C: Evaluación de la proliferación lisosomal mediante el marcador LAMP-1. Fig. 16D Identificación de fibras musculares de tipo I y tipo II.

Fig. 17. Mejora de la patología de músculo esquelético en ratones tratados con ATB-200 Miglustat (AT2221) con respecto a aquellos tratados con ERT sola. Tinción de glicógeno PAS (Fig. 17A) de tejido muscular de ratones deficientes en GAA tratados con rhGAA convencional o rhGAA A<t>B-200 y miglustat (AT-2221). Fig. 17B: Evaluación de la proliferación lisosomal mediante el marcador LAMP-1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones: Los términos usados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados ordinarios en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se discuten a continuación, o en otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar una guía adicional al profesional a la hora de describir las composiciones de la invención y cómo elaborarlas y usarlas.

El término “GAA” se refiere a a-glucosidasa ácida (GAA) humana, una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces a-1,4- y a-1,6-glicosídicos de glicógeno lisosomal así como a variantes insercionales, relacionales o de sustitución de la secuencia de aminoácidos de GAA y fragmentos de una secuencia de GAA más larga que ejercen actividad enzimática. El término “rhGAA” se usa para distinguir GAA endógena de GAA sintética o producida de manera recombinante, tal como aquella producida mediante la transformación de células CHO con ADN que codifica GAA. Una secuencia de ADN a modo de ejemplo que codifica GAA es NP_000143.2 (SEQ ID NO: 4). GAA y rhGAA pueden estar presentes en una composición que contiene una mezcla de moléculas de GAA que tienen diferentes patrones de glicosilación, tal como una mezcla de moléculas de rhGAA que portan grupos mono-M6P o bis-M6P en sus glicanos y moléculas de GAA que no portan M6P o bis-M6P. GAA y rhGAA también pueden completarse con otros compuestos, tales como chaperonas, o pueden unirse a otros radicales en un conjugado de GAA o rhGAA, tal como unirse a un radical IGF2 que direcciona el conjugado a CIMPR y posteriormente lo suministra a los lisosomas.

Un “sujeto” o “paciente” es preferiblemente un humano, aunque también pueden tratarse otros mamíferos y animales no humanos que tengan trastornos que implican la acumulación de glicógeno. Un sujeto puede ser un feto, un neonato, niño, joven o un adulto con enfermedad de Pompe u otro trastorno de almacenamiento o acumulación de glicógeno. Un ejemplo de un individuo que está tratándose es un individuo (feto, neonato, niño, joven, adolescente o humano adulto) que tiene GSD-II (por ejemplo, GSD-II infantil, GSD-II juvenil o GSD-II de aparición adulta). El individuo puede tener actividad GAA residual o actividad no medible. Por ejemplo, el individuo que tiene GSD-II puede tener actividad GAA que es menor de aproximadamente el 1% de la actividad GAA normal (GSD-II infantil), actividad GAA que es aproximadamente el 1-10% de la actividad GAA normal (GSD-II juvenil) o GAA actividad que es aproximadamente el 10-40% de la actividad GAA normal (GSD-II adulta).

Los términos “tratar” y “tratamiento”, tal como se usan en el presente documento, hacen referencia a la mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la prevención o el retardo de la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad, y/o la disminución de la gravedad o la frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, tratamiento puede hacer referencia a la mejora del estado cardiaco (por ejemplo, aumento de los volúmenes diastólicos finales y/o sistólicos finales, o reducción, mejora o prevención de la cardiomiopatía progresiva que se encuentra normalmente en GSD-II) o de la función pulmonar (por ejemplo, aumento en la capacidad vital durante el llanto con respecto a la capacidad de referencia, y/o normalización de la desaturación de oxígeno durante el llanto); mejora en el neurodesarrollo y/o las habilidades motoras (por ejemplo, aumento en la puntuación AIMS); reducción de los niveles de glicógeno en el tejido del individuo afectado por la enfermedad; o cualquier combinación de estos efectos. El tratamiento puede incluir la mejora del estado cardiaco, particularmente en la reducción o prevención de cardiomiopatía asociada con GSD-II.

Los términos “mejorar”, “aumentar” o “reducir”, tal como se usan en el presente documento, indican valores que son relativos a la medición de referencia, tal como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en el presente documento o una medición en un individuo control (o múltiples individuos control) en ausencia del tratamiento descrito en el presente documento. Un individuo control es un individuo aquejado con la misma forma de GSD-II (ya sea de aparición infantil, juvenil o adulta) que el individuo que está tratándose, que tiene aproximadamente la misma edad que el individuo que está tratándose (para garantizar que las fases de la enfermedad en el individuo tratado y el/los individuo(s) control son comparables).

El término “purificado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a material que se ha aislado en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, contaminantes, incluyendo materiales nativos a partir de los que se obtiene el material. Por ejemplo, una proteína purificada está de manera preferible sustancialmente libre de otras proteínas o ácidos nucleicos con los que esté asociada en una célula; una molécula de ácido nucleico purificada está de manera preferible sustancialmente libre de proteínas u otras moléculas de ácido nucleico no relacionadas con las que pueda encontrarse dentro de una célula. Tal como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente libre” se usa operativamente, en el contexto de pruebas analíticas del material. Preferiblemente, un material purificado sustancialmente libre de contaminantes es puro al menos al 95%; más preferiblemente, puro al menos al 97%, y más preferiblemente todavía puro al menos al 99%. La pureza puede evaluarse mediante cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de composición, ensayo biológico, ensayo enzimático y otros métodos conocidos en la técnica. Purificado puede significar que el nivel de contaminantes está por debajo de un nivel aceptable para las autoridades regulatorias para una administración seguirá a un humano o animal no humano. Proteínas recombinantes pueden aislarse o purificarse a partir de células CHO usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo mediante separación cromatográfica por tamaño, cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio aniónico.

El término “modificada genéticamente” o “recombinante” se refiere a células, tales como células CHO, que expresan un producto génico particular, tal como rhGAA o rhGAA ATB-200, tras la introducción de un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante que codifica el producto génico, junto con elementos reguladores que controlan la expresión de la secuencia codificante. La introducción del ácido nucleico puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica incluyendo el direccionamiento génico y la recombinación homóloga. Tal como se usa en el presente documento, el término incluye también células que se han modificado mediante ingeniería para expresar o sobreexpresar un gen o producto génico endógeno que no se expresa normalmente por tal célula, por ejemplo, mediante tecnología de activación génica.

