ES2969574T3 - Composición, kit y método para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio y aplicación de composición, kit y método - Google Patents

Composición, kit y método para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio y aplicación de composición, kit y método Download PDF

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Abstract

Se proporciona una composición para detectar un nuevo coronavirus, virus de la influenza A y virus de la influenza B; además, también se proporciona un kit que comprende la composición, una aplicación del kit y un método para detectar y tipificar virus que causan infección del tracto respiratorio. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición, kit y método para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio y aplicación de composición, kit y método
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la detección biológica molecular, específicamente, al campo de la detección de virus que provocan infecciones del tracto respiratorio. Más específicamente, la presente invención es capaz de detectar y tipificar simultáneamente un nuevo coronavirus 2019-nCoV, el virus de la gripe A y el virus de la gripe B.
Antecedentes
Las enfermedades respiratorias causadas por infecciones del tracto respiratorio son enfermedades comunes, y los patógenos causales incluyen principalmente virus, bacterias, micoplasmas, clamidias, etc. Entre ellos, los patógenos virales comunes incluyen virus de la gripe A y virus de la gripe B, que también son los principales patógenos del gripe estacional y otro tipo de virus que causa infecciones del tracto respiratorio es el coronavirus.
La envoltura de los virus de la gripe tiene dos glucoproteínas muy importantes: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). En general, hay 500 picos de hemaglutinina y 100 picos de neuraminidasa distribuidos en la superficie de los virus de la gripe, que sirven como base para la tipificación del virus de la gripe A de acuerdo con la antigenicidad de HA y NA en los virus de la gripe. Los virus de la gripe A pueden infectar a seres humanos, mamíferos y aves. Los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2 infectan principalmente a seres humanos y otros subtipos infectan principalmente a aves, cerdos, caballos y mamíferos acuáticos. Hay 12 subtipos de virus de la gripe aviar que pueden infectar a seres humanos, incluyendo H5N1, H7N1, H7N2, H7N4, H7N9, H9N2, H10N8, etc. Los virus de la gripe B son principalmente frecuentes en la población y no tienen clasificación de subtipo. Las tres ramas son la línea de Li, la línea de Yamagata y la línea de Victoria, y sus escalas epidémicas son más pequeñas que la de los virus de la gripe A. El material genético de los virus de la gripe es un ARN monocatenario de sentido negativo (ARNss), que se une a una nucleoproteína y se enrolla en un complejo de ribonucleoproteínas presente en una forma con una densidad extremadamente alta. Además del complejo de ribonucleoproteínas, también hay una ARN polimerasa responsable de la transcripción de ARN. El ARN de los virus de la gripe se compone principalmente de ocho segmentos. El primer, segundo y tercer segmentos codifican una ARN polimerasa, el cuarto segmento codifica una hemaglutinina; el quinto segmento codifica una nucleoproteína; el sexto segmento codifica una neuraminidasa; el séptimo segmento codifica una proteína de la matriz; y el octavo segmento codifica una proteína no estructural que puede funcionar para unir un ARN.
Hasta ahora, existen siete tipos de coronavirus que infectan a los seres humanos, entre los cuales el coronavirus 229E, el coronavirus NL63, el coronavirus OC43 y el coronavirus HKU1 son comunes, provocando afecciones leves después de infectar el tracto respiratorio humano y generalmente no induciendo enfermedades graves. Sin embargo, el nuevo coronavirus 2019-nCoV, el coronavirus MERSr-CoV y las infecciones por SRSr-CoV de coronavirus provocarán síntomas de infección muy graves en pacientes, y es muy probable que se desarrollen en enfermedades graves.
