ES2968892T3 - Métodos y composiciones para aumentar la producción de mielina funcional - Google Patents

Métodos y composiciones para aumentar la producción de mielina funcional Download PDF

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Abstract

Se proporciona un método para generar una célula que mejora la producción de mielina funcional, incluyendo el método modificar genéticamente la célula de modo que: (i) se modifique un gen PLP1 endógeno para disminuir su capacidad para inhibir la producción de mielina; (ii) se modifica un elemento regulador genético endógeno de PLP1 para disminuir su capacidad para promover la expresión de PLP1; (iii) se modifica un elemento regulador genético endógeno de PLP1 para aumentar su capacidad para inhibir la expresión de PLP1; o (iv) un producto del gen PLP1 endógeno o un producto del gen del elemento regulador de PLP1 que promueve la expresión de PLP1 se modifica para disminuir el nivel de expresión de PLP1, en donde la célula produce mielina funcional. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para aumentar la producción de mielina funcional
Referencia a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de las fechas de presentación de la solicitud de patente provisional en los EE UU No. 62/431.787, presentada el 8 de diciembre, 2018, y la solicitud de patente provisional en los EE UU No. 62/542.660, presentada el 8 de agosto, 2017.
Antecedentes de la invención
Los trastornos relacionados con mielina impactan a millones de personas, imponiendo una pesada carga de morbilidad y mortalidad en los individuos afectados y sus familias. Las leucodistrofias son trastornos genéticos relacionados con mielina que colectivamente impactan a 1 en 7.500 recién nacidos en los Estados Unidos. Estos trastornos carecen de terapias modificadoras de enfermedad e inevitablemente producen morbilidad grave y mortalidad durante la infancia y la adolescencia. Varias leucodistrofias comunes tienen mutaciones genéticas conocidas que producen la mielinización incorrecta (envuelta de mielina) de axones neuronales por oligodendrocitos en el sistema nervioso central (SNC).
La enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMD) es una leucodistrofía particularmente grave que produce deficiencias cognitivas y motoras significativas a los cuatro meses de edad y muerte en la infancia o adultez temprana. En casos más extremos, los pacientes experimentan síntomas a las dos semanas del nacimiento, nunca a prenden a andar o hablar, y sucumben a la enfermedad antes de la edad de 10.
Desafortunadamente, los procesos patológicos subyacentes a muchos de estos trastornos permanecen poco entendidos y existen pocas terapias modificadoras de enfermedad. Por tanto, hay una necesidad apremiante para agentes terapéuticos para trastornos que impactan la mielina del sistema nervioso central. El documento JP 2010 043025 A describe una composición terapéutica para fallo de mielinización del sistema nervioso central, y un método de fomentar la mielinización del sistema nervioso central. Barrieet al.,2010(J Neurosci Res.,88(10): 2135-2145) describe la modulación del fenotipo rumpshaker con PLP/DM20 de tipo salvaje y discute que esto sugiere varios mecanismos patogénicos. Osorioet al.,2016(Stem Cells,35(2): 311-315) describe un tratamiento basado en células madre de la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher. Karimet al.,2010(Glia,58(14): 1727-1738) describe la expresión y recambio de PLP/DM20 en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher.
Compendio de la invención
Las formas de realización descritas en el presente documento se refieren a composiciones y usos para las mismas para el tratamiento de trastornos relacionados con mielina usando terapia génica o manipulación genómica.
Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un método de generar una célula que aumenta la producción de mielina funcional, el método comprende modificar genéticamente la célula de modo que: un producto del genPLP1endógeno se modifica para disminuir el nivel de expresión dePLP1,en donde la modificación del producto del genPLP1endógeno comprende administrar a la célula un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige aPLP1,en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial, en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, en donde la célula produce mielina funcional, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional; en donde el método comprende poner en contacto la célulain vitrooex vivocon un vehículo de administración para el agente de silenciamiento génico, opcionalmente en donde el vehículo de administración es un vector AAV, un vector adenovírico, o un vector lentivírico.
En algunas formas de realización, la célula generada aumenta la producción de mielina al reducir la toxicidad relacionada conPLP1en la célula.
El genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial.
La modificación del producto del genPLP1incluye administrar a la célula un agente de silenciamiento génico. En algunas formas de realización, el agente de silenciamiento génico puede incluir una construcción de ARNi (tal como un ARNip, ARNhc o miARN, o una construcción que se puede transcribir para producir la misma). La invención también proporciona un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige al genPLP1endógeno para disminuir el nivel de expresión de PLP1 en una célula, para uso en generar una célula que aumenta la producción de mielina funcional, en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial, y en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, y produce mielina funcional o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional.
En algunas formas de realización, el agente de silenciamiento génico puede incluir un oligonucleótido antisentido (ASO).
En ciertas formas de realización, la célula que está genéticamente modificada muestra producción de mielina aumentada (por ejemplo, debido a toxicidad relacionada conPLP1reducida en la célula).
El método comprende poner en contacto la célula con un vehículo de administración para el agente de silenciamiento génico.
En ciertas formas de realización, el vehículo de administración es un vector AAV, un vector adenovírico, o un vector lentivírico.
En ciertas formas de realización, la célula se pone en contactoin vitroo ex vivo.
Otro aspecto de la invención proporciona una célula genéticamente modificada o una célula genéticamente modificada descendiente de la misma generada por el método de la invención, en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito. La célula está genéticamente modificada de modo que: un producto del genPLP1endógeno se modifica para disminuir el nivel de expresión dePLP1,en donde la modificación del producto del genPLP1endógeno comprende administrar a la célula un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige aPLP1,en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial, en donde la célula produce mielina funcional, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional, en donde el método comprende poner en contacto la célulain vitrooex vivocon un vehículo de administración para el agente de silenciamiento génico, opcionalmente en donde el vehículo de administración es un vector AAV, un vector adenovírico, o un vector lentivírico.
La célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, preferiblemente NSC u OPC.
Aun otro aspecto de la invención se refiere a una célula genéticamente modificada descendiente de una célula que se modifica genéticamente de modo que: un producto del genPLP1endógeno se modifica para disminuir el nivel de expresión dePLP1,en donde la modificación del producto del genPLP1endógeno comprende administrar a la célula un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige aPLP1,en donde la célula produce mielina funcional, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional, en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial, en donde el método comprende poner en contacto la célulain vitrooex vivocon un vehículo de administración para el agente de silenciamiento génico, opcionalmente en donde el vehículo de administración es un vector AAV, un vector adenovírico, o un vector lentivírico.
Aun otro aspecto de la invención se refiere a una célula generada por el método de la invención y composiciones que incluyen una célula genéticamente modificada descrita anteriormente para uso en tratar un trastorno relacionado con mielina en un sujeto produciendo mielina funcional en un sujeto, en donde el trastorno relacionado con mielina es la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD), en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito. El uso puede incluir administrar al sujeto una célula que está genéticamente modificada de modo que: un producto del genPLP1endógeno se modifica para disminuir el nivel de expresión dePLP1,en donde la modificación del producto del genPLP1endógeno comprende administrar a la célula un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige aPLP1,en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial, en donde la célula produce mielina funcional en el sujeto, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional, en donde el método comprende poner en contacto la célulain vitrooex vivocon un vehículo de administración para el agente de silenciamiento génico, opcionalmente en donde el vehículo de administración es un vector AAV, un vector adenovírico, o un vector lentivírico.
En un aspecto relacionado, la invención proporciona una célula para uso en tratar un trastorno relacionado con mielina en un sujeto, en donde el trastorno relacionado con mielina es la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD), el uso comprende modificar genéticamente una célula del sujeto según el método de la invención descrito en el presente documento, en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, produciendo de esta manera mielina funcional en el sujeto, en donde el trastorno relacionado con mielina preferiblemente se caracteriza por actividad y/o expresión del genPLP1anómala. La invención también proporciona un agente de silenciamiento génico que se dirige específicamente al genPLP1endógeno para disminuir el nivel de expresión dePLP1en una célula, para uso en tratar un trastorno relacionado con mielina en un sujeto, en donde el trastorno relacionado con mielina es la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD), en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante que causa enfermedad perjudicial, en donde el trastorno relacionado con mielina preferiblemente se caracteriza por actividad y/o expresión del genPLP1anómala, y en donde la célula produce mielina funcional o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional.
En ciertas formas de realización, el método restablece el tiempo de vida del sujeto a al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o aproximadamente el 100% de un sujeto control sin el trastorno relacionado con mielina.
En ciertas formas de realización, el método alivia al menos un síntoma(s) del sujeto asociado con dicho trastorno relacionado con mielina.
En ciertas formas de realización, el método restablece una función del sujeto a al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o aproximadamente el 100% de un sujeto control sin el trastorno relacionado con mielina, preferiblemente, la función es coordinación motora, locomoción o velocidad de conducción de axones.
En ciertas formas de realización, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano (por ejemplo, un ser humano menor de 20 años, 15 años, 10 años, 5 años, 3 años, 2 años, 1 año, 6 meses, 3 meses, 1 mes, 2 semanas, 1 semana, 3 días, o 1 día).
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una imagen de un análisis histológico que demuestra la mielinización completa del sistema nervioso central en el ratón modelo de PDMjimpycorregido por indel dePLP1(ocrimpy)que es indistinguible del tipo salvaje en tinción de MBP (proteína básica de la mielina).
La figura 2 es un dibujo esquemático (no a escala) que muestra la localización de la mutación genéticajimpyen el genPLP1de ratón, y el producto génico resultante que eventualmente produce la muerte de oligodendrocitos. La parte inferior de la figura muestra el tiempo de vida drásticamente reducido de los ratonesjimpycon una supervivencia mediana de aproximadamente 23 días.
La figura 3 muestra la hipomielinización grave en cerebro de ratónjimpy.Nótese la tinción de proteína básica de la mielina (MBP) significativamente menor que marca los oligodendrocitos maduros en el día postnatal 19 (P19) de la sección de cerebro de ratónjimpycomparado con la del control de tipo salvaje. El ratónjimpytambién muestra síntomas neurológicos de temblor de intención y ataxia en la misma edad (datos no mostrados).
Las figuras 4 y 5 son dibujos esquemáticos que muestran un enfoque ejemplar para inactivar el genPLP1en el cigoto de un ratónjimpy,mediante CRISPR SpCas9/ ARN guía dual (ARNgu) que se dirige al exón 3, para crear los ratones progeniejimpyinactivado por CRISPR(CR-impy[o crimpy]). La figura 4 muestra las localizaciones relativas de los sitios objetivo del ARNgu en el exón 3. La figura 5 muestra el enfoque experimental general para generar el cigoto machojimpypara recibir los ARNgu y el ARNm de SpCas9. La inactivación mediada por CRISPR/Cas9 con éxito del genPLP1dejimpyproduce el nacimiento de un fundadorCR-impymacho nulo paraPLP1nacido mediante una hembra huésped sustituta. Dos generaciones de cruces con la cepa parental dieron ratones progenie para caracterización adicional. El día postnatal 21 (P21), cuando la mayoría de los ratonesjimpymuestra síntomas neurológicos graves o están muertos, los ratonesCR-impycarecían de un fenotipo evidente (datos no mostrados).
La figura 6 muestra que los ratonesCR-impytenían un tiempo de vida restablecido comparado con los controlesjimpyy de tipo salvaje.
La figura 7 muestra que los ratonesCR-impymuestran recuperación en oligodendrocitos maduros por IHC de cerebro completo que detecta MBP. Comparar el día postnatal 19 con 6 meses postnatales.
La figura 8 muestra un dibujo esquemático para la prueba del rotarod para evaluar la coordinación motora de los ratonesCR-impy,donde la coordinación motora se cuantifica por un tiempo medido para caer desde la barra que gira cuando la barra que gira se acelera. Las medidas se hicieron en el día postnatal 19 (P19), 2 meses postnatales, y 6 meses postnatales, en ratones de tipo salvaje,jimpy,yCR-impyen cada punto de tiempo. La significancia estadística entre los valores diferentes está indicada por valores p. Los resultados muestran el restablecimiento de la coordinación motora en ratonesCR-impycomparados con ratones de tipo salvaje yjimpy.
La figura 9 muestra un dibujo esquemático para la prueba de campo abierto para evaluar la actividad locomotora de los ratonesCR-impy,donde la actividad locomotora se cuantifica por una distancia total medida viajada en una caja seguida por un video de seguimiento automático durante 5 minutos. Las medidas se hicieron en el día postnatal 19 (P19), 2 meses postnatales, y 6 meses postnatales, en ratones de tipo salvaje,jimpy,yCR-impyen cada punto de tiempo. La significancia estadística entre los valores diferentes está indicada por valores p. Los resultados muestran el restablecimiento de la actividad locomotora en ratonesCR-impycomparados con ratones de tipo salvaje yjimpy.
La figura 10 muestra un dibujo esquemático para la prueba de velocidad de conducción del nervio óptico y los resultados representativos de los picos de conducción más rápida y más lenta - 1er pico y 2° pico, respectivamente. Los axones mielinizados y de diámetro grande en general tienen conductividad más rápida comparados con axones no mielinizados y de diámetro menor. El día postnatal 19 (P19), las velocidades de conducción rápida y lenta, medidas por el 1er y el 2° picos, respectivamente, son ambas estadísticamente significativamente diferentes entre cualesquiera dos de los ratones de tipo salvaje,jimpy,y los ratonesCR-impy.A 6 meses postnatales, sin embargo, mientras todos los ratonesjimpyhabían muerto, no se observa diferencia entre los ratones de tipo salvaje yCR-impy.
La figura 11 muestra que no hay diferencia discernible en la imagen de ME del nervio óptico entre los ratones de tipo salvaje yCR-impya los 6 meses postnatales.
La figura 12 es un dibujo esquemático que muestra un ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención donde el silenciamiento génico mediado por CRISpR-Cas9 se administra al cerebro postnatal, por ejemplo, mediante un vector vírico AAV que codifica SaCas9 y ARNgu individual, que puede corregir al menos parcialmente las OPC mutantes en un cerebro de un paciente. Las OPC así corregidas producirán oligodendrocitos que en su momento superarán cualquier oligodendrocito mutante, proporcionando de esta manera mielinización suficientemente restablecida y funciones de las neuronas del paciente.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Por conveniencia, ciertos términos empleados en la especificación, ejemplos, y reivindicaciones adjuntas se recogen aquí. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta solicitud.
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
Los términos “comprender”, “que comprende”, “incluir”, “que incluye”, “tener”, “que tiene” se usan en el sentido inclusivo, abierto, que significa que se pueden incluir elementos adicionales. Los términos “tal como”, “por ejemplo”, como se usan en el presente documento son no limitantes y son para fines ilustrativos solo. “ Incluyendo” e “incluyendo, pero no limitado a” se usan de forma intercambiable.
El término “o” como se usa en el presente documento se debe entender que significa “y/o” a menos que el contexto claramente indique otra cosa.
Como se usa en el presente documento, el término “alrededor de” o “aproximadamente” se refiere a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía en tanto como el 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia. En una forma de realización, el término “alrededor de” o “aproximadamente” se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, o ± 1% respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.
Las frases “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” son términos reconocidos en la técnica, e incluyen modos de administración diferentes de administración entérica y tópica, tal como inyecciones, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intrapleural, intravascular, intrapericardica, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intrastemal e infusión.
El término “tratar” está reconocido en la técnica e incluye inhibir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto, por ejemplo, impedir su evolución; y aliviar la enfermedad, trastorno o afección, por ejemplo, producir regresión de la enfermedad, trastorno y/o afección. Tratar la enfermedad o afección incluye mejorar al menos un síntoma de la enfermedad o afección particular, incluso si la patofisiología subyacente no está afectada.
El término “prevenir” está reconocido en la técnica e incluye parar que una enfermedad, trastorno o afección se produzca en un sujeto, que puede estar predispuesto a la enfermedad, trastorno y/o afección, pero que aun no ha sido diagnosticado como que lo tiene. Prevenir una afección relacionada con una enfermedad incluye parar que se produzca la afección después de que la enfermedad se haya diagnosticado, pero antes de que la afección se haya diagnosticado.
El término “composición farmacéutica” se refiere a una formulación que contiene los compuestos divulgados en una forma adecuada para la administración a un sujeto. En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica está a granel o en forma posológica unitaria. La forma posológica unitaria es cualquiera de una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, un comprimido, una bomba única o un inhalador de aerosol, o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto divulgado o sales del mismos) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y varía según el tratamiento particular implicado. Un experto en la materia apreciara que algunas veces es necesario hacer variaciones rutinarias a la dosis dependiendo de la edad y estado del paciente. La dosis también dependerá de la vía de administración. Se contemplan una variedad de rutas, incluyendo oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, inhalacional, y similares. Las formas posológicas para la administración tópica o transdérmica de un compuesto descrito en el presente documento incluyen polvos, espráis, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches, compuestos nebulizados, e inhalantes. En una forma de realización preferida, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un soporte, farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón, o propelente que sea requerido.
La frase “farmacéuticamente aceptable” está reconocida en la técnica. En ciertas formas de realización, el término incluye composiciones, polímeros y otros materiales y/o formas posológicas que son, dentro del ámbito del juicio médico racional, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales son excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una proporción beneficio/riesgo razonable.
La frase “soporte farmacéuticamente aceptable” está reconocida en la técnica e incluye, por ejemplo, materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables, tal como un relleno, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante líquido o sólido, implicado en portar o transportar cualquier composición objeto de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada soporte debe ser “aceptable” en el sentido de ser compartible con los otros ingredientes de una composición objeto y no lesivo para el paciente. En ciertas formas de realización, un soporte farmacéuticamente aceptable es no pirógeno. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como soportes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tal como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tal como almidón de maíz y fécula de patata; (3) celulosa, y sus derivados, tal como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) goma tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tal como propilenglicol; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponantes, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua sin pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones de tampón fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Los términos tratamiento “profiláctico” o “terapéutico” están reconocidos en la técnica e incluyen la administración al huésped de una o más de las composiciones objeto. Si se administra antes de la manifestación clínica de la afección indeseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado indeseado del animal huésped tal como, pero no limitado a, alteraciones de mielinización, deficiencias de mielina, pérdida de mielina y reparación de mielina ineficaz) entonces el tratamiento es profiláctico, es decir, protege al huésped frente a desarrollar la afección indeseada, mientras que si se administra después de la manifestación de la afección indeseada, el tratamiento es terapéutico (es decir, se pretende para disminuir, mejorar, o estabilizar la afección indeseada existente o efectos secundarios de la misma).
Los términos “agente terapéutico”, “fármaco”, “medicamento” y “sustancia bioactiva” están reconocidos en la técnica e incluyen moléculas y otros agentes que son sustancias biológica, fisiológica o farmacológicamente activas que actúan local o sistémicamente en un paciente o sujeto para tratar una enfermedad o afección. Los términos incluyen sin limitación sales farmacéuticamente aceptables de las mismas y profármacos. Tales agentes pueden ser ácidos, básicos o sales; pueden ser moléculas neutras, moléculas polares, o complejos moleculares capaces de unirse a hidrógeno; pueden ser profármacos en la forma de éteres, ésteres, amidas y similares que se activan biológicamente cuando se administran a un paciente o sujeto.
La frase “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad farmacéuticamente eficaz” es un término reconocido en la técnica. En ciertas formas de realización, el término se refiere a una cantidad de un agente terapéutico que produce algún efecto deseado a una proporción beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. En ciertas formas de realización, el término se refiere a esa cantidad necesaria o suficiente para eliminar, reducir o mantener una diana de una pauta terapéutica particular. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de tales factores como la enfermedad o afección que se trata, las construcciones dirigidas particulares que se administran, el tamaño del sujeto o la gravedad de la enfermedad o afección. Un experto en la materia puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un compuesto particular sin necesitar experimentación indebida. En ciertas formas de realización, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente (por ejemplo, una composición o células genéticamente modificadas descritas en el presente documento) para usoin vivoprobablemente dependerá de un número de factores, incluyendo: la velocidad de liberación de un agente de una matriz polimérica, que dependerá en parte de las características químicas y físicas del polímero; la identidad del agente; el modo y método de administración; y cualquier otro material incorporado en la matriz polimérica además del agente.
Los términos “ácido nucleico”, “nucleótido”, “polinucleótido”, y “oligonucleótido” se usan de forma intercambiable y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en conformación lineal o circular, y en forma monoo bicatenaria. Para los fines de la presente divulgación, estos términos no se deben interpretar como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en la base, el azúcar y/o las fracciones fosfato (por ejemplo, esqueletos fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases, es decir, un análogo de A se emparejará con T
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma intercambiable para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de un aminoácido natural correspondiente.
Un “dominio funcional” es un dominio de un polipéptido que comprende una actividad específica. Los ejemplos no limitantes de actividades que un dominio funcional puede poseer son actividad nucleasa, actividad reguladora transcripcional, actividad de reconocimiento de la cápside vírica y similares.
“Unión” se refiere a una interacción no covalente, específica de secuencia entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (por ejemplo, contactos con residuos fosfato en un esqueleto de ADN), siempre que la interacción como un todo sea específica de secuencia. Tales interacciones en general se caracterizan por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o menor. “Afinidad” se refiere a la potencia de unión: la afinidad de unión aumentada se correlaciona con una Kd menor.
Una “proteína de unión” es una proteína que es capaz de unirse a otra molécula. Una proteína de unión se puede unir a, por ejemplo, una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión a proteína, se puede unir a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o se puede unir a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas de dedo de cinc tienen actividad de unión a ADN, unión a ARN y unión a proteínas.
Una “proteína de unión a ADN de dedo de cinc” (o dominio de unión) es una proteína, o dominio en una proteína mayor, que se une a ADN de una manera específica de secuencia mediante uno o más dedos de cinc, que son regiones de secuencia de aminoácidos en el dominio de unión cuya estructura está estabilizada mediante coordinación de un ion cinc. El término proteína de unión a ADN de dedo de cinc con frecuencia se abrevia a proteína de dedo de cinc o ZFP
Un “dominio de unión a ADN TALE” o “TALE” es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición TALE. Los dominios de repetición están implicados en la unión de TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una única “unidad de repetición” (también denominada una “repetición”) tiene típicamente 33-35 aminoácidos de longitud y muestra al menos alguna homología de secuencia con otras secuencias de repetición TALE en una proteína TALE natural.
Los dominios de unión de dedo de cinc y TALE se pueden “manipular” para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, a través de manipulación (alterar uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de una proteína de dedo de cinc o TALE natural. Por tanto, las proteínas de unión a ADN manipuladas (dedos de cinc o TALE) son proteínas que no son naturales. Los ejemplos no limitantes de métodos para manipular proteínas de unión a ADN son diseño y selección. Una proteína de unión a ADN diseñada es una proteína que no se produce en la naturaleza cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños de ZFP y/o TALE existentes y datos de unión. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 6.140.081, 6.453.242, 6.534.261 y 8.585.526; véase también los documentos WO 98/53058, WO 98/53059, WO 98/53060, WO 02/016536 y WO 03/016496.
Una proteína de dedo de cinc o TALE “seleccionada” es una proteína no encontrada en la naturaleza cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico tal como presentación en fagos, trampa de interacción o selección de híbridos. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; 8.586.526; documentos WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084.
En general “CRISPR” (repeticiones palindrómicas cortas espaciadas regularmente agrupadas) también conocidas como SPIDR (repeticiones directas intercaladas con espaciador), se refiere a una familia de loci de ADN que habitualmente son específicos a una especie bacteriana particular. El locus CRISPR comprende una clase distinta de repeticiones de secuencia corta intercaladas (SSR) que fueron reconocidas enE. coli(Ishinoet al.(1987)J Bacteriol.,169:5429-5433; y Nakataet al., J. Bacteriol.(1989) 171:3553-3556), y genes asociados. Se han identificado SSR similares intercaladas enHaloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena,yMycobacterium tuberculosis(véase, Groenenet al.(1993)Mol. Microbiol.,10:1057-1065; Hoeet al.(1999)Emerg. Infect. Dis.,5:254-263; Masepohlet al.(1996)Biochim. Biophys. Acta1307:26-30; y Mojicaet al.(1995)Mol. Microbiol.,17:85-93). Los loci CR<i>S<p>R típicamente se diferencian de otras SSR por la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones separadas regularmente cortas (SRSR) (Janssenet al.(2002)OMICS J. Integ. Biol.,6:23-33; y Mojicaet al.(2000)Mol. Microbiol.,36:244-246). En general, las repeticiones son elementos cortos que se producen en grupos que están separados regularmente por secuencias intermedias únicas con una longitud sustancialmente constante (Mojicaet al.
