ES2969350T3

ES2969350T3 - Anticuerpos murinos caninizados anti-PD-1 canino

Info

Publication number: ES2969350T3
Application number: ES14833345T
Authority: ES
Inventors: Mohamad Morsey; Yuanzheng Zhang; Denise Bartels-Morozov; Jason Erskine; Ian Tarpey; Leonard G Presta
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-19
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2034-12-19
Also published as: FI3083694T3; CA3185195A1; JP6681832B2; US20200354450A1; CN105829344A; BR112016014284A2; EP3083693B1; AU2014368453A1; AU2014368450A1; CN117986366A; US10711061B2; BR112016014293B1; US11680097B2; AU2014368453B2; RU2761663C2; CN106029697A; CN106029695B; AU2023285870A1; RU2732604C2; CN113402609B

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-1 humano murino caninizado que tienen secuencias específicas y una alta afinidad de unión por PD-1 canino. La invención también se refiere al uso de estos anticuerpos en el tratamiento de perros. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos murinos caninizados anti-PD-1 canino

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos murinos caninizados contra PD-1 humano que tienen secuencias específicas y una alta afinidad de unión por PD-1 canino. La invención también se refiere al uso de los anticuerpos de la presente invención en el tratamiento de cáncer en perros.

Antecedentes de la invención

Un receptor inmunoinhibidor que se expresa principalmente en células T y B activadas, Receptor de muerte celular programada 1, también denominado Receptor de Muerte Programada (PD-1), es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas relacionada con CD28 y CTLA-4. PD-1 y miembros de la familia similares son glucoproteínas transmembrana de tipo I que contienen un dominio extracelular de tipo variable de Ig (tipo V) que se une a sus ligandos y una cola citoplasmática que se une a moléculas de señalización. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de señalización basados en tirosina, un ITIM (motivo inmunorreceptor de inhibición basado en tirosina) y un ITSM (motivo inmunorreceptor de cambio basado en tirosina).

PD-1 atenúa las respuestas de las células T cuando se une al ligando 1 de muerte celular programada, también denominado ligando 1 de muerte programada (PD-L1) y/o ligando 2 de muerte celular programada, también denominado ligando 2 de muerte programada (PD-L2). La unión de cualquiera de estos ligandos a PD-1 regula negativamente la señalización del receptor de antígeno. El bloqueo de la unión de PD-L1 a PD-1 mejora la inmunidad de las células T CD8+ específica de tumor, mientras que ayuda a la eliminación de las células tumorales por parte del sistema inmunológico. La estructura tridimensional del PD-1 murino, así como la estructura cocristalina de PD-1 de ratón con PD-L1 humano [Zhanget al.,Immunity 20: 337-347 (2004); Linet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 3011 3016 (2008)]. PD-L1 y PD-L2 son ligandos transmembrana de tipo I que contienen ambos dominios similares a IgV e IgC en la región extracelular junto con regiones citoplasmáticas cortas sin motivos de señalización conocidos. Tanto PD-L1 como PD-L2 se expresan constitutivamente o pueden inducirse en una diversidad de tipos de células, incluyendo tejidos no hematopoyéticos, así como diversos tipos de tumores. PD-L1 no sólo se expresa en células B, T, mieloides y dendríticas (DC), sino también en células periféricas, tales como células endoteliales microvasculares y órganos no linfoides, por ejemplo, corazón o pulmón. Por el contrario, PD-L2 solo se encuentra en macrófagos y DC. El patrón de expresión de los ligandos de PD-1 sugiere que PD-1 juega un papel en el mantenimiento de la tolerancia periférica y puede servir además para regular las respuestas autorreactivas de células T y B en la periferia.

En cualquier caso, ahora está muy claro que PD-1 juega un papel crítico en al menos determinados cánceres humanos, presumiblemente mediando la evasión inmunitaria. En consecuencia, se ha demostrado que PD-L1 se expresa en varios tumores de ratón y humanos y es inducible por IFNgammaen la mayoría de las líneas de células tumorales negativas para PD-L1 [Iwaiet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002); Stromeet al.,Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003)]. Adicionalmente, la expresión de PD-1 en linfocitos infiltrantes del tumor y/o PD-L1 en células tumorales se ha identificado en varias biopsias de tumores humanos primarios. Dichos tejidos tumorales incluyen cánceres del pulmón, hígado, ovario, cuello uterino, piel, colon, glioma, vejiga, mama, riñón, esófago, estómago, células escamosas orales, células uroteliales y páncreas, así como tumores de cabeza y cuello [Brownet al.,J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Donget al.,Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterleet al.,Cancer Res. 63: 7462 7467 (2003); Stromeet al.,Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003); Thompsonet al.,Cancer Res. 66: 3381-5 (2006); Thompsonet al.,Clin. Cancer Res. 13: 1757-1761 (2007); Nomiet al.,Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157. (2007)]. Más sorprendentemente, la expresión del ligando de PD en células tumorales se ha correlacionado con un mal pronóstico de pacientes humanos con cáncer en múltiples tipos de tumores [revisado en Okazaki y Honjo, Int. Immunol. 19: 813 824 (2007)].

Por otra parte, Nomiet al.[Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157 (2007)] demostraron la efectividad terapéutica de bloquear la unión de PD-L1 a PD-1 en un modelo murino de cáncer pancreático agresivo mediante la administración de anticuerpos dirigidos contra PD-1 o bien PD-L1. Estos anticuerpos promovieron eficazmente la infiltración de células T CD8+ reactivas al tumor en el tumor, lo que dio como resultado la regulación positiva de efectores antitumorales incluyendo IFNgamma,granzima B y perforina. De forma similar, el uso de anticuerpos para bloquear la unión de PD-L1 y PD-1 inhibió significativamente el crecimiento tumoral en un modelo de carcinoma de células escamosas de ratón [Tsushimaet al.,Oral Oncol. 42: 268-274 (2006)].

En otros estudios, la transfección de una línea de mastocitoma murino con PD-L1 condujo a una disminución de la lisis de las células tumorales cuando se cocultivaron con un clon de CTL específico del tumor. La lisis se restauró cuando se añadió el anticuerpo monoclonal anti-PD-L1 [Iwaiet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)].In vivo,se demostró que el bloqueo de la interacción PD1/PD-L1 aumenta la eficacia de la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T en un modelo tumoral de ratón [Stromeet al.,Cancer Res. 63: 6501-6505 (2003)]. La evidencia adicional del papel de PD-1 en el tratamiento del cáncer proviene de experimentos realizados con ratones con genes inactivados para PD-1 en los cuales las células de mieloma que expresan PD-L1 crecieron solo en animales de tipo silvestre (lo que dio como resultado el crecimiento tumoral y la muerte animal asociada), pero no en ratones deficientes en PD-1 [Iwai Y.et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 12293-12297 (2002)]. Más recientemente, los anticuerpos contra PD-1 (incluyendo los anticuerpos monoclonales murinos humanizados contra PD-1 humano) han mostrado al menos un éxito inicial en la terapia del cáncer en seres humanos [véase por ejemplo, el documento US 8.354.509 B2, el documento US 8.008.449 B2 y el documento US 7.595.048 B2]. El documento WO2008/083174 desvela anticuerpos que se unen específicamente a PD-1 y bloquean la unión de PD-1 a PD-L-1, y el uso de los mismos para tratar cáncer o infecciones. Este documento enseña que el sujeto a tratar puede ser un perro.

El documento WO2008/156712 desvela el anticuerpo PD-1-08A murino que se generó contra PD-1 humano y se canonizó en la presente solicitud.

Los anticuerpos anti-PD-1 también pueden ser útiles en la infección vírica crónica. Las células T CD8 generadas después de una infección vírica aguda son altamente funcionales y constituyen un componente importante de la inmunidad protectora. Por el contrario, las infecciones crónicas se caracterizan a menudo por diversos grados de deterioro funcional (agotamiento) de las respuestas de células T específicas del virus y este defecto es la razón principal de la incapacidad del hospedador para eliminar el patógeno persistente. Aunque las células T efectoras funcionales se generan inicialmente durante las primeras fases de la infección, pierden función de manera gradual durante el transcurso de una infección crónica. Barberet al.[Nature 439: 682-687 (2006)] mostraron que los ratones infectados con una cepa de laboratorio de LCMV desarrollaron una infección crónica que dio como resultado niveles altos de virus en la sangre y otros tejidos. Estos ratones desarrollaron inicialmente una fuerte respuesta de células T, pero finalmente sucumbieron a la infección al agotarse los células T. Barberet al.descubrieron que la disminución en el número y la función de las células T efectoras en ratones infectados crónicamente podría revertirse inyectando un anticuerpo que bloqueara la interacción entre PD-1 y PD-L1.

La cita de cualquier referencia en el presente documento no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica anterior" para la presente solicitud.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados que tienen una alta afinidad de unión al PD-1 canino, además de tener la capacidad de bloquear la unión de PD-1 canino a PD-L1 canino. La presente invención también se refiere al uso de tales anticuerpos en el tratamiento de enfermedades tales como cáncer y/o aquellas debidas a infecciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo animal mediante terapia o para diagnóstico.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En consecuencia, la presente invención proporciona un anticuerpo caninizado aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se define en las reivindicaciones que se une específicamente al Receptor de Muerte Programada 1 (PD-1) que comprende una cadena pesada de IgG canina y una cadena ligerakappa.En realizaciones particulares de este tipo, la cadena ligerakappaolambdacanina que comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (Cd R) de cadena ligera: Cd R ligera 1 (CDRL1), CDR ligera 2 (CDRL2) y CDR ligera 3 (CDRL3); y la cadena pesada de IgG canina que comprende tres CDR de cadena pesada: CDR pesada 1 (CDRH1), CDR pesada 2 (CDRH2) y CDR pesada 3 (CDRH3) obtenidas de un anticuerpo PD-1 de mamífero. Las realizaciones particulares de los anticuerpos caninizados y fragmentos de los mismos de la presente invención se unen a PD-1 canino y/o bloquean la unión de PD-1 canino al Ligando de muerte programada 1 (PD-L1) canino.

En determinadas realizaciones, la cadena ligera canina es una cadena kappa. En realizaciones particulares de este tipo, la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. En realizaciones relacionadas la CDRL1 comprende una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 20. En otras realizaciones, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 22. En realizaciones relacionadas la CDRL2 comprende una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 22. En otras realizaciones más la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En realizaciones relacionadas la CDRL3 comprende una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 24. En otras realizaciones más la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En realizaciones relacionadas la CDRH1 comprende una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 14. En otras realizaciones más la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En realizaciones relacionadas la CDRH2 comprende una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 16. En otras realizaciones más la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En realizaciones relacionadas la CDRH3 comprende una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 18.

En realizaciones específicas la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 20, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 22 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 22 y la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 24.

En otras realizaciones específicas, CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 14, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 16 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 16 y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 18.

En una realización más específica la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 20, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 22 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 22 y la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 24 y CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 14, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 16 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 16 y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una variante modificada conservativamente de SEQ ID NO: 18.

En una realización incluso más específica la CDRL1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, la CDRL2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y la CDRL3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, la CDRH1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, la CDRH2 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 y la CDRH3 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.

En otras realizaciones la cadena pesada de IgG comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28

En determinadas realizaciones la cadena ligerakappacomprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

En realizaciones particulares la cadena ligerakappacomprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

En una realización más particular, un anticuerpo caninizado aislado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y de SEQ ID NO: 34.

