ES2968853T3 - Aislamiento microfluídico de células tumorales u otras células raras a partir de sangre total u otros líquidos - Google Patents

Abstract

Se describe que los microdispositivos aíslan y enumeran de manera eficiente, precisa y rápida células raras, como células tumorales circulantes, a partir de líquidos como sangre completa. El sistema emplea múltiples canales serpenteantes paralelos que tienen una anchura del orden de 1 a 2 diámetros de celda. Los microdispositivos pueden producirse a bajo costo, pueden automatizarse fácilmente y, en muchos casos, pueden usarse sin procesamiento previo de la muestra. Pueden usarse para aislar y enumerar células raras, incluida, por ejemplo, la detección y el diagnóstico de cánceres, la estadificación del cáncer, la evaluación de la eficacia de una intervención terapéutica o la detección de bacterias patógenas. El dispositivo puede usarse opcionalmente para capturar de forma no destructiva y posteriormente liberar células objetivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aislamiento microfluídico de células tumorales u otras células raras a partir de sangre total u otros líquidos

Campo técnico

Esta invención se refiere al aislamiento microfluídico de células tumorales u otras células raras a partir de sangre total u otros líquidos.

El desarrollo de esta invención ha sido financiado parcialmente por el Gobierno de los Estados Unidos bajo la subvención 1 R33-CA099246-01 otorgada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud; y también bajo la subvención EPS-0346411 otorgada por la Fundación Nacional de Ciencias. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Técnica anterior

Existe una necesidad no cubierta de técnicas mejoradas para aislar y detectar células tumorales circulantes y otras células raras.

La mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer se deben a metástasis. Las células cancerosas pueden ser transportadas desde el tumor primario a través del sistema circulatorio o la médula ósea; algunas de esas células circulantes pueden tener potencial metastásico. La capacidad de identificar y hacer un recuento de las células tumorales circulantes (CTCs) sería de gran ayuda en el diagnóstico y pronóstico de muchos tipos de cáncer. Sin embargo, ha sido difícil detectar de forma fiable las CTCs debido a su concentración extremadamente baja en un fondo elevado de células "espectadoras" en la sangre periférica (por ejemplo, glóbulos rojos y blancos). Se ha informado de que la concentración de CTCs en sangre se correlaciona con el tiempo medio de supervivencia de los pacientes con cáncer de mama. Sería muy útil clínicamente, por ejemplo, el poder hacer un recuento con precisión de 0-10 CTCs en 1 mL de sangre total en un fondo de ~109 eritrocitos y ~106 leucocitos.

Al realizar un muestreo de eventos raros a partir de una población amplia, son importantes tres mediciones: (1) el rendimiento, la cantidad de células identificadas o la cantidad de etapas para una clasificación por unidad de tiempo; (2) la recuperación, la fracción de células diana recuperadas con éxito a partir de la muestra de partida; y (3) la pureza, el grado en que las células recuperadas están exentas de células "interferentes". Además de esas tres mediciones, las células enriquecidas también deben poder contarse con precisión.

Los enfoques anteriores para enriquecer las CTCs en muestras clínicas generalmente han producido recuperaciones bajas con pureza elevada o pureza baja con recuperación elevada. En unos pocos casos, se ha informado de pureza elevada y recuperación elevada, pero solo con equipos y técnicas de procesamiento y manipulación de muestras altamente especializados. Por ejemplo, se han utilizado partículas magnéticas de tamaño micrométrico recubiertas de anticuerpos para enriquecer las CTCs con pureza elevada, pero solo con recuperaciones modestas (~70%). Se han utilizado membranas de policarbonato con diferentes tamaños de poro (8 - 14 pm) para filtrar células por tamaño a partir de volúmenes relativamente grandes de sangre (9,0 - 18 mL), con una recuperación de ~85% de las CTCs, pero con pureza baja debida también a la retención de grandes cantidades de leucocitos.

Otro enfoque ha sido utilizar una PCR cuantitativa; o utilizar una PCR de transcripción inversa para analizar el ARNm como sustituto de las CTCs. La RT-PCR puede detectar una CTC en un exceso de 106 células mononucleadas. Sin embargo, los ensayos de RT-PCR son propensos a una alta variabilidad entre laboratorios, están notoriamente sujetos a falsos positivos debido a la contaminación ambiental y requieren un manejo y manipulación extensivos de las muestras. Además, las técnicas de PCR generalmente destruirán las células que se han tomado en las muestras.

Entre las dificultades a las que enfrentan los métodos existentes para aislar y hacer un recuento de CTCs, se encuentran una o más de las siguientes: la necesidad de seleccionar células CTCs raras a partir de la fracción mononucleada de sangre total, lo que normalmente implica el uso de una centrifugación en gradiente de densidad para eliminar los glóbulos rojos mucho más numerosos; la necesidad de aparatos de citometría de flujo; o la necesidad de microscopía de fluorescencia. Además de sus costes y complejidad, esos procedimientos implican etapas de manipulación y transferencia de muestras que pueden provocar una pérdida o contaminación de las células, lo que puede afectar dramáticamente a los resultados, particularmente cuando, para empezar, se trata de una cantidad muy pequeña de células diana.

Los sistemas de microfluidos se pueden utilizar para procesar muestras, incluidas muestras clínicas, con el fin de minimizar la contaminación y la pérdida de muestras. Sin embargo, los sistemas de microfluidos no se han utilizado ampliamente con anterioridad para procesar volúmenes de muestras relativamente grandes (p. ej., >1 mL) debido a las pequeñas dimensiones de los dispositivos. Por ejemplo, para procesar totalmente un volumen de muestra de 1,0 mL utilizando un microcanal de 30 pm x 30 pm, a una velocidad lineal de 1,0 mm s"1, se requerirían -309 h (~13 días). Un enfoque ha sido preparar un lecho de captura inmunológica de gran superficie, lleno de micropilares (por ejemplo, ~100 pm de diámetro x ~100 pm de altura).

El documento de publicación de la solicitud de patente núm. US2007/0026413A1 describe un dispositivo con una serie de obstáculos (por ejemplo, micropilares) que se basa en la hidrodinámica de flujo a través de espacios entre los obstáculos, así como desplazamientos espaciales entre filas adyacentes de los obstáculos, y anticuerpos sobre las superficies de los micropilares para clasificar preferentemente los tipos de células por tamaño, forma, composición química o deformabilidad. Véase también S. Nagrath et al., "Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology," Nature, vol. 450, págs. 1235-1239 (2007); y los documentos de las publicaciones de solicitudes de patente núm. US2007/0264675A1; US2007/0172903A1; US2008/0124721A1 y US2006/0134599A1.

El documento de publicación de la solicitud de patente núm. US2008/0318324A1 describe dispositivos microfabricados o nano-fabricados para separar, concentrar y aislar células tumorales circulantes u otras partículas. Se podrían usar canales de fluidos que tengan formas de sección transversal particulares u otras características para la dispersión, distribución o partición del flujo de fluidos, con el fin de reducir el impacto directo de las células contra las características de la exclusión. La divulgación describe el uso de la denominada "filtración efusiva": redirigir, dividir, humedecer o dispersar el flujo de un fluido para reducir el impacto físico sobre las células, al tiempo que permite la filtración a través de aberturas. En algunos casos, la curvatura podría incluirse como una característica del perímetro de filtración. Las superficies de los canales podrían tratarse con compuestos anticoagulantes, compuestos que se unen preferentemente a las células tumorales circulantes o compuestos que impiden la adherencia de las células.

P. Sethu et al., "Continuous flow microfluidic device for rapid erythrocyte lysis", Anal. Chem., vol. 76, págs. 6247-6253 (2004) describen un dispositivo microfluídico para la eliminación de eritrocitos de una muestra de sangre mediante lisis selectiva de los eritrocitos. La sangre total se mezcló con un tampón de lisis y la mezcla se transportó a través de un canal de reacción de microfluidos de onda rectangular.

M. Toner et al., "Blood-on-a-Chip", Annu. Rev. Biomed. Ing., vol. 7, págs. 77-103 (2005) proporcionan una revisión de la investigación sobre el uso de microdispositivos para manipular sangre y células sanguíneas a microescala.

Los anticuerpos no son los únicos elementos de reconocimiento molecular con especificidad elevada hacia moléculas diana seleccionadas. Los aptámeros son otro ejemplo de elementos de reconocimiento que pueden tener una especificidad elevada. Los aptámeros son oligómeros de ácidos nucleicos monocatenarios con afinidad específica hacia una diana molecular, generalmente a través de interacciones distintas al emparejamiento de bases clásico de Watson-Crick. En comparación con los anticuerpos, los aptámeros (generalmente) tienen un peso molecular más bajo y una mayor estabilidad durante el almacenamiento a largo plazo. Se conocen tecnologías automatizadas en la técnica para seleccionar y sintetizar aptámeros que tienen especificidad hacia una diana deseada, por ejemplo, una proteína de membrana. Los aptámeros pueden inmovilizarse fácilmente sobre superficies de soporte sólidas como vidrio, polímeros u oro.

