ES2970111T3 - Modelo para una simulación in vitro del comportamiento de vasos disfuncionales - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un modelo para simulación in vitro del comportamiento de vasos humanos disfuncionales, como por ejemplo vasos afectados por aneurisma, estenosis o placas de esclerosis, como instrumento para probar dispositivos médicos y medicamentos con el objetivo de verificar su efectividad y seguridad del mismo antes de su uso en humanos. Específicamente, la presente invención se refiere a un modelo in vitro de una estructura vascular de forma sustancialmente tubular que tiene características anatómicas y fisiológicas disfuncionales que simulan la misma estructura vascular de un sujeto sano cuya estructura vascular ha sido dañada o deformada o deteriorada debido a un daño seleccionado entre entre el grupo que comprende o, alternativamente, que consiste en aneurisma, estenosis, placas de esclerosis, formas de tumores o miocardiopatías que tienen las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas. Además, la presente invención también se refiere a un proceso de industrialización confiable y reproducible para eliminar burbujas de aire para producir un tejido vascular diseñado para la prueba in vitro de medicamentos para uso humano y productos veterinarios para uso animal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Modelo para una simulaciónin vitrodel comportamiento de vasos disfuncionales
La presente invención versa sobre un modelo para una simulaciónin vitrodel comportamiento de vasos humanos disfuncionales, tales como, por ejemplo, vasos afectados por un aneurisma, estenosis o placas escleróticas, como un instrumento para probar dispositivos médicos y fármacos con el objetivo de verificar la eficacia y la seguridad de los mismos antes del uso de los mismos en seres humanos. Específicamente, la presente invención hace referencia a un modeloin vitrode una estructura vascular, preferiblemente una estructura vascular sintética con forma sustancialmente tubular que tiene características anatómicas y fisiológicas disfuncionales, simulando la estructura vascular de un sujeto sano cuya estructura vascular ha sido dañada o deformada o deteriorada debido a un daño seleccionado entre el grupo que comprende o, de forma alternativa, que consiste en un aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o cardiomiopatías que tiene las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas. Además, la presente invención también versa sobre un proceso de industrialización fiable y reproducible para eliminar burbujas de aire para producir un tejido vascular artificial para la pruebain vitrode productos medicinales para su uso en seres humanos y de productos veterinarios para su uso en animales.
Es sabido que el desarrollo de un producto médico es un proceso largo y delicado. Básicamente, en el proceso de desarrollo de un producto medicinal o veterinario, ya se trate de un fármaco o de un dispositivo médico, antes de que pueda usarse el producto en seres humanos o animales, es importante poder determinar el tipo de efectos en el o los tejidos con los que hará contacto, de manera que se evalúen los aspectos relacionados tanto con la seguridad biológica como con la eficacia del producto medicinal y prever problemas potenciales relativos al uso del mismo.
En este contexto, la evaluación de la seguridad biológica y de la eficacia del producto medicinal es exhaustiva y compleja, mientras que la evaluación de la interacción con el o los tejidos de un solo material constituyente puede no ser considerada en aislamiento de la planificación general del producto medicinal o veterinario, que debe ser evaluado en su totalidad y en un contexto que pueda reproducir las condiciones de uso con la máxima fidelidad posible.
En la actualidad, la evaluación de la seguridad biológica y de la eficacia de un producto medicinal o veterinario se basa en pruebasin vitro, ex vivoy en modelos animales que tienen diferencias significativas con respecto a las condiciones finales de uso. En particular, los modelos animales tienen diferencias fisiológicas significativas que complican la trasposición de la validez de los resultados a seres humanos. Tales diferencias son aún más observables cuando se evalúan productos medicinales para su uso en seres humanos o productos veterinarios para su uso en animales, el uso previsto de los cuales esté en la región cardiovascular y vascular periférica, tales como, por ejemplo, válvulas cardiacas, stents, injertos, catéteres, vendajes y mallas.
Desgraciadamente, la evaluación de la interacción de productos medicinales para su uso en seres humanos o de productos veterinarios para su uso en animales con los tejidos vasculares y con la sangre para poder establecer la seguridad biológica y su eficacia es crucial, y los modelos actualmente en uso revelan limitaciones y desventajas importantes, tanto anatómicas/estructurales como en relación con la composición de la sangre.
Además, las pruebas en animales han estado en el centro de un debate intenso y controvertido relativo la cuestión de si el uso de animales para una prueba biomédica puede ser considerado moralmente aceptable. Esta cuestión llevó, ya en 1959, al principio de las 3 R (3R), y hoy sigue siendo un tema muy candente en debates y en los programas internacionales de investigación. El principio de las 3 R se refiere a tres conceptos clave: reemplazo, reducción y refinamiento. El principio de las 3 R defiende que la investigación en la industria biomédica debería marcarse como meta, con el máximo esfuerzo posible, reemplazar o sustituir el modelo animal por un modelo alternativo; reducir tanto como sea posible el número de animales usados en un protocolo experimental dado; refinar, es decir mejorar, las condiciones experimentales a las que son sometidos los animales.
En la técnica es sabido en el contexto de la reconstrucción de tejidosex vivoque es crucial caracterizar y manipular el microentorno celular para una implementación con éxito de sistemas de bioingeniería basados en células y lo esencial que resulta el conocimiento de conceptos fundamentales de biomimesis, fenómenos de transporte e ingeniería de reacciones para el diseño y el desarrollo de sistemas de ingeniería de tejidos, tales como productos sintéticos o terapéuticos (“Controlling Tissue Microenvironments: Biomimetics, Transport Phenomena and Reacting Systems”, Robert J Fisher y otros).
La industria de la ingeniería de tejidos vasculares muestra que es crucial poder producir un endotelio continuo (es decir, que tenga una monocapa de células confluyentes) y funcional que consista principalmente en células endoteliales (CE).
Se conoce en la técnica una metodología para la fabricación de tejido vascular tubular utilizando polímeros termosensibles que tienen características de transición de fase reversible inducida por la temperatura (“Fabrication Factory for Tubular Vascular Tissue Mimics based on automated Rolling Manipulation and Thermo-Responsive Polymers”, Takehisa Matsuda y otros).
También se conoce en la técnica, un constructo de tejido artificial que imita la estructura de vasos sanguíneos utilizando matrices tubulares de fibroína de seda electrohilada con propiedades mecánicas adecuadas. Se sembraron secuencialmente células musculares lisas de arterias coronarias humanas y células endoteliales de las arterias coronarias humanas (CEACH) sobre la superficie luminal de las matrices tubulares y fueron cultivadas bajo un flujo pulsátil fisiológico (“Dynamic culture conditions to generate silk-based tissue-engineered vascular grafts”, Zhang X y otros).
Se presenta una matriz vascular bifurcada de tres capas con una estructura curvada utilizando una técnica que combina moldes impresos tridimensionales y vierte hidrogel y tinta para crear constructos que imitan vasos con parámetros estructurales a medida, proporcionando, por lo tanto, un planteamiento viable para una construcción de matriz vascular. Se utilizó gelatina reticulada enzimáticamente como el material de la matriz. En la matriz se sembraron células endoteliales derivadas de la vena umbilical humana (CEVUH) en las matrices y se cultivaron (“Fabrication of triple-layered bifurcated vascular scaffold with a certain degree of three-dimensional structure” Liu Y y otros).
La producción de un endotelio continuo y funcional es un factor crucial para la promoción de una endotelización matricial y en la garantía de una eficacia apropiada de los constructos de tejido artificial (consistentes en matrices y células), incluyendo la prevención de la trombosis y la estenosis una vez que se han implantado dichos constructos. El documento US2004/037813 describe la formación y el uso de colágeno electroprocesado, incluyendo su uso como una matriz extracelular y su uso en la formación de tejido artificial.
También se conoce en la técnica la investigación acerca de la eficacia de la siembra y la retención en una matrizex vivoacelular de células endoteliales y de células musculares lisas vasculares en condiciones simuladasin vivode cizallamiento y de flujo (“Endothelial and Smooth Muscle Cell Seeding onto Processed Ex Vivo Arterial Scaffolds Using 3D Vascular Bioreactors”, McFetridge y otros).
La generaciónin vitrode endotelio vascular o constructo/tejido vascular artificial contempla, sucintamente, las siguientes etapas:
(1) siembra de células endoteliales en la luz de la matriz y la subsiguiente adhesión de las mismas,
(2) crecimiento/proliferación y organización de las células como una función de estímulos mecánicos (tales como, por ejemplo, el flujo de un fluido) a las que son sometidas, y
(3) generación de una o más capas de células endoteliales funcionales.
Debido a la importancia crucial de la etapa de siembra, muchos grupos de investigación de ámbito universitario han invertido en las últimas décadas en la investigación creando diversas técnicas para la siembra uniforme de las células endoteliales en la luz de la matriz y mejorando la eficacia de la siembra. Sin embargo, los resultados logrados no han sido completamente satisfactorios.
El documento WO 03/082145 describe materiales y una técnica de moldeo para fabricar tejidos vascularizados vivos complejos para un reemplazo de órganos y de tejidos por matrices poliméricas y membranas semipermeables.
El documento WO 2018/063099 describe un dispositivo para modelar hidrogel de matriz extracelular (MEC) con una superficie de primera capa caracterizada por un microcanal, y una segunda capa que comprende un canal de carga en comunicación de fluido con vías de carga para recibir un hidrogel de MEC, estando confinado el hidrogel de MEC para formar un canal perfusionable y, por lo tanto, proporcionar un procedimiento mejorado y eficaz para modelar un microcanal de distintas geometrías vasculares en el hidrogel de MEC.
En la actualidad, la siembra estática y la siembra dinámica representan los principales procedimientos de siembra de células endoteliales. El procedimiento de siembra más simple consiste en depositar con pipeta una suspensión de células directamente sobre la superficie luminal de la matriz seguido por una etapa de incubación breve en una placa de Petri. Este procedimiento depende mucho del operario y se complica por la dificultad de obtener una capa endotelial uniforme.
En cambio, los procedimientos dinámicos, basados en gran medida en la rotación, el vacío y fuerzas electrostáticas o magnéticas, aumentan la eficacia de la siembra celular, la uniformidad y la adhesión. Algunos de estos principios dinámicos podrían ser transferidos directamente y emparejados con biorreactores de perfusión, permitiendo una reducción en la manipulación de la matriz. En este caso, las matrices pueden ser sembradas inmediatamente una vez están alojadas en la cámara del biorreactor.