La presente invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican una cualquiera de las cadenas ligeras del anticuerpo caninizado de la presente invención. De forma similar, la presente invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican una cualquiera de las cadenas pesadas del anticuerpo caninizado de la presente invención. La presente invención proporciona además vectores de expresión que comprenden uno o más de los ácidos nucleicos aislados de la presente invención. La presente invención proporciona además células hospedadoras que comprenden uno o más vectores de expresión de la presente invención.

En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones relacionadas, el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera están conectados por un enlazador flexible para formar un anticuerpo monocatenario.

En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab.

En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab'. En otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un fragmento (Fab')<2>. En aún otras realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un diacuerpo. En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio. En realizaciones particulares, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo de dominio único camelizado.

En realizaciones particulares, el anticuerpo murino caninizado anti-PD-1 humano o el fragmento de unión a antígeno aumenta la respuesta inmunitaria del sujeto canino que está siendo tratado.

La presente invención proporciona además ácidos nucleicos aislados que codifican los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados o fragmentos de unión a antígeno como se desvela en el presente documento. En realizaciones relacionadas, dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar cáncer en un sujeto canino. Como alternativa, o en conjunto, la presente invención proporciona el uso de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente invención para uso diagnóstico. En otras realizaciones adicionales, se proporciona un kit que comprende cualquiera de los anticuerpos caninizados o fragmentos de unión a antígeno desvelados en el presente documento.

En otras realizaciones adicionales, se proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de la invención. La invención también se refiere a una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión descritos en el presente documento. En realizaciones particulares, estos ácidos nucleicos, vectores de expresión o polipéptidos de la invención son útiles en los métodos para preparar un anticuerpo.

La presente invención incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo junto con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención proporciona métodos para aumentar la actividad de una célula inmunitaria, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de dichas composiciones farmacéuticas. En determinadas realizaciones, el método se usa para el tratamiento del cáncer. En otras realizaciones, el método se usa en el tratamiento de una infección o enfermedad infecciosa. En aún otras realizaciones, un anticuerpo caninizado de la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo se usa como adyuvante de vacuna.

Estos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán mejor en referencia a la siguiente Breve descripción de los dibujos y a la Descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal murino anti-PD-1 humano 08A [mAb 08A; como se describió por primera vez en el documento US 8.354.509 B2 en relación con PD-1 humano] contra el dominio extracelular etiquetado con His de PD-1 canino.

La Figura 2 muestra la reactividad del anticuerpo monoclonal 08A anti-PD-1 humano murino (véase anteriormente) contra proteínas PD-1 caninas expresadas en células CHO usando CELISA. Se descubrió que el anticuerpo monoclonal murino anti-PD-1 humano 08A y sus variantes caninizadas reaccionan con PD-1 canino de manera dependiente de la dosis.

La Figura 3 representa el bloqueo de ligando mediante anticuerpos monoclonales murinos y caninizados. El anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humano murino 08A (ver arriba) y sus variantes caninizadas bloquearon la unión de PD-L1 canino a PD-1 expresado en la superficie de las células CHO.

La Figura 4 proporciona el alineamiento de las cadenas pesadas constantes (CH) de IgGB canina que carecen de función ADCC. La IgB canina de tipo silvestre [cIgGB ts], IgGB(+)A-bisagra canina [cIgGB(+) A-bisagra], IgGB(+) D-bisagra canina [cIgGB(+) D-bisagra] e IgGB (-)ADCC canina [cIgGB(-) ADCC] están representadas. La (+) A bisagra es el reemplazo con una bisagra IgG-Amásun reemplazo de aminoácidos de lisina y asparagina como se muestra; la (+) D-bisagra es el reemplazo con una bisagra IgG-Dmásun reemplazo de aminoácidos de lisina y asparagina como se muestra. El (-)ADCC es el reemplazo de los aminoácidos lisina y asparagina.

Descripción detallada

Abreviaturas

A lo largo de la descripción detallada y de los ejemplos de la invención se usarán las siguientes abreviaturas:

ADCC Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

CDC Citotoxicidad dependiente del complemento

CDR Región determinante de la complementariedad en las regiones variables de inmunoglobulina, definidas usando el sistema de numeración de Kabat

CHO Ovario de hámster chino

CE50 concentración que da como resultado una efectividad o unión del 50 %

ELISA Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

FR Región marco del anticuerpo: las regiones variables de inmunoglobulina excluyendo las regiones CDR. HRP Peroxidasa de rábano picante

IFN interferón

CI50 concentración que da como resultado una inhibición del 50 %

IgG Inmunoglobulina G

Kabat Un sistema de alineamiento y numeración de inmunoglobulinas liderado por Elvin A. Kabat [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]

mAb Anticuerpo monoclonal (también Mab o MAb)

MES ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

MOA Mecanismo de acción

NHS Suero humano normal

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

PK Farmacocinética

SEB Enterotoxina B de Staphylococcus

TT Toxoide tetánico

Región V El segmento de cadenas de IgG que es variable en secuencia entre diferentes anticuerpos. Se extiende hasta el resto 109 de Kabat en la cadena ligera y hasta el 113 en la cadena pesada.

VH Región variable de cadena pesada de inmunoglobulina

VK Región variable de la cadena ligerakappade inmunoglobulina

Definiciones

Para que la invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen específicamente determinados términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte del presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Como se usa en el presente documento, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular de palabras tales como "un", "una", y "el/la", incluyen sus referencias en plural correspondientes a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

"Activación" como se aplica a células o a receptores se refiere a la activación o al tratamiento de una célula o de un receptor con un ligando, a menos que el contexto indique lo contrario o explícitamente. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y compuestos de unión procedentes de anticuerpos. "Ligando" también abarca moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos peptídicos de citocinas y miméticos peptídicos de anticuerpos. "Activación" puede referirse a la activación celular regulada por mecanismos internos así como por factores externos o ambientales.

La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula con un ligando o con un receptor, a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización celular, la diferenciación o la maduración; a la actividad antigénica, a la modulación de las actividades de otras moléculas y similares. La "actividad" de una molécula también puede referirse a la actividad para modular o conservar interacciones célula a célula, por ejemplo, adhesión o actividad en la conservación de la estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico o similares. "Actividad" puede referirse a la modulación de componentes de los sistemas inmunológicos innato o adaptativo.

La "administración" y el "tratamiento", cuando se aplica a un animal, por ejemplo, un sujeto experimental, célula, tejido, órgano o líquido biológico caninos, se refiere al contacto de un agente farmacéutico exógeno, terapéutico, de diagnóstico o composición con el animal, por ejemplo, un sujeto, célula, tejido, órgano o líquido biológico caninos. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un líquido, donde el líquido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" también significa tratamientosin vitroyex vivo,por ejemplo, de una célula, mediante un reactivo, diagnóstico, compuesto de unión o por otra célula. El término "sujeto" incluye cualquier organismo, preferentemente un animal, más preferentemente un mamífero (por ejemplo, canino, felino o ser humano) y lo más preferentemente un canino.

"Tratar" o "tratamiento" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención, de manera interna o externa a un sujeto o paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad, o que se sospecha que tiene una enfermedad, para la cual el agente tiene actividad terapéutica. Normalmente, el agente se administra en una cantidad eficaz para aliviar y/o mejorar uno o más síntomas de enfermedad en el sujeto o la población tratados, ya sea induciendo la regresión del avance de dicho síntoma o síntomas o inhibiendo su avance en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad en particular (también denominada "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar según factores tales como el cuadro clínico de la enfermedad, la edad y el peso del paciente (por ejemplo, canino) y de la capacidad de la composición farmacéutica para provocar una respuesta deseada en el sujeto. Si un síntoma de enfermedad se ha aliviado o mejorado puede evaluarse mediante cualquier medida clínica usada normalmente por los veterinarios u otros proveedores de atención médica capacitados para evaluar la gravedad o el estado de avance de ese síntoma. Si bien una realización de la presente invención (por ejemplo, un método de tratamiento o artículo de fabricación) puede no ser eficaz para aliviar el síntoma o síntomas de la enfermedad diana en todos los sujetos, debería aliviar el síntoma o síntomas de la enfermedad diana en un número estadísticamente significativo de sujetos como se determina por cualquier prueba estadística conocida en la materia, tal como la prueba t de Student, la prueba chi2, la prueba U de acuerdo con Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

"Tratamiento", como se aplica a un sujeto humano, veterinario (por ejemplo, canino) o de investigación, se refiere a un tratamiento terapéutico, así como a aplicaciones de investigación y diagnóstico. "Tratamiento" como se aplica a un sujeto humano, veterinario (por ejemplo, canino) o de investigación, o una célula, un tejido o un órgano, abarca el contacto de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención con un sujeto canino u otro animal, una célula, tejido, compartimento fisiológico o líquido fisiológico.

Se ha descubierto que PD-1 canino comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En una realización específica PD-1 canino está codificado por un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Las secuencias de PD-1 canino pueden diferir por tener, por ejemplo, variaciones conservadas en regiones no conservadas, pero el PD-1 canino tendrá sustancialmente la misma función biológica que el PD-1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, una función biológica de PD-1 es atenuar las respuestas de las células T cuando se unen a PD-L1 y/o PD-L2. Esto es, PD-1 puede considerarse un regulador negativo. De forma notable, la cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de señalización basados en tirosina, un ITIM (motivo inmunorreceptor de inhibición basado en tirosina) y un ITSM (motivo inmunorreceptor de cambio basado en tirosina). Además, una función biológica del PD-1 canino puede tener, por ejemplo, un epítopo en el dominio extracelular que está unido de manera específica mediante un anticuerpo de la presente divulgación.

Se ha descubierto que PD-L1 canino comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En una realización específica PD-L1 canino está codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 7. Las secuencias de PD-L1 canino pueden diferir por tener, por ejemplo, variaciones conservadas en regiones no conservadas, pero el PD-L1 canino tendrá sustancialmente la misma función biológica que el PD-L1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, una función biológica de PD-L1 es atenuar las respuestas de las células T cuando se unen a PD-1.

Una secuencia de aminoácidos PD-1 o PD-L1 canina particular respectivamente, será generalmente al menos un 90 % idéntica al PD-1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o al PD-L1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, respectivamente. En determinados casos, un PD-1 o PD-L1 canino respectivamente, puede ser al menos un 95 % o incluso al menos un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica al PD-1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o al PD-L1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, respectivamente. En determinadas realizaciones, un PD-1 canino o una secuencia de aminoácidos de PD-L1 mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto al PD-1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o el PD-L1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, respectivamente. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de PD-1 o de PD-L1 caninos respectivamente, puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos con respecto al PD-1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos ID NO: 2 o el PD-L1 canino que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, respectivamente. El porcentaje de identidad puede determinarse como se describe a continuación en el presente documento.

La expresión "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que da como resultado un daño selectivo a, destrucción de o eliminación del cuerpo de los mamíferos (por ejemplo, cuerpo canino) de células cancerosas, células o tejidos infectados con patógenos o patógenos invasores.