S. Lupoid et al.,Cancer Res.,vol. 62, págs. 4029-4033 (2002) han descrito aptámeros de ARN dirigidos contra PSMA y el uso de esos aptámeros para dirigirlos a una diana de células de cáncer de próstata con metástasis en ganglios linfáticos (LNCaP).

J. Phillips et al., Anal. Chem., vol. 81, págs. 1033-1039 (2009) han descrito el uso de aptámeros sobre paredes de microcanales de PDMS para la selección de células leucémicas sembradas (~1 * 106 células/mL) en un tampón acuoso que también se cargó con células no cancerosas.

A. Adams et al., "Low abundant biomarker screening in poly(methylmethacrylate) high aspect ratio microstructures using immunoaffinity-based molecular recognition", Special Publication: Royal Society of Chemistry - Miniaturized Total Analysis Systems, vol.1, págs. 132-134 (2004) han descrito un dispositivo microfluídico de<p>M<m>A recubierto con anticuerpos y con una relación de aspecto elevada para concentrar previamente células cancerosas poco abundantes a partir de suspensiones de sangre simulada. Se encontró que un caudal óptimo para ese dispositivo era 2 mm/s. Los anticuerpos se fijaron a una superficie de polímero carboxilado, generado por exposición a radiación ultravioleta. El dispositivo tenía 17 canales rectos "con un carácter extremadamente rectangular, es decir, estrecho (30-50 pm) y alto (250 pm)" para maximizar las colisiones entre las células y las paredes del canal. Se informó de una eficiencia de captura del 1% para un canal de 50 pm y del 100% para un canal de 20 pm.

El documento WO 2006/108087 describe dispositivos y métodos para analizar células tumorales circulantes y el documento US 5637469 describe métodos y dispositivos para la detección de un analito utilizando sistemas de flujo a mesoescala.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un microdispositivo tal y como se define en la reivindicación 1, para capturar o aislar células diana tal y como se define en la reivindicación 1, a partir de un líquido. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento tal y como se define en la reivindicación 4, para capturar o aislar las células diana en circulación definidas a partir de un líquido. Las reivindicaciones dependientes establecen características de ciertas realizaciones de los aspectos de la invención.

Hemos descubierto un sistema para aislar y hacer un recuento de manera eficiente, precisa y rápida de células raras, como las células tumorales circulantes, a partir de líquidos como la sangre total. Ahora es posible examinar de forma exhaustiva y rápida grandes volúmenes (p. ej., 1,0 mL o más) de sangre total sin procesar en busca de células raras, como las CTCs. Se han aislado y detectado con éxito células raras en experimentos prototipo en los que las células de fondo superaban en número a las células diana en ocho órdenes de magnitud; y deberían ser posibles niveles de sensibilidad aún más elevados.

En una realización prototipo de la novedosa unidad de micromuestreo de alto rendimiento (HTMSU, por sus siglas en inglés), hemos diseñado y sometido a ensayo con éxito lechos de captura con una relación de aspecto elevada, extremadamente eficientes, recubiertos con anticuerpos monoclonales (AcMos) o aptámeros específicos para proteínas de la membrana de CTCs. La HTMSU tiene canales de fluidos paralelos sinusoidales o cuasisinusoidales con un ancho del orden de 1 a 2 veces el diámetro de las células. Una realización preferida emplea un sensor de conductividad altamente específico y sin marcador para la detección no destructiva de células individuales. Las células tumorales suelen tener conductividades eléctricas más altas que las células normales, por ejemplo, debido a la sobreexpresión de proteínas o glicoproteínas de la membrana cargadas, como las que tienen las moléculas de ácido siálico. Esa diferencia se presta ella misma para una detección mediante mediciones de la conductividad. Un método preferido para fijar elementos de captura es la técnica de preparación de micropatrones no fotorresistentes, descrita en el documento de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. US2007/0191703A1. Utilizando esa técnica, los elementos de captura se pueden fijar selectivamente solo a las paredes del canal, sin estar también fijados a otras partes del dispositivo. Se prefiere fijar selectivamente los elementos de captura solo a las paredes del canal y esto ayuda a facilitar una elevada recuperación de las células diana. Por el contrario, fijar los elementos de captura fuera de los canales podría hacer que las células se anclen en puntos de "volúmenes vacíos no barridos" que puede que no se liberen más adelante; aunque en general no se prefiere, en algunas aplicaciones específicas también podría ser útil fijar los elementos de captura a otras superficies dentro del dispositivo, superficies fuera de los propios canales. La hidrodinámica generalmente está mejor ajustada dentro de los canales de captura que en otras áreas del dispositivo y, por lo tanto, se prefiere capturar las células solo dentro de los canales. Observamos que las paredes laterales de los canales pueden exponerse con una máscara convencional y radiación UV, porque la luz normalmente no es completamente colineal. Hay rayos luminosos divergentes que inciden en las paredes laterales. Además, habrá dispersión que causará que las paredes laterales queden expuestas a la radiación ultravioleta.

Los dispositivos de acuerdo con la presente invención se pueden producir con bajos costes utilizando microrreplicación y tecnologías de fabricación que por lo demás se conocen en la técnica. Los dispositivos pueden automatizarse fácilmente y, en muchos casos, pueden usarse sin requerir ningún procesamiento previo de la muestra. El sistema novedoso se puede utilizar en muchas situaciones en las que es deseable aislar y hacer un recuento de células raras, incluyendo, por ejemplo, la detección y el diagnóstico de cánceres, la estadificación de un cáncer, la evaluación de la eficacia de una intervención terapéutica o la detección de bacterias patógenas (por ejemplo, en muestras de alimentos o ambientales).

El sistema HTMSU es flexible y se adapta a una amplia variedad de elementos de reconocimiento molecular (anticuerpos, aptámeros) para dirigirlos a dianas de tipos particulares de células raras, tal y como se define en las reivindicaciones. A modo de ejemplo, las paredes de un canal podrían recubrirse con anticuerpos monoclonales dirigidos contra E. coli O157:H7 para detectar esa cepa bacteriana patógena en concentraciones extremadamente bajas.

Las realizaciones preferidas del sistema novedoso emplean una o más de las siguientes características o particularidades: se usan canales "cerrados" en lugar de pilares para que fluya el fluido y la captura de células; los pilares, aunque no se prefieren, también pueden estar presentes opcionalmente, pero sin excluir los canales "cerrados"; se prefieren múltiples canales paralelos para mejorar el rendimiento; se utiliza una forma de canal sinusoidal o cuasisinusoidal para mejorar el contacto entre las células en el fluido y las paredes del canal; se obtiene una eficacia de captura muy elevada; los canales tienen una relación de aspecto elevada (3:1 o más); la anchura del canal debe ser del orden de 1-2 veces el diámetro de la célula; hay una caída de presión uniforme o cuasiuniforme a través de los múltiples canales; el material del dispositivo elegido para inhibir una unión no específica, el PMMA, suele ser útil para ese fin; se utilizan elementos de captura altamente específicos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o aptámeros; el dispositivo es fácilmente expandible cambiando la profundidad del canal, el número de canales o ambos; y el dispositivo puede usarse para capturar de forma no destructiva y posteriormente liberar las células diana.

Las eficacias de una recuperación de células raras pueden ser muy altas: 80%+, 85%+, 90%+, 95%+, 97%+. Esas tasas son superiores a cualquiera que se haya descrito anteriormente con otros dispositivos o sistemas. Además, la tasa de falsos positivos puede ser muy baja, por ejemplo, menos de 1 por 10 mL de muestra. Se puede lograr una tasa baja de falsos positivos incorporando varios modos independientes de especificidad en el dispositivo y su funcionamiento; realizaciones preferidas emplean un reconocimiento molecular (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal), fuerza de cizallamiento para eliminar células que no son diana que pueden estar adheridas de forma no selectiva a la superficie y el uso de un detector que es selectivo para células que tienen el mismo tamaño que las células diana. La invención se puede utilizar para recuperar células raras a partir de una variedad de líquidos, incluida sangre total, agua, orina, saliva, LCR y otros.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 representa esquemáticamente un prototipo de HTMSU según la presente invención.

Las Figs. 2A - D son histogramas que representan la posición radial observada de las CTCs en microcanales de diferentes formas a diferentes velocidades.

Las Figs. 3A - C representan los resultados de varias mediciones de la conductancia con el sistema novedoso, utilizando células de cáncer de mama MCF-7 y sangre total.

Las Figs. 4A y B representan los resultados de varias mediciones de la conductancia con el sistema novedoso, utilizando células de cáncer de próstata LNCaP y sangre total.