El nuevo coronavirus es un nuevo tipo de coronavirus que pertenece al género p, que la Organización Mundial de la Salud ha denominado el “nuevo coronavirus (2019-nCoV)”. El 2019-nCoV tiene una envoltura y las partículas son redondas u ovaladas, a menudo pleomórficas, con un diámetro de 60-140 nm. Las características genéticas de las mismas son significativamente diferentes de las del SARSr-CoV y MERSr-CoV. De acuerdo con los últimos resultados de investigación de los investigadores, el 2019-nCoV es muy similar al RTG13, un cepa de coronavirus de murciélago previamente aislada de los murciélagos herradura chinos, con una similitud general del genoma del 96,2 %. Además, los estudios han demostrado que el 2019-nCoV es un 85 % o más homólogo a coronavirus similares al SARS (bat-SL-CoVZC45 y bat-SL-CoVZXC21).
Los patógenos de las infecciones del tracto respiratorio son extremadamente diversos. Una manifestación clínica puede ser causada por múltiples patógenos, y un patógeno también puede causar múltiples manifestaciones clínicas, lo que genera grandes dificultades en el diagnóstico clínico temprano.
Para la mayoría de los virus que causan infecciones del tracto respiratorio, el tratamiento temprano producirá mejores efectos terapéuticos. Por ejemplo, una vez que un paciente con gripe muestra síntomas, debe empezar a tomar oseltamivir tan pronto como sea posible, idealmente dentro de las 48 horas a la aparición de los síntomas; cuando se usa para la prevención, el medicamento oseltamivir también debe tomarse en las 48 horas posteriores a la exposición a un paciente con gripe. El diagnóstico temprano y el tratamiento temprano son claves para mejorar la tasa de curación y reducir la tasa de mortalidad de los pacientes con gripe.
Para el nuevo coronavirus, además de la detección temprana y el tratamiento temprano, también es necesario controlar la fuente de infección en el tiempo, para detener posibles pandemias y brotes de virus.
Por lo tanto, distinguir si una infección del tracto respiratorio está causada por un nuevo coronavirus o por un virus de la gripe A o B para proporcionar orientación para la prevención y el control posteriores, el tratamiento y la adopción de medidas dirigidas es la principal prioridad de las campañas de control y prevención de enfermedades respiratorias.
Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de contar con un producto relacionado capaz de detectar y distinguir un nuevo coronavirus, un virus de la gripe A y un virus de la gripe B, mientras que el documento CN110343784 describe la detección basada en la amplificación de los virus de la gripe, que incluyen A y B así como el coronavirus.
Resumen
En vista de esto, se proporciona una composición capaz de detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio. La composición simultáneamente incluye:
un nuevo cebador directo de protocolo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 1, un nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 2, y una nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 3; y al menos uno de los siguientes dos grupos:
un primer grupo: un cebador directo de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 7, un cebador inverso del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 8, y una sonda de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 9; y
un cebador directo de virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 10, un cebador inverso del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 11 y una sonda del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 12,
donde los grupos fluorescentes de las sondas son diferentes entre sí y no interfieren entre sí.
En la presente memoria, la descripción “diferente entre sí y no interfiere entre sí” significa que los grupos fluorescentes utilizados por las sondas respectivas en la composición son diferentes, y no afectarán a la detección entre sí, es decir, pueden usarse diferentes canales para la detección. Por ejemplo, pueden usarse FAM, HEX, ROX y CY5. Los valores de absorbancia de estos grupos fluorescentes no están cerca y pueden seleccionarse diferentes canales de detección y, por lo tanto, los grupos fluorescentes no interferirán entre sí.
En una realización preferida, la composición incluye, además: un nuevo cebador directo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 4, un nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 5 y una nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 6.
Al incluir las N.° DE ID SEC: 4-6 adicionales, la composición de la presente invención puede aumentar aún más la precisión de la nueva detección de coronavirus, y evitar falsos negativos tales como fallos en la mayor medida.
En una realización específica, la composición incluye: el nuevo cebador directo 2019-nCoV de coronavirus como se muestra en el N.° de ID SEC. 1, el nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 2, y la nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 3; y
El cebador directo de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 7, el cebador inverso del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 8, y la sonda del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 9.
La realización anterior se puede usar cuando no hay necesidad clínica real de detectar un virus de la gripe B, y se necesita una detección simultánea de un nuevo coronavirus y un virus de la gripe A, reduciendo así los costes.