La “enfermedad de Pompe” se refiere a una LSD recesiva autosómica caracterizada por una actividad alfa-glucosidasa ácida (GAA) deficiente que altera el metabolismo lisosomal de glicógeno. La deficiencia enzimática conduce a la acumulación lisosomal de glicógeno y da como resultado una debilidad del músculo esquelético progresiva, una función cardiaca reducida, insuficiencia respiratoria y/o alteración del SNC en fases tardías de la enfermedad. Las mutaciones genéticas en el gen GAA dan como resultado o bien una expresión menor o bien producen formas mutantes de la enzima con estabilidad y/o actividad biológica alteradas que conducen en última instancia a la enfermedad (véase en general Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid a-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriveret al.,eds., McGraw-Hill, Nueva York, 7a ed., páginas 2443-2464). Las tres formas clínicas reconocidas de la enfermedad de Pompe (infantil, juvenil y adulta) están correlacionadas con el nivel de actividad a-glucosidasa residual (Reuser A Jet al.,1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). La enfermedad de Pompe infantil (tipo I o A) es la más común y la más grave, caracterizada por fallo para crecer, hipertrofia cardiaca, hipotónica generalizada, y fallo cardiorrespiratorio en el segundo año de vida. La enfermedad de Pompe juvenil (tipo II o B) es intermedia en gravedad y está caracterizada por una predominancia de síntomas musculares sin cardiomegalia. Los individuos con Pompe juveniles habitualmente mueren antes de alcanzar los 20 años de edad debido a fallo respiratorio. La enfermedad de Pompe adulta (tipo III o C) se presenta a menudo como una miopatía lentamente progresiva en los años de la adolescencia o tan tarde como en la sexta década (Felicia K Jet al.,1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135). En Pompe, se ha mostrado que la a-glucosidasa se modifica extensamente postraduccionalmente mediante glicosilación, fosforilación y procesamiento proteolítico. La conversión del precursor de 110 Kilodaltons (kids) a formas maduras de 76 y 70 kids mediante proteólisis en el lisosoma se requiere para una catálisis de glicógeno óptima. Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad de Pompe” se refiere a todos los tipos de enfermedad de Pompe. Las formulaciones y los regímenes de dosificación dados a conocer en esta solicitud pueden usarse para tratar, por ejemplo, enfermedad de Pompe de tipo I, tipo II o tipo III.

Realizaciones no limitativas de la invención

Una composición de rhGAA derivada de células CHO que contiene una cantidad mayor de rhGAA que contiene N-glicanos que portan mono-manosa-6-fosfato (M6P) que la rhGAA convencional tal como se ejemplifica mediante Lumizyme@ (Alglucosidase Alfa; CAS 420794-05-0). Una composición de rhGAA a modo de ejemplo según la invención es ATB-200 (denominada en ocasiones ATB-200, ATB-200 o CBP-rhGAA) que se describe en los ejemplos. Se ha mostrado que la rhGAA de la invención (ATB-200) se une al CIMPR con alta afinidad(Kd ~2-4 nM) y se internaliza eficientemente mediante fibroblastos y mioblastos de músculo esquelético de Pompe(Kabsorción~ 7-14 nM). ATB-200 se caracterizóin vivoy mostró que tenía una semivida en plasma aparente más corta (t<1/2>~ 45 min) que la ERT de rhGAA actual (t<1/2>~ 60 min).

La secuencia de aminoácidos de la rhGAA puede ser idéntica al menos al 70%, al 75%, al 80%, al 85%, al 95% o al 99%, o contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más deleciones, sustituciones o adiciones con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 1, 3 o 4. En algunos casos de la GAA o rhGAA, tal como en rhGAA ATB-200, la GAA o rhGAA comprenderá una secuencia de aminoácidos de GAA de tipo silvestre tal como la de SEQ ID NO: 1 o 3. En otros casos no limitativos, la rhGAA comprende un subconjunto de los residuos de aminoácido presentes en una GAA de tipo silvestre, incluyendo el subconjunto los residuos de aminoácido de la GAA de tipo silvestre que forman el sitio activo para la unión al sustrato y/o la reducción del sustrato. En un caso, la rhGAA es glucosidasa alfa, que es la enzima a-glucosidasa ácida (GAA) humana, codificada por los más predominantes de nueve haplotipos observados de este gen. La rhGAA de la invención, incluyendo rhGAA ATB-200, puede comprender una secuencia de aminoácidos que es idéntica al 90%, al 95%, al 96%, al 97%, al 98% o al 99% a la secuencia de aminoácidos de alfa-glucosidasa humana, tal como la facilitada por el número de registro AHE24104.1 (GI:568760974)(SEQ ID NO: 1) y que se incorpora como referencia con respecto a la patente estadounidense n.° 8.592.362 o con respecto a la secuencia de aminoácidos de NP_000143.2 (SEQ ID NO: 4). Una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos para GAA se facilita también mediante las SEQ ID NOS: 2 y 3, respectivamente. Las variantes de esta secuencia de aminoácidos incluyen también aquellas con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más deleciones, inserciones o sustituciones de aminoácido con respecto a la secuencia de aminoácidos de GAA más adelante. Las secuencias de polinucleótido que codifican GAA y tales GAA humanas variantes también se contemplan y pueden usarse para expresar recombinantemente rhGAA.

Diversos algoritmos y/o programas de alineación pueden usarse para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse con, por ejemplo, ajuste por defecto. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen una identidad de al menos el 70%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% con respecto a polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que presentan de manera preferible sustancialmente las mismas funciones, así como un polinucleótido que codifica tales polipéptidos. A menos que se indique lo contrario una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades BLASTP. Las “identidades” BLASTP muestran el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y los “positivos” BLASTP muestran el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con respecto a las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento se contemplan y están abarcadas por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótido de polipéptidos similares se deducen usando el código genético y pueden obtenerse mediante medios convencionales, en particular mediante la traducción inversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.

Preferiblemente, no más del 70, del 65, del 60, del 55, del 45, del 40, del 35, del 30, del 25, del 20, del 15, del 10 o del 5% de la rhGAA total en la composición carece de un N-glicano que porta M6P o bis-M6P o carece de una capacidad de unirse al receptor de manosa-6-fosfato independiente de catión (CIMPR). Alternativamente, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 99% <100% o más de la rhGAA en la composición comprende al menos un N-glicano que porta M6P y/o bis-M6P o tiene la capacidad de unirse a CIMPR.

Las moléculas de rhGAA en la composición de rhGAA pueden tener 1, 2, 3 o 4 grupos M6P en sus glicanos. Por ejemplo, solo un N-glicano en una molécula rhGAA puede portar M6P (monofosforilado), un único N-glicano puede portar dos grupos M6P (bisfosforilado), o dos N-glicanos diferentes en la misma molécula rhGAA puede portar grupos M6P individuales. Las moléculas de rhGAA en la composición de rhGAA pueden tener también N-glicanos que no portan ningún grupo M6P. En otro caso, en promedio los N-glicanos contienen más de 3 moles/mol de M6P y más de 4 moles/mol de ácido siálico. En promedio al menos aproximadamente el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% de los glicanos totales en la rhGAA puede estar en forma de un glicano mono-M6P, por ejemplo, aproximadamente el 6,25% de los glicanos totales puede portar un único grupo M6P y en promedio, al menos aproximadamente el 0,5, el 1, el 1,5, el 2,0, el 2,5, el 3,0% de los glicanos totales en la rhGAA está en forma de un glicano bis-M6P y en promedio menos del 25% de la rhGAA total no contiene ningún glicano fosforilado que se une a CIMPR.

La composición de rhGAA según la invención tiene un contenido promedio de N-glicanos que portan M6P que oscila entre 3,0 y 5,0 moles/mol de rhGAA o cualquier valor intermedio de subintervalo incluyendo 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 o 5,0 moles/mol de rhGAA. Como se muestra en los ejemplos, la rhGAA puede fraccionarse para proporcionar composiciones de rhGAA con diferentes números promedio de glicanos que portan M6P o que portan bis-M6P en la rhGAA, permitiendo así una personalización adicional del direccionamiento de rhGAA a los lisosomas en tejidos diana seleccionando una fracción particular o combinando selectivamente diferentes fracciones.

Hasta el 60% de los N-glicanos en la rhGAA pueden estar completamente sialiados, por ejemplo, hasta el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o el 60% de los N-glicanos pueden estar completamente sialiados. En algunas realizaciones desde el 4 hasta el 20% de los N-glicanos totales en la composición de rhGAA están completamente sialilados.