Modos para llevar a cabo la invención

Ejemplos 1-21: Fabricación de un prototipo de HTMSU y aislamiento y detección de células de cáncer de mama MCF-7 poco abundantes en la sangre total.

Materiales y métodos

Ejemplo 1. Fabricación de HTMSU. La Fig. 1 representa esquemáticamente un prototipo de HTMSU según la presente invención. El prototipo de HTMSU ha sido fabricado y analizado con éxito. El dispositivo prototipo contenía 51 canales paralelos sinusoidales con relación de aspecto alta que compartían un puerto de entrada común y un puerto de salida común. Los dispositivos se replicaron a partir de un molde maestro utilizando técnicas de estampado en caliente que por lo demás se conocen en la técnica. Véase, A. Adams et al, "Highly efficient circulating tumor cell isolation from whole blood and label-free enumeration using polymer-based microfluidics with an integrated conductivity sensor", J. Am. Chem. Soc, vol. 130, págs. 8633-8641 (2008), y el material de apoyo que está disponible en pubs.acs.org para obtener detalles adicionales sobre la fabricación del molde maestro y los procedimientos de microrreplicación, a los que se hará una referencia adicional. El sustrato utilizado en el prototipo de HTMSU era poli(metacrilato de metilo) (PMMA), que se eligió por su alta fidelidad en la replicación de microestructuras con relación de aspecto elevada, su mínima adsorción no específica de componentes sanguíneos totales y la capacidad de funcionalizar la superficie de PMMA con diferentes restos mediante radiación UV.

Ejemplo 2. Inmovilización de anticuerpos. Los anticuerpos se inmovilizaron en un procedimiento de dos etapas. Primera, el dispositivo de HTMSU modificado en la superficie con UV se cargó con una solución que contenía 4,0 mg/mL de clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropilcarbodiimida (EDC), 6,0 mg/mL de N-hidroxisuccinimida (NHS) en solución de ácido 2-(4-morfolino)-etanosulfónico 150 mM a pH = 6 (MES, Fisher Biotech, Fair Lawn, Nueva Jersey); y solución salina tamponada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 1,0 h para formar un producto intermedio de éster succinimidílico. A continuación, la solución de EDC/NHS dentro del dispositivo se reemplazó hidrodinámicamente con una solución de 1,0 mg/mL de anticuerpo monoclonal anti-EpCAM (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) en PBS 150 mM a pH = 7,4 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), que se dejó reaccionando durante 4 horas. Luego se lavó el dispositivo con una solución de PBS (pH = 7,4) para eliminar los anticuerpos anti-EpCAM no unidos. Para obtener detalles adicionales sobre esos procedimientos, véase la información adicional de Adams et al. (2008).

Ejemplo 3. Aparato. Se utilizó una bomba de jeringa PHD2000 (Harvard Apparatus, Holliston, MA) para procesar hidrodinámicamente las muestras en el prototipo de HTMSU. Se equipó una jeringa con cierre de tipo Luer (Hamilton, Reno, NV) con un adaptador de luer a capilar (InnovaQuartz, Phoenix, AZ) para conectar la HTMSU y la bomba. El caudal de la bomba de jeringa era programable. Las velocidades lineales se calcularon en función de la relación entre el área de la sección transversal de los canales de captura de la HTMSU y el caudal volumétrico programado. Los caudales se confirmaron mediante un seguimiento de las células suspendidas en una región fija de 80 pm mediante microscopía óptica.

El prototipo de HTMSU se fijó a una etapa motorizada programable de un microscopio Axiovert 200M (Carl Zeiss, Thornwood, NY), que podía realizar un seguimiento de las células en la HTMSU mediante fluorescencia o imágenes de campo brillante. Se capturaron vídeos de transporte celular con 30 fotogramas por segundo, utilizando un CCD monocromático (JAI CV252, San Jose, CA). Para la observación de la fluorescencia de las células MCF-7, los colorantes se excitaron con una lámpara de arco Xe y conjuntos de filtros específicos para colorantes (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Cada cubo de filtro contenía un espejo dicroico, un filtro de emisión y un filtro de excitación.

Ejemplo 4. Sensor de conductividad integrado. Los electrodos de conductividad eran alambres de Pt (~75 pm) en canales guía impresos en la red de fluidos y posicionados de manera ortogonal al canal de salida del fluido. El alambre de Pt se había insertado en los canales guía antes de la unión térmica de la placa de cubierta al sustrato. Una vez posicionado el alambre, el conjunto de sustrato/alambre se colocaba entre placas de vidrio, se sujetaba entre ellas y se calentaba ligeramente por encima de la temperatura de transición vítrea del PMMA, para incrustar el alambre en los canales guía. El alambre abarcaba toda la profundidad del canal de salida. A continuación, se cortó el alambre para formar un par de electrodos, utilizando una microfresadora de alta precisión (KERN MMP 2522, KERN Micro- und Feinwerktechnik GmbH & Co.; Eschenlohe Alemania) con una broca de 50 pm. Después del mecanizado del alambre de Pt y la activación UV de las superficies del polímero del canal, la placa de cubierta se alineó con el sustrato impreso mediante marcas de alineación, y el conjunto se sujetó entre dos placas de vidrio y se calentó para unir los componentes entre sí.

Para obtener más detalles sobre el sensor de conductividad preferido, véase, D. Patterson, "Conductivity Counter", documento de solicitud de patente de Estados Unidos con núm. de serie 12/388,904, presentada el 19 de febrero 2009; y el material de apoyo de Adams et al. (2008); a ambos de los cuales se hace referencia adicionalmente.

La conductividad se midió en tampón TRIS-glicina que contenía tripsina al 0,25% (p/p), TRIS 0,18 mM, glicina 47 mM y Tween-20 al 0,05% (v/v), a veces denominado "tampón de liberación de CTCs". El tampón de liberación de CTCs tenía una conductividad relativamente baja (-50 pS/cm, pH 7,2). La tripsina en el tampón de liberación de CTCs actúa para eliminar las células unidas (CTCs) desde la superficie del canal de captura.

Ejemplo 5. Suspensiones celulares. Se adquirió sangre total citrada de conejo en Colorado Serum Company (Denver, CO). (La sangre contenía citrato de sodio al 10% (p/p) para inhibir la coagulación). Las células MCF-7 (una línea celular de cáncer de mama), el medio de crecimiento, la solución salina tamponada con fosfato, la tripsina y el suero bovino fetal se adquirieron en la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Se cultivaron las células MCF-7 adherentes hasta una confluencia del 80% en medio Eagle modificado con Dulbecco complementado con un contenido elevado en glucosa y que contenía 1,5 g L_1 de bicarbonato de sodio (NaHCO3), tampón HEPES 15 mM y suero bovino fetal (FBS) al 10%.

Algunas de las células MCF-7 se tiñeron para experimentos de visualización mediante fluorescencia con PKH67, un derivado de la fluoresceína que contiene un enlazador de membrana lipófilo (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo). El protocolo sugerido por el fabricante para la tinción celular se modificó duplicando la concentración de colorante, de modo que los marcadores fluorescentes se distribuían de manera más uniforme sobre las membranas celulares. Los recuentos de células en los experimentos de siembra de sangre total se determinaron contando tres partes alícuotas de células con un hemocitómetro. La precisión del recuento celular era de ±10%.

Resultados y discusión (experimentos con células MCF-7)

Modelo de sistema CTC. Utilizamos la línea celular MCF-7 como modelo para la selección y el recuento de CTCs con el prototipo de HTMSU. MCF-7 es una línea celular de cáncer de mama que sobreexpresa la molécula de adhesión de células epiteliales unida a la membrana (EpCAM). Las células MCF-7 tienen entre 15 y 30 pm de diámetro (media = 24 pm). Se han asociado estrechamente con el cáncer de mama micrometastásico. Las membranas de MCF-7 tienen un promedio de ~5,1 *105 moléculas de EpCAM por célula. Los anticuerpos monoclonales para EpCAM están disponibles comercialmente.

Encontramos diversos parámetros experimentales y del dispositivo que afectaban al rendimiento de la HTMSU. Hemos tomado medidas preliminares para optimizar esos parámetros para mejorar el rendimiento de la HTMSU. Entre esos parámetros se encuentran los siguientes: (1) rendimiento: velocidad del flujo lineal, caída de presión, tiempo de procesamiento; (2) recuperación: geometría del canal de captura (forma y anchura), dinámica del flujo celular; (3) pureza: diseño de la superficie para minimizar una adsorción no específica y proporcionar una selectividad elevada para las células diana.

