ES2968358T3 - Composición de partículas lipídicas y composición farmacéutica - Google Patents

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Hayato OGURA
Mikinaga Mori
Taisuke Endo
Kentaro Numajiri
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Abstract

La presente invención aborda el problema de proporcionar: una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat o una sal del mismo, y que presenta un alto rendimiento de direccionamiento a la médula ósea; y una composición farmacéutica que contiene la composición de partículas lipídicas. La presente invención proporciona una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat o una sal del mismo, en la que las partículas lipídicas contienen fosfolípidos y colesterol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de partículas lipídicas y composición farmacéutica
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat o una sal del mismo y a una composición farmacéutica que incluye la composición de partículas lipídicas para su uso en el tratamiento del cáncer.
2. Descripción de la técnica relacionada
El panobinostat es un derivado del ácido hidroxámico utilizado para el tratamiento del mieloma múltiple y es uno de los inhibidores no selectivos de la histona desacetilasa. Panobinostat está disponible comercialmente en forma de preparación oral de tipo cápsula con el nombre comercial de FARYDAK (marca registrada).
Por otra parte, a menudo se estudia que un fármaco se acumula en el cáncer y se expone durante un largo período de tiempo mediante una preparación de liposomas. La preparación de liposomas es una preparación en la que un fármaco se encapsula en un liposoma constituido por una membrana lipídica.
Por ejemplo, la bibliografía no de patentes 1 desvela una preparación de liposomas dirigida a la médula ósea. La bibliografía no de patentes 1 desvela un liposoma que contiene 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), colesterol, ácido L-glutámico, éster de N-(3-carboxil-1-oxopropil)-1,5-dihexadecil (lípido SA) y poli(etilenglicol) y desvela que el componente lipídico SA es un factor activo que induce la fagocitosis por fagocitos mieloides.
La bibliografía no de patentes 2 desvela que un liposoma (CPX-351) que encapsula citarabina y daunorrubicina exhibe altas propiedades de acumulación en la médula ósea. La bibliografía no de patentes 2 desvela que la acumulación de CPX-351 en la médula ósea es entre un 20 % y un 50 % mayor en un ratón normal en comparación con un liposoma vacío y un 75 % mayor en un ratón modelo con leucemia en comparación con un liposoma vacío.
Publicaciones de la técnica anterior
Bibliografía no de patentes
Bibliografía no de patentes 1: Keitaro Souet al., Expert. Opin. Drug Deliv.Marzo de 2011; 8(3): 317-328 Bibliografía no de patente 2: Resumen 5534: La acumulación de liposomas en la médula ósea injertada con leucemia aumenta significativamente cuando la formulación contiene citarabina más daunorrubicina, Sharon A. Johnstone, Sherwin Xie, Troy Harasym, Lawrence Mayer y Paul G. Tardi, DOI: 10.1158/1538-7445.AM10-5534 Publicado el 15 de abril de 2010, Proceedings: 101a Reunión Anual de la AACR 2010, 17-21 de abril de 2010; Washington, DC
Sumario de la invención
Como se ha mencionado anteriormente, aunque ha habido algunos informes de liposomas que exhiben propiedades de alta acumulación en la médula ósea, no se han encontrado composiciones de liposomas que contengan panobinostat o una sal del mismo y que presenten una alta capacidad de direccionamiento a la médula ósea. Un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat o una sal del mismo y que muestra una alta capacidad de direccionamiento a la médula ósea, y una composición farmacéutica que incluye la composición de partículas lipídicas.
Como resultado de extensas investigaciones para lograr el objetivo anterior, los presentes inventores han descubierto que una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat o una sal del mismo, en el que las partículas lipídicas contienen un fosfolípido y colesterol, exhibe una alta capacidad de direccionamiento a la médula ósea. La presente invención se ha completado basándose en estos hallazgos.
Esto es, la presente invención proporciona lo siguiente.
[1] Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer, que comprende una composición de partículas lipídicas:
en donde la composición de partículas lipídicas comprende panobinostat o una sal del mismo,
en donde una partícula lipídica contiene un fosfolípido y colesterol.
[2] La composición farmacéutica para su uso según [1],
en donde una relación de área representada por la Fórmula 1 hasta un tiempo infinito después de la administración única de una composición de partículas lipídicas de 4 mg/kg como cantidad de panobinostat a una vena de la cola de un ratón es 5 o más.
Fórmula 1: (área bajo la curva de concentración-tiempo en la médula ósea)/(área bajo la curva de concentracióntiempo del tracto gastrointestinal)
[3] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con el punto [1] o [2], en donde la partícula lipídica tiene un tamaño de partícula promedio de 50 nm a 500 nm medido usando un método de dispersión dinámica de luz.
[4] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [3], en donde el panobinostat o la sal del mismo se encapsula en la partícula lipídica mediante un método de carga remota.
[5] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [4], en donde un material solidificado del panobinostat o la sal del mismo está presente en al menos una parte de una superficie y un interior de la partícula lipídica.
[6] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5], que contiene un fosfolípido que tiene un esqueleto de glicerol, como el fosfolípido.
[7] La composición farmacéutica para su uso según [6], en donde el fosfolípido que tiene un esqueleto de glicerol es fosfatidilcolina.
[8] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [5], que contiene un esfingofosfolípido como fosfolípido.
[9] La composición farmacéutica para su uso según [8], en donde el esfingofosfolípido es esfingomielina.
[10] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [9], en donde el fosfolípido contiene un resto de ácido graso que tiene 20 o más átomos de carbono.
[11] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [10], en donde la partícula lipídica contiene además un lípido de polietilenglicol.
[12] La composición farmacéutica para su uso según [11], en donde un porcentaje del lípido de polietilenglicol en los lípidos totales que constituyen la partícula lipídica es del 5 % en moles o menos.
[13] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [10], en donde la partícula lipídica está sustancialmente libre de un lípido de polietilenglicol.
[14] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [13], en donde la partícula lipídica contiene un lípido aniónico.
[15] La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [15], en donde la partícula lipídica tiene un tamaño de partícula promedio de 100 nm a 300 nm medido usando un método de dispersión dinámica de luz.
La composición de partículas lipídicas y la composición farmacéutica de la presente invención exhiben una alta capacidad de direccionamiento a la médula ósea. Según la composición de partículas lipídicas y la composición farmacéutica de la presente invención, se puede proporcionar una composición farmacéutica que tenga un índice terapéutico mejorado.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una imagen de microscopio electrónico de transmisión (TEM) de una partícula lipídica que contiene panobinostat.
La figura 2 muestra los resultados de la medición de una concentración plasmática de panobinostat después de la administración de la partícula lipídica que contiene panobinostat o una solución de panobinostat.
La figura 3 muestra los resultados de la medición de una concentración tisular de panobinostat después de la administración de la partícula lipídica que contiene panobinostat o la solución de panobinostat.
La figura 4 muestra los resultados de la medición de la actividad inhibidora del crecimiento contra células leucémicas en un ratón modelo ortotópico Molm-13.
La figura 5 muestra los resultados del análisis del número de macrófagos en la médula ósea y la cantidad de partículas lipídicas en las células.
La figura 6 muestra los resultados del análisis de la expresión de citocinas en la médula ósea.
Descripción de las realizaciones preferidas
El intervalo numérico indicado mediante el uso de "a" en la presente memoria descriptiva significa un intervalo que incluye los valores numéricos descritos antes y después de "a" como el valor mínimo y el valor máximo, respectivamente.
Al referirse en el presente documento al contenido de un componente en una composición, en un caso en donde existan varias sustancias correspondientes a un componente en la composición, el contenido significa, a menos que se especifique otra cosa, la cantidad total de las diversas sustancias que existen en la composición.
La expresión "liposoma vacío" significa un liposoma que no contiene un fármaco.
La expresión "liberación" significa que un fármaco contenido en una partícula lipídica (liposoma o similar) pasa a través de una membrana lipídica que constituye la partícula lipídica (liposoma o similar) y luego sale de la partícula lipídica (liposoma o similar).
La expresión "capacidad de retención en sangre" significa una propiedad en la que un fármaco en estado de estar encapsulado en una partícula lipídica (liposoma o similar) está presente en la sangre de un sujeto al que se le ha administrado una composición de partícula lipídica (liposoma o similar).
La expresión "tamaño de partícula promedio de la partícula lipídica (liposoma o similar)" significa un tamaño de partícula promedio en volumen de la partícula lipídica (liposoma o similar) presente en la composición de partícula lipídica (liposoma o similar). El tamaño promedio de partícula de la partícula lipídica contenida en la composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención se mide usando un método de dispersión dinámica de luz. Ejemplos de dispositivos de medición disponibles comercialmente que utilizan dispersión dinámica de luz incluyen un analizador de tamaño de partículas de sistema concentrado FPAR-1000 (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.), NANOTRAC UPA (fabricado por Nikkiso Co., Ltd.) y NANOSIZER (fabricado por Malvern Panalytical Ltd.). El "sujeto" es un mamífero tal como un ser humano, un ratón, un mono, o un animal doméstico que necesita la prevención o el tratamiento de una enfermedad o similar y, preferentemente, un ser humano que necesita la prevención o el tratamiento de una enfermedad o similar.
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle.
La composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención es una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat o una sal del mismo, en donde la partícula lipídica contiene un fosfolípido y colesterol.
