ES2968737T3 - Proceso para producir células T manipuladas genéticamente - Google Patents

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Abstract

La presente divulgación proporciona poblaciones celulares enriquecidas en células T CD57 negativas, o agotadas en células CD57 positivas, y métodos para estimular, cultivar, expandir y/o modificar genéticamente poblaciones de células enriquecidas en células T CD57-o agotadas en células T CD57+. También se incluyen métodos para generar, aislar, enriquecer o seleccionar células T CD57- o agotar células CD57+, tales como mediante selección negativa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso para producir células T manipuladas genéticamente
Campo
La presente divulgación se refiere en algunos aspectos a poblaciones celulares enriquecidas para células T negativas para CD57, o agotadas para células positivas para CD57, y métodos para estimular, cultivar, expandir, y/o manipular genéticamente poblaciones celulares enriquecidas para células T negativas para CD57 o agotadas para células T positivas para<c>D57. También se incluyen métodos para generar, aislar, enriquecer o seleccionar células T negativas para CD57, o agotar células positivas para CD57, como por selección negativa.
Antecedentes
Hay varios métodos de terapia celular para tratar enfermedades y afecciones. Entre los métodos de terapia celular se encuentran los que implican células inmunitarias, como las células T, manipuladas genéticamente con un receptor recombinante, como los receptores de antígenos quiméricos. Sin embargo, en algunos casos, algunos de los procesos existentes pueden dar como resultado una población con baja consistencia, potencia o persistenciain vivo.Se necesitan métodos mejorados para la fabricación y/o manipulación de tales terapias celulares, incluso para proporcionar un producto de terapia celular mejorado con alta consistencia, potencia y persistencia in vivo.
La WO2016/187216 describe composiciones para terapias celulares adoptivas para dirigirse a cánceres que expresan el receptor huérfano 1 similar al receptor detirosina quinasa (ROR1). Wolf et al, Nature Protocols, 2014, vol.
9, N° 4, páginas 950-966 describe la activación específica del antígeno de la expansión facilitada por citoquinas de células T CD8+ humanas vírgenes. Casati et al, Cancer Immunology, 2016, vol. 62, N° 10, páginas 1563-1573 describe la selección a escala clínica y la transducción viral de células T CD8+ humanas vírgenes y de memoria central para la terapia celular adoptiva de pacientes con cáncer. Hinrichs et al, Journal of the American Society of Hematology, 2011, vol. 117, N° 3, páginas 808-814 describe que las células T CD8+ efectoras humanas derivadas de subconjuntos nativos en lugar de memoria poseen características superiores para la inmunoterapia adoptiva. Ohkawa et al, Immunology Oxford, 2001, páginas 281-290 describe la caracterización sistemática de células T CD8+ humanas con marcadores de células asesinas naturales en comparación con células asesinas naturales y células T CD8+ normales.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona un método para enriquecer células T y generar una población manipulada de células T, el método comprendiendo:
(a) realizar una primera selección, la primera selección comprendiendo enriquecer para cualquiera de las células T CD57- o CD3+ a partir de una muestra biológica que comprende células T humanas primarias, generando de este modo una población de células T enriquecida; en donde:
(b) realizar una segunda selección de las células de la población de células T enriquecidas, en donde:
la primera selección comprende enriquecer para células T CD57- y la segunda selección comprende enriquecer para células T CD3+ a partir de la población enriquecida; o
la primera selección comprende enriquecer para células T CD3+ y la segunda selección comprende eliminar células T CD57+ de la población de células T enriquecidas,
en donde el método genera una población agotada que comprende menos células T CD57+ que la muestra biológica y está enriquecida para células T CD3+, y
(c) introducir un polinucleótido heterólogo que codifique un receptor recombinante en una población de células T obtenida a partir de la población agotada, generando de este modo una población manipulada de células T.
En algunas de tales realizaciones, la población agotada contiene por lo menos uno de los siguientes: (i) menos de o de aproximadamente un 5% de células T CD57+; (ii) una frecuencia de células T CD57+ que es menor de o de aproximadamente un 35% de la frecuencia de células T CD57+ presentes en la muestra biológica; (iii) células T CD4+, en donde por lo menos o aproximadamente un 95% de las células T CD4+ son CD57-; y (iv) células T CD8+, en donde por lo menos o aproximadamente un 95% de las células T CD8+ son CD57-. En algunas de tales realizaciones, por lo menos o aproximadamente el 95% de las células T CD3+ de la población agotada contiene células T CD57-CD3+.
En algunas de tales realizaciones, la muestra biológica comprende un producto de aféresis o un producto de leucaféresis.
En algunas de tales realizaciones, la población agotada contiene células T CD57-CD4+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada contiene células T CD57- CD8+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada contiene células T CD57-CD4+ y células T CD57-CD8+.
En algunas de tales realizaciones, la frecuencia de las células CD57+ en la población agotada es menor de o de aproximadamente un 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o 0,1% de la frecuencia de células T CD57+ en la muestra biológica. En algunas de tales realizaciones, la frecuencia de las células T CD57+ en la población agotada es menor de o de aproximadamente un 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o 0,1% de la frecuencia de células T CD57+ en la muestra biológica. En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende menos de o de aproximadamente un 3%, menos de o de aproximadamente un 2%, menos de o de aproximadamente un 1%, menos de o de aproximadamente un 0,1%, o menos de o de aproximadamente un 0,01% de células T CD57+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada está libre o esencialmente libre de células T CD57+. En algunas realizaciones, una población agotada que está esencialmente libre de células T CD57+ comprende menos de aproximadamente o aproximadamente un 3%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 2%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 1%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 0,1% o menos de aproximadamente o aproximadamente un 0,01% de células T CD57+.
En algunas de tales realizaciones, por lo menos o aproximadamente el 95% de las células T CD4+ de la población agotada comprende células T CD57-CD4+. En algunas de tales realizaciones, por lo menos o aproximadamente el 95% de las células T CD8+ de la población agotada comprende células T CD57-CD8+. En algunas de tales realizaciones, por lo menos o aproximadamente el 95% de las células T CD4+ y el 95% de las células T CD8+ de la población agotada comprende células T CD57-CD4+ y células T CD57-CD8+, respectivamente.
En algunas de tales realizaciones, la frecuencia de las células de tipo virgen en la población agotada es por lo menos de o de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor de o de aproximadamente la frecuencia de células de tipo virgen en la muestra biológica. En algunas de tales realizaciones, la frecuencia de una o más células T CD25+, células T CD27+, células T CD28+, células T CCR7+ o células T CD45RA+ en la población agotada es por lo menos o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la frecuencia de las células respectivas en la muestra biológica.
En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende por lo menos o aproximadamente un 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD27+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD28+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD27+CD28+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de células T CD27+CD28+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende por lo menos o aproximadamente un 70% o un 80% de células T CD27+CD28+. En algunas de tales realizaciones, la población agotada comprende por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20% o 25% de células T CCR7+.
En algunas de cualquiera de las realizaciones proporcionadas, la población agotada se usa como composición de entrada para los pasos posteriores de un proceso para manipular genéticamente células T. En algunas realizaciones, la composición de entrada incluye poblaciones agotadas de CD57 enriquecidas para células CD4+ (CD57-CD4+) y enriquecidas para células CD8+ (CD57-CD8+). En algunas realizaciones, la composición de entrada incluye poblaciones agotadas para CD57 enriquecidas para células T CD4+ (CD57-CD4+) y enriquecidas para células T CD8+ (CD57-CD8+).
En algunos de los métodos proporcionados, el método produce una composición de células T que contiene por lo menos o aproximadamente el 90%, por lo menos o aproximadamente el 95%, por lo menos o aproximadamente el 97%, por lo menos o aproximadamente el 99% o por lo menos o aproximadamente el 99,9% de células T CD57-CD4+. En algunos de los métodos proporcionados, el método produce una composición de células T que contiene por lo menos o aproximadamente un 90%, por lo menos o aproximadamente un 95%, por lo menos o aproximadamente un 97%, por lo menos o aproximadamente un 99% o por lo menos o aproximadamente un 99,9% de células T CD57-CD8+. En algunos de los métodos proporcionados, el método produce una composición de células T que contiene por lo menos de o de aproximadamente el 90%, por lo menos de o de aproximadamente el 95%, por lo menos de o de aproximadamente el 97%, por lo menos de o de aproximadamente el 99% o por lo menos de o de aproximadamente el 99,9% de células T CD57-CD3+.
En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proporción de células T CD4+ a CD8+ en la composición está entre 3:1 y 1:3, cada una inclusive. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proporción de células T CD4+ a CD8+ en la composición está entre 2:1 y 1:2, cada una inclusive. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proporción de células T CD4+ a CD8+ en la composición está entre 1,5:1 y 1:1,5, cada una inclusive. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proporción de células T CD4+ a CD8+ en la composición está entre 1,2:1 y 1:1,2, cada una inclusive. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la proporción de células T CD4+ y CD8+ en la composición es de o de aproximadamente 1:1 CD4+. En algunas de las realizaciones proporcionadas, las células T primarias proceden de un sujeto con una enfermedad o afección. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la enfermedad o afección es un cáncer. En algunas de las realizaciones proporcionadas, las células T primarias proceden de un sujeto sano.
En algunas de las realizaciones proporcionadas, la eliminación de las células T CD57+ incluye la selección basada en inmunoafinidad. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la selección basada en inmunoafinidad incluye poner en contacto las células con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a CD57 y recuperar las células no unidas al anticuerpo, efectuando de este modo una selección negativa, en donde las células recuperadas se agotan para las células CD57+. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el enriquecimiento de células comprende selección basada en inmunoafinidad. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la selección enriquece para células T CD3 y la selección basada en inmunoafinidad se efectúa poniendo en contacto las células con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a CD3, y recuperar las células unidas al anticuerpo, efectuando de este modo una selección positiva, en donde las células recuperadas se enriquecen para las células CD3+. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el anticuerpo se inmoviliza en una superficie sólida. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la superficie sólida es una partícula magnética. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el anticuerpo está inmovilizado o unido a una matriz de cromatografía de afinidad.
En algunas de las realizaciones proporcionadas, el anticuerpo incluye además una o más moléculas de unión capaces de formar un enlace reversible con un reactivo de unión inmovilizado en la matriz, por lo que el anticuerpo se une reversiblemente a dicha matriz cromatográfica durante dicho contacto. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el reactivo de unión es una muteína de estreptavidina que se une reversiblemente a la molécula de unión. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la muteína de estreptavidina contiene la secuencia de aminoácidos lle44-Gly45-Ala46-Arg47 en posiciones de secuencia correspondientes a las posiciones 44 a 47 con referencia a posiciones en estreptavidina en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:66; o la muteína de estreptavidina contiene la secuencia de aminoácidos Va144-Thr45-Ala46-Arg47 en posiciones de secuencia correspondientes a las posiciones 44 a 47 con referencia a posiciones en estreptavidina en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 66. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la molécula de unión es un péptido de unión a estreptavidina. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el péptido de unión a estreptavidina se selecciona del grupo que consiste en Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 69), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO:78), SAWSHPQFEKGGGSGGSGGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO:79), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 71) y Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 72). En algunas de las realizaciones proporcionadas, el péptido de unión a estreptavidina tiene la secuencia SAWSHPQFEKGGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO:79). En algunas de las realizaciones proporcionadas, el método incluye además, después de poner en contacto las células de la muestra con la matriz de cromatografía de afinidad, aplicar un reactivo de competición para interrumpir la unión entre la molécula de unión y el reactivo de unión, recuperando de este modo las células unidas al anticuerpo. En algunas de las realizaciones proporcionadas, el reactivo de competición es biotina o un análogo de biotina. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la matriz cromatográfica se empaqueta en un recipiente de separación, que es una columna. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la muestra biológica que comprende las células T primarias es una muestra formulada con un crioprotector. En algunas de las realizaciones proporcionadas, la muestra de aféresis o leucaféresis es una muestra formulada con un crioprotector.
En algunas de tales realizaciones, las condiciones de estimulación incluyen la presencia de un reactivo estimulador, dicho reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo TCR y uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras. En algunas de tales realizaciones, el reactivo estimulador contiene (i) un agente primario que se une específicamente a un miembro de un complejo TCR, opcionalmente que se une específicamente a CD3 y (ii) un agente secundario que se une específicamente a una molécula coestimuladora de células T, opcionalmente en donde la molécula coestimuladora se selecciona entre CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 o ICOS.
En algunas de tales realizaciones, uno o ambos de los agentes primario y secundario incluyen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas de tales realizaciones, los agentes primario y secundario incluyen un anticuerpo, opcionalmente en donde el reactivo estimulador incluye la incubación con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas de tales realizaciones, el agente primario es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo y el agente secundario es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas de tales realizaciones, el fragmento de unión a antígeno es un fragmento de anticuerpo monovalente seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En algunas de tales realizaciones, el agente primario es un Fab anti-CD3 y el agente secundario comprende un Fab anti-CD28. En algunas de tales realizaciones, el agente primario y el agente secundario están presentes o unidos en la superficie de un soporte sólido. En algunas de tales realizaciones, el soporte sólido es o comprende una perla, opcionalmente una perla paramagnética. En algunas de tales realizaciones, el soporte sólido es una perla paramagnética con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 adheridos a la superficie, y el reactivo estimulador está presente en una proporción de menos de aproximadamente o aproximadamente 3:1 perlas a células.
En algunas de tales realizaciones, las condiciones de estimulación incluyen la presencia de un reactivo estimulador que contiene una perla paramagnética con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 adheridos a la superficie, dicho reactivo estimulador presente en una proporción de menos de o aproximadamente 3:1 perlas a células. En algunas de tales realizaciones, dicho reactivo estimulador está presente en una proporción de o de aproximadamente 1:1 perlas a células.
En algunas de tales realizaciones, el método incluye además separar el reactivo estimulador de las células, dicha separación incluyendo la exposición de las células a un campo magnético.
En algunas de tales realizaciones, el agente primario y el agente secundario están unidos reversiblemente en la superficie de un reactivo de partícula oligomérica que comprende una pluralidad de moléculas de estreptavidina 0 muteína de estreptavidina. En algunas de tales realizaciones, las moléculas de estreptavidina o muteína de estreptavidina se unen o son capaces de unirse a biotina, avidina, un análogo o muteína de biotina, un análogo o muteína de avidina, y/o un fragmento biológicamente activo de los mismos. En algunas de tales realizaciones, las moléculas de muteína de estreptavidina incluyen la secuencia de aminoácidos Val44-Thr45-Ala46-Arg47 o Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 en posiciones de secuencia correspondientes a las posiciones 44 a 47 con referencia a posiciones en estreptavidina en la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 66. En algunas de tales realizaciones, las moléculas de muteína de estreptavidina contienen: a) la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 66-68, 73, 80-82, u 85-88; b) una secuencia de aminoácidos que muestran por lo menos o aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 70-73, 78 y 85-89 y contienen la secuencia de aminoácidos correspondiente a Val44-Thr45-Ala46-Arg47 o Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 y/o se unen reversiblemente a biotina, a un análogo de biotina o a un péptido de unión a estreptavidina; o c) un fragmento funcional de a) o b) que se une reversiblemente a biotina, a un análogo de biotina o a un péptido de unión a estreptavidina.
En algunas de tales realizaciones, las moléculas de muteína de estreptavidina contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73 o 78. En algunas de tales realizaciones, las moléculas de muteína de estreptavidina contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 73. En algunas de tales realizaciones, las moléculas de muteína de estreptavidina contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 78. En algunas de tales realizaciones, el agente primario y el agente secundario contienen cada uno un péptido de unión a estreptavidina. En algunas de tales realizaciones, el péptido de unión a estreptavidina se selecciona del grupo que consiste en Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)a-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 76), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)<2>-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 77) y Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)<2>Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 89). En algunas de tales realizaciones, el péptido de unión a estreptavidina se selecciona del grupo que consiste en Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 71) y Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)<2>Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 89). En algunas de tales realizaciones, el agente primario incluye un Fab anti-CD3 y en donde el agente secundario contiene un Fab anti-CD28.
En algunas de tales realizaciones, el reactivo de partículas oligoméricas contiene un radio de más de o de aproximadamente 60 nm, de más de o de aproximadamente 70 nm, de más de o de aproximadamente 80 nm, o de más de o de aproximadamente 90 nm. En algunas de tales realizaciones, el reactivo de partículas oligoméricas contiene un peso molecular de: por lo menos o aproximadamente 5 x 107 g/mol, o por lo menos o aproximadamente 1 x 108 g/mol; y/o entre 5 x 107 g/mol y 5 x 108 g/mol, entre 1 x 108 g/mol y 5 x 108 g/mol, o entre 1 x 108 g/mol y 2 x 108 g/mol. En algunas de tales realizaciones, el reactivo de partículas oligoméricas contiene por lo menos o aproximadamente 500 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, por lo menos o aproximadamente 1.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, por lo menos o aproximadamente 1.500 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, o por lo menos o aproximadamente 2.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina; y/o; entre 1.000 y 20.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, entre 1.000 y 10.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, o entre 2.000 y 5.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina.
En algunas de tales realizaciones, el método incluye además separar el reactivo estimulador de las células, dicha separación incluyendo poner en contacto una sustancia con las células, dicha sustancia siendo capaz de invertir los enlaces entre el agente primario y secundario y el reactivo de partículas oligoméricas.
En algunas de tales realizaciones, la sustancia es un molécula de unión libre y/o es un agente de competencia. En algunas de tales realizaciones, la presencia de la sustancia termina o disminuye la señal inducida o modulada por el agente primario y secundario en las células T. En algunas de tales realizaciones, la sustancia es o incluye un péptido de unión a estreptavidina, biotina o un fragmento biológicamente activo, o un análogo de biotina o un fragmento biológicamente activo. En algunas de tales realizaciones, la sustancia es o incluye un análogo de la biotina. En algunas de tales realizaciones, la sustancia es o incluye un péptido de unión a estreptavidina y el péptido de unión a estreptavidina se selecciona del grupo que consiste en Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 69), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlySer)<3>-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 70), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlySer)<2>-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 77, por ejemplo S<e>Q ID NO:71) y Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)zGly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 89, también expuesto SEQ ID NO:72). En algunas de tales realizaciones, la sustancia es o incluye biotina o un fragmento biológicamente activo, o un análogo de biotina o un fragmento biológicamente activo.
En algunas de tales realizaciones, las condiciones de estimulación incluyen la presencia de una o más citoquinas recombinantes. En algunas de tales realizaciones, las condiciones de estimulación incluyen la presencia de una o más de las IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes.
En algunas de tales realizaciones, antes de la introducción, la población agotada se incuba en condiciones estimuladoras.
En algunas de tales realizaciones, la introducción incluye la transducción con un vector viral que comprende el polinucleótido heterólogo. En algunas de tales realizaciones, el vector viral es un vector gammaretroviral o un vector lentiviral. En algunas de tales realizaciones, el vector viral es un vector lentiviral.
En algunas de tales realizaciones, el método incluye además incubar la composición que contiene las células transducidas hasta 96 horas después de la introducción. En algunas de tales realizaciones, la incubación se lleva a cabo a una temperatura de por lo menos 37°± 2° C. En algunas de tales realizaciones, la incubación se lleva a cabo hasta 72 horas después de la introducción. En algunas de tales realizaciones, la incubación se lleva a cabo hasta 48 horas después de la introducción. En algunas de tales realizaciones, la incubación se lleva a cabo hasta 24 horas después de la introducción. En algunas de tales realizaciones, la incubación da como resultado la integración del vector viral en el genoma de las células T.
En algunas de tales realizaciones, el método incluye opcionalmente cultivar las células de la población transformada en condiciones que promuevan la proliferación o expansión de las células manipuladas, generando de este modo una población expandida de células. En algunas de tales realizaciones, el cultivo se lleva a cabo en presencia de una o más citoquinas recombinantes. En algunas realizaciones, la una o más citoquinas recombinantes es una o más de IL-2, IL-7 e IL-15. En algunas de tales realizaciones, la proliferación o expansión da como resultado un aumento de, o de aproximadamente, o de por lo menos o aproximadamente, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más de o de aproximadamente 5 veces el número de células T viables que comprenden el polinucleótido heterólogo.
En algunas de tales realizaciones, el método incluye además:(i) cultivar las poblaciones de células T manipuladas bajo condiciones que promuevan la proliferación o expansión de la población manipulada, generando de este modo una población expandida de células T; y (ii) cosechar o recolectar la población expandida.
En algunas de tales realizaciones, el reactivo estimulador incluye una perla paramagnética con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a la superficie. En algunas de tales realizaciones, el reactivo estimulador incluye un reactivo de partícula oligomérica que contiene una pluralidad de moléculas de estreptavidina o muteína de estreptavidina con Fabs anti-CD3 y anti-CD28 unidos reversiblemente.
En algunas de tales realizaciones, la recogida se lleva a cabo en o después del momento en el que la población manipulada o la población expandida de células T incluye un número umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables, o una concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables. En algunas de tales realizaciones, el número o concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables se alcanza en el plazo de o aproximadamente 4, 5, 6 o 7 días después del inicio de la estimulación.
En algunas de tales realizaciones, entre una pluralidad de poblaciones de células T manipuladas o poblaciones de células T expandidas, el número o concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables se alcanza en un plazo de o aproximadamente 5 o 6 días después del inicio de la estimulación en por lo menos o aproximadamente o por lo menos o aproximadamente un 70%, 80%, 90% o 95% de la pluralidad. En algunas de tales realizaciones, el número o concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables se alcanza en el plazo de o aproximadamente 2, 3, 4 o 5 duplicaciones de población después del inicio de la estimulación.
En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida contiene menos de o aproximadamente el 3%, menos de o aproximadamente el 2%, menos de o aproximadamente el 1%, menos de o aproximadamente el 0,1% o menos de o aproximadamente el 0,01% de células T CD57+. En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida está libre o esencialmente libre de células T CD57+. En algunas realizaciones, una población agotada que está esencialmente libre de células T CD57+ comprende menos de aproximadamente o aproximadamente un 3%, menos de aproximadamente o aproximadamente un2%,menos de aproximadamente o aproximadamente un 1%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 0,1% o menos de aproximadamente o aproximadamente un 0,01% de células T CD57+.
En algunas de tales realizaciones, la frecuencia de las células de tipo virgen en la población manipulada o la población expandida es de por lo menos o aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40% o 50% de las células de la población. En algunas de tales realizaciones, la frecuencia de una o más de las células T CD25+, células T CD27+, células T CD28+, células T CCR7+ o células T CD45RA+ en la población manipulada o la población expandida es de por lo menos o de aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor de o aproximadamente la frecuencia de las células respectivas en la población. En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida contiene por lo menos o aproximadamente un 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD27+. En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida contiene por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD28+. En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida contiene por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de células T CD27+CD28+.
En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida contiene por lo menos o aproximadamente un 70% o un 80% de células T CD27+CD28+. En algunas de tales realizaciones, la población manipulada o la población expandida contiene por lo menos o aproximadamente un 10%, 15%, 20% o 25% de células T CCR7+.
En algunas de tales realizaciones, la recogida de las células incluye la eliminación de los restos celulares mediante enjuague o lavado de las células. En algunas de tales realizaciones, la cosecha o recogida incluye además la formulación de las células para su crioconservación o administración a un sujeto. En algunas de tales realizaciones, las células cosechadas o recogidas se formulan en presencia de un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas de tales realizaciones, las células recolectadas o recogidas se formulan para su crioconservación en presencia de un crioprotector. En algunas de tales realizaciones, el crioprotector comprende DMSO. En algunas de tales realizaciones, las células recolectadas o recogidas se formulan en un recipiente, opcionalmente un vial o una bolsa.
En algunas de tales realizaciones, la separación se produce antes de la recogida. En algunas de tales realizaciones, la separación se produce antes o durante el cultivo. En algunas de tales realizaciones, la separación se produce después de la introducción.
En algunas de tales realizaciones, el receptor recombinante es capaz de unirse a un antígeno diana que está asociado con, es específico de y/o se expresa en una célula o tejido de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas de tales realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección es una enfermedad o trastorno infeccioso, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o un tumor o cáncer. En algunas de tales realizaciones, el antígeno diana es un antígeno tumoral. En algunas de tales realizaciones, el antígeno diana se selecciona entre integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículos, el antígeno de cáncer de testículos 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), el antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, la ciclina A2, el ligando 1 de quimiocinas con motivo C-C 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vlII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A<2>(EPHa2), receptor de estrógenos, receptor de Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como receptor Fc homólogo 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido<g>D2, GD2 O-acetilado (O<g>D2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicán-3 (GPC3), receptor 5D acoplado a proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor de IL-22 alfa(IL-22Ra), receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, miembro A de la familia 8 que contiene repetición rico en leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 de asesinas naturales (NKG2D), melanina A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno expresado preferiblemente de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor 1 huérfano similar a receptor tirosina quinasa (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos.
En algunas de tales realizaciones, la proteína recombinante es o incluye un receptor funcional de antígeno no TCR o un TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas de tales realizaciones, la proteína recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas de tales realizaciones, el receptor recombinante es un CAR anti-BCMA. En algunas de tales realizaciones, la proteína recombinante es un CAR anti-CD19. En algunas de tales realizaciones, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio extracelular que contiene un dominio de unión a antígeno, un espaciador y/o una región bisagra, un dominio transmembrana, y un dominio de señalización intracelular que contiene una región de señalización coestimuladora. En algunas de tales realizaciones, el dominio extracelular que incluye un dominio de unión a antígeno incluye un scFv.
En algunas de tales realizaciones, el dominio de señalización intracelular es o incluye un dominio de señalización primaria, un dominio de señalización que es capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, un dominio de señalización de un componente del receptor de células T (TCR), y/o un dominio de señalización que incluye un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM). En algunas de tales realizaciones, el dominio de señalización intracelular es o incluye un dominio de señalización intracelular de una cadena CD3, opcionalmente una cadena CD3-zeta (CD3Z), o una porción de señalización de la misma. En algunas de tales realizaciones, la región de señalización coestimuladora incluye un dominio de señalización intracelular de un CD28, un 4-1BB o un ICOS o una porción de señalización del mismo.
También se proporcionan composiciones de células producidas mediante los métodos de la invención.
La invención proporciona además una dosis de células T de una población manipulada de células T producidas mediante un método de la invención, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección, en donde el método comprende administrar la dosis de células T al sujeto. La invención proporciona además una dosis de células T de una población manipulada de células T producidas mediante un método de la invención, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o afección, en donde la enfermedad o afección es un cáncer, y en donde el método comprende administrar la dosis de células T al sujeto.
Breve descripción de los dibujos
LasFIGS. 1A-1Dmuestran el número total de células (FIG. 1A), las veces de expansión (FIG. 1B), el porcentaje de viabilidad (FIG. 1C)y el porcentaje de células Ki-67+ (marcador asociado a la entrada en el ciclo celular;FlG.
1D)entre células T CD8+ obtenidas de siete donantes diferentes (donantes A-G), durante aproximadamente 240 horas después del inicio de la estimulación en un proceso ejemplar de fabricación de células T humanas primarias, o un proceso similar sin transducción de las células.
LaFIG.2Amuestra un análisis de citometría de flujo para la expresión de CD57 y Ki-67 en varios puntos temporales durante aproximadamente 216 horas después del inicio de la estimulación en un proceso ejemplar para células T humanas primarias. LaFIG. 2Bmuestra el porcentaje de células CD57+ en la población celular durante la estimulación y el cultivo, en tres donantes diferentes (donantes A-C). LaFIG. 2Cmuestra el porcentaje de células Ki-67+ entre las células CD57+ o CD57- en la población celular durante la estimulación y el cultivo. LaFIG. 2Dmuestra el porcentaje de células CD57+ en la población de células CD4+ durante la estimulación y el cultivo, en tres donantes diferentes (donantes A-C). LaFIG. 2Emuestra la expresión de CD57 y Ki67 en las células de las composiciones celulares de los donantes, a lo largo del tiempo, tras la estimulación. Las células de una composición celular donante necesitaron 8 días para alcanzar el criterio de cosecha ("8d hasta cosecha"), mientras que las células de la otra composición celular donante necesitaron sólo 7 días para alcanzar el criterio de cosecha ("7d hasta cosecha"). LaFIG. 2Fmuestra la expresión de CD45RA y CD27 en células de las composiciones de células donantes descritas en laFIG. 2E.
LaFIG. 3Amuestra un análisis de citometría de flujo para la expresión de CD69 y CD25 (marcadores asociados con la activación) entre células CD57+ y células c D57- en la población celular durante la estimulación y el cultivo en un proceso ejemplar para células T humanas primarias. LasFIGS. 3By3Cmuestran análisis de agrupación jerárquica para la expresión de varios marcadores de superficie asociados con fenotipos de diferenciación de células T (por ejemplo, células T de tipo virgen, células T efectoras (T<eff>), células T de memoria, células T de memoria central (T<cm>), células T de memoria efectoras (T<em>), células T RA de memoria efectoras (T<emra>)), y la expresión de CD57 (f Ig .3B)o Ki-67 (FIG. 3C). Cada fila representa una población celular de un donante individual, las columnas representan marcadores o combinaciones de marcadores que están asociados con fenotipos de diferenciación de células T.
LaFIG. 4Amuestra el número de células totales y el porcentaje de células viables a lo largo de aproximadamente 240 horas después del inicio de la estimulación en un proceso de fabricación ejemplar, para composiciones celulares tituladas que contienen una mezcla de células CD57+ y CD57- con la siguiente frecuencia: (1) 100% de células CD57+; (2) 75% de células CD57+; (3) 25% de células CD57+; y (4) 0% de células CD57+. Se indica un criterio de cosecha ejemplar. LaFIG. 4Bmuestra imágenes de pocillos de cultivo celular a las 48 horas después del inicio de la estimulación, mostrando la agrupación celular en presencia de un reactivo estimulador, en la estimulación y cultivo de las composiciones celulares tituladas. LaFIG. 4Cmuestra la cantidad de IL-2 (pg/ml) presente en los medios de cultivo a las 12 y 48 horas después del inicio de la estimulación, en la estimulación y el cultivo de las composiciones celulares tituladas.
LasFIGS. 5A y 5Bmuestran el porcentaje de células T CD57+ (FIG. 5A), células T CD27+CD28+ (FIG. 5B). LaFIG. 5Cmuestra la expresión de CD27 para cuatro composiciones de células donantes que no se agotaron de células CD57+ (no agotadas) o que se agotaron de células CD57+ (agotadas). LaFIG. 5Dmuestra la expresión de Ki67 en composiciones de células CD3+ agotadas y no agotadas. LaFIG. 5Emuestra la duración del cultivo hasta la cosecha (desde el inicio de la estimulación hasta el momento en que se alcanzó el criterio de cosecha) para células CD8+ primarias obtenidas de sujetos que fueron agotados de células CD57+ (agotadas) o que no fueron agotados de células CD57+ (no agotadas). LaFIG. 5Fmuestra el número total de células T a lo largo del tiempo en composiciones celulares agotadas y no agotadas, tras la estimulación. LaFIG. 5Gmuestra el porcentaje de células que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) tras la transducción, en composiciones celulares agotadas y no agotadas.
LaFIG. 6Amuestra un diagrama de bigotes que indica el porcentaje de células T CD57+ en células T CD4+ y CD8+ obtenidas de pacientes con linfoma no Hodgkin (LNH) para la manipulación de las células para que expresen un receptor de antígeno quimérico (CAR) usando un proceso de fabricación ejemplar. Los recuadros representan el intervalo intercuartílico y los bigotes representan el intervalo completo del conjunto de datos. LaFIG.6Bmuestra la relación entre el porcentaje de células CD57+CD8+ y el porcentaje de células Ki-67+ en las varias poblaciones celulares obtenidas de pacientes con LNH. LaFIG. 6Cmuestra un análisis de agrupamiento jerárquico para la expresión de varios marcadores de superficie asociados con fenotipos de diferenciación de células T (por ejemplo, células T de tipo virgen, células T efectoras (T<eff>), células T de memoria, células T de memoria central (T<cm>), células efectoras terminales), y la expresión de CD57 en las poblaciones celulares obtenidas de pacientes con NHL. Cada fila representa un paciente individual, las columnas representan marcadores o combinaciones de marcadores que están asociados con fenotipos de diferenciación de células T. LaFIG. 6Dmuestra el porcentaje de células vivas CD57+ que expresan Ki67 en subconjuntos de poblaciones celulares, agrupadas por estado de expresión de CD27 y CD45RA. LaFIG. 6Emuestra el porcentaje de células vivas, CD8+CD57+ en subconjuntos de poblaciones celulares, clasificadas por expresión de CD27 y CD45RA (panel superior), y el porcentaje de células vivas, CD4+CD57+ en subconjuntos de poblaciones celulares, clasificadas por expresión de CD27 y CD45RA (panel inferior).
LaFIG. 7muestra la relación entre el porcentaje de células T CD4+ de memoria central/de tipo virgen en la composición de células T de salida terapéutica (por ejemplo, producto farmacéutico) y el número de duplicaciones de la población para alcanzar el criterio de cosecha (Spearman p: -0,54; valor p: <0,001). Se observó un resultado similar para las células T CD8+ en la composición de células T de salida terapéutica (por ejemplo, producto farmacéutico).
LaFIG. 8Amuestra el número de duplicaciones de población para alcanzar el criterio de cosecha para densidad de siembra alta (0,35x10A6 células/ml) y baja (0,05x10A6 células/ml) durante el paso de expansión del proceso de producción. LaFIG. 8Bmuestra el porcentaje de células T CD27+CAR+CD8+ en la composición terapéutica de salida en función de la densidad de semillas durante el paso de expansión del proceso de producción. LaFIG. 8Cmuestra el impacto de la duración del procesamiento en la cantidad de células T de memoria central en la composición de células T de salida.
LasFIGS. 9A-9Dmuestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para sujetos a los que se administraron composiciones de células T CAR+, divididos en grupos a los que se les administraron composiciones que contenían un porcentaje de células T CCR7+ CD27+ CAR+ entre las células T CD4+ CAR+ (FIG. 9Apara la supervivencia libre de progresión, laFIG. 9Cpara la duración de la respuesta) y entre las células T CD8+ CAR+(FIG. 9Bpara la supervivencia libre de progresión,FIG. 9Dpara la duración de la respuesta) que está por encima o por debajo de un cierto nivel umbral.
LaFIG. 10muestra una curva de PFS basada en una prueba de intervalos logarítmicos de división óptima para pacientes con números "altos" o "bajos" de duplicaciones de población (PDL) en células T CD8+/CAR+. PDL bajo se refiere a <6 PDL y >6 PDL se refiere a PDL alto.
LaFIG. 11muestra el porcentaje de células T CD27+CD28+ en composiciones de entrada enriquecidas CD4+ (panel izquierdo) y CD8+ (panel derecho) derivadas de pacientes con linfoma no Hodgkin.
LaFIG. 12muestra la relación entre el porcentaje de células T efectoras de memoria en composiciones de entrada CD4+ enriquecidas y el número de duplicaciones de población necesarias para alcanzar el criterio de cosecha (Spearman p: 0,43; valor p: <0,001). Se observó un resultado similar para las composiciones de entrada CD8+ enriquecidas.
Las FIGS. 13A-D muestran el total de células vivas (FIG. 13A), la viabilidad (FIG. 13B) y el fenotipo (FIGS. 13C y 13D) durante y después de las series de fabricación, incluyendo una variedad de procesos de ingeniería expandidos y no expandidos.
LaFIG. 14muestra el porcentaje de células CD57+ en las poblaciones de células CD4+ y CD8+ durante y después de las series de fabricación, incluyendo una variedad de procesos de ingeniería expandidos y no expandidos.
Descripción detallada
Las realizaciones de la invención caen dentro de algunos de los casos que se describen a continuación. Se pretende que cualquier referencia en la presente a métodos de tratamiento se refiera a productos para su uso en dichos métodos.
En la presente se divulgan métodos y composiciones útiles para, entre otras cosas, seleccionar, aislar, enriquecer, estimular, activar, manipular genéticamente o expandir muestras, poblaciones o composiciones de células que tienen una frecuencia reducida de células T CD57+, como en comparación con material celular de partida o muestras biológicas. En algunos casos, en la presente se divulga un método para enriquecer células T que es o incluye seleccionar, aislar o eliminar células T CD57+ de una muestra biológica, como para generar una población de células T CD57- enriquecidas, o una población agotada para células CD57+. En algunos casos, en la presente se divulga un método para enriquecer células T que es o incluye seleccionar, aislar o eliminar células T CD57+ de una muestra biológica, como para generar una población de células T CD57- enriquecidas, o una población agotada para células T CD57+.
En algunos casos, en la presente se divulga un método para estimular una población de células T CD57-incubando las células de la población en condiciones estimuladoras. También se divulga en la presente un método para manipular genéticamente células T mediante la introducción de un polipéptido heterólogo en células, como células de o procedentes de una población de células T CD57- enriquecidas.
Las divulgaciones particulares contemplan que los métodos existentes para generar células T manipuladas, por ejemplo, células T de ingeniería que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) pueden incluir pasos, etapas o fases en las que las poblaciones o composiciones de células T proliferan o se expanden. Sin embargo, en algunos casos divulgados en la presente, una parte de las poblaciones o composiciones puede no mostrar ninguna proliferación o expansión, o, en algunos casos divulgados en la presente, puede expandirse lentamente y, por lo tanto, requerir días adicionales para completar el proceso de manipulación.
En algunas divulgaciones, los métodos o procesos existentes para generar o fabricar composiciones celulares manipuladas pueden dar como resultado heterogeneidad en el proceso de fabricación. En algunas divulgaciones, los fenotipos asociados con las células T de memoria pueden afectar al resultado clínico (consultar, por ejemplo, Fraietta et al., Nat Med. 2018; 24(5):563-571; y Larson et al., Cancer Res. 2018; 78(13 Suppl):Abstract nr 960). En algunos casos divulgados en la presente, el enriquecimiento para células que muestran fenotipos de células T de memoria temprana puede mejorar la fabricación de composiciones celulares manipuladas (consultar, por ejemplo, Singh et al., Sci Trans Med. 2016; 8(320):320ra3).
Los métodos y composiciones divulgados abordan estas cuestiones. Los métodos y composiciones divulgados se dirigen, por lo menos en parte, a poblaciones de células, por ejemplo, poblaciones de células T CD57-enriquecidas que experimentan una proliferación y expansión mejoradas o más rápidas, como durante los procesos de estimulación o manipulación de células T. La CD57 (que también se conoce como HNK1 y LEU7) es una beta-1,3-glucuroniltransferasa que puede expresarse en la superficie de linfocitos T y NK. En algunas divulgaciones, la expresión de CD57, por ejemplo, la expresión de superficie, se asocia con subpoblaciones maduras, diferenciadas de efectoras de linfocitos T y NK. En algunas divulgaciones, la expresión de CD57 se corresponde con células T o poblaciones de células T que carecen de expresión de receptores coestimuladores CD28 y CD27 que, en ciertas divulgaciones, pueden afectar a la proliferación sostenida y la supervivencia celular. En divulgaciones particulares, la expresión de CD57 también puede identificar células con capacidad proliferativa menor o reducida. En algunas divulgaciones, las poblaciones de células CD57+CD28- pueden mostrar una longitud de telómeros acortada y una capacidad proliferativa reducida en comparación con las poblaciones de células CD57- (revisado en Strioga, Pasukoniene, & Characiejus, Immunol. (2011)).
Divulgaciones particulares contemplan que una reducción de la frecuencia de células T CD57+ a partir de material celular de partida usado en procesos de ingeniería genética enriquecerá en células con mayor capacidad proliferativa. En algunas divulgaciones, la selección negativa de células T CD57+ mejora el éxito de la fabricación y la consistencia del producto farmacéutico mediante el enriquecimiento previo de células que están mejor preparadas para expandirse. Además, en algunas divulgaciones, el enriquecimiento de las poblaciones o composiciones de células con células que muestran una mayor capacidad proliferativa puede reducir el grado de diferenciación de las células efectoras, lo que debería ayudar a mejorar la consistencia del perfil del producto diana entre sujetos en un entorno autólogo o entre lotes en un entorno alogénico (células T CD27+, CCR7+).
En algunas divulgaciones, los métodos se usan en relación con un proceso que genera o produce células manipuladas genéticamente que son adecuadas para la terapia celular de una manera que puede ser más rápida y más eficiente que los procesos alternativos. En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados en la presente tienen una alta tasa de éxito para generar o producir composiciones de células manipuladas a partir de una población más amplia de sujetos que lo que puede ser posible a partir de procesos alternativos. Por tanto, en algunas divulgaciones, la velocidad y eficiencia de los métodos divulgados para generar células manipuladas para terapia celular permiten una planificación y coordinación más fácil de los tratamientos de terapia celular, como terapia autóloga, a una población más amplia de sujetos que lo que puede ser posible por algunos métodos alternativos. En algunas divulgaciones, se contempla que el agotamiento de células CD57+ (por ejemplo, células T CD57+) es ventajoso, por ejemplo, mejorando la consistencia de las poblaciones celulares en procesos posteriores. Por ejemplo, se observa en la presente que el agotamiento de las células CD57+ puede agotar las células con capacidad proliferativa menor o reducida, de tal manera que las composiciones agotadas muestran una consistencia mejorada en las tasas de proliferación celular.
En relación con esto, la mejora de la consistencia en las tasas de proliferación celular puede mejorar la consistencia en la duración requerida para que las poblaciones celulares alcancen un criterio de cosecha. En la presente se observa adicionalmente que el agotamiento de células CD57+ antes de transducir la población celular con un vector que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) puede mejorar la consistencia en la expresión de CAR de las células transducidas.
En algunas divulgaciones, la preselección de células donantes entrantes con capacidad proliferativa mejorada, por ejemplo, mediante la eliminación de células T CD57+ o la selección de cantidades bajas de células T CD57+, puede ofrecer un control de proceso mejorado sobre el número de células usadas en un proceso para generar una terapia celular. En ciertas divulgaciones, la expresión de CD57 puede servir como biomarcador que indica células que muestran un crecimiento retardado o deficiente. Por tanto, algunos de los ejemplos divulgados se dirigen a métodos que utilizan uno o más reactivos de selección o pasos del proceso para eliminar selectivamente las células CD57+ antes de un proceso para estimular, manipular genéticamente o expandir células. En algunas divulgaciones, tales reactivos y pasos de proceso pueden usarse junto con estrategias de selección de CD8+ y CD4+. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, la selección de células CD57+ se emplea para eliminar o agotar las células CD57+ de una muestra, composición o población de células antes de cualquier paso para la selección de CD8+ o CD4+. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, la selección de células T CD57+ se emplea para eliminar o agotar las células T CD57+ de una muestra, composición o población de células antes de cualquier paso para la selección de CD8+ o CD4+, generando de este modo una población que agota CD57-. En algunas divulgaciones, puede ser ventajoso agotar las células CD57+ mediante selección negativa (en contraposición a la selección positiva), como antes de cualquier paso para la selección CD8+ o CD4+. En algunas divulgaciones, el agotamiento de las células CD57+ mediante selección negativa, como por ejemplo antes de cualquier paso para la selección CD8+ o CD4+, reduce la probabilidad de que la población agotada de c D57- se contamine por uno o más reactivos o soluciones usados en el paso de selección de CD57.
En algunas divulgaciones, la selección de células T CD57+ se emplea para eliminar o agotar las células T CD57+ de una muestra, composición o población de células después de cualquier paso para la selección CD8+ o CD4+. En algunas divulgaciones, tales reactivos y pasos del proceso pueden usarse junto con estrategias de selección de CD3+. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, la selección de células T CD57+ se emplea para eliminar o agotar las células T CD57+ de una muestra, composición o población de células antes de cualquier paso para la selección de CD3+. En algunas divulgaciones, la selección de células T CD57+ se emplea para eliminar o agotar las células T CD57+ de una muestra, composición o población de células después de cualquier paso para la selección CD3+. En algunas divulgaciones, las células CD57+ se seleccionan o eliminan con perlas magnéticas dirigidas a CD57 que se unen a células CD57+, como en una columna, y el flujo de la columna (fracciones no unidas) contendría entonces una fuente de células CD57+ agotadas, por ejemplo, una población de células enriquecidas para células T CD57-. En algunas divulgaciones, las células T CD57+ se seleccionan o eliminan con perlas magnéticas dirigidas a CD57- que se unen a células T CD57+, como en una columna, y el flujo de la columna (fracciones no unidas) contendría entonces una fuente de células CD57+ agotadas, por ejemplo, una población de células enriquecidas para células T CD57-.
Las divulgaciones particulares contemplan que algunos protocolos de activación o expansión de células Tex vivoexistentes son propensos a reducir la presencia de células T CD57+ después de una cantidad de tiempo, como después de las primeras 48 horas del proceso, ya que las células T CD57+ son menos propensas a proliferar. En algunas divulgaciones, las células CD57+ (por ejemplo, las células T CD57+) mueren durante tales procesos o su frecuencia se ve disminuida por subconjuntos de células que son capaces de una expansión robusta. Sin embargo, aunque puede producirse una reducción natural de células T CD57+ durante dichos procesos, la reducción natural no controla la cantidad de células que entran en proceso que muestran una alta capacidad proliferativa (por ejemplo, células CD57-). Por tanto, en algunas divulgaciones, como las células CD57+ (por ejemplo, células T CD57+) son células viables pero menos proliferativas, contribuyen a la entrada del número total de células de partida al proceso. Por tanto, en algunas divulgaciones, una ventaja de eliminar las células T CD57+ o verificar el bajo contenido de células T CD57+ en una muestra, composición o población asegura que las células T CD57-, por ejemplo, células con capacidad de proliferación, no constituyan una población minoritaria en el material de entrada. Por tanto, en algunas divulgaciones, asegurar una baja frecuencia de células T CD57+ o una fracción reducida de células proliferantes podría reducir las incidencias relacionadas con tiempos de proceso prolongados, aumento de la diferenciación celular y/o fallo de cumplir los criterios de cosecha durante los procesos de manipulación.
En algunas divulgaciones, los ejemplos divulgados se basan en la observación de que durante un proceso de manipulación de células, como un proceso de fabricación para generar composiciones que contienen células T que expresan receptores recombinantes para terapia celular, muchas células expresan o regulan por incremento marcadores que están asociados con la estimulación o activación de células T, incluyendo CD25 y CD69 tras la estimulación, como incubación de células en presencia de anticuerpos anti-CD3/anti-CD8. En algunas divulgaciones, sólo se observa que un subconjunto de células se introduce en el ciclo celular, como se muestra basándose en la expresión de Ki-67. En algunos casos divulgados en la presente, las células Ki-67+ incluyen principalmente células que expresan CD27 y CD28, mientras que se observó que las poblaciones Ki67- estaban enriquecidas para células CD57+ y presentaban fenotipos CD27-CD28-. En algunas divulgaciones, se observó que las células CD57+ mostraban fenotipos asociados con la estimulación o activación, y persistieron durante las primeras etapas del proceso de fabricación. En algunas divulgaciones, la frecuencia de células T CD57+ disminuyó después de aproximadamente 48 horas después de la estimulación, lo que típicamente coincidió con la expansión de células T y el aumento de la viabilidad. En algunas divulgaciones, tipos particulares de células, como células CD57+ (por ejemplo, células T CD57+), mostraron una expansión baja o nula durante la estimulación o el cultivo, mientras se continuaba usando factores de crecimiento y/o reactivos de activación, lo que dio como resultado heterogeneidad en el proceso y en el producto.
En algunas divulgaciones, se observó que cuando las células CD57+ (por ejemplo, células T CD57+) se seleccionaban y combinaban con células CD57- (por ejemplo, células T CD57+) en varias proporciones antes de la estimulación, la frecuencia de células CD57+ en la composición celular antes de la estimulación (por ejemplo, composición de entrada) se asociaba con una mayor duración del proceso. En algunas divulgaciones, también se observó que las composiciones celulares, como las composiciones que contienen células T CAR+, no se expandían ni proliferaban cuando el 95% o más, como el 100% de las células T en la composición eran células T CD57+.
En algunas divulgaciones, mientras que las células T CD27+ pueden contribuir a la expansión de las células durante un proceso de fabricación para generar células T manipuladas, las células CD57+, por ejemplo, células T CD57+) en general no se expandieron y se observó que contribuían mínimamente a las células en la composición de células manipuladas (por ejemplo, composición celular para administración). Por tanto, la presencia de células T CD57+ puede afectar al proceso de fabricación, y también se observó que contribuía a la variabilidad en el proceso, por ejemplo, durante el cultivo para la expansión, y otros atributos de la composición celular. En algunos casos, como se describe en la presente, la eliminación selectiva de células T CD57+ al principio de un proceso de fabricación, por ejemplo, antes de la estimulación de las células, puede mejorar la consistencia, calidad y potencia de la composición celular manipulada.
Por tanto, en algunas divulgaciones, los métodos divulgados pueden disminuir la duración del proceso para generar una terapia celular y por tanto, en ciertas divulgaciones, mejorar la consistencia de los programas de fabricación. Además, en algunas divulgaciones, la velocidad y eficiencia de los métodos divulgados para generar células manipuladas para terapia celular permiten una planificación y coordinación más fácil de los tratamientos de terapia celular, como la terapia autóloga, a una población más amplia de sujetos que lo que puede ser posible por algunos métodos alternativos.
En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados eliminan con éxito por lo menos una parte de las células no proliferativas al inicio del proceso que genera células útiles para una terapia celular, por ejemplo, poblaciones o composiciones de células T manipuladas. En algunas divulgaciones, esto se consigue mediante la selección de células CD57+ (por ejemplo, células T CD57+) antes del inicio de dichos procesos, o mediante la selección para asegurar que sólo las composiciones o poblaciones celulares que no tienen o tienen un bajo contenido de células T CD57+ se usan para dichos procesos, mejorar el éxito de los procesos, por ejemplo, la tasa o frecuencia de generar con éxito la población celular adecuada para su uso en una terapia celular. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados disminuyen la duración requerida y el número de duplicaciones de las células, por ejemplo, durante la proliferación, cultivo o expansión, hasta la cosecha para producir un número requerido de células T para su uso en una terapia celular. Por tanto, sin querer estar limitados por la teoría, algunas divulgaciones contemplan que los métodos divulgados aumenten o verifiquen un número suficiente de células donantes entrantes que muestren una capacidad proliferativa mejorada.
En algunas divulgaciones, las terapias celulares generadas a partir de poblaciones de células T CD57-enriquecidas contienen células T con un menor grado de diferenciación que las terapias celulares generadas a partir de procesos alternativos. En ciertas divulgaciones, la diferenciación celular reducida de las terapias celulares mejora la consistencia entre las terapias celulares generadas por los procesos divulgados (por ejemplo, en comparación con procesos alternativos, por ejemplo, terapias celulares que se generan a partir de poblaciones de células que contienen una cantidad variable de células T CD57+. En ciertas divulgaciones, la diferenciación celular reducida de las terapias celulares mejora los perfiles de calidad del producto de las terapias celulares.
Divulgaciones particulares contemplan que CD57 sea expresado por células NK y NKT además de células T, todas las cuales pueden estar presentes en una muestra biológica, por ejemplo, material de leucaféresis. Por tanto, en algunas divulgaciones, la selección negativa para células CD57+ (por ejemplo, células T CD57+) reduce las células no T residuales y mejora la pureza de las células T. Por tanto, los métodos divulgados aumentan la pureza de las poblaciones de células T que se procesan, como por estimulación, transducción o expansión, así como la pureza de las células T de las terapias celulares resultantes.
Los títulos de las secciones que se usan en la presente tienen únicamente propósitos organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.
I. POBLACIONES DE CÉLULAS T ENRIQUECIDAS PARA CD57-
En ciertos ejemplos, en la presente se divulgan poblaciones de células T CD57- enriquecidas (también denominadas en la presente poblaciones de células T CD57-, composiciones de células T CD57- enriquecidas o composiciones de células T CD57-). En ciertas divulgaciones, las poblaciones de células T CD57- enriquecidas divulgadas se usan en relación con métodos para estimular, activar, diseñar, transducir, cultivar o expandir células T, por ejemplo, células T de o procedentes de una población de células T CD57- enriquecidas. En algunas divulgaciones, las poblaciones de células T CD57- enriquecidas resultan de o son productos de aislamiento, selección o enriquecimiento, por ejemplo, de una muestra biológica, como una muestra biológica que contiene una o más células inmunitarias. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas es o incluye células T viables, células T CD3+, células T CD4+, y/o células T CD8+. En ciertas divulgaciones, las células de la población de células T CD57- enriquecidas son o incluyen células T viables, células T CD3+, células T CD4+, y/o células T CD8+ o una combinación de cualquiera de las anteriores. En varias divulgaciones, las células de la población de células T CD57-enriquecidas son o incluyen células T CD57- viables, células T CD57- CD3+, células T CD57- CD4+, células T CD57-CD8+, o una combinación de cualquiera de las anteriores.
Las divulgaciones particulares contemplan que la cantidad de expresión de CD57, por ejemplo, cantidad de células T CD57+, en una muestra, población o composición que contiene células puede medirse mediante cualquier medio conocido adecuado. En algunas divulgaciones, la expresión de CD57 se mide en una muestra, población o composición para medir, evaluar o determinar la cantidad, frecuencia o porcentaje de células CD57+, por ejemplo, células T CD57+ en la muestra, población o composición. En ciertas divulgaciones, la expresión de CD57 se mide en una muestra, población o composición para medir, evaluar o determinar la cantidad, frecuencia o porcentaje de células CD57+, por ejemplo, células T CD57+ en la muestra, población o composición.
En algunas divulgaciones, las composiciones celulares que tienen un mayor porcentaje de células CD57+ pueden dar como resultado un menor porcentaje de células capaces de expansión proliferativa. En algunos casos divulgados en la presente, una composición de células manipuladas con un alto porcentaje de células CD57+ se asocia con una capacidad proliferativa reducida y puede dar como resultado tiempos de proceso prolongados, duplicaciones más altas para alcanzar números celulares umbral, diferenciación celular aumentada y/o incumplimiento de un criterio de cosecha en un proceso de fabricación para producir una composición de células T manipulada para terapia celular.
En algunos ejemplos también se divulgan métodos para identificar una población de células capaces de expansión, el método incluye medir la frecuencia de células CD57+ en la población, en donde la población de células se identifica como capaz de expansión si la frecuencia de células CD57+ está por debajo de una frecuencia umbral. En algunas de tales divulgaciones, la frecuencia umbral es un porcentaje que es menor de o aproximadamente un 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, o 0,1%. En algunas de tales divulgaciones, una población que es capaz de expansión se expande por lo menos o aproximadamente 2 veces, 4 veces, 8 veces o 16 veces en 4, 5, 6, 7 u 8 días de cultivo en condiciones que promueven la proliferación o expansión.
También se divulgan en algunos casos métodos para determinar la capacidad de expansión de una población de células T, el método comprendiendo medir un valor de un rasgo asociado con la expresión de CD57 en una población de células T, en donde si se determina que una población de células T es capaz de expansión si el valor del rasgo es menor de o aproximadamente un valor umbral del rasgo.
En algunas divulgaciones, el umbral del valor umbral: i) está en, en aproximadamente, o dentro del 25%, dentro del 20%, dentro del 15%, dentro del 10%, o dentro del 5% por debajo de una medición media o mediana del rasgo asociado con la expresión de CD57, y/o está por debajo de una desviación estándar menor de o de aproximadamente la medición media o mediana, en una pluralidad de poblaciones de células T de referencia; ii) está por debajo de una medición más baja del rasgo asociado con la expresión de CD57, opcionalmente dentro del 50%, dentro del 25%, dentro del 20%, dentro del 15%, dentro del 10%, o dentro del 5% por debajo de la medición más baja, en una población de entre una pluralidad de poblaciones de células T de referencia; iii) está por debajo de una medición media o mediana del rasgo asociado con la expresión de CD57 calculada entre más del 65%, 75%, 80%, 85% de las muestras de una pluralidad de composiciones de células T de referencia; en donde la pluralidad de poblaciones de células T de referencia son una pluralidad de poblaciones que no se expandieron cuando se cultivaron en condiciones que promueven la proliferación o expansión de células T, opcionalmente en donde las células no se expandieron por lo menos o aproximadamente 2 veces, 4 veces, 8 veces o 16 veces en 4, 5, 6, 7 u 8 días de cultivo.
En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 expresado en el total de células T, células T CD4+ o células T CD8+. En algunas divulgaciones, el rasgo es una frecuencia, porcentaje o cantidad de células T CD57+, células T CD57+CD4+ o células T CD57+CD8+ presentes en la población celular. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 expresado en las células T CD3+. En algunas divulgaciones, el rasgo es una frecuencia, porcentaje o cantidad de células T CD57+CD3+ presentes en la población celular. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de ARNm de CD57 presente en las células T de la población celular. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de accesibilidad a la cromatina del gen que codifica CD57 (B3GAT1).
En algunas divulgaciones, en donde el método incluye además medir un segundo valor de un segundo rasgo asociado con la expresión de uno o más segundos productos génicos en una población de células T, en donde la población es capaz de expandirse si el valor del rasgo es menor que o aproximadamente el valor umbral del rasgo y si el segundo valor del segundo rasgo es mayor de o aproximadamente un segundo umbral del segundo rasgo.
En algunas divulgaciones, el segundo producto génico es un marcador asociado con una célula T tipo virgen. En algunas divulgaciones, el uno o más segundo producto génico se selecciona entre CD27, CD28, CCR7 o CD45RA. En algunas divulgaciones, el uno o más segundo producto génico es CD27 y CD28.
En ciertas divulgaciones, la expresión negativa, por ejemplo, la expresión negativa de CD57 o CD57-, es una expresión igual o menor que el nivel de expresión de fondo, por ejemplo, como se detecta usando una técnica estándar, como una técnica que implica tinción con anticuerpos. En ciertas divulgaciones, la expresión negativa es igual o menor que el nivel de expresión de fondo, como se detecta mediante técnicas adecuadas para evaluar la expresión de proteínas o genes como, pero no limitadas a, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o técnicas basadas en citometría de flujo. En algunas divulgaciones, la expresión positiva, por ejemplo, de una proteína particular, es o incluye la expresión superficial de la proteína en una cantidad, nivel o concentración por encima del fondo. En divulgaciones particulares, la expresión negativa, por ejemplo, de una proteína particular, es o incluye la expresión superficial de la proteína en una cantidad, nivel o concentración en o por debajo del fondo.
En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados en la presente incluyen uno o más pasos para evaluar, medir, determinar y/o cuantificar la expresión de una o más proteínas o genes (por ejemplo, CD57) en una muestra, población o composición, como para cuantificar células en la muestra, composición o población con expresión positiva o negativa para la proteína o gen (por ejemplo, CD57). Tales pasos pueden incluir evaluar, medir, determinar y/o cuantificar cualquier rasgo adecuado asociado con la expresión, como medir los niveles de proteína, proteína de superficie, ARNm o accesibilidad génica, por ejemplo, accesibilidad génica epigenética.
En algunas divulgaciones, la expresión de una proteína (por ejemplo, CD57) es o incluye evaluar, medir, determinar y/o cuantificar un nivel, cantidad o concentración de la proteína, o una proteína codificada por el gen, expresada en la superficie de las células. En divulgaciones particulares, la expresión de una proteína (por ejemplo, c D57) se evalúa valorando, midiendo, determinando y/o cuantificando la expresión superficial de la proteína, por ejemplo, el nivel, cantidad o concentración de la proteína en la superficie de las células. En divulgaciones particulares, la cantidad, frecuencia o porcentaje de células positivas para la expresión superficial de la proteína, por ejemplo, células con superficies que tienen una mayor cantidad, concentración o densidad de proteínas en la superficie que es mayor que la señal de fondo de la técnica usada para medir la proteína superficial. En divulgaciones particulares, la expresión superficial de una proteína (por ejemplo, CD57) se mide mediante inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o técnicas basadas en citometría de flujo. En algunas divulgaciones, la cantidad, frecuencia o porcentaje de células positivas para la expresión superficial de una proteína se determina mediante una técnica conocida adecuada como una técnica basada en inmunohistoquímica, inmunofluorescencia o citometría de flujo.
En divulgaciones particulares, la cantidad, frecuencia o porcentaje de células que son negativas o positivas para la expresión de proteínas, por ejemplo, expresión de superficie, en la muestra, composición o población se determina por citometría de flujo. En algunas divulgaciones, la proteína es CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD28, CD57, CCR7 o CD45RA. En divulgaciones particulares, la proteína es CD57.
En divulgaciones particulares, la expresión de una proteína (por ejemplo, CD57) en una muestra, población o composición es o incluye cualquier método adecuado para evaluar, medir, determinar y/o cuantificar el nivel, cantidad o concentración de proteína. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, detección con inmunoensayos, técnicas de aptámeros basadas en ácidos nucleicos o proteínas, HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento), secuenciación de péptidos (como secuenciación de degradación Edman o espectrometría de masas (como MS/MS), opcionalmente acoplada a HPLC), y adaptaciones de micromatrices de cualquiera de los anteriores (incluyendo matrices de ácidos nucleicos, anticuerpos o proteína-proteína (es decir, no anticuerpos)). En algunas divulgaciones, el inmunoensayo es o incluye métodos o ensayos que detectan proteínas sobre la base en una reacción inmunológica, por ejemplo, detectando la unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno a un producto génico. Los inmunoensayos incluyen, pero no se limitan a, inmunocitoquímica cuantitativa o inmunohistoquímica, ELISA (incluyendo ELISA directo, indirecto, sándwich, competitivo, múltiple y portátil (consultar, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 7,510,687), transferencia western (incluyendo transferencia de una, dos o más dimensiones u otros medios cromatográficos, incluyendo opcionalmente secuenciación de péptidos), inmunoensayo enzimático (EIA), RIA (radioinmunoensayo) y SPR (resonancia de plasmón superficial).
En ciertas divulgaciones, la expresión de una proteína o su gen correspondiente se mide, evalúa o cuantifica midiendo un ARNm (o producto de ADNc derivado del ARNm) que codifica la proteína (por ejemplo, CD57). En divulgaciones particulares, la cantidad o nivel del ARNm (o ADNc correspondiente) se evalúa, mide, determina y/o cuantifica mediante cualquier medio adecuado (PCR), incluyendo PCR de transcriptasa inversa (rt), PCR digital de gotitas, métodos de PCR en tiempo real y cuantitativos (incluyendo, por ejemplo, TAQMAN®, baliza molecular, LIGHTUP™, SCORPION™, SIMPLEPROBES®; consultar, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5,538,848; 5,925,517; 6,174,670; 6,329,144; 6,326,145 y 6,635,427); transferencia northern; transferencia Southern, por ejemplo, de productos de transcripción inversa y derivados; métodos basados en matrices, incluyendo matrices por transferencia, micromatrices o matrices sintetizadas in situ; y secuenciación, por ejemplo, secuenciación por síntesis, pirosecuenciación, dideoxisecuenciación, o secuenciación por ligadura, o cualquier otro método de ensayo conocido como el analizado en Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) o Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310 (2010), incluyendo plataformas específicas como secuenciación H<e>L<i>COS®, ROCHE® 454, ILLUMINA /SOLEXA®®, ABI SOLiD®, y POLONATOR®. En algunas divulgaciones, la expresión de ARNm se determina mediante un método de secuenciación de próxima generación como la secuenciación de ARN (ARN-Seq). Los métodos de secuenciación de ARN se han adaptado a las plataformas de secuenciación de ADN más comunes (sistemas HiSeq (Illumina), 454 Genome Sequencer FLX System (Roche), Applied Biosystems SOLiD (Life Technologies), IonTorrent (Life Technologies)). Estas plataformas requieren la transcripción inversa inicial del ARN en ADNc. Por el contrario, el secuenciador de molécula única HeliScope (Helicos BioSciences) puede usar ARN como plantilla para la secuenciación.
En algunas divulgaciones, la expresión de una proteína o su gen correspondiente es o incluye un análisis epigenético de la proteína. En algunas divulgaciones, una población de células se evalúa para determinar la accesibilidad de un gen, por ejemplo, la accesibilidad de B3GAT1 que codifica CD57. El análisis epigenético puede realizarse mediante cualquier medio conocido adecuado, incluyendo pero sin limitarse al Ensayo de Cromatina Accesible por Transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq) para examinar la accesibilidad de la cromatina.
En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene menos de o aproximadamente el 25%, 20%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,01%, o 0,001%, de células T CD57+. En ciertas divulgaciones, la población de células CD57-enriquecidas está esencialmente libre de células CD57+. En ciertas divulgaciones, la población de células CD57-enriquecidas está esencialmente libre de células CD57+. En divulgaciones particulares, la población de células CD57-enriquecidas contiene menos de o aproximadamente un 20% de células CD57+. En ciertas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene menos de o aproximadamente el 10% de células CD57+. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene menos de o aproximadamente el 5% de células CD57+. En varias divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene menos de o aproximadamente el 1%, 0,1% o 0,01% de células CD57+.
En ciertas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene por lo menos o aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, 99,99%, o 100% o aproximadamente el 100% de células T CD57-. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 80% de células T CD57-. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 95% de células T CD57-. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente el 99%, 99,9% o 99,99% de células T CD57-. En divulgaciones particulares, todas o esencialmente todas las células de la población de células T CD57- enriquecidas son células T CD57-. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene por lo menos o aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, 99,99%, o 100% o aproximadamente el 100% de células T CD57-CD3+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 80% de células T CD57- CD3+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 95% de células T CD57-CD3+. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente el 99%, 99,9% o 99,99% de células T CD57- CD3+. En divulgaciones particulares, todas o esencialmente todas las células de la población de células T CD57- enriquecidas son células T CD57- CD3+.
En divulgaciones particulares, las células de la población de células T CD57- enriquecidas son o incluyen células viables. En algunas divulgaciones, la viabilidad celular se evalúa con un ensayo que puede incluir, pero no se limita a, ensayos de captación de colorante (por ejemplo, ensayos de calceína AM), ensayos de viabilidad celular XTT y ensayos de exclusión de colorante (por ejemplo, ensayos de exclusión de colorante azul tripán, Eosina o propidio). En divulgaciones particulares, una célula viable tiene expresión negativa de uno o más marcadores apoptóticos, por ejemplo, anexina V o caspasa 3 activa. En algunas divulgaciones, la célula viable tiene expresión negativa de uno o más marcadores de apoptosis que pueden incluir, pero no se limitan a, una caspasa o una caspasa activa, por ejemplo, caspasa 2, caspasa 3, caspasa 6, caspasa 7, caspasa 8, caspasa 9 o caspasa 10, miembros de la familia Bcl-2, por ejemplo, Bax, Bad y Bid, Anexina V o tinción TUNEL. En divulgaciones particulares, las células viables son caspasa 3 activa negativa. En ciertas divulgaciones, las células viables son Anexina V negativas. En ciertas divulgaciones, por lo menos o aproximadamente el 60%, por lo menos o aproximadamente el 65%, por lo menos o aproximadamente el 70%, por lo menos o aproximadamente el 75%, por lo menos o aproximadamente el 80%, por lo menos o aproximadamente el 85%, por lo menos o aproximadamente el 90%, por lo menos o aproximadamente el 95%, por lo menos o aproximadamente el 97%, por lo menos o aproximadamente el 99%, por lo menos o aproximadamente el 99,5%, por lo menos o aproximadamente el 99,9%, o el 100% o aproximadamente el 100% de las células de la población de células T<c>D57- enriquecidas son células viables. En algunas divulgaciones, las células viables son o incluyen células T CD3+ viables, C<d>4+ viables, CD8+ viables, CD57- viables, CD57- CD3+ viables, CD57-CD4+ viables, o CD57-CD8+ viables, o una combinación de cualquiera de las anteriores. En algunas divulgaciones, las células viables son caspasa 3 activa negativa. En divulgaciones particulares, las células viables son Anexina V negativas.
En ciertas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene por lo menos o aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, 99,99%, o 100% o aproximadamente el 100% de células T CD57- CD4+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 80% de células T CD57-CD4+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 90% de células T CD57-. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente el 95% de células T CD57- CD4+. En divulgaciones particulares, todas o esencialmente todas las células de la población de células T CD57- enriquecidas son células T CD57- CD4+. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene por lo menos o aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, 99,99%, o 100% o aproximadamente el 100% de células T CD57-CD8+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 80% de células T CD57- CD8+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente el 90% de células T CD57-CD8+. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente el 95% de células T CD57- CD8+. En divulgaciones particulares, todas o esencialmente todas las células de la población de células T CD57- enriquecidas son células T CD57- CD8+. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene por lo menos o aproximadamente el 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9%, 99,99%, o 100% o aproximadamente el 100% de células T CD57-CD3+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 80% de células T CD57- CD3+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 90% de células T CD57-<c>D3+. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 95% de células T CD57- CD3+. En divulgaciones particulares, todas o esencialmente todas las células de la población de células T CD57- enriquecidas son células T CD57- CD3+.
En divulgaciones particulares, una frecuencia de las células de la población de células CD57- enriquecidas son células de tipo virgen. En algunas divulgaciones, una célula T de tipo virgen es una célula T que es positiva para la expresión de uno o más marcadores que indican que la célula es virgen y/o es una célula de tipo virgen. En ciertas divulgaciones, una célula T de tipo virgen es una célula que es positiva para la expresión de un marcador que está asociado con un estado virgen o de tipo virgen en células T. En divulgaciones particulares, una célula T de tipo virgen es una célula T que es negativa para la expresión de uno o más marcadores que indican que la célula no es virgen y/o no es una célula de tipo virgen. En ciertas divulgaciones, un estado no virgen o no de tipo virgen en una célula T incluye, por ejemplo pero sin limitación, células T efectoras (T<eff>), células T de memoria, células T de memoria central (T<cm>), células T de memoria efectoras (T<em>), y combinaciones de las mismas.
En algunas divulgaciones, una célula T de tipo virgen es positiva para la expresión de por lo menos uno o más marcadores que indican que la célula es virgen y/o es una célula de tipo virgen, y/o está asociada con un estado virgen o de tipo virgen en células T. En algunas divulgaciones, los marcadores se expresan en la superficie celular. En ciertas divulgaciones, la célula T de tipo virgen es negativa para la expresión de por lo menos uno o más marcadores que indican que la célula es una célula no virgen y/o no tipo virgen, y/o está asociada con un estado no virgen o no virgen en células T.
Los marcadores que indican que la célula T es virgen y/o es una célula T de tipo virgen, y/o están asociados con un estado virgen o de tipo virgen en células T incluyen, pero no se limitan a, CD27, CD28, CD45RA, CD62L, y/o CCR7. En algunas divulgaciones, la célula T de tipo virgen, por ejemplo, la célula T CD4+ y/o CD8+ de tipo virgen, es positiva para la expresión de CD27, CD28, CD45RA, y/o CCR7. En ciertas divulgaciones, la célula T de tipo virgen es positiva para la expresión superficial de uno o más de CD27, CD28, CD45RA, y/o CCR7. En algunas divulgaciones, la célula T virgen, por ejemplo, la célula T CD4+ y/o CD8+ virgen, es negativa para la expresión de CD62L. En algunas divulgaciones, la célula T virgen, por ejemplo, la célula T CD3+ virgen, es negativa para la expresión de CD62L. En algunas divulgaciones, la célula T de tipo virgen, por ejemplo, la célula T CD3+, c D4+ y/o CD8+ de tipo virgen, es negativa para la expresión de CD62L.
Los marcadores que indican que la célula es no virgen y/o es una célula T no virgen, y/o están asociados con un estado no virgen o no virgen en células T incluyen, pero no se limitan a, CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, y/o CD95. En algunas divulgaciones, la célula T de tipo virgen, por ejemplo, una célula T CD4+ y/o CD8+ de tipo virgen, es negativa para la expresión de CD25, CD45RO, CD56, y/o KLRG1. En divulgaciones particulares, la célula T de tipo virgen, por ejemplo, una célula T CD4+ y/o CD8+ de tipo virgen, tiene una expresión baja de un marcador asociado con células no vírgenes o no de tipo virgen. En algunas divulgaciones, la célula T de tipo virgen, por ejemplo, una célula T CD3+ de tipo virgen, es negativa para la expresión de CD25, CD45RO, CD56 y/o KLRG1. En divulgaciones particulares, la célula T de tipo virgen, por ejemplo, una célula T CD3+ de tipo virgen, tiene baja expresión de un marcador asociado con células no vírgenes o de tipo no virgen. En divulgaciones particulares, la célula T de tipo virgen tiene baja expresión de CD95. En ciertas divulgaciones, la célula T de tipo virgen es negativa para la expresión superficial de uno o más de CD25, CD45RO, CD56, y/o KLRG1.
En algunas divulgaciones, la baja expresión de un marcador asociado con células no virgen o no de tipo virgen es o incluye por lo menos un 10%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, o por lo menos un 99% menos de expresión que la expresión del marcador en una célula que es una célula de tipo no virgen, y/o una célula que es positiva para uno o más marcadores que indican que la célula es una célula T no virgen y/o no de tipo virgen, y/o están asociados con un estado no virgen o no tipo virgen en células T. En ciertas divulgaciones, la baja expresión de un marcador asociado con células no vírgenes o no de tipo virgen es o incluye por lo menos un 10%, por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, o por lo menos un 99% menos de expresión que la expresión del marcador en una célula T efectora (T<eff>), una célula T de memoria, una célula T de memoria central (T<cm>), y/o una célula T de memoria efectora (T<em>).
En algunas divulgaciones, los marcadores que indican que la célula es una célula T no virgen y/o no de tipo virgen, y/o están asociados con un estado no virgen o no de tipo virgen en células T incluyen una o más citoquinas. Por ejemplo, en ciertas divulgaciones, una célula T no virgen o no de tipo virgen es negativa para la expresión y/o la producción de una o más de IL-2, IFN-<y>, IL-4 e IL-10. En algunas divulgaciones, la una o más citoquinas son secretadas. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas se expresan internamente por las células T tipo no virgen, por ejemplo, durante o después del tratamiento con un agente que impide, inhibe o reduce la secreción.
En ciertas divulgaciones, una célula T de tipo virgen, por ejemplo, una célula T CD57- de tipo virgen, es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA y CCR7. En divulgaciones particulares, una célula T CD4+ de tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA y CCR7. En algunas divulgaciones, una célula T CD8+ tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA y CCR7. En algunas divulgaciones, una célula T CD3+ de tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA y CCR7. En divulgaciones particulares, una célula T de tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA, CD27 y CCR7 y es negativa para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie de CD45RO. En divulgaciones particulares, una célula T CD4+ de tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA, CD27, y CCR7 y es negativa para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie de CD45RO. En algunas divulgaciones, una célula T CD8+ de tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA, CD27 y CCR7 y es negativa para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie de CD45RO. En algunas divulgaciones, una célula T CD3+ de tipo virgen es positiva para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie, de CD45RA, CD27 y CCR7 y es negativa para la expresión, por ejemplo, expresión de superficie de CD45RO.
En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T que son positivas para la expresión de CD25. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T CD57- CD25+. En varias divulgaciones, la población de células CD57-enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente un 10% y un 60%, un 20% y un 50%, o un 25% y un 40% de células T CD25+, cada uno inclusive. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente un 10% y un 60%, un 20% y un 50%, o un 25% y un 40% de células T CD57-CD25+, cada uno inclusive.
En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T que son positivas para la expresión de CD27. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T CD57- CD27+. En varias divulgaciones, la población de células CD57-enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente un 10% y un 60%, un 20% y un 50%, o un 25% y un 40% de células T CD27+, cada uno inclusive. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente un 10% y un 60%, un 20% y un 50%, o un 25% y u 40% de células T CD57-CD27+, cada uno inclusive. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 25% de células T CD27+.
En divulgaciones particulares, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T que son positivas para la expresión de CD28. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T CD57- CD28+. En ciertas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 50%, un n o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 35%, o un o aproximadamente un 10% y un o aproximadamente un 25% de células T CD27+, cada uno inclusive. En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 50%, un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 35%, o un o aproximadamente un 10% y un o aproximadamente un 25% de células T CD57- CD27+, cada una inclusive. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos o aproximadamente un 25% de células T CD27+.
En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T que son positivas para la expresión de CCR7. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T CD57- CCR7+. En algunas divulgaciones, la población de células CD57-enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 50%, un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 35%, o un o aproximadamente un 10% y un o aproximadamente un 25% de células T CCR7+, cada uno inclusive. En divulgaciones particulares, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente un o aproximadamente un% y un o aproximadamente un 50%, un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 35%, o un o aproximadamente un 10% y un o aproximadamente un 25% de células T CD57- CCR7+, cada una inclusive. En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos un o aproximadamente un 25% de células T CCR7+.
En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de células T que son positivas para la expresión de CD45RA. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene por lo menos un o aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o 50% de células T CD57- CD45RA . En algunas divulgaciones, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente o un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 50%, un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 35%, un o aproximadamente un 10% y un o aproximadamente un 25% de células T CD45RA+, cada uno inclusive. En divulgaciones particulares, la población de células CD57- enriquecidas contiene entre o entre aproximadamente un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 50%, un o aproximadamente un 5% y un o aproximadamente un 35%, o un o aproximadamente un 10% y un o aproximadamente un 25% de células T CD57- CD45RA+, cada una inclusive. En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene por lo menos un o aproximadamente un 25% de células T CD45RA+.
En algunas divulgaciones, la frecuencia de las células de tipo virgen en la población agotada es por lo menos un o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor de o de aproximadamente la frecuencia de células de tipo virgen en la muestra biológica. En algunas divulgaciones, la frecuencia de una o más de las células T CD25+, células T CD27+, células T CD28+, células T CCR7+ o células T CD45RA+ en la población agotada es por lo menos un o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor de o de aproximadamente la frecuencia de las células respectivas en la muestra biológica. En algunas divulgaciones, la población agotada comprende por lo menos un o aproximadamente un 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD27+. En algunas divulgaciones, la población agotada comprende por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 25%, 30%, 35% o 40% de células T CD28+. En algunas divulgaciones, la población agotada comprende por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de células T CD27+CD28+. En algunas divulgaciones, la población agotada comprende por lo menos un o aproximadamente un 70% o un 80% de células T CD27+CD28+. En algunas divulgaciones, la población agotada comprende por lo menos un o aproximadamente un 10%, 15%, 20% o 25% de células T CCR7+.
II.SELECCIÓN DE CÉLULAS T CD57- Y/O AGOTAMIENTO DE CÉLULAS T CD57+
En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas se obtiene a partir de una muestra biológica. En divulgaciones particulares, la población de células T CD57- enriquecidas se selecciona, aísla o enriquece a partir de una muestra biológica. En divulgaciones particulares, las células T CD57+ se eliminan, separan o agotan de una muestra biológica. En ciertas divulgaciones, por lo menos el 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o 99,9% de las células T CD57+ se retiran, separan o agotan de la muestra biológica.
En divulgaciones particulares, se seleccionan, aíslan o enriquecen subconjuntos de células, por ejemplo, subconjuntos de células T, a partir de la muestra biológica antes de seleccionar, aislar o enriquecer células T CD57-de la muestra biológica. En algunas divulgaciones, se seleccionan, aíslan o enriquecen subconjuntos de células, por ejemplo, células T, de la población de células T CD57- enriquecidas.
En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene menos de un 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,1%, 0,01% o 0,001% de las células T CD57+ de la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En divulgaciones particulares, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente, o contiene menos de un 20% de las células T CD57+ de la muestra biológica. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene menos del 5% de las células T CD57+ de la muestra biológica. En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene menos del 1% de las células T CD57+ de la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene menos del 0,1% de las células T CD57+ de la muestra biológica. En divulgaciones particulares, la población de células T CD57- enriquecidas contiene, contiene aproximadamente o contiene menos del 0,01% de las células T CD57+ de la muestra biológica. En algunas divulgaciones, la frecuencia de las células T CD57+ en la población agotada es menor de o de aproximadamente el 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o 0,1% de la frecuencia de células T CD57+ en la muestra biológica. En algunas divulgaciones, la población agotada comprende menos de o de aproximadamente el 3%, menos de o de aproximadamente el 2%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1%, o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T CD57+. En algunas divulgaciones, la población agotada está libre o esencialmente libre de células T CD57+.
En divulgaciones particulares, las células de la población de células T CD57- enriquecidas están menos diferenciadas que las células de la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas contiene una mayor frecuencia de células de tipo virgen que la muestra biológica. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57+ enriquecidas incluye, incluye aproximadamente o incluye por lo menos un o aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más células de tipo virgen que la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento.
En algunas divulgaciones, las células de tipo virgen incluyen células T vírgenes o células T de memoria central. En algunas divulgaciones, las células de tipo virgen pueden incluir células positivas o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, las células son CD27+. En algunas divulgaciones, las células son CD28+. En algunas divulgaciones, las células son CCR7+. En divulgaciones particulares, CCR7 se expresa por células T vírgenes o de tipo virgen (por ejemplo, CCR7+CD45RA+ o CCR7+CD27+) y células T de memoria central (CCR7+CD45RA-). En ciertas divulgaciones, las células T de tipo virgen o las células T que son positivas en superficie para un marcador expresado en células T de tipo virgen son CCR7+CD45RA+, donde las células son CD27+ o CD27-. En ciertas divulgaciones, las células T de tipo virgen o las células T que son positivas en superficie para un marcador expresado en células T de tipo virgen son CD27+CCR7+, donde las células son CD45RA+ o CD45RA-. En ciertas divulgaciones, las células T de tipo virgen o las células T que son positivas en superficie para un marcador expresado en células T de tipo virgen son CD62L-CCR7+. En ciertas divulgaciones, las células de tipo virgen incluyen células en una etapa temprana de diferenciación (por ejemplo, células que son CCR7+CD27+).
En ciertas divulgaciones, las células T de memoria central pueden incluir células en varios estados de diferenciación y pueden caracterizarse por la expresión positiva o alta (por ejemplo, expresión de superficie) de ciertos marcadores celulares y/o expresión negativa o baja (por ejemplo, expresión de superficie) de otros marcadores celulares. En algunas divulgaciones, las células menos diferenciadas, por ejemplo, las células de memoria central, tienen una vida más larga y se agotan menos rápidamente, aumentando de este modo la persistencia y la durabilidad. En algunas divulgaciones, un respondedor a una terapia celular, como una terapia celular de CAR-T, tiene una expresión aumentada de genes de memoria central. Consultar, por ejemplo, Fraietta et al. (2018) Nat Med. 24(5):563-571. En algunas divulgaciones, las células T de memoria central se caracterizan por una expresión positiva o alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, y/o CD127. En algunas divulgaciones, las células T de memoria central se caracterizan por la expresión negativa o baja de CD45RA y/o granzima B. En ciertas divulgaciones, las células T de memoria central o las células T que son positivas en superficie para un marcador expresado en células T de memoria central son CCR7+CD45RA-.