En cambio, otros grupos de investigación usan el procedimiento de siembra dinámica mediante una inyección continua de una suspensión celular utilizando una bomba de jeringa, o mediante una perfusión continua de la luz de la matriz sembrada con un medio de crecimiento usando una bomba peristáltica, después de inyectar la suspensión de células endoteliales. Estos procedimientos requieren volúmenes mayores de suspensión celular con respecto a un procedimiento de siembra por deposición con pipeta/rotación debido también a la necesidad de llenar el volumen del tubo de perfusión, al igual que el volumen de la jeringa de inyección, revelando posibles limitaciones con referencia a la reducción de costes (células y medios de crecimiento).
Una técnica completamente diferente con respecto a las descritas anteriormente se basa en hacer gotear la suspensión de células en la luz de una matriz. En este caso, la principal desventaja radica en una baja adhesión inicial de las células y en una baja reproducibilidad del procedimiento, dado que depende en gran medida del operario.
Además, la elección de un procedimiento para conectar un circuito de perfusión (procedimiento de perfusión), requerido para la perfusión de una matriz, principalmente tubular, al sistema biorreactor-matriz debe adaptarse a la configuración experimental.
Teniendo en cuenta el aspecto general relativo a los procedimientos para la siembra y la conexión de un circuito de perfusión (procedimiento de perfusión) mencionados anteriormente, siguen existiendo limitaciones y desventajas considerables.
Por lo tanto, claramente surge la necesidad de proporcionar un proceso que comprenda un procedimiento para la siembra y la conexión del circuito de perfusión (procedimiento de perfusión) al sistema biorreactor-matriz que sea reproducible, fiable y eficaz, especialmente teniendo en cuenta la aplicabilidad de dicho proceso a laboratorios de ingeniería de tejidos con certificación BPL (Buenas Prácticas de Laboratorio), cuyo objetivo se centra en pruebas preclínicas avanzadas y en pruebas clínicas.
Surge la necesidad de desarrollar un proceso para la producción de tejidos/constructos vasculares artificiales que tengan un endotelio continuo (es decir, que tenga una monocapa de células confluyentes) y funcional, siendo dicho proceso simple, rápido, eficaz, independiente del operario, bien definido, altamente reproducible y fiable, que comprenda: (1) un procedimiento para la siembra de células, principalmente células endoteliales, en la luz de una matriz, que garantice la homogeneidad y la adhesión uniforme de las células endoteliales, con la eliminación de las burbujas de aire en la matriz; (2) un procedimiento para conectar el circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz (procedimiento de perfusión) con capacidad para garantizar la esterilidad y mantener la ausencia de burbujas de aire en el sistema ensamblado que consta del circuito de perfusión y del sistema biorreactor-matriz.
También surge la necesidad de poder desarrollar tejidos/constructos vasculares artificialesin vitroque comprendan un endotelio continuo y funcional para realizar pruebas preclínicas y clínicas avanzadas, para evitar el uso de conejillos de Indias de laboratorio para realizar pruebas preclínicas y clínicas. Por lo tanto, surge la necesidad de un procedimiento que sea fiable, eficaz y reproducible para la industrialización de dichos tejidos/constructos vasculares artificialesin vitro.
Como se ha observado anteriormente, el proceso para desarrollar y aprobar productos medicinales, tales como, por ejemplo, dispositivos médicos y fármacos, normalmente requiere la realización de numerosas pruebas preclínicas que han de ser realizadasin vitro, ex vivoein vivoen animales antes de realizar una prueba clínica en seres humanos. A pesar de que la prueba en animales ofrece un modeloin vivopara la prueba de productos medicinales, la estructura anatómica, la fisiología y la composición sanguínea difieren considerablemente de las de los seres humanos y los resultados logrados en el modelo animal pueden diferir considerablemente de los logrados en una prueba con seres humanos.
Además, aparte de ser técnicamente complejo, provocar enfermedades (tales como, por ejemplo, disfunciones vasculares, aneurismas o estenosis) utilizando modelos animales es considerado de forma generalizada éticamente inadmisible. Por lo tanto, la pruebain vivoen animales no puede ser realizada para verificar si el producto medicinal es eficaz para tratar enfermedades dadas. Para confirmar la voluntad científica y las directrices en cuanto a la reducción de las pruebasin vivoen animales, desde 1987 la Fundación de Investigación 3R (Reemplazar, Reducir, Refinar) ha promovido el desarrollo de procedimientos alternativos al modelo animal y ha venido concienciando al público y a la comunidad científica sobre la necesidad de realizar pruebas en animales únicamente en ausencia de procedimientos alternativos para cumplir el requisito “técnico”, con el objetivo de reducir al mínimo el número de animales de laboratorio y el sufrimiento causado sobre los animales. Los procedimientos alternativos a las pruebas en animales representan un avance significativo no solo desde un punto de vista ético en lo referente al tratamiento de los animales de forma más responsable, sino sobre todo en lo que respecta a la posibilidad de desarrollar modelos que sean fiables, reproducibles y que permitan simular al máximo el entorno “humano”. Con este fin, en los últimos años se han creado simulaciones informatizadas y un cultivo celularin vitropara el análisis preliminar de algunas características de productos medicinales.
En conformidad con el principio 3R y con el objetivo de superar las limitaciones anatómicas/fisiológicas de modelos animales, sería útil tener modelos vasculares artificiales disfuncionales capaces de reproducir las enfermedades (tales como, por ejemplo, estenosis, aneurismas) y estructuras vasculares “especiales” como plataforma de prueba para dispositivos médicos y fármacos antes del uso de los mismos en seres humanos. El uso de un sistemain vitrocapaz de reproducir, de forma estandarizada, estructuras anatómicas humanas y el entornoin vivono solo permitiría acelerar la investigación y el desarrollo de nuevos productos medicinales, sino también obtener respuestas más fiables acerca de la seguridad y de la eficacia de los productos probados con respecto al modelo animal.
El solicitante satisfizo las necesidades mencionadas anteriormente.
Forma un objeto de la presente invención un modeloin vitrode una estructura vascular con forma sustancialmente tubular que tiene características anatómicas y fisiológicas disfuncionales, simulando la estructura vascular de un sujeto sano cuya estructura vascular ha sido dañada o deformada o deteriorada debido a un daño seleccionado entre el grupo que comprende o, alternativamente, que consiste en un aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o cardiomiopatías que tienen las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Además, forma un objeto de la presente invención un modeloin vitrode una estructura vascular con forma sustancialmente tubular que tiene características anatómicas y fisiológicas disfuncionales que simula la misma estructura vascular de un sujeto sano cuya estructura vascular ha sido dañada o deformada o deteriorada debido a un daño seleccionado entre el grupo que comprende o, alternativamente, que consiste en un aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o cardiomiopatías, comprendiendo, alternativamente, consistiendo dicho modelo de o uno o más soportes (“matrices”) poliméricos porosos biocompatibles con capacidad para promover una adhesión y un crecimiento de células, siendo sembrada dicha matriz con células endoteliales que cubren una luz de la matriz y constituyen un endotelio que tiene una monocapa de células confluyentes, estando dotada dicha matriz de deformidades o defectos en una estructura tubular de la misma, que tiene las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Preferiblemente, dicho modeloin vivotiene una estructura vascular que fue seleccionada entre los vasos sanguíneos o válvulas del sistema circulatorio central o periférico; preferiblemente arterias, venas, capilares, válvula aórtica o mitral. Preferiblemente, dicho modeloin vitroes un modelo vascular disfuncional. Preferiblemente, dicha estructura vascular es una estructura vascular sintética. Preferiblemente, dicha matriz consta de fibroína de seda electrohilada, copolímeros de ácido poliglicólico/ácido poliláctico (PGA/PLA) o copolímeros de ácido poliglicólico/policaprolactona (PGA/PCL). Preferiblemente, dicho modeloin vitrocomprende o, alternativamente, consta de una o más matrices sembradas con células endoteliales, y opcionalmente células musculares. Preferiblemente, dichas deformidades o dichos defectos de la estructura tubular comprenden bifurcaciones, curvaturas, codos, constricciones, dilataciones o combinaciones de los mismos. Forma un objeto de la presente invención un procedimiento para probar un dispositivo médico o un fármaco con el objetivo de verificar la eficacia y la seguridad del mismo antes del usoin vivodel mismo en seres humanos o animales, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:
- preparar una matriz con forma sustancialmente tubular que tiene las características anatómicas y fisiológicas disfuncionales adecuadas para simular un daño o una deformación o un deterioro debido a un aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o teniendo dicha matriz deformidades o defectos en la estructura tubular de la misma que son curvaturas, codos, constricciones, dilataciones; constando dicha matriz de fibroína de seda electrohilada, copolímeros de ácido poliglicólico/ácido poliláctico (PGA/PLA) o copolímeros de ácido poliglicólico/policaprolactona (PGA/PCL);
- sembrar al menos parte de la luz interna de dicha matriz con líneas celulares endoteliales para obtener una capa continua y homogénea de células endoteliales sembradas (procedimiento de siembra), sembrando, opcionalmente, al menos parte de la superficie externa de dicha matriz con líneas celulares musculares;
- promover el crecimiento de dichas células endoteliales, y opcionalmente de dichas células musculares, hasta obtener una única capa continua y uniforme de células endoteliales, para obtener dicho modeloin vitro;
- introducir en dicho modeloin vitroun dispositivo médico o un fármaco objeto de prueba, y
- permitir la circulación (modelo de perfusión) en dicho modeloin vitroque comprende dicho dispositivo médico o fármaco de una muestra de sangre completa humana, sangre artificial o derivados de la misma, de manera que se evalúen el comportamiento y la interacción de dicho dispositivo médico o fármaco con dicha muestra de sangre completa humana, sangre artificial o derivados de la misma.
Forma un objeto de la presente invención un modelo para una simulaciónin vitrodel comportamiento de vasos humanos disfuncionales que comprenden o, alternativamente, que consisten en vasos afectados por un aneurisma, estenosis o placas escleróticas, como un instrumento para probar dispositivos médicos y fármacos con el objetivo de verificar la eficacia y la seguridad de los mismos antes del uso de los mismos en seres humanos, que tienen las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
También forma un objeto de la presente invención proporcionar modelos de estructura vascularin vitro,principalmente con una forma sustancialmente tubular, que tienen, dependiendo de la necesidad, características anatómicas y fisiológicas disfuncionales con respecto a la estructura vascular humana sana, tal como, a modo de ejemplo no limitante, aneurismas, estenosis, placas escleróticas, que tienen las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Forman otro objeto de la presente invención modelos vasculares disfuncionales que comprenden o, alternativamente, que consisten en una o más matrices sembradas con células seleccionadas adecuadas, que tienen las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Forma otro objeto de la presente divulgación un procedimiento para proporcionar dichos modelos vasculares disfuncionales utilizando matrices sembradas con células seleccionadas adecuadas, que tienen las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas. Tales estructuras vasculares disfuncionales incluyen: (i) una matriz que consta de material biocompatible adecuado para ser electrohilado, tal como, por ejemplo, fibroína de seda, o fundido en moldes o impreso utilizando bioimpresoras, tales como, por ejemplo, ácido poliláctico, policaprolactona, etc. La estructura de la matriz es adecuada para permitir la siembra de células vasculares endoteliales en la matriz y para permitir el flujo pasante de fluidos, tales como medio de crecimiento, para sostener las células y la sangre (artificial o completa humana).
