ES2968247T3

ES2968247T3 - Método para la ingeniería de inmunoglobulinas

Info

Publication number: ES2968247T3
Application number: ES17182619T
Authority: ES
Inventors: Gottfried Himmler; Gerda Redl; Florian RÜCKER; Gordana Wozniak-Knopp
Original assignee: F Star Therapeutics Ltd
Current assignee: F Star Therapeutics Ltd
Priority date: 2006-07-05
Filing date: 2007-07-05
Publication date: 2024-05-08
Anticipated expiration: 2027-07-05
Also published as: JP2009541361A; WO2008003116A3; AT503902A1; LT2044117T; JP5508002B2; CY1119641T1; EP3293200B1; DK2044117T3; SI2044117T1; HUE037426T2; US20100029497A1; AT503902B1; EP2044117B1; PL2044117T3; EP2044117A2; WO2008003116A2; US9133274B2; CN101528775A; US20210388339A1; PT2044117T

Abstract

La presente invención se refiere a un método para diseñar una inmunoglobulina que comprende un dominio variable y al menos una modificación en al menos dos bucles estructurales de dicha inmunoglobulina y determinar la unión de dicha inmunoglobulina a un epítopo de un antígeno, en donde la inmunoglobulina no modificada no modifica significativamente unirse a dicho epítopo, que comprende las etapas de: - proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que comprende al menos dos bucles estructurales, - modificar al menos un residuo de nucleótido de cada uno de dichos bucles estructurales, - transferir dicho ácido nucleico modificado en un sistema de expresión, -expresar dicha inmunoglobulina modificada, -poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con un epítopo, y -determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho epítopo, inmunoglobulinas producidas mediante tal método y bibliotecas de inmunoglobulinas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la ingeniería de inmunoglobulinas

Campo de invención

La presente invención se refiere a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina modificado.

El campo general es la ingeniería de proteínas con el objetivo de impartirles propiedades de unión específicas. Más específicamente, las proteínas modificadas por ingeniería relevantes aquí son inmunoglobulinas (anticuerpos), e incluso más específicamente, dominios variables únicos o pares o combinaciones de dominios variables únicos de inmunoglobulinas o combinaciones con otros dominios de inmunoglobulinas. Las propiedades de unión específicas de las inmunoglobulinas son características importantes ya que controlan la interacción con otras moléculas tales como antígenos y hacen que las inmunoglobulinas sean útiles para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

Antecedentes

Estructura de anticuerpos

La estructura básica de los anticuerpos es similar para diversas clases de anticuerpos y para diversas especies y se explicará aquí utilizando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.

Dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos ligeras (L) idénticas se combinan para formar la molécula de anticuerpo en forma de Y. Cada una de las cadenas pesadas tiene cuatro dominios. Los dominios variables (VH) amino terminales están en las puntas de la Y. Les siguen tres dominios constantes: CH1, CH2 y el CH3 carboxi terminal, en la base del tallo de la Y. Un tramo corto, el interruptor, conecta las regiones variables y constantes de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab). Se pueden producir un fragmento Fc y dos fragmentos Fab idénticos mediante escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacta. Las cadenas ligeras están construidas con dos dominios, variable (VL) y constante (CL), separados por un interruptor.

Los enlaces disulfuro en la región bisagra conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras están acopladas a las cadenas pesadas mediante enlaces disulfuro adicionales.

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (VH) y (VL) se encuentran en las "puntas" de la Y, donde están posicionadas para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lado en el que se encuentran los extremos N de las secuencias de aminoácidos.

El tallo de la Y se proyecta de una manera para mediar eficientemente funciones efectoras como la activación del complemento y la interacción con los receptores de Fc, o ADCC y ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con las proteínas efectoras. El extremo C de la secuencia de aminoácidos está localizado en el lado opuesto de la punta, que puede denominarse "parte inferior" de la Y.

Dominios variables de inmunoglobulina (dominios V)

Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas beta empaquetadas estrechamente una contra la otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina pliegue de inmunoglobulina. Para referencia véase Bork et al. (1994) J. Mol. Biol. 242:309-320; Halaby et al. (1999) Protein Engineering 12: 563-571; Immunobiology. 5a ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport, Mark; Shlomchik, Mark. Nueva York y Londres: Garland Publishing; 2001.

El pliegue de dominios variables tiene 9 cadenas beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 cadenas. La lámina de 5 cadenas es estructuralmente homóloga a la lámina de 3 cadenas de dominios constantes, pero contiene las cadenas extra C' y C". El resto de las cadenas (A, B, C, D, E, F, G) tienen La misma topología y estructura similar que sus contrapartes en los pliegues de inmunoglobulina de dominio constante. Un enlace disulfuro une las cadenas B y F en láminas opuestas, como en los dominios constantes. Los dominios variables de las cadenas de inmunoglobulina ligera y pesada contienen tres bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan las cadenas beta B-C, C'-C" y F-G del pliegue de inmunoglobulina. Los residuos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a la siguiente, lo que imparte especificidad de antígeno a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH en las puntas de las moléculas de anticuerpos están estrechamente empaquetados de modo que las 6 CDR (3 en cada dominio) cooperan en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica del antígeno. Por tanto, el sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por bucles que conectan las cadenas B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de la cadena ligera y las cadenas B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de la cadena pesada.

Armazones para la ingeniería de proteínas.

Utilizando la estructura 3D de una proteína como ayuda para el diseño, los residuos de aminoácidos localizados en la superficie de muchas proteínas se han aleatorizado utilizando la estructura central de la proteína como armazón. Los ejemplos de esta estrategia se describen o revisan en las siguientes referencias: Nygren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6.562.617; Hufton et al. FEBS Letters (2000) 475: 225; Binz et al. Nat Biotechnol. (2005) 23:1257-68; Hosse et al. Protein Sci. (2006) 15:14-27.

El principio básico de esta técnica se basa en la observación de que muchas proteínas tienen un núcleo estable, formado por disposiciones específicas de elementos de estructura secundaria, como láminas beta o hélices alfa, que están interconectados por estructuras como bucles, giros o bobinas aleatorias. Típicamente, estos últimos tres elementos estructurales son menos cruciales para la estructura general de la proteína, y los residuos de aminoácidos en estos elementos estructurales pueden intercambiarse a menudo sin destruir el pliegue general de la proteína. Los ejemplos naturales de este principio de diseño son las CDR de dominios similares a las inmunoglobulinas, como se pueden encontrar en los anticuerpos, los receptores de células T y otras moléculas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Los ejemplos artificiales incluyen lipocalinas, anquirinas, inhibidores del dominio kunitz, nudos y otros armazones proteicos.

Manipulación de los bucles CDR de dominios variables de inmunoglobulina

Una multitud de documentos de la técnica anterior muestran que el armazón similar a una inmunoglobulina se ha empleado con el propósito de manipular el sitio de unión al antígeno o ligando existente, introduciendo así nuevas propiedades de unión. Más precisamente, principalmente las regiones CDR se han diseñado por ingeniería para la unión al antígeno; en otras palabras, en el caso del pliegue de la inmunoglobulina, el sitio de unión al antígeno natural se ha modificado con el fin de cambiar su afinidad o especificidad de unión. Existe una gran cantidad de literatura que describe diferentes formatos de dichas inmunoglobulinas manipuladas, frecuentemente expresadas en forma de anticuerpos completos, productos de fusión y/o fragmentos tales como fragmentos Fv monocatenarios (scFv), diacuerpos, minicuerpos, dominios únicos o fragmentos Fab y similares, ya sea presentados en la superficie de partículas de fagos u otros virus y células o expresados de manera soluble en diversos sistemas de expresión procariotas o eucariotas. Se revisan las técnicas, p. ej., en Holliger y Hudson, Nat. Biotechnol. (2005) 23:1126-36 y Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005) 23:1105-16.

Regiones marco o distintas de CDR de dominios variables de inmunoglobulina

Los bucles de CDR de un dominio variable de inmunoglobulina definen la especificidad del antígeno. El resto de la molécula se denomina marco (FR). Sin embargo, estas regiones marco están compuestas de estructuras de bucle y cadena beta.

Los bucles que no son bucles de CDR en un dominio variable de inmunoglobulina nativo no tienen especificidad de unión a antígeno o de unión a epítopo, pero contribuyen al plegamiento global correcto del dominio de inmunoglobulina y, por consiguiente, también al posicionamiento correcto de las CDR y a la interacción entre dominios. Estos bucles se denominan bucles estructurales a los efectos de esta invención.

Los dominios variables de los anticuerpos en general se han manipulado por muchas razones diferentes, como la construcción de diversos formatos de anticuerpos, el injerto de CDR (es decir, el injerto de la especificidad de un anticuerpo particular en otro marco; p. ej., Jones et al. Nature (1986) 321: 522-525; Kashmiri et al. Methods (2005) 36:25-34), cambiando la superficie de los dominios variables con el fin de hacerla más soluble y estable (p. ej., Ewert et al. Methods (2004) 34:184-99; Conrath et al. J Mol Biol. (2005) 350:112-125), para convertirlo en monomérico (p. ej., Dottorini et al. Biochemistry (2004) 43:622-628)) o para estudiar la interacción entre dominios variables (p. ej., Masuda et al. FEBS J. (2006) 273:2184-94). Muchas de esas manipulaciones han implicado cambios en la región marco de la molécula; se han realizado algunas mutaciones de aminoácidos dentro de bucles estructurales del dominio variable.

La influencia de las regiones marco remotas en el posicionamiento del bucle de CDR es evidente a partir de los resultados del injerto de CDR, que muestran que la mutación de los aminoácidos marco frecuentemente es necesaria para recuperar la unión al antígeno después del injerto de CDR de un marco a otro (p. ej., Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487-499; Kettleborough et al. Protein Eng. (1991) 4:773-783; Wu et al. J. Mol. Biol. (1999) 294:151-162).

Simon y Rajwesky (Protein Sci. (1992) 5:229-234) han estudiado los efectos de una inserción de cuatro residuos en el bucle FR3 de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo anti-NP B1 -8. El mutante de inserción se obtuvo como anticuerpo secretado sin defectos importantes en la biosíntesis, lo que indica que los dominios variables del anticuerpo pueden adaptarse a la variación de longitud no solo en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), sino también en los bucles de la región marco (FR). En este caso, el sitio de unión al antígeno original formado por los bucles CDR no se vio afectado por la modificación en un bucle estructural vecino.

Injerto de bucles de CDR en regiones de bucles estructurales

El documento EP0640130B1 describe análogos de proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas quiméricas (proteínas chi) que tienen más de un sitio de unión biológico (dominios V únicos o Fv). Los sitios de unión de estas proteínas están compuestos por regiones hipervariables derivadas de moléculas relacionadas con la superfamilia de moléculas de inmunoglobulinas, incluidas inmunoglobulinas, antígenos de la superficie celular (como los antígenos de las células T) y receptores celulares (como el receptor de Fc). Las regiones hipervariables se denominan "regiones similares a CDR" y definen sitios de unión de ligandos. Además, la proteína chi tiene al menos un segmento más del sitio de unión del ligando, también una región similar a CDR, empalmada en las regiones similares a FR del dominio de barril beta.

Por lo tanto, cada sitio de unión al ligando de la proteína chi está compuesto por una región similar a CDR derivada de moléculas de la superfamilia de inmunoglobulinas. Por ejemplo, un sitio de unión al ligando está compuesto por las CDR derivadas de una molécula de inmunoglobulina cuyo ligando es un antígeno.

El documento EP0640130B1 enseña, por tanto, cómo empalmar regiones similares a CDR con una especificidad dada de una molécula de la superfamilia de inmunoglobulinas en los bucles estructurales de un dominio variable. Se postula que mediante esta técnica se pueden preparar anticuerpos biespecíficos funcionales. Existe el requisito para esta técnica de que las orientaciones relativas de los bucles similares a CDR (simetría de bucles de CDR) para un dominio variable se reproduzcan con una aproximación razonable en la orientación relativa de los bucles estructurales. El documento EP0640130B1 reivindica que tal aproximación de la simetría de bucle similar a CDR existe para los bucles estructurales. Sin embargo, es dudoso que la orientación relativa de los bucles de CDR y los bucles estructurales sea similar ensuficientedetalle y resolución; en consecuencia, hasta la fecha no se ha descrito que sea realmente posible desarrollar moléculas biespecíficas mediante esta técnica.

El documento EP0640130B1 ejemplifica que se usaron R19.9 (un anticuerpo monoclonal murino específico para el pazobencenoarsonato) y 26-10 (anticuerpo monoclonal murino específico para la ouabaína) como marco que proporciona los bucles de CDR primarios respectivamente, y los bucles de CDR del anticuerpo anti-lisozima murino D1.3 se injertaron en las regiones de bucle estructural. Sin embargo, no se describe la especificidad funcional después del injerto.

Otro ejemplo describe que el anticuerpo de cadena única 26-10 específico para ouabaína podría retener su especificidad para la ouabaína después de injertar dos CDR del anticuerpo específico de lisozima en los bucles estructurales del fragmento de anticuerpo Fv de cadena única específico de ouabaína. Sin embargo, no se describe que el fragmento de anticuerpo que se preparó según este método tuviera también especificidad de unión para la lisozima.

Injerto de péptidos en la región del bucle estructural

El documento WO00244215A2 describe moléculas de unión que comprenden un sitio de unión a diana específico y un péptido efector Fc. El péptido efector Fc es un péptido de hasta 100 aminoácidos que interactúa con moléculas efectoras. El péptido efector puede, p. ej., insertarse en las regiones de bucle de un anticuerpo siempre que la capacidad de unirse a un antígeno no se vea afectada adversamente. Se ejemplifica la inserción de un péptido efector en un bucle que no es de CDR de un dominio CH1 de un fragmento de inmunoglobulina. La misma inserción no se describe para un dominio variable. Cada péptido injertado en un bucle que no es de CDR según esta divulgación tiene una alta probabilidad de ser inactivo debido al entorno estructural diferente en el que se ha colocado. Además, puede resultar difícil retener una conformación de bucle de CDR específica en una inmunoglobulina original si se injerta un péptido en un bucle estructural de un dominio variable. En consecuencia, no se describe que un péptido efector pueda injertarse en un dominio variable sin pérdida de unión al antígeno o unión a la molécula efectora.

El documento PCT/EP2006/050059 describe un método de ingeniería de una inmunoglobulina que comprende una modificación en una región de bucle estructural para obtener nuevos sitios de unión a antígeno. Este método es ampliamente aplicable a las inmunoglobulinas y puede usarse para producir una serie de inmunoglobulinas dirigidas a una variedad de antígenos.

El documento US2005/266000A1 describe polipéptidos que comprenden un dominio marco variable (VFR) de cadena pesada variante. Un VFR es parte del bolsillo o surco de unión al antígeno que puede entrar en contacto con el antígeno.

Los VFR son parte de la región del bucle de CDR, también denominada en la presente memoria región CDR, y están localizados en un dominio variable al lado de los bucles de CDR para soportar la unión del antígeno a través de la región del bucle de CDR. Los bucles de marco distintos del VFR no se han mutado con el fin de diseñar por ingeniería un sitio de unión a antígeno.

Un objeto de la presente invención es proporcionar inmunoglobulinas y dominios variables de inmunoglobulinas con propiedades de unión a antígeno mejoradas.

Descripción de la invención

La presente invención es tal como se establece en las reivindicaciones.

Con el fin de superar los inconvenientes del estado de la técnica tal como se describe en WO00244215A2 y EP0640130B1 al diseñar por ingeniería un sitio de unión en una región de bucle estructural de un dominio variable de anticuerpo, en la presente memoria se describen métodos para seleccionar la unión específica de un polipéptido (es decir, un péptido de dominio variable que comprende regiones de bucle estructural modificadas) en su contexto natural (es decir, dominio variable de anticuerpo). Con el fin de aumentar el número de estructuras potenciales de dominios de inmunoglobulina variantes que pueden seleccionarse para la unión a antígeno, se modifican según la invención al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle. Por tanto, es posible introducir y seleccionar muchas modificaciones diferentes con una alteración mínima de la estructura general del dominio. Otra ventaja de modificar al menos dos bucles o regiones de bucles es el área de superficie ampliada potencialmente capaz de interactuar con un compañero de unión específico. Los dominios variables de inmunoglobulina así modificados se seleccionan para funciones o unión específicas. El método descrito permite la ingeniería de un dominio variable de inmunoglobulina modificado y una unión de inmunoglobulina modificada con sus bucles estructurales o regiones de bucle modificados con unión de alta afinidad y/o alta especificidad a una pareja de unión. El método permite la selección de moléculas de unión específicas con modificaciones mínimas y sin destrucción de la estructura general del dominio de inmunoglobulina variable.

Para superar la dificultad de retener una conformación de bucle de CDR específica en una inmunoglobulina parental, se modifica un bucle estructural de un dominio variable según la invención. Por lo tanto, es la primera vez que es posible aumentar las propiedades de unión al antígeno de una inmunoglobulina sin una pérdida significativa de la unión al antígeno o incluso de la unión a la molécula efectora de un anticuerpo parental. Es sorprendentemente posible diseñar por ingeniería la inmunoglobulina según la invención sin interferir significativamente con las propiedades de unión de una conformación de bucle de CDR específica, tal como la afinidad, la avidez y la especificidad de unión, de la inmunoglobulina parental.

Una conformación de bucle de CDR específica proporciona la unión al antígeno mediante bucles de CDR o una región de bucle de CDR. Cualquier inmunoglobulina que se una al antígeno a través de dicha conformación de bucle de CDR se puede modificar como se describe en la presente memoria para obtener un sitio de unión adicional en un bucle estructural de la inmunoglobulina, preferiblemente mientras se retienen o permanecen inalteradas la conformación de bucle de CDR específica y las propiedades de unión al antígeno originales de la molécula parental. Preferiblemente, las propiedades de unión de la conformación de bucle de CDR se pueden mantener en la medida en que la afinidad de unión de la molécula parental no se reduzca significativamente, por ejemplo, la constante de disociación Kd no aumenta significativamente, lo que significa que la diferencia en Kd es un factor preferiblemente menor de 104, más preferiblemente menor de 103, aún más preferido menor de 102, o menor de 10.

Según la presente invención, una de las características clave de la presente invención es que la ingeniería de la inmunoglobulina o de los dominios variables de inmunoglobulina tiene lugar en regiones que normalmente no están involucradas en la unión al antígeno, en otras palabras, en regiones distintas de las CDR de un dominio variable de anticuerpo. Se observó que el pliegue específico de los dominios de inmunoglobulina permite la introducción de mutaciones aleatorias en regiones que son estructuralmente análogas a las CDR, pero diferentes en posición en secuencia y estructura. Las regiones identificadas para la modificación según la presente invención son, al igual que las CDR, regiones de bucle que conectan las cadenas beta del pliegue de la inmunoglobulina. Estos bucles estructurales o regiones de bucle pueden mutarse como se describe en la presente memoria sin afectar la unión de los dominios variables de la inmunoglobulina que está mediada a través de los bucles de CDR. Al mutar dichos bucles estructurales o regiones de bucle, se genera una nueva superficie de unión molecular o bolsillo de unión que es similar en tamaño y forma a la superficie de unión o bolsillo de unión formado por los bucles de CDR del sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo. Dado que los bucles estructurales también pueden ampliarse mediante la inserción de aminoácidos adicionales, la arquitectura del sitio de unión recién generado puede ajustarse voluntariamente a la diana a la que debería unirse. Por ejemplo, los bolsillos de unión profundos, que son especialmente adecuados para la unión de moléculas pequeñas, pueden estar formados preferentemente por bucles largos, es decir, bucles estructurales con aminoácidos adicionales insertados en su secuencia, mientras que las superficies de unión más bien planas, que son muy adecuadas para unirse a dianas con una superficie molecular grande y plana se forman preferentemente cuando los residuos en los bucles estructurales se mutan sin la inserción de residuos adicionales. Más específicamente, se describe en la presente memoria que mediante la introducción de mutaciones aleatorias en los bucles que conectan las cadenas beta A-B, C’-D y E-F de un dominio variable de cadena pesada humano o humanizado, se pueden seleccionar dominios mutados que se unan específicamente a la albúmina sérica humana o al receptor Fcgamma III, que normalmente no son reconocidos ni unidos por dominios variables de inmunoglobulina humanos o humanizados. Las mutaciones introducidas incluyen mutaciones en las que residuos de aminoácidos seleccionados en la secuencia de tipo salvaje fueron reemplazados por residuos elegidos al azar, y también incluyen inserciones de residuos de aminoácidos extra en los bucles mencionados anteriormente. Así, según la invención se proporcionan preferiblemente inmunoglobulinas modificadas que se pueden obtener y producir según los métodos descritos anteriormente, y que tienen un sitio de unión específico para un antígeno, en particular específico para una albúmina sérica, receptores celulares y factores del complemento, más específicamente albúmina sérica humana y receptores de Fc.