Anticuerpos caninizados anti-PD-1 humano

La presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones que se unen a PD-1 canino y usos de dichos anticuerpos o fragmentos.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado se refiere a un anticuerpo caninizado que se une específicamente a PD-1 de mamífero. Un anticuerpo que se une específicamente a PD-1 de mamífero y, en particular, a PD-1 canino, es un anticuerpo que presenta unión preferencial con el PD-1 de mamífero en comparación con otros antígenos, pero esta especificidad no requiere una especificidad de unión absoluta. Un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado se considera "específico" para PD-1 canino si su unión es determinante de la presencia de PD-1 canino en una muestra biológica o si es capaz de alterar la actividad de PD-1 canino sin interferir indebidamente con la actividad de otras proteínas caninas en una muestra canina, por ejemplo, sin producir resultados no deseados tales como falsos positivos en un contexto de diagnóstico o efectos secundarios en un contexto terapéutico. El grado de especificidad necesario para un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado puede depender del uso previsto del anticuerpo y, en cualquier caso, se define por su idoneidad para su uso para un fin previsto. El anticuerpo, o el compuesto de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, del método contemplado, se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, preferentemente al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor y lo más preferentemente al menos 100 veces mayor que la afinidad con cualquier otro antígeno canino.

Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia dada (en este caso PD-1 canino) si se une a polipéptidos que comprenden la secuencia de PD-1 canino, pero no se une a otras proteínas caninas que carecen de la secuencia de aminoácidos de PD-1 canino. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende PD-1 canino puede unirse a una forma etiquetada con FLAG® de PD-1 canino, pero no se unirá a otras proteínas caninas etiquetadas con FLAG®.

Como se usa en el presente documento, salvo que se indique lo contrario, "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno" se refieren a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, es decir, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno (por ejemplo, PD-1 canino) unido por el anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, fragmentos que conservan una o más regiones CDR. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, sc-Fv; nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Normalmente, un anticuerpo caninizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención conserva al menos un 10% de su actividad de unión a PD-1 canino (cuando se compara con el anticuerpo progenitor) cuando esa actividad se expresa sobre una base molar. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos un 20 %, un 50 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % o más de la afinidad de unión a PD-1 como el anticuerpo progenitor. También se pretende que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (denominadas "variantes conservativas" o "variantes de función conservada" del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.

"Anticuerpo aislado" se refiere al estado de purificación y en dicho contexto significa que la molécula está sustancialmente libre de otras moléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales, tales como restos celulares y medios de crecimiento. Generalmente, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia total de dicho material o una ausencia de agua, tampones o sales, a menos que estén presentes en cantidades que interfieran sustancialmente con el uso experimental o terapéutico del compuesto de unión como se describe en el presente documento.

Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas forman el sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Por lo tanto, en general, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son, en general, los mismos.

Normalmente, los dominios variables de las cadenas tanto pesada como ligera comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), localizadas dentro de regiones marco (FR) relativamente conservadas. Las CDR están habitualmente flanqueadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. En general, desde el N-terminal al C-terminal, los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es, generalmente, de acuerdo con las definiciones de Sequences of proteins of Immunological Interest, Kabat,et al.;National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5.a ed.; NIH Publ. N.° 91-3242 (1991); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978); Kabat,et al.,J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Chothia,et al.,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) o Chothia,et al.,Nature 342:878-883 (1989)].

Como se usa en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en el dominio variable de cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en el dominio variable de cadena pesada). [Véase Kabatet al.Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), definiendo las regiones CDR de un anticuerpo por secuencia; véase también Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.

196: 901-917 (1987) definiendo las regiones CDR de un anticuerpo por estructura]. Como se usa en el presente documento, la expresión restos de la "región marco" o de "FR" se refiere a los restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR.

Como se usa en el presente documento, el término "canino" incluye todos los perros domésticos,Canis lupus familiarisoCanis familiaris,salvo que se indique lo contrario.

Como se usa en el presente documento, la expresión "marco canino" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo canino distinto de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR. Con respecto a un anticuerpo caninizado, en la mayoría de las realizaciones, las secuencias de aminoácidos de las CDR caninas nativas se reemplazan por las<c>D<r>extrañas correspondientes (por ejemplo, aquellas de un anticuerpo de ratón) en ambas cadenas. Opcionalmente las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo canino pueden contener algunos restos extraños no de CDR, por ejemplo, para conservar la conformación de las CDR extrañas dentro del anticuerpo canino y/o modificar la función Fc, como se analiza a continuación.

Hay cuatro subtipos de cadenas pesadas de IgG conocidas de IgG de perro y se las conoce como IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D. Los dos subtipos de cadenas ligeras conocidos se denominanlambdaykappa.

Además de unirse y activar las células inmunitarias caninas, un anticuerpo canino o caninizado contra PD-1 óptimamente tiene dos atributos:

1. Falta de funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y

2. purificarse fácilmente a gran escala usando tecnologías estándar de la industria tales como la basada en la cromatografía de la proteína A.

Ninguno de los isotipos de IgG canina de origen natural satisface ambos criterios. Por ejemplo, IgG-B puede purificarse usando proteína A, pero tiene un elevado nivel de actividad ADCC. Por otra parte, IgG-A se une débilmente a la proteína A, pero muestra una actividad ADCC no deseable. Por otra parte, ni IgG-C ni IgG-D pueden purificarse en columnas de proteína A, aunque IgG-D no muestra actividad ADCC. (IgG-C tiene una actividad ADCC considerable). La presente invención supera esta dificultad proporcionando anticuerpos IgG-B caninos mutantes específicos para PD-1; dichos anticuerpos carecen de funciones efectoras tales como ADCC y pueden purificarse fácilmente usando cromatografía de proteína A convencional de la industria.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo caninizado" se refiere a un anticuerpo que comprende las tres CDR de cadena pesada y las tres CDR de cadena ligera de un anticuerpo murino anti-PD-1 humano junto con un marco canino o un marco canino modificado. Un marco canino modificado comprende uno o más cambios de aminoácidos como se ejemplifica en el presente documento que optimizan adicionalmente la eficacia del anticuerpo caninizado, por ejemplo, para aumentar su unión a PD-1 canino y/o su capacidad para bloquear la unión de PD-1 canino a PD-L1 canino.

"Homología" se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos cuando están alineadas de manera óptima. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si en cada una de las dos moléculas de ADN una posición está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología es el número de posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número total de posiciones comparadas *100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima entonces las dos secuencias son un 60 % homólogas. Generalmente, la comparación se hace cuando dos secuencias se alinean para proporcionar el máximo porcentaje de homología.

"Molécula de ácido nucleico aislada" significa un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos que no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido en el cual el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. Para los fines de esta divulgación, ha de entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias específicas de un ácido nucleico pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte o más proteínas distintas o porciones o fragmentos de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de un ácido nucleico citadas y/o pueden incluir secuencias de vector.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, son contiguas y están en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué estar contiguos. La unión se realiza mediante conexión en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores de oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. También debe entenderse fácilmente que cuando se proporciona en el presente documento una secuencia de ácido nucleico, puede incluir un codón de parada. Sin embargo, como los codones de parada son intercambiables, la inclusión de un codón de parada específico en una secuencia no debe considerarse una parte necesaria de esa secuencia.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se usan indistintamente y todas estas denominaciones incluyen progenie. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que no toda la descendencia tendrá un contenido de ADN exactamente idéntico, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenda hacer denominaciones distintas, estas quedarán claras a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de la línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas. Puede usarse cualquier fuente adecuada de secuencias de inmunoglobulina no reordenadas. Pueden obtenerse secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, de las bases de datos de la línea germinal JOINSOLVER® en el sitio web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del United States National Institutes of Health. Pueden obtenerse secuencias de la línea germinal de ratón, por ejemplo, como se describe en GiudiceMiet al.[Nucleic Acids Res. 33:D256-D261 (2005)].

Propiedades de los anticuerpos anti-PD-1 humanos murinos caninizados ilustrativos

La presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados aislados como se define en las reivindicaciones y métodos de uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en el tratamiento de enfermedades, por ejemplo, el tratamiento del cáncer en caninos. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados que se unen a PD-1 canino incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos que comprenden cadenas pesadas de IgG-A, IgG-B e IgG-D caninas y/o cadenas ligeraskappacaninas junto con CDR anti-PD-1 humano murinas. En consecuencia, la presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones que se unen a PD-1 canino y bloquean la unión de PD-1 canino a PD-L1 canino.

En una realización adicional, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a PD-1 canino comprende una cadena ligerakappade anticuerpo canino que comprende una CDR-1, CDR-2 y CDR-3 de cadena ligera murina y una IgG de cadena pesada de anticuerpo canino que comprende una CDR-1, CDR-2 y CDR-3 de cadena pesada murina.

También se describen en el presente documento anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a PD-1 y tienen cadenas ligeraskappade anticuerpo canino que comprenden CDR que comprenden al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con s Eq ID NO: 20, 22 y/o 24 e IgG de cadena pesada de anticuerpo canino con CDR que comprenden al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con SEQ ID N<o>: 14, 16 y/o 18, sin dejar de presentar las propiedades aglutinantes y funcionales deseadas. En otro caso, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un marco canino que comprende una combinación de secuencias de cadena pesada de IgG (que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, 28 o 30 con y sin secuencia señal) con una cadena ligerakappa(que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 34 con y sin secuencia señal) que tiene hasta 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, sin dejar de presentar las propiedades aglutinantes y funcionales deseadas. En un caso particular, el número de sustituciones de aminoácidos conservativas está entre 0 y 5 para la cadena pesada de IgG y entre 0 y 5 para la cadena ligerakappa.

"Variantes modificadas conservativamente" o "sustitución conservativa" se refieren a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de cadena lateral, hidrofobia/hidrofilia, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.), de tal manera que pueden realizarse cambios con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica [véase, por ejemplo, Watsonet al.,Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Ed.; 1987)]. Además, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden comprender cadenas polipeptídicas con las secuencias desveladas en el presente documento, por ejemplo, S<e>Q ID NO: 26, 28, 30, 32 y/o 34 o cadenas polipeptídicas que comprenden hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos ilustrativas se exponen en la Tabla I.

TABLA I.

continuación

En la presente invención también se contemplan variantes de función conservativa de los anticuerpos de la invención. "Variantes de función conservativa", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos o a fragmentos en los cuales se han cambiado uno o más restos de aminoácidos sin alterar una propiedad deseada, tal como una afinidad y/o especificidad del antígeno. Dichas variantes incluyen, pero no se limitan a, el remplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, tal como las sustituciones de aminoácidos conservativas de la Tabla I.

Ácidos nucleicos

La presente invención comprende además los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de inmunoglobulina de anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos definidos en las reivindicaciones

Por ejemplo, la presente invención incluye los ácidos nucleicos enumerados en las Tablas 2 y 3 y la Tabla de Listado de Secuencias a continuación que codifican los anticuerpos reivindicados.

En el presente documento se describen ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % idénticas, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % idénticas, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % idénticas y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % idénticas (por ejemplo, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98%, un 99%, un 100%) a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en el presente documento cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en el que los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia.

También se describen ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de inmunoglobulina que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos aproximadamente un 70 % similares, preferentemente al menos aproximadamente un 80 % similares, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 % similares y lo más preferentemente al menos aproximadamente un 95 % similares (por ejemplo, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 100 %) a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de referencia cuando la comparación se realiza con un algoritmo BLAST, en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia.

