ES2970269T3 - Linfocitos citolíticos naturales modificados y líneas de linfocitos citolíticos naturales que tienen citotoxicidad aumentada - Google Patents

Linfocitos citolíticos naturales modificados y líneas de linfocitos citolíticos naturales que tienen citotoxicidad aumentada Download PDF

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Abstract

Las células NK y las líneas de células NK se modifican para aumentar la citotoxicidad, donde las células y sus composiciones tienen un uso en el tratamiento del cáncer. La producción de células NK modificadas y líneas de células NK se realiza mediante modificación genética para eliminar la expresión del receptor inhibidor del punto de control y/o agregar la expresión del ligando TRAIL mutante (variante). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Linfocitos citolíticos naturales modificados y líneas de linfocitos citolíticos naturales que tienen citotoxicidad aumentada
Introducción
La presente invención se refiere a la modificación de linfocitos citolíticos naturales (NK) para producir derivados de los mismos con un fenotipo más citotóxico en el tratamiento del cáncer.
Antecedentes de la invención
Típicamente, los inmunocitos requieren que una célula diana presente el antígeno mediante el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) antes de activar una respuesta inmunitaria que provoque la muerte de la célula diana. Esto permite que las células cancerosas que no presentan MHC de clase I evadan la mayoría de las respuestas inmunitarias.
Los linfocitos NK, sin embargo, pueden reconocer células cancerosas en ausencia de la expresión de MHC de clase I. Por tanto, realizan una función crucial en la defensa del organismo contra el cáncer.
Por otro lado, en determinadas circunstancias, las células cancerosas demuestran una capacidad de amortiguar la actividad citotóxica de los linfocitos NK, a través de la expresión de ligandos que se unen a receptores inhibidores en la membrana a los linfocitos NK. La resistencia al cáncer puede implicar un equilibrio entre estos factores y otros.
La citotoxicidad, en este contexto, se refiere a la capacidad de los inmunocitos efectores, por ejemplo, linfocitos NK, de inducir la muerte de células cancerosas, por ejemplo, al liberar compuestos citolíticos o al unirse a receptores en las membranas de las células cancerosas e inducir apoptosis de dichas células cancerosas. La citotoxicidad se ve influida no solamente por las señales que inducen la liberación de compuestos citolíticos, pero también por señales que inhiben su liberación. Por lo tanto, un aumento en la citotoxicidad dará lugar a una destrucción más eficaz de las células cancerosas, con menos posibilidad de que la célula cancerosa amortigüe la actividad citotóxica de los NK, como se menciona anteriormente.
Se ha sugerido la modificación genética para retirar la función de receptor inhibidor en los linfocitos NK como método para aumentar la citotoxicidad de los linfocitos NK contra las células cancerosas que carecen de expresión de MHC de clase I, pero que pueden amortiguar la citotoxicidad de los NK (Bodduluruet al.2012). Se ha establecido NKG2A como un receptor inhibidor de utilidad en silenciamiento en estas circunstancias, ya que se sabe que determinadas células cancerosas expresan MICA que se une NKG2A e inhibe la citotoxicidad de los linfocitos NK en ausencia de expresión de MHC de clase I (Shooket al.2011; documento WO 2006/023148).
Otro método de regulación por disminución de la expresión de NKG2A se ha mostrado en células NK-92, en que se mostró que la transfección con un gen que codifica IL-15 está asociada con una reducción en la expresión de NKG2A (Zhanget al.2004). Sin embargo, a pesar de un aumento observado en la citotoxicidad de los linfocitos NK, el aumento era probablemente un resultado de un aumento concomitante en la expresión del receptor activador NKG2D. Esto está respaldado por la observación de que el bloqueo de los receptores NKG2A en células NK-92 no estaba asociado con un aumento en la citotoxicidad contra células de mieloma múltiple (Heidenreichet al.2012). No obstante, vale la pena apreciar que la línea celular NK-92 es una línea celular altamente citotóxica con muy baja expresión de receptores inhibidores. Por lo tanto, cualquier aumento en la citotoxicidad asociada con expresión disminuida de NKG2A podría haber sido demasiado trivial de detectar.