Ejemplo 6. Caída de presión. Un objetivo principal del prototipo de HTMSU era procesar sangre total directamente en un tiempo razonable. Diseñamos canales de captura con relación de aspecto elevada para mejorar el rendimiento. (Relación de aspecto = altura del canal / anchura del canal). Si la anchura y la altura del canal estaban en el orden de las dimensiones de la célula (relación de aspecto “ 1), entonces la captura de incluso una sola célula dentro de un canal causaría una gran caída de presión, y posiblemente podría dañar la célula capturada. Otras fuentes potenciales de obstrucción también se vuelven más probables cuando tanto la anchura como la altura son bajas. Para el dispositivo prototipo elegimos un canal de captura con una relación de aspecto de 4,3: 35 pm de ancho por 150 pm de profundidad. Esas dimensiones pueden reproducirse fácilmente mediante técnicas de impresión en caliente conocidas por lo demás en la técnica. Suponiendo una viscosidad de la sangre de 4,8 cP (hematocrito = 0,4), calculamos que la caída de presión para un canal de 35 pm * 35 pm (L = 3,5 cm) sería ~7,4 * 103 Pa, mientras que la caída de presión para un canal de 35 pm * 150 pm sería ~2,9 * 103 Pa, una reducción de más del 60%.

Ejemplos 7-10. Dinámica de flujo. Cuando un capilar tiene dimensiones que son más de ~15% mayores que las dimensiones de las células que se transportan, las células tienden a migrar hacia el eje central del tubo y dejar una capa libre de células adyacente a la pared del capilar, típicamente de ~4 pm de espesor. Debido a que los elementos de captura (por ejemplo, anticuerpos) están fijados a la pared del canal, este "enfoque" alejado de la pared tiende a reducir el número de encuentros entre las células diana (por ejemplo, CTCs) y los elementos de reconocimiento. Para investigar este fenómeno cuantitativamente, teñimos las CTCs con un derivado de fluoresceína específico de la membrana y tomamos imágenes de las mismas mientras eran transportadas a través de microcanales no modificados (sin AcMo) de 35 pm de ancho con una configuración recta o sinusoidal. Los resultados de esos experimentos se muestran en las Figs. 2A - D.

Las Figs. 2A - D son histogramas que representan la posición radial observada de las CTCs en los microcanales a velocidades lineales (U) de 1,0 mm/s (Figs. 2A y C) y 10 mm/s (Figs. 2B y D); en canales rectos (Figs. 2A y B) y sinusoidales (Figs. 2C y D). Las líneas centrales representan el eje central del microcanal. Las células se tiñeron con un colorante fluorescente de la membrana lipófilo, PKH67, y se obtuvieron imágenes mediante microscopía de fluorescencia.

Los canales rectos (Figs. 2A y B) mostraban una zona exenta de células, similar a lo que se ha observado en los capilares rectos. El espesor de esa zona exenta de células aumentaba con el aumento de la velocidadU.La dinámica de flujo observada era bastante diferente en los canales de forma sinusoidal (Figs. 2C y D). En primer lugar, no aparecía ninguna zona marginal a lo largo del borde de la pared del microcanal y, en segundo lugar, la distribución radial de las células parecía ser en gran medida independiente de los cambios en U. Por lo tanto, se obtiene una captura más eficiente de las células cuando se utilizan canales sinusoidales o cuasisinusoidales, incluso cuando se utilizan velocidades lineales relativamente altas para procesar grandes volúmenes de entrada en tiempos relativamente cortos. Sin desear estar ligados a esta hipótesis, creemos que las células migran hacia el exterior del canal curvado debido principalmente a dos factores: (1) un componente de velocidad a través de la corriente debido a la inversión de la dirección de la curvatura, que promueve una recirculación y mezcla; y (2) la fuerza centrífuga que actúa sobre las células, que tiende a "empujar" las células hacia las paredes exteriores.

También calculamos el número de Reynolds y el número de Dean para los canales curvados de 35 pm. El número de Dean es una cantidad adimensional que representa tanto el radio de curvatura como el diámetro hidráulico de un canal curvado. Para los canales sinusoidales utilizados en nuestros dispositivos prototipo, se calculó que el número de Dean era ~1,1 a una velocidad de traslación de 10 mm s-1, muy por debajo del valor umbral de ~36 con el que el flujo se vuelve inestable.

Ejemplos 11-14. Efectos de la anchura del canal y la velocidad lineal sobre la eficiencia de la captura. Examinamos los efectos de variar las dimensiones y la forma de los canales de captura y la velocidad del flujo lineal. Medimos la eficiencia de captura de CTCs en canales rectos de 20, 35 y 50 pm de ancho, y en un canal sinusoidal de 35 pm de ancho, con diversos caudales.

El canal recto de 20 pm de ancho atrapaba esencialmente el 100% de las células diana antes de entrar en el canal, con todos los caudales investigados. La observación mediante microscopía de fluorescencia revelaba que la mayoría de las células ni siquiera entraba en el canal de captura, porque las CTCs eran típicamente más anchas que el canal de 20 pm. Para aquellas células que entraban en los canales, las membranas celulares estaban en constante proximidad a las paredes del canal recubiertas de anticuerpos y generalmente eran capturadas en los primeros 1 a 2 mm del canal de 3,5 cm de largo. El dispositivo de 20 pm fallaba constantemente debido al bloqueo de los microcanales en esas pruebas y consideramos que era demasiado estrecho para usarlo con muchos tipos de células (aunque ese ancho o incluso más estrecho podría ser práctico para capturar células más pequeñas, como bacterias). Además, a velocidades de flujo lineales más altas, los bloqueos pueden provocar presiones de cabeza inaceptables. Por esas razones, se prefiere utilizar una anchura de canal que tenga al menos el mismo tamaño que el diámetro de la célula diana promedio.

También observamos que para todas las anchuras de canal superiores a 20 pm, tanto en los canales lineales como los sinusoidales, la eficiencia de captura de las células alcanzaba un máximo con una velocidad de flujo lineal de ~2 mm s-1. La eficiencia de captura disminuía tanto con caudales más rápidos como más lentos. La eficiencia de captura era mayor para anchuras de canal más estrechas, siempre que el canal no fuera tan estrecho que fuera fácilmente susceptible de bloqueo. La mayor eficiencia de captura se obtuvo con el canal de forma sinusoidal y 35 pm de ancho (~97%). Esa velocidad de flujo óptima variará dependiendo del tipo particular de célula diana y del elemento de captura particular utilizado.

Un dispositivo con un único canal de 35 x 150 pm, manejado con un caudal lineal de ~2 mm s-1, procesaría 1 mL de líquido en ~9,5 * 105 s (~26 h). Aumentar el caudal lineal disminuiría la eficiencia de captura, por lo que diseñamos un dispositivo prototipo con múltiples canales de captura (todos de dimensiones similares), con una única entrada común y una única salida común. El dispositivo prototipo tenía 51 canales de captura, lo que reducía el tiempo de procesamiento de 1 mL de líquido a ~1900 s (~31 min). El uso de una salida común para todos los canales de captura permitía una recogida y agrupación simples de las células seleccionadas. El dispositivo prototipo de 51 canales se muestra en la Fig. 1. Si la profundidad del canal aumentaba a 250 pm (una relación de aspecto de 7,14 para un canal de 35 pm de ancho) y si se duplicaba el número de canales paralelos, entonces el tiempo de muestreo para esa misma entrada de volumen podía reducirse a ~2,7 min. Además, se podían procesar volúmenes de muestra más grandes (por ejemplo, 10 mL o más) en un tiempo razonable.

Ejemplos 15-16. Efectos del cizallamiento sobre las células capturadas. También evaluamos las fuerzas de cizallamiento sobre las células capturadas, para determinar si el cizallamiento inducido por el flujo podía desprender las células de las paredes o dañarlas. Utilizando un modelo simple de las fuerzas implicadas, calculamos que la velocidad de flujo lineal requerida para separar las células que expresan EpCAM de una pared de PMMA recubierta con anticuerpos anti-EpCAM, sería del orden de 102 a 104 cm s-1, dependiendo del grado en que las células capturadas se hubieran aplanado y alargado sobre la superficie recubierta con anticuerpos. Ese intervalo de velocidades es sustancialmente mayor que los caudales utilizados en nuestros experimentos, lo que implica que no se debe esperar que las fuerzas de cizallamiento presenten dificultades. Observamos diversas células capturadas de forma continua durante las pruebas que empleaban velocidades lineales de hasta 10,0 cm s-1; no se observó daño celular ni alteración de la adhesión a la pared celular.

Ejemplo 17. Desprendimiento y recuento de células intactas. Una vez capturadas las células, normalmente será deseable liberar selectivamente las células capturadas en un momento posterior sin dañarlas, por ejemplo, para contarlas o caracterizarlas de otro modo. Existen fuertes fuerzas de adhesión en un sistema típico antígeno-anticuerpo, por lo que se debe utilizar un mecanismo de liberación enzimático u otro mecanismo de liberación selectiva. Por ejemplo, hemos utilizado con éxito la enzima proteolítica tripsina para liberar células capturadas sin dañarlas. La digestión proteolítica y la liberación de las células capturadas normalmente requerían menos de 10 minutos.