La identidad de secuencia se refiere al grado en el que los aminoácidos de dos polipéptidos son los mismos en posiciones equivalentes cuando las dos secuencias se alinean de manera óptima. La similitud de secuencia incluye restos idénticos y aminoácidos bioquímicamente relacionados no idénticos. Los aminoácidos bioquímicamente relacionados que comparten propiedades similares y que pueden ser intercambiables se analizan anteriormente.

Las siguientes referencias se refieren a algoritmos BLAST usados a menudo para el análisis de secuencias: ALGORITMOS BLAST: Altschul, S.F.,et al.,J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish, W.,et al.,Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden, T.L.,et al.,Meth. Enzymol. 266:131-141(1996); Altschul, S.F.,et al.,Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang, J.,et al.,Genome Res. 7:649-656 (1997); Wootton, J.C.,et al.,Comput. Chem. 17:149-163 (1993); Hancock, J.M.et al.,Comput. Appl. Biosci. 10:67-70 (1994); SISTEMAS DE PUNTUACIÓN DE ALINEAMIENTO: Dayhoff, M.O.,et al.,"A model of evolutionary change in proteins" en Atlas of protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, (1978); Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M.,et al.,"Matrices for detecting distant relationships" en Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3". (1978), M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358 (1978), Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., J. Mol. Biol. 219:555-565 (1991); States, D.J.,et al.,Methods 3:66-70(1991); Henikoff, S.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992); Altschul, S.F.,et al.,J. Mol. Evol. 36:290-300 (1993); ESTADÍSTICAS DE ALINEAMIENTO: Karlin, S.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990); Karlin, S.,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993); Dembo, A.,et al.,Ann. Prob. 22:2022-2039 (1994); y Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments" en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), pp. 1-14, Plenum, Nueva York (1997).

La presente invención también proporciona vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos aislados de la invención, en donde el ácido nucleico está unido operativamente a secuencias de control que son reconocidas por una célula hospedadora cuando la célula hospedadora se transfecta con el vector. También se proporcionan células hospedadoras que comprenden un vector de expresión de la presente invención y métodos para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo desvelados en el presente documento que comprenden cultivar en un medio de cultivo una célula hospedadora que lleva un vector de expresión que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno definido en las reivindicaciones y aislar dicho antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

Unión de epítopos y afinidad de unión

En el presente documento también se describen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al mismo epítopo sobre PD-1 canino que el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y/o de SEQ ID NO: 32, o el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado que comprende la secuencia de aminoácidos ID NO: 28 y/o ID NO: 34. Los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos son capaces de inhibir la unión de PD-1 canino a PD-L1 canino.

El anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado puede producirse de forma recombinante como se describe a continuación en los ejemplos. Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de los anticuerpos o de los fragmentos desvelados en el presente documento son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección americana de cultivos tipo(American Type Culture Collection,ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y una variedad de otras líneas celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen células de ser humano, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, bovino, de caballo y de hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión recombinante codifican la cadena pesada o la porción de unión al antígeno o un fragmento de la misma, la cadena ligera y/o el fragmento de unión a antígeno de la misma se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen mediante el cultivo de las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde crecen las células hospedadoras.

Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras fracciones de los mismos) a partir de líneas celulares de producción puede potenciarse usando diversas de técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es una estrategia habitual para potenciar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza, total o parcialmente, en relación con las patentes europeas N.° 0216846, 0256055 y 0323997 y con la solicitud de patente europea N.° 89303964.4.

En general, las glucoproteínas producidas en una línea celular o animal transgénico particular tendrán un patrón de glucosilación que es característico de las glucoproteínas producidas en la línea celular o el animal transgénico. Por tanto, el patrón de glucosilación particular de un anticuerpo dependerá de la línea celular o animal transgénico particular usado para producir el anticuerpo. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas del ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento, comprenden la presente invención, independiente del patrón de glucosilación que puedan tener los anticuerpos. De forma similar, en realizaciones particulares, los anticuerpos con un patrón de glucosilación que comprende solamente W-glucanos no fucosilados pueden ser ventajosos, debido a que se ha demostrado que estos anticuerpos presentan normalmente una efectividad más potente que sus homólogos fucosilados tantoin vitrocomoin vivo[Véase, por ejemplo, Shinkawaet al.,J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); Patentes de EE.UU. N.° 6.946.292 y 7.214.775].

La presente invención incluye además fragmentos de anticuerpos de los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados definidos en las reivindicaciones. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab)<2>, que pueden producirse por escisión enzimática de una IgG mediante, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos Fab pueden producirse por, por ejemplo, reducción de F(ab)<2>con ditiotreitol o mercaptoetilamina. Un fragmento Fab es una cadena V<l>-C<l>unida a una cadena Vh-Ch1 mediante un puente disulfuro. Un fragmento F(ab)<2>está constituido por dos fragmentos Fab que, a su vez, están unidos por dos puentes disulfuro. La porción Fab de una molécula F(ab)<2>incluye una porción de la región F<c>entre la que se encuentran los puentes disulfuro. Un fragmento F<v>es una región V<l>o V<h>.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante canina, tal como una región constante de cadena pesada canina de IgG-A, IgG-B, IgG-C and IgG-D o una variante de las mismas. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena ligera, por ejemplo, una región constante de cadena ligera canina, tal como una región de cadena ligera kappa. A modo de ejemplo, y sin limitación, la región constante de la cadena pesada canina puede ser de IgG-D y la región constante de la cadena ligera canina puede ser dekappa.

Modificación por ingeniería genética de anticuerpos

Los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados de la presente invención se han modificado por ingeniería genética para incluir modificaciones en los restos marco dentro de los dominios variables de un anticuerpo monoclonal parental (es decir, canino), por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo.

Usos experimentales y de diagnóstico

Los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención también pueden ser útiles en ensayos de diagnóstico para la proteína PD-1 canina, por ejemplo, detectando su expresión en células tumorales específicas, tejidos o suero. Estos métodos de diagnóstico pueden ser útiles en el diagnóstico de diversas enfermedades, particularmente ciertos cánceres en caninos.

Por ejemplo, un método tal comprende las siguientes etapas:

(a) recubrir un sustrato (por ejemplo, la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, una placa de plástico) con un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

(b) aplicar una muestra para analizar la presencia de PD-1 canino al sustrato;

(c) lavar la placa, de tal manera que se elimine el material no unido de la muestra;

(d) aplicar anticuerpos marcados de manera detectable (por ejemplo, anticuerpos ligados a enzimas) que también son específicos del antígeno PD-1;

(e) lavar el sustrato, de tal manera que se eliminen los anticuerpos marcados no unidos;

(f) si los anticuerpos marcados están ligados a enzimas, aplicar una sustancia química que la enzima convierta en una señal fluorescente; y

(g) detectar la presencia del anticuerpo marcado.

En una realización adicional, el anticuerpo marcado está marcado con peroxidasa que reacciona con ABTS [por ejemplo, ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)] o 3,3',5,5'-tetrametilbencidina para producir un cambio de color que sea detectable. De forma alternativa, el anticuerpo marcado está marcado con un radioisótopo detectable (por ejemplo, 3H) que puede detectarse mediante un contador de centelleo en presencia de un agente centelleante. Los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados de la invención pueden usarse en un procedimiento de transferencia Western o inmunotransferencia de proteínas.

Dicho procedimiento forma parte de la presente invención e incluye, por ejemplo:

(i) poner en contacto una membrana u otro sustrato sólido para probar la presencia de PD-1 canino unido o un fragmento del mismo con un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención. Una membrana tal puede tomar la forma de una membrana de nitrocelulosa o basada en vinilo [por ejemplo, fluoruro de polivinilideno (PVDF)] a la que se han transferido las proteínas que se van a probar para determinar la presencia de PD-1 canino en un gel de PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) no desnaturalizante o en un gel de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) (por ejemplo, después de la separación electroforética en el gel). Antes del contacto de la membrana con el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo, la membrana se bloquea opcionalmente, por ejemplo, con leche en polvo desnatada o similar para unir sitios de unión a proteínas inespecíficos en la membrana.

(ii) lavar la membrana una o más veces para eliminar el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado no unido o un fragmento de unión a antígeno del mismo y otras sustancias no unidas; y

(iii) detectar el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado unido o el fragmento de unión a antígeno del mismo.

La detección del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno unido puede realizarse mediante la unión del anticuerpo 0 fragmento de unión a antígeno con un anticuerpo secundario (un anticuerpo anti-inmunoglobulina) que está marcado de manera detectable y, después, detectar la presencia del anticuerpo secundario.

Los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento también pueden usarse para inmunohistoquímica. Un método tal forma parte de la presente invención y comprende, por ejemplo, (1) poner en contacto una célula para probar la presencia de PD-1 canino con un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención; y (2) detectar el anticuerpo o fragmento sobre o en la célula. Si el anticuerpo o el propio fragmento de unión a antígeno está marcado de manera detectable, puede detectarse directamente. De forma alternativa, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se detecta puede unirse mediante un anticuerpo secundario marcado de manera detectable.

Determinados anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento también pueden usarse para la obtención de imágenes tumoralesin vivo.Un método tal puede incluir la inyección de un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o de un fragmento de unión a antígeno del mismo radiomarcados en el cuerpo de un paciente humano para analizar la presencia de un tumor asociado a la expresión de PD-1 canino seguido de la formación de imágenes nucleares del cuerpo del paciente para detectar la presencia del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno marcados, por ejemplo, en loci que comprenden una alta concentración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se unen al tumor.

Las técnicas de obtención de imágenes incluyen imágenes SPECT (por sus siglas en inglés, tomografía de emisión monofotónica) o imágenes PET (por sus siglas en inglés, tomografía de emisión positrónica). Los marcadores incluyen, por ejemplo, yodo-123 (<123>I) y tecnecio 99m (<99m>Tc), por ejemplo, junto con obtención de imágenes por SPECT u<11>C,<13>N,<15>O o<18>F, por ejemplo, junto con imágenes de PET o indio-111 [Véase, por ejemplo, Gordonet al.,International Rev. Neurobiol. 67:385-440 (2005)].

Composiciones farmacéuticas y administración

Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles del anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo se mezcla con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

[Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)].

Las formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico pueden prepararse mezclando con vehículos aceptables, excipientes o estabilizantes en forma de, por ejemplo,polvos liofilizados, pastas, soluciones acuosas o suspensiones [véanse, por ejemplo, Hardman,et al.(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, NY; Avis,et al.(eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman,et al.(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman,et al.(eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY]. En una realización, los anticuerpos anti-PD-1 de la presente invención se diluyen a una concentración apropiada en una solución de acetato de sodio a pH 5 a 6, y se añade NaCl o sacarosa para tonicidad. Los agentes adicionales, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80, pueden añadirse para mejorar la estabilidad.

La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones de anticuerpos, administradas solas o en combinación con otro agente, pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL<50>(la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE<50>(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico (DL<50>/DE<50>). En aspectos particulares, son deseables anticuerpos que presenten índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para su uso en caninos. La dosificación de dichos compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE<50>con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración.

El modo de administración puede variar. Las vías de administración adecuadas incluyen oral, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica o intraarterial.

En realizaciones particulares, el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede administrarse mediante una vía invasiva tal como mediante inyección. En realizaciones adicionales de la invención, un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica del mismo, se administra por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intraarterial, por vía intratumoral o por inhalación, administración por aerosol. La administración por vías no invasivas (por ejemplo, por vía oral; por ejemplo, en una píldora, cápsula o comprimido) también está dentro del alcance de la presente invención.