El término "inmunoglobulina", tal y como se usa en la presente memoria, incluye inmunoglobulinas o partes, fragmentos o derivados de inmunoglobulinas. Por lo tanto, incluye un "péptido de dominio variable de inmunoglobulina" que se va a modificar como se describe en la presente memoria (tal y como se usan en la presente memoria, los términos inmunoglobulina y anticuerpo son intercambiables), así como dominios variables de inmunoglobulina o partes de los mismos que contienen un bucle estructural, tal como un minidominio, o un bucle estructural de tales dominios. Las inmunoglobulinas se pueden utilizar como péptidos aislados o como moléculas combinadas con otros péptidos. En algunos casos, es preferible utilizar un bucle estructural modificado definido o una región de bucle estructural, o partes de los mismos, como moléculas aisladas para fines de unión o combinación. El "dominio variable de inmunoglobulina" como se define en la presente memoria contiene dichos péptidos o polipéptidos del dominio variable de inmunoglobulina que pueden tener características de unión específicas tras su modificación e ingeniería. Los péptidos son homólogos a secuencias de dominio variable de inmunoglobulina, y tienen preferiblemente al menos 5 aminoácidos de longitud, más preferiblemente al menos 10 o incluso al menos 50 ó 100 aminoácidos de longitud, y constituyen al menos parcialmente la región de bucle estructural o la región de bucle que no es de CDR del dominio variable. Preferiblemente, los péptidos excluyen aquellas inserciones que se consideran aminoácidos no funcionales, regiones de CDR híbridas o quiméricas o regiones similares a CDR y/o estructuras canónicas de regiones de CDR. Las características de unión se refieren a la unión, afinidad y avidez de epítopos específicos.

Un derivado de una inmunoglobulina según la invención es cualquier combinación de una o más inmunoglobulinas de la invención y/o una proteína de fusión en la que cualquier dominio o minidominio de la inmunoglobulina de la invención puede fusionarse en cualquier posición de una o más proteínas diferentes (tales como otras inmunoglobulinas, ligandos, proteínas de armazón, enzimas, toxinas y similares). También se puede obtener un derivado de la inmunoglobulina de la invención mediante técnicas de recombinación o unión a otras sustancias mediante diversas técnicas químicas tales como acoplamiento covalente, interacción electrostática, enlaces disulfuro, etc.

Las otras sustancias unidas a las inmunoglobulinas pueden ser lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas o cualquier combinación de los mismos (p. ej., PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también es una inmunoglobulina con la misma secuencia de aminoácidos, pero preparada completamente o parcialmente a partir de aminoácidos no naturales o modificados químicamente.

Las moléculas diseñadas por ingeniería según la presente invención serán útiles como proteínas independientes, así como proteínas de fusión o derivados, más típicamente fusionados de tal manera que formen parte de estructuras de anticuerpos más grandes o moléculas de anticuerpos completas, o partes de las mismas, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv y otros. Será posible utilizar proteínas diseñadas por ingeniería para producir moléculas que sean biespecíficas, triespecíficas y tal vez incluso con más especificidades al mismo tiempo, y será posible al mismo tiempo controlar y preseleccionar la valencia de unión al mismo tiempo según los requisitos del uso planificado de tales moléculas.

También se describe en la presente memoria una inmunoglobulina con al menos una región de bucle además de la conformación de bucle de CDR del dominio variable, caracterizada porque dicha al menos una región de bucle comprende al menos una modificación de aminoácido que forma al menos una región de bucle modificada, en donde dicha al menos una región de bucle modificada se une específicamente a al menos un epítopo de un antígeno.

Se prefiere combinar molecularmente al menos un dominio de anticuerpo modificado, que se une al compañero específico a través de secuencias no variables o un bucle estructural, con al menos otra molécula de unión, que puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro dominio de anticuerpo modificado.

La molécula que funciona como parte de un par de unión específicamente reconocido por la inmunoglobulina según la invención se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en moléculas proteicas, ácidos nucleicos y carbohidratos.

Los bucles o regiones de bucle modificados de las inmunoglobulinas según la invención pueden unirse específicamente a cualquier tipo de moléculas o estructuras de unión, en particular a antígenos, moléculas proteicas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, carbohidratos, lípidos, moléculas orgánicas pequeñas, moléculas inorgánicas, o combinaciones o fusiones de las mismas. Por supuesto, las inmunoglobulinas modificadas pueden comprender al menos dos bucles o regiones de bucles mediante los cuales cada uno de los bucles o regiones de bucles puede unirse específicamente a diferentes moléculas o epítopos.

Según la presente invención, se pueden introducir regiones de unión a antígenos o sitios de unión a antígenos de todo tipo de antígenos de la superficie celular en un bucle estructural de una estructura de anticuerpo dada.

La unión de las inmunoglobulinas según la invención se realiza preferentemente, por un lado, a través de regiones CDR, si la inmunoglobulina contiene una región CDR de este tipo, y, por otro lado, a través de un sitio de unión adicional que se forma modificando al menos dos bucles estructurales. Así, una inmunoglobulina según la invención contiene al menos dos modificaciones en los bucles estructurales de dominios variables a través de al menos dos modificaciones de al menos un dominio variable. Preferiblemente, la inmunoglobulina modificada exhibe así un sitio de unión cambiando la estructura primaria de la proteína o cambiando la estructura terciaria para obtener un sitio de unión específico de conformación.

Por analogía, los dominios variables de inmunoglobulina de cualquier clase de inmunoglobulinas y de inmunoglobulinas de cualquier especie son susceptibles de este tipo de ingeniería. Además, no sólo se pueden manipular los bucles específicos a los que se dirigen los ejemplos de la presente invención, sino que también se puede manipular de la misma manera cualquier bucle que conecte cadenas beta en dominios variables de inmunoglobulina.

Las inmunoglobulinas diseñadas por ingeniería o dominios variables de inmunoglobulina de cualquier organismo y de cualquier clase de inmunoglobulina pueden usarse según la presente invención como tales (como dominios únicos) o como parte de una molécula más grande. Por ejemplo, pueden ser parte de una inmunoglobulina intacta, que, en consecuencia, tendría su región de unión al antígeno "normal" formada por al menos una de las 6 CDR y el nuevo sitio de unión al antígeno diseñado por ingeniería. De esta manera, podría generarse una inmunoglobulina multiespecífica, p. ej., biespecífica o triespecífica. Los dominios de inmunoglobulina diseñados por ingeniería también pueden ser parte de cualquier proteína de fusión.

Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención pueden ser moléculas de anticuerpos completas o parte de anticuerpos, tales como IgG, IgA, IgM, IgD, IgE y similares. Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina de la invención también pueden contener o consistir en un fragmento de anticuerpo funcional tal como Fab, Fab2, scFv, Fv, o partes de los mismos, u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas tales como minicuerpos, dominios de las cadenas pesadas y ligeras de la región variable (tal como Fd, VL, incluyendo Vlambda y Vkappa, VH, VHH), así como minidominios que consisten en dos cadenas beta de un dominio de inmunoglobulina conectadas por al menos dos bucles estructurales (véase, por ejemplo, Laffly et al (2005) Hum Antibodies. 2005;14:33-55), como dominios aislados o en el contexto de moléculas asociadas naturalmente.

La inmunoglobulina modificada según la invención posiblemente se combine además con una o más inmunoglobulinas modificadas o con inmunoglobulinas no modificadas, o partes de las mismas, para obtener una inmunoglobulina combinada. Las combinaciones se obtienen preferentemente mediante técnicas de recombinación, pero también mediante asociación mediante adsorción, interacciones electrostáticas o similares, o también mediante unión química con o sin un conector. La secuencia conectora preferida es una secuencia conectora natural o una secuencia artificial funcionalmente adecuada.

Se entiende que los términos "inmunoglobulina", "péptido de dominio variable de inmunoglobulina" y "dominio variable de inmunoglobulina" también incluyen derivados. Un derivado es cualquier parte o combinación de una o más inmunoglobulinas y/o una proteína de fusión en la que cualquier dominio o minidominio de la inmunoglobulina obtenido según la invención puede combinarse o fusionarse en cualquier posición con uno o más de otros péptidos o proteínas (incluyendo, pero no limitado a, otras inmunoglobulinas, dominios de inmunoglobulina, partes Fc, ligandos, proteínas de armazón, enzimas, toxinas, proteínas séricas y similares). También se puede obtener un derivado de la inmunoglobulina de la invención uniendo la inmunoglobulina modificada o no modificada o el dominio variable de inmunoglobulina de la invención a otras sustancias mediante diversas técnicas químicas tales como acoplamiento covalente, interacción electrostática, enlaces disulfuro, etc.

Las otras sustancias unidas a la inmunoglobulina o al dominio variable de inmunoglobulina pueden ser lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas einorgánicaso cualquier combinación de las mismas (p. ej., PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también es una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina con la misma secuencia de aminoácidos, pero preparado completamente o parcialmente a partir de aminoácidos no naturales, artificiales o modificados químicamente.

Las moléculas diseñadas por ingeniería según la presente invención serán útiles como proteínas independientes, así como proteínas de fusión o derivados, lo más típicamente fusionados antes o después de la modificación de tal manera que formen parte de estructuras de anticuerpos más grandes o moléculas de anticuerpos completas, o partes. del mismo. Las inmunoglobulinas descritas en la presente memoria también pueden consistir así en o comprender fragmentos Fab, fragmentos Fc, fragmentos Fv, anticuerpos de cadena única, en particular fragmentos Fv de cadena única, scFv biespecíficos o multiespecíficos, diacuerpos, multicuerpos, multivalentes o multímeros de dominios de inmunoglobulina y otros. Será posible utilizar las proteínas diseñadas por ingeniería para producir moléculas monoespecíficas, biespecíficas, triespecíficas y moléculas que incluso pueden tener más especificidades. Por consiguiente, es posible controlar y preseleccionar la valencia de unión al mismo tiempo según los requisitos del uso planificado de tales moléculas.

Según la presente invención, se pueden introducir uno o más sitios de unión a antígenos o sitios de unión a antígenos a uno o más antígenos en un bucle estructural o región de bucle de una estructura de dominio variable de anticuerpo dada. Los antígenos pueden ser moléculas de origen natural o moléculas sintetizadas químicamente o moléculas recombinantes, ya sea en solución o en suspensión, p. ej., localizados sobre o dentro de partículas tales como fases sólidas, sobre o dentro de células o sobre superficies virales. Fue sorprendente que la unión de una inmunoglobulina a un antígeno pudiera lograrse según la invención, incluso cuando el antígeno todavía está adherido o unido a moléculas y estructuras que impedirían su unión. Empleando el antígeno diana en su contexto y estructura seleccionados o naturales para seleccionar la inmunoglobulina modificada y diseñada por ingeniería, es posible identificar y obtener aquellas inmunoglobulinas modificadas que sean más adecuadas para fines de uso diagnóstico o terapéutico.

El término "antígeno", tal y como se usa en la presente memoria, comprenderá moléculas seleccionadas del grupo que consiste en alérgenos, antígenos asociados a tumores, autoantígenos incluyendo albúmina, receptores de células T, FcRn, receptores de superficie celular, enzimas, receptores de Fc, proteínas del sistema del complemento, moléculas séricas, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos protozoarios y antígenos virales, también moléculas responsables de la encefalitis espongiforme transmisible (TSE), como priones, infecciosos o no, y marcadores o moléculas que se relacionan con la enfermedad de Alzheimer. Los antígenos pueden ser tomados como diana y unidos por las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención a través de al menos parte de un bucle estructural modificado.

En una realización preferida, la inmunoglobulina se une con sus bucles estructurales modificados específicamente a al menos dos de dichos epítopos que son idénticos o diferentes entre sí, ya sea del mismo antígeno o de antígenos diferentes.

Por ejemplo, el método descrito en la presente memoria se refiere a diseñar por ingeniería una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina que se une específicamente a al menos un primer epítopo y que comprende al menos una modificación en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle de dicha inmunoglobulina, y a determinar la unión específica de dichos bucles o regiones de bucle a al menos un segundo epítopo, seleccionándose el epítopo del grupo de antígenos como se mencionó anteriormente, en donde el bucle o región de bucle estructural no modificado (región que no es de CDR) no se une específicamente a dicho al menos un segundo epítopo.

El término antígeno tal y como se usa según la presente invención incluirá, en particular, todos los antígenos y moléculas diana capaces de ser reconocidos por un sitio de unión de una inmunoglobulina o una estructura de anticuerpo, como una molécula diana completa o como un fragmento de dicha molécula (especialmente subestructuras de dianas, generalmente denominadas "epítopos").

Los antígenos preferidos a los que se dirigen las inmunoglobulinas según la invención son aquellos antígenos o moléculas que ya se ha demostrado que son o pueden ser inmunogénicos, unidos por factores de respuesta inmune o también inmunológicamente o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los cuales se ha ensayado la eficacia clínica.

El término "antígeno" según la presente invención significará moléculas o estructuras que se sabe que interactúan o son capaces de interactuar con la región del bucle de CDR de las inmunoglobulinas. Las regiones de bucle estructural de la técnica anterior que se refieren a anticuerpos nativos no interactúan con antígenos, sino que contribuyen a la estructura general y/o a la unión a moléculas efectoras. Sólo al diseñar por ingeniería bucles estructurales se pueden formar bolsas de unión a antígeno sin la participación de los bucles de CDR o la región CDR.

Según una realización preferida, el antígeno unido por la inmunoglobulina según la invención es un antígeno de la superficie celular. El término "antígenos de la superficie celular" incluirá todos los antígenos o capaces de ser reconocidos por una estructura de anticuerpo en la superficie de una célula, y fragmentos de tales moléculas. Los "antígenos de la superficie celular" preferidos son aquellos antígenos que ya ha demostrado ser o que pueden ser inmunológicamente o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los cuales se ha ensayado una eficacia preclínica o clínica. Para el propósito de la presente invención son específicamente relevantes aquellas moléculas de la superficie celular que median la actividad de destrucción celular. Tras la unión de la inmunoglobulina según la invención a al menos dos de esas moléculas de la superficie celular, el sistema inmune proporciona citólisis o muerte celular, por lo que se puede proporcionar un medio potente para atacar células humanas.

Preferiblemente, el antígeno se selecciona de antígenos de la superficie celular, incluidos receptores, en particular del grupo que consiste en tirosina quinasas receptoras erbB (tales como EGFR, HER2, HER3 y HER4, pero sin limitarse a éstas), moléculas de la superfamilia de receptores de TNF, tales como receptor Apo-1, TNFR1, TNFR2, receptor del factor de crecimiento nervioso NGFR, CD40, moléculas de la superficie de células T, receptores de células T, antígeno de células T OX40, receptor TACI, BCMA, Apo-3, DR4, DR5, DR6, receptores señuelo tales como DcR1, DcR2, CAR1, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1 pero sin limitarse a estas moléculas, antígenos de la superficie de células B, tales como CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, antígenos o marcadores de tumores sólidos o células cancerosas hematológicas, células de linfoma o leucemia, otras células sanguíneas incluidas las plaquetas sanguíneas, pero sin limitarse a estas moléculas.

Según una realización preferida adicional de la presente invención, el antígeno o la molécula que se une al bucle estructural modificado o a la región del bucle se selecciona del grupo que consiste en antígenos asociados a tumores, en particular EpCAM, glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72). , antígeno asociado a tumores CA 125, antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA), antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), antígeno asociado a tumores que expresa carbohidratos relacionados con Lewis Y, antígeno carcinoembrionario (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18 y antígeno asociado a tumores de citoqueratina, antígenos bacterianos, antígenos virales, alérgenos, moléculas relacionadas con alergias IgE, cKIT y receptor de Fc-épsilon I, IRp60, receptor de IL-5, CCR3, receptor de glóbulos rojos (CR1), albúmina sérica humana, albúmina sérica de ratón, albúmina sérica de rata, receptor de Fc-gamma neonatal FcRn, receptores de Fc-gamma Fc-gamma RI, Fc-gamma-RII, Fc-gamma RIII, receptores de Fc-alfa, receptores de Fc-épsilon, fluoresceína, lisozima, receptor similar a toll 9, eritropoyetina, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD64, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, iL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma; TNF-alfa, TNFbeta2, TNFalfa, TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1 , OX40L, receptor T<r>AIL 1, receptor de adenosina A1, receptor beta de linfotoxina, TACI, BAFF-R, E<p>O; LFA-3, ICAM-1, I<c>A<m>-3, integrina beta1, integrina beta2, integrina alfa4/beta7, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa5, integrina alfa6, integrina alfav, integrina alfaVbeta3, FGFR-3, factor de crecimiento de queratinocitos, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-Id, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de células T, B7-1, B7-2, VNRintegrina, TGFbeta1, TGFbeta2, eotaxina1, BLyS (estimulador de linfocitos B), complemento C5, IgE, IgA, IgD, IgM, IgG, factor VII, CBL, NCA 90, E<g>F<r>(ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB -3), Her4 (ErbB4), factor tisular, VEGF, VEGFR, receptor de endotelina, VLA-4, carbohidratos como antígenos de grupos sanguíneos y carbohidratos relacionados, glicosilación de Galili, gastrina, receptores de gastrina, carbohidratos asociados a tumores, Hapteno NP-cap o NIP-cap, receptor de células T alfa/beta, E-selectina, glicoproteína P, MRP3, MRP5, glutatión-S-transferasa pi (proteínas de resistencia a múltiples fármacos), proteína de membrana de gránulos alfa (GMP) 140, digoxina, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP) y fosfatasa alcalina similar a PLAP testicular, receptor de transferrina, heparanasa I, miosina cardíaca humana, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), citomegalovirus humano (HCMV), glicoproteína de la envoltura gH, gp120 del VIH, H<c>M<v>, F de virus respiratorio sincitial RSV, RSVF Fgp, VNRintegrina, Hep B gp120, CMV, gpIIbIIIa, bucle V3 IIIB gp120 de VIH, Fgp de virus respiratorio sincitial (RSV), glicoproteína gD del virus del herpes simple (HSV), glicoproteína gB del HSV, glicoproteína de la envoltura gB del HCMV, toxina de Clostridium perfringens y fragmentos de los mismos.

