ES2970072T3 - Anticuerpos que tienen especificidad por la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y usos de los mismos con fines de diagnóstico - Google Patents

Abstract

El virus de la hepatitis E (VHE) es responsable anualmente de 20 millones de infecciones, con 3,4 millones de casos sintomáticos y 70.000 muertes que se producen principalmente en las regiones menos desarrolladas del mundo. El VHE es un virus casi envuelto que contiene un genoma de ARN lineal, monocatenario y de sentido positivo que contiene tres marcos de lectura abiertos (ORF), a saber, ORF1, ORF2 y ORF3. ORF2 codifica la proteína de la cápside viral ORF2, que participa en el ensamblaje de partículas, se une a las células huésped y genera anticuerpos neutralizantes. Recientemente, se identificaron 3 formas diferentes de la proteína de la cápside ORF2: ORF2 infeccioso/intracelular (ORF2i), ORF2 glicosilado (ORF2g) y ORF2 escindido (ORF2c). La proteína ORF2i, cuya secuencia precisa se ha identificado, es la forma asociada con partículas infecciosas y, por tanto, los anticuerpos que tengan especificidad por la proteína ORF2i serían adecuados para el diagnóstico del VHE. La presente satisface esta necesidad proporcionando un anticuerpo que se une a la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y en el que dicho anticuerpo no se une a la proteína ORF2g ni al ORF2c del virus de la hepatitis E, y en el que el epítopo de dicho anticuerpo comprende al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácidos 10 a 23 de SEQ ID NO: 1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que tienen especificidad por la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y usos de los mismos con fines de diagnóstico

Campo de la presente invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que tienen especificidad por la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y a usos de los mismos con fines de diagnóstico.

Antecedentes de la presente invención

El virus de la hepatitis E (VHE) es responsable anualmente de 20 millones de infecciones, con 3,4 millones de casos sintomáticos y 70.000 muertes que se producen principalmente en las regiones menos desarrolladas del mundo. Provoca hepatitis aguda, o bien como brotes epidémicos transmitidos por el agua o bien como casos esporádicos por vía fecal-oral (Debing Y, Moradpour D, Neyts J,et al.Update on Hepatitis E Virology: Implications for Clinical Practice. Journal of Hepatology 2016;65:200-212). Aunque la infección por VHE suele resolverse por sí sola, se han descrito formas graves o infecciones crónicas, principalmente en pacientes inmunocomprometidos. También se ha informado de una alta tasa de mortalidad entre las mujeres embarazadas. La infección por VHE también se ha asociado con trastornos extrahepáticos (Pischke S, Hartl J, Pas SD,et al.Hepatitis E virus infection beyond the liver? Journal of Hepatology 2016. 10.1016/j.jhep.2016.11.016). Cuatro genotipos (gt) son patógenos en los seres humanos. Gt1 y gt2 infectan exclusivamente a seres humanos, mientras que gt3 y gt4 son zoonóticos e infectan principalmente a animales mamíferos con transmisión ocasional a seres humanos. Recientemente, han surgido infecciones por gt3 en el mundo occidental, probablemente debido al consumo de alimentos contaminados y a las transfusiones de sangre (Debing Y, Moradpour D, Neyts J,et al.Update on Hepatitis E Virology: Implications for Clinical Practice. Journal of Hepatology 2016;65:200-212). El diagnóstico de la hepatitis E se basa en la detección de anticuerpos anti-VHE y/o ARN viral en el suero del paciente (Khuroo MS, Khuroo MS. Hepatitis E: an emerging global disease - from discovery towards control and cure. Journal of Viral Hepatitis 2016;23:68-79). Recientemente, se ha desarrollado un nuevo ensayo basado en la detección de la proteína de la cápside del antígeno del VHE (Wantaí Biologicals), especialmente para laboratorios que no cuentan con instalaciones de diagnóstico molecular.

El VHE es un virus casi envuelto que contiene un genoma de ARN lineal, monocatenario y de sentido positivo que contiene tres marcos de lectura abiertos (ORF), concretamente ORF1, ORF2 y ORF3 (Debing Y, Moradpour D, Neyts J,et al.Update on Hepatitis E Virology: Implications for Clinical Practice. Journal of Hepatology 2016;65:200-212). ORF1 es el gen más grande que codifica para una poliproteína no estructural (proteína ORF1) que contiene varios dominios funcionales esenciales para la replicación viral. ORF2 codifica para la proteína de la cápside viral ORF2, que participa en el ensamblaje de partículas, uniéndose a las células huésped y produciendo anticuerpos neutralizantes. ORF3 codifica para una pequeña fosfoproteína multifuncional que participa en la morfogénesis y la salida de viriones. Aunque el VHE es un virus sin envoltura que se encuentra en la bilis y las heces, se ha descrito que las partículas producidas en cultivos celulares y sueros de pacientes están asociadas con lípidos celulares y muestran la proteína ORF3 en su superficie (Okamoto H. Culture systems for hepatitis E virus. J Gastroenterol 2012;48:147158).