(Partícula lipídica)
Una partícula lipídica significa una partícula constituida por un lípido y no está particularmente limitada. La partícula lipídica de la presente invención incluye un liposoma que tiene una estructura laminar que es un cuerpo vesicular cerrado constituido por una membrana lipídica bimolecular. El liposoma es un cuerpo vesicular cerrado formado por una membrana de bicapa lipídica constituida por lípidos y que tiene una fase acuosa (fase acuosa interna) dentro del espacio de la vesícula cerrada. La fase acuosa interna contiene agua y similares. El liposoma habitualmente está presente en un estado de dispersión en una solución acuosa (fase acuosa externa) fuera de la vesícula cerrada. El liposoma puede ser monolamelar (que también se conoce como lamelar monocapa o unilamelar, y es una estructura que tiene una sola membrana bicapa) o lamelar multicapa (que también se conoce como multilaminar y es una estructura similar a una cebolla que tiene múltiples membranas bicapa donde las capas individuales están compartimentadas por capas acuosas). En la presente invención, desde el punto de vista de la seguridad y estabilidad en aplicaciones farmacéuticas se prefiere un liposoma monolamelar.
La partícula lipídica de la presente invención también incluye una partícula que no tiene la estructura de membrana lipídica bimolecular (estructura laminar) del liposoma descrito anteriormente y tiene una estructura en la que el interior de la partícula también está lleno de componentes constituyentes.
La forma de formación de lípidos puede confirmarse mediante observación con microscopio electrónico, análisis estructural usando rayos X o similares. Por ejemplo, es posible confirmar que una partícula lipídica tiene una estructura que tiene una estructura de membrana lipídica bimolecular (estructura laminar) y una capa interna de agua como un liposoma, o una estructura que no tiene una estructura de membrana lipídica bimolecular (estructura laminar) y una capa interna de agua a diferencia de un liposoma y tiene un núcleo con una alta densidad de electrones en el interior de la partícula, resultando así en una estructura llena de componentes constituyentes que incluyen lípidos, mediante un método en el que se utiliza la observación por microscopía electrónica de criotransmisión (método CryoTEM). También es posible confirmar la presencia y ausencia de la estructura de membrana lipídica bimolecular (estructura laminar) en una partícula lipídica incluso mediante la medición de dispersión de ángulo pequeño de rayos X (SAXS).
La partícula lipídica no está particularmente limitada en términos de forma de la misma siempre que sea una partícula lipídica capaz de encapsular un fármaco. El "encapsulamiento" significa adoptar una forma en la cual un fármaco está contenido en una fase acuosa interna y/o una membrana propiamente dicha con respecto a la partícula lipídica. Por ejemplo, el liposoma puede ser una forma en donde un fármaco se encapsula dentro de un espacio cerrado formado por una membrana, una forma en donde se encapsula un fármaco en la propia membrana o una combinación de los mismos.
El tamaño promedio de partícula de la partícula lipídica es generalmente de 10 nm a 1000 nm, preferentemente de 50 nm a 500 nm, más preferentemente de 100 nm a 500 nm y, aún más preferentemente, de 100 nm a 300 nm.
La partícula lipídica tiene preferentemente forma esférica o una morfología cercana a la misma.
El potencial zeta de la partícula lipídica según la presente invención no está particularmente limitado, pero es, preferentemente, -10 mV o menos, más preferentemente, -15 mV o menos y aún más preferentemente -20 mV o menos. El potencial zeta de la partícula lipídica también es preferentemente -25 mV o menos y más preferentemente -30 mV o menos.
El componente que constituye la bicapa lipídica de una partícula lipídica se selecciona entre los lípidos. Como el lípido, se puede utilizar cualquiera siempre que se disuelva en un disolvente mixto de un disolvente orgánico soluble en agua y un disolvente orgánico a base de éster. Ejemplos de los lípidos incluyen fosfolípidos, lípidos distintos de los fosfolípidos, colesteroles, lisofosfolípidos y derivados de los mismos. Estos componentes pueden estar compuestos por un solo componente o múltiples componentes. Las partículas lipídicas de la presente invención contienen al menos fosfolípidos y colesteroles.
Los ejemplos de fosfolípido incluyen fosfolípidos naturales y sintéticos tales como fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidil etanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina, y cardiolipina, y productos hidrogenados de los mismos (por ejemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC)). En la presente invención, el término "fosfolípido" también abarca un derivado de fosfolípido en donde el fosfolípido está modificado.
En la presente invención, el fosfolípido incluye, preferentemente, un fosfolípido que tiene un esqueleto de glicerol. De manera especialmente preferida, el fosfolípido con estructura de glicerol es fosfatidilcolina. Como fosfatidilcolina se puede utilizar 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina o similares. En la presente invención, también es preferible incluir esfingofosfolípido como el fosfolípido. Como esfingofosfolípido se puede utilizar esfingomielina o similares.
El fosfolípido en la presente invención contiene, preferentemente, un resto de ácido graso que tiene 20 o más átomos de carbono desde el punto de vista de reducir la liberación de panobinostat o una sal del mismo y, por lo tanto, mejorar la capacidad de retención del mismo en la sangre.
Los lípidos distintos de los fosfolípidos pueden ser lípidos que no contienen ácido fosfórico, y los ejemplos de los mismos incluyen, aunque sin limitación particular, glicerolípido que no contiene un resto de ácido fosfórico en la molécula, y esfingolípido que no contiene un resto de ácido fosfórico en la molécula. En la presente invención, la expresión "lípidos distintos de los fosfolípidos" también abarca derivados de lípidos distintos de los fosfolípidos en los que se han realizado modificaciones en lípidos distintos de los fosfolípidos.
Los ejemplos de colesteroles incluyen colesterol que contiene ciclopentahidrofenantreno como un esqueleto básico cuyos átomos de carbono están parcial o completamente hidrogenados y derivados del mismo. Por ejemplo, se menciona el colesterol. En un caso en el que el tamaño promedio de partícula de la partícula lipídica disminuye a 100 nm o menos, la curvatura de la membrana lipídica aumenta. La deformación de la membrana dispuesta en la partícula lipídica también aumenta. Es eficaz añadir colesterol o similares con el fin de llenar la deformación de la membrana causada por el lípido (efecto estabilizante de la membrana).
En relación con la partícula lipídica, se espera que la adición de colesterol reduzca la fluidez de la membrana de la partícula lipídica, por ejemplo, llenando los huecos en la membrana de la partícula lipídica.
El contenido de colesteroles con respecto a la cantidad total de lípidos que constituyen la partícula lipídica según la presente invención es preferentemente del 10 % en moles al 50 % en moles, más preferentemente del 20 % en moles al 45 % en moles, aún más preferentemente de 30 % en moles al 45 % en moles, y particularmente preferentemente del 35 % en moles al 45 % en moles.
Las partículas lipídicas de la presente invención pueden contener un lípido modificado con un polímero hidrófilo.
Ejemplos del polímero hidrófilo incluyen polietilenglicoles, poliglicerinas, polipropilenglicoles, alcoholes polivinílicos, copolímeros alternantes de estireno-anhídrido de ácido maleico, polivinilpirrolidona y poliaminoácido sintético. Los polímeros hidrófilos mencionados anteriormente pueden usarse solos o en combinación de dos o más de los mismos.
Entre estos, desde el punto de vista de la capacidad de retención en sangre de una composición, se prefieren polietilenglicoles, poliglicerinas o polipropilenglicoles son preferibles y polietilenglicol (PEG), poliglicerina (PG) o polipropilenglicol (PPG) son más preferibles. El polietilenglicol (PEG) es más preferible desde el punto de vista de la versatilidad y capacidad de retención en sangre.
El peso molecular promedio en peso del polietilenglicol no está particularmente limitado, pero es entre 500 y 10.000 daltons, preferentemente de 1.000 a 7.000 daltons y más preferentemente de 2.000 a 5.000 daltons.
En el primer aspecto de la partícula lipídica en la presente invención, es preferible utilizar un lípido modificado con PEG (lípido de polietilenglicol), junto con el lípido principal contenido en la partícula lipídica. Los ejemplos del lípido de polietilenglicol incluyen 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-polietilenglicol tal como 1,2-diestearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 1,2-distearoil-3-fosfatidiletanolamina-PEG5000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) y diestearoil glicerol-PEG2000 (fabricado por Nippon Oil & Fats Co., Ltd.).
El porcentaje del lípido de polietilenglicol en los lípidos totales que constituyen la partícula lipídica es generalmente de 0,01 a 10 % en moles, preferentemente del 0,05 al 8 % en moles y, más preferentemente, del 0,1 al 7 % en moles. El porcentaje del lípido de polietilenglicol también es preferentemente del 5 % en moles o menos y más preferentemente del 1 % en moles o menos.
En el segundo aspecto de la partícula lipídica en la presente invención, se prefiere que la partícula lipídica esté sustancialmente libre del lípido polietilenglicol.
También se prefiere que la partícula lipídica en la presente invención contenga un lípido aniónico junto con el lípido principal contenido en la partícula lipídica. Los ejemplos del lípido aniónico incluyen un lípido que tiene un fosfatidilglicerol, tal como 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, sal de sodio (COATSOME MG-6060LS, fabricado por NOF Corporation); un lípido que tiene un ácido fosfatídico, tal como ácido 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatídico, sal de sodio (COATSOME MA-6060LS, fabricado por NOF Corporation); un lípido que tiene una fosfatidilserina, tal como 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, sal de sodio (COATSOME MS-6060LS, fabricado por NOF Corporation); un lisofosfolípido tal como 1-estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (COTSOME MC-80H, fabricado por NOF Corporation); un derivado esteroide que tiene un grupo aniónico, tal como hemisuccinato de colesterol (CH<e>M<s>, fabricado por Avanti Polar Lipids, Inc.); y un ácido graso tal como ácido esteárico.