Preferiblemente, el antígeno se selecciona del grupo que consiste en antígeno patógeno, antígeno asociado a tumor, enzima, sustrato, autoantígeno, molécula orgánica o alérgeno. Los antígenos más preferidos se seleccionan del grupo que consiste en antígenos virales, antígenos bacterianos o antígenos de patógenos deeucariotaso fagos. Los antígenos virales preferidos incluyen virus de HAV, HBV, HCV, VIH I, VIH II, parvovirus, influenza, HSV, virus de la hepatitis, flavivirus, virus del Nilo Occidental, virus del Ébola, virus de la varicela, virus de la viruela, virus del sarampión, virus del herpes, adenovirus, virus del papiloma, virus del polioma, parvovirus, rinovirus, virus coxsackie, virus de la polio, Echovirus, virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la fiebre amarilla, coronavirus, virus respiratorio sincitial, virus de la parainfluenza, virus de La Crosse, virus de Lassa, virus de la rabia, antígenos de rotavirus; los antígenos bacterianos preferidos incluyen antígenos de Pseudomonas, Mycobacterium, Staphylococcus, Salmonella, Meningococcal, Borellia, Listeria, Neisseria, Clostridium, Escherichia, Legionella, Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Moraxella, Brucella, Campylobacter, Cardiobacterium, Francisella, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Vibrio, Chlamydia, Leptospira, Rickettsia, Mycobacterium, Treponema, Bartonella. Los antígenos eucariotas preferidos de eucariotas patógenos incluyen antígenos de Giardia, Toxoplasma, Cyclospora, Cryptosporidium, Trichinella, Levaduras, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Blastomyces, Histoplasma, Coccidioides.

La inmunoglobulina modificada según la presente invención puede unirse preferiblemente a una de las moléculas divulgadas anteriormente. Estas moléculas comprenden también alérgenos y haptenos.

Las subestructuras de antígenos se denominan generalmente ''epítopos'' (p. ej., epítopos de células B, epítopos de células T), siempre que sean inmunológicamente relevantes, es decir, que también sean reconocibles por anticuerpos naturales o monoclonales. El término ''epítopo'' significará una estructura molecular que puede formar completamente una pareja de unión específica o ser parte de una pareja de unión específica al dominio de unión o la inmunoglobulina de la presente invención.

Químicamente, un epítopo puede estar compuesto por un carbohidrato, un péptido, un ácido graso, una sustanciainorgánicao derivados de los mismos y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo es un péptido o polipéptido, normalmente habrá al menos 3 aminoácidos, preferiblemente de 8 a 50 aminoácidos, y más preferiblemente entre aproximadamente 10-20 aminoácidos incluidos en el péptido. No existe un límite superior crítico para la longitud del péptido, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia polipeptídica. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o conformacionales. Un epítopo lineal está compuesto por un único segmento de una secuencia primaria de una cadena polipeptídica. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o superpuestos. Los epítopos conformacionales están compuestos por aminoácidos reunidos mediante el plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal.

Específicamente, los epítopos son al menos parte de moléculas relevantes para el diagnóstico, es decir, la ausencia o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona cualitativa o cuantitativamente con una enfermedad o con el estado de salud o con el estado de un proceso en la fabricación o con el estado ambiental y alimentario. Los epítopos también pueden ser al menos parte de moléculas terapéuticamente relevantes, es decir, moléculas a las que puede dirigirse el dominio de unión específico que cambia el curso de la enfermedad.

Además de los sitios de unión a antígeno de la inmunoglobulina, se pueden introducir capacidades de unión adicionales además de o dentro de las regiones de bucle estructural de dominios variables, p. ej., capacidades de unión a otros antígenos, moléculas pequeñas, a fármacos o enzimas, sitios catalíticos de enzimas o sustratos enzimáticos o la unión a un análogo en estado de transición de un sustrato enzimático.

Preferiblemente, el nuevo sitio de unión a antígeno en los bucles estructurales es extraño al dominio variable de inmunoglobulina no modificado. Por lo tanto, se prefieren dianas extrañas como moléculas efectoras, proteínas séricas o receptores de Fc o receptores de la superficie celular, a los que naturalmente no se unen los dominios variables, como antígenos o moléculas de unión a las que se unen los dominios variables de inmunoglobulina según la invención.

En estocontexto, el término "extraño" significa que el antígeno no es reconocido por la región de unión de CDR específica u otras regiones de unión naturales o intrínsecas de la inmunoglobulina. Por lo tanto, una pareja de unión extraña, pero no la pareja de unión natural de una inmunoglobulina, puede unirse mediante el sitio de unión al antígeno recién formado de un bucle estructural. Esto significa que no se considera que una pareja de unión natural, tal como un receptor de Fc o un efector del sistema inmune, esté unido al sitio de unión al antígeno extraño para la inmunoglobulina no modificada.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "se une específicamente" o "unión específica" se refiere a una reacción de unión, que es determinante del ligando afín de interés en una población heterogénea de moléculas. Por tanto, en condiciones designadas (p. ej., condiciones de inmunoensayo), el dominio variable del anticuerpo especificado se une a su "diana" particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra. La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad o avidez de unión alta, media o baja, según se seleccione. La unión selectiva generalmente se logra si la constante de unión o la dinámica de unión es al menos 10 veces diferente.

El término "sistema de expresión" se refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en unión operativa, de modo que los huéspedes transformados o transfectados con estas secuencias sean capaces de producir las proteínas codificadas. Con el fin de efectuar la transformación, el sistema de expresión puede incluirse en un vector; sin embargo, el ADN relevante también puede integrarse en el cromosoma del huésped. Alternativamente, un sistema de expresión se puede utilizar para la transcripción/traducción in vitro.

Un "bucle estructural" o "bucle que no es de CDR" como se hace referencia en la presente memoria debe entenderse de la siguiente manera: las inmunoglobulinas están formadas por dominios con un llamado pliegue de inmunoglobulina. En esencia, las láminas beta antiparalelas están conectadas mediante bucles para formar un barril beta antiparalelo comprimido. En la región variable, algunos de los bucles de los dominios contribuyen esencialmente a la especificidad del anticuerpo, es decir, a la unión a un antígeno. Estos bucles se denominan bucles de CDR.

Los bucles de CDR están localizados dentro de la región de bucles de CDR, que en algunos casos también puede ser la región marco variable (llamada "VFR") adyacente a los bucles de CDR. Se sabe que las VFR pueden contribuir al bolsillo de unión al antígeno de un anticuerpo, que generalmente está determinado principalmente por los bucles de CDR. Por lo tanto, esas VFR se consideran parte de la región del bucle de CDR y no se usarían apropiadamente para el propósito descrito en la presente memoria. Al contrario de aquellas VFR dentro de la región del bucle de CDR o localizados proximales a los bucles de CDR, otras VFR de dominios variables serían particularmente adecuadas para usarse como se describe en la presente memoria. Esos son los bucles estructurales de las VFR localizados opuestos a la región del bucle de CDR, o en el lado C-terminal de un dominio de inmunoglobulina variable.

Todos los bucles de los dominios variables del anticuerpo fuera de la región del bucle de CDR contribuyen más bien a la estructura de la molécula. Estos bucles se definen en la presente memoria como bucles estructurales o bucles que no son de CDR.

Toda la numeración de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas se realiza según el esquema de numeración IMGT (IMGT, el sistema de información internacional ImMunoGeneTics@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29:185-203).

El dominio variable modificado de la invención es de origen humano o una versión humanizada de un dominio variable de cualquier especie.

Un dominio variable de inmunoglobulina humanizado tiene al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente un 55 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina humana nativa.

Un dominio variable de inmunoglobulina humanizado tiene además al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente un 55 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos cuando se comparan todos los aminoácidos accesibles en la superficie con los aminoácidos accesibles en la superficie de una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana nativa.

La homología o identidades de secuencia preferidas se relacionan específicamente con aquellas secuencias de la región marco.

La inmunoglobulina preferida según la invención comprende un dominio que tiene al menos un 50 % de homología con el dominio no modificado.

El término "homología" indica que los polipéptidos tienen residuos iguales o conservados en una posición correspondiente en su estructura primaria, secundaria o terciaria. El término también se extiende a dos o más secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos homólogos.

"Dominio de inmunoglobulina homólogo" significa un dominio de inmunoglobulina según la invención que tiene al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de dominio de inmunoglobulina de secuencia nativa de longitud completa o cualquier otro fragmento de una secuencia de dominio de inmunoglobulina de longitud completa como se divulga en la presente memoria. Preferiblemente, un dominio de inmunoglobulina homólogo tendrá al menos aproximadamente un 50 % de identidad de secuencia de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente un 55 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de dominio de inmunoglobulina nativa, o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de dominio de inmunoglobulina de longitud completa como se divulga en la presente memoria.

El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del dominio de inmunoglobulina identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina específica, después de alinear la secuencia e introduciendo huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y no considerando ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de diversas maneras que están dentro de los conocimientos especializados en la técnica, por ejemplo, utilizando software informático disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluido cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando.

Los valores de % de identidad de secuencia de aminoácidos se pueden obtener como se describe a continuación utilizando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). La mayoría de los parámetros de búsqueda de WU-BLAST-2 están configurados con los valores por defecto. Aquellos que no están configurados con valores por defecto, es decir, los parámetros ajustables, se configuran con los siguientes valores: intervalo de superposición = 1, fracción de superposición = 0,125, umbral de palabra (T) = 11 y matriz de puntuación = BLOSUM62. Cuando se emplea WU-BLAST-2, se determina un valor de % de identidad de secuencia de aminoácidos dividiendo (a) el número de residuos de aminoácidos idénticos coincidentes entre la secuencia de aminoácidos del dominio variable de inmunoglobulina de interés que tiene una secuencia derivada del dominio variable de inmunoglobulina nativo y, la secuencia de aminoácidos de comparación de interés (es decir, la secuencia con la que se compara el dominio variable de inmunoglobulina de interés, que puede ser el dominio variable de inmunoglobulina no modificado) según lo determinado por WU-BLAST-2 por (b) el número total de residuos de aminoácidos de las partes no aleatorias del dominio variable de inmunoglobulina de interés. Por ejemplo, en la expresión "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos X que tiene o tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos Y", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del dominio variable de inmunoglobulina de interés.

En una realización preferida, el polipéptido según la invención es un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo biespecífico de cadena única o un Fab biespecífico o un sdAb biespecífico. Se prefiere aún más que el polipéptido comprenda un dominio biespecífico o una parte del mismo. Los ejemplos específicos se refieren a moléculas Fab o dAb con funcionalidad adicional a través del nuevo sitio de unión en el lado opuesto de la región CDR. La inmunoglobulina preferida según la invención, que es una molécula Fab, puede contener, por ejemplo, uno o dos sitios de unión adicionales en el lado del bucle C-terminal de un dominio CH1 y/o CL. La inmunoglobulina preferida según la invención, que es una molécula dAb, puede contener, por ejemplo, un sitio de unión adicional en el lado del bucle C-terminal de un dominio Vh, Vhh o Vl. Mediante dichos sitios de unión adicionales se pueden agregar funcionalidades adicionales a las moléculas, como una semivida prolongada (p. ej., a través de la unión a un FcRn o proteínas séricas, como albúmina o IgG), o función efectora (p. ej., a través de la unión a receptores de células T, C1q o CD64). Según tales ejemplos, las bibliotecas Fab o dAb específicas se prepararían con un tamaño apropiado para permitir la selección de los ligantes específicos para las parejas de unión específicas.

El dominio variable preferido según la invención se selecciona del grupo de VH, VL, incluidos Vkappa y Vlambda, VHH y combinaciones de los mismos. Resultó que esas modificaciones presentan una ventaja específica cuando se introducen en los bucles de un VH, un Vkappa, un Vlambda o un VHH, y los bucles modificados comprenden al menos una modificación dentro de los aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 o aminoácidos 106 a 117.

Los bucles estructurales de la inmunoglobulina o dominio variable de la inmunoglobulina de origen humano o humanizado modificados según la invención se seleccionan preferentemente entre los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 y aminoácidos 89 a 101, lo más preferiblemente las posiciones de aminoácidos 12 a 17, posiciones de aminoácidos 45 a 50, posiciones de aminoácidos 69 a 75 y posiciones de aminoácidos 93 a 98.

En otra realización preferida, una modificación en los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 93 a 98 se combina con una modificación en los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 8 a 20.

Las regiones de aminoácidos identificadas anteriormente de las respectivas inmunoglobulinas son bucles o regiones de bucles especificadas como adecuadas para fines de modificación. Preferiblemente, las combinaciones de tales modificaciones, p. ej., en al menos dos de los bucles o regiones de bucle especificados, se diseñan por ingeniería en la inmunoglobulina según la invención.

Preferiblemente, una modificación en el bucle estructural o región de bucle que comprende los aminoácidos 93 a 98 se combina con una modificación en uno o más de los otros bucles estructurales.

En una realización preferida, una modificación en el bucle estructural o región de bucle que comprende los aminoácidos 93 a 98 se combina con una modificación en la región de bucle estructural que comprende los aminoácidos 69 a 75.

Lo más preferiblemente, cada uno de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 93 a 98, aminoácidos 69 a 75 y aminoácidos 8 a 20 contienen al menos una modificación de aminoácido.

En otra realización preferida, cada uno de los bucles estructurales que comprenden los aminoácidos 93 a 98, aminoácidos 69 a 75, aminoácidos 44 a 50 y aminoácidos 8 a 20 contienen al menos una modificación de aminoácido.

Los dominios variables de origen camélido o variantes humanizadas de origen camélido, tienen la ventaja de que podrían combinarse fácilmente con otros dominios variables, por ejemplo, con otros VHH de origen camélido, modificados o nativos. La posible combinación de VHH de origen camélido es la base de las inmunoglobulinas multivalentes. Así, los dominios variables modificados específicos de origen camélido son combinaciones multivalentes, preferiblemente con al menos 3, más preferiblemente con al menos 4 o 5 valencias o VHH.

Preferiblemente, los nuevos sitios de unión a antígeno en los bucles estructurales se introducen en la inmunoglobulina codificada por el ácido nucleico seleccionado mediante sustitución, deleción y/o inserción de al menos un nucleótido.

Según otra realización preferida de la presente invención, la modificación de al menos un nucleótido en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle da como resultado una sustitución, deleción y/o inserción en la inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina codificado por dicho ácido nucleico.

La modificación de los al menos dos bucles o regiones de bucle de un dominio variable de inmunoglobulina o anticuerpo puede dar como resultado una sustitución, deleción y/o inserción de 2 o más aminoácidos, preferiblemente mutaciones puntuales, cambio de aminoácidos de bucles completos, más preferiblemente el cambio de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, hasta 30 aminoácidos. Sin embargo, el número máximo de aminoácidos insertados en bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina no puede exceder en casos específicos el número de 30, preferiblemente 25, más preferiblemente 20, aminoácidos.

De este modo, la secuencia modificada comprende aminoácidos no incluidos en las regiones conservadas de los bucles estructurales, siendo los aminoácidos recién introducidos de origen natural, pero extraños al sitio de modificación, o sustitutos de aminoácidos de origen natural. Cuando el aminoácido extraño se selecciona de un grupo específico de aminoácidos, tal como aminoácidos con polaridad específica, o hidrofobicidad, se puede obtener una biblioteca enriquecida en el grupo específico de aminoácidos en las posiciones aleatorias. Dichas bibliotecas también se denominan bibliotecas "focalizadas".

Los al menos dos bucles o regiones de bucles se mutan o modifican preferiblemente mediante métodos de mutagénesis aleatoria, semialeatoria o, en particular, aleatoria dirigida al sitio.

Un método preferido para introducir modificaciones es la mutación aleatoria dirigida al sitio. Con este método, se intercambian o introducen dos o más residuos de aminoácidos específicos de los bucles utilizando inserciones generadas aleatoriamente en dichos bucles estructurales. Alternativamente, se prefiere el uso de enfoques combinatorios.

En otra realización preferida, al menos tres bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o de un dominio variable de inmunoglobulina se mutan o modifican mediante métodos de mutagénesis aleatoria, semialeatoria o, en particular, aleatoria dirigida al sitio.

Estos métodos pueden usarse para realizar modificaciones de aminoácidos en posiciones deseadas de las inmunoglobulinas o del dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención. En estos casos, las posiciones se eligen al azar o los cambios de aminoácidos se realizan siguiendo ciertas reglas. Por ejemplo, ciertos residuos pueden mutarse a cualquier aminoácido, mientras que otros residuos pueden mutarse a un conjunto restringido de aminoácidos. Esto se puede lograr por etapas alternando ciclos de mutación y selección o simultáneamente.

La molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente puede comprender las unidades repetitivas identificadas en la presente memoria, que codifican todos los aminoácidos naturales conocidos o un subconjunto de los mismos. Aquellas bibliotecas que contienen secuencias modificadas en donde se utiliza un subconjunto específico de aminoácidos con fines de modificación se denominan bibliotecas "focalizadas". Los miembros de dichas bibliotecas tienen una mayor probabilidad de que un aminoácido de dicho subconjunto esté en la posición modificada, que es al menos dos veces mayor de lo habitual, preferiblemente al menos 3 veces o incluso al menos 4 veces mayor. Dichas bibliotecas también tienen un número limitado o menor de miembros de la biblioteca, de modo que el número real de miembros de la biblioteca alcanza el número teórico de miembros de la biblioteca. En algunos casos, el número de miembros de la biblioteca de una biblioteca focalizada no es inferior a 103 veces el número teórico, preferiblemente no es inferior a 102 veces, más preferiblemente no es inferior a 10 veces.

Una biblioteca puede diseñarse como una biblioteca que contiene o consiste en miembros de la biblioteca de un formato de inmunoglobulina específico. Aquellas bibliotecas que consisten en un formato molecular específico deinmunoglobulinase denominan en la presente memoria biblioteca especializada.

Las bibliotecas especializadas contienen preferiblemente la mayoría de los formatos específicos, al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 60 %, más preferiblemente al menos un 70 %, más preferiblemente al menos un 80 %, más preferiblemente al menos un 90 %, o aquellas que consisten esencialmente en formatos específicos de anticuerpos. Se prefieren formatos específicos de anticuerpos, de modo que la biblioteca se selecciona del grupo que consiste en una biblioteca de VH, una biblioteca de VHH, una biblioteca de Vkappa, una biblioteca de Vlambda, una biblioteca de Fab, una biblioteca de CH1/CL y una biblioteca de CH3. Se prefieren especialmente las bibliotecas caracterizadas por el contenido de moléculas compuestas que contienen más de un dominio de anticuerpo, tal como una biblioteca de IgG.

Sin embargo, el número máximo de aminoácidos insertados en un bucle o región de bucle de una inmunoglobulina preferiblemente no puede exceder el número de 30, preferiblemente 25, más preferiblemente 20 aminoácidos como máximo. La sustitución y la inserción de los aminoácidos se produce preferiblemente de forma aleatoria o semialeatoria usando todos los aminoácidos posibles o una selección de aminoácidos preferidos con fines de aleatorización, mediante métodos conocidos en la técnica y como se describe en la presente memoria.

El sitio de modificación es al menos dos bucles estructurales. Una región de bucle está compuesta de al menos dos, preferiblemente al menos 3 o al menos 4 bucles que son adyacentes entre sí, y que pueden contribuir a la unión de un antígeno mediante la formación de un sitio de unión al antígeno o bolsillo de unión al antígeno. Se prefiere que los sitios de modificación estén localizados dentro del área de 10 aminoácidos, más preferiblemente dentro de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 hasta 100 aminoácidos, en particular dentro de una región de bucle estructural para formar una superficie o bolsillo donde el antígeno puede acceder estéricamente a las regiones del bucle.

