ES2968226T3 - GDF-15 como marcador de diagnóstico para predecir la evolución clínica de un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para predecir la probabilidad de una respuesta al tratamiento de un paciente con cáncer humano a un tratamiento con un bloqueador de puntos de control inmunológico, por ejemplo con anti PD-1, y a métodos para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente con cáncer humano después de un tratamiento con un bloqueador de puntos de control inmunológico. tratamiento con bloqueadores, y a los aparatos y kits que pueden usarse en estos métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

GDF-15 como marcador de diagnóstico para predecir la evolución clínica de un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para predecir la probabilidad de una respuesta al tratamiento de un paciente humano con cáncer a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, y a métodos para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente humano con cáncer tras un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, y a aparatos y a kits que pueden usarse en estos métodos.

Antecedentes

Hasta la fecha, muchos cánceres siguen siendo áreas de necesidades médicas no cubiertas. Además, para varios cánceres, algunos subconjuntos de pacientes muestran una respuesta a las terapias contra el cáncer, mientras que otros subconjuntos de pacientes no responden. En muchos casos, aún se desconocen los factores que determinan si los pacientes responderán o no a un tratamiento contra el cáncer particular.

Se sabe que muchos tipos de cáncer expresan factores de crecimiento, incluyendo factores tales como VEGF, PDGF, TGF-� y GDF-15. GDF-15, factor de crecimiento y diferenciación 15, es un miembro divergente de la superfamilia de TGF-�. Es una proteína que se expresa de manera intracelular como precursora, posteriormente se procesa y finalmente se secreta desde la célula al entorno. Tanto la forma activa, completamente procesada (madura) como el precursor de GDF-15 pueden encontrarse fuera de las células. El precursor se une covalentemente a través de su secuencia de aminoácidos COOH-terminal a la matriz extracelular (Bauskin ARet al., Cancer Research 2005) y, por tanto, reside en el exterior de una célula. La forma activa, completamente procesada (madura) de GDF-15 es soluble y se encuentra en el suero sanguíneo. Por tanto, la forma procesada de GDF-15 puede actuar potencialmente sobre cualquier célula diana dentro del cuerpo que esté conectada a la circulación sanguínea, siempre que la célula diana potencial exprese un receptor para el ligando de GDF-15 soluble.

Durante el embarazo, GDF-15 se encuentra en condiciones fisiológicas en la placenta. Sin embargo, muchos cánceres malignos (especialmente cánceres de cerebro agresivos, melanoma, cáncer de pulmón, tumores gastrointestinales, cáncer de colon, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de mama (Mimeault M y Batra SK, J. Cell Physiol 2010)) presentan niveles de GDF-15 aumentados tanto en el tumor como en el suero sanguíneo. Asimismo, se han descrito correlaciones entre la alta expresión de GDF-15 y la quimiorresistencia (Huang CYet al., Clin. Res. Cancer.2009) y entre la alta expresión de GDF-15 y un mal pronóstico, respectivamente (Brown DAet al., Clin. Res. Cancer.2009). Wallentin Let al.(PLoS One.2 de diciembre de 2013; 8(12):e78797) usaron GDF-15 para pronosticar la morbimortalidad cardiovascular y por cáncer en hombres.

GDF-15 se expresa en gliomas de diferentes grados según la OMS tal como se evalúa mediante inmunohistoquímica (Rothet al., Clin. Res. Cancer. 2010). Además, Rothet al.expresaron de manera estable constructos de ADN que expresan ARN en horquilla pequeño que seleccionan como diana GDF-15 endógeno o constructos de control en células de glioma SMA560. Cuando usaron estas líneas celulares estables preestablecidas, observaron que la formación de tumores en ratones que portaban células SMA560 con inactivación de GDF-15 se retrasó en comparación con los ratones que portaban constructos de control.

Las solicitudes de patente WO 2005/099746 y WO 2009/021293 se refieren a un anticuerpo anti-GDF-15 humano (Mab26) capaz de antagonizar los efectos de GDF-15 humano (hGDF-15) sobre la pérdida de peso inducida por tumoresin vivoen ratones. De manera similar, Johnen Het al.(Nature Medicine, 2007) notificaron los efectos de un anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano sobre la anorexia y la pérdida de peso inducidas por el cáncer, pero no observaron ningún efecto del anticuerpo anti-GDF-15 humano sobre el tamaño del tumor formado por el cáncer. Los documentos WO 2014/049087 y PCT/EP2015/056654 se refieren a anticuerpos monoclonales contra hGDF-15 y a usos médicos de los mismos.

Un enfoque desarrollado recientemente para la terapia contra el cáncer es el uso de bloqueadores de puntos de control inmunitario tales como inhibidores de PD-1 humana e inhibidores de PD-L1 humana. Un fundamento del uso de estos bloqueadores de puntos de control inmunitario es que, al bloquear los puntos de control inmunitario que impiden que el sistema inmunitario seleccione como diana antígenos cancerosos y las células cancerosas respectivas, una respuesta inmunitaria al cáncer puede ser más eficaz. Aunque se ha demostrado que los bloqueadores de puntos de control inmunitario, así como combinaciones particulares de bloqueadores de puntos de control inmunitario, mejoran la supervivencia del paciente en pacientes con melanoma (Cully M, “Combinations with checkpoint inhibitors at wavefront of cancer immunotherapy.”, Nat Rev Drug Discov.14 de junio de 2015;14(6):374-5), no todos los pacientes con melanoma presentaban una respuesta completa y aún no se han divulgado los resultados para muchos otros cánceres, todavía existen motivos (como la carga mutacional) que sugieren que los resultados en otras indicaciones serán menos favorables. El estudio de referencia actual es el ensayo KEYNOTE006 (número de ClinicalTrials.gov, NCT01866319) con una tasa de respuesta justo por debajo del 34 %. Robertet al.Pembrolizumab versus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med 2015; 372:2521-2532.

El conocimiento actual de factores de pronóstico que predicen si los pacientes con cáncer responderán o no a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario es todavía bastante limitado. Un factor particular que se ha demostrado que se correlaciona con una respuesta objetiva mejorada, un beneficio clínico duradero y supervivencia libre de progresión en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas tratados con un inhibidor de PD-1 es una carga de mutación no sinónima mayor en los tumores (Rizvi NAet al.: “Cancer immunology. Mutational landscape determines sensitivity to PD-1 blockade in non-small cell lung cancer”. Science 3 de abril de 2015; 348(6230):124-8). Sin embargo, para determinar tal carga de mutación en el nivel del exoma completo, es necesaria una laboriosa secuenciación del exoma completo.

Otro factor de pronóstico específico que se correlaciona con una respuesta objetiva a la terapia anti-PD-1 en varias entidades tumorales, incluyendo melanoma y cáncer de pulmón de células no pequeñas, es la expresión de PD-L1 de células tumorales (Taubeet al., “Association of PD-1, PD-1 ligands, and other features of the tumor immune microenvironment with response to anti-PD-1 therapy.”, Clin Cancer Res.1 de octubre de 2014;20(19):5064-74). En cambio, sin embargo, un metanálisis halló que, para poblaciones de pacientes que incluían pacientes con cánceres de pulmón de células no pequeñas que no se habían tratado con terapia anti-PD-1, una alta expresión de PD-L1 se correlacionó con un mal pronóstico en lugar de con un pronóstico favorable (Wang Aet al.: “The prognostic value of PD-L1 expression for non-small cell lung cancer patients: a meta-analysis.” Eur J Surg Oncol. Abril de 2015; 41(4):450-6). Además, también se han observado respuestas al tratamiento anti-PD-1 en pacientes cuyos cortes de tumor extirpados no mostraron una tinción discernible para la expresión de PD-L1. Además, un estudio reciente en carcinoma de células renales avanzado halló que no existe ninguna correlación significativa entre la expresión de PD-L1 y la respuesta al anticuerpo anti-PD-1 nivolumab en los pacientes (Motzer RJet al., Nivolumab versus Everolimus in Advanced Renal-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 25 de septiembre de 2015). Adicionalmente, la detección de la expresión PD-L1 requiere muestras de tejido, que no siempre están disponibles. Por tanto, la detección de la expresión de PD-L1 tiene muchas desventajas con respecto a su uso como marcador de diagnóstico potencial.

A partir de estos resultados opuestos sobre el valor predictivo de la alta expresión de PD-L1 en grupos de pacientes sometidos a tratamiento anti-PD-1 en comparación con otros grupos de pacientes, resulta evidente que el tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario es una forma específica de tratamiento contra el cáncer que es distinta de otras terapias contra el cáncer, y que sigue un conjunto diferente de factores de pronóstico. Uno de los motivos para estas diferencias entre las terapias contra el cáncer convencionales y la terapia con bloqueadores de puntos de control inmunitario es una activación del sistema inmunitario por los bloqueadores de puntos de control inmunitario, que es un mecanismo que habitualmente no se observa en otras terapias contra el cáncer.

Adicionalmente, los métodos de diagnóstico mencionados anteriormente son desventajosos debido al hecho de que requieren o bien secuenciación del exoma completo o bien una muestra de tumor existente y su análisis. En la búsqueda de otros marcadores, KK Tsaiet al.hallaron sólo factores predisponentes débiles entre los que el patrón de metástasis (presencia de metástasis de pulmón y ausencia de metástasis de hígado), sin ipilimumab previo (es decir, tratamiento preliminar con anticuerpo anti-PD-1) y niveles de LDH normales eran los mejores (KK Tsaiet al., JCO 33, 2015 (resumen del apéndice 9031). Sin embargo, mientras que la tasa de respuesta global era del 40 %, el mejor subgrupo (metástasis de pulmón y no metástasis de hígado) mostró una tasa de respuesta del 62,2 %.

Entre los pacientes con LDH baja o normal, la tasa de respuesta era del 52,2 %.

Topalianet al.(“Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy”. Cancer cell 201527(4):450-461) describen la identificación de marcadores de diagnóstico para tratamientos con bloqueadores de puntos de control centrándose en la expresión de PD-L1 como marcador prometedor en tejido tumoral.

Por estos motivos, existe la necesidad en la técnica de identificar factores de pronóstico que puedan usarse para predecir la probabilidad de una evolución clínica de estos nuevos tratamientos con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Además, son necesarios factores de pronóstico que permitan predecir la probabilidad de una evolución clínica de tales tratamientos de una manera menos laboriosa y más sencilla.

Descripción de la invención

La presente invención cumple las necesidades anteriores y resuelve los problemas anteriores en la técnica proporcionando las realizaciones descritas a continuación:

En particular, en un esfuerzo para identificar factores que puedan usarse para predecir una respuesta a tratamientos con bloqueadores de puntos de control inmunitario, los presentes inventores han hallado sorprendentemente que la probabilidad de una evolución clínica positiva a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario disminuye significativamente con niveles de hGDF-15 crecientes en los sueros de pacientes y viceversa. Por consiguiente, la probabilidad de una evolución clínica positiva de un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario se correlaciona de manera inversa con los niveles de hGDF-15. Por ejemplo, esta evolución clínica puede ser una respuesta al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario o la supervivencia del paciente tras el tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario.

Por ejemplo, si los niveles en suero de hGDF-15 en pacientes con melanoma se aumentan en 1 ng/ml, la probabilidad de una respuesta a un tratamiento con un bloqueador de puntos de control inmunitario disminuye en aproximadamente el 60 %. Por el contrario, si los niveles en suero de hGDF-15 en pacientes con melanoma se disminuyen en 1 ng/ml, la probabilidad de una respuesta a un tratamiento con un bloqueador de puntos de control inmunitario aumenta en aproximadamente el 60 %. De manera similar, si los niveles en suero de hGDF-15 se aumentan en 1 ng/ml, la probabilidad de muerte de los pacientes aumenta en un factor de 1,27.

La expresión de hGDF-15 no se limita al melanoma, sino que también está presente en numerosos otros cánceres sólidos. Asimismo, también pueden tratarse tumores sólidos distintos del melanoma con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, según la invención, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre de pacientes pueden usarse ventajosamente para predecir la probabilidad de una evolución clínica positiva de los pacientes tras un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario no sólo en melanoma, sino en todos los cánceres sólidos a los que se hace referencia en el presente documento.

Además, los métodos de la invención también son ventajosos porque no requieren secuenciación del exoma completo ni una muestra de tumor existente (que no siempre está disponible), sino que pueden basarse en un simple análisis de una muestra de sangre.

Por tanto, la presente invención proporciona medios mejorados para predecir la evolución clínica de tratamientos con bloqueadores de puntos de control inmunitario tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Esta figura muestra los niveles en suero de GDF-15 para pacientes que responden y pacientes que no responden al régimen de tratamiento.

Figura 2: Esta figura muestra los números de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento en los grupos de pacientes que tienen niveles en suero de hGDF-15 de <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml y >4,2 ng/ml, respectivamente.

Figura 3: Probabilidad de respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1) tal como se predice mediante el modelo lineal generalizado usando GDF-15 como factor predisponente continuo. Los círculos muestran los datos, la curva muestra el modelo. La línea vertical indica la concentración de GDF-15 a la que la probabilidad de respuesta al tratamiento es de 0,5.

Figura 4: Curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia en los tres grupos definidos por el nivel en suero de GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 ng/ml).

Figura 5: Figura 5A: Probabilidad de respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1) tal como se predice mediante el modelo lineal generalizado usando LDH como factor predisponente continuo. Los círculos muestran los datos, la curva muestra el modelo. La línea vertical indica la concentración de LDH a la que la probabilidad de respuesta al tratamiento es de 0,5. La cohorte de pacientes era idéntica. Sin embargo, no se logró una determinación fiable de los niveles de LDH en cuatro pacientes debido a la hemólisis. Figura 5B: Representación gráfica de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento y sus respectivos niveles de hGDF-15 y LDH. Cuando se seleccionan valores de corte para cubrir a todos los pacientes que responden al tratamiento, las pruebas basadas en GDF-15 permiten la identificación de 6 (de 9) pacientes que no responden al tratamiento mientras que los análisis basados en los niveles de LDH pueden discriminar sólo 4 (de 9) pacientes que no responden al tratamiento. Para las pruebas de LDH, tuvieron que excluirse 4 muestras hemolíticas, lo que provoca una pérdida de datos.

Figura 6: Esta figura muestra cortes de tejido a modo de ejemplo de metástasis cerebrales de melanoma que no tienen (panel superior) o que tienen una alta (panel inferior) inmunorreactividad con GDF-15, que se tiñeron mediante inmunohistoquímica para GDF-15 y para las proteínas marcadoras de células T CD3 y CD8, respectivamente, tal como se indica en la figura. Las células positivas para CD3 y CD8 se indican mediante flechas en las muestras con niveles altos de GDF-15. Las tinciones para CD3 y CD8 se realizaron de la misma zona de cortes en serie (sin embargo, no del mismo corte).

Figura 7: Esta figura muestra un gráfico del porcentaje de células CD3<+>frente a la puntuación de GDF-15 en diferentes metástasis cerebrales de melanoma (7A) y un gráfico del porcentaje de células CD8<+>frente a la puntuación de GDF-15 en diferentes metástasis cerebrales de melanoma (7B).

Figura 8: Esta figura muestra un gráfico de la puntuación de GDF-15 frente al porcentaje de células T CD8<+>y CD3<+>, respectivamente, en metástasis cerebrales de diferentes entidades tumorales (melanoma, CRC, RCC, NSCLC y SCLC).

Figura 9: La figura 9A muestra el número de células T rodantes por campo de visión por segundo. Los datos se obtuvieron del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”). La figura 9B muestra la velocidad de rodamiento de las células T (medida en píxeles por 0,2 segundos). Los datos se obtuvieron del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”). La figura 9C muestra el número de células adherentes por campo de visión. Los datos se obtuvieron del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”). La figura 9D muestra el número de células adherentes por campo de visión. Los datos se obtuvieron del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”).

Figura 10: La figura 10 muestra el número de células T rodantes por campo de visión por segundo. Los datos se obtuvieron del canal n.º 1 (células T de control en HUVEC no estimuladas como “control neg.”), del canal n.º 2 (células T de control en HUVEC estimuladas como “control pos.”), del canal n.º 3 (“GDF-15”), del canal n.º 4 (“UACC257”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 que contienen GDF-15 secretado) y del canal n.º 5 (“UACC257 anticuerpo anti-hGDF-15”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 agotadas de GDF-15 secretado con un anticuerpo anti-hGDF-15 B1-23 como inhibidor de hGDF-15).

Figura 11: Supervivencia acumulada en grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y ≥1,5 ng/ml, respectivamente.

Figura 12: Supervivencia acumulada en grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 altos (es decir, los 50 pacientes con los niveles de GDF-15 más altos) y niveles de GDF-15 bajos (es decir, los 49 pacientes con los niveles de GDF-15 más bajos), respectivamente (mediana de la división de la cohorte de estudio total).

Figura 13: Los niveles en suero de hGDF-15 no se correlacionan significativamente con la carga mutacional de los tumores. Los niveles de ARNm de hGDF-15 en muestras de pacientes con cáncer se representaron gráficamente frente al número de mutaciones somáticas que se identificaron en los cánceres. Las mutaciones somáticas se determinaron mediante el uso de secuenciación del exoma. Los datos se analizaron usando la herramienta web UZH del Hospital Universitario de Zúrich (Cheng PFet al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). La figura 13A muestra un gráfico para datos de pacientes con cáncer obtenidos del Atlas del Genoma del Cáncer (TGCA) considerando sólo a pacientes con melanoma maligno de evolución rápida (el Atlas del Genoma del Cáncer se describe en la referencia de Cheng PFet al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). Se evaluó la expresión de GDF-15 mediante normalización usando el paquete de software RSEM (“secuenciación de ARN por maximización de expectativas”) (Li B y Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics.4 de agosto de 2011;12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323). La figura 13B muestra un gráfico para datos de pacientes con cáncer de 40 pacientes con melanoma maligno metastásico adicionales del Hospital Universitario de Zúrich, que se analizaron independientemente.

Figura 14: Se muestran imágenes de inmunocitoquímica para CD8a en ratones que albergan tumores de tipo natural o tumores que sobreexpresan hGDF-15 transgénico (tg). Se tiñeron cortes de tejido con anticuerpo anti-CD8a (dilución 1:100; anticuerpo 4SM15 adquirido de eBioscience).

Descripción detallada de la invención

Definiciones y técnicas generales

A menos que se defina lo contrario a continuación, los términos usados en la presente invención deben entenderse según su significado habitual conocido por el experto en la técnica.

El término “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier anticuerpo funcional que sea capaz de unirse específicamente al antígeno de interés, tal como se describe generalmente en el capítulo 7 de Paul, W.E. (Ed.): Fundamental Immunology 2ª ed. Raven Press, Ltd., Nueva York 1989. Sin limitación particular, el término “anticuerpo” abarca anticuerpos de cualquier especie de fuente apropiada, incluyendo pollos y mamíferos tales como ratones, cabras, primates no humanos y humanos. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal que puede prepararse mediante métodos bien conocidos en la técnica. El término “anticuerpo” abarca un anticuerpo de isotipo IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgE, IgA, IgM o IgD. El término “anticuerpo” abarca anticuerpos monoméricos (tales como IgD, IgE, IgG) o anticuerpos oligoméricos (tales como IgA o IgM). El término “anticuerpo” también abarca, sin limitaciones particulares, anticuerpos aislados y anticuerpos modificados tales como anticuerpos modificados por ingeniería genética, por ejemplo, anticuerpos quiméricos.