Una realización distinta de la estructura de la matriz descrita en el anterior punto permite la posibilidad de sembrar, en la superficie externa de la matriz, como una función de las características que han de ser sometidas a ensayo en el producto medicinal objeto del ensayo, células musculares o células nerviosas, produciendo una trama que promueve la orientación de dichas células, de forma que se pueda simular la vasoconstricción o vasodilatación dependiendo del estímulo mecánico, farmacológico o químico al que es sometido el modelo.
En la matriz, por ejemplo para simular coágulos, placas escleróticas, trombosis o estenosis, componentes sanguíneos (tales como, por ejemplo, plaquetas, colesterol, eritrocitos, etc.).
Aún con el objetivo de simular una disfunción de la estructura vascular, las matrices pueden estar fabricadas con deformidades o defectos en la estructura tubular de las mismas, tales como, por ejemplo, bifurcaciones, curvaturas, codos, constricciones, dilataciones.
De aquí en adelante, en la presente descripción, se esbozan el circuito hidráulico y el biorreactor en el que se inserta la matriz, a lo cual se hará referencia con la ayuda de los dibujos adjuntos. El circuito, ya proporcionado, permite la perfusión de las células sembradas en la matriz con medio de crecimiento, para permitir la supervivencia y el crecimiento de las mismas, con la posibilidad de pasar a un régimen pulsátil tras reemplazar el medio de crecimiento por sangre (completa o diluida con medio de crecimiento o con eluato del producto que ha de ser probado), o por sangre artificial, o por medio de crecimiento diluido con eluato del producto que ha de ser probado. El circuito permite — por medio de una válvula adecuada corriente arriba del biorreactor— introducir el producto medicinal (fármaco, dispositivo médico) en la matriz.
Las matrices disfuncionales objeto de la presente invención y obtenidas por medio del procedimiento descrito en la presente memoria fueron sometidas a ensayo utilizando:
Análisis de sangre (alteraciones de la sangre causadas por la disfunción del vaso y/o por el producto utilizado para tratar la disfunción del vaso) o hemocompatibilidad del producto medicinal.
Biocompatibilidad del producto medicinal utilizado para tratar la disfunción vascular, tal como, por ejemplo, stents, dispositivos para la embolización de los aneurismas, catéteres, válvulas cardíacas, fármacos, etc.
Verificación de la funcionalidad, la viabilidad o la pertinencia del diseño del producto medicinal para corregir la disfunción vascular. Además, tras una prolongada e intensa actividad de investigación y desarrollo, el solicitante ha creado un proceso que comprende un procedimiento de siembra y un procedimiento para la conexión del circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz, que tiene las características reivindicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada realizaciones preferidas de la presente invención. En la presente descripción se esbozan a continuación las Figuras 1-27.
En el contexto de la presente invención, se utiliza la expresión “endotelio continuo y funcional” para indicar un endotelio, con comportamiento de tipo fisiológico, en el que las células endoteliales son adyacentes entre sí, adheridas a la matriz, y expresan marcadores típicos de las células endoteliales, tales como, por ejemplo, el factor de von Willebrand (VWF, por sus siglas en inglés), el cúmulo de diferenciación 31 (CD31), la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1, por sus siglas en inglés). En particular, se utiliza la expresión “endotelio continuo” para indicar un endotelio que tiene una monocapa de células confluyentes.
En el contexto de la presente invención, se utiliza el término “matriz” para indicar un medio polimérico poroso biocompatible capaz de promover la adhesión y el crecimiento de las células, en este caso de células endoteliales. La matriz polimérica puede ser de origen sintético o natural y consistir en un único polímero o copolímero (conjunto de polímeros), escogidos entre fibroína de seda electrohilada o copolímeros de PGA/PLA (ácido poliglicólico/ácido poliláctico) o PGA/PCL (ácido poliglicólico/policaprolactona).
En el contexto de la presente invención, el término “confluencia” hace referencia a una superficie de la matriz (en particular una superficie o luz interna de tal matriz) que está cubierta por células adherentes. En particular, las denominadas “células confluyentes” tienen una confluencia equivalente o superior a un 90%, preferiblemente comprendida entre un 90% y un 100%, aún más preferiblemente comprendida entre un 95% y un 100%; por ende, sustancialmente toda la superficie de la matriz está cubierta por células adherentes y no queda más superficie disponible en la matriz para que las células puedan crecer como una monocapa.
En el contexto de la presente invención, las células que constituyen un endotelio de un tejido vascular se definen como células endoteliales. Ejemplos de células endoteliales son las CEAH (células endoteliales aórticas humanas), las CEACH (células endoteliales de las arterias coronarias humanas), las CEMDH (células endoteliales microvasculares dérmicas humanas) o las CEVUH (células endoteliales de la vena umbilical humana).
En el contexto de la presente invención, una matriz que tiene la luz cubierta principalmente por células endoteliales funcionales tras el proceso de endotelizaciónin vitrose define como un constructo vascular artificial. Dichas células endoteliales que cubren la luz de la matriz constituyen un endotelio continuo, es decir, un endotelio que tiene una monocapa de células confluyentes.
En el contexto de la presente invención, el fluido de crecimiento y mantenimiento celulares, específico para cada tipo de célula, se define “medio de crecimiento”. En particular, en lo que respecta a las células endoteliales usadas en este caso específico (CEVUH: células endoteliales de la vena umbilical humana, adquiridas en Sigma Aldrich, código 200-05n), el medio de crecimiento es medio de crecimiento endotelial (por sus siglas en inglés, EGM, Sigma Aldrich, 211 500). El EGM contiene suero fetal bovino (2%), adenina (0,2 pg/ml), metavanadato de amonio (0,0006 pg/ml), anfotericina B (0,3 pg/ml), cloruro de calcio 2H2O (300 pg/ml), cloruro de colina (20 pg/ml), sulfato de cobre 5H2O (0,002 pg/ml), ácido tióctico DL-6,8 (0,003 pg/ml), ácido folínico (calcio) (0,6 pg/ml), heparina (4 pg/ml), hidrocortisona (2 pg/ml), ácido L-aspártico (15 pg/ml), L-cisteína (30 pg/ml), L-tirosina (20 pg/ml), sulfato manganoso monohidrato (0,0002 pg/ml), molibdato de amonio 4H2O (0,004 pg/ml), nicotinamida (8 pg/ml), cloruro de níquel 6H2O (0,0001 pg/ml), penicilina (60 pg/ml), sal sódica de rojo de fenol (15 pg/ml), cloruro de potasio (300 pg/ml), diclorhidrato de putrescina (0,0002 pg/ml), clorhidrato de piridoxina (3 pg/ml), metasilicato de sodio 9H2O (3 pg/ml), sulfato de sodio 7H2O (200 pg/ml), selenita de sodio (0,01 pg/ml), sulfato de estreptomicina (100 pg/ml), clorhidrato de tiamina (4 pg/ml) y sulfato de cinc 7H2O (0,0003 pg/ml). El medio de crecimiento nuevo es el medio estéril, nunca usado con anterioridad, suministrado directamente por el fabricante. Se utiliza la expresión “medio de crecimiento caliente” para indicar que el medio de crecimiento fue previamente calentado a una temperatura comprendida en el intervalo entre 30°C y 45°C, preferiblemente a 37°C.
El proceso objeto de la presente invención comprende un procedimiento de siembra y un procedimiento para la conexión entre un biorreactor y un circuito de perfusión para matrices (procedimiento de perfusión), preferiblemente matrices tubulares, para el diseño de un tejido vascular con la subsiguiente producción de injertos vasculares artificiales (constructos/tejidos vasculares) para probar productos medicinales. Dicho proceso, que comprende el procedimiento de siembra y el procedimiento para la conexión de un circuito de perfusión para un sistema biorreactormatriz (procedimiento de perfusión), garantiza de forma ventajosa la eliminación precisa de burbujas de aire del sistema descrito de aquí en adelante y, por tanto, garantiza una máxima reproducibilidad del proceso. Además, la reducción del riesgo de que las burbujas de aire entren en contacto con las células endoteliales permite prevenir el daño a las células endoteliales y permite obtener una monocapa confluyente de células endoteliales adherida a la luz de la matriz (endotelio continuo y funcional). En este caso específico, se aplican tal procedimiento de siembra y tal procedimiento para la conexión de un circuito de perfusión para matrices (procedimiento de perfusión) a una matriz, preferiblemente tubular, de fibroína de seda electrohilada en un biorreactor para la perfusión.
