ES2967690T3

ES2967690T3 - Colorantes de fosforamidita de sulforodamina

Info

Publication number: ES2967690T3
Application number: ES19725532T
Authority: ES
Inventors: Kevin Lund; Dmitri Sergueev; Maher Qabar; Alexander Gall
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 2018-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: AU2019266218A1; CA3099701A1; WO2019217470A1; EP3790931B1; ZA202006485B; US12071547B2; KR102753367B1; CN112533998A; US20250051577A1; US20240067824A1; EP3790931A1; CN112533998B; BR112020022684A2; MX2020011378A; AU2019266218B2; JP7399882B2; JP2021523268A; KR20210035079A

Abstract

Se proporcionan compuestos de fosforamidita colorantes de sulforodamina compatibles con la síntesis automatizada de oligonucleótidos y polinucleótidos marcados que incorporan estos colorantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Colorantes de fosforamidita de sulforodamina

[0001] La presente invención proporciona compuestos de fosforamidita de colorante de sulforodamina novedosos útiles como colorantes rojos compatibles con la síntesis automatizada de oligonucleótidos, tal como se reivindica. El documento US 5,451,463 A describe reactivos de 1,3-diol no nucleósidos para marcar oligonucleótidos sintéticos. El documento US 2005/170363 A1 describe colorantes de xanteno. El documento US 5,231,191 A describe compuestos de fosforamidita de rodamina. El documento WO 2011/123820 A2 describe colorantes de rodamina y conjugados.

[0002] Los colorantes fluorescentes se encuentran entre las etiquetas más utilizadas habitualmente en la modificación de oligonucleótidos debido a que ofrecen una detección sensible en una amplia variedad de aplicaciones que van desde PCR a secuenciación. Los colorantes de rodamina se utilizan ampliamente en el marcaje de oligonucleótidos debido a que ofrecen máximos de emisión de longitud de onda más larga que otros colorantes, tales como fluoresceínas y proporcionan oportunidades de marcaje y tinción multicolor. Adicionalmente, la rodamina muestra una mayor fotoestabilidad que las fluoresceínas y cumarinas.

[0003] La preparación de polinucleótidos marcados con colorante fluorescente se realiza normalmente mediante conjugación postsintética, por ejemplo, mediante la reacción de un intermedio de colorante activado con un aminoderivado de un polinucleótido. Este enfoque tiene determinadas desventajas, que incluyen rendimientos de conjugación bajos y la necesidad de purificación adicional del producto conjugado. La incorporación de colorantes fluorescentes en los polinucleótidos sintéticos mediante la síntesis automatizada de fosforamiditas ofrece un enfoque más conveniente. Sin embargo, pocos derivados de fosforamidita de colorantes fluorescentes que permiten la adición del colorante fluorescente al polinucleótido como una parte de la síntesis automatizada en fase sólida están disponibles comercialmente.

[0004] Un ejemplo de un colorante de marcaje de oligonucleótidos conocido es cloruro de sulfonilo de sulforodamina 101 (colorante Texas Red®). Sin embargo, el colorante Texas Red® solamente se puede introducir en un oligonucleótido mediante un acoplamiento postsintético debido a que no se conoce ningún derivado de fosforamidita de colorante Texas Red®. Dado que el colorante Texas Red® es inestable, genera rendimientos de acoplamiento mucho más bajos que los colorantes de carboxirodamina (tal como 5-TAMRA, SE), lo que aumenta los costes asociados con la preparación de oligonucleótidos marcados con Texas Red®.

[0005] Para ser una alternativa viable al colorante Texas Red® para la síntesis automatizada de oligonucleótidos, un fluoróforo debería poseer características espectrales parecidas a las del colorante Texas Red®. Dicho fluoróforo debería ser estable en las condiciones estándares de síntesis de oligonucleótidos (por ejemplo, tratamiento con yodo, “capping” y condiciones de desprotección ácida) y susceptible a la incorporación en cualquier posición en el oligonucleótido. Adicionalmente, para las aplicaciones de PCR, dicha luminosidad de fluoróforo debería ser insensible a cambios en el intervalo de pH biológicamente relevante, y es necesario desactivar el colorante bien para generar alta fluorescencia de punto final (EPF), que se mide como una diferencia entre la fluorescencia de una sonda desactivada y una sonda escindida o una sonda no desactivada (por ejemplo, una sonda hibridada).

[0006] Las alternativas previamente conocidas de colorante Texas Red® que son compatibles con la síntesis de oligonucleótidos tienen determinadas desventajas. Por ejemplo, el colorante CAL Fluor Red® 610 es una fosforamidita que presenta fluorescencia en la región naranja-roja del espectro visible y se puede utilizar para el marcaje del extremo 5' terminal de sondas fluorogénicas, tales como sondas utilizadas en los ensayos con 5' nucleasa, balizas moleculares y ensayos de detección similares. Sin embargo, este colorante no contiene un grupo hidroxilo protegido y, por consiguiente, solamente se puede añadir al extremo 5' terminal de un oligonucleótido, limitando sus aplicaciones. Otra familia de colorantes, AquaPhluor®, incluye un colorante rojo que es altamente fluorescente con un máximo de absorción a 593 nm un máximo de emisión a 613 nm. Sin embargo, debido a sus limitaciones estructurales, este colorante solamente se puede incorporar en el extremo 5' terminal o el extremo 3' terminal de un oligonucleótido.0789*

[0007] Por consiguiente, todavía persiste la necesidad de colorantes fluorescentes rojos que sean compatibles con las condiciones de la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamiditas, que se puedan incorporar en cualquier posición de un polinucleótido, tengan máximos de emisión y absorción compatibles con la instrumentación de PCR existente y que proporcione una señal de fluorescencia de punto final en aplicaciones de PCR.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención se define en las reivindicaciones.

[0009] En un aspecto, en el presente documento se proporciona un compuesto que tiene una estructura representada por la Fórmula I:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R1 es L1-X;

R2 es halógeno o SO2NH2;

R3 es H o halógeno;

R4, R7, R8 y R11, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido,

R5, R6, R9, y R10, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R4 y R5, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5;

R6 y R7, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7;

R8 y R9, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9;

R10 y R11, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11;

R5 y R6, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R5 y R6, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros;

R9 y R10, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R9 y R10, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros;

L1 es un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido;

X es

y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando no están sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0010] En algunas realizaciones, R2 es Cl y R3 es H.

[0011] En algunas realizaciones, L1 es un enlazador PEG2-10. En determinadas realizaciones, L1 es -CH2CH2OCH2CH2-.012

[0012] En algunas realizaciones, R4 y R5 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10y R11; R6y R7 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9. En algunas realizaciones, R4 y R5 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9 En algunas realizaciones, R5, R6, R9 y R10 son cada uno metilo.

[0013] En algunas realizaciones, el compuesto tiene una estructura representada por la Fórmula IA:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que R1 es L1X y R3 es H o halógeno.

[0014] En algunas realizaciones, el compuesto es:

[0015] En un segundo aspecto, en el presente documento se proporciona un compuesto representado por la Fórmula II:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R1 es alquilo C1-C6;

R2 es H, halógeno o SO2NH2;

R3 es H o halógeno;

R14 y R16, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R15 y R17, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R14 y R15, cuando se toman en conjunto, forman una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R14 y R15;

R16 y R17, cuando se toman en conjunto, forman una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R16 y R17;

Q es un grupo tritilo o dimetoxitritilo;

L1 y L2 son de manera independiente un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o un heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando no están sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0016] En algunas realizaciones, R3 es H. En algunas realizaciones, R2 es H. En algunas realizaciones, R2 es Cl.

[0017] En algunas realizaciones, el compuesto se representa mediante la Fórmula (IIA):

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R1 es alquilo C1-C6;

R2 es H, halógeno o SO2NH2; y

R3 es H o halógeno.

[0018] En algunas realizaciones, el compuesto es: 019

[0019] En un tercer aspecto, en el presente documento se proporciona un compuesto que tiene una estructura de la Fórmula (III):

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R2 es H, halógeno o SO2NH2;

R3 es halógeno o H;

R4, R7, R8 y R11, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R5, R6, R9, y R10, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido,

n es un número entero de 1 a 9;

Y es:

en el que:

Q es un grupo tritilo o dimetoxitritilo;

R12 y R13 son de manera independiente alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0020] En algunas realizaciones, R2 es Cl y R3 es H.

[0021] En algunas realizaciones, R4 y R5 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10y R11; R6y R7 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9. En algunas realizaciones, R4 y R5 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9

[0022] En otras realizaciones adicionales, R12 y R13 son cada uno isopropilo.

[0023] En algunas realizaciones, el compuesto es:

[0024] En un cuarto aspecto, en el presente documento se da a conocer un compuesto representado por la Fórmula VI:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R1 es L1-X;

R2, R3, R4 y R5 son de manera independiente H, halógeno, alquilo C1-C6 o SO2NH2;

R6 y R9 son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R7, R8, R10, R11, R14 y R15 son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

X es -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2; en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0025] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, R7, R8, R10, R11, R14 y R15 son metilo.

[0026] En algunas realizaciones, L1 es un enlazador PEG2-10 y en otras realizaciones, L1 es -CH2CH2OCH2CH2-. En algunas realizaciones, R2, R3, R4 y R5 son H.

[0027] En algunas realizaciones, R6 es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con OH o aciloxi C1-C6, por ejemplo, R6 es un etilo sustituido con OH u OAc. En algunas realizaciones, R9 es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con OH o aciloxi C1-C6, por ejemplo, R9 es un etilo sustituido con OH u OAc.

[0028] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, el compuesto es:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R2, R3, R4 y R5 son H; y

Q1 y Q2 son de manera independiente H o acilo C1-C6.

[0029] En algunas realizaciones, Q1 y Q2 son acetilo.

[0030] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, el compuesto es:

en el que R1 es tal como se define anteriormente para la Fórmula VI.

[0031] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, el compuesto es:

compuesto de la fórmula IV:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R2 es halógeno o SO2NH2;

R3 es H o halógeno;

R4, R7, R8 y R11, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C rC 6 opcionalmente sustituido;

R5, R6, R9 y R10, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R10 y R11, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11 ;

n es un número entero de 1 a 9;

Y es:

la línea ondulada es el punto de unión a la Fórmula IV;

W es H o L4-O-Z2;

L3, L4 y L5 de manera independiente son un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C2-C30 opcionalmente sustituido;

Z es CH, N, NHC(O)N u OC(O)N;

Z1 es un nucleótido u oligonucleótido;

Z2 es un nucleótido, oligonucleótido o H; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0033] En algunas realizaciones, R2 es Cl y R3 es H. En otras realizaciones, R4 y R5 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9.

[0034] En algunas realizaciones, el polinucleótido marcado es una sonda de PCR de 5' nucleasa. En algunas realizaciones, el polinucleótido marcado comprende adicionalmente un desactivador de fluorescencia. En algunas realizaciones, el polinucleótido marcado se acopla a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una perla de cristal poroso controlado, perla de poliestireno, perla magnética o placa de micropocillos.

[0035] En un quinto aspecto, en el presente documento se da a conocer un procedimiento para la preparación de un conjugado marcado de un ligando que comprende poner en contacto un ligando con un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9 o las reivindicaciones de 12 a 14 en un disolvente adecuado en condiciones suficientes para unir de manera covalente el compuesto al ligando, formando de este modo el conjugado marcado.

[0036] En algunas realizaciones, el ligando es un polinucleótido, una proteína, un péptido, un polisacárido, un polímero con un esqueleto de etileno o un soporte sólido. En algunas realizaciones, el ligando es un polinucleótido. En otras realizaciones, las condiciones suficientes para unir de manera covalente el compuesto al ligando son condiciones de la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamidita.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0037] Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas relacionadas de la presente invención se apreciarán con más facilidad en cuanto los mismos se entiendan mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se considera en conjunto con los dibujos que la acompañan, en los que:

Figura 1A son los espectros de excitación y emisión de una SEQ ID NO: 1 de polinucleótido de ejemplo marcada con el colorante Texas Red®: (Tx Red)-TCAGAGTACCTGAAACA; (Oligo A) máx de Ex/Em = 598 nm/616 nm. En esta figura, el eje x representa nm y el eje y representa unidades de fluorescencia.

Figura 1B son los espectros de excitación y emisión de una SEQ ID NO: 1 de polinucleótido de ejemplo marcada con colorante S7: (S7)-TCAGAGTACCTGAAACA (Oligo B); Ex/Em = 598 nm/616 nm. En esta figura, el eje x representa nm y el eje y representa unidades de fluorescencia.

Figura 1C representa los espectros de excitación y emisión de una SEQ ID NO: 1 de polinucleótido de ejemplo marcada con colorante de sulforodamina S6 : (S6 )-TCAGAGTACCTGAAACA (Oligo C); máx de Ex/Em = 568/589 nm. En esta figura, el eje x representa nm y el eje y representa unidades de fluorescencia.

Figura 1D representa los espectros de excitación y emisión de una SEQ ID NO: 1 de polinucleótido de ejemplo marcada en el extremo 5' terminal con colorante de sulforodamina S10a; máx de Ex/Em = 568/587 nm.

Figura 2A muestra las curvas de PCR que comparan el rendimiento de la sonda que tiene la SEQ ID NO: 2 marcada con el colorante Texas Red® (Oligo D) y la sonda que tiene la SEQ ID NO: 2 marcada con un colorante de ejemplo (Oligo E) en un modelo de reacción de PCR que utiliza los cebadores de SEQ ID NOS: 4 y 5. En esta figura, el eje x representa Ct y el eje y representa unidades de fluorescencia.

Figura 2B muestra las curvas de PCR que comparan el rendimiento de la sonda marcada con colorante Texas Red® que tiene la SEQ ID NO: 3 marcada con colorante Texas Red® (Oligo F) y la sonda que tiene la SEQ ID NO: 3 marcada con un colorante de ejemplo (Oligo G) en un modelo de reacción de PCR que utiliza los cebadores de SEQ ID NOS: 6 y 7. En esta figura, el eje x representa Ct y el eje y representa unidades de fluorescencia.

Figuras 3A y 3B son trazas de HPLC de oligonucleótidos de ejemplo marcados con el compuesto racémico de ejemplo S10 (3A) y su isómero S10a (3B). En esta figura, el eje x representa minutos y el eje y representa la absorbancia a 260 nm.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0038] En el presente documento se dan a conocer fosforamiditas de colorante de sulforodamina que pueden incorporarse en oligonucleótidos mediante la síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos. Adicionalmente, se proporcionan colorantes de sulforodamina que comprenden otros grupos reactivos.

[0039] A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones que la acompañan, las palabras «comprender» e «incluir» y las variaciones de las mismas, tales como «comprende», «que comprende», «incluye» y «que incluye» pretenden expresar la posible inclusión de otros elementos o números enteros no enumerados de manera específica, cuando el contexto lo permita. Tal como se utiliza en el presente documento, el término «que consiste en» pretende significar que incluye y se limita a lo que sigue la frase «que consiste en». Por consiguiente, la frase «que consiste en» indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios y que ningún otro elemento puede estar presente. El término «que consiste esencialmente en» significa que la composición, el procedimiento o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solamente, si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran sustancialmente las características básicas y novedosas de la composición, el procedimiento y la estructura reivindicados.

[0040] El término «un» y «una» y «el/la» son términos similares que deben interpretarse como que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.

[0041] A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos u oligonucleótidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación del extremo 5' al extremo 3'.

[0042] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «amplificación» hace referencia a cualquier medio mediante el cual se produce como mínimo una secuencia parcial de como mínimo un ácido nucleico diana o su complemento de secuencia, típicamente de una manera dependiente de la plantilla, que incluye sin limitación, una amplia gama de técnicas de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos, tanto de manera lineal como de manera exponencial. Los procedimientos de amplificación de ejemplo no limitativos incluye reacción en cadena de polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR múltiple, PCR cuantitativa (Q-PCR), amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA), amplificación mediada por la transcripción (TMA), reacción en cadena de ligasa (LCR), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), reacción por detección de ligasa (LDR), amplificación con sondas dependiente de ligandos múltiples (MLPA), ligación seguida de amplificación con Q-replicasa, extensión con cebadores, amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación por desplazamiento de cadena hiperramificada, amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación basada en cadena de ácido nucleico (NASBA), amplificaciones multiplexadas de dos etapas, amplificación digital y similares. Se pueden encontrar las descripciones de dichas técnicas, entre otras fuentes, en Ausubel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); e Innis et al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990).