Los al menos dos bucles se mutan o modifican preferiblemente para producir bibliotecas, preferiblemente mediante métodos de mutagénesis aleatoria, semialeatoria o, en particular, mediante mutagénesis aleatoria dirigida al sitio, en particular para delecionar, intercambiar o introducir insertos generados aleatoriamente en bucles estructurales. Alternativamente, se prefiere el uso de enfoques combinatorios. Se puede emplear cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, entre ellos la mutagénesis en casete. Estos métodos pueden usarse para realizar modificaciones de aminoácidos en posiciones deseadas de la inmunoglobulina de la presente invención. En algunos casos, las posiciones se eligen al azar, p. ej., con cualquiera de los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para aleatorizar secuencias de bucle, o los cambios de aminoácidos se realizan utilizando reglas simplistas. Por ejemplo, todos los residuos se pueden mutar preferiblemente a aminoácidos específicos, tales como alanina, denominado barrido de aminoácidos o alanina. Dichos métodos pueden acoplarse con enfoques de ingeniería más sofisticados que emplean métodos de selección para cribar niveles más altos de diversidad de secuencias.

En la presente memoria se describe una molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente que codifica una inmunoglobulina, un dominio de inmunoglobulina o una parte del mismo que comprende al menos una unidad repetida de nucleótidos dentro de una región codificante de bucle estructural que tiene la secuencia 5'-NNS-3', 5'-NNN- 3', 5'-NNB-3' o 5'-NNK-3'. En algunas realizaciones, el ácido nucleico modificado comprende codones de nucleótidos seleccionados del grupo de TMT, WMT, BMT, RMC, RMG, MRT, SRC, KMT, RST, YMT, MKC, RSA, RRC, NNK, NNN, NNS o cualquier combinación de los mismos. (la codificación es según IUPAC).

La molécula de ácido nucleico modificada aleatoriamente puede comprender las unidades repetitivas identificadas anteriormente, que codifican todos los aminoácidos naturales conocidos o un subconjunto de los mismos.

La modificación de la molécula de ácido nucleico se puede realizar introduciendo oligonucleótidos sintéticos en un segmento más grande de ácido nucleico o mediante síntesisde novode una molécula de ácido nucleico completa. La síntesis de ácido nucleico se puede realizar con bloques de construcción de trinucleótidos que reducirían el número de combinaciones de secuencias sin sentido si se va a codificar un subconjunto de aminoácidos (p. ej., Yanez et al. Nucleic Acids Res. (2004) 32:e158; Virnekas et al. Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607)

Preferiblemente, las posiciones que se van a modificar son aminoácidos expuestos en la superficie. La exposición en la superficie de los aminoácidos de los bucles estructurales se puede juzgar a partir de estructuras proteicas conocidas de dominios variables de anticuerpos y por analogía u homología para aquellas secuencias de aminoácidos para las que no está disponible ninguna estructura determinada experimentalmente.

En una realización preferida de la invención, las modificaciones introducidas en los al menos dos bucles estructurales comprenden al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos extraños o aminoácidos que no se encuentran naturalmente en el sitio respectivo del bucle estructural de la inmunoglobulina no modificada o dominio variable de inmunoglobulina.

La modificación de aminoácidos puede estar preferentemente sesgada con el fin de introducir en bucles estructurales o regiones de bucles aminoácidos que se sabe que están frecuentemente implicados en interacciones proteínaproteína (p. ej., Lea y Stewart (1995) FASEB J. 9:87-93; Fellhouse et al. (2006) J. Mol. Biol. 357:100-114; Adib-Conquuy et al. (1998) International Immunology 10:341-346; Lo Conte et al. (1999) J. Mol. Biol. 285:2177-2198; Zemlin et al. (2003) J. Mol. Biol. 334:733-749).

Una inmunoglobulina que se puede obtener mediante el método descrito en la presente memoria se puede usar para la preparación de una biblioteca presentando o codificando los miembros de la biblioteca las inmunoglobulinas según la invención, específicamente una biblioteca de proteínas, proteínas de fusión, células, en particular células microbianas, como células de bacterias o levaduras, fagos, virus, ácidos nucleicos o ribosomas.

La siguiente memoria descriptiva no sólo se refiere a bibliotecas de variantes de polipéptidos o proteínas, sino, por supuesto, también a las bibliotecas alternativas utilizadas para expresar las inmunoglobulinas según la invención, p. ej., como se ha mencionado anteriormente.

Se puede usar una biblioteca de variantes de polipéptidos que comprenden inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas de la invención como un conjunto para la selección en donde las modificaciones contienen o introducen al menos uno, más preferiblemente al menos dos aminoácidos por bucle estructural modificado fuera del grupo de aminoácidos triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparagina.

Resultó que, según la invención, se puede dotar a un polipéptido de dominio variable variante con mutaciones específicas que son extrañas para los polipéptidos nativos. Cualquiera de los aminoácidos triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina yasparaginano están presentes en los bucles estructurales de las inmunoglobulinas humanas nativas, por lo que se consideran "extraños". Un polipéptido variante según la invención puede contener al menos dos de dichos aminoácidos extraños en los bucles estructurales, mediante modificación de al menos dos bucles estructurales y para formar un sitio de unión.

Si la inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina es de origen humano o un dominio variable de inmunoglobulina humanizado, las modificaciones preferidas son la incorporación de al menos una tirosina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 50, 69 a 75 y 93 a 98 y/o al menos un triptófano en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 50, 69, 71 a 75 y 93 a 94 y 96 a 98, y/o al menos una histidina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 46, 47, 49, 50, 69 a 74 y 93 a 98, y/o al menos una asparagina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 45 a 47, 49, 50, 70 a 73, 75, 94 a 96 y 98, y/o al menos una metionina en una cualquiera de las posiciones 12 a 17, 46 a 50, 69 a 71, 73 a 75, 93, 95, 96 y 98, y/o al menos una serina en una cualquiera de las posiciones 13, 71,75, 94, 95 y 98, y/o al menos una isoleucina en una cualquiera de las posiciones 12, 14 a 17, 45 a 50, 69, 70, 72 a 75, 93 y 96 a 98, y/o al menos una fenilalanina en una cualquiera de las posiciones 15, 46, 48, 70 a 73, 75, 93, 95 y 98.

Según otra realización preferida de la presente invención, se modifican al menos dos residuos de aminoácidos en las posiciones 15 a 17, 29 a 34, 85,4 a 85,3, 92 a 94, 97 a 98 y/o 108 a 110 de un anticuerpo de dominio único humano o humanizado.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las inmunoglobulinas modificadas o los dominios variables de inmunoglobulina (y siempre incluidas en toda la memoria descriptiva: inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulina que comprenden un dominio variable de inmunoglobulina modificado) pueden clonarse en células huésped, expresarse y analizarse para determinar sus especificidades de unión. Estas prácticas se llevan a cabo utilizando procedimientos bien conocidos, y una variedad de métodos que pueden encontrar uso en la presente invención se describen en Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001), y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Los ácidos nucleicos que codifican las inmunoglobulinas modificadas o los dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención pueden incorporarse en un vector de expresión con el fin de expresar dichas inmunoglobulinas. Los vectores de expresión comprenden típicamente una inmunoglobulina unida operativamente - es decir, colocada en una relación funcional - con secuencias reguladoras o de control, marcadores seleccionables, cualquier compañero de fusión y/o elementos adicionales. Las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se pueden producir cultivando una célula huésped transformada con ácido nucleico, preferiblemente un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica las inmunoglobulinas modificadas, en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de las inmunoglobulinas modificadas. Los métodos para introducir moléculas exógenas de ácido nucleico en un huésped son bien conocidos en la técnica y variarán según el huésped utilizado. Por supuesto, también se pueden emplear sistemas de expresión no celulares o exentos de células para la expresión de inmunoglobulinas modificadas.

Las inmunoglobulinas modificadas pueden purificarse o aislarse después de la expresión. Las inmunoglobulinas modificadas se pueden aislar o purificar de diversas formas conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos de purificación estándar incluyen técnicas cromatográficas, electroforéticas, inmunológicas, de precipitación, diálisis, filtración, concentración y técnicas de cromatoenfoque. La purificación a menudo puede ser habilitada por una pareja de fusión en particular. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar usando resina de glutatión si se emplea una fusión con GST, cromatografía de afinidad de Ni2+ si se emplea una etiqueta His o anticuerpo anti-flag inmovilizado si se usa una etiqueta flag. Para obtener una orientación general sobre técnicas de purificación adecuadas, véase, p. ej., Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice ", 1994, 3a ed., Springer-Science and Business Media Inc., NY o Roe, " Protein Purification Techniques: A Practical Approach ", 2001, Oxford University Press. Por supuesto, también es posible expresar las inmunoglobulinas modificadas según la presente invención en la superficie de un huésped, en particular en la superficie de una célula bacteriana, de insecto o de levadura o en la superficie de fagos o virus.

Las inmunoglobulinas modificadas de la invención se pueden cribar usando una variedad de métodos, incluidos, pero no limitados a, aquellos que usan ensayos in vitro, ensayos in vivo y basados en células, y tecnologías de selección. En los procedimientos de detección se pueden utilizar tecnologías de cribado de alto rendimiento y automatización. El cribado puede emplear el uso de un compañero de fusión o marcador, por ejemplo, una enzima, un marcador inmune, un marcador isotópico o un marcador de molécula pequeña tal como un tinte fluorescente o colorimétrico o una molécula luminógena.

Las propiedades funcionales y/o biofísicas de las inmunoglobulinas pueden cribarse en un ensayo in vitro. Se puede cribar la funcionalidad del anticuerpo, por ejemplo, su capacidad para catalizar una reacción o su especificidad de unión, reactividad cruzada y/o afinidad para su diana.

Los dominios de inmunoglobulina modificados favorables pueden seleccionarse in vivo, p. ej., introduciéndolos en una célula o en un organismo. Las variantes de unión específica pueden aislarse de fluidos corporales tales como sangre o líquido linfático o de órganos específicos, dependiendo de las propiedades requeridas de los dominios modificados.

Los ensayos pueden emplear una variedad de métodos de detección que incluyen, pero no se limitan a, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos.

Como es bien conocido en la técnica, existe una variedad de tecnologías de selección que pueden usarse para la identificación y aislamiento de proteínas con ciertas características y afinidades de unión, incluyendo, por ejemplo, tecnologías de presentación tales como presentación en fagos, presentación en ribosomas, presentación en la superficie celular, y similares, como se describe a continuación. Los métodos para la producción y cribado de variantes de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Los métodos generales para la biología molecular, expresión, purificación y cribado de anticuerpos se describen en Antibody Engineering, editado por Duebel y Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst y Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard y Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

Como se sabe en la técnica, algunos métodos de cribado seleccionan miembros favorables de una biblioteca. Los métodos se denominan en la presente memoria "métodos de selección" y estos métodos encuentran uso en el cribado de inmunoglobulinas modificadas. Cuando se criban bibliotecas de dominios variables de inmunoglobulinas variantes utilizando un método de selección, sólo se propagan, aíslan y/u observan aquellos miembros de una biblioteca que son favorables, es decir, que cumplen algunos criterios de selección. Como se apreciará, debido a que sólo se observan las variantes más aptas, tales métodos permiten el cribado de bibliotecas que son más grandes que aquellas que pueden ser cribadas mediante métodos que analizan la aptitud de los miembros de la biblioteca individualmente. La selección está habilitada por cualquier método, técnica o compañero de fusión que una, covalentemente o no covalentemente, el fenotipo de las inmunoglobulinas con su genotipo, que es la función de un anticuerpo con el ácido nucleico que lo codifica. Por ejemplo, el uso de presentación en fagos como método de selección se permite mediante la fusión de miembros de la biblioteca con una proteína de cubierta de fago (la más frecuentemente utilizada es la proteína del gen III del bacteriófago filamentoso, aunque también pueden usarse otras proteínas de cubierta tales como proteína VIII, proteína VII, proteína VI y proteína IX). De esta manera, la selección o aislamiento de inmunoglobulinas modificadas que cumplen algunos criterios, por ejemplo, afinidad de unión a la diana de la inmunoglobulina, también selecciona o aísla el ácido nucleico que la codifica. Una vez aislados, se pueden amplificar el gen o los genes que codifican las inmunoglobulinas modificadas. Este proceso de aislamiento y amplificación, denominado reconocimiento y selección, puede repetirse, lo que permite enriquecer variantes favorables del dominio variable del anticuerpo en la biblioteca. La secuenciación del ácido nucleico del ácido nucleico unido permite en última instancia la identificación de genes.

Se conocen en la técnica una variedad de métodos de selección que pueden ser útiles en el cribado de bibliotecas de inmunoglobulinas o de dominios variables de inmunoglobulinas. Estos incluyen, pero no se limitan a, la presentación de fagos (Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif., 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317) y sus derivados como la infección selectiva por fagos (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551), fago selectivamente infectivo (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630) y reconocimiento y selección de infectividad retardada (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), presentación en la superficie celular (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) como la presentación en bacterias (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80), levadura (Bader y Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder y Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557), y células de mamíferos (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), así como tecnologías de presentación in vitro (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405) como la presentación en polisomas (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026), presentación en ribosomas (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942), presentación en ARNm (Roberts y Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405-408), y el sistema de presentación e inactivación de ribosomas (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

Otros métodos de selección incluyen métodos que no se basan en la presentación, como métodos in vivo que incluyen, pero no se limitan a, expresión periplásmica y detección citométrica (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542), el ensayo de complementación de fragmentos de anticuerpos (Johnsson y Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146), y el cribado de dos híbridos en levadura (Fields y Song, 1989, Nature 340:245-246) utilizado en el modo de selección (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728). En una realización alternativa, la selección es posible mediante un compañero de fusión que se une a una secuencia específica en el vector de expresión, uniendo así covalentemente o no covalentemente el compañero de fusión y el miembro asociado de la biblioteca de inmunoglobulinas con el ácido nucleico que los codifica. Por ejemplo, el documento WO9308278 describe dicha técnica y compañero de fusión. En una realización alternativa, la selección in vivo puede ocurrir si la expresión del anticuerpo imparte alguna ventaja de crecimiento, reproducción o supervivencia a la célula.

Algunos métodos de selección se denominan métodos de "evolución dirigida". Estos métodos incluyen el apareamiento o reproducción de secuencias favorables durante la selección, a veces con la incorporación de nuevas mutaciones. Como apreciarán los expertos en la técnica, los métodos de evolución dirigida pueden facilitar la identificación de las secuencias más favorables en una pluralidad de polipéptidos y pueden aumentar la diversidad de secuencias que se criban. Se conocen en la técnica una variedad de métodos de evolución dirigida que pueden ser útiles para generar y cribar variantes de dominio variable de anticuerpos, que incluyen, pero no se limitan a, intercambio de ADN (PCT WO00/42561; PCT WO 01/70947), intercambio de exones (Kolkman y Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), intercambio de familias (Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291), aleatorización combinatoria selectiva (WO03012100, WO04018674A1), Quimeragénesis aleatoria en moldes transitorios (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354-359), recombinación in vitro por evolución molecular mediante proceso de extensión escalonada (StEP) (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683), ensamblaje de genes mediado por exonucleasa (Pat. de EE. UU.No. 6.352.842; Pat. de EE. UU. No. 6.361.974), mutagénesis por saturación del sitio génico ( Pat. de EE. UU. No. 6.358.709), reensamblaje de genes (Pat. de EE. UU. No. 6.358.709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253), métodos de fragmentación del ADN (Kikuchi et al., Gene 236:159-167), mezcla de ADN monocatenario (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137), y tecnología de ingeniería de anticuerpos de evolución dirigida (Applied Molecular Evolution) (Pat. de EE. UU. No. 5.824.514; Pat. de EE. UU. No.

5.817.483; Pat. de EE. UU. No. 5.814.476; Pat. de EE. UU. No. 5.763.192; Pat. de EE. UU. No. 5.723.323).

Las inmunoglobulinas o variantes de dominio variable de anticuerpos pueden cribarse usando uno o más ensayos basados en células o in vivo. Para tales ensayos, típicamente se añaden de forma exógena inmunoglobulinas modificadas purificadas o no purificadas o dominios variables de inmunoglobulina de manera que las células se exponen a inmunoglobulinas individuales o dominios variables de inmunoglobulina modificados o conjuntos de dominios variables de inmunoglobulina modificados que pertenecen a una biblioteca. Estos ensayos se basan típicamente, pero no siempre, en la función deseada de la inmunoglobulina o del dominio variable de inmunoglobulina; es decir, la capacidad del anticuerpo o dominio variable del anticuerpo modificado según la invención para unirse a su diana y mediar algún evento bioquímico, por ejemplo, función efectora, inhibición de la unión de ligando/receptor, apoptosis y similares. Dichos ensayos a menudo implican monitorizar la respuesta de las células al dominio variable del anticuerpo, por ejemplo, supervivencia celular, muerte celular, cambio en la morfología celular o activación transcripcional tal como la expresión celular de un gen natural o gen informador. Por ejemplo, tales ensayos pueden medir la capacidad de variantes de dominios de inmunoglobulina variables para incitar ADCC, ADCP o CDC. Para algunos ensayos, puede ser necesario añadir células o componentes adicionales, es decir, además de las células diana, por ejemplo, complemento sérico o células efectoras tales como monocitos de sangre periférica (PBMC), células NK, macrófagos y similares. Dichas células adicionales pueden ser de cualquier organismo, preferiblemente seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Las inmunoglobulinas pueden provocar la apoptosis de determinadas líneas celulares que expresan la diana, o pueden mediar el ataque a las células diana por parte de células inmunes que se han añadido al ensayo. Los métodos para monitorizar la muerte o viabilidad celular se conocen en la técnica e incluyen el uso de colorantes, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, los ensayos de tinción con caspasa pueden permitir medir la apoptosis, y la captación o liberación de sustratos radiactivos o tintes fluorescentes puede permitir monitorizar el crecimiento o la activación celular.

Alternativamente, las células diana muertas o dañadas pueden monitorizarse midiendo la liberación de uno o más componentes intracelulares naturales, p. ej., lactato deshidrogenasa. La activación transcripcional también puede servir como método para ensayar la función en ensayos basados en células. En este caso, la respuesta se puede monitorizar ensayando genes naturales que pueden estar regulados al alza, por ejemplo, se puede medir la liberación de ciertas interleuquinas o, alternativamente, la lectura se puede realizar a través de un sistema informador. Los ensayos basados en células también pueden implicar la medición de cambios morfológicos de las células como respuesta a la presencia de dominios variables de inmunoglobulina modificados. Los tipos de células para tales ensayos pueden ser procariotas o eucariotas, y se puede emplear una variedad de líneas celulares conocidas en la técnica.

Alternativamente, se pueden realizar cribados basados en células usando células que han sido transformadas o transfectadas con ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de inmunoglobulina variantes. En este caso, las variantes del dominio variable del anticuerpo de la invención no se añaden exógenamente a las células (p. ej., Auf der Maur, 2004, Methods, 34:215-224). En otro método alternativo, el cribado basado en células utiliza una presentación en la superficie de las células. Se puede emplear un compañero de fusión que permita la presentación de dominios variables de inmunoglobulina modificados en la superficie de las células (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

La inmunogenicidad de las inmunoglobulinas modificadas se puede cambiar y determinar experimentalmente usando uno o más ensayos inmunológicos o basados en células (p. ej., Koren et al., 2002, Current Pharmaceutical Biotechnology 3:349-360; Chirino et al., 2004, Drug Discovery Today 9:82-90; Tangri et al., 2005, J. Immunol.

174:3187-3196; Hermeling et al., 2004, Pharm. Res. 21:897-903). Por ejemplo, se utilizan ensayos de activación de células T ex vivo para cuantificar experimentalmente la inmunogenicidad. En este método, las células presentadoras de antígenos y las células T sin activar de donantes compatibles se pulsan con un péptido o anticuerpo completo o inmunoglobulina de interés una o más veces. La activación de las células T se puede detectar usando varios métodos, p. ej., mediante la monitorización de la liberación de citoquinas o la medición de la captación de timidina tritiada. La tecnología LUMINEX se puede utilizar para medir la liberación de citoquinas (p. ej., de Jager et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2003, 10:133-139) o la producción de interferón gamma se monitoriza usando ensayos Elispot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24).