(2000), supra). Aunque las secuencias de repetición están muy conservadas entre cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones espadadoras típicamente se diferencian de cepa a cepa (van Embdenet al., J. Bacteriol.(2002) 182:2393-2401). Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas incluyendo, pero no limitados aAeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacteriumn, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thernioplasnia, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifrx, Porphvromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myrococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Envinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema,yThermotoga.
“Sistema CRISPR” se refiere colectivamente a transcritos y otros elementos implicados en la expresión de o dirigiendo la actividad de genes asociados a CRISPR (“Cas”), incluyendo secuencias que codifican un gen Cas, una secuencia tracr (trans-activadora de CRISPR) (por ejemplo, tracrARN o un tracrARN parcial activo), una secuencia compañera de tracr (que abarca una “repetición directa” y una repetición directa parcial de tracrARN procesado en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), una secuencia guía (también denominada un “espaciador” en el contexto de un sistema CRISPR endógeno), u otras secuencias y transcritos de un locus CRISPR. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, uno o más elementos de un sistema CRISPR deriva de un sistema CRISPR de clase 1 tipo I o tipo III. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, uno o más elementos de un sistema CRISPR deriva de un sistema CRISPR de clase 2 tipo II o tipo V. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, uno o más elementos de un sistema CRISPR deriva de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal comoStreptococcus pyogenes.En general, un sistema CRISPR se caracteriza por elementos que fomentan la formación de un complejo CRISPR en el sitio de una secuencia diana (también denominado un protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, “secuencia diana” se refiere a una secuencia a la que una secuencia guía se diseña que tenga complementariedad, donde la hibridación entre una secuencia diana y una secuencia guía fomenta la formación de un complejo CRISPR. La complementariedad completa no se requiere necesariamente, siempre que haya suficiente complementariedad para producir hibridación y fomentar la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas formas de realización, una secuencia diana está localizada en el núcleo o citoplasma de una célula. Una secuencia o molde que se puede usar para recombinación en el locus objetivo que comprende las secuencias diana se denomina un “molde de edición” o “polinucleótido de edición” o “secuencia de edición”. Como se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención, un polinucleótido molde exógeno se puede denominar un molde de edición. En un ejemplo divulgado en el presente documento pero que no forma parte de la invención reivindicada la recombinación es recombinación homóloga.
“NgAgo” es una proteína argonauta procariota que se piensa está implicada en silenciamiento génico. NgAgo deriva de la arqueobacteriaNatronobacterium gregoryi(Véase, por ejemplo, Gaoet al.(2016)Nature Biotechnology34, 768 773). Un “sistema NgAgo” es todos los componentes requeridos incluyendo, por ejemplo, ADN guías monocatenarios para corte por una enzima NgAgo.
“Recombinación” se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos incluyendo, pero no limitado a, captura de donante por unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga. Para los fines de esta divulgación, “recombinación homóloga (RH)” se refiere a la forma especializada de tal intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en células a través de mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere homología de secuencia, usa una molécula “donante” para la reparación con molde de una molécula “diana” (es decir, la que experimenta la rotura bicatenaria), y se conoce variablemente como “conversión génica sin entrecruzamiento” o “conversión génica de tramo corto”, porque produce la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría particular, tal transferencia puede implicar corrección de malos emparejamientos de ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o “hibridación de hebra dependiente de síntesis”, en la que el donante se usa para resintetizar la información genética que se convertirá en parte de la diana, y/o procesos relacionados. Tal RH especializada con frecuencia produce una alteración de la secuencia de la molécula diana de modo que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido diana.
En los métodos de la divulgación, una o más nucleasas dirigidas como se describe en el presente documento cortan (por ejemplo, crean una o más mellas monocatenarias y/o una o más roturas bicatenarias [DSB]) en la secuencia diana (por ejemplo, cromatina celular) en un sitio predeterminado. La DSB puede producir deleciones y/o inserciones por reparación dirigida por homología (HDR) o por mecanismos de reparación dirigida por no homología (por ejemplo, NHEJ). Las deleciones pueden incluir cualquier número de pares de bases. De forma similar, las inserciones pueden incluir cualquier número de pares de bases incluyendo, por ejemplo, la integración de un polinucleótido “donante”, que opcionalmente tiene homología a la secuencia de nucleótidos en la región de la rotura.
En ciertos ejemplos divulgados, pero que no forman parte de la invención reivindicada, los métodos de la invención generan DSB en un gen diana (tal como el genPLP1o un elemento regulador del mismo) usando cualquiera de las nucleasas adecuadas, tal como el sistema nucleasa CRISPR/Cas9, y la reparación resultante (tal como NHEJ) crea una pequeña inserción o deleción (por ejemplo, indel) que perturba la función del genPLP1o elemento regulador del mismo, produciendo función dePLP1reducida o eliminada. En este ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, no se requiere secuencia donante para el método.
En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, se puede incluir una secuencia donante en el método para reparar o sustituir un genPLP1defectuoso o un elemento regulador del mismo. La secuencia donante se puede integrar físicamente o, alternativamente, el polinucleótido donante se usa como un molde para la reparación de la rotura a través de recombinación homóloga, produciendo la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el donante en la cromatina celular. Por tanto, una primera secuencia en la cromatina celular se puede alterar y, en ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, se puede convertir a una secuencia presente en un polinucleótido donante. Por tanto, el uso de los términos “sustituir” o “sustitución” se puede entender que representa la sustitución de una secuencia de nucleótidos por otra (es decir, la sustitución de una secuencia en el sentido informacional), y no requiere necesariamente la sustitución física o química de un polinucleótido por otro.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, se pueden usar pares adicionales de proteínas de dedo de cinc, TALEN, sistemas CRISPR/Cas o NgAgo para corte bicatenario adicional (por ejemplo, dos o más) de sitios diana adicionales en la célula (por ejemplo, en el mismos gen diana tal comoPLp1,pero en diferentes sitios objetivo).
Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento se puede usar para la inserción de un donante de cualquier tamaño y/o la inactivación parcial o completa de una o más secuencias diana en una célula por integración dirigida de la secuencia donante que altera la expresión del/los gen(es) de interés. También se proporcionan líneas celulares con genes parcial o completamente inactivados.
En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la secuencia de nucleótidos exógena (la “secuencia donante” o “transgén”) puede contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a secuencias genómicas en la región de interés, estimulando de esta manera la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Por tanto, en ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, porciones de la secuencia donante que son homólogas a secuencias en la región de interés muestran entre aproximadamente el 80 al 99% (o cualquier número entero entre los mismos) de identidad de secuencia respecto a la secuencia genómica que se sustituye. En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la homología entre la secuencia donante y genómica es mayor del 99%, por ejemplo, si solo 1 nucleótido se diferencia entre las secuencias donante y genómica de más de 100 pares de bases contiguas. En ciertos casos, una porción no homóloga de la secuencia donante puede contener secuencias no presentes en la región de interés, de modo que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga en general está flanqueada por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor entero entre las mismas) o cualquier número de pares de bases mayor de 1.000 que son homólogas o idénticas a secuencias en la región de interés. En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la secuencia donante es no homóloga respecto a la primera secuencia, y se inserta en el genoma por mecanismos de recombinación no homóloga.
“Genéticamente modificado” se refiere a una modificación hecha a un ácido nucleico de modo que la secuencia del ácido nucleico se altera en comparación con el ácido nucleico antes de ser modificado. Modificar genéticamente una célula se refiere a modificar un ácido nucleico celular en una célula, incluyendo modificaciones genéticas a ácidos nucleicos endógenos y/o exógenos en la célula, tal como ADN genómico y ARNm transcrito. Las modificaciones genéticas pueden comprender cortes, deleciones, e inserciones en ácidos nucleicos endógenos y/o exógenos en la célula, integración de ADN exógeno, corrección de genes y/o mutación génica.
“Corte” se refiere a la rotura del esqueleto covalente de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN tal como ARNm). El corte se puede iniciar por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitados a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Son posibles tanto corte monocatenario como corte bicatenario, y el corte bicatenario se puede producir como resultado de dos sucesos de corte monocatenario diferentes. El corte de ADN puede dar la producción de extremos romos o extremos escalonados. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, se usan polipéptidos de fusión para corte de ADN bicatenario dirigido.
Un “semidominio de corte” es una secuencia polipeptídica que, junto con un segundo polipéptido (ya sea idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de corte (preferiblemente actividad de corte bicatenario). Los términos “primer y segundo semidominios de corte”; “semidominios de corte y -” y “semidominios de corte derecho e izquierdo” se usan de forma intercambiable para referirse a pares de semidominios de corte que dimerizan.
Un “semidominio de corte manipulado” es un semidominio de corte que se ha modificado de modo que forme heterodímeros obligados con otro semidominio de corte (por ejemplo, otro semidominio de corte manipulado). Véase también, las publicaciones de patente en EE UU No. 2005/0064474, 20070218528, 20080131962 y 20110201055.
El término “secuencia” se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular, o ramificada y puede ser monocatenaria o bicatenaria.
El término “secuencia donante” se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 100.000.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos o por encima de ellos), preferiblemente entre aproximadamente 100 y 100.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos), más preferiblemente entre aproximadamente 2000 y 20.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos) e incluso más preferiblemente entre aproximadamente 5 y 15 kb (o cualquier valor entero entre ellos).
“Cromatina” es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteína, incluyendo histonas y proteínas cromosómicas no histonas. La mayoría de la cromatina celular eucariota existe en la forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociado con un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y ADN enlazador (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre núcleos de nucleosomas. Una molécula de histona H1 en general está asociada con el ADN enlazador. Para los fines de la presente divulgación, se pretende que el término “cromatina” abarque todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariota como eucariota. La cromatina celular incluye cromatina tanto cromosómica como episómica (por ejemplo, ADN mitocondrial).
Un “cromosoma” es un complejo de cromatina que comprende todo o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula con frecuencia se caracteriza por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que comprende el genoma de una célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.
Un “episoma” es un ácido nucleico replicante, complejo nucleoproteico u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no es parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas/vectores víricos (tal como vectores AAV y secuencias codificadas).
Una “región accesible” es un sitio en la cromatina celular en el que un sitio diana presente en el ácido nucleico puede unirse a una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría particular, se cree que una región accesible es una que no está empaquetada en una estructura nucleosómica. La estructura diferente de una región accesible con frecuencia se puede detectar por su sensibilidad a sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas.
Un “sitio diana” o “secuencia diana” es una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico a la que se unirá una molécula de unión, siempre que existan suficientes condiciones para la unión.
Una molécula “exógena” es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero se puede introducir en una célula por uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La “presencia normal en la célula” se determina con respecto al estadio de desarrollo y condiciones medioambientales particulares de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario del músculo es una molécula exógena con respecto a una célula de músculo adulto. De forma similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula sin choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión que funciona de una molécula endógena disfuncional o una versión disfuncional de una molécula endógena que funciona normalmente.
Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, tal como se genera por un proceso de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprende una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser mono- o bicatenarios; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden ser de cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los capaces de formar dúplex, así como ácidos nucleicos que forman triplex. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no están limitadas a, proteínas de unión a ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de cromatina, proteínas de unión a<a>D<n>metilado, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.
Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína o ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma vírico infectivo, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que no está normalmente presente en la célula. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en células los conocen los expertos en la materia e incluyen, pero no están limitados a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vector vírico. Una molécula exógena también puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, pero derivada de una especie diferente de la que la célula deriva. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico humano se puede introducir en una línea celular originalmente derivada de un ratón o hámster. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en células vegetales los conocen los expertos en la materia e incluyen, pero no están limitados a, transformación de protoplastos, carburo de silicio (por ejemplo, WHISKERS™), transformación mediada por Agrobacterium, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas (por ejemplo, usando un “cañón génico”), coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vector vírico.
Por el contrario, una molécula “endógena” es una que normalmente está presente en una célula particular en un estadio de desarrollo particular en condiciones medioambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.
Como se usa en el presente documento, el término “producto de un ácido nucleico exógeno” incluye productos tanto de polinucleótido como polipéptido, por ejemplo, productos de transcripción (polinucleótidos tal como a Rn ) y productos de traducción (polipéptidos).
Una molécula “de fusión” es una molécula en la que dos o más moléculas subunidades están unidas, preferiblemente de forma covalente. Las moléculas subunidades pueden ser del mismo tipo químico de molécula, o pueden ser tipos químicos diferentes de molécula. Los ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero no están limitados a, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN ZPF o TALE y uno o más dominios activadores) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita anteriormente). Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero no están limitados a, una fusión entre un ácido nucleico que forma triplex y un polipéptido, y una fusión entre un unidor del surco menor y un ácido nucleico.
La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar de la administración de la proteína de fusión a la célula o por administración de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde el polinucleótido se transcribe, y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. También pueden estar implicados trans-ayuste, corte del polipéptido y ligación de polipéptido en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para la administración de polinucleótidos y polipéptidos a células se presentan en otro lugar en esta divulgación.
Un “gen”, para los fines de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase posteriormente), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico (elementos reguladores genéticos), estén o no tales secuencias de los elementos genéticos regulares adyacentes a las secuencias codificantes y/o transcritas. Según esto, un gen incluye, pero no está necesariamente limitado a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de traducción tal como sitios de unión al ribosoma y sitios de entrada internos al ribosoma, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos límite, orígenes de replicación, sitios de unión a matriz y regiones de control de locus.
“Expresión génica” se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, a un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por la traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen los ARN que están modificados, por procesos tales como adición de caperuza, poliadenilación, metilación, y edición, y proteínas modificadas por, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristilación, y glucosilación.
“Modulación” de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no está limitada a, activación génica y represión génica, así como actividad y/o estabilidad de los productos de expresión génica tal como proteínas y ARNm (por ejemplo, modulación de expresión a nivel transcripcional, traduccional y/o postraduccional). La edición genómica (por ejemplo, corte, alteración, inactivación, mutación aleatoria) se puede usar para modular la expresión, así es ARNi o corte de ARNm mediado por oligo antisentido (ASO) y/o bloqueo de traducción. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica comparada con una célula que no incluye un sistema ZFP, TALE, NgAgo o CRISPR/Cas como se describe en el presente documento. Por tanto, la inactivación génica puede ser parcial o completa.
Una “región de interés” es cualquier región de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante en o adyacente a un gen, en la que es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser para los fines de corte de ADN dirigido y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma de orgánulo (por ejemplo, mitocondrial, cloroplasto), o un genoma vírico infeccioso, por ejemplo. Una región de interés puede estar en la región codificante de un gen, en las regiones no codificantes transcritas tal como, por ejemplo, secuencias líder, secuencias remolque o intrones o en secuencias no transcritas, ya sea antes o después de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un único par de nucleótidos o hasta 2.000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor entero de pares de nucleótidos.
Las células “eucariotas” incluyen, pero no están limitadas a, células fúngicas (tal como levaduras), células vegetales, células animales, células de mamífero y células humanas (por ejemplo, oligodendrocitos), incluyendo células madre (pluripotentes y multipotentes).
Los términos “unión operativa” y “operativamente unido” se usan de forma intercambiable con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tal como elementos de secuencia), en la que los componentes están organizados de modo que ambos componentes funcionan normalmente y permiten la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar una función que es ejercida sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia de elemento regulador transcripcional, tal como un promotor, está operativamente unida a una secuencia codificante si la secuencia de elemento regulador transcripcional controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores transcripcionales. Una secuencia de elemento regulador transcripcional en general está operativamente unida en cis con una secuencia codificante, pero no necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia de elemento regulador transcripcional que está operativamente unida a una secuencia codificante, incluso aunque no son contiguas.
Con respecto a polipéptidos de fusión, el término “operativamente unido” se puede referir al hecho de cada uno de los componentes realiza la misma función en unión al otro componente que tendría si no estuvieran así unidos. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN ZFP, TALE, NgAgo o Cas está fusionado a un dominio de activación, el dominio de unión a ADN ZFP, TALE, NgAgo o Cas y el dominio de activación están en unión operativa si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión a ADN ZFP, TALE, NgAgo o Cas es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras el dominio de activación es capaz de aumentar la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN ZFP, TALE, NgAgo o Cas está fusionado a un dominio de corte, el dominio de unión a ADN ZFP, TALE, NgAgo o Cas y el dominio de corte están en unión operativa si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión a ADN<z>F<p>, TALE, NgAgo o Cas es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras el dominio de corte es capaz de cortar ADN en la vecindad del sitio diana.
Un “fragmento funcional” de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, con todo retiene la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos, o el mismo número de residuos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Los métodos para determinar la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función codificante, capacidad para hibridar con otro ácido nucleico) se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, la función de unión a ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, por unión a filtro, cambio en la movilidad electroforética, o ensayos de inmunoprecipitación. El corte de ADN se puede ensayar por electroforesis en gel. Véase, Ausubelet al.,anteriormente. La capacidad de una proteína para interaccionar con otra proteína se puede determinar, por ejemplo, por coinmunoprecipitación, ensayos de doble híbrido o complementación, tanto genética como bioquímica. Véase, por ejemplo, Fieldset al.,(1989)Nature340:245-246; patente en EE UU No. 5.585.245 y PCT WO 98/44350.
Un “vector” es capaz de transferir secuencias de genes a células diana. Típicamente, “construcción de vector”, “vector de expresión” y “vector de transferencia génica”, significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias de genes a células diana. Por tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores de integración.
Los términos “sujeto” y “paciente” se usan de forma intercambiable y se refieren a mamíferos tal como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales tal como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. Según esto, el término “sujeto” o “paciente” como se usa en el presente documento significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que se pueden administrar las nucleasas, donantes y/o células genéticamente modificadas de la invención. Los sujetos de la presente invención incluyen esos con un trastorno relacionado con mielina.
“Troncalidad” se refiere a la capacidad relativa de cualquier célula de actuar de una manera similar a célula madre, es decir, el grado de toti-, pluri- u oligopotencia y la autorrenovación expandida o indefinida que esa célula madre particular pueda tener.
Mediante “células que aumentan la producción de mielina funcional” se quiere decir una célula que muestra una cantidad aumentada de producción de mielina (en comparación con células sin la modificación) y/o células que muestran una mejora en la capacidad funcional de la mielina producida por las células.
El término “indel” se refiere a la inserción, deleción, combinaciones de las mismas de bases en la secuencia de nucleótidos de un organismo o célula. La inserción (también llamada una mutación de inserción) es la adición de uno o más pares de bases nucleotídicas en una secuencia de nucleótidos mientras una deleción se refiere a una mutación en la que una parte de una secuencia de nucleótidos se elimina. Cualquier número de nucleótidos se puede insertar o delecionar, desde una única base a un trozo entero de cromosoma.
“Degradación mediada por mutaciones terminadoras” se refiere a un mecanismo acoplado a la traducción en células eucariotas que elimina transcritos de ARNm que contienen codones de terminación de traducción prematuros (PTC). En células de mamífero, la NMD también está ligada a ayuste de pre-ARNm, ya que en muchos casos una fuerte reducción del ARNm se produce solo cuando el PTC está localizado antes de un intrón.
Perspectiva general
Las formas de realización descritas en el presente documento se refieren a métodos de generar células genéticamente modificadas para alterar o inactivar el gen de laproteína proteolipídica 1 (PLP1)y su uso en el tratamiento de trastornos relacionados con mielina humanos. La presente solicitud de basa, en parte, en la demostración de inducción dirigida por sitio eficaz de indels inactivadores dePLP1en células de glía y en cigotos. Se ha mostrado que la edición mediada por nucleasa del genPLP1restablece la función normal y el tiempo de vida completo en el modelo de ratónjimpydel trastorno relacionado con mielina enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD), así como restablecer la función en células de glía del modelo de PMDin vitro.Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se cree que la toxicidad relacionada conPLP1se evita por la inactivación del genPLP1,aumentando de esta manera la capacidad de las células de glía u oligodendrocitos modificados de producir mielina funcional.
En el presente documento se describe, pero no forma de la invención reivindicada, la inserción o deleción (indel) específica de sitio en el genPLP1o sus elementos reguladores. Al dirigirse al genPLP1,esto proporcionará inactivación o reducción eficaz y permanente del genPLP1.Las composiciones que alteran el genPLP1por nucleasa dirigida por sitio o edición génica se pueden administrar, por ejemplo, usando uno o más vectores<a>A<v>, vectores lentivíricos deficientes en integrasa (IDLV) y/o ácidos nucleicos tal como plásmidos, plásmidos de minicírculos y oligonucleótidos.
También se describe en el presente documento, pero no forma de la invención reivindicada, la ediciónin situprecisa del genPLP1o sus elementos reguladores, con el fin de crear capacidades de producción de mielina funcional aumentadas en células madre neurales (NSC) y/o células precursoras de oligodendrocitos (OPC) y su progenie. La introducción mediada por nucleasa o edición génica de mutaciones disruptivasin situen el genPLP1endógeno en NSC y/o OPC confiere estas capacidades aumentadas a la progenie de las células editadas. Además, la inactivación o mutación específica de un gen regulador dePLP1 in situen los genes endógenos en las NSC u OPC confiere producción de mielina funcional aumentada/mejorada en la progenie de las células.
Las células y métodos descritos se pueden trasplantar a modelos animales y/o pacientes humanos sin impactar significativamente la función y viabilidad celular. Además, las células mantienen su capacidad de persistirin vivo,y pueden aumentar la producción de mielina funcional en el sujeto después del trasplante.
La práctica de los métodos, así como la preparación y uso de las composiciones divulgadas en el presente documento emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados como están dentro de las capacidades de la técnica. Estas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrooket al.MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y tercera edición, 2001; Ausubelet al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATlN STRUCTURE<a>N<d>FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P. M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.
Se describen aspectos adicionales de la invención en las secciones siguientes.
Moléculas de fusión
En el presente documento se describen, pero no forman de la invención reivindicada, composiciones, por ejemplo, nucleasas, que son útiles para el corte de un gen diana seleccionado en una célula (por ejemplo,PLP1o elementos reguladores genéticos del mismo). En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, uno o más componentes de las moléculas de fusión (por ejemplo, nucleasas) son naturales. En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, uno o más componentes de las moléculas de fusión (por ejemplo, nucleasas) son no naturales, es decir, manipulados en el/los dominio(s) de unión a ADN y/o el/los dominio(s) de corte. Por ejemplo, el dominio de unión a ADN de una nucleasa natural se puede alterar para unirse a un sitio diana seleccionado (por ejemplo, una meganucleasa que se ha manipulado para unirse a un sitio diferente que el sitio de unión afín). En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la nucleasa comprende dominios de unión a ADN y corte heterólogos (por ejemplo, nucleasas de dedo de cinc; proteínas de unión a ADN de dominio efector TAL; dominios de unión a ADN de meganucleasa con dominios de corte heterólogos).
Dominios de unión a ADN
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la composición y los métodos descritos en el presente documento emplean un dominio de unión a ADN de una meganucleasa (endonucleasa de migración dirigida) para la unión a la molécula donante y/o unión a la región de interés en el genoma de la célula. La meganucleasas naturales reconocen sitios de corte de 15-40 pares de bases y comúnmente se agrupan en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de caja His-Cyst y la familia HNH. Las endonucleasas de migración dirigida ejemplares incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-SceI-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. Sus secuencias de reconocimiento son conocidas. Véase, también, la patente en EE UU No. 5.420.032; la patente en EE UU No. 6.833.252; Belfortet al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388; Dujonet al.(1989)Gene82:115-118; Perleretal. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996)TrendsGenet.12:224-228; Gimbleet al.(1996)J. Mol.Biol.263:163-180; Argastet al.(1998)J. Mol. Biol.280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión a ADN de las endonucleasas de migración dirigida y meganucleasas se puede manipular para unirse a sitios diana no naturales. Véase, por ejemplo, Chevalieret al.(2002)Molec. Cell10:895-905; Epinatet al.(2003)Nucleic AcidsRes.31:2952-2962; Ashworthet al.(2006)Nature441:656-659; Paqueset al.(2007)Current Gene Therapy7:49-66; la publicación de patente en EE UU No. 20070117128. Los dominios de unión a ADN de las endonucleasas de migración dirigida y meganucleasas se pueden alterar en el contexto de la nucleasa como un todo (es decir, de modo que la nucleasa incluya el dominio de corte afín) o se pueden fusionar a un dominio de corte heterólogo.