El porcentaje del lípido aniónico en los lípidos totales que constituyen la partícula lipídica no está particularmente limitado, pero es del 0,01 al 50 % en moles, preferentemente del 0,05 al 30 % en moles y, más preferentemente, del 0,1 al 10 % en moles. El lípido aniónico se puede usar solo o en combinación con el lípido PEG. Además, los polímeros hidrófilos pueden usarse solos o en combinación de dos o más de los mismos.
Además de los componentes anteriores, se puede añadir a la partícula lipídica un polímero hidrófilo o similar para mejorar la capacidad de retención en sangre, ácido graso, fosfato de diacetilo o similar como un estabilizador de la estructura de la membrana o a-tocoferol o similar como antioxidante. En la presente invención, es preferible no utilizar un aditivo tal como un coadyuvante de dispersión que no esté reconocido para su uso en inyección intravenosa en uso médico, por ejemplo, un tensioactivo.
(Panobinostat)
La composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención contiene panobinostat o una sal del mismo como fármaco.
El panobinostat es un derivado del ácido hidroxámico utilizado para el tratamiento del mieloma múltiple y es uno de los inhibidores no selectivos de la histona desacetilasa. La estructura química de panobinostat se muestra a continuación.
La sal de panobinostat puede ser, por ejemplo, una sal en un grupo básico tal como un grupo amino comúnmente conocido.
Los ejemplos de la sal en un grupo básico incluyen sales con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido nítrico y ácido sulfúrico; sales con ácidos carboxílicos orgánicos tales como ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, ácido cítrico, ácido oxálico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido málico, ácido tartárico, ácido aspártico, ácido tricloroacético y ácido trifluoroacético; y sales con ácido sulfónicos, tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido mesitilenosulfónico y ácido naftalenosulfónico. Un ejemplo de sal de panobinostat es una sal lactato de panobinostat, cuya estructura se muestra a continuación.
(Panobinostat o sal del mismo contenida en la composición de partículas lipídicas)
En la composición de partículas lipídicas de acuerdo con la realización de la presente invención, el estado de presencia de panobinostat o una sal del mismo en la partícula lipídica no está particularmente limitado, pero se presume que, por la diferencia en las propiedades de acumulación del panobinostat o una sal del mismo en la médula ósea con un liposoma vacío, que se describirá más adelante, al menos una parte de panobinostat o una sal del mismo está presente en una forma que afecta al reconocimiento por proteínas en la sangre o células tales como macrófagos, que reconocen partículas lipídicas. Esto es, se supone que una parte del panobinostat o la sal del mismo está presente en la superficie de la membrana de la partícula lipídica o en un estado que afecta a la movilidad de las moléculas lipídicas presentes en la superficie de la membrana.
En la composición de partículas lipídicas de acuerdo con la realización de la presente invención, en cuanto al estado de presencia de panobinostat o una sal del mismo en un caso en el que el panobinostat o la sal del mismo que se va a encapsular está en una concentración alta, como se puede leer en la imagen TEM en la Figura 1, una parte del panobinostat o la sal del mismo puede estar presente como un material solidificado en al menos una parte de la superficie y el interior de la partícula lipídica. Incluso en tal caso, el resto del panobinostat o la sal del mismo puede estar presente en estado disuelto en la fase acuosa interna de la partícula lipídica. En este caso, con respecto a la expresión "estado disuelto", se considera que un fármaco ha sido encapsulado en un estado disuelto en el caso en el que la cantidad de fármaco llenado con respecto al volumen de la partícula lipídica es inferior a la solubilidad de saturación del fármaco en la composición líquida de la fase acuosa interna. Además, incluso en el caso en el que la cantidad del fármaco llenado esté por encima de su solubilidad de saturación, un caso en el que los cristales de fármaco no se observan mediante Cryo-TEM [observación de una muestra congelada con microscopio electrónico de transmisión (TEM)] o los patrones de difracción debidos a las redes cristalinas no se observan mediante medición XRD, se puede considerar que la mayor parte del fármaco encapsulado en la partícula lipídica está disuelto y presente en estado disuelto.
En la presente invención, el material solidificado significa un sólido que puede observarse mediante un microscopio electrónico de transmisión (TEM).
(Relación de panobinostat o sal del mismo/lípido)
La relación panobinostat o una sal del mismo/lípido en la partícula lipídica en la presente invención es de 10 a 500 mg/mmol, preferentemente de 20 a 400 mg/mmol y, más preferentemente, de 30 a 300 mg/mmol. En el caso de incluir una sal de panobinostat, la relación de panobinostat o una sal del mismo/lípido se calcula en una cantidad convertida como panobinostat. Además, el lípido en la relación de panobinostat o una sal del mismo/lípido significa todos los lípidos que constituyen una partícula lipídica, en donde el lípido también incluye colesterol y lisofosfolípido.
(Composición de partículas lipídicas)
En la composición de partículas lipídicas de acuerdo con la realización de la presente invención, la relación de área representada por la Fórmula 1 hasta el tiempo infinito después de la administración única de la composición de partículas lipídicas de 4 mg/kg como cantidad de panobinostat en la vena de la cola del ratón es, preferentemente, mayor que 1, más preferentemente 2 o más, aún más preferentemente 3 o más, incluso más preferentemente 5 o más, de forma particularmente preferente 10 o más y, más preferentemente, 12 o más.
Fórmula 1: (área bajo la curva de concentración-tiempo en la médula ósea)/(área bajo la curva de concentracióntiempo del tracto gastrointestinal)
En la composición de partículas lipídicas de acuerdo con la realización de la presente invención, la tasa de acumulación de médula ósea (%DI/g) representada por la Fórmula 2 es, preferentemente, 10 % de DI/g o más, más preferentemente 15 %de Dl/g o más, aún más preferentemente de 20%de Dl/g o más, incluso más preferentemente 30%de Dl/g o más y, de forma particularmente preferente 40 % de DI/g o más. La tasa de acumulación de médula ósea mostrada en los Ejemplos de la presente invención se determina como un porcentaje (% de dosis inyectada/g) de partículas lipídicas acumuladas en la médula ósea entre las partículas lipídicas administradas por gramo de médula ósea femoral, 72 horas después de la administración de una composición de partículas lipídicas que contiene panobinostat (6 mg/kg o 4 mg/kg en términos de la cantidad de panobinostat), que está marcado con DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina), a la vena de la cola de un ratón y está representado por la Fórmula 2.
Fórmula 2: Tasa de acumulación en la médula ósea (% DI/g) = concentración de DiI en la médula ósea (ng/g)/(concentración de DiI en el líquido de administración (ng/ml)xdosis (ml))x100
Para determinar la tasa de acumulación de médula ósea (%DI/g), se puede utilizar una etiqueta diferente de DiI utilizada en la presente invención. Como alternativa, la tasa de acumulación en la médula ósea se puede determinar rastreando los lípidos que constituyen la partícula lipídica sin utilizar una etiqueta. Más aún, la tasa de acumulación en la médula ósea también se puede determinar usando un método para marcar la composición de partículas lipídicas más adelante como se muestra en el Ejemplo 25, además del método de marcar previamente la composición de partículas lipídicas como se muestra en los Ejemplos de la presente invención.
La composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención puede incluir partículas lipídicas que contienen panobinostat o una sal del mismo y un disolvente acuoso para dispersar las partículas lipídicas.
En relación con la vía de administración, la composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención puede contener al menos uno de un agente de tonicidad, un estabilizante, un antioxidante o un agente de ajuste del pH que sea farmacéuticamente aceptable.
El agente de tonicidad no está particularmente limitado y sus ejemplos incluyen sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de potasio e dihidrogenofosfato de potasio; polioles tales como glicerol, manitol y sorbitol; y azúcares tales como glucosa, fructosa, lactosa y sacarosa.
El estabilizador no está particularmente limitado y los ejemplos del mismo incluyen azúcares tales como glicerol, manitol, sorbitol, lactosa y sacarosa.
El antioxidante no está particularmente limitado y sus ejemplos incluyen ácido ascórbico, ácido úrico, tocoferol u homólogos (por ejemplo, vitamina E, cuatro isómeros de tocoferol a, p,<y>, y 5), cisteína y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), galato de propilo, dibutilhidroxitolueno (BHT), butilhidroxianisol (BHA) y pirosulfito de sodio. Los estabilizadores y antioxidantes pueden usarse respectivamente solos o en combinación de dos o más de los mismos.
Los ejemplos del agente de ajuste del pH incluyen hidróxido de sodio, ácido cítrico, ácido acético, trietanolamina, hidrogenofosfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de potasio.
La composición de partículas lipídicas de acuerdo con la realización de la presente invención puede contener un disolvente orgánico, colágeno, poli(alcohol vinílico), polivinil pirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetil almidón de sodio, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xantana, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, solución salina tamponada con fosfato (PBS), cloruro de sodio, azúcares, un polímero biodegradable, un medio sin suero, cada uno de los cuales es farmacéuticamente aceptable, o un aditivo que es aceptable como un aditivo farmacéutico.