[0043] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «base» significa un resto heterocíclico que contiene nitrógeno capaz de formar enlaces de hidrógeno, por ejemplo, enlaces de hidrógeno del tipo Watson-Crick, con una base de nucleótido complementaria o un análogo de base de nucleótido, por ejemplo, una purina, una 7-deazapurina o una pirimidina. Las bases típicas son las bases de adenina, citosina, guanina, timina y uracilo de origen natural. Las bases incluyen también los análogos de bases de origen natural, tales como deazaadenina, 7-deaza-8-azaadenina, 7-deazaguanina, 7-deaza-8-azaguanina, inosina, nebularina, nitropirrol, nitroindol, 2-amino-purina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-cloro-6-aminopurina, xantina, hipoxantina, etc.

[0044] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «complementario» hace referencia a la capacidad de secuencias de polinucleótidos de hibridarse con y a partir de pares de bases entre sí. Los pares de bases se forman típicamente mediante los enlaces de hidrógeno entre las unidades de nucleótidos en cadenas de polinucleótidos antiparalelas. Las cadenas de polinucleótidos complementarias pueden emparejarse por bases del modo de Watson-Crick (por ejemplo, A con T, A con U, C con G), o de cualquier otra manera que permita la formación de dúplex. El porcentaje de «complementariedad» de una secuencia de sonda en relación con una secuencia diana es el porcentaje de «identidad» de la secuencia de sonda en relación con la secuencia de la diana o en relación con el complemento de la secuencia de la diana. En la determinación del grado de «complementariedad» entre una secuencia de sonda y una de diana, el grado de «complementariedad» se expresa como el porcentaje de identidad entre la secuencia de la sonda y la secuencia de la secuencia diana o el complemento de la secuencia de la secuencia diana que se alinea de mejor manera con la misma. Una sonda de ejemplo es un polinucleótido tal como se describe en el presente documento.

[0045] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «dúplex» hace referencia a un complejo de hibridación de doble cadena formado mediante acoplamiento (hibridación) de los polinucleótidos de cadena sencilla complementarios (o parcialmente complementarios), por ejemplo, ADN, ARN, LNA o ácido nucleico peptídico (PNA).

[0046] Tal como se describe en el presente documento, «desactivación de fluorescencia» hace referencia a cualquier proceso que disminuye la intensidad de fluorescencia de una muestra de fluorescencia, es decir, una sonda de polinucleótido fluorescente. Una variedad de interacciones moleculares puede dar como resultado una desactivación. Los ejemplos no limitativos incluyen reacciones en estado excitado, reagrupamientos moleculares, transferencia de energía, formación de complejo en estado fundamental y desactivación colisional.

[0047] Tal como se utiliza en el presente documento, «halógeno» significa F, Cl, Br o I.

[0048] Los términos «hibridar» y «hibridación» se utilizan en el presente documento con referencia a «hibridación específica» que es la unión, formación de dúplex o acoplamiento de una molécula de ácido nucleico, de manera preferente a una secuencia de nucleótidos particular, en algunas realizaciones, en condiciones rigurosas. El término «condiciones rigurosas» hace referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará de manera preferente con su secuencia diana y en menor cantidad o de ningún modo, con otras secuencias. «Hibridación rigurosa» y «condiciones de lavado de hibridación rigurosas» en el contexto de hibridación de ácido nucleico dependen de la secuencia y son diferentes bajo parámetros del entorno diferentes. Una guía extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en, por ejemplo, Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes parte I, Capítulo 2, «Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays», Elsevier, NY. El grado de hibridación de un polinucleótido con una secuencia diana, también conocido como fuerza de hibridación, se determina mediante procedimientos que se conocen bien en la técnica. Un procedimiento preferido es determinar la Tm de un dúplex híbrido determinado. Esto se puede conseguir sometiendo un dúplex formado en solución a un aumento de temperatura gradual y monitorización de la desnaturalización del dúplex, por ejemplo, mediante la absorbancia de luz ultravioleta, que aumenta con el desagrupamiento de pares de bases que acompañan la desnaturalización. La Tm se define, en general, como la temperatura a la que la mitad de las cadenas de ADN se encuentran en el estado de cadena sencilla (ADNss). La Tm depende de diferentes parámetros, tales como la longitud de la secuencia de cadena complementaria hibridada, sus secuencias de nucleótidos específicas, composiciones de bases, modificaciones de bases y las concentraciones de las cadenas complementarias.

[0049] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «marcador» y «marcador detectable» se utilizan de manera intercambiable y hacen referencia a un resto que, cuando se une a una biomolécula, un nucleósido, un nucleótido o un polinucleótido, hace que dicha biomolécula, nucleósido, nucleótido o polinucleótido detectable sea detectable mediante los medios de detección adecuados. Los marcadores de ejemplo incluyen fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, marcadores de spin, marcadores de enzimas, marcadores quimioluminiscentes, compuestos electroquimioluminiscentes, marcadores magnéticos, microesferas, metal coloidal, marcadores inmunológicos, ligandos, enzimas y similares.

[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «base de nucleótidos modificada» o «base modificada» hacen referencia a una base que no tiene la estructura de una base de origen natural y, por consiguiente, es de origen no natural. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «azúcar modificado» hace referencia a un azúcar o un análogo de azúcar que no tiene la estructura de un azúcar de origen natural, por ejemplo, azúcar de ribosa o desoxirribosa, y, por consiguiente, es de origen no natural.

[0051] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «de origen natural» en el contexto de moléculas de ácido nucleico hace referencia a una molécula de ARN o ADN (de cadena sencilla o de cadena doble) que tiene una secuencia de nucleótidos que tiene lugar en la naturaleza y que comprende solamente los componentes, tales como bases, azúcares, nucleósidos y nucleótidos que tienen lugar en la naturaleza.

[0052] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «nucleósido» hace referencia a una molécula que consiste en una base nitrogenada del tipo mencionado en el presente documento que se une a un azúcar de los tipos mencionados en el presente documento, por ejemplo, a un azúcar de ribosa o desoxirribosa a través de un enlace beta-glicosídico. Los ejemplos de nucleósidos incluyen adenosina, citidina, guanosina, timidina, uridina e inosina.

[0053] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «nucleótido» significa un éster de fosfato de un nucleósido, ya se como un monómero independiente o como una subunidad en un polinucleótido. Los monómeros de nucleótido incluyen, por ejemplo, nucleótido 5'-monofosfato, 5'-difosfato, 5'-trifosfato y 3'-monofosfato. Los trifosfatos de nucleótidos a menudo se señalan como «NTP», «dNTP» (2'-desoxipentosa) o «ddNTP» (2', 3'-didesoxipentosa) para señalar de manera particular las características estructurales del azúcar de ribosa. «Nucléotido 5'-trifosfato» hace referencia a un nucleótido con un grupo éster de trifosfato en la posición 5'. El grupo éster de trifosfato puede incluir sustituciones de azufre por uno o más átomos de oxígeno del fosfato, por ejemplo, alfa-tionucleótido 5'-trifosfatos. Un nucleótido monofosfato, difosfato o trifosfato puede servir como el sustrato para una enzima procesadora de ácido nucleico que cataliza las modificaciones de ácidos nucleicos o intermedios de ácidos nucleicos.

[0054] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «oligonucleótido» hace referencia de manera amplia a una cadena monocatenaria compuesta principalmente o completamente de aproximadamente 2 a aproximadamente 300 unidades de monómero de nucleótidos de origen natural o modificados, por ejemplo, anillos de azúcar de desoxirribosa o ribosa sustituidos por bases A, C, G, T o U y que se unen mediante restos de esqueleto de fosfato convencionales. Más particularmente, el término hace referencia a una cadena monocatenaria de desoxirribonucleótidos con un rango de tamaño descrito anteriormente. En algunas realizaciones, un oligonucleótido puede comprender una o más bases modificadas y/o azúcares. Además de las unidades de monómeros de nucleótidos, un oligonucleótido puede incorporar uno o más marcadores detectables y/o uno o más grupos reactivos.

[0055] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «pluralidad» significa más de uno.

[0056] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «polinucleótido» se refiere de manera general a un oligonucleótido que comprende desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 300 unidades de monómeros de nucleótidos. Además de las unidades de monómeros de nucleótidos, un polinucleótido puede incorporar uno o más marcadores detectables y/o uno o más grupos reactivos.

[0057] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «cebador» hace referencia a un polinucleótido o un polinucleótido modificado que es eficaz como un punto de partida para sintetizar una cadena de polinucleótidos que es complementaria para una cadena de ácido nucleico diana. Por ejemplo, los cebadores que se utilizan en<p>C<r>comprenden un cebador directo e inverso, en el que el cebador directo contiene una secuencia complementaria a una región de una cadena de ácido nucleico diana y dirige la síntesis de una cadena complementaria. Un cebador inverso contiene una secuencia complementaria a la cadena opuesta y dirige la síntesis a lo largo de la cadena opuesta de la cadena de ácido nucleico diana.

[0058] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «sonda» hace referencia a un oligonucleótido marcado u oligonucleótido modificado marcado que contiene una secuencia complementaria a una región de una secuencia de ácido nucleico diana, permitiendo que la sonda forme un dúplex con la secuencia diana y genere una señal detectable que indica la presencia de la región de la secuencia diana. Se genera una señal detectable durante o después de la hibridación, ya sea directa o indirectamente. En algunas aplicaciones, tales como durante la extensión con cebadores en PCR de 5'-nucleasa, las sondas carecen de un grupo hidroxilo en el extremo 3' terminal extensible para impedir la extensión mediada por polimerasa de la sonda. En determinadas realizaciones, las sondas incluyen sondas TaqMan®, sondas TaqMan MGB®, sondas Pleiades®, balizas moleculares (por ejemplo, aquellas divulgadas en Tyagi, Sanjay & Kramer, Fred. (2012) Molecular Beacons in Diagnostics. F1000 medicine reports. 4. 10. 10.3410/M4-10) y similares.

[0059] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «grupo que protege», «grupo protector» o «forma protegida» hacen referencia a una modificación química lábil de un grupo funcional (por ejemplo, hidroxilo) destinado a conservar su funcionalidad y/u obtener la quimioselectividad en una reacción química posterior. Un grupo protector se elimina del producto final mediante un tratamiento desprotector (por ejemplo, tratamiento con ácido).

[0060] Tal como se utiliza en el presente documento, el término «soporte sólido» hace referencia a cualquier material insoluble que incluya partículas (por ejemplo, perlas), fibras, monolitos, membranas, filtros, tiras de plástico, matrices, placas con micropocillos y similares. En algunas realizaciones, los soportes sólidos son soportes sólidos adecuados para la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamidatos, tales como poliestireno y vidrio poroso controlado (CPG,controlled pore glass).

Colorantes de Sulforodamina y Fosforamiditas de los mismos

[0061] En un aspecto, en el presente documento se dan a conocer colorantes de sulforodamina que comprenden uno o más grupos fosforamidita tal como se reivindica.

[0062] En determinadas realizaciones, los colorantes divulgados en el presente documento comprenden un resto sultamo. En algunas realizaciones, los colorantes divulgados en el presente documento pueden existir en forma abierta o cerrada, tal como se muestra a continuación para un compuesto de ejemplo:

[0063] En su forma cíclica o «cerrada», los colorantes de sulforodamina de la divulgación y las fosforamiditas de los mismos son incoloros y no fluorescentes. Sin embargo, tras la protonación, por ejemplo, la exposición a condiciones ácidas, la forma cíclica puede convertirse en la forma «abierta» que es fluorescente. Tal como se utiliza en el presente documento, cuando se hace referencia a los colorantes divulgados en el presente documento, el término «colorante de sulforodamina» incluye ambas formas fluorescentes abiertas y sus formas cerradas correspondientes incluso cuando solamente las formas abiertas son fluorescentes.

[0064] En la técnica se conoce dicho fenómeno de la transición de coloreado a incoloro que se asocia con la interconversión reversible dependiente de pH de sultamos derivados de colorantes de sulforodamina de abiertos a cerrados (Véanse, por ejemplo, Corrie J.E.T. y Munasinghe V.R. Dyes and Pigments 79 (2008): 76-82). Determinados derivados reactivos de colorantes de sulforodamina utilizados en el marcaje de moléculas biológicas, tales como cloruro de sulforodamina B, generalmente están disponibles de proveedores comerciales como una mezcla de dos isómeros de cloruro de sulfonilo, isómeros orto y para, pero solamente el isómero con su cloruro de sulfonilo en orto con respecto al sistema de xantilio puede formar un compuesto de sulfonamida cíclica (sultamo) que experimenta el proceso de encadenamiento del anillo mostrado anteriormente. Por consiguiente, se ha informado de que los isómeros orto de tales colorantes generalmente no son deseables para las aplicaciones biológicas debido a que fluorescencia de los isómeros orto depende del pH (véase, por ejemplo, Corrie J.E.T. et al. Bioconjugate Chem. 12 (2001): 186-194). De manera sorprendente, los inventores descubrieron que los conjugados de polinucleótidos de los colorantes de la presente divulgación, a diferencia del conjugado de los colorantes divulgados en la técnica, presentan fluorescencia que no es dependiente del pH en el intervalo del pH relevante para las aplicaciones de p Cr , por ejemplo, desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 8,5, y se puede desactivar bien con desactivadores convencionales, tales como el desactivador BHQ-2 (Biosearch), para producir una fluorescencia de punto final (EPF) elevada. Tal como se utiliza en el presente documento, la fluorescencia de punto final es una diferencia entre la fluorescencia de una sonda desactivada y una sonda escindida o una diferencia entre la fluorescencia de una sonda desactivada y una sonda hibridada.

[0065] En determinadas realizaciones, la forma «abierta» de los colorantes de sulforodamina divulgados en el presente documento posee propiedades espectrales, tales como máximos de emisión y absorción, comparables con o equivalentes a aquellas del colorante de sulforodamina 101 o un colorante TAMRA. Sin embargo, a diferencia de los colorantes de sulforodamina del tipo 101 que comprenden grupos de ácido sulfónico polares y que, por lo tanto, no se pueden preparar en la forma de reactivos de fosforamiditas, los colorantes de sulforodamina divulgados en el presente documento son no polares en su forma cerrada (sultamo) y se disuelven fácilmente en disolventes orgánicos compatibles con la síntesis automatizada de fosforamiditas y/o las condiciones de bioconjugación. La propiedad ventajosa de los colorantes divulgados en el presente documento permite también la facilidad de purificación mediante técnicas de laboratorio convencionales, tales como cromatografía en columna con gel de sílice.

[0066] En algunas realizaciones, los colorantes tienen una estructura representada por la Fórmula I:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R1 es L1-X;

R2 es halógeno o SO2NH2;

R3 es H o halógeno;

X es

y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0067] En determinadas realizaciones de la Fórmula I, R2 es Cl y R3 es H. En otras realizaciones, R4 y R5 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R11 y R10 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R11 y R10; R6 y R7 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9

[0068] En algunas realizaciones, el alquileno C3 es propileno.

[0069] L1 puede comprender uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O, S, P y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, L1 es un enlazador PEG2-10. En otras realizaciones, L1 es - CH2CH2OCH2CH2-.

[0070] En determinadas realizaciones, R5, R6, R9 y R10 son alquilo C1-C3, por ejemplo, metilo.

[0071] En las fórmulas mostradas en el presente documento, Q indica un grupo tritilo o dimetoxitritilo. Los ejemplos de grupos protectores se conocen en la técnica (Véase, por ejemplo, Peter G. M. Wuts, Greene's protective groups in organic synthesis (2006)).

[0072] Q es un grupo protector de hidroxilo que es compatible con las condiciones de la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamidita.

[0073] Los colorantes de sulforodamina que comprenden otros restos o grupos reactivos se encuentran también dentro del alcance de esta divulgación; por ejemplo, grupos reactivos que pueden formar enlaces químicos con aminas primarias. Estos incluyen isotiocianatos, isocianatos, azidas de acilo, ésteres NHS, cloruros de sulfonilo, aldehidos, glioxales, epóxidos, oxiranos, carbonatos, haluros de arilo, imidoésteres, carbodiimidas, anhídridos, ésteres de nitrofenilo y ésteres de fluorofenilo. Preferiblemente, el grupo reactivo es un éster activado. Tal como se utiliza en el presente documento, un «éster activado» es un éster de ácido carboxílico que puede reaccionar con un grupo amino con la formación de una amida. Los ésteres activados incluyen ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo y ésteres de p-nitrofenilo. Se incluyen también en el presente documento los ésteres activados que se generanin situ(por ejemplo, mediante la adición de un agente activador, tal como una carbodiimida a un ácido carboxílico).