En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de unión a ADN de una o más de las nucleasas usadas en los métodos y composiciones descritas en el presente documento comprenden un dominio de unión a ADN de efector TAL natural o manipulado (no natural). Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 8.586.526. Se sabe que las bacterias patógenas vegetales del géneroXanthomonasproducen muchas enfermedades en plantas de cultivo importantes. La patogenicidad deXanthomonasdepende de un sistema de secreción de tipo III (T3S) conservado que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas están efectores de tipo activador de transcripción (TAL) que mimetizan los activadores transcripcionales de la planta y manipulan el transcriptoma de la planta (véase Kayet al(2007)Science318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión a ADN y un dominio de activación transcripcional. Uno de los efectores tAl mejor caracterizados es AvrBs3 deXanthomonas campestgrispv.Vesicatoria(véase Bonaset al(1989)Mol Gen Genet218: 127-136 y el documento WO2010079430). Los efectores TAL contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, cada repetición contiene aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional ácido (para una revisión véase Schornack S,et al.(2006)J Plant Physiol163(3): 256-272). Además, en las bacterias fitopatógenasRalstonia solanacearumse han encontrado dos genes, designados brg11 y hpx17 que son homólogos a la familia AvrBs3 deXanthomonasen la cepa biovar 1 deR. solanacearumGMI1000 y en la cepa biovar 4 RS 1000 (Véase Heuer et at (2007)Appl and Envir Micro73(13): 4379 4384). Estos genes son el 98,9% idénticos en secuencia de nucleótidos entre sí, pero se diferencian por una deleción de 1.575 pb en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40% de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 deXanthomonas.Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 8.586.526.
La especificidad de estos efectores TAL depende de las secuencias encontradas en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pb y las repeticiones son típicamente el 91-100% homólogas entre sí (Bonaset al,ibid). El polimorfismo de la repetición habitualmente está localizado en las posiciones 12 y 13 y parece ser una correspondencia uno a uno entre la identidad de los dirresiduos hipervariables (RVD) en las posiciones 12 y 13 con la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana del efector TAL (véase, Moscou y Bogdanove, (2009)Science326:1501 y Bochet al(2009)Science326:1509-1512). Experimentalmente, el código natural para el reconocimiento de ADN de estos efectores TAL se ha determinado de modo que una secuencia HD en las posiciones 12 y 13 produce una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, e ING se une a T. Estas repeticiones de unión a ADN se han ensamblado en proteínas con nuevas combinaciones y números de repeticiones, para hacer factores de transcripción artificiales que sean capaces de interaccionar con las nuevas secuencias y activar la expresión de un gen indicador no endógeno en células vegetales (Bochet al,ibid). Las proteínas TAL manipuladas se han unido a un semidominio de corte Fok1 para dar una fusión de nucleasa a dominio efector TAL (TALEN). Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 8.586.526; Christianet al.((2010)<Geneticsepub 10.1534/genetics. 110.120717). En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio TALE comprende una caperuza N y/o caperuza C como se describe en la patente en EE UU No. 8.586.526.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de unión a ADN de una o más nucleasas usado para cortein vivoy/o corte dirigido del genoma de una célula comprende una proteína de dedo de cinc. Preferiblemente, la proteína de dedo de cinc es no natural en que se manipula para unirse a un sitio diana de elección. Véase, por ejemplo, Beerliet al.(2002)Nature Biotechnol.20:135141; Paboet al.(2001)Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalanet al.(2001)Nature Biotechnol.19:656-660; Segalet al.(2001)Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Chooet al.(2000)Curr. Opin. Struct.Biol.10:411-416; patentes en EE UU Nos. 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y publicaciones de patentes en EE UU Nos. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
Un dominio de unión de dedo de cinc manipulado puede tener una especificidad de unión novedosa, comparada con una proteína de dedo de cinc natural. Los métodos de manipulación incluyen, pero no están limitados a, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, usar bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos de dedos de cinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos triplete o cuadruplete se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de cinc que se unen la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU en propiedad conjunta No. 6.453.242 y 6.534.261.
Los métodos de selección ejemplares, incluyendo presentación en fagos y sistemas de doble híbrido, se divulgan en las patentes en EE UU Nos. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como los documentos WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, el aumento de la especificidad de unión para dominios de unión de dedo de cinc se ha descrito, por ejemplo, en el documento de propiedad conjunta WO 02/077227.
Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedo de cinc y/o proteínas de dedos de cinc multidedo se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia enlazadora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase, también, las patentes en EE UU Nos. 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de cinc individuales de la proteína.
En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de unión a ADN se dirige a un genPLP1o elemento regulador genético dePLP1.
La selección de sitios diana, ZFP y métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que codifican las mismas) los conocen los expertos en la materia y se describen en detalle en las patentes en EE UU Nos. 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; documentos WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
Además, como se divulga en estas y otras referencias, los dominios de dedo de cinc y/o proteínas de dedos de cinc multidedo se pueden unir entre sí usando cualquier secuencia enlazadora adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véase, también, las patentes en EE UU Nos. 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de cinc individuales de la proteína.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de unión a ADN es parte de un sistema nucleasa CRISPR/Cas. Véase, por ejemplo, la patente en EE UU No.
8.697.359 y la solicitud de patente en EE UU con No. de serie 14/278.903. El locus Cr IPSR (repeticiones palindrómicas cortas separadas regularmente agrupadas), que codifica componentes de ARN, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansenet al.,2002.Mol. Microbiol.43: 1565-1575; Makarovaet al.,2002.Nucleic Acids Res.30: 482-496; Makarovaet al.,2006.Biol. Direct1: 7; Haftet al.,2005.PLoS Comput. Biol.1: e60) constituyen las secuencias génicas del sistema nucleasa CRISPR/Cas. Los loci CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas) así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad del corte de ácido nucleico mediado por CRISPR. Los sistemas CRIPSR/Cas se separan en dos clases. La clase 1 usa varias proteínas Cas junto con los ARN de CRIPSR (crARN) para construir una endonucleasa funcional. Los sistemas CRIPSR de clase 2 usan una única proteína Cas con un crARN.
El CRISPR de clase 2 tipo II es uno de sistemas mejor caracterizados y lleva a cabo rotura bicatenaria de ADN dirigida en cuatro etapas secuenciales. Primero, dos ARN no codificantes, el conjunto pre-crARN y tracrARN, se transcriben del locus CRISPR. Segundo, tracrARN hibrida a las regiones repetidas del pre-crARN y media el procesamiento del pre-crARN a crARN maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. Tercero, el complejo crARN maduro:tracrARN dirige el dominio funcional (por ejemplo, nucleasa tal como Cas) al ADN diana a través de emparejamiento de bases de Watson-Crick entre el espaciador en el crARN y el protoespaciador en el ADN diana junto al motivo adyacente al protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento de la diana. Por último, Cas9 media el corte del ADN diana para crear una rotura bicatenaria en el protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas comprende tres etapas: (i) inserción de secuencias de ADN exógeno en la serie CRISPR para prevenir futuros ataques, en un proceso llamado 'adaptación', (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la serie, seguido por (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico exógeno.
Por tanto, en la célula bacteriana, varias de las llamadas proteínas 'Cas' están implicadas en la función natural del sistema CRISPR/Cas y cumplen papeles en funciones tales como inserción del ADN exógeno, etc.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la proteína Cas puede ser un “derivado funcional” de una proteína Cas natural. Un “derivado funcional” de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los “derivados funcionales” incluyen, pero no están limitados a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada en el presente documento es la capacidad del derivado funcional para hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término “derivado” abarca tanto variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido, modificaciones covalentes, y fusiones del mismo tal como proteínas Cas derivadas. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero no están limitados a, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de proteína Cas o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como derivados de proteína Cas o un fragmento de los mismos, puede ser obtenible de una célula o sintetizarse químicamente o mediante una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce proteína Cas de forma natural, o una célula que produce proteína Cas de forma natural y está genéticamente manipulada para producir proteína Cas endógena a un nivel de expresión mayor o para producir una proteína Cas de un ácido nucleico introducido exógenamente, ácido nucleico que codifica una Cas que es igual o diferente de la Cas endógena. En algunos casos, la célula no produce proteína Cas de forma natural y se manipula genéticamente para producir proteína Cas. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la proteína Cas es un ortólogo de Cas9 pequeño para administración a través de un vector AAV (Ranet al.(2015)Nature510, p. 186). En ejemplos particulares divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la proteína Cas es una proteína SaCas9 o SpCas9.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la proteína Cas9 es una Cas9 de mamífero o una Cas9 deStreptococcus pyogenes, Neisseria Meningitidis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus pneumnoniae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus mutans, Pasteurella multocida, Bifidobacterium longum, Bacillus smithii, Treponema denticola, mycoplasma canesoEnterococcus faecalis, Sutterella wadsworthensis, Filifactor alocis, Lactobacillus johnsonii, Campylobacter lari, Corynebacter diptheriae, Parvibaculum lavamentivorans, Mycoplasma gallisepticum, Staphylococcus aureus subsubspecies Aureus, Legionella pneumophila Paris, Treponema denticola, Staphylococcus pseudintermedius, o Neisseria cinerea.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la proteína Cas9 tiene una o más secuencias de localización nuclear.
En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de unión a ADN es parte de un sistema CRISPR/Cas Cpfl de clase 2 de tipo V. Como Cas9, las nucleasas Cpf1 contienen un dominio endonucleasa de tipo RuvC, pero carecen del segundo dominio endonucleasa HNH de Cas9 y el lóbulo de reconocimiento de alfa hélice N-terminal. Cpf1 corta el ADN en un patrón escalonado y requiere solo un ARN más que los dos (tracrARN y crARN) necesitados por Cas9 para el corte. El patrón de corte escalonado de Cpf1 abre la posibilidad de transferencia génica direccional, análoga a la clonación con enzimas de restricción tradicional. La transferencia génica mediada por extremos cohesivos puede ser particularmente útil para dirigirse a células que no se dividen, que son difíciles de modificar mediante reparación dirigida por homología (HDR). Cpf1 también expande el número de sitios a los que se puede dirigir CRISPR a regiones ricas en AT o genomas ricos en AT que carecen de los sitios PAM 3'-NGG favorecidos por SpCas9 (véase, por ejemplo, Zetscheet al.(2015)Cell163(3):759-771 y Makarovaet al.,(2015)Nature Reviews Microbiology13(11):722-736.
En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de unión a ADN es parte de un sistema de endonucleasa Argonauta adecuado para edición genómica en células humanas. Un sistema de endonucleasa Argonauta ejemplar adecuado para edición genómica en células humanas puede incluir una endonucleasa guiada por ADN argonauta deNatronobacterium gregoryi(NgAgo) (Gaoet al.(2016)Nature Biotechnology.34: 768-773). NgAgo se une a ADN guía (ADNg) monocatenario fosforilado en 5' de ~24 nucleótidos y crea de forma eficaz roturas bicatenarias de ADN específicas de sitio cuando se carga con el ADNg. Usando ADNmc fosforilados en 5' como moléculas guía reduce la posibilidad de que oligonucleótidos celulares confundan a NgAgo. Una molécula guía puede solo unirse a NgAgo durante la expresión de la proteína. Una vez la guía está cargada, NgAgo no puede intercambiar ADNmc que flota libremente por su ADNg. El sistema NaAgo-ADNg no requiere un motivo adyacente al protoespaciador (PAM), como Cas9, y parece poseer una baja tolerancia a malos emparejamientos guía-diana y alta eficacia en editar dianas genómicas ricas en (G+C).
Se pueden cargar ADN guía exógenos de secuencia de ADN arbitraria en la proteína NgAgo. Puesto que la especificidad del corte de NgAgo está dirigida por el ADN guía, un complejo NgAgo-ADN formado con un ADN guía especificado por el investigador, exógeno, por tanto, dirigirá el corte del ADN diana de NgAgo a un ADN diana especificado por el investigador complementario. De esta manera, se puede crear una rotura bicatenaria dirigida en el<a>D<n>. El uso del sistema NgAgo-ADN guía (o sistemas NgAgo-ADN guía ortólogos de otros organismos) permite el corte dirigido de ADN genómico en las células. Tal corte puede ser mono- o bicatenario. Para el corte de ADN genómico de mamífero, sería preferible el uso de una versión de NaAgo con codones optimizados para la expresión en células de mamífero. Además, podría ser preferible tratar las células con un complejo NgAgo-ADN formadoin vitrodonde la proteína NgAgo se fusiona a un péptido de penetración celular. Además, podría ser preferible usar una versión de la proteína NgAgo que se ha alterado a través de mutagénesis para tener actividad mejorada a 37°C. Se podría usar el corte de ADN mediado por Ago-ARN para afectar una panoplia de desenlaces incluyendo inactivación génica, adición génica dirigida, corrección génica, deleción génica dirigida usando métodos estándar en la técnica para explotación de roturas de ADN.
Por tanto, la nucleasa incluye un dominio de unión a ADN en que específicamente se une a un sitio diana en cualquier gen (por ejemplo,PLP1)en el que se desea insertar o delecionar bases (crear indels) para inactivar o reducir la expresión génica.
Dominios de corte
Cualquier dominio de corte adecuado puede estar operativamente unido a un dominio de unión a ADN para formar una nucleasa. Por ejemplo, los dominios de unión a ADN ZFP se han fusionado a dominios nucleasa para crear ZFN - una entidad funcional que es capaz de reconocer su diana de ácido nucleico esperada mediante su dominio de unión a ADN manipulado (ZFP) y producir que el ADN se corte cerca del sitio de unión del ZFP a través de la actividad nucleasa, incluyendo para uso en modificación genómica en una variedad de organismos. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patente en EE UU No. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la publicación internacional WO 07/014275. Asimismo, los dominios de unión a ADN TALE se han fusionado a dominios nucleasa para crear TALEN. Véase, por ejemplo, la patente en EE UU, No. 8.586.526.
Como se ha indicado anteriormente, el dominio de corte puede ser heterólogo al dominio de unión a ADN, por ejemplo, un dominio de unión a ADN de dedo de cinc y un dominio de corte de una nucleasa o un dominio de unión de ADN y un dominio de corte TALEN, o dominio de unión a ADN de meganucleasa y un dominio de corte de una nucleasa diferente. Los dominios de corte heterólogos se pueden obtener de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que puede derivar un dominio de corte incluyen, pero no están limitadas a, endonucleasas de restricción y endonucleasas de migración dirigida. Se conocen enzimas adicionales que cortan el ADN (por ejemplo, nucleasa S1, nucleasa de soja verde; DNasa I pancreática; nucleasa de micrococo; endonucleasa HO de levadura. Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) se puede usar como fuente de los dominios de corte y semidominios de corte.
De forma similar, un semidominio de corte puede derivar de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se expone anteriormente, que requiera dimerización para actividad de corte. En general, se requieren dos proteínas de fusión para el corte si las proteínas de fusión comprenden semidominios de corte. Alternativamente, se puede usar una única proteína que comprende dos semidominios de corte. Los dos semidominios de corte pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada semidominio de corte puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están preferiblemente dispuestos, uno respecto al otro, de modo que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloque los semidominios de corte en una orientación espacial entre sí que permita que los semidominios de corte formen un dominio de corte funcional, por ejemplo, por dimerización. Por tanto, en ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, los bordes cercanos de los sitios diana están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede interponerse entre dos sitios diana (por ejemplo, de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de corte está entre los sitios diana.
Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse a ADN de forma específica de secuencia (en un sitio de reconocimiento), y cortar a Dn en o cerca del sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, tipo IIS) cortan ADN en sitios alejados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y corte separables. Por ejemplo, la enzima de tipo IIS Fok I cataliza el corte bicatenario de ADN, a 9 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en una hebra y 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Lietal. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci.USA89:4275-4279; Liet al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2764-2768; Kimet al.(1994a)Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:883-887; Kimet al.(1994b)J. Biol. Chem.269:31,978-31,982. Por tanto, en un ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, las proteínas de fusión comprenden el dominio de corte (o semidominio de corte) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión de dedo de cinc, que pueden o no estar manipulados.
Una enzima de restricción de tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de corte es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particulares activa como un dímero. Bitinaiteet al.(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 10.570-10.575. Según esto, para los fines de la presente divulgación, la porción de la enzima Fok I usada en las proteínas de fusión divulgadas se considera un semidominio de corte. Por tanto, para el corte bicatenario dirigido y/o sustitución dirigida de secuencias celulares usando fusiones dedo de cinc-Fok I, se pueden usar dos proteínas de fusión, cada una comprende un semidominio de corte de Fok I, para reconstituir un dominio de corte catalíticamente activo.
Alternativamente, también se puede usar un único polipéptido que contiene un dominio de unión de dedo de cinc y dos semidominios de corte de Fok I. Los parámetros para el corte dirigido y alteración de secuencia dirigida usando fusiones dedo de cinc-Fok I se proporcionan en otro lugar en esta divulgación.
Un dominio de corte o semidominio de corte puede ser cualquier porción de una proteína que retenga actividad de corte, o que retenga la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizarse) para formar un dominio de corte funcional.
Las enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares se describen en la publicación internacional WO 07/014275. Enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y corte separables, y estas se contemplan por la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Robertset al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el dominio de corte comprende uno o más semidominios de corte manipulados (también denominados mutantes de dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de patente en EE UU No. 20050064474; 20060188987; 20070305346 y 20080131962. Los residuos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, y 538 de Fok1 son todos dianas para influir la dimerización de los semidominios de corte de Fok1.
Se pueden usar dominios de corte con más de una mutación, por ejemplo, mutaciones en las posiciones 490 (E^-K) y 538 (I^-K) en un semidominio de corte para producir un semidominio de corte manipulado designado “E490K:I538K” y mutando las posiciones 486 (Q^-E) y 499 (I^-L) en otro semidominio de corte para producir un semidominio de corte manipulado designado “Q486E:I499L”; las mutaciones que sustituyen el residuo de Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 con un residuo de Glu (E), el residuo de Iso (I) de tipo salvaje en la posición 499 con un residuo de Leu (L) y el residuo de Asn (N) de tipo salvaje en la posición 496 con un residuo de Asp (D) o Glu (E) (también denominados dominios “ELD” o ELE”, respectivamente); un semidominio de corte manipulado que comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numeradas relativo a FokI de tipo salvaje), por ejemplo, mutaciones que sustituyen el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 con un residuo de Lys (K), el residuo de Iso (I) de tipo salvaje en la posición 538 con un residuo de Lys (K), y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 con un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (también denominados dominios “KKK” o “KKR”, respectivamente); y/o un semidominio de corte manipulado que comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numeradas relativo a FokI de tipo salvaje), por ejemplo, mutaciones que sustituyen el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 con un residuo de Lys (K) y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 con un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (también denominados dominios “KIK” o “KIR”, respectivamente). Véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No.
7.914.796; 8.034.598 y 8.623.618. En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el semidominio de corte manipulado comprende las mutaciones “Sharkey” y/o “Sharkey” (véase, Guoet al,(2010)1Mol. Biol.400(1):96-107)
Alternativamente, se pueden ensamblar las nucleasasin vivoen el sitio diana de ácido nucleico usando la tecnología llamada “enzima fragmentada” (véase, por ejemplo, la publicación de patente en EE UU No. 20090068164). Los componentes de tales enzimas fragmentadas se pueden expresar o bien en construcciones de expresión separadas, o pueden estar unidas en un marco abierto de lectura donde los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A autocortante o secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión de dedo de cinc individuales o dominios de un dominio de unión a ácido nucleico de meganucleasa.
Las nucleasas también se pueden cribar para actividad antes del uso, por ejemplo, en un sistema cromosómico de levadura como se describe en la patente en EE UU No. 8.563.314.
El sistema CRISPR/Cas relacionado con Cas9 comprenden dos componentes no codificantes de ARN: tracrARN y un conjunto pre-crARN que contiene secuencia guía de nucleasa (espaciadores) separados por repeticiones directas (DR) idénticas. Para usar un sistema CRISPR/Cas para lograr manipulación genómica, ambas funciones de estos A<r>N deben estar presentes (véase Conget al,(2013) Sciencexpress1/10.1126/science 1231143). En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el tracrARN y pre-crARN son suministrados a través de construcciones de expresión separadas o como ARN separados.
En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, se construye un ARN quimérico donde un crARN maduro manipulado (que confiere especificidad de diana) se fusiona a un tracrARN (que suministra interacción con Cas9) para crear un híbrido cr-ARN-tracrARN quimérico (también denominado un ARN guía único o ARNgu). Por tanto, junto con la nucleasa Cas9, la modificación de los genesPLP1en un método de la invención requiere la introducción de un ARNgu que contiene una secuencia de aproximadamente 20 bases específica al ADN diana 5' de una secuencia soporte no variable. El ARNgu se puede administrar como ARN o transformando con un plásmido con la secuencia codificante del ARNgu bajo un promotor. En ejemplos particulares divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, una secuencia de ARNgu para uso en modificar un genPLP1incluye, pero no está limitada a, AAGACCACCATCTGCGGCAANGG (SEQ ID NO:1) y CCAGCAGGAGGGCCCCATAANGG (SEQ ID NO:2) que se dirige al exón 3 del genPLP1,GTCAGAGTGCCAAAGACATGGNNGRRT (SEQ ID NO:3) que se dirige al exón 1 del genPLP1.
Sitios diana
Como se ha descrito en detalle anteriormente, los dominios de unión a ADN se pueden manipular para unirse a cualquier secuencia de elección. Un dominio de unión a ADN manipulado puede tener una especificidad de unión novedosa, comparado a un dominio de unión de ADN natural.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el/los sitio(s) diana está(n) en un exón del genPLP1endógeno. Los ejemplos no limitantes de regiones exónicas genómicas para objetivo incluyen los exones 1 o 3 o 7 dePLP1.En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el sitio diana incluye aproximadamente un segmento de 80 nucleótidos en el 5' del exón 3 dePLP1.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la nucleasa se dirige al genPLP1.En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la nucleasa se dirige a un elemento regulador genético dePLP1tal como un promotor o un potenciador.
Donantes
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la presente divulgación se refiere a una integración dirigida mediada por nucleasa de una secuencia exógena en el genoma de una célula. Como se ha indicado anteriormente, la inserción de una secuencia exógena (también llamada una “secuencia donante”, o “donante” o “transgén”), por ejemplo, para la deleción de una región especificada (tal como delecionar una copia del genPLP1duplicado que aparece en aproximadamente el 70% de los pacientes de PMD) y/o la corrección de un gen mutante (tal como una mutación puntual enPLP1que aparece en aproximadamente el 30% de los pacientes de PMD) o para la expresión aumentada de un gen de tipo salvaje. Será enseguida aparente que la secuencia donante típicamente no es idéntica a la secuencia genómica donde se coloca. Una secuencia donante puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir HDR eficaz en la localización de interés o se puede integrar a través de mecanismos de reparación dirigidos por no homología. Además, las secuencias donantes pueden comprender una molécula vector que contiene secuencias que no son homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula donante puede contener varias regiones discontinuas de homología a ADN celular. Además, para la inserción dirigida de secuencias normalmente no presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico donante y flanqueadas por regiones de homología a secuencias en la región de interés.