El recipiente en el que se llena la composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención no está particularmente limitado y está hecho preferentemente de un material que tiene una baja permeabilidad al oxígeno. Los ejemplos del recipiente incluyen un recipiente de plástico, un recipiente de vidrio y una bolsa hecha de una película laminada que tiene una lámina de aluminio, una película depositada de aluminio, una película depositada de óxido de aluminio, una película depositada de óxido de silicio, un poli(alcohol vinílico), un copolímero de etilenoalcohol vinílico, tereftalato de polietileno, naftalato de polietileno, poli(cloruro de vinilideno), o similares como una capa de barrera a los gases. Si fuera necesario, puede protegerse de la luz adoptando una bolsa o similar usando un vidrio coloreado, una hoja de aluminio, una película depositada de aluminio o similar.
En el recipiente en el que se llena la composición de partículas lipídicas, para evitar la oxidación debida al oxígeno presente en el espacio del recipiente, es preferible reemplazar los gases en el espacio del recipiente y la solución de fármaco con gases inertes tales como el nitrógeno. Por ejemplo, la composición de partículas lipídicas se puede llenar de tal manera que se burbujee nitrógeno en una solución para inyección y luego el llenado de la solución para inyección en un recipiente se lleva a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno.
También es preferible llevar a cabo una liofilización para evitar la descomposición del lípido y del fármaco en la composición de partículas lipídicas. Por ejemplo, es posible dispersar partículas lipídicas en una fase acuosa que contiene sacarosa y realizar una liofilización.
(Método para producir una composición de partículas lipídicas)
El método para producir las partículas lipídicas de acuerdo con la realización de la presente invención no está particularmente limitada. Por ejemplo, la composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención se puede producir mediante las siguientes etapas:
(a) preparación de una fase oleosa;
(b) preparación de una fase acuosa;
(c) formación de partículas lipídicas mediante emulsificación;
(d) regulación del tamaño de partícula mediante una extrusora;
(e) sustitución del líquido de la fase acuosa exterior de partículas lipídicas mediante diálisis;
(f) encapsulación de panobinostat en partículas lipídicas mediante carga remota; y
(g) eliminación del panobinostat en fase acuosa externa mediante diálisis.
<(a) Preparación de la fase oleosa>
(a) En la preparación de una fase oleosa, los componentes individuales (fosfolípido, colesterol y similares) que constituyen la partícula lipídica y un disolvente orgánico se mezclan y la mezcla se calienta para disolver los componentes mencionados anteriormente, por lo que se puede producir una fase oleosa.
Aunque el disolvente orgánico usado en la fase oleosa no está particularmente limitado, por ejemplo, se puede utilizar un disolvente orgánico soluble en agua que opcionalmente se mezcla con agua.
Ejemplos del disolvente orgánico soluble en agua incluyen alcoholes tales como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, y t-butanol; glicoles tales como glicerina, etilenglicol y propilenglicol; y polialquilenglicoles tales como polietilenglicol. Entre estos, son preferibles los alcoholes. El alcohol es preferentemente al menos uno seleccionado de etanol, metanol, 2-propanol, o t-butanol, más preferentemente al menos uno seleccionado de etanol, 2-propanol o t-butanol, y aún más preferentemente etanol.
La concentración del lípido no está limitada particularmente y puede ajustarse apropiadamente.
<(b) Preparación de la fase acuosa>
Como la fase acusa se puede usar agua (agua destilada, agua para inyección o similares), solución salina fisiológica, una solución acuosa de diversas soluciones tampón o azúcares, o una mezcla de los mismos (disolvente acuoso). En la presente invención, es preferible utilizar una solución acuosa que contenga una sal de amonio como fase acuosa, en un caso en el que el panobinostat se encapsula en partículas lipídicas mediante carga remota que se describirá más adelante.
La solución tampón no se limita a soluciones tampón orgánicas e inorgánicas y se usa preferentemente una solución tampón que tenga una acción tamponadora en las proximidades de un pH cercano al del fluido corporal y los ejemplos del mismo incluyen solución tampón fosfato, una solución de tampón Tris, una solución de tampón citrato, una solución de tampón acetato y una solución de tampón de Good. La fase acuosa interna de la partícula lipídica puede ser una solución acuosa en la que las partículas lipídicas están dispersas en el caso de producir partículas lipídicas, o puede ser agua, solución salina fisiológica, una solución acuosa de diversas soluciones tampón o azúcares, o una mezcla de los mismos recién añadida. El agua utilizada como fase acuosa externa o fase acuosa interna está preferentemente exenta de impurezas (polvo, productos químicos o similares).
La solución salina fisiológica se refiere a una solución de sal inorgánica ajustada para ser isotónica con el fluido corporal humano, y además puede tener una función tampón. Los ejemplos de solución salina fisiológica incluyen solución salina que contiene 0,9 % (porcentaje de masa/volumen) de cloruro de sodio, PBS y solución salina fisiológica tamponada con Tris.
En la presente invención, la fase acuosa significa una fase acuosa externa y una fase acuosa interna.
La fase acuosa externa en la presente invención significa una solución acuosa en la que se dispersan las partículas lipídicas. Por ejemplo, en el caso de una inyección, una solución que ocupa la parte externa de la partícula lipídica de un líquido de dispersión de partículas lipídicas envasadas y almacenadas en un vial o jeringa precargada se convierte en una fase acuosa externa. Además, de manera similar para un líquido que se va a dispersar en el momento de su uso cuando se administra mediante una solución de dispersión unida u otras soluciones, una solución que ocupa la parte externa de la partícula lipídica de un líquido de dispersión de partículas lipídicas se convierte en una fase acuosa externa.
La fase acuosa interna en la presente invención se refiere a una fase acuosa en vesículas cerradas separadas por membranas de bicapa lipídica de partículas lipídicas.
<(c) Formación de partículas lipídicas por emulsificación>
En la etapa de emulsificación, se mezclan una fase oleosa en donde al menos un lípido se ha disuelto en un disolvente orgánico y se mezcla una fase acuosa para preparar una solución acuosa que contiene lípidos, que luego se puede emulsionar agitando. Se mezclan una fase oleosa en donde los lípidos se han disuelto en un disolvente orgánico y una fase acuosa, se agitan y emulsionan para preparar de este modo una emulsión en donde se emulsionan una fase oleosa y una fase acuosa en un tipo O/W (tipo aceite en agua). Después del mezclado, las partículas lipídicas se forman eliminando una parte o la totalidad del disolvente orgánico derivado de la fase oleosa mediante evaporación. Como alternativa, una parte o la totalidad del disolvente orgánico en la fase oleosa se evapora en el transcurso de la emulsificación con agitación para formar partículas lipídicas.
Como un método de agitación, se utilizan ondas ultrasónicas o fuerza de corte mecánica para la miniaturización de partículas. Además, se puede llevar a cabo un procesamiento con extrusora o un procesamiento con microfluidizador para permitir el paso a través de un filtro que tiene un tamaño de poro determinado para lograr uniformidad de los tamaños de partículas. El uso de una extrusora o similar puede dar como resultado la descomposición de partículas lipídicas multivesiculares formados de forma secundaria en partículas lipídicas univesiculares.
La etapa de emulsificación no está limitada siempre que sea una etapa de emulsificación, pero preferentemente es una etapa de aplicación de una fuerza de cizallamiento elevada y realización de una microparticulación con una etapa de emulsificación incluyendo un disolvente orgánico. Si fuera necesario, se puede llevar a cabo la evaporación (desolvatación) del disolvente orgánico usado en la etapa de emulsificación para formar partículas lipídicas.
La temperatura del líquido en la etapa de emulsificación en un caso de producción de partículas lipídicas puede controlarse apropiadamente, pero la temperatura del líquido en el momento de mezclar una fase oleosa y una fase acuosa es preferentemente superior o igual a la temperatura de transición de fase del lípido a ser usado. Por ejemplo, en el caso de que se utilice un lípido que tiene una temperatura de transición de fase de 35 °C a 40 °C, la temperatura del líquido se fija preferentemente en 35 °C a 70 °C.
En la etapa de emulsificación, el disolvente orgánico y el agua se pueden evaporar de la solución acuosa que contiene partículas lipídicas. En cuanto a la evaporación a la que se hace referencia en el presente documento, una parte o todo el disolvente orgánico derivado de la fase oleosa y el agua derivada de la fase acuosa se pueden eliminar por la fuerza como una etapa de evaporación o una parte o todo el disolvente orgánico derivado de la fase oleosa y el agua derivada de la fase acuosa puede evaporarse naturalmente durante el curso de agitación-emulsión.
El método de evaporación no se limita particularmente. Por ejemplo, se puede llevar a cabo al menos una de una etapa de calentamiento para evaporar un disolvente orgánico y agua, una etapa de continuar el reposo o agitación lenta después de la emulsificación, o una etapa de realizar desgasificación al vacío.
<(d) Regulación del tamaño de partículas por extrusora>
Las partículas lipídicas obtenidas se pueden uniformar en tamaño de partícula mediante diálisis, filtración, procesamiento por extrusión, o similares.
El procesamiento de extrusión implica una etapa en la que se hacen pasar partículas lipídicas a través de un filtro que tiene un poro fino para aplicar una fuerza de cizallamiento física, llevando a cabo así la micropartícula de las partículas lipídicas. En el caso de que las partículas lipídicas pasen a través, se puede lograr una microparticulación rápida incubando el líquido de dispersión de partículas lipídicas y el filtro a una temperatura superior o igual a la temperatura de transición de fase de la membrana que constituye el liposoma.
Además, la regulación del tamaño de partículas mediante una extrusora puede realizarse o no.