Las composiciones pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede administrarse mediante inyección con una aguja hipodérmica, incluyendo, por ejemplo, una jeringa precargada o un autoinyector. Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento también pueden administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja; tales como los dispositivos desvelados en las Patentes de EE.UU. N.° 6.620.135; 6.096.002; 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 o 4.596.556.

Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento también pueden administrarse mediante infusión. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos para la administración de composiciones farmacéuticas incluyen: Patente de EE.UU. N.° 4.487.603, que desvela una bomba de microinfusión implantable para dispensar un medicamento a una velocidad controlada; Patente de EE.UU. N.° 4.447.233, que desvela una bomba de infusión de medicamentos para suministrar un medicamento a una velocidad de infusión precisa; Patente de EE.UU. N.° 4.447.224, que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua de fármacos; Patente de EE.UU. N.° 4.439.196, que desvela un sistema de suministro osmótico de fármacos que tiene compartimentos multicámara. Muchos otros de estos implantes, sistemas de administración y módulos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Como alternativa, puede administrarse el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del anticuerpo directamente en una articulación artrítica o una lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología, con frecuencia en una formulación en depósito o de liberación sostenida. Adicionalmente, puede administrarse el anticuerpo PD-1 antihumano murino caninizado en un sistema de administración de fármacos dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico de tejido, dirigido, por ejemplo, a la articulación artrítica o la lesión inducida por patógeno caracterizada por inmunopatología. Los liposomas se dirigirán a y se captarán de manera selectiva por el tejido afectado.

El régimen de administración depende de varios factores, incluyendo la tasa de renovación en suero o en el tejido del anticuerpo terapéutico, el nivel de los síntomas, la inmunogenia del anticuerpo terapéutico y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. Preferentemente, el régimen de administración proporciona suficiente anticuerpo terapéutico para conseguir una mejora en la patología diana, al mismo tiempo que minimiza los efectos secundarios no deseados. En consecuencia, la cantidad de producto biológico administrado depende en parte del anticuerpo terapéutico en particular y de la gravedad de la afección que se trate. Se dispone de orientación para seleccionar las dosis apropiadas de anticuerpos terapéuticos [véase, por ejemplo, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK (1996); Kresina (ed.) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, NY (1991); Bach (ed.) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, NY (1993); Baert,et al.New Engl. J. Med. 348:601-608 (2003); Milgromet al.New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamonet al.New Engl. J. Med. 344:783-792 (2001); Beniaminovitzet al.New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000); Ghoshet al.New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipskyet al.New Engl. J. Med. 343:1594-1602 (2000)].

El veterinario realiza la determinación de la dosis adecuada, por ejemplo, usando parámetros o factores que se sabe o se sospecha en la técnica que afectan al tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y a continuación se incrementa en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Las medidas de diagnóstico importantes incluyen las de síntomas de, por ejemplo, la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas.

Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento pueden proporcionarse mediante infusión continua o mediante dosis administradas, por ejemplo, cada día, 1-7 veces a la semana, semanalmente, cada quince días, mensualmente, dos veces al mes, trimestralmente, cada seis meses, anualmente, etc. Las dosis pueden proporcionarse, por ejemplo, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía tópica, por vía oral, por vía nasal, por vía rectal, intramuscular, por vía intracerebral, por vía intramedular o por inhalación. Una dosis semanal total es generalmente de al menos 0,05 pg/kg de peso corporal, más generalmente al menos 0,2 pg/kg, 0,5 pg/kg, 1 pg/kg, 10 pg/kg, 100 pg/kg, 0,25 mg/kg, 1,0mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/ml, 10mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg o más [véanse, por ejemplo, Yang,et al.New Engl. J. Med. 349:427-434 (2003); Herold,et al.New Engl. J. Med. 346:1692-1698 (2002); Liu,et al.J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456 (1999); Portielji,et al.Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144 (2003)]. También pueden proporcionarse dosis para lograr una concentración diana predeterminada del anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado en el suero del sujeto, tal como 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 pg/ml o más. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado de la presente invención se administra por vía subcutánea o intravenosa, en una base semanal, cada quince días, "cada 4 semanas", mensual, bimestral o trimestral a 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 o 2500 mg/sujeto.

Como se usa en el presente documento, "inhibir" o "tratar" o "tratamiento" incluye un aplazamiento del desarrollo de los síntomas asociados a un trastorno y/o una reducción en la gravedad de los síntomas de dicho trastorno. Los términos incluyen además mejorar los síntomas no deseados o incontrolados existentes, prevenir síntomas adicionales y aliviar o prevenir las causas subyacentes de dichos síntomas. Por lo tanto, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto vertebrado con un trastorno, enfermedad o síntoma o con el potencial de desarrollar tal trastorno, enfermedad o síntoma.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención que, cuando se administra solo o en combinación con un agente terapéutico adicional a una célula, tejido, o sujeto, es eficaz para provocar una mejora medible en uno o más síntomas de una enfermedad o afección o la progresión de dicha enfermedad o afección. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a la cantidad de compuesto de unión suficiente para producir al menos una mejora parcial de los síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación, prevención o alivio de la afección médica relevante, o aumentar la tasa de tratamiento, curación, prevención o alivio de dichas afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o de manera simultánea. Una cantidad eficaz de un agente terapéutico dará como resultado una mejora de una medición o parámetro de diagnóstico en al menos un 10%; habitualmente en al menos un 20%; preferentemente al menos aproximadamente un 30 %; más preferentemente al menos un 40 % y lo más preferentemente al menos un 50 %. Una cantidad eficaz también puede dar como resultado una mejora en una medida subjetiva en los casos en que se usan medidas subjetivas para evaluar la gravedad de la enfermedad.

Otras terapias de combinación

Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede coadministrarse con uno u otros agentes terapéuticos (tales como un agente quimioterapéutica). El anticuerpo puede estar enlazado al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o simultáneamente con el agente o puede administrarse de manera conjunta con otras terapias conocidas.

Kits

Se proporcionan además kits que comprenden uno o más componentes que incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, como se analiza en el presente documento, que se une específicamente a PD-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención) en asociación con uno o más componentes adicionales incluyendo, pero no limitado a un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un agente quimioterapéutico, como se analiza en el presente documento. La composición de unión y/o el agente quimioterapéutico pueden formularse como una composición pura o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica.

En una realización, el kit incluye una composición de unión de la invención (el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 e ID NO: 32 o 34 o una composición farmacéutica de los mismos en un recipiente (por ejemplo, en un vial esterilizado de vidrio o plástico) y/o una composición farmacéutica del mismo y/o un agente quimioterapéutico en otro recipiente (por ejemplo, en un vial esterilizado de vidrio o plástico).

En otra realización, el kit comprende una combinación de la invención, incluyendo un componente de composición de unión (por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 humano murino caninizado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y de SEQ ID NO: 32 o 34) junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en combinación con uno o más componentes de agentes terapéuticos formulados juntos, opcionalmente, en una composición farmacéutica, en un recipiente individual común.

Si el kit incluye una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto, el kit puede incluir un dispositivo para realizar dicha administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección como se analiza anteriormente. El kit también puede incluir un prospecto que incluya información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación en el kit. Generalmente, dicha información ayuda a los dueños de mascotas y a los veteranos a usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación adjuntas de manera eficaz y segura. Por ejemplo, la siguiente información sobre una combinación de la invención puede proporcionarse en el prospecto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración adecuadas, cómo suministrarlo, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias, información sobre el fabricante/distribuidor e información sobre patentes.

Por cuestiones de conveniencia, un anticuerpo o agente de unión específico desvelado en el presente documento puede proporcionarse en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico o detección. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar unas concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivos que tiene la concentración apropiada.

Ejemplos

EJEMPLO 1

PD-1 Y PD-L1 CANINOS

Identificación y clonación de PD-1 canino:

Un ácido nucleico que codifica un PD-1 canino de longitud completa (cPD-1) se identificó a través de una búsqueda en las bases de datos del banco de genes del NCBI (número de registro XM_543338.4, SEQ ID NO: 1). La secuencia de aminoácidos traducida SEQ ID NO: 2 (número de registro XP-543338.3) corresponde a la proteína PD-1 canina putativa que se identificó adicionalmente mediante búsquedas en las bases de datos de proteínas del banco de genes (NCBI) y alineando la secuencia de aminoácidos identificada con secuencias de aminoácidos de PD-1 murino, felino y humano. La secuencia de ADN correspondiente al gen PD-1 canino de longitud completa que tenía un codón optimizado para células CHO se sintetizó y se clonó en un plásmido designado p96793. La comparación de secuencias de ADN y proteínas de PD-1 canino predicho con secuencias conocidas de ADN y proteínas de PD-1 condujo a la identificación de las secuencias de<a>D<n>que codifican el dominio extracelular (ECD) de PD-1 canino (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos del ECD de PD-1 canino (SEQ ID NO: 4).

Se sintetizó una secuencia de ADN que codifica el ECD del PD-1 canino además de un enlazador GT y 8 restos de histidina y se clonó en un plásmido denominado LPD2726. Una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) correspondiente al ECD del PD-1 canino más un enlazador GT y la parte Fc del gen Fc de la IgG1 humana se sintetizó químicamente y se clonó en un plásmido denominado LPD2727. El ECD del PD-1 canino y la parte Fc de la IgG1 humana comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

Identificación y clonación de PD-L1 canino:

Se identificó un ácido nucleico que codifica un PD-L1 canino de longitud completa mediante una búsqueda en las bases de datos del banco de genes del NCBI (número de registro XM_541302.4; SEQ ID NO: 7). La secuencia de aminoácidos traducida (número de registro XP-541302.4; SEQ ID NO: 8) correspondiente a la proteína PD-L1 canina putativa se identificó buscando en las bases de datos de proteínas del banco de genes (NCBI) y alineando la secuencia identificada con secuencias conocidas de PD-L1 de ratón y humano.

La comparación del ADN que codifica PD-L1 canino con secuencias de PD-L1 conocidas identificó la secuencia de ADN correspondiente al dominio ECD de PD-L1 canino (SEQ ID NO: 9; que se optimizó por codones para células CHO). La secuencia de aminoácidos predicha del ECD del PD-L1 canino es SEQ ID NO: 10. El ADN que codifica el ECD del PD-L1 más enlazador GT y 8 restos de histidina se sintetizó y se clonó en un plásmido designado LPD2695.

Se sintetizó químicamente una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del ECD del PD-L1 canino más enlazador GT y la parte Fc del Fc de la IgG1 humana (SEQ ID NO: 11) y se clonó en un plásmido designado LPD2697. El ECD del PD-L1 canino más el enlazador GT y la parte Fc de la IgG1 humana comprenden la secuencia de aminoácidos ID NO: 12. La Tabla 1 contiene una descripción de los plásmidos de expresión mencionados anteriormente.

T l 1

Expresión de proteínas PD-1 y PD-L1:

Los plásmidos de expresión que codifican las proteínas PD-1ECD-HIS, PD-1ECD-Fc, PDL-1 ECD-HIS y PD-L1ECD-Fc se transfectaron en células HEK 293 y las proteínas se purificaron del sobrenadante de las células transfectadas usando Proteína A para proteínas de fusión Fc o con níquel (Ni2+) para proteínas etiquetadas con HIS. Las proteínas purificadas se usaron para: ELISA o ensayos de unión como se detalla a continuación. Las proteínas expresadas se analizaron mediante geles SDS-PAGE.