Como con las nucleasas, los donantes se pueden introducir en cualquier forma. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, los donantes se pueden introducir usando ADN y/o vectores víricos por métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patente en EE u U No. 20100047805 y 20110207221. El donante se puede introducir en la célula en forma bi- o monocatenaria. El donante se puede introducir en la célula en forma circular o lineal. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden estar protegidos (por ejemplo, de degradación exonucleolítica) por métodos que conocen los expertos en la materia. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos. Véase, por ejemplo, Changet al.(1987)Proc. Natl. Acad. Sci.USA84:4959-4963; Nehlset al.(1996)Science272:886-889. Los métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos de degradación incluyen, pero no están limitados a, adición de grupo(s) amino terminal(es) y el uso de enlaces internucleotídicos modificados tal como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforoamidatos, y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el donante incluye secuencias (por ejemplo, secuencias codificantes, también denominadas transgenes) mayores de 1 kb de longitud, por ejemplo, entre 2 y 200 kb, entre 2 y 10 kb (o cualquier valor entre ellos). El donante también puede incluir al menos un sitio diana de nucleasa. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el donante incluye al menos 2 sitios diana, por ejemplo, para un par de nucleasas ZFN, TALEN, NgAgo o CRISPR/Cas. Típicamente, los sitios diana de las nucleasas están fuera de las secuencias transgénicas, por ejemplo, 5' y/o 3' respecto a las secuencias del transgén, para corte del transgén. El/los sitio(s) de corte de la nucleasa puede(n) ser para cualquier nucleasa. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el/los sitio(s) diana de nucleasa contenido(s) en el donante bicatenario son para la misma(s) nucleasa(s) usada(s) para cortar la diana endógena en la que el donante cortado se integra a través de métodos independientes de homología.
El donante se puede insertar de modo que su expresión esté dirigida por el promotor endógeno en el sitio de integración, es decir, el promotor que dirige la expresión del gen endógeno en el que se inserta el donante. Sin embargo, será aparente que el donante puede comprender un promotor y/o potenciador, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible o específico de tejido.
La molécula donante se puede insertar en un gen endógeno de modo que todo, algo o nada del gen endógeno se exprese. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el transgén se integra en unPLP1o elemento regulador genético dePLP1de modo quePLP1se inactiva o su expresión se reduce.
Además, aunque no se requiere para expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras de transcripción o traducción u otras, por ejemplo, promotores, potenciadores, aislantes, sitios de entrada interna al ribosoma, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación. Además, se pueden incluir secuencias aceptoras de ayuste. Los expertos en la materia conocen secuencias de sitios aceptores de ayuste ejemplares e incluyen, a modo de ejemplo solo, CTGACCTCTTCTCTTCCTCCCACAG, (SEQ ID NO: 4) (del gen HBB humano) y TTTCTCTCCACAG (SEQ ID NO: 5) (del gen de inmunoglobulina gamma humana).
Las secuencias donantes (transgenes y/o moldes de reparación) descritas en el presente documento se pueden aislar de plásmidos, células u otras fuentes usando métodos estándar conocidos en la técnica tal como PCR. Los donantes para uso pueden incluir varios tipos de topología, incluyendo circular superenrollada, circular relajada, lineal y similares. Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de nucleótidos estándar. Además, los donantes pueden estar metilados o carecer de metilación. Los donantes pueden estar en forma de cromosomas artificiales bacterianos o de levadura (BAC o YAC).
Los polinucleótidos donantes descritos en el presente documento pueden incluir una o más bases y/o esqueletos no naturales. En particular, la inserción de una molécula donante con citosinas metiladas se puede llevar a cabo usando los métodos descritos en el presente documento para lograr un estado de quiescencia transcripcional en una región de interés.
El polinucleótido exógeno (donante) puede comprender cualquier secuencia de interés (secuencia exógena). Las secuencias exógenas ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, cualquier secuencia codificante de polipéptido (por ejemplo, ADNc), secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, etiquetas epítopos, genes marcadores, sitios de reconocimiento de enzimas de corte y varios tipos de construcciones de expresión. Los genes marcadores incluyen, pero no están limitados a, secuencias que codifican proteínas que median resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde mejorada, proteína fluorescente roja, luciferasa), y proteínas que median crecimiento celular aumentado y/o amplificación génica (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las etiquetas epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable.
En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el donante además comprende un polinucleótido que codifica cualquier polipéptido cuya expresión en la célula se desea incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos, antígenos, enzimas, receptores (de superficie celular o nucleares), hormonas, linfoquinas, citoquinas, polipéptidos indicadores, factores de crecimiento, y fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores. Las secuencias codificantes pueden ser, por ejemplo, ADNc.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, las secuencias exógenas pueden comprender un gen marcador (descrito anteriormente), que permite la selección de las células que han experimentado integración dirigida, y una secuencia ligada que codifica una funcionalidad adicional. Los ejemplos no limitantes de genes marcadores incluyen GFP, marcador(es) de selección de fármacos y similares.
En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el donante puede incluir, por ejemplo, genes de tipo salvaje para sustituir secuencias endógenas nocivas mutadas. Por ejemplo, una secuencia génica de tipo salvaje (u otra funcional) se puede insertar en el genoma de una célula madre en la que la copia endógena del gen está mutada. En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el donante puede incluir, por ejemplo, un gen mutante para sustituir genes endógenos de tipo salvaje. Por ejemplo, una secuenciaPLP1de tipo salvaje se puede insertar en el genoma de una célula madre para mutar el genPLpImutante, nocivo endógeno implicado en un trastorno relacionado con mielina.
La construcción de tales casetes de expresión, según las enseñanzas de la presente especificación, utiliza metodologías bien conocidas en la técnica de biología molecular (véase, por ejemplo, Ausubel o Maniatis). Antes del uso del casete de expresión para generar un animal transgénico, se puede ensayar la sensibilidad del casete de expresión al inductor de estrés asociado con los elementos de control seleccionados introduciendo el casete de expresión en una línea celular adecuada (por ejemplo, células primarias, células transformadas, o líneas celulares inmortalizadas).
Además, aunque no se requiere para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras de transcripción o traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aislantes, sitios de entrada interna al ribosoma, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación. Además, los elementos de control de los genes de interés pueden estar operativamente unidos a genes indicadores para crear genes quiméricos (por ejemplo, casetes de expresión indicadores).
También se puede lograr la inserción dirigida de una secuencia de ácido nucleico no codificante. También se pueden usar secuencias que codifican ARN antisentido, ARNi, ARNip, ARNhc y micro ARN (miARN) para inserciones dirigidas.
En ejemplos adicionales divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, el ácido nucleico donante puede comprender secuencias no codificantes que son sitios diana específicos para diseños de nucleasas adicionales. Posteriormente, se pueden expresar nucleasas adicionales en las células de modo que la molécula donante original se corte y modifique por inserción de otra molécula donante de interés. De esta manera, se pueden generar integraciones reiterativas de moléculas donantes permitiendo apilar rasgos en un locus de interés particular o en un locus puerto seguro.
En algunas formas de realización, las composiciones modificadoras genéticas terapéuticas de la invención se pueden además cribar usando un ensayoin vivoque evalúa la remielinización y reducción de la gravedad clínica en el modelo de ratónjimpyde la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD).
Silenciamiento génico
También divulgado en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, la nucleasa que se dirige al genPLP1.En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la nucleasa se dirige a un elemento regulador genético dePLP1tal como un promotor o un potenciador.
Según la invención reivindicada, un producto del genPLP1endógeno o, como también se divulga en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, un producto génico de elemento regulador dePLP1que fomenta la expresión dePLP1,se modifica para disminuir los niveles de expresión dePLP1.Según la invención reivindicada, un producto del genPLP1endógeno o, como también se divulga en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, un producto génico de elemento regulador dePLP1,se modifica para disminuir los niveles de expresión dePLP1usando silenciamiento génico.
Según la invención reivindicada, el producto del genPLP1endógeno o, como también se divulga en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, un producto génico de elemento regulador dePLP1,se modifica mediante el uso de un agente de silenciamiento génico que reduce o inhibe la expresión dePLP1o un elemento regulador dePLP1que fomenta la expresión dePLP1,en tejido o células de un sujeto en necesidad de ello. “Expresión”, significa el flujo global de información desde un gen para producir un producto génico (típicamente una proteína, opcionalmente postraduccionalmente modificada o un a Rn funcional/estructural).
En algunas formas de realización, el agente puede incluir una construcción de ARNi que inhibe o reduce la expresión dePLP1en una célula. Las construcciones de ARNi comprenden ARN bicatenario que puede específicamente bloquear la expresión de jun gen diana. “Interferencia de a Rn ” o “ARNi” es un término inicialmente aplicado a un fenómeno observado en plantas y gusanos donde ARN bicatenario (ARNbc) bloquea la expresión de una manera específica y postranscripcional.
Como se usa en el presente documento, el término “ARNbc” se refiere a moléculas de ARNip u otras moléculas de ARN incluyendo una característica bicatenaria y capaces de ser procesadas a ARNip en células, tal como fracciones de ARN horquillado (ARNhc) y micro-ARN (miARN).
El término “pérdida de función”, como se refiere a genes inhibidos por el método de ARNi objeto, se refiere a una disminución en el nivel de expresión de un gen cuando se compara con el nivel en ausencia de construcciones de ARNi.
Como se usa en el presente documento, la frase “media ARNi” se refiere a (indica) la capacidad para distinguir qué ARN se deben degradar por el proceso de ARNi, por ejemplo, la degradación se produce de una manera específica de secuencia más que por una respuesta de ARNbc independiente de secuencia, por ejemplo, una respuesta PKR.
Como se usa en el presente documento, el término “construcción de ARNi” es un término genérico usado a lo largo de la especificación para incluir ARN interferentes pequeños (ARNip), ARN horquillados, y otras especies de ARN (tal como miARN), que se pueden cortarin vivopara formar ARNip y/o miARN. Las construcciones de ARNi en el presente documento también incluyen vectores de expresión (también denominados vectores de expresión de ARNi) capaces de dar lugar a transcritos que forman ARNbc o ARN horquillados en células, y/o transcritos que pueden producir ARNipin vivo.
“Vector de expresión de ARNi” (también denominado en el presente documento “plásmido que codifica ARNbc”) se refiere a construcciones de ácido nucleico replicables usadas para expresar (transcribir) ARN que produce fracciones ARNip/ARNhc/miARN en la célula en la que la construcción se expresa. Tales vectores incluyen una unidad transcripcional que comprende un montaje de (1) elemento(s) genético(s) que tiene(n) un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores, operadores, o potenciadores operativamente unidos a (2) una secuencia “codificante” que se transcribe para producir un ARN bicatenario (dos fracciones de ARN que hibridan en la célula para formar un ARNip, o un único ARN horquillado que se puede procesar a un ARNip, o un miARN), y (3) secuencias de iniciación y terminación de la transcripción adecuadas.
La elección de promotor y los otros elementos reguladores en general varía según la célula huésped prevista, tal como una OPC. En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante con frecuencia están en la forma de “plásmidos” que se refiere a bucles de ADN bicatenario circular, que, en su forma de vector no están unidos al cromosoma. En la presente especificación, “plásmido” y “vector” se usan de forma intercambiable ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la solicitud describe otras formas de vectores de expresión que cumplen funciones equivalentes que se vuelven conocidas en la técnica posteriormente a este documento.
Las construcciones de ARNi contienen una secuencia de nucleótidos que hibrida en las condiciones fisiológicas de la célula con la secuencia de nucleótidos de al menos una porción del transcrito de ARNm para el gen que se va a inhibir (es decir, el gen “diana”). El ARN bicatenario solo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad de mediar ARNi. Por tanto, formas de realización toleran variaciones de secuencia que podrían esperarse debido a mutación genética, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. El número de malos emparejamientos de nucleótidos tolerados entre la secuencia diana y la secuencia de la construcción de ARNi no es más de 1 en 5 pares de bases, o 1 en 10 pares de bases, o 1 en 20 pares de bases, o 1 en 50 pares de bases. Los malos emparejamientos en el centro del dúplex de ARNip son los más críticos y pueden esencialmente suprimir el corte del ARN diana. Por el contrario, los nucleótidos en el extremo 3' de la hebra de ARNip que es complementaria al ARN diana no contribuyen significativamente a la especificidad del reconocimiento de la diana.
La identidad de secuencia se puede optimizar por comparación de secuencias y algoritmos de alineamiento conocidos en la técnica y calcular el porcentaje de diferencia entre las secuencias de nucleótidos mediante, por ejemplo, el algoritmo de Smith-Waterman implementado en el programa de software BESTFIT usando parámetros por defecto (por ejemplo, Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin). Más del 90% de identidad de secuencia, o incluso el 100% de identidad de secuencia, entre el ARN inhibidor y la porción del gen diana es preferido. Alternativamente, la región dúplex del ARN se puede definir funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridar con una porción del transcrito del gen diana.
La producción de construcciones de ARNi se puede llevar a cabo por métodos sintéticos químicos o por técnicas de ácido nucleico recombinante. La ARN polimerasa endógena de la célula tratada puede mediar la transcripciónin vivo,o se puede usar ARN polimerasa clonada para transcripciónin vitro.Las construcciones de ARNi pueden incluir modificaciones a bien el esqueleto fosfato-azúcar o el nucleósido, por ejemplo, para reducir la susceptibilidad a nucleasas celulares, mejorar la biodisponibilidad, mejorar las características de formulación, y/o cambiar otras propiedades farmacocinéticas. Por ejemplo, los enlaces fosfodiéster del ARN natural se pueden modificar para incluir al menos un heteroátomo de nitrógeno o azufre. Las modificaciones en la estructura del ARN se pueden adaptar para permitir una inhibición genética específica mientras se evita una respuesta general a ARNbc. Asimismo, las bases se pueden modificar para bloquear la actividad de adenosina desaminasa. La construcción de ARNi se puede producir enzimáticamente o por síntesis orgánica parcial/total, un ribonucleótido modificado se puede introducir por síntesis enzimática u orgánicain vitro.
Los métodos para modificar químicamente moléculas de ARN se pueden adaptar para modificar construcciones de ARNi (véase, por ejemplo,Nucleic Acids Res,25:776-780;J Mol Recog7:89-98;Nucleic Acids Res23:2661-2668;Antisense Nucleic Acid Drug Dev7:55-61). Simplemente para ilustrar, el esqueleto de una construcción de ARNi se puede modificar con fosforotioatos, fosforamidato, fosfoditioatos, metilfosfonato-fosfodiésteres quiméricos, ácidos peptidonucleicos, oligómeros que contienen 5-propinil-pirimidina o modificaciones de azúcar (por ejemplo, ribonucleósidos 2'-sustituidos, configuración a).
La estructura bicatenaria se puede formar por una única hebra de ARN autocomplementaria o dos hebras de ARN complementarias. La formación de dúplex de ARN se puede iniciar o dentro o fuera de la célula. El ARN se puede introducir en una cantidad, que permita la administración de al menos una copia por célula. Dosis mayores (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) de material bicatenario pueden dar inhibición más eficaz, mientras que dosis menores también pueden ser útiles para aplicaciones específicas. La inhibición es específica de secuencia en que las secuencias de nucleótidos correspondientes a la región dúplex del ARN son objetivo para inhibición genética.
En ciertas formas de realización, las construcciones de ARNi objeto son “ARN interferentes pequeños” o “ARNip”. Estos ácidos nucleicos tienen aproximadamente 19-30 nucleótidos de longitud, e incluso más preferiblemente 21-23 nucleótidos de longitud, por ejemplo, correspondientes en longitud a los fragmentos generados por “troceado” por nucleasa de ARN bicatenarios más largos. Se entiende que los ARNip reclutan complejos de nucleasas y guían los complejos al ARNm diana por emparejamiento a las secuencias específicas. En una forma de realización particular, las moléculas de ARNip de 21-23 nucleótidos comprenden un grupo 3' hidroxilo.
Las moléculas de ARNip descritas en el presente documento se pueden obtener usando un número de técnicas que conocen los expertos en la materia. Por ejemplo, el ARNip se pueden sintetizar químicamente o producir de forma recombinante usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden sintetizar oligómeros de ARN cortos sentido y antisentido e hibridar para formar estructuras de a Rn bicatenario con salientes de 2 nucleótidos en cada extremo(Proc Natl Acad Sci USA,98:9742-9747;EMBO J,20:6877-88). Estas estructuras de ARNip bicatenarias se pueden después introducir directamente en células, sea por absorción pasiva o un sistema de administración de elección, tal como se describe posteriormente.
En ciertas formas de realización, las construcciones de ARNip se pueden generar procesando ARN bicatenarios más largos, por ejemplo, en presencia de la enzima dicer. En una forma de realización, se usa el sistemain vitrode Drosophila. En esta forma de realización, el ARNbc se combina con un extracto soluble derivado de embrión de Drosophila, produciendo de esta manera una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARNbc se procesa a moléculas de ARN de aproximadamente 21 hasta aproximadamente 23 nucleótidos.
Las moléculas de ARNip se pueden purificar usando un número de técnicas que conocen los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede usar electroforesis en gel para purificar los ARNip. Alternativamente, se pueden usar métodos no desnaturalizantes, tal como cromatografía en columna no desnaturalizante, para purificar el ARNip. Además, se pueden usar cromatografía (por ejemplo, cromatografía de exclusión molecular), centrifugación en gradiente de glicerol, purificación de afinidad con anticuerpo para purificar los ARNip.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi está en forma de una estructura horquillada (llamada ARN horquillado). Los ARN horquillados se pueden sintetizar exógenamente o se pueden formar transcribiendo de promotores de ARN polimerasa IIIin vivo.Los ejemplos de hacer y usar tales ARN horquillados para silenciamiento génico en células de mamífero se describen en, por ejemplo,Genes Dev,2002, 16:948-58; Nature, 2002, 418:38-9;RNA,2002, 8:842-50; yProc Natl Acad Sci,2002, 99:6047-52. Preferiblemente, tales ARN horquillados se manipulan en células o en un animal para asegurar la supresión continua y estable de un gen deseado. Se sabe en la técnica que los ARNip se pueden producir procesando ARN horquillado en la célula.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi está en forma de un micro-ARN o miARN. Los miARN son ARN monocatenarios no codificantes transcritos o bien de sus propios genes o de intrones por ARN polimerasa II. Después de la transcripción, el miARN primario primero se procesa a pre-miARN con una estructura de tallo-bucle (aproximadamente 70 nucleótidos) y después a un miARN funcional (21-23 nucleótidos). Como el ARNip y el ARNhc, el miARN también usa RISC para la degradación de ARNm y silenciamiento génico postranscripción, y tiene el potencial para dirigirse a cualquier ARNm de interés. Al contrario que ARNip que tiene complementariedad perfecta al ARNm diana, miARN se une imperfectamente al ARNm diana. Esta unión de complementariedad parcial permite a cada miARN interaccionar potencialmente con muchos conjuntos similares de ARNm diana. Además de la degradación de ARNm, el miARN puede producir represión de traducción sin corte endonucleolítico. Por tanto, los genes objetivo de miARN se pueden regular traduccionalmente sin afectar el nivel de ARNm de la diana. Una ventaja potencial de miARN sobre ARNip es que un único transcrito de miARN se puede procesar en múltiples ARNip.
En aun otras formas de realización, se usa un plásmido para administrar el ARN bicatenario, por ejemplo, como un producto transcripcional. En tales formas de realización, el plásmido se diseña para incluir una “secuencia codificante” para cada una de las hebras sentido y antisentido de la construcción de ARNi. Las secuencias codificantes pueden ser la misma secuencia, por ejemplo, flanqueada por promotores invertidos, o pueden ser dos secuencias separadas cada una bajo control transcripcional de promotores separados. Después de que se transcriba la secuencia codificante, los transcritos de ARN complementarios se emparejan por bases para formar el ARN bicatenario.
La solicitud PCT WO01/77350 describe un ejemplo de un vector para transcripción bidireccional de un transgén para dar transcritos de ARN tanto sentido como antisentido del mismo transgén en una célula eucariota. Según esto, ciertas formas de realización proporcionan un vector recombinante que tiene las siguientes características únicas: comprende un replicón vírico que tiene dos unidades de transcripción solapantes organizadas en una orientación opuesta y que flanquean un transgén para una construcción de ARNi de interés, en donde las dos unidades de transcripción solapantes dan transcritos de ARN tanto sentido como antisentido del mismo fragmento del transgén en una célula huésped.
En algunas formas de realización, se puede usar un vector lentivírico para la expresión a largo plazo de un ARNip, tal como un ARN horquillado corto (ARNhc), para atenuar la expresión del genPLP1.Aunque ha habido algunas preocupaciones de seguridad respecto al uso de vectores lentivíricos para terapia génica, los vectores lentivíricos autoinactivantes se consideran buenos candidatos para terapia génica ya que transfectan fácilmente células de mamífero.
A modo de ejemplo, la disminución por ARN horquillado corto (ARNhc) de la expresión dePLP1se puede crear usando software OligoEngene (OligoEngine, Seattle,<w>A) para identificar secuencias como dianas del ARNip. Las secuencias de oligos se pueden hibridar y ligar en el vector de ARNi pSUPER (OligoEngine, Seattle, WA) linealizado y transformar en células de la cepaE. colide DH5a. Después de seleccionar clones positivos, el plásmido se puede transfectar en células 292T por precipitación con calcio. El sobrenadante vírico recogido que contiene ARNhc se puede usar después para infectar células de mamífero con el fin de disminuir el producto del genPLP1disminuyendo de esta manera el nivel de expresión dePLP1en las células.
También se pueden usar portadores desarrollados para ADN para ARNi parcialmente debido a sus propiedades fisicoquímicas similares. Estos portadores se pueden dividir en sentido amplio en dos categorías, es decir, víricos y no víricos. Véase una reciente revisión sobre los sistemas de administración víricos para ARNi (Castanotto y Rossi,The promises and pitfalls of RNA-interference-based therapeutics. Nature457(7228):426-33, 2009). Los vectores de ARNi no víricos típicamente implican acomplejar construcciones de ARNi con un vector cargado positivamente (por ejemplo, péptidos penetradores de células catiónicos, polímeros y dendrímeros catiónicos, y lípidos catiónicos); conjugar las construcciones de ARNi con moléculas pequeñas (por ejemplo, colesterol, ácidos biliares, y lípidos), polímeros, anticuerpos, y ARN; y encapsular la construcción de ARNi en formulaciones nanoparticuladas. La modificación del esqueleto del ARN mejora la estabilidad del ARNip sin afectar su eficacia de ARNi. La selección de los sistemas de administración de ARNi puede depender de las propiedades del ARNip, el tipo de células diana, y las vías de administración para aplicaciónin vivo.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi se administra mediante péptidos penetradores de células catiónicos (CPP). Se han usado CPP para la administración intracelular de macromoléculas incluyendo proteínas (por ejemplo, anticuerpos), péptidos, oligonucleótidos antisentido, y ADN de plásmido. Además de utilizar las rutas endocíticas tradicionales, los sistemas de administración de ARNi mediada por CPP forman o complejos no covalentes (CPP-ARNip no covalente) mediante interacciones electrostáticas, o forman entrecruzamientos covalentes mediante enlaces disulfuro (CPP-ARNip covalente), y pueden entrar en las células directamente cruzando la membrana celular.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi se administra mediante portadores poliméricos y dendriméricos. Los polímeros catiónicos lineales o ramificados son agentes de transfección eficaces bien establecidos para ADN y ARN. Estos polímeros con carga positiva funcionan formando poliplejos con los fosfatos con carga negativa de los ácidos nucleicos mediante interacciones electrostáticas. Otros portadores poliméricos adecuados de ARNip incluyen micelas, nanoplejos, nanocápsulas, y nanogeles. Las propiedades de los poliplejos (por ejemplo, tamaño, carga de superficie, y estructura) dependen de la proporción de las cargas positivas de los polímeros catiónicos respecto al número de grupos fosfato del ARNip. Una variedad de polímeros, tal como poli-l-lisina, polietilenimina (PEI), poli-d,l-lactida-co-glicolida (PLGA), poli(alquilcianoacrilato), quitosano, y gelatina son adecuados. Otros incluyen dendrímeros con grupos de superficie con carga positiva, cuyas nanoestructuras núcleo-revestimiento precisas permiten cargar fármaco por encapsulación interior, adsorción de superficie, o conjugación química. Los dendrímeros ejemplares incluyen poliamidoamina catiónica (PAMAM, superficie amino terminada), con pegilación opcional para mejorar las características de superficie de los dendrímeros; poli(propilenimina) (PPI), y polímeros y dendrímeros catiónicos que contienen ciclodextrina.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi se administra como bioconjugados. La construcción de ARNi se puede conjugar con una variedad de moléculas incluyendo moléculas pequeñas (por ejemplo, colesterol, ácidos biliares, y lípidos), péptidos (tal como péptidos penetradores de células catiónicos), polímeros (tal como el agente endosomolítico anfipático poli(éter de vinilo) PBAVE), proteínas (por ejemplo, anticuerpo) y aptámeros (por ejemplo, aptámeros de ARN) para mejorar la estabilidad, internalización celular o administración dirigida activa específica de célula.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi se administra con portadores basados en lípidos, incluyendo liposomas, micelas, microemulsiones, y nanopartículas lipídicas sólidas. Los liposomas son portadores de ARNip populares debido a su relativa simplicidad y propiedades farmacéuticas bien conocidas. Varios portadores liposómicos de fármacos contra el cáncer han mostrado buenos registros de seguridad en seres humanos, y uno (Doxil) ha recibido la aprobación de la FDA para uso humano. Los portadores basados en lípidos también se han usado con éxito para administrar ARNip (por ejemplo, inyección intravenosa o intraperitoneal de ARNip cargado en liposomas de lípidos catiónicos y fusógenos) a sitios diana en el endotelio, órganos SRE (por ejemplo, hígado), y tumores sólidos.