<(e) Reemplazo de la fase líquida acuosa externa de partículas lipídicas mediante diálisis>
En la presente invención, en el caso de que el panobinostat esté encapsulado en las partículas lipídicas mediante carga remota, el líquido de la fase acuosa exterior de partículas lipídicas puede sustituirse mediante diálisis. Se puede utilizar una solución acuosa de NaCl del 0,1 % al 5 % en masa como líquido de diálisis, lo cual no está particularmente limitado. La diálisis del líquido de partículas lipídicas usando el líquido de diálisis mencionado anteriormente puede proporcionar partículas lipídicas en las que se elimina la sal de amonio presente en la fase acuosa externa y la fase acuosa externa se reemplaza con el líquido de diálisis.
<(f) Encapsulación de panobinostat en partículas lipídicas mediante método de carga remota>
En la presente invención, es preferible encapsular panobinostat en partículas lipídicas mediante un método de carga remota.
En la presente invención, el método de carga remota se refiere a un método para producir un liposoma vacío en el que no se encapsula un fármaco y luego agregar el fármaco al líquido externo del liposoma para introducir el fármaco en el liposoma. El método de carga remota no está particularmente limitado y un ejemplo del mismo es un método que utiliza una solución tampón de citrato o sulfato de amonio.
En el método de carga remota, el fármaco añadido al líquido exterior se transfiere activamente a las partículas lipídicas y se incorpora a las partículas lipídicas. Un gradiente de solubilidad, un gradiente de iones, un gradiente de pH o similar se usa como fuerza impulsora. Por ejemplo, existe un método para introducir un fármaco en partículas lipídicas utilizando un gradiente iónico formado a través de la membrana de una partícula lipídica. Por ejemplo, existe una técnica para añadir un fármaco a partículas lipídicas que se realizan mediante el método de carga remota utilizando un gradiente de concentración de Na+/K+.
Entre los gradientes de iones, generalmente se utiliza un gradiente de concentración de protones. Por ejemplo, hay un aspecto en el que el pH interno (fase acuosa interna) de la membrana de partículas lipídicas tiene un gradiente de pH menor que el pH externo (fase acuosa externa), utilizando ácido cítrico. En concreto, el gradiente de pH puede formarse mediante, por ejemplo, un gradiente de iones amonio y/o un gradiente de concentración de un compuesto orgánico que tiene un grupo amino que puede ser protonado.
La fuente de iones de amonio no está particularmente limitada, pero se usa adecuadamente una sal de amonio soluble en agua y ejemplos de la misma incluyen sulfato de amonio, cloruro de amonio, formiato de amonio, succinato de amonio y acetato de amonio.
<(g) Eliminación del panobinostat en fase acuosa externa mediante diálisis>
El líquido de partículas lipídicas encapsuladas en panobinostat se puede someter a diálisis para eliminar el panobinostat no contenido en las partículas lipídicas. Por ejemplo, sometiendo el líquido de partículas lipídicas encapsuladas en panobinostat a diálisis, usando una concentración predeterminada de tampón sacarosa/histidina como líquido de diálisis, el panobinostat presente en la fase acuosa externa se puede eliminar para obtener una composición de partículas lipídicas en la que la fase acuosa externa se reemplaza con el líquido de diálisis.
<Esterilización por filtración>
La composición de partículas lipídicas obtenida anteriormente se somete preferentemente a esterilización por filtración. Con respecto al método de filtración, es posible eliminar materiales no deseados de la solución acuosa que contiene partículas lipídicas usando una membrana de fibra hueca, una membrana de ósmosis inversa, un filtro de membrana o similares. En la presente invención, es preferible filtrar la composición de partículas lipídicas a través de un filtro que tenga un tamaño de poro esterilizable (preferentemente un filtro de esterilización por filtración de 0,2 pm).
Para evitar un efecto de deformación de las partículas lipídicas sobre el tamaño promedio de las partículas, la etapa de esterilización por filtración y la etapa de llenado aséptico descrita a continuación se llevan a cabo preferentemente a una temperatura inferior o igual a la temperatura de transición de fase del lípido que constituye la partícula lipídica. Por ejemplo, en el caso de que la temperatura de transición de fase del lípido sea de aproximadamente 50 °C, la etapa de esterilización por filtración y la etapa de llenado aséptico que se describen a continuación se llevan a cabo a una temperatura de preferentemente aproximadamente 0 °C a 40 °C, y más específicamente de aproximadamente 5 °C a 30 °C.
<Llenado aséptico>
La composición de partículas lipídicas obtenida después de la esterilización por filtración se llena preferentemente de forma aséptica para aplicaciones médicas. Pueden aplicarse métodos conocidos para el llenado aséptico. Se puede preparar una composición de partículas lipídicas adecuada para aplicaciones médicas llenando asépticamente la composición de partículas lipídicas en un recipiente.
(Composición farmacéutica)
La composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención se puede utilizar como composición farmacéutica. Esto es, de acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que incluye la composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención.
El método de administración de la composición farmacéutica según la realización de la presente invención es preferentemente administración parenteral. Ejemplos de administración parenteral incluyen inyección intravenosa tal como goteo intravenoso, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intraocular e inyección intratecal. El método de administración de la composición farmacéutica puede ser, por ejemplo, administración mediante jeringa o goteo intravenoso.
La dosis y frecuencia de administración de panobinostat o una sal del mismo como fármaco contenido en la composición de partículas lipídicas se puede establecer generalmente en el intervalo de 0,01 mg/kg/día a 100 mg/kg/día en términos de la masa de panobinostat o una sal del mismo, pero la composición de partículas lipídicas según la realización de la presente invención no se limita a estas dosis.
La composición farmacéutica según la realización de la presente invención se puede utilizar preferentemente como agente antitumoral.
El tipo de cáncer al que se aplica la composición farmacéutica según la realización de la presente invención no está particularmente limitado, y ejemplos del mismo incluyen mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia de linfocitos T en adultos, cáncer metastásico de médula ósea, osteosarcoma, leucemia mielomonocítica crónica, linfoma de Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de cuerpo uterino, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer gástrico (adenocarcinoma gástrico), cáncer de pulmón no microcítico, cáncer pancreático, carcinoma de células escamosas del cuello uterino, cáncer de esófago, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer de colon, cáncer de células renales, linfoma no hodgkiniano y cáncer urotelial.
Ejemplos
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá con detalle por medio de ejemplos. No obstante, la presente invención no está limitada a los ejemplos.
[Preparación de la composición de partículas lipídicas]
<Ejemplo 1>
(a) Preparación de la fase oleosa
Se pesaron 0,495 g de 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (fabricada por Nippon Fine Chemical Co., Ltd., denominado en lo sucesivo C20PC), 0,153 g de fosfolípido PEG (SUNBRI<g>H<t>DSPE-020CN, fabricado por NOF Corporation) en lo sucesivo denominado DSPE-PEG) y 0,153 g de colesterol. Para marcar partículas lipídicas con DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina), una cantidad de DiI, que fue de 0,2% en moles con respecto a los lípidos totales, se pesó y se disolvió en etanol. Se añadió etanol a la solución de etanol DiI para obtener un volumen total de 11,25 ml y se le añadieron además 3,75 ml de acetato de etilo. El lípido pesado y este disolvente orgánico se mezclaron y se calentaron a 60 °C para disolver el lípido, preparando así una fase oleosa. (b) Preparación de la fase acuosa
Se preparó una fase acuosa disolviendo 0,9 g de sulfato de amonio en 40 g de agua.
(c) Formación de partículas lipídicas mediante emulsificación
La fase acuosa preparada en (b) se calentó a 70 °C, se le añadió toda la fase oleosa preparada en (a) (relación en volumen: fase acuosa/fase oleosa = 8/3), y luego se mezclaron dos fases usando una máquina de emulsificación (homogeneizador Excel Auto ED-3, fabricado por Nippon Seiki Seisakusho Co., Ltd.) a 3000 rpm (rotación por minuto: 1/60 s-1) por 30 minutos. Seguidamente, el disolvente orgánico y el agua se evaporaron continuando la agitación a 300 rpm mientras se calentaba a 65 °C y en el caso en que el líquido se concentró a 15 g, se detuvieron el calentamiento y la agitación y se detuvo la evaporación.
(d) Regulación del tamaño de partículas por extrusora
Aunque la regulación del tamaño de partícula no se llevó a cabo en el Ejemplo 1, Los ejemplos que tenían una descripción del tamaño del filtro en la columna de "Regulación del tamaño de partículas" entre los ejemplos descritos en la tabla que se proporcionará más adelante se sometieron a la regulación del tamaño de partículas de la siguiente manera. El líquido obtenido en (c) se sometió a la regulación del tamaño de partículas haciéndolo pasar secuencialmente a través de un filtro usando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids, Inc.) en calentamiento a 70 °C. En cuanto al tamaño del filtro, se utilizó un filtro que tenía el tamaño de filtro descrito en la columna de "Regulación del tamaño de partículas" de cada tabla. En el ejemplo descrito para múltiples tamaños de filtro, la regulación del tamaño de partículas se llevó a cabo con un filtro de tamaño de poro grande, y luego la regulación del tamaño de partícula se llevó a cabo con un filtro de tamaño de poro pequeño.
(e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa de partículas lipídicas mediante diálisis
Se usó una solución acuosa de NaCl al 2,43 % en masa como líquido de diálisis. Utilizando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (c) o (d) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para eliminar el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa para obtener partículas lipídicas en las que la fase acuosa externa se reemplazó con el líquido de diálisis.