Las propiedades biológicas o funcionales de las inmunoglobulinas modificadas o de los dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención se pueden caracterizar en experimentos con células, tejidos y organismos completos. Como se sabe en la técnica, los fármacos a menudo se ensayan en animales, incluidos, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, con el fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad. o para medir la farmacocinética, la toxicidad y otras propiedades de un fármaco. Los animales pueden denominarse modelos de enfermedades. Los agentes terapéuticos a menudo se ensayan en ratones, incluidos, pero no limitados a, ratones desnudos, ratones SCID, ratones con xenoinjerto y ratones transgénicos (incluidos mutantes con activación e inactivación genética). Tal experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial de la variante polipeptídica para usarse como un agente terapéutico. Para los ensayos se puede utilizar cualquier organismo, preferiblemente mamíferos. Debido a su similitud genética con los seres humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados y, por tanto, pueden usarse para ensayar la eficacia, toxicidad, farmacocinética u otras propiedades de las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención. La mayoría de las veces se requiere ensayar candidatos a fármacos en seres humanos para su aprobación como agentes terapéuticos y, por lo tanto, por supuesto, se contemplan estos experimentos. Por lo tanto, las inmunoglobulinas modificadas o los dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención se pueden ensayar en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, inmunogenicidad, farmacocinética, farmacodinamia y/u otras propiedades clínicas.

La inmunoglobulina según la presente invención se puede utilizar para cualquier fin conocido en la técnica para las inmunoglobulinas, pero también permite aplicaciones que dependen de la combinación de especificidades introducidas por la presente invención.

En una realización, la variante de anticuerpo de la presente invención es para su uso en terapia o profilaxis, para su uso preparativo o analítico, como diagnóstico, compuesto industrial o reactivo de investigación, preferiblemente un agente terapéutico. La variante de anticuerpo puede encontrar uso en una composición de anticuerpo que sea monoclonal, oligoclonal o policlonal. En una realización preferida, las inmunoglobulinas modificadas o los dominios variables de inmunoglobulina de la presente invención se utilizan para matar células diana que portan el antígeno diana, por ejemplo, células cancerosas. Las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se pueden usar para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno diana, por ejemplo, antagonizando una citoquina o un receptor de citoquina. Alternativamente, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se pueden usar para bloquear, antagonizar o agonizar el antígeno diana y matar las células diana que portan el antígeno diana.

En una alternativa adicional, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se pueden usar para bloquear, antagonizar o agonizar factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento y matar las células diana que portan o necesitan el antígeno diana. Las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se pueden usar para bloquear, antagonizar o agonizar enzimas y sustratos de enzimas. En otra alternativa, los dominios variables de inmunoglobulina modificados de la presente invención se pueden usar para neutralizar agentes infecciosos tales como virus, virus pequeños, priones, bacterias u hongos.

Las inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulinas de la presente invención pueden usarse para diversos fines terapéuticos. Un anticuerpo que comprende la inmunoglobulina modificada o el dominio variable de inmunoglobulina puede administrarse a un paciente para tratar un trastorno específico. Un "paciente" incluye tanto seres humanos como otros animales, preferiblemente mamíferos y más preferiblemente seres humanos. Por "trastorno específico" en la presente memoria se entiende un trastorno que puede mejorarse mediante la administración de una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención. Los métodos para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia no forman parte de la presente invención. Una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención puede ser el único agente terapéuticamente activo administrado a un paciente. Alternativamente, la inmunoglobulina modificada o el dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención se administra en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos diferentes, incluidos, pero no limitados a, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, citoquinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes antihormonales, inhibidores de quinasa, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores u otros agentes terapéuticos. La inmunoglobulina modificada o el dominio variable de inmunoglobulina se puede administrar concomitantemente con uno o más de otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, una variante de anticuerpo de la presente invención se puede formular y administrar al paciente junto con quimioterapia, radioterapia o tanto quimioterapia como radioterapia. La inmunoglobulina modificada o el dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención se puede administrar junto con uno o más anticuerpos, que pueden comprender o no una variante de anticuerpo de la presente invención. La inmunoglobulina modificada o el dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención y una o más de otras terapias anticancerígenas se pueden emplear para tratar células cancerosas ex vivo. Se contempla que dicho tratamiento ex vivo puede ser útil en el trasplante de médula ósea y, en particular, en el trasplante autólogo de médula ósea. Por supuesto, se contempla que los anticuerpos de la invención se puedan emplear en combinación con otras técnicas terapéuticas más, tales como la cirugía.

Una variedad de otros agentes terapéuticos puede encontrar uso para la administración con las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención. Por ejemplo, la inmunoglobulina modificada puede administrarse con un agente antiangiogénico, que es un compuesto que bloquea o interfiere hasta cierto punto con el desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo, un anticuerpo, una fusión de Fc o una citoquina, que se une a un factor de crecimiento o a un receptor del factor de crecimiento implicado en la promoción de la angiogénesis. El factor antiangiogénico puede ser un anticuerpo que se une al factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Alternativamente, la inmunoglobulina modificada puede administrarse con un agente terapéutico que induzca o mejore la respuesta inmune adaptativa, por ejemplo, un anticuerpo dirigido a CTLA-4. En una realización alternativa, la inmunoglobulina modificada se administra con un inhibidor de tirosina quinasa, que es una molécula que inhibe hasta cierto punto la actividad tirosina quinasa de una tirosina quinasa. Alternativamente, las inmunoglobulinas modificadas de la presente invención se pueden administrar con una citoquina. Por "citoquina", tal y como se usa en la presente memoria, se entiende un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares, incluidas las quimioquinas.

Se contemplan composiciones farmacéuticas en donde se formulan inmunoglobulinas modificadas de la presente invención y uno o más agentes terapéuticamente activos. Las formulaciones de las variantes polipeptídicas de la presente invención se preparan para su almacenamiento mezclando dicha inmunoglobulina modificada o dominio variable de inmunoglobulina que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1980, 16a edición, Osol, A. Ed.,), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Las formulaciones que se van a utilizar para la administración in vivo son preferiblemente estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos. Las inmunoglobulinas modificadas y otros agentes terapéuticamente activos divulgados en la presente memoria también pueden formularse como inmunoliposomas y/o quedar atrapados en microcápsulas.

La administración de la composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina de la presente invención, preferiblemente en forma de una solución acuosa estéril, se puede realizar de diversas maneras, incluidas, pero no limitadas a, por vía oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, tópica (p. ej., geles, ungüentos, lociones, cremas, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular.

También se describe un método para fabricar una molécula compuesta por una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina o una preparación farmacéutica de la misma que comprende al menos una modificación en cada uno de dos bucles estructurales o regiones de bucle de dicha inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina y determinar la unión de dicha molécula a un epítopo de un antígeno, en donde la molécula no modificada no se une significativamente a dicho epítopo, que comprende las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina que comprende al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle,

- modificar al menos un residuo de nucleótido en cada uno de dichos bucles estructurales o regiones de bucle,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con un epítopo,

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho epítopo, y

- proporcionar la inmunoglobulina modificada que se une a dicho epítopo y opcionalmente terminarla en una preparación farmacéutica.

El método puede ser un método para fabricar una molécula multiespecífica que se une específicamente a al menos una primera molécula o una preparación farmacéutica de la misma que comprende al menos una modificación en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina y determinar la unión específica de dichos al menos dos bucles o regiones de bucle a al menos una segunda molécula seleccionada de antígenos. La inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina que contiene bucles estructurales o regiones de bucle no modificados no se une específicamente a dicha al menos una segunda molécula.

El método puede comprender las etapas de:

- proporcionar un ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina que se une específicamente a al menos una primera molécula que comprende al menos un bucle estructural o regiones de bucle,

- modificar al menos un residuo de nucleótido de al menos uno de dichos bucles o regiones de bucle codificadas por dicho ácido nucleico,

- transferir dicho ácido nucleico modificado a un sistema de expresión,

- expresar dicha inmunoglobulina modificada,

- poner en contacto la inmunoglobulina modificada expresada con dicha al menos una segunda molécula, y

- determinar si dicha inmunoglobulina modificada se une específicamente a la segunda molécula y

- proporcionar la inmunoglobulina modificada que se une específicamente a dicha al menos una segunda molécula y opcionalmente terminarla en una preparación farmacéutica.

Se prefiere la ingeniería de más de un sitio de unión o al menos dos especificidades en un miembro de un par de unión específico (Kufer et al. (2004) Trends in Biotechnology vol. 22 páginas 238-244).

Se han realizado numerosos intentos para producir anticuerpos multiespecíficos, p. ej., monoclonales biespecíficos o fragmentos de anticuerpos. Un problema en la producción de anticuerpos biespecíficos formados por dos cadenas polipeptídicas diferentes (cadena pesada y ligera) es la necesidad de expresar cuatro cadenas diferentes (dos cadenas pesadas y dos ligeras) en una célula, lo que da lugar a diversas combinaciones de moléculas que tienen que separarse de la molécula biespecífica deseada en la mezcla. Debido a su similitud, la separación de estas moléculas es difícil y costosa. Se han empleado varias técnicas para minimizar la aparición de estos emparejamientos no deseados (Carter (2001) Journal of Immunological Methods, vol 248, páginas 7-15).

Una solución al problema es la producción de una cadena polipeptídica con dos especificidades, como p. ej., dos scFv unidos entre sí o la producción de los llamados diacuerpos. Se ha mostrado que dichas moléculas están muy alejadas del pliegue de una molécula natural y son notoriamente difíciles de producir (LeGall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection vol 17 páginas 357-366).

El sistema de expresión puede comprender un vector. Para este fin, se puede utilizar cualquier vector de expresión conocido en la técnica, según sea apropiado.

La inmunoglobulina modificada se puede expresar en un huésped, tal como una bacteria, en una levadura, en una célula vegetal, en una célula de insecto, en una célula animal o en una célula de mamífero o en un órgano de una planta o animal o en una planta o animal completo.

Se puede usar una amplia variedad de células huésped apropiadas para expresar el polipéptido modificado de la invención, incluyendo, pero no limitado a, células de mamíferos (células animales), células vegetales, bacterias (p. ej., Bacillus subtilis, Escherichia coli), células de insectos y levaduras (p. ej., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Por ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden encontrar uso en la presente invención se describe en el catálogo de líneas celulares de la ATCC, disponible en la American Type Culture Collection. Además, también se pueden utilizar plantas y animales como huéspedes para la expresión de la inmunoglobulina según la presente invención. La expresión, así como los vectores o casetes de transfección, se pueden seleccionar según el huésped utilizado.

Por supuesto, también se pueden utilizar sistemas de expresión de proteínas no celulares o libres de células. Las plataformas de expresión de proteínas de transcripción/traducción in vitro, que producen cantidades suficientes de proteínas, ofrecen muchas ventajas de una expresión de proteínas sin células, eliminando la necesidad de etapas laboriosas aguas arriba y abajo (p. ej., transformación, cultivo o lisis de la célula huésped) típicamente asociadas con sistemas de expresión basados en células.

Otro problema del diseño actual de anticuerpos biespecíficos es el hecho de que incluso si los anticuerpos parentales se unen de forma bivalente a su respectiva pareja de unión (p. ej., IgG), el anticuerpo biespecífico resultante es monovalente para cada una de las respectivas parejas de unión.

Las moléculas multiespecíficas preferidas de la presente invención resuelven estos problemas:

Es posible la expresión de una molécula biespecífica como una cadena polipeptídica (un dominio variable de inmunoglobulina modificado con dos especificidades de unión, véase la sección de ejemplos), lo cual es más fácil de lograr que la expresión de dos cadenas polipeptídicas de anticuerpos (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984).

También se puede producir como una molécula similar a un anticuerpo (es decir, formada por 2 cadenas polipeptídicas). Debido al hecho de que la segunda especificidad está localizada en la parte que no es CDR de los dominios variables, no hay necesidad de dos cadenas pesadas diferentes o cadenas ligeras diferentes. Por tanto, no hay posibilidad de que se produzca un emparejamiento incorrecto de las dos cadenas.

Un anticuerpo de la presente invención como se establece en las reivindicaciones puede consistir en una cadena pesada y una cadena ligera, que forman juntas una región de bucle de CDR variable que se une a una pareja de unión específica, es decir, una conformación de bucle de CDR específica, y la segunda especificidad se forma por bucles estructurales modificados contenidos en la molécula de inmunoglobulina, p. ej., los bucles estructurales del dominio variable de la cadena pesada o de la cadena ligera, manteniendo al mismo tiempo la conformación del bucle de CDR específica. El sitio de unión también puede estar formado por bucles que no son de CDR en dos dominios variables (p. ej., un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que pueden ser estructuralmente vecinos).

El anticuerpo modificado puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo (p. ej., Fab, scFv, Fv, minicuerpo, dAb) que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina y modificaciones en los bucles estructurales o regiones de bucle, o derivados de los mismos.

Puede unirse de forma mono o multivalente a las parejas de unión o incluso con diferente valencia para las diferentes parejas de unión, dependiendo del diseño. Por ejemplo, se puede diseñar por ingeniería un fragmento Fab o, de manera equivalente, un scFv de tal manera que los bucles estructurales de los dominios VH y VL se diseñen por ingeniería por separado para unirse al mismo epítopo que el sitio de unión formado por las CDR, lo que resulta en un fragmento Fab trivalente o scFv, respectivamente. En otra realización, una inmunoglobulina completa que contiene los mismos dominios VH y VL diseñados por ingeniería se unirá de forma hexavalente a su epítopo diana. Si, por ejemplo, el sitio de unión natural formado por las CDR reconoce un epítopo diana diferente al de los dominios Vh y Vl diseñados por ingeniería, entonces el fragmento Fab o scFv resultante se unirá de forma monovalente a la primera diana y de forma bivalente a la segunda diana a la que se unen independientemente los bucles estructurales modificados del dominio VH y VL, respectivamente. Este principio de diseño modular se puede aplicar de numerosas maneras diferentes, como será obvio para los expertos en la técnica.

Como hay varios bucles estructurales disponibles para la selección y el diseño de un sitio de unión específico en las regiones que no son CDR de los dominios pesado y ligero, es posible diseñar derivados de anticuerpos con incluso más de dos especificidades. Por ejemplo, los dominios VH y VL que reconocen una primera diana mediante sus CDR pueden diseñarse por ingeniería por separado para unirse específicamente a diferentes (segunda y tercera) dianas a través de interacciones mediadas por los bucles estructurales modificados. Por lo tanto, se puede generar un fragmento Fab triespecífico o scFv, que se une de forma monovalente a cada una de sus dianas. Si los dominios variables modificados de este Fab se diseñan por ingeniería en forma de una IgG de tamaño completo, se genera una IgG diseñada por ingeniería que es triespecífica y, para cada una de sus tres especificidades, se une de forma bivalente.

Los dominios de unión específicos dentro de una cadena polipeptídica pueden estar conectados con o sin un conector peptídico.

Algunas clases de anticuerpos pueden considerarse multiespecíficas, en particular biespecíficas, por naturaleza: se unen a un antígeno (que es típicamente, p. ej., una estructura extraña o una estructura asociada al cáncer) con la región variable y se unen a moléculas efectoras Fc con la parte Fc (p. ej., receptores de Fc en varias células inmunes o proteínas del complemento), permitiendo así efectos tales como ADCC, ADCP o CDC.

Las moléculas efectoras Fc están unidas por la parte Fc de una molécula de inmunoglobulina (para IgG1 consiste en los dominios CH2 y CH3) y se han descrito varios métodos para optimizar la función efectora mejorando la unión de la parte Fc de una molécula de anticuerpo ya sea mediante técnicas de glicoingeniería (US 6.602.684) o mediante ingeniería de proteínas, ya sea directamente en el Fc (US 2005/0054832) o indirectamente mediante ingeniería fuera del Fc (US 2005/02444403). Ambas técnicas han alterado la unión de la región Fc al receptor de Fc y/o la unión a proteínas del complemento como Cq1. Normalmente, se intenta mejorar la afinidad de unión a dichas moléculas efectoras Fc, ya que esto se correlaciona con funciones efectoras mejoradas.

Es posible diseñar un anticuerpo que se una a moléculas efectoras de Fc fuera de la región de unión a Fc natural. Los bucles modificados en dominios variables de anticuerpo distintos de los bucles implicados en la unión de la molécula efectora de Fc "natural" pueden seleccionarse de una biblioteca de estructuras de bucle modificadas o diseñarse para unirse a una o más moléculas efectoras de Fc. Un anticuerpo con tales sitios de unión de molécula efectora de Fc adicionales tendría una avidez más fuerte hacia una determinada molécula efectora de Fc o una célula efectora que presente una molécula efectora de Fc y, por lo tanto, puede tener un efecto aún más fuerte que los anticuerpos sometidos a glicoingeniería o que las regiones Fc mejoradas de otro modo.

Los fragmentos de anticuerpos tienen ciertas ventajas en comparación con los anticuerpos completos. Los fragmentos suelen tener buenas propiedades de biodistribución y pueden producirse más fácilmente. Sin embargo, la mayoría de los diseños de fragmentos de anticuerpos carecen de funciones efectoras y tienen una semivida in vivo corta (Holliger P, et al. Nat Biotechnol. (2005) 23:1126-36.). Ni los dominios CH1 ni Cko CA pueden mediar funciones efectoras, razón por la cual las moléculas de Fab no muestran habitualmente ADCC, ADCP o CDC.

WO 02/44215 describe moléculas de unión que consisten en el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo y un péptido que se une a moléculas efectoras Fc. De esta manera, se puede construir un fragmento de anticuerpo que presente funciones efectoras. El péptido se incorpora a la molécula de unión en una posición que no destruye la unión al antígeno ni la capacidad del péptido para unirse a una molécula efectora de Fc.

Sin embargo, según la presente invención, la unión a moléculas efectoras de Fc se puede realizar con inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulinas que se han seleccionado para la unión a moléculas efectoras de Fc a partir de bibliotecas de dos, tres o cuatro secuencias de bucles estructurales aleatorias dentro de un armazón fijo de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina. Por lo tanto, es posible seleccionar secuencias de bucle específicas que no se unirían a moléculas efectoras de Fc si se aislaran del armazón de dominio de Ig. Por lo tanto, los polipéptidos pueden consistir en más de 100 aminoácidos y pueden comprender uno o más dominios variables de inmunoglobulina.

Con el fin de seleccionar la función efectora potencial de dichos dominios variables según la presente invención, se pueden seleccionar bibliotecas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que comprenden dominios variables mutantes para la unión a receptores de Fc y/o factores del complemento tales como C1q. Los receptores Fcgamma para la selección pueden proporcionarse en la superficie de células que expresan naturalmente los receptores respectivos o mediante expresión y purificación de la parte extracelular del receptor respectivo. Las células U937 estimuladas con IFN-g (CRL-1503, American Type Culture Collection) se pueden utilizar como células diana para el aislamiento de dominios variables de inmunoglobulina modificados presentados en fagos que se unen específicamente al receptor de IgG de alta afinidad, FcgammaRI (Berntzen et al., 2006, Protein Eng Des Sel. 19(3):121 -8). La unión al receptor de Fc puede ensayarse mediante FACS utilizando células U937 como diana, células que se tiñen específicamente con dominios variables de inmunoglobulina modificados seleccionados. Además, los dominios extracelulares de los receptores Fcgamma humanos pueden clonarse y expresarse como proteínas solubles o proteínas de fusión y usarse para el análisis de la unión específica de parejas de unión potenciales (p. ej., como en Berntzen et al., 2005, J Immunol Methods. 298(1-2):93-104). La identificación y caracterización de dominios variables de inmunoglobulina modificados que se unen específicamente al factor del complemento C1q se puede realizar esencialmente de manera similar (p. ej., como en Lauvrak et al. 1997 Biol Chem. 378(12):1509-19).