En una realización específica, la composición incluye el nuevo cebador directo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 1, el nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 2, y la nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 3; y
el cebador directo del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 10, el cebador inverso del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 11 y la sonda del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 12.
La realización anterior se puede usar cuando no hay necesidad clínica real para detectar el virus de la gripe A, y se necesita una detección simultánea del nuevo coronavirus y del virus de la gripe B, reduciendo así los costes.
En una realización específica, la composición incluye el nuevo cebador directo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 1, el nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 2, y la nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 3;
El cebador directo de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 7, el cebador inverso del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 8 y la sonda del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 9; y
el cebador directo del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 10, el cebador inverso del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 11 y la sonda del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 12.
La realización anterior se usa cuando existe la necesidad de detectar los tres virus, y puede detectar de manera más completa el virus que causa la infección, y se usa un conjunto de cebadores para cada virus, reduciendo así los costes. En una realización específica, la composición incluye el nuevo cebador directo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 1, el nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 2, y la nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 3;
el nuevo cebador directo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 4, el nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 5, y la nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 6;
El cebador directo de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 7, el cebador inverso del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 8 y la sonda del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 9; y
el cebador directo del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 10, el cebador inverso del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 11 y la sonda del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 12.
La realización anterior se usa cuando existe una necesidad de detectar los tres virus y se requiere una alta precisión de detección, y puede obtener una alta precisión de detección y evitar falsos negativos.
El virus que causa la infección del tracto respiratorio incluye: el nuevo coronavirus 2019-nCoV, el virus de la gripe A y el virus de la gripe B.
Además, la composición incluye: un cebador directo estándar interno, un cebador inverso estándar interno y una sonda estándar interna para el monitoreo.
En una realización específica, la composición incluye además: el cebador directo estándar interno como se muestra en el N.° de ID SEC. 13, el cebador inverso estándar interno como se muestra en el N.° de ID SEC. 14 y la sonda estándar interna como se muestra en el N.° de ID SEC. 15.
En la presente invención, el grupo indicador fluorescente puede seleccionarse entre FAM, HEX, ROX, VIC, CY5, 5-TAMRA, TET, CY3 y JOE, pero no se limita a los mismos.
En una realización específica, los grupos indicadores fluorescentes de las novedosas sondas de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en las N.° DE ID SEC: 3 y 6 son FAM; El grupo indicador fluorescente de la sonda de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 9 es HEX; Y el grupo indicador fluorescente de la sonda de virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 12 es ROX.
En una realización específica, un grupo indicador fluorescente de la sonda estándar interna como se muestra en el N.° de ID SEC. 15 es CY5.
Además, la cantidad del cebador en la composición es 50-150 nM, y la cantidad de la sonda en la composición es de 25-75 nM.
En una realización específica, los componentes de la composición de la presente invención se encuentran en el mismo envase.
Además, los componentes de la composición de la presente invención están presentes en una forma mixta.
En un segundo aspecto, se proporciona en la presente invención un uso de la composición anterior de la presente invención en la preparación de un kit para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio. El virus que causa la infección del tracto respiratorio incluye: el nuevo coronavirus 2019-nCoV, el virus de la gripe A y el virus de la gripe B.
En un tercer aspecto, se proporciona un kit para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio, incluyendo el kit la composición anterior de la presente invención.
Además, el kit incluye además al menos uno de un reactivo de liberación de ácido nucleico, dNTP, transcriptasa inversa, ADN-polimerasa, tampón de PCR y Mg2+.
Además, la cantidad del cebador en la composición es 50-150 nM; la cantidad de la sonda en la composición es 25 75 nM; y la cantidad del dNTP es 0,2-0,3 mM.
Además, la concentración de transcriptasa inversa es de 5 U/pL a 15 U/pL y, por ejemplo, la transcriptasa inversa puede ser una transcriptasa inversa de leucemia murina (MMLV). La concentración de a Dn polimerasa es de 5 U/pL a 15 U/pL y, por ejemplo, la ADN-polimerasa puede ser una enzima Taq.