Ejemplos 18-20. Sensor de la conductividad para el recuento de células. Se utilizaron dos electrodos de Pt integrados, separados por 50 jm , en un sensor de conductividad para el recuento de células. El parámetro característico K (la relación entre la separación del electrodo y el área del electrodo) se eligió como ~0,01 |jirr1 para detectar las CTCs de mayor tamaño, preferentemente sobre leucocitos o eritrocitos más pequeños que aún podían estar presentes en pequeñas cantidades como resultado de una adsorción no específica.

Los canales de captura del prototipo de HTMSU se estrecharon desde 150 jm hasta una profundidad de ~80 jm a medida que se acercaban al sensor de conductividad, para igualar el diámetro del electrodo de Pt y tener una eficiencia de muestreo cercana al 100%. Las Figs. 3A-C representan los resultados de varias mediciones de la conductancia. Las Figs. 3A y B representan respuestas de conductancia, en unidades arbitrarias (UA). La Fig. 3A representa la respuesta de los electrodos frente a muestras de la prueba enriquecidas con leucocitos (curva inferior) o eritrocitos (curva superior). En ambos casos la densidad celular era de 150 células/pL, en tampón TRIS-glicina, transportada a través del sensor de conductividad integrado con un caudal de 0,05 pL/min. Observamos que los electrodos eran esencialmente insensibles tanto a los leucocitos como a los eritrocitos. Brevemente: el sensor de conductividad es sensible a los cambios en la conductancia local de la solución en masa. Cuando una sola célula atraviesa el par de electrodos, puede dar lugar a un cambio en la conductividad local medida en masa. Los glóbulos rojos no producían ninguna señal apreciable, simplemente como resultado de su pequeño tamaño. La conductancia de los leucocitos es similar a la del tampón vehículo, lo que no produce ninguna señal aparente. Sin embargo, la conductancia de las CTCs generalmente diferirá de la del tampón, lo que permitirá detectarlas de forma selectiva.

La composición química de las CTCs diferencia sus propiedades eléctricas de las de los eritrocitos o leucocitos. Por ejemplo, las CTCs generalmente tienen un potencial de membrana bajo y una impedancia baja. Además, las membranas de las células cancerosas generalmente tienen una mayor cantidad de moléculas de ácido siálico cargadas negativamente. Debido al diferencial entre la conductancia de las CTCs y la del tampón vehículo, y debido al tamaño relativamente grande de las células, el sensor de conductividad registraba señales distintas, correspondientes a CTCs individuales.

A continuación, sembramos 1 mL de sangre total con 10 ±1 CTCs, bombeamos la muestra a través del prototipo de HTMSU a 2,0 mm/s para concentrar las CTCs en un volumen de ~190 nL, liberamos las células capturadas con tripsina y las contamos con el sensor de conductividad con un caudal volumétrico de 0,05 jL/min. Véase la Fig. 3B, que muestra los datos de conductividad medidos utilizando un filtro de suavizado numérico Savitsky-Golay de 3 puntos. Con un umbral de señal frente a ruido de 3:1 (= nivel de confianza del 99,7%), había 10 picos en el trazo de la conductancia que asignamos a las CTCs (indicados con asteriscos). Solo los picos de conductancia positivos (en relación con el fondo) se calificaron como CTCs, no los picos negativos. La curva "media" o "base" también mostrada en la Fig. 3B corresponde a una muestra de control de sangre total que carecía de células MCF-7, pero que también había sido procesada a través de la HTMSU. El sistema de puntuación de CTCs se verificó mediante microscopía de campo brillante, que confirmó que las CTCs individuales estaban correlacionadas con señales positivas en relación con la conductancia de fondo, y que las señales negativas parecían estar correlacionadas con partículas no celulares. La disparidad en las magnitudes de los picos de CTCs evidentemente surgía de diferencias en la morfología y la composición celular, tal vez debido al menos en parte a variaciones en la fase mitótica. Con la muestra de sangre de control (no enriquecida con CTCs), ninguna señal de conductancia excedía el criterio 3a, es decir, logramos una tasa de falsos positivos de 0 en esa prueba en particular.

Ejemplo 21. Pruebas adicionales del sensor de conductividad para el recuento de células. Para verificar aún más la eficiencia de la recuperación y detección del sistema, realizamos pruebas adicionales en las que la cantidad de CTCs sembradas variaba en un rango amplio y fisiológicamente relevante (10-250 CTCs por mL de sangre total). Véase la Fig. 3C. La línea de mejor ajuste para los datos medidos tenía una pendiente de 0,945 con una intersección cercana a 0 (r2 = 0,9988), lo que indica una tasa general de recuperación y detección del ~95% para las CTCs, con una tasa baja de falsos negativos y una tasa muy baja de falsos positivos.

Ejemplos 22 - 31: Uso del prototipo de HTMSU para aislar y detectar células de cáncer de próstata LNCaP de poca abundancia en sangre total.

Las células tumorales de próstata sobreexpresan el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA). El PSMA se puede utilizar como marcador para seleccionar células tumorales de próstata de poca abundancia a partir de muestras clínicas muy heterogéneas, incluida la sangre total. Hemos desarrollado un sistema de HTMSU que emplea aptámeros que se unen específicamente a PSMA. La densidad superficial de los aptámeros específicos de PSMA en la superficie de PMMA era de ~8,4 * 1012 moléculas/cm2 A una velocidad lineal de 2,5 mm/s, recuperamos ~90% de las células de cáncer de próstata desde una muestra de sangre total. Posteriormente, las células capturadas se liberaron intactas desde la superficie utilizando tripsina al 0,25% (p/v). El dispositivo de HTMSU utilizado en esos experimentos era generalmente similar al dispositivo prototipo descrito en los Ejemplos 1, 3, 4 y 6-14, y representado en la Figura 1, salvo que se indique lo contrario. No era necesario ningún procesamiento previo de la sangre ni una tinción de las células. Se inmovilizaron aptámeros de ARN generadosin vitrosobre canales de captura sinusoidales modificados mediante UV en la HTMSU, utilizando química de acoplamiento de carbodiimida y un enlazador para mejorar la accesibilidad del aptámero unido a la superficie.

Ejemplo 22. Reactivos. Los siguientes reactivos se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO): alcohol isopropílico de grado reactivo, clorhidrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropilcarbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), suero bovino fetal (FBS) y ácido 2-(4-morfolino)-etanosulfónico (MES). El aptámero de ARN resistente a nucleasas (NH<2>-(CH<2>M O C H<2>CH<2>MACCAAGACCUGACUUCUAACUAAGUCUACGUUCC) (SEQ ID NO. 1), se obtuvo en Eurogentec (San Diego, CA). Los oligonucleótidos de secuencia aleatoria se obtuvieron en Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). El anticuerpo monoclonal anti-EpCAM se obtuvo en R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN). LNCaP (línea celular de cáncer de próstata), MCF-7 (línea celular de cáncer de mama), los medios de crecimiento, el tampón HEPES, la solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la tripsina se adquirieron en la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Se adquirió sangre de conejo citrada en Colorado Serum Company (Denver,<c>O). El tampón Tris-glicina se obtuvo en Bio Rad Laboratories (Hercules, CA). Todas las soluciones se prepararon en agua exenta de nucleasas, adquirida en Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA). Se utilizaron tubos de microcentrífuga sin nucleasa adquiridos en Ambion Inc. (Foster City, CA) para la preparación y el almacenamiento de todas las muestras y reactivos. Un derivado de fluoresceína, PKH67, que contiene un enlazador de membrana lipófilo para la tinción celular, se adquirió en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Ejemplo 23. Suspensiones celulares. Las células LNCaP y MCF-7 se cultivaron hasta una confluencia del 80% en medio Eagle modificado con Dulbecco, complementado con un contenido elevado en glucosa y que contenía 1,5 g/L de bicarbonato de sodio (NaHCO3), tampón HEPES 15 mM y FBS al 10%. Se usó una solución de tripsina al 0,25% en PBS 150 mM para recoger las células LNCaP y MCF-7 desde la placa de cultivo. Las células LNCaP y MCF-7 se tiñeron con PKH67 para microscopía de fluorescencia, con el doble de la concentración de PKH67 recomendada por el fabricante para distribuir de manera más uniforme los marcadores fluorescentes sobre la superficie celular. Los recuentos de células para los experimentos de siembra en sangre total se determinaron contando tres partes alícuotas de células usando un hemocitómetro. La precisión del recuento celular era de ±10%.