EJEMPLO 2

IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTIHUMANOS MURINOS QUE SE UNEN AL PD-1 CANINO

Confirmación de la reactividad de los anticuerpos monoclonales frente a PD-1 canino

Uno de los anticuerpos monoclonales de ratón que se habían generado anteriormente contra PD-1 humano [hPD-1.08A, identificado en el documento US 8.354.509 B2, incorporado de esta manera por referencia en su totalidad] también se descubrió que reaccionaba fuertemente con PD-1 canino. Se analizó la reactividad de hPD-1.08A purificado con el dominio ECD etiquetado con HIS de PD-1 canino mediante ELISA como sigue: La proteína ECD de PD-1 canino etiquetado con HIS se diluye a 10 pg/ml en tampón de recubrimiento (Carbonato/Bicarbonato pH 9,0) y se dispensa a 100 pl/pocillo en placas ELISA de fondo plano de 96 pocillos (NUNC). Las placas se incuban a 4 °C durante una noche. Las placas se lavan después tres veces con solución salina tamponada con fosfato que contiene Tween-20 (PBST) al 0,05 %. A continuación, se añaden 200 pl de tampón de bloqueo (leche desnatada al 5 % en PBST) a cada pocillo y las placas se incuban a 37 °C durante 60 minutos.

Las placas se lavan después tres veces con PBST. A continuación, se añaden 100 |jl de anticuerpos monoclonales (mAb) de prueba diluidos en tampón de bloqueo a los primeros pocillos de las columnas apropiadas. Los mAb de prueba se diluyen después dos veces hasta la posición adecuada de la placa. Después de la incubación de las placas a 37 °C durante 60 minutos, las placas se lavan tres veces con PBST. A continuación, se añaden a las placas 100 j l por pocillo de una dilución 1:2.000 de una IgG de cabra anti-ratón (KPL) conjugada con peroxidasa de rábano picante, que después se incuba a 37 °C durante 60 minutos. Después las placas se lavan tres veces con PBST y se añaden 100 jl/pocillo de sustrato 3,3',5,5' tetrametil bencidina, (TMB) (de KPL) a las placas. Se deja que se desarrolle la reacción de color durante 5-20 minutos a 37 °C antes de medir la absorbancia a 650 nm.

Células CHO que expresan la proteína PD-1 canina

El gen canino PD-1 de longitud completa se clonó en el plásmido p96793. En este plásmido la expresión de la proteína PD-1 canina está impulsada por un promotor hCMV. Las células CHO DXB11 (dhfr-) se mantuvieron en MEM-alfa (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10 %.

La transfección de células CHO con el plásmido p96793 se realizó en matraces de 75 cm<2>que contienen aproximadamente 6*10<®>células mediante administración de genes mediada por liposomas usando Lipofectamine (Invitrogen). Después de 48 horas, las células se pasaron a medio MEM-alfa sin nucleósidos, suplementado con FBS al 10 % y 400 jg/m l de higromicina B (medio selectivo). La clonación de dilución limitada se realizó en el conjunto de dhfr+, células resistentes a la higromicina. Se evaluó la expresión de PD-1 canino en los clones mediante ensayo de inmunofluorescencia. Brevemente, las monocapas celulares se fijaron en placas de 96 pocillos con acetona al 80 %. Después se incubaron monocapas de células fijadas y secas durante 1 hora con un anticuerpo policlonal de cabra anti-PD-1 humano (R&D Systems). Las placas se lavaron con PBS, después se incubaron durante 1 hora con un anticuerpo de conejo anti-IgG de cabra (KPL) marcado con fluoresceína. Las placas se lavaron con PBS. Los clones que presentaban fluorescencia se expandieron y se establecieron reservas de células.

Reactividad de mab de ratón contra proteínas PD-1 caninas expresadas en células CHO

La reactividad de los mAb anti-PD-1 humano de ratón con PD-1 canino en células CHO se determinó mediante un ensayo basado en células usando células CHO que expresan PD-1. Brevemente, las células CHO que expresaban PD-1 canino se cultivaron hasta una confluencia del 80-100 % en 50 j l de medio (DMEM/F12 de H<a>M, FBS al 10 %; "Medios CHO"). A continuación, se añadieron 50 j l de medios que contenían diversas concentraciones de mAb purificados durante 1 hora a 37 °C. Después de tres lavados con PBS-TWEEN, se añadieron 100 j l de peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-ratón de cabra diluido 1:1000 en medios de cultivo durante una hora a 37 °C. Después de tres lavados adicionales con PBS-TWEEN, los mAb unidos se visualizaron con un sustrato de peroxidasa (TMB). El aumento de absorbancia debido a la actividad de la peroxidasa a 450 nm se midió en un lector de microplacas. El desarrollo del color se detiene añadiendo 50 j l por pocillo de ácido fosfórico 1 M.

Bloqueo de ligando por mAb anti-PD-1 caninizados y de ratón

Para mAb de PD-1 antihumano de ratón que reaccionan con PD-1 canino, se usó un ensayo ELISA basado en células (CELISA) basado en la línea celular CHO que expresa PD-1 canino. El bloqueo del ligando se confirmó usando este ensayo junto con la proteína cPD-L1/Fc biotinilada. Brevemente, se sembraron células cPD-1 CHO en placas de 96 pocillos a 4*10<4>células por pocillo y se incubaron las células a 37 °C durante 18-24 horas hasta que tuvieran una confluencia del 95-100 %. Aspirar medios de cultivo celular, lavar las placas 3 veces con PBS Tween20 al 0,05 % y 1x medio CHO. Hacer diluciones en serie de 3 veces de mAb anti-cPD1 en medio CHO, comenzando a 30 jg/m l y añadir 50 jl/pocillo de cada dilución de anticuerpo a la placa. Incubar a 37 °C, CO<2>al 5 % con agitación durante 30 min. Añadir 50 jl/pocillo de cPD-L1-Fc-biotina (2 ug/ml en medio CHO) y continuar incubando a 37 °C, CO<2>al 5 % con agitación durante 45 min. Lavar las placas seis veces con PBS Tween 20 al 0,05%. Añadir 100 ul/pocillo de peroxidasa de rábano-estreptavidina 1:2000 (estreptavidina-HRP) en medio CHO e incubar 30-60 min a 37 °C/CO<2>al 5 %. Lavar las placas cinco veces con PBS Tween20 al 0,05 %. Añadir 100 jl/pocillo de sustrato de desarrollo de color TMB. Detener el desarrollo del color añadiendo 50 jl/pocillo de ácido fosfórico 1 M. Medir la densidad óptica (D.O.) a A450 - A620 usando un lector de placas ELISA.

Clonación e identificación de secuencias de ADN correspondientes a Hpd de ratón-mAb .08A

La secuencia de ADN de las cadenas VH y VL de ratón y las secuencias de ADN que codifican sus CDR se identifican como se describe en el documento US 8.354.509 [véase, Tabla IV del documento US 8.354.509; proporcionada en la Tabla 2 directamente a continuación].

T l 2

continuación

EJEMPLO 3

CANINIZACIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-PD-1 HUMANO DE RATÓN

Para ejecutar el proceso de caninización, se determinó la secuencia de ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de IgG canina. La secuencia de ADN y proteína de las cadenas ligera y pesada canina se conocen en la técnica y pueden obtenerse buscando en las bases de datos de genes y proteínas de NCBI. Hay cuatro subtipos de IgG conocidas de IgG de perro y se denominan IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D. Hay dos tipos de cadenas ligeras en los anticuerpos caninos denominadas kappa y lambda. La Tabla 3 enumera tanto las secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos de las cadenas de anticuerpos pesadas (IgG-A, IgG-B, IgG-D) y ligeras(Kappa)caninas modificadas de la presente invención que comprenden las CDR murinas anti-PD-1 humano de la Tabla 2.

T l

Construcción de anticuerpos anti PD-1 caninizados

Sin desear quedar ligados a ninguna estrategia específica, el proceso de producción de variantes de mAb anti-PD-1 caninizados con diversos contenidos de secuencias caninas y de ratón implicó el siguiente esquema general:

i) Determinar la secuencia de ADN de las cadenas VH y VL de mab de ratón

ii) Identificar las CDR de cadena H y L de mab de ratón

iii) Identificar una cadena H y L adecuada de IgG canina

iv) Escribir la secuencia de ADN de las cadenas H y L de IgG canina

v) Reemplazar la secuencia de ADN que codifica las CDR de cadena H y L endógenas de perro con secuencias de ADN que codifican las respectivas CDR de ratón. También, opcionalmente reemplazar algunos restos del marco canino con restos seleccionados de las regiones correspondientes del marco del ratón.

vi) Sintetizar el ADN de la etapa (v) y clonarlo en un plásmido de expresión adecuado

vii) Transfectar plásmidos en células HEK 293

viii) Purificar el anticuerpo expresado a partir del sobrenadante de HEK 293

ix) Probar el anticuerpo purificado para determinar la unión a PD-1 canino

Las etapas descritas anteriormente dieron como resultado un conjunto de anticuerpos variantes con diversos contenidos de secuencias caninas y de ratón. La presente invención identifica los anticuerpos anti-PD-1 humano murinos caninizados que comprenden SEQ ID NO: 28 e ID NO: 32 o 34 por tener una unión particularmente estrecha con PD-1 canino.

Secuencia de ADN de PD-1 canino de longitud completa: secuencia señalsubrayada y en negrita

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 1 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 35 incluye la secuencia señal.

atggggagccggcgggggccctggccgctcgtctgggccgtgctgcagctgggctggtggccaggatggctcctagactcccctgacaggccctggagcccgctcaccttctccccggcgcagctcacggtgcaggagggagagaacgccac gttcacctgcagcctggccgacatccccgacagcttcgtgctcaactggtaccgcctgagcccccgcaaccagacg gacaagctggccgccttccaggaggaccgcatcgagccgggccgggacaggcgcttccgcgtcatgcggctgccca acgggcgggacttccacatgagcatcgtcgctgcgcgcctcaacgacagcggcatctacctgtgcggggccatcta cctgccccccaacacacagatcaacgagagtccccgcgcagagctctccgtgacggagagaaccctggagcccccc acacagagccccagccccccacccagactcagcggccagttgcaggggctggtcatcggcgtcacgagcgtgctgg tgggtgtcctgctactgctgctgctgacctgggtcctggccgctgtcttccccagggccacccgaggtgcctgtgt gtgcgggagcgaggacgagcctctgaaggagggccccgatgcagcgcccgtcttcaccctggactacggggagctg gacttccagtggcgagagaagacgccggagcccccggcgccctgtgccccggagcagaccgagtatgccaccatcg tcttcccgggcaggccggcgtccccgggccgcagggcctcggccagcagcctgcagggagcccagcctccgagccc cgaggacggacccggcctgtggcccctctga

Secuencia de aminoácidos de PD-1 canino de longitud completa: secuencia señalsubrayada y en negrita

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 2 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 36 incluye la secuencia señal.