En una realización específica, además de la composición anterior de la presente invención, el kit incluye además los siguientes componentes y cantidades:
Componente Volumen/concentración en cada reacción
Mg2+ 4 mM
dNTPs (100 mM) 0,25 mM
MMLV (10 U/pL) 10 U
Enzima Taq (5 U/pL) 5 U
Tampón de PCR (1,5x) Preparación hasta 50 pL
En un cuarto aspecto, se proporciona un método para detectar y tipificar virus que causan una infección del tracto respiratorio, incluyendo el método las etapas de:
1) liberar un ácido nucleico de una muestra de ensayo;
2) realizar, mediante el uso de la composición anterior de la presente invención o el kit anterior de la presente invención, una PCR cuantitativa fluorescente sobre el ácido nucleico obtenido en la etapa 1); y
3) obtener y analizar los resultados.
En la presente invención, la muestra de prueba puede ser un hisopo de garganta, esputo, un fluido de lavado broncoalveolar, sangre, etc., entre otros.
Además, las condiciones de reacción de la PCR cuantitativa fluorescente son las siguientes:
transcripción inversa a una temperatura de 50 °C durante 25-35 minutos durante 1 ciclo; predesnaturalización a una temperatura de 94 °C durante 2-10 minutos durante 1 ciclo; desnaturalización a una temperatura de 94 °C durante 10 20 segundos; recocido a una temperatura de 60 °C durante 20-40 segundos para 45-50 ciclos.
El uso de la composición de la presente invención puede detectar y tipificar simultáneamente los tres virus que causan infecciones del tracto respiratorio, para identificar algunos pacientes que tienen fiebre causada por la gripe estacional común, reducir el desperdicio de recursos médicos y reducir la carga psicológica en pacientes y la sociedad.
Además, la presente invención puede diagnosticar rápidamente el nuevo coronavirus 2019-nCoV, proporcionar evidencia molecular para diagnóstico temprano, tratamiento temprano y aislamiento temprano del nuevo coronavirus, y permitir preparaciones adecuadas para la prevención y el control de la enfermedad, lo que hace posible controlar la fuente de infección del coronavirus nuevo altamente contagioso 2019-nCoV de manera oportuna y detener los brotes y las pandemias de virus.
La composición de la presente invención en combinación con un método de sonda fluorescente permite el uso de un tubo en una prueba simultáneamente, logrando bajos costes y alto rendimiento. La presente invención permite que la información de cuatro objetivos sea dada por un tubo en una sola prueba, y las operaciones son simples y convenientes, y el proceso de lectura de resultados puede completarse de acuerdo con un valor de CT. Todo el proceso de detección se lleva a cabo en condiciones cerradas de un solo tubo, evitando los falsos positivos y la contaminación medioambiental causada por el cruce entre las muestras.
Además, el uso de la composición de la presente invención es eficiente en el tiempo, y el tiempo total de adquirir una muestra para obtener un resultado es de aproximadamente 120 min, mejorando en gran medida la eficacia de detección.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un resultado de detección positiva para 2019-nCoV en un canal FAM de la composición de la presente invención;
La figura 2 muestra un resultado de detección positiva para el virus de la gripe A en un canal HEX de la composición de la presente invención;
La figura 3 muestra un resultado de detección positiva para el virus de la gripe B en un canal ROX de la composición de la presente invención;
La figura 4 muestra un resultado de detección positiva para un estándar interno en un canal CY5 de la composición de la presente invención;
Las figuras 5-8 muestran resultados de reproducibilidad de la detección de virus de acuerdo con una realización de la composición de la presente invención;
Las figuras 9-12 muestran resultados de reproducibilidad de la detección de virus de acuerdo con otra realización de la composición de la presente invención;
La figura 13 muestra un resultado de la sensibilidad de la composición de la presente invención;
Las figuras 14-15 muestran resultados de especificidad de la composición de la presente invención;
La figura 16 muestra los resultados experimentales de la composición de la presente invención y un cebador comparativo.