La nomenclatura de los dominios de anticuerpos sigue los términos conocidos en la técnica. Cada monómero de un anticuerpo comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, tal como se conoce generalmente en la técnica. De éstas, cada cadena pesada y ligera comprende un dominio variable (denominado VHpara la cadena pesada y VLpara la cadena ligera) que es importante para la unión al antígeno. Estos dominios variables de cadena pesada y ligera comprenden (en un orden N-terminal a C-terminal) las regiones FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 (FR, región de entramado; CDR, región determinante de complementariedad que también se conoce como región hipervariable). De manera general, la identificación y asignación de las regiones de anticuerpo mencionadas anteriormente dentro de la secuencia de anticuerpo es según Kabatet al.(Sequences of proteins of immunological interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md.1983) o Chothiaet al.(Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 21-28 de diciembre de 1989; 342 (6252): 877-83), o puede realizarse usando el software IMGT/V-QUEST descrito en Giudicelliet al.(IMGT/V-QUEST, an integrated software program for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucleic Acids Res.1 de julio de 2004; 32 (edición del servidor web: W435-40). Preferiblemente, las regiones de anticuerpo indicadas anteriormente se identifican y asignan usando el software IMGT/V-QUEST.

Un “anticuerpo monoclonal” es un anticuerpo de una población esencialmente homogénea de anticuerpos, en donde los anticuerpos son sustancialmente idénticos en cuanto a secuencia (es decir, idénticos excepto por una mínima fracción de anticuerpos que contienen modificaciones de secuencia que se producen de manera natural tales como modificaciones de aminoácidos en sus extremos N-terminal y C-terminal). A diferencia de los anticuerpos policlonales que contienen una mezcla de diferentes anticuerpos dirigidos o bien a un único epítopo o bien a numerosos epítopos diferentes, los anticuerpos monoclonales se dirigen al mismo epítopo y, por tanto, son muy específicos. El término “anticuerpo monoclonal” incluye (pero no se limita a) anticuerpos que se obtienen a partir de una población de células monoclonales derivadas de un clon celular único, como por ejemplo los anticuerpos generados mediante el método de hibridoma descrito en Köhler y Milstein (Nature, 7 de agosto de 1975; 256(5517):495-7) o Harlow y Lane (“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988). También puede obtenerse un anticuerpo monoclonal a partir de otros métodos adecuados, incluyendo técnicas de presentación en fago tales como las descritas en Clacksonet al.(Nature.15 de agosto de 1991; 352(6336):624-8) o Markset al.(J Mol Biol.5 de diciembre de 1991; 222(3):581-97). Un anticuerpo monoclonal puede ser un anticuerpo que se ha optimizado en cuanto a propiedades de unión a antígeno tales como valores disminuidos de Kd y cinéticas de asociación y disociación optimizadas mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los valores de Kd pueden optimizarse mediante métodos de presentación incluyendo presentación en fago, lo que da como resultado anticuerpos monoclonales madurados por afinidad. El término “anticuerpo monoclonal” no se limita a secuencias de anticuerpos de especies de origen particulares o de una única especie de origen. Por tanto, el significado del término “anticuerpo monoclonal” abarca anticuerpos monoclonales quiméricos tales como anticuerpos monoclonales humanizados.

Los “anticuerpos humanizados” son anticuerpos que contienen secuencias humanas y una mínima porción de secuencias no humanas que confieren especificidad de unión a un antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). Normalmente, los anticuerpos humanizados se generan reemplazando secuencias de la región hipervariable de un anticuerpo aceptor humano por secuencias de la región hipervariable de un anticuerpo donante no humano (por ejemplo, un anticuerpo donante de ratón, conejo o rata) que se une a un antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). En algunos casos, las secuencias de la región de entramado del anticuerpo aceptor también pueden reemplazarse por las secuencias correspondientes del anticuerpo donante. Además de las secuencias derivadas de los anticuerpos donante y aceptor, un “anticuerpo humanizado” puede contener otros residuos o secuencias (adicionales o sustitutos) o no. Tales otros residuos o secuencias pueden servir para mejorar adicionalmente las propiedades de los anticuerpos, tales como las propiedades de unión (por ejemplo, para disminuir los valores de Kd) y/o las propiedades inmunogénicas (por ejemplo, para disminuir la antigenicidad en humanos). En la técnica se conocen ejemplos no limitativos de métodos para generar anticuerpos humanizados, por ejemplo, a partir de Riechmannet al.(Nature.24 de marzo de 1988; 332(6162):323-7) o Joneset al.(Nature. Del 29 de mayo al 4 de junio de 1986; 321(6069):522-5).

El término “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo que contiene secuencias de dominio constante y variable humanas. Esta definición abarca anticuerpos que tienen secuencias humanas que portan sustituciones o modificaciones de aminoácidos individuales que pueden servir para mejorar adicionalmente las propiedades del anticuerpo tales como las propiedades de unión (por ejemplo, para disminuir los valores de Kd) y/o las propiedades inmunogénicas (por ejemplo, para disminuir la antigenicidad en humanos). El término “anticuerpo humano” excluye los anticuerpos humanizados en los que una porción de secuencias no humanas confiere especificidad de unión a un antígeno de interés.

Una “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo tal como se usa en el presente documento se refiere a una porción de un anticuerpo que conserva la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente al antígeno (por ejemplo, hGDF-15, PD-1 o PD-L1). Esta capacidad puede determinarse, por ejemplo, determinando la capacidad de la porción de unión a antígeno para competir con el anticuerpo por la unión específica al antígeno mediante métodos conocidos en la técnica. La porción de unión a antígeno puede contener uno o más fragmentos del anticuerpo. Sin limitación particular, la porción de unión a antígeno puede producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo métodos de ADN recombinante y preparación mediante fragmentación química o enzimática de anticuerpos. Las porciones de unión a antígeno pueden ser fragmentos Fab, fragmentos F(ab’), fragmentos F(ab’)2, anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de un solo dominio, diacuerpos o cualquier otra porción del anticuerpo que conserve la capacidad del anticuerpo para unirse específicamente al antígeno. Un “anticuerpo” (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) o una “porción de unión a antígeno” puede haberse derivatizado o estar unido a una molécula diferente. Por ejemplo, las moléculas que pueden unirse al anticuerpo son otras proteínas (por ejemplo, otros anticuerpos), un marcador molecular (por ejemplo, una molécula fluorescente, luminiscente, coloreada o radiactiva), un fármaco y/o un agente tóxico. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno puede unirse directamente (por ejemplo, en forma de una fusión entre dos proteínas) o mediante una molécula ligadora (por ejemplo, cualquier tipo adecuado de ligador químico conocido en la técnica).

Tal como se usa en el presente documento, los términos “unión” o “unir” se refieren a la unión específica al antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). Preferiblemente, el valor de Kd es menor de 100 nM, más preferiblemente menor de 50 nM, todavía más preferiblemente menor de 10 nM, todavía más preferiblemente menor de 5 nM y lo más preferiblemente menor de 2 nM.

El término “epítopo” tal como se usa en el presente documento se refiere a una porción pequeña de un antígeno que forma un sitio de unión para un anticuerpo.

En el contexto de la presente invención, con el fin de caracterizar las propiedades de unión de los anticuerpos, la unión o unión competitiva de los anticuerpos o sus porciones de unión a antígeno al antígeno de interés (por ejemplo, GDF-15 humano) se mide preferiblemente usando mediciones de resonancia de plasmón superficial como ensayo convencional de referencia, tal como se describe a continuación.

Los términos “KD” o “valor de KD” se refieren a la constante de disociación en equilibrio tal como se conoce en la técnica. En el contexto de la presente invención, estos términos se refieren a la constante de disociación en equilibrio de un anticuerpo con respecto a un antígeno particular de interés (por ejemplo, GDF-15 humano). La constante de disociación en equilibrio es una medida de la propensión de un complejo (por ejemplo, un complejo antígeno-anticuerpo) a disociarse de manera reversible en sus componentes (por ejemplo, el antígeno y el anticuerpo). Para los anticuerpos según la invención, los valores de KD(tales como los del antígeno GDF-15 humano) se determinan preferiblemente usando mediciones de resonancia de plasmón superficial tal como se describe a continuación.

Un “anticuerpo aislado” tal como se usa en el presente documento es un anticuerpo que se ha identificado y separado de la mayoría de los componentes (en peso) de su entorno fuente, por ejemplo, de los componentes de un cultivo celular de hibridoma o un cultivo celular diferente que se usó para su producción (por ejemplo, células productoras tales como células CHO que expresan de manera recombinante el anticuerpo). La separación se realiza de modo que elimine suficientemente los componentes que de otro modo podrían interferir con la idoneidad del anticuerpo para las aplicaciones deseadas (por ejemplo, con un uso terapéutico del anticuerpo anti-GDF-15 humano).

Los métodos para preparar anticuerpos aislados son conocidos en la técnica e incluyen cromatografía de proteína A, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, filtración de retención de virus y ultrafiltración. Preferiblemente, la preparación de anticuerpos aislados es al menos el 70 % pura (p/p), más preferiblemente al menos el 80 % pura (p/p), todavía más preferiblemente al menos el 90 % pura (p/p), todavía más preferiblemente al menos el 95 % pura (p/p) y lo más preferiblemente al menos el 99 % pura (p/p), tal como se mide usando el ensayo de proteínas de Lowry.

Un “diacuerpo” tal como se usa en el presente documento es una pequeña porción de anticuerpo de unión a antígeno bivalente que comprende un dominio variable de cadena pesada unido a un dominio variable de cadena ligera en la misma cadena polipeptídica unida por un ligador peptídico que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Esto da como resultado el emparejamiento con los dominios complementarios de otra cadena y el ensamblaje de una molécula dimérica con dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos pueden ser bivalentes y monoespecíficos (tales como diacuerpos con dos sitios de unión a antígeno para GDF-15 humano), o pueden ser bivalentes y biespecíficos (por ejemplo, diacuerpos con dos sitios de unión a antígeno, siendo uno de ellos un sitio de unión para GDF-15 humano y siendo el otro de ellos un sitio de unión para un antígeno diferente). Puede encontrarse una descripción detallada de los diacuerpos en Holliger Pet al.(“Diabodies”: small bivalent and bispecific antibody fragments”. Proc Natl Acad Sci USA. 15 de julio de 1993;90(14):6444-8).

Un “anticuerpo de un solo dominio” (que también se denomina “Nanobody<™>”) tal como se usa en el presente documento es un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo variable monomérico. Las estructuras y los métodos para producir anticuerpos de un solo dominio se conocen en la técnica, por ejemplo, a partir de Holt LJet al.(“Domain antibodies: proteins for therapy”. Trends Biotechnol. Noviembre de 2003;21(11):484-90), Saerens Det al.(“Single-domain antibodies as building blocks for novel therapeutics”. Curr Opin Pharmacol.

Octubre de 2008;8(5):600-8. Publicación electrónica del 22 de agosto de 2008) y Arbabi Ghahroudi Met al.(“Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies”. FEBS Lett.15 de septiembre de 1997;414(3):521-6).

Los términos “significativo”, “significativamente”, etc., tal como se usan en el presente documento, se refieren a una diferencia estadísticamente significativa entre valores tal como se evalúa mediante métodos apropiados conocidos en la técnica, y tal como se evalúa mediante los métodos a los que se hace referencia en el presente documento. Según la presente invención, cada aparición del término “que comprende” puede sustituirse opcionalmente por el término “que consiste en”.

Los términos “cáncer” y “célula cancerosa” se usan en el presente documento según su significado habitual en la técnica (véase, por ejemplo, Weinberg R.et al.: The Biology of Cancer. Garland Science: Nueva York 2006. Pág.

850).

Los cánceres, para los que se proporciona una predicción de una evolución clínica según la presente invención, son cánceres sólidos. Un “cáncer sólido” es un cáncer que forma uno o más tumores sólidos. Tales cánceres sólidos que forman tumores sólidos se conocen generalmente en la técnica. El término “cáncer sólido” abarca tanto un tumor primario formado por el cáncer como posibles tumores secundarios, que también se conocen como metástasis. Los cánceres sólidos preferidos se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, sarcoma de Ewing, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas, preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de cuello uterino, más preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial y cáncer de estómago, y lo más preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal y cáncer de próstata.

Tal como se hace referencia en el presente documento, el término “cáncer de cerebro” se refiere a todos los cánceres de cerebro conocidos en la técnica. Incluye, pero no se limita a, glioma (grado I a IV según la OMS), astrocitoma, meningioma y meduloblastoma.

Tal como se hace referencia en el presente documento, el término “cáncer de cabeza y cuello” se refiere a todos los cánceres de cabeza y cuello conocidos en la técnica. Incluye, pero no se limita a, carcinoma de esófago, carcinoma bucal de células escamosas y cáncer de hipofaringe. Un cáncer de cabeza y cuello particularmente preferido según la invención es el carcinoma bucal de células escamosas.

Tal como se usa en el presente documento, términos tales como “tratamiento del cáncer” o “tratar un cáncer” se refieren a un tratamiento terapéutico.

Tal como se hace referencia en el presente documento, un tratamiento del cáncer puede ser una terapia de primera línea, una terapia de segunda línea o una terapia de tercera línea o una terapia que va más allá de la terapia de tercera línea. El significado de estos términos se conoce en la técnica y es según la terminología que usa habitualmente el Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos.

Un tratamiento del cáncer no excluye que también se produzcan beneficios terapéuticos adicionales o secundarios en los pacientes. Por ejemplo, un beneficio adicional o secundario puede ser una influencia en la pérdida de peso inducida por el cáncer. Sin embargo, se entiende que un “tratamiento del cáncer” tal como se hace referencia en el presente documento es para tratar el cáncer en sí, y que cualquier efecto secundario o adicional sólo refleja ventajas adicionales opcionales del tratamiento del cáncer.

Como tratamiento del cáncer tal como se hace referencia según la divulgación es preferiblemente una inmunoterapia contra el cáncer.

El término “inmunoterapia contra el cáncer” se conoce en la técnica y generalmente se refiere a un tratamiento del cáncer en el que el sistema inmunitario del paciente se usa para tratar el cáncer. Las células cancerosas portan mutaciones genómicas que dan lugar a antígenos de células cancerosas que son específicos para las células cancerosas y diferentes de los antígenos de células no cancerosas. Por tanto, una inmunoterapia contra el cáncer a la que se hace referencia según la invención es preferiblemente una inmunoterapia contra el cáncer en la que el sistema inmunitario reconoce tales antígenos de células cancerosas, y en la que el sistema inmunitario destruye las células cancerosas que expresan estos antígenos. Una inmunoterapia contra el cáncer puede evaluarse mediante métodos de inmunomonitorización conocidos en la técnica, por ejemplo, midiendo la expresión de IFN-� intracelular (por ejemplo, en células T CD8<+>y/o células NK) en muestras de sangre, midiendo la expresión superficial de células CD107a (por ejemplo, en células T CD8<+>y/o células NK) en muestras de sangre, midiendo la expresión de TNF-� intracelular (por ejemplo, en leucocitos) en muestras de sangre, la expresión de interleucina-2 intracelular (por ejemplo, en células T CD8<+>y/o en células T CD4<+>) en muestras de sangre, la expresión superficial de células CD154 (por ejemplo, en células T CD8<+>y/o en células T CD4<+>) en muestras de sangre, la tinción de tetrámeros o dextrámeros para células T específicas de antígeno tumoral en muestras de sangre, la actividad CTL contra células tumorales autólogas o la presencia de células T contra neoantígenos derivados de mutaciones específicas de tumores. Los métodos preferidos para evaluar la inmunoterapia contra el cáncer son los métodos según Gouttefangeas Cet al.: “Flow Cytometry in Cancer Immunotherapy: Applications, Quality Assurance and Future”. (2015) En: Cancer Immunology: Translational Medicine from Bench to Bedside (N. Rezaei editor). Springer. Capítulo 25: páginas 471-486; y los métodos según Van der Burg SH,et al.: “Immunoguiding, the final frontier in the immunotherapy of cancer.” (2014) En Cancer Immunotherapy meets oncology (CM Britten, S Kreiter, M. Diken & HG Rammensee eds). Springer International Publishing Switzerland págs.37-51 ISBN: 978-3-319-05103-1.

Tal como se usa en el presente documento, una “inmunoterapia contra el cáncer” abarca opcionalmente un tratamiento en el que, además del sistema inmunitario que se usa para tratar el cáncer, se usan mecanismos adicionales de tratamiento del cáncer. Un ejemplo de una inmunoterapia contra el cáncer en la que pueden usarse mecanismos adicionales de tratamiento del cáncer es una terapia de combinación con agente(s) quimioterápico(s) conocido(s). Tal terapia de combinación con agente(s) quimioterápico(s) conocido(s) puede incluir, por ejemplo, no sólo el tratamiento del cáncer en el que el sistema inmunitario se usa para tratar el cáncer, sino también un tratamiento del cáncer en el que las células cancerosas se destruyen mediante dicho(s) agente(s) quimioterápico(s) directamente.

Tal como se hace referencia en el presente documento, un “tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario” es un tratamiento con uno o más bloqueadores de puntos de control inmunitario tal como se indica a continuación.

Los métodos para predecir según la invención se llevan a cabo preferiblemente antes del comienzo del tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario.

Alternativamente, los métodos para predecir según la invención también pueden llevarse a cabo en un punto en el tiempo en el que ya se ha comenzado el tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario.

Por tanto, debe entenderse que los métodos para predecir según la invención pueden usarse para pacientes que se someten a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario del cáncer sólido o un tratamiento diferente del cáncer sólido (por ejemplo, un tratamiento con otros agentes que son farmacéuticamente activos contra el cáncer). Sin embargo, también se entiende que ni las etapas del tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario ni las etapas de cualquier otro tratamiento forman parte de los métodos para predecir según la presente invención.

Tal como se hace referencia en el presente documento, un agente farmacéuticamente activo contra el cáncer puede ser, por ejemplo, un antineoplásico conocido y/o una molécula inmunoestimuladora. Los antineoplásicos conocidos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, clorambucilo e ifosfamida; antimetabolitos tales como azatioprina y mercaptopurina; alcaloides tales como alcaloides de la vinca (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina), taxanos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel), etopósido y tenipósido; inhibidores de topoisomerasas tales como camptotecinas (por ejemplo, irinotecán y topotecán); antibióticos citotóxicos tales como actinomicina, antraciclinas, doxorrubicina, daunorrubicina, valrubicina, idarrubicina, epirrubicina, bleomicina, plicamicina y mitomicina; y radioisótopos.

Muestras de sangre:

Tal como se hace referencia en el presente documento, el término “muestra de sangre” incluye, sin limitación, muestras de sangre completa, suero y plasma. También incluye otros tipos de muestras tales como fracciones de la sangre distintas del suero y el plasma. Tales muestras y fracciones se conocen en la técnica.

Las muestras de sangre que se usan para los métodos según la invención pueden ser cualquier tipo de muestras de sangre que contienen hGDF-15. Los tipos adecuados de muestras de sangre que contienen hGDF-15 se conocen en la técnica e incluyen muestras de suero y plasma. Alternativamente, tipos adicionales de muestras de sangre que contienen hGDF-15 también pueden identificarse fácilmente por el experto en la técnica, por ejemplo, midiendo si hGDF-15 está contenido en estas muestras, y qué niveles de hGDF-15 están contenidos en estas muestras, usando los métodos divulgados en el presente documento.

Si la muestra de sangre humana obtenida del paciente humano es una muestra de un paciente que ha recibido dicho bloqueador de puntos de control inmunitario, la muestra de sangre obtenida del paciente humano puede contener el bloqueador de puntos de control inmunitario y/o metabolitos biológicos del mismo.

En la técnica se conocen bloqueadores de puntos de control inmunitario, y su presencia puede determinarse por el experto en la técnica. También se conocen ejemplos de metabolitos de fármacos tales como metabolitos de anticuerpos terapéuticos y pueden detectarse, por ejemplo, usando anticuerpos secundarios apropiados.