En otros casos no más del 5%, del 10%, del 20% o del 30% de los N-glicanos en la rhGAA portan ácido siálico y una Gal terminal. Esto intervalos incluyen todos los valores y subintervalos intermedios, por ejemplo, del 7 al 30% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición pueden portar ácido siálico y Gal terminal.

En aún otros casos, no más del 5, del 10, del 15, del 16, del 17, del 18, del 19 o del 20% de los N-glicanos en la rhGAA tienen una Gal terminal solo y no contienen ácido siálico. Este intervalo incluye todos los valores y subintervalos intermedios, por ejemplo, desde el 8 hasta el 19% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición pueden tener Gal terminal solo y no contienen ácido siálico.

En la invención, del 40, del 45, del 50, del 55 al 60% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición son N-glicanos de tipo complejo. En algunos casos, no más del 1, del 2, del 3, del 4, del 5, del 6, del 7% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición son N-glicanos de tipo híbrido; no más del 5, del 10 o del 15% de los N-glicanos de tipo con alto contenido de manosa en la rhGAA en la composición son no fosforilados; al menos el 5% o el 10% de los N-glicanos de tipo con alto contenido de manosa en la rhGAA en la composición son mono-M6P fosforilados; y/o al menos el 1 o el 2% de los N-glicanos de tipo con alto contenido de manosa en la rhGAA en la composición son bis-M6P fosforilados. Estos valores incluyen todos los valores y subintervalos intermedios. Una composición de rhGAA puede cumplir uno o más de los intervalos de contenido descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, la composición de rhGAA de la invención portará, en promedio, de 2,0 a 8,0 residuos de ácido siálico por mol de rhGAA. Este intervalo incluye todos los valores y subintervalos intermedios incluyendo 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0 residuos/moles de rhGAA. Los residuos de ácido siálico pueden impedir el aclaramiento no productivo mediante receptores de asialoglicoproteína.

La composición de rhGAA de la invención se produce preferiblemente mediante células CHO, tales como la línea de células CHO GA-ATB-200, o mediante un subcultivo o derivado de un cultivo de células CHO de este tipo. Constructos de ADN, que expresan variantes alélicas de GAA u otras secuencias de aminoácidos de GAA variantes tales como aquellas que son idénticas al menos al 90%, al 95% o al 99% con respecto a SEQ ID NO: 1, pueden construirse y expresarse en células CHO. Los expertos en la técnica pueden seleccionar vectores alternativos adecuados para transformar células CHO para la producción de tales constructos de ADN.

Los inventores han encontrado que rhGAA que tiene una capacidad superior para seleccionar como diana el CIMPR y lisosomas celulares así como patrones de glicosilación que reducen su aclaramiento no productivoin vivopuede producirse usando células de ovario de hámster chino (CHO). Estas células pueden inducirse para expresar rhGAA con niveles significativamente mayores de M6P y bis-M6P total que los productos de rhGAA convencionales. La GAA humana recombinante producida mediante estas células, por ejemplo, tal como se ejemplifica mediante ATB-200 rhGAA descrita en los ejemplos, tiene significativamente más grupos M6P y bis-M6P que seleccionan como diana células musculares que la GAA convencional, tal como Lumizyme®, y se ha mostrado que se une eficientemente a CIMPR y se absorbe eficientemente mediante músculo esquelético y músculo cardiaco. También se ha mostrado que tiene un patrón de glicosilación que proporciona un perfil farmacocinético favorable y reduce el aclaramiento no productivoin vivo.

La rhGAA según la invención puede formularse como composición farmacéutica o usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Pompe u otros estados asociados con una deficiencia de GAA. Las composiciones pueden formularse con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. El portador y la composición pueden ser estériles y por lo demás adaptarse al modo de administración.

Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, disoluciones de sal (por ejemplo, NaCl), solución salina, solución salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, azúcares tales como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas pueden, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo, tensioactivos, tales como polisorbatos como polisorbato 80, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, sustancias colorantes, aromatizantes y/o aromáticas y similares que no reaccionan perjudicialmente con los compuestos activos. Puede usarse un portador soluble en agua adecuado para administración intravenosa.

La composición o el medicamento, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. La composición puede ser una disolución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, pastilla, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. La composición puede formularse también como supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En una realización preferida, la rhGAA se administra mediante infusión IV.

La composición o el medicamento puede formularse según los procedimientos rutinarios como composición farmacéutica adaptada para su administración a seres humanos. Por ejemplo, en un caso preferido, una composición para administración intravenosa es una disolución en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los componentes se suministran o bien por separado o bien se mezclan entre sí en fauno de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo liofilizado secado o concentrado libre de agua en un recipiente sellado herméticamente tal como una ampolla o un sobre que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición deba administrarse mediante infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua de calidad farmacéutica estéril, solución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los componentes puedan mezclarse antes de la administración.

La rhGAA puede formulares como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como aquellas derivadas de hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

La rhGAA (o una composición o un medicamento que contiene GAA) se administra medianite una vía apropiada. En un caso, la GAA se administra por vía intravenosa. En otros casos, la GAA se administra mediante administración directa a un tejido diana, tal como al músculo cardiaco o esquelético (por ejemplo, intramuscular), o al sistema nervioso (por ejemplo, inyección directa al cerebro; por vía intraventricular; por vía intratecal). Más de una vía puede usarse concurrentemente, si se desea.

La rhGAA (o una composición o un medicamento que contiene GAA) se administra en una cantidad terapéuticamente efectiva (por ejemplo, una cantidad de dosificación que, cuando se administra a intervalos regulares, es suficiente para tratar la enfermedad, tal como mejorando síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retardando la aparición de la enfermedad, y/o también disminuyendo la gravedad o la frecuencia de síntomas de la enfermedad, tal como se describió anteriormente). La cantidad que será terapéuticamente efectiva en el tratamiento de la enfermedad dependerá de la naturaleza y el grado de los efectos de la enfermedad, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayosin vitrooin vivopara ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que debe emplearse dependerá también de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse según la evaluación de un profesional y las circunstancias de cada paciente. Las dosis efectivas pueden extrapolarse de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo animal oin vitro.En un caso preferido, la cantidad terapéuticamente efectiva es igual de menos de 20 mg de enzima/kg de peso corporal del individuo, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 1-10 mg de enzima/kg de peso corporal, e incluso más preferiblemente de aproximadamente 10 mg de enzima/kg de peso corporal o aproximadamente 5 mg de enzima/kg de peso corporal. La dosis efectiva para un individuo particular puede variarse (por ejemplo, aumentarse o disminuirse) a lo largo del tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad física o estrés, o si pasan a estar presentes o aumentan anticuerpos anti-GAA, o si empeoran los síntomas de la enfermedad, la cantidad puede aumentarse.

La cantidad terapéuticamente efectiva de GAA (o composición o medicamento que contiene GAA) se administra a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza y el grado de los efectos de la enfermedad, y en una base continua. La administración a un “intervalo regular”, tal como se usa en el presente documento, indica que la cantidad terapéuticamente efectiva se administra periódicamente (a diferencia de una dosis de una vez). El intervalo puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. En casos preferidos, la GAA se administra mensual, bimensualmente; semanalmente; dos veces a la semana; o diariamente. No es necesario que el intervalo de administración para un único individuo sea un intervalo fijo, sino que puede variarse a lo largo del tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad física o estrés, si pasan a estar presentes o aumentan anticuerpos anti-GAA, o si empeoran los síntomas de la enfermedad, puede disminuirse el intervalo entre dosis. En algunos casos, una cantidad terapéuticamente efectiva de 5, 10, 20, 50, 100 o 200 mg de enzima/kg de peso corporal se administra dos veces a la semana, semanalmente o cada dos semanas con o sin una chaperona.