Ejemplo 24. Radiación de superficies de canales y formación de la HTMSU. Los dispositivos con PMMA limpios y las placas de cubierta se expusieron a radiación ultravioleta (UV) a través de una máscara para formar restos de carboxilato en la superficie de la región del lecho de captura del dispositivo (pero no en otras partes de la HTMSU). La radiación UV se transmitió a través de una máscara de aluminio durante 10 minutos a 15 mW cm-2. Luego, las piezas se alinearon y se sujetaron entre dos placas de borosilicato. La placa de cubierta se fusionó térmicamente con el sustrato en un horno convectivo. La temperatura se incrementó de 50°C a 101°C a una tasa de 20°C/min y se mantuvo durante 15 min a 101°C, una temperatura que está ligeramente por encima de la temperatura de transición vítrea del material modificado con UV. A continuación, se insertaron capilares de sílice fundida recubiertos de poliimida en el puerto de entrada de la HTMSU para introducir muestras en el dispositivo con una bomba de jeringa programable (Harvard, Holliston, MA).

Ejemplo 25. Sensor de la conductividad. Los electrodos de Pt (d = 76 pm) se colocaron en canales guía de forma ortogonal al canal de salida de los fluidos. La inserción de los electrodos se vigiló con un microscopio para controlar cuidadosamente el espacio entre los electrodos (50 pm). La constante celular del sensor de conductividad, K, era de ~0,01 pm'1, elegida para optimizar la detección específica de las células LNCaP con un diámetro promedio de ~25 pm con electrodos que tenían un diámetro de ~75 pm.

Ejemplo 26. Inmovilización de anticuerpos. Los anticuerpos se inmovilizaron en un procedimiento de dos etapas. El dispositivo de HTMSU ensamblado térmicamente y modificado con UV se cargó con una solución que contenía 4 mg/mL de EDC, 6 mg/mL de NHS y MES 150 mM (pH = 6) durante 1 h a temperatura ambiente para obtener un producto intermedio de éster de succinimidilo. Luego se eliminó la solución de<e>D<c>/NHS haciendo fluir agua exenta de nucleasas a través del dispositivo. Después se introdujo en la HTMSU una parte alícuota de 1,0 mg/mL de solución de anticuerpo monoclonal anti-EpCAM en PBS 150 mM (pH = 7,4) y se dejó reaccionar durante 4 h. A continuación, se lavó el dispositivo con una solución de PBS (pH = 7,4) para eliminar cualquier molécula de anticuerpo unida de forma no específica.

Ejemplo 27. Inmovilización de aptámeros. En una realización, empleamos aptámeros como elemento de captura en lugar de anticuerpos. Entre las ventajas de los aptámeros se encuentran la naturaleza ordenada de su fijación a la superficie sólida (p. ej., a través del extremo 5'), en lugar del sitio de fijación más aleatorio con anticuerpos (p. ej., a través de grupos amina primarios en el anticuerpo); la capacidad de controlar cuidadosamente la distancia aptámero/superficie para mejorar la accesibilidad; y la naturaleza robusta de los elementos de reconocimiento molecular. En comparación con los anticuerpos, los aptámeros se almacenan más fácilmente durante períodos más largos mientras mantienen la actividad. Por ejemplo, a diferencia de los anticuerpos, los aptámeros pueden almacenarse a temperatura ambiente sin una pérdida sustancial de actividad.

Los aptámeros se inmovilizaron sobre superficies de PMMA en una sola etapa. Después de la activación con UV, las superficies de PMMA activadas se incubaron con una solución que contenía 10 pM del aptámero de PSMA o de oligonucleótidos aleatorios, y se dejaron incubar durante 2-3 h a temperatura ambiente. Cada solución de oligonucleótido también contenía 4 mg/mL de EDC y 6 mg/mL de NHS en MES 150 mM (pH = 6). Para recubrir las películas planas de PMMA, la superficie de PMMA se sumergió en la solución de reacción. Después de la reacción, la superficie de PMMA se lavó con una solución de PBS (pH = 7,4) para eliminar cualquier componente no unido específicamente.

Ejemplo 28. Determinación de la densidad superficial de los aptámeros. Se recubrió una superficie limpia del sensor de oro para resonancia de plasmón en superficie (SPR) con 300 mL de una solución de PMMA (1,0 mg de PMMA en 10 mL de CH<2>C<2>en un aparato recubridor giratorio hecho a medida y se hizo girar a 1500 rpm durante 1 min. Después, la película de PMMA se activó con UV y los aptámeros se inmovilizaron sobre el PMMA en condiciones, por lo demás, idénticas a las descritas anteriormente. La respuesta de la SPR se midió después de cada tratamiento con un instrumento BIACORE X SPR (Piscataway, NJ) usando agua desionizada. La diferencia en la respuesta de SPR antes y después de la inmovilización del aptámero se utilizó para estimar el número de moléculas/cm2 utilizando los factores de conversión publicados por el fabricante.

Ejemplo 29. Captura de células LNCaP. Una jeringa con cierre Luer (Hamilton, Reno, NV) con un adaptador de tipo luer a capilar (Inovaquartz, Phoenix, AZ) conectaba la bomba a un capilar, que a su vez estaba sellado con el puerto de entrada de la HTMSU. Se realizó un lavado previo a la captura con 0,2 mL de PBS 150 mM a una velocidad lineal de 50 mm/s para mantener las condiciones isotónicas. Después, la suspensión celular se bombeó a través de la HTMSU a una velocidad seleccionada, seguida de un lavado posterior a la captura con 0,2 mL de PBS 150 mM a 50 mm/s para eliminar las células adsorbidas de forma no específica. La muestra de la prueba era 1,0 mL de sangre total sembrada con 20±1 células LNCaP, y la muestra de control era una muestra idéntica de sangre total sin células LNCaP. Se utilizó la velocidad de flujo lineal óptima de 2,5 mm/s.

En algunos casos, la HTMSU se fijó sobre una platina motorizada programable de un microscopio Axiovert 200M (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Las imágenes de vídeo se recopilaron a 30 fotogramas por segundo (fps) utilizando un CCD monocromático (JAI CV252, San Jose, CA). Se utilizó una lámpara de arco Xe para excitar los colorantes fluorescentes incorporados en las membranas celulares.

Ejemplo 30. Liberación de las células LNCaP unidas desde la HTMSU. Después del lavado posterior a la captura de las células con PBS, se bombeó una solución de tripsina al 0,25% (p/v) en tampón Tris-glicina (pH = 7,4) a través de la HTMSU. Las células capturadas pudieron observarse microscópicamente hasta que se liberaron.

Ejemplo 31. Recuento de las células liberadas mediante mediciones de la conductividad. Las células liberadas se bombearon a 0,05 pL/min a través de los electrodos de Pt para su recuento. Se seleccionó el tampón de Tris-glicina como componente principal del tampón de liberación debido a su baja conductancia; es decir, se prefiere que el tampón tenga una conductividad sustancialmente diferente a la de las células diana y, en general, que la conductividad del tampón sea menor que la de las células diana. La respuesta de la conductancia representada en la Fig. 4A mostraba 18 picos que asignamos a células LNCaP individuales, según un umbral de señal frente a ruido de 3 (nivel de confianza del 99,7%). Los asteriscos designan picos que se identificaron como células LNCaP. Las puntas de flecha representan eventos de células que no son LNCaP. Nuevamente, solo se asignaron señales positivas a las células diana; se cree que los picos negativos, con menor conductancia, se deben a partículas. Los 18 picos representaban una recuperación del ~90% de las células. Los recuadros de la Fig. 4A muestran vistas ampliadas para ilustrar el umbral de discriminación entre señal-ruido de 3:1. Los datos se suavizaron mediante el método de Savitsky-Golay (utilizando una función de suavizado de 25 puntos).

La curva inferior en la Fig. 4A representa la medición de la conductividad para la muestra de control de sangre total sin células LNCaP. No se observaron picos unicelulares en el rastro de datos, lo que indica que los picos observados para la sangre total sembrada con LNCaP se debían en realidad a las células tumorales, y que la pureza de la selección de células LNCaP era cercana al 100% (es decir, muy pocos falsos positivos).

La Fig. 4B representa un gráfico de calibración del "recuento de la conductividad" frente al número real de células LNCaP sembradas, en un intervalo de 10 - 250 células LNCaP por mL de sangre total. El gráfico lineal de mejor ajuste tenía una pendiente de 0,990, con una intersección cercana a cero (r2 = 0,9997). Incluso con la carga de células LNCaP más baja sometida a ensayo, los datos aún se ajustan muy bien a la función lineal. Por tanto, el sistema novedoso es muy adecuado para detectar células tumorales circulantes en sangre total, incluso en concentraciones extremadamente bajas. En 1 mL de sangre total, normalmente hay aproximadamente 2,5 * 109 eritrocitos; por lo tanto, en la carga de células LNCaP más baja investigada, el factor de enriquecimiento era de aproximadamente 2,5 * 108 -una diferencia de ocho órdenes de magnitud. Con el caudal optimizado de 2,5 mm/s utilizado en esos experimentos, el tiempo necesario para procesar exhaustivamente 1 mL de sangre era de ~29 min.