[0074] En algunas realizaciones, el colorante de sulforodamina tiene una estructura representada por la Fórmula IA:

[0075] En algunas realizaciones, la fosforamidita del colorante de sulforodamina está representada por la Fórmula II:

en el que:

R1 es alquilo C1-C6;

R2 es H, halógeno o SO2NH2;

R3 es H o halógeno;

R14 y R16, por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R15 y R17, por sí solos, de manera independiente son H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

o R14 y R15, en conjunto forman una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R14 y R15;

R16 y R17, en conjunto forman una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R16 y R17;

Q es un grupo tritilo o dimetoxitritilo;

L1 y L2 de manera independiente son un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.

[0076] En algunas realizaciones de la fórmula II, R3 es H. En otras realizaciones, R2 es H. En otras realizaciones adicionales, R2 es Cl.

[0077] En otras realizaciones, R14 y R15 forman una cadena de alquileno C2, opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos metilo, que conecta los átomos a los que están unidos R14 y R15; y en otras realizaciones adicionales, R16 y R17 forman una cadena de alquileno C2, opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos metilo, que conecta los átomos a los que están unidos R16 y R17 En determinadas realizaciones, R14 y R15 forman una cadena de etileno sustituida con 3 grupos metilo y R16 y R17 forman una cadena de etileno sustituida con 3 grupos metilo.

[0078] En determinadas realizaciones, R14 y R15 en conjunto y R16 y R17, en conjunto son:

en donde * señala el punto de unión al átomo de nitrógeno y ** señala el punto de unión al átomo de carbono aromático.

[0079] En determinadas realizaciones, el compuesto se representa mediante la Fórmula (IIA):

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo.

[0080] En realizaciones particulares, el compuesto es:

[0081] En algunas realizaciones, las fosforamiditas del colorante de sulforodamina son compuestos representados por la Fórmula (III):

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R2 es H, halógeno o SO2NH2;

R3 es halógeno o H;

n es un número entero de 1 a 9;

Y es:

en los que: Q es un grupo tritilo o dimetoxitritilo;

[0082] En determinadas realizaciones, R2 es Cl y R3 es H. En algunas realizaciones, R4 y R5 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno; R11 y R10 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno; R6 y R7 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno; y R8 y R9 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno.

[0083] En determinadas realizaciones, el compuesto es:

[0084] En algunas realizaciones, el colorante de sulforodamina es un compuesto representado por la Fórmula VI:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R1 es L1-X;

R6 y R9 son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

[0085] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, R7, R8, R10, R11, R14 y R15 son metilo.

[0086] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, L1 es un enlazador PEG2-10. En otra realización de la Fórmula VI, L1 es -CH2CH2OCH2CH2-.

[0087] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, R2, R3, R4, y R5 son H. En realizaciones particulares de la Fórmula V i, R6 es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con OH o alcoxi C1-C6. En determinadas realizaciones de la Fórmula VI, R9 es un alquilo a C1-C6 opcionalmente sustituido con OH o alcoxi C1-C6.

[0088] En determinadas realizaciones de la Fórmula VI, R6 es un etilo sustituido con OH u OAc. En algunas realizaciones de la Fórmula VI, R9 es un etilo sustituido con OH u OAc.

[0089] En algunas realizaciones de la Fórmula VI, el compuesto es:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que:

R2, R3, R4 y R5 son H ; y

Q1 y Q2 son de manera independiente H o acilo C1-C6.

[0090] En algunas realizaciones, el compuesto es:

en el que R1 es tal como se define para el compuesto de la Fórmula VI.

[0091] En realizaciones particulares, el compuesto es:

[0092] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «alquilo», «alquenilo» y «alquinilo» incluyen radicales de hidrocarbilo monovalentes de cadena lineal, cadena ramificada o cíclicos y combinaciones de los mismos, que contienen solamente C y H cuando están no sustituidos. Entre los ejemplos se incluyen metilo, etilo, isobutilo, ciclohexilo, ciclopentiletilo, 2-propenilo, 3-butinilo y similares. El número total de átomos de carbono en cada uno de dichos grupos se describe a veces en el presente documento, por ejemplo, cuando el grupo puede contener hasta diez átomos de carbono se puede representar como 1-10C, como C1-C10, C-C10 o C1-10.

[0093] Los términos «heteroalquilo», «heteroalquenilo» y «heteroalquinilo», tal como se utilizan en el presente documento, significan los hidrocarburos correspondientes en los que uno o más átomos de carbono de la cadena han sido reemplazados por un heteroátomo. Entre los heteroátomos de ejemplo se incluyen N, O, S y P. Cuando se permite que los heteroátomos reemplacen átomos de carbono, por ejemplo, en grupos heteroalquilo, los números que describen el grupo, aunque todavía se escriba como, por ejemplo, C3-C10, representan la suma del número de átomos de carbono en el ciclo o cadena y el número de dichos heteroátomos que se incluyen como sustituciones de átomos de carbono en el ciclo o la cadena que se describe.

[0094] Típicamente, los sustituyentes de alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-10 átomos de carbono (alquilo) o 2 10 átomos de carbono (alquenilo o alquinilo). Preferiblemente, contienen 1-8 átomos de carbono (alquilo) o 2-8 átomos de carbono (alquenilo o alquinilo). A menudo se les hace referencia como «alquilos inferiores», lo que significa que contienen 1-6 átomos de carbono (alquilo) o 2-6 átomos de carbono (alquenilo o alquinilo). Un grupo único puede incluir más de un tipo de enlace múltiple o más de un enlace múltiple; tales grupos se incluyen en la definición del término «alquenilo» cuando contienen como mínimo un doble enlace carbono-carbono y se incluyen en el término «alquinilo» cuando contienen como mínimo triple enlace carbono-carbono.

[0095] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos «alquileno», «alquenileno» y «alquinileno» incluyen radicales de hidrocarbilo divalentes de cadena lineal, cadena ramificada y cíclicos y combinaciones de los mismos.

[0096] Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos hasta un cierto punto en el que tales sustituciones tengan sentido químicamente. Los sustituyentes típicos incluyen, pero no se limitan a, halógenos (F, Cl, Br, I), =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R y NO2, en donde cada R es de manera independiente H, alquilo C-i-Ca, heteroalquilo C2-C8, acilo C-i-Ca, heteroacilo C2-C8, alquenilo C2-C8, heteroalquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, heteroalquinilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo C5-C10 y cada R se sustituye opcionalmente con halógenos (F, Cl, Br, I), =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'C(O)OR', NR'C(O)R', CN, C(O)OR', C(O)NR'2, OC(O)R', C(O)R' y NO2, en el que cada R' es de manera independiente H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo C5-C10. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo se pueden sustituir también por acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo C5-C10, cada uno de los cuales se puede sustituir con los sutituyentes que son adecuados para el grupo particular.

[0097] Aunque «alquilo» tal como se utiliza en el presente documento incluye grupos cicloalquilo y cicloalquilalquilo, el término «cicloalquilo» se utiliza en el presente documento para describir un grupo no aromático carbocíclico que está conectado a través de un átomo de carbono de anillo, y «cicloalquilalquilo» se utiliza para describir un grupo no aromático carbocíclico que se conecta a la molécula a través de un enlazador de alquilo. De manera similar, se utiliza «heterocidilo» para identificar un grupo cíclico no aromático que contiene como mínimo un heteroátomo como un miembro de anillo y que se conecta a la molécula a través de un átomo de anillo, que puede ser C o N; y se puede utilizar «heterociclilalquilo» para describir dicho grupo que se conecta a otra molécula a través de un enlazador de alquileno. Tal como se utiliza en el presente documento, estos términos incluyen también los anillos que contienen un doble enlace o dos, siempre y cuando el anillo no sea aromático.

[0098] Un sustituyente o un resto «aromático» o «arilo» hace referencia a un resto monocíclico o bicíclico fusionado que posee las características bien conocidas de aromaticidad; entre los ejemplos se incluyen fenilo y naftilo. De manera similar, los términos «heteroaromático» y «heteroarilo» hacen referencia a tales sistemas de anillos monocíclicos o bicíclicos fusionados que contienen como miembros del anillo uno o más heteroátomos. Los heteroátomos adecuados incluyen N, O y S, la inclusión de los cuales facilita la aromaticidad en anillos de 5 miembros, así como en anillos de 6 miembros. Los sistemas heteroaromáticos típicos incluyen grupos aromáticos C5-C6 monocíclicos, tales como piridilo, pirimidilo, pirazinilo, tienilo, furanilo, pirrolilo, pirazolilo, tiazolilo, oxazolilo e imidazolilo y restos bicíclicos fusionados formados mediante la fusión de uno de estos grupos monocíclicos con un anillo de fenilo o con cualquiera de los grupos monocíclicos heteroaromáticos para formar un grupo bicíclico C8-C10, tal como indolilo, benzimidazolilo, indazolilo, benzotiazolilo, isoquinolilo, quinolilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, pirazolopiridilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, cinnolinilo y similares. Cualquier sistema monocíclico o bicíclico de anillos fusionados que posee las características de aromaticidad en términos de distribución de electrones a lo largo del sistema de anillos se incluye en esta definición. Incluye también grupos bicíclicos, donde como mínimo el anillo que está unido de manera directa al resto de la molécula posee las características de aromaticidad. Típicamente, el sistema de anillos contienen 5-12 átomos miembros del anillo. Preferiblemente, los heteroarilos monocíclicos contienen 5-6 miembros de anillo, y los heteroarilos bicíclicos contienen 8 -10 miembros de anillo.

[0099] Los restos de arilo y heteroarilo pueden sustituirse por una variedad de sustituyentes que incluyen alquilo C1-Ca, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-C12, acilo C1-C8 y heteroformas de los mismos, cada uno de las cuales por sí solo puede sustituirse adicionalmente; otros sustituyentes de restos de arilo y heteroarilo incluyen halógenos (F, Cl, Br, I), OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R y NO2, en los que cada R es de manera independiente H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, alquenilo C2-C8, heteroalquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, heteroalquinilo C2-C8, arilo C6-C10, heteroarilo C5-C10, arilalquilo C7-C12 o heteroarilalquilo C6-C12 y cada uno de R se sustituye de manera opcional tal como se describe anteriormente para los grupos alquilo. Los grupos sustituyentes en un grupo arilo o heteroarilo, por supuesto, pueden sustituirse adicionalmente con los grupos descritos en el presente documento como adecuados para cada tipo de dichos sustituyentes o para cada componente del sustituyente. Por consiguiente, por ejemplo, un sustituyente de arilalquilo puede sustituirse en la posición de arilo con sustituyentes descritos en el presente documento como típico para grupos arilo, y puede sustituirse adicionalmente en la parte alquilo con sustituyentes descritos en el presente documento como típicos o adecuados para los grupos alquilo.

[0100] «Opcionalmente sustituido», tal como se utiliza en el presente documento, indica que el grupo particular que se describe puede tener uno o más sustituyentes de hidrógeno reemplazados por un sustituyente que no es hidrógeno. En algunos grupos o restos opcionalmente sustituidos, todos los sustituyentes de hidrógeno se reemplazan por un sustituyente que no es hidrógeno, por ejemplo, alquilo C1-C6, heteroalquilo C2-C6, alquinilo, halógenos (F, Cl, Br, I), N3, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R, NRCONR2, NRC(O)OR, NRC(O)R, CN, C(O)OR, C(O)NR2, OC(O)R, C(O)R, oxo y NO2, en los que cada R es de manera independiente H, alquilo C1-C6 o heteroalquilo C2-C6. Cuando un sustituyente opcional se une a través de un doble enlace, tal como un oxígeno de carbonilo u oxo (=O), el grupo acepta dos valencias disponibles, de tal modo que el número total de sustituyentes que se pueden incluir se reduce de acuerdo con el número de valencias disponibles.

[0101] Las sales, estereoisómeros y tautómeros de los compuestos de sulforodamina divulgados en el presente documento, tales como los compuestos de las fórmulas I, IA, II, IIA y III, se encuentran también en el alcance de esta divulgación. Tal como se utiliza en el presente documento, «estereoisómero» o «estereoisómeros» hacen referencia a los compuestos que difieren en la quiralidad de uno o más estereocentros. Los estereoisómeros incluyen enantiómeros y diastereómeros. Tal como se utiliza en el presente documento, «tautómero» hace referencia a formas alternativas de un compuesto que difieren en la posición de un protón, tal como tautómeros enol-ceto e imina-enamina. Tal como se utiliza en el presente documento, «sal» de un compuesto hace referencia a un ion del compuesto asociado iónicamente con un contraión. Se puede formar una sal de un compuesto mediante la reacción de neutralización de un ácido y una base. Las sales pueden derivar de una variedad de contraiones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica e incluyen, solamente a modo de ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio y tetraalquilamonio; y cuando la molécula contiene una funcionalidad básica, sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como clorhidrato, bromhidrato, tartrato, mesilato, acetato, maleato y oxalato. Aunque las estructuras de los compuestos divulgados en el presente documento pueden mostrarse solamente en una forma de resonancia, se entiende que todos las formas de resonancia están incluidas.

[0102] La síntesis de los compuestos de sulforodamina divulgados en el presente documento, por ejemplo, los compuestos de las Fórmulas I, IA, II, IIA, III y VI se puede lograr de cualquier manera adecuada utilizando las técnicas y los procedimientos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Beija M. et al, Chem. Soc. Rev., (2009): 38, 2410 2433; Kreimerman et al, Current Radiopharmaceuticals, (2017): 10, 212-220; Corrie J.E.T. y Munasinghe V.R. Dyes and Pigments 79 (2008): 76-82; Corrie J.E.T. et al. Bioconjugate Chem. 12 (2001): 186-194. Los ejemplos 1-9 expuestos a continuación muestran la síntesis de algunos compuestos de ejemplo de la divulgación.

Polinucleótidos Marcados

[0103] En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan polinucleótidos marcados con colorante de sulforodamina preparados mediante una síntesis automatizada de oligonucleótidos a partir de los colorantes de sulforodamina de fosforamiditas divulgados en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, «polinucleótido marcado con colorante de sulforodamina» hace referencia a un polinucleótido preparado mediante una síntesis automatizada de oligonucleótidos a partir de los colorantes de sulforodamina de fosforamiditas divulgados en el presente documento e incorpora un resto de colorante de sulforodamina en cualquiera de las dos formas abierta o cerrada.

[0104] En algunas realizaciones, en el presente documento se da a conocer un polinucleótido marcado que comprende un compuesto de la fórmula IV:

R2 es H, halógeno o SO2NH2;

R3 es H o halógeno;

n es un número entero de 1 a 9;

Y es:

en los que:

la línea ondulada es el punto de unión a la Fórmula IV;

Z es CH, N, NHC(O)N o OC(O)N;

W es H o L4-O-Z2,

Z1 es un nucleótido u oligonucleótido;

Z2 es un nucleótido, oligonucleótido o H; y en los que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido. En algunas realizaciones, R4 y R5 forman una cadena de alquileno C3 que conecta los átomos a los que está unido cada uno; R11 y R10 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno; R6 y R7 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno; y R8 y R9 forman una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que está unido cada uno. En determinadas realizaciones, R2 es Cl y R3 es H.

[0105] L3 puede comprender uno o más heteroátomos seleccionados entre N, O, S, P y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones de la Fórmula IV, L3 es -(OCH2CH2)n-, en donde n es un número entero de 1 a 5.

[0106] En algunas realizaciones, en el presente documento se da a conocer un polinucleótido marcado que comprende un com uesto de las fórmulas VA o VB:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal de los mismos, en los que:

R1 es alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido;

R2 es H, halógeno o SO2NH2,

R3 es H o halógeno;

L1 y L2 de manera independiente son un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o un heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido;

Z1 es un nucleótido u oligonucleótido; y

Z2 es un nucleótido, oligonucleótido o H.

[0107] En algunas realizaciones de las fórmulas VA o VB, R3 es H. En otras realizaciones, R2 es H. En otras realizaciones adicionales, R2 es Cl.