Se han realizado estudios similares en ratones. Por ejemplo, los ratones expresan un receptor denominado Ly49 en linfocitos NK, que es análogo a los receptores inhibidores humanos KIR. Se ha mostrado que al bloquear el receptor Ly49 con fragmentos de anticuerpo, los linfocitos NK son más citotóxicos y capaces de destruir células leucémicas murinasin vitroein vivo(Kohet al.2001).
Una consecuencia de reducir la función de los receptores inhibidores, sin embargo, es que las células "normales" en el organismo también se vuelven más susceptibles al ataque por linfocitos NK modificados, ya que los linfocitos NK modificados se vuelven menos capaces de distinguir entre células "normales" y células cancerosas. Esta es una desventaja significativa de reducir la función "clásica" de los receptores inhibidores.
Otra manera en que los linfocitos NK muestran destruir células cancerosas es expresando TRAIL en su superficie. El ligando TRAIL puede unirse a receptores de TRAIL en células cancerosas e inducir la apoptosis de dichas células cancerosas. Una estrategia especulativa describe la sobreexpresión de TRAIL en linfocitos<n>K, para aprovechar este mecanismo antineoplásico (documento EP1621550). Además, se ha informado de que IL-12 regulación por aumento la expresión de TRAIL en linfocitos NK (Smythet al.2001).
No obstante, las células cancerosas han desarrollado mecanismos evasivos y protectores para hacer frente a los linfocitos NK que expresan TRAIL. A menudo se expresan receptores de TRAIL de señuelo en las membranas de las células cancerosas, y la unión de TRAIL a esos receptores de señuelo no puede inducir apoptosis; aún no se han buscado métodos para superar dichos mecanismos.
La leucemia mielógena aguda (AML) es una neoplasia maligna hematopoyética que implica las células precursoras destinadas al desarrollo mielocítico, y representa una proporción importante de las leucemias agudas tanto en adultos (90 %) como en niños (15-20 %) (Hurwitz, Mounceet al.1995; Lowenberg, Downinget al.1999). A pesar de que un 80% de los pacientes que consiguen remisión con quimioterapia convencional (Hurwitz, Mounceet al.1995; Ribeiro, Razzouket al.2005), la supervivencia sigue siendo insatisfactoria a causa de las altas tasas de recidiva a partir de la enfermedad residual mínima (MRD). La supervivencia en cinco años depende de la edad; de un 60 % en niños (Rubnitz 2012), de un 40 % en adultos por debajo de los 65 años (Lowenberg, Downinget al.1999) y de un 10 % en adultos por encima de los 65 años (Ferrara y Schiffer 2013). Estos desenlaces pueden mejorarse si los pacientes tienen un donador de células hematopoyéticas adecuado, pero muchos no, lo que pone de relieve la necesidad de una estrategia alternativa para el tratamiento.
Los linfocitos citolíticos naturales (NK) son linfocitos citotóxicos, con fenotipos distintivos y funciones efectoras que difieren de, por ejemplo, los linfocitos T citolíticos naturales (NK-T). Por ejemplo, mientras los linfocitos NK-T expresan tanto CD3 como receptores de antígeno de linfocitos T (TCR), los linfocitos N<k>no. Se encuentra que los linfocitos NK en general expresan los marcadores CD16 y CD56, en donde CD16 funciona como un receptor de Fc y media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) que se analiza a continuación. KHYG-1 es una excepción notable a este respecto. A pesar de que los linfocitos NK son citotóxicos de forma natural, se han desarrollado líneas celulares NK con citotoxicidad aumentada. NK-92 y KHYG-1 representan dos líneas celulares NK que se han investigado ampliamente y se muestran prometedoras en productos terapéuticos contra el cáncer (Swiftet al.2011; Swiftet al.2012).