Recientemente, se identificaron 3 formas diferentes de la proteína de la cápside ORF2: ORF2 infecciosa/intracelular (ORF2i), ORF2 glicosilada (ORF2g) y ORF2 escindida (ORF2c) (Montpellier C.,et al.“Hepatitis E virus lifecycle and identification of 3 forms of the ORF2 capsid protein.” Gastroenterology 154.1 (2018): 211-223). La proteína ORF2i, cuya secuencia precisa ha sido identificada, es la forma asociada con partículas infecciosas. La proteína ORF2i no está glicosilada y probablemente no se transloca a la luz del retículo endoplásmico (RE) y permanece en el compartimento citosólico. Por el contrario, las proteínas ORF2g y ORF2c se secretan en grandes cantidades en cultivos celulares y sueros de pacientes infectados, sialiladas, N- y O-glicosiladas, pero no están asociadas con viriones infecciosos. Es importante destacar que las proteínas ORF2g y ORF2c son los principales antígenos presentes en los sueros de pacientes infectados por VHE. Por consiguiente, los anticuerpos que tengan especificidad por la proteína ORF2i serían adecuados para el diagnóstico de VHE.

Sumario de la presente invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que tienen especificidad por la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y a usos de los mismos con fines de diagnóstico. En particular, la presente invención se define por las reivindicaciones.

Descripción detallada de la presente invención

El primer objeto de la presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y en el que dicho anticuerpo no se une a la proteína oRF2g ni a la proteína ORF2c del virus de la hepatitis E, y en el que el epítopo de dicho anticuerpo comprende al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácido 10 a 23 de SEQ ID NO: 1.

Los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan indistintamente y se refieren a un compuesto que se compone de residuos de aminoácido unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. Un polipéptido no está limitado a una longitud específica: debe contener al menos dos aminoácidos y no se impone ninguna limitación sobre el número máximo de aminoácidos que puede comprender la secuencia de un polipéptido. Los péptidos, los oligopéptidos y las proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido, y tales términos pueden usarse indistintamente en el presente documento a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también se denominan comúnmente en la técnica péptidos, oligopéptidos y oligómeros, por ejemplo, como a cadenas más largas, que se denominan generalmente en la técnica proteínas, de las cuales hay muchos tipos. En una realización, tal como se usa en el presente documento, el término “péptidos” se refiere a un polímero lineal de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos, que tiene preferiblemente una longitud de cadena de menos de aproximadamente 50 residuos de aminoácido; un “polipéptido” se refiere a un polímero lineal de al menos 50 aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos; y una proteína se refiere específicamente a una entidad funcional formada por uno o más péptidos o polipéptidos, opcionalmente glicosilados, y opcionalmente de cofactores no polipeptídicos. Este término también excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto las que se producen de manera natural como las que no se producen de manera natural. Un polipéptido puede ser una proteína completa o una subsecuencia de la misma. Los “polipéptidos” incluyen, por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos sustancialmente homólogos, oligopéptidos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión, entre otros. Un polipéptido incluye un péptido natural, un péptido recombinante o una combinación de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína ORF2i” se refiere a la proteína de la cápside ORF2 del virus de la hepatitis E (ORF2i) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 1 y en la que dicha proteína no está glicosilada.

SEQ ID NO:l:

Según la invención, la masa de la proteína ORF2i de la presente invención es de aproximadamente 80 kDa.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína ORF2g” se refiere a la proteína de la cápside ORF2 del virus de la hepatitis E (ORF2g) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 2 y en la que dicha proteína está glicosilada.

SEQ ID NO:2:

Según la invención, la masa de la proteína ORF2g de la presente invención es de aproximadamente 90 kDa.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína ORF2c” se refiere a la proteína de la cápside ORF2 del virus de la hepatitis E (ORF2c) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 3 y en la que dicha proteína está glicosilada.

Según la invención, la masa de la proteína ORF2c de la presente invención es de aproximadamente 75 kDa.

Tal como se usa en el presente documento, el término “glicosilado” con respecto a una proteína significa que un resto de hidrato de carbono está presente en uno o más sitios de la molécula de proteína. En particular, una proteína glicosilada se refiere a una proteína que normalmente se modifica mediante la adición de N-glicano u O-glicano.

Según la invención, una primera secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con una segunda secuencia de aminoácidos significa que la primera secuencia tiene el 90; el 91; el 92; el 93; el 94; el 95; el 96; el 97; el 98; el 99 o el 100 % de identidad con la segunda secuencia de aminoácidos. La identidad de secuencia se mide frecuentemente en cuanto a porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineación se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins y Sharp, cAb Io S, 5:151-153, 1989; Corpetet al.Nuc. Acids Res., 16:10881-10890,1988; Huanget al.,Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992; y Pearsonet al.,Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994). Altschulet al.,Nat. Genet., 6:119-129, 1994, presenta una consideración detallada de los métodos de alineación de secuencias y cálculos de homología. A modo de ejemplo, pueden usarse las herramientas de alineación ALIGN (Myers y Miller, CABIOS 4:11-17, 1989) o LFA<s>T<a>(Pearson y Lipman, 1988) para realizar comparaciones de secuencias (Internet Program® 1996, W. R. Pearson y la Universidad de Virginia, fasta20u63 versión 2.0u63, fecha de lanzamiento: diciembre de 1996). ALIGN compara secuencias completas entre sí, mientras que LFASTA compara regiones de similitud local. Estas herramientas de alineación y sus respectivos tutoriales están disponibles en Internet en el sitio web de NCSA, por ejemplo. Alternativamente, para comparaciones de secuencias de aminoácidos de más de aproximadamente 30 aminoácidos, puede emplearse la función de secuencias Blast 2 usando la matriz BLOSUM62 predeterminada configurada con parámetros predeterminados (coste de existencia de hueco de 11 y un coste de hueco por residuo de 1). Al alinear péptidos cortos (menos de aproximadamente 30 aminoácidos), la alineación debe realizarse usando la función de secuencias Blast 2, empleando la matriz PAM30 configurada con parámetros predeterminados (penalizaciones de hueco abierto de 9, de hueco por extensión de 1). El sistema de comparación de secuencias BLAST está disponible, por ejemplo, en el sitio web del NCBI; véanse también Altschulet al.,J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish y States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Maddenet al.Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschulet al.,Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997; y Zhang y Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997.