La GAA o rhGAA puede prepararse para su uso posterior, tal como en una jeringa o vial de dosis unitaria, o en una botella o bolsa para administración intravenosa. Los kits que contienen la GAA o rhGAA, así como excipientes opcionales u otros principios activos, tales como chaperonas u otros fármacos, pueden rodearse con material de envasado e ir acompañados por instrucciones para la reconstitución, la dilución o la dosificación para tratar a un sujeto que necesita tratamiento, tal como un paciente que tiene enfermedad de Pompe.

La GAA (o una composición o medicamento que contiene GAA) puede administrarse sola, o junto con otros agentes, tal como una chaperona. Puede administrarse rhGAA con diferentes grados de glicosilación con mono-M6P o bis-M6P o administrarse combinaciones de rhGAA con diferentes grados de glicosilado M6P o bis-M6P.

En algunas realizaciones, la composición de rhGAA de la invención se complejará o mezclará con una chaperona, tal como AT-2220 o AT-2221. Las chaperonas, denominadas en ocasiones “chaperonas farmacológicas”, son compuestos que cuando se complejan o se administran conjuntamente con rhGAA modifican su farmacocinética y otras propiedades farmacológicas. Las chaperonas representativas ejemplificadas en el presente documento incluyen AT2221 (miglustat, N-butil-desoxinojirimicina) y AT2220 (duvoglustat HCl, 1-desoxinojirimicina). Tal complejación o mezclado puede producirse fuera del cuerpo o dentro del cuerpo, por ejemplo, cuando se administran dosificaciones independientes de la rhGAA y chaperona. Por ejemplo, el direccionamiento de rhGAA activa, sus fracciones o derivados a CIMPR y posteriormente a lisosomas celulares puede mejorarse combinándola con duvoglustat-HCl (AT2220, desoxinojirimicinas, AT2220) o miglustat (AT2221, N-butil-desoxinojirimicina). Los ejemplos más adelante muestran reducciones de sustrato de glicógeno significativas en músculos esqueléticos clave de ratones deficientes en GAA que reciben la rhGAA bien direccionada de la invención en combinación con una chaperona.

Otro aspecto de la presente divulgación pertenece a células CHO o sus derivados u otros equivalentes que producen la rhGAA según la invención. Un ejemplo de una línea de células CHO de este tipo es GA-ATB-200 o un subcultivo de la misma que produce una composición de rhGAA tal como se describe en el presente documento. Tales líneas de células CHO pueden contener múltiples copias de un gen, tal como 5, 10, 15 o 20 o más copias, de un polinucleótido que codifica GAA.

La rhGAA con alto contenido de M6P y bis-M6P de la invención, tal como rhGAA ATB-200, puede producirse transformando células CHO (células de ovario de hámster chino) con un constructo de ADN que codifica GAA. Aunque las células CHO se han usado previamente para elaborar rhGAA, no se apreció que las células CHO transformadas podían cultivarse y seleccionarse de un modo que produjese rhGAA que tiene un alto contenido de glicanos M6P y bis-M6P que seleccionan como diana el CIMPR.

Sorprendentemente, los inventores encontraron que era posible transformar líneas de células CHO, seleccionar transformantes que producen rhGAA que contiene un alto contenido de glicanos que portan M6P o bis-M6P que seleccionan como diana el CIMPR, y expresar de manera estable esta rhGAA con alto contenido de M6P. Por tanto, un aspecto relacionado de la presente divulgación se refiere a un método para elaborar estas líneas de células CHO. Este método implica transformar una célula CHO con ADN que codifica GAA o una variante de GAA, seleccionar una célula CHO que integra de manera estable el ADN que codifica GAA en su(s) cromosoma(s) y que expresa de manera estable GAA, y seleccionar una célula CHO que expresa GAA que tiene un alto contenido de glicanos que portan M6P o bis-M6P, y, opcionalmente, seleccionar una célula CHO que tiene N-glicanos con alto contenido de ácido siálico y/o que tiene N-glicanos con un bajo contenido de manosa alta no fosforilada.

Estas líneas de células CHO pueden usarse para producir rhGAA y composiciones de rhGAA según la invención cultivando la línea de células CHO y recuperar dicha composición del cultivo de células CHO.

La composición de rhGAA de la invención o sus fracciones o derivados se usa ventajosamente para tratar sujetos que tienen un estado, trastorno o enfermedad asociado con GAA lisosomal insuficiente administrando la composición de rhGAA. Un sujeto que necesita tratamiento incluye aquellos que tienen enfermedad de almacenamiento de glicógeno tipo II (enfermedad de Pompe) así como otros estados, trastornos o enfermedades que se beneficiarían de la administración de la rhGAA.

Los ejemplos más adelante muestran que la rhGAA de la invención (ATB-200) se absorbe mediante células de músculos esqueléticos, se une a CIMPR y elimina efectivamente el glicógeno de células de músculos esqueléticos cuando se administra a una dosificación significativamente menor que los productos de rhGAA convencionales. Se alcanzó una reducción de hasta el 75% de glicógeno en mioblasto de músculo esquelético en ratones deficientes en GAA usando un régimen bisemanal de administración intravenosa de ATB-200. Estas reducciones superaron las proporcionadas mediante la misma cantidad de Lumizyme@ mostrando que la rhGAA de la invención, que tiene un contenido potenciado de N-glicanos que portan M6P y bis-M6P, proporcionó reducciones superiores en el sustrato de glicógeno. Debido al direccionamiento, la farmacodinámica y la farmacocinética mejorados de la composición de rhGAA de la invención puede administrarse en una dosificación menor que productos de rhGAA convencionales tales como Lumizyme® o Myozyme®.