[0108] En otras realizaciones de las fórmulas VA o VB, R14 y R15 forman una cadena de alquileno C2, opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos metilo, que contienen los átomos a los que están unidos R14 y R15; y en otras realizaciones adicionales, R16 y R17 forman una cadena de alquileno C2, opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 grupos metilo, que conectan los átomos a los que están unidos R16 y R17. En determinadas realizaciones, R14 y R15 forman una cadena de etileno sustituida con 3 grupos metilo y R16 y R17 forman una cadena de etileno sustituida con 3 grupos metilo.

[0109] En determinadas realizaciones de las fórmulas VA o VB, R14 y R15 en conjunto y R16 y R17, en conjunto son:

[0110] Los polinucleótidos marcados divulgados en el presente documento pueden comprender uno o más compuestos adicionales. En algunas realizaciones de la presente divulgación, un polinucleótido comprende un compuesto de unión al surco menor. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende un intercalador.

[0111] Típicamente, un polinucleótido marcado con los colorantes divulgados en el presente documento es un polinucleótido en el que el esqueleto comprende 2'-desoxirribosa o ribosa. Sin embargo, un polinucleótido marcado puede comprender una o más modificaciones. En algunas realizaciones, un polinucleótido comprende una modificación de azúcar, por ejemplo, un azúcar modificado. Varias modificaciones de azúcar son útiles. Algunas modificaciones de azúcar no limitativas incluyen arabinosa, d-arabino-hexitol, 2 -fluoroarabinosa, xilulosa, hexosa, o un azúcar bicíclico.

[0112] Un polinucleótido marcado de la divulgación puede comprender una o más modificaciones de esqueleto. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una modificación de esqueleto. En algunas realizaciones, una modificación de esqueleto se selecciona entre el grupo que consiste en un esqueleto de fosfato con azúcar modificado, un esqueleto de ácido nucleico bloqueado, un esqueleto peptídico, un esqueleto de fosfotriéster, un esqueleto de fosforamidato, un esqueleto de siloxano, un esqueleto de carboximetiléster, un esqueleto de acetamidato, un esqueleto de carbamato, un esqueleto de tioéter, un esqueleto de fosfonato de metileno con puente, un esqueleto de fosforotioato, un esqueleto de metilfosfonato, un esqueleto de alquilfosfonato, un esqueleto de éster de fosfato, un esqueleto de alquilfosfonotioato, un esqueleto de fosforoditioato, un esqueleto de carbonato, un esqueleto de triéster de fosfato, un esqueleto de éster de carboximetilo, un esqueleto de metilfosforotioato, un esqueleto de fosforoditioato, un esqueleto de que tiene dos enlaces p-etoxi y una combinación de dos o más de cualquiera de los mencionados anteriormente. En una realización particular de la presente divulgación, la modificación del esqueleto es un esqueleto de fosfato con azúcar modificado.

[0113] Los polinucleótidos marcados divulgados en el presente documento pueden comprender una o más bases modificadas o no naturales. Las bases modificadas incluyen bases de timina y citosina modificadas (por ejemplo, aquellas divulgadas en las Patentes de EE. UU. Nos. 9,598,455 y 9,598,456), bases de 2,6-diaminopurina, bases universales y similares. Los polinucleótidos marcados divulgados en el presente documento pueden comprender segmentos no nucleosídicos o monómeros no nucleosídicos (por ejemplo, enlazadores, tales como enlazadores de poli(etilenglicol)).

[0114] En algunas realizaciones, el polinucleótido divulgado en el presente documento es una sonda, por ejemplo, una sonda de PCR de 5' nucleasa. En determinadas realizaciones, el polinucleótido comprende además uno o más marcadores adicionales, por ejemplo, un desactivador de fluorescencia. Tal como entenderá un experto en la técnica, la ubicación de un marcadora en el oligonucleótido puede variar y no está limitada a la divulgación del presente documento.

[0115] En algunas realizaciones, en el presente documento se proporciona un polinucleótido modificado que comprende un resto del colorante de sulforodamina como un fluoróforo en un extremo de su secuencia y un desactivador de fluorescencia en el otro extremo de su secuencia, de tal modo que el desactivador de fluorescencia reprime la señal de fluorescencia del fluoróforo en la sonda intacta (es decir, el oligonucleótido que se utiliza como sonda) a través de un mecanismo de transferencia de energía, tal como transferencia de energía por resonancia de fluorescencia ("FRET",fluorescence resonance energy transfer).Cuando una polimerasa extiende un cebador a lo largo de una plantilla con la que se ha hibridado también la sonda, la actividad de 5'-nucleasa de la polimerasa escinde la sonda, permitiendo de este modo que el fluoróforo se difunda lejos del desactivador de fluorescencia, de tal modo que se detecta ahora la señal fluorescente. La señal aumenta con cada ciclo de PCR de manera proporcional a la cantidad de sonda que se escinde, y, por consiguiente, proporcionalmente a la cantidad de producto de amplificación (por ejemplo, amplicón, secuencia diana). Esto permite la detección directa y la cuantificación de la secuencia de ADN diana.

[0116] En algunas realizaciones, el resto del colorante de sulforodamina se une a la base que se encuentra como mínimo a una posición de nucleótido del extremo de la secuencia del polinucleótido marcado y el desactivador de fluorescencia se une a una base que se encuentra como mínimo a una posición de nucleótido del otro extremo del polinucleótido marcado. En algunas realizaciones, el fluoróforo, por ejemplo, el resto de colorante de sulforodamina, y el desactivador de fluorescencia se ubican internamente dentro de una sonda. Tal como entenderá un experto en la técnica, la ubicación del fluoróforo y/o el desactivador de fluorescencia dentro de una sonda puede variar y no se limita.

[0117] En algunas realizaciones, el fluoróforo, por ejemplo, el resto del colorante de sulforodamina, y el desactivador de fluorescencia no se encuentran en los extremos de una sonda de FRET. En algunas realizaciones, el espectro de emisión del colorante de sulforodamina se solapa considerablemente sobre el espectro de absorción del desactivador de fluorescencia. Sin embargo, dicho solapamiento espectral es menos importante o no es necesaria cuando la desactivación implica un mecanismo de colisión, o el solapamiento aumenta, por ejemplo, debido a las condiciones de reacción o la estructura de la sonda.

[0118] En la técnica está disponible una gran cantidad de orientación práctica para la selección de pares de fluoróforodesactivador adecuados para sondas particulares. Véase, por ejemplo, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, Nueva York, 1971). Los desactivadores útiles para la inclusión en las sondas divulgadas en el presente documento incluyen desactivadores bis-azo (por ejemplo, aquellos divulgados en la Patente de EE. UU. No.

6,790,945), desactivadores disponibles de Biosearch Technologies, Inc. (Desactivadores Black Hole™: BHQ-1, BHQ-2 y BHQ-3), TAMRA, carboxitetrametil rodamina, ácido 4-((4-(dimetilamino)fenil)azo)benzoico (Dabcyl), desactivador Zen®, desactivador Blackberry®, 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ)-I y cloruro de 2-[6-(1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)-9-{2-[(4-[(2,5-dioxopirrolidin-1-il)oxi]carbonil piperidin-1-il)sulfonil]fenil}-3H-xanten-3-iliden]-2,3-dihidro-1H-isoindolio (QSY 21) y otros desactivadores conocidos en la técnica.

[0119] En otro aspecto adicional, en el presente documento se da a conocer un procedimiento para la preparación de un conjugado marcado de un ligando que comprende poner en contacto un ligando con un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 9 o de las reivindicaciones 12 a 14 en un disolvente adecuado en condiciones suficientes para unir de manera covalente el compuesto al ligando, formando de este modo el conjugado marcado con colorante. Los ligandos adecuados incluyen biomoléculas (por ejemplo, un polinucleótido, una proteína, un anticuerpo, un péptido o un polisacárido), polímeros sintéticos (por ejemplo, un polímero con un esqueleto de etileno, tal como ácido poliacrílico) y soportes sólidos (por ejemplo, cristal poroso controlado o poliestireno).

[0120] En algunas realizaciones, el ligando es un polinucleótido. En determinadas realizaciones, las condiciones suficientes para unir de manera covalente el compuesto de la presente divulgación al ligando, es decir, oligonucleótido o polinucleótido, son condiciones de la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamidita. Las condiciones de la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamiditas utilizadas para sintetizar y desproteger los oligonucleótidos sintéticos se conocen bien en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volumen I, Beaucage et al., Eds., John Wiley & Sons, 2002.

[0121] El procedimiento de síntesis de fosforamiditas de oligonucleótido, por ejemplo, ADN, se considera como el procedimiento de síntesis estándar utilizado en la mayoría de sintetizadores automatizados. A los bloques de construcción utilizados para la síntesis se les denominan habitualmente bloques de construcción de nucleótidos, monómeros o fosforamiditas de nucleósidos, que son derivados de nucleósido activados (fosforamiditas). Un grupo protector escindible por ácido, típicamente, el grupo dimetoxitritilo (DMT), se utiliza para proteger el extremo 5' terminal del nucleósido y se utiliza un grupo p-cianoetilo para proteger el resto del extremo 3' terminal. Un monómero puede incluir también grupos adicionales que sirven para proteger otros restos, por ejemplo, aminas primarias reactivas en las nucleobases. Los grupos protectores se seleccionan para prevenir la ramificación o que tengan lugar otras reacciones secundarias indeseables durante la síntesis. Los expertos serán capaces de seleccionar fácilmente grupos protectores que poseen propiedades adecuadas para ser utilizados en condiciones específicas de síntesis y desprotección y/o escisión. Una gran variedad de grupos protectores de amina se muestran, por ejemplo, en Greene & Wuts, «Protective Groups In Organic Chemistry», 3a edición, John Wiley & Sons, 1999 (de aquí en adelante «Green & Wuts»).

[0122] Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan en soportes sólidos, por ejemplo, columna rellena de cristal poroso controlado (CPG) o poliestireno, una membrana o un material similar. Un oligonucleótido normalmente se sintetiza desde el extremo 3' terminal en dirección al extremo 5' terminal. Normalmente el primer bloque de construcción de nucleótido o monómero se ancla al soporte, típicamente, a través de un enlazador, tal como un cristal poroso controlado mediante alquilamina de cadena larga (LCAA-CPG).

[0123] En algunas realizaciones, los procedimientos de la síntesis que utilizan reactivos de fosforamiditas implican múltiples rondas de: (i) desprotección con DMT para revelar un hidroxilo libre, que se puede realizar, por ejemplo, mediante el tratamiento con ácido dicloroacético o tricloroacético al 2,5 % o 3 % en diclorometano; (ii) acoplamiento de nucleósido u otros reactivos de fosforamiditas al hidroxilo libre, que se puede llevar a cabo, por ejemplo, en acetonitrilo que contiene tetrazol (por ejemplo, 0,45 M o 0,5 M de tetrazol); (iii) oxidación, que se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el tratamiento con l2/2 ,6-lutidina/H2O; y “capping” que se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el tratamiento con anhídrido acético al 6,5 % en tetrahidrofurano (THF) activado con 1-metilimidazol (NMI) al 10 % en THF.

[0124] También se conocen en la técnica otras condiciones de realización de diferentes etapas en la síntesis y se pueden utilizar en el presente documento. Por ejemplo, el acoplamiento de fosforamiditas se puede llevar a cabo en acetonitrilo que contiene 0,25 M de 5-etiltio-1H-tetrazol, 0,25 M de 4,5-dicianoimidazol (DCI) o 0,25 M de 5-benziltio-1H-tetrazol (BTT). La oxidación se puede llevar a cabo con 0,1 M, 0,05 M o 0,02 M de I2 en THF/H2O/piridina (7:2:1).

El “capping” se puede llevar a cabo mediante el tratamiento con THF/lutidina/anhídrido acético seguido del tratamiento con NMI al 16 % en THF.

[0125] La eliminación de cualquier grupo protector y escisión del reactivo de la síntesis se logra típicamente mediante el tratamiento con hidróxido de amonio concentrado a 60 °C durante 1-12 horas, aunque las fosforamiditas de nucleósido protegidas con grupos que se pueden eliminar en condiciones más suaves, tales como mediante el tratamiento con hidróxido de amonio concentrado a temperatura ambiente durante 4-17 horas o tratamiento con carbonato de potasio 0,05 M en metanol, o tratamiento con t-butilamida al 25 % en agua/EtOH, también se conocen y se pueden utilizar.

[0126] El término «escisión» en referencia a la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida significa romper el enlace que une un oligonucleótido a un soporte de fase sólida. En algunas realizaciones, la escisión implica hidrólisis de un enlace de éster de succinato entre el hidroxilo del extremo 3' de un oligonucleótido unido y el soporte de fase sólida.

[0127] El término «desprotección», tal como se utiliza en el presente documento, significa la eliminación de grupos protectores de las aminas exocíclicas de las bases heterocíclicas de un oligonucleótido. Normalmente, la desprotección implica la hidrólisis de un resto de amida que consiste en una amina exocíclica y un grupo protector amino, por ejemplo, benzoílo o isobutirilo. Diferentes técnicas y procedimientos de desprotección se conocen en la técnica.

[0128] Aunque cada uno de los elementos de la presente invención se describe en el presente documento como que contiene múltiples realizaciones, se debería entender que, a menos que se indique lo contrario, cada una de las realizaciones de un elemento determinado de la presente invención es capaz de ser utilizada con cada una de las realizaciones de los otros elementos de la presente invención y cada uno de tales usos pretende formar una realización distinta de la presente invención.

[0129] Cualquier conflicto entre cualquier referencia citada en el presente documento y las enseñanzas específicas de esta memoria descriptiva deben resolverse a favor de la segunda. Del mismo modo, cualquier conflicto entre una definición conocida la técnica de una palabra o frase y una definición de la palabra o la frase tal como una que se enseña de manera específica en esta memoria descriptiva debe resolverse a favor de la última.

[0130] La presente invención se ilustra mediante los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se incluyen con fines ilustrativos solamente y no pretenden limitar la invención.

EJEMPLOS

[0131] Se obtuvieron los espectros de la resonancia magnética nuclear (RMN) de protón (1H, 400 MHz) y de fósforo (31P, 160 Mhz) en un instrumento Bruker Biospin 400. Las muestras de Rm N se prepararon en DMSO-d6 y CD3CN y se utilizó el disolvente protonado residual como un patrón interno de desplazamiento químico. Los datos de LCMS se obtuvieron mediante la ionización por electrospray (ESI) en instrumentos Agilent series 1200 (LC/MSD Trap XCT Plus) y Agilent 1260 infinity (6130 LC/MS Cuadrupolo). Se llevó a cabo una cromatografía automatizada en gel de sílice 60 utilizando instrumentos Biotage Isolera LS y Teledyne ISCO Torrent® Combi Flash. Se llevó a cabo la cromatografía de capa fina analítica en gel de sílice 60 f254 soportado en aluminio, y se visualizaron las placas bajo una lámpara UV (254 y 365 nm). Los reactivos procedían de fuentes comerciales a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1: Síntesis del colorante de sulforodamina S1

[0132] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S1 que comprende un grupo fosforamidita. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5' terminal de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0133] El compuesto S1 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Esquema 1.

Compuesto 1

[0134] Se añadió por partes una mezcla seca de compuestos CFBSA (4,0 g, 1 eq) y8-hidroxijuloMdina (HJ, 6,2 g, 2 eq) a una solución acuosa de ácido sulfúrico (60 %, 32 ml) en un recipiente multipuerto (> 3; cualquiera de los puertos que no se utiliza estaba abierto al ambiente) a 132-138 °C. El progreso de la reacción se controló utilizando HPLC. Cuando la reacción se completó (7-16 horas), se permitió que la mezcla de reacción se enfriara hasta la temperatura ambiente y, a continuación, se vertió en una solución acuosa fría diluida de NaOH (110 ml). Después de que se ajustó el pH a 8,5-11, el producto de la reacción de ciclocondensación (Compuesto 1) se aisló mediante filtración y, a continuación, se secó en un horno al vacío a 45-50 °C durante > 16 horas. A continuación, el producto se disolvió en 130 ml de diclorometano (DMC) y la solución se filtró. La concentración de la capa de DCM generó el Compuesto 1 (6 g, 65 %) que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación adicional. LCMS: m/z 561,5; [M+H] 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8 7,94 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 7,60 (dd, 1H, J = 8,0, 2,4 Hz), 7,10 (d, 1H, J = 8,0Hz), 6,59 (s, 2H), 3,58 (m, 8H), 2,98 (m, 4H), 2,52 (m, 4H), 1,99 (m, 4H), 1,83 (m, 4H).