(f) Encapsulación de panobinostat en partículas lipídicas mediante carga remota
Se añadió agua para inyección a panobinostat (fabricado por APAC Pharmaceutical, LLC.) a 10 mg/ml. Más aún, mientras se agita bien el líquido, se añadió una solución de HCl de 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 3 para disolver el panobinostat. Se añadieron partículas lipídicas a la solución de panobinostat resultante en una proporción de volumen de 1/1, seguido de calentamiento a 60 °C durante 120 minutos.
(g) Eliminación del panobinostat en fase acuosa externa mediante diálisis
Se preparó como líquido de diálisis un tampón sacarosa/histidina que consistía en 9,4% en masa de sacarosa y 10 mmol/l de histidina. Utilizando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (f) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para eliminar el panobinostat presente en la fase acuosa exterior para obtener partículas lipídicas que contenían panobinostat en las que la fase acuosa exterior se reemplazó con el líquido de diálisis.
<Ejemplo 2>
Las partículas lipídicas que contenían panobinostat se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que la cantidad de DSp E-PEG utilizada fue 0,0153 g.
<Ejemplos 3 a 13>
Las partículas lipídicas que contenían panobinostat se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se utilizó la composición lipídica descrita en la tabla proporcionada más adelante. En la tabla que se proporciona más adelante, SM indica esfingomielina (COATSOME n M-10, fabricada por NOF Corporation), y DHSM indica dihidroesfingomielina (un producto sintético hidrogenado de COATSOME NM-10 (fabricado por NOF Corporation)). <Ejemplo 14>
(a) Preparación de la fase oleosa
Se pesaron 0,420 g de esfingomielina (COATSOME NM-10, fabricado por NOF Corporation) en lo sucesivo denominado SM), 0,014 g de fosfolípido PEG (SUNBRIGHT DSPE-020CN, fabricado por NOF Corporation) en lo sucesivo denominado DSPE-PEG) y 0,155 g de colesterol. Para marcar partículas lipídicas con DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina), una cantidad de DiI, que fue de 0,2 % en moles con respecto a los lípidos totales, se pesó y se disolvió en etanol. Se añadió etanol a la solución de etanol DiI para obtener un volumen total de 11,25 ml y se le añadieron además 3,75 ml de acetato de etilo. El lípido pesado y este disolvente orgánico se mezclaron y se calentaron a 70 °C para disolver el lípido, preparando así una fase oleosa.
(b) Preparación de la fase acuosa
Se preparó una fase acuosa disolviendo 0,9 g de sulfato de amonio en 40 g de agua.
(c) Formación de partículas lipídicas mediante emulsificación
La fase acuosa preparada en (b) se calentó a 70 °C, seguido de agitación con un agitador magnético, y se añadió a esto toda la fase oleosa preparada en (a), seguido de agitación durante 30 segundos (proporción de volumen: fase acuosa/fase oleosa = 8/3). Seguidamente, el disolvente orgánico y el agua se evaporaron continuando la agitación a 300 rpm mientras se calentaba a 65 °C y en el caso en que el líquido se concentró a 15 g, se detuvieron el calentamiento y la agitación y se detuvo la evaporación.
(d) Regulación del tamaño de partículas por extrusora
El líquido obtenido en (c) se sometió a la regulación del tamaño de partículas haciéndolo pasar secuencialmente a través de un filtro usando una extrusora (Mini Extruder, fabricada por Avanti Polar Lipids, Inc.) en calentamiento a 70 °C. En cuanto al tamaño del filtro, se utilizó un filtro que tenía el tamaño de filtro descrito en la columna de "Regulación del tamaño de partículas" de cada tabla. En el ejemplo descrito para múltiples tamaños de filtro, la regulación del tamaño de partículas se llevó a cabo con un filtro de tamaño de poro grande, y luego la regulación del tamaño de partícula se llevó a cabo con un filtro de tamaño de poro pequeño.
(e) Reemplazo del líquido de la fase acuosa externa de partículas lipídicas mediante diálisis
Se utilizó una solución acuosa de NaCl 720 mM como líquido de diálisis. Utilizando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (d) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para eliminar el sulfato de amonio presente en la fase acuosa externa para obtener partículas lipídicas en las que la fase acuosa externa se reemplazó con el líquido de diálisis.
(f) Encapsulación de panobinostat en partículas lipídicas mediante carga remota
Se añadió agua para inyección a panobinostat (fabricado por APAC Pharmaceutical, LLC.) a 4 mg/ml. Más aún, mientras se agita bien el líquido, se añadió una solución de HCl de 8 mol/l para ajustar el pH a aproximadamente 4 para disolver el panobinostat. La solución de panobinostat, una solución acuosa de NaCl 720 mM y las partículas lipídicas se mezclaron en una proporción de volumen de 5/3/2 y luego se calentaron a 60 °C durante 120 minutos.
(g) Eliminación del panobinostat en fase acuosa externa mediante diálisis
Se preparó como líquido de diálisis un tampón sacarosa/histidina que consistía en 9,4% en masa de sacarosa y 10 mmol/l de histidina. Utilizando este líquido de diálisis, el líquido obtenido en (f) se sometió a diálisis a temperatura ambiente para eliminar el panobinostat presente en la fase acuosa exterior para obtener partículas lipídicas que contenían panobinostat en las que la fase acuosa exterior se reemplazó con el líquido de diálisis.
<Ejemplos 15 a 25>
Se obtuvieron partículas lipídicas que contenían panobinostat de la misma manera que en el Ejemplo 14 usando las composiciones lipídicas descritas en las Tablas 2 a 4. En el ejemplo 25, las partículas lipídicas se prepararon sin adición de DiI. En las Tablas 2 a 4, C20PC indica 1,2-diaraquidonoil-sn-glicero-3-fosfocolina (fabricada por Nippon Fine Chemical Co., Ltd ); HSPC indica fosfatidilcolina de soja hidrogenada (COATSOME NC-21, fabricado por NOF Corporation); DPPG indica 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, sal de sodio (COATSOME MG-6060LS, fabricado por NOF Corporation); DPPA indica ácido 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatídico, sal de sodio (COATSOME MA-6060LS, fabricado por NOF Corporation); y DPPS indica 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina, sal de sodio (COATSOME MS-6060LS, fabricado por NOF Corporation). En la etapa (f) de encapsular panobinostat en partículas lipídicas mediante carga remota, la solución de panobinostat fue 3,6 mg/ml en los Ejemplos 17 a 25. La proporción de mezcla de la solución de panobinostat, la solución acuosa de NaCl 720 mM y las partículas lipídicas fueron 8/5/5 en el Ejemplo 16 y 2/1/1 en los Ejemplos 17 a 25.
Sólo en el ejemplo 22, el tamaño promedio de partícula es de 331 nm, que es más grande que en otros ejemplos. Esto se debe a que el pico del agregado se observó en la vecindad de 1 pm en la medición del tamaño de partícula mediante DLS, y se calculó que el tamaño promedio de partícula era grande. En el ejemplo 22, el valor absoluto del potencial zeta es pequeño y la repulsión de fase electrostática entre partículas es pequeña. Además, no se ha añadido ningún material como DSPE-PEG que interfiera con la coalescencia de las partículas por repulsión estérica. Aunque la tasa de acumulación de médula ósea es alta en el Ejemplo 22, se puede decir que otros ejemplos son aspectos preferidos desde el punto de vista de la estabilidad de las partículas.
<Ejemplo 25>
En el ejemplo 25, no se añadió DiI en el momento de (a) preparación de una fase oleosa y la tinción con DiI se llevó a cabo en las partículas lipídicas sometidas a diálisis con un tampón de sacarosa/histidina en (g). Se mezclaron 5 pl de solución de Dil/etanol de 3 mg/ml con 500 pl de líquido de partículas lipídicas y la mezcla se agitó a fondo. Tras ello, utilizando un método de filtración en gel (PD MiniTrap G-25, fabricado por GE Healthcare), la fase acuosa exterior se reemplazó con un tampón sacarosa/histidina que consistía en 9,4 % en masa de sacarosa y 10 mmol/l de histidina para eliminar el exceso de DiI.
<Ejemplo comparativo 1>
Se disolvió panobinostat en una mezcla de aceite de ricino polioxil 35 (Kolliphore EL, fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC.) y polietilenglicol 400 (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en una relación de volumen de 1:4 mientras se irradiado con ondas ultrasónicas. La solución obtenida y la solución salina fisiológica se mezclaron en una proporción de volumen de 1:7 para obtener una solución de panobinostat de 0,5 mg/ml.
<Ejemplo comparativo 2>
Las partículas lipídicas se prepararon mediante las mismas etapas que (a) a (e) en el Ejemplo 1 y además, de la misma manera que en (g) en el Ejemplo 1, la fase acuosa exterior se reemplazó con la misma solución que en el Ejemplo 1, de modo que se obtuvieron partículas lipídicas que no contenían panobinostat.
<Ejemplo comparativo 3>
Se pesaron y disolvieron 16,63 g de HSPC, 2,04 g de colesterol y 4,15 g de DSPE-PEG, junto con la cantidad de Dil que fue del 0,2 % en moles respecto a los lípidos totales, en 303,75 ml de etanol y 101,25 ml de acetato de etilo para preparar una fase oleosa. Se mezclaron 5,6 g de dihidrógenofosfato de sodio 100 mmol/l, 37,6 g de hidrogenofosfato disódico de 100 mmol/l y 1037 g de agua para inyección para preparar una fase acuosa. La fase oleosa se mezcló con la fase acuosa y se preparó un liposoma vacío marcado con DiI utilizando un método de emulsificación. La fase acuosa exterior se reemplazó con TFF usando una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,09 % en masa y posteriormente se encapsuló pemetrexed mediante un método de carga pasiva. A esto le siguió diálisis con un tampón de sacarosa/histidina que consistía en 9,4% en masa de sacarosa y 0,155% en masa de histidina para obtener partículas lipídicas que contenían pemetrexed.