En divulgaciones particulares, la población de células T CD57- enriquecidas incluye, incluye aproximadamente o incluye por lo menos un o aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más células T CD27+ que la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En divulgaciones particulares, la población de células T CD57- enriquecidas incluye, incluye aproximadamente o incluye por lo menos un o aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más células T CD28+ que la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En varias divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas incluye, incluye aproximadamente o incluye por lo menos un o aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más células T CD25+ que la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas incluye, incluye aproximadamente o incluye por lo menos un o aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más células T CCR7+ que la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- enriquecidas incluye, incluye aproximadamente o incluye por lo menos un o aproximadamente un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces más células CD45RA+ que la muestra biológica, por ejemplo, antes de la selección, aislamiento o enriquecimiento.
En ciertas divulgaciones, las células T, por ejemplo, las células T CD3+, se seleccionan, aíslan o enriquecen a partir de la muestra biológica antes de seleccionar, aislar o enriquecer las células T CD57- a partir de la muestra biológica. En algunas divulgaciones, las células T, por ejemplo, las células T CD3+, se seleccionan, aíslan o enriquecen a partir de la población de células T CD57- enriquecidas. En divulgaciones particulares, la selección, aislamiento o enriquecimiento de células T, por ejemplo, células T CD3+, implica la selección positiva de las células a partir de la muestra.
En algunas divulgaciones, las células CD57+ se seleccionan, aíslan o enriquecen a partir de una muestra, composición celular o población celular, produciendo de este modo células CD57+ aisladas o seleccionadas y una población de células CD57- enriquecidas, por ejemplo, células T. En ciertas divulgaciones, las células CD57+ se seleccionan, aíslan o enriquecen a partir de una muestra biológica, produciendo de este modo células CD57+ aisladas o seleccionadas y una población de células CD57- enriquecidas, por ejemplo, células T. En ciertas divulgaciones, las células T CD3+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD3+ CD57- enriquecidas y una población no seleccionada de células CD57-enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las células T CD3+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población no seleccionada de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD3+ enriquecidas. En varias divulgaciones, las células T CD3+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57- CD3+ enriquecidas y una población no seleccionada enriquecida para células CD57-, y después las células T CD4+ o CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población no seleccionada de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas o células T CD57-CD8+ enriquecidas.
En ciertas divulgaciones, se seleccionan, aíslan o enriquecen subconjuntos de células T, por ejemplo, células T CD4+ o CD8+, de la muestra biológica antes de seleccionar, aislar o enriquecer células T CD57- de la muestra biológica. En algunas divulgaciones, se seleccionan, aíslan o enriquecen subconjuntos de células T, por ejemplo, células T CD4+ o CD8+, a partir de la población de células T CD57- enriquecidas. En divulgaciones particulares, la selección, aislamiento o enriquecimiento de un subconjunto de células T, por ejemplo, células T CD4+ o CD8+, implica la selección positiva de las células a partir de la muestra.
En algunas divulgaciones, las células CD57+ se seleccionan, aíslan o enriquecen a partir de una muestra, composición celular o población celular, produciendo de este modo células CD57+ aisladas o seleccionadas y una población de células CD57- enriquecidas, por ejemplo, células T. En ciertas divulgaciones, las células CD57+ se seleccionan, aíslan o enriquecen a partir de una muestra biológica, produciendo de este modo células CD57+ aisladas o seleccionadas y una población de células CD57- enriquecidas, por ejemplo, células T. En divulgaciones particulares, las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD4+ enriquecidas en CD57- y una población no seleccionada enriquecida en células CD57-. En ciertas divulgaciones, las células T CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas y una población no seleccionada de células CD57-enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las células T CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan a partir de la población no seleccionada de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población no seleccionada de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas.
En divulgaciones particulares, las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD4+ CD57- enriquecidas y una población no seleccionada enriquecida para células CD57-, y luego las células T CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población no seleccionada de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En varias divulgaciones, las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD4+ CD57-enriquecidas y una población no seleccionada enriquecida para células CD57-, y luego las células T CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población no seleccionada de células CD57- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas.
En divulgaciones particulares, (1) las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de una muestra biológica, generando de este modo una población de células T CD4+ enriquecidas y una población no seleccionada enriquecida para células CD4-; (2) las células T CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan a partir de la población no seleccionada de células CD4- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD8+ enriquecidas; y (3) las células T CD57+ se agotan a partir de poblaciones de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas, generando de este modo poblaciones de células T CD57-CD4+ y CD57-CD8+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, (1) las células T<c>D8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de una muestra biológica, generando de este modo una población de células T CD8+ enriquecidas y una población no seleccionada enriquecida para células CD8-; (2) las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de la población no seleccionada de células CD4- enriquecidas, generando de este modo una población de células T CD4+ enriquecidas; y (3) las células T CD57+ se agotan de las poblaciones de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas, generando poblaciones de células T CD57-CD4+ y CD57-CD8+ enriquecidas.
En divulgaciones particulares, las células T CD4+ se enriquecen, seleccionan o aíslan de una muestra biológica, generando de este modo una población enriquecida de células T CD4+, y después las células CD57+ se eliminan de la población enriquecida de células T CD4+, generando de este modo una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, las células T CD8+ se enriquecen, seleccionan o aíslan a partir de una muestra biológica, generando de este modo una población enriquecida de células T CD8+, y después las células CD57+ se eliminan de la población enriquecida de células T CD8+, generando de este modo una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas.
En algunas divulgaciones, la una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas se congelan, por ejemplo, se crioconservan y/o crioprotegen, después del aislamiento, selección y/o enriquecimiento. En divulgaciones particulares, una población de células T CD57- CD4+ enriquecidas se congela, por ejemplo, se crioconserva y/o crioprotege, después del aislamiento, selección y/o enriquecimiento. En ciertas divulgaciones, una población de células T CD57- CD8+ enriquecidas se congela, por ejemplo, se crioconserva y/o crioprotege, después del aislamiento, selección y/o enriquecimiento. En ciertas divulgaciones, una población de células T CD57- CD3+ enriquecidas se congela, por ejemplo, se crioconserva y/o crioprotege, después del aislamiento, selección y/o enriquecimiento. En algunas divulgaciones, la una o más poblaciones de células T enriquecidas se congelan, por ejemplo, se crioconservan y/o crioprotegen, antes de cualquier paso de incubación, activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, cultivo, expansión, cosecha, y/o formulación de la población de células. En divulgaciones particulares, una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas se congela, por ejemplo, se crioconserva y/o crioprotege, antes de cualquier paso de incubación, activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, cultivo, expansión, cosecha, y/o formulación de la población de células. En algunas divulgaciones, una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas se congela, por ejemplo, se crioconserva y/o crioprotege, antes de cualquier paso de incubación, activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, cultivo, expansión, recogida y/o formulación de la población de células. En algunas divulgaciones, una población de células T CD57-CD3+ enriquecidas se congela, por ejemplo, se crioconserva y/o crioprotege, antes de cualquier paso de incubación, activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, cultivo, expansión, cosecha y/o formulación de la población de células. En divulgaciones particulares, la una o más composiciones de entrada crioprotegidas se almacenan, por ejemplo, a o aproximadamente -80° C, durante entre 12 horas y 7 días, entre 24 horas y 120 horas, o entre 2 días y 5 días. En divulgaciones particulares, la una o más composiciones de entrada crioprotegidas se almacenan a o aproximadamente a -80° C, durante un tiempo de menos de 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, o 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, o 1 día. En algunas divulgaciones, la una o más composiciones de entrada crioprotegidas se almacenan a -70° C o -80° C durante menos de 3 días, como durante aproximadamente 2 días.
En algunas divulgaciones, "agotar" o "eliminar" cuando se hace referencia a uno o más tipos celulares o poblaciones celulares en particular, se refiere a disminuir el número o porcentaje del tipo o población celular, por ejemplo, en comparación con el número total de células o el volumen de la composición, o en relación con otros tipos celulares, como por selección negativa basada en marcadores expresados por la población o célula, o por selección positiva basada en un marcador no presente en la población celular o célula a agotar. En general, los términos agotar o eliminar no requieren la eliminación completa de la célula, tipo de célula o población de la composición.
En algunas divulgaciones, "enriquecer" cuando se refiere a uno o más tipos celulares o poblaciones celulares en particular, se refiere a aumentar el número o porcentaje del tipo o población celular, por ejemplo, en comparación con el número total de células o el volumen de la composición, o en relación con otros tipos celulares, como por selección positiva basada en marcadores expresados por la población o célula, o por selección negativa basada en un marcador no presente en la población celular o célula que se va a agotar. En general, el término enriquecer no requiere la eliminación completa de otras células, tipos celulares o poblaciones de la composición y no requiere que las células así enriquecidas estén presentes al 100 % o incluso cerca del 100 % en la composición enriquecida.
En algunas divulgaciones, las poblaciones celulares o composiciones celulares obtenidas de un sujeto, como un sujeto humano, para terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, pueden mostrar un crecimiento bajo o lento, de tal manera que no alcanzan (por ejemplo, crecimiento nulo) el umbral para cosechar células (por ejemplo, criterio de cosecha) para generar una composición terapéutica, o no alcanzan el umbral para cosechar células (por ejemplo, criterio de cosecha) para generar una composición terapéutica dentro de un periodo de tiempo específico (por ejemplo, crecimiento lento). En algunas divulgaciones, algunas de tales poblaciones celulares pueden contener una alta frecuencia de células CD57+, como una frecuencia de CD57+ por encima de un valor umbral. En otras divulgaciones, las poblaciones celulares o las composiciones celulares obtenidas de un sujeto, como un sujeto humano, para terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, pueden mostrar un crecimiento mejorado en comparación con las poblaciones que no muestran crecimiento o muestran un crecimiento lento. En algunas divulgaciones, tales poblaciones celulares o composiciones celulares pueden contener una frecuencia baja de células CD57+, como una frecuencia de células CD57+ menor de un valor umbral. En algunas divulgaciones, las poblaciones celulares o composiciones celulares que muestran un crecimiento mejorado pueden mostrar fenotipos o expresar marcadores asociados con fenotipos de tipo virgen o de tipo memoria central, como CD27+, CD28+ y/o CCR7+. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados se basan en observaciones de que hay variabilidad o heterogeneidad en la expresión de células T CD57+ entre células T en una muestra biológica (por ejemplo, muestra de leucaféresis o aféresis) de sujetos humanos, lo que, en algunas divulgaciones, puede dar como resultado variabilidad en el fenotipo y la función de composiciones de células T manipuladas producidas para su uso en terapia celular adoptiva a partir de una pluralidad de sujetos diferentes, incluso usando el mismo proceso de fabricación. En divulgaciones particulares, los métodos divulgados controlan o reducen tal variabilidad seleccionando, aislando o enriqueciendo células T CD57-de una muestra biológica, como eliminando, separando o agotando células T CD57+ de la muestra biológica. Tales células pueden usarse luego en procesos de manipulación o fabricación de células para terapia celular para minimizar la variabilidad entre productos, a la vez que también se mejoran atributos y características particulares del producto, como la capacidad de expansión y persistencia tras la administración a un sujeto.
A. Muestras y preparación celular
En divulgaciones particulares, los métodos divulgados se usan en relación con el aislamiento, selección o enriquecimiento de células a partir de una muestra biológica para generar una o más poblaciones de células enriquecidas, por ejemplo, células T CD57-. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados incluyen el aislamiento de células o poblaciones de las mismas a partir de muestras biológicas, como las obtenidas o derivadas de un sujeto, como uno que tiene una enfermedad o afección particular o que necesita una terapia celular o al que se le administrará la terapia celular. En algunas divulgaciones, el sujeto es un humano, como un sujeto que es un paciente que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o diseñan las células. Por consiguiente, en algunas divulgaciones las células son células primarias, por ejemplo, células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra procesada. Las muestras biológicas incluyen, entre otras, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo muestras procesadas derivadas de los mismos.
En algunas divulgaciones, la muestra es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado a intestino, tejido linfoide asociado a mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano, y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo, terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas. En algunas divulgaciones, la muestra es o comprende una muestra de sangre completa, una muestra de capa leucocitaria, una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una muestra de células T no fraccionadas, una muestra de linfocitos, una muestra de glóbulos blancos, un producto de aféresis o un producto de leucaféresis.
En algunos ejemplos divulgados en la presente, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo, mediante aféresis o leucaféresis. Las muestras, en algunas divulgaciones, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunas divulgaciones contienen células distintas de los glóbulos rojos y las plaquetas.
En algunas divulgaciones, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo, para eliminar la fracción de plasma y para colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunas divulgaciones, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas divulgaciones, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunas divulgaciones, un paso de lavado se realiza en una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas divulgaciones, un paso de lavado se realiza mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas divulgaciones, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS libre de Ca++/Mg++. En ciertas divulgaciones, se eliminan los componentes de una muestra de células sanguíneas y las células se vuelven a suspender directamente en medios de cultivo.
En algunas divulgaciones, la muestra que contiene células (por ejemplo, un producto de aféresis o un producto de leucaféresis) se lava para eliminar uno o más anticoagulantes, como la heparina, añadidos durante la aféresis o la leucaféresis.
En algunas divulgaciones, la muestra que contiene células (por ejemplo, una muestra de sangre completa, una muestra de capa leucocitaria, una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), una muestra de células T no fraccionadas, una muestra de linfocitos, una muestra de glóbulos blancos, un producto de aféresis o un producto de leucaféresis) se crioconserva y/o crioprotege (por ejemplo, se congela) y luego se descongela y opcionalmente se lava antes de cualquier paso para aislar, seleccionar, activar, estimular, diseñar, transducir, transfectar, incubar, cultivar, cosechar, formular una población de las células, y/o administrar la población celular formulada a un sujeto.
En algunas divulgaciones, una muestra que contiene Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMCs) autólogas de un sujeto se recoge en un método adecuado para asegurar la calidad apropiada para la fabricación. En una divulgación, la muestra que contiene PBMCs se deriva de sangre completa fraccionada. En algunas divulgaciones, la sangre completa de un sujeto se fracciona mediante leucaféresis usando una fuerza centrífuga y aprovechando las diferencias de densidad entre fenotipos celulares, cuando las células mononucleares autólogas (MNC) se enriquecen preferiblemente mientras que otros fenotipos celulares, como los glóbulos rojos, se reducen en la composición celular recogida. En algunas divulgaciones, el plasma autólogo se recoge simultáneamente durante la recogida de MNC, lo que en algunas divulgaciones puede permitir una mayor estabilidad del producto de leucaféresis. En una divulgación, el plasma autólogo se añade al producto de leucaféresis para mejorar la capacidad de tamponamiento de la matriz del producto de leucaféresis. En algunas divulgaciones, un volumen total de sangre completa procesada para generar el producto de leucaféresis es de o es de aproximadamente 2L, 4L, 6L, 8L, 10L, 12L, 14L, 16L, 18L, o 20L, o es cualquier valor entre cualquiera de los anteriores. En algunas divulgaciones, el volumen de plasma autólogo recogido es o es de aproximadamente 10ml, 50ml, 100ml, 150ml, 200ml, 250ml, o 300ml, o más, o es un volumen entre cualquiera de los anteriores. En algunas divulgaciones, el producto de leucaféresis se somete a un procedimiento, por ejemplo, lavado y formulación para crioconservación en proceso, en el plazo de aproximadamente 48 horas de la finalización de la recogida de leucaféresis. En algunas divulgaciones, el producto de leucaféresis se somete a uno o más pasos de lavado, por ejemplo, en el plazo de aproximadamente 2 horas, 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o 48 horas de la finalización de la recogida de leucaféresis. En algunas divulgaciones, el uno o más pasos de lavado eliminan el anticoagulante durante la recogida de leucaféresis, los residuos celulares que pueden haberse acumulado en el producto de leucaféresis, las plaquetas residuales y/o los restos celulares. En algunas divulgaciones, se realizan uno o más intercambios de tampón durante uno o más pasos de lavado.
En divulgaciones particulares, un producto de aféresis o un producto de leucaféresis se crioconserva y/o crioprotege (por ejemplo, se congela) y luego se descongela antes de someterlo a un paso de enriquecimiento, selección o aislamiento celular (por ejemplo, un paso de selección o aislamiento de células T) como se describe a continuación. En algunas divulgaciones, después de que un producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido se ha sometido a un paso de selección o aislamiento de células T, no se realiza ningún paso adicional de crioconservación y/o crioprotección durante o entre cualquiera de los pasos posteriores, como los pasos de activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, incubación, cultivo, cosecha, formulación de una población de las células, y/o administración de la población celular formulada a un sujeto. Por ejemplo, las células T seleccionadas de un producto de aféresis o leucaféresis descongelado crioconservado y/o crioprotegido no se crioconservan y/o crioprotegen de nuevo antes de descongelarse y, opcionalmente, lavarse para un proceso posterior, como la activación/estimulación o transducción de células T.
En divulgaciones particulares, un producto de aféresis o un producto de leucaféresis se crioconserva y/o crioprotege (por ejemplo, se congela) a una densidad de, de aproximadamente, o de por lo menos 5 x 106 células/ml, 10 x 106 células/ml, 20 x 106 células/ml, 30 x 106 células/ml, 40 x 106 células/ml, 50 x 106 células/ml, 60 x 106 células/ml, 70 x 106 células/ml, 80 x 106 células/ml, 90 x 106 células/ml, 100 x 106 células/ml, 110 x 106 células/ml, 120 x 106 células/ml, 130 x 106 células/ml, 140 x 106 células/ml, o 150 x 106 células/ml, o cualquier valor entre cualquiera de los anteriores, en una solución o tampón de crioconservación. En algunas divulgaciones, la solución o tampón de crioconservación es o contiene, por ejemplo, una solución DMSO que comprende opcionalmente albúmina sérica humana (HSA), u otros medios de congelación celular adecuados.
En divulgaciones particulares, el producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido se almacena en bancos (por ejemplo, sin selección de células T antes de congelar la muestra), lo que, en algunas divulgaciones, puede permitir una mayor flexibilidad para los pasos de fabricación posteriores. En algunas divulgaciones, el producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido se divide en alícuotas en múltiples recipientes de crioconservación, como bolsas, que pueden usarse cada una individualmente o en combinación en el procesamiento del producto. Por ejemplo, cuando el número total de células viables en el producto de aféresis o leucaféresis es menor de 15 x 109 células, el producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido se divide en alícuotas en cuatro recipientes de crioconservación, como bolsas. En algunas divulgaciones, cuando el número total de células viables en el producto de aféresis o leucaféresis es de 15-30 x 109 células, el producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido se divide en alícuotas en ocho recipientes de crioconservación, como bolsas.
En una divulgación, almacenar en bancos las células antes de la selección aumenta el rendimiento celular para un proceso posterior, y almacenar en bancos las células antes puede significar que están más sanas y puede ser más fácil cumplir los criterios de éxito de la fabricación. En otra divulgación, una vez descongelado, el producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido puede someterse a uno o más métodos de selección diferentes. Las ventajas de este enfoque son, entre otras, mejorar la disponibilidad, eficacia y/u otros aspectos de las células de una terapia celular para el tratamiento de una enfermedad o afección de un sujeto, como en el donante de la muestra y/u otro receptor.
En algunas divulgaciones, la muestra (por ejemplo, muestra de aféresis o leucaféresis) se recoge y crioconserva y/o crioprotege antes o sin selección celular anterior (por ejemplo, sin selección anterior de células T, como la selección por cromatografía), en un momento después de que al donante se le diagnostique una enfermedad o afección. En algunas divulgaciones, el momento de la crioconservación también es antes de que el donante haya recibido uno o más de los siguientes: cualquier tratamiento inicial para la enfermedad o afección, cualquier tratamiento dirigido o cualquier tratamiento marcado para el tratamiento de la enfermedad o afección, o cualquier tratamiento distinto de la radiación y/o quimioterapia. En algunas divulgaciones, la muestra se recoge después de una primera recaída de una enfermedad tras el tratamiento inicial para la enfermedad, y antes de que el donante o el sujeto reciba un tratamiento posterior para la enfermedad. Los tratamientos iniciales y/o posteriores pueden ser una terapia distinta de la terapia celular. En algunas divulgaciones, las células recogidas pueden usarse en una terapia celular después de los tratamientos iniciales y/o posteriores. En una divulgación, la muestra crioconservada y/o crioprotegida sin selección celular previa puede ayudar a reducir los costes iniciales, como los asociados a los pacientes no tratados en un ensayo clínico aleatorizado que pueden cruzarse y requerir tratamiento más tarde.
En algunas divulgaciones, la muestra (por ejemplo, muestra de aféresis o leucaféresis) se recoge y crioconserva y/o crioprotege antes o sin selección celular previa (por ejemplo, sin selección previa de células T, como la selección por cromatografía), en un momento después de una segunda recaída de una enfermedad tras una segunda línea de tratamiento para la enfermedad, y antes de que el donante o el sujeto reciba un tratamiento posterior para la enfermedad. En algunas divulgaciones, los pacientes se identifican como propensos a recaer después de una segunda línea de tratamiento, por ejemplo, mediante la evaluación de ciertos factores de riesgo. En algunas divulgaciones, los factores de riesgo se basan en el tipo de enfermedad y/o la genética, como linfoma de doble lesión, cáncer refractario primario o linfoma de células B activadas. En algunas divulgaciones, los factores de riesgo se basan en la presentación clínica, como la recaída temprana después del tratamiento de primera línea, u otros indicadores de mal pronóstico después del tratamiento (por ejemplo, IPI (Índice Pronóstico Internacional) > 2).
En algunas divulgaciones, la muestra (por ejemplo, muestra de aféresis o leucaféresis) se recoge y crioconserva y/o crioprotege antes o sin selección celular previa (por ejemplo, sin selección previa de células T, como la selección por cromatografía), en un momento antes de que al donante o sujeto se le diagnostique una enfermedad. En algunas divulgaciones, puede determinarse que el donante o sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad. En algunas divulgaciones, el donante o sujeto puede ser un sujeto sano. En ciertos casos divulgados en la presente, el donante o sujeto puede elegir almacenar células sin que se le considere en riesgo de desarrollar una enfermedad o sin que se le diagnostique una enfermedad en el caso de que se requiera terapia celular en una etapa posterior de la vida. En algunas divulgaciones, un donante o sujeto puede considerarse en riesgo de desarrollar una enfermedad basándose en factores como mutaciones genéticas, anomalías genéticas, alteraciones genéticas, antecedentes familiares, anomalías proteicas (como deficiencias en la producción y/o procesamiento de proteínas) y elecciones de estilo de vida que pueden aumentar el riesgo de desarrollar una enfermedad. En algunas divulgaciones, las células se recogen como profiláctico.
En algunas divulgaciones, la muestra de células crioconservada y/o crioprotegida (por ejemplo, muestra de aféresis o leucaféresis), como una muestra de células que no ha sido sometida a una selección celular previa (por ejemplo, sin selección previa de células T, como selección por cromatografía) se almacena, o almacena en bancos, durante un periodo de tiempo mayor o igual a 12 horas, 24 horas, 36 horas, o 48 horas, o mayor o igual a 0,5 días, un día, 1,5 días, o dos días. En algunas divulgaciones, la muestra se almacena o almacena en bancos durante un periodo de tiempo mayor o igual a 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. En algunas divulgaciones, la muestra se almacena o almacena en bancos a largo plazo. En algunas divulgaciones, la muestra se almacena durante un período de tiempo mayor o igual a 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años, 11 años, 12 años, 13 años, 14 años, 15 años, 16 años, 17 años, 18 años, 19 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, o más.
En algunas divulgaciones, una muestra de aféresis o leucaféresis tomada de un donante se envía en un entorno refrigerado a una instalación de almacenamiento o procesamiento, y/o se almacena criogénicamente en la instalación de almacenamiento o se procesa en la instalación de procesamiento. En algunas divulgaciones, antes del envío, la muestra se procesa, por ejemplo, seleccionando células T, como células T CD3+, células T CD4+ y/o células T CD8+. En algunas divulgaciones, dicho procesamiento se realiza después del envío y antes de almacenar criogénicamente la muestra. En algunas divulgaciones, el procesamiento se realiza después de descongelar la muestra tras el almacenamiento criogénico.
Al permitir a los donantes almacenar sus células en una fase en la que los donantes, y por tanto sus células, no se han sometido a un tratamiento exhaustivo de una enfermedad y/o antes de contraer una enfermedad o afección o de ser diagnosticados de la misma, dichas células pueden tener ciertas ventajas para su uso en terapia celular en comparación con las células recogidas después de una o varias rondas de tratamiento. Por ejemplo, las células recogidas antes de una o más rondas de tratamiento pueden ser más sanas, pueden mostrar niveles más altos de ciertas actividades celulares, pueden crecer más rápidamente, y/o pueden ser más receptivas a la manipulación genética que las células que se han sometida a varias rondas de tratamiento. Otro ejemplo de una ventaja de acuerdo con los casos divulgados en la presente puede incluir la conveniencia. Por ejemplo, al recoger, opcionalmente procesar y almacenar las células de un donante antes de que se necesiten para la terapia celular, las células estarían fácilmente disponibles si y cuando un receptor las necesite más tarde. Esto podría aumentar la capacidad del laboratorio de aféresis, proporcionando a los técnicos una mayor flexibilidad para programar el proceso de recogida de aféresis.
Los métodos y sistemas ejemplares para el almacenamiento criogénico y el procesamiento de células de una muestra, como una muestra de aféresis, pueden incluir los descritos en la WO2018170188. En algunas divulgaciones, el método y los sistemas implican recoger aféresis antes de que el paciente necesite terapia celular, y luego someter la muestra de aféresis a crioconservación para su uso posterior en un proceso de manipulación de las células, por ejemplo, células T, con un receptor recombinante (por ejemplo, CAR). En algunos casos divulgados en la presente, tales procesos pueden incluir los descritos en la presente. En algunas divulgaciones, se recoge una muestra de aféresis de un sujeto y se crioconserva antes de la posterior selección, activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, incubación, cultivo, cosecha, formulación de una población de las células, y/o administración de la población celular formulada a un sujeto. En tales ejemplos descritos en la presente, la muestra de aféresis crioconservada se descongela antes de someter la muestra a uno o más pasos de selección, como cualquiera de los descritos en la presente.
En algunas divulgaciones, la muestra de células crioconservada y/o crioprotegida (por ejemplo, muestra de aféresis o leucaféresis), como una muestra de células que no ha sido sometida a una selección celular previa (por ejemplo, sin selección previa de células T, como selección por cromatografía) se descongela antes de su uso para procesos posteriores para la fabricación de una población de células para terapia celular, por ejemplo, una población de células T que contiene células T CAR+. En algunas divulgaciones, dicha muestra de células crioconservadas y/o crioprotegidas (por ejemplo, muestra de aféresis o leucaféresis) se usa en relación con el proceso divulgado en la presente para la manipulación de una terapia de células T, como una terapia de células T CAR+. En ejemplos particulares divulgados en la presente, no se lleva a cabo ningún paso adicional de crioconservación antes o durante los pasos de cosecha/formación.
En algunas divulgaciones, se descongela un producto de aféresis o leucaféresis crioconservado y/o crioprotegido. En algunas divulgaciones, la composición celular descongelada se somete a dilución (por ejemplo, con un medio libre de suero) y/o lavado (por ejemplo, con un medio libre de suero), que en algunos casos divulgados en la presente puede eliminar o reducir componentes no buscados o no deseados. En algunos casos divulgados en la presente, la dilución y/o el lavado eliminan o reducen la presencia de un crioprotector, por ejemplo DMSO, contenido en la muestra descongelada, que de otro modo puede afectar negativamente a la viabilidad celular, el rendimiento, la recuperación tras la exposición prolongada a temperatura ambiente. En algunas divulgaciones, la dilución y/o el lavado permiten el intercambio de medios de un producto crioconservado descongelado en un medio libre de suero, como en la PCT/US2018/064627.
En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal (por ejemplo, medio basal de expanssión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher), suplementado con uno o más suplementos. En algunas divulgaciones, el uno o más suplementos no contienen suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal suplementado con uno o más componentes adicionales para el mantenimiento, expansión y/o activación de una célula (por ejemplo, una célula T), como el proporcionado por un suplemento adicional (por ejemplo, suplemento de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher)). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además un suplemento de reemplazo de suero, por ejemplo, un reemplazo de suero de células inmunes, por ejemplo, ThermoFisher, N° A2596101, el reemplazo sérico de células inmunes CTS™, o el reemplazo de suero de células inmunes descrito en Smith et al. Clin Transl Immunology. Enero 2015; 4(1): e31. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma libre de un aminoácido como L-glutamina. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma dipéptida de L-glutamina (por ejemplo, L-alanil-L-glutamina), como el dipéptido enGlutamax™(ThermoFisher). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una o más citoquinas recombinantes, como IL-2 humana recombinante, IL-7 humana recombinante y/o IL-15 humana recombinante.
B. Selección de células T
En algunas divulgaciones, la selección, aislamiento o enriquecimiento de las células, por ejemplo, células CD57+ o CD57- (por ejemplo, células T CD57+), incluye uno o más pasos de preparación y/o separación celular no basados en afinidad. En algunos ejemplos divulgados en la presente, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer para componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos divulgados en la presente, las células se separan basándose en una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares. En algunas divulgaciones, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante lisis de los glóbulos rojos y centrifugación a través de un gradiente de Percoll o Ficoll. En ciertas divulgaciones, los métodos, técnicas y reactivos para la selección, aislamiento y enriquecimiento se describen, por ejemplo, en las solicitudes de PCT N° WO2013124474 y WO2015164675.
En ciertas divulgaciones, las células CD57- se aíslan, enriquecen o seleccionan en un proceso o procedimiento que implica uno o más pasos de selección. En algunas divulgaciones, el uno o más pasos de selección son o implican selección negativa. En ciertas divulgaciones, las células CD57- se aíslan, enriquecen o seleccionan mediante separación o eliminación de células CD57+. En ciertas divulgaciones, una población celular enriquecida para células CD57- es el resultado de la selección negativa de células CD57+ de la población.
En ciertas divulgaciones, un anticuerpo bivalente para enlazar células CD57+ a una célula o perla de gran densidad. Esta tecnología se ha usado sobre todo con glóbulos rojos (por ejemplo, RosetteSep™ STEMCELL Technologies), o cualquier otra tecnología similar o adecuada para acoplar células diana, por ejemplo, células T CD57+, a gradientes de densidad para su extracción.
En algunas divulgaciones, por lo menos una parte del paso de selección incluye la incubación de las células con un reactivo de selección. La incubación con un reactivo o reactivos de selección, por ejemplo, como parte de métodos de selección que pueden realizarse usando uno o más reactivos de selección para la selección de uno o más tipos celulares diferentes basándose en la expresión o presencia en o sobre la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo, proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En ciertas divulgaciones, tales proteínas de superficie pueden incluir CD57, CD4 o CD8. En ciertas divulgaciones, tales proteínas de superficie pueden incluir CD3. En algunas divulgaciones, puede usarse cualquier método conocido que use un reactivo o reactivos de selección para la separación basada en dichos marcadores. En algunas divulgaciones, el reactivo o reactivos de selección dan como resultado una separación basada en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, la selección en algunas divulgaciones incluye la incubación con un reactivo o reactivos para la separación de células y poblaciones celulares basada en la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, por incubación con un anticuerpo o molécula de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o molécula de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o molécula de unión. En algunas divulgaciones, el reactivo o reactivos para la separación de células es o incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen o reconocen CD4, CD8 o CD57. En algunas divulgaciones, el reactivo o reactivos para la separación de células es o incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen o reconocen CD3.
En algunas divulgaciones de tales procesos, se mezcla un volumen de células con una cantidad de un reactivo de selección basado en afinidad deseado. La selección basada en inmunoafinidad puede llevarse a cabo usando cualquier sistema o método que dé como resultado una interacción energética favorable entre las células que se separan y la molécula que se une específicamente al marcador en la célula, por ejemplo, el anticuerpo u otra molécula de unión en la superficie sólida, por ejemplo, la partícula. En algunas divulgaciones, los métodos se llevan a cabo usando partículas como perlas, por ejemplo, perlas magnéticas, que están recubiertas con un agente de selección (por ejemplo, anticuerpo) específico para el marcador de las células. Las partículas (por ejemplo, microesferas) pueden incubarse o mezclarse con células en un recipiente, como un tubo o una bolsa, mientras se agitan o mezclan, con una relación constante de densidad celular/partícula (por ejemplo, perla) para ayudar a promover interacciones energéticamente favorecidas. En otros casos divulgados en la presente, los métodos incluyen la selección de células en la que toda o una parte de la selección se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo, bajo rotación centrífuga. En algunas divulgaciones, la incubación de células con reactivos de selección, como reactivos de selección basados en inmunoafinidad, se realiza en una cámara centrífuga. En ciertas divulgaciones, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato descrito en la Solicitud de Patente Internacional, Número de Publicación WO2009/072003, o US 20110003380 A1. En un ejemplo divulgado en la presente, el sistema es un sistema como el descrito en la Publicación Internacional Número WO2016/073602.
En algunas divulgaciones, al realizar dichos pasos de selección o partes de los mismos (por ejemplo, incubación con partículas recubiertas de anticuerpos, por ejemplo, perlas magnéticas) en la cavidad de una cámara centrífuga, el usuario puede controlar ciertos parámetros, como el volumen de varias soluciones, la adición de solución durante el procesamiento y la cadencia de la misma, lo que puede proporcionar ventajas en comparación con otros métodos disponibles. Por ejemplo, la capacidad de disminuir el volumen de líquido en la cavidad durante la incubación puede aumentar la concentración de las partículas (por ejemplo, el reactivo de perlas) usadas en la selección y, por tanto, el potencial químico de la solución, sin afectar al número total de células en la cavidad. Esto, a su vez, puede potenciar las interacciones por pares entre las células que se procesan y las partículas usadas para la selección. En algunas divulgaciones, llevar a cabo el paso de incubación en la cámara, por ejemplo, cuando se asocia con los sistemas, circuitos y control como se describe en la presente, permite al usuario efectuar la agitación de la solución en el momento o momentos deseados durante la incubación, lo que también puede mejorar la interacción.
En algunas divulgaciones, por lo menos una parte del paso de selección se realiza en una cámara centrífuga, que incluye la incubación de células con un reactivo de selección. En algunas divulgaciones de tales procesos, un volumen de células se mezcla con una cantidad de un reactivo de selección basado en afinidad deseado que es mucho menor que la que se emplea normalmente al realizar selecciones similares en un tubo o recipiente para la selección del mismo número de células y/o volumen de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas divulgaciones, se emplea una cantidad de reactivo o reactivos de selección que no es más del 5%, no más del 10%, no más del 15%, no más del 20%, no más del 25%, no más del 50%, no más del 60%, no más del 70% o no más del 80% de la cantidad del mismo reactivo o reactivos de selección empleados para la selección de células en una incubación basada en tubo o recipiente para el mismo número de células y/o el mismo volumen de células de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En algunas divulgaciones, para la selección, por ejemplo, selección basada en inmunoafinidad de las células, las células se incuban en la cavidad de la cámara en una población que también contiene el tampón de selección con un reactivo de selección, como una molécula que se une específicamente a un marcador de superficie en una célula que se desea enriquecer y/o agotar, pero no en otras células de la población, como un anticuerpo, que opcionalmente se acopla a un andamiaje como un polímero o superficie, por ejemplo, perla, por ejemplo perla magnética, como perlas magnéticas acopladas a anticuerpos monoclonales específicos para CD4 y CD8. En algunas divulgaciones, para la selección, por ejemplo, selección basada en inmunoafinidad de las células, las células se incuban en la cavidad de la cámara en una población que también contiene el tampón de selección con un reactivo de selección, como una molécula que se une específicamente a un marcador de superficie en una célula que se desea enriquecer y/o agotar, pero no en otras células de la población, como un anticuerpo, que opcionalmente está acoplado a un andamiaje como un polímero o superficie, por ejemplo perla, por ejemplo perla magnética, como perlas magnéticas acopladas a anticuerpos monoclonales específicos para CD3. En algunas divulgaciones, como se describe, el reactivo de selección se añade a las células en la cavidad de la cámara en una cantidad que es sustancialmente menor que (por ejemplo, no es más del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de la cantidad) en comparación con la cantidad del reactivo de selección que se usa típicamente o que sería necesaria para lograr aproximadamente la misma o similar eficacia de selección del mismo número de células o del mismo volumen de células cuando la selección se realiza en un tubo con agitación o rotación. En algunas divulgaciones, la incubación se realiza con la adición de un tampón de selección a las células y al reactivo de selección para lograr un volumen objetivo con incubación del reactivo de, por ejemplo, de 10 ml a 200 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml o 200 ml. En algunas divulgaciones, el tampón de selección y el reactivo de selección se mezclan previamente antes de la adición a las células. En algunas divulgaciones, el tampón de selección y el reactivo de selección se añaden por separado a las células. En algunas divulgaciones, la incubación de selección se lleva a cabo con condiciones periódicas de mezclado suave, lo que puede ayudar a promover interacciones energéticamente favorecidas y, de este modo, permitir el uso de menos reactivo de selección global a la vez que se consigue una alta eficacia de selección.
En algunas divulgaciones, la duración total de la incubación con el reactivo de selección es de o de aproximadamente de 5 minutos a 6 horas, como de 30 minutos a 3 horas, por ejemplo, por lo menos o aproximadamente por lo menos 30 minutos, 60 minutos, 120 minutos o 180 minutos.
En algunas divulgaciones, la incubación generalmente se lleva a cabo en condiciones de mezclado, como en presencia de centrifugación, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, como una velocidad inferior a la usada para sedimentar las células, como de o de aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (por ejemplo, de o aproximadamente o por lo menos 600 rpm, 1000 rpm, 1500 rpm o 1700 rpm), como a una RCF en la muestra o pared de la cámara u otro recipiente de o de aproximadamente 80 g a 100 g (por ejemplo de o de aproximadamente o de por lo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, o 100 g). En algunas divulgaciones, el centrifugado se lleva a cabo usando intervalos repetidos de un centrifugado a dicha velocidad baja seguido de un periodo de descanso, como un centrifugado y/o descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 segundos, como un centrifugado a aproximadamente 1 o 2 segundos seguido de un descanso durante aproximadamente 5, 6, 7, u 8 segundos.
En algunas divulgaciones, dicho proceso se lleva a cabo dentro del sistema completamente cerrado del que forma parte la cámara. En algunas divulgaciones, este proceso (y en algunas divulgaciones también uno o más pasos adicionales, como un paso de lavado previo que lava una muestra que contiene las células, como una muestra de aféresis) se lleva a cabo de manera automatizada, de tal manera que las células, el reactivo y otros componentes se introducen y se extraen de la cámara en momentos apropiados y se efectúa la centrifugación, para completar el paso de lavado y unión en un único sistema cerrado usando un programa automatizado.
En algunas divulgaciones, después de la incubación y/o mezclado de las células y el reactivo y/o reactivos de selección, las células incubadas se someten a una separación para seleccionar las células sobre la base de la presencia o ausencia del reactivo o reactivos particulares. En algunas divulgaciones, la separación se realiza en el mismo sistema cerrado en el que se realizó la incubación de las células con el reactivo de selección. En algunas divulgaciones, después de la incubación con los reactivos de selección, las células incubadas, incluyendo las células en las que se ha unido el reactivo de selección, se transfieren a un sistema para la separación de las células basada en inmunoafinidad. En algunas divulgaciones, el sistema para la separación basada en inmunoafinidad es o contiene una columna de separación magnética.
Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos, por ejemplo, el anticuerpo o la molécula de unión, se retienen para su uso posterior, y/o en la selección negativa, en la que las células que no se han unido al reactivo, por ejemplo, el anticuerpo o la molécula de unión, se retienen. En algunos ejemplos divulgados en la presente, ambas fracciones se retienen para su uso posterior. En algunas divulgaciones, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no se dispone de un anticuerpo que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de tal manera que la separación se realiza mejor basándose en marcadores expresados por células distintas de la población deseada.
En algunas divulgaciones, los pasos del proceso incluyen además la selección negativa y/o positiva de las células incubadas, como el uso de un sistema o aparato que puede realizar una selección basada en afinidad. En algunas divulgaciones, el aislamiento se lleva a cabo por enriquecimiento para una población celular particular mediante selección positiva, o agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunas divulgaciones, la selección positiva o negativa se lleva a cabo incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.
No es necesario que la separación dé como resultado un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular concreta o de células que expresen un marcador concreto. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere al aumento del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una ausencia total de células que no expresen el marcador. De igual manera, la selección negativa, eliminación o agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas estas células.
En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, en donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un único paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, por ejemplo incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o moléculas de unión, cada uno específico para un marcador objeto de selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos celulares simultáneamente incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o moléculas de unión expresados en los varios tipos celulares. En ciertas divulgaciones, los pasos de separación se repiten y/o se realizan más de una vez, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete al mismo paso de separación, como una selección positiva o negativa repetida. En algunos ejemplos, un único paso de separación se repite y/o se realiza más de una vez, por ejemplo para aumentar la pureza de las células seleccionadas y/o para eliminar y/o agotar aún más las células seleccionadas negativamente de la fracción seleccionada negativamente. En ciertas divulgaciones, uno o más pasos de separación se realizan dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más de diez veces. En ciertas divulgaciones, el uno o más pasos de selección se realizan y/o repiten entre una y diez veces, entre una y cinco veces, o entre tres y cinco veces.
Por ejemplo, en algunas divulgaciones, subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD3+, CD4+, CD8+ o CD57+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa. En algunas divulgaciones, tales células se seleccionan por incubación con uno o más anticuerpos o moléculas de unión que se unen específicamente a tales marcadores. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o molécula de unión puede conjugarse, como directa o indirectamente, a un soporte sólido o matriz para efectuar la selección, como una perla magnética o perla paramagnética. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, las células T CD4+, las células T CD8+ o las células T CD57+ pueden seleccionarse, por ejemplo, positivamente, con microperlas CD4, microperlas CD8 o microperlas CD57 (Miltenyl Biotec). Por ejemplo, en algunas divulgaciones, las células T CD3+ pueden seleccionarse, por ejemplo, positivamente, con microperlas CD3 (Miltenyl Biotec).
En ciertas divulgaciones, las células CD57- se separan de una muestra de PBMC mediante selección negativa de células positivas para la expresión de CD57. En varias divulgaciones, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante selección negativa de marcadores expresados en células no T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunas divulgaciones, se usa un paso de selección de CD3+ para separar las células T de las que no son T. Dicha población de CD3+ puede clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para CD4+ o CD8+, y/o marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T de tipo virgen, de memoria y/o efectoras. En algunas divulgaciones, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ de las células T citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse además en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente más alto en una o más subpoblaciones de células T de tipo virgen, de memoria y/o efectoras.
En algunas divulgaciones, las células CD8+ se enriquecen aún más o se agotan de células T CD57-, como por selección positiva o negativa basada en la expresión de superficie de CD57. En ciertas divulgaciones, las células CD4+ se enriquecen aún más o se reducen de células T CD57-, como por selección positiva o negativa basada en la expresión de superficie de CD57. En ciertas divulgaciones, las células CD3+ se enriquecen aún más o se reducen de células T CD57-, como por selección positiva o negativa basada en la expresión de superficie de CD57.
En algunas divulgaciones, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente o se agotan de las células madre vírgenes, de memoria central, de memoria efectora y/o de memoria central, por ejemplo mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (TCM) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto tras la administración, que en algunas divulgaciones es particularmente robusta en tales subpoblaciones. Consultar Terakura et al., (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunas divulgaciones, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con MTC y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.
En algunas divulgaciones, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 usado en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+, se usa también para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 se retienen y se usan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente después de uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales. En algunas realizaciones, la selección de la población de células CD4+ y la selección de la población de células CD8+ se llevan a cabo simultáneamente. En algunas divulgaciones, la población de células CD4+ y la selección de la población de células CD8+ se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunas divulgaciones, los métodos para seleccionar células pueden incluir los descritos en la Solicitud de Estados Unidos publicada N° US20170037369. En algunas divulgaciones, la población de células CD4+ seleccionada y la población de células CD8+ seleccionada pueden combinarse posteriormente a la selección. En algunas divulgaciones, la población de células CD4+ seleccionada y la población de células CD8+ seleccionada pueden combinarse en una bolsa biorreactora como se describe en la presente.
En varias divulgaciones, una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de PBMC u otros glóbulos blancos, se somete a selección de células T CD57+, en donde se retienen las fracciones negativas que contienen células CD57-enriquecidas. En algunas divulgaciones, la fracción negativa enriquecida con células CD57- se somete a selección de células T CD3+, donde se retiene la fracción positiva. En ciertas divulgaciones, las células T CD8+ se seleccionan de la fracción negativa enriquecida con células CD57-. En algunas divulgaciones, la fracción negativa enriquecida con células CD57- se somete a selección de células T CD8+, donde se retienen tanto la fracción negativa como la positiva. En ciertas divulgaciones, las células T CD4+ se seleccionan de la fracción negativa. En divulgaciones particulares, de la fracción negativa enriquecida con células CD57-, se somete a selección de células T CD4+, donde se retienen tanto la fracción negativa como la positiva. En ciertas divulgaciones, las células T CD8+ se seleccionan de la fracción negativa.
En algunas divulgaciones, la muestra incubada o la población de células a separar se incuba con un reactivo de selección que contiene material pequeño, magnetizable o que responde magnéticamente, como partículas o micropartículas que responden magnéticamente, como perlas paramagnéticas (por ejemplo, como Dynalbeads o perlas MACS®). El material con respuesta magnética, por ejemplo, partícula, generalmente está unido directa o indirectamente a una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo, que se desea seleccionar negativa o positivamente. En algunas divulgaciones, el agente de selección es o incluye una perla paramagnética y un anticuerpo unido o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une o reconoce<c>D3,<c>D4, CD8 o CD57. En algunas divulgaciones, el agente de selección es una microperla CD3, CD4, CD8 o CD57 MACS®.
En algunas divulgaciones, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otra molécula de unión. Se conocen muchos materiales magnéticamente sensibles para su uso en métodos de separación magnética, por ejemplo, los descritos en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4,452,773, y en la Memoria Descriptiva de Patente Europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen Patente de Estados Unidos N° 4,795,698, y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5,200,084.
Generalmente, la incubación se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o las moléculas de unión, o moléculas, como los anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o moléculas de unión, que están adheridos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células de la muestra.
En ciertas divulgaciones, las partículas magnéticamente sensibles se recubren en anticuerpos primarios u otras moléculas de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertas divulgaciones, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertas divulgaciones, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o molécula de unión y, a continuación, se añaden partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos secundarios específicos del tipo celular u otro molécula de unión (por ejemplo, estreptavidina). En algunos casos, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.
En algunas divulgaciones, la separación se consigue mediante un procedimiento en el que la muestra se coloca en un campo magnético, y aquellas células que tengan partículas magnéticamente sensibles o magnetizables adheridas a las mismas serán atraídas por el imán y separadas de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células no marcadas). En algunas divulgaciones, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, en donde se retienen las fracciones positivas y negativas y se procesan o someten a otros pasos de separación.
En algunas divulgaciones, la selección basada en la afinidad se realiza mediante clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). La clasificación celular activada magnéticamente (MACS), por ejemplo, los sistemas CliniMACS son capaces de realizar una selección de alta pureza de células que tienen partículas magnetizadas unidas a las mismas. En ciertas divulgaciones, la MACS funciona en un modo en el que las especies diana y no diana se eluyen secuencialmente tras la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células adheridas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no adheridas. A continuación, una vez completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y no pudieron ser eluidas se liberan de alguna manera para que puedan ser eluidas y recuperadas. En ciertas divulgaciones, las células no diana se marcan y se agotan de la población heterogénea de células. En varias divulgaciones, el agente de selección es una microperla MACS® CD3, c D4, CD8 o CD57.
En algunas divulgaciones, la concentración de rendimiento subóptimo del reactivo de afinidad es una concentración inferior a una concentración usada o requerida para lograr un rendimiento óptimo o máximo de células unidas en una selección o enriquecimiento dados que implican incubar células con el reactivo y recuperar o separar células que se han unido al reactivo ("rendimiento", por ejemplo, el número de células recuperadas de este modo o seleccionadas en comparación con el número total de células de la incubación a las que se dirige el reactivo o para las que el reactivo es específico o que tienen un marcador para el que el reactivo es específico y capaz de unirse). La concentración de rendimiento subóptima generalmente es una concentración o cantidad del reactivo que en dicho proceso o paso consigue menos de todo, por ejemplo, no más del 70% de rendimiento de células unidas, por ejemplo, células T CD57+, CD4+ o CD8+, tras la recuperación de las células que se han unido al reactivo. En algunas divulgaciones, la concentración de rendimiento subóptima generalmente es una concentración o cantidad del reactivo que en dicho proceso o paso consigue menos de todo, por ejemplo, no más del 70% de rendimiento de células unidas, por ejemplo, células T CD3+, tras la recuperación de las células que se han unido al reactivo. En algunas divulgaciones, no se consigue más de aproximadamente el 50%, 45%, 40%, 30% o 25% de rendimiento por la concentración subóptima del reactivo de afinidad. La concentración puede expresarse en términos de número o masa de partículas o superficies por célula y/o número de masa o moléculas de agente (por ejemplo, anticuerpo, como fragmento de anticuerpo) por célula.
En algunas divulgaciones, por ejemplo, cuando se opera en una concentración de rendimiento subóptima para cada uno o uno o más de dos o más reactivos de selección con afinidad por células T CD57+, CD4+ o CD8+, se usan uno o más de tales reactivos a una concentración que es mayor que uno o más de los otros reactivos, para sesgar la proporción del tipo de célula reconocido por ese reactivo en comparación con el tipo o tipos de células reconocidos por el otro o los otros. En algunas divulgaciones, por ejemplo, cuando se opera en una concentración de rendimiento subóptima para cada uno o uno o más de dos o más reactivos de selección con afinidad por las células T CD57+, CD3+, CD4+ o CD8+, se usan uno o más de tales reactivos a una concentración que es más alta que la del uno o más de los otros reactivos, para sesgar la proporción del tipo celular reconocido por ese reactivo en comparación con el tipo celular reconocido por el otro u otros. Por ejemplo, el reactivo que se une específicamente al marcador para el que se desea sesgar la proporción puede incluirse a una concentración (por ejemplo, agente o masa por células) que se aumenta a la mitad, 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, o más, en comparación con el otro u otros, dependiendo de cuánto se desee aumentar la proporción. En algunas divulgaciones, cuando se opera en el intervalo subóptimo y/o con suficientes células para lograr la saturación de reactivos, la cantidad de reactivo de inmunoafinidad es proporcional al rendimiento aproximado de células enriquecidas. En ciertas divulgaciones, puede determinarse de forma rutinaria una cantidad o concentración apropiada de reactivos de inmunoafinidad que dependen de la proporción deseada de la población generada que contiene las células enriquecidas o seleccionadas, por ejemplo, células T CD57-, CD4+ o CD8+. En ciertas divulgaciones, puede determinarse de forma rutinaria una cantidad o concentración adecuada de reactivos de inmunoafinidad que dependen de la proporción deseada de la población generada que contiene las células enriquecidas o seleccionadas, por ejemplo, células T CD3+.
En algunas divulgaciones, los pasos de separación y/o aislamiento se llevan a cabo usando perlas magnéticas en las que se unen reversiblemente reactivos de inmunoafinidad, como por ejemplo mediante una interacción de ligando peptídico con una muteína de estreptavidina, como se describe en la WO 2015/164675. Ejemplos de tales perlas magnéticas son Streptamers®. En algunas divulgaciones, la separación y/o los pasos se llevan a cabo usando perlas magnéticas, como las disponibles comercialmente de Miltenyi Biotec.
En algunas divulgaciones, las partículas magnéticamente sensibles se dejan adheridas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunas divulgaciones, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunas divulgaciones, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se retiran de las células. Los métodos para eliminar las partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo, el uso de anticuerpos no marcados competidores, partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles, etc. En algunas divulgaciones, las partículas magnetizables son biodegradables.
En algunas divulgaciones, el aislamiento y/o selección da como resultado una o más poblaciones de células T enriquecidas, por ejemplo, células T CD57-, células T CD3+, células T CD4+, y/o células T CD8+. En algunas divulgaciones, se aíslan, seleccionan, enriquecen u obtienen dos o más poblaciones separadas de células T enriquecidas a partir de una única muestra biológica. En algunas divulgaciones, se aíslan, seleccionan, enriquecen y/u obtienen poblaciones separadas de muestras biológicas separadas recogidas, tomadas y/u obtenidas del mismo sujeto.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento y/o selección da como resultado una o más poblaciones de células T enriquecidas que incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD57-CD3+. En divulgaciones particulares, la población de células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD57- CD3+.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento y/o enriquecimiento da como resultado una población de células T CD4+ enriquecidas que incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos el o aproximadamente el 100% de células T CD57- CD4+. En ciertas divulgaciones, la composición de entrada de células T CD4+ incluye menos del 40%, menos del 35%, menos del 30%, menos del 25%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,1%, o menos del 0,01% de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+. En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD57- CD4+.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento y/o enriquecimiento da como resultado una población de células T CD57- CD8+ enriquecidas que incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD57- CD8+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD8+ contiene menos del 40%, menos del 35%, menos del 30%, menos del 25%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,1%, o menos del 0,01% de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre de o sustancialmente libre de células T CD4+. En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD57- CD8+.
C. Selección de células por cromatografía
En divulgaciones de los métodos divulgados en la presente, las células de una muestra, por ejemplo, células T, se seleccionan por aislamiento cromatográfico, como por cromatografía en columna que incluye cromatografía de afinidad o cromatografía de permeación en gel. En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, células T CD57-, se aíslan, seleccionan o enriquecen por aislamiento cromatográfico, como por cromatografía en columna que incluye cromatografía de afinidad o cromatografía de permeación en gel. En algunas divulgaciones, el método emplea un reactivo de unión al receptor que se une a una molécula receptora (por ejemplo, CD57) que se localiza en la superficie de una célula diana, como la célula a aislar, seleccionar o enriquecer (por ejemplo, células CD57+). Tales métodos pueden describirse como tecnología de cromatografía de afinidad celular (sin trazas) (CATCH) y pueden incluir cualquiera de los métodos o técnicas descritos en las solicitudes de PCT N° WO2013124474 y WO2015164675. En divulgaciones particulares, las células CD57+ se seleccionan negativamente por aislamiento cromatográfico.
En algunas divulgaciones, las células diana (por ejemplo, células CD57+), tienen o expresan una molécula receptora en la superficie celular, de tal manera que las células a aislar, seleccionar o enriquecer se definen por la presencia de por lo menos una molécula receptora específica común (por ejemplo, CD57). En algunas divulgaciones, la muestra que contiene la célula diana también puede contener células adicionales que carecen de la molécula receptora. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, las células T se aíslan, se enriquecen y/o seleccionan de una muestra que contiene múltiples tipos de células, por ejemplo, glóbulos rojos o células B. En ciertas divulgaciones, las células CD57+ se aíslan, enriquecen y/o eligen a partir de una muestra que contiene múltiples tipos de células, por ejemplo, glóbulos rojos o células B, proporcionando de este modo células CD57+ aisladas y una población no seleccionada de células, por ejemplo, una población de células T CD57- enriquecidas.
En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor está comprendido en una columna de cromatografía, por ejemplo, unido directa o indirectamente a la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor está presente en la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria) en el momento en que la muestra se añade a la columna. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor puede unirse indirectamente a la matriz de cromatografía (por ejemplo, la fase estacionaria) a través de un reactivo, por ejemplo, un reactivo de afinidad como se describe en la presente. En algunas realizaciones, el reactivo de afinidad se une covalente o no covalentemente a la fase estacionaria de la columna. En algunas divulgaciones, el reactivo de afinidad se inmoviliza reversiblemente en la matriz de cromatografía (por ejemplo, la fase estacionaria). En algunos casos divulgados en la presente, el reactivo de afinidad se inmoviliza en la matriz de cromatografía (por ejemplo, la fase estacionaria) mediante enlaces covalentes. En algunas divulgaciones, el reactivo de afinidad se inmoviliza reversiblemente en la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria) no covalentemente.
En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor puede estar presente, por ejemplo unido directamente (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente) o indirectamente a través de un reactivo de afinidad, en la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria) en el momento en que se añade la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). Por tanto, tras añadir la muestra, las células diana pueden unirse al reactivo de unión al receptor e inmovilizarse en la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria) de la columna. Alternativamente, en algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor puede añadirse a la muestra. De esta manera, el reactivo de unión al receptor se une a las células diana (por ejemplo, células T) en la muestra, y la muestra puede añadirse a continuación a una matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria) que comprende el reactivo de afinidad, donde el reactivo de unión al receptor, ya unido a las células diana, se une al reactivo de afinidad, inmovilizando de este modo las células diana en la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor se une al reactivo de afinidad como se describe en la presente, por ejemplo, como se describe en la presente, a través de la molécula de unión C, como se describe en la presente, comprendida en el reactivo de unión al receptor.
En algunas divulgaciones, se añade a la muestra un reactivo de unión al receptor. En ciertas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor tiene un sitio de unión B, que se une específicamente a la molécula receptora en la superficie de la célula, por ejemplo, la célula diana. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor también incluye un molécula de unión C, que puede unirse específica y reversiblemente a un sitio de unión Z de un reactivo de afinidad. Por ejemplo, en ciertas divulgaciones, se añade a la muestra un reactivo de unión al receptor que se une o reconoce CD57, que se une a CD57 en la superficie de células positivas para la expresión de CD57 en el sitio de unión B.
En ciertas divulgaciones, el reactivo de afinidad también puede contener dos o más sitios de unión Z que pueden ser unidos por la molécula de unión C, proporcionando de este modo una multimerización del reactivo de unión al receptor. Por tanto, el reactivo de afinidad usado en la presente puede ser también un reactivo de multimerización. El reactivo de afinidad puede ser, por ejemplo, estreptavidina, una muteína de estreptavidina, avidina, una muteína de avidina o una mezcla de los mismos. En algunas divulgaciones, se acoplan diferentes matrices de cromatografía a diferentes reactivos de afinidad, y pueden estratificarse en una columna formando un sistema multicomponente para la separación.
En algunas divulgaciones, dos o más reactivos de unión a receptores se asocian con el reactivo de afinidad, por ejemplo, se unen reversible o irreversiblemente al reactivo de afinidad, por ejemplo, a través de uno o una pluralidad de sitios de unión Z presentes en el reactivo de afinidad. En algunos casos divulgados en la presente, esto da como resultado que los reactivos de unión a receptores estén estrechamente dispuestos entre sí, de tal manera que puede producirse un efecto de avidez si una célula diana que tiene (por lo menos dos copias de) una molécula de superficie celular (por ejemplo, marcador de selección) se pone en contacto con el reactivo de unión a receptores que es capaz de unirse a la molécula particular (por ejemplo, marcador de selección).
En algunas divulgaciones, dos o más reactivos de unión a receptores diferentes que son iguales, es decir, que tienen la misma especificidad de unión a marcadores de selección, pueden unirse reversiblemente al reactivo de afinidad. En algunas divulgaciones, es posible usar por lo menos dos reactivos de unión a receptor diferentes, y en algunos casos divulgados en la presente, tres o cuatro reactivos de unión a receptor diferentes que se unen a marcadores de selección diferentes. En algunas divulgaciones, cada uno de los por lo menos dos reactivos de unión a receptores puede unirse a una molécula diferente (por ejemplo, marcador de selección), como una primera molécula, una segunda molécula y así sucesivamente. En algunos casos divulgados en la presente, las diferentes moléculas (por ejemplo, marcadores de selección), como moléculas de superficie celular, pueden estar presentes en la misma célula diana. En otros casos divulgados en la presente, las diferentes moléculas (por ejemplo, marcadores de selección), como moléculas de superficie celular, pueden estar presentes en diferentes células diana que están presentes en la misma población de células. En algunos casos divulgados en la presente, un tercer, cuarto y demás reactivos de unión a receptores pueden estar asociados con el mismo reactivo, cada uno conteniendo un sitio de unión diferente adicional.
En algunas divulgaciones, los dos o más reactivos de unión a receptores diferentes contienen la misma molécula de unión C. En algunas divulgaciones, los dos o más reactivos de unión a receptores diferentes contienen moléculas de unión diferentes. En algunas divulgaciones, un primer reactivo de unión a receptores puede tener una molécula de unión C1 que puede unirse específicamente a un sitio de unión Z1 presente en el reactivo de afinidad y un segundo reactivo de unión a receptores puede tener una molécula de unión C2 que puede unirse específicamente al sitio de unión Z1 o a un sitio de unión Z2 presente en el reactivo de afinidad. Por tanto, en algunos casos, la pluralidad de sitios de unión Z comprendidos por el reactivo de afinidad incluye sitios de unión Z1 y Z2, que son capaces de unirse reversiblemente a las moléculas de unión C1 y C2, respectivamente, comprendidas por el reactivo de unión al receptor. En algunas divulgaciones, C1 y C2 son iguales, y/o Z1 y Z2 son iguales. En otras divulgaciones, uno o más de la pluralidad de sitios de unión Z pueden ser diferentes. En otras divulgaciones, uno o más de la pluralidad de moléculas de unión C pueden ser diferentes. Está dentro del nivel de un experto en la técnica elegir cualquier combinación de diferentes moléculas de unión C que sean compatibles con un reactivo de afinidad que contenga los sitios de unión Z, siempre que cada uno de las moléculas de unión C sea capaz de interactuar, como unirse específicamente, con uno de los sitios de unión Z.
En ciertas divulgaciones, la muestra, por ejemplo, la muestra que contiene las células y el reactivo de unión al receptor (por ejemplo, anticuerpo), se carga o se pone en contacto con una matriz de cromatografía que contiene un reactivo de afinidad unido o inmovilizado (por ejemplo, reactivo de unión). En divulgaciones particulares, el reactivo de afinidad tiene una pluralidad de sitios de unión Z que se unen específicamente a la molécula de unión C del reactivo de unión al receptor. En ciertas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor se une al reactivo de afinidad por la interacción entre el molécula de unión C y el sitio de unión Z. Por tanto, en algunas divulgaciones, la célula, por ejemplo, la célula diana, se inmoviliza a través del complejo que se forma por los uno o más sitios de unión Z del reactivo de afinidad y el sitio de unión Z del reactivo de unión al receptor en la matriz de cromatografía. En divulgaciones adicionales, las células, por ejemplo, la célula diana, pueden agotarse de la muestra, por ejemplo, enjuagando, liberando o lavando la muestra restante de la matriz de cromatografía. En divulgaciones particulares, el reactivo de unión al receptor puede incluirse en la muestra que contiene las células o puede aplicarse o ponerse en contacto con la matriz de cromatografía para que se una al reactivo de afinidad o multimerización unido, por ejemplo, como antes de añadir la muestra a la matriz de cromatografía.
En algunas divulgaciones, la matriz de cromatografía se usa para eliminar o separar células diana de una muestra, por ejemplo, mediante selección negativa. Por ejemplo, en ciertas divulgaciones, una muestra que contiene células CD57+ y células CD57- se pone en contacto o se incuba con un reactivo de unión al receptor que se une a o reconoce CD57. En ciertas divulgaciones, la muestra y los reactivos de unión al receptor se cargan en la matriz, donde, en algunas divulgaciones, se forma un complejo por el reactivo de afinidad inmovilizado o unido, el reactivo de unión al receptor y una célula T CD57+. En algunas divulgaciones, las células no unidas se eliminan o enjuagan de la matriz de cromatografía, eliminando de este modo las células CD57+ unidas y proporcionando una muestra, por ejemplo, una población, enriquecida para células CD57-.
En ciertas divulgaciones, la matriz de cromatografía se usa para aislar, seleccionar o enriquecer células diana de una muestra, por ejemplo, mediante selección positiva. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, una muestra que contiene células T CD4+ o CD8+ y otras células, por ejemplo, células inmunitarias no T, se pone en contacto o se incuba con un reactivo de unión al receptor que se une a o reconoce CD4 o CD8. En ciertas divulgaciones, la muestra y los reactivos de unión al receptor se cargan en la matriz, donde, en algunas divulgaciones, se forma un complejo por el reactivo de afinidad inmovilizado o unido, el reactivo de unión al receptor y la célula T CD4+ o CD8+. En ciertas divulgaciones, las células no unidas se eliminan o enjuagan de la matriz de cromatografía. En divulgaciones particulares, las células CD4+ o CD8+ inmovilizadas pueden eliminarse o liberarse mediante la adición del reactivo de competición, como por ejemplo mediante la alteración del complejo. En algunas divulgaciones, las células T CD4+ o CD8+ separadas, liberadas o eluidas son por tanto una muestra, composición o población de células enriquecidas para células T CD4+ o CD8+.
En ciertas divulgaciones, la matriz de cromatografía se usa para aislar, seleccionar o enriquecer células diana de una muestra, por ejemplo, mediante selección positiva. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, una muestra que contiene células T CD3+ y otras células, por ejemplo, células inmunitarias no T, se pone en contacto o se incuba con un reactivo de unión al receptor que se une o reconoce CD3. En ciertas divulgaciones, la muestra y los reactivos de unión al receptor se cargan en la matriz, donde, en algunas divulgaciones, se forma un complejo por el reactivo de afinidad inmovilizado o unido, el reactivo de unión al receptor y la célula T CD3+. En ciertas divulgaciones, las células no unidas se retiran o enjuagan de la matriz de cromatografía. En divulgaciones particulares, las células CD3+ inmovilizadas pueden eliminarse o liberarse mediante la adición del reactivo de competición, como por ejemplo mediante la alteración del complejo. En algunas divulgaciones, las células T CD3+ separadas, liberadas o eluidas son por tanto una muestra, composición o población de células enriquecidas para células T CD3+.
En algunas divulgaciones, en la columna de cromatografía se carga un reactivo de competición. En algunas divulgaciones, un reactivo de competición puede alterar un enlace reversible formado entre la molécula de unión C y el sitio de unión Z. En algunas divulgaciones, un reactivo de competición tiene un sitio de unión que puede unirse al sitio de unión Z del reactivo de competición. En algunas realizaciones, el reactivo de competición tiene un sitio de unión que es capaz de unirse al sitio de unión Z del reactivo de afinidad. En algunas divulgaciones, un reactivo de competición puede ser una biotina, un derivado o análogo de biotina o un péptido de unión a estreptavidina capaz de competir por la unión con la molécula de unión C por el uno o más sitios de unión Z. En ciertas divulgaciones, el reactivo de competición forma un complejo con el reactivo de afinidad, y queda de este modo inmovilizado en la matriz cromatográfica. En algunas divulgaciones, la molécula de unión C y el reactivo de competición son diferentes, y el reactivo de competición presenta una mayor afinidad de unión para el uno o más sitios de unión Z en comparación con la afinidad de la molécula de unión. En divulgaciones particulares de cualquiera de los métodos divulgados en la presente, no se requiere la adición de un reactivo de competición a la fase estacionaria de la columna de cromatografía para alterar la unión del agente de selección (por ejemplo, el agente de unión al receptor) al reactivo de afinidad para desprender las células diana (por ejemplo, células T) de la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria).
Como resultado de esta unión competitiva, se desplaza la unión entre el reactivo de unión al receptor y el reactivo de afinidad en la molécula de unión C y el sitio de unión Z. En divulgaciones particulares, la adición o carga del reactivo de competición a una matriz de cromatografía con un complejo unido que contiene el reactivo de afinidad, el reactivo de unión al receptor y la célula, por ejemplo, la célula diana, eluye la célula de la matriz de cromatografía. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor tiene una baja afinidad hacia la molécula receptora de la célula en el sitio de unión B, de tal manera que el reactivo de unión al receptor se disocia de la célula en presencia del reactivo de competición. Por tanto, en algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células diana, se eluyen de la matriz de cromatografía libres o esencialmente libres de moléculas de unión a receptor unidas.
En algunas divulgaciones, se recoge una muestra de elución del eluido de la primera columna de cromatografía, que incluye las células, por ejemplo, las células diana, el reactivo de competición y el reactivo de unión al receptor. En ciertas divulgaciones, la muestra de elución se carga en una segunda columna de cromatografía, que tiene una fase estacionaria adecuada que es a la vez una matriz de cromatografía por afinidad y, al mismo tiempo, puede actuar como matriz de permeación de gel. En divulgaciones particulares, la matriz de cromatografía por afinidad tiene un reactivo de afinidad inmovilizado en la misma. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor y el reactivo de competición se unen a un sitio de unión Z en el reactivo de afinidad, y por lo tanto se inmovilizan en la matriz de cromatografía. Como resultado, en ciertas divulgaciones, la muestra de elución que contiene las células diana aisladas se agota del reactivo de unión al receptor y del reactivo de competición. Por tanto, en algunas divulgaciones, las células diana, estando liberadas de cualquier reactivo, están ahora en condiciones para su uso adicional, por ejemplo, para su procesamiento mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células diana de la muestra, pueden agotarse de la muestra, por ejemplo, enjuagando, liberando o lavando la muestra restante de la matriz de cromatografía (por ejemplo, la fase estacionaria). En algunas divulgaciones, se usan uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6) pasos de lavado para eliminar células no unidas y restos de la matriz de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, se realizan por lo menos dos pasos de lavado. En algunas divulgaciones, se permite que la muestra penetre en la matriz durante por lo menos o aproximadamente 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 o 120 minutos antes de realizar uno o más pasos de lavado. En algunas divulgaciones, un paso de lavado se realiza en, aproximadamente, o por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, o 120 minutos después de que la muestra se añade a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, se realiza un paso de lavado en, aproximadamente, o por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o 60 minutos después de que la muestra se añada a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo o en el plazo de aproximadamente 120, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo o en el plazo de aproximadamente 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o 5 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo o en el plazo de aproximadamente 5 a 60 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 5 a 50 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 5 a 40 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 5 a 30 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 5 a 20 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 5 a 10 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 10 a 60 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 20 a 60 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 30 a 60 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 40 a 60 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria). En algunas divulgaciones, uno o más pasos de lavado se realizan en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 50 a 60 minutos después de la adición de la muestra a la columna de cromatografía (por ejemplo, fase estacionaria).
En algunas divulgaciones, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de selección celular, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de selección, como una selección positiva o negativa posterior. En ciertas divulgaciones, los métodos, técnicas y reactivos para la selección, aislamiento y enriquecimiento se describen, por ejemplo, en la solicitud PCT N° WO2015164675.
En algunas divulgaciones, puede usarse un único paso de selección para aislar células diana (por ejemplo, células T CD57-) de una muestra. En algunas divulgaciones, el único paso de selección puede realizarse en una única columna de cromatografía. En algunos ejemplos divulgados en la presente, un único paso de selección puede agotar células que expresan múltiples marcadores simultáneamente. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos celulares simultáneamente. En ciertas divulgaciones, los pasos de selección se repiten y/o se realizan más de una vez, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete al mismo paso de selección, como una selección positiva o negativa repetida. En algunos ejemplos divulgados en la presente, un único paso de selección se repite y/o se realiza más de una vez, por ejemplo para aumentar la pureza de las células seleccionadas y/o para eliminar y/o agotar aún más las células seleccionadas negativamente de la fracción seleccionada negativamente. En ciertas divulgaciones, uno o más pasos de selección se realizan dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más de diez veces. En ciertas divulgaciones, el uno o más pasos de selección se realizan y/o se repiten entre una y diez veces, entre una y cinco veces, o entre tres y cinco veces. En algunas divulgaciones, se realizan dos pasos de selección.
La selección celular puede realizarse usando una o más columnas de cromatografía. En algunas divulgaciones, la una o más columnas de cromatografía están incluidas en un sistema cerrado. En algunas divulgaciones, el sistema cerrado es un sistema cerrado automatizado, por ejemplo, que requiere una intervención mínima o nula del usuario (por ejemplo, humano). En algunas divulgaciones, la selección celular se realiza secuencialmente (por ejemplo, una técnica de selección secuencial). En algunas divulgaciones, la una o más columnas de cromatografía se disponen secuencialmente. Por ejemplo, una primera columna puede estar orientada de tal manera que la salida de la columna (por ejemplo, eluyente) puede alimentarse, por ejemplo, a través de tubos conectados, a una segunda columna de cromatografía. En algunas divulgaciones, una pluralidad de columnas de cromatografía pueden disponerse secuencialmente. En algunas divulgaciones, la selección celular puede lograrse llevando a cabo pasos secuenciales de selección positiva y negativa, el paso posterior somete la fracción negativa y/o positiva del paso anterior a selección adicional, donde todo el proceso se lleva a cabo en el mismo tubo o conjunto de tubos.
En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una de las poblaciones de CD4+ o CD8+, y las células no seleccionadas de la primera selección se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para la otra de las poblaciones de CD4+ o CD8+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de una o ambas poblaciones de CD4+ o CD8+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD3+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+ en una primera fase estacionaria (por ejemplo, en una primera columna de cromatografía), y el flujo que contiene células no unidas se usa como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para una población de CD3+ en una segunda fase estacionaria (por ejemplo, en una segunda columna de cromatografía), en donde la primera y la segunda fases estacionarias se disponen secuencialmente. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD3+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD4+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse otra selección o selecciones para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD3+CD4+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD8+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD3+CD8+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. Se contempla que en algunas divulgaciones, subpoblaciones específicas de células T (por ejemplo, células CD3+), como células positivas o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, c D27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+, se seleccionan mediante técnicas de selección secuencial positiva o negativa.
En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD57-, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD3+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD57- en una primera fase estacionaria (por ejemplo, en una primera columna de cromatografía), y el flujo que contiene células no unidas se usa como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para una población de CD3+ en una segunda fase estacionaria (por ejemplo, en una segunda columna de cromatografía), en la que la primera y la segunda fases estacionarias se disponen secuencialmente. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD57-, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD57-, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD3+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse otra selección o selecciones para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD57-CD3+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. Se contempla que en algunas divulgaciones, se seleccionen subpoblaciones específicas de células T (por ejemplo, células CD57-), como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+, mediante técnicas de selección secuencial positiva o negativa.
En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD57-. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+ en una primera fase estacionaria (por ejemplo, en una primera columna de cromatografía), y el flujo que contiene células no unidas se usa como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para una población de C57- en una segunda fase estacionaria (por ejemplo, en una segunda columna de cromatografía), en donde la primera y la segunda fases estacionarias se disponen secuencialmente. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD3+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+, y las células seleccionadas se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para poblaciones de CD57-. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD3+CD57-, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+,<c>D27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. Se contempla que en algunas divulgaciones, subpoblaciones específicas de células T (por ejemplo, células CD57-), como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+, se seleccionan mediante técnicas de selección secuencial positiva o negativa.
En algunas divulgaciones, la selección celular se realiza en paralelo (por ejemplo, técnica de selección en paralelo). En algunas divulgaciones, la una o más columnas de cromatografía están dispuestas en paralelo. Por ejemplo, dos o más columnas pueden estar dispuestas de tal manera que una muestra se carga en dos o más columnas al mismo tiempo a través de tubos que permiten que la muestra se añada a cada columna, por ejemplo, sin necesidad de que la muestra atraviese una primera columna. Por ejemplo, usando una técnica de selección en paralelo, la selección celular puede lograrse llevando a cabo pasos de selección positiva y/o negativa simultáneamente, por ejemplo en un sistema cerrado en el que todo el proceso se lleva a cabo en el mismo tubo o conjunto de tubos. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que la muestra se carga en dos o más columnas de cromatografía, donde cada columna efectúa la selección de una población celular. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía efectúan la selección de las poblaciones de CD57-, CD3+, CD4+ o CD8+ individualmente. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía, incluyendo la cromatografía de afinidad o la cromatografía de permeación en gel, efectúan independientemente la selección de la misma población celular. Por ejemplo, las dos o más columnas de cromatografía pueden efectuar la selección de células CD57-. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía, incluyendo la cromatografía de afinidad o la cromatografía de permeación en gel, efectúan independientemente la selección de diferentes poblaciones celulares. Por ejemplo, las dos o más columnas de cromatografía pueden efectuar independientemente la selección de células c D57-, células CD4+, células CD3+ y/o células CD8+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse otra selección o selecciones, por ejemplo usando técnicas de selección secuencial, para enriquecer subpoblaciones de una o todas las poblaciones celulares seleccionadas mediante selección en paralelo. Por ejemplo, las células seleccionadas pueden seleccionarse adicionalmente para células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, c D27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que se efectúa una selección en paralelo para enriquecer para una población de CD57- en las dos o más columnas. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD57-, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, c D27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que se efectúa una selección para enriquecer para una población de CD57- y una población de CD3+ en las dos o más columnas, independientemente. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de las poblaciones de CD57- y CD3+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que se efectúa una selección para enriquecer para una población de CD57- y una población de CD4+ en las dos o más columnas, independientemente. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de las poblaciones de CD57- y CD4+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que se efectúa una selección en paralelo para enriquecer una población de CD57- y una población de CD8+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de las poblaciones de CD57- y CD8+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, c D27+, c D127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. En algunas divulgaciones, una muestra que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que se efectúa una selección en paralelo para enriquecer una población de CD4+ y una población de CD8+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de las poblaciones de CD4+ y CD8+, por ejemplo, células T de memoria central (T<cm>), células T vírgenes, y/o células positivas para o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+. Se contempla que en algunas divulgaciones, se seleccionen subpoblaciones específicas de células T (por ejemplo, células T CD3+, CD4+, CD8+), como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+, mediante técnicas de selección en paralelo positiva o negativa. En algunas divulgaciones, pueden usarse en combinación técnicas de selección secuencial y paralela.
En algunas divulgaciones, se usan dos columnas para la selección en paralelo. En algunas divulgaciones, las dos columnas seleccionan el mismo tipo celular (por ejemplo, el mismo marcador de selección). En algunas divulgaciones, las dos columnas seleccionan cada una para células T CD57-.
En general, la capacidad de unión de una fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) afecta a la cantidad de fase estacionaria que se necesita para seleccionar un cierto número de fracciones diana, por ejemplo, células diana como las células T. La capacidad de unión, por ejemplo, el número de células diana que pueden inmovilizarse por ml de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección), puede usarse para determinar o controlar el número de células diana capturadas en una o más columnas. Pueden usarse una o más columnas de cromatografía para la selección y estimulación celular en columna divulgada en la presente. Cuando se usan varias columnas, pueden disponerse secuencialmente, en paralelo o en una combinación adecuada de las mismas. Por tanto, la capacidad de unión de una fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) puede usarse para estandarizar la cantidad de reactivo en un enfoque de columna única o la cantidad de reactivo para cada columna en un enfoque de columnas múltiples.
En algunas divulgaciones, la capacidad de unión de la fase estacionaria usada en la presente es el número máximo de células diana unidas a la fase estacionaria en condiciones dadas de solvente y concentración celular, cuando se carga un exceso de células diana en la fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión es o es de aproximadamente 100 millones ± 25 millones de células diana (por ejemplo, células T) por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión estática de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) divulgada en la presente varía entre aproximadamente 75 millones y aproximadamente 125 millones de células diana por ml de fase estacionaria. En una divulgación, la capacidad de unión de la fase estacionaria usada en la presente para la selección y estimulación celular en columna es una capacidad de unión estática. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión estática es la cantidad máxima de células capaces de ser inmovilizadas en la fase estacionaria, por ejemplo, en ciertas condiciones de solvente y concentración celular. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión estática de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) divulgada en la presente varía entre aproximadamente 50 millones y aproximadamente 100 millones células diana por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión estática es o es de aproximadamente 100 millones ± 25 millones de células diana (por ejemplo, células T) por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión estática de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) divulgada en la presente varía entre aproximadamente 75 millones y aproximadamente 125 millones células diana por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión estática de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) está entre aproximadamente 10 millones y aproximadamente 20 millones, entre aproximadamente 20 millones y aproximadamente 30 millones, entre aproximadamente 30 millones y aproximadamente 40 millones, entre aproximadamente 40 millones y aproximadamente 50 millones, entre aproximadamente 50 millones y aproximadamente 60 millones, entre aproximadamente 60 millones y aproximadamente 70 millones, entre aproximadamente 70 millones y aproximadamente 80 millones, entre aproximadamente 80 millones y aproximadamente 90 millones, entre aproximadamente 90 millones y aproximadamente 100 millones, entre aproximadamente 110 millones y aproximadamente 120 millones, entre aproximadamente 120 millones y aproximadamente 130 millones, entre aproximadamente 130 millones y aproximadamente 140 millones, entre aproximadamente 140 millones y aproximadamente 150 millones, entre aproximadamente 150 millones y aproximadamente 160 millones, entre aproximadamente 160 millones y aproximadamente 170 millones, entre aproximadamente 170 millones y aproximadamente 180 millones, entre aproximadamente 180 millones y aproximadamente 190 millones, o entre aproximadamente 190 millones y aproximadamente 200 millones de células diana por ml de fase estacionaria.
En algunas divulgaciones, la capacidad de unión de la fase estacionaria usada en la presente es el número de células diana que se unen a la fase estacionaria en condiciones de flujo dadas antes de que se produzca una ruptura significativa de células diana no unidas. En una divulgación, la capacidad de unión de la fase estacionaria usada en la presente para la selección de células en columna es una capacidad de unión dinámica, es decir, la capacidad de unión en condiciones de funcionamiento en una columna de cromatografía empaquetada durante la aplicación de la muestra. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión dinámica se determina cargando una muestra que contiene una concentración conocida de células diana y monitorizando el flujo, y las células diana se unirán a la fase estacionaria hasta un cierto punto de ruptura antes de que las células diana no unidas fluyan a través de la columna. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión dinámica es o es de aproximadamente 100 millones ± 25 millones de células diana (por ejemplo, células T) por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión dinámica de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) divulgada en la presente está entre o está entre aproximadamente 75 millones y aproximadamente 125 millones de células diana por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión dinámica de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) divulgada en la presente varía entre aproximadamente 50 millones y aproximadamente 100 millones de células diana por ml de fase estacionaria. En algunas divulgaciones, la capacidad de unión dinámica de la fase estacionaria (por ejemplo, resina de selección) está entre aproximadamente 10 millones y aproximadamente 20 millones, entre aproximadamente 20 millones y aproximadamente 30 millones, entre aproximadamente 30 millones y aproximadamente 40 millones, entre aproximadamente 40 millones y aproximadamente 50 millones, entre aproximadamente 50 millones y aproximadamente 60 millones, entre aproximadamente 60 millones y aproximadamente 70 millones, entre aproximadamente 70 millones y aproximadamente 80 millones, entre aproximadamente 80 millones y aproximadamente 90 millones, entre aproximadamente 90 millones y aproximadamente 100 millones, entre aproximadamente 110 millones y aproximadamente 120 millones, entre aproximadamente 120 millones y aproximadamente 130 millones, entre aproximadamente 130 millones y aproximadamente 140 millones, entre aproximadamente 140 millones y aproximadamente 150 millones, entre aproximadamente 150 millones y aproximadamente 160 millones, entre aproximadamente 160 millones y aproximadamente 170 millones, entre aproximadamente 170 millones y aproximadamente 180 millones, entre aproximadamente 180 millones y aproximadamente 190 millones, o entre aproximadamente 190 millones y aproximadamente 200 millones de células diana por ml de fase estacionaria.