El proceso según la presente invención permite superar las limitaciones de los modelos actualmente disponibles y satisface los requisitos 3R, por cuanto ofrece una alternativa válida al uso de modelos animales. Forma un objeto de la presente invención un proceso para producir un tejido o constructo vascular artificial, preferiblemente una matriz (Fig. 2: 21) que tiene una luz cubierta con un endotelio funcional y continuo que tiene una monocapa de células confluyentes, preferiblemente utilizable para probar modelos medicinales o veterinarios, comprendiendo dicho proceso la aplicación de:
- un procedimiento para sembrar un cultivo celular endotelial en la luz de una matriz (21) para obtener una matriz sembrada (21); estando presente dicha matriz sembrada (21) en un biorreactor (11), para obtener un sistema biorreactor (Fig. 3: 11)-matriz sembrada (21);
en donde dicho procedimiento de siembra comprende las etapas de:
- la liberación, mediante un conector giratorio (Fig. 10: CR1), de dicho cultivo celular endotelial en forma de una suspensión celular que comprende un medio de crecimiento nuevo y células endoteliales en un recipiente (Fig. 10: 91) montado sobre un conector (Fig. 10: T2) con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor (11); seguida por
- la liberación de dicho cultivo celular endotelial en la luz de la matriz (21) presente en la cámara (11) del biorreactor con un flujo continuo, de modo que la velocidad de flujo permita que dicha suspensión celular gotee en el conector (T2) con forma de T sin generar burbujas de aire y empuje las burbujas de aire presentes en la luz de la matriz (21) hacia una abertura de un conector (Fig. 10: T3) con forma de T dispuesto corriente abajo del biorreactor (11) que permita la salida de las mismas;
y, subsiguientemente,
- un procedimiento para la perfusión — con un medio de crecimiento nuevo que tiene una temperatura comprendida en el intervalo entre 30°C y 45°C, preferiblemente a 37°C— de las células endoteliales presentes en la luz de dicha matriz sembrada (21); obteniéndose dicho procedimiento de perfusión mediante la conexión de un circuito (Fig. 6: 51, 52, 53, 54, 55, y 51-56 o 51-57 y TB) de perfusión a dicho sistema biorreactor (11)-matriz sembrada (21);
en donde dicho procedimiento de perfusión comprende una etapa de:
- llenado parcial de un elemento para la eliminación de las burbujas de aire (71 o TB) presentes en el circuito de perfusión con dicho medio de crecimiento nuevo, comprendiendo dicho elemento para la eliminación de las burbujas de aire (71 o TB) una cámara, un tapón que cierra dicha cámara, un acceso con función (211) de entrada y un acceso con función (212) de salida, en donde dicha cámara del elemento para la eliminación de las burbujas de aire (71 o TB) tiene un volumen y en donde una primera parte de dicho volumen está llena de dicho medio de crecimiento nuevo y en donde una segunda parte de dicho volumen está llena de aire, teniendo dicha segunda parte de dicho volumen la función de atrapar las burbujas de aire presentes en dicho medio de crecimiento nuevo que fluye a través de dicho acceso con función (211) de entrada y de dicho acceso con función (212) de salida.
Con el objetivo de ilustrar realizaciones preferidas, la solución técnica propuesta representada por el proceso objeto de la presente invención, se divide, para facilitar la comprensión, en los dos procedimientos que se describen por separado a continuación en detalle de aquí en adelante: (1) procedimiento para la siembra de un cultivo celular en la luz de una matriz, preferiblemente a matriz tubular; (2) procedimiento para la conexión de un circuito de perfusión a un sistema biorreactor-matriz (procedimiento de perfusión).
(1) Procedimiento de siembra de un cultivo celular en la luz de una matriz según una realización preferida
El procedimiento de siembra uniforme de células endoteliales para un sistema biorreactor-matriz comprende múltiples etapas llevadas a cabo secuencialmente y en condiciones estériles:
1.1 Se aloja en la cámara del biorreactor una matriz (Fig. 2: 21), preferiblemente una matriz tubular, por ejemplo una matriz tubular de fibroína de seda electrohilada, montada sobre los extremos del soporte (Fig. 1: 13, 13a, 13b) de la matriz, para obtener un sistema biorreactor-matriz. En ambos extremos del biorreactor (corriente arriba y corriente abajo) se aplican conectores giratorios (Fig. 4: CR1, CR2) y conectores (Fig. 4: T2, T3) con forma de T.
En el contexto de la presente invención, se utiliza la expresión “sistema biorreactor-matriz” para indicar el conjunto del biorreactor y de la matriz (Fig. 3: 11, 21), preferiblemente una matriz tubular, tal como, por ejemplo, una matriz tubular de fibroína de seda electrohilada, que está alojada y fijada por medio de extremos del soporte (Fig. 1: 13, 13a, 13b) de la matriz que está dispuesto en el biorreactor. La matriz, preferiblemente tubular, está fijada a los extremos del soporte (que es hueco internamente para permitir la perfusión de la matriz) de la matriz con correas autoajustables, después de haber protegido la matriz, una fibroína de seda electrohilada en este caso, con una cinta esterilizada de teflón.
La inserción del soporte 13 de la matriz en el biorreactor 11 se produce de una forma tal que la entrada corriente arriba del biorreactor coincida (Fig. 4: CR1, 41) con un extremo de la matriz (Fig. 4: 13a) y la abertura corriente abajo de la cámara del biorreactor (Fig. 4: CR2, 42) coincida con el otro extremo de la matriz (Fig. 4: 13b). De esta forma, la matriz 21 es perfectamente coaxial con respecto al recorrido de perfusión generado por el soporte internamente hueco de la matriz. El eje mayor según el cual está orientada la matriz montada en el biorreactor se define como el eje longitudinal.
1.2 La matriz se preacondiciona con medio de crecimiento nuevo inyectado en la luz de la matriz que está alojada en el biorreactor, usando una jeringa con un conector Luer-Lok que está acoplado con uno de los dos extremos del biorreactor por medio de un conector (Fig. 9: T2) con forma de T. Subsiguientemente, los extremos abiertos de los conectores dispuestos corriente arriba y corriente abajo del biorreactor se cierran utilizando tapones para evitar el vaciado de la luz de la matriz. Además, se inserta en la cámara del biorreactor medio de crecimiento nuevo hasta que la matriz alojada en la misma quede completamente cubierta. De esta forma, la matriz alojada en la cámara del biorreactor es preacondicionada, preferiblemente durante 1 hora a 25°C, utilizando un medio de crecimiento nuevo tanto internamente (en la luz) como externamente.
1.3 Después del preacondicionamiento, se vacía la matriz dentro del biorreactor preacondicionado con el medio de crecimiento inyectado en la luz utilizando, preferiblemente, una pipeta estéril y se elimina el medio de crecimiento previamente introducido en la cámara, preferiblemente, utilizando una pipeta estéril. Se eliminan los residuos del medio de crecimiento presentes en los conectores (giratorio y con forma de T) dispuestos corriente abajo y corriente arriba del biorreactor con un vacío usando una pipeta, sin hacer que colapse la matriz.
1.4 Los conectores con forma de T dispuestos corriente arriba (Fig. 9: T2) y corriente abajo (Fig. 9: T3) del extremo del biorreactor, con la matriz montada en el mismo sobre los extremos, están orientados con la abertura superior hacia arriba (a 90° con respecto al plano en el que se encuentra el sistema biorreactor-matriz). Subsiguientemente, se cierra con un tapón la abertura lateral de los conectores con forma de T dispuestos corriente abajo (T3) y corriente arriba (T2) del biorreactor. En la abertura orientada hacia arriba del conector (Fig. 9: T2) con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor hay montado un recipiente, preferiblemente una jeringa (Fig. 9: 91) con un conector Luer-Lok con una capacidad, por ejemplo, de 5 ml sin el émbolo de la misma. En vez de ello, la abertura del conector (Fig. 9: T3) con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor permanece abierta (Figura 9).
1.5 Utilizando una pipeta, preferiblemente una pipeta estéril de plástico con una capacidad, por ejemplo, de 25 ml (Fig. 10: 101), se extrae de un recipiente preparado en el que hay una suspensión celular que consta de medio de crecimiento nuevo y células endoteliales (por ejemplo, CEVUH). Subsiguientemente, la suspensión celular extraída es liberada en el recipiente o en la jeringa (Fig. 10: 91) montado en el elemento conector (Fig. 10: T2) con forma de T corriente arriba del biorreactor por medio del elemento conector giratorio (Fig. 10: CR1). La suspensión celular debe liberarse, utilizando la pipeta (Fig. 10: 101), con capacidad, por ejemplo, de 25 ml, con un flujo continuo para que la velocidad de flujo permita que la suspensión celular gotee en el conector (Fig. 10: T2) con forma de T sin generar burbujas de aire y empuje posibles burbujas de aire presentes en la matriz hacia la abertura del conector T3 con forma de T dispuesto corriente abajo (Fig. 10: T3) del biorreactor 11 y que, por ende, fluyan al exterior (Figura 10).
1.6 Cuando la suspensión celular, cargada utilizando una jeringa, alcanza el extremo abierto del conector T3 con forma de T dispuesto corriente abajo del biorreactor sin posibles burbujas de aire, el conector T2 con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor se cierra utilizando un tapón (Figura 11).
1.7 Subsiguientemente, la jeringa (91) con el residuo de suspensión celular es girada aproximadamente 90° con respecto al plano en el que se encuentra (Figura 12); en esta posición, vuelve a insertarse el émbolo de la jeringa (102) en el extremo abierto de la jeringa (Figura 12) insertando únicamente la parte negra aislante para no crear presión dentro de la matriz. Subsiguientemente, la jeringa (91) puede ser desenroscada del conector T2 con forma de T corriente arriba del biorreactor sin formar burbujas de aire (Figura 13) y se cierra el extremo del conector utilizando un tapón (Figura 14).
1.8 Se añade un medio de crecimiento nuevo caliente (definido anteriormente) a la cámara del biorreactor hasta que la matriz sembrada presente en la cámara del biorreactor esté semisumergida en el medio de crecimiento.
1.9 Entonces, se aplica una rotación continua a lo largo del eje longitudinal de la matriz, por ejemplo, con una velocidad de rotación comprendida entre 1,5 y 2 rpm, durante 24 horas. La rotación permite la adhesión uniforme de las células a la luz de la matriz, permite que la matriz permanezca continuamente mojada por el medio de crecimiento presente en la cámara del biorreactor y permite el flujo pasante de los nutrientes entre el medio presente en la cámara (fuera de la matriz) y el de la suspensión celular sembrada en la luz de la matriz.
1.10 Incubar, preferiblemente durante 24 horas a 37°C con un 5% de CO2, la matriz alojada en la cámara del biorreactor (con rotación).
Ventajosamente, el procedimiento de siembra creado por el solicitante permite operar en condiciones de esterilidad. Además, el presente procedimiento de siembra objeto de la presente invención es rápido, reproducible y permite preparar, de forma ventajosa, una matriz que tiene la superficie (interna) de la luz con células endoteliales adheridas de manera homogénea y uniforme en toda la longitud de la matriz (desde la parte proximal, pasando por la parte medial hasta la parte distal). El presente procedimiento de siembra objeto de la presente invención permite sembrar las células eliminando tanto las burbujas de aire presentes en el sistema biorreactor-matriz como las burbujas de aire que se forman, evitando, por ende, el daño a las células. Básicamente, cada etapa del presente procedimiento está estandarizada y es reproducible, y optimiza el coste y el tiempo de operación.
Evidencia experimental del procedimiento de siembra
Para demostrar la eficacia del procedimiento de siembra objeto de la presente invención, se llevaron a cabo los siguientes análisis.