<Ejemplo comparativo 4>
Se pesaron y disolvieron 12,42 g de HSPC, 4,14 g de colesterol y 4,14 g de DSPE-PEG, junto con la cantidad de DiI que fue del 0,2 % en moles respecto a los lípidos totales, en 303,4 ml de etanol y 101,25 ml de acetato de etilo para preparar una fase oleosa. Se disolvieron 26,73 g de sulfato de amonio en 1080 g de agua MilliQ para preparar una fase acuosa. Se preparó un liposoma vacío marcado con Dil que contenía sulfato de amonio utilizando un método de emulsificación. La fase acuosa exterior se reemplazó con TFF usando una solución acuosa de cloruro de sodio 417 mM y posteriormente se encapsuló clorhidrato de doxorrubicina mediante un método de carga remota. A esto le siguió diálisis con un tampón de sacarosa/histidina que consistía en 9,4% en masa de sacarosa y 0,155% en masa de histidina para obtener partículas lipídicas que contenían clorhidrato de doxorrubicina. La composición de las partículas lipídicas se hizo referencia a la composición descrita en el prospecto de DOXIL inyectable 20 mg (2 mg/ml de clorhidrato de doxorrubicina, 9,58 mg/ml de HSPC, 3,19 mg/ml DSPE-PEG y 3,19 mg/ml colesterol). Como resultado de la cuantificación, se encontró que tenía 2,24 mg/ml de clorhidrato de doxorrubicina, 11,5 mg/ml de HSPC, 4,1 mg/ml de DSPE-PEG y 4,2 mg/ml de colesterol.
[Medición y evaluación de propiedades físicas]
<Tamaño de partícula promedio>
En la presente invención, el tamaño de partícula se refiere a un tamaño de partícula promedio acumulativo medido mediante un método de dispersión dinámica de luz. Los tamaños de partícula promedio de los Ejemplos y Ejemplos Comparativos descritos en cada tabla son tamaños de partícula promedio acumulativos medidos mediante un método de dispersión dinámica de luz usando un analizador de tamaño de partículas de sistema concentrado FPAR-1000AS (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.) con un muestreador automático. Los resultados de la medición se muestran en cada tabla.
<Potencial zeta>
En la presente invención, el potencial zeta se refiere a un valor medido mediante un método láser Doppler. El potencial zeta de los ejemplos descritos en cada tabla es un valor obtenido diluyendo un líquido de partículas lipídicas 20 veces con un tampón de sacarosa/histidina que consiste en 9,4 % en masa de sacarosa y 10 mmol/l de histidina, que es la misma que la fase de agua exterior, y medir el potencial zeta con un sistema de medición de potencial zeta/tamaño de partícula ELSZ-2 (fabricado por Otsuka Electronics Co., Ltd.). Los resultados de la medición se muestran en cada tabla.
<Concentración de API>
En la presente invención, la concentración de API descrita en cada tabla es un valor obtenido midiendo la cantidad de panobinostat (forma libre) contenida en partículas lipídicas mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Se utilizó luz ultravioleta (UV) a 279 nm para la detección de panobinostat.
<Concentración de lípidos>
En la presente invención, la concentración de lípidos descrita en cada tabla es un total de la concentración de cada lípido obtenida cuantificando cada lípido contenido en partículas lipídicas mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución). Se utilizó un detector de partículas cargadas de corona (detector de aerosol cargado de corona (CAD)) para la detección de lípidos.
<Observación por microscopio electrónico de transmisión (TEM)>
La composición de partículas lipídicas del Ejemplo 1 se congeló rápidamente y se observó en condiciones criogénicas usando un TEM universal para obtener una imagen TEM. La imagen TEM obtenida se muestra en la Figura 1. De la imagen TEM de la Figura 1, se puede ver que el material solidificado de panobinostat está presente en al menos una parte de la superficie y el interior de la partícula lipídica.
<Medición de la tasa de acumulación de partículas lipídicas en la médula ósea>
Se usaron ratones ICR (macho, de 7 semanas de edad, ICR es una sigla de Institute of Cancer Research) para la prueba. Las partículas lipídicas que contenían panobinostat (6 mg/kg en términos de cantidad de fármaco) preparadas en los Ejemplos 1 y 3 a 7 y marcadas con un tinte fluorescente (Dil) se administraron desde la vena de la cola del animal. Además, las partículas lipídicas que contenían panobinostat (4 mg/kg en términos de cantidad de fármaco) preparadas en los Ejemplos 2 y 8 a 13 y marcadas con un tinte fluorescente (DiI) se administraron desde la vena de la cola del animal. Además, las partículas lipídicas que no contenían panobinostat (la misma cantidad que en el Ejemplo 1 en términos de cantidad de lípidos), preparado en el Ejemplo Comparativo 2 y marcado con un tinte fluorescente (DiI), se administraron desde la vena de la cola del animal. Además, las partículas lipídicas que contenían pemetrexed (1,5 mg/kg en términos de cantidad de fármaco), preparado en el Ejemplo Comparativo 3 y marcado con un tinte fluorescente (DiI), se administraron desde la vena de la cola del animal. Además, las partículas lipídicas que contenían clorhidrato de doxorrubicina (16,7 mg/kg en términos de cantidad de fármaco), preparado en el Ejemplo Comparativo 4 y marcado con un tinte fluorescente (DiI), se administraron desde la vena de la cola del animal.
72 horas después de la administración de partículas lipídicas, se diseccionaron ratones y se recogió la médula ósea femoral. Con respecto a la médula ósea recolectada, la concentración de DiI en el líquido y el tejido de administración se cuantificó utilizando un detector de fluorescencia de HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) y la tasa de acumulación en la médula ósea se calculó mediante la Fórmula 2. Circunstancialmente, la tasa de acumulación en la médula ósea se muestra como un porcentaje de partículas lipídicas acumuladas en la médula ósea (% de dosis inyectada/g, también expresado como % de DI/g), entre las partículas lipídicas administradas por gramo de médula ósea. Los resultados de la medición se muestran en cada tabla.
Fórmula 2: Tasa de acumulación en la médula ósea (% de DI/g) = Concentración de Dil en la médula ósea (ng/g)/(Concentración de DiI en el líquido de administración (ng/ml)xdosis (ml))x 100
Las composiciones de partículas lipídicas de los Ejemplos 1 a 25 de la presente invención exhibieron propiedades de alta acumulación en la médula ósea en comparación con las composiciones de partículas lipídicas de los Ejemplos Comparativos 2 a 4.
De los ejemplos 3 a 5 y 22 a 24, cuanto menor sea la cantidad de DSPE-PEG añadida, mejores serán las propiedades de acumulación en la médula ósea. Además, a partir de los Ejemplos 10 a 13, cuanto mayor sea el tamaño de las partículas, mejor será la capacidad de acumularse en la médula ósea, pero, por otro lado, incluso para partículas lipídicas pequeñas de aproximadamente 100 nm, se obtuvieron mayores propiedades de acumulación en la médula ósea en comparación con las partículas lipídicas que no encapsulan panobinostat (liposomas vacíos). A partir de los Ejemplos 14 a 17, las propiedades de acumulación en la médula ósea mejoraron mediante la adición de lípidos aniónicos.
Se supone que las partículas lipídicas que encapsulan panobinostat están altamente acumuladas en la médula ósea al ser reconocidas por los macrófagos, como se muestra en el análisis posterior. Se cree que todos los factores mencionados anteriormente contribuyen indirectamente a mejorar la capacidad de acumulación de la médula ósea al afectar a la facilidad de reconocimiento de los macrófagos. Por ejemplo, en un caso en el que el potencial zeta se reduce mediante la adición de un lípido aniónico, existe un efecto como el de ser fácilmente reconocido por un receptor secuestrante de macrófagos, que se considera relacionado con la mejora de las propiedades de acumulación de médula ósea.
<Medición de la concentración tisular de panobinostat>
Las partículas lipídicas que contienen panobinostat (4 mg/kg en términos de cantidad de fármaco) preparadas en los Ejemplos 1,2, 14 y 19 se administraron a ratones ICR (macho, 7 semanas de edad) desde la vena de la cola. Además, la solución de panobinostat (5 mg/kg) preparada en el Ejemplo Comparativo 1 se administró por vía intraperitoneal a ratones ICR (macho, 7 semanas de edad). Asumiendo la dosis en la prueba de eficacia del fármaco, la dosis de las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en los Ejemplos 1,2, 14 y 19 se ajustó a la dosis máxima de tolerancia en administración única y la dosis de la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1 se ajustó a la dosis máxima de tolerancia. para administración diaria durante 8 días.
Los ratones a los que se administraron las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en los Ejemplos 1, 2, 14 y 19 se diseccionaron a las 3, 6, 24, 72 y 168 horas después de la administración. Los ratones a los que se administró la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1 se diseccionaron 1, 3, 6, 24 y 72 horas después de la administración, y se extrajo sangre, médula ósea femoral y el tracto gastrointestinal (íleon inferior). La sangre se centrifugó a 800 xg durante 10 minutos para recuperar el plasma. El tracto gastrointestinal se homogeneizó mediante congelación y trituración. Con respecto al plasma, médula ósea y tracto gastrointestinal recolectados, la cuantificación de la concentración tisular de panobinostat se llevó a cabo mediante cromatografía líquida/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS). Usando el software de análisis farmacocinético WinNonlin (marca registrada) (disponible en Certara, L.P.), el área bajo la curva de concentración tisular-tiempo (AUC) hasta un tiempo infinito después de la administración única se calculó a partir de la transición de la concentración de panobinostat así obtenida en los tejidos. Más aún, la relación médula ósea/gastrointestinal de la AUC en tejido se calculó según la Fórmula 1. Los resultados se muestran en las figuras 2 y 3 y la tabla 5.