En algunas divulgaciones, la fase estacionaria es de 20 ml. En algunas divulgaciones, la fase estacionaria tiene una capacidad de unión de 2 mil millones ± 0,5 mil millones de células.
Generalmente, un método cromatográfico es una cromatografía de fluidos, típicamente una cromatografía líquida. En algunas divulgaciones, la cromatografía puede llevarse a cabo en un modo de flujo en el que una muestra de fluido que contiene las células, por ejemplo, las células diana, se aplica, por ejemplo, por flujo de gravedad o por una bomba en un extremo de una columna que contiene la matriz de cromatografía y en el que la muestra de fluido sale de la columna en el otro extremo de la columna. Además, la cromatografía puede llevarse a cabo en un modo "ascendente y descendente" en el que una muestra de fluido que contiene las células que deben aislarse se aplica, por ejemplo, mediante una pipeta en un extremo de una columna que contiene la matriz de cromatografía empaquetada dentro de una punta de pipeta y en la que la muestra de fluido entra y sale de la matriz de cromatografía/punta de pipeta en el otro extremo de la columna. Alternativamente, la cromatografía también puede llevarse a cabo en un modo por lotes en el que el material de cromatografía (fase estacionaria) se incuba con la muestra que contiene las células, por ejemplo, bajo agitación, rotación o contacto repetido y extracción de la muestra fluida, por ejemplo, por medio de una pipeta.
En algunas divulgaciones, en el contexto de la invención puede emplearse cualquier material como matriz de cromatografía, siempre que el material sea adecuado para el aislamiento cromatográfico de células. En divulgaciones particulares, un material de cromatografía adecuado es por lo menos inocuo o esencialmente inocuo, por ejemplo, no perjudicial para la viabilidad celular, cuando se usa en una columna de cromatografía empaquetada en las condiciones deseadas para el aislamiento celular y/o la separación celular. En algunas divulgaciones, la matriz de cromatografía permanece en una ubicación predefinida, típicamente en una posición predefinida, mientras que se altera la ubicación de la muestra a separar y de los componentes incluidos en la misma. Por tanto, en algunas divulgaciones, la matriz de cromatografía es una "fase estacionaria".
Típicamente, la matriz cromatográfica respectiva tiene la forma de una fase sólida o semisólida, mientras que la muestra que contiene la célula diana a aislar/separar es una fase fluida. La fase móvil usada para lograr la separación cromatográfica es de igual manera una fase fluida. La matriz cromatográfica puede ser un material particulado (de cualquier tamaño y forma adecuados) o un material cromatográfico monolítico, incluyendo un sustrato de papel o una membrana (consultar la Sección de Ejemplos). Por tanto, la cromatografía puede ser tanto cromatografía en columna como cromatografía planar. Además de las columnas de cromatografía estándar, pueden usarse columnas que permitan un flujo bidireccional o puntas de pipeta para la separación cromatográfica de células basada en columnas/flujo mediante el modo descrito en la presente. Por tanto, en algunos casos divulgados en la presente, las puntas de pipeta o las columnas que permiten un flujo bidireccional también comprenden columnas de cromatografía útiles en los presentes métodos. En algunas divulgaciones, se usa un material de matriz particulado, y el material de matriz particulado puede, por ejemplo, tener un tamaño medio de partículas de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 200 pm, o de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 400 pm, o de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 600 pm. En algunas divulgaciones, se usa cromatografía planar, y el material de la matriz puede ser cualquier material adecuado para cromatografía planar, como membranas convencionales a base de celulosa o polímeros orgánicos (por ejemplo, una membrana de papel, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF)) o placas de vidrio recubiertas de sílice. En una divulgación, la matriz cromatográfica/fase estacionaria es un material no magnético o un material no magnetizable.
En algunas divulgaciones, la matriz cromatográfica/fase estacionaria es un material no magnético o no magnetizable. Dicho material puede incluir sílice derivatizada o un gel reticulado. Un gel reticulado (que típicamente se fabrica en forma de perlas) puede basarse en un polímero natural, como un polisacárido reticulado. Un ejemplo de matriz de polisacárido incluye, pero no se limita a, un gel de agarosa (por ejemplo, agarosa Superflow™ o un material Sepharose® como Superflow™ Sepharose® que están disponibles comercialmente en diferentes tamaños de perlas y poros) o un gel de dextrano o dextranos reticulados. Un ejemplo ilustrativo adicional es una matriz de agarosa reticulada particulada, a la que se une covalentemente el dextrano, que está disponible comercialmente (en varios tamaños de perlas y con varios tamaños de poros) como Sephadex® o Superdex®, ambos disponibles en GE Healthcare. Otro ejemplo ilustrativo de dichomaterial cromatográfico es Sephacryl®, también disponible en distintos tamaños de perlas y de poros de GE Healthcare.
En algunas divulgaciones, un gel reticulado también puede basarse en un polímero sintético, como por ejemplo en una clase de polímero que no se produce en la naturaleza. Ejemplos adecuados divulgados en la presente incluyen, pero no se limitan a, geles de agarosa o un gel de dextrano o dextranos reticulados. Un gel reticulado también puede basarse en un polímero sintético, es decir, en una clase de polímero que no se encuentra en la naturaleza. Por lo general, dicho polímero sintético en el que se basa una fase estacionaria de cromatografía para la separación celular es un polímero que tiene unidades monoméricas polares y que, por lo tanto, es en sí mismo polar. Por tanto, en algunos casos divulgados en la presente, dicho polímero polar es hidrófilo. Las moléculas hidrófilas, también denominadas lipofóbicas, en algunas divulgaciones contienen elementos que pueden formar interacciones dipolodipolo con moléculas de agua. En general, las moléculas hidrófobas, también denominadas lipofílicas, tienen tendencia a separarse del agua.
Ejemplos ilustrativos de polímeros sintéticos adecuados son las poliacrilamidas, un gel de estirenodivinilbenceno y un copolímero de un acrilato y un diol o de una acrilamida y un diol. Un ejemplo ilustrativo es un gel de polimetacrilato, disponible comercialmente como Fractogel®. Otro ejemplo es un copolímero de etilenglicol y metacrilato, disponible comercialmente como Toyopearl®. En algunas divulgaciones, una fase estacionaria de cromatografía también puede incluir componentes poliméricos naturales y sintéticos, como una matriz compuesta o un compuesto o un copolímero de un polisacárido y agarosa, por ejemplo, un compuesto de poliacrilamida/agarosa, o de un polisacárido y N,N'-metilenbisacrilamida. Un ejemplo ilustrativo de copolímero de dextrano y N,N'metilenbisacrilamida es el material de la serie Sephacryl® mencionado anteriormente. Una sílice derivatizada puede incluir partículas de sílice acopladas a un polímero sintético o natural. Ejemplos de tales divulgaciones incluyen, pero no se limitan a, sílice injertada de polisacárido, sílice injertada de polivinilpirrolidona, sílice injertada de óxido de polietileno, sílice injertada de poli(2-hidroxietilaspartamida) y sílice injertada de poli(N-isopropilacrilamida).
Una matriz de cromatografía empleada en la presente invención es en algunas divulgaciones una matriz de filtración en gel (también conocida como exclusión por tamaño), por ejemplo, cuando se usa en un cartucho de eliminación como se describe en la presente. Una filtración en gel puede caracterizarse por la propiedad de que está diseñada para no experimentar, por lo menos esencialmente, ninguna interacción con las células a separar. Por lo tanto, una matriz de filtración en gel permite la separación de células u otras entidades biológicas como se definen en la presente en gran medida sobre la base de su tamaño. Una matriz de cromatografía respectiva es típicamente un material poroso particulado como el mencionado anteriormente. La matriz cromatográfica puede tener un cierto límite de exclusión, que típicamente se define en términos de un peso molecular por encima del cual las moléculas quedan totalmente excluidas de introducirse en los poros. El peso molecular respectivo que define el límite de exclusión por tamaño puede seleccionarse para que esté por debajo del peso correspondiente al peso de una célula diana (o entidad biológica) a aislar. En tal divulgación, se impide que la célula diana se introduzca en los poros de la matriz cromatográfica de exclusión por tamaño. De igual manera, una fase estacionaria que es una matriz de cromatografía de afinidad puede tener poros que son de un tamaño que es más pequeño que el tamaño de una célula diana elegida. En las divulgaciones ilustrativas, la matriz de cromatografía de afinidad y/o la matriz de filtración en gel tiene un tamaño de poro medio de 0 a aproximadamente 500 nm.
Otros componentes presentes en una muestra, como las moléculas de unión a receptores o un reactivo de competición, pueden tener un tamaño por debajo del límite de exclusión de los poros e introducirse en los poros de la matriz de cromatografía de exclusión por tamaño. De tales componentes que son capaces de introducirse parcial o totalmente en el volumen de poros, las moléculas más grandes, con menos acceso al volumen de poros, habitualmente eluirán primero, mientras que las moléculas más pequeñas eluirán en último lugar. En algunas divulgaciones, el límite de exclusión de la matriz de cromatografía de exclusión por tamaño se selecciona para que sea inferior a la anchura máxima de la célula diana. Por lo tanto, los componentes que tienen acceso al volumen de poros permanecerán habitualmente más tiempo en la matriz de cromatografía de exclusión por tamaño que la célula diana. Por tanto, las células diana pueden recogerse en el eluido de una columna de cromatografía separadamente de otras materias/componentes de una muestra. Por lo tanto, componentes como un reactivo de unión a receptores o, en su caso, un reactivo de competición, eluyen en un momento posterior de una matriz de filtración en gel que la célula diana. Este efecto de separación se incrementará aún más si la matriz de permeación en gel comprende un reactivo de afinidad (habitualmente unido covalentemente al mismo) que comprende sitios de unión, por ejemplo sitios de unión Z que son capaces de unir reactivos como un reactivo de unión al receptor y/o un reactivo de competición presente en una muestra. El reactivo de unión al receptor y/o el reactivo de competición se unirán a los sitios de unión Z del reactivo de afinidad y, de este modo, se inmovilizarán en la matriz de permeación en gel. Este método se lleva a cabo habitualmente en un cartucho de eliminación como el usado en la presente invención y en algunas divulgaciones un método, una combinación y un kit de acuerdo con la invención incluyen y/o emplean dicha matriz de filtración de gel. En un método respectivo las células se separan por consiguiente sobre la base del tamaño.
Una matriz de cromatografía empleada en la presente invención también puede incluir materia magnéticamente atrayente, como una o más partículas magnéticamente atrayentes o un ferrofluido. Una partícula atraíble magnéticamente respectiva puede comprender un reactivo de multimerización o un reactivo de afinidad con sitio de unión capaz de unirse a una célula diana. Las partículas atraíbles magnéticamente pueden contener material diamagnético, ferromagnético, paramagnético o superparamagnético. El material superparamagnético responde a un campo magnético con un campo magnético inducido sin una magnetización permanente resultante. Las partículas magnéticas basadas en óxido de hierro están, por ejemplo, disponibles comercialmente como Dynabeads® de Dynal Biotech, como MicroBeads magnéticas de Miltenyi Biotec, como perlas magnéticas de vidrio poroso de CPG Inc., así como de otras varias fuentes, como Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences o Novagen Inc. por citar sólo unas pocas. Se han descrito nanopartículas magnéticas basadas en Co superparamagnético y FeCo, así como nanocristales ferromagnéticos de Co, por ejemplo por Hütten, A. et al. (J. Biotech. (2004), 112, 47-63). Sin embargo, en algunas divulgaciones una matriz de cromatografía empleada en la presente invención está desprovista de cualquier materia atraíble magnéticamente.
Reactivo de unión a receptores
Como se ha descrito anteriormente, en ciertas divulgaciones, los métodos divulgados en la presente emplean un reactivo de unión al receptor. En algunas divulgaciones, el reactivo, como se describe en esta Sección, es un reactivo de unión al receptor. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor se une a una molécula en la superficie de una célula, como una molécula de superficie celular. En algunos casos, la molécula de superficie celular es un marcador de selección. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor es capaz de unirse específicamente a un marcador de selección expresado por una o más de las células de una muestra. En algunas divulgaciones, la referencia a la unión específica a una molécula, como una molécula de superficie celular o un receptor de superficie celular, a lo largo de la divulgación no significa necesariamente que el agente se una sólo a dicha molécula. Por ejemplo, un reactivo que se une específicamente a una molécula puede unirse a otras moléculas, generalmente con una afinidad mucho menor, como se determina mediante, por ejemplo, inmunoensayos, BIAcore®, instrumento KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID), u otros ensayos. En algunos casos divulgados en la presente, la capacidad de un reactivo, en condiciones de unión específicas, de unirse a una molécula diana de tal manera que su afinidad o avidez sea por lo menos 5 veces mayor, como por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 o 500 veces mayor, o incluso por lo menos 1000 veces mayor que la afinidad o avidez media del mismo agente a una colección de péptidos o polipéptidos aleatorios de tamaño estadístico suficiente.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, células diana (por ejemplo, células T), tienen o expresan una molécula en la superficie celular, por ejemplo, un marcador de selección, de tal manera que las células a seleccionar se definen por la presencia de por lo menos una molécula específica común (por ejemplo, marcador de selección). En algunas divulgaciones, la muestra que contiene la célula diana también puede contener células adicionales que carecen de la molécula (por ejemplo, marcador de selección). Por ejemplo, en algunas divulgaciones, las células T pueden seleccionarse a partir de una muestra que contenga múltiples tipos de células, por ejemplo, glóbulos rojos o células B. Marcador de selección y molécula receptora pueden usarse indistintamente en la presente para referirse a una molécula de superficie celular.
En algunas divulgaciones, la molécula receptora que se localiza en la superficie celular, por ejemplo, la superficie de la célula diana puede ser cualquier molécula siempre que permanezca unida covalentemente o no covalentemente a la superficie celular durante un proceso de separación cromatográfica en un método de acuerdo con la invención. La molécula receptora es una molécula contra la que puede dirigirse un reactivo de unión al receptor. En algunas divulgaciones el receptor es un péptido o una proteína, como una proteína receptora de membrana. En algunas divulgaciones, el receptor es un lípido, un polisacárido o un ácido nucleico. Un receptor que es una proteína puede ser una proteína de membrana periférica o una proteína de membrana integral. En algunas divulgaciones puede tener uno o más dominios que abarcan la membrana. En ciertas divulgaciones, la molécula receptora es una proteína de superficie de una célula inmunitaria, por ejemplo, CD4, CD8 o CD57. En algunos casos divulgados en la presente, para las células T la molécula receptora es CD3. En algunos casos divulgados en la presente, para las células T la molécula receptora es CD4 o CD8. En algunas divulgaciones, la molécula receptora puede ser un antígeno que define una población o subpoblación celular deseada, por ejemplo una población o subpoblación de células sanguíneas, por ejemplo linfocitos (por ejemplo células T, células T CD57+, células T CD4+ o células T CD8+).
En algunas divulgaciones, la molécula de superficie celular, por ejemplo, marcador de selección, puede ser un antígeno que defina una población o subpoblación celular deseada, por ejemplo, una población o subpoblación de células sanguíneas, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células T, células T auxiliares, por ejemplo, células T CD57-, células T CD3+, células T CD8+, células T auxiliares CD4+, células B o células asesinas naturales), monocitos o células madre, por ejemplo, células madre periféricas positivas para CD34 o células madre que expresen Nanog u Oct-4. En algunas divulgaciones, el marcador de selección puede ser un marcador expresado en la superficie de células T o un subconjunto de células T, como CD57, CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, Cd 4, CD8, CD45RA y/o CD45RO. Los ejemplos de células T incluyen células como linfocitos T CD8+ específicos de CMV, células T citotóxicas, células T de memoria y células T reguladoras (Treg). Un ejemplo ilustrativo de Treg incluye células Treg CD4 CD25 CD45RA y un ejemplo ilustrativo de células T de memoria incluye células T de memoria central específicas CD62L CD8+.
En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor tiene o contiene un sitio de unión B. En ciertas divulgaciones, el sitio de unión B es monovalente. En algunas divulgaciones, un sitio de unión monovalente B es o contiene un fragmento de anticuerpo monovalente o una molécula de unión proteínica con funciones similares a las inmunoglobulinas, un aptámero o una molécula MHC. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos monovalentes incluyen, entre otros, un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), incluyendo un fragmento Fv divalente de cadena sencilla. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos (recombinantes) son fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv), un fragmento de anticuerpo divalente como un fragmento (Fab)2'-, diacuerpos, triacuerpos (Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441), decacuerpos (Stone, E., et al., Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) y otros anticuerpos de dominio (Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490). En algunas divulgaciones uno o más sitios de unión del reactivo de unión a molécula receptora puede ser una molécula de unión artificial proteínica bivalente como una muteína lipocalina dimérica que también se conoce como "duocalina". En algunas divulgaciones, el reactivo de unión a receptores puede tener un único segundo sitio de unión, es decir, puede ser monovalente. Los ejemplos de reactivos de unión a receptores monovalentes incluyen, entre otros, un fragmento de anticuerpo monovalente, una molécula de unión proteínica con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos o una molécula MHC.
Otros ejemplos más de moléculas de unión a proteínas adecuadas son un dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio de fibronectina tipo I, un dominio de fibronectina tipo II, un dominio de fibronectina tipo III, un dominio PAN, un dominio G1a, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de la tripsina pancreática bovina Kunitz, tendamistat, un dominio inhibidor de la serina proteasa tipo Kazal, un dominio Trefoil (tipo P), un dominio del factor von Willebrand tipo C, un dominio similar a la anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tiroglobulina tipo I, un dominio LDL-receptor de clase A, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio trombospondina tipo I, un dominio inmunoglobulina o un dominio similar a inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpos de dominio o anticuerpos de cadena pesada de camello), un dominio lectina tipo C un dominio MAM, un dominio de factor von Willebrand tipo A, un dominio de somatomedina B, un dominio de núcleo de cuatro disulfuros tipo WAP, un dominio F5/8 tipo C, un dominio de hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio tipo EGF tipo laminina, un dominio C2, "Kappacuerpos" (cf. Ill. et al, Protein Eng (1997) 10, 949-57, un denominado "minicuerpo" (Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), un diacuerpo (cf. Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448), un denominado "Janusis" (cf. Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659, o Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52), un nanocuerpo, un microcuerpo, una afilina, un aficuerpo, un knottin, una ubiquitina, una proteína de dedos de zinc, una proteína autofluorescente o una proteína de repetición rica en leucina. Un ejemplo de molécula de ácido nucleico con funciones similares a las de los anticuerpos es un aptámero. Un aptámero se pliega en un motivo tridimensional definido y muestra una gran afinidad por una estructura diana determinada.
En divulgaciones particulares, la proteína de unión a receptores contiene una molécula de unión C. En algunas divulgaciones, la molécula de unión C incluida en el reactivo de unión a receptores puede, por ejemplo, basarse en hidrocarburos (incluyendo los poliméricos) e incluir grupos nitrógeno, fósforo, azufre, carbeno, halógeno o pseudohalógeno. Puede ser un alcohol, un ácido orgánico, un ácido inorgánico, una amina, una fosfina, un tiol, un disulfuro, un alcano, un aminoácido, un péptido, un oligopéptido, un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, un lípido, un sacárido, un oligosacárido o un polisacárido. Como ejemplos adicionales, también puede ser un catión, un anión, un policatión, un polianión, un policatión, un electrolito, un polielectrolito, un nanotubo de carbono o una nanoespuma de carbono. Generalmente, dicho molécula de unión tiene una mayor afinidad con el sitio de unión del reactivo de multimerización que con otro material. Ejemplos de una molécula de unión respectiva incluyen, pero no se limitan a, un éter corona, una inmunoglobulina, un fragmento de la misma y una molécula de unión proteínica con funciones similares a las de los anticuerpos.
En algunas divulgaciones, la molécula de unión C que se incluye en el reactivo de unión al receptor incluye biotina y el reactivo de afinidad incluye un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente a la biotina. En algunas divulgaciones, la molécula de unión C que se incluye en el reactivo de unión al receptor incluye un análogo de biotina que se une reversiblemente a estreptavidina o avidina, y el reactivo de afinidad incluye estreptavidina, avidina, un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente al análogo de biotina respectivo. En algunas divulgaciones, la molécula de unión C que se incluye en el reactivo de unión al receptor incluye un péptido de unión a estreptavidina o avidina y el reactivo de afinidad incluye estreptavidina, avidina, un análogo de estreptavidina o un análogo de avidina que se une reversiblemente al respectivo péptido de unión a estreptavidina o avidina.
En algunas divulgaciones, la molécula de unión que se incluye en el reactivo de unión al receptor puede incluir un péptido de unión a estreptavidina En algunas divulgaciones, la secuencia peptídica contiene una secuencia con la fórmula general His-Pro-Xaa, donde Xaa es glutamina, asparagina o metionina, como la contenida en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 78. En algunas divulgaciones, la secuencia peptídica tiene la fórmula general expuesta en la SEQ ID NO: 69, como la expuesta en la SEQ ID NO: 79. En un ejemplo divulgado en la presente, la secuencia peptídica es Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (también denominada Strep-tag®, expuesta en la SEQ ID NO: 75). En un ejemplo divulgado en la presente, la secuencia peptídica es Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (también denominada Strep-tag®, expuesta en SEQ ID NO: 90). En un ejemplo divulgado en la presente, la secuencia peptídica es Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (también denominada Strep-tag® II, expuesta en la SEQ ID NO: 69), que se describe en la Patente de Estados Unidos 6.103.493, por ejemplo, y está disponible comercialmente bajo la marca Strep-Tactin®. Los péptidos de unión a estreptavidina pueden ser, por ejemplo, péptidos únicos como el "Streptag®" descrito en la patente de Estados Unidos 5.506.121, por ejemplo, o péptidos de unión a estreptavidina con una disposición secuencial de dos o más módulos de unión individuales como los descritos en la Publicación de Patente Internacional WO 02/077018 o en la Patente de Estados Unidos 7.981.632.
En algunas divulgaciones, la molécula de unión C del reactivo de unión al receptor incluye una fracción conocida por el experto como etiqueta de afinidad. En tal divulgación, el reactivo de afinidad incluye un molécula de unión correspondiente, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que se sabe que se une a la etiqueta de afinidad. Como algunos ejemplos ilustrativos de etiquetas de afinidad conocidas, la molécula de unión que se incluye en el reactivo de unión al receptor puede incluir dinitrofenol o digoxigenina, oligohistidina, polihistidina, un dominio de inmunoglobulina, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa (GST), proteína de unión a quitina (CBP) o tiorredoxina, el péptido de unión a la calmodulina (CBP), el péptido FLAG', la etiqueta HA, la etiqueta VSV-G, la etiqueta HSV, el epítopo T7, la proteína de unión a maltosa (MBP), el epítopo HSV de la secuencia de la glicoproteína D del virus del herpes simple, el epítopo "myc" del factor de transcripción c-myc de la secuencia, la etiqueta V5 o la glutatión-S-transferasa (GST). En tal divulgación, el complejo formado entre uno o más sitios de unión del reactivo de afinidad, en este caso un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y el antígeno puede alterarse competitivamente añadiendo el antígeno libre, es decir, el péptido libre (etiqueta de epítopo) o la proteína libre (como MBP o CBP). La etiqueta de afinidad también puede ser una etiqueta oligonucleotídica. Dicha etiqueta oligonucleotídica puede, por ejemplo, usarse para hibridar con un oligonucleótido con una secuencia complementaria, enlazada o incluida en el reactivo de afinidad.
De acuerdo con la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO 2013/011011, la intensidad de la unión entre el reactivo de unión al receptor y una molécula receptora en una célula diana puede no ser esencial para la reversibilidad de la unión de la célula diana al reactivo de afinidad a través del reactivo de unión al receptor. Más bien, independientemente de la fuerza de la unión, es decir, si la constante de disociación de equilibrio (K<d>) para la unión entre el reactivo de unión al receptor a través del sitio de unión B y la molécula receptora es de baja afinidad, por ejemplo, en el intervalo de una K<d>de aproximadamente 10-3 a aproximadamente 10-7 M, o de alta afinidad, por ejemplo, en el intervalo de una Kd de aproximadamente 10-7 a aproximadamente 1 x 10-10 M, una célula diana puede teñirse reversiblemente siempre que la disociación de la unión del reactivo de unión al receptor a través del sitio de unión B y la molécula receptora se produzca con suficiente rapidez. A este respecto, la constante de tasa de disociación (koff) para la unión entre el reactivo de unión al receptor a través del sitio de unión B y la molécula receptora puede tener un valor de aproximadamente 3 x 10-5 seg-1 o más (esta constante de tasa de disociación es la constante que caracteriza la reacción de disociación del complejo formado entre el sitio de unión B del reactivo de unión al receptor y la molécula receptora en la superficie de la célula diana). La constante de tasa de asociación (kon) para la reacción de asociación entre el sitio de unión B del reactivo de unión del receptor y la molécula receptora en la superficie de la célula diana puede tener cualquier valor. Para garantizar una unión suficientemente reversible entre la molécula receptora y el reactivo de unión al receptor, es ventajoso seleccionar el valor de koff del equilibrio de unión para que tenga un valor de aproximadamente 3 x 10-5 seg-1 o mayor, de aproximadamente 5 x 10-5 sec-1 o mayor, como o como aproximadamente 1 x 10-4 sec-1 o mayor, 5 x 10-4 sec-1 o mayor, 1 x 10-3 sec-1 o mayor, 5 x 10-3 sec-1 o mayor, a 1 x 10-2 sec-1 o mayor, 1 x 10-1 sec-1 o mayor o 5 x 10-1 sec-1 o mayor. Cabe señalar aquí que los valores de las constantes cinéticas y termodinámicas, como se usan en la presente, se refieren a condiciones de presión atmosférica, es decir, 1,013 bar, y temperatura ambiente, es decir, 25° C.
En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor tiene un único sitio de unión B (monovalente) capaz de unirse específicamente a la molécula receptora. En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor tiene por lo menos dos (es decir, una pluralidad de sitios de unión B que incluyen tres, cuatro o también cinco sitios de unión B idénticos), capaces de unirse a la molécula receptora. En cualquiera de estas divulgaciones, la unión de la molécula receptora a través de (cada uno de) los sitios de unión B puede tener un valor koff de aproximadamente 3 x 10-5 seg-1 o mayor. Por tanto, el reactivo de unión al receptor puede ser monovalente (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monovalente o una molécula de unión artificial monovalente (proteínica o de otro tipo) como una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas (también conocida como "Anticalin®), o una molécula bivalente como un anticuerpo o un fragmento en el que se conservan ambos sitios de unión como un fragmento F(ab')2. En algunas divulgaciones, la molécula receptora puede ser una molécula multivalente, como una molécula IgE pentamérica, siempre que la tasa de koff sea de 3 x 10-5 seg-1 o superior. En algunas divulgaciones, el Fab es un Fab anti-CD57. En divulgaciones particulares, el Fab es un Fab anti-CD4. En algunas divulgaciones, el Fab es un Fab anti-CD8.
En algunas divulgaciones de la invención, no es a nivel molecular la tasa koff (de 3 x 10-5 seg-1 o mayor) de la unión del reactivo de unión al receptor a través del por lo menos sitio de unión B y la molécula receptora en la célula diana lo que proporciona el aislamiento (sin trazas) de material biológico a través de la tecnología de cromatografía de afinidad celular reversible descrita en la presente. Más bien, y como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 7.776.562 o en la solicitud de patente internacional WO02/054065, una unión de baja afinidad entre la molécula receptora y el sitio de unión B del reactivo de unión al receptor junto con un efecto de avidez mediado a través del reactivo de afinidad inmovilizado permite un aislamiento reversible y sin trazas de una célula diana. En estas divulgaciones puede formarse un complejo entre los dos o más sitios de unión Z del reactivo de afinidad y la molécula de unión C de por lo menos dos reactivos de unión a receptores, lo que permite una inmovilización reversible y la posterior elución de las células diana de la matriz de cromatografía de afinidad (mediante la adición del agente competidor que interrumpirá la unión (complejo) formada entre la molécula de unión C y los sitios de unión Z que a su vez lleva a la disociación del reactivo de unión a receptores de la célula diana. Como se ha mencionado anteriormente, una afinidad de unión tan baja puede caracterizarse por una constante de disociación (K<d>) en el intervalo de aproximadamente 1,0 x 10'3 M a aproximadamente 1,0 x 10'7 M para la unión del reactivo de unión al receptor a través del sitio de unión B y la molécula receptora en la superficie de la célula diana.
En algunas divulgaciones, el marcador de selección puede ser CD57 y el agente de unión a receptores se une específicamente a CD57. En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores que se une específicamente a CD3 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD57, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD57, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD57 y una molécula proteínica de unión a CD57 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. En algunas divulgaciones, el agente de selección comprende un fragmento Fab anti-CD57.
En algunas divulgaciones, el marcador de selección puede ser CD4 y el agente de unión a receptores se une específicamente a CD4. En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores que se une específicamente a CD4 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD4, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD4, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD4 y una molécula proteínica de unión a CD4 con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos. En algunas divulgaciones, un anticuerpo anti-CD4, como un fragmento de anticuerpo divalente o un fragmento de anticuerpo monovalente (por ejemplo, fragmento CD4 Fab) puede derivarse del anticuerpo 13B8.2 o un mutante funcionalmente activo de 13B8.2 que retiene la unión específica para CD4. Por ejemplo, mutantes ejemplares del anticuerpo 13B8.2 o m13B8.2 se describen en la Patente de Estados Unidos N° 7.482.000, la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° US2014/0295458 o la Solicitud de Patente Internacional N° WO2013/124474; y Bes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003). El fragmento Fab mutante denominado "ml3B8.2" lleva el dominio variable del anticuerpo murino de unión a CD4 13B8.2 y un dominio constante que contiene el dominio CH1 humano constante de tipo gamma para la cadena pesada y el dominio de cadena ligera humana constante de tipo kappa, como se describe en la Patente de Estados Unidos 7.482.000. En algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-CD4, por ejemplo un mutante del anticuerpo 13B8.2, contiene la sustitución de aminoácidos H91A en la cadena ligera variable, la sustitución de aminoácidos Y92A en la cadena ligera variable, la sustitución de aminoácidos H35A en la cadena pesada variable y/o la sustitución de aminoácidos R53A en la cadena pesada variable, cada una por numeración de Kabat. En algunas divulgaciones, en comparación con los dominios variables del fragmento 13B8.2 Fab en ml3B8.2 el residuo His en la posición 91 de la cadena ligera (posición 93 en la SEQ ID NO: 96) está mutado a Ala y el residuo Arg en la posición 53 de la cadena pesada (posición 55 en la SEQ ID NO: 95) está mutado a Ala. En algunas divulgaciones, el reactivo que se une reversiblemente al anti-CD4 o a un fragmento del mismo está disponible comercialmente o se deriva de un reactivo que está disponible comercialmente (por ejemplo, catálogo N° 6-8000-206 o 6-8000-205 o 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Alemania). En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores comprende un fragmento Fab anti-CD4. En algunas divulgaciones, el fragmento Fab anti-CD4 comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:95 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:96. En algunas divulgaciones, el fragmento Fab anti-CD4 comprende las CDR de la cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:95 y las CDR de la cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID n O:96.
En algunas divulgaciones, el marcador de selección puede ser CD8 y el agente de unión a receptores se une específicamente a CD8. En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores que se une específicamente a c D8 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD8, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD8, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD8 y una molécula proteínica de unión a CD8 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. En algunas divulgaciones, un anticuerpo anti-CD8, como un fragmento de anticuerpo divalente o un fragmento de anticuerpo monovalente (por ejemplo, fragmento CD8 Fab) puede derivarse del anticuerpo OKT8 (por ejemplo, ATCC CRL-8014) o un mutante funcionalmente activo del mismo que retiene la unión específica para CD8. En algunas divulgaciones, el reactivo que se une reversiblemente al anti-CD8 o un fragmento del mismo está disponible comercialmente o se deriva de un reactivo que está disponible comercialmente (por ejemplo, catálogo N° 6-8003 o 6-8000-201; IBA GmbH, Gottingen, Alemania). En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores comprende un fragmento Fab anti-CD8. En algunas divulgaciones, el fragmento Fab anti-CD8 comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:97 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:98. En algunas divulgaciones, el fragmento Fab anti-CD8 comprende las CDR de la cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:97 y las CDR de la cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:98.
En algunas divulgaciones, el marcador de selección puede ser CD3 y el agente de unión a receptores se une específicamente a CD3. En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores que se une específicamente a CD3 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD3 y una molécula proteínica de unión a CD3 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. En algunas divulgaciones, un anticuerpo anti-CD3, como un fragmento de anticuerpo divalente o un fragmento de anticuerpo monovalente (por ejemplo, fragmento CD3 Fab) puede derivarse del anticuerpo OKT3 (por ejemplo, ATCC CRL-8001; consultar, por ejemplo, Stemberger et al. pLoS One. 2012; 7(4): e35798) o un mutante funcionalmente activo del mismo que retiene la unión específica para CD3. En algunas divulgaciones, el reactivo que se une reversiblemente a anti-CD3 o un fragmento del mismo está disponible comercialmente o se deriva de un reactivo que está disponible comercialmente (por ejemplo, catálogo N° 6-8000-201, 6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Alemania). En algunas divulgaciones, el agente de unión a receptores comprende un fragmento Fab anti-CD3. En algunas divulgaciones, el fragmento Fab anti-CD3 comprende una cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:93 y una cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:94. En algunas divulgaciones, el fragmento Fab anti-CD3 comprende las CDR de la cadena pesada variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID NO:93 y las CDR de la cadena ligera variable que tiene la secuencia expuesta por la SEQ ID<n>O:94.
En cualquiera de las divulgaciones anteriores, el fragmento de anticuerpo divalente puede ser un fragmento (Fab)2'o un fragmento Fv divalente de cadena sencilla, mientras que el fragmento de anticuerpo monovalente puede seleccionarse del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En cualquiera de las divulgaciones anteriores, la molécula de unión proteínica con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos puede ser un aptámero, una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas, un glucuerpo, una proteína basada en el andamiaje de anquirina, una proteína basada en el andamiaje cristalino, una adnectina y un avímero.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento y/o selección por aislamiento cromatográfico da como resultado una o más poblaciones de células T enriquecidas que incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD57- CD3+. En divulgaciones particulares, la población de células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD57- CD3+.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento y/o enriquecimiento por aislamiento cromatográfico da como resultado una población de células T CD4+ enriquecidas que incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD57- CD4+. En ciertas divulgaciones, la composición de entrada de células T CD4+ incluye menos del 40%, menos del 35%, menos del 30%, menos del 25%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,1%, o menos del 0,01% de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+. En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD57- CD4+.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento y/o enriquecimiento mediante aislamiento cromatográfico da como resultado una población de células T CD57- CD8+ enriquecidas que incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD57- CD8+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD8+ contiene menos del 40%, menos del 35%, menos del 30%, menos del 25%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,1%, o menos del 0,01% de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre de o sustancialmente libre de células T CD4+. En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas consiste esencialmente en células T CD57- CD8+.
D. Composiciones de entrada
En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados se usan en relación con la producción o preparación de una población de entrada o composición de células (en la presente composición de entrada o población de entrada se usan indistintamente). En ciertas divulgaciones, la composición de células de entrada se genera siguiendo cualquiera de los métodos divulgados como se describe, por ejemplo a continuación, para seleccionar células T a partir de una muestra biológica (por ejemplo, muestra que contiene células T primarias, como una muestra de leucaféresis o aféresis). En ciertas divulgaciones, la composición celular de entrada incluye una población de células para su uso en manipulación genética, por ejemplo, células que serán manipuladas genéticamente o que se someterán a un proceso para producir células manipuladas genéticamente. En ciertas divulgaciones, las células se tratarán con, se pondrán en contacto con, o se incubarán con un ácido nucleico que codifica un receptor recombinante. En ciertas divulgaciones, la composición de entrada contiene células T, células T viables, células T CD57-, células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+, y/o subpoblaciones de las mismas.
En algunas divulgaciones, la viabilidad celular se evalúa con un ensayo que puede incluir, pero no se limita a, ensayos de captación de colorantes (por ejemplo, ensayos de calceína AM), ensayos de viabilidad celular XTT y ensayos de exclusión de colorantes (por ejemplo, ensayos de exclusión de colorantes azul tripán, eosina o propidio). En divulgaciones particulares, una célula viable tiene expresión negativa de uno o más marcadores apoptóticos, por ejemplo, anexina V o caspasa 3 activa. En algunas divulgaciones, la célula viable tiene expresión negativa de uno o más marcadores de apoptosis que pueden incluir, pero no se limitan a, una caspasa o una caspasa activa, por ejemplo, caspasa 2, caspasa 3, caspasa 6, caspasa 7, caspasa 8, caspasa 9 o caspasa 10, miembros de la familia Bcl-2, por ejemplo, Bax, Bad y Bid, Anexina V o tinción TUNEL. En divulgaciones particulares, las células viables son negativas para caspasa 3 activa. En ciertas divulgaciones, las células viables son negativas para Anexina V.
En algunas divulgaciones, la composición de entrada comprende una población de células T CD57-enriquecidas, por ejemplo, células T CD57- viables. En algunas divulgaciones, por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de las células de la población de entrada son células T CD57-, por ejemplo, células T CD57- viables. En algunas divulgaciones, la población de entrada consiste esencialmente en células T CD57-, por ejemplo, células T CD57- viables.
En ciertas divulgaciones, la población de entrada es una población de células enriquecidas para células T CD4+ y células T CD8+ enriquecidas, por ejemplo, células T CD4+ y células T CD8+. En divulgaciones particulares, la población de entrada es o incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células que son células T CD3+. En divulgaciones particulares, la población de entrada es o incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el99,5%,por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células que son células T CD4+ y CD8+. En algunas divulgaciones, la población de entrada consiste esencialmente en células T CD4+ y CD8+. En divulgaciones particulares, la población de entrada es o incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD3+ (células T CD4+ y CD8+) que son CD57-, por ejemplo células T CD57- viables.
En ciertas divulgaciones, la población de entrada es una población de células T CD4+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de las células de la población de entrada son células T CD4+. En algunas divulgaciones, la población de entrada consiste esencialmente en células T CD4+. En divulgaciones particulares, la población de entrada es o incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD4+ que son CD57-, por ejemplo células T CD57-viables.
En ciertas divulgaciones, la población de entrada es una población de células T CD8+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de las células de la población de entrada son células T CD8+. En algunas divulgaciones, la población de entrada consiste esencialmente en células T CD8+. En divulgaciones particulares, la población de entrada es o incluye por lo menos el 60%, por lo menos el 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 98%, por lo menos el 99%, por lo menos el 99,5%, por lo menos el 99,9%, o por lo menos aproximadamente el 100% de células T CD8+ que son CD57-, por ejemplo células T CD57-viables.
En algunas divulgaciones, las células de una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas y las células de una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas se mezclan, combinan y/o agrupan para generar una población de entrada que contiene células T CD57-CD4+ y células T CD57-CD8+. En ciertas divulgaciones, las poblaciones de células T CD57-CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ se agrupan, mezclan y/o combinan antes de estimular las células, por ejemplo, cultivando las células en condiciones de estimulación. En divulgaciones particulares, las poblaciones de células T CD57-CD4+ y CD57-CD8+ enriquecidas se agrupan, mezclan y/o combinan después de congelar, por ejemplo, crioconservar, y descongelar las poblaciones de células T CD57-CD4+ y CD57-CD8+ enriquecidas.
En ciertas divulgaciones, la población de entrada se produce, genera o elabora mezclando, agrupando y/o combinando células de una población de células CD57-CD4+ enriquecidas con células de una población de células CD57-CD8+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-CD4+ enriquecidas contiene por lo menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,9% de células T CD57-CD4+. En divulgaciones particulares, la población de células T CD57-CD4+ enriquecidas contiene el 100% de células T CD57-CD4+ o contiene aproximadamente el 100% de células T CD57-CD4+. En ciertas divulgaciones, la población de células T enriquecidas incluye o contiene menos del 20%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,1%, o menos del 0,01% de células T CD57-CD8+, y/o no contiene células T CD57-CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD57-CD8+. En algunas divulgaciones, las poblaciones de células consisten esencialmente en células T CD57-CD4+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-CD8+ enriquecidas contiene por lo menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,9% de células T CD57-CD8+, o contiene o contiene aproximadamente un 100% de células T CD57-CD8+. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57-CD8+ enriquecidas incluye o contiene menos del 20%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 1%, menos del 0,1%, o menos del 0,01% de células T CD57-CD4+, y/o no contiene células T CD57-CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD57-CD4+. En algunas divulgaciones, las poblaciones de células consisten esencialmente en células T CD57-CD8+.
En ciertas divulgaciones, las células T CD4+ y las células T CD8+ se agrupan, mezclan y/o combinan en una proporción de entre 1:10 y 10:1, entre 1:5 y 5:1, entre 4:1 y 1:4, entre 1:3 y 3:1, entre 2:1 y 1:2, entre 1.5:1 y 1:1,5, entre 1,25:1 y 1:1,25, entre 1,2:1 y 1:1,2, entre 1,1:1 y 1:1,1, o aproximadamente 1:1 o 1:1 células T CD4+ a células T CD8+. En divulgaciones particulares, las células T CD4+ viables y las células T CD8+ viables se agrupan, mezclan y/o combinan en una proporción de entre 1:10 y 10:1, entre 1:5 y 5:1, entre 4:1 y 1:4, entre 1:3 y 3:1, entre 2:1 y 1:2, entre 15:1 y 1:1,5, entre 1,25:1 y 1:1,25, entre 1,2:1 y 1:1,2, entre 1,1:1 y 1:1,1, o entre 1:1 o 1:1 células T CD4+ y células T CD8+.
En divulgaciones particulares, la composición de entrada tiene una cantidad de, de aproximadamente, o de por lo menos 50 x 106, 100 x 106, 150 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106, 700 x 106, 800 x 106, 900 x 106, 1,000 x 106, 1,100 x 106, or 1,200 x 106 células T, como células T viables, células T CD3+ viables, o células T CD4+ y CD8+ mixtas viables. En divulgaciones particulares, la composición de entrada tiene una cantidad de, de aproximadamente, o de por lo menos 50 x 106, 100 x 106, 150 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106 células T CD4+, por ejemplo, células T CD4+ viables. En ciertas divulgaciones, la composición de entrada tiene una cantidad de, de aproximadamente, o de por lo menos 0 x 106, 100 x 106, 150 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106 células T CD8+, por ejemplo, células T CD8+ viables. En algunas divulgaciones, la cantidad de células es una cantidad de células T CD4+ y CD8+ viables agrupadas, mezcladas y/o combinadas en la misma composición. En tales divulgaciones, las células T CD4+ y CD8+ están presentes en una proporción de entre 1:3 y 3:1, entre 2:1 y 1:2, entre 1,5:1 y 1:1,5, entre 1,25:1 y 1:1,25, entre 1,2:1 y 1:1,2, entre 1,1:1 y 1:1,1, o aproximadamente 1:1 o 1:1 de células T CD4+ a células T CD8+. En algunas divulgaciones, la cantidad de células es una cantidad de células T CD4+ y CD8+ viables agrupadas, mezcladas y/o combinadas en una proporción de aproximadamente 1:1 o 1:1 de células T CD4+ a células T CD8+.
En divulgaciones particulares, la composición de entrada tiene una cantidad de entre o entre aproximadamente 300 x 106 y 600 x 106 células T, por ejemplo, células CD3+ viables, o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o aproximadamente en una proporción 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 300 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables, o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 400 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 500 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 600 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o aproximadamente 700 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o aproximadamente 800 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 900 x 106, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 100 x 107, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 110 x 107, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1). En algunas divulgaciones, la población de entrada tiene una cantidad de o de aproximadamente 120 x 107, por ejemplo, células CD3+ viables o células CD4+ y CD8+ viables mezcladas (por ejemplo, mezcladas en o en aproximadamente una proporción de 1:1).
En ciertas divulgaciones, las células T CD4+ y las células T CD8+ se agrupan, mezclan y/o combinan de tal manera que la composición de entrada tiene hasta o hasta aproximadamente un número objetivo (2n) de células T, como células T viables, células T CD3+ viables o células T CD4+ y CD8+ viables mezcladas. En ciertas divulgaciones en las que un composición que comprende células T CD4+ enriquecidas contiene por lo menos n de células T CD4+ y un composición que comprende células T CD8+ enriquecidas (por ejemplo, derivadas del mismo donante, por ejemplo, de la misma muestra de aféresis o leucaféresis del donante, como la composición de células T CD4+) contiene por lo menos n de células T CD8+, n de células T CD4+ de la composición de células T CD4+ y n de células T CD8+ de la composición de células T CD8+ se juntan, mezclan y/o combinan (es decir, en proporción 1:1 de CD4+ a CD8+) para generar una composición de entrada que contiene el número objetivo (2n) de células T. En ciertas divulgaciones en las que un composición que comprende células T CD4+ enriquecidas no contiene más de (por ejemplo, menos de) n de células T CD4+ y un composición que comprende células T CD8+ enriquecidas (por ejemplo, derivadas del mismo donante, por ejemplo, de la misma muestra de aféresis o leucaféresis del donante, como la composición de células T CD4+) no contiene más de (por ejemplo, menos de) n células T CD8+, todas las células de la composición de células T CD4+ y todas las células de la composición de células T CD8+ se juntan, mezclan y/o combinan para generar la composición de entrada. En estas divulgaciones, la composición de entrada puede contener menos del número objetivo (2n) de células T. En ciertas divulgaciones en las que una composición que comprende células T CD4+ enriquecidas contiene menos de n de células T CD4+ y una composición que comprende células T CD8+ enriquecidas (por ejemplo, derivadas del mismo donante, por ejemplo, de la misma muestra de aféresis o leucaféresis del donante, como la composición de células T CD4+) contiene más de n de células T CD8+, o viceversa, las células de la composición de células T CD4+ o CD8+ se usan para suplementar el tipo celular alternativo de tal manera que la composición de entrada contiene hasta el número objetivo (2n) de células T. En cualquiera de las divulgaciones anteriores, el número objetivo 2n puede ser 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106, 700 x 106, 800 x 106, 900 x 106, 1,000 x 106, 1,100 x 106, o 1,200 x 106.
En ciertas divulgaciones, 450 x 106 células T CD4+ de un composición que comprende células T CD4+ enriquecidas y 450 x 106 células T CD8+ de un composición que comprende células T CD8+ enriquecidas (por ejemplo, derivadas del mismo donante, por ejemplo, de la misma muestra de aféresis o leucaféresis del donante, como la composición de células T CD4+) se juntan, mezclan y/o combinan para generar una composición de entrada que contiene 900 x 106 células T CD4+ y CD8+. En ciertas divulgaciones, cuando un composición que comprende células T CD4+ enriquecidas contiene menos de 450 x 106 células T CD4+ y un composición que comprende células T CD8+ enriquecidas (por ejemplo, derivadas del mismo donante, por ejemplo, de la misma muestra de aféresis o leucaféresis del donante, como la composición de células T CD4+) contiene menos de 450 x 106 células T CD8+, todas las células de la composición de células T CD4+ y todas las células de la composición de células T CD8+ se juntan, mezclan y/o combinan para generar la composición de entrada. En ciertas divulgaciones, cuando cualquiera de las composiciones contiene menos de 450 x 106 células CD4+ o CD8+ mientras que la otra composición contiene más de 450 x 106 células CD8+ o células CD4+, entonces se combinan hasta 900 x 106 células T CD4+ y células T CD8+ para generar una composición de entrada. El número total de células T CD4+ y CD8+ en la composición de entrada puede ser inferior a 900 x 106. En otras palabras, las células de la composición que comprende células T CD4+ enriquecidas pueden usarse para suplementar la composición que comprende células T CD8+ enriquecidas, o viceversa, para generar una composición de entrada que comprenda hasta el número objetivo (2n) de células T, por ejemplo, hasta 900 x 106 células T que se someterán a estimulación.
Aunque en las divulgaciones anteriores, los procesos de selección, aislamiento, separación, enriquecimiento y/o purificación celular se analizan en el contexto de la preparación de una composición de entrada, debe entenderse que los procesos de selección, aislamiento, separación, enriquecimiento y/o purificación celular divulgados en la presente pueden usarse durante, antes de o entre cualquiera de los pasos posteriores (por ejemplo, activación, estimulación, manipulación, transducción, transfección, incubación, cultivo, cosecha, formulación y/o administración de una población celular formulada a un sujeto), en cualquier combinación y/u orden adecuados. Por ejemplo, puede realizarse un paso de selección, aislamiento, separación, enriquecimiento y/o purificación de células T entre la activación/estimulación de células T y la transducción de células T. En otro ejemplo divulgado en la presente, puede realizarse un paso de selección, aislamiento, separación, enriquecimiento y/o purificación de células T después de la transducción de células T, pero antes de la recogida, antes de la recogida y/o antes de la formulación de las células. En un ejemplo particular divulgado en la presente, puede realizarse un paso de selección, aislamiento, separación, enriquecimiento y/o purificación de células T inmediatamente antes de la recogida de las células como un paso de refinamiento o clarificación. En algunas divulgaciones, un paso de selección de células T por cromatografía se realiza entre la activación/estimulación de células T y la transducción de células T. En algunas divulgaciones, un paso de selección de células T por cromatografía se realiza después de la transducción de células T, pero antes de la cosecha, antes de la recogida y/o antes de la formulación de las células. En algunas divulgaciones, un paso de selección de células T por cromatografía se realiza inmediatamente antes de la cosecha de las células.
En algunas divulgaciones, la composición de entrada se somete a uno o más pasos de dilución y/o lavado, por ejemplo, con un medio libre de suero, antes de estimular las células, por ejemplo, cultivando las células en condiciones de estimulación. En algunas divulgaciones, el paso de dilución y/o lavado permite el intercambio de medios en un medio libre de suero, como el descrito en el PCT/US2018/064627.
En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal (por ejemplo, medio basal de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher)), suplementado con uno o más suplementos. En algunas divulgaciones, el uno o más suplementos no contienen suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal suplementado con uno o más componentes adicionales para el mantenimiento, expansión y/o activación de una célula (por ejemplo, una célula T), como el proporcionado por un suplemento adicional (por ejemplo, suplemente de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher)). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además un suplemento de reemplazo de suero, por ejemplo, un reemplazo de suero de células inmunes, por ejemplo, ThermoFisher, #A2596101, el reemplazo de suero de células inmunes CTS™, o el reemplazo de suero de células inmunes descrito en Smith et al. Clin Transl Immunology. Enero 2015; 4(1): e31. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma libre de un aminoácido como L-glutamina. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma dipéptida de L-glutamina (por ejemplo, L-alanil-L-glutamina), como el dipéptido en Glutamax™ (ThermoFisher). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una o más citoquinas recombinantes, como IL-2 humana recombinante, IL-7 humana recombinante y/o IL-15 humana recombinante.
En algunas divulgaciones, la composición de entrada se genera mezclando, combinando y/o agrupando una población enriquecida en células T CD57-CD8+ generada a partir de una muestra de partida, como PBMC o una muestra de leucafresis, con una población enriquecida en células T CD57-CD4+ generada a partir de la muestra de partida. En algunas divulgaciones, la población enriquecida en células T CD57-CD4+ se genera a partir de la fracción CD8 negativa generada durante el proceso de generación de la población enriquecida en células T CD8+ a partir de la muestra de partida. En divulgaciones particulares, la composición de entrada tiene una proporción de o de aproximadamente 1:1 células T CD4+ a células T CD8+, y se somete a uno o más pasos de lavado, por ejemplo, con un medio libre de suero descrito en el PCT/US2018/064627, antes de estimular las células, por ejemplo, cultivando las células en condiciones de estimulación. En algunas divulgaciones, el uno o más paso de lavado permite el intercambio de medios desde un tampón PBS/EDTA que contiene albúmina al medio libre de suero, que también se usa en la estimulación celular.
III. PROCESO PARA MANIPULAR GENÉTICAMENTE POBLACIONES DE CÉLULAS CD57- ENRIQUECIDAS
Entre los métodos divulgados se encuentran métodos para manipular genéticamente células T con un receptor recombinante, como un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunas divulgaciones, los métodos divulgados pueden incluir uno o más pasos de estimulación, activación, manipulación, cultivo y/o expansión de una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas. En ciertas divulgaciones, la una o más poblaciones son o incluyen cualquier población de células T CD57- descritas en la presente, por ejemplo, en la Sección I. En algunas divulgaciones, la una o más poblaciones se aíslan, seleccionan o enriquecen a partir de una muestra biológica mediante cualquier método o proceso descrito en la presente, por ejemplo, en la Sección II. En algunas divulgaciones, la una o más poblaciones de células CD57-T enriquecidas se estimulan o activan, como incubando las células de la población en condiciones de estimulación, como cualquier condición de estimulación descrita en la presente, por ejemplo, en la Sección III.A. En ciertas divulgaciones, la una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas se manipulan genéticamente, como introduciendo un polinucleótido heterólogo en las células de la una o más poblaciones. En algunas divulgaciones, la introducción se realiza mediante cualquier método de manipulación genética divulgado en la presente, por ejemplo, en la Sección III.B. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados pueden incluir la incubación de células T transducidas en condiciones que permitan la integración del vector viral en el genoma de las células.
Los métodos divulgados pueden incluir métodos en los que las células manipuladas no se cultivan más con el propósito de ampliar la población de células. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, las células que se cosechan no se han sometido a ninguna incubación o cultivo donde la cantidad de células viables totales se incrementa al final de la incubación o cultivo en comparación con el número de células viables totales al comienzo de la incubación o cultivo. En algunas divulgaciones, las células que se cosechan no se han sometido a ningún paso de incubación o cultivo explícitamente con el propósito de aumentar (por ejemplo, expandir) el número total de células viables al final del proceso de incubación o cultivo en comparación con el comienzo de dicho proceso de incubación o cultivo. En algunas divulgaciones, las células se incuban o cultivan en condiciones que pueden dar como resultado una expansión, pero las condiciones de incubación o cultivo no se llevan a cabo con el propósito de expandir la población celular. En algunas divulgaciones, las células que se cosechan pueden haber experimentado expansión a pesar de haber sido fabricadas en un proceso que no incluye un paso de expansión. En algunas divulgaciones, un proceso de fabricación que no incluye un paso de expansión se denomina proceso no expandido o mínimamente expandido. Un proceso "no expandido" también puede denominarse proceso "mínimamente expandido". En algunas divulgaciones, un proceso no expandido o mínimamente expandido puede dar como resultado que las células hayan experimentado expansión a pesar de que el proceso no incluya un paso de expansión. En algunas divulgaciones, las células que se cosechan pueden haberse sometido a un paso de incubación o cultivo que incluye una composición de medios diseñada para reducir, suprimir, minimizar o eliminar la expansión de una población celular en su conjunto. En algunas divulgaciones, las células recogidas, cosechadas o formuladas no se han sometido previamente a una incubación o cultivo que se haya realizado en un biorreactor, o en condiciones en las que las células se hayan sacudido, rotado, agitado o perfundido durante toda o una parte de la incubación o cultivo.
En ciertas divulgaciones, la una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas se cultivan, por ejemplo, se cultivan en condiciones que promueven o permiten la división, crecimiento o expansión de células T, como por ejemplo durante una cantidad fija de tiempo o hasta que se alcanza un límite umbral para la expansión. En algunas divulgaciones, el cultivo se realiza mediante cualquier método descrito en la presente, como en la Sección III.C.
En casos particulares, en la presente se divulgan métodos para generar una composición de células T manipuladas genéticamente a partir de una o más poblaciones iniciales, por ejemplo, de entrada, de células T CD57-. En algunas divulgaciones, una población de células T CD57- enriquecidas se incuba en condiciones de estimulación, generando de este modo una población estimulada. En ciertas divulgaciones, la estimulación, por ejemplo, el cultivo de las células en condiciones de estimulación, se realiza durante una cantidad de tiempo establecida o fija, como una cantidad de tiempo inferior a 2 días o durante una cantidad de tiempo comprendida entre 18 horas y 30 horas. En algunas divulgaciones, la estimulación con el reactivo estimulador se lleva a cabo durante aproximadamente 20 horas ± 4 horas.
En ciertas divulgaciones, se introduce un polinucleótido heterólogo en las células de la población estimulada, generando de este modo una población transformada. En divulgaciones particulares, las células se incuban durante o después de la manipulación genética de las células, por ejemplo, durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la integración de un polinucleótido heterólogo o recombinante que codifica una proteína recombinante o para permitir la expresión de la proteína recombinante. En ciertas divulgaciones, las células se incuban durante una cantidad de tiempo establecida o fija, como una cantidad de tiempo superior a 18 horas o inferior a 4 días, por ejemplo, 72 horas ± 6 horas. En cualquiera de los ejemplos divulgados, la introducción puede llevarse a cabo en células después de que hayan sido estimuladas con el reactivo estimulador. En algunas divulgaciones, el paso de manipulación se comienza o se inicia dentro de una cantidad de tiempo establecida desde que se comienza o se inicia la estimulación, como en el plazo de 30 horas desde que el reactivo estimulador se añade, cultiva o se pone en contacto con las células. En divulgaciones particulares, el paso de manipulación se comienza o se inicia entre 18 horas y 30 horas, como 20 horas ± 4 horas, después de que el reactivo estimulador se haya añadido, cultivado o puesto en contacto con las células.
En ciertas divulgaciones, luego se expande la población transformada, por ejemplo durante un periodo de tiempo determinado o hasta que se alcance un umbral de expansión, lo que da como resultado una población expandida. En divulgaciones particulares, la población transformada o la población expandida se cosecha o recoge, y opcionalmente se formula, como para administración a un sujeto o para crioconservación. En algunas divulgaciones, la población es o contiene células T CD57- CD4+ y células T CD57- CD8+. En algunas divulgaciones, la población es o contiene células T CD57- CD3+.
En divulgaciones particulares, las poblaciones de células T enriquecidas pueden recogerse, formularse para crioprotección, congelarse (por ejemplo, crioprotegerse), y/o almacenarse por debajo de 0° C, por debajo de -20° C, o a o por debajo de -70C o -80° C antes, durante o después de cualquier etapa o paso del proceso para generar poblaciones manipuladas de células T enriquecidas que expresan receptores recombinantes. En algunas divulgaciones, las células pueden almacenarse durante una cantidad de tiempo inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 días, o una cantidad de tiempo inferior a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas, o durante una cantidad de tiempo de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 semanas, o durante más de 8 semanas. Después del almacenamiento, las poblaciones de células T enriquecidas pueden descongelarse y el procesamiento puede reanudarse desde el mismo punto del proceso. En algunas divulgaciones, las poblaciones de entrada de células T enriquecidas se crioprotegen y almacenan antes del procesamiento posterior, por ejemplo, incubación en condiciones de estimulación. En divulgaciones particulares, las poblaciones cultivadas y/o formuladas de células T enriquecidas se crioprotegen y almacenan antes de administrarse a un sujeto, por ejemplo, como terapia celular autóloga.
En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados en la presente se usan en conexión con un proceso por el que se generan células manipuladas mediante un proceso que incluye pasos para estimular las células y luego introducir un polinucleótido que codifica un receptor recombinante, por ejemplo, un CAR, en las células. En divulgaciones particulares, la estimulación se realiza durante entre 18 y 30 horas, como durante aproximadamente 24 horas, y la introducción del polinucleótido se realiza posteriormente. En ciertas divulgaciones, las células se cosechan o recogen, como para ser formuladas para crioconservación o administradas a un sujeto, dentro de los 3 días después de iniciada la introducción del polinucleótido. En varias divulgaciones, las células se cosechan o recogen, como para ser formuladas para crioconservación o administradas a un sujeto, en el plazo de 4 días después de que se inicie la incubación bajo condiciones de estimulación.
En ciertas divulgaciones, en la presente se divulgan métodos para generar una composición de células T manipuladas genéticamente a partir de dos poblaciones iniciales, por ejemplo, de entrada, de células T CD57-. En algunas divulgaciones, las dos poblaciones de células T CD57 enriquecidas se incuban por separado en condiciones de estimulación, generando de este modo dos poblaciones estimuladas separadas. En ciertas divulgaciones, se introduce un polinucleótido heterólogo en las células de las dos poblaciones estimuladas separadas, generando de este modo dos poblaciones transformadas separadas. En ciertas divulgaciones, a continuación se expanden las dos poblaciones transformadas separadas, como por ejemplo durante una cantidad de tiempo determinada o hasta que se alcanza un umbral de expansión, dando lugar por tanto a dos poblaciones expandidas separadas. En divulgaciones particulares, las dos poblaciones transformadas separadas o las dos poblaciones expandidas separadas se cosechan o recogen, y opcionalmente se formulan, como para administración a un sujeto o para crioconservación. En divulgaciones particulares, las dos poblaciones separadas se originan o derivan de la misma muestra biológica o de diferentes muestras biológicas del mismo sujeto individual. En algunas divulgaciones, las dos poblaciones separadas son o contienen una población de células T CD57- CD4+ enriquecidas y una población separada de células T CD57-CD8+.
También se divulgan métodos para identificar una población de células capaces de expandirse o proliferar, como durante una incubación o cultivo en condiciones que promueven la proliferación o expansión de células T, como cualquiera de dichas condiciones descritas en la presente, por ejemplo, Sección MI C. En algunas divulgaciones, dichos métodos son o incluyen medir la frecuencia de células CD57+ en la población, en donde si la frecuencia de células CD57+ está por debajo de una frecuencia umbral, la población es capaz de expandirse. En algunas divulgaciones, la frecuencia umbral es menor del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 1%. En algunas divulgaciones, el umbral es o es de aproximadamente el 20%. En algunas divulgaciones, una población que es capaz de expandirse se expande por lo menos 2 veces, 3 veces, 4 veces o 5 veces en 10, 11, 12, 13 o 14 días durante un cultivo en condiciones que promueven la proliferación o expansión. En ciertas divulgaciones, una población que es capaz de expandirse se multiplica por lo menos por 4 en 11 días durante un cultivo, por ejemplo, un cultivo divulgado en la presente como en la Sección III.C.
En algunas divulgaciones, el método es o incluye medir un valor de un rasgo asociado con la expresión de CD57 de una población de células T, en donde la población de células T es capaz de terapia celular de expansión si el valor del rasgo es menor que un valor umbral del rasgo. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de un polipéptido codificado por el CD57 presente en las células T totales, células T CD4+ o células T CD8+ de la dosis. En ciertas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de un polipéptido codificado por el CD57 presente en la superficie de las células T totales, células T CD4+, o células T CD8+ de la dosis, en divulgaciones particulares, el rasgo es una frecuencia, porcentaje, o cantidad de células T, células T CD4+, o células T CD8+ presentes positivas para la expresión del CD57. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de ARNm del segundo gen presente en las células T. En algunas divulgaciones, un nivel o cantidad de accesibilidad del CD57.
En ciertas divulgaciones, el valor umbral está en, en aproximadamente, o dentro del 25%, dentro del 20%, dentro del 15%, dentro del 10%, o dentro del 5% por debajo de una medición media o mediana del rasgo asociado con la expresión de CD57, y/o está por debajo de una desviación estándar menos que la medición media o mediana, en una pluralidad de poblaciones de células T de referencia. En ciertas divulgaciones, el valor umbral está por debajo de una medición más baja del rasgo asociado con la expresión de CD57, opcionalmente dentro del 50%, dentro del 25%, dentro del 20%, dentro del 15%, dentro del 10%, o dentro del 5% por debajo de la medición más baja, en una población de entre una pluralidad de poblaciones de células T de referencia. En algunas divulgaciones, el umbral está por debajo de una medición media o mediana del rasgo asociado con la expresión de CD57 calculada entre más del 65%, 75%, 80%, 85% de muestras de una pluralidad de composiciones de células T de referencia. En divulgaciones particulares, la pluralidad de poblaciones de células T de referencia es una pluralidad de poblaciones que no se expandieron cuando se cultivaron en condiciones que promueven la proliferación o expansión de células T, opcionalmente en donde las células no se expandieron por lo menos 3 veces, 4 veces o 5 veces, en 10, 11, 12, 13 o 14 días de cultivo, por ejemplo, un cultivo como se describe en la presente, como en la Sección III.C. En algunas divulgaciones, las poblaciones de células T de referencia no se expandieron por lo menos 4 veces en el plazo de 11 días de cultivo.
En algunas divulgaciones, la recogida se realiza en o después del momento en que la población manipulada o la población expandida de células T incluye un número umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables, o una concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables. En algunas divulgaciones, el número o concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables se alcanza en el plazo de o de aproximadamente 4, 5, 6 o 7 días después del inicio de la estimulación.
En algunas divulgaciones, entre una pluralidad de poblaciones de células T manipuladas o poblaciones de células T expandidas, el número o concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables se alcanza en un plazo de o de aproximadamente 5 o 6 días después del inicio de la estimulación en por lo menos o aproximadamente o por lo menos de o de aproximadamente el 70%, 80%, 90% o 95% de la pluralidad. En algunas divulgaciones, el número o concentración umbral de células T, células T viables, células T manipuladas o células T manipuladas viables se alcanza en el plazo de o de aproximadamente 2, 3, 4 o 5 duplicaciones de población después del inicio de la estimulación.
En algunas divulgaciones, el método también incluye medir un valor de un rasgo asociado con la expresión de un segundo gen, de tal manera que la población es capaz de expandirse si el valor del rasgo asociado con la expresión de CD57 es menor que el valor umbral y si un rasgo asociado con la expresión del segundo gen es mayor que un segundo umbral. En algunas divulgaciones, el segundo gen es un marcador de una célula de tipo virgen, como pero no limitado a CD25, CD27, CD28, CCR7, o CD45RA. En algunas divulgaciones, el segundo gen codifica CD27.
A. Estimulación
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados se usan en relación con la incubación de células, por ejemplo, células T CD57-, en condiciones de estimulación. En algunas divulgaciones, las condiciones de estimulación incluyen condiciones que activan o estimulan, y/o son capaces de activar o estimular una señal en la célula, por ejemplo, una célula T CD4+ o CD8+, como una señal generada a partir de un TCR y/o un correceptor. En algunas divulgaciones, las condiciones de estimulación incluyen uno o más pasos de cultivo, incubación, activación, propagación de las células con y/o en presencia de un reactivo estimulador, por ejemplo, un reactivo que activa o estimula, y/o es capaz de activar o estimular una señal en la célula. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador estimula y/o activa un TCR y/o un correceptor. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador es un reactivo descrito en la Sección III.A. 1.
En ciertas divulgaciones, se incuban una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas en condiciones de estimulación antes de la manipulación genética de las células, por ejemplo, transfectando y/o transduciendo la célula como mediante una técnica divulgada en la Sección III.B. En divulgaciones particulares, se incuban una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas en condiciones de estimulación después de que la una o más composiciones se hayan aislado, seleccionado, enriquecido u obtenido a partir de una muestra biológica. En divulgaciones particulares, la una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas se han crioconservado y almacenado con anterioridad, y se descongelan antes de la incubación.
En ciertas divulgaciones, la una o más poblaciones de células T CD57- enriquecidas son o incluyen dos poblaciones separadas de células T CD57- enriquecidas. En divulgaciones particulares, las dos composiciones separadas de células T enriquecidas, por ejemplo, dos composiciones separadas de células T enriquecidas seleccionadas, aisladas y/o enriquecidas a partir de la misma muestra biológica, se incuban por separado en condiciones de estimulación. En ciertas divulgaciones, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD57- CD4+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD57- CD8+ enriquecidas. En algunas realizaciones, las dos composiciones separadas incluyen una composición de células T CD57- CD3+ enriquecidas. En algunas divulgaciones, dos composiciones separadas de células T CD57- CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ enriquecidas se incuban por separado en condiciones de estimulación. En algunas divulgaciones, se incuba una única composición de células T enriquecidas en condiciones de estimulación. En ciertas divulgaciones, la composición única es una composición de células T CD57-CD4+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, la composición única es una composición de células T CD57- CD8+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, la composición única es una composición de células T CD57- CD3+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, la composición única es una composición de células T CD57-CD4+ y CD57-CD8+ enriquecidas que se han combinado a partir de composiciones separadas antes de la incubación.
En algunas divulgaciones, la población de células T CD57- CD4+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye por lo menos o aproximadamente un 60%, por lo menos o aproximadamente un 65%, por lo menos o aproximadamente un 70%, por lo menos o aproximadamente un 75%, por lo menos o aproximadamente un 80%, por lo menos o aproximadamente un 85%, por lo menos o aproximadamente un 90%, por lo menos o aproximadamente un 95%, por lo menos o aproximadamente un 98%, por lo menos o aproximadamente un 99%, por lo menos o aproximadamente un 99,5%, por lo menos o aproximadamente un 99,9% o por lo menos un 100% de células T CD57- CD4+. En ciertas divulgaciones, la composición de células T CD57- CD4+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye menos de o de aproximadamente el 40%, menos de o de aproximadamente el 35%, menos de o de aproximadamente el 30%, menos de o de aproximadamente el 25%, menos de o de aproximadamente el 20%, menos de o de aproximadamente el 15%, menos de o de aproximadamente el 10%, menos de o de aproximadamente el 5%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1%, o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T que son positivas para la expresión de CD57 o negativas para la expresión de CD4.
En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye por lo menos o aproximadamente un 60%, por lo menos o aproximadamente un 65%, por lo menos o aproximadamente un 70%, por lo menos o aproximadamente un 75%, por lo menos o aproximadamente un 80%, por lo menos o aproximadamente un 85%, por lo menos o aproximadamente un 90%, por lo menos o aproximadamente un 95%, por lo menos o aproximadamente un 98%, por lo menos o aproximadamente un 99%, por lo menos o aproximadamente un 99,5%, por lo menos o aproximadamente un 99,9% o por lo menos o aproximadamente un 100% de células T CD57- CD8+. En ciertas divulgaciones, la composición de células T CD57-CD4+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye menos de o de aproximadamente el 40%, menos de o de aproximadamente el 35%, menos de o de aproximadamente el 30%, menos de o de aproximadamente el 25%, menos de o de aproximadamente el 20%, menos de o de aproximadamente el 15%, menos de o de aproximadamente el 10%, menos de o de aproximadamente el 5%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1%, o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T que son positivas para la expresión de CD57 o negativas para la expresión de CD8. En ciertas divulgaciones, la composición de células T CD57- CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye menos de o de aproximadamente el 40%, menos de o de aproximadamente el 35%, menos de o de aproximadamente el 30%, menos de o de aproximadamente el 25%, menos de o de aproximadamente el 20%, menos de o de aproximadamente el 15%, menos de o de aproximadamente el 10%, menos de o de aproximadamente el 5%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1% o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T positivas para la expresión de CD57 o negativas para la expresión de CD8.
En ciertas divulgaciones, la población de células T CD57- CD3+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye por lo menos o aproximadamente un 60%, por lo menos o aproximadamente un 65%, por lo menos o aproximadamente un 70%, por lo menos o aproximadamente un 75%, por lo menos o aproximadamente un 80%, por lo menos o aproximadamente un 85%, por lo menos o aproximadamente un 90%, por lo menos o aproximadamente un 95%, por lo menos o aproximadamente un 98%, por lo menos o aproximadamente un 99%, por lo menos o aproximadamente un 99,5%, por lo menos o aproximadamente un 99,9% o por lo menos o aproximadamente un 100% de células T CD57- CD3+. En ciertas divulgaciones, la composición de células T CD57-CD3+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye menos de o de aproximadamente el 40%, menos de o de aproximadamente el 35%, menos de o de aproximadamente el 30%, menos de o de aproximadamente el 25%, menos de o de aproximadamente el 20%, menos de o de aproximadamente el 15%, menos de o de aproximadamente el 10%, menos de o de aproximadamente el 5%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1%, o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T que son positivas para la expresión de CD57 o negativas para la expresión de CD3.
En ciertas divulgaciones, se combinan composiciones separadas de células T CD57-CD4+ y CD57-CD8+ enriquecidas en una única composición y se incuban en condiciones de estimulación. En ciertas divulgaciones, se combinan composiciones estimuladas separadas de células T CD57-CD4+ enriquecidas y CD57- CD8+ enriquecidas en una única composición después de que se haya realizado y/o completado la incubación.
En algunas divulgaciones, la incubación en condiciones de estimulación puede incluir cultivo, estimulación, activación, propagación, incluyendo por incubación en presencia de condiciones de estimulación, por ejemplo, condiciones diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación, y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición a antígenos, y/o para preparar las células para manipulación genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante. En divulgaciones particulares, las condiciones de estimulación pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, como citoquinas, quimiocinas, antígenos, moléculas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En algunas divulgaciones, la estimulación y/o incubación en condiciones de estimulación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.1 77 de Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother.
35(9):689-701.
En algunas divulgaciones, las células T CD57- se expanden añadiendo a la composición iniciadora del cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que no se dividen (por ejemplo, de manera que la población resultante de células contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras PBMC por cada linfocito T de la población inicial que se va a expandir); e incubando el cultivo (por ejemplo, durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunas divulgaciones, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunas divulgaciones, las PBMC se irradian con rayos gamma en un intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunas divulgaciones, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de añadir las poblaciones de células T.
En algunas divulgaciones, las condiciones de estimulación incluyen temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25° C, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados, y generalmente de o de aproximadamente 37° C. En algunas divulgaciones, se efectúa un cambio de temperatura durante el cultivo, como de 37° C a 35° C. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) transformadas por EBV que no se dividen como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en un intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunas divulgaciones se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.
En divulgaciones particulares, las condiciones de estimulación incluyen incubar y/o cultivar las células con un reactivo estimulador. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador es un reactivo descrito en la Sección III.A.
1. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador contiene o incluye una perla. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador contiene o incluye un reactivo oligomérico, por ejemplo, un reactivo oligomérico de muteína de estreptavidina. En ciertas realizaciones, el inicio de la incubación y/o cultivo de células en condiciones de estimulación se produce cuando las células entran en contacto y/o se incuban con el reactivo estimulador. En divulgaciones particulares, las células se incuban antes, durante y/o después de la manipulación genética de las células, por ejemplo, introduciendo un polinucleótido recombinante en la célula como por transducción o transfección. En algunas divulgaciones, la composición de células T enriquecidas se incuba en una proporción de reactivo estimulador y/o perlas a células de o de aproximadamente 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1, o 0,2:1. En divulgaciones particulares, la proporción de reactivo estimulador y/o perlas respecto a las células está comprendida entre 2,5:1 y 0,2:1, entre 2:1 y 0,5:1, entre 1,5:1 y 0,75:1, entre 1,25:1 y 0,8:1, entre 1,1:1 y 0,9:1. En divulgaciones particulares, la proporción de reactivo estimulador a células es de aproximadamente 1:1 o es de 1:1.
En algunas divulgaciones, las células se estimulan en presencia de, de aproximadamente, o de por lo menos 0,01 |jg, 0,02 |jg, 0,03 |jg, 0,04 |jg, 0,05 |jg, 0,1 |jg, 0,2 |jg, 0,3 |jg, 0,4 |jg, 0,5 |jg, 0,75 |jg, 1 |jg, 2 |jg, 3 |jg, 4 |jg, 5 |jg, 6 jig, 7 jig, 8 jig, 9 jig, o 10 jig del reactivo estimulador por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 4 jig del reactivo estimulador por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 0,8 jg del reactivo estimulador por 106 células.
En ciertas divulgaciones, las células, por ejemplo, células de la población de entrada, se estimulan o se someten a estimulación, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación, como en presencia de un reactivo estimulador, a una densidad de, de aproximadamente, o por lo menos 0,01 x 106 células/ml, 0,1 x 106 células/ml, 0,5 x 106 células/ml, 1,0 x 106 células/ml, 1,5 x 106 células/ml, 2,0 x 106 células/ml, 2,5 x 106 células/ml, 3,0 x 106 células/ml, 4,0 x 106 células/ml, 5,0 x 106 células/ml, 10 x 106 células/ml, o 50 x 106 células/ml. En ciertas divulgaciones, las células, por ejemplo, células de la población de entrada, se estimulan o se someten a estimulación, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación, como en presencia de un reactivo estimulador, a una densidad de, de aproximadamente, o por lo menos 3,0 x 106 células/ml. En ciertas divulgaciones, las células de la entrada son células viables.
En algunas divulgaciones, las composiciones o células se incuban en presencia de condiciones de estimulación o de un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de células en la población, para imitar la exposición a antígenos y/o para preparar las células para manipulación genética, como para la introducción de un receptor de antígeno recombinante. A continuación se describen reactivos estimuladores ejemplares.
En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la incubación en presencia de una o más condiciones de estimulación o un agente estimulador se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo, bajo rotación centrífuga, como se describe en la Publicación Internacional Número WO2016/073602. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la incubación realizada en una cámara centrífuga incluye el mezclado con un reactivo o reactivos para inducir la estimulación y/o activación. En algunas divulgaciones, las células, como células seleccionadas, se mezclan con una condición estimuladora o agente estimulador en la cámara centrífuga. En algunas divulgaciones de tales procesos, un volumen de células se mezcla con una cantidad de una o más condiciones o agentes estimuladores que es mucho menor que la que se emplea normalmente al realizar estimulaciones similares en una placa de cultivo celular u otro sistema.
En algunas divulgaciones, el agente estimulador se añade a las células en la cavidad de la cámara en una cantidad que es sustancialmente menor que (por ejemplo, no es más del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% de la cantidad) en comparación con la cantidad del agente estimulador que se usa típicamente o que sería necesaria para lograr aproximadamente la misma eficacia de selección o una similar del mismo número de células o el mismo volumen de células cuando la selección se realiza sin mezclar en una cámara centrífuga, por ejemplo, en un tubo o bolsa con agitación o rotación periódica. En algunas divulgaciones, la incubación se realiza con la adición de un tampón de incubación a las células y al agente estimulador para conseguir un volumen objetivo con incubación del reactivo de, por ejemplo, 10 ml a 200 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml o 200 ml. En algunas divulgaciones, el tampón de incubación y el agente estimulador se mezclan previamente antes de la adición a las células. En algunas divulgaciones, el tampón de incubación y el agente estimulador se añaden por separado a las células. En algunas divulgaciones, la incubación estimuladora se lleva a cabo con condiciones periódicas de mezclado suave, lo que puede ayudar a promover interacciones energéticamente favorecidas y, de este modo, permitir el uso de menos agente estimulador total mientras se consigue la estimulación y activación de las células.
En algunas divulgaciones, la incubación se lleva a cabo generalmente en condiciones de mezclado, como en presencia de centrifugación, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, como una velocidad inferior a la usada para sedimentar las células, como de o de aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (por ejemplo, de o de aproximadamente 600 rpm, 1000 rpm, 1500 rpm o 1700 rpm), como a una RCF en la muestra o pared de la cámara u otro recipiente de o de aproximadamente 80 g a 100 g (por ejemplo de o de aproximadamente o por lo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, o 100 g). En algunas divulgaciones, el centrifugado se lleva a cabo usando intervalos repetidos de un centrifugado a dicha velocidad baja seguido de un periodo de descanso, como un centrifugado y/o descanso durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 segundos, como un centrifugado a aproximadamente 1 o 2 segundos seguido de un descanso durante aproximadamente 5, 6, 7, u 8 segundos.
En algunas divulgaciones, la duración total de la incubación, por ejemplo con el agente estimulador, está comprendida entre o entre aproximadamente 1 hora y 96 horas, 1 hora y 72 horas, 1 hora y 48 horas, 4 horas y 36 horas, 8 horas y 30 horas o 12 horas y 24 horas, como por lo menos o aproximadamente por lo menos 6 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas o 72 horas. En algunas divulgaciones, la incubación adicional es durante un tiempo entre o aproximadamente entre 1 hora y 48 horas, 4 horas y 36 horas, 8 horas y 30 horas o 12 horas y 24 horas, inclusive.
En algunas divulgaciones, la estimulación, por ejemplo, el cultivo de las células en condiciones de estimulación, se realiza durante, durante aproximadamente o durante menos de 48 horas, 42 horas, 36 horas, 30 horas, 24 horas, 22 horas, 20 horas, 18 horas, 16 horas o 12 horas. En algunas divulgaciones, la estimulación, por ejemplo, el cultivo de las células en condiciones de estimulación, se realiza durante 20 ± 4 horas o entre o entre aproximadamente 16 horas y 24 horas. En divulgaciones particulares, la estimulación, por ejemplo, el cultivo de las células en condiciones de estimulación, se realiza durante entre o entre aproximadamente 36 horas y 12 horas, 30 horas y 18 horas, o durante o durante aproximadamente 24 horas, o 22 horas. En algunas divulgaciones, la estimulación, por ejemplo, el cultivo de las células en condiciones de estimulación, se realiza durante, durante aproximadamente, o durante menos de, 2 días o un día.