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier molécula similar a un anticuerpo que tiene una región de unión a antígeno, y este término incluye fragmentos de anticuerpos que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab', Fab, F(ab')2 y anticuerpos de dominio único (DAB). En los anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro y cada cadena pesada está unida a una cadena ligera mediante un enlace disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadenas pesadas que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene dominios de secuencia distintos. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, denominados en conjunto CH). Las regiones variables de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento de unión y la especificidad del antígeno. Los dominios de la región constante de las cadenas ligera (CL) y pesada (CH) confieren importantes propiedades biológicas, tales como la asociación de cadenas de anticuerpos, la secreción, la movilidad transplacentaria, la unión al complemento y la unión a los receptores de Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación del anticuerpo están formados por residuos que provienen principalmente de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) o hipervariables. Ocasionalmente, los residuos de las regiones de entramado (FR) o no hipervariables influyen en la estructura general del dominio y, por tanto, en el sitio de combinación. Las regiones determinantes de complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoácidos que, juntas, definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina nativa. Cada una de las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina tiene tres CDR, denominadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Por tanto, un sitio de unión a antígeno incluye seis CDR, que comprenden el conjunto de CDR de cada región V de cadena pesada y cadena ligera. Las regiones de entramado (FR) se refieren a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR.

El término “fragmento de anticuerpo” se refiere a al menos una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, que conserva la capacidad de interactuar específicamente con (por ejemplo, mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) un epítopo de un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla, en particular fragmentos de anticuerpos scFv, Fv unidos por puentes disulfuro (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único tales como, por ejemplo, sdAb (o bien VL o bien VH), dominios VHH de camélido, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos tales como, por ejemplo, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, y una CDR aislada u otros fragmentos de unión a epítopo de un anticuerpo. Un fragmento de unión a antígeno también puede incorporarse en anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Los fragmentos de unión a antígeno también pueden injertarse en andamiajes basados en polipéptidos tales como fibronectina tipo III (véase la patente estadounidense n.°: 6.703.199, que describe minicuerpos polipeptídicos de fibronectina). La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente.

El término “Fab” indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L completa, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, la papaína, están unidos mediante un enlace disulfuro.

El término “F(ab')2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de unión a antígeno, que es ligeramente mayor que el Fab unido mediante un enlace disulfuro de la región bisagra, entre los fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, la pepsina.

El término “Fab'” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígeno, que se obtiene escindiendo un enlace disulfuro de la región bisagra de F(ab')2.

Un polipéptido Fv de cadena sencilla (“scFv”) es un heterodímero VH:VL unido covalentemente que normalmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes que codifican para VH y VL unidos mediante un ligador que codifica para un péptido. “dsFv” es un heterodímero VH::VL estabilizado mediante un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpos divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFv monovalentes o pueden generarse acoplando scFv monovalentes mediante un ligador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.

Según la presente invención, el anticuerpo de la presente invención tiene especificidad por la proteína ORF2i. Tal como se usa en el presente documento, el término “especificidad” se refiere a la capacidad de un anticuerpo para unirse de manera detectable a un epítopo presentado en la proteína ORF2i, al tiempo que tiene una reactividad detectable relativamente pequeña con la proteína ORF2g y la proteína ORF2c.

Tal como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una disposición específica de aminoácidos ubicados en una proteína a la que se une un anticuerpo. Los epítopos a menudo consisten en una agrupación superficial químicamente activa de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales, es decir, que implican dos o más secuencias de aminoácidos en diversas regiones del antígeno que pueden no ser necesariamente contiguas. Por tanto, los epítopos de la presente invención comprenden al menos un residuo de aminoácido de los residuos de aminoácido 10 a 23 de SEQ ID NO: 1 (es decir, SEQ ID NO: 4).

SEQ ID NO: 4

GQPSGRRRGRRSGG

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la divulgación que no forma parte de la invención se une a un epítopo que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 residuos de aminoácido de SEQ ID NO: 4, o de una secuencia que comparte al menos el 90 % de identidad con respecto a SEQ ID NO: 4.

El anticuerpo de la invención se une a un epítopo que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 4. Un anticuerpo de la divulgación que no forma parte de la invención se une a una secuencia de aminoácidos que comparte al menos el 90 % de identidad con respecto a SEQ ID NO: 4.

Tal como se usa en el presente documento, el término “unión” tal como se usa en el presente documento se refiere a una asociación directa entre dos moléculas debida a, por ejemplo, interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas e iónicas y/o por enlaces de hidrógeno, incluyendo interacciones tales como puentes salinos y puentes de agua. En particular, tal como se usa en el presente documento, el término “unión” en el contexto de la unión de un anticuerpo a un antígeno o epítopo predeterminado normalmente es una unión con una afinidad correspondiente a una K<d>de aproximadamente 10-7 M o menos, tal como de aproximadamente 10-8 M o menos, tal como de aproximadamente 10-9 M o menos, de aproximadamente 10-10 M o menos o de aproximadamente 10-11 M o incluso menos.