Fórmula 1: Relación médula ósea/tracto gastrointestinal = AUC de panobinostat en médula ósea/AUC de panobinostat en tracto gastrointestinal = (área bajo la curva concentración-tiempo en médula ósea)/(área bajo la curva concentración-tiempo en el tracto gastrointestinal)
<Medición de la concentración tisular de pemetrexed>
Las partículas lipídicas que contienen pemetrexed (1,5 mg/kg en términos de cantidad de fármaco) preparadas en el Ejemplo Comparativo 3 se administraron a ratones ICR (macho, 7 semanas de edad) desde la vena de la cola.
Los ratones a los que se administraron las partículas lipídicas que contienen pemetrexed preparadas en el Ejemplo Comparativo 3 se diseccionaron a las 24, 72, 120 y 168 horas después de la administración, y se extrajo sangre, médula ósea femoral y el tracto gastrointestinal (íleon inferior). La concentración tisular de pemetrexed se cuantificó de la misma manera que en panobinostat y se calculó el AUC y la relación médula ósea/gastrointestinal del AUC en los tejidos. Los resultados se muestran en la Tabla 5.
A partir de los resultados anteriores, se demostró que las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en los Ejemplos 1, 2, 14 y 19 tienen una relación médula ósea/tracto gastrointestinal elevada y propiedades de acumulación de médula ósea satisfactorias con respecto al AUC de panobinostat en tejido, en comparación con la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1 y las partículas lipídicas que contienen pemetrexed preparadas en el Ejemplo Comparativo 3.
<Prueba de eficacia del fármaco utilizando el modelo de ratón ortotópico Molm-13>
Se inmunosuprimieron ratones NOD/SCID (macho, 8 semanas de edad) con ciclofosfamida (125 mg/kg, administración intraperitoneal durante 2 días consecutivos) y anticuerpo de conejo anti-asialo GM1 (disponible en Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 0,4 mg, administración intraperitoneal, administración única). 3*10® células de Molm-13, que es una línea celular de leucemia humana, fueron trasplantados por vía intravenosa e injertados en la médula ósea. A partir del día 8 después del trasplante, la administración de las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 1 (8 mg/kg en términos de cantidad de fármaco, administración en la vena de la cola, administración única), la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1 (5 mg/kg, administración intraperitoneal durante 8 días consecutivos), y las partículas lipídicas que no contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo Comparativo 2 (cantidad de lípido equivalente a 8 mg/kg de las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 1, administración en la vena de la cola, administración única) como control negativo. Además, el grupo no sometido a inmunosupresión y trasplante se estableció como grupo sin trasplante. El día 16 después del trasplante (8 días después del inicio de la administración), se diseccionaron los ratones y se recogió médula ósea femoral. La médula ósea obtenida se trató con un tampón de hemólisis para eliminar los eritrocitos y luego se tiñó con anticuerpo CD45 antihumano marcado con PerCP y 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Además, PerCP indica complejo peridinina clorofila-proteína. El porcentaje de células leucémicas (células humanas positivas para CD45 negativas para DAPI) en células vivas de la médula ósea mediante citometría de flujo y se comparó la actividad inhibidora del crecimiento contra células leucémicas en ratones modelo ortotópicos Molm-13. Los resultados de la medición se muestran en la figura 4.
A partir de los resultados mostrados en la figura 4, se descubrió que, en comparación con la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1 y las partículas lipídicas sin contener panobinostat preparadas en el Ejemplo Comparativo 2, las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 1 exhiben una alta actividad inhibidora del crecimiento contra las células leucémicas, cuyo efecto depende de la dosis.
<Análisis del número de macrófagos en la médula ósea y cantidad de partículas lipídicas en las células>
Las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 2 y marcadas con Dil se administraron con 6 mg/kg de panobinostat en términos de cantidad de fármaco a ratones ICR (macho, 7 semanas de edad) desde la vena de la cola. Después de la no administración, 6 horas después de la administración y 96 horas después de la administración, se diseccionaron los ratones y se recogió médula ósea femoral. La médula ósea obtenida se trató con un tampón de hemólisis para eliminar los eritrocitos y luego se tiñó con el anticuerpo anti-ratón F4/80 marcado con Alexa fluor (marca registrada) 647, anticuerpo CD11b anti-ratón marcado con FITC y DAPI. FITC indica isotiocianato de fluoresceína. El porcentaje de macrófagos (células de ratón positivas para F4/80, de ratón positivas para CD11 negativas para DAPI) en células vivas de la médula ósea se midió mediante citometría de flujo. Más aún, para la muestra 96 horas después de la administración, la cantidad de partículas lipídicas introducidas en las células se analizó utilizando la intensidad de fluorescencia intracelular de DiI como índice. Los resultados del análisis se muestran en la figura 5. En la figura 5, M$ indica macrófagos.
A partir de los resultados mostrados en la figura 5, se encontró que el número de macrófagos en la médula ósea aumenta con el paso del tiempo después de la administración de las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 2, y las partículas lipídicas que contienen panobinostat son absorbidas por los macrófagos aumentados.
<Análisis de la expresión de citocinas en la médula ósea>
Las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 2 (4 mg/kg en términos de cantidad de fármaco, administración en la vena de la cola, administración única) y la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1 (5 mg/kg, administración intraperitoneal, administración única) se administraron a ratones ICR (macho, 7 semanas de edad), y 72 horas después de la administración, los ratones se diseccionaron para recolectar médula ósea femoral. Además, también se obtuvo médula ósea femoral de ratones a los que no se les administró como control negativo. Después de añadir 3 veces el peso de la médula ósea de PBS, el sobrenadante se recuperó mediante centrifugación a 30o xg durante 5 minutos. La concentración de proteína en el sobrenadante de médula ósea obtenido se midió mediante un método BCA (método del ácido bicinconínico) y cada muestra se diluyó hasta una concentración de proteína de 8 mg/ml. La concentración de citocinas en cada muestra se cuantificó utilizando un panel de citocinas de ratón GI23-Plex Bio-Plex y un sistema Bio-Plex 200 (disponible en Bio-Rad Laboratories, Inc.). Se mostraron los cambios en el nivel de expresión relativo en un caso en el que el valor medio del nivel de expresión de citocinas en el momento de la no administración se consideró 1. Los resultados del análisis se muestran en la figura 6.
En la figura 6, IL indica una interleucina, G-CSF indica un factor estimulante de colonias de granulocitos, GM-CSF indica un factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos, IFN indica un interferón, KC indica un quimioatrayente de queratinocitos, MCP indica una proteína quimiotáctica de monocitos, MIP indica una proteína inflamatoria de macrófagos, RANTES indica T normal regulada por activación expresada y secretada, y TNF indica un factor de necrosis tumoral.
A partir de los resultados mostrados en la figura 6, en un caso en el que se administraron las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 2 o la solución de panobinostat preparada en el Ejemplo Comparativo 1, se observó una tendencia a que la expresión de citocinas aumente en comparación con un caso de no administración. En las partículas lipídicas que contienen panobinostat preparadas en el Ejemplo 2, la expresión de citocinas se mejoró aún más. Un aumento en la expresión de citocinas se considera un factor por el que los macrófagos se acumulan en la médula ósea.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de cáncer, que comprende una composición de partículas lipídicas:
en donde la composición de partículas lipídicas comprende panobinostat o una sal del mismo,
en donde una partícula lipídica contiene un fosfolípido y colesterol.
2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde una relación de área representada por la Fórmula 1 hasta un tiempo infinito después de la administración única de una composición de partículas lipídicas de 4 mg/kg como cantidad de panobinostat a una vena de la cola de un ratón es 5 o más.
Fórmula 1: (área bajo la curva de concentración-tiempo en la médula ósea)/(área bajo la curva de concentracióntiempo del tracto gastrointestinal)
3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la partícula lipídica tiene un tamaño de partícula promedio de 50 nm a 500 nm medido usando un método de dispersión dinámica de luz.
4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el panobinostat o la sal del mismo se encapsula en la partícula lipídica mediante un método de carga remota.
5. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde un material solidificado del panobinostat o la sal del mismo está presente en al menos una parte de una superficie y un interior de la partícula lipídica.
6. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene un fosfolípido que tiene un esqueleto de glicerol, como el fosfolípido.
7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el fosfolípido que tiene un esqueleto de glicerol es fosfatidilcolina.
8. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene un esfingofosfolípido como fosfolípido.
9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el esfingofosfolípido es esfingomielina.
10. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el fosfolípido contiene un resto de ácido graso que tiene 20 o más átomos de carbono.
11. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la partícula lipídica contiene además un lípido de polietilenglicol.
12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde un porcentaje del lípido de polietilenglicol en los lípidos totales que constituyen la partícula lipídica es del 5 % en moles o menos.
13. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la partícula lipídica está sustancialmente libre de un lípido de polietilenglicol.
14. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la partícula lipídica contiene un lípido aniónico.
15. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la partícula lipídica tiene un tamaño de partícula promedio de 100 nm a 300 nm medido usando un método de dispersión dinámica de luz.
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