Evoluciones clínicas:

Según la invención, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre humana pueden usarse para predecir la probabilidad de una evolución clínica positiva de un tratamiento con un bloqueador de puntos de control inmunitario en un paciente humano con cáncer.

Tal como se hace referencia en el presente documento, una “evolución clínica positiva” puede ser cualquier indicador terapéutico para un beneficio del tratamiento terapéutico. Tales indicadores se conocen bien en la técnica. Por tanto, según la invención, en una realización preferida, una evolución clínica positiva puede ser una respuesta al tratamiento del paciente humano con cáncer al tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario. En un aspecto preferido de esta realización, la presencia o ausencia de una respuesta al tratamiento se evalúa mediante una evaluación de si el tratamiento inhibe el crecimiento del cáncer en el paciente o pacientes tratados. Preferiblemente, la inhibición es estadísticamente significativa tal como se evalúa mediante pruebas estadísticas apropiadas que se conocen en la técnica. La inhibición del crecimiento del cáncer puede evaluarse comparando el crecimiento del cáncer en un grupo de pacientes tratados según la presente invención con un grupo de control de pacientes no tratados, o comparando un grupo de pacientes que recibe un tratamiento del cáncer convencional de la técnica más un tratamiento según la invención con un grupo de control de pacientes que sólo recibe un tratamiento del cáncer convencional de la técnica. Tales estudios para evaluar la inhibición del crecimiento del cáncer se designan según estándares aceptados para los estudios clínicos, por ejemplo, estudios con doble enmascaramiento, aleatorizados con suficiente potencia estadística.

El término “crecimiento del cáncer” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier crecimiento medible del cáncer. Para cánceres que forman tumores sólidos, “crecimiento del cáncer” se refiere a un aumento medible del volumen del tumor a lo largo del tiempo. Si el cáncer ha formado sólo un único tumor, “crecimiento del cáncer” se refiere sólo al aumento en el volumen de un único tumor. Si el cáncer ha formado múltiples tumores tales como metástasis, “crecimiento del cáncer” se refiere al aumento de volumen de todos los tumores medibles. Para tumores sólidos, el volumen del tumor puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo obtención de imágenes por resonancia magnética y tomografía computarizada (TAC).

En un aspecto muy preferido de esta realización, una evaluación de una respuesta al tratamiento se realiza basándose en una clasificación de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento usando los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhaueret al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). En: Eur. J. Cancer.45, n.º 2, enero de 2009, págs.228-47). Asimismo, estos criterios también son muy preferidos para los métodos de predicción según la invención.

En la técnica se conocen periodos de tiempo apropiados para una evaluación de una respuesta y se elegirán por el experto en la técnica teniendo en cuenta factores conocidos tales como el cáncer sólido particular y la gravedad de dicho cáncer, y el respectivo estadio de la enfermedad cancerosa. Por ejemplo, una respuesta al tratamiento puede evaluarse en un punto de tiempo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 y/o 24 meses después del comienzo del tratamiento con el bloqueador de puntos de control inmunitario. Preferiblemente, una respuesta al tratamiento se evalúa después de 12 semanas o después de 4 meses o después de 6 meses después del comienzo del tratamiento con el bloqueador de puntos de control inmunitario. Por el contrario, una predicción de la probabilidad de una respuesta al tratamiento según la invención puede proporcionarse para uno o más de los puntos de tiempo anteriores.

En otra realización preferida, una evolución clínica positiva puede ser una supervivencia del paciente humano con cáncer tras el tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario. La supervivencia de grupos de pacientes puede analizarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante las curvas de Kaplan-Meier.

En la técnica se conocen periodos de tiempo apropiados para la evaluación de la supervivencia y se elegirán por el experto en la técnica teniendo en cuenta factores conocidos tales como el cáncer sólido particular y la gravedad de dicho cáncer, y el respectivo estadio de la enfermedad cancerosa. Por ejemplo, la supervivencia, preferiblemente supervivencia a corto plazo, puede evaluarse, por ejemplo, en un punto de tiempo de 1 mes, 6 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses y/o 18 meses después del comienzo del tratamiento con el bloqueador de puntos de control inmunitario. La supervivencia a corto plazo se evalúa preferiblemente después de 6 semanas, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses después del comienzo del tratamiento con el bloqueador de puntos de control inmunitario. Alternativamente, la supervivencia, preferiblemente la supervivencia a largo plazo, puede evaluarse, por ejemplo, en un punto de tiempo de 24 meses, 30 meses, 36 meses, 42 meses, 48 meses, 54 meses, 60 meses, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años y/o 10 años después del comienzo del tratamiento con el bloqueador de puntos de control inmunitario. En melanoma, la supervivencia a largo plazo se evalúa preferiblemente en un punto de tiempo de 36 meses después del comienzo del tratamiento con el bloqueador de puntos de control inmunitario. Por el contrario, una predicción de una probabilidad de supervivencia según la invención puede proporcionarse para uno o más de estos puntos de tiempo. Tal como se describe en el presente documento, una “evolución clínica positiva” puede ser la ausencia de progresión de la enfermedad del paciente humano con cáncer tras el tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario. En la técnica se conocen indicadores para la presencia y ausencia de progresión de la enfermedad y se elegirán por el experto en la técnica teniendo en cuenta el respectivo cáncer sólido y el respectivo estadio de la enfermedad cancerosa.

Predicción de la probabilidad de una evolución clínica positiva según la invención

Para predecir la probabilidad de una evolución clínica positiva según la invención basándose en los niveles de hGDF-15, se usan preferiblemente los métodos para predecir que se definieron anteriormente.

Con el fin de poner en práctica los métodos de la invención, pueden emplearse métodos estadísticos conocidos en la técnica.

En estos métodos, pueden usarse datos de pacientes de uno o más estudios clínicos, que han tratado pacientes que padecen cánceres sólidos con bloqueadores de puntos de control inmunitario, como base para generar modelos estadísticos. Luego pueden usarse estos modelos para determinar los niveles umbral de hGDF-15 apropiados para predecir la probabilidad de una evolución clínica positiva.

Por ejemplo, la supervivencia puede analizarse mediante modelos de supervivencia de riesgos proporcionales de Cox, por ejemplo, ajustando el modelo con el nivel de hGDF-15 (ng/ml) como factor predisponente continuo.

En una realización preferida, la probabilidad de supervivencia se predice usando un cociente de riesgos instantáneos (HR) con supervivencia general (tiempo hasta la muerte) como criterio de valoración y GDF-15 como factor predisponente continuo, donde se predice que por 1 ng/ml de aumento en los niveles en suero de GDF-15, el riesgo de muerte aumenta en un factor de 1,27 (intervalo de confianza del 95 % de 1,10 - 1,47, P=0,00109).

En una realización alternativa, la probabilidad de supervivencia se predice usando una variable de agrupamiento basándose en GDF-15 como factor predisponente categórico, por ejemplo, con grupos <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml, >4,2 ng/ml).

Los métodos estadísticos preferidos, que pueden usarse según la invención para generar modelos estadísticos de datos de pacientes de estudios clínicos, se divulgan en el ejemplo 1. Teniendo en cuenta los efectos altamente significativos, también son adecuados modelos estadísticos menos precisos. Se entiende que los métodos estadísticos divulgados en el ejemplo 1 no se limitan a las características particulares del ejemplo 1 tales como el tipo de cáncer (melanoma), el tipo de bloqueador de puntos de control inmunitario y los valores estadísticos particulares obtenidos en el ejemplo. Más bien, estos métodos divulgados en el ejemplo 1 pueden usarse generalmente junto con cualquier realización de la presente invención.

Niveles de hGDF-15

Según la invención, existe una relación inversa entre los niveles de hGDF-15 y la probabilidad de una evolución clínica positiva (por ejemplo, probabilidad de supervivencia o probabilidad de una respuesta al tratamiento) en pacientes humanos con cáncer tratados con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, según la invención, un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de una evolución clínica positiva (por ejemplo, probabilidad de supervivencia o probabilidad de una respuesta al tratamiento) en dichos pacientes humanos con cáncer.

Por tanto, tal como se usa en el presente documento, los términos tales como “un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada” significa que el nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana y la probabilidad de una evolución clínica positiva (por ejemplo, probabilidad de supervivencia o probabilidad de una respuesta al tratamiento) en pacientes humanos con cáncer tratados con bloqueadores de puntos de control inmunitario siguen una relación inversa. Por tanto, cuanto mayor sea el nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana, menor será la probabilidad de una evolución clínica positiva (por ejemplo, probabilidad de supervivencia o probabilidad de una respuesta al tratamiento).

Por ejemplo, junto con los métodos para predecir según la invención definidos en el presente documento, pueden usarse niveles umbral de hGDF-15.

Según la invención, la relación inversa entre los niveles de hGDF-15 y una evolución clínica positiva se aplica a cualquier valor umbral y, por tanto, la invención no se limita a valores umbral particulares.

Los niveles umbral de hGDF-15 preferibles son niveles en suero de hGDF-15 tal como se definió anteriormente en las realizaciones preferidas.

Alternativamente, pueden obtenerse niveles umbral de hGDF-15 según la presente invención, y/o ajustarse adicionalmente, usando los métodos estadísticos mencionados anteriormente para predecir la probabilidad de una evolución clínica positiva.

Un nivel umbral de hGDF-15 puede ser un nivel umbral de hGDF-15 individual. La invención también abarca el uso de más de un nivel umbral de hGDF-15, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más niveles umbral de hGDF-15. La invención también abarca el uso de una serie continua de niveles umbral de hGDF-15. Un ejemplo no limitativo de una serie continua de niveles umbral de hGDF-15 de este tipo se proporciona en la figura 3.

Para cada nivel umbral de hGDF-15 individual del uno o más niveles umbral de hGDF-15, puede predecirse la probabilidad correspondiente de una evolución clínica positiva (por ejemplo, probabilidad de supervivencia o probabilidad de una respuesta al tratamiento). Si disminuye el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre en comparación con un nivel umbral de hGDF-15 según la invención, esto indica que aumenta la probabilidad de una evolución clínica positiva (por ejemplo, la probabilidad de supervivencia o la probabilidad de una respuesta al tratamiento), es decir, aumenta en comparación con la probabilidad de una evolución clínica positiva que puede predecirse para dicho nivel umbral de hGDF-15. En un ejemplo no limitativo, la figura 3 del ejemplo 1 ilustra una serie continua de niveles umbral de hGDF-15 y una curva de probabilidades predichas correspondientes para una respuesta al tratamiento.

En un ejemplo no limitativo adicional, la probabilidad de una respuesta al tratamiento puede predecirse basándose en un cociente de probabilidades tal como el cociente de probabilidades mostrado en la tabla 2. Por tanto, la probabilidad de una respuesta al tratamiento puede predecirse usando un cociente de probabilidades de 0,389 para niveles en suero de hGDF-15 en ng/ml como factor predisponente continuo con un intervalo de confianza de desde 0,159 hasta 0,698.

Los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, un método preferido para medir los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre, incluyendo los niveles en suero, es una medición de los niveles de hGDF-15 mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) usando anticuerpos contra GDF-15 o mediante inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos contra GDF-15 (por ejemplo, inmunotransferencia de tipo Western de suero concentrado). Tales métodos de ELISA se ejemplifican en el ejemplo 1, pero también pueden incluir métodos basados en perlas como la tecnología Luminex y otras. Alternativamente, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre, incluyendo los niveles en suero, pueden determinarse mediante inmunoensayos de electroquimioluminiscencia conocidos usando anticuerpos contra GDF-15. Por ejemplo, la tecnología Elecsys<®>de Roche puede usarse para tales inmunoensayos de electroquimioluminiscencia. Otros métodos posibles incluyen detección basada en anticuerpos de fluidos corporales después de la separación de proteínas en un campo eléctrico.

La mediana del nivel en suero de hGDF-15 de individuos de control humanos sanos es de < 0,8 ng/ml. El intervalo esperado es de entre 0,2 ng/ml y 1,2 ng/ml en controles humanos sanos (referencia: Tanno Tet al.: “Growth differentiation factor 15 in erythroid health and disease”. Curr Opin Hematol. Mayo de 2010; 17(3): 184-190).

Según la invención, un nivel umbral de hGDF-15 preferido es un nivel en suero de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,2 ng/ml y 8,0 ng/ml, o un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,5 ng/ml y 7,0 ng/ml, o un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 2,0 ng/ml y 6,0 ng/ml, o un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 2,5 ng/ml y 5,0 ng/ml, o un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 3,0 ng/ml y 4,0 ng/ml.

En una realización preferida, el cáncer del paciente es melanoma. En un aspecto preferido de esta realización, el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 3,0 ng/ml y 4,0 ng/ml, preferiblemente un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 3,2 ng/ml y 3,7 ng/ml, y lo más preferiblemente un nivel de hGDF-15 de 3,4 ng/ml.

Se entiende que para estos niveles en suero de hGDF-15, y basándose en la divulgación de la invención proporcionada en el presente documento, el experto en la técnica puede obtener de manera rutinaria niveles de hGDF-15 correspondientes en otras muestras de sangre (por ejemplo, comparando el nivel de hGDF-15 relativo en suero con el respectivo nivel en otras muestras de sangre). Por tanto, la presente invención también abarca niveles de hGDF-15 preferidos en plasma, sangre completa y otras muestras de sangre, que corresponden a cada uno de los niveles en suero de hGDF-15 preferidos y los intervalos indicados anteriormente.

Anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 que pueden usarse según la invención

Los métodos, aparatos y kits usados en la invención pueden usar uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o una porción de unión a antígeno de los mismos, tal como se definió anteriormente.

Se mostró anteriormente que una proteína GDF-15 humana puede seleccionarse como diana ventajosamente por un anticuerpo monoclonal (documento WO2014/049087), y que tal anticuerpo tiene propiedades ventajosas incluyendo una alta afinidad de unión a GDF-15 humano, tal como se demostró mediante una constante de disociación en equilibrio de aproximadamente 790 pM para GDF-15 humano recombinante (véase el ejemplo de referencia 1). Por tanto, en una realización preferida, la invención usa un anticuerpo capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a antígeno del mismo. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a hGDF-15, o una porción de unión a antígeno del mismo.

Por tanto, preferiblemente, el anticuerpo capaz de unirse a hGDF-15 o la porción de unión a antígeno del mismo según la invención es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos al menos el 90 % idéntica a la misma, y en el que el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de aminoácidos al menos el 85 % idéntica a la misma. Preferiblemente, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser.

Por tanto, más preferiblemente, el anticuerpo capaz de unirse a hGDF-15 o la porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y en el que el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

En otro ejemplo del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, el dominio variable de cadena pesada comprende una región que comprende una FR1, una CDR1, una FR2, una CDR2 y una región FR3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la misma, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región que comprende una FR1, una CDR1, una FR2, una CDR2 y una región FR3 y que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la misma.

En otro ejemplo del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, el dominio variable de cadena pesada comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, y el dominio variable de cadena ligera comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 y una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En un aspecto preferido, el anticuerpo puede tener secuencias de CDR3 tal como se definió anteriormente.

En otro aspecto del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, la porción de unión a antígeno es un anticuerpo de un solo dominio (también denominado “Nanobody<™>”). En un aspecto, el anticuerpo de un solo dominio comprende las secuencias de aminoácidos CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. En otro aspecto, el anticuerpo de un solo dominio comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 6, ser-ala-ser y SEQ ID NO: 7, respectivamente. En un aspecto preferido, el anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo humanizado. Preferiblemente, los anticuerpos capaces de unirse a GDF-15 humano o las porciones de unión a antígeno de los mismos tienen una constante de disociación en equilibrio para GDF-15 humano que es igual a o menor de 100 nM, menor de 20 nM, preferiblemente menor de 10 nM, más preferiblemente menor de 5 nM y lo más preferiblemente de entre 0,1 nM y 2 nM.

En otro aspecto del anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a antígeno del mismo se une al mismo epítopo de GDF-15 humano como anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse a partir de la línea celular B1-23 depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DMSZ) con el n.º de registro DSM ACC3142. Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo que se une a GDF-15 humano según la presente invención se evalúa preferiblemente mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial como método convencional de referencia, según los procedimientos descritos en el ejemplo de referencia 1. La unión al mismo epítopo en GDF-15 humano puede evaluarse de manera similar mediante experimentos de unión competitiva mediante resonancia de plasmón superficial del anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse de la línea celular B1-23 y el anticuerpo que se espera que se una al mismo epítopo de GDF-15 humano como anticuerpo contra GDF-15 humano que puede obtenerse de la línea celular B1-23.

Muy preferiblemente, el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a GDF-15 humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en GDF-15 humano que se compone de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26. En un aspecto preferido, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo tal como se define por las secuencias de uno cualquiera de las anteriores.

Los anticuerpos, incluyendo el anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a antígeno del mismo, pueden modificarse, por ejemplo, mediante una etiqueta o un marcador.

Una etiqueta puede ser, por ejemplo, una etiqueta de biotina o una etiqueta de aminoácido. Los ejemplos no limitativos de tales etiquetas de etiqueta de ácido incluyen etiquetas de polihistidina (His), etiquetas FLAG, etiqueta de hemaglutinina (HA), etiqueta de glicoproteína D (gD) y etiqueta c-myc. Pueden usarse etiquetas para diversos propósitos. Por ejemplo, pueden usarse etiquetas para ayudar a la purificación del anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a antígeno del mismo. Preferiblemente, tales etiquetas están presentes en el extremo C-terminal o el extremo N-terminal del anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a antígeno del mismo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “marcador” se refiere a cualquier molécula o grupo de moléculas que puede facilitar la detección del anticuerpo. Por ejemplo, los marcadores pueden ser enzimáticos, tales como peroxidasa del rábano (HRP), fosfatasa alcalina (AP) o glucosa oxidasa. Los anticuerpos marcados enzimáticamente pueden emplearse, por ejemplo, en ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas. Los marcadores también pueden ser isótopos radiactivos, secuencias de ADN (que pueden usarse, por ejemplo, para detectar los anticuerpos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)), indicadores fluorogénicos y grupos electroquimioluminiscentes (por ejemplo, complejos de rutenio). Como alternativa al marcaje, los anticuerpos usados según la invención, en particular un anticuerpo capaz de unirse a GDF-15 humano o la porción de unión a antígeno del mismo, pueden detectarse directamente, por ejemplo, mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial.

Bloqueadores de puntos de control inmunitario

La presente invención se refiere a la predicción de la probabilidad de una evolución clínica positiva de un tratamiento con un bloqueador de puntos de control inmunitario en un paciente humano con cáncer, en particular a la predicción de la probabilidad de una respuesta al tratamiento de un paciente humano con cáncer a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario y a la predicción de la probabilidad de supervivencia de un paciente humano con cáncer tras un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario.

Las células cancerosas albergan mutaciones genómicas que dan lugar a antígenos de células cancerosas que son específicos para las células cancerosas y diferentes de los antígenos de células no cancerosas. Por tanto, un sistema inmunitario intacto que no está inhibido debería reconocer estos antígenos de células cancerosas, de modo que se provoca una respuesta inmunitaria contra estos antígenos. Sin embargo, la mayoría de los cánceres han desarrollado mecanismos de inmunotolerancia contra estos antígenos. Una clase de mecanismo mediante el cual las células cancerosas logran tal inmunotolerancia es la utilización de puntos de control inmunitario.