Puede usarse para degradar, disminuir o eliminar glicógeno de músculo cardiaco, músculo liso o músculo estriado. Los ejemplos de músculos esqueléticos o estriados sujetos a tratamiento incluyen al menos un músculo seleccionado del grupo que consiste en abductor del dedo meñique (pie), abductor del dedo meñique (mano), abductor del dedo gordo, abductor corto del pulgar, abductor largo del pulgar, aductor corto, aductor del dedo gordo, aductor largo, aductor mayor, aductor del pulgar, ancóneo, músculo articular del codo, músculo articular de la rodilla, aritenoepligótico, aryjordanicus, auricular, bíceps braquial, bíceps femoral, braquial, braquiorradial, buccinadores, bulboesponjoso, constrictor faríngeo inferior, constrictor faríngeo medio, constrictor faríngeo superior, coracobraquial, corrugador superciliar, cremáster, cricotiroideo, dartos, transverso profundo del periné, deltoide, depresor del ángulo de la boca, depresor del labio inferior, diafragma, digástrico, digástrico (vista anterior), erector de la columna, erector iliocostal, erector longísimo, extensor radial corto del carpo, extensor radial largo del carpo, extensor ulnar del carpo, extensor del dedo meñique (mano), extensor de los dedos (mano), extensor corte de los dedos (pie), extensor largo de los dedos (pie), extensor largo del dedo gordo, extensor del índice, extensor corto del pulgar, extensor largo del pulgar, oblicuo externo del abdomen, flexor radial del carpo, flexor ulnar del carpo, flexor corto del dedo meñique (pie), flexor corto del dedo meñique (mano), flexor corto de los dedos, flexor largo de los dedos (pie), flexor profundo de los dedos, flexor superficial de los dedos, flexor corto del dedo gordo, flexor largo del dedo gordo, flexor corto del pulgar, flexor largo del pulgar, frontal, gastrocnemio, gemelo inferior, gemelo superior, geniogloso, geniohioideo, glúteo mayor, glúteo medio, glúteo menor, grácil, hiogloso, ilíaco, oblicuo inferior, recto inferior, infraespinoso, intercostales externos, intercostales más internos, intercostales internos, oblicuo interno abdominal, interóseos dorsales de la mano, interóseos dorsales del pie, interóseos palmares de la mano, interóseos plantares del pie, interespinosos, intertransversos, músculos intrínsecos de la lengua, isquiocavernoso, cricoaritenoide lateral, pterigoideo lateral, recto lateral, dorsal ancho, elevador del ángulo de la boca, elevador del ano-coxígeo, elevador del ano-iliocoxígeo, elevador del ano-pubocoxígeno, elevador del ano-puborrectal, elevador del ano-pubovaginal, elevador del labio superior, elevador del labio superior y del ala de la nariz, elevador del párpado superior, elevador de la escápula, elevador del velo del paladar, elevadores de las costillas, largo de la cabeza, largo del cuello, lumbricales del pie (4), lumbricales de la mano, masetero, pterigoideo medial, recto medial, mentoniano, de la úvula, milohioideo, nasal, aritenoideo oblicuo, oblicuo mayor de la cabeza, oblicuo menor de la cabeza, obturador externo, obturador interno (A), obturador interno (B), omohioideo, oponente del dedo meñique (mano), oponente de pulgar, orbicular del ojo, orbicular de la boca, palatogloso, palatofaríngeo, palmar corto, palmar largo, pectíneo, pectoral mayor, pectoral menor, peroneo corto, peroneo largo, tercer peroneo, piriforme (A), piriforme (B), plantar, platisma, poplíteo, cricoaritenoideo posterior, prócer, pronador cuadrado, pronador redondo, psoas mayor, psoas menor, piramidal, cuadrado femoral, cuadrado lumbar, cuadrado plantar, recto del abdomen, recto anterior de la cabeza, recto lateral de la cabeza, recto posterior mayor de la cabeza, recto posterior menor de la cabeza, recto femoral, romboides mayor, romboides menor, risorio, salpingofaríngeo, sartorio, escaleno anterior, escaleno medio, escaleno mínimo, escaleno posterior, semimembranoso, semitendinoso, serrato anterior, serrato posterior inferior, serrato posterior superior, sóleo, esfínter del ano, esfínter de la uretra, esplenio de la cabeza, esplenio del cuello, estapedio, esternocleidomastoideo, esternohioideo, esternotiroideo, estilogloso, estilohioideo, estilohioideo (vista anterior), estilofaríngeo, subclavio, subcostal, subescapular, transverso superficial, periné, oblicuo superior, recto superior, supinador, supraespinoso, temporal, temporoparietal, tensor de la fascia lata, tensor del tímpano, tensor del velo del paladar, redondo mayor, redondo menor, tiroaritenoides y vocal, tiroepiglótico, tirohioideo, tibial anterior, tibial posterior, aritenoideo transverso, transversoespinoso-multífido, transversoespinoso-rotador, transversoespinoso-semiespinoso, transverso del abdomen, transverso del tórax, trapecio, tríceps, vasto intermedio, vasto lateral, vasto medial, cigomático mayor y cigomático menor.

La composición de GAA de la invención puede administrarse también a, o usarse para tratar, fibra muscular de tipo 1 (contracción lenta) o fibra muscular de tipo 2 (contracción rápida) o sujetos que acumulan glicógeno en tales fibras musculares. El músculo de tipo I, contracción lenta, o “rojo”, es denso con capilares y es rico en mitocondria y mioglobina, dando al tejido muscular se color rojo característico. Puede portar más oxígeno y sostener actividad aeróbica usando grasas o carbohidratos como combustible. Las fibras de contracción lenta se contraen durante periodos de tiempo prolongados pero con poca fuerza. Los músculos de tipo II, contracción rápida, tienen tres subtipos principales (IIa, IIx y lib) que varían tanto en la velocidad de contracción como en la fuerza generada. Las fibras de contracción rápida se contraen rápidamente y de manera potente, pero se fatigan muy rápidamente, sosteniendo solo ráfagas cortas, anaeróbicas, de actividad antes de que la contracción muscular se vuelva dolorosa. Contribuyen en la mayoría de los casos a la fuerza muscular y tienen un mayor potencial para aumentar en masa. El tipo Ilb es músculo anaeróbico, glicolítico, “blanco”, que es el menos denso en mitocondria y mioglobina. En los animales pequeños (por ejemplo, roedores), este es el tipo de músculo rápido principal, lo que explica el color pálido de su carne.

La composición de rhGAA de la invención, sus fracciones o derivados pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, mediante infusión intravenosa (IV), o administrarse directamente a un sitio deseado, tal como a músculo cardiaco o esquelético, tal como cuádriceps, tríceps o diafragma. Puede administrarse a miocitos, tejidos musculares particulares, músculos o grupos musculares. Por ejemplo, un tratamiento de este tipo puede administrar por vía intramuscular la composición de rhGAA directamente al cuádriceps o tríceps o diafragma de un sujeto.

Como se ha mencionado anteriormente, la composición de rhGAA de la invención, sus fracciones o derivados pueden complejarse o mezclarse con una chaperona, tal como AT-2220 (Duvoglustat HCl, 1-desoxinojirimicina) o AT-2221 (Miglustat, N-butil-desoxinojirimicina) o sus sales para mejorar la farmacocinética de la administración de rhGAA. La rhGAA y la chaperona pueden administrarse juntas o por separado. Cuando se administran simultáneamente, la GAA en la composición puede precargarse con la chaperona. Alternativamente, la GAA y la chaperona pueden administrarse por separado ya sea al mismo tiempo o en diferentes momentos.

Las dosificaciones representativas de AT2221 oscilan entre 0,25 y 400 mg/kg, preferiblemente entre 0,5-200 mg/kg, y lo más preferiblemente entre 2 y 50 mg/kg. Las dosificaciones específicas de AT2221 incluyen 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 mg/kg. Estas dosificaciones pueden combinarse con rhGAA, tal como rhGAA ATB-200, a una relación molar de AT2221 con respecto a rhGAA que oscila entre 15:1 y 150:1. Las relaciones específicas incluyen 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 60: 1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 125:1 y 150:1. rhGAA y AT2221 pueden administrarse conjuntamente en estas cantidades o relaciones molares ya sea concurrente, secuencialmente o por separado. Los intervalos anteriores incluyen todos los subintervalos y valores intermedios, tales como todos los valores de número entero entre los puntos de extremo del intervalo.

Las dosificaciones representativas de AT2220 oscilan entre 0,1 y 120 mg/kg, preferiblemente entre 0,25 y 60, y lo más preferiblemente entre 0,6 y 15 mg/kg. Las dosificaciones específicas de AT2220 incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 y 30 mg/kg. Estas dosificaciones pueden combinarse con rhGAA, tal como rhGAA ATB-200, a una relación molar de AT2220 con respecto a rhGAA que oscila entre 15:1 y 150:1. Las relaciones específicas incluyen 15:1, 20: 125:1, 50:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 125:1 y 150:1. rhGAA y AT2220 pueden administrarse conjuntamente en estas cantidades o relaciones molares ya sea concurrente, secuencialmente o por separado. Los intervalos anteriores incluyen todos los subintervalos y valores intermedios, tales como todos los valores de número entero entre los puntos de extremo del intervalo.