En ciertas formas de realización, la construcción de ARNi se administra con el uso de caballos de troya moleculares (tal como una formulación de liposoma caballo de troya (THL)) y tecnología de avidina-biotina. Los caballos de troya moleculares también se pueden formular como liposomas de caballo de troya para administrar ADN de plásmido que expresa ARNhc al cerebroin vivo.Similar a la administración de terapias génicas no víricas, el ADN de plásmido que codifica ARN horquillado corto (ARNhc) también se puede administrar al cerebro después de la administración intravenosa con inmunoliposomas pegilados (PIL). Por ejemplo, el ADN de plásmido se puede encapsular en un liposoma (tal como un liposoma de 100 nm), que está pegilado, y conjugado con anticuerpos monoclonales (Acm) que se dirigen a un receptor específico. Usando este medio de administración, ARNi con PIL intravenoso semanalmente permite una atenuación del 90% del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR) que produce un aumento del 90% en tiempo de supervivencia en ratones con cáncer cerebral intracraneal. También se puede usar la misma tecnología para administrar otras construcciones de ARNi incluyendo ARNip y miARN al cerebro. Por ejemplo, el ARNip se puede monobiotinilar en paralelo con la producción de un conjugado del Acm de direccionamiento y estreptavidina.
Un caballo de troya molecular (MTH) es un péptido endógeno o anticuerpo monoclonal (Acm) peptidomimético que experimenta transporte mediado por receptor (RMT) a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Un Acm peptidomimético se une a un epítopo exofacial en el receptor de la BHE, que permite que el Acm experimente RMT a través de la BHE sin interferencia del transporte de la BHE del ligando endógeno. El Acm peptidomimético puede transportar a través de la BHE cualquier fármaco unido o incluso ADN de plásmido a través del sistema de RMT de la BHE.
Se ha desarrollado un panel de caballos de troya moleculares Acm específicos de especie para administración de fármacos al cerebro. Por ejemplo, para la administración de fármacos en ratones, el Acm 8D3 de rata hacia el TfR de ratón se usa. Este MTH no es activo en ratas. Para administración de fármacos al cerebro en ratas, el Acm OX26 murino hacia el TfR de rata se usa, y este MTH no es activo en ratones u otras especies. Para administración de fármacos al cerebro de primates del viejo mundo tal como mono Rhesus, el Acm 83-14 murino hacia el receptor de insulina humano (HIR) se usa. El Acm de HIR no es activo en primates del nuevo mundo tal como el mono ardilla. Las formas genéticamente manipuladas del Acm de HIR, tanto un Acm de HIR quimérico como un Acm de HIR humanizado, se han producido para permitir la administración de fármacos al cerebro en seres humanos.
La administración de agentes terapéuticos proteicos al cerebro después de administración intravenosa con caballos de troya moleculares se ha reducido a la práctica farmacológicain vivopara un número de sistemas experimentales. Véase, Pardridge(Adv Drug Deliv Rev.59(23):141-152, 2007). Estos estudios de administración de proteína recombinante al cerebroin vivocon administración intravenosa demuestran que los MTH de la BHE pueden administrar agentes terapéuticos de molécula grande al cerebroin vivo.
Para la administración de ADN de plásmido no víricoin vivo, se desarrolló una formulación de liposoma de caballo de troya (THL), mediante lo cual el MTH se asoció con ADN de plásmido no vírico de una manera que sería establein vivo.Específicamente, una única molécula de ADN de plásmido se encapsula en el interior de un liposoma de ~100 nm, cuya superficie se conjuga con varios miles de hebras de un polímero, tal como polietilenglicol (PEG) de 2000 Da. Las puntas del 1-2% de las hebras de PEG se conjugan con un Acm específico de receptor (R) que actúa como el MTH. Esto produce la formulación de un inmunoliposoma pegilado (PIL) que encapsula el ADN de plásmido. El Acm de direccionamiento se une al receptor de la BHE para desencadenar el RMT de la sangre al líquido intersticial del cerebro. Posteriormente, el Acm de direccionamiento se une al mismo receptor en células cerebrales para desencadenar la endocitosis mediada por receptor en los espacios intracelulares cerebrales. En el caso de un receptor de insulina, que normalmente administra su ligando endógeno, insulina, al compartimento nuclear, el receptor de insulina administra el ADN de plásmido al núcleo de la célula cerebral, que va seguido por expresión del transgén endógeno. En juna formulación típica, hay de 30 a 80 moléculas de Acm conjugado a un liposoma individual. Cualquier ADN que no esté encapsulado por completo en el interior del liposoma puede ser exhaustivamente eliminado por tratamiento con nucleasa.
Usando esta tecnología, se han administrado genes indicadores luciferasa y p-galactosidasa (y muchos otros genes de manera similar) a cerebro de ratones con liposoma caballos de troya, por inyección intravenosa en ratones adultos a una dosis de 5 |jg de ADN de plásmido por ratón en un volumen de 0,2 ml. Hubo expresión global del transgén en todo el cerebro después de una administración intravenosa de esta formulación no vírica. El patrón de expresión es paralelo a la expresión del receptor de transferrina neuronal, que es ubicuo en el cerebro. El transgén se expresa en estructuras tanto corticales como subcorticales, en el plexo coroideo, en el hipocampo, el mesencéfalo, la médula espinal, y se expresa mucho en la capa de células de Purkinje del cerebelo. La tecnología de liposomas caballos de troya permite “transgénicos adultos” a las 24 horas después de la administración intravenosa de las formulaciones no víricas. El gen se administra a virtualmente todas las células del cerebro. A una dosis de 10 jg de ADN de plásmido/kg de peso corporal, aproximadamente 3-4 moléculas de ADN de plásmido se pueden administrar a cada célula cerebral del cerebro primate adulto.
En un estudio similar, se formuló un ADNc de tirosina hidroxilasa (TH) en un plásmido de expresión dirigido por el promotor de SV40. El plásmido de expresión de TH se encapsuló en liposomas caballos de troya que estaban dirigidos a cerebro de rata con el Acm OX26 murino al TfR de rata. La terapia génica de TH con los liposomas caballo de troya produjo una normalización completa de la actividad de la enzima TH estriatal ipsilateral a la lesión y produjo una reducción del 82% en comportamiento de rotación anómalo inducido por apomorfina. Véase, Pardridge(Adv Drug Deliv Rev.59(23):141-152, 2007).
En ciertas formas de realización, se usa un promotor específico de tejido para dirigir y limitar la expresión del transgén (por ejemplo, la construcción de ARNi o ASO) en el cerebro. Un promotor específico de cerebro que se puede usar en la presente invención puede tener la secuencia 5' flanqueante (FS) del gen de la proteína ácida fibrilar glial humana (GFAP), para eliminar la expresión del transgén en tejidos periféricos (no del SNC). Por tanto, el uso combinado de promotores específicos de tejido y tecnología de administración de liposomas caballos de troya permite la localización de la expresiónin vivodel gen terapéutico al órgano o tipo tisular específico tal como el cerebro.
La inyección IV de construcciones de ARNi (encapsulados en liposomas caballo de troya dirigidos con el Acm de TfR) se ha usado para administrar la expresión de una construcción de ARNi (ADN de plásmido que codifica ARNhc) en el cerebro y alcanza una atenuación del 90% de la expresión del gen diana en un tumor cerebral. No hay actividad del gen diana medible en el cerebro contralateral, y la terapia génica de ARNi no tuvo efecto sobre la expresión de un gen no diana. Véase, Pardridge(Adv Drug Deliv Rev.59(23):141-152, 2007). Por tanto, el efecto terapéuticoin vivodel ARNi se hizo posible combinando la tecnología de ARNi con tecnología de direccionamiento de liposomas caballos de troya.
La administración de oligodesoxinucleótidos antisentido (ASO), ácidos péptido nucleicos antisentido (APN) o ARNip requiere unión de alta afinidad de estos agentes al caballo de troya molecular. El enlace entre el MTH y el ácido nucleico terapéutico debe ser establein vivoen la circulación. En algunas formas de realización, tales ácidos nucleicos se pueden unir a ligandos de direccionamiento a través de un puente policatiónico, tal como polilisina o protamina. Alternativamente, en otras formas de realización, tales terapéuticos de ácido nucleico se pueden unir a ligandos de direccionamiento con el uso de tecnología de avidina-biotina.
El enlace entre avidina o estreptavidina y biotina es extremadamente estrecho, y no se rompe por proteínas del suero. Un conjugado del Acm de direccionamiento y bien avidina o estreptavidina (SA) se puede formular en un vial. En un segundo vial, se produce el agente antisentido (ASO) o ARNi/ARNip monobiotinilado. Los dos viales se mezclan justo antes de la administración intravenosa. Debido a la afinidad extremadamente alta de la unión de avidina o SA a biotina, hay una formación inmediata del conjugado entre el agente antisentido o el ARNip, y el Acm de direccionamiento. La semivida de disociación de la unión de biotina a avidina o SA es 89 días, y la constante de disociación de 10-15 M. Por tanto, la asociación entre el agente antisentido y el Acm de direccionamientoin vivoen la circulación permanece intacta durante varias horas después de la administración intravenosa. La unión del agente antisentido al Acm de direccionamiento mediante una unión avidina-biotina no tiene efecto inhibidor sobre la hibridación del agente antisentido con el ARN diana. Esto se demostró en estudios previos tanto por ensayos de protección a RNasa como transferencia Northern.
Usando esta tecnología, los agentes ASO (incluyendo fosforotioato (PS) y ácido peptidonucleico (APN), tal como APN monobiotinilados), así como construcciones de ARNi (tal como ARNip monobiotinilados) se han administrado al cerebro usando MTH.
En ciertas formas de realización, en lugar de usar el ARNip monobiotinilado, se usa un conjugado químico de SA y caballo de troya molecular. En aun otra forma de realización, se usan proteínas de fusión Acm-avidina. El ARNip monobiotinilado, y el conjugado MTH-SA o MTH-avidina, se pueden mezclar antes de la administración intravenosa. Los MTH pueden transportar las moléculas de ARNip a través de la BHE y el BCM similar a los demostrado previamente para agentes antisentido APN.
En otra forma de realización, el agente de silenciamiento génico que reduce o inhibe la expresión dePLP1o, como también se divulga en el presente documento, pero sin formar parte de la invención reivindicada, un elemento regulador dePLP1que fomenta la expresión dePLP1,puede incluir oligonucleótidos antisentido (ASO). Los oligonucleótidos antisentido son ácidos nucleicos relativamente cortos que son complementarios (o antisentido) a la hebra codificante (hebra sentido) del ARNm que codifica una proteína particular. Aunque los oligonucleótidos antisentido típicamente se basan en ARN, también se pueden basar en ADN. Además, los oligonucleótidos antisentido con frecuencia se modifican para aumentar su estabilidad.
La unión de estos oligonucleótidos relativamente cortos al ARNm se cree que introduce tramos de ARN bicatenario que desencadenan la degradación de los mensajes por las RNasas endógenas. Además, algunas veces los oligonucleótidos están específicamente diseñados para unirse cerca del promotor del mensaje, y en estas circunstancias, los oligonucleótidos antisentido pueden además interferir con la traducción del mensaje. Independientemente del mecanismo específico por el que los oligonucleótidos antisentido funcionan, su administración a un célula o tejido permite la degradación del ARNm que codifica una proteína específica. Según esto, los oligonucleótidos antisentido disminuyen la expresión y/o actividad de una proteína particular (por ejemplo,PLP1).
Los oligonucleótidos pueden ser ADN, ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, monocatenarios o bicatenarios. Los oligonucleótidos se pueden modificar en la fracción de base, fracción azúcar, o esqueleto de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, hibridación, etc. El oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos, tal como péptidos (por ejemplo, para dirigirse a receptores de células huésped), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo,Proc Natl Acad Sci86:6553-6556;Proc Natl Acad Sci84:648-652; Publicación PCT No. WO88/09810, publicada el 15 Dic., 1988) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, Publicación PCT No. WO89/10134, publicada el 25 Abr., 1988), agentes de corte desencadenado por hibridación (véase, por ejemplo,BioTechniques6:958-976) o agentes intercalantes. (véase, por ejemplo,Pharm Res5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido se puede conjugar o acoplar a otra molécula.
Los oligonucleótidos descritos en el presente documento se pueden sintetizar por métodos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como están comercialmente disponibles de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucleótidos de fosforotioato se pueden sintetizar por el método de Steinet al. (Nucl. Acids Res.16:3209), los oligonucleótidos de metilfosfonato se pueden preparar mediante el uso de soportes poliméricos de vidrio de poro controlado(Proc Natl Acad Sci85:7448-7451).
La selección de un oligonucleótido apropiado la puede realizar un experto en la materia. Dada la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína particular, un experto en la materia puede diseñar oligonucleótidos antisentido para unirse a esa proteína, y ensayar estos oligonucleótidos en un sistemain vitrooin vivopara confirmar que se unen a y median la degradación del ARNm que codifica la proteína particular. Para diseñar un oligonucleótido antisentido que se una específicamente a y medie la degradación de una proteína particular, es importante que la secuencia reconocida por el oligonucleótido sea única o sustancialmente única a esa proteína particular. Por ejemplo, secuencias que están frecuentemente repetidas a través de proteínas pueden no ser una elección ideal para el diseño de un oligonucleótido que específicamente reconoce y degrada un menaje particular. Un experto en la materia puede diseñar un oligonucleótido, y comparar la secuencia de ese oligonucleótido con secuencias de ácido nucleico que están depositadas en las bases de datos públicamente disponibles para confirmar que la secuencia es específica o sustancialmente específica para una proteína particular.
Se han desarrollado un número de métodos para administrar ADN o ARN antisentido a células, por ejemplo, las moléculas antisentido se pueden inyectar directamente en el sitio tisular, o moléculas antisentido modificadas diseñadas para dirigirse a las células deseadas (por ejemplo, antisentido unido a péptidos o anticuerpos que específicamente se unen a receptores o antígenos expresados en la superficie de la célula diana) se pueden administrar por vía sistémica.
Sin embargo, puede ser difícil alcanzar concentraciones intracelulares del oligonucleótido antisentido suficientes para suprimir la traducción en ARNm endógenos en ciertos casos. Por tanto, otro enfoque utiliza una construcción de ADN recombinante en la que el oligonucleótido antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol III o pol II. Por ejemplo, un vector se puede introducirin vivode modo que sea absorbido por una célula y dirija la transcripción de un ARN antisentido. Tal vector puede permanecer episómico o integrase en el cromosoma, siempre que se pueda transcribir para producir el ARN antisentido deseado. Tales vectores se pueden construir por métodos de tecnología de ADN recombinante estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmido, víricos u otros conocidos en la técnica, usados para replicación y expresión de células de mamífero.
La expresión de la secuencia que codifica el ARN antisentido puede ser por un promotor que se sabe en la técnica que actúa en células de mamífero, preferiblemente humanas. Tales promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Tales promotores incluyen, pero no están limitados a: la región promotora temprana de SV40(Nature290:304-310), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus del sarcoma de Rous(Cell22:787-797), el promotor de la timidina quinasa de herpes(Proc Natl Acad Sci78:1441-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína(Nature296:39-42), etc. Un tipo de plásmido, cósmido, YAC, o vector vírico se puede usar para preparar la construcción de ADN recombinante que se puede introducir directamente en el sitio del tejido. Alternativamente, se pueden usar vectores víricos que infectan selectivamente el tejido deseado, en cuyo caso la administración se puede lograr por otra vía (por ejemplo, por vía sistémica).
Células
Por tanto, en el presente documento se proporcionan células genéticamente modificadas que comprenden inserciones o deleciones (indels) en el genPLP1,por ejemplo, una deleción dirigida de secuencias de nucleótidos del exón 1 o 3 enPLP1,u otra(s) modificación(es) que inactivan o reducen la expresión dePLP1.Por ejemplo, la invención proporciona células genéticamente modificadas generadas por el método de la invención, en las que el producto del genPLP1endógeno se modifica usando un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige a PLP1. Las células preferiblemente producen mielina funcional, o es una célula progenitora de una célula productora de mielina. La célula en relación a la invención es una célula madre neuronal (NSC), una OPC, o un oligodendrocito. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la célula genéticamente modificada comprende una deleción dirigida de aproximadamente 80 nucleótidos en el extremo 5' del exón 3 enPLP1inactiva la expresión dePLP1.También se proporcionan, pero no forman parte de la invención reivindicada, células genéticamente modificadas en las que un elemento regulador dePLP1implicado en la transcripción o traducción dePLP1está modificado.
Las indels (inserciones o deleciones) típicamente se integran de una manera dirigida en el genoma de una célula usando una o más nucleasas. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, las indels se integran enPLP1,por ejemplo, para la inactivación del genPLP1.En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, las indels se generan como resultado de NHEJ u otro mecanismo de reparación después de la introducción de roturas bicatenarias (DSB) por nucleasas (por ejemplo, en el genPLP1o un elemento regulador del mismo). En otros ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, las indels se integraron en un locus genómico endógeno asociado conPLP1,por ejemplo, un elemento regulador genético dePLP1tal como un potenciador o un promotor. En cualquiera de las células descritas en el presente documento, la integración puede ser en un exón y/o un intrón (por ejemplo, el exón 1 o 3 dePLP1).
A diferencia de la integración y deleción aleatoria, la integración o deleción dirigida asegura que la indel se integra en un gen específico. La indel se puede integrar en cualquier parte del gen diana. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la indel o la secuencia donante se integra en o cerca del sitio de corte de la nucleasa, por ejemplo, a 1-3000 (o cualquier valor entre ellos) pares de bases antes o después del sitio de corte, más preferiblemente a 1-1000 pares de bases (o cualquier valor entre ellos) en cualquier lado del sitio de corte de la nucleasa, o a 1-500 pares de bases (o cualquier valor entre ellos), o a 1-100 pares de bases (o cualquier valor entre ellos) en cualquier lado del sitio de corte de la nucleasa. En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la secuencia integrada que comprende un transgén donante no incluye ninguna secuencia del vector (por ejemplo, secuencias del vector vírico).
Cualquier tipo de célula se puede modificar genéticamente como se describe en el presente documento para que comprenda una secuencia que inactive o reduzca la expresión dePLP1,incluyendo, pero no limitado a células y líneas celulares. Otros ejemplos no limitantes de células como se describen en el presente documento incluyen cigotos, células madre neuronales (NSC), células progenitoras de oligodendrocitos (OPC), células neuronales, y células de glía tal como oligodendrocitos, astrocitos, células ependimales, o células de microglía. Ejemplos adicionales no limitantes de células como se describen en el presente documento incluyen células madre autólogas (derivadas del paciente) o heterólogas (alogénicas) pluripotentes, totipotentes o multipotentes (por ejemplo, células madre embrionarias o similares). En ciertas formas de realización, las células como se describen en el presente documento son OPC.
Las células como se describen en el presente documento son útiles en tratar y/o prevenir trastornos relacionados con mielina en un sujeto con el trastorno, por ejemplo, mediante terapiasex vivo.Las células modificadas con nucleasas se pueden expandir y después reintroducir en el paciente usando técnicas estándar. Véase, por ejemplo, Tebaset al.(2014)New Eng J Med370(10):901. En el caso de células madre, después de la infusión en el sujeto, la diferenciaciónin vivode estos precursores a células que expresan elPLP1inactivado también se produce. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la célula como se describe en el presente documento. Además, las células se pueden crioconservar antes de la administración al paciente.
Las células y métodosex vivocomo se describen en el presente documento proporcionan tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con mielina en un sujeto y eliminan la necesidad de administración farmacéutica profiláctica continua o terapias con riesgo. Como tal, la invención descrita en el presente documento proporciona una manera más segura, económica y eficiente en cuanto al tiempo de tratar y/o prevenir trastornos relacionados con mielina.
Administración
Las nucleasas, los polinucleótidos que codifican estas nucleasas, polinucleótidos donantes y composiciones que comprenden las proteínas, oligonucleótidos y/o polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden administrar por cualquier medio adecuado. En ciertas formas de realización, los donantes se administranin vivo.En otras formas de realización, los donantes se administran a células aisladas (por ejemplo, células madre autólogas o heterólogas) para la provisión de células modificadas útiles en la administraciónex vivoa pacientes de trastornos relacionados con mielina.
Los métodos de administrar nucleasas como se describen en el presente documento se describen, por ejemplo, en las patentes en EE UU No. 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.
Las nucleasas y/o las construcciones donantes como se describen en el presente documento también se pueden administrar usando cualquier mecanismo de administración de ácidos nucleicos, incluyendo ADN y/o<a>R<n>(por ejemplo, ARNm) desnudos y vectores que contienen secuencias que codifican uno o más de los componentes. Cualquier sistema de vectores se puede usar incluyendo, pero no limitado a, vectores plásmidos, minicírculos de ADN, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos, vectores poxvíricos; vectores de herpesvirus y vectores de virus adenoasociados, etc., y combinaciones de los mismos. Véase, también, las patentes en E<e>UU No.
6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824, y la solicitud de patente en EE UU con número de serie 14/271.008. Además, será aparente que cualquiera de estos sistemas puede comprender una o más de las secuencias necesarias para el tratamiento. Por tanto, cuando una o más nucleasas y una construcción donante se introducen en la célula, las nucleasas y/o el polinucleótido donante se puede transportar en el mismo sistema de administración o en diferentes mecanismos de administración. Cuando se usan múltiples sistemas, cada mecanismo de administración puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples nucleasas y/o construcciones donantes (por ejemplo, ARNm que codifica una o más nucleasas y/o ARNm o AAV que portan una o más construcciones donantes).
Los vectores adecuados pueden incluir vectores de administración que son no integradores, no inmunógenos, y capaces de infectar células tanto en división como quiescentes. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la administraciónin vivode la nucleasa Cas9 y ARNgu puede estar mediada por un vector de virus adenoasociado (AAV). Los vectores AAV para la administraciónin vivoincluyen serotipos de AAV que tienen la capacidad de penetrar el sistema nervioso central e infectar tipos celulares gliales que producen mielina del sistema nervioso central (oligodendrocitos, OPC, NPC, etc.) del sujeto. En un ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, se emplean vectores AVV para la administraciónin vivode una nucleasa Cas9 (por ejemplo, una nucleasa SaCas9 o SpCas9). En ciertos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, la nucleasa SaCas9 y un ARNgu están empaquetados en un vector AAV para la alteración genética mediada por nucleasas dePLP1en células. Véanse detalles adicionales posteriormente.
Se pueden usar métodos de transferencia génica víricos y no víricos convencionales para introducir ácidos nucleicos que codifican las nucleasas y construcciones donantes en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Los sistemas de administración de vectores no víricos incluyen plásmidos de ADN, minicírculos de ADN, ácido nucleico desnudo, nanopartículas lipídicas (LNP), nanopartículas de poli-lactato-ácido glicólico, agentes acomplejantes de poliamina, o poloxámero. Los sistemas de administración de vectores víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas o bien episómicos o integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase, Anderson, Sc/ence256:808-813 (1992); Nabel & Felgner,TIBTECH11:211-217(1993); Mitani & Caskey,TIBTECH11:162-166(1993); Dillon,TIBTECH11:167-175 (1993); Miller,Nature357:455-460 (1992); Van Brunt,B/otechnology6(10):1149-1154 (1988); Vigne,Restorat/ve Neurology and Neurosc/ence8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet,Br/t/sh Medical Bullet/n51(1):31-44 (1995); Haddadaet al.,enCurrent Top/cs in M/crob/ology and ImmunologyDoerfler y Bohm (eds.) (1995); y Yuet al., Gene Therapy1:13-26(1994).