Compuesto 2

[0135] El Compuesto 1 (8 g, 14,3 mmol) se suspendió en DCM anhidro (120 ml) a temperatura ambiente (TA) y se trató con POCh (13,1 ml, 10 eq) durante la noche. El progreso/finalización de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10 %/DCM). Cuando la reacción se completó, la mezcla se concentró al vacío y la espuma resultante se secó al vació durante 90-150 minutos a 40 °C. A continuación, la espuma se disolvió en diclorometano anhidro (150 ml) bajo argón. La solución de la reacción se enfrió hasta 0-5 °C y se trató con N,N-diisopropiletilamina (DIEA) (25 ml, 10 eq) y 2- aminoetoxietanol (AEE) (7,2 ml, 5 eq) mientras se mantenía la temperatura por debajo de 8 °C. La mezcla de reacción se agitó mientras se calentaba hasta TA durante 1-2 horas, a continuación, se agitó a TA durante la noche. El progreso de la reacción se controló mediante CCF (MeOH al 10 %/DCM). La mezcla de reacción se diluyó con DCM (250 ml) y se lavó con HCl 1 N (2 X 185 ml), solución acuosa saturada de cloruro sódico (1 x 200 ml) y se secó sobre Na2SO4. La filtración, la concentración y la purificación utilizando la purificación de columna en gel de sílice generaron el Compuesto 2 puro (3,74 g, 40 % de rendimiento). LCMS: m/z 648,5 [M+H]; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 88,19 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,60 (dd, 1H, J = 8,0, 2,0 Hz), 6,95 (1H, d, J = 8 Hz), 6,28 (s, 2H), 4,4 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,30 (m, 3H), 3,15 (m, 12H), 2,90 (t, 2H, J = 6,8 Hz), 2,82 (m, 4H), 2,51 (m, 4H), 1,96 (m, 4H), 1,81 (m, 4H).

Compuesto S1

[0136] El Compuesto 2 (2,8 g, 4,3 mmol) se colocó en un matraz con fondo redondo de 3 bocas y se secó a vacío elevado (< 2 mBar) durante como mínimo 90 minutos. A continuación, el compuesto seco se disolvió en DCM anhidro (88 m) bajo argón. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0-5 °C y se añadió DIEA (7,5 ml, 10 eq), seguido de la adición gota a gota de N,N-diisopropilclorofosforamidito de 2-cianoetilo (PAM-Cl) (1,2 ml,1,4 eq) mientras se mantenía la temperatura interna a 0-5 °C. La mezcla de reacción se agitó mientras se calentaba hasta TA hasta su finalización (2 3 horas). La mezcla de reacción se diluyó con DCM (88 ml) y se lavó con NaHCO3 (2 x 45 ml) y solución acuosa saturada de cloruro sódico (45 ml) y la capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La filtración, la concentración y la purificación en columna de gel de sílice de producto en bruto produjeron el producto puro como un sólido rosa (1,75 g, 48 % de rendimiento). LCMS: m/z 848,2 [M+H]; 31P RMN (CD3CN, 160 MHz): 8 148,25; 1H RM (DMSO-d6, 400 MHz): 88,18 (d, 1H, J = 2 Hz), 7,59 (dd, 1H, J = 8,4, 2,0 Hz), 6,96 (d, 1H, J = 8 Hz), 6,27 (s, 2H), 3.66 (m, 2H), 3,27 (t, 2H, J = 5,2 Hz), 3,20 (t, 1H, J = 6,8 Hz), 3,10-3,20 (m, 8H), 2,90 (t, 2H, 6,8 Hz), 2,82 (t, 4H, J = 6,4Hz), 2,70 (t, 2H, J = 7,0 Hz)), 2,40-2,51 (m, 4H), 1,95 (m, 4H), 1,78 (m, 4H), 1,13 (d, 6 H, J = 8 Hz), 1,05 (d, 6 H, J = 8 Hz).

Ejemplo 2: Síntesis del colorante de sulforodamina S2

[0137] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S2 que comprende un grupo fosforamidita y un grupo hidroxilo protegido con el grupo dimetoxitritilo. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5' o en la posición central de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0138] El compuesto S2 se preparó de acuerdo con el procedimiento indicado en el Esquema 2.

Compuesto 3

[0139] Se enfrió ácido trifluorometanosulfónico (50 ml) en un matraz con fondo redondo de 150 ml se enfrió hasta 0 °C bajo atmósfera de argón. Se añadió por partes 8-hidroxijulolidina (HJ) (15,0 g, 79,3 mmol) durante 20 minutos y se dejó que la mezcla se calentara hasta TA, a continuación, se agitó a TA hasta que la 8-hidroxijulolidina se disolvió por completo. Se añadió de golpe anhídrido cíclico de ácido 2-sulfobenzoico (10,95 g, 59,5 mmol). La mezcla se calentó hasta 110 °C y se agitó durante 18 horas, a continuación, se enfrió hasta TA. La mezcla de reacción se añadió gota a gota a una mezcla de NaOAc 3 M (300 ml) y hielo picado (200 ml). A la mezcla resultante, se le añadió DMC (500 ml) y la mezcla se transfirió a un embudo separador. Se recogió la capa orgánica y se lavó con agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. Las capas acuosas combinadas se retroextrajeron con DCM y se combinaron todas las capas orgánicas. Después del secado sobre Na2SO4, la solución se filtró y se eliminó el DCM al vacío. El producto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (lecho de 3"x7") utilizando desde 2 % hasta 10 % de agua/acetonitrilo (ACN). Aparece una impureza de color rojo oscuro de la columna en el frente de disolvente. El Rf del producto en CCF es de 0,4 en agua al 10 %/ACN. La concentración de fracciones que contienen producto produjo el Compuesto 3 (8,34 g, 40 %). 1H RMN (DMSO-da, 400 MHz): 87,80 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,60 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,51 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 7,09 (d, 1 H, J = 7,4 Hz) 6,58 (s, 2H), 3,49 (m, 8H), 2,98 (m, 4H), 2,62 (m, 4H), 2,02 (m, 4H), 1,83 (m, 4H); LCMS: m/z 527,5 [M+H].

Compuesto 4

[0140] Bajo argón, se disolvió el Compuesto 3 (6,50 g, 12,3 mmol) se disolvió en 60 ml de DCM anhidro y se añadió POCI3 (5,00 ml, 53,6 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 24 horas. Se eliminó el DCM bajo presión reducida a TA, y, a continuación, se eliminó el exceso de POCh bajo presión reducida a 60 °C para producir una espuma. La espuma se disolvió en 150 ml de DCM anhidro bajo atmósfera de argón y la solución se enfrió hasta 0 °C. Se añadió diisopropiletilamina (22,0 ml, 124 mmol), la mezcla se enfrió de nuevo hasta 0 °C y se añadió 2-(2-aminoetoxi)etanol (6,20 ml, 62,2 mmol). Se dejó que la mezcla de reacción se calentara hasta TA y se agitó durante 2,5 horas. La mezcla se desactivó mediante la adición suficiente de metanol para disolver todos los sólidos. La mezcla se lavó con NaHCO3 saturado, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. El producto se sometió a cromatografía en gel de sílice (3"x6"), EtOAc al 30 %/hexanos hasta EtOAc al 60 %/hexanos que contenía trietilamina (TEA) al 10 % para producir 4,56 g (60 %) del Compuesto 4. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8 7,94 (dd, 1H, J = 3,6, 2.8 Hz), 7,58 (dd, 2H, J = 5,6, 3,2 Hz), 6,93 (dd, 1H, J = 6,4, 3,2 Hz), 6,27 (s, 2H), 4,4 (t, 1 H, J = 5,6 Hz), 3,31 (m, 2 H), 3,07-3,20 (m, 12H), 2,89 (t, 2H J = 7,2 Hz), 2,83 (t, 4H, J = 6,4 Hz)), 2,45 (m, 4H), 1,95 (m, 4H), 1,79 (m, 4H). LCMS: m/z 614,5 [M+H].

Compuesto 5

[0141] Bajo argón, se disolvió el Compuesto 4 (1,58 g, 2,57 mmol) en 50 ml de DCM anhidro y se añadió TEA (3,60 ml, 25,8 mmol), seguido de p-nitrofenilclororformiato (777 mg, 3,85 mmol). La mezcla resultante se agitó a TA durante 18 horas. Se añadió mono-DMT-dietanolamina (2,09 g, 5,13 mmol) y se continuó la agitación a TA durante otras 24 horas. La mezcla se lavó con NaHCO3 saturado, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico y se secó sobre Na2SO4. La purificación del producto mediante cromatografía en gel de sílice, EtOAc al 40 %/hexanos hasta EtOAc al 70 %/hexanos que contenía TEA al 10 % produjo 1,78 g (66%) del Compuesto 5. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8 7,85 (m, 1H), 7,42 (m, 4H), 7,29 (m, 7H), 6,99 (m, 1H), 6,82 (d, 4H, J = 8,8 Hz), 6,44 (s, 2H), 4,10 (m, 1H), 4,05 (m, 1H), 3,79 (s, 6 H), 3,76 (m, 1H), 3,66 (m, 1H), 3,57-3,21 (m, 10H), 3,18-3,02 (m, 11H), 2,89 (t, 4H, J = 6,5 Hz), 2,54 (m, 4H), 2,04 (m, 4H), 1,87 (m, 4H). LCMS: m/z 1047,7 [M+H].

Compuesto S2

[0142] Bajo argón, se disolvió el Compuesto 5 (300 mg, 0,287 mmol) en 20 ml de DCM anhidro. Se añadió DIEA (0,500 ml, 2,87 mmol), seguido de PAM-Cl (0,080 ml, 0,389 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 4 horas y, a continuación, se lavó con NaHCO3 saturado, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La cromatografía en gel de sílice (EtOAc al 20 %/hexanos hasta EtOAc al 40%/hexanos que contenía TEA al 5 %) produjo 0,213 g (60 %) del Compuesto S2. 1H RMN (CD3CN, 400 MHz): 87,82 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 7,42 (m, 4H), 7,24 (m, 7H), 6,82 (m, 5H), 6,36 (s, 2H), 3,93 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,72 (s, 6 H), 3,65 (m, 4H), 3,45 (m, 1H), 3,40 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,27 (m, 1H), 3,19 (m, 1H), 3,13 (m, 1H), 3,06 (m, 10H), 2,92 (m, 1H), 2,82 (m, 4H), 2,60 (m, 1H), 2,48 (m, 2H), 2,41 (m, 2H), 1,96 (m, 4H), 1,77 (m, 4H), 1,19 (m, 12H). 31P RMN (CD3CN, 160 MHz): 8 147,5.

Ejemplo 3. Síntesis del colorante de sulforodamina S3

[0143] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S3 que comprende un éster de NHS. Este colorante es adecuado para el marcaje fluorescente de biomoléculas, por ejemplo, péptidos, a través de reacción de conjugación con un grupo amino.

[0144] El compuesto S3 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Esquema 3.

Compuesto

[0145] Se disolvió el Compuesto 3 (2,87 g, 5,28 mmol) en 50 ml de DCM anhidro bajo argón y se añadió POCI3 (2,5 ml, 26,8 mmol). La mezcla resultante se agitó a TA durante la noche. Se eliminaron DCM y POCh bajo vacío y el intermedio se volvió a disolver en DCM anhidro (100 ml). La solución se enfrió hasta 0 °C bajo argón. Se añadió DIEA (18,5 ml, 106 mmol), seguido de metil-6-aminocaproato-HCl (4,83 g, 26,6 mmol). Se dejó que la mezcla de reacción se calentara hasta TA y se agitó durante 2 horas, a continuación, se lavó con agua (3x) y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. El producto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice utilizando EtOAc al 40 %/hexanos con TEA al 10 %. El producto en forma ciclada que se forma en condiciones básicas es incoloro; los puntos de CCF lentamente se vuelven rosas a medida que la TEA se evapora. La purificación produjo 1,30 g (37%) del Compuesto 6 como una espuma azul clara. 1H RMN (CDCl3, 400 MHz): 87,87 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 7,46 (m, 2H), 7,00 (m, 1H), 6,44 (s, 2H), 3,66 (s, 3H), 3,16 (m, 8H), 2,91 (m, 6 H), 2,58 (m, 4H), 2,14 (m, 2H), 2,07 (m, 4H), 1,89 (m, 4H), 1,39 (m, 4H), 1,15 (m, 2H). LCMS: m/z 654,3 [M+H].

Compuesto 7

[0146] El Compuesto 6 (1,30 g, 1,99 mmol) se disolvió en acetonitrilo (60 ml), agua (15 ml) y 4,5 ml de HCl concentrado. La solución se calentó a 80 °C durante 18 horas y, a continuación, se diluyó con DCM, se lavó con NaHCO3 saturado, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 para producir 1,21 g del Compuesto 7 en bruto que se utilizó en la próxima etapa sin purificación adicional. LCMS: m/z 640,3 [M+H].

Compuesto S3

[0147] Se disolvió el Compuesto 7 (1,21 g, 1,89 mmol) en 25 ml de dimetilformamida anhidra (DMF) bajo argón. Se añadieron N-hidroxisuccinimida (435 mg, 3,78 mmol) y N-(dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC) (725 mg, 3,78 mmol). La mezcla se agitó a TA durante la noche y, a continuación, la DMF se eliminó al vacío. El residuo se disolvió en DMC y la solución se lavó con HCl 1 N, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La cromatografía en gel de sílice con 5 % de HOAc y 1 % de MeOH hasta 5 % de MeOH en DMC produjo 880 mg (63%) del Compuesto S3. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 87,92 (m, 1H), 7,58 (m, 2H), 6,95 (m, 1H), 6,24 (s, 2H), 3,11 (m, 8H), 2,84 (m, 6H), 2,82 (s, 4H), 2,46 (m, 4H), 1,94 (m, 6 H), 1,79 (m, 4H), 1,21 (m, 4H), 1,12 (m, 2H). LCMS: m/z 737,3 [M+H].

Ejemplo 4: Síntesis del colorante de sulforodamina S4

[0148] Otro colorante de ejemplo S4 que comprende un derivado de éster activado se puede preparar fácilmente de acuerdo con el procedimiento descrito en el Esquema 4 utilizando las condiciones de reacción descritas anteriormente para el Compuesto S3.

[0149] Se disolvió el Compuesto 1 (4,0 g, 0,0071 mol) en DCM anhidro (60 ml) bajo atmósfera de argón. Se añadió oxicloruro de fósforo puro (6,5 ml, 0,071 mol) de golpe y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 23 horas. Los disolventes se eliminaron en un evaporador rotatorio y la espuma resultante se secó a 5 mbar durante 2 horas. A la espuma, se le añadió DCM anhidro (75 ml) bajo atmósfera de argón y el matraz de reacción se colocó en un baño de hielo/agua. Se añadió lentamente N,N-diisopropiletilamina (18,5 ml, 0,107 mol) a 0-5 °C. Se añadió por partes clorhidrato de 6-aminohexanoato de metilo sólido (6,5 g, 0,0360 mol) durante 10 minutos. Después de 1 hora, se extrajo el baño de hielo y se dejó que la mezcla de reacción se agitara hasta temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (125 ml) y se lavó con HCl 1 N (2 x 90 ml) y solución acuosa saturada de cloruro sódico (1 x 120 ml) y, a continuación, se secó sobre sulfato de sodio. La filtración, la concentración y la purificación en columna de gel de sílice (acetato de etilo/heptano/TEA, 30:10:60) produjeron el producto (2,4 g, ~49 % de rendimiento) como un sólido de color dorado. LCMS: m/z 688,5 [M+H] 1H Rm N (CDCh, 400 MHz): 87,83 (d, 1H, J = 1,6 Hz), 7,4 (dd, 1H, J = 8,4, 2,0 Hz), 6,95 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,42 (s, 2H), 3,65 (s, 3H), 3,16 (m, 8H), 2,89 (m, 6 H), 2,58 (m, 4H), 2,14 (t, 2H, J = 8 Hz), 2,06 (m, 4H), 1,91 (m, 4H), 1,40 (m, 4H), 1,15 (m, 2H).