La composición de rhGAA de la invención, sus fracciones o derivados pueden usarse también para metabolizar, degradar, eliminar o disminuir de otro modo el glicógeno en tejido, músculo, fibra muscular, células musculares, lisosomas, orgánulos, compartimentos celulares o citoplasma, administrando la composición de rhGAA a un sujeto, opcionalmente junto con una chaperona o un fármaco que reduce las respuestas inmunológicas a rhGAA.

La rhGAA de la invención puede usarse para modular la proliferación lisosomal, la autofagia o la exocitosis en una célula administrando la misma, sus fracciones o derivados a células, tejidos o sujetos que necesiten una modulación de este tipo, opcionalmente en combinación con una chaperona u opcionalmente como conjugado con otro radial de direccionamiento. La autofagia es un mecanismo catabólico que permite que una célula degrade glicógeno u otros componentes celulares innecesarios o disfuncionales a través de las acciones de sus lisosomas. Este método puede implicar también administrar sistémica o localmente la composición de GAA a un sujeto que necesite tratamiento.

La rhGAA según la invención, que está enriquecida para mono-M6P y bis-M6P, en comparación con Lumizyme@ y Myozyme, y que tiene propiedades farmacocinéticas favorables conferidas por su patrón de glicosilación puede usarse también para el tratamiento de otros estados que requieren la descomposición de carbohidratos complejos, tales como otros trastornos en los que el glicógeno u otros carbohidratos degradados mediante rhGAA se acumulan en los lisosomas u otras partes de la célula, tal como en el citoplasma accesible a rhGAA, tal como enfermedad de almacenamiento de glicógeno III. También puede usarse con fines no terapéuticos, tal como para la producción de alimentos, bebidas, productos químicos y productos farmacéuticos que requieren la descomposición de carbohidratos complejos tales como almidón y glicógeno para dar sus monómeros.

EJEMPLOS

Los siguientes Ejemplos no limitativos ejemplifican aspectos de la invención.

Sección 1: ATB-200 rhGAA y sus propiedades

Limitaciones de los productos de rhGAA Mvozvme® y Lumizyme@ existentes

Para evaluar la capacidad de la rhGAA en Myozyme® y Lumizyme@, los únicos tratamientos aprobados actualmente para la enfermedad de Pompe, estas preparaciones de rhGAA se inyectaron en una columna de CIMPR (que se une a rhGAA que tiene grupos M6P) y se eluyeron posteriormente con un gradiente libre de M6. Se recogieron fracciones en una placa de 96 pocillos y se sometió a ensayo la actividad GAA mediante el sustrato 4MU-a-glucosa. Las cantidades relativas de rhGAA unida y no unida se determinaron basándose en la actividad GAA y se notificaron como la fracción de total enzima.

La Fig. 5 describe los problemas asociados con las ERT convencionales (Myozyme® y Lumizyme®): el 73% de la rhGAA en Myozyme® (Fig. 5B) y el 78% de la rhGAA en Lumizyme® (Fig. 5A) no se unió al CIMpR, véanse los picos más a la izquierda en cada figura. Solo el 27% de la rhGAA en Myozyme® y el 22% de la rhGAA en Lumizyme@ contenía M6P que pueden direccionarla de manera productiva al CIMPR en células musculares, véase la Fig. 2 que describe el direccionamiento de fármaco productivo y el aclaramiento de fármaco no productivo.

Una dosis efectiva de Myozyme® y Lumizyme@ corresponde a la cantidad de rhGAA que contiene M6P que selecciona como diana el CIMPR en células musculares. Sin embargo, la mayoría de la rhGAA en estos dos productos convencionales no selecciona como diana el receptor CIMPR en células musculares diana. La administración de una rhGAA convencional en la que la mayoría de la rhGAA no se dirige a células musculares aumenta el riesgo de reacción alérgica o la inducción de inmunidad con respecto a la rhGAA no direccionada.

Preparación de células CHO que producen rhGAA ATB-200 que tiene un alto contenido de N-glicanos que portan mono- o bis-M6P.

Se transfectaron células CHO con ADN que expresa rh-GAA seguido de la selección de transformantes que producen rhGAA. Un constructo de ADN para transformar células CHO con ADN que codifica rh-GAA se muestra en la Fig. 5. Se transfectaron células CHO con ADN que expresa rh-GAA seguido de la selección de transformantes que producen rhGAA.

Tras la transfección, se seleccionaron células CHO DG44 (DHFR) que contiene un gen de GAA integrado de manera estable con medio deficiente en hipoxantina/timidina (-HT). La amplificación de la expresión de GAA en estas células se indujo mediante tratamiento con metotrexato (MTX, 500 nM). Se identificaron grupos de células que expresaban altas cantidades de GAA mediante ensayos de actividad enzimática GAA y se usaron para establecer clones individuales que producen rhGAA. Se generaron clones individuales en placas de medios semisólidas, se escogieron mediante el sistema ClonePix y se transfirieron a placas de 24 pocillos profundos. Los clones individuales se sometieron a ensayo para la actividad enzimática GAA para identificar clones que expresan un alto nivel de GAA. Los medios acondicionados para determinar la actividad GAA usaron un sustrato de a 4-MU-a-glucosidasa. Los clones que producen niveles mayores de GAA medidos mediante ensayos de enzima GAA se evaluaron adicionalmente para la viabilidad, capacidad para crecer, productividad de GAA, estructura de N-glicano y expresión de proteínas estables. Las líneas de células CHO, incluyendo la línea de células CHO GA-ATB-200, que expresan rhGAA con N-glicanos mono-M6P o bis-M6P potenciados se aislaron usando este procedimiento.

Purificación de rhGAA ATB-200 rhGAA

Se produjeron múltiples lotes de la rhGAA según la invención en matraces de agitación y en biorreactores de perfusión usando la línea de células CHO GA-ATB-200 y se midió la unión a CIMPR. Se observó una unión al receptor CIMPR similar (-70%) a la mostrada en la Fig. 6B y la Fig. 7 para rhGAA ATB-200 purificada de diferentes lotes de producción, lo que indica que rhGAA ATB-200 puede producirse de manera consistente. Como se muestra mediante las Figs. 6A y 6B, las rhGAA de Myozyme® y Lumizyme@ presentaban significativamente menos unión a CIMPR que rhGAA ATB-200.

Comparación analítica de ATB-200 con Lumizyme

Se usó cromatografía de líquidos de intercambio aniónico débil (“WAX”) para fraccionar rhGAA ATB-200 según el fosfato terminal. Se generaron perfiles de elución eluyendo la ERT con una cantidad creciente de sal. Los perfiles se monitorizaron mediante UV (A 280 nm). Se obtuvo rhGAA ATB-200 de células CHO y se purificó. Se obtuvo Lumizyme® de una fuente comercial. Lumizyme@ presentaba un pico alto a la izquierda de su perfil de elución. rhGAA ATB-200 presentaba cuatro picos prominentes de elución a la derecha de Lumizyme® (Fig. 8). Esto confirma que rhGAA ATB-200 se fosforilaba en un mayor grado que Lumizyme® dado que esta evaluación es mediante carga terminal en vez de afinidad por CIMPR.