Los métodos de administración no vírica de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, ARN desnudo, ARN con caperuza, viriones artificiales, y absorción de ADN aumentada por agente. La sonoporación usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) también se puede usar para la administración de ácidos nucleicos.
Los sistemas de administración de ácidos nucleicos ejemplares adicionales incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Md.), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, Mass.) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase, por ejemplo, la patente en EE UU No. 6.008.336). La lipofección se describe, por ejemplo, en las patentes en EE UU No. 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección por reconocimiento de receptor de polinucleótidos incluyen los de Felgner, documentos WO 91/17424, WO 91/16024. En algunos ejemplos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, las nucleasas se administran como ARNm (por ejemplo, usando electroporación) y el transgén se administra a través de otras modalidades tal como vectores víricos, minicírculo de ADN, ADN de plásmido, ADN monocatenario, ADN lineal, liposomas, nanopartículas y similares.
La preparación de complejos lípido:ácido nucleico, incluyendo liposomas dirigidos tal como complejos inmunolipídicos, es bien conocida para un experto en la materia (véase, por ejemplo, Crystal,Sc/ence270:404-410 (1995); Blaeseet al., Cancer GeneTher.2:291-297 (1995); Behret al., B/oconjugate Chem.5:382-389 (1994); Remyet al., B/oconjugate Chem.5:647-654 (1994); Gaoet al., Gene Therapy2:710-722 (1995); Ahmadet al., Cancer Res.52:4817-4820 (1992); patentes en EE UU No. 4.186.183. 4.217.344. 4.235.871. 4.261.975. 4.485.054. 4.501.728. 4.774.085. 4.837.028. y 4.946.787).
Los métodos adicionales de administración incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos que se van a administrar en vehículos de administración de EnGenIC (EDV). Estos EDV se administran específicamente a tejidos diana usando anticuerpos biespecíficos donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad para el tejido diana y el otro tiene especificidad para el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana y el e Dv se introdujo en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, los contenidos se liberan (véase, MacDiarmidet al.(2009)Nature B/otechnology27(7):643).
El uso de sistemas víricos basados en ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos que codifican sistemas CRISPR/Cas manipulados, o que codifican una construcción de ARNi que puede producir ARNip, ARNhc o miARN dentro de la célula diana, se aprovecha de procesos muy evolucionados para dirigir un virus a células específicas en el cuerpo y el trafico de la carga útil vírica al núcleo. Los vectores víricos se pueden administrar directamente a los sujetos(/n v/vo)o se pueden usar para tratar células/n v/troy las células modificadas se administran a los sujetos(ex v/vo).Los sistemas víricos convencionales para la administración de sistemas CRISPR/Cas incluyen, pero no están limitados a, vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, de virus adenoasociados, vaccinia y herpes simple para transferencia génica. La integración en el genoma huésped es posible con métodos de transferencia génica de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, que con frecuencia producen expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado altas eficacias de transducción en muchos tipos celulares y tejidos diana diferentes.
El tropismo de un retrovirus se puede alterar incorporando proteínas de envuelta exógenas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivíricos son vectores retrovíricos que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen altos títulos víricos. La selección de un sistema de transferencia génica retrovírico depende del tejido diana. Los vectores retrovíricos están compuestos de repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento para hasta 6-10 kb de secuencia exógena. Las LTR que actúan en cis mínimas son suficientes para la replicación y empaquetamiento de los vectores, que después se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar expresión del transgén permanente. Los vectores retrovíricos ampliamente usados incluyen los basados en virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Buchscheret al., J. Virol.
66:2731-2739 (1992); Johannet al., J. Virol.66:1635-1640 (1992); Sommerfeltet al., Virol.176:58-59 (1990); Wilsonet al., J.Virol.63:2374-2378 (1989); Milleret al., J. Virol.65:2220-2224 (1991); documento PCT/US94/05700).
Los vectores basados en adenovirus son capaces de una eficacia de transducción muy alta en muchos tipos celulares y no requieren división celular. Con tales vectores, se han obtenido altos títulos y altos niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente sencillo. Los vectores de virus adenoasociados (“AAV”) también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producciónin vitrode ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génicain vivoyex vivo(véase, por ejemplo, Westet al., Virology160:38-47 (1987); patente en EE UU No. 4.797.368; documento WO 93/24641; Kotin,Human Gene Therapy5:793-801 (1994); Muzyczka, J.Clin. Invest.94:1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en un número de publicaciones, incluyendo la patente en EE UU No. 5.173.414; Tratschinet al., Mol. Cell. Biol.5:3251-3260 (1985); Tratschin,et al., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS81:6466-6470 (1984); y Samulskiet al., J. Virol.63:03822-3828 (1989). Cualquier serotipo de AAV se puede usar, incluyendo AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 y AAV8, AAV 8.2, AAV9, y AAV rh10 y AAV pseudotipados tal como AAV2/8, AAV2/5 y AAV2/6. Los vectores adenovíricos adicionales incluyen variantes de AAV que transducen de forma eficaz y amplia el sistema nervioso central (SNC) de mamíferos después de la inyección intravenosa tal como los vectores AAV-PHPB descritos en Devermanet al.(2016)Nature Biotechnology204-209.
Al menos seis enfoques de vectores víricos están actualmente disponibles para la transferencia génica en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores deficientes por genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente de transducción.
pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovíricos que se han usado en ensayos clínicos (Dunbaret al., Blood85:3048-305 (1995); Kohnet al., Nat. Med.1:1017-102 (1995); Malechet al., PNAS94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica. (Blaeseet al., Science270:475-480 (1995)). Se han observado eficacias de transducción del 50% o más para vectores empaquetados en MFG-S. (Ellemet al., Immunol Immunother.44(1):10-20 (1997); Dranoffet al., Hum. Gene Ther.1:111-2 (1997).
Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) son un sistema de administración génica alternativo prometedor basados en virus adenoasociado de tipo 2 a parvovirus no patógeno. Todos los vectores derivan de un plásmido que retiene solo las repeticiones terminales invertidas de 145 pares de bases (pb) de AAV flanqueando el casete de expresión del transgén. La transferencia génica eficaz y administración del transgén estable debido a la integración en los genomas de las células transducidas son características clave de este sistema de vectores. (Wagneret al., Lancet351:91171702-3 (1998), Kearnset al., Gene Ther.9:748-55 (1996)). Otros serotipos de AAV, incluyendo AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AaV6, AAV8, AAV9 y AAVrh10, y todas las variantes de los mismos incluyendo mutantes manipulados seleccionados de genotecas, también se pueden usar según la presente invención.
Los vectores adenovíricos (Ad) recombinantes deficientes en replicación se pueden producir a alto título e infectan fácilmente un número de diferentes tipos celulares. La mayoría de los vectores de adenovirus se manipulan de modo que el transgén sustituya a los genes E1a, E1b y/o E3 de Ad; posteriormente el vector deficiente en replicación se propaga en células 293 humanas que suministran la función del gen delecionado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidosin vivo, incluyendo células que no se dividen, diferenciadas tal como las encontradas en el hígado, riñón y músculo. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad portadora. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó terapia de polinucleótidos para inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Stermanet al., Hum. Gene Ther.7:1083-9 (1998)). Los ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para transferencia génica en ensayos clínicos incluyen Roseneckeret al., Infection24:1 5-10 (1996); Stermanet al., Hum. Gene Ther.9:71083-1089 (1998); Welshet al., Hum. Gene Ther.2:205-18 (1995); Alvarezet al., Hum. Gene Ther.5:597-613 (1997); Topfet al., Gene Ther.5:507-513 (1998); Stermanet al., Hum. Gene Ther.
7:1083-1089 (1998).
Se usan células de empaquetamiento para formar partículas víricas que son capaces de infectar una célula huésped. Tales células incluyen células 293, que empaquetan adenovirus y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores víricos usados en terapia génica habitualmente se generan mediante una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula vírica. Los vectores típicamente contienen las secuencias víricas mínimas requeridas para empaquetamiento y posterior integración en un huésped (si es aplicable), otras secuencias víricas se sustituyen por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones víricas que faltan se suministran en trans por la línea celular empaquetadora. Por ejemplo, los vectores AAV usados en terapia génica típicamente solo poseen secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) del genoma de AAV que se requieren para empaquetamiento e integración en el genoma huésped. El ADN vírico se empaqueta en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, es decir, rep y cap, pero que carece de las secuencias ITR. La línea celular también se infecta con adenovirus como un auxiliar. El virus auxiliar fomenta la replicación del vector AAV y la expresión de los genes de AAV del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no se empaqueta en cantidades significativas debido a una falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir, por ejemplo, por tratamiento con calor al que el adenovirus es más sensible que AAV.
En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica se administre con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. Según esto, un vector vírico se puede modificar para que tenga una especificidad para un tipo celular determinado expresando un ligando tal como una proteína de fusión con una proteína de cubierta vírica en la superficie externa del virus. El ligando se elige para que tenga afinidad para un receptor que se sabe está presente en el tipo celular de interés. Por ejemplo, Hanet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:9747-9751 (1995), describió que el virus de la leucemia murina de Moloney se puede modificar para expresar heregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresa el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio se puede extender a otros pares de virus-células diana, en el que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de superficie celular. Por ejemplo, un fago filamentoso se puede manipular para que muestre fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica para virtualmente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior aplica principalmente a vectores víricos, los mismos principios se pueden aplicar a vectores no víricos. Tales vectores se pueden manipular para que contengan secuencias de absorción específicas que favorecen la absorción por células diana específicas.
Los vectores de terapia génica se pueden administrarin vivopor administración a un sujeto individual, típicamente por administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, sublingual o intracraneal) aplicación tópica, como se describe posteriormente, o a través de inhalación pulmonar. Alternativamente, los vectores se pueden administrar a las célulasex vivo,tal como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, OPC) o células madre neurales de un donante universal, seguido por la reimplantación de las células en un paciente, habitualmente después de selección para células que han incorporado el vector.
Los vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, AAV, liposomas, etc.) que contienen nucleasas y/o construcciones donantes también se pueden administrar directamente a un organismo para transducción de las célulasin vivo.Alternativamente, se puede administrar ADN desnudo. La administración es por cualquiera de las rutas normalmente usadas para introducir una molécula en contacto final con células de glía incluyendo, pero no limitado a, inyección, infusión, aplicación tópica, inhalación y electroporación. Los métodos adecuados de administrar tales ácidos nucleicos están disponibles y los conocen bien los expertos en la materia, y, aunque se puede usar más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular con frecuencia puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra ruta.
Los vectores adecuados para la introducción de los polinucleótidos descritos en el presente documento incluyen vectores lentivíricos no integrantes (IDLV). Véase, por ejemplo, Oryet al.(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:11382-11388; Dullet al.(1998)J. Virol.72:8463-8471; Zufferyet al.(1998)J. Viro.72:9873-9880; Follenziet al.(2000)Nature Genetics25:217-222; Publicación de la patente en e E UU No 2009/054985.
Los soportes farmacéuticamente aceptables están determinados en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Según esto, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles como se describe posteriormente (véase, por ejemplo,Remington's Pharmaceutical Sciences,17a ed., 1989).
Será aparente que las secuencias que codifican la nucleasa y las construcciones donantes se pueden administrar usando el mismo o diferentes sistemas. Por ejemplo, un polinucleótido donante puede ser portado por un AAV, mientras que la una o más nucleasas pueden ser portadas por ARNm. Además, los diferentes sistemas se pueden administrar por misma o diferentes rutas (inyección intramuscular, inyección en la vena de la cola, otra inyección intravenosa, administración intraperitoneal y/o inyección intramuscular. Se pueden administrar múltiples vectores simultáneamente o en cualquier orden secuencial.
Las formulaciones para la administración tantoex vivocomoin vivoincluyen suspensiones en líquidos o líquidos emulsionados. Los principios activos con frecuencia se mezclan con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares, y combinaciones de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tal como agentes humectantes o emulsionantes, agentes que regulan el pH, agentes estabilizantes u otros reactivos que potencian la eficacia de la composición farmacéutica.
Silenciamiento génico mediado por CRISPR/Cas administrado por AAV
También se divulga en el presente documento, pero sin formar parte de la presente invención un método de administrar el sistema CRISPR/Cas, incluyendo un ARN guía (ARNgu) que específicamente se dirige al genPLP1o elemento regulador del mismo, o una porción del mismo.
En un ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, este sistema puede emplear 2 vectores AVV, con un 3er vector AAV opcional: uno codifica Cas9 o un ortólogo funcional de la misma, uno que contiene la secuencia del ARN guía para el corte dirigido del genPLP1o elementos reguladores, y opcionalmente otro que contiene una secuencia de ADNc donante del genPLP1mutado (tal como una mutación puntual dePLP1)que se va a insertar en el sitio de corte con el fin de reparar o sustituir el genPLP1deficiente. Las proporciones de administración del donante respecto a la construcción de Cas9 pueden variar en el intervalo de cualquiera de 1:1 a 5:1.
En otro ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, este sistema puede emplear 2 vectores AVV: uno codifica un ortólogo de Cas9 de menos de 3,5 kb de longitud y tendrá el ARN guía codificado en cis, y un vector que contiene la secuencia de ADNc donante del genPLP1mutado que se va a insertar en el sitio de corte. Para diana mayor de 4,8 kb, este donante puede contener o bien la porción 3' del ADNc del gen hasta 4,8 kb que permite la corrección antes de la mayoría del gen mutado, o el promotor 5' y porción de ADNc anterior del gen, que después se somete a ayuste para corregir la secuencia posterior.
En un ejemplo adicional divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, este sistema empleará 2 vectores AVV: uno codifica una Cas9 o un ortólogo funcional, y uno contiene una secuencia de ARN guía específica para el corte de un gen diana.
En aun otro ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, este sistema empleará un vector AVV, el vector comprende un ácido nucleico que codifica una CRISPR-Cas9 de tipo II funcional y un ARN guía específico para el corte de un gen diana (por ejemplo,PLP1).
En un ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, el método comprende proporcionar uno o más vectores AAV (típicamente 1,2 o 3 vectores AAV) que comprenden elementos de un sistema CRISPR, para unirse al gen diana para efectuar corte de dicho gen diana/polinucleótido, modificando de esta manera el gen diana, tal como alterando el gen diana o corrigiendo o sustituyendo todo o parte del gen diana con un ácido nucleico donante. Los elementos de dicho sistema CRISPR incluyen una enzima CRISPR, que puede estar en complejo con una secuencia de ARN guía, dicho ARN guía se puede hibridar a una secuencia diana en dicho gen diana.
El corte en el gen diana puede implicar cortar una o dos hebras por la enzima CRISPR. En algún ejemplo divulgado en el presente documento, pero que no forma parte de la invención reivindicada, un método incluye corregir o sustituir el gen diana cortado mediante la introducción de un ácido nucleico donante, ácido nucleico donante que codifica una proteína que corrige el gen diana mutado o deficiente.
Un gen Cas como se describe en el presente documento incluye, pero no está limitado a, Cas3 o Cas9. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. Los ortólogos pueden incluir Cas9 deStreptococcus pyogenes, Neisseria meningitidis, Streptococcus thermophilus, Streptococcus pneumnoniae, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Streptococcus mutans, Pasteurella multocida, Bifidobacterium longum, Bacillus smithii, Treponema denticola, mycoplasma canisyEnterococcus faecalis.Un Cas9 puede incluir Cas9 mutado derivado de estos organismos.
Los vectores AAV ejemplares incluyen secuencia de cápside de cualquiera de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV 8, AAV9, AAV10, AAV 11, Rh1O, Rh74 o AAV-2i8, o una variante de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh1O, Rh74 o AAV-2i8. Los vectores AAV recombinantes de la invención también incluyen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh1O, Rh74 o AAV-2i8, y variantes de los mismos.
Las variantes de cápside particulares incluyen variantes de cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh1O, Rh74 o AAV-2i8, tal como una secuencia de cápside con una sustitución, deleción o inserción/adición de aminoácidos.
Los vectores AAV pueden incluir elementos adicionales que funcionan enciso entrans.En formas de realización particulares, un vector AAV que incluye un genoma de vector también tiene: una o más secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean el extremo 5' o 3' de la secuencia donante; un elemento de control de la expresión que dirige la transcripción (por ejemplo, un promotor o potenciador) de la secuencia donante, tal como un elemento de control constitutivo o regulable, o elemento de control de expresión específico de tejido; una secuencia de intrón, una secuencia de polinucleótido staffer o relleno; y/o una secuencia de poliadenina localizada 3' de la secuencia donante.
Típicamente, los elementos de control de la expresión son secuencia(s) de ácido nucleico que influye(n) la expresión de un polinucleótido operativamente unido. Los elementos de control, incluyendo elementos de control de la expresión como se exponen en el presente documento tal como promotores y potenciadores, presentes en un vector se incluyen para facilitar la transcripción y traducción adecuadas del ácido nucleico (por ejemplo, un promotor, potenciador, señal de ayuste para intrones, mantenimiento del marco abierto de lectura correcto del gen para permitir la traducción en el mismo marco de lectura del ARNm y codones de terminación, etc.), y empaquetamiento de AAV. Tales elementos típicamente actúan encis,denominado un “elemento que actúa en cis”, pero también pueden actuar entrans.
El control de la expresión se puede efectuar al nivel de la transcripción, traducción, ayuste, estabilidad de mensaje, etc. Típicamente, un elemento de control de la expresión que modula la transcripción se yuxtapone cerca del extremo 5' (es decir, “antes”) de un ácido nucleico transcrito. Los elementos de control de la expresión también se pueden localizar en el extremo 3' (es decir, “después”) de la secuencia transcrita o en el transcrito (por ejemplo, en un intrón). Los elementos de control de la expresión pueden estar localizados adyacentes a o a una distancia lejos de la secuencia transcrita. Típicamente, debido a las limitaciones de longitud del polinucleótido de ciertos vectores, tal como los vectores AAV, tales elementos de control de la expresión estarán dentro de 1 a 1000 nucleótidos del ácido nucleico transcrito.
Un “promotor” como se usa en el presente documento está operativamente unido a una secuencia adyacente, y aumenta una cantidad expresada de un ácido nucleico en comparación a una cantidad expresada cuando el promotor no existe.
Un “potenciador” como se usa en el presente documento se localiza adyacente al ácido nucleico, típicamente localizado antes de un elemento promotor, pero también funciona y puede estar localizado después o dentro de una secuencia de ADN (por ejemplo, un ácido nucleico donante). Un elemento potenciador puede estar localizado 100 pares de bases, 200 pares de bases, o 300 o más pares de bases antes o después de un ácido nucleico. Los elementos potenciadores también típicamente aumentan la expresión de un ácido nucleico.
Los elementos de control de la expresión incluyen promotores/potenciadores ubicuos o promiscuos que son capaces de dirigir la expresión de un polinucleótido en muchos tipos celulares diferentes. Tales elementos incluyen, pero no están limitados a, las secuencias promotoras/potenciadoras inmediatas tempranas del citomegalovirus (CMV), las secuencias promotoras/potenciadoras del virus del sarcoma de Rous (RSV) y los otros promotores/potenciadores víricos activos en una variedad de tipos de células de mamífero, o elementos sintéticos que no están presentes en la naturaleza (véase, por ejemplo, Boshartet al,Cell, 41 :521-530 (1985)), el promotor del SV40, el promotor de la dihidrofolato reductasa (DHFR), el promotor de p-actina citoplásmica y el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK).
Los elementos de control también pueden incluir esos activos en un tejido o tipo celular particular, denominado en el presente documento “elementos de control de la expresión/promotores específicos de tejido”. Los elementos de control de la expresión específicos de tejido típicamente son activos en una célula o tejido específico (por ejemplo, ojo, retina, sistema nervioso central, médula espinal, ojo, retina, etc.). En ciertas formas de realización, los elementos de control de la expresión específicos de tejido son activos en el SNC, tal como células madre neuronales, OPC, oligodendrocitos, etc. En ciertas formas de realización, los elementos de control de la expresión específicos de tejido son activos en el cigoto o un huevo.
Los elementos de control de la expresión típicamente son activos en estas células, tejidos u órganos porque son reconocidos por proteínas activadoras transcripcionales, u otros reguladores de la transcripción, que son únicos a una célula, tejido o tipo de órgano específico.
Los elementos de control de la expresión también pueden conferir expresión de una manera que es regulable, es decir, una señal o estímulo aumenta o disminuye la expresión del ácido nucleico operativamente unido. Un elemento regulable que aumenta la expresión del ácido nucleico operativamente unido en respuesta a una señal o estímulo también se denomina un “elemento inducible” (es decir, es inducible por una señal). Los ejemplos particulares incluyen, pero no están limitados a, un promotor inducible por hormona (por ejemplo, esteroide). Un elemento regulable que disminuye la expresión del ácido nucleico operativamente unido en respuesta a una señal o estímulo se denomina un “elemento reprimible” (es decir, la señal disminuye la expresión de modo que cuando la señal se elimina o está ausente, la expresión aumenta). Típicamente, la cantidad de aumento o disminución conferida por tales elementos es proporcional a la cantidad de señal o estímulo presente; cuanto mayor sea la cantidad de señal o estímulo, mayor el aumento o disminución en la expresión.
Los elementos de control de la expresión también incluyen elemento(s) nativo(s). Un elemento de control nativo (por ejemplo, promotor) se puede usar cuando se desea que la expresión del ácido nucleico pueda imitar la expresión nativa. Un elemento nativo se puede usar cuando la expresión del ácido nucleico se va a regular temporalmente o según el desarrollo, o de una manera específica de tejido o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. Otros elementos de control de expresión nativos, tal como intrones, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak también se pueden usar.
Los vectores AAV también pueden incluir una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer. Por ejemplo, donde un ácido nucleico donante tiene una longitud menor que aproximadamente 4,7 kb, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer tiene una longitud que, cuando se combina con el ácido nucleico donante, la longitud combinada total está entre aproximadamente 3,0-5,5 kb, o entre aproximadamente 4,0-5,0 kb, o entre aproximadamente 4,3-4,8 kb.
Las secuencias de polinucleótido de relleno o staffer se pueden localizar en la secuencia del vector en cualquier posición deseada de modo que no prevenga una función o actividad del vector. En un ejemplo, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer se coloca entre una ITR 5' y/o 3' (por ejemplo, una ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh1O, Rh74 o AAV-2Í8, y variantes de las mismas) que flanquea el respectivo extremo 5' y/o 3' de una secuencia de ácido nucleico donante.
Típicamente, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer es inerte o inocua y no tiene función o actividad. En varios ejemplos particulares, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer no es una secuencia de polinucleótidos bacteriana, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer no es una secuencia que codifique una proteína o un péptido, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer es una secuencia distinta de cualquiera de: la secuencia donante, un secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, un elemento de control de la expresión, o una secuencia de señal de poliadenilación (poli-A). En varios ejemplos particulares, una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer es una secuencia intrónica que está relacionada con o sin relacionar con la secuencia donante.
Un intrón también puede funcionar como una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer con el fin de alcanzar una longitud para el vector AAV que se empaqueta en una partícula vírica. Los intrones y los fragmentos de intrones (por ejemplo, porción del intrón I de FIX) que funcionan como una secuencia de polinucleótido de relleno o staffer también pueden aumentar la expresión. La inclusión de un elemento intrónico puede aumentar la expresión en comparación con la expresión en ausencia del elemento intrónico (Kurachiet al.,1995, supra).
El uso de intrones no está limitado a una secuencia genómica natural, y puede incluir intrones asociados con un gen completamente diferente u otra secuencia de ADN. Según esto, otras regiones no traducidas (no codificantes de proteínas) del ácido nucleico, tal como intrones encontrados en secuencias genómicas de genes afines (relacionados) y genes no afines (no relacionados) también pueden funcionar como secuencias de polinucleótidos de relleno o staffer según la invención.
Los ácidos nucleicos donantes, elementos de control de la expresión, ITR, secuencias de poli A, secuencias de polinucleótidos de relleno o staffer pueden variar en longitud. En ejemplos particulares, una secuencia entre 1-10, 10 20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750 1.000, 1.000-1.500, 1.500-2.000, 2.000-2.500, 2.500-3.000, 3.000-3.500, 3.500-4.000, 4.000-4.500, 4.500-5.000 o más nucleótidos de longitud hasta el límite del límite de tamaño de empaquetamiento de AAV.