Se evalúa la viabilidad de las células adheridas a la matriz utilizando un ensayo que utiliza resazurina (nombre comercial: Alamar Blue; nombre IUPAC: 7-hidroxi-10-oxidofenoxazin-10-io-3-ona, CAS 550-82-3) como reactivo. Tal ensayo consiste en una reacción metabólica que permite cuantificar la viabilidad de las células debido a la oxidaciónreducción del indicador (resazurina) que se reduce a resoflúor, un compuesto fluorescente rosa en presencia de una atmósfera reductora de una célula viva. Después de 24 horas de adhesión, se retira de los extremos la matriz sembrada. Subsiguientemente, la matriz es seccionada (cortándola) en tres zonas que miden aproximadamente 2 cm cada una, dependiendo de la distancia desde el sitio de inyección de la suspensión celular: proximal, medial y distal. Subsiguientemente, cada sección es dividida en 4 partes que miden aproximadamente 1 cm2. Para el ensayo con resazurina, se seleccionaron 3 muestras, cada una representando cada región (proximal, medial y distal) de la matriz con células endoteliales adheridas. Cada muestra es colocada en un pocillo de una placa de 24 pocillos e incubada con 1 ml de una solución de sal sódica de resazurina, a razón de 0,02 mg/ml, (Sigma Aldrich, R7017) con medio de crecimiento nuevo preferiblemente durante 3 horas a 37°C con un 5% de CO2. La reacción que se desarrolla entre la solución de 0,02 mg/ml de sal sódica de resazurina con medio de crecimiento nuevo y la muestra de la matriz (con las células endoteliales adheridas) se analiza utilizando la detección de U.A. (unidades arbitrarias de fluorescencia) a 590 nm utilizando un espectrofluorómetro.
Un análisis adicional llevado a cabo es la evaluación de la cantidad de ADN genómico presente en las células adheridas en las muestras de la matriz previamente usadas para el ensayo con resazurina. El ADN genómico es extraído por medio de lisis de las células adheridas a una matriz y se cuantifica, subsiguientemente, usando el QuantiT™ PicoGreen™ dsDNA Assay (P7589, Invitrogen, Molecular Probes), permitiendo la tinción fluorescente de los ácidos nucleicos (PicoGreen) — mediante una curva de referencia estándar— determinar la concentración de ADN genómico en la solución.
En las Figuras 15A y 15B, se representan en el gráfico los valores obtenidos utilizando el ensayo con resazurina en muestras que representan cada región (proximal, medial y distal) de una matriz sembrada con células endoteliales e incubadas durante 24 horas en tres experimentos distintos (denominados DIN1, DIN2 y DIN3). Los gráficos en las Figuras 15A y 15B muestran una adhesión y una viabilidad buenas de las células endoteliales.
Estos datos están confirmados por la cuantificación del ADN genómico (Figuras 15C y 15D) calculada considerando que el contenido de ADN genómico de una célula endotelial es de aproximadamente 7 pg.
No se observó ninguna diferencia significativa en la viabilidad de las células entre las diversas secciones proximal, medial y distal de las matrices sembradas con células endoteliales. En particular, la viabilidad de las células y el número de las mismas pueden compararse en toda la longitud (eje principal de la matriz) en las porciones proximal, medial y distal de la misma. Con el objetivo de soportar esta evidencia, se llevó a cabo una cotinción utilizando DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato, D1306, Thermo Fisher Scientific) y rodamina-faloidina (R415, Thermo Fisher Scientific) en muestras que representan cada región (proximal, medial, distal) de una matriz sembrada con células endoteliales e incubadas durante 24 horas. Los dos reactivos DAPI y rodamina-faloidina son específicos, respectivamente, para la detección de los núcleos y para los filamentos de actina (F-actina), componentes morfológicos ambos de una célula viva, visibles tras la tinción, usando un microscopio de fluorescencia o una microscopía confocal. Después de 24 horas de cultivo, estos resultados muestran que las células endoteliales están vivas y distribuidas uniformemente en la luz de la matriz. En particular, estos resultados muestran una confluencia de las células del 90%. Además, se llevan a cabo en muestras que representan cada región (proximal, medial, distal) de una matriz sembrada con células endoteliales e incubada durante 24 horas análisis de expresión génica para marcadores típicos de las células endoteliales: por ejemplo, el factor de von Willebrand (VWF), el cúmulo de diferenciación 31 (CD31), la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1). Para llevar a cabo una evaluación de la expresión génica, se extrae el ARN total de las células (en este caso endoteliales) y tras la retrotranscripción a ADNc se cuantifica utilizando un ensayo de expresión génica Taqman específico (Thermo Fisher Scientific) usando la técnica de PCR en tiempo real. Los niveles funcionales para la expresión génica de los marcadores enumerados anteriormente son indicadores de funcionalidad y viabilidad buenas de las células adheridas en la luz de la matriz.
Por último, se lleva a cabo un análisis de la tinción H y E, “tinción con hematoxilina y eosina”, en muestras de una matriz sembrada con células endoteliales según la presente invención, con el objetivo de evaluar la distribución de las células y la morfología de las mismas, y un ensayo de inmunofluorescencia para marcadores específicos de la funcionalidad endotelial. En conclusión, se ha demostrado que el presente procedimiento de siembra objeto de la presente invención es eficaz porque garantiza una siembra homogénea, uniforme y reproducible de células endoteliales vivas a lo largo de toda la luz.
(2) Procedimiento para la conexión de un circuito de perfusión a un sistema biorreactor-matriz (procedimiento de perfusión) según la primera realización (Figuras 5-8, 18-21)
El procedimiento de conexión se basa en las siguientes etapas secuenciales, posteriores a la siembra (procedimiento para la siembra de un cultivo celular en la luz de una matriz según la realización anteriormente descrita en el punto (1)) y 24 horas desde la adhesión de las células endoteliales:
2.1 Colocar el tubo o conducto bajo la bomba (Fig. 5: 52) del circuito cerrado de perfusión bajo la cabeza de la bomba peristáltica (Fig. 5: 55), que —tras su activación— genera una fuerza peristáltica capaz de aspirar fluidos, en este caso medio de crecimiento nuevo caliente. El circuito cerrado de perfusión se llena debido a la aspiración, a través del tubo (Fig. 5: 51) del circuito de perfusión conectado con el depósito (Fig. 5: 56), del medio de crecimiento nuevo caliente que es vertido previamente en el depósito una vez cerrado. Llenar los tubos del circuito de perfusión con el medio de crecimiento nuevo caliente hasta que el medio de crecimiento nuevo vuelva al depósito a través del tubo 54 (Fig. 5: 54) del circuito cerrado de perfusión. Poner el sistema biorreactor-matriz en las mismas condiciones de esterilidad que el circuito de perfusión.
2.2 Abrir los extremos superior y lateral del conector T2 con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor.
2.3 Tras retirar los tapones de los extremos superior y lateral del conector T2 con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor, la posible creación de burbujas de aire es compensada por la adición manual (preferiblemente utilizando una pipeta de Pasteur) que tiene el mismo volumen que el medio de crecimiento nuevo caliente (Fig. 16).
2.4Ocluir el tubo 54 del circuito cerrado de perfusión, preferiblemente utilizando una abrazadera (Fig. 17: 171) en una posición proximal al conector entre el tubo 54 y el tubo 53 del circuito de perfusión (Fig. 17). Tener cuidado en mantener la cabeza de la bomba cerrada para evitar el vaciado del tubo 53 del circuito cerrado de perfusión.
2.5 Mantener el tubo 53 del circuito cerrado de perfusión en posición vertical, desenroscar el conector dispuesto entre el tubo 53 y el tubo 54 del circuito de perfusión y tapar, preferiblemente, el tubo 54 del circuito de perfusión utilizando un tapón.
2.6 Enroscar el tubo 53 del circuito de perfusión al extremo lateral abierto del conector T2 con forma de T corriente arriba del biorreactor en un acceso lateral del mismo. El conector corriente arriba del biorreactor debe ser mantenido siempre en posición vertical (Fig. 18).
2.7 Abrir el conector T3 con forma de T corriente abajo del biorreactor desenroscando el tapón de la abertura lateral.
2.8 Retirar el tapón del conector del tubo 54 del circuito de perfusión (Fig. 19A) y enroscarlo en la abertura lateral del conector con forma de T corriente abajo del biorreactor (Fig. 19B).
2.9 Retirar la abrazadera 171 que ocluye el tubo 54 del circuito de perfusión (Fig. 20).
2.10 Llenar el elemento para la eliminación de las burbujas de aire (Fig. 21: 71), definido con la expresión técnica de trampa de burbujas en el contexto de la presente invención. La trampa de burbujas consiste en un elemento representado por una cámara cerrada utilizando un tapón y que tiene dos accesos que hacen de salida y de entrada. La cámara de la trampa de burbujas contiene un volumen de líquido (en este caso específico, medio de crecimiento nuevo caliente) y un volumen de aire que atrapa posibles burbujas de aire presentes en el líquido de perfusión que fluye a través de los dos accesos de la cámara de la trampa de burbujas.
Llenar la trampa de burbujas con el medio de crecimiento nuevo caliente para dejar un volumen de aire dado y cerrar la cámara al igual que sus accesos utilizando los tapones respectivos.
2.11 Conectar como sigue la trampa de burbujas al circuito de perfusión previamente conectado al sistema biorreactormatriz (Fig. 7):
a. Cerrar el tubo 53 del circuito de perfusión utilizando una abrazadera dispuesta proximalmente al conector que conecta el tubo 53 al extremo lateral del conector T1 con forma de T (dispuesto entre el tubo 53 y el tubo 52 del circuito de perfusión) y desenroscarlo (Fig. 7: 52).
b. Preferiblemente, cerrar el tubo 53 del circuito de perfusión utilizando un tapón. Tal operación impide el vaciado del tubo 53 del circuito de perfusión.
c. Tapar el extremo lateral del conector T 1 con forma de T (dispuesto entre el tubo 53 y el tubo 52 del circuito de perfusión) y abrir el extremo superior del mismo.
d. Abrir el acceso de entrada de la cámara de la trampa de burbujas y conectarlo al acceso del extremo superior y dispuesto verticalmente con respecto al conector T1 con forma de T.
e. Abrir el acceso de salida de la trampa de burbujas y conectarlo al tubo 53 del circuito de perfusión, teniendo cuidado de no retorcer el tubo en ningún caso.
f. Mantener la trampa de burbujas en posición vertical.
g. Retirar la abrazadera 171 del tubo 53 del circuito de perfusión recién conectado a la cámara de la trampa de burbujas. Poner en marcha la bomba y abrir el tapón del extremo superior del conector T2 con forma de T corriente arriba del biorreactor para eliminar posibles burbujas de aire formadas en el tubo 53 durante el proceso, evitando que alcancen la matriz. La fuerza peristáltica aplicada por la bomba al sistema ensamblado, consistente en el circuito de perfusión y el sistema biorreactor-matriz, permitirá la perfusión de la matriz.
h. Después de tal verificación, cerrar el conector T2 con forma de T corriente arriba del biorreactor utilizando el tapón del mismo.