Compuesto S4

[0150] El Compuesto 8 (0,60 g, 0,00087 mol) se suspendió en acetonitrilo (30 ml) con agitación. Se añadió agua DI (desionizada) (7 ml) y la suspensión se agitó durante unos minutos. Se añadió gota a gota ácido clorhídrico concentrado (3 ml) que produjo una solución roja/púrpura. La solución se calentó a reflujo suave durante 2-3 horas, a continuación, se dejó agitando hasta temperatura ambiente durante 15 horas. El volumen de la mezcla de reacción (de color púrpura) se redujo a la mitad mediante evaporación en el evaporador rotatorio y el producto se precipitó vertiendo la solución de reacción en agua DI (75 ml) a temperatura ambiente. La suspensión se filtró, la torta se lavó con agua DI adicional y se secó en un horno al vacío a 40-50 °C y vacío de < 2 mbar durante 20 horas para producir 0,54 g (93 % de rendimiento) del Compuesto 9 como un polvo púrpura que se utilizó como tal con la etapa siguiente.

[0151] El Compuesto 9 obtenido anteriormente (0,2 g, 0,000296 mol) se colocó en un matraz con fondo redondo de 10 ml y se disolvió en DMF anhidra (3,0 ml) bajo atmósfera de argón. A la solución púrpura resultante, se le añadieron N-hidroxisuccinimida (0,04 g, 0,00034 mol, 1,15 eqv) y EDC (0,075 g, 0,00039 mol, 1,3 eq) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (40 ml) y se lavó con agua (20ml) y se secó sobre Na2SO4. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna utilizando 5-15 % de MeOH/DCM para generar 0,14 g (61 % del rendimiento) del Compuesto S4. LCMS: m/z 771,6 [M+H] 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 8 8,17 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,60 (dd, 1H, J = 8,4, 2,0 Hz), 6,98 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 6,24 (s, 2H), 3,13 (m, 8H), 2,82 (m, 6 H), 2,74 (m, 2H), 2,55 (m, 4H), 2,41 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 1,94 (m, 4H), 1,79 (m, 4H), 1,10-1,35 (m, 8 H)

Ejemplo 5: Síntesis del colorante de sulforodamina S5

[0152] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S5 que comprende un grupo fosforamidita. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5' de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0153] El compuesto S5 se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Esquema 5.

Compuesto

[0154] Se enfrió agua (27 ml) hasta 0 °C y se añadieron lentamente 41 ml de H2SO4 concentrado. La solución resultante se calentó hasta 160 °C. Se añadieron por partes ácido 2-formilbencenosulfónico (5,03 g, 24,2 mmol) y 3-(dimetilamino)fenol (6,63 g, 48,3 mmol) mezclados previamente con intensidad durante 1 minuto a la solución de ácido sulfúrico. La solución se agitó a 160 °C durante 8 horas al aire, a continuación, se enfrió hasta TA y se agitó durante otras 8 horas. Se mezcló agua fría (300 ml, alrededor de 0 °C) con 100 ml de NaOH 10 M. La mezcla de reacción en bruto se añadió gota a gota a la solución de NaOH, manteniendo la temperatura por debajo de 25 °C. Una vez se añadió la mezcla de reacción, se añadió más NaOH 10 M hasta que el pH fuera aproximadamente de 8,5. La mezcla se agitó a TA durante la noche. Se recogieron los sólidos mediante filtración al vacío y se secaron bajo vacío elevado sobre KOH para producir 10,6 g del material en bruto que contenía aproximadamente un 50 % de sales inorgánicas. Una parte de 3,57 g del material en bruto se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (2" x 7") utilizando un gradiente de disolvente de MeOH/DCM (4 % hasta 10 % de MeOH). Se produjo una mezcla de isómeros, con el isómero deseado que se eluía el primero. Se obtuvieron 780 mg (22 %) del Compuesto 10. LCMS: m/z 423,4 [M+H].

Compuesto 11

[0155] Al Compuesto 10 (740 mg, 1,75 mmol) en 75 ml de DCM anhidro bajo argón, se añadió POCh (1,64 ml, 6,50 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 18 horas. Se eliminó DCM bajo presión reducida a TA, y, a continuación, se eliminó el exceso de POCh bajo presión reducida a 60 °C para producir una espuma. La espuma se disolvió en 125 ml de DCM anhidro bajo argón y la solución se enfrió hasta 0 °C. Se añadieron trietilamina (3,10 ml, 17,8 mmol) y 2-(2-aminoetoxi)etanol (0,875 ml, 8,78 mmol). Se dejó que la mezcla se calentara hasta TA y se agitó durante 1 hora, a continuación, se lavó con agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La cromatografía en gel de sílice (1"x7"), 40 % de EtOAc/hexanos hasta 60 % de EtOAc/hexanos que contenía TEA al 10 %, produjo 438 mg (49 %) del Compuesto 11. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 88,00 (m, 1H), 7,61 (m, 2H), 6,96 (m, 1H), 6,71 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,53 (m, 2H), 6,43 (d, J = 2,5 Hz, 2H), 4,44 (t, J = 5,6 Hz, 1H), 3,31 (m, 2H), 3,14 (m, 4H), 2,93 (s, 12H), 2,91 (m, 2H). LCMS: m/z 510,4 [M+H].

Compuesto S5

[0156] Se disolvió el Compuesto 11 (423 mg, 0,830 mmol) en 25 ml de DCM anhidro bajo argón y se añadió DIEA (0,725 ml, 4,16 mmol), seguido de PAM-Cl (0,190 mL, 0,924 mmol). La mezcla se agitó a T<a>durante 3 horas, se lavó con NaHCO3, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico y la capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La cromatografía en gel de sílice, EtOAc al 20 %/hexanos hasta EtOAc al 40 %/hexanos que contenía TEA al 10 %, produjo 485 mg (82 %) del Compuesto S5. 1H RMN (CD3CN, 400 MHz): 87,89 (m, 1H), 7,57 (m, 2H), 6,97 (m, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,52 (m, 2H), 6,44 (m, 2H), 3,73 (m,2H), 3,56 (m, 4H), 3,26 (m, 4H), 2,97 (s, 12H), 2,61 (m, 2H), 1,97 (m, 2H), 1,19 (d, J = 6,8 Hz, 6H), 1,12 (d, J = 6,8 Hz, 6H) 31P RMN (CD3CN, 160 MHz): 6148,1.

Ejemplo 6: Síntesis del colorante de sulforodamina S6

[0157] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S6 que comprende un grupo fosforamidita y un grupo hidroxilo protegido con el grupo dimetoxitritilo. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5’ o en la posición central de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0158] El compuesto S6 se preparó de acuerdo con el procedimiento del Esquema 6.

Compuesto 13

[0159] La síntesis del Compuesto 12 se llevó a cabo mediante el tratamiento con óxido de etileno de 2,3,3-trimetil-2,3-dihidro-1H-indol-6-ol en ácido acético (FCH Group, Letonia). Se enfrió agua (27 ml) hasta aproximadamente 0 °C y se añadió lentamente H2SO4 concentrado (41 ml). La solución resultante se calentó en un matraz de 250 ml, 3 bocas, fondo redondo, hasta 160 °C. Se añadieron por partes ácido 2-formilbencenosulfónico (3,21 g, 15,4 mmol) y Compuesto 12 (6,82 g, 30,8 mmol) mezclados previamente con intensidad durante 1 minuto a la solución de ácido sulfúrico. La solución se calentó a 160 °C durante 6 horas abierta al aire, a continuación, se enfrió hasta TA y se añadió lentamente a 300 ml de NaOH 5 M frío. El pH se ajustó hasta 9 con H2SO4. La mezcla se extrajo con DCM (2x). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución acuosa saturada de cloruro sódico y se secaron sobre Na2SO4.

El disolvente se eliminó al vacío y los sólidos en bruto se secaron bajo vacío elevado sobre KOH para producir 2,25 g del material en bruto. La cromatografía en columna de gel de sílice (2" x 6") utilizando un sistema de disolventes de ACN/agua (5 hasta 8 % H2O) produjo 526 mg (6 %) del Compuesto 13. 1H RMN (DMSO-da, 400 MHz): 88,03 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,64 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,15 (m, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,64 (s, 2H), 5,01 (s, 2H), 3,76 (m, 8H), 3,48 (m, 2H), 1,11 (m, 18H). LCMS: m/z 591,5 [M+H].

Compuesto 14

[0160] Se disolvió el Compuesto 13 (525 mg, 0,889 mmol) en 15 ml de piridina anhidra bajo argón. Se añadieron anhídrido acético (0,210 ml, 2,22 mmol) y DMAP (11 mg, 0,090 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 3 horas. Se eliminó piridina al vacío y se purificó el residuo mediante cromatografía de gel de sílice (1"x7") utilizando un sistema de disolventes de MeOH/DCM (2 hasta 10%) para producitr 531 mg (89%) del Compuesto 14. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 88,03 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,66 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,18 (m, 1H), 6,94 (s, 2H), 6,69 (s, 2H), 4,31 (m, 4H), 3,96 (m, 2H), 3,78 (m, 2H),3,71 (m,2H), 1,99 (s,3H), 1,97 (s, 3H), 1,18 (m, 12H), 0,98 (s, 6H). LCMS: m/z 675,5 [M+H].

Compuesto 15

[0161] Se disolvió el Compuesto 14 (520 mg, 0,771 mmol) en 25 ml de DCM anhidro bajo argón y se añadió POCh (0,360 ml, 3,68 mmol). La mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 horas, a continuación, se añadió metilamina 2,0 M en THF (11,6 ml, 23,1 mmol) y la mezcla se agitó durante 1 hora. La mezcla se lavó con agua, NaHCO3 saturado y solución acuosa saturada de cloruro sódico y la capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La cromatografía en gel de sílice (1"x7"), EtOAc al 10 %/hexanos hasta EtOAc al 30 %/hexanos que contenía TEA al 10 %, produjo 437 mg (82%) del Compuesto 15. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 88,01 (m, 1H), 7,61 (m, 2H), 7,02 (m, 1H), 6,43 (m, 2H), 6,33 (m, 2H), 4,18 (m, 4H), 3,47 (m, 2H), 3,29 (m, 4H), 2,27 (s, 3H), 1,98 (m, 6H), 1,09 (m, 9H), 0,97 (s, 3H), 0,84 (s, 3H), 0,71 (s, 3H). LCMS: m/z 688,5 [M+H].

Compuesto 16

[0162] El Compuesto 15 se disolvió en 20 ml de MeOH y se añadió una solución de K2CO3 en 5 ml de agua. La mezcla se agitó a TA durante 1 hora. Se eliminó MeOH al vacío, el residuo se lavó con agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico y se secó sobre Na2CO3 y bajo presión elevada para producir 336 mg (90 %) del Compuesto 16 que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación adicional. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 87,99 (m, 1H), 7,60 (m, 2h ), 7,01 (m, 1H), 6,41 (s, 2H), 6,24 (m, 2H), 4,71 (t, J = 4,8 Hz, 2H), 3,54 (m, 4H), 3,28 (m, 4H), 3,16 (m, 2H), 2,27 (s, 3H), 1,08 (m, 9H), 0,97 (s, 3H), 0,85 (s, 3H), 0,71 (3H). LCMS: m/z 604,5 [M+H].

Compuesto 17

[0163] El Compuesto 16 (329 mg, 0,545 mmol) se secó mediante evaporación azeotrópica con 12 ml de piridina anhidra (2X). El material seco se disolvió en 12 ml de piridina anhidra y se añadió DMTCl (258 mg, 0,761 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 18 horas y la reacción se desactivó con metanol (2 ml). Los disolventes se eliminaron al vacío. La cromatografía en gel de sílice (1"x7"), EtOAc al 30 %/hexanos hasta EtOAc al 40 %/hexanos que contenía TEA al 10 %, produjo 232 mg (47%) del Compuesto 17. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 88,01 (m, 1H), 7,62 (m, 2H), 7,52 (m, 1H), 7,35 (m, 2H), 7,22 (m, 7H), 7,05 (m, 1H), 6,81 (m, 4H), 6,43 (m, 1H), 6,36 (m, 1H), 6,29 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 3,68 (m, 6H), 3,57 (m, 3H), 3,25 (m, 7H), 2,25 (m, 3H), 1,09 (m, 9H), 0,97 (m, 3H), 0,86 (m, 3H), 0,73 (m, 3H). LCMS: m/z 906,8 [M-H].

Compuesto S6

[0164] A una solución del compuesto 17 (227 mg, 0,251 mmol) en 20 ml de DCM anhidro bajo argón, se le añadió DIEA (0,218 ml, 1,25 mmol), seguido de PAM-Cl (0,075 ml, 0,365 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 2 horas y, a continuación, se lavó con NaHCO3, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4. La cromatografía de gel de sílice, EtOAc al 20 %/hexanos hasta EtOAc al 30 %/hexanos que contenía TEA al 10 %, produjo 212 mg (77%) del Compuesto S6. 1H RMN (CD3CN, 400 MHz): 87,91 (m, 1H), 7,57 (m, 2H), 7,41 (m, 2H), 7,28 (m, 7H), 7,03 (m, 1H), 6,81 (m, 4H), 6,56 (m, 2H), 6,32 (m, 2H), 3,79 (m, 2H), 3,72 (m, 6H), 3,58 (m, 4H), 3,41 (m, 2H), 3,33 (m, 2H), 3,22 (m, 2H), 2,53 (m, 2H), 2,32 (m, 3H), 1,11 (m, 21H), 1,03 (m, 3H), 0,93 (m, 3H), 0,80 (m, 3H). 31P RMN (CD3CN, 160 MHz): 8147,3.

[0165] Se incorporó el Compuesto S6 en el extremo 5' de un oligonucleótido modelo (SEQ. ID No 1). Los espectros de excitación y emisión del oligonucleótido de ejemplo se muestran en la FIGURA 3.

Ejemplo 7: Síntesis del colorante de sulforodamina S7

[0166] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S7 que comprende un grupo fosforamidita y un grupo hidroxilo protegido con el grupo dimetoxitritilo. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5' terminal o en la posición central de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0167] El compuesto S7 se preparó de acuerdo con el procedimiento del Esquema 7.

Compuesto 19

[0168] Una suspensión del Compuesto 2 (4,9 g, 7,6 mmol) en DMF anhidro (50 ml) se trató a TA bajo argón con exceso de TEA (5,3 ml, 5 eq), seguido de carbonato de bis-nitrofenilo BNPC (2,8 g, 1,2 eq). La suspensión negra se calentó a 30-35 °C hasta la finalización de la formación del intermedio 18 (1,5-3 horas después de la adición de BNPC). Se añadió de golpe mono-DMT-dietanolamina (DMT-L) (4,6 g, 1,5 eq) y la mezcla de reacción se agitó a 30-35°C (1 3 horas), a continuación, a TA (> 2 horas) hasta la finalización de la reacción. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (530 ml) y se transfirió a un embudo separador. La capa orgánica se lavó agua DI (4 x 380 ml) y solución acuosa saturada de cloruro sódico (1 x 380 ml). La capa de EtOAc se secó sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó para producir el Compuesto 19 en bruto. La purificación en columna de gel de sílice del producto en bruto produjo el Compuesto 19 puro como un sólido púrpura (7,5 g, 91 % de rendimiento). LCMS: m/z 1082,0 [M+H]. 1H RMN (DMSO-da, 400 MHz): 88,18 (d, 1H, J = 2 Hz), 7,22 (dd, 1H, J = 8,4, 1,6 Hz), 7,16-7,36 (m, 10H), 6,95 (m, 1H), 6,86 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,81 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 6,28 (s, 2H), 4,60 (m, 1H), 3,90 (m, 1H), 3,80 (m, 1H), 3,70 (m, 6H), 3,40 (m, 3H), 3,30 (m, 3H), 3,16 (m, 2H), 3,07 (m, 12H), 2,90 (m, 1H), 2,80 (m, 1H), 2,78 (m, 4H), 2,44 (m, 4H), 1,92 (m, 4H), 1,75 (m, 4H).