Descripción detallada
La presente invención se describirá en detalle a continuación con referencia a realizaciones y ejemplos específicos, y las ventajas y diversos efectos de la presente invención se presentarán más claramente a partir de los mismos. Los expertos en la técnica deben entender que estas realizaciones y estos ejemplos específicos están destinados a ilustrar la presente invención, en lugar de limitar la presente invención.
Ejemplo 1. Cebadores y sondas usados en la presente invención
Los cebadores y las sondas usados en la presente invención se muestran en la Tabla 1 a continuación:
Tabla 1
Entre ellos, un grupo indicador fluorescente de la nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV fue FAM; Un grupo indicador fluorescente de un virus de la gripe A fue HEX; Un grupo indicador fluorescente de un virus de la gripe B fue ROX, un grupo indicador fluorescente del patrón interno fue CY5, y el extremo 3 de la sonda tenía además un grupo inactivador BHQ1 o BHQ2.
Ejemplo 2. Método para detectar y tipificar virus que causan una infección del tracto respiratorio
Una muestra de prueba de la presente invención fue un hisopo de garganta, esputo, un líquido de lavado broncoalveolar o sangre. Se usó un método de perlas magnéticas para extraer un ácido nucleico vírico, y las siguientes operaciones se realizaron en una sala de procesamiento de muestras:
2.1 Se tomó un número apropiado de tubos de centrífuga esterilizados de 1,5 ml y se marcó como control negativo, un control positivo y una muestra de prueba, respectivamente. Se añadieron 300 pL de una solución de extracción de ARN 1 a cada tubo.
Se añadieron 2,2200 pL de la muestra de prueba o el control negativo o el control positivo a cada tubo. El tubo se cubrió con un tapón y se agitó durante 10 segundos para su mezclado, y se sometió a centrifugación instantánea. Se añadieron 2,3 100 pL de una solución de extracción de ARN de mezcla 2 a cada tubo (succionado después de la mezcla), y el tubo se agitó durante 10 segundos para su mezclado, y se dejó reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2.4 Después de la centrifugación instantánea, los tubos de centrífuga se colocaron en un separador, y la solución se succionó lentamente después de 3 minutos (teniendo cuidado de no tocar una sustancia marrón adherida a la pared del tubo).
Se añadieron 2,5600 pL de una solución de extracción de ARN 3 y 200 pL de una solución de extracción de ARN 4 a cada tubo, y el tubo se agitó durante 5 segundos para su mezclado y se sometió a centrifugación instantánea, y después el tubo de centrífuga se colocó en el separador de nuevo.
2.6 Después de aproximadamente 3 minutos, el sobrenadante se separó en dos capas. Se insertó una punta de pipeta en el fondo del tubo de centrífuga, el líquido se succionó lentamente desde el fondo por completo y se desechó. El tubo se dejó reposar durante 1 minuto y luego el líquido residual en la parte inferior del tubo se succionó completamente y se desechó.
Se añadieron 2,7 pL de mezcla de PCR a cada tubo, y se usó una punta de pipeta para aspirar la mezcla de PCR para eluir el residuo marrón adherido a la pared del tubo de centrífuga. La operación se repitió varias veces para eluir el residuo lo más completamente posible, y luego toda la mezcla marrón eluida se transfirió a un tubo de reacción de PCR de 0,2 ml, y el tubo se cubrió con una tapa y se transfirió a una zona de prueba de amplificación.
El sistema de reacción de PCR fluorescente en tiempo real se configuró de la siguiente manera:
El programa de amplificación por PCR se estableció como sigue:
Análisis de resultados:
1) Las señales de detección diana fueron FAM, HEX (o VIC) y ROX, y una señal de detección de referencia interna fue CY5.
2) Configuración de referencia: La línea base se estableció generalmente en 3-15 ciclos, que se podían ajustar específicamente de acuerdo con situaciones reales. El principio de ajuste fue seleccionar una región donde una señal de fluorescencia es relativamente estable antes de la amplificación exponencial, un punto de partida (Inicio) que evita la fluctuación de la señal en una etapa inicial de la recolección de fluorescencia, y un punto final (final) es menor en 1 2 ciclos que el Ct de una muestra que muestra una amplificación exponencial más temprana. Configuración de umbral: El principio de ajuste fue para hacer una línea de umbral que exceda el punto más alto de un control negativo normal.