La especificidad puede determinarse relativamente mediante ensayos de unión o de unión competitiva, usando, por ejemplo, instrumentos Biacore, tal como se describe en otra parte en el presente documento. La especificidad puede mostrarse, por ejemplo, en una razón de afinidad/avidez de aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1, 10.000:1 o mayor en la unión al antígeno específico frente a la unión inespecífica a otras moléculas irrelevantes. El término “afinidad”, tal como se usa en el presente documento, significa la fuerza de unión de un anticuerpo a un epítopo. La afinidad de un anticuerpo viene dada por la constante de disociación Kd, definida como [Ac] x [Ag]/[Ac-Ag], donde [Ac-Ag] es la concentración molar del complejo anticuerpo-antígeno, [Ac] es la concentración molar del anticuerpo no unido y [Ag] es la concentración molar del antígeno no unido. La constante de afinidad Ka está definida por 1/Kd. Los métodos preferidos para determinar la afinidad de los AcM pueden encontrarse en Harlow,et al.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coliganet al.,eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), y Müller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983). Un método convencional y preferido bien conocido en la técnica para determinar la afinidad de los AcM es el uso de instrumentos Biacore.

En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. El término “anticuerpo policlonal”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a múltiples inmunoglobulinas en antisuero producidas contra un antígeno después de la inmunización, y que pueden reconocer y unirse a uno o más epítopos de ese antígeno. Los términos “anticuerpo monoclonal”, “Ac monoclonal”, “composición de anticuerpo monoclonal”, “AcM”, o similares, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse usando el método de Kohler y Milstein (Nature, 256:495, 1975). Para preparar anticuerpos monoclonales útiles en la invención, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado (por ejemplo, ratón, cabra, camélido...) a intervalos adecuados (por ejemplo, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes o una vez al mes) con una forma antigénica viral relevante. Normalmente, la forma inmunogénica consiste en el péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que va desde el residuo amino en la posición 10 a 23 en SEQ ID NO: 1 (es decir, SEQ ID NO: 4). Al animal puede administrársele un “refuerzo” final de la forma antigénica en el plazo de una semana del sacrificio. A menudo es deseable usar un adyuvante inmunológico durante la inmunización. Los adyuvantes inmunológicos adecuados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, alumbre, adyuvante Ribi, Titermax de Hunter, adyuvantes de saponina tales como QS21 o Quil A, u oligonucleótidos inmunoestimulantes que contienen CpG. Otros adyuvantes adecuados se conocen bien en el campo. Los animales pueden inmunizarse por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intranasal u otras vías. Tras el régimen de inmunización, se aíslan linfocitos del bazo, ganglio linfático u otro órgano del animal y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada usando un agente tal como polietilenglicol para formar un hibridoma. Tras la fusión, las células se colocan en medios que permiten el crecimiento de los hibridomas, pero no de las parejas de fusión, usando métodos convencionales, tal como se describe (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3a edición, Academic Press, Nueva York, 1996). Tras el cultivo de los hibridomas, los sobrenadantes celulares se analizan para determinar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, es decir, que se unan selectivamente al antígeno. Las técnicas analíticas adecuadas incluyen ELISA, inmunofluorescencia, citometría de flujo, inmunoprecipitación e inmunotransferencia de tipo Western. Otras técnicas de análisis son bien conocidas en el campo. Las técnicas preferidas son aquellas que confirman la unión de anticuerpos a un antígeno conformacionalmente intacto y plegado de forma nativa, tales como ELISA en condiciones no desnaturalizantes, citometría de flujo e inmunoprecipitación.

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la presente invención se conjuga con un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos para preparar y detectar tales inmunoconjugados marcados de manera detectable son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica y se describen con más detalle a continuación. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para los fines de la presente invención son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C. El anticuerpo de la presente invención también puede marcarse con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado con fluorescencia de la presente invención se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de la longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcaje fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y colorantes de fluorescamina y Alexa Fluor. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede marcarse de manera detectable acoplando dicho anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado marcado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato. De manera similar, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcaje incluyen luciferina, luciferasa y aecuorina. Normalmente, cuando el anticuerpo se conjuga con una enzima, el anticuerpo se incuba en presencia del sustrato apropiado, el resto enzimático reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que pueden usarse para marcar de manera detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen pgalactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa y fosfatasa alcalina. Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse según la presente invención. La unión de restos marcadores al anti-anticuerpo de la presente invención se logra usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe en Kennedyet al.,Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurset al.,Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shihet al.,Int'U. Cancer 46: 11O1, 1990; Steinet al.,Cancer Res. 50: 1330, 1990; y Coligan, citado anteriormente. Además, la comodidad y la versatilidad de la detección inmunoquímica pueden mejorarse mediante el uso de anticuerpos de la presente invención que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina. {Véanse, por ejemplo, Wilcheket al.(eds.), “Avidin-Biotin Technology”, Methods In Enzymology (vol. 184) (Academic Press 1990); Bayeret al.,“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology”, Methods In Molecular Biology (vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).