(3) Procedimiento para la conexión de un circuito de perfusión a un sistema biorreactor-matriz (procedimiento de perfusión) según una segunda realización preferida (Figuras 22-27)
El procedimiento de conexión se basa en las siguientes etapas secuenciales, posteriores a la siembra (procedimiento para la siembra de un cultivo celular en la luz de una matriz según la realización anteriormente descrita en el punto (1)) y después 24 horas desde la adhesión de las células endoteliales:
3.1 Conectar — en condiciones de esterilidad— los tubos del circuito de perfusión (Fig. 22: 51; 52; 53; 54; 55), el elemento para eliminar las burbujas de aire (Fig. 22: TB), definido en el contexto de la presente invención con la expresión técnica trampa de burbujas, y el depósito (Fig. 22: 56). El elemento para eliminar las burbujas de aire o trampa de burbujas (TB) consiste en un elemento representado por una cámara cerrada, preferiblemente fabricada de vidrio, utilizando un tapón y que tiene dos accesos asimétricos: el acceso con la llave de paso y la boquilla de conexión hace de entrada (Fig. 27: 211), mientras que el acceso únicamente con la boquilla de conexión solo hace de salida (Fig. 27: 221). La cámara de la trampa de burbujas contiene un volumen de líquido (en este caso específico, medio de crecimiento nuevo caliente) y un volumen de aire que atrapa posibles burbujas de aire presentes en el líquido de perfusión que fluye a través de los dos accesos de la cámara de la trampa de burbujas.
3.2 Colocar el conducto bajo la bomba (Fig. 22: 52) del circuito cerrado de perfusión bajo la cabeza de la bomba peristáltica (Fig. 22: 57), que —tras la activación— genera una fuerza peristáltica capaz de aspirar fluidos, en este caso el medio de crecimiento nuevo caliente. El circuito cerrado de perfusión se llena debido a la aspiración, a través del tubo (Fig. 22: 51) del circuito de perfusión conectado al depósito (Fig. 22: 56), del medio de crecimiento nuevo caliente que ha sido vertido previamente en el depósito (Fig. 22: 56), a su vez cerrado. Llenar todos los tubos del circuito de perfusión, la trampa de burbujas (Fig. 22: TB) y el depósito (Fig. 22: 56) con un líquido de perfusión, tal como un medio de crecimiento nuevo caliente (definido anteriormente) hasta que el medio de crecimiento nuevo caliente vuelva al depósito a través del tubo 55 (Fig. 22: 55) del circuito cerrado de perfusión. La TB y el depósito se llenan para dejar un volumen de aire dado. En particular, la trampa de burbujas (Fig. 22: TB) se llena de forma que dicha cámara de la trampa de burbujas tenga una primera parte del volumen de la misma llena de dicho medio de crecimiento nuevo y una segunda parte del volumen de la misma llena de aire, teniendo dicha segunda parte de dicho volumen la función de atrapar las burbujas de aire presentes en el líquido de perfusión (medio de crecimiento nuevo caliente) que fluye a través de dicho acceso que hace de entrada (211) y de dicho acceso que hace de salida (212) de la trampa de burbujas (TB) (Fig. 22).
3.3 Ocluir el tubo 54 (Fig. 23), preferiblemente utilizando una abrazadera (Fig. 23: 172) en una posición proximal a la TB y mover la llave de paso de la TB hasta la posición de cierre (en una posición perpendicular con respecto a los tubos del circuito de perfusión).
3.4 Poner el sistema biorreactor-matriz en las mismas condiciones de esterilidad que el circuito de perfusión.
3.5Ocluir el tubo 55 (Fig. 23), preferiblemente utilizando una abrazadera (Fig. 23: 171; Fig. 17: 171) en una posición proximal a la conexión C con el tubo 54 (Fig. 23: C). Abrir los extremos superior y lateral del conector T2 con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor (Fig. 4: T2).
3.6 Tras retirar los tapones de los extremos superior y lateral del conector T2 con forma de T (Fig. 4) dispuesto corriente arriba del biorreactor, la posible creación de burbujas de aire es compensada por la adición manual (preferiblemente utilizando una pipeta de Pasteur) que tiene el mismo volumen que el medio de crecimiento nuevo caliente (Fig. 16).
3.7 Mantener el tubo 54 (Fig. 23) del circuito cerrado de perfusión en posición vertical, desenroscar el conector dispuesto entre el tubo 54 (Fig. 23) y el tubo 55 (Fig. 23) del circuito de perfusión y tapar, preferiblemente, el tubo 55 del circuito de perfusión utilizando un tapón (Fig. 24).
3.8 Enroscar el tubo 54 (Fig. 27) del circuito de perfusión al extremo lateral abierto del conector T2 con forma de T (Fig. 27) corriente arriba del biorreactor en un acceso lateral del mismo. El conector corriente arriba del biorreactor debe ser mantenido siempre en posición vertical (Fig. 18 o 27).
3.9 Abrir el conector T3 con forma de T (Fig. 4) corriente abajo del biorreactor desenroscando el tapón de la abertura lateral.
3.10 Desenroscar el conector giratorio CR2 junto con el conector T3 con forma de T (Fig. 4), manteniendo inmóvil la rueda dentada R (Fig. 4), y enroscar el conector del tubo 55 (Fig. 25) en la abertura lateral del soporte 14a (Fig. 1) de la matriz (Fig. 25).
3.11 Retirar la abrazadera 171 que ocluye el tubo 55 del circuito de perfusión (Fig. 26).
3.12 Poner el sistema biorreactor-matriz sembrada conectado al circuito de perfusión a aproximadamente 37°C y a aproximadamente un 5% de CO2, poner el conducto 52 bajo la bomba (Fig. 27) en una posición libre, abrir la llave de paso de la trampa de burbujas TB (Fig. 27) poniéndola paralela a los tubos del circuito de perfusión, retirar la abrazadera 172 (Fig. 27) y luego poner en marcha la bomba (Fig. 27: 57). La fuerza peristáltica aplicada por la bomba al sistema ensamblado, consistente en el circuito de perfusión y el sistema biorreactor-matriz, permitirá la perfusión de la matriz.
Ventajosamente, el procedimiento de conexión (procedimiento de perfusión) descrito en el presente documento, tanto en la primera realización como en la segunda realización descritas anteriormente, permite conectar un circuito de perfusión de una matriz, preferiblemente tubular, al sistema biorreactor-matriz sembrada. Este procedimiento permite prevenir la formación de burbujas de aire y previene que las burbujas, en el supuesto caso de que se formen, alcancen la matriz sembrada con células endoteliales del sistema biorreactor-matriz. Además, las burbujas posiblemente ya presentes en el circuito de perfusión no alcanzan la matriz debido a la presencia de la trampa de burbujas (Fig. 21: 71: Fig. 27: TB) en el circuito. De esta manera, el procedimiento creado por el solicitante es capaz de garantizar una ausencia completa de burbujas de aire en la luz de la matriz. Este sistema satisface los requisitos definidos por la configuración del biorreactor. Todos los detalles indicados y descritos son requeridos para hacer que el procedimiento sea independiente del operario y, por lo tanto, para garantizar la reproducibilidad de los resultados durante la generaciónin vitrode un constructo con endotelio funcional a escala industrial. Además, este procedimiento permite poder operar en condiciones de esterilidad, al estar basado en acciones simples. Además, el procedimiento rápido y de fácil seguimiento permite reducir el riesgo de que las burbujas de aire entren en contacto con las células, previniendo así el daño a las células endoteliales adheridas en la luz de la matriz, preferiblemente tubular. Dicho procedimiento de perfusión permite obtener constructos/tejidos vasculares artificiales que tienen una matriz con una luz cubierta con un endotelio continuo (es decir, que tiene una monocapa de células confluyentes) y funcional.
Evidencia experimental del procedimiento de conexión
Los análisis experimentales relativos a la evaluación del procedimiento de conexión del circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz son iguales que los aplicados para la evaluación del procedimiento de siembra para un cultivo de células en una matriz, preferiblemente tubular.
En el contexto de la presente invención, el circuito de perfusión (Fig. 5 y Fig. 22) se define como un conjunto de: tubos (Fig. 5: 51- 54 o Fig. 22: 51-55), un depósito (Fig. 5 o Fig. 22: 56), una bomba peristáltica (Fig. 5: 55 o Fig. 22: 57) y un elemento para eliminar las burbujas de aire (Fig. 21: 71 o Fig. 22: TB). Dicho elemento para eliminar las burbujas de aire puede estar presente en el circuito de perfusión antes de la conexión del circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz sembrada (segunda realización del procedimiento de perfusión) o, alternativamente, puede ser insertado en el circuito de perfusión después de la conexión del circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz sembrada (primera realización del procedimiento de perfusión). Dichos tubos están fabricados de material biocompatible y están conectados entre sí para permitir la perfusión de la matriz (Fig. 21 y Fig. 27), preferiblemente tubular, alojada en el biorreactor 11, por medio de la bomba peristáltica (Fig. 5: 55, Fig. 22: 57) (en tal caso, Masterflex®, L/S Digital Dispensing Pump Drives 07551-20, Cole-Parmer) con la cabeza Easy-Load II 77200-62 (Masterflex, Cole-Parmer). Con referencia a la segunda realización del procedimiento de perfusión descrita anteriormente e ilustrada en la Figura 27, el circuito de perfusión consta principalmente de cinco tubos con un diámetro interno de 3/16": un primer tubo 51 para aspirar del depósito, un segundo tubo 52 que se encuentra debajo de la bomba, un tercer tubo 53 que conecta el circuito a la trampa de burbujas TB, un cuarto tubo 54 que conecta la TB al conector T2 con forma de T corriente arriba del sistema biorreactor-matriz, un quinto tubo 55 para el retorno al depósito 56 conectado al conector T3 con forma de T corriente abajo del sistema biorreactor-matriz.