Con el fin de aumentar la semivida in vivo de una molécula que consiste en o contiene dicho dominio variable que se une a FcRn, se puede seleccionar albúmina sérica con bibliotecas de dominios variables mutantes. Aquellos bucles estructurales modificados responsables de extender la semivida de una molécula a través de su unión específica a proteínas séricas o proteínas del complemento pueden usarse como bucles estructurales aislados o en el contexto de una inmunoglobulina o partes de la misma, para combinación con aquellas moléculas que van a ser diseñadas como moléculas con semivida incrementada in vivo.

Los receptores FcRn u otros receptores celulares para la selección pueden proporcionarse en la superficie de células que expresan naturalmente los receptores respectivos o mediante expresión y purificación de la parte extracelular del receptor respectivo. Un primer cribado en FcRn puede seleccionar dominios variables mutantes (o moléculas que comprenden dichos dominios variables mutantes) que pueden ensayarse adicionalmente in vitro e incluso caracterizarse adicionalmente en experimentos de FACS mediante la unión a células que expresan el receptor FcRn. El cribado y la selección también pueden considerar las dependencias del pH en la unión a FcRn (como se describe en PCT WO02/060919; PCT WO97/34631). Puede caracterizarse además mediante clasificación de afinidad de unión a diversos FcRn recombinantes, isoformas y alotipos, p. ej., con técnicas de resonancia de plasmón superficial (p. ej., como en Dall' Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169: 5171-5180).

La inmunoglobulina modificada según la invención puede comprender una cadena pesada y/o ligera, o partes de las mismas, y al menos un dominio variable como se establece en las reivindicaciones.

La inmunoglobulina según la presente invención comprende al menos un dominio variable de la inmunoglobulina, como se establece en las reivindicaciones.

Un dominio variable se considera habitualmente una unidad de plegado de inmunoglobulina de la parte variable de una inmunoglobulina, también conocido como dominio de la región variable (p. ej., VH, Vk, Vl, Vd).

Una inmunoglobulina puede consistir en un dominio variable de una cadena pesada o ligera, o una parte de la misma, con al menos dos bucles estructurales, y se caracteriza porque dichos al menos dos bucles estructurales comprenden al menos dos modificaciones de aminoácidos formando al menos dos bucles estructurales modificados, en donde dichos al menos dos bucles estructurales modificados se unen específicamente a al menos un epítopo de un antígeno. Las al menos dos modificaciones de aminoácidos pueden estar localizadas en dos bucles estructurales o en uno o dos bucles estructurales para formar un sitio de unión para un antígeno.

La unión específica del polipéptido modificado a una molécula se puede determinar mediante un ensayo de unión seleccionado del grupo que consiste en ensayos inmunológicos, preferiblemente ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), ensayos de resonancia de plasmón superficial, espectroscopia de resonancia magnética nuclear de diferencia de transferencia de saturación, espectroscopia de resonancia magnética nuclear de transferencia de NOE (trNOE), ensayos competitivos, ensayos de unión a tejidos, ensayos de unión a células vivas y ensayos de extractos celulares.

Los ensayos de unión se pueden llevar a cabo utilizando una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, ensayos basados en FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) y BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado, ensayo de proximidad de centelleo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), SPR (resonancia de plasmón superficial), calorimetría de titulación isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, electroforesis en gel y cromatografía, incluida la filtración en gel.

El polipéptido modificado de la invención puede conjugarse con un marcador seleccionado del grupo que consiste en moléculas orgánicas, marcadores enzimáticos, marcadores radiactivos, marcadores coloreados, marcadores fluorescentes, marcadores cromogénicos, marcadores luminiscentes, haptenos, digoxigenina, biotina, complejos metálicos, metales, oro coloidal y mezclas de los mismos.

Los polipéptidos modificados conjugados con marcadores como se especifica anteriormente se pueden usar, por ejemplo, en métodos de diagnóstico.

La inmunoglobulina modificada puede conjugarse con otras moléculas que permitan la detección simple de dicho conjugado, por ejemplo, en ensayos de unión (p. ej., ELISA) y estudios de unión.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un dominio variable de una cadena ligera o pesada o combinaciones de las mismas, con al menos dos bucles caracterizados porque dichos al menos dos bucles estructurales comprenden cada uno al menos una modificación de aminoácido formando al menos dos bucles estructurales modificados, en donde dichos al menos dos bucles estructurales modificados se unen específicamente a al menos un epítopo de un antígeno, como se establece en las reivindicaciones.

Se prefiere combinar molecularmente al menos un dominio variable de anticuerpo modificado (= unión a la pareja específica a través de secuencias no variables o bucles estructurales) con al menos otra molécula de unión que puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un receptor soluble, un ligando u otro dominio de anticuerpo modificado. La otra molécula de unión combinada con el al menos un dominio variable de anticuerpo modificado de la invención se selecciona del grupo que consiste en moléculas proteicas, ácidos nucleicos y carbohidratos.

Los bucles estructurales de la inmunoglobulina modificada según la invención pueden unirse específicamente a cualquier tipo de moléculas de unión, en particular a moléculas proteicas, proteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicanos, carbohidratos, lípidos, moléculas orgánicas pequeñas y grandes, moléculas inorgánicas. La inmunoglobulina modificada según la invención comprende al menos dos bucles mediante los cuales cada uno de los bucles puede unirse específicamente a diferentes moléculas o epítopos.

También se describe el uso de una inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o que se puede obtener mediante un método descrito en la presente memoria para la preparación de una vacuna para la inmunización activa. Por la presente, la inmunoglobulina se usa como sustancia farmacológica antigénica para formular una vacuna o se usa para pescar o capturar estructuras antigénicas para su uso en una formulación de vacuna.

Una inmunoglobulina según la presente invención o que se puede obtener mediante un método descrito en la presente memoria se puede utilizar para la preparación de una biblioteca de polipéptidos que comprende dominios variables de inmunoglobulina modificados.

También se divulga un método para unir y/o detectar específicamente una molécula diana que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula que comprende una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado que se puede obtener mediante un método descrito en la presente memoria con una muestra de ensayo que contiene o se sospecha que contiene dicha molécula diana, y opcionalmente

(b) detectar la formación potencial de un complejo específico de inmunoglobulina/molécula o dominio variable de inmunoglobulina/molécula.

También se divulga un método para unir y/o detectar específicamente una molécula que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una biblioteca de inmunoglobulinas modificadas o una inmunoglobulina modificada con una muestra de ensayo que contiene dicha molécula, y opcionalmente

(b) detectar la formación potencial de un complejo específico de inmunoglobulina/molécula.

Las muestras de ensayo pueden ser muestras humanas o animales, tales como muestras de sangre u otros fluidos corporales y suspensiones celulares, muestra que posiblemente contiene una molécula diana que se unirá específicamente a inmunoglobulinas con fines de captura y/o detección.

También se divulga un método para aislar específicamente una molécula diana que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula que comprende una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado que se puede obtener mediante un método descrito en la presente memoria con una muestra que contiene dicha molécula diana,

(b) separar el complejo específico de dominio variable de inmunoglobulina/molécula diana formado, y

(c) opcionalmente, aislar la molécula diana de dicho complejo.

También se divulga un método para aislar específicamente una inmunoglobulina modificada que se une a una molécula que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una biblioteca de inmunoglobulinas modificadas con una muestra que contiene dicha molécula,

(b) separar el complejo específico de inmunoglobulina modificada/molécula formado, y

(c) opcionalmente, aislar la inmunoglobulina modificada de dicho complejo.

Esas muestras se consideran habitualmente fuentes para el aislamiento preparativo de esas moléculas, por ejemplo, fuentes naturales complejas, como fuentes animales, humanas o vegetales o fuentes derivadas de microbios o suspensiones y cultivos celulares.

Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas según la presente invención se pueden usar para aislar moléculas diana específicamente de una muestra. Si se utilizan inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina multiespecíficos, se puede aislar más de una molécula diana de una muestra. Es especialmente ventajoso usar inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina modificados en tales métodos porque permite, p. ej., generar una matriz que tiene una superficie homogénea con cantidades definidas de parejas de unión (es decir, dominios variables de inmunoglobulina modificados) inmovilizadas sobre la misma que son capaces de unirse a las moléculas diana a aislar. Por el contrario, si se utilizan parejas de unión monoespecíficas, no se puede generar una matriz homogénea porque las parejas de unión individuales no se unen con la misma eficiencia a la matriz.

También se divulga un método para dirigir un compuesto a una diana que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado según la presente invención o una molécula que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado que se puede obtener mediante un método divulgado en la presente memoria capaz de unirse específicamente a dicho compuesto,

(b) administrar la molécula que comprende un complejo de dominio variable de inmunoglobulina/compuesto a la diana.

Se pueden usar inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina según la presente invención para administrar al menos un compuesto unido a las CDR mediante una conformación de bucle de CDR específica a una diana uniéndose a la región de bucle estructural modificada. Dichas inmunoglobulinas pueden usarse para dirigir sustancias terapéuticas a un sitio de acción preferido en el curso del tratamiento de una enfermedad.

Además, se divulga una biblioteca de moléculas que comprende, expresa o codifica una inmunoglobulina o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o que se puede obtener mediante el método descrito en la presente memoria.

La biblioteca de inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas puede comprender al menos 10 inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas, preferiblemente 100, más preferiblemente 1.000, más preferiblemente 10.000, más preferiblemente 100.000, lo más preferiblemente más de 1.000.000 inmunoglobulinas o dominios variables variantes, con una modificación en al menos al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle.

Normalmente, las bibliotecas comprenden al menos 10 proteínas de fusión o agentes de unión, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 1.000, más preferiblemente al menos 104, más preferiblemente al menos 105, más preferiblemente al menos 106, más preferiblemente al menos 107, más preferiblemente al menos 108, más preferiblemente al menos 109, más preferiblemente al menos 1010, más preferiblemente al menos 1011, hasta 1012, en casos de presentación ribosómica son factibles números aún mayores.

Resultó que los miembros más preferidos de una biblioteca tienen mutaciones de al menos 4, o incluso al menos 5 ó 6 posiciones de aminoácidos en al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle. Por tanto, las bibliotecas pueden consistir en miembros que tienen mutaciones de al menos 2, 3 ó 4 posiciones de aminoácidos en al menos dos bucles estructurales.

Una biblioteca también puede comprender o consistir en uno o una mezcla de dominios variables de inmunoglobulina seleccionados del grupo de VH, Vkappa, Vlambda y VHH, según sea adecuado para el fin de definir parejas de unión por razones comerciales.

Los métodos para construir dicha biblioteca se pueden encontrar anteriormente y en los ejemplos. La biblioteca puede usarse para identificar inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas que se unen a una molécula distinta.

Se divulga el uso de una biblioteca de proteínas de polipéptidos que comprende una inmunoglobulina o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención o que se puede obtener mediante el método descrito en la presente memoria para el diseño de derivados de inmunoglobulina. Se puede cambiar una inmunoglobulina existente para introducir sitios de unión a antígeno en una inmunoglobulina o un dominio variable usando una biblioteca de proteínas de la inmunoglobulina o dominio variable respectivo de al menos 10, preferiblemente 100, más preferiblemente 1.000, más preferiblemente 10.000, más preferiblemente 100.000, lo más preferiblemente más de 1.000.000 inmunoglobulinas o dominios variables variantes, cada uno con al menos dos bucles estructurales modificados. La biblioteca se criba entonces para determinar la unión al antígeno específico. Después de la caracterización molecular de las propiedades deseadas, la inmunoglobulina seleccionada o el dominio variable se clona en la inmunoglobulina original mediante técnicas de ingeniería genética para que reemplace la región de tipo salvaje. Alternativamente, sólo se puede intercambiar el ADN que codifica los bucles modificados o que codifica los aminoácidos mutados para obtener una inmunoglobulina con el sitio de unión adicional para el antígeno específico. Alternativamente, la modificación en los bucles estructurales de los dominios variables se puede realizar con el dominio variable en su contexto natural, p. ej., en forma de Fab, scFv o molécula de inmunoglobulina completa. Excepto cuando se producen inmunoglobulinas de dominio único, una cadena de dominios de inmunoglobulina únicos o inmunoglobulinas de cadena única, tales como scFv o monocuerpos (fragmentos de inmunoglobulina monovalente), normalmente la inmunoglobulina según la invención se proporciona como un dímero, preferiblemente como un heterodímero.

La elección del sitio para el bucle estructural mutado específico del antígeno depende de la estructura de la inmunoglobulina original y del propósito del sitio de unión adicional. Si, por ejemplo, la inmunoglobulina original o parental es un Fab o scFv, es posible la modificación de al menos dos bucles estructurales en los dominios variables de la cadena ligera y/o la cadena pesada, pero también se prefiere la modificación de al menos dos bucles estructurales en CH1/CL para producir una inmunoglobulina según la invención. Por lo tanto, la molécula Fab puede contener el nuevo sitio de unión a través de una región de bucle modificada en el dominio CH1 y o CL. En este contexto, suele ser de primordial importancia mantener la conformación del bucle de CDR específica y las propiedades de unión natural de la inmunoglobulina parental, scFv o Fab.

Para generar una biblioteca, se pueden preparar bibliotecas de moléculas originales mutantes que tengan mutaciones en dos o más bucles estructurales de uno o más dominios variables. La selección con moléculas originales mutadas completas puede tener algunas ventajas ya que la selección para la unión al antígeno con un bucle estructural modificado proporcionará modificaciones estéricamente ventajosas. Por ejemplo, si la molécula completa es un scFv, puede ser ventajoso cribar la biblioteca de scFv original mutado para determinar su unión a un antígeno, seguido de cribado de los ligantes específicos para determinar su unión al antígeno que es reconocido por los bucles de CDR (especificidad original). En un procedimiento de selección alternativo, el antígeno original -el primero- puede unirse a los bucles de CDR durante el cribado para la unión a un antígeno con los bucles estructurales modificados. Este cribado simultáneo puede permitir el rescate de clones que se perderían durante un procedimiento de selección secuencial si la unión al antígeno estuviera influenciada por la unión al primer antígeno.

Un ejemplo es una biblioteca de inmunoglobulinas variantes que contienen o consisten en dominios variables con al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales. La biblioteca puede comprender dominios de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera o mezclas y combinaciones moleculares de los mismos.

Otro ejemplo es una biblioteca que contiene o consiste en dominios VHH o formas humanizadas de dichos dominios de camélido con al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle.

Otro ejemplo es una biblioteca que contiene o consiste en anticuerpos de cadena única, tal como una biblioteca de scFv con al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del anticuerpo de cadena única o scFv.

También se divulga una biblioteca de diacuerpos que contiene o consiste en al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del diacuerpo.

Además, se divulga una biblioteca de minicuerpos que contiene o consiste en al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del minicuerpo.

Aún más se divulga una biblioteca de Fab que contiene o consiste en al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables del Fab.

Un ejemplo adicional es una biblioteca de anticuerpos o IgG, preferiblemente una biblioteca de anticuerpos humanos, que contiene o consiste en al menos una posición de aminoácido variante en cada uno de al menos dos de los bucles estructurales o regiones de bucle de cualquiera de los dominios variables de los dominios de anticuerpo o IgG.

El requisito de tamaño (es decir, el número de variantes) de una biblioteca, que comprende inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas mutados de manera diferente o moléculas de fusión de dominios variables de anticuerpos mutados, depende de la tarea. En general, una biblioteca para generar un sitio de unión a antígenode novonecesita ser más grande que una biblioteca utilizada para modificar aún más un sitio de unión a antígeno diseñado por ingeniería ya existente formado por un bucle estructural modificado o una región de bucle (p. ej., para mejorar la afinidad o cambiar la especificidad fina para el antígeno).

También se describe una biblioteca de polipéptidos o una biblioteca de ácidos nucleicos que comprende una pluralidad de polipéptidos que comprenden inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas o al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle contenidas en un minidominio, o moléculas de ácido nucleico que codifican el mismo. La biblioteca contiene miembros con diferentes modificaciones, en donde la pluralidad está definida por las modificaciones en los al menos dos bucles estructurales o regiones de bucle. La biblioteca de ácidos nucleicos incluye preferiblemente al menos 10 miembros diferentes (con al menos dos modificaciones potenciales de aminoácidos) y más preferiblemente incluye al menos 100, más preferiblemente 1.000 o 10.000 miembros diferentes (p. ej., diseñados mediante estrategias de aleatorización o técnicas combinatorias). También se prefieren números de miembros individuales aún más diversificados, tal como al menos 1.000.000 o al menos 10.000.000, más preferiblemente al menos 108, más preferiblemente al menos 109, más preferiblemente al menos 1010, más preferiblemente al menos 1011, hasta 1012, en casos de presentación ribosómica son factibles números aún mayores.

También se describe la combinación de dos inmunoglobulinas diferentes o dominios variables de inmunoglobulina seleccionados de al menos dos bibliotecas con el fin de generar inmunoglobulinas multiespecíficas. Estos dominios variables de inmunoglobulina específicos seleccionados se pueden combinar entre sí y con otras moléculas, similares a bloques de construcción, para diseñar la disposición óptima de los dominios para obtener las propiedades deseadas tales como combinaciones de especificidades y/o valencias.

Además, se pueden introducir una o más inmunoglobulinas modificadas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención en varios o en todos los diferentes sitios de una proteína sin la destrucción de la estructura de la proteína. Mediante esta técnica de "barajado de dominios" se crean nuevas bibliotecas que pueden seleccionarse nuevamente para las propiedades deseadas.

La biblioteca puede contener inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulina según la invención o derivados de los mismos.

También se divulga una molécula de unión para un antígeno (molécula de unión a antígeno) que comprende al menos una inmunoglobulina o un dominio variable de inmunoglobulina y al menos dos bucles estructurales que se modifican según la presente invención para unirse al antígeno, en donde dicha molécula de unión no una actividad de unión relevante y/o específica con sus bucles de CDR. Puede comprender otras partes utilizables para actividades de anticuerpos (p. ej., como regiones (secuencias) efectoras naturales o modificadas; sin embargo, carece de la región de unión "natural" de los anticuerpos, es decir, bucles de CDR activos en su posición natural. Estas moléculas de unión a antígeno tienen las ventajas descritas anteriormente para las presentes moléculas, pero sin la actividad de unión específica de los anticuerpos; sin embargo, con una actividad de unión específica recién introducida en el bucle estructural o región del bucle.

También para las moléculas de unión a antígeno, los nuevos sitios de unión a antígeno en los bucles estructurales pueden introducirse mediante tecnologías de aleatorización, es decir, modificando uno o más residuos de aminoácidos de al menos dos bucles estructurales mediante técnicas de aleatorización o introduciendo insertos generados aleatoriamente en dichos bucles estructurales. Alternativamente, se prefiere el uso de enfoques combinatorios.

Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una inmunoglobulina modificada que tiene un sitio de unión a antígeno extraño para la inmunoglobulina no modificada e incorporado en dos, tres o más bucles estructurales de la inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina. En este contexto, el término "extraño" significa que el sitio de unión al antígeno no está formado naturalmente por el bucle estructural específico o la región de bucle del dominio variable de inmunoglobulina.

Según otro aspecto más, la presente invención se refiere a una inmunoglobulina modificada que tiene un sitio de unión a antígeno extraño para la inmunoglobulina no modificada e incorporado en dos, tres o más bucles estructurales del dominio variable, en donde dicha inmunoglobulina modificada se une a dicho antígeno con una afinidad de al menos 103 moles-1, al menos 104 moles-1, al menos 105 moles-1, al menos 106 moles-1, al menos 107 moles-1, al menos 108 moles-1, o al menos 109 moles-1.