Observamos una adhesión insignificante de las células LNCaP con el PMMA intacto o con el PMMA unido a oligonucleótidos de ADN de secuencia aleatoria. Las fuerzas de adhesión de las células LNCaP a esas superficies no eran lo suficientemente fuertes como para resistir el cizallamiento hidrodinámico del flujo del fluido laminar. Sin embargo, las células LNCaP se capturaban de manera eficiente cuando el aptámero específico de PSMA se fijaba a las paredes del canal.

Cuando la velocidad del flujo es demasiado rápida, la disminución resultante en el tiempo de interacción entre las células y los elementos de captura reduce la cantidad de posibles eventos de unión. Cuando el flujo es demasiado lento, la velocidad reducida conduce a una disminución en la velocidad de encuentro entre las células y el elemento de reconocimiento inmovilizado. El caudal óptimo puede determinarse fácilmente para una combinación dada de configuración de HTMSU, elemento de captura y tipo de célula diana.

Observamos la máxima eficiencia de captura celular para células LNCaP y aptámeros con una velocidad de traslación de ~2,5 mm/s, en las condiciones empleadas en este estudio. Por el contrario, encontramos que la velocidad de traslación lineal óptima para el sistema de anticuerpos anti-EpCAM es ligeramente menor, ~2,0 mm/s. Por lo tanto, parecía que la velocidad de reacción para la interacción EpCAM-anticuerpo era ligeramente más lenta que la velocidad de reacción para la interacción PSMA-aptámero.

También examinamos la posibilidad de adsorción o reconocimiento no específico de otros tipos de CTCs utilizando la línea celular de cáncer de mama MCF-7 como ejemplo. No se observaron células MCF-7 cuando los lechos de captura de PMMA se recubrían con los aptámeros anti-PSMA, y una muestra de sangre total enriquecida con MCF-7 se procesaba tal y como se ha descrito anteriormente.

Existen dos formas biosintéticas principales de PSMA en la membrana celular de LNCaP: la forma PSMA<m>rica en manosa, y la forma PSMA<c>glicosilada. PSMA<m>es muy sensible a la tripsina, mientras que PSMA<c>es resistente a la tripsina. Debido a que la tripsina liberaba eficientemente las células LNCaP capturadas, parece que la forma PSMA<m>predominaba, o al menos predominaba en la fijación a los aptámeros anti-PSMA.

Casi el 100% de las células se había desprendido en los 7 minutos posteriores a la introducción de la tripsina. Una observación microscópica de campo brillante en los electrodos de Pt confirmaba que las células liberadas parecían estar intactas.

Ejemplo 32: Uso del prototipo de HTMSU para eliminar eficientemente glóbulos rojos de la sangre total.

Ejemplo 32. En otra realización de la invención, los glóbulos rojos ("RBCc" por sus siglas en inglés, o "eritrocitos") se eliminan eficazmente de una muestra de 100 pL de sangre total en menos de 1 minuto utilizando nuestro prototipo de HTMSU. Los aptámeros se utilizan para unir selectivamente los glóbulos rojos y eliminarlos de la muestra, dejando los glóbulos blancos para un análisis o experimentación adicionales. Realizar primero un aclaramiento de los glóbulos rojos puede facilitar que las células más grandes migren o difundan hacia las paredes del canal y sean capturadas. Las ventajas de usar la presente invención para eliminar glóbulos rojos en comparación con otros métodos como la centrifugación (es decir, aféresis) es que el aclaramiento se puede completar en un período de tiempo muy corto, se pueden procesar volúmenes más pequeños de sangre, la separación produce fracciones más puras con una mayor recuperación de células no aclaradas y el dispositivo se puede integrar directamente con dispositivos de análisis molecular para realizar un genotipo o caracterizar de otro modo las fracciones de plaquetas y leucocitos no aclaradas.

Al realizar diversos análisis moleculares y otras pruebas en la sangre total, a menudo es necesario agotar la muestra de glóbulos rojos. La centrifugación ha sido la técnica principal utilizada anteriormente para separar fracciones de la sangre, incluidos los glóbulos rojos, en función de sus densidades. Ha habido relativamente pocos informes previos sobre técnicas de microfluidos para agotar los glóbulos rojos, y esos informes se han centrado principalmente en el aislamiento de glóbulos blancos mediante diferencias morfológicas.

Se utiliza una HTMSU tal y como se describe de otro modo en los ejemplos anteriores, para eliminar de forma rápida, eficaz y selectiva los glóbulos rojos a partir de muestras de sangre total. Los aptámeros específicos de los glóbulos rojos están unidos covalentemente a las paredes del lecho de captura celular: en una realización, el aptámero es 5'-CGAATCGCATTGCCCAACGTTGCCCAAGATTCG-3' (SEQ ID NO. 2), del cual se ha informado que se une específicamente a una proteína de la membrana de los glóbulos rojos. Véase K. Morris et al., Proc. Natl Acad. Sci. u Sa , vol. 95, págs. 2902-2907 (1998). Un agente reticulante amino-terminal fijado al aptámero (5' NH<2>-(CH<2>)<6>-(CH<2>CH<2>O)<6>-TTTTT-Aptámero) facilita la formación de un enlace amida estable con grupos carboxilo generados mediante luz UV en la superficie de PMMA. La K<d>para la unión de ese aptámero a la proteína de membrana de los glóbulos rojos que reconoce es ~1,8 nM, y el número de sitios de unión en la membrana externa de un glóbulo rojo es ~6,5 x 103/célula.

En pruebas preliminares, la HTMSU recubierta con aptámeros específicos de glóbulos rojos ha eliminado con éxito y eficiencia prácticamente todos los glóbulos rojos de una muestra de 100 pL de sangre total en 1 minuto (según lo determinado en portaobjetos de hemocitometría convencionales), al tiempo que permite la recuperación de prácticamente todos los glóbulos blancos y el plasma. En una HTMSU de control recubierta con secuencias de ADN aleatorias, esencialmente no se observó un aclaramiento de los glóbulos rojos.

Utilizando otros aptámeros (o anticuerpos) adecuados, se pueden potenciar o reducir selectivamente otros componentes de una muestra, por ejemplo, plaquetas, neutrófilos, otros glóbulos blancos, etc.

Varios

Ejemplo 33. Otros usos de la invención. La invención se ha descrito anteriormente en gran medida con respecto a realizaciones para detectar y hacer un recuento de células cancerosas en la sangre. La invención también es adecuada para otros usos. Puede usarse para detectar y aislar otras células raras en la sangre u otros líquidos. Por ejemplo, puede usarse para detectar y aislar células fetales en la sangre materna, o células maternas en un bebé o un adulto, o bacterias patógenas en un abastecimiento de agua, o para aislar células madre u otros casos de células raras. La invención también se puede usar para eliminar células diana de una muestra, por ejemplo, para eliminar eritrocitos de una muestra de una prueba, por ejemplo, antes de examinar el ARNm de una muestra de sangre; o para eliminar leucocitos desde sangre total, plaquetas o plasma antes de una transfusión; o para eliminar células tumorales de la médula ósea antes de un trasplante de médula ósea.

Cuando sea aplicable, las células potencialmente interferentes unidas no específicamente, por ejemplo, los eritrocitos que no se adhieren específicamente a una superficie de PMMA, a menudo se pueden expulsar mediante cizallamiento hidrodinámico, simplemente aumentando el caudal del fluido.

Definiciones

Tal como se utilizan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, se entiende que los siguientes términos tienen los siguientes significados:

Dos o más canales son "paralelos", o el flujo de los fluidos dentro de dos o más canales es "paralelo", si el flujo tiene lugar (o puede tener lugar) en los canales al unísono. "Paralelo" debe entenderse en contraste con "en serie" o "series", con un significado análogo al utilizado en la terminología de circuitos eléctricos. Los canales "paralelos" pueden ser, en efecto, pero no necesariamente, paralelos en el sentido geométrico.

Los "canales" son vías separadas para el flujo de fluidos. Múltiples canales, incluso canales adyacentes, están físicamente separados entre sí, es decir, no están en comunicación fluídica entre sí, a lo largo de la mayor parte o la totalidad de su longitud. Por ejemplo, las vías de fluidos que están separadas entre sí por paredes, como las representadas en la Fig. 1, se consideran "canales" dentro de esta definición; incluso si pueden compartir una entrada o una salida común, están físicamente separados (no en comunicación fluídica) en la mayor parte de su longitud. Por el contrario, un sistema en el que el flujo de fluidos está definido por obstáculos tales como pilares, en donde se obstaculiza el flujo de fluidos a lo largo de diferentes vías y en donde las vías de los fluidos están comunicadas entre sí, no se considera que constituya "canales" dentro del alcance de esta definición, incluso si pudiera haber ciertas vías preferidas para el flujo de fluidos.