Caracterización de oligosacáridos de rhGAA ATB-200

Se evaluaron glicanos de rhGAA ATB-200 y Lumizyme@ purificados mediante MALDI-TOF para determinar las estructuras de glicano individuales encontradas en cada ERT (Fig. 9). Se encontró que las muestras de ATB-200 contenían cantidades ligeramente menores de N-glicanos de tipo con alto contenido de manosa no fosforilados que Lumizyme®. El mayor contenido de glicanos de M6P en ATB-200 que en Lumizyme, direcciona rhGAA ATB-200 a células musculares más efectivamente. El alto porcentaje de estructuras monofosforiladas y bisfosforiladas determinadas mediante MALDI concuerdan con los perfiles de CIMPR que ilustraron una unión significativamente mayor de ATB-200 al receptor CIMPR. El análisis de N-glicano por medio de espectrometría de masas de MALDI-TOF confirmó que en promedio cada molécula de ATB200 contiene al menos una estructura de N-glicano bis-M6P natural. Este contenido de N-glicano bis-M6P mayor en rhGAA ATB-200 se correlacionaba directamente con una unión de alta afinidad a CIMPR en ensayos de unión en placa de receptor M6P (K<d>aproximadamente 2-4 nM) Figura 10A.

Caracterización de la afinidad por CIMPR de ATB-200

Además de tener un mayor porcentaje de rhGAA que puede unirse al CIMPR, es importante entender la calidad de esa interacción. La unión a receptor de Lumizyme® y rhGAA ATB200 se determinó usando un ensayo de unión en placa de CIMPR. Resumiendo, se usaron placas recubiertas con CIMPR para capturar GAA. Se aplicaron concentraciones variables de rhGAA al receptor inmovilizado y se eliminó mediante lavado la rhGAA no unida. La cantidad de rhGAA restante se determinó mediante la actividad GAA. Como se muestra mediante la Fig. 10A, la rhGAA ATB-200 se unió a CIMPR significativamente mejor que Lumizyme.

La Fig. 10B muestra el contenido relativo de glicanos bis-M6P en Lumizyme, una rhGAA convencional, y ATB-200 según la invención. Para Lumizyme® hay en promedio solo un 10% de moléculas que tiene un glicano bisfosforilado. Esto contrasta con ATB-200, en la que en promedio cada molécula de rhGAA tiene al menos un glicano bisfosforilado.

rhGAA ATB-200 se internalizó más eficientemente mediante fibroblasto que Lumizyme.

La absorción celular relativa de rhGAA ATB-200 y de Lumizyme@ se compararon usando líneas celulares de fibroblastos normales y de Pompe. Las comparaciones implicaban 5-100 nM de rhGAA ATB-200 según la invención con 10-500 nM de rhGAA de Lumizyme@ convencional. Tras 16 h de incubación, la rhGAA externa se inactivó con base TRIS y se lavaron las células 3 veces con PBS antes de la recogida. La GAA internalizada se midió mediante hidrólisis de 4MU-a-glucósido y se representó gráficamente en relación con la proteína celular total y los resultados aparecen en la Fig. 11.

También se mostró que rhGAA ATB-200 se internaliza eficientemente en las células. La Figura 11A y 11B, respectivamente, muestran que rhGAA ATB-200 se internalizó en células de fibroblastos tanto normales como de Pompe y que se internalizada en un grado mayor que rhGAA de Lumizyme@ convencional. rhGAA ATB-200 satura los receptores celulares a aproximadamente 20 nM, mientras que se necesitan aproximadamente 250 nM de Lumizyme@. La constante de eficiencia de absorción (Kabsorción) extrapolada a partir de estos resultados es de 2-3 nm para ATB-200 y de 56 nM para Lumizyme@ como se muestra mediante la Fig. 11C. Estos resultados sugieren que rhGAA ATB-200 es un tratamiento bien direccionado para la enfermedad de Pompe.

Sección II: Estudios preclínicos

La rhGAA ATB-200 con glicosilación superior era significativamente mejor que la ERT de estándar de atención para aclaramiento de glicógeno en músculos esqueléticos de ratones deficientes en GAA

Como se ha explicado anteriormente, la terapia de reemplazo enzimático (ERT) usando GAA humana recombinante (rhGAA) es el único tratamiento aprobado disponible para la enfermedad de Pompe. Esta ERT requiere el carbohidrato especializado manosa-6-fosfato (M6P) para la absorción celular y el suministro posterior a lisosomas por medio de receptores M6P independientes de catión (CIMPR) de la superficie celular. Sin embargo, la ERT de rhGAA actual contiene bajas cantidades de M6P que limitan el direccionamiento del fármaco y la eficacia en tejidos relevantes para la enfermedad. Los inventores desarrollaron una línea celular de producción y un proceso de fabricación que dan rhGAA (designada como rhGAA ATB-200) con una glicosilación superior y un contenido de M6P mayor que la rhGAA convencional, particularmente la estructura de N-glicano bis-M6P de alta afinidad, para un direccionamiento de fármaco mejorado. rhGAA ATB-200 se une al CI-MPR con alta afinidad (KD~ 2-4 nM) y se internalizó eficientemente mediante fibroblastos de Pompe y mioblastos de músculo esquelético (Kabsorción —7-14 nM).

rhGAA ATB-200 aclara el glicógeno significativamente mejor que Lumizyme@ en músculo esquelético. Se evaluaron los efectos de administrar Lumizyme@ y rhGAA ATB-200 para el aclaramiento de glicógeno en ratones deficientes en GAA. A los animales se les dieron dos administraciones por bolo IV (cada dos semanas); los tejidos se recogieron dos semanas tras la última dosis y se analizaron para la actividad GAA y el contenido de glicógeno (Fig. 12). rhGAA ATB-200 y rhGAA de Lumizyme® eran igualmente efectivas para aclarar glicógeno en el corazón (Fig. 12A). Como se muestra en en las Figs. 12B y 12C, rhGAA ATB-200 a 5 mg/kg era equivalente a rhGAA de Lumizyme@ a 20 mg/kg para reducir el glicógeno en músculos esqueléticos; ATB-200 dosificada a 10 y 20 mg/kg era significativamente mejor que Lumizyme@ para aclarar el glicógeno en músculos esqueléticos;

Fundamento para la administración conjunta de rhGAA ATB-200 con AT2221 (tecnología CHART)

Una chaperona se une a y estabiliza la ERT de rhGAA, aumenta la absorción de enzima activa en tejidos, mejora la tolerabilidad y mitiga potencialmente la inmunogenicidad. Como se muestra anteriormente, la estabilidad proteínica de ERT en condiciones desfavorables se mejoraba sustancialmente usando CHART™. CHART: terapia de reemplazo avanzada con chaperona, véase http://_www.amicusrx.com/chaperone.aspx (accedido por última vez el 22 de septiembre de 2015). Como se muestra mediante las Figs. 13A y 13B, la estabilidad de ATB-200 se mejoraba significativamente mediante AT2221 (Miglustat, N-butil-desoxinojirimicina). El plegado de la proteína de rhGAA se monitorizó a 37°C mediante desnaturalización térmica en tampones neutros (pH 7,4 - entorno de plasma) o ácidos (pH 5,2 - entorno lisosomal). AT2220 estabilizó la proteína de rhGAA en tampón de pH neutro a lo largo de 24 horas.

Administración conjunta de Mvozvme@ con AT2221 (Miglustat) en comparación con la administración conjunta de rhGAA ATB-200 con Miglustat

Ratones deficientes en GAA de doce semanas de edad tratados con Lumizyme@ o ATB200, 20 mg/kg IV cada dos semanas 4 inyecciones; Miglustat se administró conjuntamente a 10 mg/kg PO, 30 min antes de rhGAA tal como se indica. Los tejidos se recogieron 14 días tras la última dosis de enzima para la medición de glicógeno. La Fig. 14 muestra la reducción relativa de glicógeno en músculo esquelético, cuádriceps y tríceps.