En divulgaciones particulares, se estimulan o se someten a estimulación una cantidad de, de aproximadamente, o de por lo menos 50 x 106, 100 x 106, 150 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106, 700 x 106, 800 x 106, 900 x 106, o 1.000 x 106 células de la población de entrada, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación. En divulgaciones particulares, la cantidad de la población de entrada que se estimula, por ejemplo, se cultiva en condiciones de estimulación, es de o de aproximadamente 50 x 10 células6, de o de aproximadamente 100 x 106 células, de o de aproximadamente 150 x 106 células, de o de aproximadamente 200 x 106 células, de o de aproximadamente 250 x 106 células, de o de aproximadamente 300 x 106 células, de o de aproximadamente 350 x 106 células, de o de aproximadamente 400 x 106 células, de o de aproximadamente 450 x 106 células, de o de aproximadamente 500 x 106 células, de o de aproximadamente 550 x 106 células, de o de aproximadamente 600 x 106 células, de o de aproximadamente 700 x 106 células, de o de aproximadamente 800 x 106 células, de o de aproximadamente 900 x 106 células, o de o de aproximadamente 1.000 x 106 células, o cualquier valor entre cualquiera de los anteriores. En divulgaciones particulares, se estimula una cantidad de o de aproximadamente 900 x 106 células de la población de entrada, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación.
En divulgaciones particulares, la composición de entrada comprende células T CD4+ viables y células T CD8+ viables, en una proporción de entre 1:10 y 10:1, entre 1:5 y 5:1, entre 4:1 y 1:4, entre 1:3 y 3:1, entre 2:1 y 1:2, entre 1.5:1 y 1:1,5, entre 1,25:1 y 1:1,25, entre 1,2:1 y 1:1,2, entre 1,1:1 y 1:1,1, o aproximadamente 1:1, o 1:1 células T CD4+ viables por células T CD8+ viables. En divulgaciones particulares, la composición de entrada comprende células T CD4+ viables y células T CD8+ viables, en una proporción de aproximadamente 1:1 o 1:1 células T CD4+ viables a células T CD8+ viables. En divulgaciones particulares, se estimula una cantidad de o de aproximadamente 450 x 106 células CD4+ de la población de entrada, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación. En divulgaciones particulares, se estimula una cantidad de o de aproximadamente 450 x 106 células CD8+ de la población de entrada, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación. En divulgaciones particulares, se estimula una cantidad de o de aproximadamente 450 x 106 células T CD4+ y una cantidad de o de aproximadamente 450 x 106 células T CD8+ de la población de entrada, por ejemplo, se cultivan en condiciones de estimulación.
En divulgaciones particulares, las condiciones de estimulación incluyen incubar y/o cultivar una composición de células T enriquecidas con y/o en presencia de una o más citoquinas. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes. En algunas divulgaciones, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes humanas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas se unen y/o son capaces de unirse a receptores que son expresados por y/o son endógenos a células T. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye un miembro de la familia de citoquinas del haz de 4 alfa-hélice. En algunas divulgaciones, los miembros de la familia del haz de 4 alfa-hélices de citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). En algunas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye IL-15. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-7. En algunas divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-2.
En ciertas divulgaciones, la cantidad o concentración de una o más citoquinas se mide y/o cuantifica con Unidades Internacionales (IU). Las unidades internacionales pueden usarse para cuantificar vitaminas, hormonas, citoquinas, vacunas, productos sanguíneos y sustancias biológicamente activas similares. En algunas divulgaciones, las IU son o incluyen unidades de medida de la potencia de preparaciones biológicas por comparación con un estándar de referencia internacional de un peso y fuerza específicos, por ejemplo, el 1er Estándar Internacional de la OMS para la IL-2 Humana, 86/504. Las Unidades Internacionales son el único método reconocido y estandarizado para informar de las unidades de actividad biológica que se publican y se derivan de un esfuerzo de investigación colaborativa internacional. En divulgaciones particulares, la IU para la población, muestra o fuente de una citoquina puede obtenerse a través de pruebas de comparación de productos con un producto estándar análogo de la OMS. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, la IU/mg de una población, muestra o fuente de IL-2, IL-7 o IL-15 recombinante humana se compara con el producto IL-2 estándar de la OMS (código NIBSC: 86/500), el producto IL-17 estándar de la OMS (código NIBSC: 90/530) y el producto IL-15 estándar de la OMS (código NIBSC: 95/554), respectivamente.
En algunas divulgaciones, la actividad biológica en IU/mg es equivalente a (ED50 en ng/ml)-1 x106. En divulgaciones particulares, la ED50 de IL-2 o IL-15 humana recombinante es equivalente a la concentración requerida para la estimulación semimáxima de la proliferación celular (escisión XTT) con células CTLL-2. En ciertas divulgaciones, la ED50 de IL-7 humana recombinante es equivalente a la concentración requerida para la estimulación semimáxima de la proliferación de linfocitos de sangre periférica humana activados con PHA. Los detalles relativos a los ensayos y cálculos de IU para la IL-2 se analizan en Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7; y Gearing y Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9; los detalles relativos a los ensayos y cálculos de IU para IL-15 se analizan en Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de una citoquina, por ejemplo, una citoquina humana recombinante, a una concentración de entre 1 IU/ml y 1.000 IU/ml, entre 10 IU/ml y 50 IU/ml, entre 50 IU/ml y 100 IU/ml, entre 100 IU/ml y 200 IU/ml, entre 100 IU/ml y 500 IU/ml, entre 250 IU/ml y 500 IU/ml, o entre 500 IU/ml y 1.000 IU/ml.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de IL-2 recombinante, por ejemplo, IL-2 recombinante humana, a una concentración entre 1 IU/ml y 500 lU/ml, entre 10 lU/ml y 250 lU/ml, entre 50 lU/ml y 200 lU/ml, entre 50 lU/ml y 150 lU/ml, entre 75 lU/ml y 125 lU/ml, entre 100 lU/ml y 200 lU/ml, o entre 10 lU/ml y 100 lU/ml. En divulgaciones particulares, las células, por ejemplo, células de la población de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de IL-2 recombinante a una concentración de aproximadamente 50 IU/ml, 60 IU/ml, 70 IU/ml, 80 IU/ml, 90 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml, 150 IU/ml, 160 IU/ml, 170 IU/ml, 180 IU/ml, 190 IU/ml, o 100 IU/ml. En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 100 IU/ml de IL-2 recombinante, por ejemplo, IL-2 recombinante humana.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de IL-7 recombinante, por ejemplo, IL-7 recombinante humana, a una concentración entre 100 IU/ml y 2.000 IU/ml, entre 500 IU/ml y 1.000 IU/ml, entre 100 IU/ml y 500 IU/ml, entre 500 IU/ml y 750 IU/ml, entre 750 IU/ml y 1.000 IU/ml, o entre 550 IU/ml y 650 IU/ml. En divulgaciones particulares, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de IL-7 a una concentración de o de aproximadamente 50 IU/ml, 100 IU/ml, 150 IU/ml, 200 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml, 350 IU/ml, 400 IU/ml, 450 IU/ml, 500 IU/ml, 550 IU/ml, 600 IU/ml, 650 IU/ml, 700 IU/ml, 750 IU/ml, 800 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml o 1.000 IU/ml. En divulgaciones particulares, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 600 IU/ml de IL-7 recombinante, por ejemplo, IL-7 recombinante humana.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de IL-15 recombinante, por ejemplo, IL-15 recombinante humana, a una concentración entre 1 IU/ml y 500 IU/ml, entre 10 IU/ml y 250 IU/ml, entre 50 IU/ml y 200 IU/ml, entre 50 IU/ml y 150 IU/ml, entre 75 IU/ml y 125 IU/ml, entre 100 IU/ml y 200 IU/ml, o entre 10 IU/ml y 100 IU/ml. En divulgaciones particulares, las células, por ejemplo, una célula de la población de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de IL-15 recombinante a una concentración de aproximadamente 50 IU/ml, 60 IU/ml, 70 IU/ml, 80 IU/ml, 90 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml, 150 IU/ml, 160 IU/ml, 170 IU/ml, 180 IU/ml, 190 IU/ml o 200 IU/ml. En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, las células de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 100 IU/ml de IL-15 recombinante, por ejemplo, IL-15 recombinante humana.
En divulgaciones particulares, las células, por ejemplo, células de la población de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en condiciones de estimulación en presencia de IL-2, IL-7 y/o IL-15. En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, células de la población de entrada, se estimulan o se someten a estimulación en condiciones de estimulación en presencia de lL-2, IL-7 y/o IL-15. En algunas divulgaciones, la IL-2, IL-7, y/o IL-15 son recombinantes. En ciertas divulgaciones, la IL-2, IL-7, y/o IL-15 son humanas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas son o incluyen IL-2, IL-7, y/o IL-15 recombinantes humanas. En ciertas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en condiciones de estimulación en presencia de IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes. En ciertas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en condiciones de estimulación en presencia de IL-2 recombinante de o de aproximadamente 100 IU/ml, IL-7 recombinante de o de aproximadamente 600 IU/ml, e IL-15 recombinante de o de aproximadamente 100 IU/ml.
Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, como citoquinas, quimioquinas, antígenos, moléculas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En algunas divulgaciones, la estimulación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.77 de Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunas divulgaciones, la estimulación se realiza en medios libres de suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero es un medio de cultivo celular definido y/o bien definido. En ciertas divulgaciones, el medio libre de suero es un medio de cultivo controlado que ha sido procesado, por ejemplo, filtrado para eliminar inhibidores y/o factores de crecimiento. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero contiene proteínas. En ciertas divulgaciones, los medios libres de suero pueden contener albúmina de suero, hidrolizados, factores de crecimiento, hormonas, proteínas portadoras y/o factores de unión.
En algunas divulgaciones, la estimulación se realiza en medios libres de suero descritos en la presente o en el PCT/US2018/064627. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal (por ejemplo, medio basal de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher)), suplementado con uno o más suplementos. En algunas divulgaciones, el uno o más suplementos no contienen suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal suplementado con uno o más componentes adicionales para el mantenimiento, expansión y/o activación de una célula (por ejemplo, una célula T), como el proporcionado por un suplemento adicional (por ejemplo, suplemento de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher)). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además un suplemento de reemplazo de suero, por ejemplo, un reemplazo de suero de células inmunes, por ejemplo, ThermoFisher, N° A2596101, el reemplazo de suero de células inmunes CTS™, o el reemplazo de suero de células inmunes descrito en Smith et al. Clin Transl Immunology. Enero 2015; 4(1): e31. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma libre de un aminoácido como L-glutamina. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma dipéptida de L-glutamina (por ejemplo, L-alanil-L-glutamina), como el dipéptido en Glutamax™ (ThermoFisher). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una o más citoquinas recombinantes, como IL-2 humana recombinante, IL-7 humana recombinante, y/o IL-15 humana recombinante. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la estimulación en presencia de una o más condiciones de estimulación o un reactivo estimulador se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo, bajo rotación centrífuga, como se describe en la Publicación Internacional Número WO2016/073602. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la estimulación realizada en una cámara centrífuga incluye el mezclado con un reactivo o reactivos para inducir la estimulación y/o activación. En algunas divulgaciones, las células, como células seleccionadas, se mezclan con una condición estimulante o agente estimulador en la cámara centrífuga. En algunas divulgaciones de tales procesos, un volumen de células se mezcla con una cantidad de una o más condiciones o agentes estimulantes que es mucho menor que la que se emplea normalmente al realizar estimulaciones similares en una placa de cultivo celular u otro sistema.
En algunas divulgaciones, la estimulación se lleva a cabo generalmente en condiciones de mezclado, como en presencia de centrifugación, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, como una velocidad inferior que la usada para sedimentar las células, como de o aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (por ejemplo de o de aproximadamente o por lo menos 600 rpm, 1000 rpm, o 1500 rpm o 1700 rpm), como a una RCF en la muestra o pared de la cámara u otro recipiente de o de aproximadamente 80 g a 100 g (por ejemplo de o de aproximadamente 0 por lo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, o 100 g). En algunas divulgaciones, el centrifugado se lleva a cabo usando intervalos repetidos de un centrifugado a dicha velocidad baja seguido de un periodo de descanso, como un centrifugado y/o descanso durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 segundos, como un centrifugado a aproximadamente 1 o 2 segundos seguido de un descanso durante aproximadamente 5, 6, 7, u 8 segundos.
En ciertas divulgaciones, la estimulación se realiza en condiciones estáticas, como condiciones que no implican centrifugación, agitación, rotación, balanceo o perfusión, por ejemplo, perfusión continua o semicontinua de los medios. En algunas divulgaciones, ya sea antes o poco después, por ejemplo, dentro de 5, 15 o 30 minutos, de la iniciación, las células se transfieren (por ejemplo, se transfieren en condiciones estériles) a un recipiente como una bolsa o vial, y se colocan en una incubadora. En divulgaciones particulares, la incubadora se ajusta a, a aproximadamente, o por lo menos 16° C, 24° C, o 35° C. En algunas divulgaciones, la incubadora se ajusta a 37° C, a aproximadamente 37° C, o a 37° C ±2° C, ±1° C, ±0,5° C, o ±0,1° C. En divulgaciones particulares, la estimulación en condiciones estáticas se realiza en una bolsa de cultivo celular colocada en una incubadora. En algunas divulgaciones, la bolsa de cultivo se compone de una película de poliolefina permeable al gas de una sola banda que permite que los monocitos, si están presentes, se adhieran a la superficie de la bolsa.
En divulgaciones particulares, los métodos emplean sistemas reversibles en los que por lo menos un reactivo (por ejemplo, un reactivo de afinidad o un reactivo estimulador) capaz de unirse a una molécula en la superficie de una célula (molécula de superficie celular), se asocia reversiblemente con un reactivo (por ejemplo, un reactivo de afinidad o un reactivo estimulador). En algunos casos divulgados en la presente, el reactivo contiene una pluralidad de sitios de unión capaces de unirse reversiblemente al reactivo (por ejemplo, un reactivo de afinidad o un reactivo estimulador). En algunos casos divulgados en la presente, el reactivo (por ejemplo, reactivo de afinidad o reactivo estimulador) es un reactivo de multimerización. En algunas divulgaciones, el por lo menos un reactivo (por ejemplo, un reactivo de afinidad o reactivo estimulador) contiene por lo menos un sitio de unión B que puede unirse específicamente a un epítopo o región de la molécula y también contiene un molécula de unión C que se une específicamente a por lo menos un sitio de unión Z del reactivo (por ejemplo, reactivo de afinidad o reactivo estimulador). En algunos casos divulgados en la presente, la interacción de unión entre la molécula de unión C y el por lo menos un sitio de unión Z es una interacción no covalente. En algunas divulgaciones, la interacción de unión, como la interacción no covalente, entre la molécula de unión C y el por lo menos un sitio de unión Z es reversible.
En algunas divulgaciones, la asociación reversible puede estar mediada en presencia de una sustancia, como un reactivo de competición, que es o contiene un sitio de unión que también es capaz de unirse al por lo menos un sitio de unión Z. Generalmente, la sustancia (por ejemplo, reactivo de competición) puede actuar como un competidor debido a una afinidad de unión más alta para el sitio de unión Z presente en el reactivo y/o debido a que está presente a concentraciones más altas que la molécula de unión C, separando y/o disociando de este modo la molécula de unión C del reactivo. En algunas divulgaciones, la afinidad de la sustancia (por ejemplo, reactivo de competición) por el por lo menos un sitio de unión Z es mayor que la afinidad de la molécula de unión C del agente (por ejemplo, un reactivo de afinidad o reactivo estimulador) por el por lo menos un sitio de unión Z. Por tanto, en algunos casos divulgados en la presente, la unión entre el sitio de unión Z del reactivo y la molécula de unión C del reactivo (por ejemplo, un reactivo de afinidad o un reactivo estimulador) puede alterarse mediante la adición de la sustancia (por ejemplo, reactivo de competición), haciendo de este modo reversible la asociación del reactivo (por ejemplo, un reactivo de afinidad o un reactivo estimulador) y el reactivo (por ejemplo, reactivo de afinidad o reactivo estimulador).
Los reactivos que pueden usarse en tales sistemas reversibles se describen y son conocidos en la técnica, consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.168.049; 5.506.121; 6.103.493; 7.776.562; 7.981.632; 8.298.782; 8.735.540; 9.023.604; y las solicitudes de PCT internacionales publicadas N° WO2013/124474 y WO2014/076277. A continuación se describen ejemplos no limitativos divulgados en la presente de reactivos y moléculas de unión capaces de formar una interacción reversible, así como sustancias (por ejemplo, agentes de competencia) capaces de invertir dicha unión.
En algunas divulgaciones, la estimulación da como resultado la activación y/o proliferación de las células, por ejemplo, antes de la transducción.
1. Reactivos estimuladores
En divulgaciones particulares, las condiciones de estimulación incluyen incubar y/o cultivar las células con un reactivo estimulador. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador contiene o incluye una perla. En ciertas divulgaciones, el inicio de la estimulación se produce cuando las células se incuban o se ponen en contacto con el reactivo estimulador. En ciertas divulgaciones particulares, el reactivo estimulador contiene o incluye un reactivo oligomérico, por ejemplo, un oligómero de muteína de estreptavidina. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador activa y/o es capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo TCR y/o uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras.
En algunas divulgaciones, las condiciones de estimulación o los reactivos estimuladores incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunas divulgaciones, un agente como se contempla en la presente puede incluir, pero no se limita a, ARN, ADN, proteínas (por ejemplo, enzimas), antígenos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, hidratos de carbono, lípidos lectinas, o cualquier otra biomolécula con afinidad por una diana deseada. En algunas divulgaciones, la diana deseada es un receptor de células T y/o un componente de un receptor de células T. En ciertas divulgaciones, la diana deseada es CD3. En ciertas divulgaciones, la diana deseada es una molécula coestimuladora de células T, por ejemplo, CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 o ICOS. El uno o más agentes pueden unirse directa o indirectamente a la perla mediante una variedad de métodos conocidos. La unión puede ser covalente, no covalente, electrostática o hidrófoba y puede lograrse por una variedad de medios de unión, incluyendo, por ejemplo, un medio químico, un medio mecánico o un medio enzimático. En algunas divulgaciones, el agente es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, como un Fab. En algunas divulgaciones, una biomolécula (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 biotinilado) puede unirse indirectamente a la perla a través de otra biomolécula (por ejemplo, un anticuerpo antibiotina) que se une directamente a la perla.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador contiene uno o más agentes (por ejemplo, un anticuerpo) que está unido a una perla (por ejemplo, una perla paramagnética) y se une específicamente a una o más de las siguientes macromoléculas en una célula (por ejemplo, una célula T): CD2, CD3, c D4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-gammaR, TNF-alfaR, IL-4R, IL-10R, CD18/CDl la (LFA-1), CD62L (L-selectina), CD29/CD49d (VLA-4), ligando Notch (por ejemplo tipo Delta 1/4, Jagged 1/2, etc.), CCR1, C<c>R2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, y CXCR3 o fragmento de los mismos incluyendo los ligandos correspondientes a estas macromoléculas o fragmentos de las mismas. En algunas divulgaciones, un agente (por ejemplo, un anticuerpo) unido a la perla se une específicamente a una o más de las siguientes macromoléculas de una célula (por ejemplo, una célula T): CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, y/o CD45RO.
En algunas divulgaciones, uno o más de los agentes unidos a la perla es un anticuerpo. El anticuerpo puede incluir un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal (incluyendo anticuerpos de longitud completa que tienen una región Fc de inmunoglobulina), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas de cadena sencilla, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv). En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador es un fragmento de anticuerpo (incluyendo un fragmento de unión a antígeno), por ejemplo, un fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, o (Fab')2. Se apreciará que pueden usarse regiones constantes de cualquier isotipo para los anticuerpos contemplados en la presente, incluyendo regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, y que tales regiones constantes pueden obtenerse de cualquier especie humana o animal (por ejemplo, especies murinas).
En algunas divulgaciones, el agente es un anticuerpo que se une a y/o reconoce uno o más componentes de un receptor de células T. En divulgaciones particulares, el agente es un anticuerpo anti-CD3. En ciertas divulgaciones, el agente es un anticuerpo que se une a y/o reconoce un correceptor. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo anti-CD28. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo anti-CD28 y un anticuerpo anti-CD3. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende uno o más agentes estimuladores. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende un agente estimulador primario y un agente estimulador secundario. En algunas divulgaciones, el primer agente estimulador es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo como se describe en la presente, y el segundo agente estimulador es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo como se describe en la presente. En algunas divulgaciones, el primer agente estimulador es un Fab anti-CD3, por ejemplo como se describe en la presente, y el segundo agente estimulador es un Fab anti-CD28, por ejemplo como se describe en la presente.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo, células de la composición de entrada, se estimulan en presencia de una proporción de reactivo estimulador a células en o aproximadamente 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1, o 0,2:1. En divulgaciones particulares, la proporción de reactivo estimulador a las células está comprendida entre 2,5:1 y 0,2:1, entre 2:1 y 0,5:1, entre 1,5:1 y 0,75:1, entre 1,25:1 y 0,8:1, entre 1,1:1 y 0,9:1. En divulgaciones particulares, la proporción de reactivo estimulador a células es de aproximadamente 1:1 o es de 1:1. En divulgaciones particulares, la proporción de reactivo estimulador y células es de aproximadamente 0,3:1 o de 0,3:1. En divulgaciones particulares, la proporción entre el reactivo estimulador y las células es de aproximadamente 0,2:1 o de 0,2:1.
En algunas divulgaciones, las células se estimulan en presencia de, de aproximadamente, o de por lo menos 0,01 |jg, 0,02 |jg, 0,03 |jg, 0,04 |jg, 0,05 |jg, 0,1 |jg, 0,2 |jg, 0,3 |jg, 0,4 |jg, 0,5 |jg, 0,75 |jg, 1 |jg, 2 |jg, 3 |jg, 4 |jg, 5 |jg, 6 jig, 7 jig, 8 jig, 9 jig, o 10 jig del reactivo estimulador por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 4 jig por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 3 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 2,5 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o con aproximadamente 2 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1,8 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1,6 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1,4 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de aproximadamente 1,2 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 0,8 jg de 106 células. En varias divulgaciones, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 0,8 jg por 106 células.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador se une a una molécula en la superficie de una célula, cuya unión entre el reactivo estimulador y la molécula es capaz de inducir, suministrar o modular una señal estimuladora en las células. En algunos casos, la molécula de la superficie celular (por ejemplo, el receptor) es una molécula de señalización. En algunos de los casos divulgados en la presente, el reactivo estimulador es capaz de unirse específicamente a una molécula de señalización expresada por una o más células diana (por ejemplo, células T). En algunos casos, el reactivo estimulador es cualquier agente capaz de inducir o suministrar una señal estimuladora en una célula (por ejemplo, una célula T) al unirse a una molécula de la superficie celular, como un receptor. En algunas divulgaciones, la señal estimuladora puede ser inmunoestimuladora, en cuyo caso el agente estimulador es capaz de inducir, suministrar o modular una señal que está implicada en o que estimula una respuesta inmunitaria de la célula (por ejemplo, célula T), por ejemplo, aumentar la proliferación o expansión de la célula inmunitaria, la activación de la célula inmunitaria, la diferenciación de la célula inmunitaria, la secreción de citoquinas, la actividad citotóxica o una o más actividades funcionales de una célula inmunitaria. En algunas divulgaciones, la señal estimuladora puede ser inhibidora, en cuyo caso el reactivo estimulador es capaz de inducir, suministrar o modular una señal estimuladora en la célula (por ejemplo, célula T) que está implicada o que inhibe una respuesta inmunitaria, por ejemplo, inhibe o disminuye la proliferación o expansión de células inmunitarias, la activación de células inmunitarias, la diferenciación de células inmunitarias, la secreción de citoquinas, la actividad citotóxica o una o más actividades funcionales de una célula inmunitaria.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende un agente estimulador primario. En algunas divulgaciones, el agente estimulador primario se une a una molécula receptora en la superficie de las células seleccionadas de la muestra. Por tanto, en algunos casos divulgados en la presente, el agente estimulador primario suministra, induce o modula una señal estimuladora. En algunas divulgaciones, el suministro, inducción o modulación de una señal estimuladora por el agente estimulador primario produce la estimulación de las células. Por tanto, en algunos casos divulgados en la presente, el agente estimulador primario suministra una señal estimuladora o proporciona una señal de activación primaria a las células, estimulando y/o activando de este modo las células. En algunas divulgaciones, el agente estimulador primario induce además la regulación por disminución un marcador de selección. Como se usa en la presente, la regulación por diminución puede abarcar una reducción en la expresión, por ejemplo, la expresión de la superficie celular, de un marcador de selección en comparación con un momento anterior.
En algunas divulgaciones, las células diana (por ejemplo, células T) comprenden complejos TCR/CD3 y moléculas coestimuladoras, como CD28. En este caso divulgado en la presente, el agente estimulador primario se une a un complejo TCR/CD3, proporcionando de este modo una señal estimuladora (por ejemplo, una señal primaria, por ejemplo, señal de activación primaria) en las células T, y el agente estimulador secundario se une a una molécula CD28 coestimuladora. En divulgaciones particulares, el agente estimulador primario y/o el agente estimulador secundario inducen además la regulación por diminución de un marcador de selección (por ejemplo, un marcador de selección usado para inmovilizar las células diana (por ejemplo, células T)).
En algunas divulgaciones, el agente estimulador primario suministra una señal estimuladora asociada al complejo TCR/CD3 (por ejemplo, señal primaria) en las células, por ejemplo, células T. En algunas divulgaciones, el agente estimulador primario se une específicamente a una molécula que contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora o ITAM. En algunas divulgaciones, el agente estimulador primario se une específicamente a CD3. En algunos casos divulgados en la presente, un agente estimulador primario que se une específicamente a CD3 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD3, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD3, y una molécula proteínica de unión a CD3 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. El fragmento de anticuerpo divalente puede ser un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv divalente de cadena sencilla, mientras que el fragmento de anticuerpo monovalente puede seleccionarse del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En algunos casos divulgados en la presente, una molécula proteínica de unión a CD3 con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos puede ser un aptámero, una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas, un glucuerpo, una proteína basada en el andamiaje de anquirina, una proteína basada en el andamiaje cristalino, una adnectina o un avímero.
En algunas divulgaciones, un fragmento Fab anti-CD3 puede derivarse del anticuerpo monoclonal de unión a CD3 producido por la línea celular de hibridoma OKT3 (At Cc ® CRL-8001™; consultar también la Patente de Estados Unidos N° 4.361.549). El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-CD3 OKT3 se describen en Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996) y comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 93 y 94, respectivamente. En algunas divulgaciones, el Fab anti-CD3 comprende las CDR de las cadenas pesadas y ligeras variables expuestas en las SEQ ID NO: 93 y 94, respectivamente.
En algunas divulgaciones, el agente estimulador comprende un agente estimulador secundario. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario se une a una molécula de la superficie de las células, como una molécula de la superficie celular, por ejemplo, una molécula receptora. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario es capaz de potenciar, amortiguar o modificar una señal estimuladora suministrada a través de la molécula unida por el primer agente estimulador. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario suministra, induce o modula una señal estimuladora, por ejemplo, una segunda señal estimuladora o una señal estimuladora adicional. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario mejora o potencia una señal estimuladora inducida por el agente estimulador primario. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario se une a una molécula accesoria y/o puede estimular o inducir una señal estimuladora accesoria o secundaria en la célula. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario se une a una molécula coestimuladora y/o proporciona una señal coestimuladora.
En algunas divulgaciones, el agente estimulador, que puede comprender el agente estimulador secundario, se une, por ejemplo, se une específicamente a una segunda molécula que puede ser una molécula coestimuladora, una molécula accesoria, un receptor de citoquinas, un receptor de quimiocinas, una molécula de punto de control inmunitario o un miembro de la familia del TNF o de la familia del receptor del TNF.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo, célula T, puede ser CD28 y el agente estimulador secundario) se une específicamente a CD28. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a<c>D28 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD28, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD28, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD28 y una molécula proteínica de unión a CD28 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. El fragmento de anticuerpo divalente puede ser un fragmento F(ab')2 o un fragmento Fv divalente de cadena sencilla, mientras que el fragmento de anticuerpo monovalente puede seleccionarse del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). Una molécula proteínica de unión a CD28 con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos puede ser un aptámero, una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas, un glucuerpo, una proteína basada en el andamiaje de anquirina, una proteína basada en el andamiaje cristalino, una adnectina y un avímero.
En algunas divulgaciones, un fragmento Fab anti-CD28 puede derivarse del anticuerpo CD28.3 (depositado como un constructo Fv sintético de cadena sencilla bajo el N° de Registro GenBank AF451974.1; consultar también Vanhove et al, BLOOD, 15 de julio de 2003, Vol. 102, N° 2, páginas 564-570) cuyas cadenas pesadas y ligeras variables comprenden la SEQ ID NO: 91 y 92, respectivamente. En algunas divulgaciones, el Fab anti-CD28 comprenden las CDR de las cadenas pesadas y ligeras variables expuestas en las SEQ ID NO:91 y 92, respectivamente.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo, célula T, es CD90 y el agente estimulador secundario se une específicamente a CD90. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a CD90 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD90, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD90, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD90 y una molécula proteínica de unión a CD90 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Consultar, por ejemplo, el anticuerpo anti-CD90 G7 (Biolegend, N° de cat. 105201).
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo, célula T, es CD95 y el agente estimulador secundario se une específicamente a CD95. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a<c>D95 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD95, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD95, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD95 y una molécula proteínica de unión a CD95 con propiedades de unión similares a las del anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-CD90 puede ser monoclonal de ratón anti-CD95 humano CH11 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) o puede ser anti-CD95 mAb 7C11 o anti-APO-1, como se describe en Paulsen et al. Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo, célula T o célula B, puede ser CD137 y el agente estimulador secundario se une específicamente a CD137. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a CD137 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD137, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD137, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD137 y una molécula proteínica de unión a CD137 con propiedades de unión similares a las del anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo anti-CD137 puede ser LOB12, IgG2a o LOB12.3, IgG1 como se describe en Taraban et al. Eur J Immunol. Diciembre 2002;32(12):3617-27. Consultar también, por ejemplo, US6569997, US6303121, Mittler et al. Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo célula B, puede ser CD40 y el agente estimulador secundario se une específicamente a CD40. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a CD40 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD40, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD40, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD40 y una molécula proteínica de unión a CD40 con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo célula T, puede ser CD40L (CD154) y el agente estimulador secundario se une específicamente a CD40L. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a CD40L puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD40L, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD40L, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD40L y una molécula proteínica de unión a CD40L con propiedades de unión similares a las del anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Por ejemplo, en algunas divulgaciones, el anticuerpo anti-CD40L puede ser Hu5C8, como se describe en Blair et al. JEM vol. 191 N° 4 651-660. Consultar también, por ejemplo WO1999061065, US20010026932, US7547438, WO2001056603.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo célula T, puede ser un coestimulador inducible de células T (ICOS) y el agente estimulador secundario se une específicamente a ICOS. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a ICOS puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-ICOS, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-ICOS, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-ICOS y una molécula proteínica de unión a ICOS con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Consultar, por ejemplo US20080279851 y Deng et al. Hybrid Hybridomics. Junio 2004;23(3): 176-82.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo célula T, puede ser el Conector para la Activación de Células T (LAT) y el agente estimulador secundario) se une específicamente a LAT. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a LAT puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-LAT, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-LAT, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-LAT y una molécula de unión a LAT proteínica con propiedades de unión similares a las del anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo célula T, puede ser CD27 y el agente estimulador secundario se une específicamente a CD27. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a CD27 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD27, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-CD27, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-CD27 y una molécula proteínica de unión a CD27 con propiedades de unión similares a las de un anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Consultar, por ejemplo la WO2008051424.
En algunas divulgaciones, la molécula de la célula, por ejemplo célula T, puede ser OX40 y el agente estimulador secundario se une específicamente a OX40. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente a OX40 puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-OX40, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-OX40, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-OX40 y una molécula proteínica de unión a OX40 con propiedades de unión similares a las del anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Consultar, por ejemplo, la WO2013038191, Melero et al. Clin Cancer Res. 2013.
En algunas divulgaciones, la molécula en la célula, por ejemplo célula T, puede ser HVEM y el agente estimulador secundario se une específicamente a HVEM. En algunas divulgaciones, el agente estimulador secundario que se une específicamente al HVEM puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo anti-HVEM, un fragmento de anticuerpo divalente de un anticuerpo anti-HVEM, un fragmento de anticuerpo monovalente de un anticuerpo anti-HVEM y una molécula proteínica de unión a HVEM con propiedades de unión similares a las del anticuerpo. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivarse de cualquiera conocido en la técnica. Consultar, por ejemplo WO2006054961, WO2007001459, Park et al. Cancer Immunol Immunother. Febrero 2012;61(2):203-14.
En cualquiera de las divulgaciones anteriores, el fragmento de anticuerpo divalente puede ser un fragmento (Fab)2'o un fragmento Fv divalente de cadena sencilla, mientras que el fragmento de anticuerpo monovalente puede seleccionarse del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fv y un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En cualquiera de las divulgaciones anteriores, la molécula de unión proteínica con propiedades de unión similares a las de los anticuerpos puede ser un aptámero, una muteína basada en un polipéptido de la familia de las lipocalinas, un glucuerpo, una proteína basada en el andamiaje de anquirina, una proteína basada en el andamiaje cristalino, una adnectina y un avímero.
En algunas divulgaciones, el agente estimulador se dirige específicamente a una molécula expresada en la superficie de las células diana en las que la molécula es un TCR, un receptor de antígeno quimérico o una molécula que comprende un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora o ITAM. Por ejemplo la molécula expresada en la superficie de la célula diana se selecciona entre un complejo receptor de antígeno de células T o células B, una cadena CD3, un CD3 zeta, una porción de unión a antígeno de un receptor de células T o un receptor de células B, o un receptor de antígeno quimérico. En algunos casos descritos en la presente, el agente estimulador se dirige a complejos péptido:MHC de clase I.
En algunas divulgaciones, el agente estimulador se une a un dominio extracelular etiquetado con His de una molécula expresada en la superficie de las células diana. En algunos casos divulgados en la presente, el agente estimulador contiene la secuencia peptídica Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (también denominada Strep-tag® II, expuesta en la SEQ ID NO: 69) conjugada con un trisNTA cargado con níquel (también denominado His-STREPPER o His/Strep-tag® II Adapter). En algunas divulgaciones, la molécula expresada en la superficie de las células diana que está marcada con His es CD19.
En algunas divulgaciones, el agente estimulador se une específicamente a la porción de anticuerpo del receptor recombinante, por ejemplo CAR. En algunos casos divulgados en la presente, la porción de anticuerpo del receptor recombinante incluye por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, como una región bisagra, por ejemplo una región bisagra de IgG4, y/o una región CH1/CL y/o Fc. En algunas divulgaciones, la región constante o porción es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunas divulgaciones, el reactivo se carga con aIgG que reconoce el espaciador IgG4.
En algunas divulgaciones, la diana deseada es un receptor de células T y/o un componente de un receptor de células T. En ciertas divulgaciones, la diana deseada es CD3. En ciertas divulgaciones, la diana deseada es una molécula coestimuladora de células T, por ejemplo CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 o ICOS.
En algunas divulgaciones, por ejemplo cuando el agente estimulador no está unido a un reactivo estimulador o a un reactivo de agente de unión a receptor, el agente estimulador es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo divalente, un F(ab)<2>, o un fragmento de Fv divalente de cadena sencilla. En algunas divulgaciones, cuando el agente estimulador no está unido al reactivo, el agente estimulador no incluye un molécula de unión C.
a. Reactivos de perlas
En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador contiene una partícula, por ejemplo una perla, que está conjugada o enlazada a uno o más agentes, por ejemplo biomoléculas, que son capaces de activar y/o expandir células, por ejemplo células T. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes están unidos a una perla. En algunas divulgaciones, la perla es biocompatible, es decir, está compuesta de un material que es adecuado para uso biológico. En algunas divulgaciones, las perlas no son tóxicas para las células cultivadas, por ejemplo células T cultivadas. En algunas divulgaciones, las perlas pueden ser cualquier partícula que sea capaz de unir agentes de una manera que permita una interacción entre el agente y una célula.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador contiene una perla y uno o más agentes que interactúan directamente con una macromolécula en la superficie de una célula. En ciertas divulgaciones, la perla (por ejemplo una perla paramagnética) interactúa con una célula a través de uno o más agentes (por ejemplo un anticuerpo) específicos para una o más macromoléculas de la célula (por ejemplo una o más proteínas de la superficie celular). En ciertas divulgaciones, la perla (por ejemplo una perla paramagnética) se marca con un primer agente descrito en la presente, como un anticuerpo primario (por ejemplo un anticuerpo antibiotina) u otra biomolécula, y luego un segundo agente, como un anticuerpo secundario (por ejemplo un anticuerpo anti-CD3 biotinilado) u otra segunda biomolécula (por ejemplo estreptavidina), por lo que el anticuerpo secundario u otra segunda biomolécula se une específicamente a tales anticuerpos primarios u otra biomolécula en la partícula.
En algunas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de más de aproximadamente 0,001 pm, de más de aproximadamente 0,01 pm, de más de aproximadamente 0,1 pm, de más de aproximadamente 1,0 pm, de más de aproximadamente 10 pm, de más de aproximadamente 50 pm, de más de aproximadamente 100 pm o de más de aproximadamente 1000 pm y no más de aproximadamente 1500pm. En algunas realizaciones, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 500 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 150 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 30 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 10 pm, de aproximadamente 1,0 pm a aproximadamente 5,0 pm, de aproximadamente 2,0 pm a aproximadamente 5.0 pm, o de aproximadamente 3,0 pm a aproximadamente 5,0 pm. En algunas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 5 pm. En algunas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de por lo menos o por lo menos aproximadamente o aproximadamente 0,001 pm, 0,01 pm, 0,1pm, 0,5pm, 1,0 pm, 1,5 pm, 2,0 pm, 2,5 pm, 3,0 pm, 3.5 pm, 4,0 pm, 4,5 pm, 5,0 pm, 5,5 pm, 6,0 pm, 6,5 pm, 7,0 pm, 7,5 pm, 8,0 pm, 8,5 pm, 9.0 pm, 9,5 pm, 10 pm, 12 pm, 14 pm, 16 pm, 18 pm o 20 pm. En ciertas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de o aproximadamente 4,5 pm. En ciertas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de o de aproximadamente 2,8 pm.
En algunas divulgaciones, las perlas tienen una densidad de más de 0,001 g/cm3, de más de 0,01 g/cm3, de más de 0,05 g/cm3, de más de 0,1 g/cm3, de más de 0,5 g/cm3, de más de 0,6 g/cm3, de más de 0,7 g/cm3, de más de 0,8 g/cm3, de más de 0.9 g/cm3, de más de 1 g/cm3, de más de 1,1 g/cm3, de más de 1,2 g/cm3, de más de 1,3 g/cm3, de más de 1,4 g/cm3, de más de 1,5 g/cm3, de más de 2 g/cm3, de más de 3 g/cm3, de más de 4 g/cm3, o de más de 5 g/cm3. En algunas divulgaciones, las perlas tienen una densidad de entre aproximadamente 0,001 g/cm3 y aproximadamente 100 g/cm3, aproximadamente 0,01 g/cm3 y aproximadamente 50 g/cm3, aproximadamente 0,1 g/cm3 y aproximadamente 10 g/cm3, aproximadamente 0,1 g/cm3 y aproximadamente .5 g/cm3, aproximadamente 0,5 g/cm3 y aproximadamente 1 g/cm3, aproximadamente 0,5 g/cm3 y aproximadamente 1,5 g/cm3, aproximadamente 1 g/cm3 y aproximadamente 1,5 g/cm3, aproximadamente 1 g/cm3 y aproximadamente 2 g/cm3, o aproximadamente 1 g/cm3 y aproximadamente 5 g/cm3. En algunas divulgaciones, las perlas tienen una densidad de aproximadamente 0,5 g/cm3, aproximadamente 0,5 g/cm3, aproximadamente 0,6 g/cm3, aproximadamente 0,7 g/cm3, aproximadamente 0,8 g/cm3, aproximadamente 0,9 g/cm3, aproximadamente 1,0 g/cm3, aproximadamente 1,1 g/cm3, aproximadamente 1,2 g/cm3, aproximadamente 1,3 g/cm3, aproximadamente 1,4 g/cm3, aproximadamente 1,5 g/cm3, aproximadamente 1,6 g/cm3, aproximadamente 1,7 g/cm3, aproximadamente 1,8 g/cm3, aproximadamente 1,9 g/cm3, o aproximadamente 2,0 g/cm3. En ciertas divulgaciones, las perlas tienen una densidad de aproximadamente 1,6 g/cm3. En divulgaciones particulares, las perlas o partículas tienen una densidad de aproximadamente 1,5 g/cm3. En divulgaciones particulares, las partículas tienen una densidad de aproximadamente 1,3 g/cm3
En ciertas divulgaciones, una pluralidad de perlas tiene una densidad uniforme. En ciertas divulgaciones, una densidad uniforme comprende una desviación estándar de la densidad de menos del 10%, menos del 5% o menos del 1% de la densidad media de las perlas.
En algunas divulgaciones, la perla contiene por lo menos un material en o cerca de la superficie de la perla que puede acoplarse, enlazarse o conjugarse con un agente. En algunas divulgaciones, la perla está funcionalizada en superficie, es decir, comprende grupos funcionales capaces de formar un enlace covalente con una molécula de unión, por ejemplo un polinucleótido o un polipéptido. En divulgaciones particulares, la perla comprende grupos carboxilo, amino, hidroxilo, tosilo, epoxi y/o clorometilo expuestos en superficie. En divulgaciones particulares, las perlas comprenden agarosa y/o sefarosa expuestas en la superficie. En ciertas divulgaciones, la superficie de la perla comprende reactivos estimuladores unidos que pueden unir o adherir moléculas de unión. En ciertas divulgaciones, las biomoléculas son polipéptidos. En algunas divulgaciones, las perlas comprenden proteína A, proteína G o biotina expuestas en la superficie.
En algunas divulgaciones, la perla reacciona en un campo magnético. En algunas divulgaciones, la perla es una perla magnética. En algunas divulgaciones, la perla magnética es paramagnética. En divulgaciones particulares, la perla magnética es superparamagnética. En ciertas divulgaciones, las perlas no muestran ninguna propiedad magnética a menos que se expongan a un campo magnético.
En divulgaciones particulares, la perla comprende un núcleo magnético, un núcleo paramagnético o un núcleo superparamagnético. En algunas divulgaciones, el núcleo magnético contiene un metal. En algunas divulgaciones, el metal puede ser, pero no se limita a, hierro, níquel, cobre, cobalto, gadolinio, manganeso, tántalo, zinc, circonio o cualquier combinación de los mismos. En ciertas divulgaciones, el núcleo magnético comprende óxidos metálicos (por ejemplo óxidos de hierro), ferritas (por ejemplo ferritas de manganeso, ferritas de cobalto, ferritas de níquel, etc.), hematita y aleaciones metálicas (por ejemplo CoTaZn). En algunas divulgaciones, el núcleo magnético comprende una o más de una ferrita, un metal, una aleación metálica, un óxido de hierro o dióxido de cromo. En algunas divulgaciones, el núcleo magnético comprende hierro elemental o un compuesto del mismo. En algunas divulgaciones, el núcleo magnético comprende uno o más de magnetita (Fe3O4), maghemita (YFe2O3), o greigita (Fe3S4). En algunas divulgaciones, el núcleo interno comprende un óxido de hierro (por ejemplo Fe<3>O<4>).
En ciertas divulgaciones, la perla contiene un núcleo magnético, paramagnético y/o superparamagnético que está cubierto por una capa o recubrimiento funcionalizado superficialmente. En algunas divulgaciones, la capa puede contener un material que puede incluir, pero no se limita a, un polímero, un polisacárido, una sílice, un ácido graso, una proteína, un carbono, agarosa, sefarosa, o una combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, el polímero puede ser un polietilenglicol, poli (ácido láctico-co-glicólico), poliglutaraldehído, poliuretano, poliestireno, o un alcohol polivinílico. En ciertas divulgaciones, la capa o recubrimiento exterior comprende poliestireno. En divulgaciones particulares, el recubrimiento exterior está funcionalizado en la superficie.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende una perla que contiene un núcleo de óxido metálico (por ejemplo un núcleo de óxido de hierro) y una capa, en donde el núcleo de óxido metálico comprende por lo menos un polisacárido (por ejemplo dextrano), y en donde la capa comprende por lo menos un polisacárido (por ejemplo amino dextrano), por lo menos un polímero (por ejemplo poliuretano) y sílice. En algunas divulgaciones, el núcleo de óxido metálico es un núcleo de óxido de hierro coloidal. En ciertas divulgaciones, el uno o más agentes incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En ciertas divulgaciones, el uno o más agentes incluyen un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 y un anticuerpo antibiotina. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende un anticuerpo antibiotina. En algunas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 10 pm. En algunas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 5 pm. En ciertas divulgaciones, la perla tiene un diámetro de aproximadamente 3,5 pm.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador comprende uno o más agentes que están unidos a una perla que comprende un núcleo de óxido metálico (por ejemplo un núcleo interno de óxido de hierro) y una capa (por ejemplo una capa protectora), en donde la capa comprende poliestireno. En ciertas divulgaciones, las perlas son perlas monodispersas, paramagnéticas (por ejemplo superparamagnéticas) que comprenden un núcleo de hierro paramagnético (por ejemplo superparamagnético), por ejemplo un núcleo que comprende magnetita (Fe<3>O<4>) y/o maghemita (yFe<2>O<3>) c y una capa o recubrimiento de poliestireno. En algunas divulgaciones, la perla no es porosa. En algunas divulgaciones, las perlas contienen una superficie funcionalizada a la que se unen uno o más agentes. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes están enlazados covalentemente a las perlas en la superficie. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes incluyen un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes incluyen un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes incluyen un anticuerpo anti-CD3 y/o un anticuerpo anti-CD28, y un anticuerpo o fragmento de antígeno del mismo capaz de unirse a un anticuerpo marcado (por ejemplo anticuerpo biotinilado), como un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD28 marcado. En ciertas divulgaciones, las perlas tienen una densidad de aproximadamente 1,5 g/cm3 y un área superficial de aproximadamente 1 m2/g a aproximadamente 4 m2/g. En ciertas divulgaciones, las perlas son perlas superparamagnéticas monodispersas que tienen un diámetro de aproximadamente 4,5 pm y una densidad de aproximadamente 1,5 g/cm3. En algunas divulgaciones, las perlas son perlas superparamagnéticas monodispersas que tienen un diámetro medio de aproximadamente 2,8 pm y una densidad de aproximadamente 1,3 g/cm3.
En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas se incuba con el reactivo estimulador en una proporción de perlas a células de aproximadamente 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25: 1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1, o 0,2:1. En algunas realizaciones, la proporción entre perlas y células está comprendida entre 2,5:1 y 0,2:1, entre 2:1 y 0,5:1, entre 1,5:1 y 0,75:1, entre 1,25:1 y 0,8:1, entre 1,1:1 y 0,9:1. En divulgaciones particulares, la proporción de perlas con respecto a las células es de aproximadamente 1:1 o es de 1:1.
b. Reactivo de muteína de estreptavidina oligomérico
En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador contiene un reactivo oligomérico, por ejemplo un reactivo de muteína de estreptavidina, que está conjugado, enlazado o unido a uno o más agentes, por ejemplo ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes tienen un dominio de unión o molécula de unión (por ejemplo un molécula de unión C) unido que es capaz de unirse al reactivo oligomérico en un sitio de unión particular (por ejemplo sitio de unión Z). En algunas divulgaciones, una pluralidad del agente se une reversiblemente al reactivo oligomérico. En varias divulgaciones, el reactivo oligomérico tiene una pluralidad de los sitios de unión particulares que, en ciertas divulgaciones, se unen reversiblemente a una pluralidad de agentes en el dominio de unión (por ejemplo la molécula de unión C). En algunas divulgaciones, la cantidad de agentes unidos se reduce o disminuye en presencia de un reactivo competidor, por ejemplo un reactivo que también es capaz de unirse a los sitios de unión particulares (por ejemplo el sitio de unión Z).
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador oligomérico es o incluye un sistema reversible en el que por lo menos un agente (por ejemplo un agente que es capaz de producir una señal en una célula como una célula T) está asociado, por ejemplo reversiblemente asociado, con el reactivo oligomérico. Ejemplos no limitativos divulgados en la presente de reactivos estimuladores oligoméricos pueden encontrarse, por ejemplo en la Solicitud de PCT internacional publicada N° WO 2018/197949. En algunas divulgaciones, el reactivo contiene una pluralidad de sitios de unión capaces de unirse, por ejemplo unirse reversiblemente, al agente. En algunos casos divulgados en la presente, el reactivo es un reactivo de partícula oligomérica que tiene por lo menos un agente unido capaz de producir una señal en una célula como una célula T. En algunas divulgaciones, el agente contiene por lo menos un sitio de unión, por ejemplo un sitio de unión B, que puede unirse específicamente a un epítopo o región de la molécula y también contiene un molécula de unión, también denominado en la presente molécula de unión C, que se une específicamente a por lo menos un sitio de unión del reactivo, por ejemplo el sitio de unión Z del reactivo. En algunas divulgaciones, la interacción de unión entre la molécula de unión C y el por lo menos un sitio de unión Z es una interacción no covalente. En algunas divulgaciones, la interacción de unión entre la molécula de unión C y el por lo menos un sitio de unión Z es una interacción covalente. En algunas divulgaciones, la interacción de unión, como la interacción no covalente, entre la molécula de unión C y el por lo menos un sitio de unión Z es reversible.
Se conocen las sustancias que pueden usarse como reactivos oligoméricos en tales sistemas reversibles, consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.168.049; 5.506.121; 6.103.493; 7.776.562; 7.981.632; 8.298.782; 8.735.540; 9.023.604; y las solicitudes de PCT internacionales publicadas N° WO2013/124474 y WO2014/076277. A continuación se describen ejemplos no limitativos divulgados en la presente de reactivos y moléculas de unión capaces de formar una interacción reversible, así como sustancias (por ejemplo reactivos de competición) capaces de invertir dicha unión.
En algunas divulgaciones, el reactivo oligomérico es un oligómero de estreptavidina, muteína o análogo de estreptavidina, avidina, una muteína o análogo de avidina (como neutravidina) o una mezcla de los mismos, en el que dicho reactivo oligomérico contiene uno o más sitios de unión para la asociación reversible con el dominio de unión del agente (por ejemplo un molécula de unión C). En algunas divulgaciones, el dominio de unión del agente puede ser una biotina, un derivado o análogo de biotina, o un péptido de unión a estreptavidina u otra molécula capaz de unirse específicamente a estreptavidina, una muteína o análogo de estreptavidina, avidina o una muteína o análogo de avidina.
En ciertas divulgaciones, uno o más agentes (por ejemplo agentes que son capaces de producir una señal en una célula como una célula T) se asocian con, como se unen reversiblemente, el reactivo oligomérico, como a través de la pluralidad de los sitios de unión particulares (por ejemplo sitios de unión Z) presentes en el reactivo oligomérico. En algunos casos divulgados en la presente, esto da como resultado que los agentes estén estrechamente dispuestos entre sí de tal manera que pueda producirse un efecto de avidez si una célula diana que tiene (por lo menos dos copias de) una molécula de superficie celular que está unida o es reconocida por el agente se pone en contacto con el agente.
En algunas divulgaciones, el reactivo oligomérico es un oligómero de estreptavidina, un oligómero de muteína de estreptavidina, un oligómero análogo de estreptavidina, un oligómero de avidina, un oligómero compuesto de avidina muteína o análogo de avidina (como neutravidina) o una mezcla de los mismos. En divulgaciones particulares, los reactivos oligoméricos contienen sitios de unión particulares que son capaces de unirse a un dominio de unión (por ejemplo la molécula de unión C) de un agente. En algunas divulgaciones, el dominio de unión puede ser una biotina, un derivado o análogo de biotina, o un péptido de unión a estreptavidina u otra molécula capaz de unirse específicamente a estreptavidina, una muteína o análogo de estreptavidina, avidina o una muteína o análogo de avidina. Los métodos divulgados en la presente contemplan además que el reactivo oligomérico puede comprender una molécula capaz de unirse a una etiqueta de afinidad de oligohistidina, una glutatión-S-transferasa, calmodulina o un análogo de la misma, péptido de unión a calmodulina (CBP), un péptido FLAG, una etiqueta HA, proteína de unión a maltosa (MBP), un epítopo HSV, un epítopo myc, y/o una proteína portadora biotinilada.
En algunas divulgaciones, la estreptavidina puede ser estreptavidina de tipo salvaje, muteínas o análogos de estreptavidina, como polipéptidos similares a la estreptavidina. De igual manera, la avidina, en algunas divulgaciones, incluye avidina de tipo salvaje o muteínas o análogos de avidina como neutravidina, una avidina deglicosilada con argininas modificadas que típicamente muestra un pi más neutro y está disponible como alternativa a la avidina nativa. Generalmente, las formas neutras y deglicosiladas de avidina incluyen las comercializadas como la "Extravidina", disponible a través de Sigma Aldrich, o la "NeutrAvidina" disponible de Thermo Scientific o Invitrogen, por ejemplo.
En algunas divulgaciones, el reactivo es una estreptavidina o una muteína o análogo de estreptavidina. En algunas divulgaciones, la estreptavidina de tipo salvaje (wt-estreptavidina) tiene la secuencia de aminoácidos divulgada por Argarana et al, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882 (SEQ iD NO: 66). En general, la estreptavidina se presenta de manera natural como un tetrámero de cuatro subunidades idénticas, es decir, es un homotetrámero, en donde cada subunidad contiene un único sitio de unión para la biotina, un derivado o análogo de la biotina o un imitador de la biotina. Una secuencia ejemplar de una subunidad de estreptavidina es la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 66, pero dicha secuencia también puede incluir una secuencia presente en homólogos de la misma de otras especies de Streptomyces. En particular, cada subunidad de estreptavidina puede mostrar una fuerte afinidad de unión por la biotina con una constante de disociación de equilibrio (Kd) del orden de aproximadamente 10-14 M. En algunos casos divulgados en la presente, la estreptavidina puede existir como un tetrámero monovalente en el que sólo uno de los cuatro sitios de unión es funcional (Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63)), un tetrámero divalente en el que dos de los cuatro sitios de unión son funcionales (Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214), o puede estar presente en forma monomérica o dimérica (Wu et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91).
En algunas divulgaciones, la estreptavidina puede estar en cualquier forma, como estreptavidina de tipo salvaje o no modificada, como una estreptavidina de una especiede Streptomyceso un fragmento funcionalmente activo de la misma que incluya por lo menos una subunidad funcional que contenga un sitio de unión para biotina, un derivado o análogo de biotina o un imitador de biotina, como generalmente contiene por lo menos una subunidad funcional de una estreptavidina de tipo salvaje deStreptomyces avidiniiexpuesta en la SEQ ID NO: 66 o un fragmento funcionalmente activo de la misma. Por ejemplo en algunas divulgaciones, la estreptavidina puede incluir un fragmento de estreptavidina de tipo salvaje, que se acorta en el extremo N- y/o C-terminal. Dichas estreptavidinas mínimas incluyen cualquiera que comience N-terminalmente en la región de las posiciones de aminoácidos 10 a 16 de la SEQ ID NO: 66 y termine C-terminalmente en la región de las posiciones de aminoácidos 133 a 142 de la SEQ ID NO: 66. En algunas divulgaciones, un fragmento funcionalmente activo de estreptavidina contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 67. En algunas divulgaciones, la estreptavidina, como se expone en la SEQ ID NO: 67, puede contener además una metionina N-terminal en una posición correspondiente a Ala13 con la numeración expuesta en la SEQ ID NO: 66. La referencia a la posición de los residuos en la estreptavidina o las muteínas de estreptavidina es con referencia a la numeración de los residuos en la SEQ ID NO: 66.
Los ejemplos de estreptavidinas o muteínas de estreptavidina se mencionan, por ejemplo en la WO 86/02077, DE 19641876 A1, US 6,022,951, WO 98/40396 o WO 96/24606. Se conocen ejemplos de muteínas de estreptavidina, consultar, por ejemplo Patentes de Estados Unidos N° 5,168,049; 5,506,121; 6,022,951; 6,156,493; 6,165,750; 6,103,493; o 6,368,813; o Solicitud de PCT publicada internacional N° WO2014/076277.
En algunas divulgaciones, una muteína de estreptavidina puede contener aminoácidos que no forman parte de una estreptavidina no modificada o de tipo salvaje o puede incluir sólo una parte de una estreptavidina de tipo salvaje o no modificada. En algunas divulgaciones, una muteína de estreptavidina contiene por lo menos una subunidad que puede tener más sustituciones (reemplazos) de aminoácidos en comparación con una subunidad de una estreptavidina no modificada o de tipo salvaje, por ejemplo en comparación con la subunidad de estreptavidina de tipo salvaje expuesta en la SEQ ID NO: 66 o un fragmento funcionalmente activo de la misma, por ejemplo expuesto en la SEQ ID NO: 67.
En algunas divulgaciones, la constante de disociación de equilibrio (Kd), de la estreptavidina o de una muteína de estreptavidina para un dominio de unión es de menos de 1 x 10'4 M, 5 x 10'4 M, 1 x 10'5 M, 5 x 10'5 M, 1 x 10'6 M, 5 x 10'6 M o 1 x 10-7 M, pero generalmente de más de 1 x 10'13 M, 1 x 10'12 M o 1 x 10'11 M. Por ejemplo secuencias peptídicas (Strep-tags), como las divulgadas en la Patente de Estados Unidos N° 5.506.121, pueden actuar como imitadores de biotina y demostrar una afinidad de unión por la estreptavidina, por ejemplo con una K<d>de aproximadamente entre 10'4 y 10'5 M. En algunos casos divulgados en la presente, la afinidad de unión puede mejorarse aún más realizando una mutación dentro de la molécula de estreptavidina, consultar, por ejemplo la Patente de Estados Unidos N° 6,103,493 o la Solicitud de PCT publicada internacional WO2014/076277. En algunas divulgaciones, la afinidad de unión puede determinarse mediante métodos conocidos, como cualquiera de los descritos en la presente.
En algunas divulgaciones, el reactivo, como una estreptavidina o una muteína de estreptavidina, muestra afinidad de unión por un molécula de unión a ligando peptídico, dicha molécula de unión a ligando peptídico puede ser la molécula de unión C presente en el agente (por ejemplo agente de unión a receptor o agente de selección). En algunas divulgaciones, la secuencia peptídica contiene una secuencia con la fórmula general His-Pro-Xaa, en donde Xaa es glutamina, asparagina o metionina, como la contenida en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 83. En algunas divulgaciones, la secuencia peptídica tiene la fórmula general expuesta en la SEQ ID NO: 83, como se expone en la SEQ ID NO: 74. En un ejemplo divulgado en la presente, la secuencia peptídica es Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (también denominada Strep-tag®, expuesta en la SEQ ID NO: 75). En un ejemplo divulgado en la presente, la secuencia peptídica es Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (también denominada Strep-tag® II, expuesta en la SEQ ID NO: 69). En algunas divulgaciones, el ligando peptídico contiene una disposición secuencial de por lo menos dos módulos de unión a estreptavidina, en donde la distancia entre los dos módulos es de por lo menos 0 y de no más de 50 aminoácidos, en donde un módulo de unión tiene de 3 a 8 aminoácidos y contiene por lo menos la secuencia His-Pro-Xaa, en donde Xaa es glutamina, asparagina o metionina, y en donde el otro módulo de unión tiene el mismo ligando peptídico de estreptavidina o uno diferente, como se expone en la SEQ ID NO: 84 (consultar, por ejemplo, Solicitud de PCT publicada internacional N° WO02/077018; Patente de Estados Unidos N° 7,981,632). En algunas divulgaciones, el ligando peptídico contiene una secuencia que tiene la fórmula expuesta en cualquiera de la SEQ ID NO: 76 o 77. En algunas divulgaciones, el ligando peptídico tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 70-73, 78-79. En la mayoría de los casos divulgados en la presente, todos estos péptidos de unión a estreptavidina se unen al mismo sitio de unión, concretamente, el sitio de unión a biotina de la estreptavidina. Si se usan uno o más de dichos péptidos de unión a estreptavidina como moléculas de unión C, por ejemplo C1 y C2, el reactivo de multimerización y/o los reactivos de partículas oligoméricas unidos a uno o más agentes a través de la molécula de unión C se componen típicamente de una o más muteínas de estreptavidina.
En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina es un mutante como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6,103,493. En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina contiene por lo menos una mutación dentro de la región de las posiciones de aminoácidos 44 a 53, basándose en la secuencia de aminoácidos de la estreptavidina de tipo salvaje, como se expone en la SEQ ID NO: 66. En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina contiene una mutación en uno o más residuos 44, 45, 46, y/o 47. En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina contiene una sustitución de Glu en la posición 44 de la estreptavidina de tipo salvaje con un aminoácido alifático hidrófobo, por ejemplo Val, Ala, Ile o Leu, cualquier aminoácido en la posición 45, un aminoácido alifático, como un aminoácido alifático hidrófobo en la posición 46 y/o una sustitución de Val en la posición 47 con un aminoácido básico, por ejemplo Arg o Lys, como generalmente Arg. En algunas divulgaciones, Ala está en la posición 46 y/o Arg está en la posición 47 y/o Val o Ile está en la posición 44. En algunas divulgaciones, el mutante de estreptavidina contiene residuos Val44-Thr45-Ala46-Arg47, como se expone en muteínas de estreptavidina ejemplares que contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 80 o SEQ ID NO: 81 u 82 (también conocida como mutante de estreptavidina 1, SAM1). En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina contiene residuos Ile44-Gly45-Ala46-Arg47, como se expone en muteínas de estreptavidina ejemplares que contienen la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 85, 68 o 73 (también conocida como SAM2). En algunos casos divulgados en la presente, tales muteínas de estreptavidina se describen, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 6,103,493, y están disponibles comercialmente bajo la marca comercial Strep-Tactin®. En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina contiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 86 o SEQ ID NO: 87. En divulgaciones particulares, la molécula es un tetrámero de estreptavidina o una muteína de estreptavidina que comprende una secuencia expuesta en cualquiera de las SEQ ID NO: 67, 81, 68, 86, 88, 82 o 73 que, como un tetrámero, es una molécula que contiene 20 aminas primarias, incluyendo 1 amina N-terminal y 4 lisinas por monómero.
En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina presenta una afinidad de unión caracterizada por una constante de disociación de equilibrio (Kd) que es o es menor de 3,7 x 10‘5 M para el ligando peptídico (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; también denominado Strep-tag®, expuesto en la SEQ ID NO: 75) y/o que es o es menor de 71 x 10'5 M para el ligando peptídico (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; también denominado Strep-tag® II, expuesto en la SEQ ID NO: 69) y/o que es o es menor de 7,0 x 10‘5 M, 5,0 x 10‘5 M, 1.0 x 10‘5 M, 5,0 x 10‘6 M, 1,0 x 10‘6 M, 5,0 x 10'7 M, o 1,0 x 10'7 M, pero generalmente mayor de 1 x 10'13 M, 1 x 10'12 M o 1 x 10'11 M para cualquiera de los ligandos peptídicos expuestos en cualquiera de las SEQ ID NO: 69, 76-78, 70-72, 74, 75, 83, 84.
En algunas divulgaciones, la muteína de estreptavidina resultante presenta una afinidad de unión caracterizada por una constante de asociación de equilibrio (K<a>) que es o es mayor de 2.7 x 104 M'1 para el ligando peptídico (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; también denominado Strep-tag®, expuesto en la SEQ ID NO: 75) y/o que es o es mayor de 1,4 x 104 M_1 para el ligando peptídico (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; también llamado Streptag® II, expuesto en la SEQ ID NO: 69) y/o que es o es mayor de 1.43 x 104M‘1, 1.67 x 104M‘1, 2 x 104M‘1, 3.33 x 104M-1, 5 x 104M-1, 1 x 105 M-1, 1.11 x 105M-1, 1.25 x 105 M‘1, 1.43 x 105 M‘1, 1.67 x 105 M‘1, 2 x 105 M‘1, 3.33 x 105 M‘ 1, 5 x 105 M-1, 1 x 106 M-1, 1.11 x 106 M-1, 1.25 x 106 M‘1, 1.43 x 106 M‘1, 1.67 x 106M‘1, 2 x 106M‘1, 3.33 x 106 M‘1, 5 x 106 M’1, 1 x 107 M’1, pero generalmente menor de 1 x 1013 M-1, 1 x 1012 M_1 o 1 x 1011 M_1 para cualquiera de los ligandos peptídicos expuestos en cualquiera de las SEQ ID NO: 69, 76-78, 70-72, 74, 75, 83, 84.
En ejemplos particulares, en la presente se divulga un reactivo de partícula oligomérica que se compone de y/o contiene una pluralidad de tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina. En ciertas divulgaciones, el reactivo de partículas oligoméricas divulgado en la presente contiene una pluralidad de sitios de unión que se unen reversiblemente o son capaces de unirse reversiblemente a uno o más agentes, por ejemplo un agente estimulador y/o un agente de selección. En algunas divulgaciones, la partícula oligomérica tiene un radio, por ejemplo un radio medio, de entre 70 nm y 125 nm, inclusive; un peso molecular de entre 1 x 107 g/mol y 1 x 109 g/mol, inclusive; y/o entre 1.000 y 5.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, inclusive. En algunas divulgaciones, el reactivo de partícula oligomérica está unido, por ejemplo unido reversiblemente, a uno o más agentes como un agente que se une a una molécula, por ejemplo receptor, en la superficie de una célula. En ciertas divulgaciones, el uno o más agentes son agentes descritos en la presente, por ejemplo en la Sección II.C.3. En algunas divulgaciones, el agente es un anticuerpo anti-CD3 y/o un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como un anticuerpo o fragmento de antígeno del mismo que contiene un molécula de unión, por ejemplo un péptido de unión a estreptavidina, por ejemplo Strep-tag® II. En divulgaciones particulares, el uno o más agentes es un Fab anti-CD3 y/o un Fab anti c D28 que contiene un molécula de unión, por ejemplo un péptido de unión a estreptavidina, por ejemplo Strep-tag® II.
En algunas divulgaciones, en la presente se divulga un reactivo de partícula oligomérica que se compone de y/o contiene una pluralidad de tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina. En ciertas divulgaciones, el reactivo de partículas oligoméricas divulgado en la presente contiene una pluralidad de sitios de unión que se unen reversiblemente o son capaces de unirse reversiblemente a uno o más agentes, por ejemplo un agente estimulador y/o un agente de selección. En algunas divulgaciones, la partícula oligomérica tiene un radio, por ejemplo un radio medio, de entre 80 nm y 120 nm, inclusive; un peso molecular, por ejemplo un peso molecular medio de entre 7,5 x 106 g/mol y 2 x 108 g/mol, inclusive; y/o una cantidad, por ejemplo una cantidad media, de entre 500 y 10.000 tetrámeros de estreptavidina o muteína de estreptavidina, inclusive. En algunas divulgaciones, el reactivo de partícula oligomérica está unido, por ejemplo unido reversiblemente, a uno o más agentes, como un agente que se une a una molécula, por ejemplo receptor, en la superficie de una célula. En ciertas divulgaciones, el uno o más agentes son agentes descritos en la presente, por ejemplo en la Sección II.C.3. En algunas divulgaciones, el agente es un Fab anti-CD3 y/o un Fab anti-CD28, como un Fab que contiene un molécula de unión, por ejemplo un péptido de unión a estreptavidina, por ejemplo Strep-tag® II. En divulgaciones particulares, el uno o más agentes es un Fab anti-CD3 y/o un Fab anti CD28 que contiene un molécula de unión, por ejemplo un péptido de unión a estreptavidina, por ejemplo Strep-tag® II.
En algunas divulgaciones, las células se estimulan en presencia de, de aproximadamente, o de por lo menos 0,01 |jg, 0,02 |jg, 0,03 |jg, 0,04 |jg, 0,05 |jg, 0,1 |jg, 0,2 |jg, 0.3 |jg, 0,4 |jg, 0,5 |jg, 0,75 |jg, 1 |jg, 2 |jg, 3 |jg, 4 |jg, 5 |jg, 6 jig, 7 jig, 8 jig, 9 jig, o 10 jig del reactivo estimulador oligomérico por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 4 jig por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 3 jg por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 2,75 jg por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 2,5 jg por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 2,25 jg por 106 células. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 2 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1,8 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o con aproximadamente 1,6 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1,4 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1,2 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 1 jg por 106 células. En divulgaciones particulares, las células se estimulan en presencia de o de aproximadamente 0,8 jg por 106 células. En ciertas divulgaciones, 4 jg del reactivo estimulador oligomérico es o incluye 3 jg de partículas oligoméricas y 1 jg de agentes unidos, por ejemplo 0,5 jg de Fabs anti-CD3 y 0,5 jg de Fabs anti-CD28. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 10 x 108, 9 x 108, 8 x 108, 7 x 108, 6 x 108, 5 x 108, 4 x 108, 3 x 108, 2 x 108, 1 x 108 reactivos oligoméricos. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 7x 108, 6 x 108, 5 x 108, 4 x 108, 3 x 108 reactivos oligoméricos. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 7 x 108 a 3 x 108 reactivos oligoméricos. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 6 x 108 a 4 x 108 reactivos oligoméricos. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 6 x 108 a 5 x 108 reactivos oligoméricos. En algunas divulgaciones, las células se estimulan o se someten a estimulación en presencia de o de aproximadamente 5 x 108 reactivos oligoméricos.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemeplo, células seleccionadas de una muestra, se estimulan o se someten a estimulación en presencia de una proporción de reactivo oligomérico con respecto a las células de o de aproximadamente 3:1, 2,5:1, 2:1, 1,5:1, 1,25:1, 1,2:1, 1,1:1, 1:1, 0,9:1, 0,8:1, 0,75:1, 0,67:1, 0,5:1, 0,3:1, o 0,2:1. En divulgaciones particulares, la proporción entre el reactivo oligomérico y las células está comprendida entre 2,5:1 y 0,2:1, entre 2:1 y 0,5:1, entre 1,5:1 y 0,75:1, entre 1,25:1 y 0,8:1, entre 1,1:1 y 0,9:1. En divulgaciones particulares, la proporción de reactivo oligomérico a células es de aproximadamente 1:1 o es de 1:1. En divulgaciones particulares, la proporción entre el reactivo oligomérico y las células es de aproximadamente 0,3:1 o es de 0,3:1. En divulgaciones particulares, la proporción entre el reactivo oligomérico y las células es de aproximadamente 0,2:1 o es de 0,2:1.
En ciertas divulgaciones, dentro del reactivo oligomérico, la relación de masas entre las partículas oligoméricas y los agentes unidos es de aproximadamente 3:1. En ciertas divulgaciones, dentro del reactivo oligomérico, la relación de masas entre las partículas oligoméricas, los Fabs anti-CD3 unidos y los Fabs anti-CD28 unidos es de aproximadamente 3:0,5:0,5. En ciertas divulgaciones, 4 jg del reactivo oligomérico es o incluye 3 jg de partículas oligoméricas y 1 jg de agentes unidos, por ejemplo 0,5 jg de Fabs anti-CD3 y 0,5 jg de Fabs anti-CD28. En otros ejemplos divulgados en la presente, 1,2 jg del reactivo oligomérico por 106 células es o incluye 0,9 jg de partículas oligoméricas y 0,3 jg de agentes unidos, por ejemplo 0,15 jg de Fabs anti-CD3 y 0,15 jg de Fabs anti-CD28, por 106 células. En algunas divulgaciones, el reactivo oligomérico se añade a un medio libre de suero y la estimulación se realiza en el medio libre de suero, por ejemplo como se describe en el PCT/US2018/064627.
En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal (por ejemplo, medio basal de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher), suplementado con uno o más suplementos. En algunas divulgaciones, el uno o más suplementos no contienen suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende un medio basal suplementado con uno o más componentes adicionales para el mantenimiento, expansión y/o activación de una célula (por ejemplo una célula T), como el proporcionado por un suplemento adicional (por ejemplo suplemento de expansión de células T OpTmizer™ (ThermoFisher)). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además un suplemento de reemplazo de suero, por ejemplo un reemplazo de suero de células inmunes, por ejemplo ThermoFisher, N° A2596101, el reemplazo de suero de células inmunes CTS™, o el reemplazo de suero de células inmunes descrito en Smith et al. Clin Transl Immunology. Enero 2015; 4(1): e31. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma libre de un aminoácido como L-glutamina. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una forma dipéptida de L-glutamina (por ejemplo L-alanil-L-glutamina), como el dipéptido en Glutamax™ (ThermoFisher). En algunas divulgaciones, el medio libre de suero comprende además una o más citoquinas recombinantes, como IL-2 humana recombinante, IL-7 humana recombinante y/o IL-15 humana recombinante.
2. Eliminación de reactivos estimuladores
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira o separa de las células o poblaciones celulares antes de recoger, cosechar o formular las células. En algunas divulgaciones, los reactivos estimuladores se retiran o separan de las células o poblaciones celulares después o durante la incubación, por ejemplo una incubación descrita en la presente como en la Sección I.D. En ciertas divulgaciones, las células o población celular se someten a un proceso, procedimiento, paso o técnica para retirar el reactivo estimulador después de la incubación pero antes de los pasos para recoger, cosechar o formular las células. En divulgaciones particulares, las células o población celular se someten a un proceso, procedimiento, paso o técnica para eliminar el reactivo estimulador después de la incubación. En algunas divulgaciones, cuando el reactivo estimulador se separa o elimina de las células durante la incubación, las células se devuelven a las mismas condiciones de incubación que antes de la separación o eliminación durante el resto de la incubación.
En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira y/o separa de las células. Sin querer estar limitado por la teoría, divulgaciones particulares contemplan que la unión y/o asociación entre un reactivo estimulador y las células puede, en algunas circunstancias, reducirse con el tiempo durante la incubación. En ciertas divulgaciones, pueden añadirse uno o más agentes para reducir la unión y/o asociación entre el reactivo estimulador y las células. En divulgaciones particulares, un cambio en las condiciones de cultivo celular, por ejemplo la adición de un agente, puede reducir la unión y/o asociación entre el reactivo estimulador y las células. Por tanto, en algunas divulgaciones, el reactivo estimulador puede retirarse de una incubación, sistema de cultivo celular, y/o una solución por separado de las células, por ejemplo sin retirar también las células de la incubación, sistema de cultivo celular, y/o una solución.
En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador se separa y/o se retira de las células después de una cantidad de tiempo. En divulgaciones particulares, la cantidad de tiempo es una cantidad de tiempo desde el inicio de la estimulación. En divulgaciones particulares, el inicio de la incubación se considera en el momento o aproximadamente en el momento en que las células entran en contacto con el reactivo estimulador y/o un medio o solución que contiene el reactivo estimulador. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador se retira o separa de las células en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 120 horas, 108 horas, 96 horas, 84 horas, 72 horas, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas, o 12 horas, inclusive, desde el inicio de la estimulación. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador se retira o separa de las células a las o aproximadamente a las 48 horas después de que se haya iniciado la estimulación. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira o separa de las células a las o aproximadamente a las 72 horas después de que se haya iniciado la estimulación. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira o separa de las células a las o aproximadamente a las 96 horas después de que se haya iniciado la estimulación.
a. Eliminación de reactivos de perlas
En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador de perlas, por ejemplo una perla paramagnética conjugada con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28, se separa o elimina de las células o de la población celular. Se conocen métodos para eliminar reactivos estimulantes (por ejemplo reactivos estimuladores que son o contienen partículas como partículas de perlas o partículas magnetizables) de las células. En algunas divulgaciones, puede usarse el uso de anticuerpos competidores, como anticuerpos no marcados, que, por ejemplo se unen a un anticuerpo primario del reactivo estimulador y alteran su afinidad por su antígeno en la célula, permitiendo de este modo un desprendimiento suave. En algunos casos divulgados en la presente, tras el desprendimiento, los anticuerpos competidores pueden permanecer asociados a la partícula (por ejemplo la partícula de perlas) mientras que el anticuerpo que no ha reaccionado se lava o puede lavarse y la célula queda libre de anticuerpo aislante, seleccionador, enriquecedor y/o activador. Un ejemplo de tal reactivo es DETACaBEAD (Friedl et al. 1995; Entschladen et al. 1997). En algunas divulgaciones, las partículas (por ejemplo partículas de perlas) pueden eliminarse en presencia de un conector escindible (por ejemplo conector de A<d>N), por lo que los anticuerpos unidos a partículas se conjugan con el conector (por ejemplo CELLection, Dynal). En algunos casos divulgados en la presente, la región del conector proporciona un sitio escindible para eliminar las partículas (por ejemplo partículas de perlas) de las células después del aislamiento, por ejemplo mediante la adición de DNasa u otro tampón de liberación. En algunas divulgaciones, también pueden emplearse otros métodos enzimáticos para liberar una partícula (por ejemplo partícula de perlas) de las células. En algunas divulgaciones, las partículas (por ejemplo partículas de perlas o partículas magnetizables) son biodegradables.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimuladores magnético, paramagnético y/o superparamagnético, y/o contiene una perla que es magnética, paramagnética o superparamagnética, y el reactivo estimulador puede eliminarse de las células exponiendo las células a un campo magnético. Entre los ejemplos divulgados en la presente de equipos adecuados que contienen imanes para generar el campo magnético se incluyen DynaMag CTS (Thermo Fisher), Magnetic Separator (Takara) y EasySep Magnet (Stem Cell Technologies).
En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador se retira o separa de las células antes de la finalización de los métodos divulgados, por ejemplo antes de cosechar, recoger y/o formular células manipuladas producidas por los métodos divulgados en la presente. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira y/o separa de las células después de la manipulación, por ejemplo transducción o transfección, de las células.
En algunas divulgaciones, el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, se retira o separa de las células o poblaciones celulares antes de recoger, cosechar o formular las células. En algunas divulgaciones, el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, se retira o separa de las células o poblaciones celulares mediante exposición a un campo magnético durante o después de la incubación, por ejemplo una incubación descrita en la presente como en la Sección I-D. En ciertas divulgaciones, las células o población celular se exponen al campo magnético para eliminar el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, después de la incubación pero antes de los pasos para recoger, cosechar o formular las células. En algunas realizaciones, las células o la población de células se exponen al campo magnético para eliminar el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, después de la incubación. En algunas realizaciones, cuando el reactivo de perlas estimuladoras se separa o se retira de las células o de la población celular durante la incubación, las células o la población celular se devuelven a las mismas condiciones de incubación que antes de la exposición al campo magnético para el resto de la duración de la incubación.
En divulgaciones particulares, el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, se retira o separa de las células, por ejemplo, por exposición a un campo magnético, en el plazo o en el plazo de aproximadamente 120 horas, 108 horas, 96 horas, 84 horas, 72 horas, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas o 12 horas, inclusive, desde la incubación. En ciertas divulgaciones, el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, se retira o separa de las células, por ejemplo por exposición a un campo magnético, después o después de aproximadamente 72 horas de la incubación. En algunas divulgaciones, el reactivo de perlas estimuladoras, por ejemplo el reactivo de perlas magnéticas estimuladoras, se retira o separa de las células, por ejemplo por exposición a un campo magnético, después o después de aproximadamente 96 horas de incubación.
b. Eliminación de reactivos oligoméricos
En algunas divulgaciones, la población de células T incubadas se produjo o generó de acuerdo con cualquiera de los métodos divulgados en la presente en el que una sustancia, como un agente de competición, se añadió a las células T para alterar, como disminuir y/o terminar, la señalización del agente o agentes estimuladores. En algunas divulgaciones, la población de las células T incubadas contiene la presencia de una sustancia, como un agente de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina, por ejemplo D-Biotina. En algunas divulgaciones, la sustancia, como un agente de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina, por ejemplo D-Biotina, está presente en una cantidad que es por lo menos 1,5 veces mayor, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 1000 veces o más mayor que la cantidad de la sustancia en una población de referencia o preparación de células T cultivadas en la que la sustancia no se añadió exógenamente durante la incubación. En algunas divulgaciones, la cantidad de la sustancia, como un agente de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina, por ejemplo D-Biotina, en la población de células T cultivadas es de o de aproximadamente 10 pM a 100 pM, 100 pM a 1 mM, 100 pM a 500 pM o 10 pM a 100 pM. En algunas divulgaciones, se añaden 10 pM o aproximadamente 10 pM de biotina o un análogo de biotina, por ejemplo D-biotina, a las células o la población celular para separar o eliminar el reactivo estimulador oligomérico de las células o la población celular.
En ciertas divulgaciones, los uno o más agentes (por ejemplo agentes que estimulan o activan un TCR y/o un coreceptor) se asocian, por ejemplo se unen reversiblemente, con el reactivo oligomérico como a través de la pluralidad de los sitios de unión particulares (por ejemplo sitios de unión Z) presentes en el reactivo oligomérico. En algunos casos divulgados en la presente, esto da como resultado que los agentes estén estrechamente dispuestos entre sí de tal manera que pueda producirse un efecto de avidez si una célula diana que tiene (por lo menos dos copias de) una molécula de superficie celular que está unida o es reconocida por el agente se pone en contacto con el agente.
En algunas divulgaciones, el reactivo de unión al receptor tiene una baja afinidad hacia la molécula receptora de la célula en el sitio de unión B, de tal manera que el reactivo de unión al receptor se disocia de la célula en presencia del reactivo de competición. Por tanto, en algunas divulgaciones, los agentes se eliminan de las células en presencia del reactivo de competición.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador oligomérico es un oligómero de muteína de estreptavidina con Fabs anti-CD3 y anti-CD28 unidos reversiblemente. En algunas divulgaciones, los Fabs unidos contienen dominios de unión a estreptavidina, por ejemplo que permiten la unión reversible al oligómero de muteína de estreptavidina. En algunos casos divulgados en la presente, los Fabs anti-CD3 y anti-CD28 están dispuestos estrechamente entre sí de tal manera que puede tener lugar un efecto de avidez si una célula T que expresa CD3 y/o CD28 se pone en contacto con el reactivo estimulador oligomérico con los Fabs unidos reversiblemente. En algunas divulgaciones, los Fabs tienen una baja afinidad hacia CD3 y CD28, de tal manera que los Fabs se disocian de la célula en presencia del reactivo de competición, por ejemplo biotina o una variante o análogo de biotina. Así, en algunas divulgaciones, los Fabs se eliminan o disocian de las células en presencia del reactivo de competición, por ejemplo D-biotina.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador oligomérico, por ejemplo el reactivo estimulador oligomérico de muteína de estreptavidina, se retira o separa de las células o poblaciones celulares antes de recoger, cosechar o formular las células. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador oligomérico, por ejemplo el reactivo estimulador oligomérico de muteína de estreptavidina, se retira o separa de las células o poblaciones celulares por contacto o exposición a un reactivo de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina como D-biotina, después o durante la incubación, por ejemplo una incubación descrita en la presente como en la Sección I.D. En ciertas divulgaciones, las células o la población celular se ponen en contacto o se exponen a un reactivo de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina como D-biotina, para eliminar el reactivo oligomérico estimulador, por ejemplo el reactivo oligomérico estimulador muteína de estreptavidina, después de la incubación pero antes de los pasos para recoger, cosechar o formular las células. En divulgaciones particulares, las células o la población de células se ponen en contacto o se exponen a un reactivo de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina como D-biotina, para eliminar el reactivo oligomérico estimulador, por ejemplo el reactivo oligomérico estimulador de muteína de estreptavidina, después de la incubación. En algunas divulgaciones, cuando el reactivo estimulador oligomérico, por ejemplo el reactivo estimulador oligomérico de muteína de estreptavidina, se separa o se elimina de las células durante la incubación, por ejemplo por contacto o exposición a un reactivo de competición, por ejemplo biotina o un análogo de biotina como D-biotina, las células se devuelven a las mismas condiciones de incubación que antes de la separación o eliminación para la duración restante de la incubación.