Con referencia a la primera realización del procedimiento de perfusión descrito anteriormente y representado en la Figura 5, el tubo 51 está conectado al tubo 52 que se encuentra debajo de la bomba, el tubo 52 que se encuentra debajo de la bomba a la TB, la TB al tubo 53, el tubo 53 al conector t 2 con forma de T corriente arriba del sistema biorreactor-matriz, el tubo 54 al conector T3 con forma de T corriente abajo del sistema biorreactor-matriz y al depósito 56. El depósito (Fig. 5 o Fig. 22: 56) es el elemento que contiene el medio de crecimiento nuevo caliente (por ejemplo, medio de crecimiento endotelial EGM, Sigma Aldrich) del cual aspira el tubo 51 (Fig. 5 o Fig. 22) y al cual regresa el tubo 54 (Fig. 5) o 55 (Fig. 22), manteniendo todo el sistema biorreactor-matriz sembrada como un sistema cerrado. El depósito (Fig. 5 o Fig. 22: 56) está a presión atmosférica, debido a un filtro de 0,22 pm presente en el tapón del depósito, que garantiza la esterilidad del aire.
La primera fase que ha de llevarse a cabo y optimizarse es la fase de siembra de células, preferiblemente células endoteliales, seguida por una segunda fase crítica de conexión del circuito de perfusión al sistema que comprende el biorreactor y la matriz, para garantizar la fiabilidad, la eficacia y la reproducibilidad al proceso de industrialización para la generaciónin vitrode un endotelio continuo y funcional.
El éxito del proceso de industrialización objeto de la presente invención para la producción del tejido/constructo vascular artificial, según se reivindica, consiste principalmente en el éxito relativo a la fase de la siembra y la conexión del circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz, para garantizar globalmente la eliminación de las burbujas de aire de una manera fiable y reproducible. El procedimiento de siembra depende del origen de las células y de la densidad de las mismas, de las propiedades químicas y la porosidad y de la eliminación total de las burbujas de aire de la luz de la matriz durante la inyección de la suspensión celular. Por otro lado, el procedimiento para la conexión entre el circuito de perfusión y el sistema biorreactor-matriz se basa en mantener la esterilidad del sistema ensamblado y en la garantía de ausencia de burbujas de aire que puedan entrar en contacto con la matriz sembrada. Se debería observar que debe evitarse la formación de burbujas de aire dado que las burbujas de aire pueden dañar las células, poniendo en peligro la viabilidad de las mismas con una subsiguiente falta de endotelización de las matrices.
La descripción de la presente invención muestra que la elección del procedimiento de conexión del circuito de perfusión al sistema biorreactor-matriz depende del procedimiento para sembrar las células endoteliales previamente optimizadas, debido al hecho de que dicho procedimiento de conexión debe ser adecuado a la configuración experimental y a las necesidades de perfusión y la posición elegida para este sistema en la incubadora. El proceso de siembra de una matriz, preferiblemente una matriz tubular, es uno de los factores cruciales para la generaciónin vitrode constructos vasculares artificiales funcionales, utilizando un endotelio confluyente, como se muestra en la descripción de la presente invención. Este proceso es responsable de una distribución uniforme y homogénea de células endoteliales en la luz, aplicándose lo mismo a la adhesión de las células a la superficie. La descripción de la presente invención muestra que la elección del procedimiento de siembra más apropiado, adaptándolo a cada sistema biorreactor-matriz, define la reproducibilidad del proceso, mostrando las ventajas del mismo en la reproducibilidad de los resultados.
También en los ensayos preclínicos, al igual que en otros, surge la necesidad de crear procedimientos reproducibles para la producción a gran escala de constructos vasculares funcionales.
Por lo tanto, el procedimiento de siembra de la presente invención, bien definido y de fácil seguimiento, garantiza una distribución sumamente uniforme en términos de la adhesión de las células endoteliales y una buena reproducibilidad de los resultados, necesarios para un laboratorio cuya actividad se centre en la producción de constructos vascularesin vitrocomo modelos de prueba del campo preclínico, al igual que otros campos.
Tras 24 horas de adhesión, las células adheridas en la luz de la matriz, principalmente tubular, deben mantener su morfología y viabilidad para obtener un endotelio vascular homogéneo. Por lo tanto, es importante evitar cualquier alteración celular durante el proceso de conexión que pudiera alterar el estado de adhesión de las células, con una posible pérdida de la capa vascular objeto de crecimiento (que está siendo formada).
Los procedimientos conocidos para una conexión entre el biorreactor y el circuito de perfusión provocan un padecimiento de las células con una separación subsiguiente — incluso parcial— de las células endoteliales de la superficie luminal, de forma que se ralentice o se impida la formación de una capa endotelial funcional. Además, los procedimientos conocidos para una conexión entre el biorreactor y el circuito de perfusión no garantizan la ausencia de burbujas de aire, que pueden formarse debido a posibles torsiones o compresiones (totales o parciales) de los tubos de conexión durante la perfusión. Es importante evitar totalmente el contacto entre dichas burbujas de aire y la matriz sembrada, lo que se evita introduciendo un elemento, por ejemplo una trampa de burbujas, capaz de eliminar las burbujas de aire antes de que alcancen la matriz sembrada. Esta desventaja fue superada con éxito gracias al proceso objeto de la presente invención, que permite obtener una superficie interna de la matriz cubierta con una capa uniforme y funcional de células endoteliales, en particular una capa de células confluyentes.
Lista de números de referencia
11 biorreactor
13 soporte de la matriz
13a extremo del soporte de la matriz
13b extremo del soporte de la matriz
14a abertura lateral del soporte de la matriz
21 matriz
41 entrada de la cámara del biorreactor
42 salida de la cámara del biorreactor
51 tubo
52 tubo o conducto bajo la bomba
53 tubo
54 tubo
55 cabeza de la bomba peristáltica
56 depósito
57 bomba
71 elemento para eliminar burbujas de aire (o trampa de burbujas)
72 tapón
91 recipiente, preferiblemente jeringa
101 pipeta
102 émbolo de la jeringa
171 abrazadera
172 abrazadera
211 acceso con función de entrada
212 acceso con función de salida
TB trampa de burbujas
CR1 conector giratorio
CR2 conector giratorio
T1 conector con forma de T
T2 conector con forma de T
T3 conector con forma de T

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un modeloin vitrode una estructura vascular humana con forma tubular que tiene características anatómicas y fisiológicas disfuncionales que simulan la misma estructura vascular de un sujeto sano cuya estructura vascular ha sido dañada o deformada o deteriorada debido a un daño seleccionado entre el grupo que comprende o, de forma alternativa, que consiste en aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o cardiomiopatías; comprendiendo o, de forma alternativa, consistiendo dicho modelo en una o más matrices (21) poliméricas porosas biocompatibles de soporte con capacidad para promover una adhesión y un crecimiento celulares, habiendo sido sembrada dicha matriz con células endoteliales que cubren una luz de la matriz y constituyen un endotelio que tiene una única capa de células confluyentes, habiéndose fabricado dicha matriz (21) con deformidades o defectos en una estructura tubular de la misma, comprendiendo dichas deformidades o defectos curvaturas, codos, constricciones, dilataciones; constando dicha matriz (21) de fibroína de seda electrohilada, copolímeros de ácido poliglicólico/ácido poliláctico (PGA/PLA) o copolímeros de ácido poliglicólico/policaprolactona (PGA/PCL).
2. El modeloin vitrosegún la reivindicación 1, en el que se selecciona dicha estructura vascular entre vasos sanguíneos o conductos sanguíneos.
3. El modeloin vitrosegún la reivindicación 1 o 2, en el que se selecciona dicha estructura vascular entre arterias y venas.
4. El modeloin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dichas deformidades o dichos defectos de la estructura tubular comprenden combinaciones de curvaturas, codos, constricciones, dilataciones.
5. El modeloin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que se seleccionan las células endoteliales entre las células que forman un endotelio de tejido vascular.
6. El modeloin vitrosegún la reivindicación 5, en el que se seleccionan las células endoteliales entre CEAH(células endoteliales aórticas humanas),CEACH(células endoteliales de las arterias coronarias humanas),CEMDH(células endoteliales microvasculares dérmicas humanas)o CEVUH(células endoteliales de la vena umbilical humana).
7. Un procedimiento para probar un dispositivo médico o un fármaco, de manera que se verifique la eficacia y la seguridad del mismo antes de un usoin vivodel mismo en el ser humano, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas:
preparar una matriz (21) con forma tubular que tiene las características anatómicas y fisiológicas disfuncionales adecuadas para simular un daño o una deformación o un deterioro debido a un aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o cardiomiopatías, teniendo dicha matriz (21) deformidades o defectos en la estructura tubular de la misma que son curvaturas, codos, constricciones, dilataciones; constando dicha matriz (21) de fibroína de seda electrohilada, copolímeros de ácido poliglicólico/ácido poliláctico (PGA/PLA) o copolímeros de ácido poliglicólico/policaprolactona (PGA/PCL);
sembrar al menos una parte de la luz interior de dicha matriz (21) con líneas celulares endoteliales, de manera que se obtenga una capa continua y homogénea de células endoteliales sembradas (procedimiento de siembra), sembrando, opcionalmente, al menos una parte de la superficie externa de dicha matriz (21) con líneas celulares musculares;
promover el crecimiento de dichas células endoteliales, y opcionalmente dichas células musculares, hasta obtener una única capa continua y uniforme de células endoteliales, para obtener dicho modeloin vitro;
introducir en dicho modeloin vitroun dispositivo médico o un fármaco objeto de prueba, y
permitir la circulación (modelo de perfusión) en dicho modeloin vitroque comprende dicho dispositivo médico o fármaco de una muestra de sangre completa humana, sangre artificial o derivados de la misma, de manera que se evalúe el comportamiento y la interacción de dicho dispositivo médico o fármaco con dicha muestra de sangre completa humana, sangre artificial o derivados de la misma.