Reducción del glicógeno tisular con rhGAA ATB-200 administrada conjuntamente con chaperona farmacológica AT2221 (Miglustat).

Se encontró que la combinación de una chaperona farmacológica y rhGAA ATB-200 potenciaba el aclaramiento de glicógenoin vivo.A ratones deficientes en GAA se les dieron dos administraciones por bolo IV de rhGAA a 20 mg/kg cada 2 semanas. La chaperona farmacológica AT2221 se administró por vía oral 30 min antes de rhGAA a dosificaciones de 0, 1,2 y 10 mg/kg. Los tejidos recogieron dos semanas tras la última dosis de ERT y se analizaron para la actividad GAA, el contenido de glicógeno de glicógeno específico celular y la proliferación al lisosoma.

Como se muestra mediante la Fig. 15, los animales que reciben ATB200 chaperona AT2221 presentaban un aclaramiento de glicógeno potenciado de músculo cuádriceps. rhGAA ATB-200 (20 mg/kg) redujo el glicógeno más que la misma dosis de Lumizyme@ y cuando se combinó rhGAA ATB-200 con 10 mg/kg de AT2220 se alcanzaron niveles casi normales de glicógeno en el músculo.

Como se muestra mediante las Figs. 16A y 16B, a diferencia de la rhGAA convencional, que mostraba una reducción de glicógeno limitada (indicada mediante una señal PAS punteada abundante), rhGAA ATB-200 sola mostró una disminución significativa en la señales PAS. La administración conjunta con 10 mg/kg de miglustat dio como resultado una reducción adicional sustancial en el sustrato. La TEM reveló que la mayoría del glicógeno en los lisosomas era material unido a membrana, electrónicamente denso, lo que corresponde a las señales PAS punteadas. La administración conjunta de rhGAA ATB-200 con miglustat redujo el número, el tamaño y la densidad de lisosomas que contienen sustrato lo que sugiere un suministro direccionado de rhGAA ATB-200 a las células musculares y un suministro posterior a los lisosomas.

A partir del estudio (inyección de 2 bolos IV cada 2 semanas) mostrado anteriormente, los tejidos se procesaron para la proliferación lisosomal usando un marcador LAMP 1, la regulación por incremento es otro sello distintivo de la enfermedad de Pompe. LAMP: proteína de membrana asociada a lisosoma. A partir del estudio (inyección EOW de 2 bolos IV) mostrado anteriormente, se procesó tejido de sóleo para tinción con LAMP 1 en secciones adyacentes y anticuerpo específico de fibras de tipo I (NOQ7.5.4D) en secciones adyacentes (Fig. 16C y 16D). rhGAA ATB-200 da como resultado una reducción de LAMP1 más sustancial en comparación con rhGAA convencional, conduciendo las reducciones a niveles observados en animales WT (Figura 16C).

Además, a diferencia de rhGAA, en la que el efecto está restringido en su mayoría a fibras de tipo I (contracción lenta, marcado con asteriscos), rhGAA ATB-200 condujo también a una reducción significativa en señales de LAMP1 en una fracción de fibras de tipo II (contracción) (cabezas de flecha rojas) (Figura 16D). De manera importante, la administración conjunta con miglustat mejoró adicionalmente la reducción mediada por ATB-200 de la proliferación de LAMP1 en la mayoría de las fibras de tipo II (Fig. 16C y 16D). Como resultado, no pareció haber una diferencia específica del tipo de fibras significativa en el nivel de señales de LAMP1. Se extrajeron conclusiones similares de cuádriceps y diafragma (datos no mostrados).

En un estudio independiente y diseñado de manera similar, se examinó el efecto de ATB-200 ± AT2221 a lo largo de un periodo más largo con 4 inyecciones de bolo IV bisemanalmente. En el corazón, el almacenamiento de glicógeno principal en los cardiomiocitos se aclaró fácilmente mediante la administración repetida de o bien rhGAA o bien ATB-200 hasta niveles vistos en animales de tipo silvestre (WT) (Fig. 17A). Sin embargo, el sustrato en células de músculo liso cardiaco parece aclararse preferiblemente mediante rhGAA ATB-200, lo que sugiere una biodistribución potencialmente más amplia de ATB-200 en comparación con rhGAA (los asteriscos marcan la luz de vasos sanguíneos cardiacos). De manera importante, la administración conjunta con miglustat mejoró adicionalmente la reducción mediada por ATB-200 de la proliferación de LAMP1.

Estos resultados muestran que rhGAA ATB-200, que tiene niveles mayores de M6P y bis-M6P en sus N-glicanos, selecciona como diana eficientemente CIMPR en músculo esquelético. rhGAA ATB-200 también tienen N-glicanos de tipo complejo bien procesados que minimizan el aclaramiento no productivoin vivo,tiene propiedades farmacocinéticas favorables para su usoin vivoy presenta un buen direccionamiento a tejidos musculares clavein vivo.También muestran que rhGAA ATB-200 es mejor que el estándar de atención convencional, Lumizyme, para reducir el glicógeno en tejido muscular y que una combinación de rhGAA ATB-200 y chaperona AT2221 mejora adicionalmente la eliminación de glicógeno de tejidos diana y mejora la patología muscular.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Una composición que comprende alfa-glucosidasa ácida humana recombinante (rhGAA) producida mediante células de ovario de hámster chino (CHO), en la que el 40%-60% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición son N-glicanos de tipo complejo; y en la que el contenido promedio de N-glicanos que portan manosa-6-fosfato (M6P) oscila entre 3,0 y 5,0 moles por mol de rhGAA.
2. 2. - La composición según la reivindicación 1, en la que el contenido promedio de N-glicanos que portan M6P oscila entre 3,0 y 4,0 moles por mol de rhGAA.
3. 3. - La composición según la reivindicación 1, en la que el contenido promedio de N-glicanos que portan M6P oscila entre 4,0 y 5,0 moles por mol de rhGAA.
4. 4. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en la que en promedio los N-glicanos contienen más de 4 moles de ácido siálico por mol de rhGAA.
5. 5. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la rhGAA comprende en promedio de 2,0 a 8,0 moles de residuos ácido siálico por mol de rhGAA.
6. 6. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en la que la rhGAA comprende en promedio al menos un N-glicano bisfosforilado por rhGAA.
7. 7. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en la que el 45%-55% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición son N-glicanos de tipo complejo.
8. 8. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el 50% de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición son N-glicanos de tipo complejo.
9. 9. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el contenido promedio de N-glicanos que portan M6P es de 4 moles por mol de rhGAA, y en la que la rhGAA comprende en promedio 4,5 moles de residuos ácido siálico por mol de rhGAA y en promedio al menos un N-glicano bisfosforilado por rhGAA.
10. 10. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además una chaperona farmacológica.
11. 11. - La composición según la reivindicación 10, en la que la chaperona farmacológica se selecciona del grupo que consiste en 1 -desoxinojirimicina o una sal de la misma y N-butil-desoxinojirimicina o una sal de la misma.
12. 12. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe.
13. 13. - La composición para su uso según la reivindicación 12, en la que dicha composición se administra a (a) músculo cardiaco del sujeto, (b) cuádriceps, tríceps u otro músculo esquelético del sujeto, o (c) el diafragma del sujeto.
14. 14. - La composición para su uso según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en la que dicha composición se combina con, se administra conjuntamente con o se administra por separado junto con una chaperona farmacológica.
15. 15. - La composición para su uso según la reivindicación 14, en la que la chaperona farmacológica se selecciona del grupo que consiste en 1 -desoxinojirimicina o una sal de la misma y N-butil-desoxinojirimicina o una sal de la misma.