En algunas divulgaciones, las células se ponen en contacto con, con aproximadamente, o con por lo menos 0,01|JM, 0,05|JM, 0,1|JM, 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 10 pM, 100 pM, 500 pM, 0,01 pM, 1 mM, o 10 mM del reactivo de competición para eliminar o separar el reactivo estimulador oligomérico de las células. En varias divulgaciones, las células se ponen en contacto con, con aproximadamente, o con por lo menos 0,01 pM, 0,05 pM, 0,1 pM, 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 10 pM, 100 pM, 500 pM, 0,01 pM, 1 mM, o 10 mM de biotina o de un análogo de la biotina como la D-biotina, para eliminar o separar de las células los oligómeros estimuladores de muteína de estreptavidina con Fabs anti-CD3 y anti-CD28 unidos reversiblemente.
En divulgaciones particulares, el reactivo oligomérico estimulador, por ejemplo el reactivo oligomérico estimulador de muteína de estreptavidina, se retira o se separa de las células en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 120 horas, 108 horas, 96 horas, 84 horas, 72 horas, 60 horas, 48 horas, 36 horas, 24 horas o 12 horas, inclusive, de incubación, por ejemplo en presencia del reactivo oligomérico estimulador de muteína de estreptavidina. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador se retira o se separa de las células después o después de aproximadamente 48 horas de incubación, por ejemplo en presencia del reactivo estimulador oligomérico. En ciertas divulgaciones, el reactivo oligomérico estimulador, por ejemplo el reactivo oligomérico estimulador muteína de estreptavidina, se retira o se separa de las células después o después de aproximadamente 72 horas de incubación. En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador oligomérico, por ejemplo el reactivo estimulador oligomérico de muteína de estreptavidina, se retira o separa de las células a las o aproximadamente a las 96 horas de la incubación.
B. Manipulación genética
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados incluyen la manipulación genética de las células, por ejemplo células de o derivadas de una población de células T CD57- enriquecidas, como mediante la introducción de un polinucleótido heterólogo que codifica una proteína recombinante. Tales proteínas recombinantes pueden incluir receptores recombinantes, como cualquiera descrito en la presente, como en la Sección IV. La introducción de los polinucleótidos, por ejemplo polinucleótidos heterólogos o recombinantes, que codifican la proteína recombinante en la célula puede llevarse a cabo usando cualquiera de una serie de vectores conocidos. Tales vectores incluyen sistemas virales, incluyendo lentivirales y gammaretrovirales. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de polinucleótidos heterólogos que codifican los receptores, incluyendo mediante transducción viral, por ejemplo retroviral o lentiviral. En algunas divulgaciones, una población de células estimuladas se manipula genéticamente, como para introducir un polinucleótido heterólogo o recombinante que codifica un receptor recombinante, generando de este modo una población de células transformadas (también denominada en la presente población de células transformadas).
En divulgaciones particulares, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen después de que las células hayan sido estimuladas, activadas y/o incubadas en condiciones de estimulación, como mediante cualquiera de los métodos divulgados en la presente, por ejemplo en la Sección III.A. En divulgaciones particulares, la una o más poblaciones estimuladas se han agotado o separado previamente de células T CD57+.
En ciertas divulgaciones, los métodos de manipulación genética se llevan a cabo poniendo en contacto o introduciendo una o más células de una población con un polinucleótido que codifica una proteína recombinante, por ejemplo un receptor recombinante. En ciertas divulgaciones, la molécula de ácido nucleico o el polinucleótido es heterólogo para las células. En divulgaciones particulares, el polinucleótido heterólogo no es nativo de las células. En ciertas divulgaciones, el polinucleótido heterólogo no es nativo de ningún vector, por ejemplo vector viral, a partir del cual se administra. En ciertas divulgaciones, el polinucleótido heterólogo codifica una proteína, por ejemplo una proteína recombinante, que no es expresada nativamente por la célula. En divulgaciones particulares, el polinucleótido nucleico heterólogo es o contiene una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra en la célula antes de la introducción.
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo las células estimuladas, son manipuladas, por ejemplo transducidas o en presencia de un adyuvante de transducción. Los adyuvantes de transducción ejemplares incluyen, entre otros, policationes, fibronectina o fragmentos o variantes derivados de fibronectina, y RetroNectina. En ciertas divulgaciones, las células se manipulan en presencia de policationes, fibronectina o fragmentos o variantes derivados de la fibronectina, y/o RetroNectina. En divulgaciones particulares, las células se manipulan en presencia de un policatión que es polibreno, DEAE-dextrano, sulfato de protamina, poli-L-lisina, o un liposoma catiónico. En particular, las células se manipulan en presencia de sulfato de protamina.
En algunas divulgaciones, la manipulación genética, por ejemplo la transducción, se lleva a cabo en medios libres de suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero es un medio de cultivo celular definido o bien definido. En ciertas divulgaciones, el medio libre de suero es un medio de cultivo controlado que ha sido procesado, por ejemplo filtrado para eliminar inhibidores y/o factores de crecimiento. En ciertas divulgaciones, el medio libre de suero contiene proteínas. En ciertas divulgaciones, los medios libres de suero pueden contener albúmina de suero, hidrolizados, factores de crecimiento, hormonas, proteínas portadoras y/o factores de unión.
En divulgaciones particulares, las células se manipulan en presencia de una o más citoquinas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes humanas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas se unen y/o son capaces de unirse a receptores que son expresados por y/o son endógenos a las células T. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye un miembro de la familia de citoquinas del haz de 4 hélices alfa. En algunas divulgaciones, los miembros de la familia del haz de 4 alfa-hélices de citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF). En algunas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye IL-15. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-7. En algunas divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-2 recombinante.
En algunas divulgaciones, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen en presencia del mismo medio o de un medio similar al que estaba presente durante la estimulación. En algunas divulgaciones, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen en medios que tienen las mismas citoquinas que los medios presentes durante la estimulación. En ciertas divulgaciones, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen en medios que tienen las mismas citoquinas en las mismas concentraciones que los medios presentes durante la estimulación.
En algunas divulgaciones, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen en presencia del mismo medio o de un medio similar al que estaba presente durante la estimulación. En algunas divulgaciones, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen en medios que tienen las mismas citoquinas que los medios presentes durante la estimulación. En ciertas divulgaciones, las células se manipulan genéticamente, se transforman o se transducen en medios que tienen las mismas citoquinas en las mismas concentraciones que los medios presentes durante la estimulación.
1. Transducción
En algunas divulgaciones, la manipulación genética de las células es o incluye la introducción del polinucleótido, por ejemplo el polinucleótido heterólogo, en las células por transducción. En algunas divulgaciones, las células se transducen con un vector viral. En algunas divulgaciones, el virus es un vector retroviral, como un vector gammaretroviral o un vector lentiviral. Se conocen métodos de transducción lentiviral. Métodos ejemplares se describen en, por ejemplo Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:16371644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
En algunas divulgaciones, la transducción se lleva a cabo poniendo en contacto una o más células de una población con una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína recombinante, por ejemplo el receptor recombinante. En algunas divulgaciones, el contacto puede efectuarse con centrifugación, como espinoculación (por ejemplo inoculación centrífuga). Tales métodos incluyen cualquiera de los descritos en la Publicación Internacional Número WO2016/073602. Las cámaras centrífugas ejemplares incluyen las producidas y vendidas por Biosafe SA, incluyendo aquellas para uso con el sistema Sepax® y Sepax® 2, incluyendo una cámara centrífuga A-200/F y A-200 y varios kits para uso con tales sistemas. Cámaras, sistemas e instrumentación de procesamiento y armarios ejemplares se describen, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos N° 6.123.655, la Patente de Estados Unidos N° 6.733.433 y la solicitud de Patente de Estados Unidos publicada, N° de publicación: US 2008/0171951, y la solicitud de patente internacional publicada, N° de publicación WO 00/38762. Entre los kits ejemplares para su uso con dichos sistemas se incluyen, entre otros, los kits de un solo uso vendidos por BioSafe SA con los nombres de producto CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 o CS-900.2.
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados se usan en relación con la transducción de un vector viral que contiene un polinucleótido que codifica un receptor recombinante en, en aproximadamente, o en menos de 300 x 106 células, por ejemplo células T viables de una población de células estimuladas. En ciertas divulgaciones, se transducen aproximadamente 100 x 106 células, por ejemplo células T viables de una población celular estimulada.
En algunas divulgaciones, la transducción se realiza en medios libres de suero. En algunas divulgaciones, la transducción se realiza en presencia de IL-2, IL-7 e IL-15. En divulgaciones particulares, las células, por ejemplo las células de la población celular estimulada contienen por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90% o por lo menos un 95% de células que son células T CD4+ o células T CD8+. En algunas divulgaciones, la transducción se realiza durante entre 24 y 48 horas, entre 36 y 12 horas, entre 18 y 30 horas, o durante o durante aproximadamente 24 horas. En ciertas divulgaciones, el paso de transducción se inicia en el plazo de dos días, en el plazo de 36 horas, o en el plazo de 30 horas desde el comienzo o inicio de la incubación, por ejemplo la incubación en condiciones de estimulación.
En algunas divulgaciones, el sistema se incluye con y/o se coloca en asociación con otra instrumentación, incluyendo instrumentación para funcionar, automatizar, controlar y/o monitorizar divulgaciones del paso de transducción y uno o más varios otros pasos de procesamiento realizados en el sistema, por ejemplo uno o más pasos de procesamiento que pueden llevarse a cabo con o en relación con el sistema de cámara centrífuga como se describe en la presente o en el Número de Publicación Internacional WO2016/073602. Esta instrumentación en algunas divulgaciones está contenida dentro de un armario. En algunas divulgaciones, la instrumentación incluye un armario que incluye una carcasa que contiene circuitos de control, una centrífuga, una cubierta, motores, bombas, sensores, pantallas y una interfaz de usuario. Un dispositivo ejemplar se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6,123,655, la Patente de Estados Unidos N° 6,733,433 y la US 2008/0171951.
En algunas divulgaciones, el sistema comprende una serie de recipientes, por ejemplo bolsas, tubos, llaves de paso, abrazaderas, conectores, y una cámara de centrifugado. En algunas divulgaciones, los recipientes, como bolsas, incluyen uno o más recipientes, como bolsas, que contienen las células a transducir y las partículas de vector viral, en el mismo recipiente o recipientes separados, como la misma bolsa o bolsas separadas. En algunas divulgaciones, el sistema incluye además uno o más recipientes, como bolsas, que contienen medio, como diluyente y/o solución de lavado, que se introduce en la cámara y/u otros componentes para diluir, volver a suspender y/o lavar componentes y/o poblaciones durante los métodos. Los recipientes pueden conectarse en una o más posiciones del sistema, como en una posición correspondiente a una línea de entrada, línea de diluyente, línea de lavado, línea de residuos y/o línea de salida.
En algunas divulgaciones, la cámara está asociada con una centrifugadora, que es capaz de efectuar la rotación de la cámara, como alrededor de su eje de rotación. La rotación puede producirse antes, durante y/o después de la incubación en relación con la transducción de las células y/o en uno o más de los otros pasos de procesamiento. Por lo tanto, en algunas divulgaciones, uno o más de los varios pasos de procesamiento se lleva a cabo bajo rotación, por ejemplo a una fuerza particular. La cámara es típicamente capaz de rotación vertical o generalmente vertical, de tal manera que la cámara se asienta verticalmente durante la centrifugación y la pared lateral y el eje son verticales o generalmente verticales, con la pared o paredes de los extremos horizontales o generalmente horizontales.
En algunas divulgaciones, la población que contiene células y la población que contiene partículas de vector viral, y opcionalmente aire, pueden combinarse o mezclarse antes de proporcionar las poblaciones a la cavidad. En algunas divulgaciones, la población que contiene células y la población que contiene partículas de vector viral, y opcionalmente aire, se proporcionan por separado y se combinan y mezclan en la cavidad. En algunas divulgaciones, una población que contiene células, una población que contiene partículas vectoriales virales, y opcionalmente aire, pueden proporcionarse a la cavidad interna en cualquier orden. En cualquiera de tales algunas divulgaciones, una población que contiene células y partículas de vector viral es la composición de entrada una vez que se combinan o mezclan juntos, si se combinan o mezclan dentro o fuera de la cámara centrífuga y/o si las células y las partículas de vector viral se proporcionan a la cámara centrífuga juntos o por separado, como simultáneamente o secuencialmente.
En algunas divulgaciones, la captación del volumen de gas, como aire, se produce antes de la incubación de las células y partículas de vector viral, como rotación, en el método de transducción. En algunas divulgaciones, la captación del volumen de gas, como aire, se produce durante la incubación de las células y partículas de vector viral, como rotación, en el método de transducción.
En algunas divulgaciones, el volumen de líquido de las células o partículas de vector viral que componen la población de transducción, y opcionalmente el volumen de aire, puede ser un volumen predeterminado. El volumen puede ser un volumen programado y/o controlado por circuitos asociados con el sistema.
En algunas divulgaciones, la captación de la población de transducción, y opcionalmente gas, como aire, se controla manualmente, semiautomáticamente y/o automáticamente hasta que se haya llevado un volumen deseado o predeterminado a la cavidad interna de la cámara. En algunas divulgaciones, un sensor asociado con el sistema puede detectar líquido y/o gas que fluye hacia y desde la cámara centrífuga, como a través de su color, caudal y/o densidad, y puede comunicarse con la circuitería asociada para detener o continuar la captación según sea necesario hasta que se haya logrado la captación de dicho volumen deseado o predeterminado. En algunas divulgaciones, un sensor que sólo está programado o es capaz de detectar líquido en el sistema, pero no gas (por ejemplo aire), puede ser capaz de permitir el paso de gas, como aire, hacia el sistema sin detener la captación. En algunas de tales divulgaciones, puede colocarse un trozo de tubería no transparente en la línea cerca del sensor mientras se desea la entrada de gas, como el aire. En algunas divulgaciones, la entrada de gas, como el aire, puede controlarse manualmente.
En divulgaciones de los métodos divulgados, la cavidad interna de la cámara centrífuga se somete a rotación a alta velocidad. En algunas divulgaciones, la rotación se efectúa antes, simultáneamente, posteriormente o intermitentemente con la entrada de la composición de entrada de líquidos y, opcionalmente, aire. En algunas divulgaciones, la rotación se efectúa con posterioridad a la entrada de la composición líquida de entrada y, opcionalmente, de aire. En algunas divulgaciones, la rotación es por centrifugación de la cámara centrífuga a una fuerza centrífuga relativa en la superficie interna de la pared lateral de la cavidad interna y/o en una capa superficial de las células de por lo menos 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g, 3500 g o 4000 g. En algunas divulgaciones, la rotación es por centrifugación a una fuerza que es mayor de o de aproximadamente 1100 g, como mayor de o de aproximadamente 1200 g, mayor de o de aproximadamente 1400 g, mayor de o de aproximadamente 1600 g, mayor de o de aproximadamente 1800 g, mayor de o de aproximadamente 2000 g, mayor de o de aproximadamente 2400 g, mayor de o de aproximadamente 2800 g, mayor de o de aproximadamente 3000 g o mayor de o de aproximadamente 3200 g. En divulgaciones particulares, la rotación por centrifugación se efectúa con una fuerza comprendida entre 600 g y 800 g. En divulgaciones particulares, la rotación por centrifugación se efectúa con una fuerza de o de aproximadamente 693 g. En divulgaciones particulares, la rotación por centrifugación se efectúa con una fuerza de o de aproximadamente 1600 g.
En algunas divulgaciones, el gas, como el aire, en la cavidad de la cámara se expulsa de la cámara. En algunas divulgaciones, el gas, como el aire, se expulsa a un recipiente que está vinculado operativamente como parte del sistema cerrado con la cámara centrífuga. En algunas divulgaciones, el recipiente es un recipiente libre o vacío. En algunas divulgaciones, el aire, como gas, en la cavidad de la cámara se expulsa a través de un filtro que está operativamente conectado a la cavidad interna de la cámara a través de una línea de tubería estéril. En algunas divulgaciones, el aire se expulsa mediante procesos manuales, semiautomáticos o automáticos. En algunas divulgaciones, el aire se expulsa de la cámara antes de, simultáneamente, intermitentemente o posteriormente con la expresión de la población de salida que contiene células incubadas y partículas de vector viral, como células en las que se ha iniciado la transducción o células que han sido transducidas con un vector viral, de la cavidad de la cámara.
En algunas divulgaciones, la transducción y/u otra incubación se realiza como o como parte de un proceso continuo o semicontinuo. En algunas divulgaciones, un proceso continuo implica la captación continua de las células y partículas de vector viral, por ejemplo la composición de transducción (ya sea como una composición única preexistente o tirando continuamente hacia el mismo recipiente, por ejemplo cavidad, y por lo tanto mezclando, sus partes), y/o la expresión continua o expulsión de líquido, y opcionalmente expulsión de gas (por ejemplo aire), del recipiente, durante por lo menos una parte de la incubación, por ejemplo mientras se centrifuga. En algunas divulgaciones, la captación continua y la expresión continua se llevan a cabo por lo menos en parte simultáneamente. En algunas divulgaciones, la captación continua se produce durante parte de la incubación, por ejemplo durante parte de la centrifugación, y la expresión continua se produce durante una parte separada de la incubación. Ambas pueden alternarse. Por tanto, la captación y la expresión continuas, mientras se lleva a cabo la incubación, pueden permitir un mayor volumen total de muestra a procesar, por ejemplo transducir.
En algunas divulgaciones, la incubación es parte de un proceso continuo, el método incluye, durante por lo menos una parte de la incubación, efectuar la captación continua de dicha composición de transducción en la cavidad durante la rotación de la cámara y durante una parte de la incubación, efectuar la expresión continua de líquido y, opcionalmente la expulsión de gas (por ejemplo aire), desde la cavidad a través de la por lo menos una abertura durante la rotación de la cámara.
En algunas divulgaciones, la incubación semicontinua se lleva a cabo alternando entre efectuar la captación de la composición en la cavidad, la incubación, la expresión de líquido de la cavidad y, opcionalmente, la expulsión de gas (por ejemplo aire) de la cavidad, como a un recipiente de salida, y luego la captación de una composición posterior (por ejemplo segunda, tercera, etc.) que contiene más células y otros reactivos para el procesamiento, por ejemplo partículas de vector viral, y repitiendo el proceso. Por ejemplo en algunas divulgaciones, la incubación forma parte de un proceso semicontinuo, el método incluye, antes de la incubación, efectuar la captación de la composición de transducción en la cavidad a través de dicha por lo menos una abertura, y después de la incubación, efectuar la expresión del fluido desde la cavidad; efectuar la captación de otra composición de transducción que comprende células y las partículas del vector viral en dicha cavidad interna; e incubar la otra composición de transducción en dicha cavidad interna en condiciones por las que dichas células en dicha otra composición de transducción se transducen con dicho vector. El proceso puede continuarse iterativamente durante varias rondas adicionales. A este respecto, los métodos semicontinuos o continuos pueden permitir la producción de un volumen y/o número de células aún mayor.
En algunas divulgaciones, una parte de la incubación de transducción se realiza en la cámara centrífuga, que se realiza en condiciones que incluyen rotación o centrifugación.
En divulgaciones particulares, la transducción de las células con el vector viral es o incluye espinoculación, por ejemplo centrifugación de una mezcla que contiene las células y las partículas virales. En algunas divulgaciones, la composición que contiene las células y las partículas virales puede rotarse, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, como una velocidad inferior a la usada para sedimentar las células, como de o de aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (por ejemplo a o a aproximadamente o por lo menos 600 rpm, 1000 rpm, o 1500 rpm o 1700 rpm). En algunas divulgaciones, la rotación se realiza con una fuerza, por ejemplo una fuerza centrífuga relativa, de o de aproximadamente1 00 g a 4000 g (por ejemplo de o de aproximadamente o por lo menos o aproximadamente 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g o 3500 g), medido, por ejemplo en una pared interna o externa de la cámara o cavidad.
En algunas divulgaciones, las células se espinoculan con el vector viral a una fuerza, por ejemplo una fuerza centrífuga relativa, de entre o entre aproximadamente 100 g y 4000 g, 200 g y 1000 g, 500 g y 1200 g, 1000 g y 2000 g, 600 g y 800 g, 1200 g y 1800 g, o 1500 g y 1800 g. En ciertas divulgaciones, las células se espinoculan con la partícula de vector viral durante, durante por lo menos, o durante aproximadamente 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1200 g, 1500 g, 1600 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g, o 3500 g. En algunas divulgaciones, las células se transducen con el vector viral a una fuerza de o de aproximadamente 692 g. En divulgaciones particulares, las células se transducen con el vector viral a una fuerza de o de aproximadamente 1600 g. En algunas divulgaciones, la fuerza es la fuerza en la superficie interna de la pared lateral de la cavidad interna y/o en una capa superficial de las células.
En ciertas divulgaciones, las células se espinoculan, por ejemplo la composición celular que contiene células y vector viral se rota, durante más de o aproximadamente 5 minutos, como más de o aproximadamente 10 minutos, más de o aproximadamente 15 minutos, más de o aproximadamente 20 minutos, más de o aproximadamente 30 minutos, más de o aproximadamente 45 minutos, más de o aproximadamente 60 minutos, más de o aproximadamente 90 minutos o más de o aproximadamente 120 minutos; o entre o aproximadamente 5 minutos y 120 minutos, 30 minutos y 90 minutos, 15 minutos y 60 minutos, 15 minutos y 45 minutos, 30 minutos y 60 minutos o 45 minutos y 60 minutos, cada uno inclusive. En algunas divulgaciones, las células se espinoculan con el vector viral durante o durante aproximadamente 30 minutos. En ciertas divulgaciones, las células se espinoculan con el vector viral durante o durante aproximadamente 60 minutos.
En algunas divulgaciones, el método de transducción incluye una espinoculación, por ejemplo una rotación o centrifugación de la composición de transducción, y opcionalmente aire, en la cámara centrífuga durante más de o aproximadamente 5 minutos, como más de o aproximadamente 10 minutos, más de o aproximadamente 15 minutos, más de o aproximadamente 20 minutos, más de o aproximadamente 30 minutos, más de o aproximadamente 45 minutos, más de o aproximadamente 60 minutos, más de o aproximadamente 90 minutos o más de o aproximadamente 120 minutos. En algunas divulgaciones, la composición de transducción, y opcionalmente el aire, se rota o centrifuga en la cámara centrífuga durante más de 5 minutos, pero no más de 60 minutos, no más de 45 minutos, no más de 30 minutos o no más de 15 minutos. En divulgaciones particulares, la transducción incluye rotación o centrifugación durante o durante aproximadamente 60 minutos.
En algunas divulgaciones, el método de transducción incluye la rotación o centrifugación de la composición de transducción, y opcionalmente aire, en la cámara centrífuga durante un tiempo comprendido entre o entre aproximadamente 10 minutos y 60 minutos, 15 minutos y 60 minutos, 15 minutos y 45 minutos, 30 minutos y 60 minutos o 45 minutos y 60 minutos, cada uno inclusive, y a una fuerza en la superficie interna de la pared lateral de la cavidad interna y/o en una capa superficial de las células de, de aproximadamente, o a 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2400 g, 2800 g, 3200 g o 3600 g. En divulgaciones particulares, el método de transducción incluye la rotación o centrifugación de la composición de transducción, por ejemplo las células y las partículas de vector viral, a o a aproximadamente 1600 g durante o durante aproximadamente 60 minutos.
2. Partículas de vectores virales
En algunas divulgaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células usando partículas de virus infecciosos recombinantes, como, por ejemplo vectores derivados del virus simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunas divulgaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como vectores gamma-retrovirales (consultar, por ejemplo Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 noviembre 29(11): 550-557.
En algunas divulgaciones, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMI,V), el virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), el virus de células madre embrionarias murinas (MESV), el virus de células madre murinas (MSCV) o el virus formador de focos en el bazo (SFFV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunas divulgaciones, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente celular aviar o mamífera. Los retrovirus son típicamente anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo los seres humanos. En una divulgación, el gen a expresar sustituye a las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
El genoma del vector viral se construye típicamente en forma de plásmido que puede transfectarse en una línea celular de empaquetamiento o productora. En cualquiera de tales divulgaciones, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante, como un receptor recombinante, se inserta o localiza en una región del vector viral, como generalmente en una región no esencial del genoma viral. En algunas divulgaciones, el ácido nucleico se inserta en el genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso en la replicación.
Puede usarse cualquiera de los varios métodos conocidos para producir partículas retrovirales cuyo genoma contenga una copia de ARN del genoma del vector viral. En algunas divulgaciones, por lo menos dos componentes intervienen en la elaboración de un sistema de administración de genes basado en virus: en primer lugar, los plásmidos de empaquetamiento, que engloban las proteínas estructurales así como las enzimas necesarias para generar una partícula de vector viral, y en segundo lugar, el propio vector viral, es decir, el material genético que se va a transferir. En el diseño de cualquiera de estos componentes o de ambos pueden introducirse salvaguardias de bioseguridad.
En algunas divulgaciones, el plásmido de empaquetamiento puede contener todas las proteínas retrovirales, como las del VIH-1, distintas de las proteínas de la envoltura (Naldini et al., 1998). En otras divulgaciones, los vectores virales pueden carecer de genes virales adicionales, como los que están asociados con la virulencia, por ejemplo vpr, vif, vpu y nef, y/o Tat, un transactivador primario del VIH. En algunas divulgaciones, los vectores lentivirales, como los vectores lentivirales basados en el VIH, comprenden sólo tres genes del virus parental: gag, pol y rev, lo que reduce o elimina la posibilidad de reconstitución de un virus de tipo salvaje mediante recombinación.
En algunas divulgaciones, el genoma del vector viral se introduce en una línea celular de empaquetamiento que contiene todos los componentes necesarios para empaquetar el ARN genómico viral, transcrito a partir del genoma del vector viral, en partículas virales. Alternativamente, el genoma del vector viral puede comprender uno o más genes que codifican componentes virales además de una o más secuencias, por ejemplo ácidos nucleicos recombinantes, de interés. Sin embargo, en algunas divulgaciones, para evitar la replicación del genoma en la célula diana, los genes virales endógenos necesarios para la replicación se eliminan y se proporcionan por separado en la línea celular de empaquetamiento.
En algunas divulgaciones, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con uno o más vectores plasmídicos que contienen los componentes necesarios para generar las partículas. En algunas divulgaciones, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con un plásmido que contiene el genoma del vector viral, incluiyendo los LTR, la secuencia de empaquetamiento de acción cis y la secuencia de interés, es decir, un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno, como un CAR; y uno o más plásmidos ayudantes que codifican los componentes enzimáticos y/o estructurales del virus, como Gag, pol y/o rev. En algunas divulgaciones, se utilizan múltiples vectores para separar los varios componentes genéticos que generan las partículas vectoriales retrovirales. En algunas de tales divulgaciones, el suministro de vectores separados a la célula de empaquetamiento reduce la posibilidad de eventos de recombinación que de otro modo podrían generar virus competentes para la replicación. En algunas divulgaciones, puede usarse un único vector plasmídico que contenga todos los componentes retrovirales.
En algunas divulgaciones, la partícula vectorial retroviral, como la partícula vectorial lentiviral, está pseudotipada para aumentar la eficacia de transducción de las células huésped. Por ejemplo una partícula vectorial retroviral, como una partícula vectorial lentiviral, en algunas divulgaciones está pseudotipada con una glicoproteína VSV-G, que proporciona una amplia gama de células huésped que amplía los tipos celulares que pueden transducirse. En algunas divulgaciones, una línea celular de empaquetamiento se transfecta con un plásmido o polinucleótido que codifica una glicoproteína de envoltura no nativa, como para incluir envolturas xenotrópicas, politrópicas o anfotrópicas, como la envoltura del virus Sindbis, GALV o VSV-G.
En algunas divulgaciones, la línea celular de empaquetamiento proporciona los componentes, incluyendo las proteínas reguladoras y estructurales virales, que se requieren en trans para el empaquetamiento del ARN genómico viral en partículas de vector lentiviral. En algunas divulgaciones, la línea celular de empaquetamiento puede ser cualquier línea celular capaz de expresar proteínas lentivirales y producir partículas de vector lentiviral funcionales. En algunas divulgaciones, las líneas celulares de empaquetamiento adecuadas incluyen células 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) y Cf2Th (ATCC CRL 1430).
En algunas divulgaciones, la línea celular de empaquetamiento expresa de forma estable la proteína o proteínas virales. Por ejemplo en algunas divulgaciones, puede construirse una línea celular de empaquetamiento que contenga los genes gag, pol, rev y/u otros genes estructurales pero sin los componentes LTR y de empaquetamiento. En algunas divulgaciones, una línea celular de empaquetamiento puede transfectarse transitoriamente con moléculas de ácido nucleico que codifican una o más proteínas virales junto con el genoma del vector viral que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga, y/o un ácido nucleico que codifica una glicoproteína de envoltura.
En algunas divulgaciones, los vectores virales y los plásmidos de empaquetamiento y/o de ayuda se introducen mediante transfección o infección en la línea celular de empaquetamiento. La línea celular de empaquetamiento produce partículas de vector viral que contienen el genoma del vector viral. Los métodos de transfección o infección son bien conocidos. Entre los ejemplos no limitativos divulgados en la presente se incluyen los métodos de fosfato cálcico, DEAE-dextrano y lipofección, electroporación y microinyección.
Cuando un plásmido recombinante y el LTR retroviral y las secuencias de empaquetamiento se introducen en una línea celular especial (por ejemplo por precipitación con fosfato de calcio), las secuencias de empaquetamiento pueden permitir que el transcrito de ARN del plásmido recombinante se empaquete en partículas virales, que luego pueden secretarse en los medios de cultivo. Los medios que contienen los retrovirus recombinantes en algunas divulgaciones se recogen, opcionalmente se concentran y se usan para la transferencia de genes. Por ejemplo en algunas divulgaciones, tras la cotransfección de los plásmidos de empaquetamiento y el vector de transferencia a la línea celular de empaquetamiento, las partículas del vector viral se recuperan de los medios de cultivo y se titulan mediante métodos estándar usados por los expertos en la técnica.
En algunas divulgaciones, un vector retroviral, como un vector lentiviral, puede producirse en una línea celular de empaquetamiento, como una línea celular HEK 293T ejemplar, mediante la introducción de plásmidos para permitir la generación de partículas lentivirales. En algunas divulgaciones, una célula de empaquetamiento se transfecta y/o contiene un polinucleótido que codifica gag y pol, y un polinucleótido que codifica un receptor recombinante, como un receptor de antígeno, por ejemplo un CAR. En algunas divulgaciones, la línea celular de empaquetamiento se transfecta opcional y/o adicionalmente con y/o contiene un polinucleótido que codifica una proteína rev. En algunas divulgaciones, la línea celular de empaquetamiento se transfecta opcional y/o adicionalmente con y/o contiene un polinucleótido que codifica una glicoproteína de envoltura no nativa, como VSV-G. En algunas de estas divulgaciones, aproximadamente dos días después de la transfección de células, por ejemplo células HEK 293T, el sobrenadante celular contiene vectores lentivirales recombinantes, que pueden recuperarse y titulizarse.
Las partículas de vectores retrovirales recuperadas y/o producidas pueden usarse para transducir células diana usando los métodos descritos. Una vez en las células diana, el ARN viral se transcribe inversamente, se importa al núcleo y se integra de manera estable en el genoma del huésped. Uno o dos días después de la integración del ARN viral, puede detectarse la expresión de la proteína recombinante, por ejemplo el receptor de antígeno, como CAR.
3. Incubación con vector vírico
En divulgaciones particulares, la transformación o transducción de las células es o incluye uno o más pasos de incubación de las células, por ejemplo en presencia del vector viral. En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo las células de la población celular transformada, se incuban después de la manipulación genética, transformación, transducción o transfección de las células.
En ciertas divulgaciones, la incubación se realiza en condiciones estáticas, como condiciones que no implican centrifugación, agitación, rotación, balanceo o perfusión, por ejemplo perfusión continua o semicontinua de los medios. En algunas divulgaciones, ya sea antes o poco después, por ejemplo en el plazo de 5, 15 o 30 minutos, del inicio de la incubación, las células se transfieren (por ejemplo se transfieren en condiciones estériles) a un recipiente como una bolsa o vial, y se colocan en una incubadora.
En algunas divulgaciones, la incubación se realiza en medios libres de suero. En algunas divulgaciones, el medio libre de suero es un medio de cultivo celular definido y/o bien definido. En ciertas divulgaciones, el medio libre de suero es un medio de cultivo controlado que ha sido procesado, por ejemplo filtrado para eliminar inhibidores y/o factores de crecimiento. En ciertas divulgaciones, el medio libre de suero contiene proteínas. En ciertas divulgaciones, los medios libres de suero pueden contener albúmina de suero, hidrolizados, factores de crecimiento, hormonas, proteínas portadoras y/o factores de fijación.
Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, como citoquinas, quimioquinas, antígenos, moléculas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la incubación se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo bajo rotación centrífuga, como se describe en la Publicación Internacional Número WO2016/073602.
En algunas divulgaciones, las células, y opcionalmente el polipéptido heterólogo o recombinante, por ejemplo los vectores virales, se transfieren a un recipiente para la incubación. En algunas divulgaciones, el recipiente es un vial. En divulgaciones particulares, el recipiente es una bolsa. En algunas divulgaciones, las células, y opcionalmente el polipéptido heterólogo o recombinante, se transfieren al recipiente en condiciones cerradas o estériles. En algunas divulgaciones, el recipiente, por ejemplo el vial o la bolsa, se coloca entonces en una incubadora durante toda o una parte de la incubación. En algunas realizaciones, la incubadora se ajusta a, aproximadamente, o por lo menos 16° C, 24° C o 35° C. En algunas divulgaciones, la incubadora se ajusta a 37° C, aproximadamente a 37° C, o a 37° C ±2° C, ±1° C, ±0,5° C, o ±0,1° C.
En divulgaciones particulares, las células se incuban en presencia de una o más citoquinas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes humanas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas se unen y/o son capaces de unirse a receptores que son expresados por y/o son endógenos a las células T. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye un miembro de la familia de citoquinas del haz de 4 hélices alfa. En algunas divulgaciones, los miembros de la familia del haz de 4 alfa-hélices de citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF). En algunas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye IL-15. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-7. En algunas divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-2 recombinante.
En algunas divulgaciones, las células se incuban en ausencia de citoquinas recombinantes.
En algunas divulgaciones, toda o una parte de la incubación se realiza en medio basal. En algunas divulgaciones, el medio basal es una solución salina equilibrada (por ejemplo PBS, DPBS, HBSS, EBSS). En algunas divulgaciones, el medio basal se selecciona entre medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (BME), F-10, F-12, RPMI 1640, medio esencial mínimo de Glasgow (GMEM), medio esencial mínimo alfa (MEM alfa), medio de Dulbecco modificado de Iscove y M199. En algunas divulgaciones, el medio base es un medio complejo (por ejemplo RPMI-1640, IMDM). En algunas divulgaciones, el medio base es medio basal de expansión de células T OpTmizer™ CTS™ (ThermoFisher).
En algunas divulgaciones, el medio basal contiene una mezcla de sales inorgánicas, azúcares, aminoácidos y, opcionalmente, vitaminas, ácidos orgánicos y/o tampones u otros nutrientes de cultivo celular bien conocidos. Además de los nutrientes, el medio también ayuda a mantener el pH y la osmolalidad. En algunas divulgaciones, los reactivos del medio basal favorecen el crecimiento, la proliferación y/o la expansión celular. Una amplia variedad de medios basales disponibles comercialmente son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), el medio de Dulbecco modificado por Iscove y el medio de Hams. En algunas divulgaciones, el medio basal es el medio de Dulbecco modificado por Iscove, Rp MI- 1640 o a-MEM.
En ciertas divulgaciones, el medio basal se suplementa con aditivos adicionales. En algunas divulgaciones, el medio basal no se suplementa con ningún aditivo adicional. Los aditivos de los medios de cultivo celular pueden incluir, entre otros, nutrientes, azúcares, por ejemplo glucosa, aminoácidos, vitaminas o aditivos como ATP y NADH.
En algunas divulgaciones, las células se incuban con el polinucleótido heterólogo, por ejemplo el vector viral. En ciertas divulgaciones, las células se incuban con el polinucleótido, por ejemplo vector viral, durante, durante aproximadamente, o durante por lo menos 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas, 96 horas, o más de 96 horas. En ciertas divulgaciones, la duración total de la incubación es, es aproximadamente, o es de por lo menos 12 horas, 18 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas, 96 horas, 108 horas, o 120 horas. En divulgaciones particulares, la incubación se completa en, en aproximadamente, o en el plazo de 120 horas, 108 horas, 96 horas, 84 horas, 72 horas, 60 horas, 54 horas, 48 horas, 42 horas, 36 horas, 30 horas, 24 horas, 18 horas, o 12 horas. En algunas divulgaciones, la duración total de la incubación está comprendida entre o entre aproximadamente 12 horas y 120 horas, 18 horas y 96 horas, 24 horas y 72 horas, o 24 horas y 48 horas, inclusive. En algunas divulgaciones, la duración total de la incubación es entre o aproximadamente entre 1 hora y 48 horas, 4 horas y 36 horas, 8 horas y 30 horas o 12 horas y 24 horas, inclusive.
C. Cultivo
En divulgaciones particulares, los procesos para generar composiciones de células T manipuladas divulgados en la presente se realizan en conexión con un paso de cultivo opcional o un paso en el que las células se someten a expansión o proliferaciónin vitro,como después de una introducción de un polinucleótido heterólogo en la célula. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados incluyen uno o más pasos para cultivar células, por ejemplo cultivar células en condiciones que promueven la proliferación o expansión. En algunas divulgaciones, las células se cultivan en condiciones que promueven la proliferación o expansión posterior a un paso de manipulación genética, por ejemplo la introducción de un polipéptido recombinante en las células por transducción o transfección. En divulgaciones particulares, las células se cultivan después de que las células se hayan incubado en condiciones de estimulación y se hayan transducido o transfectado con un polinucleótido recombinante, por ejemplo un polinucleótido que codifica un receptor recombinante. Por tanto, en algunas divulgaciones, se cultivan células de una población transformada de células T enriquecidas. En divulgaciones particulares, la una o más poblaciones transformadas se han agotado o separado con anterioridad de las células T CD57+.
En algunas divulgaciones, los procesos para generar composiciones de células T manipuladas divulgados en la presente no requieren un paso de cultivo o un paso en el que las células se someten a expansión o proliferaciónin vitrodespués de una introducción de un polinucleótido heterólogo en las células. En algunas divulgaciones, el proceso o método para generar o fabricar composiciones de células manipuladas no incluyen un paso para el cultivo, por ejemplo para ampliar el número de células manipuladas en la composición terapéutica.
En ciertas divulgaciones, la una o más poblaciones de células T manipuladas son o incluyen dos poblaciones separadas de células T enriquecidas. En divulgaciones particulares, dos poblaciones separadas de células T enriquecidas, por ejemplo dos poblaciones separadas de células T enriquecidas seleccionadas, aisladas y/o enriquecidas a partir de la misma muestra biológica, se cultivan por separado en condiciones de estimulación. En ciertas divulgaciones, las dos poblaciones separadas incluyen una población de células T CD4+ enriquecidas, por ejemplo células T CD57- CD4+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las dos poblaciones separadas incluyen una población de células T CD8+ enriquecidas, por ejemplo células T CD57- CD8+ enriquecidas. En algunas divulgaciones, dos poblaciones separadas de células T CD4+ enriquecidas y células T CD8+ enriquecidas, por ejemplo dos poblaciones separadas de células T CD57- CD4+ enriquecidas y células T CD57- CD8+ enriquecidas, se cultivan por separado, por ejemplo en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión. En algunas divulgaciones, se cultiva una única población de células T enriquecidas, por ejemplo una única población que incluye o contiene células T CD57- CD4+ y células T CD57- CD8+. En ciertas divulgaciones, la población única es una población de células T CD4+ enriquecidas. En algunas divulgaciones, la población única es una población de células T CD4+ y CD8+ enriquecidas que se han combinado a partir de poblaciones separadas antes del cultivo.
En algunas divulgaciones, la población de células T CD4+ enriquecidas (por ejemplo células T CD57- CD4+) que se cultiva, por ejemplo en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión, incluye por lo menos o aproximadamente el 60%, por lo menos o aproximadamente el 65%, por lo menos o aproximadamente el 70%, por lo menos o aproximadamente el 75%, por lo menos o aproximadamente el 80%, por lo menos o aproximadamente el 85%, por lo menos o aproximadamente el 90%, por lo menos o aproximadamente el 95%, por lo menos o aproximadamente el 98%, por lo menos o aproximadamente el 99%, por lo menos o aproximadamente el 99,5%, por lo menos o aproximadamente el 99,9%, o el o aproximadamente el 100% de células T CD4+ (por ejemplo células T CD57- CD4+). En algunas divulgaciones, la población incluye por lo menos o aproximadamente un 30%, por lo menos o aproximadamente un 40%, por lo menos o aproximadamente un 50%, por lo menos o aproximadamente un 60%, por lo menos o aproximadamente un 70%, por lo menos o aproximadamente un 80%, por lo menos o aproximadamente un 90%, por lo menos o aproximadamente un 95%, por lo menos o aproximadamente un 98%, por lo menos o aproximadamente un 99%, por lo menos o aproximadamente un 99,5%, por lo menos o aproximadamente un 99,9%, o por lo menos o aproximadamente un 100% de células T CD4+ (por ejemplo células T CD57- CD4+) que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD4+ enriquecidas (por ejemplo células T CD57- CD4+) que se cultiva incluye menos de o de aproximadamente el 40%, menos de o de aproximadamente el 35%, menos de o de aproximadamente el 30%, menos de o de aproximadamente el 25%, menos de o de aproximadamente el 20%, menos de o de aproximadamente el 15%, menos de o de aproximadamente el 10%, menos de o de aproximadamente el 5%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1%, o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T CD8+, y/o no contiene células T CD8+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD8+.
En algunas divulgaciones, la población de células T CD8+ enriquecidas que se cultiva, por ejemplo, en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión, incluye por lo menos o aproximadamente el 60%, por lo menos o aproximadamente el 65%, por lo menos o aproximadamente el 70%, por lo menos o aproximadamente el 75%, por lo menos o aproximadamente el 80%, por lo menos o aproximadamente el 85%, por lo menos o aproximadamente el 90%, por lo menos o aproximadamente el 95%, por lo menos o aproximadamente el 98%, por lo menos o aproximadamente el 99%, por lo menos o aproximadamente el 99,5%, por lo menos o aproximadamente el 99,9%, o el o aproximadamente el 100% de células T CD8+ (por ejemplo células T CD57- CD8+). En divulgaciones particulares, la población incluye por lo menos o aproximadamente el 30%, por lo menos o aproximadamente el 40%, por lo menos o aproximadamente el 50%, por lo menos o aproximadamente el 60%, por lo menos o aproximadamente el 70%, por lo menos o aproximadamente el 80%, por lo menos o aproximadamente el 90%, por lo menos o aproximadamente el 95%, por lo menos o aproximadamente el 98%, por lo menos o aproximadamente el 99%, por lo menos o aproximadamente el 99,5%, por lo menos o aproximadamente el 99,9%, o el o aproximadamente el 100% de células T CD8+ (por ejemplo células T CD57-<c>D8+) que expresan el receptor recombinante y/o han sido transducidas o transfectadas con el polinucleótido recombinante. En ciertas divulgaciones, la población de células T CD8+ enriquecidas que se incuba en condiciones de estimulación incluye menos de o de aproximadamente el 40%, menos de o de aproximadamente el 35%, menos de o de aproximadamente el 30%, menos de o de aproximadamente el 25%, menos de o de aproximadamente el 20%, menos de o de aproximadamente el 15%, menos de o de aproximadamente el 10%, menos de o de aproximadamente el 5%, menos de o de aproximadamente el 1%, menos de o de aproximadamente el 0,1%, o menos de o de aproximadamente el 0,01% de células T CD4+, y/o no contiene células T CD4+, y/o está libre o sustancialmente libre de células T CD4+.
En algunas divulgaciones, el cultivo se realiza en condiciones que generalmente incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de células inmunitarias primarias, como linfocitos T humanos, por ejemplo por lo menos a o aproximadamente a 25 grados Celsius, generalmente por lo menos a o aproximadamente a 30 grados, y generalmente por lo menos a o aproximadamente a 37 grados Celsius. En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas se incuba a una temperatura de 25 a 38° C, como de 30 a 37° C, por ejemplo a o a aproximadamente 37° C ± 2° C. En algunas divulgaciones, la incubación se lleva a cabo durante un periodo de tiempo hasta que el cultivo, por ejemplo cultivo o expansión, da como resultado una densidad, número o dosis de células deseada o umbral. En algunas divulgaciones, el cultivo es mayor de o mayor de aproximadamente o es durante aproximadamente o 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días o más.
En algunas divulgaciones, las células se cultivan para alcanzar un umbral de expansión que es una cantidad, concentración o densidad de células que es por lo menos del 50%, por lo menos o aproximadamente del 60%, por lo menos o aproximadamente del 70%, por lo menos o aproximadamente del 80%, por lo menos o aproximadamente del 90%, por lo menos o aproximadamente del 95%, por lo menos o aproximadamente del 100%, por lo menos o aproximadamente del 150%, por lo menos o aproximadamente 1 vez, por lo menos o aproximadamente 2 veces, por lo menos o aproximadamente 3 veces, por lo menos o aproximadamente 4 veces, por lo menos o aproximadamente 5 veces, por lo menos o aproximadamente 10 veces, por lo menos o aproximadamente 20 veces, por lo menos o aproximadamente 50 veces mayor en comparación con la cantidad, concentración o densidad de células al inicio del cultivo.
Como se describe en los Ejemplos, el número de duplicaciones de población se correlacionó inversamente con la probabilidad de supervivencia libre de progresión en pacientes tratados con la composición de células T terapéuticas (por ejemplo composición de salida). Por tanto, en algunas divulgaciones, el número de duplicaciones de población no es de más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, o 10 duplicaciones de población. En algunas divulgaciones, el número de duplicaciones de población no es de más de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 duplicaciones de la población. En algunas divulgaciones, los números reducidos de duplicaciones de población (por ejemplo menos de o igual a 6) se consiguen expandiendo composiciones de células T (por ejemplo células T CD4+, CD+ 8 manipuladas) que incluyen por lo menos o por lo menos aproximadamente el 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de células T vírgenes y/o células T de memoria central. En algunas divulgaciones, se consiguen números reducidos de duplicaciones de población (por ejemplo menos de o igual a 6) expandiendo composiciones de células T (por ejemplo células T CD4+, CD+ 8 manipuladas) que incluyen no más del 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, o 1% de células T CD57+. En algunas divulgaciones, los números reducidos de duplicaciones de población (por ejemplo menores de o iguales a 6) se logran usando una densidad de siembra de más de 0,05x10A6 células/ml, 0,1x10A6 células/ml, 0,15x10A6 células/ml, 0,2x10A6 células/ml, 0,25x10A6 células/ml, 0,3x10A6 células/ml, 0,35x10A6 células/ml, 0,4x10A6 células/ml, 0,45x10A6 células/ml, o más.
Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, como citoquinas, quimioquinas, antígenos, moléculas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En divulgaciones particulares, una composición de células T enriquecidas se cultiva en presencia de una o más citoquinas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas son citoquinas recombinantes humanas. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas se unen y/o son capaces de unirse a receptores que son expresados por y/o son endógenos a las células T. En ciertas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye un miembro de la familia de citoquinas del haz de 4 hélices alfa. En algunas divulgaciones, los miembros de la familia del haz de 4 alfa-hélices de citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4), interleucina-7 (IL-7), interleucina-9 (IL-9), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF). En algunas divulgaciones, la una o más citoquinas es o incluye IL-15. En divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-7. En algunas divulgaciones particulares, la una o más citoquinas es o incluye IL-2 recombinante.
En algunas divulgaciones, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.77 de Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunas divulgaciones, por lo menos una parte del cultivo se lleva a cabo en la cavidad interna de una cámara centrífuga, por ejemplo bajo rotación centrífuga, como se describe en la Publicación Internacional Número WO2016/073602. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la incubación realizada en una cámara centrífuga incluye el mezclado con un reactivo o reactivos para inducir la estimulación y/o activación. En algunas divulgaciones, las células, como células seleccionadas, se mezclan con una condición de estimulación o agente estimulador en la cámara centrífuga. En algunas divulgaciones de tales procesos, un volumen de células se mezcla con una cantidad de una o más condiciones o agentes estimuladores que es mucho menor que la que se emplea normalmente al realizar estimulaciones similares en una placa de cultivo celular u otro sistema.
En algunas divulgaciones, el cultivo se realiza con la adición de un tampón de cultivo a las células y el agente estimulador para lograr un volumen objetivo de, por ejemplo 10 ml a 2.000 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 10 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml, 1.000 ml, 1.200 ml, 1.400 ml, 1.600 ml, 1.800 ml, 2.000 ml, 2.200 ml o 2.400 ml.. En algunas divulgaciones, el tampón de incubación y el agente estimulador se mezclan antes de la adición a las células. En algunas divulgaciones, la incubación de estimulación se lleva a cabo con condiciones periódicas de mezclado suave, lo que puede ayudar a promover interacciones energéticamente favorecidas y, por lo tanto, permitir el uso de menos agente estimulador en general mientras se logra la estimulación y activación de las células.
En algunas divulgaciones, la incubación se lleva a cabo generalmente en condiciones de mezclado, como en presencia de centrifugación, generalmente a una fuerza o velocidad relativamente baja, como una velocidad menor a la usada para sedimentar las células, como de o de aproximadamente 600 rpm a 1700 rpm (por ejemplo de o de aproximadamente o por lo menos 600 rpm, 1000 rpm, o 1500 rpm o 1700 rpm), como a una RCF en la muestra o pared de la cámara u otro recipiente de o de aproximadamente<80>g a 100 g (por ejemplo de o de aproximadamente 0 de por lo menos 80 g, 85 g, 90 g, 95 g, o 100 g). En algunas divulgaciones, el centrifugado se lleva a cabo usando intervalos repetidos de un centrifugado a dicha velocidad baja seguido de un periodo de descanso, como un centrifugado y/o descanso durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 segundos, como un centrifugado a aproximadamente 1 o 2 segundos seguido de un descanso durante aproximadamente 5, 6, 7, u 8 segundos.
En divulgaciones particulares, el cultivo se realiza en un sistema cerrado. En divulgaciones particulares, el cultivo se realiza en un sistema cerrado en condiciones estériles. En divulgaciones particulares, el cultivo se realiza en el mismo sistema cerrado que uno o más pasos de los sistemas divulgados. En algunas divulgaciones, la población de células T enriquecidas se extrae de un sistema cerrado y se coloca en y/o se conecta a un biorreactor para el cultivo. Ejemplos de biorreactores adecuados para el cultivo incluyen, pero no se limitan a los sistemas de biorreactores, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker, y los sistemas de biorreactores Pall XRS. En algunas divulgaciones, el biorreactor se usa para perfundir y/o mezclar las células durante por lo menos una parte del paso de cultivo.
En algunas divulgaciones, el mezclado es o incluye balanceo y/o movimiento. En algunos casos divulgados en la presente, el biorreactor puede someterse a movimiento o balanceo, que, en algunas divulgaciones, puede aumentar la transferencia de oxígeno. El movimiento del biorreactor puede incluir, pero no se limita a, la rotación a lo largo de un eje horizontal, la rotación a lo largo de un eje vertical, un movimiento de balanceo a lo largo de un eje horizontal ladeado o inclinado del biorreactor o cualquier combinación de los mismos. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la incubación se lleva a cabo con balanceo. La velocidad y el ángulo de balanceo pueden ajustarse para conseguir la agitación deseada. En algunas divulgaciones, el ángulo de balanceo es de 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° o 1°. En ciertas divulgaciones, el ángulo de balanceo está entre 6-16°. En otras divulgaciones, el ángulo de balanceo está entre 7-16°. En otras divulgaciones, el ángulo de balanceo está entre 8-12°. En algunas divulgaciones, la velocidad de balanceo es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm. En algunas divulgaciones, la velocidad de balanceo está entre 4 y 12 rpm, como entre 4 y 6 rpm, inclusive.
En algunas divulgaciones, el biorreactor mantiene la temperatura en o cerca de 37° C y los niveles de CO2 en o cerca del 5% con un flujo de aire constante en, aproximadamente, o por lo menos 0,01 l/min, 0,05 l/min, 0,1 l/min, 0,2 l/min, 0,3 l/min, 0,4 l/min, 0,5 l/min, 1,0 l/min, 1,5 l/min, o 2,0 l/min o de más de 2,0 l/min. En ciertas divulgaciones, por lo menos una parte del cultivo se realiza con perfusión, como con una tasa de 290 ml/día, 580 ml/día, y/o 1160 ml/día, por ejemplo dependiendo del momento con respecto al inicio del cultivo y/o la densidad de las células cultivadas. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte de la expansión del cultivo celular se realiza con un movimiento de balanceo, como con un ángulo de entre 5° y 10°, como 6°, a una velocidad de balanceo constante, como una velocidad de entre 5 y 15 RPM, como 6 RMP o 10 RPM.
En algunas divulgaciones, por lo menos una parte del paso de cultivo se realiza bajo perfusión constante, por ejemplo una perfusión a un ritmo lento y constante. En algunas divulgaciones, la perfusión es o incluye una salida de líquido, por ejemplo medios usados, y una entrada de medios frescos. En ciertas divulgaciones, la perfusión reemplaza los medios usados por medios frescos. En algunas divulgaciones, por lo menos una parte del cultivo se realiza bajo perfusión a una velocidad constante de o de aproximadamente o de por lo menos 100 ml/día, 200 ml/día, 250 ml/día, 275 ml/día, 290 ml/día, 300 ml/día, 350 ml/día, 400 ml/día, 450 ml/día, 500 ml/día, 550 ml/día, 575 ml/día, 580 ml/día, 600 ml/día, 650 ml/día, 700 ml/día, 750 ml/día, 800 ml/día, 850 ml/día, 900 ml/día, 950 ml/día, 1000 ml/día, 1100 ml/día, 1160 ml/día, 1200 ml/día, 1400 ml/día, 1500 ml/día, 1600 ml/día, 1800 ml/día, 2000 ml/día, 2200 ml/día o 2400 ml/día.
D. Cosecha, recogida y formulación de células
En algunas divulgaciones, uno o más pasos del proceso (por ejemplo llevados a cabo en la cámara centrífuga y/o sistema cerrado) para fabricar, generar o producir una terapia celular y/o células manipuladas puede incluir la formulación de células, como la formulación de células manipuladas genéticamente resultantes de los pasos de procesamiento de transducción divulgados antes o después del cultivo, por ejemplo cultivo y expansión, y/o uno o más otros pasos de procesamiento como se describe. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados asociados con la formulación de células incluyen el procesamiento de células transducidas, como células transducidas y/o expandidas usando los pasos de procesamiento descritos anteriormente, en un sistema cerrado.
En algunas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira y/o separa de las células antes de la formulación. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira y/o se separa de las células después del cultivo. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador se retira y/o separa de las células después del cultivo y antes de formular las células cultivadas, por ejemplo en condiciones que promueven la proliferación y/o expansión. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador es un reactivo estimulador que se describe en la presente, por ejemplo en la Sección N IA 1. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador se retira y/o separa de las células como se describe en la presente, por ejemplo en la Sección III.A.2.
En ciertas divulgaciones, las células de una población cultivada de células se formulan entre 0 días y 10 días, entre 0 y 5 días, entre 2 días y 7 días, entre 0,5 días, y 4 días, o entre 1 día y 3 días después de que las células hayan alcanzado el recuento, la densidad, y/o la expansión celular umbral durante el cultivo. En ciertas divulgaciones, las células se formulan en o aproximadamente en o en el plazo de 12 horas, 18 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 3 días después de que se haya alcanzado el recuento, densidad y/o expansión celular umbral durante el cultivo. En algunas divulgaciones, las células se formulan en el plazo o en el plazo de aproximadamente 1 día después de que se haya alcanzado el recuento, densidad y/o expansión celular umbral durante el cultivo.
En ciertas divulgaciones, la cantidad de tiempo desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células es, es aproximadamente o es de menos de 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas, 96 horas, 108 horas o 120 horas. En ciertas divulgaciones, la cantidad de tiempo desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células es, es aproximadamente o es de menos de 1,5 días, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días. En algunas divulgaciones, la cantidad de tiempo desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células para generar células manipuladas, desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células es entre o entre aproximadamente 36 horas y 120 horas, 48 horas y 96 horas, o 48 horas y 72 horas, inclusive, o entre o entre aproximadamente 1,5 días y 5 días, 2 días y 4 días, o 2 días y 3 días, inclusive. En divulgaciones particulares, la cantidad de tiempo desde el inicio de la incubación hasta la cosecha, recogida o formulación de las células es, es de aproximadamente o es de menos de 48 horas, 72 horas o 96 horas. En divulgaciones particulares, la cantidad de tiempo desde el inicio de la incubación hasta la cosecha, recogida o formulación de las células es, es de aproximadamente o es de menos de 2 días, 3 días o 4 días. En divulgaciones particulares, el tiempo transcurrido desde el inicio de la incubación hasta la cosecha, recogida o formulación de las células es de 48 horas ± 6 horas, 72 horas ± 6 horas o 96 horas ± 6 horas. En divulgaciones particulares, la cantidad de tiempo desde el inicio de la incubación hasta la cosecha, recogida o formulación de las células es o es de aproximadamente 96 horas o cuatro días.
En ciertas divulgaciones, las células se cosechan o recogen por lo menos cuando se detecta el vector integrado en el genoma. En algunas divulgaciones, las células se cosechan o recogen antes de que el número de copias del vector integrado (iVCN) por genoma diploide sea estable. En divulgaciones particulares, las células se cosechan o recogen después de que se detecte el vector integrado en el genoma pero antes de que se alcance un iVCN estable por genoma diploide.
En algunas divulgaciones, las células se cosechan o recogen antes de que el iVCN de alcance, alcance aproximadamente o alcance por lo menos 5,0, 4,0, 3,0, 2,5, 2,0, 1,75, 1,5, 1,25, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,75, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3 o 0,25 copias por genoma diploide. En divulgaciones particulares, las células se cosechan o recogen antes de que la iVCN alcance o aproximadamente 1,0 copias por genoma diploide. En algunas divulgaciones, las células se recogen o cosechan antes de que el iVCN alcance o aproximadamente 0,5 copias por genoma diploide.
En ciertas divulgaciones, las células se cosechan antes, antes de aproximadamente o antes de por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, veinte o más duplicaciones celulares de la población celular, por ejemplo duplicaciones que se producen durante la incubación.
En divulgaciones particulares, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células, por ejemplo el número total de células incubadas o células que se someten a la incubación, sea mayor de o de aproximadamente una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, veinte o más de veinte veces el número de células de la población de entrada, por ejemplo el número total de células que se pusieron en contacto con el reactivo estimulador. En algunas divulgaciones, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células incubadas sea mayor de o de aproximadamente una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, veinte o más de veinte veces el número total de células que se transformaron, transdujeron o espinocularon, por ejemplo el número total de células que se pusieron en contacto con un vector viral. En ciertas divulgaciones, las células son células T, células T viables, células T CD3+, células T CD4+, células T CD8+, células T que expresan CAR, o una combinación de cualquiera de las anteriores. En divulgaciones particulares, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células sea mayor que el número total de células de la población de entrada. En varias divulgaciones, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células T CD3+ viables sea mayor que el número total de células CD3+ viables de la población de entrada. En divulgaciones particulares, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células sea mayor que el número total de células de las células transformadas, transducidas o espinoculadas. En varias divulgaciones, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células T CD3+ viables sea mayor que el número total de células CD3+ viables de las células transformadas, transducidas o espinoculadas. En varias divulgaciones, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células CD4+ y CD8+ viables sea mayor que el número total de células CD4+ y CD8+ viables de la población de entrada. En divulgaciones particulares, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células sea mayor que el número total de células de las células transformadas, transducidas o espinoculadas. En varias divulgaciones, las células se cosechan o recogen en un momento antes de que el número total de células CD4+ y CD8+ viables sea mayor que el número total de células CD4+ y CD8+ viables de las células transformadas, transducidas o espinoculadas.
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados para fabricar, generar o producir una terapia celular y/o células manipuladas pueden incluir la formulación de células, como la formulación de células manipuladas genéticamente resultantes de los pasos de procesamiento divulgados antes o después de la incubación, manipulación y cultivo, y/o uno o más otros pasos de procesamiento como se describe. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados asociados con la formulación de células incluyen el procesamiento de células transducidas, como células transducidas y/o expandidas usando los pasos de procesamiento descritos anteriormente, en un sistema cerrado. En algunas divulgaciones, la dosis de células que comprende células manipuladas con un receptor de antígeno recombinante, por ejemplo CAR o TCR, se divulga como una composición o formulación, como una composición o formulación farmacéutica. Tales composiciones pueden usarse de acuerdo con los métodos divulgados, como en la prevención o tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos, o en métodos de detección, diagnóstico y pronóstico.
En algunos casos divulgados en la presente, las células se procesan en uno o más pasos (por ejemplo llevados a cabo en la cámara centrífuga y/o sistema cerrado) para fabricar, generar o producir una terapia celular y/o células manipuladas pueden incluir la formulación de células, como la formulación de células manipuladas genéticamente resultantes de los pasos de procesamiento de transducción divulgados antes o después del cultivo, por ejemplo cultivo y expansión, y/o uno o más otros pasos de procesamiento como se describe. En algunos casos divulgados en la presente, las células pueden formularse en una cantidad para administración de dosificación, como para una administración de dosificación unitaria o administración de dosificaciones múltiples. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados asociados con la formulación de células incluyen el procesamiento de células transducidas, como células transducidas y/o expandidas usando los pasos de procesamiento descritos anteriormente, en un sistema cerrado.
En ciertas divulgaciones, se formulan una o más composiciones de células T enriquecidas. En divulgaciones particulares, una o más composiciones de células T enriquecidas se formulan después de que la una o más composiciones se hayan manipulado y/o cultivado. En divulgaciones particulares, la una o más composiciones son composiciones de entrada. En algunas divulgaciones, la una o más composiciones de entrada se han crioconservado y almacenado previamente, y se descongelan antes de la incubación.
En ciertas divulgaciones, las células formuladas son células de salida. En algunas divulgaciones, una composición formulada de células T enriquecidas es una composición de salida de células T enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las células T CD4+ formuladas y las células T CD8+ formuladas son las células T CD4+ y CD8+ de salida. En divulgaciones particulares, una composición celular formulada, por ejemplo una composición formulada de células CD4+ y CD8+ enriquecidas, es una composición celular de salida, por ejemplo una composición de salida de células CD4+ y CD8+ enriquecidas.
En algunas divulgaciones, las células pueden formularse en un recipiente, como una bolsa o un vial. En algunas divulgaciones, las células se formulan entre 0 días y 10 días, entre 0 y 5 días, entre 2 días y 7 días, entre 0,5 días, y 4 días, o entre 1 día y 3 días después de que las células hayan alcanzado el recuento, densidad, y/o expansión celular umbral durante el cultivo. En ciertas divulgaciones, las células se formulan en o en aproximadamente o en el plazo de 12 horas, 18 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 3 días después de que se haya alcanzado el recuento, densidad y/o expansión celular umbral durante el cultivo. En algunas divulgaciones, las células se formulan en el plazo o en el plazo de aproximadamente 1 día después de que se haya alcanzado el recuento, densidad y/o expansión celular umbral durante el cultivo.
En ciertas divulgaciones, las células se cultivan durante una duración o cantidad de tiempo mínima, por ejemplo de tal manera que las células se cosechan en un estado menos activado que si se formularan en un punto de tiempo anterior durante el cultivo, independientemente de cuándo se alcanza el umbral. En algunas divulgaciones, las células se cultivan entre 0 días y 3 días, por ejemplo entre 0 y 3 días, entre 1 y 2 días, en o en aproximadamente 1 día, en o en aproximadamente 2 días, o en o en aproximadamente 3 días, después de que se haya alcanzado el recuento, densidad y/o expansión celular umbral durante el cultivo. En ciertas divulgaciones, las células activan el recuento , la densidad, y/o la expansión celular umbral y permanecen cultivadas durante un tiempo o duración mínimos antes de la formulación. En algunas divulgaciones, las células que han alcanzado el umbral no se formulan hasta que se han cultivado durante una duración y/o cantidad de tiempo mínimo, como un tiempo o duración mínima de entre 1 día y 14 días, 2 días y 7 días, o 3 días y 6 días, o un tiempo mínimo o duración del cultivo de o de aproximadamente 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, o más de 7 días. En algunas divulgaciones, el tiempo mínimo o la duración del cultivo es de entre 3 días y 6 días.
En algunas divulgaciones, las células se formulan en un tampón farmacéuticamente aceptable, que puede, en algunas divulgaciones, incluir un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas divulgaciones, el procesamiento incluye el intercambio de un medio en un medio o tampón de formulación que sea farmacéuticamente aceptable o deseado para la administración a un sujeto. En algunas divulgaciones, los pasos de procesamiento pueden incluir el lavado de las células transducidas y/o expandidas para sustituir las células en un tampón farmacéuticamente aceptable que puede incluir uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables opcionales. Ejemplos de tales formas farmacéuticas, incluyendo portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, pueden ser cualquiera de las descritas a continuación junto con formas aceptables para administrar las células y composiciones a un sujeto. En algunas divulgaciones la composición farmacéutica contiene las células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" es un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
En algunas divulgaciones, la elección del portador viene determinada en parte por la célula particular y/o por el método de administración. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo metilparabeno, propilparabeno, benzoato sódico y cloruro de benzalconio. En algunas divulgaciones, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o las mezclas del mismo están presentes típicamente en una cantidad comprendida entre aproximadamente el 0,0001% y aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones, como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína); aminoácidos, como glicinapor ejemplo complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como el polietilenglicol (PEG).
En algunas divulgaciones se incluyen agentes tamponadores en las composiciones. Los agentes tamponadores adecuados incluyen, por ejemplo ácido cítrico, citrato sódico, ácido fosfórico, fosfato potásico y otros ácidos y sales. En algunas divulgaciones, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o las mezclas del mismos están presentes típicamente en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (1 de mayo de 2005).
Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. La formulación o composición también puede contener más de un principio activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se esté tratando con las células, preferiblemente aquellos con actividades complementarias a las células, cuando las actividades respectivas no se afecten negativamente entre sí. Tales ingredientes activos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunas divulgaciones, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina y/o vincristina.
Las composiciones en algunas divulgaciones se divulgan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunas divulgaciones pueden estar tamponadas a un pH seleccionado. Las composiciones líquidas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando las células en un solvente, por ejemplo en mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ejemplo metilcelulosa), agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o potenciadores de la viscosidad, conservantes, aromatizantes y/o colorantes, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. En algunas divulgaciones pueden consultarse textos estándar para preparar preparaciones adecuadas.
Pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol y ácido sórbico. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
En algunas divulgaciones, el tampón de formulación contiene un crioconservante. En algunas divulgaciones, la célula se formula con una solución crioconservante que contiene una solución de DMSO del 1,0% al 30%, como una solución de DMSO del 5% al 20% o una solución de DMSO del 5% al 10%. En algunas divulgaciones, la solución de crioconservación es o contiene, por ejemplo PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina sérica humana (HSA), u otros medios de congelación celular adecuados. En algunas divulgaciones, la solución crioconservante es o contiene, por ejemplo por lo menos o aproximadamente el 7,5% de DMSO. En algunas divulgaciones, los pasos de procesamiento pueden incluir el lavado de las células transducidas y/o expandidas para reemplazar las células en una solución crioconservante. En algunas divulgaciones, las células se congelan, por ejemplo se crioconservan o crioprotegen, en medios y/o solución con una concentración final de o de aproximadamente el 12,5%, 12,0%, 11,5%, 11,0%, 10,5%, 10,0%, 9,5%, 9. 0%, 8,5%, 8,0%, 7,5%, 7,0%, 6,5%, 6,0%, 5,5%, o 5,0% de DMSO, o entre el 1% y el 15%, entre el 6% y el 12%, entre el 5% y el 10%, o entre el 6% y el 8% de DMSO. En divulgaciones particulares, las células se congelan, por ejemplo se crioconservan o crioprotegen, en medios y/o solución con una concentración final de o de aproximadamente el 5,0%, 4,5%, 4,0%, 3,5%, 3,0%, 2,5%, 2,0%, 1,5%, 1,25%, 1,0%, 0,75%, 0,5%, o 0,25% de HSA, o entre el 0,1% y el -5%, entre el 0,25% y el 4%, entre el 0,5% y el 2%, o entre el 1% y el 2% de HSA.
En divulgaciones particulares, la composición de células T enriquecidas, por ejemplo células T que han sido estimuladas, manipuladas y/o cultivadas, se formulan, crioconservan y luego se almacenan durante un periodo de tiempo. En ciertas divulgaciones, las células formuladas y crioconservadas se almacenan hasta que se liberan para infusión. En divulgaciones particulares, las células crioconservadas formuladas se almacenan entre 1 día y 6 meses, entre 1 mes y 3 meses, entre 1 día y 14 días, entre 1 día y 7 días, entre 3 días y 6 días, entre 6 meses y 12 meses, o durante más de 12 meses. En algunas divulgaciones, las células se crioconservan y almacenan durante, durante aproximadamente o durante menos de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días. En ciertas divulgaciones, las células se descongelan y luego se administran a un sujeto después del almacenamiento. En ciertas divulgaciones, las células se almacenan durante o durante aproximadamente 5 días.
En algunas divulgaciones, la formulación se lleva a cabo usando uno o más pasos de procesamiento que incluyen el lavado, la dilución o la concentración de las células, como las células cultivadas o expandidas. En algunas divulgaciones, el procesamiento puede incluir la dilución o concentración de las células hasta una concentración o número deseados, como composiciones en forma de dosis unitaria que incluyen el número de células para la administración en una dosis o fracción determinada. En algunas divulgaciones, los pasos de procesamiento pueden incluir una reducción de volumen para aumentar de este modo la concentración de células según se desee. En algunas divulgaciones, los pasos de procesamiento pueden incluir una adición de volumen para disminuir de este modo la concentración de células según se desee. En algunas divulgaciones, el procesamiento incluye añadir un volumen de un tampón de formulación a las células transducidas y/o expandidas. En algunas divulgaciones, el volumen de tampón de formulación es de o de aproximadamente 10 ml a 1000 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos o aproximadamente o 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml, 800 ml, 900 ml o 1000 ml.
En algunas divulgaciones, tales pasos de procesamiento para formular una composición celular se llevan a cabo en un sistema cerrado. Ejemplos de tales pasos de procesamiento pueden realizarse usando una cámara centrífuga junto con uno o más sistemas o kits asociados con un sistema de procesamiento celular, como una cámara centrífuga producida y vendida por Biosafe SA, incluyendo aquellos para su uso con los sistemas de procesamiento celular Sepax® o Sepax 2®. Un sistema y proceso ejemplares se describen en la Publicación Internacional Número WO2016/073602. En algunas divulgaciones, el método incluye efectuar la expresión desde la cavidad interna de la cámara centrífuga de una composición formulada, que es la composición resultante de células formuladas en un tampón de formulación, como un tampón farmacéuticamente aceptable, en cualquiera de las divulgaciones anteriores como se describe. En algunas divulgaciones, la expresión de la composición formulada es a un recipiente, como una bolsa que está unida operativamente como parte de un sistema cerrado con la cámara centrífuga. En algunas divulgaciones, el recipiente, como una bolsa, está conectado a un sistema en una línea de salida o posición de salida.
En algunas divulgaciones, el sistema cerrado, como el asociado con una cámara centrífuga o un sistema de procesamiento celular, incluye un kit de salida multipuerto que contiene un colector de tubería multidireccional asociado en cada extremo de una línea de tubería con un puerto al que pueden conectarse uno o una pluralidad de recipientes para la expresión de la composición formulada. En algunas divulgaciones, un número deseado o pluralidad de recipientes de salida, por ejemplo bolsas, pueden conectarse de manera estéril a uno o más, generalmente dos o más, como por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de los puertos de la salida multipuerto. Por ejemplo en algunas divulgaciones, uno o más recipientes, por ejemplo bolsas pueden estar conectados a los puertos, o a menos de todos los puertos. Por tanto, en algunas divulgaciones, el sistema puede efectuar la expresión de la composición de salida en una pluralidad de bolsas de salida.
En algunas divulgaciones, las células pueden expresarse a la una o más de la pluralidad de bolsas de salida en una cantidad para la administración de dosis, como para una administración de dosis unitaria única o administración de dosis múltiple. Por ejemplo en algunas divulgaciones, las bolsas de salida pueden contener cada una el número de células para la administración en una dosis dada o fracción de la misma. Por tanto, cada bolsa, en algunas divulgaciones, puede contener una dosis unitaria única para la administración o puede contener una fracción de una dosis deseada de tal manera que más de una de la pluralidad de bolsas de salida, como dos de las bolsas de salida, o 3 de las bolsas de salida, juntas constituyen una dosis para la administración.
Por tanto, los recipientes, por ejemplo las bolsas de salida, contienen generalmente las células que se van a administrar, por ejemplo una o más dosis unitarias de las mismas. La dosis unitaria puede ser una cantidad o número de las células a administrar al sujeto o el doble del número (o más) de las células a administrar. Puede ser la dosis más baja o la dosis más baja posible de las células que se administrarían al sujeto.
En algunas divulgaciones, cada uno de los recipientes, por ejemplo bolsas, comprende individualmente una dosis unitaria de células. Por tanto, en algunas divulgaciones, cada uno de los recipientes comprende el mismo número de células o aproximadamente el mismo número de células. En algunas divulgaciones, cada dosis unitaria contiene por lo menos o aproximadamente por lo menos 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, o 1 x 108 células manipuladas, células totales, células T o PBMC. En algunas divulgaciones, el volumen de la composición celular formulada en cada bolsa es de 10 ml a 100 ml, como por lo menos o aproximadamente por lo menos 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, 60 ml, 70 ml, 80 ml, 90 ml o 100 ml.
En algunas divulgaciones, tales células producidas por el método, o una composición que comprende tales células, se administran a un sujeto para tratar una enfermedad o afección.
E. Selección secuencial y selección en paralelo
Los métodos divulgados en la presente permiten múltiples pasos de selección, por ejemplo mediante cromatografía en columna, para aislar y/o enriquecer una población celular diana (por ejemplo células T, CD3+, CD4+, CD8+, células T CD57-). En algunas divulgaciones, se llevan a cabo uno o más pasos de selección en uno o más puntos temporales o después de ciertos pasos del proceso para crear una composición celular terapéutica de salida. En algunas divulgaciones, un paso de selección incluye múltiples pasos de selección para, por ejemplo purificar aún más la composición celular, seleccionar subtipos celulares específicos, seleccionar células viables, seleccionar células manipuladas, y/o ajustar la proporción, el número total o la concentración de células. En algunas divulgaciones, se realiza un paso de selección antes de la incubación. En algunas divulgaciones, se realiza un paso de selección antes de la cosecha y recogida.
En algunas divulgaciones, tales métodos (por ejemplo pasos de selección) se logran mediante una única corriente de proceso, como en un sistema cerrado, empleando selecciones secuenciales en las que se enriquecen y/o aíslan una pluralidad de poblaciones celulares diferentes de una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas), como se divulga en la presente. En algunas divulgaciones, llevar a cabo la separación o aislamiento en el mismo recipiente o conjunto de recipientes, por ejemplo conjunto de tubos, se consigue llevando a cabo pasos secuenciales de selección positiva y negativa, el paso posterior sometiendo la fracción negativa y/o positiva del paso anterior a selección adicional, donde todo el proceso se lleva a cabo en el mismo tubo o conjunto de tubos. En una divulgación, una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una de las poblaciones de CD4+ o CD8+, y las células no seleccionadas de la primera selección se usan como fuente de células para una segunda selección para enriquecer para la otra de las poblaciones de CD4+ o CD8+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse otra selección o selecciones para enriquecer para subpoblaciones de una o ambas poblaciones de CD4+ o CD8+, por ejemplo células CD57-. En algunas divulgaciones, una población celular (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana se somete a una selección secuencial para células viables. En algunas divulgaciones, se controla o ajusta la proporción o el número total de células en la población celular (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana.
En algunas divulgaciones, tales métodos (por ejemplo pasos de selección) se logran mediante una única corriente de proceso, como en un sistema cerrado, empleando selecciones secuenciales en las que se enriquecen y/o aíslan una pluralidad de poblaciones celulares diferentes de una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas), como se divulga en la presente. En algunas divulgaciones, llevar a cabo la separación o aislamiento en el mismo recipiente o conjunto de recipientes, por ejemplo conjunto de tubos, se consigue llevando a cabo pasos secuenciales de selección negativa y positiva, el paso posterior sometiendo a la fracción negativa y/o positiva del paso anterior a selección adicional, donde todo el proceso se lleva a cabo en el mismo tubo o conjunto de tubos. En una divulgación, una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana se somete a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para eliminar las poblaciones de CD57+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse otra selección o selecciones para enriquecer una o ambas poblaciones de CD4+ o CD8+, por ejemplo células CD57-CD4+ o CD57-CD8+. En algunas divulgaciones, una población celular (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana se somete a una selección secuencial para células viables. En algunas divulgaciones, se controla o ajusta la proporción o el número total de células en la población celular (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana.
En una divulgación, se somete una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para enriquecer para una población de CD3+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer para subpoblaciones de la población de CD3+, por ejemplo células CD57-. En algunas divulgaciones, la selección o selecciones adicionales pueden efectuarse para enriquecer las células viables. En algunas divulgaciones, la selección o selecciones adicionales pueden efectuarse para enriquecer subpoblaciones de células CD57-CD3+, por ejemplo células CD3+CD57-CD4+ o CD57-CD3+CD8+ viables. En algunas divulgaciones, la selección de células viables incluye o consiste en eliminar células muertas de la población celular (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas o subpoblaciones de las mismas).
En una divulgación, se somete una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana a una selección secuencial en la que se efectúa una primera selección para eliminar las células CD57+. En algunas divulgaciones, puede efectuarse otra selección o selecciones para enriquecer subpoblaciones de la población de CD57-, por ejemplo células CD4+ y/o CD8+. En algunas divulgaciones, la selección o selecciones adicionales pueden efectuarse para enriquecer las células viables. En algunas divulgaciones, la selección de células viables incluye o consiste en eliminar células muertas de la población celular (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas o subpoblaciones de las mismas).
En algunas divulgaciones, no es necesario que los métodos (por ejemplo pasos de selección) divulgados en esta Sección se lleven a cabo usando técnicas de selección secuencial. En algunas divulgaciones, los métodos (por ejemplo pasos de selección) divulgados en esta Sección pueden llevarse a cabo usando técnicas de selección secuencial en combinación con técnicas de selección en paralelo. En algunas divulgaciones, el paso de selección no emplea selección secuencial o puede emplear selección secuencial que no se produce en un sistema cerrado o en un conjunto de recipientes que usan la misma tubería. En algunas realizaciones, el paso de selección se lleva a cabo en un único paso, por ejemplo usando una única columna de cromatografía. En algunas divulgaciones, el paso de selección se realiza usando una técnica de selección en paralelo. Por ejemplo, el paso de selección se consigue llevando a cabo pasos de selección positiva y/o negativa simultáneamente, por ejemplo en un sistema cerrado en el que todo el proceso se lleva a cabo en el mismo tubo o conjunto de tubos. En algunas divulgaciones, una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana se somete a una selección en paralelo en la que la muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) se carga en dos o más columnas de cromatografía, donde cada columna efectúa la selección de una población celular. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía efectúan la selección de las poblaciones de CD57-, CD3+, CD4+ o CD8+ individualmente. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía efectúan la selección de la misma población celular. Por ejemplo las dos o más columnas de cromatografía pueden efectuar la selección de células CD57-. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía, incluyendo la cromatografía de afinidad o la cromatografía de permeación en gel, efectúan independientemente la selección de la misma población celular. En algunas divulgaciones, las dos o más columnas de cromatografía, incluyendo cromatografía de afinidad o cromatografía de permeación en gel, efectúan independientemente la selección de diferentes poblaciones celulares. En algunas divulgaciones, puede efectuarse una selección o selecciones adicionales para enriquecer subpoblaciones de una o todas las poblaciones celulares seleccionadas mediante selección en paralelo. En algunas divulgaciones, una muestra (por ejemplo composición de salida de células estimuladas y/o manipuladas) que contiene células diana (por ejemplo células CD57-) se somete a una selección en paralelo en la que se efectúa la selección en paralelo para enriquecer para una población de CD4+ y una población de CD8+ o una población de CD3+.
En algunas divulgaciones, puede llevarse a cabo un paso de selección usando perlas marcadas con agentes de selección como se describe en la presente, y pueden retenerse las fracciones positivas y negativas del primer paso de selección, seguido de una selección positiva adicional de la fracción positiva para enriquecer para un segundo marcador de selección, como usando perlas marcadas con un segundo agente de selección o sometiendo la fracción positiva a cromatografía en columna como se ha descrito anteriormente. En algunas divulgaciones, se llevan a cabo uno o más pasos de selección usando cromatografía en columna como se describe en la presente. En algunas divulgaciones, los pasos de selección se llevan a cabo usando uno o más métodos que incluyen separación por perlas y cromatografía en columna. En algunas divulgaciones, la selección se lleva a cabo usando cromatografía en columna.