MGSRRGPWPLVWAVLQLGWWPGWLLDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQT

DKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPP

TQSPSPPPRLSGQLQGLVIGVTSVLVGVLLLLLLTWVLAAVFPRATRGACVCGSEDEPLKEGPDAAPVFTLDYGEL

DFQWREKTPEPPAPCAPEQTEYATIVFPGRPASPGRRASASSLQGAQPPSPEDGPGLWPL

Secuencia de ADN_dominio extracelular PD-1 canino:SEQ ID NO: 3(optimizado por codón para expresión en células CHO)

ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccaggaaggcgagaatg ccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggtacagactgagccccaggaacca gaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaacccggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctg cccaacggcagggacttccacatgtccatcgtggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgcta tctacctgccccccaacacccagatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacc tcccacccagagcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtg

Dominio extracelular de PD-1 canino:SEQ ID NO:4:

LDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRL

PNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLV

Dominio extracelular de PD-1 canino - secuencia de ADN de Fc de IgG1 humana:SEQ ID NO: 5(optimizado por codón para expresión en células HEK-293)

ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccaggaaggcgagaatg ccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggtacagactgagccccaggaacca gaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaacccggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctg cccaacggcagggacttccacatgtccatcgtggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgcta tctacctgccccccaacacccagatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacc tcccacccagagcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtgggtaccgacaaaactcac acatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggaca ccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagtt caactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaaca aagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccct gcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac atcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacg

gctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgt gatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

Dominio extracelular de PD-1 canino - proteína de fusión de Fc de IgG1 humana: secuencia señalsubrayada y en negrita: SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 53 incluye la secuencia señal.

MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQALDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRN

QTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLE

PPTQSPSPPPRLSGQLQGLVGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVK

FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT

LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS

VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Secuencia de ADN de PD-L1 canino de longitud completa: secuencia señalsubrayada y en negrita

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 7 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 37 incluye la secuencia señal.

atgagaatgtttagtgtctttacattcatggcctactgccatttgctaaaagcatttacgatcacaqtttctaaqqacctqtatgtqqtaqagtatqqtqqcaatqtgacaatgqaatqcaaattcccqqtqqaaaaacaqttaaacttqtt tgcactaatcgtctactgggaaatggaggataaaaaaattatacaatttgtgaatggaaaggaagacctgaaagtt cagcacagcagctacagccagagggctcagctattgaaggaccagctcttcttggggaaggctgcgcttcagatca cagatgtgagattgcaggatgcaggggtttactgctgcttgatcggctatggcggtgctgactacaagcggattac tttgaaagttcatgccccgtaccgcaacatcagccaaagaatttctgtggatcctgtcacctctgaacatgaacta atgtgtcaggctgagggttaccctgaggctgaagtcatctggacaagcagtgaccaccgagtcctgagtggcaaaa ccaccatcactaattccaatagggaagagaagcttttcaatgtgaccagcacgctgaacatcaatgcaacagctaa tgagattttctactgcacttttcaaagatcaggtcctgaggaaaacaatactgccgagttggtcatcccagaacga ctgcccgttccagcaagtgagaggactcatttcatgattctgggacctttcctgttgcttcttggtgtagtcctgg cagtcactttctgtctaaaaaaacatgggagaatgatggatgtggaaaaatgttgcacccgagataggaactcaaa gaaacgaaatgatatacaatttgaagagacataa

PD-L1 canino de longitud completa: secuencia señalsubrayada y en negrita

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 8 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 38 incluye la secuencia señal.

MRMFSVFTFMAYCHLLKAFTITVSKDLYWEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKV

QHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHEL

MCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPER

LPVPASERTHFMILGPFLLLLGWLAVTFCLKKHGRMMDVEKCCTRDRNSKKRNDIQFEET

Secuencia de ADN del dominio extracelular de PD-L1 canino:SEQ ID NO: 9(optimizado por codón para expresión en células CHO)

tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtgcaagttccccg tggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggacaagaagatcatccagttcgtgaa cggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccagagagcccagctgctgaaggaccagctgttcctg ggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgagactgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggag gcgccgactacaagaggatcaccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcc cgtgaccagcgagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcgac cacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacgtgaccagcaccc tcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagcggccccgaagagaacaacaccgc cgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcgagaggacccac

Proteína de dominio extracelular de PD-L1 canino:SEQ ID NO: 10

FTITVSKDLYWEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFL

GKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSD

HRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTH

Dominio extracelular de PD-L1 canino - secuencia de ADN de Fc de IgG1 humana:SEQ ID NO: 11(optimizado por codón para expresión en células HEK-293)

tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtgcaagttccccg tggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggacaagaagatcatccagttcgtgaa cggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccagagagcccagctgctgaaggaccagctgttcctg ggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgagactgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggag gcgccgactacaagaggatcaccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcc cgtgaccagcgagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcgac cacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacgtgaccagcaccc tcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagcggccccgaagagaacaacaccgc cgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcgagaggacccacggtaccgacaaaactcacacatgc ccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctca tgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg gtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtg gtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccc tcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccccc atcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgcc gtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctcct tcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgca tgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

Dominio extracelular de PD-L1 canino - proteína de fusión de Fc de IgG1 humana:SEQ ID NO: 12

FTITVSKDLYWEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFL

GKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSD

HRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTHGTDKTHTC

PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV

VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

ADN de CDR VH : H1 de 08A:SEQ ID NO: 13:

agttattatc tgtac

Proteína CDR VH : H1 de 08A:SEQ ID NO: 14:

SerTyrTyr Leu Tyr

ADN de CDR VH : H2 de 08A:SEQ ID NO: 15:

ggggttaatc ctagtaatgg tggtactaac ttcagtgaga agttcaag

Proteína CDR VH : H2 de 08A:SEQ ID NO: 16:

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe Lys

ADN de CDR VH : H3 de 08A:SEQ ID NO: 17:

agggattcta actacgacgg gggctttgac tac

Proteína CDR VH : H3 de 08A:SEQ ID NO: 18:

Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr

ADN de CDR VL : L1 de 08A:SEQ ID NO: 19:agggccagca aaagtgtcag tacatctggc tttagttatt tgcac Proteína CDR VL : L1 de 08A:SEQ ID NO: 20:Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Leu His ADN de CDR VL : L2 de 08A:SEQ ID NO: 21:cttgcatcca acctagagtc t

Proteína CDR VL : L2 de 08A:SEQ ID NO: 22:

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

ADN de CDR VL : L3 de 08A:SEQ ID NO: 23:

cagcacagtt gggagcttcc gctcacg

Proteína CDR VL : L3 de 08A:SEQ ID NO: 24:

Gin His Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

Anticuerpo 08A anti-PD-1 humano murino caninizado

canVH-canIgGB-Fc (secuencia señal 12G8subrayada y en negrita) : CADENA PESADA

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 27 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 41 incluye la secuencia señal.

ATGGCCGTGCTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTGCTAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGT

CCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCGTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTA

CTACCTGTACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAAGGACTGCAGTGGATCGGCGGCGTGAATCCTAGCAACGGCGGC

ACCAACTTCAGCGAGAAGTTCAAGAGCAGGGCCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCGCCTACATGCAGC

TGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGAGGGACAGCAACTACGACGGCGGCTTCGA

CTACTGGGGACAGGGAACCCTGCTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACAACCGCGCCATCAGTCTTTCCGTTGGCCCCA

TCATGCGGGTCGACGAGCGGATCGACTGTGGCCCTGGCGTGCTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAACCCGTCACGG

TCAGCTGGAACTCCGGATCGCTTACGAGCGGTGTGCATACGTTCCCCTCGGTCTTGCAATCATCAGGGCTCTACTC

GCTGTCGAGCATGGTAACGGTGCCCTCATCGAGGTGGCCCTCCGAAACGTTCACATGTAACGTAGCACATCCAGCC

TCCAAAACCAAGGTGGATAAACCCGTGCCGAAAAGAGAGAATGGGCGGGTGCCTCGACCCCCTGATTGCCCCAAGT

GTCCGGCTCCGGAAATGCTCGGTGGACCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCCAAGGACACTCTGCTGATCGC

GCGCACTCCAGAAGTAACATGTGTAGTGGTGGACCTTGATCCCGAGGACCCCGAAGTCCAGATCTCCTGGTTTGTA

GATGGGAAACAGATGCAGACCGCAAAAACTCAACCCAGAGAGGAGCAGTTCAACGGAACATACCGAGTGGTATCCG

TCCTTCCGATTGGCCACCAGGACTGGTTGAAAGGGAAGCAGTTTACGTGTAAAGTCAACAATAAGGCGTTGCCTAG

CCCTATTGAGCGGACGATTTCGAAAGCTAGGGGACAGGCCCACCAGCCATCGGTCTATGTCCTTCCGCCTTCCCGC

GAGGAGCTCTCGAAGAATACAGTGAGCCTTACATGCCTCATTAAGGATTTCTTCCCGCCTGATATCGACGTAGAGT

GGCAATCAAACGGTCAACAGGAGCCGGAATCCAAGTATAGAACCACTCCGCCCCAGCTTGACGAGGACGGATCATA

CTTTTTGTATTCAAAACTGTCGGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGAGAGGTGACACCTTCATCTGTGCGGTGATGCAC

GAAGCACTCCATAATCACTACACCCAAGAGAGCCTCTCGCATTCCCCCGGAAAGTGA

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 28 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 42 incluye la secuencia señal.

MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGYTFTSYYLYWVRQAPGKGLQWIGGVNPSNGG

TNFSEKFKSRATLSVDKAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTLLTVSSASTTAPSVFPLAP

SCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPA

SKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLDPEDPEVQISWFV

DGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSR

EELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMH

EALHNHYTQESLSHSPGK

canVH-canIgGA-Fc (secuencia señal 12G8subrayada y en negrita) : CADENA PESADA

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 25 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 39 incluye la secuencia señal.

ATGGCCGTGCTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTGCTAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGT

CCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCGTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTA

CTACCTGTACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAAGGACTGCAGTGGATCGGCGGCGTGAATCCTAGCAACGGCGGC

ACCAACTTCAGCGAGAAGTTCAAGAGCAGGGCCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCGCCTACATGCAGC

TGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGAGGGACAGCAACTACGACGGCGGCTTCGA

CTACTGGGGACAGGGAACCCTGCTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACAACGGCTCCGTCGGTGTTTCCCCTGGCACCT

AGCTGCGGGTCGACCTCGGGTAGCACAGTGGCGCTGGCGTGTTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAGCCGGTAACGG

TGTCATGGAACTCAGGGTCACTTACATCAGGAGTCCATACTTTTCCGTCCGTGCTGCAGTCAAGCGGCTTGCATTC

ACTGTCCTCGATGGTGACGGTGCCTTCGTCGAGGTGGCCCAGCGAAACGTTCACTTGTAACGTAGTACACCCGGCC

TCCAACACGAAAGTCGATAAACCGGTATTCAATGAGTGCAGATGTACAGACACCCCTCCCTGTCCGGTACCCGAAC

CCCTTGGAGGGCCGAGCGTCCTCATCTTCCCTCCCAAGCCAAAAGACATCTTGCGCATTACGAGGACACCAGAAGT

CACGTGCGTAGTGCTTGATCTCGGTAGAGAAGATCCCGAGGTCCAGATCTCGTGGTTTGTGGATGGAAAGGAGGTC

CACACCGCAAAGACTCAGTCGCGCGAGCAGCAGTTCAATGGCACGTATCGGGTCGTGAGCGTGCTTCCTATCGAGC

ATCAGGACTGGCTCACCGGGAAGGAGTTCAAATGCCGGGTCAATCATATCGACCTCCCGTCACCAATCGAGCGGAC

CATCTCGAAGGCTAGAGGAAGGGCGCACAAACCTTCGGTCTATGTGCTTCCCCCATCGCCCAAAGAGCTTTCCTCG

TCGGATACGGTGTCCATTACATGCTTGATTAAGGACTTCTATCCTCCTGATATTGATGTGGAATGGCAATCAAACG

GACAGCAGGAGCCGGAACGCAAGCACCGAATGACCCCACCGCAATTGGACGAAGATGGTAGCTACTTTCTCTACTC

AAAGCTCTCAGTCGACAAATCCCGATGGCAGCAGGGAGATCCCTTCACTTGCGCCGTGATGCACGAGACACTCCAA

AATCATTACACGGACCTTTCGTTGAGCCACTCGCCCGGAAAG

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 26 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 40 incluye la secuencia señal.

MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGYTFTSYYLYWVRQAPGKGLQWIGGVNPSNGG

TNFSEKFKSRATLSVDKAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTLLTVSSASTTAPSVFPLAP

SCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNWHPA

SNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEV

HTAKTQSREQQFNGTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSS

SDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQ

NHYTDLSLSHSPGK

canVH-canIgGD-Fc (secuencia señal 12G8subrayada y en negrita) : CADENA PESADA

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 29 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 43 incluye la secuencia señal.

ATGGCCGTGCTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTGCTAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGT

CCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCGTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTA

CTACCTGTACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAAGGACTGCAGTGGATCGGCGGCGTGAATCCTAGCAACGGCGGC

ACCAACTTCAGCGAGAAGTTCAAGAGCAGGGCCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCGCCTACATGCAGC

TGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGAGGGACAGCAACTACGACGGCGGCTTCGA

CTACTGGGGACAGGGAACCCTGCTGACCGTGTCCAGCGCTTCAACCACAGCGCCGAGCGTGTTCCCTCTGGCGCCG

TCGTGCGGTTCCACCTCGGGATCAACAGTGGCCCTCGCCTGTCTCGTGAGCGGATACTTTCCGGAGCCTGTCACGG

TGTCGTGGAATAGCGGATCACTCACGTCGGGCGTGCATACTTTTCCATCCGTCTTGCAATCGAGCGGATTGTACTC

ACTCTCCTCAACCGTCACTGTCCCCTCGTCGCGCTGGCCCTCGGAGACTTTTACGTGCAATGTAGTCCATCCGGCG

AGCAACACGAAGGTCGACAAGCCCGTACCCAAGGAATCAACATGCAAGTGCATCTCGCCCTGTCCCGTCCCCGAAT

CCCTTGGTGGCCCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCTAAAGACATCTTGAGAATCACAAGAACACCGGAAAT

CACGTGTGTGGTCCTTGACTTGGGACGCGAGGACCCTGAGGTACAAATCTCGTGGTTTGTGGACGGGAAAGAGGTG

CACACAGCAAAGACACAACCACGCGAGCAGCAGTTTAACTCAACGTACAGGGTAGTATCCGTACTTCCCATTGAAC

ACCAGGATTGGCTCACCGGTAAAGAATTCAAATGCCGAGTGAATCACATCGGGCTTCCTAGCCCAATTGAGCGGAC

GATTTCCAAAGCTAGGGGTCAGGCCCACCAGCCGAGCGTATACGTGTTGCCGCCCTCCCCGAAGGAGCTGTCATCG

TCAGATACGGTAACGTTGACGTGTCTGATCAAAGATTTCTTTCCTCCCGAAATTGATGTGGAATGGCAAAGCAATG

GGCAGCCCGAGCCCGAGTCAAAGTACCATACTACTGCACCACAGCTGGACGAAGATGGATCGTATTTCCTCTACTC

GAAACTGTCCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGCAAGGGGACACCTTCACTTGCGCGGTCATGCACGAGGCACTTCAG

AACCACTATACGGACTTGAGCCTCTCGCATTCGCCAGGGAAG

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 30 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 44 incluye la secuencia señal.

MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGYTFTSYYLYWVRQAPGKGLQWIGGVNPSNGG

TNFSEKFKSRATLSVDKAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTLLTVSSASTTAPSVFPLAP

SCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNWHPA

SNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEV

HTAKTQPREQQFNSTYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSS

SDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQ

NHYTDLSLSHSPGK

canVL-canKappa(1022) (secuencia señal xHGFsubrayada y en negrita: CADENA LIGERA

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 33 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 47 incluye la secuencia señal.

ATGGATATGAGAGTACCTGCACAACTTCTGGGATTGCTGCTTCTTTGGCTGAGAGGGGCCCGCTGCGATATCGTCC

TGACCCAGACCCCTCCTAGCCTGTCCGTGAGCCCTGGAGAACCCGCCAGCATCAGCTGCAGGGCCTCCAAGAGCGT

GAGCACCAGCGGCTTCAGCTACCTGCACTGGTACAGGCAGAAGCCCGGACAGCCTCCTCAGCTGCTGATCTTCCTG

GCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCTGACAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGAGGATCT

CCAGGGTGGAAGCCGACGACGCCGGAGTGTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAACTGCCCCTGACCTTCGGCCAGGG

CACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCAT

ACGGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACG

GGGTAATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTC

AACCTTGACGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCC

TCCACTCTTATCAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 34 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 48 incluye la secuencia señal.

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVLTQTPPSLSVSPGEPASISCRASKSVSTSGFSYLHWYRQKPGQPPQLLIFL

ASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQHSWELPLTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLH

TGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLP

STLIKSFQRSECQRVD

canVL-canKappa(1011)(secuencia señal xHGFsubrayada y en negrita: CADENA LIGERA La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 31 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de nucleótidosSEQ ID NO: 45 incluye la secuencia señal.

ATGGATATGAGAGTACCTGCACAACTTCTGGGATTGCTGCTTCTTTGGCTGAGAGGGGCCCGCTGCGATATCGTCC

TGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGAGCCCTGGAGAACCCGCCAGCATCAGCTGCAGGGCCTCCAAGAGCGT

GAGCACCAGCGGCTTCAGCTACCTGCACTGGTACAGGCAGAAGCCCGGACAGAGCCCTCAGCTGCTGATCTTCCTG

GCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCTGACAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGAGGATCT

CCAGGGTGGAAGCCGACGACGCCGGAGTGTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAACTGCCCCTGACCTTCGGCCAGGG

CACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCAT

ACGGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACG

GGGTAATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTC

AACCTTGACGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCC

TCCACTCTTATCAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 32 es sin la secuencia señal; y

La secuencia de aminoácidosSEQ ID NO: 46 incluye la secuencia señal.

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVLTQTPLSLSVSPGEPASISCRASKSVSTSGFSYLHWYRQKPGQSPQLLIFL

ASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQHSWELPLTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLH

TGSASWCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLP

STLIKSFQRSECQRVD

EJEMPLO 4

ANTICUERPOS IgG-B CANINOS MUTANTES ESPECÍFICOS PARA PD-1

Hay cuatro subtipos de cadenas pesadas de IgG conocidas de IgG de perro y se las conoce como IgG-A, IgG-B, IgG-C e IgG-D. Los dos subtipos de cadenas ligeras conocidos se denominanlambdaykappa.Sin embargo, además de unirse y activar las células inmunitarias caninas, un anticuerpo canino o caninizado contra PD-1 óptimamente tiene dos atributos:

Ninguno de los isotipos de IgG canina de origen natural satisface ambos criterios. Por ejemplo, IgG-B puede purificarse usando proteína A, pero tiene un elevado nivel de actividad ADCC. IgG-C también tiene una actividad ADCC considerable. Por otra parte, IgG-A se une débilmente a la proteína A, pero muestra una actividad ADCC no deseable. Por otra parte, ni IgG-C ni IgG-D pueden purificarse en columnas de proteína A, aunque IgG-D no muestra actividad ADCC. La presente invención supera esta dificultad proporcionando anticuerpos IgG-B caninos mutantes específicos para PD-1; dichos anticuerpos carecen de funciones efectoras tales como ADCC y pueden purificarse fácilmente usando cromatografía de proteína A convencional de la industria. Las modificaciones exactas se muestran en la Figura 4.

Las variantes de IgG-B con funciones efectoras reducidas descritas abarcan una primera variante de IgG-B en la cual un resto de lisina (D 277) y un resto de asparagina (N 325) están mutados cada uno en un resto de alanina [cIgGB(-) ADCC], una segunda variante en la cual la región bisagra de IgG-B se reemplaza por la región bisagra de IgG-D [cIgGB(+) D-bisagra] y una tercera variante en la cual la región bisagra de IgG-B se reemplaza por la región bisagra de IgG-A [cIgGB(+) A-bisagra]. Adicionalmente, la segunda y la tercera variantes también incluyen la sustitución de los mismos restos de lisina y asparagina de la primera variante por un resto de alanina. La numeración de los restos de lisina y asparagina mutados en esta invención se basa en el esquema de numeración descrito para las cadenas pesadas de IgG canina en Tang.et al.,[Vet Immunol and Immunopathol, 80:259-270 (2001)].

IgGB ts canina

SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSR

WPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWD

LDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARG

QAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS

RWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK SEQ IDNO:49

IgGB(+)A-bisagra canina

SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSR

WPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVFNECRCTDTPPCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKATLLIARTPEVTCWVDLDPED

PEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQP

SVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRG

DTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK SEQ ID NO:50

IgGB(+)D-bisagra canina

SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSR

WPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKESTCKCISPCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKATLLIARTPEVTCVWDLDPED

PEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQP

SVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRG

DTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK SEQ ID NO: 51

IgGB(-)ADCC canina

SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSR

WPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKATLLIARTPEVTCVWD

LDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARG

QAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS

RWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK SEQ ID NO: 52

TABLA 1 LI TAD DE E EN IA

TABLA LI TAD DE E EN IA

Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan como referencia en la misma medida que si cada publicación individual, entrada de bases de datos (por ejemplo, secuencias de GenBank o entradas de GeneID), solicitud de patente o patente, se indicase específica e individualmente estar incorporado por referencia. Los solicitantes pretenden que esta declaración de incorporación por referencia, de conformidad con 37 C.F.R. §1.57(b)(1) afecte a todas y cada una de las publicaciones individuales, entradas de bases de datos (por ejemplo, secuencias de GenBank o entradas de GeneID), solicitud de patente o patente, cada una de las cuales está claramente identificada de conformidad con 37 C.F.R. §1.57 (b) (2), aunque dicha mención no esté inmediatamente adyacente a una declaración de incorporación por referencia específica. La inclusión de declaraciones de incorporación por referencia específicas, de haberlas, dentro de la memoria descriptiva no debilita de forma alguna esta declaración general de incorporación por referencia. La mención de las referencias del presente documento no pretende ser una admisión de que la referencia sea una técnica anterior pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o documentos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo caninizado aislado que se une específicamente al Receptor de muerte celular programada 1 (PD-1), en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada de IgG canina y una cadena ligerakappacanina; en donde la cadena pesada de IgG comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; y

en donde la cadena ligerakappacomprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 34; y en donde el anticuerpo se une a PD-1 canino y bloquea la unión de PD-1 canino al Ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1) canino.

2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 en donde dicho uso es para: a. el tratamiento de cáncer;

b. el tratamiento de una infección o enfermedad infecciosa; o

c. como un adyuvante de vacunas.