El sistema CRISPR/Cas incluyendo la secuencia codificante de Cas9 y el ARNgu se puede introducir/transferir/transducir/transfectar en la célula diana por medio del vector AAV. Los términos “transducir” y “transfectar” se refieren a la introducción de una molécula tal como un ácido nucleico en una célula u organismo huésped. Según esto, una célula transducida (por ejemplo, en un mamífero, tal como una célula o tejido o célula de órgano), significa un cambio genético en una célula después de la incorporación de una molécula exógena, por ejemplo, un polinucleótido o proteína (por ejemplo, un transgén) en la célula. Por tanto, una célula “transducida” es una célula en la que, o una progenie de la misma en la que una molécula exógena se ha introducido. En métodos y usos de la invención, una célula transducida puede estar en un sujeto, por ejemplo,in vivooex vivo.
Los métodos y usos divulgados en el presente documento, pero que no forman parte de la invención reivindicada, proporcionan un medio para administrar (transducir) CRISPR/Cas/ARNgu y opcionalmente ácido nucleico donante (transgenes) a células huésped, incluyendo células en división y/o que no se dividen. Los vectores AAV, métodos, usos y formulaciones farmacéuticas de la invención son además útiles en un método de suministrar, administrar o proporcionar un ácido nucleico, o proteína a un sujeto en necesidad de ello como un método de tratamiento. De esta manera, el ácido nucleico se transcribe y la proteína se puede producirin vivoen un sujeto. El sujeto se puede beneficiar de o estar necesidad del ácido nucleico o proteína porque el sujeto tiene una deficiencia del ácido nucleico o proteína, o porque la producción del ácido nucleico o proteína en el sujeto puede impartir algún efecto terapéutico, como un método de tratamiento u otra cosa.
En varias formas de realización, los vectores AAV se administran a la célula eucariota en un sujeto. Los sujetos típicamente son animales e incluyen aplicaciones humanas y veterinarias. Los sujetos adecuados, por tanto, incluyen mamíferos, tal como seres humanos, así como mamíferos no humanos (por ejemplo, primates). Otros sujetos incluyen primates (monos, gibones, gorilas, chimpancés, orangutanes, macacos), un animal doméstico (perros y gatos), un animal de granja (aves de corral tal como pollos y patos, caballos, vacas, cabras, ovejas, cerdos), y animales de experimentación (ratón, rata, conejo, cobaya). Los sujetos humanos incluyen sujetos fetales, neonatales, infantiles, juveniles y adultos. Por ejemplo, el sujeto puede ser un humano más joven de 20 años, 15 años, 10 años, 5 años, 3 años, 2 años, 1 año, 6 meses, 3 meses o 1 mes. Los sujetos también pueden incluir modelos de enfermedad en animales, por ejemplo, ratón y otros modelos animales de enfermedades de coagulación de la sangre y otras que conocen los expertos en la materia.
Los sujetos apropiados para el tratamiento incluyen los que tienen o están en riesgo de producir una cantidad insuficiente o tienen una deficiencia en un producto génico funcional (proteína), o producen un producto génico (proteína) anómalo, parcialmente funcional o no funcional, que puede producir enfermedad. En formas de realización particulares, un sujeto que se beneficiaría de o está en necesidad de alterar, corregir o sustituir un gen deficiente (por ejemplo,PLP1),o está en necesidad de perturbar, corregir o sustituir un gen que codifica una proteína que tiene función o actividad deficiente o parcial.
Un efecto terapéutico o beneficioso de tratamiento es, por tanto, cualquier mejora medible o detectable objetiva o subjetiva o beneficio proporcionado a un sujeto particular. Un efecto terapéutico o beneficioso puede, pero no necesita ser ablación completa de todo o cualquier síntoma adverso particular, trastorno, malestar, o complicación de una enfermedad. Por tanto, un punto final clínico satisfactorio se alcanza cuando hay una mejora incremental o una reducción parcial en un síntoma adverso, trastorno, malestar, o complicación causado por o asociado con una enfermedad, o una inhibición, disminución, reducción, supresión, prevención, límite o control de empeoramiento o evolución de uno o más síntomas adversos, trastornos, malestares, o complicaciones causados por o asociados con la enfermedad, durante una duración corta o larga (horas, días, semanas, meses, etc.).
La dosis para alcanzar un efecto terapéutico, por ejemplo, la dosis en genomas en el vector/por kilogramo de peso corporal (gv/kg), variará basado en varios factores incluyendo, pero no limitados a: la ruta de administración, la expresión de ácido nucleico requerida para alcanzar un efecto terapéutico, la enfermedad específica tratada, cualquier respuesta inmunitaria del huésped al vector, y la estabilidad de la proteína expresada. Un experto en la materia puede determinar un intervalo de dosis rAAV/genoma en el vector para tratar un paciente que tiene una enfermedad o trastorno particular basado en los factores anteriormente mencionados, así como otros factores.
La administración o suministroin vivoa un sujeto se puede realizar antes del desarrollo de un síntoma adverso, afección, complicación, etc., causado por o asociado con la enfermedad. Por ejemplo, se puede usar un cribado (por ejemplo, genético) para identificar tales sujetos como candidatos para composiciones, métodos y usos de la invención. Tales sujetos, por tanto, incluyen los cribados positivos para una cantidad insuficiente o una deficiencia en un producto génico (proteína) funcional, o que produce un producto génico (proteína) anómalo, parcialmente funcional o no funcional.
Los métodos de administración o suministro incluyen cualquier modo compatible con un sujeto. Los métodos y usos de la invención incluyen suministro y administración por vía sistémica, regional o local, o por cualquier ruta, por ejemplo, por inyección o infusión. Tal suministro y administración incluye por vía parenteral, por ejemplo, intraocular, intravascular, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, o transmucosa. Las rutas de administración y suministro ejemplares incluyen intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intraarterial, subcutánea, intrapleural, intubación, intrapulmonar, intracavidad, iontoforética, intraórgano, intralinfática. En formas de realización particulares, un vector AAV se administra o suministra por vía parenteral, tal como por vía intravenosa, intraarterial, intraocular, intramuscular, subcutánea, o a través de catéter o intubación.
Las dosis pueden variar y dependen de si el tipo, inicio, evolución, gravedad, frecuencia, duración o probabilidad de la enfermedad a la que se dirige el tratamiento, el punto final clínico deseado, tratamientos previos o simultáneos, la salud general, edad, sexo, raza o competencia inmunológica del sujeto y otros factores que apreciará el experto en la materia. La cantidad de dosis, número, frecuencia o duración se puede aumentar o reducir proporcionalmente, según indique cualquier efecto secundario adverso, complicación u otro factor de riesgo del tratamiento o terapia y el estado del sujeto. El experto en la materia apreciará los factores que pueden influir la dosis y cadencia requeridas para proporcionar una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico o profiláctico.
Los vectores AAV objeto, y otras composiciones, se pueden incorporar a composiciones farmacéuticas, por ejemplo, un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles para, entre otras cosas, la administración y suministro a un sujetoin vivooex vivo.
Como se usa en el presente documento el término “farmacéuticamente aceptable” y “fisiológicamente aceptable” significan una formulación biológicamente aceptable, gaseosa, líquida o sólida, o mezclas de la mismas, que es adecuada para una o más vías de administración, suministroin vivoo contacto. Una composición “farmacéuticamente aceptable” o “fisiológicamente aceptable” es un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, por ejemplo, el material se puede administrar a un sujeto sin producir efectos biológicos indeseables sustanciales. Por tanto, tal composición farmacéutica se puede usar, por ejemplo, en administrar un vector vírico o partícula vírica a un sujeto.
Tales composiciones incluyen solventes (acuosos o no acuosos), soluciones (acuosas o no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua o agua en aceite), suspensiones, jarabes, elixires, medios de dispersión y suspensión, recubrimientos, agentes isotónicos y que fomentan o retrasan la absorción, compatibles con la administración farmacéutica o contactoin vivoo suministro. Los solventes, soluciones y suspensiones acuosas y no acuosas pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Tales soportes farmacéuticamente aceptables incluyen comprimidos (recubiertos o sin recubrir), cápsulas (duras o blandas), microperlas, polvo, gránulos y cristales. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios (por ejemplo, conservantes, agentes antibacterianos, antivíricos y antifúngicos) en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular para ser compatibles con una ruta de administración o suministro particular, como se expone en el presente documento o sabe un experto en la materia. Por tanto, las composiciones farmacéuticas incluyen soportes, diluyentes, o excipientes adecuados para la administración por varias rutas.
Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas y no acuosas del compuesto activo, preparaciones que son típicamente estériles y pueden ser isotónicas con la sangre del receptor previsto. Los ejemplos ilustrativos no limitantes incluyen agua, solución salina, dextrosa, fructosa, etanol, aceites animales, vegetales o sintéticos.
Se pueden añadir cosolventes y adyuvantes a la formulación. Los ejemplos no limitantes de cosolventes contienen grupos hidroxilo u otros grupos, por ejemplo, alcoholes, tal como alcohol isopropílico; glicoles, tal como propilenglicol, polietilenglicol, polipropilenglicol, glicol éter; glicerol; alcoholes polioxietileno y ésteres de ácidos grasos de polioxietileno. Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, tensioactivos tal como lecitina de soja y ácido oleico; ésteres sorbitanos tal como trioletato sorbitano; y polivinilpirrolidona.
Las composiciones farmacéuticas y sistemas de administración apropiados para las composiciones, métodos y usos de la invención se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003) 20a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel y Stoklosa, Pharmaceutical Calculations (2001) 11a ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; y Poznanskyet al,Drug Delivery Systems (1980), R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y, pp. 253-315).
Una “forma posológica unitaria” como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada opcionalmente en asociación con un soporte (excipiente, diluyente, vehículo o agente de relleno) farmacéutico que, cuando se administra en una o más dosis, está calculada para producir un efecto deseado (por ejemplo, efecto profiláctico o terapéutico). Las formas posológicas unitarias pueden estar en, por ejemplo, ampollas y viales, que pueden incluir una composición líquida o una composición en un estado liofilizado; un soporte líquido estéril, por ejemplo, se puede añadir antes de la administración o suministroin vivo.Las formas posológicas unitarias individuales pueden estar incluidas en kits o envases multidosis. Los vectores AAV, y composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden embalar en forma posológica unitaria única o múltiple para facilidad de administración y uniformidad de dosis.
El sistema de administración de AAV descrito en el presente documento se puede adaptar fácilmente para administrar a una célula diana (por ejemplo, una OPC o NSC, ya seain vitro, in vivooex vivo)otras nucleasas (tal como TALEN o ZFN) o construcciones de ARNi (que codifican y producen ARNip funcional una vez dentro de la célula diana) o construcciones ASO (que codifican y producen oligos antisentido funcionales).
Aplicaciones
Los métodos y las composiciones divulgadas en el presente documento son para proporcionar terapias celulares para trastornos relacionados con mielina. La célula se puede modificarin vivoo se puede modificarex vivoy posteriormente administrar a un sujeto. En algunas formas de realización, las NSC, OPC y oligodendrocitos se editaríanin situ.En algunas formas de realización, las células se modificaríanex vivoy trasplantarían a pacientes.
El uso de las células propias del paciente elimina el requisito de coincidencia de HLA entre el donante y receptor para el trasplante. Además, se ha mostrado que las células genéticamente modificadas descritas en el presente documento son adecuadas para trasplantes en serie (secundarios) en que células madre se pueden aislar del sujeto y estas células retienen la modificación genética y se pueden administrar a uno o más sujetos adicionales. Por tanto, los métodos y las composiciones proporcionan el tratamiento y/o la prevención de un trastorno relacionado con mielina.
Como se divulga en el presente documento, pero sin formar parte de la invención reivindicada, la deleción dirigida dePLP1,una porción dePLP1,o un elemento regulador dePLP1se puede usar para corregir un gen anómalo, crear una mutación de pérdida de función en un gen endógeno, o cambiar la expresión de un gen endógeno. También se divulga en presente documento, pero sin formar parte de la invención reivindicada, la integración dirigida de un donante anti-PLP1 de unPLP1o una secuencia de nucleótidos de elemento regulador genético dePLP1se puede usar para corregir un gen anómalo, insertar un gen de tipo salvaje, crear una mutación de ganancia de función en un gen endógeno o cambiar la expresión de un gen endógeno. Por ejemplo, un transgén que codifica unPLP1o un transgén de elemento regulador genético dePLP1se puede integrar en una célula para proporcionar una célula (por ejemplo, oligodendrocito o un progenitor) que produce una proteína no nociva capaz de aumentar la producción de mielina funcional. La inactivación dirigida o silenciamiento génico dePLP1o un elemento regulador genético dePLP1,o la modificación por los métodos descritos en el presente documento puede proporcionar una célula que aumenta la producción de mielina funcional al reducir la toxicidad dePLP1mediante inactivación del genPLP1.La edición genética también puede incluir la corrección o introducción de mutaciones (por ejemplo, mutaciones puntuales) en un gen endógeno, por ejemplo, para modificar la expresión del genPLP1endógeno.
Las composiciones (por ejemplo, células y/o nucleótidos) descritas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto para tratar enfermedades y trastornos relacionados con mielina. Las enfermedades y trastornos relacionados con mielina contemplados para tratamiento por algunos aspectos de la presente invención pueden incluir cualquier enfermedad, afección (por ejemplo, las que se producen por lesión traumática de la médula espinal e infarto cerebral), o trastorno relacionado con la desmielinización, mielinización insuficiente y remielinización, o dismielinización en un sujeto. Un trastorno relacionado con mielina como se usa en el presente documento puede surgir de un trastorno relacionado con mielina o desmielinización resultante de una variedad de lesiones neurotóxicas. “Desmielinización” como se usa en el presente documento, se refiere al acto de desmielinizar, o la pérdida de la vaina de mielina en los nervios, y es el sello de algunas enfermedades autoinmunitarias neurodegenerativas incluyendo esclerosis múltiple, mielitis transversa, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, y síndrome de Guillain-Barre. Las leucodistrofias están producidas por deficiencias enzimáticas heredadas, que producen formación anómala, destrucción, y/o recambio anormal de las vainas de mielina en la materia blanca del<s>N<c>. Los trastornos de mielina tanto adquiridos como heredados comparten un mal pronóstico que produce discapacidad principal. Por tanto, algunas formas de realización de la presente invención pueden incluir métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias neurodegenerativas en un sujeto. La remielinización de las neuronas requiere oligodendrocitos. El término “remielinización”, como se usa en el presente documento, se refiere a la regeneración de la vaina de mielina del nervio sustituyendo las células productoras de mielina o restableciendo su función.
Las enfermedades o trastornos relacionados con mielina que se pueden tratar o aliviar por los métodos de la presente invención incluyen enfermedades, trastornos o lesiones que se refieren a la dismielinización o desmielinización en las células cerebrales de un sujeto, por ejemplo, neuronas del SNC. Tales enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, enfermedades y trastornos en los que la mielina que rodea la neurona o está ausente, incompleta, no formada apropiadamente, o se está deteriorando. Tales enfermedades incluyen, pero no están limitadas a, esclerosis múltiple (Em ), neuromielitis óptica (NMO), leucoencefalopatía multifocal progresiva (PML), encefalomielitis (EPL), mielolisis de pontino central (CPM), adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus Merzbacher (PMD), degeneración walleriana, neuritis óptica, mielitis transversa, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, lesión cerebral traumática, lesión posradiación, complicaciones neurológicas de quimioterapia, ictus, neuropatía óptica isquémica aguda, deficiencia en vitamina E, síndrome de deficiencia en vitamina E aislado, RA, síndrome de Bassen-Kornzweig, síndrome de Marchiafava-Bignami, leucodistrofia metacromática, neuralgia del trigémino, encefalitis diseminada aguda, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Marie-Charcot-Tooth y parálisis de Bell.
Las enfermedades o trastornos relacionados con mielina que se pueden tratar o aliviar por los métodos de la presente invención incluyen una enfermedad o trastorno caracterizado por una deficiencia en mielina. La mielinización insuficiente en el sistema nervioso central se ha implicado en una amplia gama de trastornos neurológicos. Entre estos están formas de parálisis cerebral en la que una deficiencia congénita en la mielinización del prosencéfalo en niños con leucomalacia periventricular, contribuye a la morbilidad neurológica (Goldmanet al.,2008) Goldman, S. A., Schanz, S., y Windrem, M. S. (2008). Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin. Hum Mol Genet. 17, R76-83. En el otro extremo del espectro de edad, la pérdida de mielina y reparación ineficaz puede contribuir al deterioro en la función cognitiva asociada con senescencia (Kohamaet al.,2011) Kohama, S. G., Rosene, D. L., y Sherman, L. S. (2011) Age (Dordr). Age-related changes in human and non-human primate white matter: from myelination disturbances to cognitive decline. Por tanto, se contempla que compuestos y métodos eficaces de aumentar la mielinización y/o remielinización pueden tener beneficios terapéuticos sustanciales en parar la evolución de la enfermedad y restablecer la función en PMD y en una amplia gama de trastornos relacionados con mielina.
En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención se pueden administrar a un sujeto que no tiene, y/o no se sospecha que tenga, un trastorno relacionado con mielina con el fin de aumentar o fomentar un proceso dependiente de mielina. En algunas formas de realización, los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar a un sujeto para fomentar la mielinización de las neuronas del SNC con el fin de aumentar la cognición, que se sabe que es un proceso dependiente de mielina, en sujetos sanos cognitivos. En ciertas formas de realización, los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar en combinación con agentes potenciadores cognitivos (nootrópicos). Los agentes ejemplares incluyen cualquier fármaco, suplemento, u otra sustancia que mejora la función cognitiva, en particular funciones ejecutivas, memoria, creatividad, o motivación, en individuos sanos. Los ejemplos no limitantes incluyen racetamos (por ejemplo, piracetam, oxiracetam, y aniracetam), nutracéuticos (por ejemplo, bacopa monnieri, panax ginseng, ginko biloba, y GABA), estimulantes (por ejemplo, fármacos anfetaminas, metilfenidato, eugeroicos, xantinas, y nicotina), L-Teanina, Tolcapona, Levodopa, Atomoxetina, y Desipramina.
Un aspecto particular de la presente invención contempla el tratamiento de PMD en un sujeto. El uso incluye administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de células genéticamente modificadas o agentes de silenciamiento génico de la invención.
La dosis global será una cantidad terapéuticamente eficaz que depende de varios factores incluyendo la salud global de un sujeto, el estado de enfermedad del sujeto, la gravedad de la afección, la observación de mejoras y la formulación y vía de administración del/los agente(s) seleccionado(s). La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la materia. La formulación exacta, vía de administración y dosis las puede elegir el médico individual en vista del estado del sujeto.
En ciertas formas de realización, las células genéticamente modificadas o agentes de silenciamiento génico de la invención se pueden administrar en una cantidad eficaz para aumentar la producción de mielina de las neuronas del SNC en un sujeto por un aumento en la cantidad de proteínas de mielina (por ejemplo, MBP) de al menos el 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, o 1000% en comparación con el nivel de proteínas de mielina de neuronas del CNS o un sujeto sin tratar.
En otras formas de realización, las células genéticamente modificadas o agentes de silenciamiento génico se pueden administrar en una cantidad eficaz para fomentar la supervivencia de las neuronas de SNC en un sujeto por un aumento en el número de neuronas supervivientes de al menos el 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, o 1000% en comparación con el número de neuronas supervivientes en neuronas del CNS o un sujeto sin tratar.
Otra estrategia para tratar un sujeto que padece un trastorno relacionado con mielina es administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células genéticamente modificadas o agentes de silenciamiento génico descritos en el presente documento junto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente(s) de diferenciación y/o proliferación de oligodendrocitos y/o agente anti-enfermedad neurodegenerativa. Los ejemplos de agentes anti-enfermedad neurodegenerativa incluyen L-dopa, inhibidores de colinesterasa, anticolinérgicos, agonistas de dopamina, esteroides, e inmunomoduladores incluyendo interferones, anticuerpos monoclonales, y acetato de glatiramer.
Por tanto, en un aspecto adicional de la invención, las células genéticamente modificadas o los agentes de silenciamiento génico de la invención se pueden administrar como parte de una terapia de combinación con terapias complementarias para tratar trastornos neurodegenerativos y relacionados con la mielina.
La frase “terapia de combinación” abarca la administración de los compuestos inductores de la diferenciación de precursores de oligodendrocitos descritos en el presente documento y un agente terapéutico como parte de una pauta de tratamiento específica destinada a proporcionar un efecto beneficioso de la coacción de estos agentes terapéuticos. Cuando se administran como una combinación, el compuesto inductor de la diferenciación de los precursores de oligodendrocitos y un agente terapéutico se pueden formular como composiciones separadas. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación típicamente se lleva a cabo durante un periodo de tiempo definido (habitualmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada).
Se pretende que “terapia de combinación” abarque la administración de estos agentes terapéuticos de una manera secuencial, es decir, en donde cada agente se administra en un tiempo diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, administrando al sujeto una única cápsula que tiene una proporción fijada de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede efectuar por cualquier ruta apropiada incluyendo, pero no limitado a, rutas orales, rutas intravenosas, rutas intramusculares, y absorción directa a través de tejidos de membranas mucosas. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por la misma ruta o por diferentes rutas. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada se puede administrar por inyección intravenosa mientras los otros agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por vía oral o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por inyección intravenosa. La secuencia en que los agentes terapéuticos se administran no es estrechamente crítica. “Terapia de combinación” también puede abarcar la administración de los agentes terapéuticos como se ha descrito anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos (tal como, pero no limitados a, un segundo y diferente agente terapéutico) y terapias no farmacéuticas (por ejemplo, cirugía).
En otro aspecto de la invención, los agentes terapéuticos administrados en una terapia de combinación con las células genéticamente modificadas o agentes de silenciamiento génico descritos en el presente documento pueden incluir al menos un agente anti-neurodegenerativo tal como, pero no limitado a, un agente inmunoterapéutico.
Un agente inmunoterapéutico para uso en la presente invención puede incluir terapias que se dirigen al componente inmunitario de la enfermedad y/o la respuesta inflamatoria aguda evidenciada durante un ataque agudo en trastornos relacionados con mielina remitentes-recidivantes tal como esclerosis múltiple. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, inmunomoduladores tal como interferón beta-1a y beta-1b (Avonex y Betaseron, respectivamente), natalizumab (Copaxone) natalizumab (Tysabri), acetato de glatiramer (Copaxone) o mitoxantrona.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten el ámbito de las reivindicaciones.
Ejemplo 11nactivación de PLP1 mediada por nucleasa para tratar trastornos genéticos de mielina
Introducción
La mielinización anómala produce señalización neuronal anormal y disfunción neurológica. El restablecimiento de la capacidad de mielinización en estos pacientes por corrección de las anomalías genéticas en sus células mielinizantes endógenas representa una avenida curativa prometedora, sin embargo, la viabilidad de este enfoque terapéutico todavía se tiene que demostrar. Por tanto, se eligió validar este paradigma enfocándose en una leucodistrofia arquetípica grave llamada enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD).
PMD es un trastorno genético grave de mielina ligado al cromosoma X causado por mutaciones en laproteína proteolipídica 1 (PLP1).Los pacientes de PMD típicamente experimentan enfermedad neurológica grave, incluyendo profunda incapacidad cognitiva y motora, que invariablemente culmina en mortalidad temprana durante la infancia o adolescencia. Por tanto, recurrimos a determinar si pacientes de PMD grave se podrían tratar mediante la introducción de inserciones o deleciones (indels) mediadas por nucleasas en el genPLP1o sus elementos reguladores que de forma eficaz y permanente inactivan o reducen la expresión dePLP1(indel dePLP1).Las indels mediadas por nucleasas se pueden dirigir a oligodendrocitos o sus progenitores incluyendo células madre neurales o células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Dirigirse a células precursoras proporcionaría una terapia permanente y autoamplificante ya que las células progenitoras con indel de PLP continuarían generando oligodendrocitos con indel dePLP1funcionales a lo largo de la vida del paciente. Dadas las muchas distintas y varias mutaciones causantes de PMD ya identificadas en pacientes, el enfoque de indel dePLP1es único ya que proporciona un enfoque universal aplicable a todos los pacientes de PMD.