En algunas divulgaciones, el aislamiento de la pluralidad de poblaciones en un único o en el mismo recipiente o conjunto de recipientes de aislamiento o separación, como una única columna o conjunto de columnas, y/o el mismo tubo, o conjunto de tubos o usando la misma matriz de separación o medios o reactivos, como la misma matriz magnética, soporte sólido etiquetado por afinidad, o anticuerpos u otros moléculas de unión, incluyen características que agilizan el aislamiento, por ejemplo dando como resultado una reducción del coste, tiempo, complejidad, necesidad de manipulación de muestras, uso de recursos, reactivos o equipos. En algunas divulgaciones, tales características son ventajosas porque minimizan el coste, la eficacia, el tiempo y/o la complejidad asociados con los métodos, y/o evitan el daño potencial al producto celular, como el daño provocado por infección, contaminación y/o cambios de temperatura. Los métodos divulgados en la presente permiten múltiples pasos de selección para enriquecer poblaciones diana tanto antes como después de la selección celular combinada con estimulación en columna.
Los métodos divulgados en la presente permiten además la selección y enriquecimiento de células estimuladas y manipuladas con éxito. Por ejemplo en algunas divulgaciones, los procedimientos de selección secuencial, selección en paralelo o selección única descritos anteriormente pueden usarse para identificar células estimuladas que expresan receptores recombinantes (por ejemplo CAR, TCR). En algunas divulgaciones, las células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo CAR) pueden enriquecerse adicionalmente para células de subpoblación, por ejemplo células T CD4+ CAR+, células T CD8+ CAR+, y/o células viables. En algunas divulgaciones, el paso de selección permite controlar o ajustar la proporción, concentración o número total de células que expresan un receptor recombinante (por ejemplo CAR, TCR) y/o subpoblaciones del mismo. En algunas divulgaciones, las poblaciones enriquecidas pueden formularse para su uso (por ejemplo administración) para terapia celular.
F. Características ejemplares del proceso
En algunas divulgaciones, los métodos y composiciones divulgados se relacionan con poblaciones de células T enriquecidas para células T CD57-. En particular, las divulgaciones se refieren a métodos para generar poblaciones de células T CD57- enriquecidas, como por selección negativa de células CD57+ y, en algunas divulgaciones, selección positiva de células T, como células T CD4+ y/o células T CD8+. En particular, se divulgan métodos para generar poblaciones de células T CD57- enriquecidas, como por selección negativa de células CD57+ y, en algunas divulgaciones, selección positiva de células T, como células T CD3+. Ciertas divulgaciones se refieren a métodos de incubación, estimulación, activación, manipulación, transducción, cultivo y/o expansión de poblaciones de células T CD57- enriquecidas. En ciertas divulgaciones, la incubación, estimulación, activación, manipulación, transducción, cultivo y/o expansión de poblaciones de células T CD57- enriquecidas proporcionan ventajas sobre tales pasos o procesos con poblaciones alternativas de células T, como poblaciones que contienen cantidades o altas cantidades de células T CD57+. Tales ventajas incluyen, pero no se limitan a, una proliferación o expansión mejorada y una menor diferenciación, por ejemplo diferenciación terminal.
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados son o incluyen pasos de enriquecimiento de células T, como mediante la selección de células T CD57+ de una muestra biológica que contiene células T humanas primarias para generar una población de células T agotadas de células T CD57+, por ejemplo una población de células T CD57-enriquecidas. En algunas divulgaciones, la población contiene menos de o menos de aproximadamente un 10%, 5%,1%,o 0,1% de células T CD57+. En divulgaciones particulares, la población contiene menos de o menos de aproximadamente un 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% de la frecuencia de células T CD57+ que estaban presentes la muestra biológica. En ciertas divulgaciones, por lo menos el 85%, 90%, 95% o 99% de las células T CD4+ de la población son células T CD57-CD4+. En divulgaciones particulares, por lo menos el 85%, 90%, 95% o 99% de las células T CD8+ de la población son células T CD57-CD8+. En divulgaciones particulares, por lo menos el 85%, 90%, 95% o 99% de las células T CD3+ de la población son células T CD57-CD3+.
En ciertas divulgaciones, el enriquecimiento de células T incluye seleccionar o eliminar células CD57+ de una muestra biológica, y luego seleccionar por separado células T CD4+ y células T CD8+ de la población seleccionada negativamente para CD57, como para generar una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas y una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En algunas divulgaciones, estas poblaciones permanecen separadas, de tal manera que se crioprotegen y almacenan posteriormente por separado y/o se diseñan por separado para expresar un receptor recombinante. En divulgaciones particulares, las poblaciones separadas se combinan, como en una proporción de 1:1 de células T CD57-CD4+ a células T CD57-CD8+.
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados son o incluyen estimular poblaciones de células T CD57-enriquecidas. En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados incluyen uno o más pasos para estimular poblaciones de células T CD57-CD4+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, los métodos divulgados incluyen uno o más pasos para estimular poblaciones de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las poblaciones de células T CD57- CD4+ enriquecidas y las poblaciones de células T CD57- CD8+ enriquecidas se estimulan como incubando las células en condiciones de estimulación, por ejemplo cualquier condición de estimulación descrita en la presente como en la Sección III.A. En divulgaciones particulares, las condiciones de estimulación son o incluyen la presencia de un reactivo estimulador. En ciertas divulgaciones, se estimulan por separado poblaciones separadas de células T CD57- CD4+ enriquecidas y células T CD57- CD8+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, se combinan o mezclan poblaciones separadas de células T CD57- CD4+ enriquecidas y células T CD57- CD8+ enriquecidas antes de ser estimuladas, de tal manera que se estimula una composición combinada de células T CD57- CD4+ enriquecidas y células T CD57- CD8+ enriquecidas.
En ciertas divulgaciones, un método o proceso para estimular células T incluye seleccionar o eliminar células CD57+ de una muestra biológica, y después seleccionar por separado células T CD4+ y células T CD8+ de la población seleccionada negativamente para CD57, como para generar una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas y una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las poblaciones separadas de células T CD57-CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ enriquecidas se incuban por separado en condiciones de estimulación. En divulgaciones particulares, se combinan las poblaciones separadas de células T CD57-CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ enriquecidas, como una incubación por separado en condiciones de estimulación. En algunas divulgaciones, la estimulación incluye la presencia de un reactivo estimulador. En ciertas divulgaciones, el reactivo estimulador es o incluye una perla paramagnética conjugada con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador es o incluye una partícula oligomérica de muteína de estreptavidina con Fabs anti-CD3 y anti-CD28 unidos reversiblemente.
En divulgaciones particulares, los métodos divulgados son o incluyen manipular genéticamente poblaciones de células T CD57- enriquecidas, como mediante cualquiera de los métodos divulgados en la presente, por ejemplo en la Sección III.B. En algunas divulgaciones, se introduce un polinucleótido heterólogo en las células de las poblaciones, por ejemplo por transducción. En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados incluyen uno o más pasos para la manipulación de poblaciones de células T CD57-CD4+ enriquecidas o poblaciones de células que se originan o derivan de tales células. En divulgaciones particulares, los métodos divulgados incluyen uno o más pasos para la manipulación genética de poblaciones de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las poblaciones de células T CD57- CD4+ enriquecidas y las poblaciones de células T CD57- CD8+ enriquecidas se manipulan genéticamente, como por transducción con un vector viral. En ciertas divulgaciones, se manipulan genéticamente poblaciones separadas de células T CD57- CD4+ enriquecidas y células T CD57- CD8+ enriquecidas, por ejemplo células T CD57- CD4+ enriquecidas estimuladas y células T CD57- CD8+ enriquecidas estimuladas. En divulgaciones particulares, se manipula genéticamente una única población de células T CD57- enriquecidas, por ejemplo células T CD57- estimuladas, incluyendo tanto células T CD57-CD4+ como células T CD57- CD8+, por ejemplo células T CD57- CD4+ estimuladas enriquecidas y células T CD57- CD8+ estimuladas enriquecidas.
En divulgaciones particulares, un método para manipular genéticamente células T es o incluye pasos para seleccionar o eliminar células CD57+ de una muestra biológica, y luego seleccionar por separado células T CD4+ y células T CD8+ de la población seleccionada negativamente para CD57, como para generar una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas y una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, las poblaciones separadas de células T CD57-CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ enriquecidas se manipulan genéticamente por separado. En divulgaciones particulares, las poblaciones separadas de células T CD57-CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ enriquecidas se combinan antes de los pasos para la manipulación genética de las células. En algunas divulgaciones, la manipulación genética es o incluye la introducción de un polinucleótido heterólogo, por ejemplo que codifica un receptor recombinante. En algunas divulgaciones, la introducción es o incluye pasos para la transducción, como con espinoculación y opcionalmente incubación posterior en presencia del vector viral. En algunas divulgaciones, el polinucleótido heterólogo se introduce mediante cualquier método divulgado en la presente, por ejemplo en la Sección III.B. En divulgaciones particulares, las células T CD57-CD4+ y las células T CD57-CD8+ se estimulan, por ejemplo mediante cualquier método divulgado en la presente, por ejemplo en la Sección III.A, antes de ser manipuladas genéticamente.
En algunas divulgaciones, la manipulación genética se realiza (a) incubando poblaciones de células T CD57-enriquecidas en presencia de un reactivo estimulador capaz de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo TCR y uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras generando de este modo células T estimuladas; (b) introduciendo un polinucleótido heterólogo en las células T estimuladas de la primera y segunda poblaciones enriquecidas mediante la transducción de las células T estimuladas con un vector viral que contenga un polinucleótido heterólogo para generar células T transformadas; (c) cultivando las células T transformadas en condiciones que promuevan la proliferación o expansión de las células T transformadas; y (d) cosechando o recogiendo las células T expandidas.
En algunas divulgaciones, un método para manipular genéticamente células T es o incluye pasos que seleccionan o eliminan células CD57+ de una muestra biológica, y luego seleccionan por separado células T CD4+ y células T CD8+ de la población seleccionada negativamente para CD57, como para generar una población de células T CD57-CD4+ enriquecidas y una población de células T CD57-CD8+ enriquecidas. En divulgaciones particulares, las poblaciones separadas de células T CD57-CD4+ enriquecidas y células T CD57-CD8+ enriquecidas se obtienen por manipulan genéticamente por separado o se combinan antes de uno o más pasos para la manipulación genética. En ciertas divulgaciones, las células T CD57- CD4+ y las células T CD57-CD8+ se incuban en presencia de un reactivo estimulador, por ejemplo una perla paramagnética conjugada con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador es o incluye una partícula oligomérica de muteína de estreptavidina con Fabs anti-CD3 y anti-CD28 unidos reversiblemente, para estimular las células T antes de los pasos para introducir un polinucleótido heterólogo que codifica un receptor recombinante. En algunas divulgaciones, las células T CD57- CD4+ estimuladas y las células T CD57-CD8+ se transducen con un virus que porta el polinucleótido heterólogo, como mediante pasos que incluyen espinoculación y/o incubación en presencia del virus, como para generar células T CD57-CD4+ y células T CD57-CD8+ transformadas.
En algunas divulgaciones, un método para manipular genéticamente células T es o incluye pasos para seleccionar o eliminar células CD57+ de una muestra biológica, y después seleccionar por separado células T CD3+ de la población seleccionada negativamente para CD57, como para generar una población de células T CD57-CD3+ enriquecidas. En ciertas divulgaciones, las células T CD57-CD3+ se incuban en presencia de un reactivo estimulador, por ejemplo una perla paramagnética conjugada con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. En divulgaciones particulares, el reactivo estimulador es o incluye una partícula oligomérica de muteína de estreptavidina con Fabs anti-CD3 y anti-CD28 unidos reversiblemente, para estimular las células T antes de los pasos para introducir un polinucleótido heterólogo que codifica un receptor recombinante. En algunas divulgaciones, las células T CD57-CD3+ estimuladas se transducen con un virus portador del polinucleótido heterólogo, por ejemplo mediante pasos que incluyen espinoculación y/o incubación en presencia del virus, para generar células T CD57-CD3+ transformadas.
En algunas divulgaciones, las células T transformadas se cultivan en condiciones para promover la proliferación o expansión de las células T transformadas, por ejemplo en presencia de citoquinas como IL-2, IL-7 o IL-15. En algunas divulgaciones, las células T transformadas se cultivan hasta que las células alcanzan una expansión de por lo menos 3 veces, 4 veces o 5 veces. En algunas divulgaciones, las células se cultivan hasta que las células alcanzan una expansión de por lo menos 3 veces, 4 veces o 5 veces.
En ciertas divulgaciones, las células expandidas se recogen o cosechan, por ejemplo para ser formuladas para crioprotección y almacenamiento, o para su administración a un sujeto como terapia celular. En ciertas divulgaciones, se recogen o cosechan las células transformadas.
En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados se usan en relación con la generación o producción con éxito de composiciones de salida de células T manipuladas que son adecuadas para su uso en terapia celular. En algunas divulgaciones, una composición de salida se genera con éxito si las células de la composición alcanzan el umbral de recuento celular, densidad y/o expansión durante el cultivo. En divulgaciones particulares, los métodos divulgados tienen por lo menos un 80%, por lo menos un 81%, por lo menos un 82%, por lo menos un 83%, por lo menos un 84%, por lo menos un 85%, por lo menos un 86%, por lo menos un 87%, por lo menos un 88%, por lo menos un 89%, por lo menos un 90%, por lo menos un 91%, por lo menos un 92%, por lo menos un 93%, por lo menos un 94%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, o por lo menos un 99% de probabilidad de generar o producir con éxito una población de células T adecuada para una terapia celular, por ejemplo, a partir de una población inicial de células T enriquecidas o de una muestra biológica.
En ciertas divulgaciones, la población de células T enriquecidas generadas a partir de los métodos divulgados para su uso en una terapia celular son activas y se expanden, y/o son capaces de activación y expansión, in vivo, cuando se administran a un sujeto. En divulgaciones particulares, las células muestran rasgos y/o características que indican o se asocian con eficacia, actividad y/o expansión in vivo. Por ejemplo en algunas divulgaciones, tales rasgos o características pueden incluir la expresión de una proteína, como una proteína de superficie, que está asociada con la activación, proliferación y/o expansión tras la administración a un sujeto in vivo.
En ciertas divulgaciones, las poblaciones de células T enriquecidas que se generan o producen mediante los métodos divulgados, por ejemplo para su uso en una terapia celular, tienen una mayor expresión de CD25 que las células que se generan o producen mediante el proceso alternativo y/o ejemplar (por ejemplo un proceso de estimulación, manipulación y/o cultivo de poblaciones de células T que contienen frecuencias más altas de células T CD57+). En algunas divulgaciones, las células T de una población que se genera o produce mediante los métodos divulgados tienen una mayor expresión de CD25 que las células T que se generan o producen mediante un proceso alternativo y/o ejemplar. En algunas divulgaciones, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 100%, de las células T de una población generada por el proceso divulgado son positivas para la tinción de CD25, por ejemplo expresan una cantidad detectable de c D25. En divulgaciones particulares, la composición de salida contiene una mayor frecuencia de células que son positivas para CD25 que una composición de células producidas o generadas mediante el proceso alternativo y/o ejemplar. En algunas divulgaciones, las células de la población expresan por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 150%, por lo menos 1 vez, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces o por lo menos 5 veces más<c>D25, por ejemplo en comparación con las células producidas o generadas mediante el proceso alternativo y/o ejemplar.
En ciertas divulgaciones, las poblaciones de células T enriquecidas que son generadas o producidas mediante los métodos divulgados, por ejemplo para su uso en una terapia celular, tienen mayor expresión de CD27 que las células que son generadas o producidas por el proceso alternativo y/o ejemplar (por ejemplo un proceso de estimulación, manipulación y/o cultivo de poblaciones de células T que contienen mayores frecuencias de células T CD57+). En divulgaciones particulares, las células T de una población que se genera o produce mediante los métodos divulgados tienen una mayor expresión de CD27 que las células T que se generan o producen mediante un proceso alternativo y/o ejemplar. En ciertas divulgaciones, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%,por lo menos el 100%, de las células T de una población generada mediante el proceso divulgado son positivas para la tinción de CD27, por ejemplo expresan una cantidad detectable de CD27. En divulgaciones particulares, la composición de salida contiene una mayor frecuencia de células que son positivas para CD27 que una composición de células producidas o generadas mediante el proceso alternativo y/o ejemplar. En algunas divulgaciones, las células de la población expresan por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 150%, por lo menos 1 vez, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, o por lo menos 5 veces, más CD25, por ejemplo en comparación con las células producidas o generadas mediante el proceso alternativo y/o ejemplar.
En divulgaciones particulares, las poblaciones de células T enriquecidas que se generan o producen mediante los métodos divulgados, por ejemplo para su uso en una terapia celular, tienen una mayor expresión de CD28 que las células que se generan o producen mediante el proceso alternativo y/o ejemplar (por ejemplo un proceso de estimulación, manipulación y/o cultivo de poblaciones de células T que contienen frecuencias más altas de células T CD57+). En algunas divulgaciones, las células T de una población que se genera o produce mediante los métodos divulgados tienen una mayor expresión de CD28 que las células T que se generan o producen mediante un proceso alternativo y/o ejemplar. En ciertas divulgaciones, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%,por lo menos el 100%, de las células T de una población generada mediante el proceso divulgado son positivas para la tinción de CD28, por ejemplo expresan una cantidad detectable de CD28. En algunas divulgaciones, la composición de salida contiene una mayor frecuencia de células que son positivas para CD28 que una composición de células producidas o generadas mediante el proceso alternativo y/o ejemplar. En algunas divulgaciones, las células de la población expresan por lo menos un 20%, por lo menos un 30%, por lo menos un 40%, por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 100%, por lo menos un 150%, por lo menos 1 vez, por lo menos 2 veces, por lo menos 3 veces, por lo menos 4 veces, o por lo menos 5 veces, más CD28, por ejemplo en comparación con las células producidas o generadas mediante el proceso alternativo y/o ejemplar.
En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados se usan en relación con la generación o producción con éxito de composiciones de células T manipuladas que son adecuadas para su uso en terapia celular. En algunas divulgaciones, una composición se genera con éxito si las células de la composición alcanzan un recuento, densidad y/o expansión celular objetivo durante el cultivo.
En divulgaciones particulares, los métodos divulgados tienen por lo menos un 80%, por lo menos un 81%, por lo menos un 82%, por lo menos un 83%, por lo menos un 84%, por lo menos un 85%, por lo menos un 86%, por lo menos un 87%, por lo menos un 88%, por lo menos un 89%, por lo menos un 90%, por lo menos un 91%, por lo menos un 92%, por lo menos un 93%, por lo menos un 94%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, o por lo menos un 99% de probabilidad o posibilidad de generar o producir con éxito una población de células T enriquecidas adecuadas para una terapia celular. En ciertas divulgaciones, la probabilidad está entre el 85% y el 100%, entre el 90% y el 95%, o entre el 92% y el 94%. En ciertas divulgaciones, los métodos divulgados generan o producen con éxito una población de células T enriquecidas adecuadas para una terapia celular de por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 81%, por lo menos un 82%, por lo menos un 83%, por lo menos un 84%, por lo menos un 85%, por lo menos un 86%, por lo menos un 87%, por lo menos un 88%, por lo menos un 89%, por lo menos un 90%, por lo menos un 91%, por lo menos un 92%, por lo menos un 93%, por lo menos un 94%, por lo menos un 95%, por lo menos un 96%, por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, o por lo menos un 99% de las muestras o poblaciones de células T CD57- enriquecidas.
En ciertas divulgaciones, la duración total del proceso divulgado para generar células manipuladas, desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células es, es de aproximadamente o es de menos de 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 72 horas, 84 horas, 96 horas, 108 horas o 120 horas. En ciertas divulgaciones, la duración total del proceso divulgado para generar células manipuladas, desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células es, es de aproximadamente o es de menos de 1,5 días, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días. En algunas divulgaciones, la duración total del proceso divulgado para generar células manipuladas, desde el inicio de la estimulación hasta la recogida, cosecha o formulación de las células es de entre o entre aproximadamente 36 horas y 120 horas, 48 horas y 96 horas, o 48 horas y 72 horas, inclusive, o de entre o entre aproximadamente 1,5 días y 5 días, 2 días y 4 días, o 2 días y 3 días, inclusive. En divulgaciones particulares, la cantidad de tiempo para completar el proceso divulgado medido desde el inicio de la incubación hasta la cosecha, recogida o formulación de las células es, es de aproximadamente o es de menos de 48 horas, 72 horas o 96 horas, o es, es de aproximadamente o es de menos de 2 días, 3 días o 4 días. En divulgaciones particulares, la cantidad de tiempo para completar el proceso divulgado medido desde el inicio de la incubación hasta la cosecha, recogida o formulación de las células es de 48 horas ± 6 horas, 72 horas ± 6 horas o 96 horas ± 6 horas.
En algunas divulgaciones, la incubación, se completa entre o entre aproximadamente 24 horas y 120 horas, 36 horas y 108 horas, 48 horas y 96 horas, o 48 horas y 72 horas, inclusive, después del inicio de la estimulación. En algunas divulgaciones, la incubación se completa en, aproximadamente, o en el plazo de 120 horas, 108 horas, 96 horas, 72 horas, 48 horas, o 36 horas desde el inicio de la estimulación. En divulgaciones particulares, la incubación se completa después de 24 horas ± 6 horas, 48 horas ± 6 horas, o 72 horas ± 6 horas. En algunas divulgaciones, la incubación se completa entre o entre aproximadamente un día y 5 días, 1,5 días y 4,5 días, 2 días y 4 días, o 2 días y 3 días, inclusive, después del inicio de la estimulación. En algunas divulgaciones, la incubación se completa en, aproximadamente, o en el plazo de 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, o 1,5 días desde el inicio de la estimulación.
En algunas divulgaciones, todo el proceso se realiza con una única población de células T enriquecidas, por ejemplo células T CD4+ y CD8+ o células CD3+. En ciertas divulgaciones, el proceso se realiza con dos o más poblaciones de entrada de células T enriquecidas (por ejemplo células CD4 y CD8) que se combinan antes y/o durante el proceso para generar o producir una única población de salida de células T enriquecidas. En algunas divulgaciones, las células T enriquecidas son o incluyen células T manipuladas, por ejemplo células T transducidas para expresar un receptor recombinante.
En algunas divulgaciones, una población de salida, por ejemplo una población de células T manipuladas, se genera (i) incubando una población de entrada de o que contiene células T en condiciones de estimulación durante entre o entre aproximadamente 18 y 30 horas, inclusive, (ii) introduciendo un polinucleótido heterólogo o recombinante que codifica un receptor recombinante en células T de la población estimulada, (iii) incubando las células, y luego (iv) recogiendo o cosechando las células incubadas.
En algunas divulgaciones, las células se recogen o cosechan en el plazo de entre 36 y 108 horas o entre 1,5 días y 4,5 días después de que se haya iniciado la incubación en condiciones estimuladoras. En divulgaciones particulares, las células se recogen o cosechan en el plazo de 48 horas o dos días después de que las células T transformadas (por ejemplo manipuladas genéticamente, transducidas o transfectadas) alcancen un número de copias del vector integrado (iVCN) por genoma estable que no aumente ni disminuya en más del 20% en un plazo de 24 a 48 horas o de uno a dos días. En algunas divulgaciones, la integración se considera estable cuando el iVCN medido de una población celular está dentro o dentro de aproximadamente el 20%, 15%, 10% o 5% del número total de copias del vector (VCN) medido en la población. Las divulgaciones particulares contemplan que para lograr una integración estable, las células deben incubarse durante, durante aproximadamente, o durante por lo menos 48 horas, 60 horas, o 72 horas, o un día, 2 días, o 3 días, después de que el vector viral se haya puesto en contacto o se haya introducido en las células. En algunas divulgaciones, la integración estable se produce en el plazo de o con aproximadamente 72 horas de la incubación. En algunas divulgaciones, las células se recogen o cosechan en un momento en que el número total de células T transformadas es igual o inferior al número total de células de la población de entrada. En varias divulgaciones, las células se recogen o cosechan en un momento antes de que las células de la población de entrada se hayan duplicado más de tres, dos o una veces.
En ciertas divulgaciones, una población de salida, por ejemplo una población de células T manipuladas, se genera (i) incubando una población de entrada que comprende células T en condiciones de estimulación durante entre 18 y 30 horas, inclusive, en presencia de un reactivo estimulador, por ejemplo un reactivo estimulador descrito en la presente, (ii) transduciendo las células T estimuladas con un vector viral que codifica un receptor recombinante, como por espinoculación de las células T estimuladas en presencia del vector viral, (iii) incubando las células T transducidas en condiciones estáticas durante entre o entre 18 horas y 96 horas, inclusive, y (iv) cosechando las células T de la población transformada en un plazo de entre o entre aproximadamente 36 y 108 horas después de que se haya iniciado la incubación en condiciones de estimulación.
En algunas divulgaciones, el proceso asociado con los métodos divulgados se compara con un proceso alternativo. Por ejemplo en algunas divulgaciones, los métodos divulgados en la presente se comparan con un proceso alternativo que contiene un paso para expandir las células. En divulgaciones particulares, el proceso alternativo puede diferir en uno o más aspectos específicos, pero por lo demás contiene características, aspectos, pasos, etapas, reactivos y/o condiciones similares o iguales al proceso asociado con los métodos divulgados. En algunas divulgaciones, el proceso alternativo es similar al proceso asociado con los métodos divulgados, por ejemplo carece o no incluye expansión, pero difiere de una manera que incluye, pero no se limita a, uno o más de; diferentes reactivos y/o formulaciones de medios; presencia de suero durante la incubación, transducción, transfección, y/o cultivo; diferente composición celular de la población de entrada, por ejemplo proporción de células T CD4+ a CD8+; condiciones de estimulación diferentes y/o un reactivo estimulador diferente; proporción diferente de reactivo estimulador a células; vector y/o método de transducción diferente; momento u orden diferente para incubar, transducir y/o transfectar las células; ausencia o diferencia de una o más citoquinas recombinantes presentes durante la incubación o transducción (por ejemplo citoquinas diferentes o concentraciones diferentes), o momento diferente para la cosecha o recogida de las células.
En algunas divulgaciones, la duración o cantidad de tiempo requerido para completar el proceso divulgado, medido desde el aislamiento, enriquecimiento y/o selección de las células de entrada (por ejemplo células T CD4+ o CD8+) a partir de una muestra biológica hasta el momento en que se recogen, formulan y/o crioprotegen las células de salida es, es de aproximadamente o es menor de 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días o 10 días. En algunas divulgaciones, las células aisladas, seleccionadas o enriquecidas no se crioprotegen antes de la estimulación, y la duración o cantidad de tiempo necesario para completar el proceso divulgado, medido desde el aislamiento, enriquecimiento y/o selección de las células de entrada (hasta el momento en que se recogen, formulan y/o crioprotegen las células de salida) es, es de aproximadamente o es de menos de 48 horas, 72 horas, 96 horas o 120 horas, o 2 días, 3 días, 4 días o 5 días.
En ciertas divulgaciones, los procesos divulgados se realizan en una población de células, por ejemplo células T CD4+ y CD8+ o células CD3+, que se aislaron, enriquecieron o seleccionaron a partir de una muestra biológica. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados pueden producir o generar una composición de células T manipuladas a partir de una muestra biológica obtenida de un sujeto en un periodo de tiempo más corto en comparación con otros métodos o procesos. En algunas divulgaciones, los métodos divulgados pueden producir o generar células T manipuladas, incluyendo cualquiera o todas las veces en que las muestras biológicas, o las células enriquecidas, aisladas o seleccionadas se crioconservan y almacenan antes de los pasos para la estimulación o transducción, en el plazo de o en el plazo de aproximadamente 10 días, 9 días, 8 días, 7 días, 6 días, 5 días, 4 días, 3 días, 2 días, o en un plazo de aproximadamente 120 horas, 96 horas, 72 horas o 48 horas, desde el momento en que se recoge una muestra biológica de un sujeto hasta el momento en que se recogen, cosechan o formulan las células T manipuladas (por ejemplo, para crioconservación o administración). En divulgaciones particulares, los métodos divulgados pueden producir o generar células T manipuladas, incluyendo cualquiera o todos los momentos en los que las muestras biológicas, o las células enriquecidas, aisladas o seleccionadas se crioconservan y almacenan antes de los pasos para la estimulación o transducción, en un plazo de entre o entre aproximadamente 6 días y 8 días, inclusive, desde que la muestra biológica se recoge de un sujeto hasta que se recogen, cosechan o formulan las células T manipuladas.
IV. POLINUCLEÓTIDOS HETERÓLOGOS QUE CODIFICAN PROTEÍNAS RECOMBINANTES
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados son o incluyen la introducción de un polinucleótido heterólogo en células de una población enriquecida para células CD57-. En algunas divulgaciones, el polinucleótido heterólogo codifica una proteína recombinante. Tales proteínas recombinantes pueden incluir receptores recombinantes, como cualquiera de los descritos en la Sección III.A. La introducción de los polinucleótidos, por ejemplo polinucleótidos heterólogos o recombinantes, que codifican la proteína recombinante en la célula puede llevarse a cabo usando cualquiera de una serie de vectores conocidos. Tales vectores incluyen sistemas virales, incluyendo lentivirales y gammaretrovirales. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de polinucleótidos heterólogos que codifican los receptores, incluyendo mediante transducción viral, por ejemplo retroviral o lentiviral. En algunas divulgaciones, se manipula genéticamente una población de células estimuladas, como para introducir un polinucleótido heterólogo o recombinante que codifica un receptor recombinante, generando de este modo una población de células transformadas (también denominada en la presente población transformada de células).
En ciertas divulgaciones, se introduce en las células un polinucleótido que codifica la proteína recombinante, por ejemplo un receptor recombinante. En ciertas divulgaciones, el polinucleótido o molécula de ácido nucleico es heterólogo para las células. En divulgaciones particulares, el polinucleótido heterólogo no es nativo de las células. En ciertas divulgaciones, la molécula de ácido nucleico o polinucleótido heterólogos codifica una proteína, por ejemplo una proteína recombinante que la célula no expresa de manera nativa. En divulgaciones particulares, la molécula de ácido nucleico o polinucleótido heterólogos es o contiene una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra en la célula antes del contacto o la introducción.
En divulgaciones particulares, el polinucleótido heterólogo codifica una proteína recombinante. En ciertas divulgaciones, la proteína recombinante es un receptor recombinante. En algunas divulgaciones, la proteína recombinante es un receptor de antígeno recombinante, como un TCR recombinante o un receptor de antígeno quimérico (CAR).
A. Receptores recombinantes
En algunas divulgaciones, se divulgan células manipuladas, como células T CD57-, que expresan o están manipuladas para que expresen uno o más receptores recombinantes. Entre los receptores se encuentran receptores de antígenos y receptores que contienen uno o más componentes de los mismos. Los receptores recombinantes pueden incluir receptores quiméricos, como los que contienen dominios de unión a ligando o fragmentos de unión de los mismos y dominios o regiones de señalización intracelular, receptores antigénicos funcionales no TCR, receptores antigénicos quiméricos (CAR), receptores de células T (TCR), como TCR recombinantes o transgénicos, receptor quimérico de autoanticuerpos (CAAR) y componentes de cualquiera de los anteriores. El receptor recombinante, como un CAR, generalmente incluye el dominio de unión al antígeno (o ligando) extracelular enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, en algunas divulgaciones mediante conectores y/o dominio o dominios transmembrana. En algunas divulgaciones, las células manipuladas expresan dos o más receptores que contienen diferentes componentes, dominios o regiones. En algunas divulgaciones, dos o más receptores permiten la regulación o el control espacial o temporal de la especificidad, la actividad, la unión al antígeno (o ligando), la función y/o la expresión de los receptores recombinantes.
1. Receptores de antígenos quiméricos (CAR)
En algunas divulgaciones de los métodos y usos divulgados, los receptores quiméricos, como un receptor de antígeno quimérico, contienen uno o más dominios que combinan un dominio de unión a ligando (por ejemplo anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que proporciona especificidad para un antígeno deseado (por ejemplo antígeno tumoral) con dominios de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular es una porción de dominio intracelular estimulante o activador, como un dominio estimulante o activador de células T, que proporciona una señal de activación primaria o una señal primaria. En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular contiene o contiene adicionalmente un dominio de señalización coestimulador para facilitar funciones efectoras. En algunas divulgaciones, los receptores quiméricos, cuando se introducen por manipulación genética en células inmunitarias, pueden modular la actividad de las células T y, en algunos casos divulgados en la presente, pueden modular la diferenciación u homeostasis de las células T, dando como resultado células obtenidas por manipulación genética con longevidad, supervivencia y/o persistencia mejoradasin vivo,como para su uso en métodos de terapia celular adoptiva.
Los receptores de antígeno ejemplares, incluyendo los CAR, y los métodos para la manipulación e introducción de tales receptores en células, incluyen los descritos, por ejemplo en los números de publicación de solicitud de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 números de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de Estados Unidos N°: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, y 8.479.118, y número de solicitud de Patente Europea EP2537416,y/o los descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. Abril 2013; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., octubre 2012; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, marzo 2012 18(2): 160-75. En algunas divulgaciones, los receptores de antígeno incluyen un CAR como se describe en la Patente de Estados Unidos N°: 7.446.190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO/2014055668 A1. Entre los ejemplos de CAR se incluyen los CAR divulgados en cualquiera de las publicaciones mencionadas, como WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente de Estados Unidos N° 7,446,190, Patente de Estados Unidos N° 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother.
35(9): 689-701; y Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Consultar también WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente de Estados Unidos N° 7,446,190, y Patente de Estados Unidos N° 8,389,282.
Los receptores quiméricos, como los CAR, generalmente incluyen un dominio extracelular de unión a antígeno, como una porción de una molécula de anticuerpo, generalmente una región de cadena pesada variable (Vh) y/o una región de cadena ligera variable (V<l>) del anticuerpo, por ejemplo un fragmento de anticuerpo scFv.
En algunas divulgaciones, el antígeno al que se dirige el receptor es un polipéptido. En algunas divulgaciones, es un carbohidrato u otra molécula. En algunas divulgaciones, el antígeno se expresa selectivamente o se sobreexpresa en las células de la enfermedad o afección, por ejemplo el tumor o las células patógenas, en comparación con las células o tejidos normales o no diana. En otras divulgaciones, el antígeno se expresa en las células normales y/o se expresa en las células manipuladas.
En algunas divulgaciones, el antígeno al que se dirige el receptor es o incluye avp6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículos, el antígeno de cáncer de testículos 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), el antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, la ciclina A2, el ligando 1 de quimiocinas con motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, cD l71 , proteoglicano 4 de sulfato de condroitina (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógenos, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como receptor Fc homólogo 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), una proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glypican-3 (GPC3), Receptor 5D acoplado a proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor IL-22 alfa(IL-22Ra), receptor IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), CE7 epítopo de L1-CAM, miembro A de la familia 8 que contiene repetición rica en leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (M uC l), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 de asesinas naturales (NKG2D), melanina A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno expresado preferencialmente de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor huérfano 1 similar a receptor tirosina quinasa (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72), proteína 1 relacionada con la tirosinasa (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína 2 relacionada con la tirosinasa (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. En algunas divulgaciones los antígenos a los que se dirigen los receptores incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, como cualquiera de una serie de marcadores de células B conocidos. En algunas divulgaciones, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.
En algunas divulgaciones, el antígeno es o incluye un antígeno específico de un patógeno o un antígeno expresado por un patógeno. En algunas divulgaciones, el antígeno es un antígeno viral (como un antígeno viral del VIH, VHC, VHB, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.
En algunas divulgaciones, el antígeno o dominio de unión a antígeno es CD19. En algunas divulgaciones, el scFv contiene un VH y un VL derivados de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico de CD19. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a CD19 es un anticuerpo derivado de ratón como FMC63 y SJ25C1. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, por ejemplo como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US 2016/0152723.
En algunas divulgaciones, el scFv se deriva de FMC63. FMC63 se refiere generalmente a un anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón criado contra células Nalm-1 y -16 que expresan CD19 de origen humano (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). En algunas divulgaciones, el anticuerpo FMC63 comprende la CDRH1 y H2 expuestas en las SEQ ID No : 38 y 39, respectivamente, y la CDRH3 expuesta en la SEQ ID NO: 40 o 54 y la CDRL1 expuesta en la SEQ ID NO: 35 y la CDR L2 expuesta en la SEQ ID NO: 36 o 55 y la CDR L3 expuesta en la SEQ ID NO: 37 o 56. En algunas divulgaciones, el anticuerpo FMC63 comprende la región variable de cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41 y la región variable de cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42.
En algunas divulgaciones, el scFv comprende una cadena ligera variable que contiene la secuencia CDRL1 de la SEQ ID NO:35, una secuencia CDRL2 de la SEQ ID NO:36, y una secuencia CDRL3 de la SEQ ID NO:37 y/o una cadena pesada variable que contiene una secuencia CDRH1 de la SEQ ID NO:38, una secuencia CDRH2 de la SEQ ID NO:39, y una secuencia CDRH3 de la SEQ ID NO:40. En algunas divulgaciones, el scFv comprende una región de cadena pesada variable expuesta en la SEQ ID NO:41 y una región de cadena ligera variable expuesta en la SEQ ID NO:42. En algunas divulgaciones, las cadenas pesada y ligera variables están conectadas por un conector. En algunas divulgaciones, el conector se expone en la SEQ ID<n>O:58. En algunas divulgaciones, el scFv comprende, en orden, una Vh, un conector, y una Vl. En algunas divulgaciones, el scFv comprende, en orden, una Vl, un conector, y una Vh. En algunas divulgaciones, el scFv está codificado por una secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:43 o una secuencia que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:43. En algunas divulgaciones, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:43 o una secuencia que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:43.
En algunas divulgaciones, el scFv se deriva de SJ25C1. SJ25C1 es un anticuerpo monoclonal de IgG1 de ratón criado contra células Nalm-1 y -16 que expresa CD19 de origen humano (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). En algunas divulgaciones, el anticuerpo SJ25C1 comprende las secuencias de CDRH1, H2 y H3 expuestas en las SEQ ID NO: 47-49, respectivamente, y las secuencias de CDRL1, L2 y L3 expuestas en las SEQ ID NO: 44-46, respectivamente. En algunas divulgaciones, el anticuerpo SJ25C1 comprende la región variable de cadena pesada (V<h>) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50 y la región variable de cadena ligera (V<l>) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.
En algunas divulgaciones, el scFv comprende una cadena ligera variable que contiene la secuencia CDRL1 de la SEQ ID NO:44, una secuencia CDRL2 de la SEQ ID NO: 45, y una secuencia CDRL3 de la SEQ ID NO:46 y/o una cadena pesada variable que contiene una secuencia CDRH1 de la SEQ ID NO:47, una secuencia CDRH2 de la SEQ ID NO:48, y una secuencia CDRH3 de la SEQ ID NO:49. En algunas divulgaciones, el scFv comprende una región de cadena pesada variable expuesta en la SEQ ID NO:50 y una región de cadena ligera variable expuesta en la SEQ ID NO:51. En algunas divulgaciones, la cadena pesada variable y la cadena ligera variable están conectadas por un conector. En algunas divulgaciones, el conector se expone en la SEQ ID NO:52. En algunas divulgaciones, el scFv comprende, en orden, una Vh, un conector, y una Vl. En algunas divulgaciones, el scFv comprende, en orden, una Vl, un conector, y una Vh. En algunas divulgaciones, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:53 o una secuencia que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:53.
En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento y un dominio de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv.
En algunas divulgaciones, la porción de anticuerpo del receptor recombinante, por ejemplo CAR, incluye además por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, como una región bisagra, por ejemplo una región bisagra de IgG4, y/o una región C<h>1/C<l>y/o Fc. En algunas divulgaciones, la región constante o porción es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunas divulgaciones, la porción de la región constante sirve como región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno, por ejemplo scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede tener una longitud que proporcione una mayor capacidad de respuesta de la célula tras la unión al antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador. Los espaciadores ejemplares incluyen, entre otros, los descritos en Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, la solicitud de patente internacional número de publicación WO2014031687, la Patente de Estados Unidos N° 8.822.647 o la solicitud publicada US2014/0271635.
En algunas divulgaciones, la región constante o porción es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCP (expuesta en la SEQ ID NO: 1), y está codificado por la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4. En algunas divulgaciones, la región constante o porción es de IgD. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOS: 1, 3, 4 o 5. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene la secuencia expuesta en la SEQ ID NOS: 27-34. En algunas divulgaciones, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 27-34.
En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno comprende un dominio intracelular enlazado directa o indirectamente al dominio extracelular. En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que enlaza el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un ITAM. Por ejemplo en algunas divulgaciones, el dominio de reconocimiento de antígeno (por ejemplo dominio extracelular) generalmente está enlazado a uno o más componentes de señalización intracelular, como componentes de señalización que imitan la activación a través de un complejo receptor de antígeno, como un complejo TCR, en el caso de un CAR, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. En algunas divulgaciones, el receptor quimérico comprende un dominio transmembrana enlazado o fusionado entre el dominio extracelular (por ejemplo scFv) y el dominio de señalización intracelular. Por tanto, en algunas divulgaciones, el componente de unión a antígeno (por ejemplo anticuerpo) está enlazado a uno o más dominios transmembrana y de señalización intracelular.
En una divulgación, se usa un dominio transmembrana que se asocia de manera natural con uno de los dominios del receptor, por ejemplo CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas proteínas de membrana de superficie o unas diferentes para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.
En algunas divulgaciones, el dominio transmembrana procede de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, en algunas divulgaciones el dominio se deriva de cualquier proteína de membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen las derivadas de (es decir, comprenden por lo menos la región o regiones transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, en algunas divulgaciones el dominio transmembrana es sintético. En algunas divulgaciones, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrófobos como leucina y valina. En algunas divulgaciones, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunas divulgaciones, la unión se realiza mediante conectores, espaciadores y/o dominio o dominios transmembrana. En algunas divulgaciones, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28.
En algunas divulgaciones, el dominio extracelular y el dominio transmembrana pueden estar enlazados directa o indirectamente. En algunas divulgaciones, el dominio extracelular y el transmembrana están enlazados por un espaciador, como cualquiera descrito en la presente. En algunas divulgaciones, el receptor contiene la porción extracelular de la molécula de la que se deriva el dominio transmembrana, como una porción extracelular de CD28.
Entre los dominios de señalización intracelular están los que imitan o se aproximan a una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador, y/o una señal a través de un receptor coestimulador solo. En algunas divulgaciones, está presente un conector oligopéptido corto, por ejemplo un conector de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contenga glicinas y serinas, por ejemplo un doblete de glicina-serina, y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR.
En algunas divulgaciones, la activación de células T se describe como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (secuencias de señalización citoplasmática primaria), y las que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplasmática secundaria). En algunas divulgaciones, el CAR incluye uno o ambos de dichos componentes de señalización.
El receptor, por ejemplo el CAR, incluye generalmente por lo menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, el CAR incluye una secuencia de señalización citoplasmática primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las secuencias de señalización citoplasmática primaria que actúan de manera estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora o ITAM. Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias incluyen las derivadas de la cadena CD3 zeta, FcR gamma, CD3 gamma, CD3 delta y CD3 epsilon. En algunas divulgaciones, la molécula o moléculas de señalización citoplasmática en el CAR contienen un dominio de señalización citoplasmática, una porción del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta.
En algunas divulgaciones, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo TCR, como una cadena TCR de CD3 que media la activación de células T y la citotoxicidad, por ejemplo la cadena CD3 zeta. Así, en algunas divulgaciones, la porción de unión a antígeno está enlazada a uno o más módulos de señalización celular. En algunas divulgaciones, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana de CD3, dominios de señalización intracelular de CD3 y/u otros dominios transmembrana de CD. En algunas divulgaciones, el receptor, por ejemplo CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales como receptor Fc y, CD8, CD4, CD25, o CD 16. Por ejemplo en algunas divulgaciones, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor Fc y y CD8, CD4, CD25 o CD16.
En algunas divulgaciones, tras la ligadura del CAR u otro receptor quimérico, el dominio citoplasmático o el dominio de señalización intracelular del receptor activa por lo menos una de las funciones efectoras o respuestas normales de la célula inmunitaria, por ejemplo la célula T manipulada para que exprese el CAR. Por ejemplo en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T-coadyuvante, como la secreción de citoquinas u otros factores. En algunas divulgaciones, se usa una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo si transduce la señal de función efectora. En algunas divulgaciones, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de células T (TCR), y en algunas divulgaciones también las de correceptores que en el contexto natural actúan en concierto con tales receptores para iniciar la transducción de señales tras el acoplamiento del receptor de antígeno.
En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no sólo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Por tanto, en algunas divulgaciones, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otras divulgaciones, el CAR no incluye un componente para generar una señal coestimuladora. En algunas divulgaciones, se expresa en la misma célula un CAR adicional y proporciona el componente para generar la señal secundaria o coestimuladora.
En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. En algunas divulgaciones, el CAR incluye un dominio de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor coestimulador, como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. En algunas divulgaciones, el mismo CAR incluye tanto los componentes activadores como los coestimuladores. En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno quimérico contiene un dominio intracelular derivado de una molécula coestimuladora de células T o una variante funcional de la misma, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 41BB.
En algunas divulgaciones, el dominio activador está incluido dentro de un CAR, mientras que el componente coestimulador está divulgado por otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunas divulgaciones, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores, CAR coestimuladores, ambos expresados en la misma célula (consultar la WO2014/055668). En algunas divulgaciones, las células incluyen uno o más CAR estimuladores o activadores y/o un CAR coestimulador. En algunas divulgaciones, las células incluyen además CAR inhibidores (iCAR, consultar Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (diciembre de 2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del asociado y/o específico para la enfermedad o afección, por lo que una señal activadora emitida a través del CAR dirigido a la enfermedad se ve disminuida o inhibida por la unión del CAR inhibidor a su ligando, por ejemplo para reducir los efectos fuera del objetivo.
En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana y de señalización de CD28 unido a un dominio intracelular de CD3 (por ejemplo CD3-zeta). En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular comprende unos dominios coestimuladores quiméricos de CD28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9), enlazados a un dominio intracelular de CD3 zeta.
En algunas divulgaciones, el CAR abarca uno o más, por ejemplo dos o más, dominios coestimuladores y un dominio de activación, por ejemplo dominio de activación primario, en la porción citoplasmática. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 y 4-1BB.
En algunas divulgaciones, el receptor de antígeno incluye además un marcador y/o las células que expresan el CAR u otro receptor de antígeno incluyen además un marcador sustituto, como un marcador de superficie celular, que puede usarse para confirmar la transducción o manipulación de la célula para que exprese el receptor. En algunas divulgaciones, el marcador incluye todo o parte (por ejemplo forma truncada) de<c>D34, un NGFR, o receptor del factor de crecimiento epidérmico, como versión truncada de tal receptor de superficie celular (por ejemplo tEGFR). En algunas divulgaciones, el ácido nucleico que codifica el marcador está enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica para una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible, por ejemplo T2A. Por ejemplo un marcador, y opcionalmente una secuencia conectora, puede ser cualquiera de los descritos en la solicitud de patente publicada N° WO2014031687. Por ejemplo el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, enlazado a una secuencia conectora, como una secuencia conectora escindible T2A.
Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (por ejemplo tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 7 o 16 o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 o 16. Una secuencia conectora T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o 17 o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 o 16. Una secuencia conectora T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 o 17 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 o 17.
En algunas divulgaciones, el marcador es una molécula, por ejemplo una proteína de la superficie celular, que no se encuentra de manera natural en las células T o que no se encuentra de manera natural en la superficie de las células T, o una parte de la misma. En algunas divulgaciones, la molécula es una molécula no propia, por ejemplo una proteína no propia, es decir, una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunitario del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.
En algunas divulgaciones, el marcador no cumple ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto aparte de ser usado como marcador para la manipulación genética, por ejemplo para seleccionar células manipuladas con éxito. En otras divulgaciones, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que ejerza algún efecto deseado, como un ligando para una célula que se va a encontrar in vivo, como una molécula coestimuladora o de punto de control inmunitario para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.
En algunos casos divulgados en la presente, los CAR se denominan CAR de primera, segunda y/o tercera generación. En algunas divulgaciones, un CAR de primera generación es aquel que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión al antígeno; en algunas divulgaciones, un CAR de segunda generación es aquel que proporciona dicha señal y una señal coestimuladora, como la que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador como CD28 o CD137; en algunas divulgaciones, un CAR de tercera generación es aquel que incluye múltiples dominios coestimuladores de diferentes receptores coestimuladores.
Por ejemplo en algunas divulgaciones, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de CD28 o una variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunas divulgaciones, el CAR contiene un anticuerpo, por ejemplo un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1BB o una variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunas de tales divulgaciones, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula de Ig, como una molécula de Ig humana, como una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, como un espaciador de sólo bisagra.
En algunas divulgaciones, el dominio transmembrana del receptor recombinante, por ejemplo, el CAR, es o incluye un dominio transmembrana de CD28 humano (por ejemplo N° de registro P01747.1) o una variante del mismo, como un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8; en algunas divulgaciones, la porción del receptor recombinante que contiene el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos o aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la misma.
En algunas divulgaciones, el componente o componentes de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo el CAR, contienen un dominio de señalización coestimuladora intracelular de CD28 humano o una variante funcional o porción del mismo, como un dominio con una sustitución LL a GG en las posiciones 186 187 de una proteína CD28 nativa. Por ejemplo el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 u 11 o una secuencia de aminoácidos que muestre por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10 u 11. En algunas divulgaciones, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización coestimuladora intracelular de 4-1BB (por ejemplo (N° de registro Q07011.1) o variante funcional o porción del mismo, como la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 12.
En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, por ejemplo el CAR, comprende un dominio de señalización estimulador de CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, como un dominio citoplasmático 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de registro: P20963.2) o un dominio de señalización de CD3 zeta como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 7.446.190 o la Patente de Estados Unidos N° 8.911.993. Por ejemplo en algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 13, 14 o 15 o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13, 14 o 15.
En algunas divulgaciones, el espaciador contiene sólo una región bisagra de una IgG, como sólo una bisagra de IgG4 o IgG1, como el espaciador sólo bisagra expuesto en la SEQ ID NO: 1. En otras divulgaciones, el espaciador es o contiene una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra derivada de IgG4, enlazada opcionalmente a un dominio Ch2 y/o C<h>3. En algunas divulgaciones, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, enlazada a los dominios C<h>2 y C<h>3, como se expone en la SEQ ID NO: 4. En algunas divulgaciones, el espaciador es una bisagra de Ig, por ejemplo una bisagra de IgG4, enlazada a un dominio Ch3 solamente, como se expone en la SEQ ID NO: 3. En algunas divulgaciones, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro conector flexible como conectores flexibles conocidos.
Por ejemplo en algunas divulgaciones, el CAR incluye un anticuerpo como un fragmento de anticuerpo, incluyendo scFv, un espaciador, como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, como una región bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de cadena pesada, como un espaciador que contiene bisagra de Ig, un dominio transmembrana que contiene todo o una porción de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización de CD3 zeta. En algunas divulgaciones, el CAR incluye un anticuerpo o fragmento, como scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra de Ig, un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta.
En algunas divulgaciones, las moléculas de ácido nucleico que codifican tales constructos de CAR incluyen además una secuencia que codifica un elemento de omisión ribosomal T2A y/o una secuencia tEGFR, por ejemplo en sentido descendente de la secuencia que codifica el CAR. En algunas divulgaciones, la secuencia codifica un elemento de omisión ribosomal T2A expuesto en la SEQ ID NO: 6 o 17, o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6 o 17. En algunas divulgaciones, las células T que expresan un receptor de antígeno (por ejemplo CAR) también pueden generarse para expresar un EGFR truncado (EGFRt) como un epítopo de selección no inmunogénico (por ejemplo mediante la introducción de un constructo que codifica el CAR y el EGFRt separados por un conmutador ribosómico T2A para que exprese dos proteínas del mismo constructo), que luego puede usarse como un marcador para detectar tales células (consultar, por ejemplo la Patente de Estados Unidos N° 8.802.374). En algunas divulgaciones, la secuencia codifica una secuencia tEGFR expuesta en la SEQ ID NO: 7 o 16, o una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 o 16. En algunos casos divulgados en la presente, el péptido, como T2A, puede hacer que el ribosoma omita (omisión de ribosoma) la síntesis de un enlace peptídico en el extremo C-terminal de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el extremo de la secuencia 2a y el siguiente péptido en sentido descendente (consultar, por ejemplo de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) y deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Se conocen muchos elementos 2A. Ejemplos de secuencias 2A que pueden usarse en los métodos y ácidos nucleicos divulgados en la presente, sin limitación, secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A, por ejemplo SEQ ID NO: 21), virus de la rinitis equina A (E2A, por ejemplo SEQ ID NO: 20), virus Thosea asigna (T2A, por ejemplo SEQ ID NO: 6 o 17), y teschovirus-1 porcino (p2a , por ejemplo SEQ ID NO: 18 o 19) como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20070116690.
Los receptores recombinantes, como los CAR, expresados por las células administradas al sujeto generalmente reconocen o se unen específicamente a una molécula que se expresa en, está asociada a y/o es específica de la enfermedad o afección o de las células de la misma que se están tratando. Tras la unión específica a la molécula, por ejemplo el antígeno, el receptor generalmente envía una señal inmunoestimuladora, como una señal inducida por ITAM, a la célula, promoviendo de este modo una respuesta inmunitaria dirigida a la enfermedad o afección. Por ejemplo en algunas divulgaciones, las células expresan un CAR que se une específicamente a un antígeno expresado por una célula o tejido de la enfermedad o afección o asociado con la enfermedad o afección.
2. Receptores de células T (TCR)
En algunas divulgaciones, las células manipuladas, como las células T, usadas en relación con los métodos, usos, artículos de fabricación o composiciones divulgados son células que expresan un receptor de células T (TCR) o una porción de unión a antígeno del mismo que reconoce un epítopo peptídico o un epítopo de células T de un polipéptido diana, como un antígeno de una proteína tumoral, vírica o autoinmune.
En algunas divulgaciones, un "receptor de células T" o "TCR" es una molécula que contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas y y 6 variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente), o porciones de unión a antígeno de las mismas, y que es capaz de unirse específicamente a un péptido unido a una molécula MHC. En algunas divulgaciones, el TCR está en la forma ap. Típicamente, los TCR que existen en las formas ap y y6 son generalmente estructuralmente similares, pero las células T que los expresan pueden tener localizaciones anatómicas o funciones distintas. Un TCR puede encontrarse en la superficie de una célula o en forma soluble. Por lo general, un TCR se encuentra en la superficie de las células T (o linfocitos T), donde generalmente es responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca los TCR completos, así como porciones de unión a antígeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunas divulgaciones, el TCR es un TCR intacto o de longitud completa, incluyendo los TCR en forma ap o y6. En algunas divulgaciones, el TCR es una porción de unión a antígeno que es menor que un TCR de longitud completa pero que se une a un péptido específico unido en una molécula MHC, como se une a un complejo MHC-péptido. En algunos casos divulgados en la presente, una porción o fragmento de unión a antígeno de un Tc R puede contener sólo una porción de los dominios estructurales de un TCR de longitud completa o intacto, pero aun así es capaz de unirse al epítopo peptídico, como un complejo MHC-péptido, al que se une el TCR completo. En algunos casos divulgados en la presente, una porción de unión a antígeno contiene los dominios variables de un TCR, como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficientes para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico. Generalmente, las cadenas variables de un TCR contienen regiones determinantes de la complementariedad implicadas en el reconocimiento del péptido, MHC y/o complejo MHC-péptido.
En algunas divulgaciones, los dominios variables del TCR contienen giros hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que generalmente son los principales contribuyentes al reconocimiento del antígeno y a las capacidades y especificidad de unión. En algunas divulgaciones, una CDR de un TCR o una combinación de las mismas forma todo o sustancialmente todo el sitio de unión a antígeno de una molécula de TCR dada. Las varias CDR dentro de una región variable de una cadena de TCR generalmente están separadas por regiones marco (FR), que generalmente muestran menos variabilidad entre moléculas de TCR en comparación con las CDR (consultar, por ejemplo Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., E<m>BO J.
7:3745, 1988; consultartambién Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En algunas divulgaciones, la CDR3 es la CDR principal responsable de la unión a antígeno o especificidad, o es la más importante entre las tres CDR en una región variable de TCR dada para el reconocimiento de antígeno, y/o para la interacción con la porción de péptido procesado del complejo péptido-MHC. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena alfa puede interactuar con la parte N-terminal de ciertos péptidos antigénicos. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena beta puede interactuar con la parte C-terminal del péptido. En algunos contextos, la CDR2 contribuye en mayor medida o es la CDR primaria responsable de la interacción con o el reconocimiento de la porción MHC del complejo MHC-péptido. En algunas divulgaciones, la región variable de la cadena p puede contener otra región hipervariable (CDR4 o HVR4), que generalmente participa en la unión al superantígeno y no en el reconocimiento del antígeno (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
En algunas divulgaciones, un TCR también puede contener un dominio constante, un dominio transmembrana y/o una cola citoplasmática corta (consultar, por ejemplo Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). En algunas divulgaciones, cada cadena del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana, y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal. En algunas divulgaciones, un TCR se asocia con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales.
En algunas divulgaciones, una cadena de TCR contiene uno o más dominios constantes. Por ejemplo la porción extracelular de una cadena TCR dada (por ejemplo cadena a o cadena p) puede contener dos dominios similares a inmunoglobulina, como un dominio variable (por ejemplo Va o Vp; típicamente los aminoácidos 1 a 116 basados en la numeración de Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) y un dominio constante (por ejemplo dominio constante de cadena a o Ca, típicamente las posiciones 117 a 259 de la cadena basada en la numeración de Kabat o dominio constante de cadena p o Cp, típicamente las posiciones 117 a 295 de la cadena basada en Kabat) adyacente a la membrana celular. Por ejemplo en algunos casos divulgados en la presente, la porción extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales a la membrana, y dos dominios variables distales a la membrana, cuyos dominios variables contienen cada uno las CDR. El dominio constante del TCR puede contener secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro, enlazando de este modo las dos cadenas del TCR. En algunas divulgaciones, un TCR puede tener un residuo de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p, de manera que el TCR contiene dos enlaces disulfuro en los dominios constantes.
En algunas divulgaciones, las cadenas TCR contienen un dominio transmembrana. En algunas divulgaciones, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos divulgados en la presente, la cadena TCR contiene una cola citoplasmática. En algunos casos divulgados en la presente, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3 y subunidades de la misma. Por ejemplo un TCR que contiene dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariantes del aparato o complejo de señalización de CD3. Las colas intracelulares de las subunidades de señalización de CD3 (por ejemplo las cadenas CD3<y>, CD36, CD3<e>y CD3Z) contienen uno o más motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptora o ITAM que intervienen en la capacidad de señalización del complejo TCR.
En algunas divulgaciones, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente y y 6) o puede ser un constructo de TCR de cadena sencilla. En algunas divulgaciones, el TCR es un heterodímero que contiene dos cadenas separadas (cadenas a y p o cadenas<y>y 6) que están enlazadas, como por un enlace disulfuro o enlaces disulfuro.
En algunas divulgaciones, el TCR puede generarse a partir de una secuencia o secuencias de TCR conocidas, como secuencias de cadenas Va,p, para las que se dispone fácilmente de una secuencia codificante sustancialmente de longitud completa. Los métodos para obtener secuencias de TCR de longitud completa, incluyendo secuencias de cadena V, a partir de fuentes celulares son bien conocidos. En algunas divulgaciones, los ácidos nucleicos que codifican el TCR pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes, como mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ácidos nucleicos que codifican el TCR dentro o aislados de una célula o células dadas, o síntesis de secuencias de ADN de TCR disponibles públicamente.
En algunas divulgaciones, el TCR se obtiene a partir de una fuente biológica, como a partir de células como de una célula T (por ejemplo célula T citotóxica), hibridomas de células T u otra fuente disponible públicamente. En algunas divulgaciones, las células T pueden obtenerse a partir de células aisladasin vivo.En algunas divulgaciones, el TCR es un TCR seleccionado Mímicamente. En algunas divulgaciones, el TCR es un TCR restringido a neoepítopos. En algunas divulgaciones, las células T pueden ser un hibridoma o clon de células T cultivadas. En algunas divulgaciones, el TCR o porción de unión a antígeno del mismo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede generarse sintéticamente a partir del conocimiento de la secuencia del TCR.
En algunas divulgaciones, el TCR se genera a partir de un TCR identificado o seleccionado a partir de la selección de una biblioteca de TCR candidatos contra un antígeno polipéptido diana, o epítopo de células T diana del mismo. Las bibliotecas de TCR pueden generarse por amplificación del repertorio de Va y Vp de células T aisladas de un sujeto, incluyendo células presentes en PBMC, bazo u otro órgano linfoide. En algunos casos divulgados en la presente, las células T pueden amplificarse a partir de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunas divulgaciones, las bibliotecas de TCR pueden generarse a partir de células CD4+ o CD8+. En algunas divulgaciones, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto normal o sano, es decir, bibliotecas de TCR normales. En algunas divulgaciones, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto enfermo, es decir, bibliotecas de TCR enfermos. En algunas divulgaciones, se usan cebadores degenerados para amplificar el repertorio génico de Va y Vp, como por RT-PCR en muestras, como células T, obtenidas de seres humanos. En algunas divulgaciones, las bibliotecas scTv pueden ensamblarse a partir de bibliotecas Va y Vp vírgenes en las que los productos amplificados se clonan o ensamblan para separarse mediante un conector. Dependiendo de la fuente del sujeto y de las células, las bibliotecas pueden ser específicas de alelos HLA. Alternativamente, en algunas divulgaciones, las bibliotecas de TCR pueden generarse por mutagénesis o diversificación de una molécula de TCR original o andamiaje. En algunas divulgaciones, los TCR se someten a evolución dirigida, como por mutagénesis, por ejemplo de la cadena a o p. En algunas divulgaciones, se alteran residuos particulares dentro de las CDR del t Cr . En algunas divulgaciones, los TCR seleccionados pueden modificarse mediante maduración por afinidad. En algunas divulgaciones, pueden seleccionarse células T específicas de antígeno, como por ejemplo mediante selección para evaluar la actividad CTL contra el péptido. En algunas divulgaciones, los TCR, por ejemplo presentes en las células T específicas de antígeno, pueden seleccionarse, por ejemplo por actividad de unión, por ejemplo afinidad o avidez particular por el antígeno.
En algunas divulgaciones, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo es uno que ha sido modificado o manipulado. En algunas divulgaciones, se usan métodos de evolución dirigida para generar TCR con propiedades alteradas, como con mayor afinidad por un complejo MHC-péptido específico. En algunas divulgaciones, la evolución dirigida se consigue mediante métodos de presentación que incluyen, pero no se limitan a, presentación en levadura (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (<2>O<0>O) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), presentación en fagos (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), o presentación en células T (Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). En algunas divulgaciones, los enfoques de presentación implican la manipulación, o modificación, de un TCR conocido, original o de referencia. Por ejemplo en algunos casos divulgados en la presente, puede usarse un TCR de tipo salvaje como plantilla para producir TCR mutagenizados en los que se mutan uno o más residuos de las CDR, y se seleccionan mutantes con una propiedad alterada deseada, como mayor afinidad por un antígeno diana deseado.
En algunas divulgaciones, se conocen o pueden identificarse fácilmente los péptidos de un polipéptido diana para su uso en la producción o generación de un TCR de interés. En algunas divulgaciones, los péptidos adecuados para su uso en la generación de TCR o porciones de unión a antígeno pueden determinarse basándose en la presencia de un motivo restringido por HLA en un polipéptido diana de interés, como un polipéptido diana descrito a continuación. En algunas divulgaciones, los péptidos se identifican usando modelos informáticos de predicción disponibles. En algunas divulgaciones, para predecir sitios de unión a MHC clase I, tales modelos incluyen, pero no se limitan a, ProPredl (Singh y Raghava (2001) Bioinformatics 17(12): 1236-1237, y SYFPEITHI (consultar Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007). En algunas divulgaciones, el epítopo restringido por MHC es HLA-A0201, que se expresa en aproximadamente el 39-46% de todos los caucásicos y, por lo tanto, representa una elección adecuada de antígeno MHC para su uso en la preparación de un TCR u otra molécula de unión a péptido MHC.
Se conocen los motivos de unión de HLA-A0201 y los sitios de escisión para proteasomas e inmunoproteasomas mediante modelos informáticos de predicción. Para predecir sitios de unión a MHC clase I, tales modelos incluyen, pero no se limitan a, ProPred1 (descrito con más detalle en Singh y Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001), y SYFPEITHI (consultar Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. en Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-932007)
En algunas divulgaciones, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo puede ser una proteína natural producida recombinantemente o una forma mutada de la misma en la que se han alterado una o más propiedades, como la característica de unión. En algunas divulgaciones, un TCR puede derivarse de una de varias especies animales, como el ser humano, el ratón, la rata u otro mamífero. Un TCR puede estar unido a células o en forma soluble. En algunas divulgaciones, a efectos de los métodos divulgados, el TCR está en forma unida a células expresada en la superficie de una célula.
En algunas divulgaciones, el TCR es un TCR de longitud completa. En algunas divulgaciones, el TCR es una porción de unión a antígeno. En algunas divulgaciones, el TCR es un TCR dimérico (dTCR). En algunas divulgaciones, el TCR es un TCR de cadena sencilla (sc-TCR). En algunas divulgaciones, un dTCR o un scTCR tienen las estructuras que se describen en la WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.
En algunas divulgaciones, el TCR contiene una secuencia correspondiente a la secuencia transmembrana. En algunas divulgaciones, el TCR contiene una secuencia correspondiente a secuencias citoplásmicas. En algunas divulgaciones, el TCR es capaz de formar un complejo TCR con CD3. En algunas divulgaciones, cualquiera de los TCR, incluyendo un dTCR o scTCR, puede unirse a dominios de señalización que dan lugar a un TCR activo en la superficie de una célula T. En algunas divulgaciones, el TCR se expresa en la superficie de las células.
En algunas divulgaciones, un dTCR contiene un primer polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de región variable de cadena a del TCR se fusiona con el extremo N terminal de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena a del TCR, y un segundo polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de región variable de cadena p del TCR se fusiona con el extremo N terminal de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena p del TCR, el primer y el segundo polipéptidos estando unidos por un enlace disulfuro. En algunas divulgaciones, el enlace puede corresponder al enlace disulfuro entre cadenas nativo presente en los TCR ap diméricos nativos. En algunas divulgaciones, los enlaces disulfuro entre cadenas no están presentes en un TCR nativo. Por ejemplo en algunas divulgaciones, pueden incorporarse una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de región constante del par de polipéptidos dTCR. En algunos casos divulgados en la presente, puede ser deseable tanto un enlace disulfuro nativo como no nativo. En algunas divulgaciones, el TCR contiene una secuencia transmembrana para anclarse a la membrana.
En algunas divulgaciones, un dTCR contiene una cadena a de TCR que comprende un dominio a variable, un dominio a constante y un primer motivo de dimerización unido al extremo C-terminal del dominio a constante, y una cadena p de TCR que comprende un dominio p variable, un dominio p constante y un primer motivo de dimerización unido al extremo C-terminal del dominio p constante, en conde el primer y el segundo motivos de dimerización interactúan fácilmente para formar un enlace covalente entre un aminoácido del primer motivo de dimerización y un aminoácido del segundo motivo de dimerización que une la cadena a de TCR y la cadena p de TCR.
En algunas divulgaciones, el TCR es un scTCR. Típicamente, un scTCR puede generarse usando métodos conocidos, Consultar por ejemplo Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. and Plückthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); PCT internacionales publicados N° WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; y Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). En algunas divulgaciones, un scTCR contiene un enlace entre cadenas de disulfuro no nativo introducido para facilitar la asociación de las cadenas de TCR (consultar, por ejemplo el PCT internacional publicado N° WO 03/020763). En algunas divulgaciones, un scTCR es un TCR truncado sin enlace disulfuro en el que cremalleras de leucina heterólogas fusionadas a los extremos C terminales del mismo facilitan la asociación de cadenas (consultar, por ejemplo el PCT internacional publicado N° WO99/60120). En algunas divulgaciones, un scTCR contiene un dominio variable TCRa unido covalentemente a un dominio variable TCRp mediante un conector peptídico (consultar, por ejemplo el PCT internacional publicado N° WO99/18129).
En algunas divulgaciones, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de cadena a del TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de cadena p del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de dominio constante de cadena p del TCR, y una secuencia conectora que une el extremo C terminal del primer segmento al extremo N del segundo segmento.
En algunas divulgaciones, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N terminal de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena a, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p fusionada al extremo N terminal de una secuencia constante extracelular y transmembrana de cadena p, y, opcionalmente, una secuencia conectora que une el extremo C terminal del primer segmento al extremo N terminal del segundo segmento.
En algunas divulgaciones, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena p, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N terminal de una secuencia constante extracelular de cadena a y secuencia transmembrana, y, opcionalmente, una secuencia conectora que une el extremo C terminal del primer segmento al extremo N terminal del segundo segmento.
En algunas divulgaciones, el conector de un scTCR que une el primer y el segundo segmentos del TCR puede ser cualquier conector capaz de formar una única cadena polipeptídica, conservando al mismo tiempo la especificidad de unión al TCR. En algunas divulgaciones, la secuencia conectora puede, por ejemplo tener la fórmula -P-AA-P- en donde P es prolina y AA representa una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos son glicina y serina. En algunas divulgaciones, el primer y el segundo segmentos están emparejados de tal manera que las secuencias de región variable de los mismos están orientadas para dicha unión. Por lo tanto, en algunos casos divulgados en la presente, el conector tiene una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C terminal del primer segmento y el extremo N terminal del segundo segmento, o viceversa, pero no es demasiado largo para bloquear o reducir la unión del scTCR al ligando objetivo. En algunas divulgaciones, el conector puede contener de o de aproximadamente 10 a 45 aminoácidos, como de 10 a 30 aminoácidos o de 26 a 41 residuos de aminoácidos, por ejemplo 29, 30, 31 o 32 aminoácidos. En algunas divulgaciones, el conector tiene la fórmula -PG-GG-(SGGGG)<5>-P-en donde P es prolina, G es glicina y S es serina (SEQ ID NO:22). En algunas divulgaciones, el conector tiene la secuencia GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO:23).
En algunas divulgaciones, el scTCR contiene un enlace disulfuro covalente que enlaza un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena a con un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena p. En algunas divulgaciones, el enlace disulfuro entre cadenas en un TCR nativo no está presente. Por ejemplo en algunas divulgaciones, pueden incorporarse una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de la región constante del primer y el segundo segmentos del polipéptido scTCR. En algunos casos divulgados en la presente, puede ser deseable tanto un enlace disulfuro nativo como uno no nativo.
En algunas divulgaciones de un dTCR o scTCR que contiene enlaces disulfuro entre cadenas introducidos, los enlaces disulfuro nativos no están presentes. En algunas divulgaciones, la una o más de las cisteínas nativas que forman un enlace disulfuro nativo entre cadenas se sustituyen por otro residuo, como una serina o alanina. En algunas divulgaciones, puede formarse un enlace disulfuro introducido mutando residuos no cisteína en el primero y el segundo segmentos a cisteína. Los enlaces disulfuro no nativos ejemplares de un TCR se describen en el PCT internacional publicado N° W02006/000830.
En algunas divulgaciones, el TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo presenta una afinidad con una constante de unión de equilibrio para un antígeno diana de entre o aproximadamente 10-5 y 10-12 M y todos los valores individuales e intervalos de los mismos. En algunas divulgaciones, el antígeno diana es un complejo o ligando MHC-péptido.
En algunas divulgaciones, el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican un TCR, como las cadenas a y p, pueden amplificarse por PCR, clonación u otros medios adecuados y clonarse en un vector o vectores de expresión adecuados. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, como plásmidos y virus.
En algunas divulgaciones, el vector puede ser un vector de la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), la serie pET (Novagen, Madison, Wis.), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), o la serie pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). En algunos casos divulgados en la presente, también pueden usarse vectores bacteriófagos, como AG10, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4, y ANM1149. En algunas divulgaciones, pueden usarse vectores de expresión vegetal e incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). En algunas divulgaciones, los vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). En algunas divulgaciones, se usa un vector viral, como un vector retroviral.
En algunas divulgaciones, los vectores de expresión recombinante pueden prepararse usando técnicas estándar de ADN recombinante. En algunas divulgaciones, los vectores pueden contener secuencias reguladoras, como codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según proceda y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. En algunas divulgaciones, el vector puede contener un promotor no nativo enlazado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR o la porción de unión a antígeno (u otra molécula de unión a péptido MHC). En algunas divulgaciones, el promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, como un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murino. También se contemplan otros promotores conocidos.
En algunas divulgaciones, para generar un vector que codifica un TCR, las cadenas a y p se amplifican por PCR a partir de ADNc total aislado de un clon de células T que expresa el TCR de interés y se clonan en un vector de expresión. En algunas divulgaciones, las cadenas a y p se clonan en el mismo vector. En algunas divulgaciones, las cadenas a y p se clonan en vectores diferentes. En algunas divulgaciones, las cadenas a y p generadas se incorporan a un vector retroviral, por ejemplo lentiviral.
Células manipuladas genéticamente y métodos de producción de células
En algunas divulgaciones, los métodos divulgados implican administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección células que expresan un receptor de antígeno recombinante. Se conocen varios métodos para la introducción de componentes genéticamente manipulados, por ejemplo receptores recombinantes, por ejemplo CARs o TCRs, y pueden usarse con los métodos y composiciones divulgados. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo vía viral, por ejemplo retroviral o lentiviral, transducción, transposones y electroporación.
Entre las células que expresan los receptores y se administran mediante los métodos descritos se encuentran las células manipuladas. La manipulación genética generalmente implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente recombinante o modificado en una composición que contiene las células, como por transducción retroviral, transfección o transformación.
3. Receptores quiméricos de autoanticuerpos (CAAR)
En algunas divulgaciones, entre el receptor recombinante expresado por las células manipuladas usadas en relación con los métodos, usos, artículos de fabricación y composiciones divulgados se encuentra un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR). En algunas divulgaciones, el CAAR es específico para un autoanticuerpo. En algunas divulgaciones, una célula que expresa el CAAR, como una célula T manipulada para que exprese un CAAR, puede usarse para unirse específicamente y matar células que expresan autoanticuerpos, pero no a células normales que expresan anticuerpos. En algunas divulgaciones, las células que expresan CAAR pueden usarse para tratar una enfermedad autoinmune asociada con la expresión de autoantígenos, como las enfermedades autoinmunes. En algunas divulgaciones, las células que expresan CAAR pueden dirigirse a las células B que en última instancia producen los autoanticuerpos y presentan los autoanticuerpos en sus superficies celulares, marcando estas células B como dianas específicas de la enfermedad para la intervención terapéutica. En algunas divulgaciones, las células que expresan CAAR pueden usarse para dirigir y eliminar eficazmente las células B patógenas en enfermedades autoinmunes dirigiéndose a las células B causantes de la enfermedad usando un receptor quimérico de autoanticuerpos específico de antígeno. En algunas divulgaciones, el receptor recombinante es un CAAR, como cualquiera de los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° US 2017/0051035.
En algunas divulgaciones, el CAAR comprende un dominio de unión a autoanticuerpos, un dominio transmembrana y una región de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, la región de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular. En algunas divulgaciones, el dominio de señalización intracelular es o comprende un dominio de señalización primaria, un dominio de señalización que es capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, un dominio de señalización de un componente del receptor de células T (TCR), y/o un dominio de señalización que comprende un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM). En algunas divulgaciones, la región de señalización intracelular comprende una región de señalización secundaria o coestimuladora (regiones de señalización intracelular secundaria).
En algunas divulgaciones, el dominio de unión a autoanticuerpos comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo. La elección del autoantígeno puede depender del tipo de autoanticuerpo objetivo. Por ejemplo el autoantígeno puede elegirse porque reconoce un autoanticuerpo en una célula diana, como una célula B, asociada con un estado de enfermedad particular, por ejemplo una enfermedad autoinmune, como una enfermedad autoinmune mediada por autoanticuerpos. En algunas divulgaciones, la enfermedad autoinmune incluye el pénfigo vulgar (PV). Los autoantígenos ejemplares incluyen desmogleína 1 (Dsg1) y Dsg3.
4. Multidireccionamiento
En algunas divulgaciones, las células usadas en relación con los métodos, usos, artículos de fabricación y composiciones divulgados incluyen células que emplean estrategias multidireccionamiento, como la expresión de dos o más receptores manipulados genéticamente en la célula, cada uno de los cuales reconoce el mismo antígeno o un antígeno diferente y típicamente cada uno incluye un componente de señalización intracelular diferente. Tales estrategias multidireccionamiento se describen, por ejemplo en la Solicitud de Patente Internacional, N° de Publicación WO 2014055668 A1 (que describe combinaciones de CAR activadores y coestimuladores, por ejemplo dirigidos a dos antígenos diferentes presentes individualmente en células fuera del objetivo, por ejemplo normales, pero presentes juntos solo en células de la enfermedad o afección que se va a tratar) y Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) (en el que se describen células que expresan un CAR activador y un CAR inhibidor, como aquellas en las que el CAR activador se une a un antígeno expresado tanto en células normales o no enfermas como en células de la enfermedad o afección que se desea tratar, y el CAR inhibidor se une a otro antígeno expresado únicamente en las células normales o en las células que no se desea tratar).
Por ejemplo en algunas divulgaciones, las células incluyen un receptor que expresa un primer receptor de antígeno modificado genéticamente (por ejemplo CAR o TCR) que es capaz de inducir una señal activadora o estimuladora a la célula, generalmente tras la unión específica al antígeno reconocido por el primer receptor, por ejemplo el primer antígeno. En algunas divulgaciones, la célula incluye además un segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente (por ejemplo CAR o TCR), por ejemplo un receptor coestimulador quimérico, que es capaz de inducir una señal coestimuladora a la célula inmunitaria, generalmente tras la unión específica a un segundo antígeno reconocido por el segundo receptor. En algunas divulgaciones, el primer antígeno y el segundo antígeno son iguales. En algunas divulgaciones, el primer antígeno y el segundo antígeno son diferentes.
En algunas divulgaciones, el primer y/o el segundo receptor de antígeno manipulado genéticamente (por ejemplo CAR o TCR) es capaz de inducir una señal activadora a la célula. En algunas divulgaciones, el receptor incluye un componente de señalización intracelular que contiene ITAM o motivos similares a ITAM. En algunas divulgaciones, la activación inducida por el primer receptor implica una transducción de señales o un cambio en la expresión de proteínas en la célula que da como resultado el inicio de una respuesta inmunitaria, como la fosforilación de ITAM y/o el inicio de la cascada de transducción de señales mediada por ITAM, la formación de una sinapsis inmunológica y/o la agrupación de moléculas cerca del receptor unido (por ejemplo CD4 o CD8, etc.), activación de uno o más factores de transcripción, como NF-kB y/o AP-1, y/o inducción de la expresión génica de factores como citoquinas, proliferación y/o supervivencia.
En algunas divulgaciones, el primer y/o el segundo receptor incluyen dominios o regiones de señalización intracelular de receptores coestimuladores como CD28, CD 137 (4-1BB), OX40, y/o ICOS. En algunas divulgaciones, el primer y segundo receptor incluyen un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador que son diferentes. En una divulgación, el primer receptor contiene una región de señalización coestimuladora CD28 y el segundo receptor contiene una región de señalización coestimuladora 4-1BB o viceversa.
En algunas divulgaciones, el primer y/o el segundo receptor incluye tanto un dominio de señalización intracelular que contiene motivos ITAM o similares a ITAM como un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador.
En algunas divulgaciones, el primer receptor contiene un dominio de señalización intracelular que contiene motivos ITAM o similares a ITAM y el segundo receptor contiene un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador. La señal coestimuladora en combinación con la señal activadora inducida en la misma célula es la que da lugar a una respuesta inmunitaria, como una respuesta inmunitaria robusta y sostenida, como el aumento de la expresión génica, la secreción de citoquinas y otros factores, y funciones efectoras mediadas por células T, como la destrucción celular.
En algunas divulgaciones, ni la ligadura del primer receptor solo ni la ligadura del segundo receptor solo inducen una respuesta inmunitaria robusta. En algunas divulgaciones, si sólo se liga un receptor, la célula se tolera o no responde al antígeno, o se inhibe, y/o no se induce para que prolifere o secrete factores o lleve a cabo funciones efectoras. En algunas de tales divulgaciones, sin embargo, cuando se ligan la pluralidad de receptores, como al encontrarse una célula que expresa el primer y el segundo antígenos, se consigue una respuesta deseada, como una activación o estimulación inmunitaria completa, por ejemplo como se indica por la secreción de una o más citoquinas, proliferación, persistencia y/o realización de una función efectora inmunitaria como la destrucción citotóxica de una célula diana.
En algunas divulgaciones, los dos receptores inducen, respectivamente, una señal activadora y una señal inhibidora a la célula, de tal manera que la unión de uno de los receptores a su antígeno activa la célula o induce una respuesta, pero la unión del segundo receptor inhibidor a su antígeno induce una señal que suprime o amortigua esa respuesta. Los ejemplos descritos en la presente son combinaciones de CAR activadores y c A r inhibidores o iCAR. Puede usarse una estrategia de este tipo, por ejemplo en la que el CAR activador se une a un antígeno expresado en una enfermedad o afección pero que también se expresa en células normales, y el receptor inhibidor se une a un antígeno distinto que se expresa en las células normales pero no en las células de la enfermedad o afección.
En algunas divulgaciones, la estrategia multiobjetivo se emplea en un caso divulgado en la presente en el que un antígeno asociado con una enfermedad o afección particular se expresa en una célula no enferma y/o se expresa en la propia célula manipulada, ya sea de manera transitoria (por ejemplo tras la estimulación en asociación con la manipulación genética) o permanente. En tales casos divulgados en la presente, al requerir la ligadura de dos receptores de antígeno separados e individualmente específicos, puede mejorarse la especificidad, selectividad y/o eficacia.