La "longitud" de un canal es la distancia que recorre el fluido al atravesar el canal, por el recorrido más directo de un extremo al otro. La "anchura" y la "altura" de un canal son dimensiones características de una sección transversal del canal, ambas tomadas en una dirección perpendicular a la longitud del canal, y también perpendiculares entre sí. La „anchura" es generalmente la menor de las dos dimensiones características y la "altura" la mayor de las dos. El uso de los términos "longitud", "anchura" y "altura" no debe interpretarse en el sentido de que el canal tiene necesariamente una forma particular. La longitud de un canal normalmente será sustancialmente mayor que su anchura o su altura. La "relación de aspecto" de un canal es la relación entre su altura y su anchura.

"Sinusoidal" se refiere a una sinusoide matemática estándar, por ejemplo, una que podría escribirse en la forma

y(x) = A • sen(kx 6) D

"Cuasisinusoidal" se refiere a un canal que oscila periódicamente y que puede tener o no la forma de una sinusoide estándar. Solo a modo de un posible ejemplo, una serie de semicírculos consecutivos, orientados en direcciones alternas y unidos entre sí de extremo a extremo, se consideraría "cuasisinusoidal". Las formas "sinusoidales" son, por tanto, un subconjunto de formas "cuasisinusoidales".

"Serpenteante" se refiere a un canal que fluctúa hacia adelante y hacia atrás con respecto a la dirección general del flujo del fluido, pero que puede tener o no un período único y bien definido, o que de otro modo puede ser irregular. Por ejemplo, la forma de un río es "serpenteante". A modo de otro ejemplo, en algunos casos puede ser deseable que el período o la amplitud de la oscilación en un canal cambien en función de la posición, por ejemplo:

y(x) = A • sen(kxe-mx 6) D

o

y(x) = A •e-mx • sen(kx 6) D

Por tanto, los canales "sinusoidales" y "cuasisinusoidales" constituyen subconjuntos de canales "serpenteantes". En otras palabras, para muchos fines lo que es significativo es el cambio alterno en la dirección del flujo de los fluidos, no necesariamente la función matemática precisa que describe esa dirección. Al poner en práctica la invención, cada uno de los canales tiene una forma sinusoidal o cuasisinusoidal, de modo que el flujo del líquido a través de un canal tiende a provocar que las células que están suspendidas en el líquido entren en contacto con los elementos de captura sobre la superficie del canal, de forma sustancialmente más frecuente que lo que sería el caso en condiciones idénticas utilizando un microdispositivo idéntico, pero en el que los canales fueran rectos.

Se debe tener en cuenta que un canal de "onda cuadrada" o un canal de "onda rectangular" no es, por definición, "sinusoidal". Tampoco un canal de "onda cuadrada" u "onda rectangular", en general, se considerará "cuasisinusoidal" o "serpenteante" dentro del alcance de las definiciones anteriores. Si se incluyen giros de 90 grados en el recorrido de un canal, principalmente para plegar el recorrido del canal y por lo tanto aumentar su longitud, pero los giros están configurados de una manera que no se mejora sustancialmente la frecuencia de contacto entre las células suspendidas y la superficie del canal (aunque podría haber un pequeño aumento numérico), entonces un canal de "onda cuadrada" o de "onda rectangular" no se considera "cuasisinusoidal" o "serpenteante". Un canal sinusoidal o cuasisinusoidal imparte un componente de velocidad lateral hacia la pared, una velocidad lateral que es una función de la curvatura. Una onda cuadrada tiene un radio de curvatura muy pequeño en un giro y curvatura cero en otros lugares. Por tanto, hay picos ocasionales en el componente lateral de la velocidad, pero solo de corta duración. Si bien el efecto neto dependerá de las dimensiones y geometría particulares de un dispositivo particular, en general se espera que la corta duración de los picos en el componente lateral para el fluido que se mueve a través de un canal de onda cuadrada sea sustancialmente menos efectiva para mover las células hacia las paredes del canal que el componente lateral menor pero de acción más prolongada en los canales sinusoidales.

Lo que son células "raras" no es susceptible de una definición precisa y cuantitativa; cualitativamente, las células son "raras" cuando su presencia es clínica o científicamente significativa o potencialmente significativa (por ejemplo, CTCs, bacterias patógenas), y cuando su cantidad está ampliamente excedida por la de otros tipos de células, o cuando las células raras están presentes de otro modo en concentraciones muy bajas, de modo que son difíciles de detectar por medios convencionales. Dependiendo del contexto, las células raras podrían ser, por ejemplo, aquellas que están presentes en concentraciones inferiores a 100 por mililitro, menos de 50 por mL, menos de 20 por mL, menos de 10 por mL, menos de 5 por mL, menos de 2 por mL o menos de 1 por mL. Para muchos fines, menos de ~10 células diana por mL se considera "raro" o de "poca abundancia".

Además de las publicaciones mencionadas anteriormente, también se remite al lector a A. Adams et al., "Highly efficient circulating tumor cell isolation from whole blood and label-free enumeration using polymer-based microfluidics with an integrated conductivity sensor," J. Am. Chem. Soc, vol. 130, pp. 8633-8641 (2008), y al material de apoyo asociado que está disponible de forma gratuita en pubs.acs.org; y U. Dharmasiri et al, "Highly efficient capture and enumeration of low abundance prostate cancer cells using prostate-specific membrane antigen aptamers immobilized to a polymeric microfluidic device," Electrophoresis (2009) Sep; 30(18): 3289-3300.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un microdispositivo para capturar o aislar células diana desde un líquido, en donde las células diana tienen un diámetro medio; en donde:

(a) dicho microdispositivo comprende una pluralidad de canales paralelos;

(b) dichos canales están conectados fluídicamente a una entrada común y a una salida común y dichos canales tienen una longitud que se extiende desde la entrada común hasta la salida común;

(c) una sección transversal de cada uno de dicha pluralidad de canales tiene una altura y una anchura tomadas en una dirección perpendicular a la longitud de los canales; y la anchura de cada uno de dicha pluralidad de canales es al menos aproximadamente el diámetro medio de las células diana, y no es mayor que aproximadamente el doble del diámetro medio de las células diana; y en donde las células diana se seleccionan entre células tumorales circulantes, bacterias patógenas, células hospedadoras infectadas con agentes patógenos, células fetales en sangre materna, células madre, células maternas en un niño o adulto, eritrocitos, leucocitos, plaquetas, células tumorales o células cancerosas;

(d) la altura de cada uno de dicha pluralidad de canales es al menos aproximadamente tres veces la anchura de cada canal respectivo;

(e) al menos parte de la superficie dentro de cada uno de dicha pluralidad de canales está unida covalentemente a uno o más elementos de captura; en donde dichos elementos de captura comprenden anticuerpos o aptámeros que se unen selectivamente a moléculas sobre las membranas de las células diana; y

(f) cada uno de dichos canales tiene forma sinusoidal o cuasisinusoidal.

2. El microdispositivo según la reivindicación 1, en el que esencialmente todos los elementos de captura dentro de dicho microdispositivo están unidos covalentemente a las superficies dentro de dichos canales.

3. El microdispositivo según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un sensor de conductividad posicionado en o cerca de dicha salida común, en donde dicho sensor de conductividad está adaptado para detectar la presencia de células individuales.

4. Un procedimiento para capturar o aislar células diana desde un líquido, en el que las células diana se seleccionan entre células tumorales circulantes, bacterias patógenas, células hospedadoras infectadas con agentes patógenos, células fetales en la sangre materna, células madre, células maternas en un niño o un adulto, eritrocitos, leucocitos, plaquetas, células tumorales o células cancerosas; comprendiendo dicho procedimiento hacer que el líquido atraviese el microdispositivo según la reivindicación 1 desde la entrada común hasta la salida común, de modo que las células se unan a los elementos de captura sobre las superficies dentro de los canales.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente la etapa de eliminar células no unidas específicamente desde las superficies de los canales mediante cizallamiento hidrodinámico después de que las células diana se han adherido a los elementos de captura.

6. El procedimiento según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente la etapa de hidrólisis con tripsina u otra enzima para liberar las células unidas específicamente de las superficies de los canales.

7. El procedimiento según la reivindicación 6, que comprende adicionalmente la etapa de hacer un recuento de las células que se liberan después de dicha etapa de hidrólisis.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicha etapa de recuento comprende observar cambios en la conductividad del líquido en o cerca de la salida común.

9. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que el líquido es sangre total.

10. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que las células diana tienen una concentración inferior a aproximadamente 10 células por mililitro de sangre.

11. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que las células diana son células tumorales circulantes.

12. El procedimiento según la reivindicación 9, en el que las células diana son eritrocitos y en el que los eritrocitos se eliminan de la sangre.

13. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que las células diana son agentes patógenos o las células seleccionadas son células hospedadoras infectadas con agentes patógenos.