3) En primer lugar, se analizó si una curva de amplificación para el patrón interno se detecta en el canal CY5 y Ct < 39, y si es así, indicó que la prueba actual fue eficaz, y el análisis posterior continuó transportado:
A) Si se detectó una curva de amplificación en forma de S típica en el canal FAM y Ct<39, indicó que el nuevo resultado de detección de coronavirus 2019-nCoV fue positivo;
B) Si se detectó una curva de amplificación de tipo S típica en el canal HEX y Ct<39, indicó que el resultado de detección del virus de la gripe A fue positivo;
C) Si se detectó una curva de amplificación de tipo S típica en el canal ROX y Ct<39, indicó que el resultado de la detección de la gripe B fue positivo.
4) Si un Ct para el estándar interno no se detectó en el canal CY5 o Ct>39, indicó que la concentración de la muestra de prueba fue excesivamente baja o había una sustancia interferente que inhibió la reacción, y el experimento tenía que volver a prepararse.
Ejemplo 3. Resultados de detección de la detección del control positivo por la composición de la presente invención La composición en la Tabla 1 de la presente invención se usó para detectar cada plásmido positivo para diana de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2, para simular una muestra clínica. Se realizaron múltiples pruebas de PCR en un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente Hongshi. Los resultados son como se muestran en las figuras 1-4. Se podría detectar una buena curva de amplificación en cada canal, lo que indica que la composición de la presente invención podría detectar y tipificar virus que causan una infección del tracto respiratorio.
Ejemplo 4. Resultados de reproducibilidad de la detección del control positivo por diferentes composiciones de la presente invención
La composición en la Tabla 1 de la presente invención se usó para detectar cada plásmido positivo para diana LOD (sensibilidad) de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2, para simular una muestra clínica. Se realizaron múltiples pruebas de PCR en un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente Hongshi. Los resultados de esta combinación son los más convenientes, y el virus podría detectarse en las 20 repeticiones, como se muestra en las figuras 5-8.
Los experimentos se llevaron a cabo usando solo un conjunto de cebadores dirigidos al nuevo coronavirus (es decir, usando solo las N.° DE ID SEC: 1-3) en combinación con los cebadores para el virus de la gripe A y el virus de la gripe B. Los resultados de esta combinación fueron que el virus pudo detectarse en los canales h Ex , ROX y CY5 en las 20 repeticiones, y el virus pudo detectarse en el canal FAM en 18 de 20 repeticiones. Los resultados se muestran en las figuras 9-12.
Ejemplo 5. Sensibilidad de la composición de la presente invención
Los experimentos se llevaron a cabo con plantillas plasmídicas de diferentes concentraciones para probar la sensibilidad de la composición de la presente invención
La composición en la Tabla 1 de la presente invención se usó para detectar cada plásmido positivo para diana LOD (sensibilidad) de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2, para simular una muestra clínica. Se realizaron múltiples pruebas de PCR en un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente Hongshi. La sensibilidad de detección en cada canal fue de 200 copias/ml. Los resultados muestran que la composición de la presente invención todavía podría detectar un virus a una concentración de 200 copias/ml. Los resultados son como se muestran en la figura 13, lo que indica que la sensibilidad de la composición de la presente invención podría alcanzar 200 copias/ml.
Ejemplo 6. Especificidad de la composición de la presente invención
Los experimentos con algunos virus similares mostraron que la composición de la presente invención no detectaría otros virus y causaría falsos positivos. Los resultados son como se muestran en las figuras 14-15, en las que la composición de la presente invención no mostró amplificación no específica a otros coronavirus OC43/OC43-NL63-229E/MERS/SARS/HKU1, así como virus comunes de adenovirus ADV, virus sincitial RSV, rinovirus HRV, lo que indica que la composición de la presente invención tiene una buena especificidad.