Compuesto S7

[0169] El Compuesto 19 (6,5 g, 6 mmol) se colocó en un matraz redondo con 3 bocas y se secó a vacío elevado a < 2 mBar durante > 90 minutos. A continuación, se disolvió el Compuesto 19 seco en DCM anhidro (130 m) bajo argón. El matraz de reacción se enfrió hasta 0-5 °C y se añadió DIEA (10,5 ml, 10 eq), seguido de la adición gota a gota de N,N-diisopropil-clorofosforamidita-Cl (PAM-Cl) (1,7 ml, 1,3 eq.) mientras se mantenía la temperatura interna a 0-5 °C. Se dejó agitando la mezcla de reacción a TA hasta su finalización (2-3 horas). La mezcla de reacción se diluyó con DCM (130 ml), se lavó con NaHCO3 (2 x 80 ml), solución acuosa saturada de cloruro sódico (150 ml) y se secó sobre Na2SO4. La filtración, la concentración y la purificación en columna de gel de sílice de producto en bruto produjeron el Compuesto S7 puro como un sólido de color rosa a lavanda (6,07 g, 78 % de rendimiento). LCMS: m/z 1281,2 [M+H].

31P RMN (DMSO-d6, 160 MHz): 8147,57. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 87,90 (s, 1H), 7,48 (dd, 1H, J = 8,4, 2,0 Hz), 7,40 (m, 2H), 7,20-7,30 (m, 7H), 6,82 (m, 5H), 6,35 (s, 2H), 3,93 (m, 1H), 3,87 (m, 1H), 3,76 (m, 8 H), 3,62 (m, 4H), 3,46 (m, 2H), 3,41 (m, 1H), 3,33 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 3,19 (m, 1H), 3,13 (m, 11H), 2,98 (m, 1H), 2,84-2,91 (m, 5H), 2,64 (m, 2H), 2,40-2,56 (m, 6H), 1,95 (m, 4H), 1,78 (m, 4H), 1,10-1,23 (m, 12H).

Ejemplo 8: Síntesis de Compuesto S8

[0170] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S8 que comprende un grupo fosforamidita y un grupo hidroxilo protegido con el grupo dimetoxitritilo. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5' terminal o en la posición central de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0171] El compuesto S8 se preparó de acuerdo con el procedimiento del Esquema 8.

Compuesto 20

[0172] El Compuesto 3 (2,80 g, 1 eq) se disolvió en diclorometano anhidro (50 ml) y se añadió gota a gota POCh (6,9 ml, 14 eq) a temperatura ambiente. Después de 4 horas, la mezcla de reacción se evaporó a sequedad para generar un intermedio bruto como un sólido azul oscuro. Se disolvió etilendiamina (EDA, 6,0 ml, 17,0 eq) en diclorometano anhidro (40 ml) y la solución se enfrió hasta 5 °C. El sólido se disolvió en diclorometano anhidro (20 ml) y se añadió gota a gota a la solución de EDA. Después de 17 horas a 4 °C la mezcla de reacción se lavó con bicarbonato de sodio saturado (2 x 40 ml) y, a continuación, con agua DI (40 ml). La capa orgánica se evaporó a sequedad para producir el Compuesto 20 (3,08 g, 96 %) como un sólido azul oscuro. LCMS: m/z 569,4 [M+ H+]. Calc-d: 569,25. 1H RMN (DMSO-da, 400 MHz): 87,92 (dd, 1H, J = 6,0, 2,8 Hz), 7,54 - 7,56 (m, 2H), 6,90 (dd, 1H, J = 6,4, 2,8 Hz), 6,30 (s, 2H), 3,3 (br., 2H), 3,07 -3,14 (m, 8H), 2,75 -2,88 (m, 6H), 2,35 -2,49 (m, 6H), 1,95 (m, 4H), 1,79 (m, 4H).

Compuesto 21

[0173] Se disolvió ácido 4-pentinoico (4PA, 0,67 g, 1,1 eq) en acetonitrilo anhidro (6,5 ml) y la solución se enfrió hasta 5 °C. Se añadió diisopropiletilamina (3,3 ml, 3,0 eq) seguido de trifluoroacetato de pentafluorofenilo (PFP- TFA, 1,2 mL, 1,1 eq). La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El Compuesto 20 (3,1 g, 1,0 eq) se suspendió en una mezcla de 10 ml de N,N-dimetilformamida, 10 ml de diclorometano y 5 ml de dimetilsulfóxido. La suspensión se añadió a la solución de ácido 4-pentinoico activado y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se diluyó con 50 ml de acetato de etilo y se lavó con bicarbonato de sodio saturado (2 x 30 ml) y, a continuación, agua DI (30 ml). La capa orgánica se evaporó a sequedad. El producto en bruto se purificó utilizando purificación en columna de gel de sílice para producir el Compuesto 21 (2,74 g, 68 % de rendimiento) como un sólido azul. LCMS: m/z 649,5 [M+ H+]. Calc-d: 649,28. 1H RMN (DMSO-da, 400 MHz): 87,93 - 7,96 (m, 1H), 7,65 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 7,54 - 7,58 (m, 2H), 6,87 -6,90 (m, 1H), 6,32 (s, 2H), 3,05-3,16 (m, 8H), 2,97 -3,04 (m, 2H), 2,79 -2.88 (m, 6H), 2,72 (t, 1H, J = 2,4 Hz), 2,39 - 2,58 (m, 4H, se solapa con DMSO-ds), 2,20 - 2,27 (m, 2H), 2,10 (t, 2H, 7,6 Hz), 1,95 (m, 4H), 1,79 (m, 4H).

Compuesto 22

[0174] El Compuesto 21 (2,7 g, 1,0 eq) se disolvió en N,N-dimetilformamida (22,0 ml) y se añadió trietilamina(1,7 ml, 3,0 eq). La solución preparada se añadió bajo atmósfera inerte a la mezcla sólida de 5-yodo-5'-dimetoxitritil-2'-desoxiuridina (2,7 g, 1,0 eq; DMT-I-dU), tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0) (0,48 g, 0,1 eq) y yoduro de cobre(I) (0,24 g, 0,3 eq) y la mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (120 ml) y se lavó con la solución de EDTA 0,1M (2 x 80 ml). La capa orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro (25 g, 18 horas), se filtró y se evaporó a sequedad (sólido azul). El producto en bruto se purificó utilizando purificación en columna de gel de sílice para producir el Compuesto 22 (4,73 g, 97 % de rendimiento) como un sólido azul. LCMS: m/z 1177,9 [M+ H+]. Calc-d: 1177,471H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): 87,93 -7,96 (m, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,54 - 7,58 (m, 2H), 7,49 (t, 1H, J = 6,0 Hz), 7,37 - 7,41 (m, 2H), 7,25 - 7,31 (m, 6H), 7,18 - 7,22 (m, 1H), 6,83 -6,90 (m, 5H), 6,32 (s, 2H), 6,11 (t, 1H, J = 6,8 Hz), 5,33 (s, 1H), 4,27 (m, 1H), 3,91 (m, 1H), 3,71 (s, 6H), 3,21 - 3,26 (m, 2H), 3,05-3,14 (m, 8H), 2,97 - 3,04 (m, 2H), 2,77 - 2,88 (m, 6H), 2,38 - 2,59 (m, 4H, se solapa con DMSO-d5), 2,14 -2,28 (m, 4H), 1,98 -2,03 (m, 2H), 1,93 (m, 4H), 1,77 (m, 4H).

Compuesto S8

[0175] Se disolvió el Compuesto 22 (4,6 g, 1,0 eq) en diclorometano anhidro (27,6 ml) bajo argón. El matraz de reacción se enfrió hasta 0-5 °C y se añadió diisopropiletilamina (2,0 ml, 3,0 eq) seguido de adición gota a gota de PAM-Cl (1,1 ml, 1,3 eq) mientras se mantenía la temperatura interna a 0-5 °C. Se dejó agitando la mezcla de reacción a TA durante 2 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (150 ml), se lavó con NaHCO3 (2 x 100 ml), solución acuosa saturada de cloruro sódico (80 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro (46 g, 20 horas), se filtró y se evaporó a sequedad (sólido azul). El producto se disolvió en 200 ml de diclorometano y se purificó mediante precipitación en una mezcla igual de éter y hexanos (2 litros). La filtración y el secado produjeron el producto como un sólido azul (1,92 g, 36 % de rendimiento). LCMS: m/z 1378.3 [M+H]. 31P RMN (CD3CN, 160 MHz): dos singletes (diastereómeros) 8147,97 ppm y 148,04 ppm. 1H RMN (CD3CN, 400 MHz): 89,2 (br, 1H), 7,94 y 7,97 (s, 1H), 7,85 -7.89 (m, 1H), 7,53 - 7,59 (m, 2H), 7,42 - 7,47 (m, 2H), 7,30 - 7,37 (m, 4H), 7,19 - 7,29 (m, 3H), 6,80 - 6,92 (m, 5H), 6,35 (s, 2H), 6,13 -6,21 (m, 1H), 5,36 -5,41 (m, 1H), 4,55 -4,64 (m, 1H), 4,08 -4,15 (m, 1H), 3,73 -3,75 (m, 6H), 3,55 - 3,70 (m, 4H), 3,25 - 3,40 (m, 2H), 3,05-3,16 (m, 8H), 2,93 - 3,00 (m, 2H), 2,72 - 2,88 (m, 6H), 2,66 (t, 1H, 6,0 Hz), 2,33 -2,59 (m, 7H), 2,15 -2,22 (m, 2H), 1,92 -2,00 (m, 2H), 1,75 - 1,88 (m, 6H), 1,14 - 1,21 (m, 9H), 1,07 y 1,06 (2 x s, 3H).

Ejemplo 9: Síntesis de Compuesto S9

[0176] Este ejemplo describe la síntesis de un colorante de sulforodamina de ejemplo S9 que comprende un grupo fosforamidita y un grupo hidroxilo protegido con el grupo dimetoxitritilo. Este colorante es adecuado para su incorporación en el extremo 5' terminal o en la posición central de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0177] El Compuesto S9 se preparó de manera analógica a la preparación del Compuesto S8 descrito anteriormente de acuerdo con el Esquema 9.

Ejemplo 10: Preparación de polinucleótidos marcados de manera fluorescente a partir de fosforamiditas de colorante de sulforodamina

[0178] Se sintetizaron polinucleótidos que comprenden colorantes de sulforodamina en un sintetizador de oligonucleótidos MerMade-12 utilizando el protocolo de ADN 200 nmol estándar en ciclos de eliminación -acoplamiento - “capping” - oxidación - “capping”. El tiempo de acoplamiento para fosforamiditas de colorante de sulforodamina se extendió a 6 minutos.

[0179] Para polinucleótidos que contienen colorantes de sulforodamina en 5', la síntesis se completó después del último ciclo de acoplamiento de la fosforamidita del colorante de sulforodamina. En el caso de incorporación interna de fosforamiditas de colorante de sulforodamina, se añadieron más monómeros de nucleósidos después del acoplamiento del colorante. Se dejó un grupo de DMT final en el polinucleótido.

[0180] Los polinucleótidos completamente ensamblados se escindieron del soporte sólido y se sometieron a desprotección mediante hidróxido de amonio al 30 % a 55 °C durante 10-12 horas. Después de la eliminación del amoniaco, se analizaron los oligonucleótidos y se purificaron mediante HPLC de fase inversa (RP-HPLC) en columna C18 Gemini eluyendo con un gradiente lineal de acetonitrilo/bicarbonato de trietilamonio 0,1 M, pH 7. Después de la eliminación del grupo DMT, los polinucleótidos se purificaron por segunda vez.

[0181] Se prepararon oligonucleótidos marcados con sulforodamina 101 mediante conjugación de amino-C6-oligo con un reactivo comercial Texas Red®-X (éster de NHS) (isómeros mezclados, Thermo Fisher Scientific). Todos los polinucleótidos purificados se caracterizaron mediante espectroscopia de masas.

[0182] Se prepararon sondas de 5'-nucleasa que comprenden colorantes de sulforodamina de ejemplo utilizando el desactivador BHQ-2 CPG, columna de glicolato 500 Angstrom (BioSearch Technologies). A01 indica 2-amino-dA (2,6-diamino-2'-desoxipurina ribósido) que se incorporó utilizando la fosforamidita de 2-amino-dA-CE disponible comercialmente (Glen Research, Número de catálogo del producto: 10-1085).

[0183] Los oligonucleótidos de ejemplo que incorporan fosforamiditas de colorante de sulforodamina y oligonucleótidos marcados con sulforodamina 101 (Tx Red) se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1.

[0184] En la Tabla 1, los restos de colorante incorporados en el extremo 5' terminal de los polinucleótidos tienen las siguientes estructuras:

y las secuencias de los oligonucleótidos son tal como se indica a continuación:

TCA GAG TAC CTG AAA CA (SEQ ID NO: 1),

CC(A01) CGG (A01)GC G(A01)G AC(A01) TCT CGG CC (SEQ ID NO: 2), y

CC(A01) G(A01)G CAA ACT GGG CGG C(A01) (SEQ ID NO:3), en donde A01 indica 2,6-diaminopurina 2'-desoxirribósido.

[0185] Los espectros de excitación y emisión de oligonucleótidos marcados se registraron en un fluorímetro Agilent Cary (oligonucleótido 200 nM, tampón Tris 0,1 M, pH 8). Tal como se muestra en las FIGURAS 1A y 1B, los máximos de excitación y emisión de un oligonucleótido de ejemplo preparado a través de una síntesis automatizada de oligonucleótidos utilizando un Compuesto S7 de reactivo de fosforamidita de colorante de ejemplo (Oligo C) coinciden con los valores máximos de excitación y emisión de un oligonucleótido que comprende un colorante Texas Red® (Oligo A). Tal como se muestra en la FIGURA 1C, los máximos de excitación y emisión de un oligonucleótido de ejemplo preparado a través de una síntesis automatizada de oligonucleótidos utilizando un Compuesto S6 de reactivo de fosforamidita de colorante de ejemplo (Oligo B), están próximos a los máximos de excitación y emisión dados a conocer en la literatura de oligonucleótidos marcados con colorante TAMRA.

Ejemplo 11: Comparación de rendimiento de un colorante de sulforodamina de ejemplo y colorante Texas Red® en PCR con 5’-nucleasa

[0186] En este ejemplo, las reacciones de PCR con 5'-nucleasa se llevaron a cabo utilizando sondas fluorescentes desactivadas escindibles que comprendían colorantes de la divulgación y un desactivador BHQ-2 disponible comercialmente. Los perfiles de PCR mostrados en las FIGURAS 2A y 2B demuestran que las sondas que comprenden los colorantes de la presente invención se comportaron de manera eficiente como sondas de detección.

[0187] Las sondas de PCR con 5'-nucleasa que comprenden colorantes de la divulgación se evaluaron y se compararon con sondas de PCR que comprenden Texas Red®. Se utilizó el gen constitutivo de beta-globulina de ADN del genoma humano como la diana. Los cebadores directos e inversos tenían las siguientes secuencias:

AAA CCT CCA GGC CAG AAA GAG AGA GTA (SEQ. ID NO: 4)

AAA AGG CAT TCC TGA AGC TGA CAG CAT TC (SEQ. ID NO: 5)

AAA ACC TGC CTT CTG CGT GAG ATT CT (SEQ. ID NO: 6)

CTG TAC GAA AAG ACC ACA GGG CCC AT (SEQ. ID NO: 7)

[0188] Se llevó a cabo la PCR en un instrumento GeneXpert® (Cepheid) con 4 módulos (detección: canal Tx Red, Ex 585 nm, Em 610 nm). Cada curva de PCR es un promedio de 4 repeticiones. Se utilizó el siguiente protocolo de PCR:

Amplicón: longitud 96 pb, 1.000 copias/reacción;

Concentraciones de nucleótido trifosfato (NTP) para cada uno de ATP, CTP, GTP, TTP: 0,25 mmol;

Polimerasa Taq: 3 unidades/25 ul de reacción;

Concentraciones de cebador (cada uno): 200 nM; y

Concentración de sonda: 250 nM;

[0189] Dos ciclos de desnaturalización durante 35 segundos a 95 °C, extensión por acoplamiento durante 30 segundos a 66°; y 45 ciclos: desnaturalización durante 8 segundos a 95°C, extensión por acoplamiento durante 30 segundos a 66° C.

[0190] Los datos de PCR resultantes se muestran en las FIGURAS 2A y 2B. Tal como se demuestra con los datos, las sondas de PCR con 5' nucleasa marcadas con colorantes de ejemplo de la divulgación tienen un rendimiento comparable con el de sondas de PCR marcadas con Texas Red®. Tal como se puede observar a partir de los datos de las FIGURAS 2A y 2B, las sondas que comprenden un colorante S7 de ejemplo muestran un punto final similar al punto final mostrado por las sondas marcadas con Texas Red®.