Un “punto de control inmunitario” tal como se usa en el presente documento generalmente significa un mecanismo inmunológico mediante el cual puede inhibirse una respuesta inmunitaria. Más particularmente, un punto de control inmunitario es un mecanismo que se caracteriza porque una molécula del sistema inmunitario (o un grupo de moléculas del sistema inmunitario) inhibe la respuesta inmunitaria inhibiendo la activación de células del sistema inmunitario. Tal molécula (o grupo de moléculas) del sistema inmunitario que inhibe (inhiben) la respuesta inmunitaria inhibiendo la activación de células del sistema inmunitario también se conoce (conocen) como molécula(s) de punto de control.

Tal como se usa en el presente documento, un “bloqueador de puntos de control inmunitario” es una molécula que es capaz de bloquear un punto de control inmunitario. El término “bloqueador de puntos de control inmunitario” tal como se usa en el presente documento no se refiere a un inhibidor de hGDF-15 tal como un anticuerpo capaz de unirse a hGDF-15, sino que significa una molécula que es diferente de un inhibidor de hGDF-15.

Los bloqueadores de puntos de control inmunitario más habituales que se conocen hasta la fecha son inhibidores de moléculas de puntos de control inmunitario tales como inhibidores de PD-1 humana e inhibidores de PD-L1 humana. Bloqueadores de puntos de control inmunitario adicionales son los anticuerpos anti-LAG-3, anti-B7H3, anti-TIM3, anti-VISTA, anti-TIGIT, anti-KIR, anti-CD27, anti-CD137, así como inhibidores de IDO. Por tanto, una forma preferida de un bloqueador de puntos de control inmunitario es un inhibidor de una molécula de punto de control inmunitario. Alternativamente, un bloqueador de puntos de control inmunitario puede ser un activador de una señal de coestimulación que anula el punto de control inmunitario.

Según la invención, los bloqueadores de puntos de control inmunitario son inhibidores de PD-1 humana e inhibidores de PD-L1 humana.

Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de PD-1 humana” puede ser cualquier molécula que sea capaz de inhibir específicamente la función de PD-1 humana. Ejemplos no limitativos de tales moléculas son anticuerpos capaces de unirse a PD-1 humana y DARPin (proteínas de repetición de anquirina diseñadas) capaces de unirse a PD-1 humana. Preferiblemente, el inhibidor de PD-1 al que se hace referencia en la invención es un anticuerpo capaz de unirse a PD-1 humana, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana. Lo más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana se selecciona del grupo que consiste en nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab y AMP-224.

Tal como se usa en el presente documento, un “inhibidor de PD-L1 humana” puede ser cualquier molécula que sea capaz de inhibir específicamente la función de PD-L1 humana. Ejemplos no limitativos de tales moléculas son anticuerpos capaces de unirse a PD-L1 humana y DARPin (proteínas de repetición de anquirina diseñadas) capaces de unirse a PD-L1 humana. Preferiblemente, el inhibidor de PD-L1 humana al que se hace referencia en la invención es un anticuerpo capaz de unirse a PD-L1 humana, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana. Lo más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana se selecciona del grupo que consiste en BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 y MSB0010718C.

Métodos y técnicas

Generalmente, a menos que se defina lo contrario en el presente documento, los métodos usados en la presente divulgación (por ejemplo, métodos de clonación o métodos relacionados con anticuerpos) se realizan según procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, los procedimientos descritos en Sambrooket al.(“Molecular Cloning: A Laboratory Manual.”, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1989), Ausubelet al.(“Current Protocols in Molecular Biology.” Greene Publishing Associates and Wiley Interscience; Nueva York 1992), y Harlow y Lane (“Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York 1988).

La unión de anticuerpos a sus respectivas proteínas diana puede evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica. La unión de anticuerpos monoclonales a sus respectivas dianas se evalúa preferiblemente mediante mediciones de resonancia de plasmón superficial. Estas mediciones se llevan a cabo preferiblemente usando un sistema ProteOn XPR36 de Biorad y chips sensores GLC de Biorad, tal como se ejemplifica para el anticuerpo anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 en el ejemplo de referencia 1.

Las alineaciones de secuencias de las secuencias según la invención se realizan usando el algoritmo BLAST (véase Altschulet al.(1990) “Basic local alignment search tool.” Journal of Molecular Biology 215. págs.403-410; Altschulet al.: (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.25:3389-3402).

Preferiblemente, se usan los siguientes parámetros: secuencias diana máx. 10; tamaño de palabra 3; matriz BLOSUM 62; penalizaciones de huecos: existencia 11, extensión 1; ajuste de matriz de puntuación composicional condicional. Por tanto, cuando se usan junto con secuencias, los términos tales como “identidad” o “idéntica” se refieren al valor de identidad obtenido usando el algoritmo BLAST.

Pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos a los que se hace referencia en Siegel DL (“Recombinant monoclonal antibody technology.” Transfus Clin Biol. Enero de 2002;9(1):15-22). En un aspecto, se produce un anticuerpo según la divulgación mediante la línea celular de hibridoma B1-23 depositada en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DSMZ) con el n.º de registro DSM ACC3142 bajo el Tratado de Budapest. El depósito se presentó el 29 de septiembre de 2011.

Los niveles de GDF-15 humano (hGDF-15) pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo mediciones de niveles de proteína hGDF-15 mediante métodos que incluyen (pero no se limitan a) espectrometría de masas para proteínas o péptidos derivados de GDF-15 humano, inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos específicos contra GDF-15 humano, pruebas con tiras reactivas usando anticuerpos específicos contra GDF-15 humano o inmunocitoquímica usando anticuerpos específicos contra GDF-15 humano. Un método preferido para medir los niveles en suero de hGDF-15 es una medición de los niveles en suero de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) usando anticuerpos contra GDF-15. Tales métodos de ELISA se ejemplifican en el ejemplo 1. Alternativamente, pueden determinarse los niveles en suero de hGDF-15 mediante inmunoensayos de electroquimioluminiscencia conocidos usando anticuerpos contra GDF-15. Por ejemplo, la tecnología Elecsys<®>de Roche puede usarse para tales inmunoensayos de electroquimioluminiscencia.

Aparatos

Un aparato puede ser cualquier aparato que está configurado para realizar los métodos de la divulgación.

Tal como se usa en el presente documento, el término “configurado para realizar” significa que el aparato está específicamente configurado para las etapas del método mencionadas. Por ejemplo, un aparato configurado para realizar un método que usa un nivel umbral particular estará específicamente configurado para usar ese umbral particular. Para medición mediante ELISA, sería adecuado cualquier lector capaz de medir la absorción. Para ensayos basados en perlas, podría usarse un analizador de Luminex o un citómetro de flujo.

Para su uso en la invención, el aparato es un analizador de electroquimioluminiscencia (por ejemplo, Elecsys<®>) tal como un analizador Cobas<®>, incluyendo, pero sin limitarse a, analizadores de las series Cobas<®>4000, Cobas<®>6000, Cobas<®>8000, Cobas c 111 y Cobas INTEGRA<®>400 plus.

Kits de la invención

La invención también se refiere al uso de kits en los métodos de la invención detallados en las reivindicaciones adjuntas.

El hGDF-15 recombinante contenido en los kits puede estar presente en una forma que pueda usarse de manera conveniente para propósitos de calibración. Por ejemplo, puede estar presente en forma de disoluciones madre que cubren varias concentraciones en el intervalo de 0 a 15 ng/ml, por ejemplo, al menos una concentración en el intervalo de 0-1 ng/ml, al menos una concentración en el intervalo de 1-3 ng/ml, al menos una concentración en el intervalo de 3-6 ng/ml y preferiblemente al menos una concentración adicional en el intervalo de 6-10 ng/ml, y más preferiblemente comprendiendo además al menos una concentración adicional en el intervalo de 10-15 ng/ml.

La calibración con múltiples disoluciones de hGDF-15 a estas concentraciones será particularmente ventajosa para una medición precisa debido a las altas concentraciones de hGDF-15 observadas en los sueros de los pacientes con una mala evolución clínica predicha.

Secuencias

Las secuencias de aminoácidos a las que se hace referencia en la presente solicitud son las siguientes (en un orden N-terminal a C-terminal; representadas en un código de aminoácido de una letra):

SEQ ID NO: 1 (región del dominio variable de cadena pesada que comprende una FR1, una CDR1, una FR2, una CDR2 y una región FR3 de la secuencia polipeptídica del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

SEQ ID NO: 2 (región del dominio variable de cadena ligera que comprende una FR1, una CDR1, una FR2, una CDR2 y una región FR3 de la secuencia polipeptídica del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

SEQ ID NO: 3 (secuencia peptídica de la región CDR1 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

GFSLSTSGMG SEQ ID NO: 4 (secuencia peptídica de la región CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

IYWDDDK SEQ ID NO: 5 (secuencia peptídica de la región CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

ARSSYGAMDY

SEQ ID NO: 6 (secuencia peptídica de la región CDR1 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

QNVGTN

Secuencia peptídica de la región CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23:

SAS SEQ ID NO: 7 (secuencia peptídica de la región CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23):

QQYNNFPYT SEQ ID NO: 8 (proteína GDF-15 humana madura recombinante):

SEQ ID NO: 9 (proteína precursora de GDF-15 humana):

SEQ ID NO: 10 (proteína precursora de GDF-15 humana ligador GSGS N-terminal y C-terminal):

SEQ ID NO: 11 (péptido Flag): DYKDDDDKGG

SEQ ID NO: 12 (péptido HA): YPYDVPDYAG

SEQ ID NO: 13 (péptido derivado de GDF-15 humano): ELHLRPQAARGRR

SEQ ID NO: 14 (péptido derivado de GDF-15 humano): LHLRPQAARGRRR

SEQ ID NO: 15 (péptido derivado de GDF-15 humano): HLRPQAARGRRRA

SEQ ID NO: 16 (péptido derivado de GDF-15 humano): LRPQAARGRRRAR

SEQ ID NO: 17 (péptido derivado de GDF-15 humano): RPQAARGRRRARA

SEQ ID NO: 18 (péptido derivado de GDF-15 humano): PQAARGRRRARAR

SEQ ID NO: 19 (péptido derivado de GDF-15 humano): QAARGRRRARARN

SEQ ID NO: 20 (péptido derivado de GDF-15 humano): MHAQIKTSLHRLK

SEQ ID NO: 25 (péptido de GDF-15 que comprende parte del epítopo de GDF-15 que se une a B1-23):

EVQVTMCIGACPSQFR SEQ ID NO: 26 (péptido de GDF-15 que comprende parte del epítopo de GDF-15 que se une a B1-23): TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

Las secuencias de ácido nucleico a las que se hace referencia en la presente solicitud son las siguientes (en un orden de 5’ a 3’; representado según el código habitual de ácidos nucleicos):

SEQ ID NO: 21 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 1):

SEQ ID NO: 22 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 2):

SEQ ID NO: 23 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 5):

GCTCGAAGTTCCTACGGGGCAATGGACTAC SEQ ID NO: 24 (secuencia de nucleótidos de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos definida en SEQ ID NO: 7):

CAGCAATATAACAACTTTCCGTACACG

Ejemplos

Los ejemplos de referencia 1 a 3 ejemplifican un anticuerpo contra hGDF-15, que puede usarse en los métodos, kits y aparatos. Este anticuerpo contra hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal que se conoce a partir del documento WO 2014/049087.

Ejemplo de referencia 1: Generación y caracterización del anticuerpo contra GDF-15 B1-23

Se generó el anticuerpo B1-23 en un ratón con GDF-15 inactivado. Se usó GDF-15 humano recombinante (SEQ ID NO: 8) como inmunógeno.

La Universidad Julius Maximilians de Wurzburgo, Sanderring 2, 97070 Wurzburgo, Alemania, depositó la línea celular de hibridoma B1-23 que produce AcM-B1-23 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares GmbH (DMSZ) con el n.º de registro DSM ACC3142, según el Tratado de Budapest. Por medio de un sistema de tiras reactivas disponible comercialmente, se identificó B1-23 como un isotipo IgG2a (cadena kappa). Usando mediciones de resonancia de plasmón superficial, se determinó la constante de disociación (Kd) de la siguiente manera:

La unión del anticuerpo monoclonal anti-GDF-15 humano AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano se midió empleando mediciones de resonancia de plasmón superficial usando un sistema ProteOn XPR36 de Biorad y chips sensores GLC de Biorad:

Para preparar los biosensores, se inmovilizó la proteína GDF-15 humana madura recombinante sobre las celdas de flujo 1 y 2. Sobre una celda de flujo se usó GDF-15 recombinante derivado de células de insecto transfectadas con baculovirus (células de insecto HighFive) y sobre la otra se usó proteína recombinante derivada de la expresión enE. coli. Se activó el chip sensor GLC usando sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida) y EDC (clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida) (kit de acoplamiento de aminas ProteOn de Biorad) según la recomendación del fabricante, se cargó posteriormente la superficie del sensor con las proteínas hasta una densidad de aproximadamente 600 UR (1 UR = 1 pg mm<-2>). Luego se extinguieron los grupos de acoplamiento sin reaccionar mediante perfusión con etanolamina 1 M pH 8,5 y se equilibró el biosensor mediante perfusión del chip con tampón de transferencia (HEPES 10 M, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, Tween-20 al 0,005 %, pH 7,4, denominado HBS150). Como controles se usaron dos celdas de flujo, una vacía sin proteína acoplada y una acoplada con una pareja de proteína no fisiológica (interleucina-5 humana), que se inmovilizó usando la misma química de acoplamiento y la misma densidad de acoplamiento. Para las mediciones de interacción se disolvió AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano en HBS150 y se usó en seis concentraciones diferentes como analito (concentración: 0,4, 0,8, 3, 12, 49 y 98 nM). Se sometió a perfusión el analito sobre el biosensor usando la configuración de cinética de una sola inyección para evitar la regeneración intermitente, se realizaron todas las mediciones a 25 ºC y usando una velocidad de flujo de 100 μl min<-1>. Para el procesamiento, se eliminaron el efecto de superficie aparente y la unión inespecífica a la matriz del sensor restando los datos de SPR de la celda de flujo vacía (celda de flujo 3) de todos los demás datos de SPR. El sensograma resultante se analizó usando el software ProteOn Manager versión 3.0. Para el análisis de la cinética de unión, se supuso una interacción de tipo Langmuir 1:1. Para la constante de velocidad de asociación, pudo determinarse un valor de 5,4� 0,06 x 10<5>M<-1>s<-1>(kon) y para la constante de velocidad de disociación un valor de 4,3 � 0,03 x 10<-4>s<-1>(koff) (los valores son para la interacción de AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano con GDF-15 derivado de la expresión en células de insecto). Se calculó la constante de disociación en equilibrio usando la ecuación KD= koff/konpara producir un valor de aproximadamente 790 pM. Los valores de afinidad para la interacción de GDF-15 derivado de la expresión enE. coliy el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano difieren en un factor de menos de 2, las constantes de velocidad para GDF-15 derivado de células de insecto yE. colise desvían en aproximadamente el 45 % y, por tanto, están dentro de la precisión de las mediciones de SPR y probablemente no reflejan una diferencia real en la afinidad. En las condiciones usadas, el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano no muestra unión a interleucina-5 humana y, por tanto, confirma la especificidad de los datos de interacción y el AcM-B1-23 anti-GDF-15 humano. La secuencia de aminoácidos de GDF-15 humano recombinante (tal como se expresa en células de insecto transfectadas en baculovirus) es:

(SEQ ID NO: 8)

Por tanto, usando mediciones de resonancia de plasmón superficial, se determinó la constante de disociación (Kd) de 790 pM. Como comparación: el anticuerpo rituximab usado terapéuticamente tenía una afinidad significativamente menor (Kd = 8 nM).

Se demostró previamente que AcM B1-23 inhibe la proliferación de células cancerosasin vitro,y que AcM B1-23 inhibe el crecimiento de tumoresin vivo(documento WO2014/049087).

Ejemplo de referencia 2: AcM B1-23 reconoce un epítopo conformacional o discontinuo de GDF-15 humano Mapeo de epítopos: anticuerpo monoclonal de ratón contra GDF-15 contra péptidos lineales de 13 meros derivados de GDF-15

Antígeno: GDF-15:

Se tradujo la secuencia de proteínas en péptidos de 13 meros con un cambio de un aminoácido. Se alargaron los extremos C-terminal y N-terminal mediante un ligador GSGS neutro para evitar los péptidos truncados (letras en negrita).

Péptidos de control:

Flag: DYKDDDDKGG (SEQ ID NO:13), 78 puntos; HA: YPYDVPDYAG (SEQ ID NO:14), 78 puntos (cada copia de alineamiento)

000264_01 (10/90, ligador Ala2Asp)

Condiciones de tinción:

Tampón patrón: PBS, pH 7,4 Tween 20 al 0,05 %

Tampón de bloqueo: tampón de bloqueo de Rockland MB-070

Tampón de incubación: tampón patrón con tampón de bloqueo de Rockland MB-070 al 10 %

Muestra primaria: anticuerpo monoclonal de ratón contra GDF-15 (1 μg/ μl): tinción en tampón de incubación durante 16 h a 4 ºC a una dilución de 1:100 y agitación ligera a 500 rpm

Anticuerpo secundario: anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) IRDye680, tinción en tampón de incubación con una dilución de 1:5000 durante 30 min a temperatura ambiente (TA)

Anticuerpos de control: anticuerpo monoclonal anti-HA (12CA5)-LL-Atto 680 (1:1000), anticuerpo monoclonal anti-FLAG(M2)-FluoProbes752 (1:1000); tinción en tampón de incubación durante 1 h a TA

Escáner:

Sistema de obtención de imágenes Odyssey, LI-COR Biosciences

Ajustes: desplazamiento: 1 mm; resolución: 21 μm; intensidad verde/rojo: 7/7

Resultados:

Después de hinchamiento previo durante 30 minutos en tampón patrón y 30 minutos en tampón de bloqueo, se incubó el alineamiento de péptidos con péptidos lineales derivados de B7H3 de 10, 12 y 15 meros con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de ratón (H L) IRDye680 sólo a una dilución de 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente para analizar las interacciones de fondo del anticuerpo secundario. Se lavó el PEPperCHIP® 2x1 min con tampón patrón, se enjuagó con agua dest. y se secó en una corriente de aire. Se realizó la lectura con el sistema de obtención de imágenes Odyssey a una resolución de 21 μm e intensidades verde/rojo de 7/7: se observó una interacción débil de péptidos ricos en arginina (ELHLRPQAARGRR (SEQ ID NO:15), LHLRPQAARGRRR (SEQ ID NO:16), HLRPQAARGRRRA (SEQ ID NO:17), LRPQAARGRRRAR (SEQ ID NO:18), RPQAARGRRRARA (SEQ ID NO:19), PQAARGRRRARAR (SEQ ID NO:20) y QAARGRRRARARN (SEQ ID NO:21)) que se conocen como agentes de unión frecuentes y con el péptido básico MHAQIKTSLHRLK (SEQ ID NO:22) debido a interacciones iónicas con el colorante de anticuerpos cargado.

Después de hinchamiento previo durante 10 minutos en tampón patrón, se incubó el microalineamiento de péptidos durante la noche a 4 ºC con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-GDF-15 a una dilución de 1:100. El lavado repetido en tampón patrón (2x1 min) estuvo seguido por incubación durante 30 min con el anticuerpo secundario a una dilución de 1:5000 a temperatura ambiente. Después de lavado durante 2x10 s en tampón patrón y enjuague corto con agua dest., se secó el PEPperCHIP® en una corriente de aire. Se realizó la lectura con el sistema de obtención de imágenes Odyssey a una resolución de 21 μm e intensidades verde/rojo de 7/7 antes y después de la tinción de los péptidos de control con anticuerpos anti-HA y anti-FLAG(M2).