En algunas realizaciones, el anticuerpo de la presente invención se conjuga con un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático, un marcador bioluminiscente u oro coloidal. Los métodos para preparar y detectar tales inmunoconjugados marcados de manera detectable son bien conocidos por los expertos habituales en la técnica y se describen con más detalle a continuación. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un radioisótopo que se detecta mediante autorradiografía. Los isótopos que son particularmente útiles para los fines de la presente invención son 3H, 125I, 131I, 35S y 14C. El anticuerpo de la presente invención también puede marcarse con un compuesto fluorescente. La presencia de un anticuerpo marcado con fluorescencia de la presente invención se determina exponiendo el inmunoconjugado a luz de la longitud de onda adecuada y detectando la fluorescencia resultante. Los compuestos de marcaje fluorescente incluyen isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y colorantes de fluorescamina y Alexa Fluor. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede marcarse de manera detectable acoplando dicho anticuerpo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del inmunoconjugado marcado con quimioluminiscencia se determina detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente incluyen luminol, isoluminol, un éster de acridinio aromático, un imidazol, una sal de acridinio y un éster de oxalato. De manera similar, puede usarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes que son útiles para el marcaje incluyen luciferina, luciferasa y aecuorina. Normalmente, cuando el anticuerpo se conjuga con un marcador fluorescente tal como se describió anteriormente, la presencia de la proteína de fusión puede detectarse con cualquier medio bien conocido en la técnica, tal como un microscopio o un sistema de análisis por microscopio o automatizado. Normalmente, cuando el anticuerpo se conjuga con una enzima, el resto enzimático reacciona con el sustrato para producir un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Los ejemplos de enzimas que pueden usarse para marcar de manera detectable inmunoconjugados poliespecíficos incluyen p-galactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante) y fosfatasa alcalina. Los expertos en la técnica conocerán otros marcadores adecuados que pueden emplearse según la presente invención. La unión de restos marcadores al anti-anticuerpo de la presente invención se logra usando técnicas convencionales conocidas en la técnica. La metodología típica a este respecto se describe en Kennedyet al.,Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurset al.,Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shihet al.,Int'U. Cancer 46: 1101, 1990; Steinet al.,Cancer Res. 50: 1330, 1990; y Coligan, citado anteriormente. Además, la comodidad y la versatilidad de la detección inmunoquímica pueden mejorarse mediante el uso de anticuerpos de la presente invención que se han conjugado con avidina, estreptavidina y biotina. {Véanse, por ejemplo, Wilcheket al.(eds.), “Avidin-Biotin Technology”, Methods In Enzymology (vol. 184) (Academic Press 1990); Bayeret al.,“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology”, Methods In Molecular Biology (vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992).

Los anticuerpos de la presente invención son particularmente interesantes para fines de diagnóstico. En particular, los anticuerpos de la presente invención son adecuados para determinar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra. Más particularmente, los anticuerpos de la presente invención son adecuados para diagnosticar la infección por virus de la hepatitis E en un sujeto.

Por consiguiente, un objeto adicional de la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de la proteína ORF2i en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con los anticuerpos de la presente invención en condiciones que permitan que se forme un inmunocomplejo de la proteína y los anticuerpos, en el que la detección del inmunocomplejo indica la presencia de la proteína ORF2i en la muestra (por ejemplo: inmunoprecipitación, inmunofluorescencia e inmunotransferencia de tipo Western).

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” incluye cualquier muestra sólida o fluida que pueda contener partículas infecciosas del virus de la hepatitis E. En algunas realizaciones, la muestra se selecciona del grupo que consiste en ascitis; orina; saliva; sudor; leche; líquido sinovial; líquido peritoneal; líquido amniótico; líquido cefalorraquídeo; líquido linfático; embolia pulmonar; y líquido pericárdico. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de heces. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de orina. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de saliva. En algunas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre. Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra de sangre” significa cualquier muestra de sangre derivada del sujeto. Las recogidas de muestras de sangre pueden realizarse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, personal médico capacitado puede extraer la sangre del sujeto directamente en anticoagulantes tales como citrato y EDTA. La sangre completa puede separarse en la porción de plasma, las células y la porción de plaquetas mediante centrifugación refrigerada a 3500 X G durante 2 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante es el plasma.

Más particularmente, un objeto adicional de la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con los anticuerpos de la presente invención en condiciones que permitan que se forme un inmunocomplejo del anticuerpo y las partículas infecciosas, en el que la detección del inmunocomplejo indica la presencia de las partículas infecciosas en la muestra.

En algunas realizaciones, los métodos de detección de la presente invención pueden comprender además poner en contacto la muestra con anticuerpos que reconocen las proteínas ORF2g y/u ORF2c.

Los métodos de detección de la presente invención son particularmente adecuados para diagnosticar una infección por VHE aguda, una infección por VHE reciente, una infección por VHE crónica, una infección por VHE débilmente activa o una infección por VHE curada.