En algunas divulgaciones, la pluralidad de antígenos, por ejemplo el primer y el segundo antígenos, se expresan en la célula, tejido o enfermedad o afección al que se dirigen, como en la célula cancerosa. En algunas divulgaciones, la célula, tejido, enfermedad o afección es mieloma múltiple o una célula de mieloma múltiple. En algunas divulgaciones, uno o más de la pluralidad de antígenos generalmente también se expresan en una célula a la que no se desea dirigir la terapia celular, como una célula o tejido normal o no enfermo, y/o las propias células manipuladas. En tales divulgaciones, al requerir la ligadura de múltiples receptores para lograr una respuesta de la célula, se consigue especificidad y/o eficacia.
B. Ácidos nucleicos, vectores y métodos de ingeniería genética
En algunas divulgaciones, las células, por ejemplo células de una población de células T CD57- enriquecidas, se manipulan genéticamente para que expresen un receptor recombinante. En algunas divulgaciones, la manipulación se lleva a cabo introduciendo uno o más polinucleótidos que codifican el receptor recombinante o porciones o componentes del mismo. También se divulgan polinucleótidos que codifican un receptor recombinante, y vectores o constructos que contienen dichos ácidos nucleicos y/o polinucleótidos.
En algunas divulgaciones, el polinucleótido que codifica el receptor recombinante contiene por lo menos un promotor que está enlazado operativamente para controlar la expresión del receptor recombinante. En algunos ejemplos divulgados en la presente, el polinucleótido contiene dos, tres o más promotores vinculados operativamente para controlar la expresión del receptor recombinante. En algunas divulgaciones, el polinucleótido puede contener secuencias reguladoras, como codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el polinucleótido, según sea apropiado y teniendo en cuenta si el polinucleótido está basado en ADN o ARN. En algunas divulgaciones, el polinucleótido puede contener elementos reguladores/controladores, como un promotor, un potenciador, un intrón, una señal de poliadenilación, una secuencia consenso de Kozak, sitios de entrada de ribosomas internos (IRES), una secuencia 2A y un aceptor o donante de corte empalme. En algunas divulgaciones, el polinucleótido puede contener un promotor no nativo enlazado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el receptor recombinante y/o uno o más polipéptidos adicionales. En algunas divulgaciones, el promotor se selecciona de entre un promotor de ARN pol I, pol II o pol III. En algunas divulgaciones, el promotor es reconocido por la ARN polimerasa II (por ejemplo una región temprana de CMV, SV40 o un promotor tardío principal de adenovirus). En otra divulgación, el promotor es reconocido por la ARN polimerasa III (por ejemplo un promotor U6 o H1). En algunas divulgaciones, el promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, como un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murino. También se contemplan otros promotores conocidos.
En algunas divulgaciones, el promotor es o comprende un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen, por ejemplo el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor humano de la ubiquitina C (UBC), el promotor humano del factor de elongación 1a (EF1a), el promotor de la fosfoglicerato quinasa 1 de ratón (PGK), y el promotor de la p-actina de pollo acoplado con el potenciador temprano del CMV (CAG<g>). En algunas divulgaciones, el promotor constitutivo es un promotor sintético o modificado. En algunas divulgaciones, el promotor es o comprende un promotor MND, un promotor sintético que contiene la región U3 de un LTR MoMuLV modificado con un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (consultar Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755). En algunas divulgaciones, el promotor es un promotor específico de tejido. En otra divulgación, el promotor es un promotor viral. En otra divulgación, el promotor es un promotor no viral. En algunas divulgaciones, los promotores ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, el promotor del factor de elongación humano 1 alfa (EF1a) o una forma modificada del mismo o el promotor MND.
En otra divulgación, el promotor es un promotor regulado (por ejemplo un promotor inducible). En algunas divulgaciones, el promotor es un promotor inducible o un promotor reprimible. En algunas divulgaciones, el promotor comprende una secuencia operadora de Lac, una secuencia operadora de tetraciclina, una secuencia operadora de galactosa o una secuencia operadora de doxiciclina, o es un análogo de las mismas o es capaz de ser unido o reconocido por un represor de Lac o un represor de tetraciclina, o un análogo de los mismos. En algunas divulgaciones, el polinucleótido no incluye un elemento regulador, por ejemplo un promotor.
En algunos casos divulgados en la presente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante contiene una secuencia señal que codifica un péptido señal. En algunas divulgaciones, la secuencia señal puede codificar un péptido señal derivado de un polipéptido nativo. En otras divulgaciones, la secuencia señal puede codificar un péptido señal heterólogo o no nativo, como el péptido señal ejemplar de la cadena alfa de GMCSFR expuesta en la SEQ ID NO:25 y codificado por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:24. En algunos casos divulgados en la presente, la secuencia señal puede codificar un péptido señal derivado de un polipéptido nativo. En algunos casos divulgados en la presente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo el receptor de antígeno quimérico (CAR) contiene una secuencia señal que codifica un péptido señal. Los péptidos señal ejemplares no limitativos incluyen, por ejemplo el péptido señal de la cadena alfa de GMCSFR expuesta en la SEQ ID NO: 25 y codificado por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:24, o el péptido señal alfa de CD8 expuesto en la SEQ<i>D NO:26.
En algunas divulgaciones, el polinucleótido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos adicionales, por ejemplo uno o más marcadores y/o una o más moléculas efectoras. En algunas divulgaciones, el marcador o marcadores incluyen un marcador de transducción, un marcador sustituto y/o un marcador de selección. Entre las secuencias de ácidos nucleicos adicionales introducidas, por ejemplo que codifican para uno o más polipéptidos adicionales, se incluyen secuencias de ácidos nucleicos que pueden mejorar la eficacia de la terapia, por ejemplo promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; secuencias de ácidos nucleicos para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, por ejemplo para evaluar la supervivencia o localizaciónin vivo;secuencias de ácidos nucleicos para mejorar la seguridad, por ejemplo haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describe en Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); consultar también la WO 1992008796 y la WO 1994028143 en donde se describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo, y la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177.
En algunas divulgaciones, el marcador es un marcador de transducción o un marcador sustituto. Un marcador de transducción o un marcador sustitutivo puede usarse para detectar células que se han introducido con el polinucleótido, por ejemplo un polinucleótido que codifica un receptor recombinante. En algunas divulgaciones, el marcador de transducción puede indicar o confirmar la modificación de una célula. En algunas divulgaciones, el marcador sustitutivo es una proteína que se hace coexpresar en la superficie celular con el receptor recombinante, por ejemplo CAR. En divulgaciones particulares, dicho marcador sustituto es una proteína de superficie que se ha modificado para que tenga poca o ninguna actividad. En ciertas divulgaciones, el marcador sustituto se codifica en el mismo polinucleótido que codifica el receptor recombinante. En algunas divulgaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante está enlazada operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador, opcionalmente separada por un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES), o un ácido nucleico que codifica un péptido de autodestrucción o un péptido que provoca la omisión de ribosomas, como una secuencia 2<a>. En algunos casos divulgados en la presente, pueden usarse genes marcadores extrínsecos en relación con células manipuladas para permitir la detección o selección de células y, en algunos casos divulgados en la presente, también para promover la eliminación de células y/o el suicidio celular.
Los marcadores sustitutos ejemplares pueden incluir formas truncadas de polipéptidos de la superficie celular, como formas truncadas que no son funcionales y no transducen o no son capaces de transducir una señal o una señal transducida normalmente por la forma de longitud completa del polipéptido de la superficie celular, y/o no se internalizan o no son capaces de internalizarse. Los polipéptidos de superficie celular truncados ejemplares incluyen formas truncadas de factores de crecimiento u otros receptores como un receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano truncado (tHER2), un receptor truncado del factor de crecimiento epidérmico (tEGFR, secuencia tEGFR ejemplar expuesta en la SEQ ID NO: 7 o 16) o un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) o forma modificada del mismo, como un PSMA truncado (tPSMA). En algunas divulgaciones, el tEGFR puede contener un epítopo reconocido por el anticuerpo cetuximab (Erbitux®) u otro anticuerpo terapéutico anti-EGFR o molécula de unión, que puede usarse para identificar o seleccionar células que se han manipulado con el constructo tEGFR y una proteína exógena codificada, y/o para eliminar o separar células que expresan la proteína exógena codificada. Consultar la Patente de Estados Unidos N° 8.802.374 y Liu et al., Nature Biotech. abril 2016; 34(4): 430-434). En algunas divulgaciones, el marcador, por ejemplo marcador sustituto, incluye todo o parte (por ejemplo forma truncada) de CD34, un NGFR, un CD19 o un CD19 truncado, por ejemplo un CD19 no humano truncado. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado (por ejemplo tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ iD NO: 7 o 16 o una secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7 o 16.
En algunas divulgaciones, el marcador es o comprende una proteína detectable, como una proteína fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP), la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), como la GFP superplegada (sfGFP), la proteína roja fluorescente (RFP), como tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed o DsRed2, proteína cian fluorescente (CFP), proteína azul verde fluorescente (BFP), proteína azul fluorescente mejorada (EBFP), y proteína amarilla fluorescente (YFP), y variantes de las mismas, incluyendo variantes de especie, variantes monoméricas, variantes optimizadas en codón, estabilizadas y/o mejoradas de las proteínas fluorescentes. En algunas divulgaciones, el marcador es o comprende una enzima, como una luciferasa, el gen lacZ deE. coli,fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Los genes informadores emisores de luz ejemplares incluyen luciferasa (luc), p-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), p-glucuronidasa (GUS) o variantes de los mismos. En algunas divulgaciones, la expresión de la enzima puede detectarse mediante la adición de un sustrato que puede detectarse tras la expresión y actividad funcional de la enzima.
En algunas divulgaciones, el marcador es un marcador de selección. En algunas divulgaciones, el marcador de selección es o comprende un polipéptido que confiere resistencia a agentes o fármacos exógenos. En algunas divulgaciones, el marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos. En algunas divulgaciones, el marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos que confiere resistencia a antibióticos a una célula de mamífero. En algunas divulgaciones, el marcador de selección es o comprende un gen de resistencia a Puromicina, un gen de resistencia a Higromicina, un gen de resistencia a Blasticidina, un gen de resistencia a Neomicina, un gen de resistencia a Geneticina o un gen de resistencia a Zeocina o una forma modificada de los mismos.
Cualquiera de los receptores recombinantes y/o el polipéptido o polipéptidos adicionales descritos en la presente pueden codificarse mediante uno o más polinucleótidos que contengan una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen receptores recombinantes, en cualquier combinación, orientación o disposición. Por ejemplo uno, dos, tres o más polinucleótidos pueden codificar uno, dos, tres o más polipéptidos diferentes, por ejemplo receptores recombinantes o porciones o componentes de los mismos, y/o uno o más polipéptidos adicionales, por ejemplo un marcador y/o una molécula efectora. En algunas divulgaciones, un polinucleótido contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor recombinante, por ejemplo CAR, o porción o componentes del mismo, y una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos adicionales. En algunas divulgaciones, un vector o constructo contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor recombinante, por ejemplo CAR, o porción o componentes del mismo, y un vector o constructo separado contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos adicionales. En algunas divulgaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante y la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o polipéptidos adicionales están enlazadas operativamente a dos promotores diferentes. En algunas divulgaciones, el ácido nucleico que codifica el receptor recombinante está presente en sentido ascendente del ácido nucleico que codifica el polipéptido o polipéptidos adicionales. En algunas divulgaciones, el ácido nucleico que codifica el receptor recombinante está presente en sentido descendente del ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos adicionales.
En ciertos casos divulgados en la presente, un polinucleótido contiene secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos o más cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo un receptor recombinante y uno o más polipéptidos adicionales, por ejemplo un marcador y/o una molécula efectora. En algunas divulgaciones, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dos o más cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo un receptor recombinante y uno o más polipéptidos adicionales, están presentes en dos polinucleótidos separados. Por ejemplo se divulgan dos polinucleótidos separados, y cada uno puede transferirse o introducirse individualmente en la célula para su expresión en la misma. En algunas divulgaciones, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el marcador y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el receptor recombinante están presentes o se insertan en diferentes ubicaciones dentro del genoma de la célula. En algunas divulgaciones, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el marcador y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el receptor recombinante están enlazadas operativamente a dos promotores diferentes.
En algunas divulgaciones, como aquellas en las que el polinucleótido contiene una primera y una segunda secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias codificantes que codifican cada una de las diferentes cadenas polipeptídicas pueden estar enlazadas operativamente a un promotor, que puede ser igual o diferente. En algunas divulgaciones, la molécula de ácido nucleico puede contener un promotor que impulsa la expresión de dos o más cadenas polipeptídicas diferentes. En algunas divulgaciones, tales moléculas de ácido nucleico pueden ser multicistrónicas (bicistrónicas o tricistrónicas, consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.060.273). En algunas divulgaciones, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el receptor recombinante y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más polipéptidos adicionales están enlazadas operativamente al mismo promotor y están opcionalmente separadas por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), o un ácido nucleico que codifica un péptido de autodestrucción o un péptido que provoca omisión de ribosoma, como un elemento 2A. Por ejemplo un marcador ejemplar, y opcionalmente una secuencia de secuencia de omisión de ribosoma, puede ser cualquiera de los divulgados en la Publicación de PCT N° WO2014031687.
En algunas divulgaciones, las unidades de transcripción pueden diseñarse como una unidad bicistrónica que contiene un IRES, lo que permite la coexpresión de productos génicos (por ejemplo, la codificación del receptor recombinante y el polipéptido adicional) mediante un mensaje de un único promotor. Alternativamente, en algunos casos divulgados en la presente, un único promotor puede dirigir la expresión de un ARN que contiene, en un único marco de lectura abierto (ORF), dos o tres genes (por ejemplo que codifican el marcador y que codifican el receptor recombinante) separados entre sí por secuencias que codifican un péptido de autolimpieza (por ejemplo secuencias 2A) o un sitio de reconocimiento de proteasas (por ejemplo furina). Por tanto, el ORF codifica un único polipéptido que, ya sea durante (en el caso de 2A) o después de la traducción, se procesa en las proteínas individuales. En algunos casos divulgados en la presente, el péptido, como un T2A, puede hacer que se omita el ribosoma (omisión de ribosoma) la síntesis de un enlace peptídico en el extremo C-terminal de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el final de la secuencia 2A y el siguiente péptido en sentido descendente (consultar, por ejemplo de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) y de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Se conocen varios elementos 2a . Ejemplos de secuencias 2A que pueden usarse en los métodos y el sistema divulgados en la presente, sin limitación, secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 21), virus de la rinitis equina A (E2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 20), virus de Thosea asigna (T2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 6 o 17), y teschovirus porcino-1 (P2A, por ejemplo, SEQ ID NO: 18 o 19) como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20070116690.
En algunas divulgaciones, el polinucleótido que codifica el receptor recombinante y/o el polipéptido adicional está contenido en un vector o puede clonarse en uno o más vectores. En algunas divulgaciones, el uno o más vectores pueden usarse para transformar o transfectar una célula huésped, por ejemplo una célula para manipulación. Los vectores ejemplares incluyen vectores diseñados para la introducción, propagación y expansión o para la expresión o ambas, como plásmidos y vectores virales. En algunas divulgaciones, el vector es un vector de expresión, por ejemplo un vector de expresión recombinante. En algunas divulgaciones, los vectores de expresión recombinante pueden prepararse usando técnicas estándar de ADN recombinante.
En algunas divulgaciones, el vector puede ser un vector de la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, Calif.), la serie pET (Novagen, Madison, Wis.), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), o la serie pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). En algunos casos divulgados en la presente, también pueden usarse vectores bacteriófagos, como AG10, AGT11, AZapII (Stratagene), AEMBL4, y ANM1149. En algunas divulgaciones, pueden usarse vectores de expresión vegetal e incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). En algunas divulgaciones, los vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech).
En algunas divulgaciones, el vector es un vector viral, como un vector retroviral. En algunas divulgaciones, el polinucleótido que codifica el receptor recombinante y/o polipéptido o polipéptidos adicionales se introducen en la célula a través de vectores retrovirales o lentivirales, o a través de transposones (consultar, por ejemplo Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757; y Hackett et al. (2010) Molecular Therapy 18:674-683).
En algunas divulgaciones, uno o más polinucleótidos se introducen en las células usando partículas de virus infecciosos recombinantes como, por ejemplo vectores derivados del virus simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunas divulgaciones, uno o más polinucleótidos se introducen en células T usando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como vectores gamma-retrovirales (consultar, por ejemplo Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol; Park et al., Trends Biotechnol. Noviembre 2011 29(11): 550-557.
En algunas divulgaciones, el vector es un vector retroviral. En algunas divulgaciones, un vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMI,V), el virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), el virus de células madre embrionarias murinas (MESV), el virus de células madre murinas (MSCV), el virus formador de foco del bazo (SFFV) o el virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales se derivan de retrovirus murinos. En algunas divulgaciones, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente celular aviar o mamífera. Los retrovirus suelen ser anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluyendo las de humanos. En una divulgación, el gen a expresar sustituye a las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo Patentes de Estados Unidos N° 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.
Se conocen métodos de transducción lentiviral. Métodos ejemplares se describen en, por ejemplo Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505. En algunas divulgaciones, el polinucleótido que codifica el receptor recombinante y/o uno o más polipéptidos adicionales, se introduce en una población que contiene células cultivadas, como por transformación, transfección o transducción retroviral.
En algunas divulgaciones, uno o más polinucleótidos se introducen en una célula T mediante electroporación (consultar, por ejemplo Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunas divulgaciones, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (consultar, por ejemplo Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos para introducir y expresar material genético, por ejemplo polinucleótidos y/o vectores, en células inmunitarias incluyen la transfección con fosfato de calcio (por ejemplo como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987) y otros enfoques descritos en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N°WO 2014055668, y la Patente de Estados Unidos N° 7,446,190.
En algunas divulgaciones, el uno o más polinucleótidos o vectores que codifican un receptor recombinante y/o polipéptidos adicionales pueden introducirse en células, por ejemplo células T, durante o después de la expansión. Esta introducción del polinucleótidos o vectores puede llevarse a cabo con cualquier vector retroviral adecuado, por ejemplo. Las células genéticamente modificadas resultantes pueden liberarse entonces del estímulo inicial (por ejemplo estímulo anti-CD3/anti-CD28) y posteriormente estimularse con un segundo tipo de estímulo (por ejemplo a través de un receptor recombinante introducido de novo). Este segundo tipo de estímulo puede incluir un estímulo antigénico en forma de una molécula de péptido/MHC, el ligando cognado (reticulado) del receptor introducido genéticamente (por ejemplo antígeno natural y/o ligando de un CAR) o cualquier ligando (como un anticuerpo) que se una directamente dentro del marco del nuevo receptor (por ejemplo reconociendo regiones constantes dentro del receptor). Consultar, por ejemplo Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 o Barrett et al, Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.
65: 333-347 (2014).
En algunos casos divulgados en la presente, puede usarse un vector que no requiera que las células, por ejemplo las células T, estén activadas. En algunos de estos casos, las células pueden seleccionarse y/o transducirse antes de la activación. Por lo tanto, las células pueden manipularse antes o después del cultivo de las células y, en algunos casos divulgados en la presente, al mismo tiempo o durante por lo menos una parte del cultivo.
C. Células y preparación de células para manipulación genética
En algunas divulgaciones, se divulgan células manipuladas, por ejemplo células modificadas o manipuladas genéticamente, y métodos de manipulación de células. En algunas divulgaciones, se introducen uno o más polinucleótidos, por ejemplo que codifican un receptor recombinante y/o polipéptidos adicionales, como cualquiera de los descritos en la presente, en una célula para su manipulación. En algunas divulgaciones, los polinucleótidos y/o porciones de los mismos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo no se encuentra normalmente en la célula que se está manipulando y/o un organismo del que deriva dicha célula. En algunas divulgaciones, las secuencias de ácidos nucleicos no son naturales, como una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza o se modifica a partir de una secuencia de ácido nucleico que se encuentra en la naturaleza, incluyendo una que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.
Las células generalmente son células eucariotas, como las células de mamíferos, y típicamente son células humanas. En algunas divulgaciones, las células se derivan de la sangre, médula ósea, linfa u órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa, por ejemplo células mieloides o linfoides, incluidos linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ejemplares incluyen las células madre, como las células madre multipotentes y pluripotentes, incluyendo las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células son típicamente células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunas divulgaciones, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcadores o citoquinas y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se incluyen métodos disponibles en el mercado. En algunas divulgaciones, como para tecnologías listas para el uso, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como células madre, como iPSCs. En algunas divulgaciones, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o manipularlas, y reintroducirlas en el mismo sujeto, antes o después de la crioconservación.
Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o CD8+ se encuentran las células T vírgenes (Tn), las células T efectoras (Teff), las células T de memoria y subtipos de las mimas, como células T con memoria de células madre (T<scm>), células T de memoria central (T<cm>), células T de memoria efectoras (T<em>), o células T de memoria efectoras diferenciadas terminalmente, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduras, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes asociadas a mucosas (MAIT), células T reguladores (Treg) naturales y adaptativas, células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.
En algunas divulgaciones, las células son células asesinas naturales (NK). En algunas divulgaciones, las células son monocitos o granulocitos, por ejemplo células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.
En algunas divulgaciones, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante manipulación genética, y de este modo expresan productos recombinantes o manipulados genéticamente de tales ácidos nucleicos. En algunas divulgaciones, los ácidos nucleicos son heterólogos, es decir, normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo no se encuentra normalmente en la célula que está siendo manipulada y/o un organismo del que deriva dicha célula. En algunas divulgaciones, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.
En algunas divulgaciones, la preparación de las células manipuladas incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del ácido nucleico que codifica el receptor transgénico como el<c>A<r>, pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica, por ejemplo una obtenida de o derivada de un sujeto. En algunas divulgaciones, el sujeto del que se aísla la célula es uno que padece la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se administrará la terapia celular. En algunas divulgaciones, el sujeto es un humano que necesita una intervención terapéutica particular, como la terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o manipulan las células.
Por consiguiente, las células en algunas divulgaciones son células primarias, por ejemplo células humanas primarias. Las muestras incluyen tejido, fluido y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, manipulación genética (por ejemplo transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra procesada. Las muestras biológicas incluyen, entre otras, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluyendo muestras procesadas derivadas de los mismos.
En algunas divulgaciones, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Las muestras ejemplares incluyen sangre completa, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado a la mucosa, tejido linfoide asociado a mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano, y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular, por ejemplo la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.
En algunas divulgaciones, las células se derivan de líneas celulares, por ejemplo líneas de células T. En algunas divulgaciones, las células se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo de ratón, rata, primate no humano y cerdo.
En algunas divulgaciones, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación celular no basada en afinidad. En algunos ejemplos de la presente divulgación, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo para eliminar componentes no deseados, enriquecer para componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a reactivos particulares. En algunos ejemplos divulgados en la presente, las células se separan sobre la base de una o más propiedades, como densidad, propiedades adherentes, tamaño, sensibilidad y/o resistencia a componentes particulares.
En algunos ejemplos divulgados en la presente, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto, por ejemplo mediante aféresis o leucaféresis. En algunas divulgaciones, las muestras contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunas divulgaciones contienen células distintas de los glóbulos rojos y las plaquetas.
En algunas divulgaciones, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan, por ejemplo para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunas divulgaciones, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunas divulgaciones, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunas divulgaciones, el paso de lavado se realiza en una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas divulgaciones, un paso de lavado se realiza mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas divulgaciones, las células se vuelven a suspender en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo Ca++/Mg++ libre de PBS. En algunas divulgaciones, se eliminan los componentes de una muestra de células sanguíneas y las células se vuelven a suspender directamente en medios de cultivo.
En algunas divulgaciones, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica mediante lisis de los glóbulos rojos y centrifugación a través de un gradiente Percoll o Ficoll.
En algunas divulgaciones, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos de células basada en la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, como marcadores de superficie, por ejemplo proteínas de superficie, marcadores intracelulares o ácido nucleico. En algunas divulgaciones, puede usarse cualquier método conocido para la separación basada en tales marcadores. En algunas divulgaciones, la separación se basa en afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo el aislamiento en algunas divulgaciones incluye la separación de células y poblaciones celulares basada en la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo por incubación con un anticuerpo o molécula de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de células que se han unido al anticuerpo o molécula de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o molécula de unión.
Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se retienen para su uso posterior, y/o en la selección negativa, en la que se retienen las células que no se han unido al anticuerpo o al molécula de unión. En algunos ejemplos divulgados en la presente, ambas fracciones se retienen para su uso posterior. En algunas divulgaciones, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no se dispone de un anticuerpo que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de manera que la separación se realiza mejor basándose en marcadores expresados por células distintas de la población deseada.
La separación no tiene por qué resultar en un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o de células que expresen un marcador particular. Por ejemplo la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a aumentar el número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una ausencia total de células que no expresen el marcador. De igual manera, la selección negativa, eliminación o agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a disminuir el número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar como resultado una eliminación completa de todas esas células.
En algunos ejemplos divulgados en la presente, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, en los que la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos divulgados en la presente, un único paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, como por ejemplo incubando células con una pluralidad de anticuerpos o moléculas de unión, cada uno específico para un marcador dirigido a la selección negativa. De igual manera, pueden seleccionarse positivamente múltiples tipos celulares de manera simultánea incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o moléculas de unión expresados en los varios tipos de células.
Por ejemplo en algunas divulgaciones, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa subpoblaciones específicas de células T, como células positivas o que expresan niveles altos de uno o más marcadores de superficie, por ejemplo CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45+ células T.
Por ejemplo las células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente usando perlas magnéticas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (por ejemplo expansor de células T CD3/CD28 DYNABEADS® M-450).
En algunas divulgaciones, el aislamiento se lleva a cabo por enriquecimiento para una población celular particular mediante selección positiva, o agotamiento de una población celular particular, mediante selección negativa. En algunas divulgaciones, la selección positiva o negativa se lleva a cabo incubando células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadoralto) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.
En algunas divulgaciones, las células T se separan de una muestra de PBMC mediante selección negativa de marcadores expresados en células no T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunas divulgaciones, se usa un paso de selección de CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ y citotóxicas CD8+. Tales poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse adicionalmente en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T vírgenes, de memoria y/o efectoras.
En algunas divulgaciones, las células CD8+ se enriquecen adicionalmente para o se agotan de células madre vírgenes, de memoria central, de memoria efectora y/o de memoria central, como por ejemplo mediante selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto tras la administración, que en algunas divulgaciones es particularmente robusto en tales subpoblaciones. Consultar Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. En algunas divulgaciones, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con Tcm y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.
En divulgaciones, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de los linfocitos de sangre periférica CD8+. Las PBMC pueden enriquecerse o eliminarse de las fracciones CD62-CD8+ y/o CD62L+CD8+, por ejemplo usando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.
En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (T<cm>) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, y/o CD127; en algunas divulgaciones, se basa en la selección negativa para células que expresan o expresan altamente CD45RA y/o granzima B. En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD45RO, c D62L, CCR7, CD28, CD3, CD27, y/o CD127. En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD62L, CCR7, CD28, y/o CD27. En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (T<cm>) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CCR7, CD28, y/o CD27. En algunas divulgaciones, el enriquecimiento para células T de memoria central (T<cm>) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD28 y CD27. En algunas divulgaciones, el aislamiento de una población de CD8+ enriquecida para células T<cm>se lleva a cabo por agotamiento de células que expresan CD4, CD14, CD45RA, y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD62L. En algunas divulgaciones, el aislamiento de una población de CD8+ enriquecida para células Tcm se lleva a cabo por agotamiento de células que expresan CD4, CD14, CD45RA, y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD27 y CD28. En una divulgación, el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo comenzando con una fracción negativa de células seleccionadas basándose en la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA, y una selección positiva basada en CD62L. Tales selecciones en algunas divulgaciones se llevan a cabo simultáneamente y en otras divulgaciones se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunas divulgaciones, también se usa el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 usado en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+, para generar la población o subpoblación de células CD4+, de tal manera que se retienen tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 y se usan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente después de uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.
En un ejemplo particular divulgado en la presente, una muestra de PBMC u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se retienen las fracciones negativa y positiva. A continuación, la fracción negativa se somete a selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y selección positiva basada en un marcador característico de células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en cualquier orden.
Las células T auxiliares CD4+ se clasifican en células virgen, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse por métodos estándar. En algunas divulgaciones, los linfocitos T CD4+ vírgenes son células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+. En algunas divulgaciones, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunas divulgaciones, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.
En un ejemplo divulgado en la presente, para enriquecer las células CD4+ mediante selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales incluye típicamente anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o molécula de unión está unido a un soporte sólido o matriz, como una perla magnética o paramagnética, para permitir la separación de células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo en algunas divulgaciones, las células y poblaciones celulares se separan o aíslan usando técnicas de separación inmunomagnéticas (o afinimagnéticas) (revisado en Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Editado por: S. A. Brooks y U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
En algunas divulgaciones, la muestra o población de células a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o con respuesta magnética, como partículas o micropartículas magnéticamente sensibles, como perlas paramagnéticas (por ejemplo Dynabeads o perlas MACS). El material magnéticamente sensible, por ejemplo la partícula, generalmente está unido directa o indirectamente a una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula, por ejemplo un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar, por ejemplo que se desea seleccionar negativa o positivamente.
En algunas divulgaciones, la partícula o perla magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, como un anticuerpo u otro molécula de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se usan en métodos de separación magnética. Entre las partículas magnéticas adecuadas se incluyen las descritas en Molday, Patente de Estados Unidos N° 4,452,773, y en la Memoria Descriptiva de la Patente Europea EP 452342 B. Las partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen Patente de Estados Unidos N° 4,795,698, y Liberti et al., Patente de Estados Unidos N° 5,200,084 son otros ejemplos.
Generalmente, la incubación se lleva a cabo en condiciones en las que los anticuerpos o las moléculas de unión, como los anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o moléculas de unión, que están adheridos a la partícula o perla magnética, se unen específicamente a las moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.
En algunas divulgaciones, la muestra se coloca en un campo magnético, y las células que tienen partículas magnéticamente sensibles o magnetizables unidas a ella serán atraídas por el imán y se separarán de las células no marcadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células no marcadas). En algunas divulgaciones, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante el mismo paso de selección, en donde se retienen las fracciones positivas y negativas y se procesan o someten a pasos de separación adicionales.
En ciertas divulgaciones, las partículas magnéticamente sensibles se recubren en anticuerpos primarios u otras moléculas de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertas divulgaciones, las partículas magnéticas se unen a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En ciertas divulgaciones, las células, en lugar de las perlas, se marcan con un anticuerpo primario o molécula de unión y, a continuación, se añaden partículas magnéticas recubiertas con anticuerpos secundarios específicos del tipo celular u otro molécula de unión (por ejemplo estreptavidina). En ciertas divulgaciones, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se usan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.
En algunas divulgaciones, las partículas magnéticamente sensibles se dejan adheridas a las células que se van a incubar, cultivar y/o manipular posteriormente; en algunas divulgaciones, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunas divulgaciones, las partículas magnetizables o magnéticamente sensibles se retiran de las células. Los métodos para eliminar las partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen, por ejemplo el uso de anticuerpos no marcados competidores, y partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con conectores escindibles. En algunas divulgaciones, las partículas magnetizables son biodegradables.
En algunas divulgaciones, la selección basada en la afinidad se realiza mediante la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Los sistemas de selección celular activada magnéticamente (MACS) son capaces de seleccionar células de gran pureza que tienen partículas magnetizadas adheridas a las mismas. En ciertas divulgaciones, el MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente tras la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células adheridas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no adheridas. A continuación, una vez se ha completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y no pudieron ser eluidas se liberan de alguna manera para que puedan ser eluidas y recuperadas. En ciertas divulgaciones, las células no diana se marcan y se eliminan de la población heterogénea de células.
En ciertas divulgaciones, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunas divulgaciones, el sistema se usa para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un entorno cerrado o estéril, por ejemplo para minimizar el error, la manipulación del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo divulgado en la presente, el sistema es un sistema como el descrito en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N° WO2009/072003 o la US 20110003380.
En algunas divulgaciones, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más, por ejemplo todos, los pasos de aislamiento, procesamiento, manipulación y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de manera automatizada o programable. En algunas divulgaciones, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o un programa informático en comunicación con el sistema o aparato, que permite a un usuario programar, controlar, evaluar el resultado de y/o ajustar varias divulgaciones de los pasos de procesamiento, aislamiento, manipulación y formulación.
En algunas divulgaciones, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por ejemplo para la separación automatizada de células a escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pellizco. El ordenador integrado en algunas divulgaciones controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. En algunas divulgaciones, la unidad de separación magnética incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pellizco, garantiza el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.
En algunas divulgaciones, el sistema CliniMACS usa partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunas divulgaciones, después de marcar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. A continuación, se conecta una bolsa de preparación celular al conjunto de tubos, que a su vez está conectado a una bolsa que contiene tampón y a una bolsa de recogida de células. El conjunto de tubos consiste en tubos estériles premontados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra celular en la columna de separación. Las células marcadas se retienen dentro de la columna, mientras que las células no marcadas se eliminan mediante una serie de pasos de lavado. En algunas divulgaciones, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en la presente no están marcadas y no se retienen en la columna. En algunas divulgaciones, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en la presente están marcadas y se retienen en la columna. En algunas divulgaciones, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en la presente se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético, y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.
En ciertas divulgaciones, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo usando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). En algunas divulgaciones, el sistema CliniMACS Prodigy está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y fraccionamiento automatizado de las células mediante centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara incorporada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final óptimo de fraccionamiento celular discerniendo las capas macroscópicas del producto celular fuente. Por ejemplo la sangre periférica se separa automáticamente en capas de eritrocitos, glóbulos blancos y plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultivo celular como, por ejemplo diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada pueden permitir la extracción y reposición estéril de medios y las células pueden monitorizarse usando un microscopio integrado. Consultar, por ejemplo Klebanoff et al. (2012) J Immunother.
35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, y Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunas divulgaciones, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunas divulgaciones, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertas divulgaciones, una población celular descrita en la presente se recoge y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (consultar, por ejemplo WO 2010/033140, Cho et al. (2010); y Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376. En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite aislar subconjuntos de células T bien definidos con alta pureza.
En algunas divulgaciones, los anticuerpos o moléculas de unión están marcados con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos divulgados en la presente, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros moléculas de unión específicos para uno o más marcadores de superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por ejemplo mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), incluyendo chips a escala preparativa (FACS) y/o de sistemas microelectromecánicos (MEMS), por ejemplo en combinación con un sistema de detección citométrica de flujo. Tales métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.
En algunas divulgaciones, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar, por ejemplo crioconservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, incubación y/o manipulación. En algunas divulgaciones, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. En algunas divulgaciones, las células se suspenden en una solución de congelación, por ejemplo después de un paso de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunas divulgaciones puede usarse cualquiera de una variedad de soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo divulgado en la presente implica el uso de PBS que contiene un 20% de DMSO y un 8% de albúmina de suero humano (HSA), u otro medio de congelación celular adecuado. A continuación, se diluye 1:1 con medio de tal manera que la concentración final de DMSO y HSA sean del 10% y del 4%, respectivamente. A continuación, las células se congelan generalmente a -80° C a una tasa de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.
En algunas divulgaciones, las células se incuban y/o cultivan antes o en relación con manipulación genética. Los pasos de incubación pueden incluir cultivo, estimulación, activación y/o propagación. La incubación y/o manipulación puede llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para cultivo de células. En algunas divulgaciones, las poblaciones o células se incuban en presencia de condiciones de estimulación o de un agente estimulador. Tales condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células de la población, para imitar la exposición al antígeno y/o para preparar las células para la manipulación genética, como por ejemplo para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.
Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes, por ejemplo nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimuladores, como citoquinas, quimioquinas, antígenos, moléculas de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
En algunas divulgaciones, las condiciones o agentes de estimulación incluyen uno o más agentes, por ejemplo ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunas divulgaciones, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular TCR/CD3 en una célula T. Tales agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un TCR, por ejemplo anti-CD3. En algunas divulgaciones, las condiciones de estimulación incluyen uno o más agentes, por ejemplo ligando, que es capaz de estimular un receptor coestimulador, por ejemplo anti-CD28. En algunas divulgaciones, tales agentes y/o ligandos pueden estar unidos a un soporte sólido, como una perla, y/o una o más citoquinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 al medio de cultivo (por ejemplo a una concentración de por lo menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunas divulgaciones, los agentes de estimulación incluyen IL-2, IL-15 y/o IL-7. En algunas divulgaciones, la concentración de IL-2 es de por lo menos aproximadamente 10 unidades/ml.
En algunas divulgaciones, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de Estados Unidos N° 6.040.177, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, y/o Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
En algunas divulgaciones, las células T se expanden añadiendo a una población iniciadora de cultivo células alimentadoras, como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) no divididas, (por ejemplo, de tal manera que la población resultante de células contenga por lo menos aproximadamente 5, 10, 20 o 40 o más células alimentadoras PBMC por cada linfocito T de la población inicial que se va a expandir); e incubando el cultivo (por ejemplo durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunas divulgaciones, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras de PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunas divulgaciones, las PBMC se irradian con rayos gamma en un intervalo de aproximadamente 3000 a 3600 rads para evitar la división celular. En algunas divulgaciones, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.
En algunas divulgaciones, las condiciones de estimulación incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo por lo menos aproximadamente 25 grados Celsius, generalmente por lo menos aproximadamente 30 grados, y generalmente aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además añadir células linfoblastoides (LCL) no divididas transformadas por EBV como células alimentadoras. Las LCL pueden irradiarse con rayos gamma en un intervalo de aproximadamente 6000 a 10.000 rads. En algunas divulgaciones las células alimentadoras LCL se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de por lo menos aproximadamente 10:1.
En las divulgaciones, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando linfocitos T vírgenes o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo pueden generarse líneas o clones de células T específicas de antígeno para antígenos de citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las células in vitro con el mismo antígeno.
V. COMPOSICIONES Y FORMULACIONES
En algunos ejemplos, en la presente se divulgan composiciones terapéuticas (por ejemplo composiciones de células T terapéuticas) generadas mediante cualquiera de los procesos de fabricación divulgados en la presente, por ejemplo una composición de salida que contiene células T manipuladas (que expresan receptores recombinantes). En algunos ejemplos, se divulgan en la presente composiciones terapéuticas (por ejemplo composiciones de células T terapéuticas) que tienen una o más de las características divulgadas en la presente, por ejemplo en la Sección III-F. En algunas divulgaciones, la dosis de células que comprende células manipuladas con un receptor de antígeno recombinante, por ejemplo CAR o TCR, se divulga como una composición o formulación, como una composición o formulación farmacéutica. Tales composiciones pueden usarse de acuerdo con los métodos divulgados, y/o con los artículos de fabricación o composiciones divulgados, como en la prevención o tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos, o en métodos de detección, diagnóstico y pronóstico.
En algunas realizaciones, la composición de células T terapéuticas contiene células T CD4+ que expresan un receptor recombinante y células T CD8+ que expresan un receptor recombinante, en donde por lo menos el 80% o el total de células receptor+/CD8+ de la composición son CD57- y por lo menos el 80% del total de células receptor+/CD4+ de la composición son CD57-. En algunas divulgaciones, la composición de células T terapéuticas es una en la que por lo menos o por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 85%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 90%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 96%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 97%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 98%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 99%, aproximadamente el 100%, o el 100% de las células en la composición son células T CD4+ y células T CD8+.
En algunas divulgaciones, la composición de células T terapéuticas incluye células T CD3+ que expresan un receptor recombinante, en el que por lo menos el 80% o el total de células receptor+/CD3+ en la composición son CD57-. En algunas divulgaciones, la composición de células T terapéuticas es una en la que por lo menos o por lo menos aproximadamente el 80%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 85%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 90%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 95%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 96%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 97%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 98%, por lo menos o por lo menos aproximadamente el 99%, aproximadamente el 100% o el 100% de las células de la composición son células T CD3+.
En algunas divulgaciones, la composición de células T terapéuticas contiene una proporción definida de células T CD4 y CD8. En algunas divulgaciones, la proporción de células T receptoras+/CD4+ a células T receptoras+/CD8+ en la composición está entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1, como 1:1 o aproximadamente.
En algunas divulgaciones, el receptor recombinante es cualquiera de los descritos en la Sección IVA. En algunas divulgaciones, el receptor recombinante es capaz de unirse a una proteína diana que está asociada a, es específica parade y/o se expresa en una célula o tejido de una enfermedad, trastorno o afección. En algunas divulgaciones, el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).
En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está comprendido entre o aproximadamente 10 x 106 células y o aproximadamente 200 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 10 x 106 células y o aproximadamente 100 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 10 x 106 células y o aproximadamente 70 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 10 x 106 células y o aproximadamente 50 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está comprendido entre o aproximadamente 50 x 106 células y o aproximadamente 200 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 50 x 106 células y o aproximadamente 100 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 50 x 106 células y o aproximadamente 70 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 70 x 106 células y o aproximadamente 200 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 70 x 106 células y o aproximadamente 100 x 106 células. En algunas divulgaciones, el número de células T viables en una composición terapéutica divulgada está entre o aproximadamente 100 x 106 células y o aproximadamente 200 x 106 células. En algunas divulgaciones, el volumen de la composición está entre 1,0 ml y 10 ml. En algunas divulgaciones, el volumen es de o de aproximadamente 2 ml, de o de aproximadamente 3 ml, de o de aproximadamente 4 ml, de o de aproximadamente 5 ml, de o de aproximadamente 6 ml, de o de aproximadamente 7 ml, de o de aproximadamente 8 ml, de o de aproximadamente 9 ml, o de o de aproximadamente 10 ml, o cualquier valor entre cualquiera de los anteriores.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación cuya forma permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en ella sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" es un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
En algunas divulgaciones, la elección del portador viene determinada en parte por la célula o agente particular y/o por el método de administración. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo metilparabeno, propilparabeno, benzoato sódico y cloruro de benzalconio. En algunas divulgaciones, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o las mezclas de los mismos están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total. Los portadores se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones, como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como el polietilenglicol (PEG).
En algunas divulgaciones se incluyen en las composiciones agentes tamponadores. Entre los agentes tamponadores adecuados se incluyen, por ejemplo ácido cítrico, citrato sódico, ácido fosfórico, fosfato potásico y otros ácidos y sales. En algunas divulgaciones, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o las mezclas del mismo están presentes típicamente en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed.<( 1>de mayo de 2005).
La formulación o composición también puede contener más de un principio activo útil para la indicación, enfermedad o afección particular que se esté previniendo o tratando con las células o agentes, cuando las actividades respectivas no se vean afectadas negativamente entre sí. Tales ingredientes activos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunas divulgaciones, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En algunas divulgaciones, los agentes o las células se administran en forma de sal, por ejemplo una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo el ácido p-toluenosulfónico.
En algunas divulgaciones, la composición farmacéutica contiene agentes o células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. En algunas divulgaciones, la eficacia terapéutica o profiláctica se monitoriza mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles y pueden determinarse otros regímenes de dosificación. La dosificación deseada puede administrarse mediante una única administración en bolo de la composición, mediante múltiples administraciones en bolo de la composición o mediante la administración de la composición en infusión continua.
Los agentes o células pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo por infusión en bolo, por inyección, por ejemplo inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconyuntival, inyección subconjuntival, inyección subtenoniana, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunas divulgaciones, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunas divulgaciones, una dosis dada se administra mediante una única administración en bolo de las células o el agente. En algunas divulgaciones, se administra mediante múltiples administraciones en bolo de las células o el agente, por ejemplo durante un periodo de no más de 3 días, o mediante la administración en infusión continua de las células o el agente.
Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosificación adecuada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de agente o agentes, el tipo de células o receptores recombinantes, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el agente o las células se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del sujeto y la respuesta al agente o las células, y el criterio del médico tratante. En algunas divulgaciones, las composiciones se administran adecuadamente al sujeto de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Las células o agentes pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. Se divulgan formulaciones y dispositivos, como jeringuillas y viales, para el almacenamiento y la administración de las composiciones. Con respecto a las células, la administración puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo pueden obtenerse de un sujeto las células o progenitores inmunosensibles y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto diferente y compatible. Las células inmunosensibles derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo una composición farmacéutica que contiene una célula inmunosensible modificada genéticamente o un agente que trata o mejora los síntomas de neurotoxicidad), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión, emulsión).
Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunas divulgaciones, el agente o las poblaciones celulares se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunas divulgaciones, el agente o las poblaciones celulares se administran a un sujeto mediante administración sistémica periférica por inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
En algunas divulgaciones las composiciones se divulgan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunas divulgaciones pueden estar tamponadas a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Por otra parte, las composiciones viscosas pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad adecuado para proporcionar periodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el agente o las células en un solvente, por ejemplo en mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares.
Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo generalmente son estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo por filtración a través de membranas de filtración estériles.
VI. MÉTODOS DE TRATAMIENTO
En la presente se divulgan métodos de tratamiento, por ejemplo que incluyen administrar cualquiera de las células manipuladas o composiciones que contienen células manipuladas descritas en la presente. En algunas divulgaciones, también se divulgan métodos de administración de cualquiera de las células manipuladas o composiciones que contienen células manipuladas descritas en la presente a un sujeto, como un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno. En algunas divulgaciones, también se divulgan usos de cualquiera de las células manipuladas o composiciones que contienen células manipuladas descritas en la presente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En algunas divulgaciones, también se divulgan usos de cualquiera de las células manipuladas o composiciones que contienen células manipuladas descritas en la presente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. En algunas divulgaciones, también se divulgan cualquiera de las células manipuladas o composiciones que contienen células manipuladas descritas en la presente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno, o para su administración a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno.
Se conocen métodos de administración de células para terapia celular adoptiva y pueden usarse en relación con los métodos y composiciones divulgados. Por ejemplo los métodos de terapia celular T adoptiva se describen, por ejemplo en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente de Estados Unidos N° 4,690,915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Consultar, por ejemplo Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
En algunas divulgaciones, al sujeto, por ejemplo un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno, se le administra una terapia celular que tiene una cantidad baja o reducida de células T CD57+. En divulgaciones particulares, la cantidad o frecuencia de células CD57+ en la terapia celular se mide antes de la administración. En ciertas divulgaciones, la terapia celular tiene menos o menos de aproximadamente un 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 1% de células T CD57+. En ciertas divulgaciones, se mide la cantidad o frecuencia de células CD57+ en la terapia celular, y la terapia celular se administra al sujeto si la terapia celular tiene menos de o menos de aproximadamente un 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, o 1% de células T CD57+. En algunas divulgaciones, la terapia celular tiene menos de o menos de aproximadamente un 25% de células T CD57. En ciertas divulgaciones, la terapia celular tiene menos de o menos de aproximadamente un 10% de células T CD57. En ciertas divulgaciones, la terapia celular tiene menos de o menos de aproximadamente una cantidad umbral de células T CD57+.
En divulgaciones particulares, al sujeto, por ejemplo un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno, se le administra una terapia celular que tiene una cantidad baja o reducida de células T positivas para la expresión de CD57 o una cantidad baja o reducida de un rasgo asociado con la expresión de CD57. En algunas divulgaciones, el rasgo asociado con la expresión de CD57 se mide en células de una terapia celular antes de administrar la terapia celular a un sujeto. En algunas divulgaciones, el rasgo asociado con la expresión de CD57 se mide en las células de la terapia celular, y la terapia celular se administra al sujeto si la terapia celular tiene menos de un valor umbral del rasgo asociado con la expresión de CD57.
En divulgaciones particulares, el valor umbral es un valor predeterminado. En algunas divulgaciones, el valor umbral se obtiene experimentalmente. En algunas divulgaciones, el valor umbral es un valor medio, mediano o promedio del rasgo medido en una pluralidad de terapias celulares. En algunas divulgaciones, el valor umbral se deriva experimentalmente de mediciones de una pluralidad de terapias celulares, por ejemplo terapias celulares de referencia. En algunas divulgaciones, las terapias celulares de referencia son composiciones de referencia de células T, por ejemplo composiciones de células T que incluyen células T que expresan un receptor recombinante. En divulgaciones particulares, las composiciones de referencia de células T, por ejemplo células T que expresan un receptor recombinante, se miden antes de la administración a los sujetos.
En divulgaciones particulares, las terapias celulares de referencia o composiciones de células T de referencia son composiciones de la terapia celular que comprenden células T, por ejemplo, que incluyen células T que expresan un receptor recombinante, de entre un grupo de sujetos que pasaron a recibir la terapia celular para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección. En algunas divulgaciones, la terapia celular de referencia o las composiciones de células T de referencia son composiciones de células T que se administraron a sujetos que desarrollaron una respuesta parcial o una enfermedad progresiva.
En algunas divulgaciones, el rasgo asociado con la expresión de CD57 es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 presente en las células T totales, células T CD4+ totales o células T CD8+ totales. En divulgaciones particulares, el rasgo es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 presente en el total de células T, células T CD4+ o células T CD8+ de la dosis. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 presente en la superficie de las células T, células T CD4+ o células T CD8+ totales. En varias divulgaciones, el rasgo es una frecuencia, porcentaje o cantidad de células T CD57+, células T CD57+CD4+ o células T CD57+CD8+. En ciertas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de ARNm de CD57 presente en las células T de la dosis. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de accesibilidad del gen que codifica CD57 (B3GAT1).
En algunas divulgaciones, el rasgo asociado con la expresión de CD57 es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 presente en el total de células T CD3+. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 presente en el total de células T CD3+ de la dosis. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de polipéptido de CD57 presente en la superficie de las células T CD3+ totales. En varias divulgaciones, el rasgo es una frecuencia, porcentaje o cantidad de células T CD57+CD3+. En ciertas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de ARNm de CD57 presente en las células T de la dosis. En algunas divulgaciones, el rasgo es un nivel o cantidad de accesibilidad del gen que codifica CD57 (B3GAT1).
En divulgaciones particulares, el valor umbral es, es de aproximadamente, o está dentro del 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, o dentro de menos del 1% por debajo de una medición media, promedio o mediana del rasgo asociado con la expresión de CD57 en una pluralidad de terapias celulares de referencia o composiciones de células T de referencia. La cantidad está por debajo de uno, la mitad, un tercio, un cuarto, un quinto, un sexto, un octavo o un décimo de una desviación estándar por debajo de la medición media, promedio o mediana del rasgo. En divulgaciones particulares, el valor umbral está por debajo de una medición más baja del rasgo asociado con la expresión de CD57 en una composición de entre una pluralidad de composiciones de células T de referencia o terapias celulares de referencia. En algunas divulgaciones, el umbral está dentro o dentro de aproximadamente el 50%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, o dentro de menos del 1% por debajo de la medición más baja del rasgo medido entre la pluralidad de terapias celulares de referencia o composiciones de células T de referencia. En ciertas divulgaciones, el valor umbral está por debajo de una medición media, mediana o promedio del rasgo asociado con la expresión de CD57 calculada de entre una frecuencia en las composiciones de células T de referencia o terapias celulares de referencia. En algunas divulgaciones, el valor umbral es la medición media, mediana o promedio de, de aproximadamente o de por lo menos el 25%, 33%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de las mediciones tomadas de una pluralidad de composiciones de células T de referencia.
En divulgaciones particulares, el rasgo asociado con la expresión de CD57 se mide en la terapia celular antes de administrar la terapia celular a un sujeto. En algunas divulgaciones, la medición se usa para evaluar el riesgo, la probabilidad o la posibilidad de que el sujeto no experimente una respuesta completa. En ciertas divulgaciones, la medición se usa para evaluar el riesgo, la probabilidad o la posibilidad de que el sujeto experimente una respuesta parcial o un resultado de enfermedad progresiva tras la administración de una terapia celular. En ciertas divulgaciones, se determina que el sujeto tiene un mayor riesgo, probabilidad o posibilidad de no experimentar una respuesta completa tras la administración de la terapia celular si el valor del rasgo es mayor que un valor umbral del rasgo. En algunas divulgaciones, se determina que el sujeto tiene un mayor riesgo, probabilidad o posibilidad de experimentar una respuesta parcial o una enfermedad progresiva tras la administración de la terapia celular si el valor del rasgo es mayor que un valor umbral del rasgo. En algunas divulgaciones, el valor umbral es cualquier valor umbral del rasgo asociado con CD57 descrito en la presente.
En algunas divulgaciones, los sujetos que se considera que tienen un mayor riesgo de no lograr una respuesta completa tras la administración de una terapia celular logran una respuesta completa con una frecuencia de menos o menos de aproximadamente el 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o menos del 10% tras la administración de una dosis de la terapia celular. En algunas divulgaciones, los sujetos considerados con un riesgo aumentado de no lograr una respuesta completa pasan a lograr una respuesta completa con una frecuencia menor del 20% tras la administración de una dosis de la terapia celular. En varias divulgaciones, los sujetos que se considera que tienen un riesgo aumentado de no lograr una respuesta completa logran una respuesta completa con frecuencias de o aproximadamente el 0% después de la administración de una dosis de la terapia celular.
En ciertas divulgaciones, los sujetos que se considera que tienen un mayor riesgo de lograr una respuesta parcial o un desenlace de enfermedad progresiva tras la administración de una terapia celular llegan a lograr una respuesta completa con una frecuencia de menos o menos de aproximadamente el 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15% 10% o menos del 10% tras la administración de una dosis de la terapia celular. En varias divulgaciones, los sujetos que se considera que tienen un riesgo aumentado de lograr una respuesta parcial o un desenlace de enfermedad progresiva llegan a lograr una respuesta completa con una frecuencia de menos del 20% tras la administración de una dosis de la terapia celular. En varias divulgaciones, los sujetos que se considera que tienen un mayor riesgo de lograr una respuesta parcial o un resultado de enfermedad progresiva logran una respuesta completa con una frecuencia de o de aproximadamente el 0% después de la administración de una dosis de la terapia celular.
En divulgaciones particulares, los sujetos que se considera que tienen un mayor riesgo de no lograr una respuesta completa reciben una dosis aumentada de la terapia celular, por ejemplo para mejorar la probabilidad de que los sujetos logren una respuesta completa. En algunas divulgaciones, los sujetos que se considera que tienen un mayor riesgo de lograr una respuesta parcial o un desenlace progresivo de la enfermedad reciben una dosis aumentada de la terapia celular, por ejemplo para mejorar la probabilidad de que el sujeto logre una respuesta completa.
La enfermedad o afección que se trata puede ser cualquiera en la que la expresión de un antígeno esté asociada y/o implicada en la etiología de una enfermedad, afección o trastorno, por ejemplo que provoque, agrave o esté implicada de otro modo en dicha enfermedad, afección o trastorno. Las enfermedades y afecciones ejemplares pueden incluir enfermedades o afecciones asociadas con enfermedad maligna o transformación de células (por ejemplo cáncer), enfermedad autoinmune o inflamatoria, o una enfermedad infecciosa, por ejemplo provocada por un patógeno bacteriano, viral o de otro tipo. Los antígenos ejemplares, que incluyen antígenos asociados con varias enfermedades y afecciones que pueden tratarse, se han descrito anteriormente. En divulgaciones particulares, el receptor de antígeno quimérico o TCR transgénico se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección.
Entre las enfermedades, afecciones y trastornos se encuentran los tumores, incluyendo los tumores sólidos, las enfermedades malignas hematológicas y los melanomas, e incluyendo los tumores localizados y metastásicos, las enfermedades infecciosas, como la infección por un virus u otro patógeno, por ejemplo VIH, VHC, VHB, CMV, VPH, y las enfermedades parasitarias, y las enfermedades autoinmunes e inflamatorias. En algunas divulgaciones, la enfermedad, trastorno o afección es un tumor, cáncer, enfermedad maligna, neoplasia u otra enfermedad o trastorno proliferativo. Tales enfermedades incluyen pero no se limitan a leucemia, linfoma, por ejemplo leucemia mieloide aguda (o mielógena) (AML), leucemia mieloide crónica (o mielógena) (CML), leucemia linfocítica aguda (o linfoblástica) (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma de la zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma folicular, linfoma folicular refractario, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) y mieloma múltiple (MM). En algunas divulgaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad maligna de células B seleccionada entre leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL en adultos, leucemia linfoblástica crónica (CLL), linfoma no Hodgkin (NHL) y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). En algunas divulgaciones, la enfermedad o afección es NHL y el NHL se selecciona del grupo que consiste en NHL agresivo, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), NOS (de novo y transformado de indolente), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBCL), linfoma de células B grandes rico en células T/histocitos (TCHRBCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células del manto (MCL), y/o linfoma folicular (FL), opcionalmente, linfoma folicular de grado 3B (FL3B).
En algunas divulgaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa como, pero no limitadas a, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK. En algunas divulgaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria, como la artritis, por ejemplo la artritis reumatoide (RA), la diabetes de tipo I, el lupus eritematoso sistémico (SLE), la enfermedad inflamatoria intestinal, la psoriasis, la esclerodermia, la enfermedad tiroidea autoinmune, la enfermedad de Grave, la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple, el asma y/o una enfermedad o afección asociada a un trasplante.
En algunas divulgaciones, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno es o incluye integrina avp6 (integrina avb6), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocido como CAIX o G250), un antígeno de cáncer de testículos, antígeno de cáncer de testículos 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, Ligando 1 de quimiocinas con motivo C-C (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína truncada del factor de crecimiento epidérmico (tEGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico de tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógenos, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como receptor Fc homólogo 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glipicán-3 (GPC3), receptor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor IL-22 alfa (IL-22Ra), receptor IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, miembro A de la familia 8 que contiene repetición rica en leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno asociado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovirus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligandos del miembro D del grupo 2 de asesinas naturales (NKG2D), melanina A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferiblemente expresado de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostático específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor 1 huérfano similar a receptor de tirosina quinasa (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína relacionada con la tirosinasa 2 (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. Los antígenos a los que se dirigen los receptores en algunas divulgaciones incluyen antígenos asociados con una enfermedad maligna de células B, como cualquiera de una serie de marcadores de células B conocidos. En algunas divulgaciones, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30. En algunas divulgaciones, el antígeno es o incluye un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, como un antígeno viral (por ejemplo un antígeno viral del VIH, VHC, VHB), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.
En algunas divulgaciones, el anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo scFv o dominio Vh) reconoce específicamente un antígeno, como CD19. En algunas divulgaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se deriva de, o es una variante de, anticuerpos o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a CD19. En algunas divulgaciones, la terapia celular, por ejemplo la terapia celular T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o a partir de una muestra derivada de dicho sujeto. Por tanto, en algunas divulgaciones, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo un paciente, que necesita un tratamiento y las células, tras su aislamiento y procesamiento, se administran al mismo sujeto.
En algunas divulgaciones, la terapia celular, por ejemplo la terapia celular T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto del sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular, por ejemplo un primer sujeto. En tales divulgaciones, las células se administran entonces a un sujeto diferente, por ejemplo un segundo sujeto, de la misma especie. En algunas divulgaciones, el primer y el segundo sujetos son genéticamente idénticos. En algunas divulgaciones, el primer y el segundo sujeto son genéticamente similares. En algunas divulgaciones, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo de HLA que el primer sujeto.
Las células pueden administrarse mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo por infusión en bolo, por inyección, por ejemplo inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconyuntival, inyección subconjuntival, inyección subtenoniana, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunas divulgaciones, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunas divulgaciones, una dosis dada se administra mediante una única administración en bolo de las células. En algunas divulgaciones, se administra mediante múltiples administraciones en bolo de las células, por ejemplo durante un periodo de no más de 3 días, o mediante la administración en infusión continua de las células. En algunas divulgaciones, la administración de la dosis de células o de cualquier terapia adicional, por ejemplo la terapia de linfodepleción, la terapia de intervención y/o la terapia combinada, se lleva a cabo mediante administración ambulatoria.
Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosis adecuada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de células o receptores recombinantes, la gravedad y el curso de la enfermedad, si las células se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del sujeto y la respuesta a las células, y la discreción del médico tratante. En algunas divulgaciones, las composiciones y las células se administran adecuadamente al sujeto de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
En algunas divulgaciones, las células se administran como parte de un tratamiento de combinación, como simultáneamente con o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, como un anticuerpo o célula o receptor o agente manipulado, como un agente citotóxico o terapéutico. En algunas divulgaciones, las células se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en conexión con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cerca en el tiempo como para que las poblaciones celulares potencien el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunas divulgaciones, las células se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas divulgaciones, las células se administran después de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes adicionales incluyen una citoquina, como IL-2, por ejemplo para mejorar la persistencia. En algunas divulgaciones, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico.
En algunas divulgaciones, los métodos comprenden la administración de un agente quimioterapéutico, por ejemplo un agente quimioterapéutico condicionante, para reducir la carga tumoral antes de la administración.
En algunas divulgaciones, preacondicionar a los sujetos con terapias inmunodepletoras (por ejemplo linfodepletoras) puede mejorar los efectos de la terapia celular adoptiva (ACT).
Por tanto, en algunas divulgaciones, los métodos incluyen la administración de un agente preacondicionador, como un agente linfodepletor o quimioterapéutico, como ciclofosfamida, fludarabina, o combinaciones de los mismos, a un sujeto antes del inicio de la terapia celular. Por ejemplo puede administrarse al sujeto un agente preacondicionador por lo menos 2 días antes, como por lo menos 3, 4, 5, 6 o 7 días antes, del inicio de la terapia celular. En algunas divulgaciones, se administra al sujeto un agente preacondicionador no más de 7 días antes, como no más de 6, 5, 4, 3 o 2 días antes, del inicio de la terapia celular.
En algunas divulgaciones, el sujeto se preacondiciona con ciclofosfamida a una dosis de entre o entre aproximadamente 20 mg/kg y 100 mg/kg, como entre o entre aproximadamente 40 mg/kg y 80 mg/kg. En algunas divulgaciones, el sujeto se preacondiciona con o con aproximadamente 60 mg/kg de ciclofosfamida. En algunas divulgaciones, la ciclofosfamida puede administrarse en una dosis única o puede administrarse en una pluralidad de dosis, como administrarse diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunas divulgaciones, la ciclofosfamida se administra una vez al día durante uno o dos días. En algunas divulgaciones, cuando el agente linfodepletor comprende ciclofosfamida, al sujeto se le administra ciclofosfamida a una dosis entre o entre aproximadamente 100 mg/m2 y 500 mg/m2, como entre o entre aproximadamente 200 mg/m2 y 400 mg/m2, o 250 mg/m2 y 350 mg/m2, inclusive. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 300 mg/m2 de ciclofosfamida. En algunas divulgaciones, la ciclofosfamida puede administrarse en una dosis única o puede administrarse en una pluralidad de dosis, como administrarse diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunas divulgaciones, la ciclofosfamida se administra diariamente, como durante 1 a 5 días, por ejemplo durante de 3 a 5 días. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 300 mg/m2 de ciclofosfamida, diariamente durante 3 días, antes del inicio de la terapia celular.
En algunas divulgaciones, en las que el agente linfodepletor comprende fludarabina, al sujeto se le administra fludarabina a una dosis entre o entre aproximadamente 1 mg/m2 y 100 mg/m2, como entre o entre aproximadamente 10 mg/m2 y 75 mg/m2, 15 mg/m2 y 50 mg/m2, 20 mg/m2 y 40 mg/m2, o 24 mg/m2 y 35 mg/m2, inclusive. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 30 mg/m2 de fludarabina. En algunas divulgaciones, la fludarabina puede administrarse en una dosis única o puede administrarse en una pluralidad de dosis, como administrarse diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunas divulgaciones, la fludarabina se administra diariamente, como durante de 1 a 5 días, por ejemplo durante de 3 a 5 días. En algunos casos, al sujeto se le administran aproximadamente 30 mg/m2 de fludarabina, diariamente durante 3 días, antes del inicio de la terapia celular.
En algunas divulgaciones, el agente linfodepletor comprende una combinación de agentes, como una combinación de ciclofosfamida y fludarabina. Por tanto, la combinación de agentes puede incluir ciclofosfamida a cualquier dosis o programa de administración, como los descritos anteriormente, y fludarabina a cualquier dosis o programa de administración, como los descritos anteriormente. Por ejemplo en algunas divulgaciones, al sujeto se le administran 60 mg/kg (~2 g/m2) de ciclofosfamida y de 3 a 5 dosis de 25 mg/m2 de fludarabina antes de la primera dosis o dosis posterior.
Después de la administración de las células, en algunas divulgaciones se mide la actividad biológica de las poblaciones celulares manipuladas, por ejemplo mediante cualquiera de los métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o artificial u otra célula inmunitaria al antígeno, in vivo, por ejemplo mediante imágenes, o ex vivo, por ejemplo mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertas divulgaciones, puede medirse la capacidad de las células manipuladas para destruir células diana usando cualquier método conocido adecuado, como los ensayos de citotoxicidad descritos en, por ejemplo Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En ciertas divulgaciones, la actividad biológica de las células se mide ensayando la expresión y/o secreción de una o más citoquinas, como CD107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunas divulgaciones, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral.
En ciertas divulgaciones, las células manipuladas se modifican adicionalmente de varias maneras, de tal manera que se aumenta su eficacia terapéutica o profiláctica. Por ejemplo el CAR o TCR manipulado expresado por la población puede conjugarse directa o indirectamente a través de un conector con una fracción diana. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo el CAR o el TCR, con elementos diana es conocida. Consultar, por ejemplo Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995), y la Patente de Estados Unidos 5,087,616.
En algunas divulgaciones, las células se administran como parte de un tratamiento combinado, como simultáneamente con o secuencialmente con, en cualquier orden, otra intervención terapéutica, como un anticuerpo o célula o receptor o agente manipulado, como un agente citotóxico o terapéutico. En algunas divulgaciones, las células se coadministran con uno o más agentes terapéuticos adicionales o en relación con otra intervención terapéutica, ya sea simultánea o secuencialmente en cualquier orden. En algunos contextos, las células se coadministran con otra terapia lo suficientemente cerca en el tiempo como para que las poblaciones celulares potencien el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunas divulgaciones, las células se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas divulgaciones, las células se administran después de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunas divulgaciones, el uno o más agentes adicionales incluyen una citoquina, como IL-2, por ejemplo para aumentar la persistencia.
A. Dosificación
En algunas divulgaciones, se administra una dosis de células a los sujetos de acuerdo con los métodos divulgados, y/o con los artículos de fabricación o composiciones divulgados. En algunas divulgaciones, el tamaño o la cadencia de administración de las dosis se determina en función de la enfermedad o afección particular del sujeto. En algunos casos divulgados en la presente, el tamaño o la cadencia de las dosis para una enfermedad particular en vista de la descripción divulgada puede determinarse empíricamente.
En algunas divulgaciones, la dosis de células comprende entre o aproximadamente 2 x 105 de las células/kg y o aproximadamente 2 x 106 de las células/kg, como entre o aproximadamente 4 x 105 de las células/kg y o aproximadamente 1 x 106 de las células/kg o entre o aproximadamente 6 x 105 de las células/kg y o aproximadamente 8 x 105 de las células/kg. En algunas divulgaciones, la dosis de células comprende no más de 2 x 105 de las células (por ejemplo, que expresan antígeno, como células que expresan CAR) por kilogramo de peso corporal del sujeto (células/kg), como no más de o aproximadamente 3 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 4 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 5 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 6 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 7 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 8 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 9 x 105 células/kg, no más de o aproximadamente 1 x 106 células/kg, o no más de o aproximadamente 2 x 106 células/kg. En algunas divulgaciones, la dosis de células comprende por lo menos o por lo menos aproximadamente 0 de o de aproximadamente 2 x 105 de las células (por ejemplo que expresan antígeno, como células que expresan CAR) por kilogramo de peso corporal del sujeto (células/kg), como por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o aproximadamente 3 x 105 células/kg, por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 4 x 105 células/kg, por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 5 x 105 células/kg, por 10 menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 6 x 105 células/kg, por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 7 x 105 células/kg, por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 8 x 105 células/kg, por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 9 x 105 células/kg, por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 1 x 106 células/kg, o por lo menos o por lo menos aproximadamente o de o de aproximadamente 2 x 106 células/kg.
En ciertas divulgaciones, las células, o poblaciones individuales de subtipos de células, se administran al sujeto en un intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células y/o esa cantidad de células por kilogramo de peso corporal, como, por ejemplo de 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo aproximadamente 5 millones de células, 10 millones de células, aproximadamente 15 millones de células, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1.000 millones de células, aproximadamente 5.000 millones de células, aproximadamente 20.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 40.000 millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), como por ejemplo de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100.000 millones de células (por ejemplo aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10.000 millones de células, aproximadamente 25.000 millones de células, aproximadamente 50.000 millones de células, aproximadamente 75.000 millones de células, aproximadamente 90.000 millones de células, o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores), y en algunos casos divulgados en la presente de aproximadamente 100 millones de células a aproximadamente 50.000 millones de células (por ejemplo aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 45.000 millones de células) o cualquier valor entre estos intervalos y/o por kilogramo de peso corporal. Las dosis pueden variar dependiendo de los atributos particulares de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/o de otros tratamientos.
En algunas divulgaciones, la dosis de células es una dosis plana de células o una dosis fija de células tal que la dosis de células no está ligada o basada en el área de superficie corporal o el peso de un sujeto.
En algunas divulgaciones, por ejemplo cuando el sujeto es un humano, la dosis incluye menos de aproximadamente 5 x 108 células totales que expresan receptores recombinantes (por ejemplo CAR), células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a 5 x 108 de tales células, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, o 5 x 108 de tales células totales, o el intervalo entre dos cualquiera de los valores anteriores.
En algunas divulgaciones, la dosis de células manipuladas genéticamente comprende de o de aproximadamente 1 x 105 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 5 x 107 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 2.5 x 107 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 1 x 107 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 5 x 106 células T que expresan c A r totales, 1 x 105 a 2.5 x 106 células T que expresan CAR totales, 1 x 105 a 1 x 106 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 5 x 107 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 2.5 x 107 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 1 x 107 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 5 x 106 células T que expresan CAR totales, 1 x 106 a 2.5 x 106 células T que expresan<c>Ar totales, 2.5 x 106 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 106 a 2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 106 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 106 a 5 x 107 células T que expresan CAR totales,
2.5 x 106 a 2.5 x 107 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 106 a 1 x 107 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 106 a 5 x 106 células T que expresan CAR totales, 5 x 106 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 5 x 106 a
2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, 5 x 106 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 5 x 106 a 5 x
107 células T que expresan CAR totales, 5 x 106 a 2.5 x 107 células T que expresan CAR totales, 5 x 106 a 1 x
107 células T que expresan CAR totales, 1 x 107 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 107 a 2.5 x
108 células T que expresan CAR totales, 1 x 107 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 107 a 5 x 107 células
T que expresan CAR totales, 1 x 107 a 2.5 x 107 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 107 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 107 a 2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 107 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 2.5 x 107 a 5 x 107 células T que expresan CAR totales, 5 x 107 a 5 x 108 células T que expresan<c>A r totales, 5 x 107 a 2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, 5 x 107 a 1 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 108 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales, 1 x 108 a 2.5 x 108 células T que expresan CAR totales, o 2.5 x 108 a 5 x 108 células T que expresan CAR totales.
En algunas divulgaciones, la dosis de células manipuladas genéticamente comprende por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 105 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 2,5 x 105 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 5 x 105 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 106 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 2.5 x 106 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 5 x 106 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 107 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 2.5 x 107 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente
5 x 107 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 108 células que expresan CAR, por lo menos o por lo menos aproximadamente 2,5 x 108 células que expresan CAR, o por lo menos o por lo menos aproximadamente 5 x 108 células que expresan CAR.
En algunas divulgaciones, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 x 105 a 5 x 108 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, de o de aproximadamente 5 x 105 a 1 x 107 de células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales o de o de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 107 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, cada uno inclusive.
En algunas divulgaciones, la terapia celular comprende la administración de una dosis de células que comprende un número de células de por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 105 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, como por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 106, por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 107, por lo menos o por lo menos aproximadamente 1 x 108 de tales células. En algunas divulgaciones, el número se refiere al número total de células CD3+ o CD8+, en algunos casos divulgados en la presente también células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo CAR+). En algunas divulgaciones, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 x 105 a 5 x 108 células T CD3+ o CD8+ totales
0 células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, de o de aproximadamente 5 x 105 a 1 x 107 células
T CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes totales, o de o de aproximadamente
1 x 106 a 1 x 107 células T CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes totales, cada una inclusive. En algunas divulgaciones, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 x 105 a 5 x 108 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, de o de aproximadamente 5 x 105 a 1 x 107 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, o de o de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 107 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, cada una inclusive.
En algunas divulgaciones, las células T de la dosis incluyen células T CD4+, células T CD8+ o células T
CD4+ y CD8+.
En algunas divulgaciones, por ejemplo cuando el sujeto es humano, las células T CD8+ de la dosis, incluyendo en una dosis que incluye células T CD4+ y CD8+, incluye entre aproximadamente 1 x 106 y 5 x 108 células
CD8+ que expresan receptor recombinante (por ejemplo, CAR) totales, por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 5 x 106 a 1 x 108 de tales células, tales células 1 x 10', 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107, 108 de tales células totales, o el intervalo entre dos cualquiera de los valores anteriores. En algunas divulgaciones, al paciente se le administran múltiples dosis, y cada una de las dosis o la dosis total puede estar dentro de cualquiera de los valores anteriores. En algunas divulgaciones, la dosis de células comprende la administración de 1 x 107 a 0,75 x 108 células totales T CD8+ que expresan receptores recombinantes, de 1 x 107 a 2,5 x 107 células totales T CD8+ que expresan receptores recombinantes, de 1 x 107 a 0,75 x 108 células totales T CD8+ que expresan receptores recombinantes, cada una inclusive. En algunas divulgaciones, la dosis de células comprende la administración de o de aproximadamente 1 x 10', 2,5 x 107, 5 x 1077,5 x 107, 1 x 108, o 5 x 108 células totales T CD8+ que expresan receptores recombinantes.
En algunas divulgaciones, la dosis de células, por ejemplo células T que expresan receptores recombinantes, se administra al sujeto como dosis única o se administra una sola vez en un periodo de dos semanas, un mes, tres meses, seis meses, 1 año o más.
En el contexto de la terapia celular adoptiva, la administración de una "dosis" dada abarca la administración de la cantidad o número dados de células como una composición única y/o una administración única ininterrumpida, por ejemplo como una inyección única o infusión continua, y también abarca la administración de la cantidad o número dados de células como una dosis dividida o como una pluralidad de composiciones, proporcionadas en múltiples composiciones o infusiones individuales, durante un periodo de tiempo especificado, como por ejemplo durante no más de 3 días. Por tanto, en algunos contextos, la dosis es una administración única o continua del número especificado de células, administrada o iniciada en un único momento. En algunos contextos, sin embargo, la dosis se administra en múltiples inyecciones o infusiones durante un periodo de no más de tres días, como una vez al día durante tres días o durante dos días o mediante múltiples infusiones durante un periodo de un solo día.
Por tanto, en algunas divulgaciones, las células de la dosis se administran en una única composición farmacéutica. En algunas divulgaciones, las células de la dosis se administran en una pluralidad de composiciones, que contienen colectivamente las células de la dosis.
En algunas divulgaciones, el término "dosis dividida" se refiere a una dosis que se divide para que se administre en más de un día. Este tipo de dosificación se incluye en los presentes métodos y se considera una dosis única.
Por tanto, la dosis de células puede administrarse como una dosis dividida, por ejemplo una dosis dividida administrada a lo largo del tiempo. Por ejemplo en algunas divulgaciones, la dosis puede administrarse al sujeto durante 2 días o durante 3 días. Los métodos ejemplares para la dosificación dividida incluyen la administración del 25% de la dosis el primer día y la administración del 75% restante de la dosis el segundo día. En otras divulgaciones, puede administrarse el 33% de la dosis el primer día y el 67% restante el segundo día. En algunas divulgaciones, el 10% de la dosis se administra el primer día, el 30% de la dosis se administra el segundo día y el 60% de la dosis se administra el tercer día. En algunas divulgaciones, la dosis dividida no se reparte durante más de 3 días.
En algunas divulgaciones, las células de la dosis pueden administrarse mediante la administración de una pluralidad de composiciones o soluciones, como una primera y una segunda, opcionalmente más, cada una de las cuales contiene algunas células de la dosis. En algunas divulgaciones, la pluralidad de composiciones, cada una de las cuales contiene una población diferente y/o subtipos de células, se administran por separado o independientemente, opcionalmente dentro de un cierto periodo de tiempo. Por ejemplo las poblaciones o subtipos de células pueden incluir células T CD8+ y CD4+, respectivamente, y/o poblaciones enriquecidas con CD8+ y CD4+, respectivamente, por ejemplo células T CD4+ y/o CD8+ que incluyen cada una individualmente células manipuladas genéticamente para que expresen el receptor recombinante. En algunas divulgaciones, la administración de la dosis comprende la administración de una primera composición que comprende una dosis de células T CD8+ o una dosis de células T CD4+ y la administración de una segunda composición que comprende la otra de la dosis de células T CD4+ y las células T CD8+.
En algunas divulgaciones, la administración de la composición o dosis, por ejemplo la administración de la pluralidad de composiciones celulares, implica la administración de las composiciones celulares por separado. En algunas divulgaciones, las administraciones separadas se llevan a cabo simultáneamente, o secuencialmente, en cualquier orden. En algunas divulgaciones, la dosis comprende una primera composición y una segunda composición, y la primera composición y la segunda composición se administran con 0 a 12 horas de diferencia, 0 a 6 horas de diferencia o 0 a 2 horas de diferencia. En algunas divulgaciones, el inicio de la administración de la primera composición y el inicio de la administración de la segunda composición se llevan a cabo con no más de 2 horas, no más de 1 hora, o no más de 30 minutos de diferencia, no más de 15 minutos, no más de 10 minutos o no más de 5 minutos de diferencia. En algunas divulgaciones, el inicio y/o finalización de la administración de la primera composición y la finalización y/o inicio de la administración de la segunda composición se llevan a cabo con no más de 2 horas, no más de 1 hora, o no más de 30 minutos de diferencia, no más de 15 minutos, no más de 10 minutos o no más de 5 minutos de diferencia.
En alguna composición, la primera composición, por ejemplo la primera composición de la dosis, comprende células T CD4+. En alguna composición, la primera composición, por ejemplo la primera composición de la dosis, comprende células T CD8+. En algunas divulgaciones, la primera composición se administra antes de la segunda composición.
En algunas divulgaciones, la dosis o composición de células incluye una proporción definida u objetivo de células CD4+ que expresan un receptor recombinante con respecto a células CD8+ que expresan un receptor recombinante y/o de células CD4+ con respecto a células CD8+, proporción que opcionalmente es de aproximadamente 1:1 o está comprendida entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1, como aproximadamente 1:1. En algunas divulgaciones, la administración de una composición o dosis con la proporción objetivo o deseada de diferentes poblaciones celulares (como la proporción CD4+:CD8+ o la proporción<c>Ar CD4+:CAR+CD8+, por ejemplo 1:1) implica la administración de una composición celular que contiene una de las poblaciones y, a continuación, la administración de una composición celular separada que comprende la otra de las poblaciones, en donde la administración es o es aproximadamente en la proporción objetivo o deseada. En algunas divulgaciones, la administración de una dosis o composición de células en una proporción definida lleva a una expansión, persistencia y/o actividad antitumoral mejoradas de la terapia de células T.
En algunas divulgaciones, el sujeto recibe múltiples dosis, por ejemplo dos o más dosis o múltiples dosis consecutivas, de las células. En algunas divulgaciones, se administran dos dosis a un sujeto. En algunas divulgaciones, el sujeto recibe la dosis consecutiva, por ejemplo la segunda dosis, se administra aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días después de la primera dosis. En algunas divulgaciones, se administran múltiples dosis consecutivas después de la primera dosis, de tal manera que se administran una o varias dosis adicionales después de la administración de la dosis consecutiva. En algunas divulgaciones, el número de células administradas al sujeto en la dosis adicional es el mismo o similar a la primera dosis y/o dosis consecutiva. En algunas divulgaciones, la dosis o dosis adicionales son mayores que las dosis anteriores.
En algunas divulgaciones, el tamaño de la primera dosis y/o consecutiva se determina basándose en uno o más criterios como la respuesta del sujeto a un tratamiento anterior, por ejemplo quimioterapia, carga de la enfermedad en el sujeto, como carga tumoral, volumen, tamaño, o grado, extensión, o tipo de metástasis, estadio, y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo CRS, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad y/o una respuesta inmunitaria del huésped contra las células y/o los receptores recombinantes administrados.
En algunas divulgaciones, el tiempo entre la administración de la primera dosis y la administración de la dosis consecutiva es de aproximadamente 9 a aproximadamente 35 días, de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 días, o de 15 a 27 días. En algunas divulgaciones, la administración de la dosis consecutiva se realiza en un momento posterior a aproximadamente 14 días e inferior a aproximadamente 28 días después de la administración de la primera dosis. En algunas divulgaciones, el tiempo entre la primera dosis y la dosis consecutiva es de aproximadamente 21 días. En algunas divulgaciones, se administran una o varias dosis adicionales, por ejemplo dosis consecutivas, tras la administración de la dosis consecutiva. En algunas divulgaciones, la dosis o dosis consecutivas adicionales se administran por lo menos aproximadamente 14 y menos de aproximadamente 28 días después de la administración de una dosis anterior. En algunas divulgaciones, la dosis adicional se administra menos de aproximadamente 14 días después de la dosis anterior, por ejemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 días después de la dosis anterior. En algunas divulgaciones, no se administra ninguna dosis menos de aproximadamente 14 días después de la dosis anterior y/o no se administra ninguna dosis más de aproximadamente 28 días después de la dosis anterior.
En algunas divulgaciones, la dosis de células, por ejemplo células que expresan receptores recombinantes, comprende dos dosis (por ejemplo una dosis doble), que comprende una primera dosis de las células T y una dosis consecutiva de las células T, en donde una o ambas de la primera dosis y la segunda dosis comprende la administración de la dosis dividida de células T.
En algunas divulgaciones, la dosis de células es generalmente lo suficientemente grande como para ser eficaz en la reducción de la carga de la enfermedad.