Ejemplo 12: Síntesis de los compuestos S10a y S10b

[0191] Este ejemplo describe la síntesis de colorantes de sulforodamina de ejemplo S10a y S10b que comprenden un grupo fosforamidita. Estos colorantes son adecuados para su incorporación en la posición del extremo 5' terminal de un oligonucleótido a través de una síntesis automatizada estándar de oligonucleótidos.

[0192] Los colorantes de sulforodamina, tales como el compuesto S10 mostrado a continuación, preparado a partir del intermedio racémico 12 contiene dos centros quirales que da como resultado los colorantes finales que existen como una mezcla de 4 diastereómeros.

[0193] Tras la incorporación de tales colorantes a los polinucleótidos, por ejemplo, mediante la síntesis o conjugación de fosforamiditas, se produce una mezcla diastereomérica de polinucleótidos marcados de manera fluorescente. Aunque estos polinucleótidos tienen propiedades ópticas idénticas, su purificación mediante HPLC puede ser difícil debido a la elución de polinucleótidos como picos múltiples o amplios. El uso de estereoisómeros puros de los colorantes puede simplificar la purificación cromatográfica de tales polinucleótidos marcados.

[0194] El Compuesto S10a es un ejemplo de un colorante de sulforodamina sintetizado a partir de 12a, un enantiómero único del compuesto 12, que da como resultado el compuesto S10a que existe como un diastereómero único. El Compuesto 12a se puede sintetizar a partir de 2,3,3-trimetil-3H-indolo-6-ol (FCH Group, Letonia) a través de hidrogenación de transferencia asimétrica (tal como se describe en Org. Lett. 2018, 20, 5107-5111) utilizando un catalizador quiral RuCl(p-cimeno)[(R,R)-Ts-DPEN] (Aldrich cat # 703907). De manera similar, el compuesto 12b, un estereoisómero de 12a, se puede sintetizar mediante un procedimiento similar utilizando RuCl(p-cimeno)[(S,S)-Ts-DPEN] (Aldrich).

Compuesto 13a

[0195] Se disolvieron la sal de sodio de ácido 2-formilbencenosulfónonico (1,41 g, 6,77 mmol) y un equivalente del compuesto 12a (1,50 g, 6,77 mmol) en 40 ml de H2SO4 al 60 %. La solución se calentó a 60 °C durante 3 horas y se añadió otro equivalente del compuesto 12a, y la mezcla se calentó hasta 100 °C. Después de 72 horas, la mezcla de reacción se enfrió hasta TA, se diluyó con 40 ml de agua, se vertió en 500 ml de hielo picado y se agitó durante 1,5 horas. Los sólidos resultantes se recogieron mediante filtración. Se añadió la solución acuosa saturada de cloruro sódico (100 ml) al filtrado y el filtrado se extrajo con diclorometano (2X). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y los disolventes se eliminaronin vacuo.El material extraído a partir de las capas orgánicas y el precipitado se combinaron y se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice (2" x 7") utilizando un gradiente del sistema ACN/agua (4% hasta 10% de H2O) para producir 1,08 g (27%) del Compuesto 13A. 1H RMN (DMSO-d6, 500 MHz): 88,03 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,64 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,15 (d, J=7,5 Hz, 1H), 6,91 (m, 1H), 6,81 (d, J=3,6 Hz, 1H), 6,65 (m, 2H), 4,98 (m, 1H), 4,93 (m, 1H), 3,96 (m, 1H), 3,82 (m, 2H), 3,70 (m, 5H), 3,45 (m, 2H), 1,18 (m, 9H), 1,12 (s, 3H), 0,98 (s, 3H), 0,97 (s, 3H). LCMS: m/z 591,5 [M+H].

Compuesto 14a

[0196] Bajo argón, se disolvió el Compuesto 13a (1,06 g, 1,79 mmol) en 25 ml de piridina anhidra. Se añadieron anhídrido acético (0,510 ml, 5,39 mmol) y DMAP (22 mg, 0,180 mmol) y la mezcla se agitó a TA durante 5 horas. Se eliminó la piridinain vacuo,y el residuo se sometió a cromatografía en columna de gel de sílice (1,5"x5") utilizando un sistema de disolventes MeOH/DCM (4 hasta 8 % de MeOH) para producir 475 mg (39 %) del compuesto 14a. 1H RMN (DMSO-d6, 500 MHz): 88,03 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,65 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,56 (t, J = 7,4 Hz, 1H), 7,16 (d, J= 7,3 Hz, 1H), 6,93 (d, J=5,3 Hz, 2H), 6,70 (s, 2H), 4,29 (m, 4H), 3,96 (m, 2H), 3,78 (m, 2H), 3,69 (m,2H), 1,99 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 1,21 (d, J=6,7 Hz, 3H), 1,17 (d, J=6,6 Hz, 3H), 1,15 (s, 3H), 1,12 (s, 3H), 0,99 (s, 3H), 0,98 (s, 3H). LCMS: m/z 675,5 [M+H].

Compuesto 26

[0197] Se disolvió el Compuesto 14a (455 mg, 0,674 mmol) en 25 ml de DCM anhidro bajo argón y se añadió POCh (0,630 ml, 6,76 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 18 horas, después de este periodo de tiempo se eliminaron DCM y POClain vacuo.El aceite resultante se disolvió en 25 ml de DCM anhidro y la solución se enfrió hasta 0 °C y se añadieron DIEA (1,15 ml, 6,60 mmol) y 2-(2-aminoetoxi)etanol (338 ul 3,37 mmol). Se dejó que la mezcla se calentara hasta TA y se agitó durante 2 horas, a continuación, se extrajo con NaHCO3. El extracto se secó sobre Na2SO4. El producto en bruto se sometió a cromatografía en gel de sílice (columna de 1"x6") utilizando un gradiente de MeOH/DCM (2 hasta 6 % de MeOH) para producir 382 mg (74 %) del compuesto 26. 1H RMN (DMSO-d6, 500 MHz): 88,00 (m, 1H), 7,60 (m, 2H), 6,99 (m, 1H), 6,43 (d, J=1,3 Hz, 2H), 6,32 (d, J=5,6 Hz, 2H), 4,41 (t, J=4,78, 1H), 4,16 (m, 4H), 3,29 (m, 2H), 3,15 (m, 6H), 3,09 (m, 4H), 2,90 (m, 2H), 1,98 (m, 6H), 1,09 (m, 9H), 0,97 (s, 3H), 0,85 (s, 3H), 0,72 (s, 3H). LCMS: m/z 762,6 [M+H].

Compuesto S10a

[0198] El Compuesto 26 (367 mg, 0,481 mmol) se disolvió bajo argón en 20 ml de DCM anhidro y se añadió DIEA (0,419 ml, 2,41 mmol), seguido de N,N-diisopropilamino cianoetil fosfonamídico-Cl (0,129 ml, 0,627 mmol). La mezcla se agitó a TA durante 3 horas y, a continuación, se extrajo con NaHCO3 saturado, agua y solución acuosa saturada de cloruro sódico. Los extractos se secaron sobre Na2SO4. La cromatografía en gel de sílice (columna de 1"x6") con EtOAc al 20 %/hexanos hasta EtOAc al 30 %/hexanos que contenía TEA al 10 %, produjo 350 mg (78 %) del Compuesto S10a. 1H RMN (CD3CN, 500 MHz): 87,91 (m, 1H), 7,59 (m, 2H), 6,97 (m, 1H), 6,54 (d, J=8,2 Hz, 2H), 6,28 (s, 2H), 4,25 (m, 4H), 3,73 (m, 2H), 3,54 (m, 6H), 3,32 (m, 6H), 3,22 (m, 2H), 2,98 (m, 2H), 2,01 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,97 (pentet, J=2,5 Hz, 2H), 1,15 (m, 15H), 1,12 (s, 3H), 1,10 (s, 3H), 1,03 (s, 3H), 0,93 (m, 3H), 0,79 (s, 3H). 31P RMN (CD3CN, 500 MHz): 8148,2 LCMS: m/z 963,0 [M+H].

[0199] Se puede preparar el Compuesto S10b a partir del intermedio 12b de un modo similar.

[0200] Los polinucleótidos marcados de ejemplo de SEQ. ID NO: 1 que incorporan los colorantes S10 y S10a en los extremos 5' terminales se prepararon mediante la síntesis automatizada de oligonucleótidos, tal como se describe anteriormente. El polinucleótido marcado que incorpora el colorante S10 se purificó mediante HPLC en columna Phenomenex Gemini (5 pm C18 110Á) eluyendo un gradiente de 16-34 % de ACN en tampón de bicarbonato de trietilamonio 0,1 M durante 20 minutos. El polinucleótido marcado que incorpora el colorante S10a se purificó mediante HPLC en columna Phenomenex Gemini (5 pm C18 110Á) eluyendo con un gradiente de 18-38 % de ACN en tampón de bicarbonato de trietilamonio 0,1 M durante 20 minutos. Los perfiles de HPLC de los dos polinucleótidos marcados de ejemplo se muestran en las FIGURAS 3A y 3B.

[0201] La FIGURA 1D muestra el espectro de emisión/excitación del oligonucleótido marcado con S10 de la SEQ. ID NO: 1 demostrando que S10a podría utilizarse como el sustituto del colorante TAMRA. Además, tal como se muestra en la FIGURA 3B, el polinucleótido marcado con S10a de ejemplo produce de manera predominante un pico único mediante HPLC en comparación con los picos múltiples producidos por el polinucleótido marcado con S10 de ejemplo (FIGURA 3A), lo que simplifica la purificación cromatográfica de dichos oligonucleótidos.

[0202] Se puede utilizar la práctica de la presente divulgación, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, microbiología, virología, ADN recombinante y así sucesivamente, que se encuentran dentro de la capacidad de la técnica. Tales técnicas se explican perfectamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición (1989), Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait Ed., 1984), Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Ed., 1987), las series de Methods In Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. M. Miller y M. P. Calos eds. 1987), Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith y K. Struhl, eds., 1987).

Claims

REIVINDICACIONES 1. Compuesto representado por la fórmula I:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que: R1 es L1-X; R2 es halógeno o SO2NH2; R3 es H o halógeno; R4, R7, R8 y R11, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, R5, R6, R9, y R10, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R4 y R5, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R6 y R7, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; R8 y R9, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; R10 y R11, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R5 y R6, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R5 y R6, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros; R9 y R10, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R9 y R10, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros; L1 es un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido; X es

y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando no están sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.
2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que: (a) R2 es Cl y R3 es H; o (b) L1 es un enlazador PEG2-10; o (c) L1 es -CH2CH2OCH2CH2-; o (d) R4 y R5 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; o (e) R4 y R5 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; o (f) R5, R6, R9 y R10 son cada uno metilo.
3. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que (a) el compuesto está representado por la Fórmula IA:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que R1 es L1X y R3 es H o halógeno; o (b) el compuesto es:
4. Compuesto representado por la fórmula (II)
o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que: R1 es alquilo C1-C6; R2 es H, halógeno o SO2NH2; R3 es H o halógeno; R14 y R16, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R15 y R17, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R14 y R15, cuando se toman en conjunto, forman una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R14 y R15; R16 y R17, cuando se toman en conjunto, forman una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R16 y R17; Q es un grupo tritilo o dimetoxitritilo; L1 y L2 son de manera independiente un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o un heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando no están sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido. 5. Compuesto, según la reivindicación 4, en el que: (a) R3 es H; o (b) R2 es H; o (c) R2 es Cl; o (d) el compuesto está representado por la Fórmula (IIA):
6. Compuesto, según la reivindicación 4, en el que el compuesto es:
7. Compuesto representado por la Fórmula (III):
o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que: R2 es H, halógeno o SO2NH2; R3 es halógeno o H; R4, R7, R8 y R11, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R5, R6, R9, y R10, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido, R4 y R5, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R6 y R7, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; R8 y R9, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; R10 y R11, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R5 y R6, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R5 y R6, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros; R9 y R10, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R9 y R10, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros; n es un número entero de 1 a 9; Y es:
en el que: Q es un grupo tritilo o dimetoxitritilo; R12 y R13 son de manera independiente alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido. 8. Compuesto, según la reivindicación 7, en el que: (a) R2 es Cl y R3 es H; o (b) R4 y R5 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; o (c) R4 y R5 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 en conjunto son una cadena de propileno que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; o (d) R12 y R13 son cada uno isopropilo. 9. Compuesto, según la reivindicación 7, en el que el compuesto es:
10. Polinucleótido marcado que comprende un compuesto de fórmula (IV):

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que: R2 es halógeno o SO2NH2; R3 es H o halógeno; R4, R7, R8 y R11, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H, halógeno o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R5, R6, R9 y R10, cuando se toman por sí solos, son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R4 y R5, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R6 y R7, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; R8 y R9, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; R10 y R11, cuando se toman en conjunto, son una cadena de alquileno C2-C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R5 y R6, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R5 y R6, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros; R9 y R10, cuando se toman en conjunto con el átomo de nitrógeno al que están unidos R9 y R10, forman un anillo insaturado de 5 miembros o 6 miembros; n es un número entero de 1 a 9; Y es:

en los que: la línea ondulada es el punto de unión a la Fórmula IV; W es H o L4-O-Z2; L3, L4 y L5 de manera independiente son un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C2-C30 opcionalmente sustituido; Z es CH, N, NHC(O)N u OC(O)N; Z1 es un nucleótido u oligonucleótido; Z2 es un nucleótido, oligonucleótido o H; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.
11. Polinucleótido marcado, según la reivindicación 10, en el que: (a) R2 es Cl y R3 es H; o (b) R4 y R5 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R4 y R5; R10 y R11 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R10 y R11; R6 y R7 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R6 y R7; y R8 y R9 son una cadena de alquileno C3 opcionalmente sustituido que conecta los átomos a los que están unidos R8 y R9; o (c) el polinucleótido marcado es una sonda de PCR de 5' nucleasa; o (d) el polinucleótido marcado comprende adicionalmente un desactivador de fluorescencia
12. Compuesto representado por la fórmula VI:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que: R1 es L1-X; R2, R3, R4 y R5 son de manera independiente H, halógeno, alquilo C1-C6 o SO2NH2; R6 y R9 son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R7, R8, R10, R11, R14 y R15 son de manera independiente H o alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; L1 es un alquileno C2-C10 opcionalmente sustituido o heteroalquileno C2-C20 opcionalmente sustituido; X es -OP(OCH2CH2CN)N(i-Pr)2; y en el que el término «alquilo» incluye un radical de hidrocarbilo monovalente de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico o una combinación de los mismos, que contiene o contienen solamente C y H cuando están no sustituidos, y en el que el alquilo está opcionalmente sustituido.
13. Compuesto, según la reivindicación 12, en el que (a) R7, R8, R10, R11, R14 y R15 son metilo; o (b) L1 es un enlazador PEG2-10; o (c) L1 es -CH2CH2OCH2CH2-; o (d) R2, R3, R4 y R5 son H; o (e) R6 es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con OH o aciloxi C1-C6; o (f) R9 es un alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido con OH o aciloxi C1-C6; o (g) R6 es un etilo sustituido con OH u OAc; o (h) R9 es un etilo sustituido con OH u OAc; o (i) el compuesto es:

o un estereoisómero, un tautómero o una sal del mismo, en el que: R2, R3, R4 y R5 son H; y Q1 y Q2 son de manera independiente H o acilo C1-C6, preferiblemente en el que Q1 y Q2 son acetilo; o (j) el compuesto es:
14. Compuesto, según la reivindicación 12, en el que el compuesto es
15. Procedimiento para preparar un conjugado marcado de un ligando que comprende poner en contacto un ligando con un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o las reivindicaciones de 12 a 14, en un disolvente adecuado en condiciones suficientes para unir de manera covalente el compuesto al ligando, formando de este modo el conjugado marcado, opcionalmente: en el que el ligando es un polinucleótido, una proteína, un péptido, un polisacárido, un polímero con un esqueleto de etileno o un soporte sólido; o en el que el ligando es un polinucleótido; o en el que las condiciones suficientes para unir de manera covalente el compuesto al ligando son condiciones de la síntesis automatizada de oligonucleótidos de fosforamidita.