8. Un procedimiento o proceso para la producción de un tejido o constructo vascular artificial que es la matriz (21) en el modeloin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para probar productos médicos, comprendiendo dicho proceso aplicar:
- un procedimiento para sembrar un cultivo de células endoteliales en la luz de dicha matriz (21) para obtener una matriz sembrada (21), estando presente dicha matriz sembrada (21) en un biorreactor (11), para obtener un sistema biorreactor (11)- matriz sembrada (21);
comprendiendo dicho procedimiento de siembra las etapas de:
- liberar dicho cultivo de células endoteliales en forma de una suspensión celular que comprende un medio de crecimiento nuevo y células endoteliales en un recipiente (91) montado en un conector (T2) con forma de T dispuesto corriente arriba del biorreactor (11) por medio de un conector giratorio (CR1), seguido por
- liberar dicho cultivo de células endoteliales en la luz de la matriz (21) presente en la cámara (11) del biorreactor con un flujo continuo, de forma que la velocidad del flujo permita que dicha suspensión celular gotee en el conector (T2) con forma de T sin generar burbujas de aire y empuje las burbujas de aire presentes en la luz de la matriz (21) hacia una abertura de un conector (T3) con forma de T dispuesto corriente abajo del biorreactor (11) que permita la salida de la misma;
y, subsiguientemente,
- un procedimiento de perfusión — con un medio de crecimiento nuevo que tiene una temperatura comprendida en el intervalo entre 30°C y 45°C, preferiblemente a 37°C— de las células endoteliales presentes en la luz de dicha matriz sembrada (21); obteniéndose dicho procedimiento de perfusión conectando un circuito (51-56) o (51-57 y TB) de perfusión con dicho sistema biorreactor (11)-matriz sembrada (21);
comprendiendo dicho procedimiento de perfusión una etapa de
- llenar parcialmente un elemento para eliminar las burbujas (71) o (TB) de aire presentes en el circuito de perfusión con dicho medio de crecimiento nuevo, comprendiendo dicho elemento para eliminar las burbujas (71) o (TB) de aire una cámara, un tapón que cierra dicha cámara, un acceso con una función (211) de entrada y un acceso con una función (212) de salida, teniendo dicha cámara del elemento para eliminar las burbujas (71 o TB) de aire un volumen y estando llena de dicho medio de crecimiento nuevo una primera parte de dicho volumen y estando llena de aire una segunda parte de dicho volumen, teniendo dicha segunda parte de dicho volumen la función de atrapar las burbujas de aire presentes en dicho medio de crecimiento nuevo que fluye a través de dicho acceso con función (211) de entrada y de dicho acceso con función (212) de salida.
9. El proceso según la reivindicación 7 u 8, en el que dicho procedimiento para sembrar dicho cultivo de células endoteliales en la luz de dicha matriz (21) comprende:
- montar la matriz (21) en los extremos de un soporte (13, 13a, 13b) de la matriz y alojar dicho soporte (13, 13a, 13b) de la matriz con la matriz (21) en la cámara (11) del biorreactor, para obtener un sistema biorreactor (11)- matriz (21);
seguido por
- inyectar el medio de crecimiento nuevo en la luz de dicha matriz (21) fijada en dicho soporte (13) de la matriz dispuesto en el interior de la cámara (11) del biorreactor; seguido por
- añadir dicho medio de crecimiento nuevo en la cámara (11) del biorreactor en el que está presente dicho soporte (13, 13a, 13b) de la matriz con la matriz (21) inyectada con dicho medio de crecimiento; seguido por
- dejar durante un intervalo de tiempo comprendido entre 1 hora y 18 horas a una temperatura comprendida entre 20°C y 30°C, preferiblemente 25°C, dicho medio de crecimiento en la luz de la matriz (21) y en la cámara (11) del biorreactor en la que está presente dicho soporte (13) de la matriz con la matriz (21) inyectada con dicho medio de crecimiento; seguido por vaciar el interior de la luz de la matriz (21) y de la cámara (11) del biorreactor del medio de crecimiento; seguido por
- liberar dicho cultivo de células endoteliales en dicho recipiente (91), siendo dicho recipiente (91), preferiblemente, una jeringa; seguido por
- liberar dicha suspensión celular en la luz de la matriz (21) según la reivindicación 1; seguido por
- añadir dicho medio de crecimiento nuevo en la cámara (11) del biorreactor en la que está presente dicho soporte (13) de la matriz con la matriz (21) sembrada que contiene dicha suspensión celular en la luz, y seguido por
- incubar, preferiblemente durante 24 horas a 37°C en presencia de un 5% de CO2, la matriz (21) alojada en la cámara (11) del biorreactor.
10. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que dicho procedimiento para la perfusión de las células endoteliales presentes en la luz de dicha matriz sembrada (21) comprende:
preparar dicho circuito cerrado de perfusión que comprende los tubos (51), (52), (53), (54) y, opcionalmente, (55);
- ocluir el tubo (54) o (55) del circuito de perfusión utilizando un elemento (171) de cierre en una posición proximal a un conector (C), siendo dicho elemento de cierre, preferiblemente, una abrazadera o similar; seguido por
- desenroscar el conector (C) dispuesto entre el tubo (53) o (54) y el tubo (54) o (55), respectivamente, en el circuito de perfusión;
- enroscar el tubo (53) o (54) del circuito de perfusión a un extremo lateral abierto del conector (T2) con forma de T corriente arriba del biorreactor (11) en un acceso lateral del mismo; seguido por
- abrir el conector (T3) con forma de T corriente abajo del biorreactor (11) y desenroscar un tapón de una abertura lateral del conector (T3) con forma de T; seguido por
- conectar el tubo (54) o (55) del circuito de perfusión con la abertura lateral del conector (T3) con forma de T dispuesto corriente abajo del biorreactor (11) y retirar el elemento (171) de cierre;
seguido, si es necesario, por
- insertar — entre el tubo (53) y el tubo (52) del circuito de perfusión que se encuentra debajo de la bomba— el elemento para eliminar las burbujas (71) de aire.
11. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 7-10, en el que el elemento para eliminar las burbujas (71) o (TB) de aire es unatrampa de burbujaso similar.
12. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 8-11, en el que el medio de crecimiento utilizado es el medio de crecimiento endotelial que comprende suero fetal bovino (2%), adenina (0,2 pg/ml), metavanadato de amonio (0,0006 pg/ml), anfotericina B (0,3 pg/ml), cloruro de calcio 2H2O (300 pg/ml), cloruro de colina (20 pg/ml), sulfato de cobre 5H2O (0,002 pg/ml), ácido tióctico DL-6,8 (0,003 pg/ml), ácido folínico (calcio) (0,6 pg/ml), heparina (4 pg/ml), hidrocortisona (2 pg/ml), ácido L-aspártico (15 pg/ml), L-cisteína (30 pg/ml), L-tirosina (20 pg/ml), sulfato manganoso monohidrato (0,0002 pg/ml), molibdato de amonio 4H2O (0,004 pg/ml), nicotinamida (8 pg/ml), cloruro de níquel 6H2O (0,0001 pg/ml), penicilina (60 pg/ml), sal sódica de rojo de fenol (15 pg/ml), cloruro de potasio (300 pg/ml), diclorhidrato de putrescina (0,0002 pg/ml), clorhidrato de piridoxina (3 pg/ml), metasilicato de sodio 9H2O (3 pg/ml), sulfato de sodio 7H2O (200 pg/ml), selenita de sodio (0,01 pg/ml), sulfato de estreptomicina (100 pg/ml), clorhidrato de tiamina (4 pg/ml) y sulfato de cinc 7H2O (0,0003 pg/ml), preferiblemente calentado hasta 37°C.
13. Una matriz (21) para su uso en una preparación de un modeloin vitrosegún las reivindicaciones 1-6, que tiene una luz recubierta con un endotelio funcional y continuo (21) que tiene una monocapa de células confluyentes obtenida por medio de un proceso que comprende las siguientes etapas:
- preparar una matriz con forma tubular que tiene las características anatómicas y fisiológicas disfuncionales adecuadas para simular un daño o una deformación o un deterioro debido a un aneurisma, estenosis, placas escleróticas, formas de tumores o cardiomiopatías, estando fabricada la matriz con deformidades o defectos en una estructura tubular de la misma, comprendiendo dichas deformidades o defectos curvaturas, codos, constricciones, dilataciones y constando de fibroína de seda electrohilada, copolímeros de ácido poliglicólico/ácido poliláctico (PGA/PLA) o copolímeros de ácido poliglicólico/policaprolactona (PGA/PCL);
- sembrar al menos una parte de la luz interior de dicha matriz con líneas celulares endoteliales de forma que se obtenga una capa continua y homogénea de células endoteliales sembradas (procedimiento de siembra), sembrando, opcionalmente, al menos una parte de la superficie externa de dicha matriz con líneas celulares musculares;
- promover el crecimiento de dichas células endoteliales, y opcionalmente de dichas células musculares, hasta obtener una capa continua y uniforme de células endoteliales, para obtener dicho modeloin vitro.
14. El uso de la matriz (21) según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 o 13, para llevar a cabo ensayos preclínicos o clínicosin vitrode un producto medicinal para un uso en seres humanos para ser utilizado en la región cardiovascular y vascular periférica.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT201900002193A1 (it) * 2019-02-14 2020-08-14 1Lab Sa Metodo di caratterizzazione di un costrutto vascolare ingegnerizzato
CN111575183B (zh) * 2020-04-30 2021-06-29 北京理工大学 一种气泡驱动的环状微单元阵列化组装系统及方法
CN115747065A (zh) * 2022-11-15 2023-03-07 南京中医药大学 一种体外循环给药模拟对血管内皮作用的实验装置
CN116769598A (zh) * 2023-07-24 2023-09-19 柔脉医疗(深圳)有限公司 一种人工组织的体外培养装置

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7615373B2 (en) * 1999-02-25 2009-11-10 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Electroprocessed collagen and tissue engineering
US7759113B2 (en) * 1999-04-30 2010-07-20 The General Hospital Corporation Fabrication of tissue lamina using microfabricated two-dimensional molds
US20070243574A1 (en) * 2006-01-27 2007-10-18 University Of Arizona Vascular mimic for drug and device evaluation
SG182710A1 (en) * 2010-01-29 2012-08-30 Organ Technologies Inc Perfusion culture method and perfusion culture device for organ or tissue
FI20115670A0 (fi) * 2011-06-23 2011-06-23 Tampereen Yliopisto Kardiovaskulaarinen in vitro-malli
JPWO2015005349A1 (ja) * 2013-07-09 2017-03-02 国立大学法人 東京大学 細胞培養支持体、細胞培養装置、細胞培養キット、及び細胞シート
EP3063262A4 (en) * 2013-10-30 2017-07-19 Miklas, Jason Devices and methods for three-dimensional tissue culturing
CA3007631A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Optimized patient specific non-linear tissue engineered vascular grafts
EP3512460B1 (en) * 2016-09-16 2023-11-01 University Of Kansas Engineered blood vessels
WO2018063099A1 (en) * 2016-09-29 2018-04-05 Nanyang Technological University Three-dimensional (3d) hydrogel patterning in microfluidic vascular models
IT201700093925A1 (it) * 2017-08-16 2019-02-16 1Lab Sa Un processo di industrializzazione affidabile e riproducibile di eliminazione di bolle d'aria per la produzione di un tessuto vascolare ingegnerizzato.

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