Habitualmente, según la invención, se proporcionan ligantes con afinidad media o alta. Aquellos con afinidad media ejercen preferentemente una tasa de disociación Kd en el rango de 10-5 a 10-7, aquellos con afinidad alta tienen una Kd probada en el rango de 10-8 a 10-10, siendo los más preferidos como ligantes de afinidad alta, aquellos que tienen una Kd inferior a 10-9. En algunos casos, será apropiado seleccionar ligantes con una Kd aún más baja, p. ej., inferior a 10-11, generalmente tan baja como 10-12.

Las inmunoglobulinas o dominios variables de inmunoglobulinas preferidos según la presente invención comprenden al menos dos sitios de unión a antígeno, uniéndose el primer sitio a un primer epítopo y uniéndose el segundo sitio a un segundo epítopo.

Según una realización preferida, la presente inmunoglobulina o dominio variable de inmunoglobulina comprende al menos tres bucles o regiones de bucle, uniéndose el primer bucle o región de bucle a un primer epítopo, y uniéndose el segundo y tercer bucle o región de bucle a un segundo epítopo. Cualquiera del al menos primer o al menos segundo y tercer bucle o región de bucle o ambos pueden contener un bucle estructural. La inmunoglobulina o dominios variables de inmunoglobulina según la presente invención incluyen los fragmentos de las mismas que se sabe en la técnica que son funcionales que contienen los elementos esenciales según la presente invención: los bucles estructurales modificados según la presente invención.

Preferiblemente, la inmunoglobulina según la presente invención está compuesta por al menos dos dominios de inmunoglobulina, o una parte de los mismos que incluye un minidominio, y cada dominio contiene al menos un sitio de unión a antígeno. Uno de los pares preferidos de dominios de inmunoglobulina es un par CL/CH1, que puede diseñarse por ingeniería en la región de bucle estructural que está localizada en el extremo C del par CL/CH1. De este modo, se diseñan por ingeniería uno o dos nuevos sitios de unión. Tras la selección del par de dominios de unión CL/CH1 específico, se puede recombinar con los dominios variables VL y VH para obtener una molécula Fab, según la invención con un sitio de unión "natural" en la región CDR y uno o dos sitios de unión adicionales opuestos a él, es decir, en la región del bucle estructural C-terminal de los dominios CH1/CL.

Por tanto, la inmunoglobulina según la invención se puede obtener modificando una molécula parental de inmunoglobulina que contiene el dominio variable. Alternativamente, se puede diseñar por ingeniería un dominio de inmunoglobulina constante para obtener un sitio de unión en la región del bucle estructural, dominio que luego se puede usar como bloque de construcción para producir combinaciones con dominios de inmunoglobulina variables y opcionalmente con otros dominios constantes, dando como resultado una inmunoglobulina según la invención que contiene tanto un dominio variable como un nuevo sitio de unión formado por bucles estructurales.

Según dicha realización preferida de la invención, se proporciona una inmunoglobulina que comprende al menos un dominio de la región variable de una inmunoglobulina y al menos un dominio de la región constante de una inmunoglobulina; por ejemplo, un dominio variable, que se modifica en al menos dos bucles estructurales unidos a un dominio CH1.

También se divulga un kit de parejas de unión que contiene

(a) un polipéptido que comprende un dominio variable de inmunoglobulina modificado que tiene un sitio de unión a antígeno incorporado en dos o más bucles estructurales, y

(b) una molécula de unión que contiene un epítopo de dicho antígeno.

El kit de parejas de unión puede contener

(a) una biblioteca de inmunoglobulinas modificadas según la presente invención, y

(b) una molécula de unión que contiene un epítopo de un antígeno.

Dicha molécula de unión de este kit se puede usar para seleccionar y distinguir una inmunoglobulina nativa o modificada según la presente invención en una muestra o de una biblioteca. Puede usarse además para identificar la especificidad de unión de polipéptidos que comprenden una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención. Utilizando la molécula de unión de este kit, se puede determinar la potencia del polipéptido modificado según la presente invención.

La potencia, tal y como se define aquí, es la propiedad de unión de la molécula modificada de la invención a su antígeno. La unión se puede determinar cuantitativamente y/o cualitativamente en términos de especificidad y/o afinidad y/o avidez mediante métodos de ensayo como se conoce en la técnica para fines de control de calidad.

Además, la molécula de unión de un kit, como se describe en la presente memoria, se puede usar para seleccionar el polipéptido que comprende una inmunoglobulina modificada o un dominio variable de inmunoglobulina según la presente invención de una biblioteca como se especifica anteriormente, que consiste preferiblemente en al menos 10, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 1.000, más preferiblemente al menos 10.000, especialmente al menos 100.000 polipéptidos con diferentes modificaciones en los bucles estructurales.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1:Diseño de la biblioteca de VHH

La estructura de cristal del dominio VHH de camello D2-L24 en complejo con lisozima de clara de huevo de gallina, que se publica en la base de datos Brookhaven como entrada 1ZVH.pdb, se utilizó para ayudar en el diseño del dominio VHH mutado. La secuencia de la cadena A del archivo de estructura 1ZVH.pdb se proporciona en la SEQ ID No. 1.

SEQ ID No.1

PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA

La secuencia que se utilizó como base para la construcción de la biblioteca de VHH es la secuencia del dominio VHH anti-TNF-alfa de la patente WO04041862A21, clon 3E y se proporciona en la SEQ ID No. 2.

SEQ ID No.2

ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcagccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc ttaccgtgnn snnsnnsagg tggnnsnnsg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctccgggt aaagcggccg ca

Después de un análisis detallado de la estructura de 1ZVH.pdb y mediante inspección visual de los residuos que forman los bucles que conectan las cadenas beta, se decidió aleatorizar los residuos 13, 15 (es decir, en el bucle entre las cadenas beta A y B) 89, 90, 92 y 93 (es decir, en el bucle entre las cadenas beta E y<f>) de la SEQ ID No. 2 para la generación de la biblioteca. Además, se decidió insertar tres posiciones aleatorias entre los residuos 14 y 15, y se decidió insertar tres posiciones aleatorias entre los residuos 92 y 93 de la SEQ ID No. 2.

Ejemplo 2:Construcción de la biblioteca de VHH

El gen modificado por ingeniería que codifica la secuencia de VHH se produce en forma de gen sintético mediante ensamblaje por PCR. La secuencia y su traducción se muestran en la Figura 2. Los residuos de aminoácidos que se aleatorizarán para la construcción de la biblioteca están subrayados. Los sitios de restricción para la clonación se incluyen a continuación y están subrayados en la secuencia de nucleótidos como se muestra en la Figura 2: NcoI, BgIII y NotI.

La secuencia de aminoácidos codificada por el gen sintético se proporciona en la SEQ ID. No. 3.

SEQ ID No.3

MAPREPQVYTLPPSRDELXXXQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF

FLYSKLTVXXXRWXXGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA

Los dos primeros residuos y los dos últimos residuos son causados por los sitios de restricción utilizados para la clonación. La secuencia de nucleótidos que codifica la SEQ ID No. 3 se proporciona en la SEQ ID No. 4.

SEQ ID No.4: cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac

Los dos primeros codones y los dos últimos codones son causados por los sitios de restricción utilizados para la clonación.

Los oligonucleótidos para el ensamblaje por PCR del gen sintético se diseñan mediante el uso de la herramienta de software disponible públicamente DNAWorks 3.1 (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) y se ensamblan mediante PCR siguiendo protocolos estándar de los 18 oligonucleótidos presentados en la Tabla 1 y como SEQ ID No. 5 a SEQ ID No. 22 (Hoover DM, Lubkowski J., DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis, Nucleic Acids Res. 15 de mayo de 2002; 30 (10): e43).

1. CCATGGCAAGTTCAGCTGCAGGAAGCGGTGGCGGCCTG (SEQ ID No. 5)

2. AGACGCAGGCTGCCGCCAGGCTGGACCAGGCCGCCACCGC (SEQ ID No. 6)

3. CGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCGGCCAGCGGCCGTACC (SEQ ID No. 7)

4. AGGGTAGCCGCTATGGTCGCTAAAGGTACGGCCGCTGGC (SEQ ID No. 8)

5. ACCATAGCGGCTACACCTATACCATTGGCTGGTTTCGTCA (SEQ ID No. 9)

6. TCACGTTCTTTTCCTGGCGCCTGACGAAACCAGCCAATGG (SEQ ID No. 10)

7. CGCCAGGAAAAAGAACGTGAATTTGTGGCGCGTATTTACTG (SEQ ID No. 11)

8. ATAGGTATTGCCGCTGCTCCAGTAAATACGCGCCACAAAT (SEQ ID No. 12)

9. GAGCAGCGGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGC (SEQ ID No. 13)

10. TGTCGCGGCTAATCGCGAAACGGCCTTTCACGCTATCGC (SEQ ID No. 14)

11. GCGATTAGCCGCGACATTGCCAAGAACACGGTAGATCTTA (SEQ ID No. 15)

12. GGCTCCAGGTTGTTCATCGTAAGATCTACCGTGTTCTTGGC (SEQ ID No. 16)

13. CGAT GAACAACCTGGAGCCCGAAGACACAGCCGT GT ATT A (SEQ ID No. 17)

14. GCCATCCCGAGCCGCGCAATAATACACGGCTGTGTCTTCG (SEQ ID No. 18)

15. GCGGCTCGGGATGGCATTCCGACCAGCCGTAGCGTGGAAA (SEQ ID No. 19)

16. CCCTGGCCCCAGTAATTGTAGCTTTCCACGCTACGGCTGG (SEQ ID No. 20)

17. CAATTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTCAGCTCT (SEQ ID No. 21)

18. GCGGCCGCAGAGCTGACGGTCACCTG (SEQ ID No. 22)

Tabla 1: Oligonucleótidos utilizados para el ensamblaje del gen sintético que codifica el gen de VHH diseñado por ingeniería.

Brevemente, se mezclan volúmenes iguales de soluciones de oligonucleótidos (cada una a una concentración de ~1 mg/ml) y se diluyen con agua hasta una concentración final de ~1 ng/^l para cada oligonucleótido. La mezcla de oligonucleótidos se diluye 5 veces con la solución de PCR. Las concentraciones finales de los componentes son 0,2 ng/|jl para cada oligonucleótido, 20 mM para Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM para KCl, 10 mM para (NH4)2SO4, 6 mM para MgSO4, 0,1 % (v/v) para Triton X-100, 0,1 mg/ml para albúmina sérica bovina, 0,2 mM para cada dNTP y 2,5 U para polimerasa Pfu. El protocolo de PCR para el ensamblaje de genes comienza con una etapa de desnaturalización de 5 minutos a 95 °C, durante la cual se agrega la polimerasa para evitar cualquier posible cebado incorrecto (PCR de "inicio en caliente"). A esta etapa le siguen 25 ciclos de una temperatura de desnaturalización de 95 °C durante 30 s, una temperatura de hibridación de 55 °C durante 30 s y una temperatura de extensión de 72 °C durante 1,5 min. La última etapa de este protocolo es un ciclo de incubación a 72 °C durante 10 min. Para la amplificación génica, se utiliza como molde 1 ^l de la mezcla resultante de la reacción de ensamblaje del gen, utilizándose como cebadores los oligonucleótidos más externos (SEQ ID No. 5 y SEQ ID No. 22). El protocolo de PCR para la amplificación de genes es esencialmente el mismo que para el ensamblaje de genes. El gen de VHH sintético ensamblado se clona posteriormente a través de los sitios de restricción NcoI y NotI en el vector pET27b (Novagen, http://www.merckbiosciences.co.uk/product/69863: http://www.novagen.com) y la secuencia se verifica mediante secuenciación de ADN.

Se utiliza entonces la PCR para construir la biblioteca aleatoria. El molde para las primeras 2 reacciones de PCR es el gen de VHH sintético clonado como se describe anteriormente. Los pares de cebadores utilizados para las dos primeras reacciones de PCR son los siguientes: 3esynmu1 (gactccatgg caagtgcaac tgcaggaaag cggaggcggt ctggttnnsc cannsnnsnn snnsggcagc ctgcgtctga gct (SEQ ID No. 23)) y 3esynmu2 (catgagatct acggtgttct tggcg (SEQ ID No. 24)): 3esynmu3 (catgagatct tacgatgnns nnsttgnnsn nsnnsnnsnn sgaagatacg gcggtgtatt attg (SEQ ID No. 25)) y 3esyn2 (aatagcggcc gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26)). Los productos de PCR resultantes se digieren con Bg III, se ligan y el producto de ligación se usa como molde para una reacción de PCR con los cebadores 3esyn1 (acgtccatgg caagtgcaac tgcag (SEQ ID No. 27)) y 3esyn2 (aatagcggcc gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26)). Los codones NNS en los cebadores 3esynmu1 (SEQ ID No. 23) y 3esynmu3 (SEQ ID No. 25) introducen las posiciones aleatorias en la secuencia. Se elige el codón NNS (código IUPAC, donde S significa C o G) que codifica los 20 aminoácidos naturales, pero evita 2 de 3 codones de parada. La Figura 3 muestra el esquema de las reacciones de PCR y el procedimiento de ligación. Las flechas horizontales indican las posiciones y direcciones de los cebadores de PCR, las líneas verticales indican las posiciones de los sitios Ncol, Bg 111 y NotI, respectivamente (de izquierda a derecha).

Este producto de PCR aleatorizado se clona posteriormente en el vector de clonación de fagémido pHEN1 (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 11 de agosto de 1991; 19 (15): 4133-7) en marco con la señal de secreción pelB a través del sitio de restricción NcoI. El sitio de restricción NotI en el extremo 3' del gen inserta la biblioteca de VHH en marco con el gen que codifica la proteína de cubierta menor (proteína III) del fago filamentoso fd contenido en el vector pHENI. La secuencia diseñada por ingeniería del inserto de biblioteca de VHH aleatorizado se proporciona como una secuencia de nucleótidos en la SEQ ID No. 28 y se traduce como una secuencia de aminoácidos en la SEQ ID No. 29. La letra X en la SEQ ID No. 29 indica los residuos de aminoácidos aleatorizados.

SEQ ID No. 28:

1ccatggcaag tgcaactgca ggaaagcgga ggcggtctgg ttnnsccann snnsnnsnns 61 ggcagcctgc gtctgagctg cgcggcgtcc ggccgtacct ttagcgacca ttcgggctat 121 acctatacca ttggctggtt ccgtcaggcg ccagggaaag aacgtgaatt tgtggcgcgt 181 atttactgga gcagcggcaa tacctactat gcggatagcg tgaaaggccg ttttgcgatt 241 agccgcgaca tcgccaagaa caccgtagat cttacgatgn nsnnsttgnn snnsnnsnns 301 nnsgaagata cggcggtgta ttattgcgca gcgcgtgacg gcattccgac ctcccgtagc 361 gtggaaagct acaattactg gggccagggc acccaggtga ccgtgagctc tgcggccgc SEQ ID No. 29:

PWQVQLQESGGGLVXPXXXXGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGR

FAISRDIAKNTVDLTMXXLXXXXXEDTAVYYCAARDGIETSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA

A continuación, el producto de ligación se transforma en Escherichia coli TG1, se determina el número de colonias obtenidas y se controlan varios clones seleccionados por análisis de restricción y por secuenciación de ADN. Para las siguientes etapas de la preparación de fagos de la biblioteca de presentación en superficie, se siguen protocolos estándar. Brevemente, la mezcla de ligación se transforma en células de E. coli TG1 mediante electroporación. Posteriormente, las partículas de fagos se rescatan de las células de E. coli TG1 con el fago auxiliar M13-KO7. Luego, las partículas de fago se precipitan del sobrenadante del cultivo con PEG/NaCl en 2 etapas, se disuelven en agua y se usan para la selección mediante reconocimiento y selección o, alternativamente, se almacenan a menos 80 °C.

Ejemplo 3:Reconocimiento y selección de la biblioteca de VHH - fagos sobre albúmina sérica humana (HSA) Se realizan 3 rondas de reconocimiento y selección según protocolos estándar. (p. ej., Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Calif.). Brevemente, se aplica el siguiente método. Se recubren placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) con HSA. Se añaden por pocillo 200 pl de la siguiente solución: tampón carbonato-Na 0,1 M, pH 9,6, con las siguientes concentraciones de HSA: 1a ronda de reconocimiento y selección: 2 mg/ml de HSA; 2a ronda de reconocimiento y selección: 1 mg/ml de HSA; 3S ronda de reconocimiento y selección: 1 mg/ml de HSA. La incubación es durante 1 hora a 37 °C, seguida del bloqueo con leche en polvo al 2 % (M-PBS) con 200 pl por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se permite que la biblioteca de fagos de presentación en superficie reaccione con la HSA unida añadiendo 100 pl de suspensión de fagos y 100 pl de leche en polvo al 4 % (M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura ambiente.

Las partículas de fagos no unidas se eliminan por lavado de la siguiente manera. Después de la 1a ronda de reconocimiento y selección: 10 x 300 pl de T-PBS, 5 x 300 pl de PBS; después de la 2a ronda de reconocimiento y selección: 15 x 300 pl de T-PBS, 10 x 300 pl de PBS; después de la 3S ronda de reconocimiento y selección: 20 x 300 pl de T-PBS, 20 x 300 pl de PBS.

La elución de las partículas de fagos unidas se realiza añadiendo 200 pl por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2, e incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la suspensión de fagos se neutraliza mediante la adición de 60 pl de Tris-Base 2 M, seguido de la infección en células de E. coli TG1 mezclando 10 ml de cultivo de crecimiento exponencial con 0,5 ml de fagos eluidos e incubación durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, las bacterias infectadas se siembran en placas en medio TYE con glucosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina y se incuban a 30 °C durante la noche.

Ejemplo 4:Clonación de clones seleccionados de mutantes de VHH seleccionados contra HSA para expresión soluble El ADN del fagémido del fago seleccionado a través de las 3 rondas de reconocimiento y selección se aísla con una midi-prep. El ADN que codifica regiones de dominios VHH mutados se amplifica por lotes mediante PCR y se clona NcoI-NotI en el vector pNOTBAD/Myc-His, que es el vector de expresión de E. coli pBAD/Myc-His (Invitrogen) con un sitio de restricción NotI insertado para facilitar la clonación. Las construcciones ligadas se transforman en células de E. coli LMG194 (Invitrogen) con electroporación y se cultivan a 30 °C en medio TYE con glucosa al 1 % y ampicilina durante la noche. Los clones seleccionados se inoculan en 200 pl de medio 2xYT con ampicilina, se cultivan durante la noche a 30 °C y se inducen añadiendo L-arabinosa hasta una concentración final del 0,1 %. Después de la expresión a 16 °C durante la noche, las células se recogen mediante centrifugación y se tratan con 100 pl de tampón borato-Na, pH 8,0, a 4 °C durante la noche para la preparación de extractos periplásmicos. Se utilizan 50 pl de los extractos periplásmicos en ELISA (véase más adelante).

Ejemplo 5:ELISA de mutantes de VHH seleccionados contra HSA

Los extractos periplasmáticos de los mutantes de VHH seleccionados para la unión a albúmina sérica humana se ensayan en un ELISA con el siguiente protocolo:

Recubrimiento: Placa de microtitulación (NUNC, Maxisorp), 100 pl por pocillo, 100 pg de HSA/ml en PBS, durante la noche a 4 °C.