En algunas divulgaciones, las células se administran a una dosificación deseada, que en algunas divulgaciones incluye una dosis o número deseado de células o tipo o tipos celulares y/o una proporción deseada de tipos celulares. Por tanto, la dosificación de células en algunas divulgaciones se basa en un número total de células (o número por kg de peso corporal) y una proporción deseada de las poblaciones individuales o subtipos, como la proporción de CD4+ a CD8+. En algunas divulgaciones, la dosificación de células se basa en un número total deseado (o número por kg de peso corporal) de células en las poblaciones individuales o de tipos celulares individuales. En algunas divulgaciones, la dosificación se basa en una combinación de tales características, como un número deseado de células totales, una proporción deseada y un número total deseado de células en las poblaciones individuales.
En algunas divulgaciones, las poblaciones o subtipos de células, como las células T CD8+ y CD4+, se administran a o en el plazo de una diferencia tolerada de una dosis deseada de células totales, como una dosis deseada de células T. En algunas divulgaciones, la dosis deseada es un número deseado de células o un número deseado de células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo células/kg. En algunas divulgaciones, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células o un número mínimo de células por unidad de peso corporal. En algunas divulgaciones, entre las células totales, administradas a la dosis deseada, las poblaciones o subtipos individuales están presentes en o cerca de una proporción de salida deseada (como la proporción de CD4+ a c D8+), por ejemplo dentro de una cierta diferencia o error tolerado de dicha proporción.
En algunas divulgaciones, las células se administran en o dentro de una diferencia tolerada de una dosis deseada de una o más de las poblaciones individuales o subtipos de células, como una dosis deseada de células CD4+ y/o una dosis deseada de células CD8+. En algunas divulgaciones, la dosis deseada es un número deseado de células del subtipo o población, o un número deseado de tales células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo células/kg. En algunas divulgaciones, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células de la población o subtipo, o un número mínimo de células de la población o subtipo por unidad de peso corporal.
Por tanto, en algunas divulgaciones, la dosificación se basa en una dosis fija deseada de células totales y una proporción deseada, y/o se basa en una dosis fija deseada de uno o más, por ejemplo cada uno, de los subtipos o subpoblaciones individuales. Por tanto, en algunas divulgaciones, la dosificación se basa en una dosis fija o mínima deseada de células T y una proporción deseada de células CD4+ a CD8+, y/o se basa en una dosis fija o mínima deseada de células CD4+ y/o CD8+.
En algunas divulgaciones, las células se administran en o dentro de un intervalo tolerado de una proporción de salida deseada de múltiples poblaciones o subtipos celulares, como células o subtipos CD4+ y CD8+. En algunas divulgaciones, la proporción deseada puede ser una proporción específica o puede ser un intervalo de proporciones. por ejemplo en algunas divulgaciones, la proporción deseada (por ejemplo proporción de células CD4+ a células CD8+) está entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 5:1 (o más de aproximadamente 1:5 y menos de aproximadamente 5:1), o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1 (o más de aproximadamente 1:3 y menos de aproximadamente 3:1), como entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:5 (o más de aproximadamente 1:5 y menos de aproximadamente 2:1, como aproximadamente 5:1,4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1,2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, o 1:5. En algunas divulgaciones, la diferencia tolerada está dentro de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50% de la proporción deseada, incluyendo cualquier valor entre estos intervalos.
En divulgaciones particulares, los números y/o concentraciones de células se refieren al número de células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo CAR). En otras divulgaciones, los números y/o concentraciones de células se refieren al número o concentración de todas las células, células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) administradas.
En algunas divulgaciones, el tamaño de la dosis se determina sobre la base de uno o más criterios como la respuesta del sujeto a un tratamiento previo, por ejemplo quimioterapia, carga de la enfermedad en el sujeto, como carga tumoral, volumen, tamaño, o grado, extensión o tipo de metástasis, estadio, y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo<c>R<s>, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad, y/o una respuesta inmunitaria del huésped contra las células y/o receptores recombinantes que se administran.
En algunas divulgaciones, los métodos también incluyen la administración de una o más dosis adicionales de células que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) y/o terapia de linfodepleción, y/o se repiten uno o más pasos de los métodos. En algunas divulgaciones, la una o más dosis adicionales es la misma que la dosis inicial. En algunas divulgaciones, la una o más dosis adicionales es diferente de la dosis inicial, por ejemplo más alta, como 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces o más alta que la dosis inicial, o más baja, como por ejemplo más alta, como 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces o más baja que la dosis inicial. En algunas divulgaciones, la administración de una o más dosis adicionales se determina sobre la base de la respuesta del sujeto al tratamiento inicial o a cualquier tratamiento anterior, la carga de la enfermedad en el sujeto, como la carga tumoral, el volumen, el tamaño, o el grado, la extensión o el tipo de metástasis, el estadio, y/o la probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos, por ejemplo CRS, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad, y/o una respuesta inmunitaria del huésped contra las células y/o los receptores recombinantes que se administran.
VII. COMPOSICIONES Y FORMULACIONES
En algunas divulgaciones, la dosis de células que comprende células manipuladas con un receptor de antígeno recombinante, por ejemplo CAR o TCR, se divulga como una composición o formulación, como una composición o formulación farmacéutica. Tales composiciones pueden usarse de acuerdo con los métodos divulgados, y/o con los artículos de fabricación o composiciones divulgados, como en la prevención o tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos, o en métodos de detección, diagnóstico y pronóstico.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación cuya forma permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en ella sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" es un ingrediente de una formulación farmacéutica, distinto del ingrediente activo, que no es tóxico para el sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
En algunas divulgaciones, la elección del portador viene determinada en parte por la célula o agente particular y/o por el método de administración. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo metilparabeno, propilparabeno, benzoato sódico y cloruro de benzalconio. En algunas divulgaciones, se usa una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o mezclas de los mismos típicamente están presentes en una cantidad comprendida entre el 0,0001% y el 2% en peso de la composición total. Los postadores se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones, como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos como el polietilenglicol (PEG).
En algunas divulgaciones se incluyen agentes tamponadores en las composiciones. Entre los agentes tamponadores adecuados se incluyen, por ejemplo ácido cítrico, citrato sódico, ácido fosfórico, fosfato potásico y otros ácidos y sales. En algunas divulgaciones, se usa una mezcla de dos o más agentes tamponadores. El agente tamponador o las mezclas de los mismos están presentes típicamente en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed.<( 1>de mayo de 2005).
La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección particulara que se esté previniendo o tratando con las células o agentes, cuando las actividades respectivas no se afectan negativamente entre sí. Tales ingredientes activos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido. Por tanto, en algunas divulgaciones, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos, por ejemplo asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En algunas divulgaciones, los agentes o células se administran en forma de sal, por ejemplo una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo el ácido p-toluenosulfónico.
En algunas divulgaciones, la composición farmacéutica contiene agentes o células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. En algunas divulgaciones, la eficacia terapéutica o profiláctica se controla mediante la evaluación periódica de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles y pueden determinarse otros regímenes de dosificación. La dosis deseada puede administrarse mediante una única administración en bolo de la composición, mediante múltiples administraciones en bolo de la composición o mediante la administración de la composición en infusión continua.
Los agentes o células pueden administrarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo por infusión en bolo, por inyección, por ejemplo inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconyuntival, inyección subconjuntival, inyección subtenoniana, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunas divulgaciones, se administran por vía parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunas divulgaciones, una dosis dada se administra mediante una única administración en bolo de las células o el agente. En algunas divulgaciones, se administra mediante múltiples administraciones en bolo de las células o el agente, por ejemplo durante un periodo de no más de 3 días, o mediante la administración en infusión continua de las células o el agente.
Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosificación adecuada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de agente o agentes, el tipo de células o receptores recombinantes, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el agente o las células se administran con propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del sujeto y la respuesta al agente o las células, y la discreción del médico tratante. En algunas divulgaciones, las composiciones se administran adecuadamente al sujeto de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
Las células o agentes pueden administrarse usando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. Se divulgan formulaciones y dispositivos, como jeringuillas y viales, para el almacenamiento y la administración de las composiciones. Con respecto a las células, la administración puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo las células o progenitores inmunosensibles pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto diferente y compatible. Las células inmunosensibles derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluyendo la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo una composición farmacéutica que contiene una célula inmunosensible modificada genéticamente o un agente que trata o mejora los síntomas de neurotoxicidad), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión, emulsión).
Las formulaciones incluyen las de administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunas divulgaciones, el agente o las poblaciones celulares se administran por vía parenteral. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunas divulgaciones, el agente o las poblaciones celulares se administran a un sujeto mediante administración sistémica periférica por inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
En algunas divulgaciones las composiciones se divulgan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunas divulgaciones pueden estar tamponadas a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas son normalmente más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Por otra parte, las composiciones viscosas pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad adecuado para proporcionar periodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el agente o las células en un solvente, por ejemplo en mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares.
Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ejemplo por filtración a través de membranas de filtración estériles.
VIM. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS
También se divulgan artículos de fabricación, sistemas, aparatos y kits útiles para realizar los métodos divulgados. También se divulgan artículos de fabricación, incluyendo: (i) uno o más reactivos para la selección basada en inmunoafinidad de células específicas para CD57, CD4 y/o CD8; e (ii) instrucciones para el uso de uno o más reactivos para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente.
También se divulgan artículos de fabricación, que incluyen: (i) uno o más reactivos para la selección basada en inmunoafinidad de células específicas para CD57, CD4 y/o CD8; (ii) uno o más reactivos estimuladores capaces de activar uno o más dominios de señalización intracelular de uno o más componentes de un complejo TCR y uno o más dominios de señalización intracelular de una o más moléculas coestimuladoras; y (iii) instrucciones de uso de uno o más reactivos para realizar cualquiera de los métodos descritos en la presente.
En algunas de tales divulgaciones, el reactivo para la selección basada en inmunoafinidad es o incluye un anticuerpo capaz de unirse específicamente a CD57, c D4 o CD8. En algunas de tales divulgaciones, el reactivo para la selección basada en inmunoafinidad es o incluye un anticuerpo capaz de unirse específicamente a CD57. En algunas de tales divulgaciones, el anticuerpo está inmovilizado en una partícula magnética o está inmovilizado o unido a una matriz de cromatografía de afinidad.
En algunas de cualquiera de tales divulgaciones, el reactivo estimulador incluye (i) un agente primario que se une específicamente a un miembro de un complejo TCR, opcionalmente que se une específicamente a CD3 y (ii) un agente secundario que se une específicamente a una molécula coestimuladora de células T, opcionalmente en donde la molécula coestimuladora se selecciona entre CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 o ICOS. En algunas de cualquiera de tales divulgaciones, el uno o ambos de los agentes primario y secundario incluyen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas de tales divulgaciones, los agentes primario y secundario incluyen un anticuerpo, opcionalmente en donde el reactivo estimulador incluye la incubación con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas de tales divulgaciones, el agente primario y el agente secundario están presentes o unidos en la superficie de un soporte sólido. En algunas de tales divulgaciones, el soporte sólido es o incluye una perla, opcionalmente una perla paramagnética. En algunas de tales divulgaciones, el agente primario y el agente secundario están unidos reversiblemente en la superficie de un reactivo de partícula oligomérica que incluye una pluralidad de moléculas de estreptavidina o muteína de estreptavidina.
También se divulgan artículos de fabricación, que incluyen (i) cualquier composición descrita en la presente; e (ii) instrucciones para administrar la composición a un sujeto.
En algunas divulgaciones, los artículos de fabricación o kits incluyen uno o más recipientes, típicamente una pluralidad de recipientes, material de envasado, y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente o recipientes y/o envase, que generalmente incluye instrucciones de uso, por ejemplo instrucciones para reactivos para la selección basada en inmunoafinidad de células particulares, por ejemplo selección positiva o negativa de células que expresan CD57, CD4 y/o CD8, e instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos divulgados en la presente, como para la manipulación de células T para generar una composición, como una composición terapéutica, para terapia celular. En algunas divulgaciones, los artículos de fabricación divulgados contienen reactivos para la estimulación y/o cultivo de células, por ejemplo en uno o más pasos del proceso de fabricación, como cualquier reactivo descrito en cualquiera de los pasos de la Sección II y la Sección III.
También se divulgan artículos de fabricación y kits que contienen células manipuladas que expresan un receptor recombinante o composiciones del mismo, como las generadas mediante los métodos divulgados en la presente, y opcionalmente instrucciones de uso, por ejemplo instrucciones de administración. En algunas divulgaciones, las instrucciones proporcionan instrucciones o especifican métodos para evaluar si un sujeto, antes de recibir una terapia celular, es probable o se sospecha que es probable que responda y/o el grado o nivel de respuesta tras la administración de células manipuladas que expresan un receptor recombinante para tratar una enfermedad o trastorno. En algunas divulgaciones, los artículos de fabricación pueden contener una dosis o una composición de células manipuladas.
Los artículos de fabricación divulgados en la presente contienen materiales de envasado. Los materiales de envasado para su uso en el envasado de los materiales divulgados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Consultar, por ejemplo las Patentes de Estados Unidos N° 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.252, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad. Los ejemplos de materiales de envasado incluyen, pero no se limitan a, blísteres, botellas, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringuillas, material de laboratorio desechable, por ejemplo puntas de pipeta y/o placas de plástico, o frascos. Los artículos de fabricación o kits pueden incluir un dispositivo para facilitar la dispensación de los materiales o para facilitar el uso de una manera de alto rendimiento o a gran escala, por ejemplo para facilitar el uso en equipos robóticos. Típicamente, el envase no es reactivo con las composiciones contenidas en el mismo.
En algunas divulgaciones, los reactivos y/o las composiciones celulares se envasan por separado. En algunas divulgaciones, cada recipiente puede tener un único compartimento. En algunas divulgaciones, otros componentes de los artículos de fabricación o kits se envasan por separado o juntos en un único compartimento.
IX. DEFINICIONES
A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, anotaciones y otros términos o terminología técnica y científica usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en la presente para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones en la presente no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial con respecto a lo que generalmente se entiende en la técnica.
Como se usan en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo "un" o "uno" significa "por lo menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones descritos en la presente incluyen aspectos y variaciones "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en".
A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible en el alcance de la materia reivindicada. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado está incluido en el objeto reivindicado. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también se incluyen en el objeto reivindicado, sin perjuicio de cualquier límite específicamente excluido en el intervalo declarado. Cuando el intervalo declarado incluya uno o ambos límites, s también se incluyen en el objeto reivindicado los intervalos que excluyan uno o ambos límites incluido. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
El término "aproximadamente", como se usa en la presente, se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) realizaciones dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo la descripción referente a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". En ciertas realizaciones, "aproximadamente X" se refiere a un valor del ±25%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, ±0,1% o ±0,01% de X.
Como se usa en la presente, la mención de que las posiciones de nucleótidos o aminoácidos "se corresponden" con las posiciones de nucleótidos o aminoácidos de una secuencia divulgada, como se expone en el listado de secuencias, se refiere a las posiciones de nucleótidos o aminoácidos identificadas tras la alineación con la secuencia divulgada para maximizar la identidad usando un algoritmo de alineación estándar, como el algoritmo GAP. Al alinear las secuencias, pueden identificarse los residuos correspondientes, por ejemplo usando residuos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. En general, para identificar las posiciones correspondientes, las secuencias de aminoácidos se alinean de tal manera que se obtenga la coincidencia de mayor orden (consultar, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
El término "vector", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al que está enlazado. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Tales vectores se denominan en la presente "vectores de expresión". Entre los vectores se encuentran los vectores virales, como los retrovirales, por ejemplo los vectores gammaretrovirales y lentivirales.
Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo celular huésped" se usan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de dichas células. Las células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de ella sin tener en cuenta el número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula progenitora, sino que puede contener mutaciones. En la presente se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la célula originalmente transformada.
Como se usa en la presente, la afirmación de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detección de dicho anticuerpo, en donde la tinción es detectable por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente superior al de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.
Como se usa en la presente, la afirmación de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de presencia detectable sustancial sobre o en la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detección de dicho anticuerpo, en donde la tinción no se detecta por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente inferior al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.
Como se usa en la presente, el "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y el "porcentaje de identidad" cuando se usan con respecto a una secuencia de aminoácidos (secuencia polipeptídica de referencia) se definen como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata (por ejemplo el anticuerpo o fragmento en cuestión) que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos puede realizarse de varias maneras conocidas, por ejemplo usando programas informáticos de acceso público como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Pueden determinarse los parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se están comparando.
Una sustitución de aminoácidos puede incluir la sustitución de un aminoácido en un polipéptido por otro aminoácido. La sustitución puede ser una sustitución de aminoácidos conservadora o una sustitución de aminoácidos no conservadora. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en una molécula de unión de interés, por ejemplo un anticuerpo, y los productos pueden analizarse para determinar la actividad deseada, por ejemplo, la unión a antígeno retenida/mejorada, la inmunogenicidad disminuida o la ADCC o la CDC mejoradas.
En general, los aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con las siguientes propiedades comunes de las cadenas laterales:
(1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. En algunas realizaciones, las sustituciones no conservadoras de aminoácidos pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro de la misma clase.
Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo las células. Puede ser una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos.
Como se usa en la presente, un "sujeto" es un mamífero, como un humano u otro animal, y típicamente es humano.
X. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen con propósitos de ilustración.
Ejemplo 1: Evaluación de la variabilidad en la expansión de células T, la viabilidad celular y la entrada en el ciclo celular durante un proceso de manipulación de células T
Se obtuvieron células T CD8+ de siete donantes ejemplares (donantes A-G) y se manipularon para que expresaran un receptor de antígeno quimérico (CAR) mediante un proceso de fabricación que incluía la estimulación, la transducción con un vector lentiviral que codificaba el constructo de CAR y el cultivo para la expansión, o se sometieron a un proceso similar de estimulación y cultivo. Se evaluó la expansión celular, la viabilidad celular y la entrada en el ciclo celular en las células estimuladas y cultivadas.
Para generar las composiciones celulares manipuladas, se aislaron células CD8+ de muestras de leucaféresis de donantes humanos mediante enriquecimiento por inmunoafinidad y se crioconservaron. Las composiciones celulares crioconservadas se descongelaron posteriormente y se estimularon incubando las células en condiciones estimuladoras en presencia de perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 y citoquinas recombinantes (por ejemplo IL-2, IL-7 e IL-15) durante aproximadamente 24 horas. A continuación, se transdujeron células de cuatro donantes (donantes D-G) con una preparación vírica que contenía ácido nucleico que codificaba un receptor de antígeno quimérico (CAR). Tras la transducción, las células se cultivaron en presencia de citoquinas recombinantes (por ejemplo IL-2, IL-7 e IL-15) en una incubadora a 37 grados centígrados y el medio se reponía diariamente. Las células de tres donantes (donantes A-C) no se sometieron a transducción y se cultivaron en presencia de citoquinas recombinantes tras la estimulación.
Se monitorizaron las células para determinar el número total de células hasta aproximadamente 240 horas después del inicio de la estimulación y se determinó las veces de expansión a lo largo del tiempo. Se evaluó la viabilidad y se tiñeron las células para un marcador indicativo de la división celular (Ki-67) y se analizaron mediante citometría de flujo a las 72 horas desde el inicio de la estimulación.
Como se muestra en lasFIGS. 1A-1D,se observó variabilidad en la expansión de células T(FIGS. 1Ay1B),viabilidad celular(FIG. 1C)y entrada en el ciclo celular(FIG. 1D)entre células T CD8+ de diferentes donantes.
Ejemplo 2: Caracterización de las poblaciones de CD57+ y CD57-tras la estimulación de células derivadas de donantes durante la fabricación celular
Los fenotipos de las células CD57+ y CD57- se caracterizaron durante un proceso ejemplar de fabricación de células para manipular las células para que expresasen un receptor de antígeno quimérico (CAR).
Se sometieron las células T CD8+ y CD4+ de tres donantes ejemplares (donantes A-C) a un proceso ejemplar similar al descrito en el Ejemplo 1, pero sin transducción de las células. Se recogieron muestras de las células inmediatamente antes del inicio de la estimulación y en varios momentos durante la misma, hasta aproximadamente 216 horas después del inicio de la estimulación. Se tiñeron las células para detectar varios marcadores, incluyendo marcadores asociados con la activación (CD25 y CD69), la capacidad proliferativa (CD57), la división celular (Ki-67) y diversos marcadores de superficie asociados con fenotipos de diferenciación de células T (por ejemplo células T vírgenes, células T efectoras (Teff), células T de memoria, células T de memoria central (Tcm), células T de memoria efectoras (T<em>), células T RA de memoria efectoras (T<emra>)), para su análisis mediante citometría de flujo. Se realizó un análisis de agrupación jerárquica para evaluar la asociación entre la expresión de CD57, la expresión de Ki-67 y los fenotipos de diferenciación de células T.
Como se muestra en lasFIGS. 2A-2C, las células T CD57+ estaban presentes en la población al inicio de la estimulación, y el porcentaje de células CD57+ se redujo en la población durante la estimulación y el cultivo (consultar lasFIGS. 2Ay2B).La frecuencia de células T CD57+ disminuyó aproximadamente 48 horas después del inicio de la estimulación, lo que coincidió en general con la expansión de las células T y el aumento de la viabilidad. Tras la estimulación, sólo un subconjunto de células T CD8+ entró en el ciclo celular, sobre la base de la expresión de Ki-67. La expresión de Ki-67 no se observó en las células T CD8+. La expresión de Ki-67 no aumentó sustancialmente entre las células CD57+ tras la estimulación. En comparación, el porcentaje de células Ki-67+ aumentó sustancialmente entre las células CD57- (consultar lasFIG. 2Ay2C).Al contrario que con el compartimento de células CD8+, entre las células CD4+, las células CD57+ estaban presentes en niveles bajos al inicio de la estimulación, y el porcentaje de células CD57+ aumentó hacia el final del proceso de estimulación y cultivo(FIG. 2D).Estos resultados son consistentes con la observación de que el compartimento de células CD8+ puede ser más homogéneo que el compartimento de células CD4+.
En particular, las composiciones derivadas de donantes mostraron variabilidad en el tiempo requerido para alcanzar un número celular umbral ejemplar para la cosecha (criterio de cosecha), que se correspondía con la variabilidad en la expresión de varios marcadores de inmunofenotipo. Una composición derivada de donante requirió sólo 7 días de cultivo para alcanzar el criterio de cosecha. Por el contrario, otra composición derivada de donante necesitó 8 días de cultivo para alcanzar el criterio de cosecha. El análisis de la expresión de CD57, Ki-67, CD45RA y CD27 (determinada por citometría de flujo) entre las dos composiciones de donantes se muestra en lasFIGS. 2Ey2F.La expresión se analizó comenzando en el punto de tiempo t=0, que representaba el tiempo justo antes de la estimulación. Como se muestra en laFIG. 2E,en todos los puntos temporales evaluados, se observó una expresión de CD57 sustancialmente mayor en la composición de células donantes que necesitó 8 días para alcanzar el criterio de cosecha ("8d hasta la cosecha"), en comparación con la composición de células donantes que necesitó 7 días para alcanzar el criterio de cosecha ("7d hasta la cosecha"). Como se muestra en laFIG. 2F,en todos los puntos temporales evaluados, las células de la composición que requería 7 días mostraron una mayor frecuencia de CD27+CD45RA+, en comparación con las células de la composición que requería 8 días. Las células de la composición que requiere 8 días mostraron una frecuencia sustancialmente menor de células CD27+ en todos los puntos temporales evaluados. Estas observaciones son consistentes con el descubrimiento de que las composiciones celulares que presentan una mayor frecuencia de células CD27+ en el material de partida muestran una mejor expansión y una mayor frecuencia de dichas células al final del proceso de cultivo.
Como se muestra en laFIG. 3A,se observó que las células T CD57+ expresaban marcadores indicativos de activación (CD69 y CD25) tras la estimulación. Las células CD57+ mostraron fenotipos asociados a la activación y persistieron durante las primeras fases del proceso. El análisis de agrupación jerárquica mostró que las células T CD57+ y Ki67- presentaban características fenotípicas asociadas con poblaciones de células efectoras más diferenciadas(FIG. 3B), en comparación con las células CD57- y Ki67+(FIG. 3C).Las poblaciones Ki-67+ incluían principalmente células que eran CD27+CD28+, y las poblaciones Ki67 estaban enriquecidas para células CD57+ y se correspondían con fenotipos CD27-CD28-.
Los resultados fueron consistentes con la observación de que las células T CD57+, aunque capaces de ser estimuladas, mostraban fenotipos asociados con células más diferenciadas terminalmente y una capacidad proliferativa reducida. En algunos aspectos, se observó que las células T CD27+ contribuían a la mayoría de las células expandidas durante el proceso de fabricación de células T CAR. En comparación, las células T CD57+ no se expandieron y contribuyeron mínimamente a las células de las composiciones de células T CAR fabricadas finalmente. En algunos aspectos, la presencia de células CD57+ en una población celular, que puede mostrar una capacidad proliferativa reducida, puede contribuir a variaciones y heterogeneidad en las poblaciones celulares sometidas al proceso de fabricación de células T CAR.
Ejemplo 3: Frecuencia de Células CD57+ en la composición de entrada y efecto sobre la expansión celular, viabilidad, reactivos de estimulación y citoquinas
Las composiciones de entrada que contenían células CD57+ y CD57- emparejadas con donantes se mezclaron en proporciones específicas y se sometieron a un proceso de fabricación ejemplar. Se evaluó la viabilidad y la expansión celular de las composiciones celulares.
Se aislaron células T CD57+CD8+ y células T CD57-CD8+ a partir de una composición de células T CD8+ obtenidas de un sujeto donante mediante selección positiva de células CD57+ por enriquecimiento basado en inmunoafinidad. La pureza de las poblaciones aisladas se determinó mediante citometría de flujo. Para evaluar el impacto de las diferentes frecuencias de células T CD57+ sobre el proceso de fabricación, se generaron composiciones de entrada que contenían la siguiente frecuencia de células CD57+ mezclando las poblaciones de CD57+ y CD57- aisladas, antes de la estimulación: (1) 100% de células CD57+; (2) 75% de células CD57+; (3) 25% de células CD57+; y (4) 0% de células CD57+. Las diferentes composiciones de entrada tituladas se sometieron a un proceso de fabricación ejemplar para células que expresan CAR, similar al descrito en el Ejemplo 1, incluyendo estimulación mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 y citoquinas recombinantes, y transducción con una preparación viral que contiene ácido nucleico que codifica un CAR. Se monitorizó el número total de células y su viabilidad a lo largo del tiempo hasta aproximadamente 288 horas después del inicio de la estimulación. Se obtuvieron imágenes de los pocillos de las placas de cultivo celular a las 48 horas del inicio de la estimulación y se evaluó la agrupación celular en presencia del reactivo de estimulación. La concentración de IL-2 en el medio de cultivo se evaluó a las 24 y 48 horas después del inicio de la estimulación.
Como se muestra en laFIG. 4A, las composiciones de entrada que contienen frecuencias más altas de células CD57+ mostraron una expansión celular más lenta, requirieron un tiempo de cultivo más largo para alcanzar un número celular umbral ejemplar para la cosecha (criterio de cosecha), y mostraron una viabilidad celular más baja, en comparación con las composiciones de entrada que contienen frecuencias más bajas de células CD57+. Se observó una expansión muy baja o nula en la composición que contenía un 100% de células CD57+. En general, se observó que la frecuencia de células CD57+ en la composición de entrada estaba asociada con la duración del cultivo necesaria para alcanzar el criterio de cosecha. Como se muestra en laFIG. 4B,las composiciones de entrada que contenían frecuencias más altas de células CD57+ también formaron agrupaciones celulares en presencia del reactivo de estimulación (perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28) a las 48 horas, lo que demuestra que las células respondían a la estimulación. Se observó que, 24 y 48 horas después del inicio de la estimulación, la concentración de IL-2 en los medios de cultivo era menor en los cultivos de composiciones de entrada que contenían frecuencias más altas de células CD57+, en comparación con los cultivos de composiciones de entrada que contenían frecuencias más bajas de células CD57+(FIG. 4C).
Los resultados fueron consistentes con la observación de que la frecuencia de células CD57+ en la composición de entrada puede afectar a la expansión celular total y a la viabilidad celular. Las composiciones de entrada con frecuencias más altas de células CD57+ requirieron tiempos de cultivo más largos para alcanzar el criterio de cosecha. En algunos aspectos, se observó que las células CD57+, que eran capaces de ser estimuladas y ocupar o usar reactivos de estimulación, consumían la IL-2 presente en las condiciones de cultivo y contribuían al número de células en el cultivo. Esto indicaba que la presencia de células CD57+ puede afectar a otras células de la población durante el proceso de fabricación.
Ejemplo 4: Agotamiento de células CD57+ en la composición de entrada y efecto sobre la duración del cultivo
Las composiciones de entrada que se habían agotado de células CD57+ se sometieron a un proceso de fabricación ejemplar, y se evaluaron los fenotipos celulares y la duración del cultivo antes de alcanzar el criterio de cosecha.
Se obtuvieron células CD8+ de cuatro sujetos diferentes y se separaron en dos brazos. En un brazo, se agotaron las células CD57+ de la composición celular para generar una composición de entrada (agotada), y se evaluó la pureza mediante citometría de flujo. En el otro brazo, las células CD8+ se usaron como composición de entrada sin agotar las células CD57+ (no agotadas). Las composiciones de entrada agotadas y no agotadas se sometieron a un proceso de fabricación ejemplar de células que expresan CAR mediante transducción viral, similar al descrito en el Ejemplo 1, que incluía estimulación mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 y citoquinas recombinantes, transducción con una preparación viral que contenía ácido nucleico que codificaba un CAR, y cultivo en condiciones para la expansión. Inmediatamente antes del inicio de la estimulación, se tiñeron muestras de las composiciones celulares para Ki67, CD3, CD57, CD27 y CD28. Se evaluó la duración de los cultivos agotados y no agotados para alcanzar un criterio de cosecha ejemplar. El criterio de cosecha representaba una expansión celular de aproximadamente 10 veces.
Como se muestra en laFIG.5A, las composiciones de entrada no agotadas mostraron una frecuencia variable de células CD57. Como se muestra en laFIG.5B,la frecuencia de células CD27+ CD28+ fue mayor y más consistente entre la composición de entrada agotada, en comparación con las composiciones de entrada no agotadas. En laFIG.
5Cse muestran diagramas de flujo para la expresión de CD27 entre las cuatro composiciones de entrada de donantes agotadas y no agotadas.El panel superior de laFIG. 5Cmuestra que las células T CD8+ de las muestras no agotadas de los cuatro donantes presentaban diversos grados de expresión de CD27. Por el contrario, como se muestra en el panel inferior de laFIG. 5C,el agotamiento de las células CD8+CD57+ de las composiciones de entrada mejoró la consistencia del material de partida entre los donantes, como se evidencia por la expresión CD27 similarmente consistente. En conjunto, estos resultados demuestran la variabilidad de las células de tipo virgen o de memoria central entre las células del donante en las muestras de leucaféresis del donante inicial, que puede mejorarse mediante el agotamiento de células CD57+.
Se evaluó la expresión de Ki67, un marcador de proliferación y crecimiento de células T, entre el células T totales CD3+ en las composiciones de entrada del donante 72 horas después del inicio de la estimulación. Como se muestra en laFIG. 5D, la expresión de Ki67 fue mayor entre las composiciones de entrada agotadas, en comparación con las composiciones no agotadas.
Como se muestra en laFIG. 5E,la duración del cultivo hasta la cosecha (desde el inicio de la estimulación hasta el momento en que se alcanzó el criterio de cosecha) fue generalmente más corta y más consistente entre las composiciones de entrada agotadas, en comparación con las composiciones de entrada no agotadas. En laFIG. 5Fse muestra la expansión de las células de un donante ejemplar, evaluada por las células T totales en varios días después de la estimulación.Los resultados muestran que se observó que el número total de células expandidas a partir de composiciones de entrada agotadas era mayor que el número total de células expandidas a partir de composiciones de entrada no agotadas, en múltiples puntos temporales tras la estimulación(FIG.5F).Estos resultados son consistentes con la observación de que las poblaciones agotadas pueden mostrar una duración más corta hasta el criterio de cosecha debido a un mayor número de células en división y totales.
Después de la transducción de las células agotadas y no agotadas con un receptor de antígeno quimérico (CAR) ejemplar, se evaluó el porcentaje de células que expresaban el CAR. Como se muestra en laFIG. 5G,el porcentaje de células que expresan el CAR entre las composiciones de donantes agotadas fue más consistente que el porcentaje de células que expresan el CAR anti-CD19 entre las composiciones de donantes no agotadas. Este resultado es consistente con la observación de que el agotamiento de las células CD57+ puede mejorar la consistencia de la expresión de CAR por las células T.
En conjunto, los resultados fueron consistentes con la observación de que el agotamiento seleccionado de células CD57+ mejoraba la expansión y reducía la duración del cultivo necesaria para alcanzar el criterio de cosecha. Además, los resultados indican que el agotamiento de células CD57+ puede reducir la variabilidad en el fenotipo de las células del material de partida (por ejemplo células CD27+) entre varias composiciones de entrada. En algunos aspectos, la variabilidad en la presencia y frecuencia de células T CD57+ entre varias composiciones de entrada puede afectar al proceso de fabricación de células T CAR, y puede dar como resultado variabilidad en la duración del cultivo y los atributos de la composición celular. En algunos aspectos, el agotamiento de las células T CD57+ en la composición de entrada puede mejorar el control del proceso y la consistencia de las composiciones de células T CAR fabricadas.
Ejemplo 5: Frecuencia de células T CD57+CD8+ en sangre periférica de pacientes con linfoma no Hodgkin (NHL)
Se evaluaron células de la sangre periférica de pacientes con linfoma no de Hodgkin (NHL) para determinar la expresión de CD57+ y varios marcadores de superficie asociados a fenotipos de diferenciación de células T.
Se aislaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ a partir de muestras de leucaféresis de pacientes con NHL de un estudio clínico mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad y se crioconservaron. Posteriormente se descongelaron las células de cada composición celular aislada y se estimularon incubando las células por separado en condiciones de estimulación en presencia de perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 y citoquinas recombinantes (por ejemplo IL-2, IL-7 e IL-15) durante 48 horas. 48 horas después del inicio de la estimulación, las muestras de las composiciones celulares se tiñeron para varios marcadores para su análisis mediante citometría de flujo, incluyendo marcadores asociados con el linaje (CD4 y CD8), la capacidad proliferativa (CD57), la división celular (Ki-67) y los fenotipos de diferenciación de células T (por ejemplo células T tipo virgen, células T efectoras (Teff), células T de memoria, células T de memoria central (Tcm)). Se realizó una agrupación jerárquica para evaluar la asociación entre la expresión de CD57+ y una variedad de marcadores asociados con los fenotipos de diferenciación de células T.
Como se muestra en laFIG. 6A,la frecuencia de células CD57+ en la composición de entrada varió entre las células CD8+ de diferentes pacientes con NHL. Como se muestra en laFIG. 6B,se observó una relación inversa general entre el porcentaje de células CD57+CD8+ y el porcentaje de células Ki67+ a las 48 horas del inicio de la estimulación. Como se muestra en laFIG. 6C,la agrupación jerárquica mostró agrupaciones que se distinguían por fenotipos de diferenciación de células T efectoras y de memoria, y estas agrupaciones de fenotipos agruparon además muestras con frecuencias altas o bajas de células T CD57+.
El análisis de las células CD57+ de las composiciones de entrada del donante reveló que la expresión de Ki67 variaba entre las células con diferentes inmunofenotipos de diferenciación de células T. Como se muestra en laFIG. 6D,el porcentaje de células CD57+ vivas que expresaban Ki67 era menor en las células CD27-CD45RA+, y era mayor en las células CD27-CD45RA-, CD27+CD45RA+ y CD27+CD45RA-.
Se analizaron las composiciones de células donantes CD4+ y CD8+ por separado para determinar la expresión de Ki67, CD27, CD45RA y CD57. Como se muestra en laFIG. 6E,un gran porcentaje de células CD8+CD57+ eran CD27-CD45RA+, lo que indica que estas células T eran células T de memoria efectoras RA diferenciadas terminalmente (TEMRA). Un alto porcentaje de células CD4+CD57+ eran CD27-CD45RA-, lo que concuerda con que estas células eran células T de memoria efectoras (EM). Estos descubrimientos demuestran que las células T CD57+ son células T efectoras diferenciadas de varios inmunofenotipos.
Los resultados fueron consistentes con la observación de frecuencias variables de células T CD57+ en la circulación periférica en sujetos con NHL. De manera similar a los descubrimientos con composiciones celulares generadas a partir de células de donantes (como se ha descrito en ejemplos anteriores), se observó que una expresión elevada de CD57 se asociaba a fenotipos indicativos de células más diferenciadas con una capacidad proliferativa reducida.
Ejemplo 6: Relación del número de duplicaciones y la diferenciación celular con la respuesta del paciente
Se generaron composiciones de células T terapéuticas ejemplares que contenían células T autólogas que expresaban un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para CD19. El CAR anti-CD19 contenía un scFv antic D19 derivado de un anticuerpo murino (región variable derivada de FMC63), un espaciador derivado de inmunoglobulina, un dominio transmembrana derivado de CD28, una región coestimuladora derivada de 4-1BB, y un dominio de señalización intracelular CD3-zeta.
Para la generación de composiciones celulares para su administración a sujetos con linfoma no Hodgkin (NHL) recidivante y refractario, se aislaron células autólogas de los sujetos mediante leucaféresis. Las muestras de leucaféresis se sometieron a un proceso de generación de células con expresión de CAR. El proceso implicó el lavado de las células mediante un lavado automatizado y la selección basada en inmunoafinidad para la purificación de células T CD4+ y CD8+, lo que dio como resultado dos composiciones, enriquecidas para células CD8+ (en las que una mediana del 99%, intervalo intercuartílico (IQR) 98-100%, de las células eran CD8+) y CD4+ (en las que una mediana del 99%, IQR 99-100%, de las células eran CD4+), respectivamente.
Las células de las composiciones CD4+ y CD8+ enriquecidas se activaron con perlas paramagnéticas anti-CD3/anti-CD28 y luego se sometieron por separado a transducción lentiviral con un vector que codificaba un CAR anti-CD19 con un dominio coestimulador 4-1BB. El CAR contenía un scFv anti-CD19 derivado de un anticuerpo murino, un espaciador de inmunoglobulina, un dominio transmembrana derivado de CD28, una región coestimuladora derivada de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular CD3-zeta. A continuación, las poblaciones transducidas se incubaron por separado en presencia de citoquinas recombinantes IL-2 e IL-15 (y adicionalmente IL-7 recombinante para la composición de células T CD4+) para la expansión celular. La incubación en condiciones para la expansión se llevó a cabo en un biorreactor de movimiento de balancín hasta alcanzar un umbral de expansión de aproximadamente 4 veces. Las células CD8+ y CD4+ expandidas se formularon y crioconservaron por separado y se almacenaron antes de su administración. Para minimizar las variaciones entre lotes y/o composiciones celulares derivadas de diferentes pacientes, como las que tienen diferentes atributos de paciente, en parámetros indicativos de la salud celular, las células se mantuvieron a volúmenes constantes en todos los lotes. Los productos celulares presentaban un intervalo ajustado de concentraciones celulares viables (basado en una evaluación de las composiciones celulares para un grupo de sujetos, CD8+: mediana 31 x 106 células/ml, IQR 28-40 x 106 células/ml, N=38; CD4+: mediana 35 x 106 células/ml, IQR 31-40 x 106, N=36).
Las composiciones de células T generadas se usaron para su administración en sujetos con linfoma no Hodgkin (NHL) recidivante y refractario, como se describe a continuación.
A. Atributos ejemplares de las composiciones terapéuticas de células T
Las composiciones de células T terapéuticas generadas, usadas para su administración en sujetos con linfoma no Hodgkin (NHL) recidivante y refractario descritos a continuación, se evaluaron para CCR7 y CD27 usando citometría de flujo. También se evaluaron los niveles de expresión superficial de CD4 y del receptor truncado usado como marcador sustituto.
Para cada composición terapéutica generada, el número de duplicaciones de las composiciones celulares generadas también se determinó basándose en el recuento nuclear total (TNC) de células, mediante tinción de fluorescencia dual con naranja de acridina (AO) y yoduro de propridio (PI) o DAPI, usando la siguiente fórmula:
LaFIG. 7muestra la correlación entre el número de duplicaciones en el proceso de producción de la composición terapéutica y el porcentaje de células CD27+ de las células CD4+CAR+. Se observaron resultados similares para las células T CD8+. Los resultados muestran que, en general, un menor número de duplicaciones durante el proceso para generar composiciones terapéuticas de células T se asocia con mayores niveles de células CD27+. Sin querer estar limitados por la teoría, los resultados son consistentes con la observación de que un mayor porcentaje de células CD27+ en un proceso para producir células T manipuladas puede estar influido por las duplicaciones limitadas en los procesos.
Los estudios de modelización de la densidad de siembra en proceso durante el paso de expansión en un proceso sustancialmente igual al descrito anteriormente demostraron que se esperaba que una densidad de siembra relativamente más alta (por ejemplo 0,35x10A6 células/ml o superior) redujera el número de duplicaciones de población para alcanzar el criterio de cosecha en comparación con una densidad de siembra más baja (por ejemplo 0,05x10A6 células/ml o inferior(FIG. 8A).El modelado también reveló que se espera que una densidad de siembra relativamente más alta(FIG. 8B)o una duración del proceso más corta(FIG. 8C)también den como resultado un mayor porcentaje de células T CD8+CAR+ positivas para CD27 en la composición de células T terapéuticas de salida (por ejemplo producto farmacéutico) en comparación con una densidad de siembra más baja o una duración del proceso más larga, respectivamente. Estos datos son consistentes con el descubrimiento de que una mayor densidad de siembra de células al inicio del paso de expansión o una menor duración del proceso pueden dar como resultado un aumento de la proporción de células con memoria central en la composición de células T terapéuticas manipuladas.
B. Administración de la composición de células T CAR+ anti-CD19
Las composiciones terapéuticas de células T CAR+ descritas anteriormente se administraron a sujetos con linfoma no Hodgkin (NHL) agresivo en recaída o refractario (R/R) en un estudio clínico. Específicamente, a una cohorte de sujetos humanos adultos con NHL R/R, incluyendo linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), de novo o transformado de linfoma indolente (NOS), linfoma de células B de alto grado (incluyendo doble/triple impacto), DLBCL transformado de leucemia linfocítica crónica (CLL) o linfomas de la zona marginal (MZL), linfoma mediastínico primario de células B grandes (PMBCL) y linfoma folicular de grado 3b (LFG3B), se les administraron composiciones de células T anti-CD19 que expresaban CAR. Los resultados se evaluaron por separado para un subconjunto básico de sujetos dentro de la cohorte completa (excluidos los sujetos con un estado funcional deficiente (ECOG 2), DLBCL transformado de linfomas de la zona marginal (MZL) y/o leucemia linfocítica crónica (CLL, de Richter), y excluyendo los sujetos con linfoma mediastínico primario de células b grandes (PMBCL), y linfoma folicular de grado 3b (FLG3B) (cohorte básica)). La cohorte principal incluyó a sujetos con DLBCLG, NOS y linfoma folicular transformado (tFL), o linfoma de células B de alto grado (doble/triple impacto) o linfoma de células B de alto grado con reordenamientos MYC y BCL2 y/o BCL6 con histología de DLBCLG (doble/triple impacto) y con un estado de rendimiento del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG PS) de 0 o 1. El análisis en el punto temporal presentado en este ejemplo se basó en la evaluación de un total de 91 sujetos de la cohorte completa (88 (65 de la cohorte principal) evaluados en cuanto a la respuesta y 91 (67 de la cohorte principal) evaluados en cuanto a la seguridad) a los que se habían administrado las células CAR anti-CD19.
Se descongelaron las composiciones celulares crioconservadas que contenían células que expresaban CAR anti-CD19 antes de la administración intravenosa. La dosis de células T terapéuticas se administró como una composición celular definida administrando la población de células CD4+ CAR+ formuladas y la población de células CD8+ CAR+ formuladas administradas por separado en una proporción objetivo de aproximadamente 1:1. Se administró a los sujetos una dosis única o doble de células T que expresan CAR (cada dosis única mediante infusiones separadas de células T que expresan CAR CD4+ y células T que expresan CAR CD8+, respectivamente) de la siguiente manera: una dosis única de nivel de dosis 1 (DL1) que contiene 5 x 107 células T que expresan CAR totales, o una dosis única de nivel de dosis 2 (DL2) que contiene 1 x 108 células T que expresan CAR totales. En algunos casos, a los sujetos se les administró una dosis doble de DL1 en la que cada dosis se administró con un intervalo de aproximadamente catorce (14) días, administrada el día 1 y el día 14, incluyendo un sujeto que recibió inadvertidamente dos dosis de DL2 mediante el esquema de dos dosis, debido a un error de dosificación. El nivel de dosis y los números objetivo de subconjuntos de células T para la composición administrada en DL1 y DL2 se exponen en laTabla E1.En la cohorte principal, se administró DL1 a 34 sujetos y DL2 a 27 sujetos.
LaTabla E2muestra la respuesta global y los resultados de seguridad para la cohorte completa y la cohorte principal en los dos niveles de dosis. La tasa de respuesta objetiva (ORR) fue del 74%, incluyendo un 52% de sujetos que mostraron una respuesta completa (CR). La incidencia de cualquier grado de síndrome de liberación de citoquinas (CRS) fue del 35%, con un 1% de CRS grave; y la incidencia de cualquier grado de neurotoxicidad (NT) fue del 19%, con un 1% de NT grave.
C. Asociación entre los atributos celulares de las células T que expresan CAR anti-CD19 y la respuesta
Se evaluó la relación entre ciertos atributos fenotípicos de las células T CAR+ en las composiciones terapéuticas y los parámetros asociados con los resultados de la respuesta clínica. Las correlaciones entre el fenotipo de memoria en la composición y la función se tradujeron en una correlación positiva entre la composición del subconjunto de memoria central y el pico de expansiónin vivode células CAR+ (p=0,42, P=0,002), y la supervivencia libre de progresión (PFS) (estimación de supervivencia de Kaplan-Meier, P=0,0164) que se observaron. LasFIGS.
9A-9Dmuestran las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para sujetos a los que se administraron composiciones de células T CAR+, divididos en grupos a los que se administraron composiciones que contenían una frecuencia de células T CCR7+ CD27+ CAR+ entre las células T CD4+ CAR+(FIG. 9Apara la supervivencia sin progresión,FIG. 9Cpara la duración de la respuesta) y entre las células T CD8+ c Ar(FIG. 9Bpara la supervivencia libre de progresión,FIG. 9Dpara la duración de la respuesta) que está por encima o por debajo de un cierto nivel umbral. Se observó que una mayor frecuencia de células de memoria CCR7+ CD27+ en la composición se correlacionaba con una mayor supervivencia libre de progresión.
El análisis univariante reveló una correlación inversa entre las duplicaciones de la población de células T (PDL) durante el proceso de producción de la composición de células T terapéuticas y la probabilidad de supervivencia libre de progresión (PFS) en pacientes con linfoma no Hodgkin (NHL). LaFIG. 10muestra una curva de PFS basada en una prueba de intervalos logarítmicos de división óptima para pacientes con números "altos" (>6 PDL) o "bajos" (<6 PDL) de PDL en células T CD8+/CAR+. Este resultado es consistente con el descubrimiento de que los factores que pueden limitar el número de duplicaciones poblacionales de células T en un proceso para producir una composición terapéutica de células T pueden mejorar la probabilidad de que los sujetos presenten una supervivencia libre de progresión que sea duradera.
Ejemplo 7: Evaluación de las características de composiciones celulares (de entrada) seleccionadas en un proceso para producir una composición celular terapéutica.
Se evaluaron los atributos fenotípicos de las células T seleccionadas de sujetos con linfoma no Hodgkin (NHL) recidivante y refractario, antes de la manipulación con un CAR anti-CD19 mediante el proceso descrito en el Ejemplo 6. Las células T CD4+ y CD8+ se seleccionaron mediante enriquecimiento basado en inmunoafinidad a partir de leucaféresis de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de una pluralidad de sujetos. Se evaluó una composición de dichas células T seleccionadas (antes de la manipulación genética, designada "composición previa a la manipulación") para determinar la expresión de marcadores de superficie celular indicativos de ciertos subtipos de células T, como los subtipos de células de memoria efectoras o de memoria central, incluyendo el receptor de quimiocina C-C tipo 7 (CCR7), CD27 y CD45RA. También se evaluó la expresión superficial de CD4 o CD8.
La evaluación de las composiciones CD4+ y CD8+ enriquecidas (por ejemplo composiciones de entrada) reveló que el porcentaje de células T positivas para marcadores de tipo virgen (por ejemplo células T CD27+CD28+), como los presentes en subconjuntos de células T de memoria central, era muy variable entre pacientes de NHL(FIG.
11).Estos datos indican que existe heterogeneidad entre pacientes de subconjuntos de células T de memoria central en composiciones de células T seleccionadas (de entrada) usadas para generar composiciones de células T terapéuticas CAR+.
Se usaron composiciones de células T seleccionadas (de entrada) para generar composiciones de células T terapéuticas CD4+ y c D8+ sustancialmente como se describe en el Ejemplo 6. El número de duplicaciones de las composiciones celulares generadas también se determinó basándose en el recuento nuclear total (TNC) de células como se describe en el Ejemplo 6. Se determinó la correlación entre los atributos fenotípicos de las células en las composiciones de células T seleccionadas (de entrada) y el número de duplicaciones en el proceso para producir la composición terapéutica. Como se muestra en laFIG. 12,un mayor porcentaje de células T CD4+ de memoria efectoras identificadas mediante tinción negativa para CD45RA y CCR7 (CD45RA-CCR7-) en las composiciones CD4+ enriquecidas (de entrada) se correlacionó positivamente con el número de duplicaciones de la población durante la producción de la composición terapéutica de células T. Se observó un resultado similar para las células CD8+.
Los resultados anteriores apoyan un enfoque que incluye la reducción del porcentaje de células T efectoras de memoria y/o el enriquecimiento de células T positivas para marcadores de subconjuntos de células de memoria central o vírgenes en una composición de entrada usada en un proceso para producir una composición de células T manipuladas. En consonancia con los resultados anteriores, dicho enfoque puede mejorar una o más características de una composición terapéutica de células T manipulada, como reducir la variabilidad de paciente a paciente, reducir el número de duplicaciones de población en un proceso para producir una composición terapéutica de células T manipulada y/o aumentar la probabilidad de que un sujeto pueda mostrar una PFS duradera.
Ejemplo 8: Cinética de los procesos de manipulación no expandida y expandida
Se diseñaron células T humanas (CD4+ y CD8+) con un receptor de antígeno quimérico (CAR) mediante una variedad de procesos de fabricación, incluidos procesos que no incluían un paso de cultivo para la expansión (cohorte de no expansión) y procesos que sí incluían un paso de cultivo para la expansión (cohorte de expansión). Se llevó a cabo un análisis compuesto de las células producidas durante y después de los ciclos de fabricación por los distintos procesos. Las series de fabricación para producir composiciones de células T manipuladas incluyeron series a escala como las descritas en el Ejemplo 8, así como procesos como los descritos a continuación. Las series de fabricación también incluyeron modelos a escala reducida (SDM) que se llevaron a cabo sustancialmente igual que las series de fabricación pero en los que se usó un número menor de células T en el proceso para las células manipuladas. En general, las series de fabricación a escala reducida compartieron las actividades de proceso descritas en la Tabla E3.
En los procesos analizados, las células T se diseñaron con un CAR anti-CD19 o un CAR anti-BCMA. El CAR anti-CD19 ejemplar contenía un scFv anti-CD19 derivado de un anticuerpo murino FMC63, un espaciador de inmunoglobulina, un dominio transmembrana derivado de CD28, una región coestimuladora derivada de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular CD3-zeta. El vector también codificaba una molécula receptora truncada que servía como marcador sustitutivo de la expresión CAR y que estaba separada del constructo de CAR por una secuencia T2A. El CAR anto-BCMA ejemplar contenía un dominio de unión a antígeno scFv específico para BCMA, una región transmembrana CD28, una región de señalización coestimuladora 4-1BB y un dominio de señalización intracelular derivado de CD3-zeta. El vector también codificaba una molécula receptora truncada que servía como marcador sustitutivo de la expresión de CAR y que estaba separada del constructo de CAR por una secuencia T2A.
Los procesos incluían la estimulación de las células T o con perlas paramagnéticas anti-CD3/anti-CD28 o con reactivos de muteína de estreptavidina oligomérica conjugada con Fab anti-CD3/anti-CD28. El reactivo oligomérico contenía un polímero de una muteína de estreptavidina designada STREP-TACTIN® M2 (un homo-tetrámero de estreptavidina que contiene la secuencia de aminoácidos de la muteína expuesta en la SEQ ID NO:73 (Solicitud internacional publicada N° WO2018/197949). La muteína de estreptavidina también se describe en la Patente de Estados Unidos N° 6.103.493 y Voss y Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982, y Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Research, 1871-1882). Los agentes estimuladores (fragmentos Fab anti-CD3 y anti-CD28) se multimerizaron mediante unión reversible al reactivo de muteína de estreptavidina oligomérica. Los fragmentos Fab anti-CD3 y anti-CD28 se unieron reversiblemente al oligómero de muteína de estreptavidina a través de un molécula de unión peptídica de estreptavidina fusionado a cada fragmento Fab. El fragmento Fab anti-CD3 se derivó del anticuerpo monoclonal de unión a CD3 producido por la línea celular de hibridoma OKT3 (ATCC® CRL-8001 ™; consultar también la Patente de Estados Unidos N° 4.361.549), y contenía el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo anti-CD3 OKT3 descrito en Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996). Estas secuencias se exponen en las SEQ ID NO: 93 y 94, respectivamente. El fragmento Fab anti-CD28 se derivó del anticuerpo CD28.3 (depositado como un constructo Fv sintético de cadena sencilla bajo el N° de registro GenBank AF451974.1; consultar también Vanhove et al., BLOOD, 15 de julio de 2003, Vol. 102, N° 2, páginas 564-570) y contenía los dominios variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo anti-CD28 CD28.3 expuesto en las SEQ iD NO: 91 y 92, respectivamente. Los fragmentos Fab se fusionaron individualmente en el extremo terminal carboxi de su cadena pesada a una secuencia de unión a péptidos de estreptavidina que contenía una disposición secuencial de dos módulos de unión a estreptavidina con la secuencia de aminoácidos S<a>WSHPQFEK(G<g>G<s>)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 79). Los fragmentos Fab marcados con péptidos se produjeron de manera recombinante (consultar las Publicaciones de solicitud de patente internacional N° WO 2013/011011 y WO 2013/124474). La unión de los anti-CD3 y anti-CD28 marcados con péptidos al reactivo de muteína oligomérica estrepavizante puede alterarse, o invertirse, mediante la adición de D-biotina. La D-biotina compite con la etiqueta de estrep. de los agentes para unirse a la molécula de unión en la muteína de estreptavidina, alterando de este modo la unión.
Las células se recogieron en varios momentos durante y al final de las series de fabricación, y se contaron, y se evaluó su viabilidad y por citometría de flujo tras la tinción con anticuerpos que reconocen marcadores de superficie, incluyendo CD4, CD8, CCR7, CD27 y CD45RA.
A. Procesos de manipulación de células T
Se compararon composiciones de células T producidas usando diferentes procesos no expandidos que diferían en varias características, incluyendo la fuente de partida de las células (aféresis crioconservada o aféresis nueva), la concentración del reactivo estimulador oligomérico y el número de células usadas para la estimulación. También se produjeron composiciones de células T en las que las células se cultivaron posteriormente para su expansión. Los procesos se llevaron a cabo en donantes sanos o en donantes pacientes.
1. Procesos no expandidos
Se recogieron muestras de leucaféresis de donantes humanos y se lavaron. Las células CD4+ y CD8+ se seleccionaron directamente por inmunoafinidad a partir de las muestras de leucaféresis que no se habían crioconservado. Después de la selección, las composiciones separadas de células T CD4+ y CD8+ se crioconservaron y luego se descongelaron, y luego las células T CD4+ y CD8+ seleccionadas se mezclaron en una proporción de 1:1 de células T CD4+ viables a células T CD8+ viables para producir una composición de entrada. Se estimularon aproximadamente 600 x 106 células de la composición celular de entrada mezclada (aproximadamente 300 x 106 CD4+ y 300 x 106 CD8+) mediante incubación con 0,8 |jg por 1 x 106 células anti-CD3/anti-CD28 Fab conjugadas con reactivos de muteína de estreptavidina oligomérica generados como se ha descrito anteriormente en este Ejemplo. La estimulación se llevó a cabo durante entre 18 y 30 horas (24 ± 6 horas) en un medio completo sin suero que contenía un medio basal (por ejemplo medio basal CTS™ OpTmizer, Thermo Fisher), un suplemento de células T (por ejemplo 2,6% de suplemente de expansión de células T OpTmizer®, Thermo Fisher), un sustituto de suero de células inmunitarias (por ejemplo 2,5% de reemplazo de suero de células inmunes CTS™), 2 mM de L-glutamina, una forma dipéptida de L-glutamina (por ejemplo 1,0% Glutamax™, Thermo Fisher), 100 IU/ml de IL-2 recombinante, 600 IU/ml de iL-7 recombinante y 100 IU/ml de IL-15 recombinante. Tras la estimulación, se transdujeron hasta 300 x 106 células mediante espinoculación con un vector lentiviral que codificaba el CAR anti-BCMA ejemplar o el CAR anti-CD19 ejemplar.
Después de la espinoculación, las células se lavaron y volvieron a suspender a una densidad de hasta aproximadamente 0,75 x 106 células/ml en medio basal (por ejemplo medio basal CTS™ OpTmizer, Thermo Fisher) con 2 mM de glutamina pero sin la adición de citoquinas recombinantes, y se incubaron a aproximadamente 37,0° C en una incubadora. Después de aproximadamente 48 horas ± 6 horas desde el inicio de la estimulación (aproximadamente 24 horas después de comenzar la incubación), se añadió 1,0 mM de D-biotina y se mezcló con las células para disociar los reactivos Fab anti-CD3 y anti-CD28 del reactivo de estreptavidina oligomérica. Las células se incubaron de nuevo durante aproximadamente 48 horas adicionales (aproximadamente 96 horas ± 6 horas después del inicio de la estimulación o hasta el día 5 del proceso), y después se formularon con un crioprotector.
En otro proceso, se recogieron muestras de leucaféresis de donantes humanos, se lavaron y se crioconservaron. Las muestras de leucaféresis crioconservadas se descongelaron y se seleccionaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ de cada muestra mediante selección basada en inmunoafinidad y, a continuación, las células T CD4+ y CD8+ se mezclaron con el objetivo de producir una composición de entrada de hasta aproximadamente 900 x 106 células T CD4+ y CD8+ viables, en la que varió la proporción de células T CD4+ viables con respecto a las células T CD8+ viables. La composición celular de entrada mixta se estimuló mediante incubación con 1,2 |jg por 1 x 106 células de reactivos oligoméricos de muteína de estreptavidina conjugados con Fab anti-CD3/anti-CD28 generados como se ha descrito anteriormente en este Ejemplo (donde 1,2 jg del reactivo estimulador oligomérico incluye 0,9 jg de partículas oligoméricas y 0,15 jg de Fabs anti-CD3 y 0,15 jg de Fabs anti-CD28). La estimulación se llevó a cabo durante entre 16 y 24 horas (20 ± 4 horas) en el mismo medio completo libre de suero descrito anteriormente. Después de la estimulación, se transdujeron hasta aproximadamente 600 x 106 células mediante espinoculación con un vector lentiviral que codificaba un CAR, en este caso el mismo CAR anti-BCMA ejemplar o CAR anti-CD19 ejemplar descrito anteriormente. En este estudio, las células que se incubaron con la concentración más alta de los reactivos oligoméricos de muteína de estreptavidina mostraron una eficacia de transducción mejorada (datos no mostrados). Después de la espinoculación en este proceso, las células se lavaron y volvieron a suspender a una densidad de 0,75 x 106 células/ml en medio basal ((por ejemplo medio basal CTS™ OpTmizer, Thermo Fisher) con 2 mM de glutamina y 2,6% de suplemento de células T (por ejemplo 2,6% de suplemento OpTmizer®, Thermofisher) sin la adición de citoquinas recombinantes, y se incubaron a aproximadamente 37,0° C en una incubadora. Después de aproximadamente 48 horas ± 6 horas desde el inicio de la estimulación (aproximadamente 24 horas después de comenzar la incubación), se añadió 1,0 mM de D-biotina y se mezcló con las células para disociar los reactivos Fab anti-CD3 y anti-CD28 del reactivo de estreptavidina oligomérica. Las células se incubaron de nuevo durante aproximadamente 48 horas adicionales (aproximadamente 96 horas ± 6 horas después del inicio de la estimulación o hasta el día 5 del proceso), y después se formularon con un crioprotector.
2. Proceso expandido
En un proceso, se obtuvieron células T CAR anti-CD19 mediante el proceso no expandido descrito anteriormente.
En otro proceso, se seleccionaron composiciones separadas de células CD4+ y CD8+ a partir de muestras de leucaféresis humana y se criocongelaron. Las composiciones celulares seleccionadas se descongelaron posteriormente y se mezclaron en una proporción de 1:1 de células T CD4+ viables y células T CD8+ viables. Se estimularon aproximadamente 300 x 106 células T (150 x 106 células CD4 y 150 x 106 células T CD8+) de la composición mezclada en presencia de perlas paramagnéticas recubiertas de poliestireno con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos en una proporción de 1:1 de perla a célula en un medio libre de suero que contenía IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes durante entre 18 y 30 horas. Después de la incubación, se concentraron aproximadamente 100 x 106 células viables de la composición celular estimulada en el medio libre de suero que contenía IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes. Las células se transdujeron, por espinoculación a aproximadamente 1600 g durante 60 minutos, con un vector lentiviral que codifica un CAR ejemplar, en este caso el CAR anti-BCMA ejemplar descrito anteriormente. Después de la espinoculación, las células se volvieron a suspender en el medio libre de suero que contenía IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes, y se incubaron durante aproximadamente de 18 a 30 horas a aproximadamente 37° C. Luego, las células se cultivaron para su expansión transfiriéndolas a un biorreactor (por ejemplo un biorreactor de movimiento de balanceo) en aproximadamente 500 ml del medio libre de suero ejemplar que contenía el doble de la concentración de IL-2, IL-7 e IL-15 usada durante los pasos de incubación y transducción. Cuando se alcanzó una densidad celular viable establecida, se inició la perfusión, en la que se sustituyó el medio por una perfusión semicontinua con mezcla continua. Las células se cultivaban al día siguiente en el biorreactor hasta que se alcanzaba una densidad celular umbral de aproximadamente 3 x 106 células/ml, lo que se producía típicamente en un proceso que implicaba 6-7 días de expansión. Las perlas paramagnéticas conjugadas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 se eliminaron de la composición celular mediante exposición a un campo magnético. A continuación, se recogieron, se formularon y se crioconservaron las células.
B. Métricas del proceso
Durante las series de fabricación se monitorizaron métricas del proceso como el total de células vivas (FIG.
13A) y la viabilidad (FIG. 13B). Como se muestra en la FIG. 13A, se observó una expansión mínima de las células en el punto temporal del día 5, con una expansión robusta a partir del día 5. La FIG. 13B muestra una disminución inicial de la viabilidad de las células en las series de fabricación que comienza a aumentar a medida que las células comienzan a expandirse después del Día 5 de los procesos.
En la FIG. 13C (por expresión de CD5RA y CCR7) y en la FIG. 13D (por expresión de CD27 y CCR7) se muestran los resultados de la comparación del fenotipo de memoria/diferenciación en diferentes momentos de las series de fabricación. Como se muestra, la evaluación de las células al principio de las series de fabricación muestra que las células aproximadamente el día 5 están sustancialmente más enriquecidas para tipos celulares menos diferenciados, como células CCR7+CD45RA- o CCR7+CD27+, en comparación con las células tanto en momentos anteriores del proceso (por ejemplo Día 1 o Día 2) como en momentos posteriores del proceso (por ejemplo Día 9). Se analizó el número de células CD57+ a lo largo del proceso de fabricación. Como se muestra en la FIG. 14, el número de células CD8+CD57+ disminuyó a lo largo del proceso de fabricación, mientras que el número de células CD4+CD57+ se mantuvo bajo durante todo el proceso.
Secuencias
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un método para enriquecer células T y generar una población manipulada de células T, el método comprendiendo:
(a) realizar una primera selección, la primera selección comprendiendo enriquecer para cualquiera de las células T CD57- o CD3+ a partir de una muestra biológica que comprende células T humanas primarias, generando de este modo una población de células T enriquecidas; y
(b) realizar una segunda selección de las células de la población de células T enriquecidas, en donde:
la primera selección comprende enriquecer para células T CD57- y la segunda selección comprende enriquecer para células T CD3+ a partir de la población enriquecida; o
la primera selección comprende enriquecer para células T CD3+ y la segunda selección comprende eliminar células T CD57+ de la población de células T enriquecidas,
en donde el método genera una población agotada que comprende menos células T CD57+ que la muestra biológica y está enriquecida para células T CD3+, y
(c) introducir un polinucleótido heterólogo que codifique un receptor recombinante en una población de células T obtenida a partir de la población agotada, generando de este modo una población manipulada de células T.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la población agotada comprende por lo menos uno de los siguientes:
(i) menos de o de aproximadamente un 5% de células T CD57+;
(ii) una frecuencia de células T CD57+ que es menor de o de aproximadamente un 35% de la frecuencia de células T CD57+ presentes en la muestra biológica;
(iii) células T CD4+, en donde por lo menos el o aproximadamente el 95% de las células T CD4+ son CD57-; y (iv) células T CD8+, en donde por lo menos el o aproximadamente el 95% de las células T CD8+ son CD57-.
3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde la muestra biológica comprende un producto de aféresis o un producto de leucaféresis.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:
(i) por lo menos el o aproximadamente el 95% de las células T CD4+ de la población agotada comprende células T CD57-CD4+; y/o
(ii) por lo menos el o aproximadamente el 95% de las células T CD8+ de la población agotada comprende células T CD57-CD8+; y/o
(iii) por lo menos el o aproximadamente el 95% de las células T CD3+ de la población agotada comprende células T CD57-CD3+.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde:
(i) la frecuencia de las células T CD57+ en la población agotada es menor de aproximadamente o aproximadamente el 35%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o 0,1% de la frecuencia de células T<c>D57+ en la muestra biológica; y/o
(ii) la población agotada comprende menos de aproximadamente o aproximadamente un 3%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 2%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 1%, menos de aproximadamente o aproximadamente un 0,1% o menos de aproximadamente o aproximadamente un 0,01% de células T CD57+; y/o
(iii) la población agotada está libre o esencialmente libre de células T CD57+.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde:
(i) la frecuencia de las células T de tipo virgen en la población agotada es por lo menos aproximadamente o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la frecuencia de células T de tipo virgen en la muestra biológica, opcionalmente en donde las células T de tipo virgen son positivas en superficie para uno o más marcadores seleccionados de CD45RA, CD27, CD28 y Cc R7; y/o
(ii) la frecuencia de células T CD27+ en la población agotada es por lo menos aproximadamente o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la frecuencia de las células respectivas en la muestra biológica; y/o
(iii) la frecuencia de células T CD28+ en la población agotada es por lo menos aproximadamente o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la frecuencia de las células respectivas en la muestra biológica; y/o
(iv) la frecuencia de células T CD27+/CD28+ en la población agotada es por lo menos aproximadamente o aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la frecuencia de las células respectivas en la muestra biológica.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el método produce una composición de células T que comprende por lo menos un o aproximadamente un 90%, por lo menos un o aproximadamente un 95%, por lo menos un o aproximadamente un 97%, por lo menos un o aproximadamente un 99% o por lo menos un o aproximadamente un 99,9% de células T CD57-CD3+, opcionalmente en donde la proporción de células T CD4+ y CD8+ en la composición está comprendida entre 3:1 y 1:3, entre 2:1 y 1:2, entre 1,5:1 y 1:1,5 o entre 1,2:1 y 1:1,2, cada una inclusive, opcionalmente además en donde la proporción de células T CD4+ y CD8+ en la composición es de o de aproximadamente 1:1.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las células T primarias proceden de un sujeto con una enfermedad o afección, opcionalmente en donde la enfermedad o afección es un cáncer.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:
(i) la eliminación de las células T CD57+ comprende una selección basada en inmunoafinidad, opcionalmente en donde la selección basada en inmunoafinidad comprende poner en contacto las células con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a CD57 y recuperar las células no unidas al anticuerpo, efectuando de este modo una selección negativa, en donde las células recuperadas están agotadas para las células CD57+; y/o
(ii) el enriquecimiento de células comprende una selección basada en inmunoafinidad, opcionalmente en donde la selección enriquece para células T CD3 y la selección basada en inmunoafinidad se efectúa poniendo en contacto las células con un anticuerpo capaz de unirse específicamente a CD3, y recuperando las células unidas al anticuerpo, efectuando de este modo una selección positiva, en donde las células recuperadas están enriquecidas para las células CD3+.
10. El método de la reivindicación 9, en donde:
(i) el anticuerpo se inmoviliza en una superficie sólida, opcionalmente en donde la superficie sólida es una partícula magnética; y/o
(ii) el anticuerpo se inmoviliza sobre o se une a una matriz de cromatografía de afinidad.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la muestra biológica que comprende las células T primarias es una muestra formulada con un crioprotector.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde, antes de la introducción, la población agotada se incuba en condiciones estimuladoras.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la introducción comprende la transducción con un vector viral que comprende el polinucleótido heterólogo, opcionalmente además en donde el vector viral es un vector gammaretroviral o un vector lentiviral.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende además cultivar las células de la población manipulada en condiciones que promuevan la proliferación o expansión de las células manipuladas, generando de este modo una población expandida de células, opcionalmente, en donde el cultivo se lleva a cabo en presencia de una o más citoquinas recombinantes, que comprenden opcionalmente una o más de IL-2, IL-7 e IL-15.
15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR), opcionalmente en donde el receptor recombinante comprende:
(i) un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno, opcionalmente un scFv;
(ii) un espaciador y/o una región de bisagra;
(iii) un dominio transmembrana; y
(iv) un dominio de señalización intracelular que comprende una región de señalización coestimuladora, opcionalmente en donde:
(a) el dominio de señalización intracelular es o comprende un dominio de señalización intracelular de una cadena CD3, opcionalmente además una cadena CD3-zeta (CD3Z) o una porción de señalización de la misma; y/o
(b) la región de señalización coestimuladora comprende un dominio de señalización intracelular de un CD28, un 4-1BB o un ICOS o una porción de señalización de los mismos.
16. Una composición que comprende células producidas por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
17. Una dosis de células T de una población manipulada de células T producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad, trastorno o afección, en donde el método comprende administrar la dosis de células T al sujeto.
18. Una dosis de células T de una población manipulada de células T producida por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o afección, en donde la enfermedad o afección es un cáncer, y en donde el método comprende administrar la dosis de células T al sujeto.
19. La dosis de células T para el uso de la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en donde:
(i) el receptor recombinante, opcionalmente el CAR, reconoce específicamente o se une específicamente a un antígeno asociado con, o expresado o presente en células de, la enfermedad o afección; y/o
(ii) la dosis de células T comprende entre o aproximadamente 5 x 106y o aproximadamente 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 5 x 106 y o aproximadamente 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 5 x 106 y o aproximadamente 50 x 106 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 5 x 106 y o aproximadamente 25 x 106 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 5 x 106 y o aproximadamente 10 x 106 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 10 x 106y o aproximadamente 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 10 x 106 y o aproximadamente 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 10 x 106 y o aproximadamente 50 x 106 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 10 x 106 y o aproximadamente 25 x 106 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 25 x 106 y o aproximadamente 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 25 x 106 y o aproximadamente 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 25 x 106 y o aproximadamente 50 x 106 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 50 x 106y o aproximadamente 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 50 x 106 y o aproximadamente 1 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, entre o aproximadamente 1 x 108 y o aproximadamente 1,5 x 108 células T que expresan receptores recombinantes, cada una inclusive; y/o
(iii) la dosis de células T es autóloga para el sujeto que está siendo tratado.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL292319B2 (en) 2019-10-30 2026-01-01 C3S2 Gmbh Cell selection and/or stimulation devices and methods of use
US20220412954A1 (en) 2019-11-05 2022-12-29 Juno Therapeutics, Inc. Methods of determining attributes of therapeutic t cell compositions
IL294565B2 (en) * 2020-01-13 2025-04-01 Aspen Neuroscience Inc Method for distinguishing between nerve cells and related compounds and methods of use
US12378521B2 (en) 2020-04-15 2025-08-05 Amgen Inc. Method for enhancing production of genetically engineered autologous T cells
US12241086B2 (en) * 2020-04-15 2025-03-04 Amgen Inc. Process for generating genetically engineered autologous T cells
JP2023526278A (ja) * 2020-05-13 2023-06-21 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 組み換え受容体を発現しているドナーバッチ細胞を産生するための方法
KR20240018454A (ko) 2021-05-06 2024-02-13 주노 테라퓨틱스 게엠베하 T 세포의 자극 및 형질도입 방법
CN117659145B (zh) * 2022-02-14 2024-08-02 西南大学 链霉亲和素第27位丝氨酸突变的突变蛋白s27v及其应用
CN114507274B (zh) * 2022-02-14 2023-08-25 西南大学 可逆结合生物素的链霉亲和素突变蛋白及其应用
EP4615960A1 (en) * 2022-11-09 2025-09-17 C3S2 GmbH Methods for manufacturing engineered immune cells
CN121002052A (zh) * 2023-02-03 2025-11-21 C3S2 有限公司 用于非病毒生产工程化免疫细胞的方法
CN116640192B (zh) * 2023-04-12 2024-08-02 西南大学 链霉亲和素突变体StrepTactin的Y43A突变蛋白及其应用
CN116785415B (zh) * 2023-05-04 2024-03-22 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 一种特异性针对免疫细胞激活/增殖刺激的产品、制备及应用

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4361549A (en) 1979-04-26 1982-11-30 Ortho Pharmaceutical Corporation Complement-fixing monoclonal antibody to human T cells, and methods of preparing same
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
JP2624470B2 (ja) 1984-10-02 1997-06-25 バイオジェン インコーポレイテッド ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4795698A (en) 1985-10-04 1989-01-03 Immunicon Corporation Magnetic-polymer particles
IN165717B (es) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5033252A (en) 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
ATE114507T1 (de) 1988-12-28 1994-12-15 Stefan Miltenyi Verfahren sowie materialien zur hochgraduierten magnetischen abspaltung biologischer materialien.
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
DK0557459T3 (da) 1990-11-13 1997-12-15 Immunex Corp Bifunktionelle, selekterbare fusionsgener
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
DE4228458A1 (de) 1992-08-27 1994-06-01 Beiersdorf Ag Multicistronische Expressionseinheiten und deren Verwendung
DE4237113B4 (de) 1992-11-03 2006-10-12 "Iba Gmbh" Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins
AU6953394A (en) 1993-05-21 1994-12-20 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
WO1996013593A2 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Procept, Inc. Soluble single chain t cell receptors
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
JPH11501008A (ja) 1995-02-09 1999-01-26 ユニバーシティ オブ ワシントン 改変−アフィニティーストレプトアビジン
WO1997011183A1 (en) 1995-04-11 1997-03-27 Trustees Of Boston University Streptavidin mutants
DE19608753C1 (de) 1996-03-06 1997-06-26 Medigene Gmbh Transduktionssystem und seine Verwendung
WO1997034634A1 (en) 1996-03-20 1997-09-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain fv constructs of anti-ganglioside gd2 antibodies
EP0912250B1 (en) 1996-04-24 1999-11-03 Claude Fell Cell separation system for biological fluids like blood
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
US6174670B1 (en) 1996-06-04 2001-01-16 University Of Utah Research Foundation Monitoring amplification of DNA during PCR
DE19641876B4 (de) 1996-10-10 2011-09-29 Iba Gmbh Streptavidinmuteine
EP0977770A4 (en) 1997-03-14 2000-04-05 Univ Boston DIFFERENTLY FLAVORED STREPTAVIDINE
EP1019439B1 (en) 1997-10-02 2011-11-16 Altor BioScience Corporation Soluble single-chain t-cell receptor proteins
AU758949B2 (en) 1998-05-19 2003-04-03 Avidex Limited Multivalent T cell receptor complexes
AU765822B2 (en) 1998-05-23 2003-10-02 Leiden University Medical Center CD40 binding molecules and CTL peptides for treating tumors
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
JP2002524081A (ja) 1998-09-04 2002-08-06 スローン − ケッタリング インスティチュート フォー キャンサー リサーチ 前立腺−特異的膜抗原に特異的な融合受容体およびその使用
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
AU1675600A (en) 1998-12-24 2000-07-31 Biosafe S.A. Blood separation system particularly for concentrating hematopoietic stem cells
CN100490895C (zh) 2000-02-01 2009-05-27 泛遗传学公司 结合cd40的apc激活分子
AU2001265346A1 (en) 2000-06-02 2001-12-17 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
EP1307592B1 (en) 2000-08-11 2006-07-05 University of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
CA2425862C (en) 2000-11-07 2013-01-22 City Of Hope Cd19-specific redirected immune cells
EP1227321A1 (en) 2000-12-28 2002-07-31 Institut für Bioanalytik GmbH Reversible MHC multimer staining for functional purification of antigen-specific T cells
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
EP1421115B1 (en) 2001-08-31 2005-03-02 Avidex Limited Soluble t cell receptor
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
ITCZ20020002A1 (it) 2002-04-11 2003-10-13 Parco Scient E Tecnologico Del Dispositivo e metodo per il rilevamento simultaneo di differenti anticorpi e antigeni in campioni clinici, alimentari ed ambientali
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
WO2007001459A2 (en) 2004-11-15 2007-01-04 Washington University Compositions and methods for modulating lymphocyte activity
FR2841905B1 (fr) 2002-07-05 2004-09-03 Centre Nat Rech Scient Fragments fab mutants de l'anticorps anti-cd4 chimere 13b8.2 et leurs applications
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US8361794B2 (en) 2004-06-29 2013-01-29 Immunocore Limited Cells expressing a modified T cell receptor
BRPI0419117A (pt) 2004-11-12 2007-12-11 Genentech Inc ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, processo para produção, polipeptìdeo isolado, molécula quimérica, anticorpo, anticorpo isolado, composição de interesse, artigo de fabricação, método de alìvio de uma disfunção imune relacionada, método para determinar a presença de um polipeptìdeo em uma amostra suspeita de conter dito polipeptìdeo, método de diagnóstico de uma doença imune relacionada em um mamìfero, método de alìvio de linfoma em um mamìfero em necessidade deste, método de alìvio de doença inflamatória de intestino em um mamìfero em necessidade deste e método de alìvio de rejeição de células transplantadas em um mamìfero
US20080112934A1 (en) * 2004-11-24 2008-05-15 Rafick-Pierre Sekaly Methods To Identify, Prepare, And Use Naive T Cell Recent Thymic Emigrants
CN101146559B (zh) 2005-03-23 2012-09-05 生物安全股份有限公司 用于再生医学的收集、处理和移植包括成人干细胞的细胞亚群的集成系统
GB0620894D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Univ Southampton Human immune therapies using a CD27 agonist alone or in combination with other immune modulators
DK2141997T3 (da) 2007-03-30 2013-02-11 Sloan Kettering Inst Cancer Konstitutiv ekspression af co-stimulatoriske ligander på adoptivt overførte t-lymfocytter
JP5575636B2 (ja) 2007-05-07 2014-08-20 メディミューン，エルエルシー 抗ｉｃｏｓ抗体ならびに、腫瘍、移植および自己免疫疾患の治療におけるその使用
DK2433713T3 (en) 2007-12-07 2017-09-25 Miltenyi Biotec Gmbh CELL PROCESSING SYSTEMS AND PROCEDURES
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
US20120164718A1 (en) 2008-05-06 2012-06-28 Innovative Micro Technology Removable/disposable apparatus for MEMS particle sorting device
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
US10464987B2 (en) 2009-10-06 2019-11-05 Abbvie Inc. Human single-chain T cell receptors
ES2717629T3 (es) 2009-11-03 2019-06-24 Hope City Receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) para selección de células T transducidas
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
RU2688185C2 (ru) 2011-03-23 2019-05-21 Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер Способ и композиции для клеточной иммунотерапии
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
PT2734538T (pt) 2011-07-18 2018-08-02 Iba Gmbh Processo para corar, de forma reversível, uma célula-alvo
GB201116092D0 (en) 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
JP6368243B2 (ja) 2011-11-11 2018-08-08 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター がんのためのサイクリンａ１に標的化されたｔ細胞免疫療法
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
WO2013124474A2 (en) 2012-02-23 2013-08-29 Stage Cell Therapeutics Gmbh Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials
US9751928B2 (en) 2012-05-03 2017-09-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Enhanced affinity T cell receptors and methods for making the same
KR102264290B1 (ko) 2012-08-20 2021-06-10 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
CN112458057A (zh) 2012-10-02 2021-03-09 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
EP2920204B1 (en) 2012-11-16 2019-09-18 IBA GmbH Streptavidin muteins and methods of using them
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
ES2995052T3 (en) 2014-04-23 2025-02-05 Juno Therapeutics Inc Methods for isolating, culturing, and genetically engineering immune cell populations for adoptive therapy
DK3166968T3 (da) 2014-05-02 2021-12-06 Univ Pennsylvania Sammensætninger og fremgangsmåder til kimæriske autoantistofreceptor-T-celler
TWI805109B (zh) 2014-08-28 2023-06-11 美商奇諾治療有限公司 對cd19具專一性之抗體及嵌合抗原受體
WO2016073602A2 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Juno Therapeutics, Inc. Methods for transduction and cell processing
US20180147271A1 (en) * 2015-05-18 2018-05-31 Bluebird Bio, Inc. Anti-ror1 chimeric antigen receptors
PT3436079T (pt) * 2016-04-01 2021-10-06 Kite Pharma Inc Recetores de antigénios quiméricos e de células t e métodos de uso
JP7359751B2 (ja) 2017-03-14 2023-10-11 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド 極低温保管のための方法
EP4647493A3 (en) 2017-04-27 2026-01-14 Juno Therapeutics, Inc. Oligomeric particle reagents and methods of use thereof

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