Los expertos en la técnica conocen los ensayos y las condiciones para la detección de inmunocomplejos. Tales ensayos incluyen, por ejemplo, ensayos de competición, ensayos de reacción directa, ensayos de tipo sándwich e inmunoensayos (por ejemplo, ELISA). Los ensayos pueden ser cuantitativos o cualitativos. Existen varios ensayos convencionales diferentes para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende una proteína de la presente invención. Por ejemplo, la etapa de detección puede comprender realizar un ensayo ELISA, realizar un inmunoensayo de flujo lateral, realizar un ensayo de aglutinación, analizar la muestra en un rotor analítico o analizar la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. Estos diferentes ensayos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una serie de variaciones de la técnica de ensayo en sándwich para realizar un inmunoensayo. Brevemente, en un ensayo en sándwich típico, se inmoviliza un primer anticuerpo de la presente invención sobre una superficie sólida y la muestra que va a analizarse se pone en contacto con el anticuerpo inmovilizado durante un tiempo y en condiciones que permitan la formación del inmunocomplejo. Después de la incubación, se añade un segundo anticuerpo de la presente invención que está marcado con un resto detectable y se incuba en condiciones que permitan la formación de un complejo ternario entre cualquier inmunocomplejo y el anticuerpo marcado. Cualquier material no unido se elimina por lavado y la presencia de polipéptido en la muestra se determina mediante observación/detección de la señal producida directa o indirectamente por el resto detectable. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Los métodos para marcar moléculas biológicas tales como anticuerpos se conocen bien en la técnica (véanse, por ejemplo, “Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B”, Methods in Enzymol., 1974, vol. 34, W.B. Jakoby and M. Wilneck (Eds.), Academic Press: Nueva York, NY; y M. Wilchek y E.A. Bayer, Anal. Biochem., 1988, 171: 1-32). Los restos detectables más comúnmente usados en inmunoensayos son enzimas y fluoróforos. En el caso de un inmunoensayo enzimático (EIA o ELISA), una enzima tal como peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y similares se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Los sustratos que van a usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente para la producción de un cambio de color detectable tras la hidrólisis de la enzima correspondiente. En el caso de la inmunofluorescencia, el segundo anticuerpo se acopla químicamente a un resto fluorescente sin alterar su capacidad de unión. Después de la unión del anticuerpo marcado con fluorescencia al inmunocomplejo y la retirada de cualquier material no unido, se detecta y, opcionalmente, se cuantifica la señal fluorescente generada por el resto fluorescente. Alternativamente, el segundo anticuerpo puede marcarse con un radioisótopo, un resto quimioluminiscente o un resto bioluminiscente. En algunas realizaciones, el ensayo usa una fase sólida o un sustrato al que el anticuerpo de la presente invención está unido directa o indirectamente. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el anticuerpo de la presente invención está unido a o inmovilizado sobre un sustrato, tal como un soporte sólido o semisólido. La unión puede ser covalente o no covalente, y puede verse facilitada por un resto asociado con la proteína que permite la unión covalente o no covalente, tal como un resto que tiene una alta afinidad por un componente unido al portador, soporte o superficie. En algunas realizaciones, el sustrato es una perla, tal como una partícula coloidal (por ejemplo, una nanopartícula coloidal elaborada de oro, plata, platino, cobre, materiales compuestos metálicos, otros metales blandos, partículas de estructura de núcleo-cubierta o nanoesferas de oro huecas) u otro tipo de partícula (por ejemplo, una perla magnética o una partícula o nanopartícula que comprende sílice, látex, poliestireno, policarbonato, poliacrilato o PVDF). Tales partículas pueden comprender un marcador (por ejemplo, un marcador colorimétrico, quimioluminiscente o fluorescente) y pueden ser útiles para visualizar la ubicación de las proteínas durante los inmunoensayos. En algunas realizaciones, el sustrato es una inmunotransferencia por puntos o una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral. Por ejemplo, el anticuerpo de la presente invención puede unirse a o inmovilizarse sobre una membrana porosa, tal como una membrana de PVDF (por ejemplo, una membrana Immobilon™), una membrana de nitrocelulosa, una membrana de polietileno, una membrana de nailon o un tipo similar de membrana. En algunas realizaciones, el sustrato es una ruta de flujo en un rotor analítico. En algunas realizaciones, el sustrato es un tubo o un pocillo, tal como un pocillo en una placa (por ejemplo, una placa de microtitulación) adecuado para su uso en un ensayo ELISA. Tales sustratos pueden comprender vidrio, materiales a base de celulosa, polímeros termoplásticos, tales como polietileno, polipropileno o poliéster, estructuras sinterizadas que se componen de materiales particulados (por ejemplo, vidrio o diversos polímeros termoplásticos) o película de membrana fundida que se compone de nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares. Un sustrato puede ser partículas finas sinterizadas de polietileno, comúnmente conocido como polietileno poroso, por ejemplo, polietileno poroso de 0,2-15 micrómetros de Chromex Corporation (Albuquerque, N. Méj.). Todos estos materiales de sustrato pueden usarse en formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o pueden recubrirse sobre, unirse o laminarse a soportes inertes apropiados, tales como papel, vidrio, películas plásticas o materiales textiles. Los métodos adecuados para inmovilizar péptidos sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares.