Se demostró que ninguno de los péptidos de 13 meros lineales derivados de GDF-15 interaccionaba con el anticuerpo monoclonal de ratón contra GDF-15 ni siquiera a intensidades sobrerreguladas. Sin embargo, la tinción de los péptidos de control Flag y HA que enmarcan el alineamiento dio lugar a intensidades de puntos buenas y homogéneas.

Resumen:

El mapeo de epítopos del anticuerpo monoclonal de ratón contra GDF-15 contra GDF-15 no reveló ningún epítopo lineal con los péptidos de 13 meros derivados del antígeno. Según este hallazgo, es muy probable que el anticuerpo monoclonal de ratón contra GDF-15 reconozca un epítopo conformacional o discontinuo con baja afinidad de epítopos parciales. Debido a la ausencia obvia de cualquier señal de GDF-15 por encima de la tinción de fondo del anticuerpo secundario solamente, se omitió la cuantificación de las intensidades puntuales con el analizador PepSlide® y la anotación posterior de péptidos.

Ejemplo de referencia 3: Identificación estructural de epítopos de ligando de péptidos mediante escisión de epítopos y extracción de epítopos mediante espectrometría de masas

El epítopo de GDF-15 humano recombinante que se une al anticuerpo B1-23 se identificó por medio del método de escisión de epítopos y el método de extracción de epítopos (Suckauet al.Proc Natl Acad Sci U S A. Diciembre de 1990; 87(24): 9848-9852; R.Stefanescuet al., Eur.J.Mass Spectrom.13, 69-75 (2007)).

Para la preparación de la columna de anticuerpo, se añadió el anticuerpo B1-23 a ácido 6-aminohexanoico activado con NHS acoplado con Sepharose. Luego se cargó el anticuerpo B1-23 acoplado con Sepharose en una microcolumna de 0,8 ml y se lavó con los tampones de bloqueo y lavado.

Experimento de extracción de epítopos:

Se digirió GDF-15 humano recombinante con tripsina durante 2 h a 37 ºC (en disolución), dando como resultado diferentes péptidos, según los sitios de escisión de tripsina en la proteína. Después de la digestión completa, se cargaron los péptidos en la columna de afinidad que contiene el anticuerpo B1-23 inmovilizado. Se usaron los péptidos de GDF-15 no unidos, así como los potencialmente unidos, para el análisis mediante espectrometría de masas. No fue posible una identificación de péptidos por medio de espectrometría de masas. Esto fue un indicador adicional de que la región de unión de GDF-15 en el inmunocomplejo B1-23 comprende un epítopo discontinuo o conformacional. En el caso de un epítopo lineal continuo, los péptidos digeridos deben unirse a su pareja de interacción, a menos que hubiera un sitio de escisión de tripsina en el péptido del epítopo. Pudo confirmarse un epítopo discontinuo o conformacional mediante el método de escisión de epítopos en la siguiente parte.

Experimento de escisión de epítopos:

Luego se incubó el anticuerpo B1-23 inmovilizado en la columna de afinidad con GDF-15 recombinante durante 2 h. Luego se incubó el inmunocomplejo formado en la columna de afinidad con tripsina durante 2 h a 37 ºC. La escisión dio como resultado diferentes péptidos derivados del GDF-15 recombinante. El anticuerpo inmovilizado es en sí mismo proteolíticamente estable. Los péptidos resultantes de la proteína GDF-15 digerida, que se protegieron mediante el anticuerpo y se protegieron así de la escisión proteolítica, se eluyeron en condiciones ácidas (TFA, pH 2), se recogieron y se identificaron mediante espectrometría de masas.

El método de escisión de epítopos usando identificación mediante EM/EM dio como resultado los siguientes péptidos:

Péptido Posición en la secuencia Masa Ion/carga

EVQVTMCIGACPSQFR (SEQ ID NO: 25) 40-55 1769,91 590,50(3+)

TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 26) 94-114 2310,96 771:33(3+)

La parte del GDF-15 humano, que se une al anticuerpo B1-23, comprende un epítopo discontinuo o conformacional. La espectrometría de masas identificó 2 péptidos en la proteína GDF-15, que son responsables de la formación del inmunocomplejo. Estos péptidos están restringidos a las posiciones 40-55 (EVQVTMCIGACPSQFR) y 94-114 (TDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI) en la secuencia de aminoácidos de GDF-15. Por tanto, estos dos péptidos comprenden un epítopo de la proteína GDF-15 que se une al anticuerpo B1-23.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos no son limitativos de la invención, siempre que la invención sea tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1: En pacientes humanos con melanoma que habían recibido un tratamiento previo con ipilimumab (un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4) y no mostraron una respuesta completa, y que habían recibido un tratamiento con pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1), los niveles en suero de hGDF-15 se correlacionan con una respuesta al tratamiento deficiente en un punto de tiempo de cuatro meses después del comienzo del tratamiento con pembrolizumab.

Los presentes inventores se propusieron investigar si los pacientes con cáncer que recibían bloqueadores de puntos de control inmunitario podrían beneficiarse de una inhibición de hGDF-15. Para someter a prueba esta posibilidad, se analizaron los sueros de pacientes con melanoma, que habían recibido un tratamiento previo con ipilimumab (un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4) y que habían recibido un tratamiento con pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1) en un estudio clínico, para determinar los niveles en suero de hGDF-15. Para investigar si hGDF-15 influye en la respuesta de los pacientes a los bloqueadores de puntos de control inmunitario, luego se correlacionaron los niveles en suero de hGDF-15 obtenidos con las respuestas de los pacientes. Se tomaron sueros de los pacientes antes del tratamiento con pembrolizumab.

El estudio y los análisis posteriores se realizaron de la siguiente manera:

Criterios de inclusión del estudio clínico:

Los pacientes idóneos tenían 18 años o más y tenían un melanoma de estadio III o estadio IV irresecable confirmado histológica o citológicamente no susceptible de terapia local; progresión de la enfermedad confirmada en el plazo de 24 semanas desde la última dosis de ipilimumab (mínimo dos dosis, 3 mg/kg una vez cada 3 semanas); terapia previa con inhibidor de BRAF o MEK o ambos (si es positivo para mutación BRAFV600); resolución o mejora de acontecimientos adversos relacionados con ipilimumab hasta grado 0-1 y dosis de prednisona de 10 mg/día o menos durante al menos 2 semanas antes de la primera dosis del fármaco de estudio; estado funcional según el Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0 ó 1; enfermedad medible por los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (RECIST v1.1); y valores dentro del intervalo preespecificado para recuento absoluto de neutrófilos (≥1500 células por ml), plaquetas (≥100.000 células por ml), hemoglobina (≥90 g/l), creatinina en suero (≤1·5 límite superior de la normalidad [ULN]), bilirrubina total en suero (≤1·5 ULN o bilirrubina directa ≤ULN para pacientes con concentraciones totales de bilirrubina >1·5 ULN), aspartato y alanina aminotransferasas (≤2·5 ULN o ≤5 ULN para pacientes con metástasis de hígado), razón normalizada internacional o tiempo de protrombina (≤1·5 ULN si no se usan anticoagulantes) y tiempo de tromboplastina parcial activada (≤1·5 ULN si no se usan anticoagulantes). Los pacientes tuvieron un periodo de reposo farmacológico de al menos 4 semanas entre la última dosis de la terapia más reciente y la primera dosis de pembrolizumab. Se excluyeron del estudio los pacientes con metástasis cerebrales activas conocidas o meningitis carcinomatosa, enfermedad autoinmunitaria activa, infección activa que requiere terapia sistémica, antecedentes conocidos de infección por VIH, infección activa con el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C, antecedentes de acontecimientos adversos relacionados con ipilimumab de grado 4 o acontecimientos adversos relacionados con ipilimumab de grado 3 que duraron más de 12 semanas, o tratamiento previo con cualquier otra terapia anti-PD-1 o anti-PD-L1.

Tratamiento de los pacientes:

Los pacientes humanos con melanoma que cumplían los criterios de inclusión definidos anteriormente ya se habían tratado (con dos excepciones) con ipilimumab (un anticuerpo monoclonal anti-CTLA4) y no mostraron una respuesta completa. Se les proporcionó pembrolizumab (un anticuerpo monoclonal anti-PD-1) o bien a 2 mg/kg de peso corporal o bien a 10 mg/kg de peso corporal. Como no se observaron diferencias dependientes de la dosis entre los dos grupos de tratamiento, se evaluaron conjuntamente los pacientes tratados.

Criterios para la respuesta:

Se clasificaron los pacientes que responden y pacientes que no responden al tratamiento, así como las respuestas en curso, usando los criterios de evaluación de respuestas en tumores sólidos, versión 1.1 (RECIST v1.1) (Eisenhaueret al.: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (version 1.1). En: Eur. J. Cancer.45, n.º 2, enero de 2009, págs.228-47).

Análisis de los niveles en suero de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):

Se midieron los niveles en suero de GDF-15 humano mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).

Tampones y reactivos:

Disolución de bloqueo tamponada: BSA al 1 % (fracción V pH 7,0, PAA) en PBS

Disolución de lavado: PBS-Tween (0,05 %)

Patrón: GDF-15 humano (concentración de disolución madre: 120 μg/ml, de R&D Systems)

Anticuerpo de captura: AcM contra GDF-15 humano (clon 147627) de R&D Systems, IgG2B de ratón (n.º de catálogo MAB957, de R&D Systems, concentración de disolución madre: 360 μg/ml)

Anticuerpo de detección: AcP purificado por afinidad biotinilado contra GDF-15 humano, IgG de cabra (n.º de catálogo BAF940, de R&D Systems, concentración de disolución madre: 9 μl/ml)

Estreptavidina-HRP (n.º de catálogo DY998, de R&D Systems)

Disolución de sustrato: 10 ml de NaOAc 0,1 M pH 6,0 100 μl de TMB 2 μl de H2O2

Disolución de parada: H2SO41 M

Procedimiento de análisis:

1. Preparación de placas:

a. Se diluyó el anticuerpo de captura a la concentración de trabajo de 2 μg/ml en PBS. Se recubrió inmediatamente una microplaca de 96 pocillos (Nunc maxisorp<®>) con 50 μl por pocillo del anticuerpo de captura diluido excluyendo las filas exteriores (A y H). Se llenaron las filas A y H con tampón para impedir la evaporación de las muestras durante el experimento. Se golpeó suavemente la placa para asegurarse de que el fondo de cada pocillo se cubría completamente. Se colocó la placa en una cámara húmeda y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (TA).

b. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

c. Se añadieron 150 μl de disolución de bloqueo a cada pocillo, seguido de incubación a TA durante 1 hora. d. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

2. Procedimiento de ensayo:

a. Se prepararon patrones. Se diluyó GDF-15 en disolución de bloqueo tamponada hasta una concentración final de 1 ng/ml (4,17 μl de GDF 496 μl de disolución de bloqueo tamponada). Se realizaron diluciones en serie 1:2. b. Se prepararon muestras duplicadas 1:20 (6 μl 114 μl de disolución de bloqueo tamponada).

c. Se añadieron 50 μl de muestras o patrones diluidos por pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

a. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

b. Se diluyó el anticuerpo de detección hasta una concentración final de 50 ng/ml (56 μl 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 μl del anticuerpo de detección diluido a cada pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

c. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

d. Se diluyó estreptavidina-HRP 1:200 (50 μl 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 μl de la dilución de trabajo de estreptavidina-HRP a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA.

e. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

f. Se preparó la disolución de sustrato. Se añadieron 50 μl de disolución de sustrato a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA.

g. Se añadieron 50 μl de disolución de parada a cada pocillo.

h. Se determinó inmediatamente la densidad óptica de cada pocillo, usando un lector de microplacas ajustado a 450 nm.

3. Cálculo del título en suero de GDF-15:

a. Se aplicó cada muestra/disolución patrón de GDF-15 por duplicado. Para determinar el título de GDF-15, se calculó el promedio de los duplicados y se restó el fondo (muestra sin GDF-15).

b. Para crear una curva de calibración, se representaron gráficamente los valores del intervalo lineal en un diagrama X-Y (eje X: concentración de GDF-15, eje Y: DO450), y se aplicó un ajuste de curva lineal. Se calculó el título en suero de GDF-15 de las muestras de prueba interpolando a partir de los valores de DO450 de las diluciones patrón con concentración conocida.

c. Para calcular la concentración final de GDF-15 de las muestras, se consideró el factor de dilución distinto. Las muestras que proporcionaron valores de DO por encima o por debajo del intervalo patrón volvieron a analizarse a diluciones apropiadas.

Comparación de los niveles en suero de hGDF-15 con los datos de pacientes:

A continuación, se compararon los niveles en suero de hGDF-15 medidos con datos de respuestas de pacientes obtenidos a partir del estudio.

La figura 1 muestra los niveles en suero de GDF-15 para pacientes que responden y pacientes que no responden al régimen de tratamiento. Todas las muestras de suero se han obtenido antes del tratamiento con el anticuerpo anti-PD-1. Tal como se observa a partir de la figura, la mayoría de los pacientes que no responden al tratamiento tenían niveles en suero de GDF-15 mayores que todos los pacientes que responden al tratamiento.

Este resultado también se refleja en la figura 2, que muestra los números de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento en los pacientes que tienen niveles en suero de hGDF-15 de <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml y >4,2 ng/ml, respectivamente.

Estos hallazgos sugirieron que los altos niveles de GDF-15 están relacionados con una mala respuesta al tratamiento. Por tanto, estos hallazgos se sometieron a prueba para determinar su significación estadística:

Correlación estadística de los niveles en suero de hGDF-15 con los datos de pacientes:

Datos:

El análisis de los datos se basó en un archivo de datos que contenía datos de muestras de 35 pacientes que contienen las columnas (variables) designación de muestra, GDF-15 (ng/ml), paciente que responde al tratamiento/paciente que no responde al tratamiento, días (hasta la muerte o censura estadística) y en curso (un índice variable para vida en curso). La clasificación de paciente que responde al tratamiento/paciente que no responde al tratamiento de estos datos se realizó en un punto de tiempo de cuatro meses después del comienzo del tratamiento con pembrolizumab. Como algunas muestras de suero se habían obtenido únicamente poco antes del análisis, la respuesta pudo evaluarse sólo en 29 pacientes. Un paciente que responde parcialmente al tratamiento (> 30 % de reducción en el tamaño del tumor) se clasificó como paciente que responde al tratamiento. Para la determinación de LDH, se habían excluido 4 muestras debido a la hemólisis.

Criterios de valoración (criterios de evaluación):

a. Supervivencia general (tiempo hasta la muerte). Este criterio de evaluación se compone del indicador de acontecimiento para la muerte (1 = muerto/0 = vivo), que se derivó del archivo de datos, y el tiempo hasta la muerte o censura estadística (última vez que se supo que el paciente estaba vivo) correspondiente a la variable “días”. b. Respuesta al tratamiento, por ejemplo, si un paciente era un paciente que responde al tratamiento o no (codificado como 1 = paciente que responde al tratamiento, 0 = paciente que no responde al tratamiento). Los pacientes que responden parcialmente al tratamiento se consideraron pacientes que responden al tratamiento.

Análisis de datos:

Se analizó la supervivencia general mediante modelos de supervivencia de riesgos proporcionales de Cox. Se ajustó un modelo con GDF-15 (ng/ml) como factor predisponente continuo y otro modelo con una variable de agrupamiento basada en GDF-15 como factor predisponente categórico (los grupos fueron: <1,8 ng/ml, 1,8-4,2 ng/ml, >4,2 ng/ml de GDF-15). En conjunto, los datos de supervivencia estaban disponibles de 35 pacientes.

Se analizó la respuesta al tratamiento (variable binaria) mediante modelos lineales generalizados (GLM) con una distribución del error binomial y función de enlace logit (regresión logística). Para la respuesta al tratamiento tal como se evalúa mediante los criterios RECIST1.1 después de 4 meses se ajustó un modelo con GDF-15 (ng/ml) como factor predisponente continuo. Debido a que ningún paciente respondió al tratamiento en el grupo con GDF-15 >4,2 ng/ml, el cociente de probabilidades estimado para este grupo frente al grupo con GDF-15 <1,8 ng/ml sería muy grande, con un intervalo de confianza muy amplio. En lugar de ajustar otro modelo con la variable de agrupamiento basada en GDF-15 como factor predisponente categórico, se usó una prueba de ji cuadrado (χ<2>) para comparar los grupos (sometiendo a prueba la proporción de pacientes que responden al tratamiento). Debido a que el número de pacientes que responden al tratamiento/pacientes que no responden al tratamiento era algunas veces demasiado pequeño (< 5), se realizó adicionalmente un análisis de sensibilidad usando la prueba exacta de Fisher. Los pacientes que habían recibido únicamente anticuerpo anti-PD-1 en el plazo de los últimos 4 meses todavía no se han podido clasificar como pacientes que responden al tratamiento o pacientes que no responden al tratamiento. Por tanto, sólo pudieron evaluarse 29 pacientes para determinar la respuesta a la terapia.

Se realizó el análisis de datos usando el paquete de software estadístico R (R Core Team, 2014, versión 3.1.0). Resultados:

Las tablas 1-2 muestran los resultados de los modelos con GDF-15 como factor predisponente continuo. El riesgo de muerte aumentó significativamente para concentraciones de GDF-15 mayores (HR > 1, tabla 1) mientras que la probabilidad de respuesta al tratamiento disminuyó significativamente, tal como se indica mediante el cociente de probabilidades (OR) (OR < 1, tabla 2). La figura 3 muestra los datos correspondientes en pacientes que responden al tratamiento/pacientes que no responden al tratamiento, así como la probabilidad de respuesta al tratamiento predicha por el modelo.

La tabla 3 muestra el resultado del modelo de riesgos proporcionales de Cox con el grupo basado en GDF-15 como factor predisponente categórico. El grupo con GDF-15 <1,8 ng/ml se usa como grupo de referencia (no mostrado en la tabla). Los dos cocientes de riesgos en la tabla 3 representan la comparación del grupo con GDF-15 entre 1,8 y 4,2 y el grupo con GDF-15 >4,2 con el grupo de referencia. El riesgo de muerte aumenta en ambos de estos grupos (en comparación con el grupo de referencia), pero en mayor medida en el grupo con GDF-15 >4,2. La figura 4A muestra las curvas de Kaplan-Meier para la supervivencia en los tres grupos.

La proporción de pacientes que responden al tratamiento difirió significativamente entre los grupos (paciente que responde al tratamiento 1: χ<2>df=2= 16,04, P = 0,0003). Este resultado se confirmó por los resultados de la prueba exacta de Fisher (P=0,0003). Los números de muertes y pacientes que responden al tratamiento por grupo se proporcionan en la tabla 4. Además, la tabla 5 muestra algunas estadísticas descriptivas del GDF-15 para cada grupo.

Tabla 1:

[ ]

La tabla 1 muestra el cociente de riesgos instantáneos (HR) estimado a partir del modelo de riesgos proporcionales de Cox con supervivencia general (tiempo hasta la muerte) como criterio de valoración y GDF-15 como factor predisponente continuo. El análisis incluyó muestras de 35 pacientes.

Tabla 2:

La tabla 2 muestra el cociente de probabilidades (OR) estimado a partir del modelo lineal generalizado con respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1) como criterio de valoración y GDF-15 como factor predisponente continuo. El análisis incluyó muestras de 29 pacientes.

Tabla 3:

La tabla 3 muestra el cociente de riesgos instantáneos (HR) estimado a partir del modelo de riesgos proporcionales de Cox con supervivencia general (tiempo hasta la muerte) como criterio de valoración y el grupo basado en GDF-15 como factor predisponente categórico. El análisis incluyó muestras de 35 pacientes.

Tabla 4:

% % % %

La tabla 4 muestra el número de muertes y pacientes que responden al tratamiento (“paciente que responde al tratamiento 1”) en los tres grupos definidos por el GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 ng/ml).