Lavado: 3x 200 pl de PBS

Bloqueo: Caseína bloqueadora al 1 % en PBS (Pierce), 1 h a RT

Lavado: 3x 200 pl de PBS

Unión de extracto periplásmico: 50 pl de extracto periplásmico (Ejemplo 4), 50 pl de PBS Tween 20 al 0,05 %, a temperatura ambiente durante la noche

Lavado: 3 x 200 pl de PBS

1<er>anticuerpo: anti-His4 (Qiagen), 1:1.000 en PBS Tween 20 al 0,05 %, 90 min a RT, 100 pl por pocillo Lavado: 3x 200 pl de PBS

2<°>anticuerpo: anti ratón de cabra*HRP (SIGMA), 1:1.000 en PBS Tween 20 al 0,05 %, 90 min a RT (temperatura ambiente), 100 pl por pocillo

Lavado: 3 x 200 pl de PBS

Detección: 3 mg/ml de OPD en tampón citrato-Na/fosfato, pH 4,5, 0,4 pl de H<2>O<2>al 30 %

Detenerse antes de que el fondo suba demasiado: 100 ml de H2SO43M

Lectura de absorbancia: 492/620 nm

Ejemplo 6:Ejemplo de una biblioteca en la que solo se aleatoriza un bucle: el bucle C'' D

El gen sintético que codifica el gen de VHH diseñado por ingeniería descrito anteriormente en el ejemplo 2 se usa como un molde para dos reacciones de PCR en las que se usan los siguientes pares de cebadores: SEQ ID No. 30 (actgctcgag agacatcgcc aagaacac; esynmu4) junto con la SEQ ID No. 26 (3esyn2) y SEQ ID No. 31 (cacactcgag atcgcaaasn nsnnsnncac snnsnncgca tagtaggtat tgcc; 3esynmu5) junto con la S<e>Q ID No. 27 (3esyn1). Los productos de PCR resultantes se digieren con XhoI, se ligan y el producto de ligación se usa como molde para una reacción de PCR con los cebadores 3esyn1 (SEQ ID No. 27) y 3esyn2 (SEQ ID No. 26). Los codones NNS en los cebadores 3esynmu4 (SEQ ID No. 30) y 3esynmu5 (SEQ ID No. 31) introducen las posiciones aleatorias en la secuencia de manera similar a como se describe en el ejemplo 2. La Figura 4 muestra el esquema de las reacciones de PCR y el procedimiento de ligación. Las flechas horizontales indican las posiciones y direcciones de los cebadores de PCR, las líneas verticales indican las posiciones de los sitios Ncol, XhoI y NotI, respectivamente (de izquierda a derecha). Este producto de PCR aleatorizado se clona posteriormente en el vector de clonación de fagémido pHEN1 (Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains. Nucleic Acids Res. 11 de agosto de 1991; 19 (15): 4133-7) en marco con la señal de secreción pelB y la proteína de cubierta menor (proteína III) del fago filamentoso fd contenida en el vector pHEN1 como se describe en el ejemplo 2. La secuencia diseñada por ingeniería del inserto de la biblioteca de VHH aleatorizada se proporciona como una secuencia de nucleótidos en la SEQ ID No. 32 y traducida como una secuencia de aminoácidos en la SEQ ID No. 33. La letra X en la SEQ ID No.

33 indica los residuos de aminoácidos aleatorizados.

SEQ ID No. 32

1 ccatggcaag ttcagctgca ggaaagcggt ggcggcctgg tccagcctgg cggcagcctg 61 cgtctgagct gtgcggccag cggccgtacc tttagcgacc atagcggcta cacctatacc 121 attggctggt ttcgtcaggc gccaggaaaa gaacgtgaat ttgtggcgcg tatttactgg 181 agcagcggca atacctatta tgcgnnsnns gtgnnsnnsn nsttcgcgat ctcgagagac 241 attgccaaga acacggtaga tcttacgatg aacaacctgg agcccgaaga cacagccgtg 301 tattattgcg cggctcggga tggcattccg accagccgta gcgtggaaag ctacaattac 361 tggggccagg gcacccaggt gaccgtcagc tctgcggccg c

SEQ ID No. 33

PWQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSDHSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYAXXVXXX

FAISRDIAKNTVDLTMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA ■

A continuación, el producto de ligación se transforma en Escherichia coli TG1, se determina el número de colonias obtenidas y se controlan varios clones seleccionados por análisis de restricción y por secuenciación de ADN. Para las siguientes etapas de la preparación de fagos de la biblioteca de presentación en superficie, se siguen protocolos estándar como se describe en el ejemplo 2. Las etapas de reconocimiento y selección, selección y caracterización de clones que se unen específicamente se realizan esencialmente como se describe en los ejemplos 3, 4 y 5.

Ejemplo 7: Ejemplo de una biblioteca en la que se aleatorizan tres bucles: el bucle AB, el EF y el C''D

La biblioteca con residuos aleatorizados en el bucle AB y en el bucle EF como se describe en el ejemplo 2 se usa como un molde para una PCR en la que se usan los mismos pares de cebadores que en el ejemplo 6: SEQ ID No. 30 (esynmu4) junto con la SEQ ID No. 26 (3esyn2) y la SEQ ID No. 31 (3esynmu5) junto con la S<e>Q ID No. 27 (3esyn1). Las siguientes etapas para la construcción de bibliotecas, clonación, reconocimiento y selección, selección y caracterización de clones que se unen específicamente son esencialmente como se describen en los ejemplos 2, 3, 4 y 5.

Ejemplo 8: Comparación de bibliotecas de dominios variables con posiciones de aminoácidos aleatorizadas en uno, dos y tres bucles estructurales

Las bibliotecas se utilizan en el reconocimiento y selección con diversos antígenos.

lisozima de huevo de gallina como antígeno:

Se realizan 3 rondas de reconocimiento y selección. Se recubren placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc) con lisozima de huevo de gallina añadiendo 200 pl de la siguiente solución por pocillo:

PBS, con las siguientes concentraciones de lisozima de huevo de gallina (HEL) disuelta:

1S de reconocimiento y selección: 2 mg/ml de HEL

2a ronda de reconocimiento y selección: 1 mg/ml de HEL

3S ronda de reconocimiento y selección: 1 mg/ml de HEL

La incubación es durante 1 hora a 37 °C, seguida del bloqueo con leche en polvo al 2 % (M-PBS) con 200 pl por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente.

Luego, se permite que la biblioteca de fagos de presentación en superficie reaccione con la lisozima de huevo de gallina unida añadiendo 100 pl de suspensión de fagos y 100 pl de leche en polvo al 4% (M-PBS), seguido de incubación durante 45 minutos con agitación y durante 90 minutos sin agitación a temperatura ambiente.

Las partículas de fagos no unidas se eliminaron por lavado de la siguiente manera:

1S ronda de reconocimiento y selección: 10 x 300 pl de T-PBS, 5 x 300 pl de PBS

2a ronda de reconocimiento y selección: 300 pl de T-PBS, 10 x 300 pl de PBS

3a ronda de reconocimiento y selección: 300 pl de T-PBS, 20 x 300 pl de PBS

La elución de las partículas de fagos unidas se realiza añadiendo 200 pl por pocillo de glicina 0,1 M, pH 2,2, e incubación con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, la suspensión de fagos se neutraliza mediante la adición de 60 pl de Tris-Base 2 M, seguido de la infección en células de E. coli TG1 mediante una mezcla de 10 ml de cultivo de crecimiento exponencial con 0,5 ml de fagos eluidos e incubación durante 30 minutos a 37 °C. Finalmente, las bacterias infectadas se siembran en placas en medio TYE con glucosa al 1 % y 100 pg/ml de ampicilina y se incuban a 30 °C durante la noche.

Albúmina sérica humana como antígeno:

Las bibliotecas de los ejemplos 2, 6 y 7 se utilizan en rondas de reconocimiento y selección como se describe anteriormente. Específicamente, las bibliotecas de fagos se suspenden en tampón de unión (PBS, ovoalbúmina al 1 %, Tween 20 al 0,005 %) y se realiza reconocimiento y selección frente a albúmina sérica humana inmovilizada directamente en placas maxisorp (10 microgramos/ml en PBS, durante la noche a 4 °C; las placas se bloquean con caseína bloqueante (Pierce). Después de 2 horas, los fagos no unidos se eliminan mediante lavados repetitivos (PBS, Tween 20 al 0,05 %) y los fagos unidos se eluyen con KCl 500 mM, HCl 10 mM, pH 2.

Después de cada ronda de reconocimiento y selección específica de HSA, los clones resultantes se seleccionan o se ensayan para determinar su unión a TNF alfa. La selección y ensayo de la especificidad de TNF-alfa se realiza como se describe en el ejemplo 1 de WO2004/041862.

FcRn como antígeno:

El reconocimiento y selección se realiza como se describe en WO02060919, Ejemplo 6.2. En resumen, las bibliotecas de fagos se resuspenden en 5 ml de MES 20 mM, pH 6,0/leche desnatada al 5 %/Tween 20 al 0,05 % y se añaden (100 microlitros de 5 x 1012 PFU/ml/pocillo) a 20 pocillos de una inmunoplaca Maxisorp (Nunc) previamente recubierta con 1 microgramo de FcRn murino y bloqueada con leche desnatada al 5 %. Después de la incubación durante 2 h a 37 °C, los pocillos se lavan 10-30 veces con MES 20 mM, pH 6,0/Tween 20 al 0,2 %/NaCl 0,3 M y los fagos se eluyen mediante incubación en 100 microlitros de PBS, pH 7,4/pocillo durante 30 min. a 37 °C. Los fagos se utilizan para reinfectar E. coli TG1 en crecimiento exponencial, como se describe en el ejemplo 3.

Después de cada ronda de reconocimiento y selección en FcRn, los clones resultantes se seleccionan o se ensayan para determinar su unión a TNF alfa como se describe anteriormente.

Receptores Fc-gamma como antígenos:

El reconocimiento y selección contra proteínas de fusión recombinantes de Fc-gammaRI, Fc-gammaRIIA y FcgammaRIIA se realiza como se describe en Berntzen et al (2006) Protein Eng Des Sel 19:121-128. Después de cada ronda de reconocimiento y selección en un receptor de Fc, los clones resultantes se seleccionan o se ensayan para determinar su unión a TNF alfa como se describió anteriormente.

Ejemplo 9:

Este ejemplo demuestra la posibilidad de introducir nuevas funciones o especificidades de unión adicionales en un fragmento de anticuerpo. La molécula utilizada como punto de partida para la modificación es el fragmento de anticuerpo de cadena única murino sFv 26-10 (Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci U S A. 85:5879-5883). Se construyen cinco bibliotecas diferentes para modificar diferentes secuencias de bucles estructurales mediante secuencias de aminoácidos aleatorias:

Biblioteca 26-10-1: (SEQ ID NO. 34)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSN RFSGXXXXFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-2: (SEQ ID NO. 35) EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPXXXXXQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSNRFSGXXXXFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-3: (SEQ ID NO. 36) EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPXXXXXQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSN RFSGXVPDRFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-4: (SEQ ID NO. 37) EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQSHGKSLDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGSSGNKWAMDYWGHGASVTVSSGGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQKAGQSPKLLIYKVSN RFSGXXXXXXXFSGSGSGTDFTLKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Biblioteca 26-10-5: (SEQ ID NO. 38)

EVQLQQSGPELVKPGASVRMSCKSSGYIFTDFYMNWVRQXXXXXXDYIGYISPYSGVTGYNQKF KGKATLTVDKS SSTAYMELRS LT SE DSAVYYCAG S S GNKWAMDYWGHGASVTVS S GGGGSGGGG SGGGGSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLNWYLQXXXXXXKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKLEIKR

Las bibliotecas se producen mediante traducción inversa de las secuencias, en donde las posiciones de aminoácidos aleatorizadas están codificadas por el triplete de nucleótidos NNK.

Gen de la biblioteca 26-10-1: (SEQ ID NO. 39)

GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTNNKNNKNNKNNKTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA TCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Gen de la biblioteca 26-10-2: (SEQ ID NO. 40) GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGNNKNNKNNKN NKNNKCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTNNKNNKNNKNNKTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTAGCGACTTCACCCTGAAAA TCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Gen de la biblioteca 26-10-3: (SEQ ID NO. 41) GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGNNKNNKNNKN NKNNKCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTGTTCCGGACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA TCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC GACCTTCGGTGGTGGTAC CAAAC T G GAAAT CAAAC GT

Gen de la biblioteca 26-10-4: (SEQ ID NO. 42) GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGTCTCACGGTAA ATCTCTGGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGAAAGCTGGTCAGTCTCCGAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCA CCCTGAAAATCTCTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCA.

CGTTCCGCCGACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Gen de la biblioteca 26-10-5: (SEQ ID NO. 43) GAAGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGTCCGGAACTGGTTAAACCGGGTGCTTCTGTTCGTATGTCTT GCAAATCTTCTGGTTACATCTTCACCGACTTCTACATGAACTGGGTTCGTCAGNNKNNKNNKNN KNNKNNKGACTACATCGGTTACATCTCTCCGTACTCTGGTGTTACCGGTTACAACCAGAAATTC AAAGGTAAAGCTACCCTGACCGTTGACAAATCTTCTTCTACCGCTTACATGGAACTGCGTTCTC TGACCTCTGAAGACTCTGCTGTTTACTACTGCGCTGGTTCTTCTGGTAACAAATGGGCTATGGA CTACTGGGGTCACGGTGCTTCTGTTACCGTTTCTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGT TCTGGTGGTGGTGGTTCTGACGTTGTTATGACCCAGACCCCGCTGTCTCTGCCGGTTTCTCTGG GTGACCAGGCTTCTATCTCTTGCCGTTCTTCTCAGTCTCTGGTTCACTCTAACGGTAACACCTA CCTGAACTGGTACCTGCAGNNKNNKNNKNNKNNKNNKAAACTGCTGATCTACAAAGTTTCTAAC CGTTTCTCTGGTGTTCCGGACCGTTTCTCTGGTTCTGGTTCTGGTACCGACTTCACCCTGAAAA TCTCTCGTGTTGAAGCTGAAGACCTGGGTATCTACTTCTGCTCTCAGACCACCCACGTTCCGCC GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT

Los genes respectivos se ensamblan con oligonucleótidos sintetizados químicamente y se clonan en un vector de presentación en fagos para la presentación en la superficie del fago como se describió anteriormente con todas las adaptaciones necesarias para lograr la traducción en marco de un péptido líder, la variante sFv y la proteína de cubierta III del fago.

Las bibliotecas de presentación en fagos se seleccionan para la unión a albúmina sérica humana, lisozima, FcRn y Fc receptores de Fc gamma como se describe en el ejemplo 8.

Alternativamente, los genes se ligan con el vector pRDV análogo al método descrito en Binz et al. (2005) Nat Biotechnol. 22:575-582 y se someten a reconocimiento y selección para albúmina sérica humana, receptores de Fc y lisozima según la metodología descrita en Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods 231:119-135.

Ejemplo 10:

Se utiliza un anticuerpo humano, 2F5, específico para el péptido ELDKWA del VIH como armazón para la aleatorización de bucles estructurales y se expresa como scFv. La construcción del vector de expresión y presentación en fagos se realiza como se describe en el ejemplo 9. La selección de fagos se realiza en consecuencia.

La secuencia de scFv de tipo salvaje y las respectivas bibliotecas se muestran en las Figuras 5 a 8.

Descripción de las figuras

Figura 1: Alineamiento de secuencias de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2.

Figura 2: Secuencia de nucleótidos que codifica el gen sintético que codifica el dominio VHH de camello anti-TNF-alfa, así como la traducción en código de una letra de aminoácidos. Los sitios de restricción utilizados para la clonación están subrayados en la secuencia de nucleótidos. Los residuos de aminoácidos que se aleatorizarán en la biblioteca están subrayados en la secuencia de aminoácidos. (Los aminoácidos insertados no se proporcionan en esta secuencia).

La Figura 3 muestra el esquema de las reacciones de PCR y el procedimiento de ligación. Las flechas horizontales indican las posiciones y direcciones de los cebadores de PCR, las líneas verticales indican las posiciones de los sitios NcoI, BgIII y NotI, respectivamente (de izquierda a derecha).

Figura 4: Esquema de las reacciones de PCR utilizadas para construir la biblioteca como se describe en el ejemplo 6. Figura 5: Biblioteca 1 de genes sintéticos de scFv 2F5 wt (VH-Conector-VL) y traducción, con dos bucles estructurales aleatorizados

Figura 6: Biblioteca 2 de genes sintéticos de scFv 2F5 wt (VH-Conector-VL) y traducción, con dos bucles estructurales aleatorizados

Figura 7: Biblioteca 3 de genes sintéticos de scFv 2F5 wt (VH-Conector-VL) y traducción, con tres bucles estructurales aleatorizados

Figura 8: Gen sintético de scFv 2F5 de tipo salvaje con traducción (VH-Conector-VL)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de dominio variable variante que comprende al menos dos bucles estructurales modificados en donde al menos un aminoácido de cada bucle estructural modificado se selecciona del grupo de aminoácidos triptófano, tirosina, fenilalanina, histidina, isoleucina, serina, metionina, alanina y asparagina.

en donde los al menos dos bucles estructurales modificados son bucles que no son de CDR y proporcionan un sitio de unión a un epítopo de un antígeno, en donde los bucles estructurales no modificados no se unen específicamente a dicho epítopo,

y en donde el dominio variable es un dominio variable de inmunoglobulina humana o humanizada.

2. Un polipéptido de dominio variable variante según la reivindicación 1, caracterizado porque al menos un bucle estructural modificado contiene al menos dos de dichos aminoácidos.

3. Un polipéptido de dominio variable variante según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque los al menos dos bucles estructurales modificados contienen al menos cuatro de dichos aminoácidos.

4. Un polipéptido de dominio variable variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio variable se selecciona del grupo que consiste en VL, VH, Vkappa y Vlambda.

5. Un polipéptido de dominio variable variante según la reivindicación 4, en donde los al menos dos bucles estructurales modificados comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 7 a 21, aminoácidos 25 a 39, aminoácidos 41 a 81, aminoácidos 83 a 85, aminoácidos 89 a 103 o aminoácidos 106 a 117, donde la numeración de las posiciones de aminoácidos es según el esquema de numeración IMGT.

6. Un polipéptido de dominio variable variante según la reivindicación 5, en donde al menos una modificación está en los aminoácidos 93 a 98 y al menos una modificación está en los aminoácidos 8 a 20 y/o los aminoácidos 69 a 75, donde la numeración de las posiciones de aminoácidos es según el esquema de numeración IMGT.

7. Un polipéptido de dominio variable variante según la reivindicación 1, en donde los al menos dos bucles estructurales modificados comprenden al menos una modificación en los aminoácidos 8 a 20, aminoácidos 44 a 50, aminoácidos 67 a 76 y aminoácidos 89 a 101, lo más preferiblemente posiciones de aminoácidos 12 a 17, posiciones de aminoácidos 45 a 50, posiciones de aminoácidos 69 a 75 y posiciones de aminoácidos 93 a 98, donde la numeración de las posiciones de aminoácidos es según el esquema de numeración IMGT.

8. Un polipéptido de dominio variable variante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos dos sitios de unión a antígeno, uniéndose el primer sitio a un primer epítopo y uniéndose el segundo sitio a un segundo epítopo.

9. Un polipéptido de dominio variable variante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una región de unión de CDR.

10. Una inmunoglobulina que comprende el polipéptido de dominio variable variante según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y al menos un dominio de la región constante de una inmunoglobulina, preferiblemente un dominio CH1.

11. Una molécula de anticuerpo completa, o fragmento de anticuerpo, que comprende un polipéptido de dominio variable variante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el fragmento de anticuerpo es opcionalmente un Fab, Fab2, scFv, Fv, minicuerpo o dAb.

12. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de dominio variable variante, inmunoglobulina, molécula de anticuerpo completa o fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

13. Un vector de expresión que incorpora la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12.

14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de dominio variable variante, inmunoglobulina, molécula de anticuerpo completa o fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

15. Un polipéptido de dominio variable variante, inmunoglobulina, molécula de anticuerpo completa o fragmento de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en terapia.