Ejemplo comparativo 1. Otros cebadores y otras sondas diseñados por la presente invención con efectos deficientes En el proceso de diseño de cebadores y sondas, el inventor también diseñó otros cebadores y sondas para la detección de virus, y las secuencias específicas de los mismos fueron las siguientes (todos los objetivos son ORF-1ab):
F1 (N.° DE ID SEC: 16): CCCCAAAATGCTGTTGTTAAAATT
R1 (N.° DE ID SEC: 17): TTCAAGCCAGATTCATTATGGTATT
P1 (N.° DE ID SEC: 18):
FAM-TCCAGCAT GT CACAATT CAGAAGTAGGAC-BH Q1
F2 (N.° DE ID SEC: 19): CCCGCACTCTTGAAACTGCTC
R2 (N.° DE ID SEC: 20): TAGATTGTTAGTAGCCAAATCAGATGTG
P2 (N.° DE ID SEC: 21): FAM-CTGTGCGTGTTTTACAGAAGGCCGC-BHQ1
F3 (N.° DE ID SEC: 22): GTTGCTCGAAATCAAAGACACAGAA
R3 (N.° DE ID SEC: 23): CTTGTAACCTTGCACTTCTATCACAGT
P3 (N.° DE ID SEC: 24):
FAM-TTGCACCTAATATGATGGTAACAAACAATACCT-BHQ1
La composición anterior se usó para la detección de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo 2. Como se puede ver en la figura 16, los cebadores del ejemplo comparativo no pudieron detectar de la forma deseada los plásmidos positivos, lo que demostró que los cebadores del ejemplo comparativo no podrían usarse para detectar virus que causan una infección del tracto respiratorio.

Claims (3)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una composición capaz de detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio, comprendiendo la composición simultáneamente:
    un nuevo cebador directo de protocolo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 1, un nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 2, y una nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 3; y al menos uno de los siguientes dos grupos:
    un primer grupo: un cebador directo de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 7, un cebador inverso del virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 8, y una sonda de virus de la gripe A como se muestra en el N.° de ID SEC. 9; y
    un cebador directo de virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 10, un cebador inverso del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 11 y una sonda del virus de la gripe B como se muestra en el N.° de ID SEC. 12,
    donde los grupos fluorescentes de las sondas son diferentes entre sí y no interfieren entre sí.
  2. 2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde la composición comprende, además: un nuevo cebador directo de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 4, un nuevo cebador inverso de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 5, y una nueva sonda de coronavirus 2019-nCoV como se muestra en el N.° de ID SEC. 6.
  3. 3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, donde la composición comprende además un cebador directo estándar interno, un cebador inverso estándar interno y una sonda estándar interna para el monitoreo.
    4. La composición según la reivindicación 3, donde la secuencia del cebador directo estándar interno es como se muestra en el N.° de ID SEC.13, la secuencia del cebador inverso estándar interno es como se muestra en el N.° de ID SEC.14, y la secuencia de la sonda estándar interna es como se muestra en el N.° de ID SEC.
    15.
    5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde los componentes de la composición se encuentran en el mismo envase.
    6. Un uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un kit para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio.
    7. Un kit para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio, comprendiendo el kit la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
    8. El kit de acuerdo con la reivindicación 7, donde el kit comprende además al menos uno de un reactivo de liberación de ácido nucleico, un dNTP, una transcriptasa inversa, ADN-polimerasa, un tampón de PCR y Mg2+.
    9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8, donde la cantidad del cebador en la composición es de 50-150 nM, y la cantidad de la sonda en la composición es de 25-75 nM.
    10. Un método para detectar y tipificar virus que provocan una infección del tracto respiratorio, comprendiendo el método las etapas de:
    1) liberar un ácido nucleico de una muestra de ensayo;
    2) realizar, usando la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, una PCR cuantitativa fluorescente sobre el ácido nucleico obtenido en la etapa 1); y
    3) obtener y analizar los resultados.
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