Un objeto adicional de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo para identificar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra que comprende al menos un anticuerpo de la presente invención (inmovilizado o no sobre un soporte sólido tal como se describió anteriormente). En algunas realizaciones, el kit puede incluir un segundo anticuerpo de la presente invención que produce una señal detectable. En algunas realizaciones, el kit comprende además anticuerpos que tienen especificidad por las proteínas ORF2g y/u ORF2c. Los ejemplos de kits incluyen, pero no se limitan a, kits de ensayo ELISA y kits que comprenden tiras de ensayo y tiras reactivas. En algunas realizaciones, los kits descritos en el presente documento comprenden además valores de referencia de los niveles de proteína o partículas infecciosas. Los valores de referencia son normalmente niveles promedio en muestras de una población de individuos sanos. En algunas realizaciones, los kits descritos en el presente documento comprenden además al menos un recipiente de recogida de muestras para la recogida de muestras. Los dispositivos y el recipiente de recogida incluyen, pero no se limitan a, jeringas, lancetas, tubos de recogida de sangre BD vAc UTAINER®. En algunas realizaciones, los kits descritos en el presente documento comprenden además instrucciones para usar el kit y para la interpretación de los resultados.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse en modo alguno como limitativos del alcance de la presente invención.

Figuras

Figura 1: Generación de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína ORF2i usando el péptido GQPSGRRRGRRSGG (SEQ ID NO: 4). Se analizaron la reactividad y la especificidad de los sueros de ratón P1S5 y de control (CTL) y el anticuerpo 1E6 (A) mediante inmunofluorescencia en células infectadas por VHE fijadas y (B) mediante inmunotransferencia de tipo Western en una mezcla de proteínas ORF2 (ORF2i y ORF2g/ORF2c). El asterisco indica una banda no especifica. Se analizaron la reactividad y la especificidad del sobrenadante del hibridoma P1H1 y el anticuerpo 1E6 (C) mediante inmunofluorescencia en células infectadas con VHE fijadas y mediante inmunotransferencia de tipo Western en una mezcla de proteínas ORF2 (D) o un extracto de células infectadas por VHE (E).

Figura 2: Inmunoprecipitación de partículas de VHE tratadas con detergente con anticuerpo P1H1. (A-C) Se analizaron la sensibilidad y la especificidad de IP P1H1 mediante inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo 1E6.

RESULTADOS: Generación de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína ORF2i usando el péptido GQPSGRRRGRRSGG (SEQ ID NO: 4)

La porción N-terminal está presente sólo en la forma ORF2i y no en la forma ORF2g ni en la forma ORF2c. Por tanto, dicha porción puede representar la mejor estrategia para obtener anticuerpos altamente específicos de la forma ORF2i. Para verificar la especificidad entre cepas/genotipos, se llevó a cabo el alineamiento de secuencias sólo entre los aminoácidos (aa) 1 a 50 (datos no mostrados). Se realizaron la predicción de estructura secundaria y ausencia de glicosilación, así como la predicción de inmunogenicidad, hidrofilia y accesibilidad, para definir la mejor secuencia para el inmunógeno. Finalmente, se seleccionó el péptido GQPSGRRRGRRSGG (SEQ ID NO: 4) para la inmunización. Para hacer que esta secuencia sea más inmunogénica durante las inmunizaciones murinas, se llevó a cabo un acoplamiento al transportador proteico KLH mediante una función maleimida añadiendo una cisteína en la posición C-terminal. La inmunización se realizó según un protocolo de rutina. Se inmunizaron cinco ratones al menos tres veces a intervalos de tres semanas con el péptido (SEQ ID NO: 4). Durante la inmunización se usaron adyuvantes completos e incompletos de Freund. Los animales se inmunizaron por vía subcutánea e intraperitoneal. Diez días después de la tercera inmunización, se obtuvieron muestras de sangre de los ratones y se analizó su suero para determinar su inmunorreactividad. Los sueros se analizaron en primer lugar mediante ELISA indirecto en placas recubiertas con el péptido (SEQ ID NO: 4) (datos no mostrados). Su reactividad se analizó mediante inmunofluorescencia (IF) en células infectadas por VHE fijadas (figura 1A). El anticuerpo monoclonal 1E6 (registro de anticuerpos #AB-827236), que reconoce las tres formas de proteínas ORF2 (Montpellieret al.,Gastroenterology, 2018), se usó como control positivo. Se usó el suero de un ratón inmunizado con PBS como control negativo (ratón CTL). Tal como se muestra en la figura 1A, el suero del ratón P1S5 mostró una reactividad específica en IF. A continuación se analizó la especificidad del suero de P1S5 en experimentos de inmunotransferencia de tipo Western con una mezcla de proteínas ORF2 (ORF2i y ORF2g/ORF2c) como antígenos (figura 1B). El suero de P1S5 mostró un reconocimiento altamente específico de la proteína ORF2i, sin reacción cruzada con las proteínas ORF2g/c, en comparación con el anticuerpo 1E6 que reconoce las tres formas.

Después de un refuerzo final, se sacrificó el ratón P1S5. Se aislaron linfocitos del bazo y se fusionaron con una línea celular de mieloma usando polietilenglicol para formar un hibridoma. Tras la fusión, las células se colocaron en medios permisivos para el crecimiento de hibridomas. Tras el cultivo de los hibridomas, los sobrenadantes celulares se analizaron mediante inmunofluorescencia. Tal como se muestra en la figura 1C, el sobrenadante del hibridoma P1H1 mostró una tinción específica de ORF2i. A continuación se analizó la especificidad del clon P1H1 en experimentos de inmunotransferencia de tipo Western con una mezcla de proteínas ORF2 (ORF2i y ORF2g/ORF2c) (figura 1D) o un extracto de células infectadas por VHE (figura 1E) como antígenos. El clon P1H1 mostró un reconocimiento altamente específico de la proteína ORF2i, sin reacción cruzada con las proteínas ORF2g/c, en comparación con el anticuerpo 1E6 que reconoce las tres formas.