Tabla 5:

Tabla 5: La variable de factor predisponente continuo GDF-15 (ng/ml) en los tres grupos definidos por el GDF-15 (<1,8, 1,8-4,2, >4,2 ng/ml). Se muestran el número de pacientes (n), la mediana (x̃), la media (x̅), la desviación estándar (s), el mínimo (Mín.) y el máximo (Máx.).

Se considera que la lactato deshidrogenasa es un marcador relevante para el pronóstico de tumores sólidos. Esto se ha confirmado recientemente mediante un metanálisis completo basado en un gran conjunto de estudios clínicos (31.857 pacientes). Se halló un efecto coherente de LDH elevada sobre OS (HR = 1,48, IC del 95% = de 1,43 a 1,53) en todos los subgrupos y estadios de enfermedad. Además, había una tendencia hacia un valor de pronóstico más fuerte de LDH en enfermedad metastásica en comparación con enfermedad no metastásica, que se pensó que reflejaba una mayor carga tumoral. Aunque el mecanismo exacto sigue siendo desconocido y también puede estar relacionado con hipoxia y reprogramación metabólica a través de un efecto Warburg, puede interpretarse que la LDH refleja una alta carga tumoral o agresividad tumoral (Zhang, J., Yao, Y.-H., Li, B.-G., Yang, Q., Zhang, P.-Y., y Wang, H.-T. (2015). Prognostic value of pretreatment serum lactate dehydrogenase level in patients with solid tumors: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports 5, 9800). Dado que los niveles en suero de LDH se han incorporado en el esquema de estadificación para el melanoma, este parámetro se mide de manera rutinaria durante el diagnóstico clínico por parte del laboratorio de referencia de la universidad.

Tabla 6:

Tabla 6: GDF-15 y LDH en pacientes que responden al tratamiento frente a pacientes que no responden al tratamiento

No se logró la determinación de LDH en 4 muestras de sangre debido a la hemólisis.

La tabla 7 es análoga a la tabla 2, excepto porque se usó LDH como factor predisponente continuo de respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1) en lugar de GDF-15. La probabilidad de respuesta al tratamiento disminuyó de manera marginalmente significativa al aumentar los valores de LDH (OR < 1, p < 0,1). La figura 5 muestra los datos correspondientes en pacientes que responden al tratamiento/pacientes que no responden al tratamiento, así como la probabilidad de respuesta al tratamiento predicha por el modelo.

Para determinar si GDF-15 es mejor factor predisponente de respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1) que LDH, se ajustaron dos modelos adicionales: un modelo que contiene ambos marcadores como factores predisponentes (que automáticamente sólo incluye pacientes con mediciones en ambos marcadores) y un modelo con GDF-15 como único factor predisponente pero también usando sólo los pacientes con una medición de LDH. Luego, se calculó el criterio de información de Akaike (AIC) para los tres modelos (tabla 8). Un AIC más bajo indica un modelo más eficiente. De hecho, el AIC del modelo con GDF-15 fue más pequeño que el AIC del modelo con LDH como factor predisponente. El modelo con GDF-15 solo tiene incluso un AIC más pequeño que el modelo con ambos factores predisponentes, lo que indica que LDH como factor predisponente adicional no mejora el modelo. Por supuesto, el modelo con ambos factores predisponentes no puede explicar que empeore la respuesta al tratamiento, pero como medida de la “eficiencia de modelo”, el AIC penaliza a los modelos con factores predisponentes que no mejoran el modelo considerablemente y favorece modelos más sencillos. Se realizó una comparación de modelos alternativos mediante el análisis de la desviación (similar al análisis de la varianza pero para modelos lineales generalizados), es decir, comparando la diferencia en la desviación explicada entre el modelo más complejo con ambos factores predisponentes y ambos de los modelos más sencillos con sólo uno de los factores predisponentes (correspondientes a una reducción del modelo por cualquiera de LDH o GDF-15). La retirada de GDF-15 a partir del modelo más complejo dio como resultado una reducción significativa en la desviación explicada (P=0,02) mientras que la retirada de LDH no (P=0,41).

Tabla 7:

Tabla 7: Cociente de probabilidades (OR) estimado a partir del modelo lineal generalizado con respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1, tal como se define en el archivo A) como criterio de valoración y LDH como factor predisponente continuo. El análisis incluyó muestras de 25 pacientes.

Tabla 8:

Tabla 8: Comparación de modelos basada en el criterio de información de Akaike (AIC) en el que valores más pequeños indican un modelo más eficiente. df: grados de libertad. Todos los modelos incluyeron muestras de 25 pacientes.

La figura 5A muestra la probabilidad de respuesta al tratamiento (paciente que responde al tratamiento 1) tal como se predice mediante el modelo lineal generalizado usando LDH como factor predisponente continuo. Los círculos muestran los datos, la curva muestra el modelo. La línea vertical indica la concentración de LDH a la que la probabilidad de respuesta al tratamiento es de 0,5. La cohorte de pacientes fue idéntica. Sin embargo, no se logró una determinación fiable de los niveles de LDH en cuatro pacientes debido a la hemólisis. La figura 5B muestra una representación gráfica de pacientes que responden al tratamiento y pacientes que no responden al tratamiento y sus respectivos niveles de hGDF-15 y LDH. Cuando se seleccionan valores de corte para cubrir a todos los pacientes que responden al tratamiento, las pruebas basadas en GDF-15 permiten la identificación de 6 (de 9) pacientes que no responden al tratamiento mientras que los análisis basados en los niveles de LDH sólo pueden discriminar 4 (de 9) pacientes que no responden al tratamiento. Para las pruebas de LDH, tuvieron que excluirse 4 muestras hemolíticas, lo que provoca una pérdida de datos.

Por tanto, una predicción de una evolución clínica basada en los niveles de hGDF-15 según la invención incluye las siguientes ventajas sobre el marcador convencional de diagnóstico LDH para tumores sólidos:

� Existe una correlación estadística inversa más fuerte entre los niveles de hGDF-15 y una evolución clínica positiva que entre los niveles de LDH y una evolución clínica positiva y, por tanto, los niveles de hGDF-15 son superiores para determinar una predicción en comparación con los niveles de LDH. Además, tal como se refleja mediante el criterio de información de Akaike indicado anteriormente, los niveles de hGDF-15 solos son incluso un factor predisponente mejor que los niveles de hGDF-15 en combinación con los niveles de LDH.

� La medición de hGDF-15 es menos sensible a la hemólisis que la medición de LDH y, por tanto, es ventajosa en la práctica clínica.

� Los niveles de hGDF-15 permiten discriminar un mayor número de pacientes que no responden al tratamiento que los niveles de LDH.

Estas ventajas son particularmente dignas de mención puesto que la LDH se considera actualmente como el mejor marcador clínico disponible para tumores sólidos.

Resumen:

En conjunto, los resultados estadísticos anteriores del ejemplo 1 mostraron que la probabilidad de una respuesta al tratamiento disminuye significativamente con niveles crecientes de hGDF-15 en los sueros de pacientes. Por ejemplo, el cociente de probabilidades de 0,389 mostrado en la tabla 2 indica que si los niveles en suero de hGDF-15 se aumentan en 1 ng/ml, la probabilidad de una respuesta al tratamiento disminuye hasta el valor de 0,389 veces el valor original, es decir, disminuye en aproximadamente el 60 %. Si los niveles en suero de hGDF-15 se aumentan en 2 ng/ml, la probabilidad de una respuesta al tratamiento disminuye al valor de 0,389x0,389 veces = 0,151 veces el valor original, es decir, disminuye en aproximadamente el 85 %.

De manera similar, el cociente de riesgos instantáneos de 1,27 mostrado en la tabla 1 indica que si los niveles en suero de hGDF-15 se aumentan en 1 ng/ml, la probabilidad de muerte de los pacientes aumenta en un factor de 1,27.

Los resultados del ejemplo 1 indican que existe una fuerte correlación inversa entre los niveles en suero de hGDF-15 y la probabilidad de una evolución clínica positiva de inmunoterapia basada en anti-PD-1 en los pacientes, incluyendo la respuesta del paciente y la supervivencia del paciente. Por tanto, según la invención, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre de pacientes pueden usarse ventajosamente para predecir la probabilidad de una respuesta de los pacientes a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Mientras que el presente ejemplo muestra los resultados para el melanoma como ejemplo de un tumor sólido, la expresión de hGDF-15 no se limita al melanoma, sino que también está presente en numerosos otros cánceres sólidos. Asimismo, se sabe que tumores sólidos distintos del melanoma también pueden tratarse con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, según la invención, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre de pacientes pueden usarse ventajosamente para predecir la probabilidad de una respuesta de los pacientes a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario no sólo en melanoma, sino en todos los cánceres sólidos a los que se hace referencia en el presente documento.

Ejemplo 2: Los niveles de GDF-15 se correlacionan de manera inversa con linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) CD8<+>en metástasis de diferentes entidades tumorales.

Para identificar el mecanismo de hGDF-15 que contribuye al efecto negativo de hGDF-15 sobre las respuestas de los pacientes, se analizaron metástasis cerebrales a partir de diferentes tumores sólidos para determinar la expresión de hGDF-15 y la presencia de células del sistema inmunitario:

Muestra de tejido y procesamiento de tejidos:

Se analizó tejido fijado en formalina e incrustado en parafina (FFPE) a partir de metástasis cerebrales archivadas, que se recogió y procesó como micromatrices de tejido (TMA). Todas las muestras se obtuvieron o bien a partir del banco de tumores de UCT (Universidad de Goethe, Fráncfort del Meno, Alemania, miembro del Consorcio Alemán del Cáncer (DKTK), Heidelburgo, Alemania y del Centro Alemán de Investigación del Cáncer (DKFZ), Heidelburgo, Alemania) o bien a partir del banco de tumores del registro de cáncer “Banco de sangre y tejidos para la investigación de melanomas malignos” (Departamento de Dermato-Oncología, Hospital Universitario de Tubinga, Alemania). La aprobación para este estudio fue concedida por dos comités de ética independientes (comité de ética de UCT de Fráncfort / Universidad de Goethe, Fráncfort del Meno, Alemania: números de proyecto: GS 4/09; SNO_01-12; comité de ética de la Universidad de Tubinga, número de proyecto: 408/2013BO2). En total, se investigaron 190 pacientes con metástasis cerebrales incluyendo: melanoma (n=98), NSCLC (n=33), carcinoma de mama (n=18), RCC (n=10), SCLC (n=7), carcinoma colorrectal (n=7), carcinomas que no se especificaron de otro modo (carcinoma NOS n=11) y muestras de tumores raros resumidas como otros (n=6). Se recogieron datos de supervivencia de 155 pacientes (tiempo de supervivencia después de la resección tumoral), adicionalmente se analizaron el número de metástasis cerebrales en 169 pacientes y el tamaño de metástasis cerebrales en una subcohorte de 55 pacientes con melanoma.

Inmunohistoquímica:

Se realizó inmunohistoquímica para todos los anticuerpos usando portaobjetos de 3 μm de grosor y protocolos convencionales en el sistema de tinción por IHC automatizado Discovery XT (Roche/Ventana, Tucson, Arizona, EE.UU.). Se usaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo anti-GDF-15 (HPA011191, dilución 1:50, Sigma/Atlas, n.º de protocolo 730), CD3 (clon A0452, dilución 1:500, DAKO, Glostrup, Dinamarca), CD8 (clon C8/144B, dilución 1:100, DAKO, Glostrup, Dinamarca), PD-1 (clon NAT105; dilución 1:50; Abcam, Cambridge, Reino Unido), PD-L1 (E1L3N; dilución 1:200; Cell Signaling, Boston, EE.UU.), FOXP3 (clon 236A/E7; dilución 1:100; eBioscience, San Diego, EE.UU.). Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina y se montaron.

Análisis estadísticos:

Todas las muestras se puntuaron según la frecuencia de células positivas con respecto a todas las células (como porcentaje) en el núcleo de TMA teñido. Para la expresión de hGDF-15, se usó una puntuación tal como se describió previamente en detalle [21,22]: frecuencia del 0-1 %: puntuación 0; del 1-10 %: puntuación 1; del 10-25 %: puntuación 2; del 25-50 %: puntuación 3; >50 %: puntuación 4; adicionalmente se multiplicó la puntuación de frecuencia por la intensidad de tinción (1: tinción débil, 2: tinción moderada, 3: tinción fuerte), dando como resultado finalmente la puntuación de hGDF-15 escalada ordinal (0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 12). Se compararon las variables escaladas ordinales con la prueba no paramétrica de Wilcoxon/Kruskal-Wallis y el método de Dunn para corregir pruebas múltiples. Para las variables continuas, se compararon las medias entre diferentes entidades de metástasis cerebrales usando ANOVA, seguido de la pruebaa posterioriHSD de Tukey-Kramer. Para los análisis de correlación del tamaño de metástasis cerebrales y la expresión de marcadores, se realizó un ajuste lineal seguido de ANOVA; en caso de variables escaladas ordinales, se usó el análisis de correlación de rho de Spearman. Se estableció un nivel de significación de p<0,05 para todos los análisis estadísticos.

Todos los análisis estadísticos se realizaron usando JMP8 y JMP11 (SAS, Cary, EE. UU.), se crearon gráficos adicionales con Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, EE. UU.).

Resultados:

La figura 6 muestra cortes de tejido a modo de ejemplo de metástasis cerebrales de melanoma que no tienen alta (panel superior) o que tienen alta (panel inferior) inmunorreactividad con GDF-15, que se tiñeron mediante inmunohistoquímica para GDF-15 y para las proteínas marcadoras de células T CD3 y CD8, respectivamente, tal como se indica en la figura. En el corte sin expresión de GDF-15, las numerosas células inmunitarias infiltrantes se observan como manchas oscuras. En la imagen que muestra las metástasis que expresan altos niveles de GDF-15, las escasas células inmunitarias infiltrantes están representadas por flechas (las células positivas para CD3 y CD8 están indicadas por flechas). Tal como puede observarse a partir de la figura, se halló sorprendentemente que, en el corte de tejido con alta inmunorreactividad hacia hGDF-15 (panel inferior), el número de células CD3<+>y CD8<+>se redujo fuertemente en comparación con el corte de tejido sin inmunorreactividad hacia hGDF-15 (panel superior). Cabe destacar que todos los demás marcadores teñidos como PD-L1, PD-1 mostraron una correlación positiva con el número de células T CD3<+>y CD8<+>infiltrantes tumorales.

Por tanto, a continuación se analizó si existe una correlación inversa entre los niveles de hGDF-15 y el porcentaje de células T CD3<+>en diferentes metástasis cerebrales de melanoma. La figura 7A muestra un gráfico del porcentaje de células CD3<+>frente a la puntuación de GDF-15 (obtenida tal como se describió anteriormente en la sección “análisis estadísticos”). Tal como se indica en la figura 7A, hubo una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD3<+>y la puntuación de GDF-15 (p=0,0015).

De manera similar, también se analizó si existe una correlación inversa entre los niveles de hGDF-15 y el porcentaje de células T CD8<+>en diferentes metástasis cerebrales de melanoma. La figura 7B muestra un gráfico del porcentaje de células CD8<+>frente a la puntuación de GDF-15 (obtenida tal como se describió anteriormente en la sección “análisis estadísticos”). Tal como se indica en la figura 7B, hubo una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD8<+>y la puntuación de GDF-15 (p=0,0038).

La correlación de GDF-15 con FOXP3, en cambio, no proporcionó ningún resultado estadísticamente significativo según la prueba del coeficiente de correlación de rangos de Spearman (rho) (p=0,8495 en diferentes entidades tumorales; p=0,2455 cuando se evalúan sólo metástasis de melanoma).

Finalmente, también se analizó si existe una correlación inversa entre los niveles de hGDF-15 y los porcentajes de células T CD8<+>y CD3<+>en metástasis cerebrales de diferentes entidades tumorales. La figura 8 muestra un gráfico de la puntuación de GDF-15 frente al porcentaje de células T CD8<+>y CD3<+>, respectivamente, en 168 (para CD3) o, respectivamente, 169 (para CD8) metástasis cerebrales de diferentes entidades tumorales (melanoma, CRC, RCC, cáncer de mama, NSCLC y SCLC). El gráfico se obtuvo tal como se describió anteriormente en la sección “análisis estadísticos”. Tal como se indica en la figura 8, hubo una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD8<+>y la puntuación de GDF-15 (p=0,0311) así como una correlación inversa estadísticamente significativa entre el porcentaje de células CD3<+>y la puntuación de GDF-15 (p=0,0093). De nuevo, otros marcadores (PD-L1, PD-1, FOXP3) mostraron correlaciones positivas con la infiltración de células T CD3 y CD8.

Resumen:

Los resultados anteriores muestran que no sólo hay una correlación inversa de hGDF-15 con el porcentaje de células T que expresan la proteína marcadora de células T general CD3 en las metástasis, sino también una correlación inversa con el porcentaje de linfocitos T CD8<+>en las metástasis. Esto es notable porque previamente se demostró que la presencia de linfocitos T CD8<+>se requería específicamente para la regresión tumoral después de la inhibición del punto de control inmunitario con un anticuerpo anti-PD-1 (Tumehet al., Nature. 27 de noviembre de 2014; 515(7528):568-71).

Por tanto, según la invención, una explicación preferida, pero no limitativa, para la correlación inversa de los niveles de hGDF-15 y una evolución clínica favorable (por ejemplo, supervivencia de los pacientes o la presencia de una respuesta al tratamiento) es que hGDF-15 disminuye el porcentaje de linfocitos T CD8<+>en tumores sólidos incluyendo metástasis tumorales, disminuyendo de ese modo la probabilidad de una evolución clínica favorable (por ejemplo, supervivencia de los pacientes o la presencia de una respuesta al tratamiento). Puesto que esta correlación se observa en diversas entidades de cánceres sólidos, la presente invención no se limita a cánceres sólidos particulares tales como melanoma.

Por tanto, la invención puede aplicarse a todos los tumores sólidos a los que se hace referencia en las realizaciones preferidas.

Ejemplo 3: GDF-15 disminuye la adhesión de célulcas T a células endoteliales.

A continuación, los inventores se propusieron determinar cómo afecta hGDF-15 al porcentaje de células T en los tumores sólidos.

Una etapa que se requiere para la invasión de células T desde el torrente circulatorio hacia el tejido tumoral es que las células T deben adherirse en primer lugar al endotelio antes de que puedan entrar en el tumor. Para simular esta etapa y evaluar si esta etapa puede verse afectada por hGDF-15, los inventores usaron un sistema de modelo que mide la adhesión de células T a células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC):

Experimento de flujo/adhesión de células T (en HUVEC):

Día 1:

a. Se recubrieron μ-portaobjetos VI 0,4 (ibidi GmbH, Alemania) con fibronectina (100 μg/ml): 30 μl por puerto de carga. Se incubaron durante 1 h a 37 ºC (o se usó un portaobjetos recubierto previamente).

b. Se aspiró la fibronectina, seguido de un lavado con medio de HUVEC.

c. Se sometieron a tripsinización las HUVEC de una placa de 6 pocillos (recuento: 2×10<5>/ml (2 ml en total)).

d. Se lavaron y se diluyeron hasta 1×10<6>células/ml.

e. Se aplicaron 30 μl de HUVEC en los puertos de carga del μ-portaobjetos VI y se comprobaron bajo un microscopio.

f. Se cubrió el μ-portaobjetos VI con una tapa y se incubó a 37 ºC, el 5 % de CO2.