Ratón jimpy
Para desarrollar el agente terapéutico de indel dePLP1se utilizó un modelo de ratón de PMD llamadojimpy.Este ratón porta una mutación puntual en un sitio aceptor de ayuste del intrón 4 en el genPLP1,que produce una proteínaPLP1mal plegada que con el tiempo produce pérdida de oligodendrocitos, hipomielinización profunda, temblor grave, ataxia, convulsiones, y mortalidad temprana en la tercera semana postnatal. Por tanto, resume de forma eficaz muchos aspectos de la PMD grave vistos en pacientes humanos.
El ratónjimpyrepresenta el modelo más grave de PMD. La figura 2 es un dibujo esquemático (no a escala) que muestra la localización de la mutación genéticajimpyen el genPLP1de ratón, y el producto génico resultante que con el tiempo produce muerte de oligodendrocitos. La parte inferior de la figura muestra el tiempo de vida sumamente reducido de los ratonesjimpycon una supervivencia mediana de solo aproximadamente 23 días.
La figura 3 muestra la hipomielinización grave en el cerebro del ratónjimpy.Nótese la tinción significativamente menor de MBP en la sección de cerebro del ratónjimpyen P19 (19días postnatales) comparada con la del control de tipo salvaje. El ratónjimpytambién muestra temblor de intención y ataxia a la misma edad (datos no mostrados).
Selección y validación de ARN guía
CRISPR-Cas9 es un ejemplo de un sistema mediado por nucleasa eficaz para inducir indels en células de mamífero mediante la introducción de la nucleasa Cas9 y un ARN guía único (ARNgu) de 22 pb. Los ARNgu adecuados se diseñaron como se describe en Hsuet al.(2013)Nature Biotechnology31, 827-832. Específicamente, los ARNgu se seleccionaron para maximizar la formación de indel específicas y minimizar las inespecíficas, así como direccionamiento a exón temprano para aumentar la eficacia de la degradación mediada por mutaciones terminadoras. Los ARNgu se validaron para actividad nucleasa mediante el kit Guide-it sgRNA Screening Kits de Clontech y la inducción de indel funcional mediante electroporación de plásmidos que expresan SaCas9 o SpCas9 y ARNgu en células de ratón y humanas usando el sistema de transfección Thermofischer Neon. Se determinó la eficacia de corte y valoración de ARNgu por cuantificación de la formación de indels mediante secuenciación profunda usando el sistema MiSeq de Illumina. Los ARNgu superiores se detallan en la tabla 1.
Tabla 1: Secuencias de ARNgu con validación superior
Las figuras 4 y 5 son dibujos esquemáticos que muestran un enfoque ejemplar para inactivar el genPLP1en el cigoto de un ratónjimpy,mediante CRISPR SpCas9/ARN guía duales (ARNgu) que se dirigen al exón 3, para crear el ratón progenie k OCR-impy.La figura 4 muestra las localizaciones relativas de los sitios objetivo de los ARNgu A y B en el exón 3. La figura 5 muestra el enfoque experimental general para generar el cigoto machojimpypara recibir los ARNgu y el ARNm de SpCas9. La inactivación mediada por CRlSPR/Cas9 con éxito del genPLP1dejimpyproduce el nacimiento de un fundadorCR-impymacho nulo paraPLP1nacido mediante hembra huésped sustituta. Dos generaciones de cruzamiento con la cepa parental dieron ratones progenie para caracterización adicional.
Deleción de PLP1 mediada por SPCas9 en animales
Como una prueba de concepto inicial para la estrategia de indel dePLP1terapéutica se electroporaron cigotos de reproductoresjimpycon ARNm de SpCas9 200 ng/pl y 10 ng/pl de cada uno de los ARNgu A y B y después se implantaron en hembras sustitutas (véase la figura 5). Esto produjo la generación de un ratón machojimpyinactivado por CRISPR (CR-impy [ocrimpy])que porta una deleción de ~80 nucleótidos en el extremo 5' del exón 3 enPLP1.Mientras los machosjimpymuestran fenotipos graves y mueren en la tercera semana postnatal, el machocrimpyera sorprendentemente distinto de los machosjimpyya que no mostró temblor, convulsiones, ataxia, o mortalidad temprana (datos no mostrados). Notablemente, este machocrimpyera capaz de cruzarse con éxito y vivió más de seis meses antes de que se sacrificara para análisis histológico que demostró mielinización completa del sistema nervioso central indistinguible del tipo salvaje (véase la figura 1). La transmisión del alelocrimpya nietos sanos confirma el efecto terapéutico drástico del tratamiento de indel dePLP1.
En efecto, la figura 6 muestra que los ratones CR-impy tiene un tiempo de vida restablecido comparado con el de los controlesjimpyy de tipo salvaje (n>15 para cada grupo, p < 0,0001).
La figura 7 muestra que los ratonesCR-impymuestran recuperación en oligodendrocitos maduros mediante IHC de cerebro entero que detecta MBP. El D19 postnatal, los ratones tanto de tipo salvaje comoCR-impytienen significativamente más tinción de MBP que la de los ratonesjimpy. A los 6 meses postnatales, mientras todos los ratonesjimpyhan muerto, los niveles de tinción de MBP en los ratones de tipo salvaje yCR-impyson indistinguibles.
Se usaron dos ensayos funcionales adicionales para evaluar el restablecimiento de la coordinación motora y la locomoción en los ratonesCR-impy.
La figura 8 muestra un dibujo esquemático para la prueba del rotarod para evaluar a coordinación motora de los ratonesCR-impy,donde la coordinación motora se cuantifica por un tiempo medido para caerse de la barra giratoria cuando la barra giratoria se acelera. Las medidas se hicieron a P19, 2 meses y 6 meses postnatales, en ratones de tipo salvaje,jimpy,yCR-impyen cada punto de tiempo. La significancia estadística entre los diferentes valores se indica por los valores p. A P19, los ratones tanto de tipo salvaje comoCR-impytuvieron tiempo estadísticamente significativamente más largo para caerse comparado con el de los ratonesjimpy.A 2 y 6 meses postnatales, mientras todos los ratonesjimpyhan muerto, los niveles de tiempo medido para caer en los ratones de tipo salvaje yCR-impyson indistinguibles. Los resultados muestran el restablecimiento de la coordinación motora en ratonesCR-impycomparado con los ratones de tipo salvaje yjimpy.
La figura 9 muestra un dibujo esquemático para la prueba de campo abierto para evaluar la actividad locomotora de los ratonesCR-impy,donde la actividad locomotora se cuantifica por una distancia total viajada medida en una caja seguida por video seguimiento automatizado durante 5 minutos. Las medidas se hicieron a P19, 2 meses y 6 meses postnatales, en ratones de tipo salvaje,jimpy,yCR-impyen cada punto de tiempo. La significancia estadística entre los diferentes valores se indica por los valores p. A P19, los ratones tanto de tipo salvaje comoCR-impytuvieron distancia total viajada estadísticamente significativamente más larga comparada con el de los ratonesjimpy.A 2 y 6 meses postnatales, mientras todos los ratonesjimpyhan muerto, los niveles de distancia total medida viajada en los ratones de tipo salvaje yCR-impyson indistinguibles. Los resultados muestran el restablecimiento de la actividad locomotora en ratonesCR-impycomparado con los ratones de tipo salvaje yjimpy.
Se realizó una prueba funcional adicional basada en una medida de la velocidad de conducción después de la estimulación del axón. La figura 10 muestra un dibujo esquemático para la prueba de velocidad de conducción del nervio óptico y los resultados representativos de los picos de conducción más rápida y más lenta - 1er pico y 2° pico, respectivamente. Los axones mielinizados y de diámetro grande en general tienen conductividad más rápida comparados con axones no mielinizados y de menor diámetro. El D19 postnatal, las velocidades de conducción rápida y lenta, medida por el 1er y 2° picos, respectivamente, son ambas estadísticamente significativamente diferentes entre cualesquiera dos del tipo salvaje, los ratonesjimpy,y los ratonesCR-impy.A los 6 meses postnatales, sin embargo, mientras todos los ratonesjimpyhan muerto, la diferencia entre los ratones de tipo salvaje yCR-impy,si hay alguna, se vuelve estadísticamente insignificante. Esto sugiere que la velocidad de conducción de los axones acelera en los ratonesCR-impy,mientras inicialmente está rezagada detrás de la de los ratones de tipo salvaje, eventualmente alcanza durante el tiempo.
En efecto, la imagenología de microscopía electrónica (ME) de los nervios ópticos de los ratones de tipo salvaje y CR-impy a aproximadamente 6 meses de edad no revela diferencia discernible. Véase la figura 11.
El hecho de que los ratonesCR-impysigan mostrando rendimiento funcional similar al del tipo salvaje a los 6 meses sugiere estabilidad funcional a largo plazo de la corrección mediada por terapia génica.
Estos resultados demuestran que la introducción de indels inactivadores enPLP1pueden rescatar por completo un modelo de ratón de PMD.
Resumen
La presente divulgación implica un método de generar células genéticamente modificadas y métodos para su uso en el tratamiento de trastornos de mielina humanos. Específicamente, se usó alteración genética mediada por nucleasa del gen de laproteína proteolipídica 1 (PLP1)como un enfoque terapéutico novedoso para trastornos relacionados con mielina con eficacia demostrada en el contexto de una leucodistrofia llamada enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD).
La figura 12 es un dibujo esquemático que muestra una forma de realización de la invención donde el silenciamiento génico mediado por CRISPR-Cas9 se administra al cerebro postnatal, por ejemplo, mediante un vector vírico AAV que codifica SaCas9 y ARNgu, que puede al menos parcialmente corregir las OPC mutantes en el cerebro del paciente. Las OPC así corregidas con el tiempo superarán cualquier OPC mutante, proporcionando de esta manera mielinización y funciones de las neuronas del paciente suficientemente restablecidas.
Nuestra estrategia evita la toxicidad relacionada conPLP1mediante la inactivación del genPLP1que aumenta la capacidad de hacer mielina funcional. En algunos casos, se pueden editar células madre neurales, células progenitoras de oligodendrocitos (OPC), u otras células de glía en el sistema nervioso central de pacientesin situ.En otro caso, las células se pueden modificarex vivoy trasplantar a los pacientes.
Más específicamente, hemos demostrado una novedosa estrategia terapéutica usando la creación de indels mediada por nucleasas en el genPLP1o elementos reguladores genéticos dePLP1para inactivar la traducción o transcripción dePLP1,respectivamente. Hemos mostrado que la edición mediada por nucleasas del genPLP1 in vivoen roedores restablece la función normal y el tiempo de vida completo a ratones con una forma grave de PMD. Demostramos que esta alteración dePLP1restablece la función de células modelo de PMDin vitro.Como parte de estos estudios de prueba de concepto la nucleasa CRISPR-Cas9 con un ARN guía dirigido a sitio se ejemplifica, pero esta estrategia terapéutica puede abarcar cualquier nucleasa dirigida o tecnología de edición génica.
El desarrollo de agentes terapéuticos para PMD y otros pacientes de leucodistrofia es desafiante debido al espectro de diversas mutaciones de<a>D<n>vistas en pacientes. Aquí, se proporciona un agente terapéutico universal para todos los pacientes de PMD. Este método/producto único se puede usar en todos los pacientes de PMD para inactivar de forma eficaz un genPLP1mutante nocivo. Además, la inactivación del genPLP1puede ser beneficiosa en otros trastornos de mielina para aliviar el estrés celular en oligodendrocitos. Además, hay considerable valor en este enfoque terapéutico y hay interés farmacéutico y económico fuerte en perseguir una terapia clínica de inactivación dePLP1.
Ejemplo 2 Inactivación postnatal de PLP1 usando administración con AAV de CRISPR/Cas9
Este ejemplo demuestra que la inactivación postnatal dePLP1se puede usar para tratar de forma eficaz PMD, o reducir la gravedad de PMD.
Para facilitar la administración del sistema CRISPR/Cas9 con ARNgu que se dirige al locusPLP1en un paciente, varios serotipos de AAV dirigidos al SNC, incluyendo PHPB se generaron, y se validó el tropismo de AAV para las OPC. Las construcciones de AAV (AAV9 o AAV-PHPB) contienen una nucleasa SaCRISPR-Cas9 (CMV-SaCas9, secuencia codificante de SaCas9 bajo el control de un promotor de CMV) con un ARN guía (ARNgu) dirigido a sitio contraPLP1(U6-ARNgu, el ARNgu está bajo el control del promotor U6), que se diseña para generar indels en el genPLP1y prevenir de esta manera la expresión de la proteínaPLP1defectuosa.
Los ratones se mantuvieron según protocolos aprobados revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Case Western Reserve. Los ratones se enjaularon en una unidad de alojamiento con temperatura y humedad controlada en un ciclo de 12 horas de día/luz y se permitió accesoad libituma alimento.
Los ratonesjimpy(un modelo de ratón grave de la enfermedad Pelizaeus Merzbacher) se trataron después mediante inyección intraventricular estereotáxica con los AAV que contienen CRISPR o controles que codifican GFP Específicamente, se obtuvieron crías macho del día postnatal 0 de parejas de críajimpyy se anestesiaron rápidamente usando crioanestesia.
Una jeringa Hamilton de 10 pl con una aguja de calibre 32 se cargó con AAV (AAV9 o AAV-PHPB) que empaquetan CMV-SaCas9 y U6-ARNgu que se dirigen aPLP1.La aguja se baja a través del cráneo a una profundidad de aproximadamente 2 mm en una posición 2/5 desde la inserción de la sutura sagital y lambdoide respecto al ojo. Se inyectaron 2 pl de solución vírica en el ventrículo lateral. La inyección se repitió después en el ventrículo lateral contralateral usando las mismas coordenadas, y volumen de inyección para una administración total de aproximadamente 1 * 1010-1 * 1011 genomas del vector al sistema ventricular. Lo mismo se repitió para ratones control.
Las crías se dejaron recuperar en una almohadilla calentadora y después se reintrodujeron a su madre. Las crías se siguieron a diario para mejora de fenotipo comparado con animalesjimpysin tratar o tratados con vehículo, que desarrollan fenotipo motor grave (por ejemplo, temblor de intención y convulsiones) a las 2 semanas de edad y muerte a las 3 semanas de edad.
Los animales tratados que sobreviven más de 3 semanas se analizan usando comportamiento (por ejemplo, ensayos de rotarod y de campo abierto para rendimiento motor, véase el ejemplo 1 y las figuras 8 y 9), histología (inmunotinción del SNC para proteínas de mielina y microscopia electrónica para ultraestructura de la mielina, véase el ejemplo 1 y las figuras 7 y 11), o seguimiento diario para análisis estadístico de la extensión del tiempo de vida (véase el ejemplo 1 y la figura 6).
Además, los requisitos espaciales para el número de células requeridas para ser editadas en el SNC (“respuesta a la dosis” de células con genes editados) se determinan para generar una respuesta funcional con inmunohistoquímica.
Por último, la relación temporal se explora introduciendo una construcción optimizada los días postnatales P1, P7 y P14.
Un enfoque CRISPR/Cas9 optimizado en una ventana terapéutica definida reduce la expresión de la proteínaPLP1mutante, aumenta el tiempo de vida del individuo tratado, y restablece la mielinización de los axones.
Ejemplo 3 Atenuación postnatal de PLP1 usando oligonucleótidos antisentido (ASO)
Este ejemplo demuestra que la disminución o atenuación postnatal de la actividad del genPLP1usando ASO se puede usar para tratar de forma eficaz PMD, o reducir la gravedad de PMD.
Los ratones se mantienen según protocolos aprobados revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Case Western Reserve. Los ratones se enjaulan en una unidad de alojamiento con temperatura y humedad controlada en un ciclo de 12 horas de día/luz y se permite accesoad libituma alimento.
Se obtienen crías macho del día postnatal 0 de parejas de críajimpy(un modelo de ratón grave de la enfermedad Pelizaeus Merzbacher) y se anestesian rápidamente usando crioanestesia. Una jeringa Hamilton de 10 pl con una aguja de calibre 32 se carga con oligonucleótidos antisentido que se dirigen aPLP1.La aguja se baja a través del cráneo a una profundidad de aproximadamente 2 mm en una posición 2/5 desde la inserción de la sutura sagital y lambdoide respecto al ojo. Se inyectan 2 pl de solución de ASO en el ventrículo lateral. La inyección se repite después en el ventrículo lateral contralateral usando las mismas coordenadas y volumen de inyección para una administración total de aproximadamente 10-75 pg de ASO al sistema ventricular.
Las crías se dejaron recuperar en una almohadilla calentadora y después se reintrodujeron a su madre. Las crías se siguieron a diario para mejora de fenotipo en comparación con animalesjimpysin tratar o tratados con vehículo, que desarrollan fenotipo motor grave (por ejemplo, temblor de intención y convulsiones) a las 2 semanas de edad y muerte a las 3 semanas de edad.
Los animales tratados que sobreviven más de 3 semanas se analizan usando comportamiento (por ejemplo, ensayos de rotarod y de campo abierto para rendimiento motor, véase el ejemplo 1 y las figuras 8 y 9), histología (inmunotinción del SNC para proteínas de mielina y microscopia electrónica para ultraestructura de la mielina, véase el ejemplo 1 y las figuras 7 y 11), o seguimiento diario para análisis estadístico de la extensión del tiempo de vida (véase el ejemplo 1 y la figura 6).
Ejemplo 4 Atenuación postnatal de PLP1 usando ARNi
Este ejemplo demuestra que la disminución o atenuación postnatal de la actividad del genPLP1usando ARNi se puede usar para tratar de forma eficaz PMD, o reducir la gravedad de PMD.
Los ratones se mantienen según protocolos aprobados revisados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Case Western Reserve. Los ratones se enjaulan en una unidad de alojamiento con temperatura y humedad controlada en un ciclo de 12 horas de día/luz y se permite accesoad libituma alimento.
Se obtienen crías macho del día postnatal 0 de parejas de críajimpy(un modelo de ratón grave de la enfermedad Pelizaeus Merzbacher) y se anestesian rápidamente usando crioanestesia. Una jeringa Hamilton de 10 pl con una aguja de calibre 32 se carga con AAV (AAV9 o AAV-PHPB) que empaquetan CMV-ARNi que se dirigen aPLP1(una construcción de ARNi que se puede transcribir dentro de la célula bajo el control de un promotor de CMV para generar moléculas de ARNi funcionales, que después se pueden procesar a ARNip/ARNhc/miARN que se dirigen aPLP1).Alternativamente, la aguja se carga con una formulación no vírica de la construcción de ARNi que se dirige aPLP1,usando portadores de ARNip no víricos tal como péptidos penetradores de células, polímeros, dendrímeros, bioconjugados de ARNip, y portadores de ARNip basados en lípidos, etc. La aguja se baja a través del cráneo a una profundidad de aproximadamente 2 mm en una posición 2/5 desde la inserción de la sutura sagital y lambdoide respecto al ojo. Se inyectan 2 pl de solución de ARNi en el ventrículo lateral. La inyección se repite después en el ventrículo lateral contralateral usando las mismas coordenadas y volumen de inyección.
Las crías se dejan recuperar en una almohadilla calentadora y después se reintroducen a su madre. Las crías se siguieron a diario para mejora de fenotipo comparado con animalesjimpysin tratar o tratados con vehículo, que desarrollan fenotipo motor grave (por ejemplo, temblor de intención y convulsiones) a las 2 semanas de edad y muerte a las 3 semanas de edad.
Los animales tratados que sobreviven más de 3 semanas se analizan usando comportamiento (por ejemplo, ensayos de rotarod y de campo abierto para rendimiento motor, véase el ejemplo 1 y las figuras 8 y 9), histología (inmunotinción del SNC para proteínas de mielina y microscopia electrónica para ultraestructura de la mielina, véase el ejemplo 1 y las figuras 7 y 11), o seguimiento diario para análisis estadístico de la extensión del tiempo de vida (véase el ejemplo 1 y la figura 6).

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un método de generar una célula que aumenta la producción de mielina funcional, el método comprende modificar genéticamente la célula de modo que:
un producto del genPLP1endógeno se modifica para disminuir el nivel de expresión dePLP1,en donde la modificación del producto del genPLP1endógeno comprende administrar a la célula un agente de silenciamiento génico que se dirige específicamente aPLP1,
en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante causante de enfermedad nocivo,
en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito,
en donde la célula produce mielina funcional, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional;
en donde el método comprende poner en contacto la célulain vitrooex vivocon un vehículo de administración para el agente de silenciamiento génico, opcionalmente, el vehículo de administración es un vector AAV, un vector adenovírico, o un vector lentivírico.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el agente de silenciamiento génico comprende un oligonucleótido antisentido (ASO).
3. El método de la reivindicación 1, en donde el agente de silenciamiento génico comprende una construcción de ARNi.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la célula que se modifica genéticamente muestra producción de mielina funcional aumentada.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la producción de mielina funcional aumentada es debido a la toxicidad relacionada conPLP1reducida en la célula.
6. Una célula genéticamente modificada generada por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una célula genéticamente modificada descendiente de la misma.
7. Una composición que comprende la célula genéticamente modificada de la reivindicación 6.
8. Una célula generada por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en tratar la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) en un sujeto produciendo mielina funcional en el sujeto, en donde la PMD preferiblemente se caracteriza por actividad y/o expresión del genPLP1anómala.
9. Una célula que aumenta la producción de mielina funcional al producir mielina funcional, o al ser un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional, para uso en tratar la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD),
en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, y está genéticamente modificada de modo que un producto del genPLP1endógeno se modifica para disminuir el nivel de expresión dePLP1,
en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante causante de enfermedad nocivo, y
en donde la modificación del producto del genPLP1endógeno comprende administrar a la célula un agente de silenciamiento génico que se dirige específicamente aPLP1.
10. Un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige al gen PLP1 endógeno para disminuir el nivel de expresión de PLP1 en una célula, para uso en tratar la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) en un sujeto, en donde la PMD preferiblemente se caracteriza por actividad y/o expresión del genPLP1anómala, en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante causante de enfermedad nocivo, y en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, y produce mielina funcional, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional.
11. Un agente de silenciamiento génico que específicamente se dirige al gen PLP1 endógeno para disminuir el nivel de expresión de PLP1 en una célula, para uso en generar una célula que aumenta la producción de mielina funcional, en donde el genPLP1endógeno es un genPLP1mutante causante de enfermedad nocivo, y en donde la célula se selecciona de una célula madre neural (NSC), una célula progenitora de oligodendrocitos (OPC), o una célula oligodendrocito, y produce mielina funcional, o es un progenitor que produce o se diferencia a una célula que produce mielina funcional.
12. El agente de silenciamiento génico para uso de la reivindicación 10 o 11, en donde el agente de silenciamiento génico comprende un oligonucleótido antisentido (ASO).
13. El agente de silenciamiento génico para uso de la reivindicación 10 o 11, en donde el agente de silenciamiento génico comprende una construcción de ARNi.
14. El método de la reivindicación 3 o el agente de silenciamiento de la reivindicación 13 en donde la construcción de ARNi es un ARNip, ARNhc o un miARN.
15. La célula para uso de la reivindicación 8 o 9, o el agente de silenciamiento génico para uso de cualquiera de las reivindicaciones 10-14 en donde la célula restablece el tiempo de vida del sujeto a al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o aproximadamente el 100% de un sujeto control sin la PMD.
16. La célula para uso o el agente de silenciamiento génico para uso de la reivindicación 15, que alivia al menos un síntoma(s) del sujeto asociado con dicha PMD, y/o restablece una función del sujeto a al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o aproximadamente el 100% de un sujeto control sin la PMD, preferiblemente, la función es coordinación motora, locomoción, o velocidad de conducción axónica.
17. La célula para uso o el agente de silenciamiento génico para uso de cualquiera de las reivindicaciones 8-16, en donde el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano.
18. La célula para uso o el agente de silenciamiento génico para uso de la reivindicación 17 en donde el ser humano es un ser humano más joven de 20 años, 15 años, 10 años, 5 años, 3 años, 2 años, 1 años, 6 meses, 3 meses, 1 mes, 2 semanas, 1 semana, 3 días, o 1 día.
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