A continuación se amplificó y se purificó el clon P1H1. El anticuerpo P1H1 purificado se usó en ensayos de inmunoprecipitación (IP) (figura 2). El sobrenadante de células productoras de VHE (SN) inactivado por calor (20 min a 80 °C) se incubó con el anticuerpo P1H1 o el anticuerpo 1E6 y luego con perlas de proteína G-Sepharose. Las proteínas ORF2 inmunoprecipitadas se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo 1E6. IP P1H1 mostró un reconocimiento altamente específico de la proteína ORF2i, sin reacción cruzada con las proteínas ORF2g/c y sin fondo (figura 2A), en comparación con IP 1E6 que mostró las tres formas de ORF2 y múltiples bandas no específicas. Se usó SN incubado únicamente con perlas de proteína G como control negativo (IP CTL). Estos resultados indican que el anticuerpo P1H1 puede inmunoprecipitar partículas de VHE desnaturalizadas por calor.

Luego, el SN se inactivó térmicamente durante 20 min a 80 °C, o se trató durante 20 min con ácido cítrico al 3 % y luego se tamponó con Tris 1 M, pH 8, o se trató durante 30 min con Triton X-100 al 1 % (figura 2B). A continuación, los SN se sometieron a IP con el anticuerpo P1H1. Las proteínas ORF2 inmunoprecipitadas se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo 1E6. IP P1H1 en SN tratado con ácido cítrico mostró sólo una banda débil de proteína ORF2i y bandas no específicas. Por el contrario, en cuanto a IP P1H1 en SN inactivado por calor, IP P1H1 en SN tratado con Triton X-100 mostró un reconocimiento altamente específico de la proteína ORF2i, sin reacción cruzada con las proteínas ORF2g/c y sin fondo (figura 2B). Luego se trató SN durante 30 minutos con Triton X-100 al 0,1 %, al 0,25 %, al 0,5 % o al 1 % antes de IP con P1H1 (figura 2C). Se usaron SN no tratado (TX 0 %) y SN desnaturalizado por calor (80 °C) como controles negativo y positivo, respectivamente. Las proteínas ORF2 inmunoprecipitadas se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando el anticuerpo 1E6. En todas las muestras tratadas con Triton X-100 (del 0,1 al 1 %), IP P1H1 mostró un reconocimiento altamente sensible y específico de la proteína ORF2i, sin reacción cruzada con las proteínas ORF2g/c y sin fondo (figura 2C). En conjunto, estos resultados indican que el anticuerpo P1H1 puede inmunoprecipitar específicamente partículas de VHE tratadas con detergente.

En conjunto, estos resultados indican que pueden producirse anticuerpos dirigidos específicamente contra los polipéptidos ORF2i (SEQ ID NO: 4). Tales anticuerpos serán muy adecuados para determinar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra. Más particularmente, la detección del polipéptido ORF2i de la presente invención es adecuada para diagnosticar la infección por virus de la hepatitis E en un sujeto.

Referencias

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo que se une a la proteína ORF2i del virus de la hepatitis E y en el que dicho anticuerpo no se une a la proteína ORF2g ni a la proteína ORF2c del virus de la hepatitis E, y en el que el anticuerpo se une a un epítopo que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 4.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es un Fab', Fab, F(ab')2, scFv o un anticuerpo de dominio único.

4. Anticuerpo según la reivindicación 1, que está conjugado con un marcador detectable.

5. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el marcador detectable es un radioisótopo, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente, un marcador enzimático o un marcador bioluminiscente.

6. Anticuerpo según la reivindicación 4, en el que el marcador se selecciona del grupo que consiste en pgalactosidasa, glucosa oxidasa, peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante) y fosfatasa alcalina.

7. Anticuerpo según la reivindicación 1, que está unido a o inmovilizado sobre un sustrato, tal como un soporte sólido o semisólido.

8. Uso del anticuerpo según la reivindicación 1 para determinar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra.

9. Método para detectar la presencia de la proteína ORF2i en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo según la reivindicación 1 en condiciones que permitan que se forme un inmunocomplejo de la proteína y el anticuerpo, en el que la detección del inmunocomplejo indica la presencia de la proteína ORF2i en la muestra.

10. Método para detectar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo según la reivindicación 1 en condiciones que permitan que se forme un inmunocomplejo del anticuerpo y las partículas infecciosas, en el que la detección del inmunocomplejo indica la presencia de las partículas infecciosas en la muestra.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en heces, sangre, ascitis; orina; saliva; sudor; leche; líquido sinovial; líquido peritoneal; líquido amniótico; líquido cefalorraquídeo; líquido linfático; embolia pulmonar; y líquido pericárdico.

12. Uso del anticuerpo según la reivindicación 1 para diagnosticar una infección por VHE aguda, una infección por VHE reciente, una infección por VHE crónica, una infección por VHE débilmente activa o una infección por VHE curada.

13. Kit o dispositivo para identificar la presencia de partículas infecciosas del virus de la hepatitis E en una muestra que comprende al menos un anticuerpo según la reivindicación 1 inmovilizado o no sobre un soporte sólido, en el que el dispositivo es un dispositivo de inmunoensayo de flujo.