Día 2:

a. Se activaron las HUVEC con TNF� (10 ng/ml) e IFN� (10 ng/ml) en los canales 2-5 (véase la tabla a continuación): se aspiraron todos los medios de los canales y se reemplazaron por medios precalentados que contienen citocinas. Día 3:

a. Se aislaron las células T (aislamiento negativo de células pan T).

b. Se incubaron previamente las células T en el pocillo 1 (1×10<6>células/ml) con o sin GDF-15 (100 ng/ml) durante 1 h.

c. Se incubaron previamente las HUVEC en los canales 4 y 5 con GDF-15 (100 ng/ml) durante 1 h: se aspiró todo el medio en los puertos de carga, y se llenaron ambos puertos de carga con medio precalentado que contiene GDF-15. d. Se precalentó una incubadora superior de platina junto al microscopio, y se conectó una mezcla de gases (el 5 % de CO2, el 16 % de O2, el 79 % de N2).

e. Se prepararon 3 jeringas de 50 ml:

i. Células T (1×10<6>células/ml): 1 ml

ii. Células T-GDF-15 (1×10<6>células/ml): 1 ml

iii. Medio

f. Se conectó la jeringa 1 al canal 1 (véase la tabla a continuación) y se inició el flujo (0,5 dinas/cm<2>: 0,38 ml/min = 22,8 ml/h).

g. Se hicieron fluir las células T durante 3 min y, mientras tanto, se predefinieron 10 campos de visión en el microscopio.

h. Se obtuvieron imágenes por vídeo de cada campo de visión durante 5 s.

i. Se evaluaron los canales restantes de manera análoga al canal 1 (f-h) con las muestras de células T tal como se indican en la tabla a continuación

Se obtuvo GDF-15 recombinante de Invigate GmbH, Jena, Alemania.

Análisis estadístico:

Todos los datos se compararon usando la prueba de Mann-Whitney para someter a prueba datos no distribuidos normalmente. Se consideró que los valores de p<0,05 eran estadísticamente significativos.

Resultados:

Los resultados del experimento se muestran en la figura 9. Esta figura muestra análisis de varios parámetros de adhesión, concretamente

a. el número de células T rodantes por campo de visión por segundo (9A; los datos se obtuvieron a partir del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”)), que refleja una forma de adhesión moderada de las células T a las células endoteliales,

b. la velocidad de rodamiento de las células T (medida en píxeles por 0,2 segundos) (9B; los datos se obtuvieron a partir del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”)), que aumenta al disminuir la adhesión entre las células T y las células endoteliales, y

c. el número de células adherentes por campo de visión (9C; los datos se obtuvieron a partir del canal n.º 3 (“GDF-15”) y del canal n.º 2 (“control”); y 9D).

Tal como puede observarse a partir de la figura 9C, se halló que el tratamiento de las células T con hGDF-15 disminuye significativamente la adhesión a las células endoteliales, tal como se refleja en el número de células adherentes por campo de visión. Se obtuvieron resultados similares cuando se analizó la adhesión contando los números de células T rodantes (figura 9A). Además, y coherente con los resultados anteriores, se halló que el tratamiento de las células T con hGDF-15 aumenta significativamente la velocidad de rodamiento, lo que indica una disminución en el tiempo de interacción entre las células T y las células endoteliales, y también indica una adhesión reducida entre las células T y las células endoteliales (figura 9B).

A continuación, los inventores analizaron qué células seleccionaron como diana hGDF-15 (figura 9D). En la muestra en la que sólo las HUVEC se trataron con hGDF-15, se observó una diminución moderada en la adhesión de las células T a las células endoteliales (HUVEC). En cambio, se observó una fuerte diminución en la adhesión de las células T a las células endoteliales (HUVEC) cuando o bien sólo las células T se trataron con hGDF-15 o bien cuando tanto las células T como las células endoteliales (HUVEC) se trataron con hGDF-15. Estos resultados indican que hGDF-15 actúa tanto sobre las células T como sobre las células endoteliales, pero también indican que el principal efecto de adhesión de hGDF-15 es un efecto sobre las células T.

A continuación, los inventores sometieron a prueba si los efectos de hGDF-15, que se secreta por células tumorales, sobre la adhesión de células T podía inhibirse con un inhibidor de hGDF-15. Para someter a prueba esto, los inventores usaron una línea celular de melanoma que secreta hGDF-15, UACC257.

Experimento de flujo/adhesión de células T (en HUVEC) en presencia o ausencia de GDF-15 en sobrenadante de células tumorales:

Día 1:

a. Se recubrió un μ-portaobjetos VI 0,4 (ibidi GmbH, Alemania; de ahora en adelante denominado μ-portaobjetos) con fibronectina (100 mg/ml): 30 μl por puerto de carga. Se incubaron durante 1 h a 37 ºC (o se usó un portaobjetos recubierto previamente).

b. Se aspiró la fibronectina, seguido de un lavado con medio de HUVEC.

c. Se sometieron a tripsinización las HUVEC de una placa de 6 pocillos (recuento: 2×10<5>/ml (2 ml en total)).

d. Se lavaron y se diluyeron hasta 1×10<6>células/ml.

e. Se aplicaron 30 μl de HUVEC en los puertos de carga del μ-portaobjetos y se comprobaron bajo un microscopio.

f. Se cubrió el μ-portaobjetos con una tapa y se incubó a 37 ºC, el 5 % de CO2.

Día 2:

a. Se activaron las HUVEC con TNFα (10 ng/ml) e IFNγ (10 ng/ml) en los canales 2-5 del μ-portaobjetos (véase la tabla a continuación): se aspiraron todos los medios de los canales y se reemplazaron por medios precalentados que contienen citocinas.

Día 3:

a. Se aislaron las células T (aislamiento negativo de células pan T).

b. En paralelo, se recubrieron 24 pocillos de una placa de ELISA de 96 pocillos (Nunc maxisorb) con 200 μl de anticuerpo anti-GDF-15 (10 μg/ml diluido en PBS), se incubaron durante 45 min y luego se lavaron con PBS. c. Para agotar el sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 que secreta GDF-15 (datos no mostrados) de GDF-15, se incubó el sobrenadante en pocillos de la placa de ELISA (véase b) que se recubrieron previamente con anticuerpo anti-GDF-15.

d. Como control, se incubó el sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 en pocillos de la placa de ELISA (véase b) que no se recubrieron previamente con anticuerpo anti-GDF-15.

e. Se incubaron previamente las células T en una placa de cultivo celular de 12 pocillos (1×10<6>células/ml) con GDF-15 (100 ng/ml), sin GDF-15, en sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 agotada de GDF-15 (véase c) o en sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 que contiene GDF-15 (véase d) durante 1 h. f. Se precalentó una incubadora superior de platina junto al microscopio, y se conectó una mezcla de gases (el 5 % de CO2, el 16 % de O2, el 79 % de N2).

g. Se prepararon 4 tubos de 2 ml de un sistema de flujo microfluídico:

i. Células T (1×10<6>células/ml): 1 ml

ii. Células T-GDF-15 (1×10<6>células/ml): 1 ml

iii. Células T-UACC257 (que contienen GDF-15)

iv. Células T-UACC257 agotadas de GDF-15

h. Se conectó el tubo 1 al canal 1 (véase la tabla a continuación) y se inició el flujo (0,4 ml/min = 24 ml/h).

i. Se hicieron fluir las células T durante 3 min y, mientras tanto, se predefinieron 5 campos de visión en el microscopio.

j. Se obtuvieron imágenes por vídeo de cada campo de visión durante 5 s.

k. Se evaluaron los canales restantes de manera análoga al canal 1 (f-h) con las muestras de células T tal como se indican en la tabla a continuación.

El GDF-15 recombinante se obtuvo de Invigate GmbH, Jena, Alemania.

Resultados:

Los resultados del experimento se muestran en la figura 10. Esta figura muestra análisis del número de células T rodantes por campo de visión por segundo. Los datos se obtuvieron a partir del canal n.º 1 (células T de control en HUVEC no estimuladas como “control neg.”), del canal n.º 2 (células T de control en HUVEC estimuladas como “control pos.”), del canal n.º 3 (“GDF-15”), del canal n.º 4 (“UACC257”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 que contienen GDF-15 secretado) y del canal n.º 5 (“UACC257 anticuerpo antihGDF-15”: células T cultivadas en el sobrenadante de células de melanoma UACC257 agotadas de GDF-15 secretado con anticuerpo anti-hGDF-15 B1-23).

En comparación con las células T que se hicieron fluir a lo largo de HUVEC no estimuladas (“control neg.”; mediana=28 células rodantes por campo de visión por segundo), hacer fluir células T a lo largo de HUVEC estimuladas (“control pos.”) aumentó el número de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=46). El tratamiento de las células T con hGDF-15 disminuye sustancialmente el número de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=29). Además, la incubación previa de las células T con sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 que secreta GDF-15 disminuye sustancialmente el número de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=36) en comparación con las células T que se hacen fluir a lo largo de HUVEC estimuladas (“control pos.”). Por el contrario, la incubación previa de las células T con sobrenadante de la línea celular de melanoma UACC257 agotada de GDF-15 secretado con anticuerpo anti-GDF-15 dio como resultado números de células rodantes por campo de visión por segundo (mediana=45) que eran comparables a las células T que se hicieron fluir a lo largo de HUVEC estimuladas (“control pos.”).

Resumen:

Este ejemplo muestra que hGDF-15, incluyendo GDF-15 secretado por células tumorales, disminuye la adhesión de las células T a células endoteliales. Puesto que la entrada de células T CD8<+>en cánceres sólidos y la presencia de estas células T CD8<+>en los cánceres sólidos es particularmente ventajosa para los enfoques terapéuticos que usan bloqueadores de puntos de control inmunitario, los niveles de hGDF-15 pueden usarse para predecir la probabilidad de una respuesta a tratamientos de estos pacientes con cáncer con bloqueadores de puntos de control inmunitario. Ejemplo 4: Los niveles en suero de GDF-15 definen la supervivencia de pacientes con melanoma tratados con anticuerpo anti-PD-1

El estudio en este ejemplo se realizó para validar adicionalmente los resultados obtenidos en el estudio del ejemplo 1, por ejemplo, el hallazgo de que hGDF-15 influye en la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario, mediante un estudio independiente adicional.

Se usaron los siguientes términos en relación con este estudio:

“Censurado” = El paciente fue retirado de la cohorte de estudio cuando no había disponibles datos de seguimiento adicionales.

“Acontecimiento” = El paciente había muerto.

“Supervivencia” = El paciente estaba vivo en el seguimiento.

Los pacientes del Departamento de Dermatología, Universidad de Tubinga, Alemania, con melanoma histológicamente confirmado se identificaron en la base de datos del Registro Central de Melanoma Maligno (CMMR) que registra de manera prospectiva a pacientes de más de 60 centros dermatológicos en Alemania. Se seleccionaron 99 pacientes, con (a) muestras de suero archivadas, (b) datos de seguimiento disponibles, (c) antecedentes o presencia de metástasis locorregional o distante en el punto de tiempo de extracción de sangre y (d) tratamiento experimental con anticuerpo anti-PD-1. Los objetivos y los métodos de recogida de datos por el CMMR se han publicado previamente en detalle (Lasitiotakis, KG et al., Cancer / 107 / 1331-9.2006). Los datos obtenidos para cada paciente incluían la edad, el sexo, la fecha del último seguimiento y la fecha y causa de la muerte, cuando fuera aplicable. Todos los pacientes habían dado el consentimiento informado por escrito para que el registro CMMR registrara sus datos clínicos. El comité de ética institucional de Tubinga ha aprobado el estudio (voto ético 125/2015BO2). Los pacientes idóneos tenían 18 años o más y tenían melanoma de estadio III o estadio IV irresecable confirmado de manera histológica o citológica no susceptible de terapia local y mostraban progresión de la enfermedad a pesar de haber recibido terapias previas según las pautas actuales. Los pacientes con tumores con mutaciones BRAFV600 habían recibido el tratamiento de primera línea recomendado o uno experimental que incluía terapia con inhibidores de BRAF o MEK o ambos. Se consideró que el tratamiento previo con ipilimumab, si fuera aplicable, había fracasado cuando los pacientes habían recibido un mínimo de dos dosis, 3 mg/kg una vez cada 3 semanas, pero mostraron progresión de la enfermedad confirmada en el plazo de 24 semanas de la última dosis de ipilimumab. Antes de la administración de anticuerpo anti-PD-1, se demandó resolución o mejora de los acontecimientos adversos relacionados con ipilimumab hasta grado 0-1 y una dosis de prednisona de 10 mg/día o menos durante al menos 2 semanas antes de la primera dosis del fármaco de estudio. Los pacientes idóneos tenían un estado funcional según el Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0 ó 1; enfermedad medible por criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos, versión 1.1 (RECIST v1.1); y valores dentro del intervalo preespecificado para recuento absoluto de neutrófilos (≥1500 células por ml), plaquetas (≥100.000 células por ml), hemoglobina (≥90 g/l), creatinina en suero (≤1·5 límite superior de la normalidad [ULN]), bilirrubina en suero total (≤1·5 ULN o bilirrubina directa ≤ULN para pacientes con concentraciones de bilirrubina total >1·5 ULN), aspartato y alanina aminotransferasas (≤2·5 ULN o ≤5 ULN para pacientes con metástasis de hígado), razón normalizada internacional o tiempo de protrombina (≤1·5 ULN si no se usan anticoagulantes) y tiempo de tromboplastina parcial activada (≤1·5 ULN si no se usan anticoagulantes). Los pacientes tuvieron un periodo de reposo farmacológico de al menos 4 semanas entre la última dosis de la terapia más reciente y la primera dosis de pembrolizumab o nivolumab. Análisis de niveles en suero de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):

Se midieron los niveles en suero de GDF-15 humano mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA).

Tampones y reactivos:

Disolución de bloqueo tamponada: BSA al 1 % (fracción V pH 7,0, PAA, Pasching, Austria) en PBS

Disolución de lavado: PBS-Tween (0,05 %)

Patrón: GDF-15 humano (concentración de disolución madre: 120 μg/ml, de R&D Systems)

Anticuerpo de captura: AcM contra GDF-15 humano (clon 147627) de R&D Systems, IgG2B de ratón (n.º de catálogo MAB957, de R&D Systems, concentración de disolución madre: 360 μg/ml)

Anticuerpo de detección: AcP purificado por afinidad biotinilado contra GDF-15 humano, IgG de cabra (n.º de catálogo BAF940, de R&D Systems, concentración de disolución madre: 9 μl/ml)

Estreptavidina-HRP (n.º de catálogo DY998, de R&D Systems)

Disolución de sustrato: 10 ml de NaOAc 0,1 M pH 6,0 100 μl de TMB 2 μl de H2O2

Disolución de parada: H2SO41 M

Procedimiento de análisis:

1. Preparación de placas:

e. Se diluyó el anticuerpo de captura a la concentración de trabajo de 2 μg/ml en PBS. Se recubrió inmediatamente una microplaca de 96 pocillos (Nunc maxisorp<®>) con 50 μl por pocillo del anticuerpo de captura diluido excluyendo las filas exteriores (A y H). Se llenaron las filas A y H con tampón para impedir la evaporación de las muestras durante el experimento. Se golpeó suavemente la placa para asegurarse de que el fondo de cada pocillo se cubría completamente. Se colocó la placa en una cámara húmeda y se incubó durante la noche a temperatura ambiente (TA).

f. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

g. Se añadieron 150 μl de disolución de bloqueo a cada pocillo, seguido de incubación a TA durante 1 hora. h. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

2. Procedimiento de ensayo:

d. Se prepararon patrones. Se diluyó GDF-15 en disolución de bloqueo tamponada hasta una concentración final de 1 ng/ml (4,17 μl de GDF 496 μl de disolución de bloqueo tamponada). Se realizaron diluciones en serie 1:2. e. Se prepararon muestras por duplicado 1:20 (6 μl 114 μl de disolución de bloqueo tamponada).

f. Se añadieron 50 μl de muestras o patrones diluidos por pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

i. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

j. Se diluyó el anticuerpo de detección hasta una concentración final de 50 ng/ml (56 μl 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 μl del anticuerpo de detección diluido a cada pocillo, seguido de incubación durante 1 hora a TA.

k. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

l. Se diluyó estreptavidina-HRP 1:200 (50 μl 10 ml de tampón de bloqueo). Se añadieron 50 μl de la dilución de trabajo de estreptavidina-HRP a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA.

m. Se aspiró cada pocillo y se lavó tres veces con PBS-Tween (0,05 %).

n. Se preparó la disolución de sustrato. Se añadieron 50 μl de disolución de sustrato a cada pocillo, seguido de incubación durante 20 min a TA.

o. Se añadieron 50 μl de disolución de parada a cada pocillo.

p. Se determinó inmediatamente la densidad óptica de cada pocillo, usando un lector de microplacas ajustado a 450 nm.

3. Cálculo del título en suero de GDF-15:

d. Se aplicó cada muestra/disolución patrón de GDF-15 por duplicado. Para determinar el título de GDF-15, se calculó el promedio de los duplicados y se restó el fondo (muestra sin GDF-15).

e. Para crear una curva de calibración, se representaron gráficamente los valores del intervalo lineal en un diagrama X-Y (eje X: concentración de GDF-15, eje Y: DO450), y se aplicó un ajuste de curva lineal. Se calculó el título en suero de GDF-15 de las muestras de prueba interpolando a partir de los valores de DO450 de las diluciones patrón con concentración conocida.

f. Para calcular la concentración final de GDF-15 de las muestras, se consideró el factor de dilución distinto. Las muestras que proporcionan valores de DO por encima o por debajo del intervalo de patrón volvieron a analizarse a diluciones apropiadas.

Comparación de los niveles en suero de hGDF-15 con los datos de pacientes:

A continuación, se compararon los niveles en suero de hGDF-15 medidos con los datos de respuestas de pacientes obtenidos a partir del estudio.

Correlación estadística de los niveles en suero de hGDF-15 con los datos de pacientes:

Datos:

El análisis de datos se basó en un archivo que contenía datos de muestras de 99 pacientes que contenía las columnas (variables) designación de muestra, GDF-15 (ng/ml), días (hasta la muerte o censura estadística) y en curso (un índice variable para la vida en curso).

Criterios de valoración (criterios de evaluación):

a. Supervivencia general (tiempo hasta la muerte). Este criterio de evaluación se compone del indicador de acontecimiento para muerte (1 = muerto/0 = vivo), que se derivó del archivo de datos, y el tiempo hasta la muerte o censura estadística (última vez que se supo que el paciente estaba vivo), correspondiente a la variable “días”. Respuesta al tratamiento, por ejemplo, si paciente era un paciente que responde al tratamiento o no (codificado como 1=r)

Análisis de datos:

Se definió el tiempo de seguimiento para el análisis de supervivencia a partir de la fecha de extracción de sangre hasta el último seguimiento (es decir, la última información obtenida del paciente) o la muerte. Todas las muestras de sangre se extrajeron en el plazo de días antes del tratamiento con el anticuerpo anti-PD1. Para el análisis de OS, los pacientes que estaban vivos en el último seguimiento fueron censurados, mientras que los pacientes que habían muerto se consideraron como “acontecimiento”. Se calcularon las probabilidades de supervivencia acumuladas según Kaplan-Meier junto con intervalos de confianza (IC) del 95% y se compararon usando parámetros estadísticos de la prueba de rangos logarítmicos bilateral. Se calcularon los valores de p para la supervivencia general mediante parámetros estadísticos de la prueba de rangos logarítmicos bilateral. Se ajustó un modelo con una variable de agrupamiento basada en GDF-15 como factor predisponente categórico (los grupos eran: <1,5 ng/ml (n=62), ≥1,5 ng/ml (n=37) o GDF-15<bajo>(n=49), GDF-15<alto>(n=50), basados en una división por la mediana). Las curvas de Kaplan-Meier resultantes se muestran en las figuras 11 y 12 en las que la censura estadística se indica mediante líneas verticales. Además, las siguientes tablas contienen un resumen de los casos (tabla 9), datos de supervivencia de los pacientes para grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y ≥1,5 ng/ml (tablas 10 y 11) y comparaciones estadísticas totales de grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y ≥1,5 ng/ml (tabla 12).

Tabla 9: Resumen de casos

*H = libre de acontecimientos ;Tabla 10: Media y mediana para la supervivencia (número de días de supervivencia) ;;; ;; a. Después de la censura estadística, la estimación se limita a la mayor supervivencia conocida. ;n/d: No pudieron calcularse datos de mediana de supervivencia debido a la presencia de >50 % de supervivientes en el grupo. ;Tabla 11: Media y mediana para la duración de supervivencia (número de días de supervivencia) ;;; ;; a. Después de la censura estadística, la estimación se limita a la mayor supervivencia conocida. ;n/d: No pudieron calcularse datos de mediana de supervivencia debido a la presencia de >50 % de supervivientes en el grupo. ;Tabla 12: Comparaciones totales ;;; ;; *df = grados de libertad

Prueba de distribución equitativa de supervivencia para diferentes niveles de GDF-15 (<1,5 ng/ml, ≥1,5 ng/ml) Resultados y conclusiones:

Los resultados estadísticos anteriores de este ejemplo confirmaron adicionalmente los resultados del ejemplo 1. Por ejemplo, se confirmó que la probabilidad de una evolución clínica positiva del tratamiento, tal como se indica por la supervivencia de los pacientes, disminuye significativamente al aumentar los niveles de hGDF-15 en el suero de pacientes. Por ejemplo, la tabla 12 muestra que la supervivencia entre los dos grupos de pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml y ≥1,5 ng/ml, respectivamente, era significativamente diferente, tal como se evidencia por un nivel de significación de 0,004. De manera similar, la tabla 9 demuestra que un mayor porcentaje de pacientes (82,3 %) sobrevivieron en el grupo que tiene niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml, y las tablas 10 y 11 y las figuras 12 y 13 demuestran que, para los pacientes que tienen niveles de GDF-15 de <1,5 ng/ml, los tiempos de supervivencia eran notablemente más largos que en pacientes que tienen niveles de GDF-15 de ≥1,5 ng/ml.

Por tanto, los resultados de este ejemplo confirman adicionalmente que existe una fuerte correlación inversa entre los niveles en suero de hGDF-15 y la probabilidad de una evolución clínica positiva de, por ejemplo, inmunoterapia basada en anticuerpo anti-PD-1 en los pacientes, incluyendo la respuesta del paciente y la supervivencia del paciente. Por tanto, según la invención, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre de pacientes puede usarse ventajosamente para predecir la probabilidad de una respuesta de los pacientes a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 5: En pacientes humanos con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tratados con un anticuerpo anti-PD1, la mediana de los niveles en suero de hGDF-15 en los pacientes con enfermedad progresiva son mayores que en pacientes que muestran una respuesta parcial

Este ejemplo se realizó para validar adicionalmente los resultados obtenidos en el estudio del ejemplo 1, por ejemplo, el hallazgo de que hGDF-15 permite predecir la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario, en un estudio independiente adicional en un cáncer sólido diferente.

Pacientes:

Los pacientes con NSCLC se trataron con anticuerpos anti-PD1 según la ficha técnica de fármaco aprobado de los anticuerpos anti-PD1. Los pacientes incluían pacientes que se trataron previamente con otras terapias contra el cáncer. Debido al hecho de que rara vez se observa una respuesta completa en pacientes con NSCLC, el grupo de pacientes incluía pacientes que muestran enfermedad progresiva y que muestran una respuesta parcial tras el tratamiento con PD-1, pero no pacientes que muestran una respuesta completa tras el tratamiento con PD-1.

Muestras de suero:

Se tomaron muestras de suero de los pacientes antes del tratamiento con los anticuerpos anti-PD1.

Análisis de los niveles en suero de hGDF-15 mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA):

Se analizaron los niveles en suero de hGDF-15 en las muestras de suero mediante ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), tal como se describe en el ejemplo 1.

Resultados:

Se obtuvieron los niveles en suero de hGDF-15 de 5 pacientes que muestran una respuesta parcial tras el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 y de 5 pacientes que muestran enfermedad progresiva tras el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1. En particular, la mediana del nivel en suero de hGDF-15 en los pacientes que muestran una respuesta parcial era de 0,55 ng/ml, mientras que la mediana del nivel en suero de hGDF-15 en los pacientes que muestran enfermedad progresiva era de 1,56 ng/ml. Por tanto, la mediana del nivel en suero de hGDF-15 en los pacientes que muestran enfermedad progresiva era aproximadamente 2,8 veces mayor que en los pacientes que muestran una respuesta parcial.

Conclusiones:

Los resultados de este ejemplo confirman adicionalmente que los niveles de hGDF-15 se correlacionan negativamente con la respuesta de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario. Por tanto, según la invención, los niveles de hGDF-15 en muestras de sangre de pacientes puede usarse ventajosamente para predecir la probabilidad de una respuesta de los pacientes a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Tales predicciones pueden realizarse no sólo para melanoma, sino también para cánceres de pulmón tales como NSCLC y en todos los otros cánceres sólidos a los que se hace referencia en el presente documento.

Ejemplo 6: Los niveles en suero de hGDF-15 no se correlacionan significativamente con la carta mutacional de los tumores

La carga mutacional es un factor de pronóstico positivo conocido para una respuesta de pacientes con cáncer a bloqueadores de puntos de control inmunitario. Generalmente, las células cancerosas albergan mutaciones genómicas que dan lugar a antígenos de células cancerosas que son específicos de las células cancerosas y diferentes de los antígenos de células no cancerosas. Una alta carga mutacional conduce a un número elevado de tales antígenos específicos de células cancerosas. En cánceres que albergan un número tan elevado de antígenos específicos de células cancerosas, se considera que la estimulación de la respuesta inmunitaria mediante bloqueadores de puntos de control inmunitario es particularmente eficaz, porque hay disponibles más antígenos específicos de células cancerosas como antígenos diana para la respuesta inmunitaria.

Para confirmar adicionalmente que hGDF-15 no es simplemente un marcador sustituto para la carga mutacional de los tumores y para confirmar adicionalmente que un tratamiento con inhibidores de hGDF-15 actúa a través de un mecanismo que es independiente de la carga mutacional de los tumores, se representaron gráficamente los niveles de ARNm de hGDF-15 en muestras de cáncer de pacientes con cáncer frente al número de mutaciones somáticas que se identificaron en los cánceres. Las mutaciones somáticas se determinaron mediante el uso de secuenciación del exoma. Los datos se analizaron usando la herramienta web UZH del Hospital Universitario de Zúrich (Cheng PFet al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). Los resultados se muestran en la figura 13. La figura 13A muestra un gráfico para datos de pacientes con cáncer obtenidos del Atlas del Genoma del Cáncer (TGCA) considerando sólo a pacientes con melanoma maligno de evolución rápida (el Atlas del Genoma del Cáncer se describe en la referencia de Cheng PFet al.: Data mining The Cancer Genome Atlas in the era of precision cancer medicine. Swiss Med Wkly. 16 de septiembre de 2015;145:w14183). Se evaluó la expresión de GDF-15 mediante normalización usando el paquete de software RSEM (“secuenciación de ARN por maximización de expectativas”) (Li B y Dewey CN: RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics.4 de agosto de 2011;12:323. doi: 10.1186/1471-2105-12-323). La figura 13B muestra un gráfico para datos de pacientes con cáncer de 40 pacientes con melanoma maligno metastásico adicional del Hospital Universitario de Zúrich, que se analizaron por separado.

En particular, ambas de las figuras 13A y 13B muestran un valor de p de 0,5, lo que indica que no hay ninguna correlación significativa entre la carga mutacional en los cánceres y los niveles de hGDF-15. Estos resultados confirman adicionalmente que hGDF-15 no es simplemente un marcador sustituto para la carga mutacional de los tumores y que los niveles de hGDF-15 permiten predecir las respuestas de los pacientes a bloqueadores de puntos de control inmunitario de una manera que es independiente de la carga mutacional de los tumores.

Ejemplo 7: Infiltración de células T CD8<+>en tumores de tipo natural o en tumores que (sobre)expresan GDF-15 humano

En un estudio piloto usando células de cáncer de colon MC38 o bien de tipo natural o bien que (sobre)expresan GDF-15 humano implantadas en el costado derecho de ratones C57BL/6 singénicos inmunocompetentes, la sobreexpresión de GDF-15 se asoció con una infiltración reducida de células inmunitarias. En la figura 14 se muestran imágenes de inmunocitoquímica para CD8a en ratones sacrificados después de 29 días que albergaban tumores de tipo natural o tumores que sobreexpresan hGDF-15 transgénico (tg). Tal como puede observarse a partir de la figura, los tumores de tipo natural contenían más células positivas para CD8a que los tumores que sobreexpresan hGDF-15 transgénico (tg).

Estos resultados respaldan adicionalmente el hallazgo de que hGDF-15 disminuye el porcentaje de células T CD8<+>en cánceres sólidos. Por tanto, una explicación preferida, pero no limitativa, para la correlación inversa de los niveles de hGDF-15 y una evolución clínica favorable (por ejemplo, supervivencia del paciente o la presencia de una respuesta al tratamiento) es que hGDF-15 disminuye el porcentaje de linfocitos T CD8<+>en tumores sólidos incluyendo metástasis tumorales, disminuyendo de ese modo la probabilidad de una evolución clínica favorable (por ejemplo, supervivencia del paciente o la presencia de una respuesta al tratamiento). Puesto que esta correlación se observa en diversas entidades de cánceres sólidos, la presente invención no se limita a cánceres sólidos particulares tales como melanoma.

Aplicabilidad industrial

Los aparatos y los kits usados en los métodos de la presente invención pueden fabricarse a nivel industrial y venderse como productos para su uso en los métodos de predicción reivindicados, según normas conocidas para la fabricación de productos de diagnóstico. Por consiguiente, la presente invención es aplicable a nivel industrial.Bibliografía

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Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Método para predecir la probabilidad de una respuesta al tratamiento de un paciente humano con cáncer a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, en el que el método comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de hGDF-15 en una muestra de sangre humana obtenida de dicho paciente; y b) predecir dicha probabilidad de una respuesta al tratamiento basándose en el nivel determinado de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana; en el que un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de una respuesta al tratamiento, y en el que el cáncer es un cáncer sólido;

en el que el bloqueador de puntos de control inmunitario se selecciona de uno o más de los siguientes grupos que consisten en:

i) un inhibidor de PD-1 humana, siendo el inhibidor preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana, o una porción de unión a antígeno del mismo; y

ii) un inhibidor de PD-L1 humana, siendo el inhibidor preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana, o una porción de unión a antígeno del mismo.

2. Método para predecir la probabilidad de supervivencia de un paciente humano con cáncer tras un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario, en el que el método comprende las etapas de:

a) determinar el nivel de hGDF-15 en una muestra de sangre humana obtenida de dicho paciente; y b) predecir dicha probabilidad de supervivencia basándose en el nivel determinado de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana; en el que un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana indica una probabilidad aumentada de supervivencia, y en el que el cáncer es un cáncer sólido; en el que el bloqueador de puntos de control inmunitario se selecciona de uno o más de los siguientes grupos que consisten en:

i) un inhibidor de PD-1 humana, siendo el inhibidor preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-1 humana, o una porción de unión a antígeno del mismo; y

ii) un inhibidor de PD-L1 humana, siendo el inhibidor preferiblemente un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a PD-L1 humana, o una porción de unión a antígeno del mismo.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa b) comprende comparar dicho nivel de hGDF-15 determinado en la etapa a) con un nivel umbral de hGDF-15, en el que dicha probabilidad se predice basándose en la comparación de dicho nivel de hGDF-15 determinado en la etapa a) con dicho nivel umbral de hGDF-15; y en el que un nivel de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana que se disminuye en comparación con dicho nivel umbral de hGDF-15 indica que dicha probabilidad se aumenta en comparación con una probabilidad a o por encima de dicho nivel umbral de hGDF-15.

4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que la muestra de sangre humana es una muestra de suero humano, y preferiblemente en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,2 ng/ml y 8,0 ng/ml, o en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 1,5 ng/ml y 7,0 ng/ml, o en el que el nivel umbral de hGDF-15 hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 2,0 ng/ml y 6,0 ng/ml, o en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 2,5 ng/ml y 5,0 ng/ml, o en el que el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 3,0 ng/ml y 4,0 ng/ml.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un nivel disminuido de hGDF-15 en dicha muestra de sangre humana en comparación con dicho nivel umbral de hGDF-15 indica que dicha probabilidad aumentada es una probabilidad de más del 5 %, más del 10 %, más del 20 %, más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 % o más del 90 %.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

en el que el cáncer sólido se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de cuello uterino, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, sarcoma de Ewing, cáncer de pulmón de células no pequeñas y cáncer de pulmón de células pequeñas, en el que el cáncer se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial, cáncer de estómago, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de testículo, cáncer de ovario, cáncer de endometrio y cáncer de cuello uterino, y en el que el cáncer se selecciona más preferiblemente del grupo que consiste en melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer urotelial y cáncer de estómago, y/o

en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, carcinoma bucal de células escamosas, cáncer colorrectal y cáncer de próstata.

7. Método según la reivindicación 6, en el que el cáncer es melanoma y el nivel umbral de hGDF-15 es un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 3,0 ng/ml y 4,0 ng/ml, en el que el nivel umbral de hGDF-15 es preferiblemente un nivel de hGDF-15 seleccionado del intervalo de entre 3,2 ng/ml y 3,7 ng/ml, y en el que el nivel umbral de hGDF-15 es lo más preferiblemente un nivel de hGDF-15 de 3,4 ng/ml.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa a) comprende determinar el nivel de hGDF-15 usando uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o una porción de unión a antígeno de los mismos, y en el que el uno o más anticuerpos capaces de unirse a hGDF-15 o la porción de unión a antígeno de los mismos forman preferiblemente un complejo con hGDF-15,

y/o en el que el uno o más anticuerpos comprenden al menos un anticuerpo policlonal,

y/o en el que el uno o más anticuerpos o la porción de unión a antígeno comprenden al menos un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, y en el que la unión es preferiblemente unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15 que se compone de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que

la muestra de sangre humana obtenida del paciente humano es una muestra de un paciente que ha recibido dicho bloqueador de puntos de control inmunitario, y en el que la muestra de sangre humana obtenida del paciente humano contiene preferiblemente el bloqueador de puntos de control inmunitario y/o metabolitos biológicos del mismo,

o en el que la muestra de sangre humana obtenida del paciente humano es una muestra de un paciente que no ha recibido ningún bloqueador de puntos de control inmunitario,

o en el que el método se usa para un paciente que se somete a un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario del cáncer sólido o un tratamiento diferente del cáncer sólido, en el que ni las etapas del tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario ni las etapas de cualquier otro tratamiento forman parte del método.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método es un métodoin vitro.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que, en la etapa a), el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia, y en el que el ensayo de electroquimioluminiscencia es preferiblemente un método de detección de tipo sándwich que comprende una etapa de formar un complejo de detección entre

(A) perlas recubiertas con estreptavidina o nanopartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina; (B) un primer anticuerpo biotinilado o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF15;

(C) hGDF-15 de la muestra; y

(D) un segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;

en el que dicho complejo de detección tiene la estructura (A)-(B)-(C)-(D), y en el que el primer anticuerpo biotinilado o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15, en el que el método comprende además una etapa de detectar el complejo de detección midiendo la electroquimioluminiscencia, y en el que el nivel de hGDF-15 en la muestra de sangre humana se determina basándose en la medición de electroquimioluminiscencia.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-12, en el que la muestra de sangre humana es una muestra de suero humano, y en el que dicha probabilidad de una respuesta al tratamiento se predice usando un cociente de probabilidades de 0,389 para niveles en suero de hGDF-15 en ng/ml como factor predisponente continuo con un intervalo de confianza del 95 % de desde 0,159 hasta 0,698.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-13, en el que la respuesta al tratamiento es una respuesta según los criterios de RECIST, versión 1.1.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en el que la probabilidad de supervivencia se predice usando un cociente de riesgos instantáneos con supervivencia general como criterio de valoración y GDF-15 como factor predisponente continuo, y en el que se predice que por 1 ng/ml de aumento en los niveles en suero de GDF-15, el riesgo de muerte aumenta en un factor de 1,27 con un intervalo de confianza del 95 % de desde 1,10 hasta 1,47.

16. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que, en la etapa a), el nivel de hGDF-15 se determina capturando hGDF-15 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 8 y detectando hGDF-15 con un anticuerpo policlonal, o detectando hGDF-15 con un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un epítopo diferente del anticuerpo que captura hGDF-15.

17. Aparato configurado para realizar el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el aparato es un analizador de electroquimioluminiscencia configurado para realizar el método según la reivindicación 12.

18. Uso de un kit de detección en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, comprendiendo el kit:

(i) perlas recubiertas con estreptavidina;

(ii) un primer anticuerpo biotinilado o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;

(iii) hGDF-15 recombinante;

(iv) un segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; y opcionalmente

(v) instrucciones para su uso en un método según las reivindicaciones 1-16,

en el que el primer anticuerpo biotinilado o la porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o la porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15,

preferiblemente en el que uno del primer anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 y el segundo anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15 que se compone de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente,

el anticuerpo monoclonal o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo monoclonal o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

19. Uso de un kit en un métodoin vitropara la predicción de una respuesta de un paciente humano con cáncer a un bloqueador de puntos de control inmunitario según las reivindicaciones 1 y 3-16, en el que el cáncer es un cáncer sólido, en el que el bloqueador de puntos de control inmunitario es según la reivindicación 1, en el que el kit es un kit de detección que comprende:

(i) perlas recubiertas con estreptavidina;

(ii) un primer anticuerpo biotinilado o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;

(iii) hGDF-15 recombinante;

(iv) un segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; y opcionalmente

(v) instrucciones para su uso en un método según las reivindicaciones 1 y 3-16,

en el que el primer anticuerpo biotinilado o la porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o la porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15,

preferiblemente en el que uno del primer anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 y el segundo anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15 que se compone de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente,

el anticuerpo monoclonal o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo monoclonal o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.

20. Uso de un kit en un métodoin vitropara la predicción de la probabilidad de supervivencia de un paciente humano con cáncer tras un tratamiento con bloqueadores de puntos de control inmunitario según las reivindicaciones 2-16,

en el que el cáncer es un cáncer sólido,

en el que el bloqueador de puntos de control inmunitario es según la reivindicación 2,

en el que el kit es un kit de detección que comprende:

(i) perlas recubiertas con estreptavidina;

(ii) un primer anticuerpo biotinilado o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15;

(iii) hGDF-15 recombinante;

(iv) un segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15; y opcionalmente

(v) instrucciones para su uso en un método según las reivindicaciones 2-16,

en el que el primer anticuerpo biotinilado o la porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un primer epítopo de hGDF-15 y el segundo anticuerpo marcado con un complejo de rutenio o la porción de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse a un segundo epítopo de hGDF-15 que es diferente de dicho primer epítopo de hGDF-15,

preferiblemente en el que uno del primer anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 y el segundo anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a hGDF-15 es un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que la unión es unión a un epítopo conformacional o discontinuo en hGDF-15 que se compone de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en el que preferiblemente,

el anticuerpo monoclonal o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y el anticuerpo monoclonal o la porción de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una región CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos ser-ala-ser y una región CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7.