La inmunoterapia celular adoptiva para su uso en el tratamiento del cáncer normalmente implica la administración de linfocitos T naturales y modificados a un paciente. Los linfocitos T pueden modificarse de diversas maneras, por ejemplo, genéticamente, para que expresen receptores y/o ligandos que se unan específicamente a determinadas células cancerosas diana. La transfección de linfocitos T con receptores de linfocitos T (TCR) de alta afinidad y receptores quiméricos de antígeno (CAR), específicos para antígenos de las células cancerosas, puede dar lugar a respuestas de linfocitos T específicas de cáncer altamente reactivas. Una limitación principal de esta estrategia inmunoterapéutica es que los linfocitos T deben obtenerse del paciente para expansión autóloga exvivoo deben usarse linfocitos T de MHC coincidente para evitar la erradicación inmunológica inmediatamente después de la transferencia de las células al paciente o, en algunos casos, el inicio de la enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD). Además, los linfocitos T transfectados satisfactoriamente a menudo sobreviven durante periodos prolongados de tiempo en la circulación, haciendo que sea difícil controlar los efectos secundarios persistentes resultantes del tratamiento.
En el trasplante de haplotipo, se cree que el efecto de injerto contra leucemia está mediado por los linfocitos NK cuando hay una discrepancia de receptor inhibidor KIR-ligando, que puede dar lugar a supervivencia mejorada en el tratamiento de AML (Ruggeri, Capanniet al.2002; Ruggeri, Mancusiet al.2005). Además, la rápida recuperación de los NK está asociada con un mejor desenlace y un efecto de injerto contra leucemia (GVL) más fuerte en paciente que experimentan trasplante de células hematopoyéticas (HCT) reducidas en haplotipo T en AML (Savani, Mielkeet al.2007). Otros ensayos han usado linfocitos NK haploidénticos expandidosex vivopara tratar la AML en adultos (Miller, Soignieret al.2005) y niños (Rubnitz, Inabaet al.2010).
Se han establecido varias líneas celulares NK permanentes, y la más notable es NK-92, derivada de un paciente con linfoma no hodgkiniano que expresa marcadores celulares NK típicos, con la excepción de CD16 (receptor III de Fc gamma). NK-92 ha experimentado amplio ensayo preclínico y presenta lisis superior contra una amplia serie de tumores en comparación con linfocitos NK activados y linfocitos citolíticos activados con linfocinas (LAK) (Gong, Makiet al.1994). Se ha establecido la citotoxicidad de las células NK-92 contra AML primaria (Yan, Steinherzet al.1998).
Otra línea celular NK, KHYG-1, se ha identificado como posible candidato para uso clínico (Sucket al.2005), pero tiene citotoxicidad reducida, de modo que ha recibido menos atención que NK-92. Se sabe que las células KHYG-1 están preactivadas. A diferencia de los linfocitos NK endógenos, las células KHYG-1 están polarizadas todo el tiempo, aumentando su citotoxicidad y haciendo que sean más rápidas en responder a estímulos externos. Las células NK-92 tienen una citotoxicidad basal mayor que las células KHYG-1.
Por lo tanto, está claro que los actuales protocolos de inmunoterapia adoptiva se ven influidos por la variabilidad del donador en la cantidad y calidad de las células efectoras, variables que podrían eliminarse si estuvieran disponibles líneas celulares eficaces para proporcionar tratamiento más normalizado.
Se ha realizado una cantidad considerable de investigación sobre la citotoxicidad de los linfocitos NK usando modelos de ratón. Un ejemplo es el hallazgo de que el ARNm de la perforina y la granzima B se transcriben de forma constitutiva en linfocitos NK de ratón, pero se detectan niveles mínimos de proteína hasta la estimulación o activación de los linfocitos NK (Fehnigeret al.,2007).
Aunque este trabajo y otros trabajos usando linfocitos NK de ratón son de interés, no pueden tomarse como evidencia concluyente de la citotoxicidad de los linfocitos NK en seres humanos. En contraste con el ejemplo anterior, los linfocitos NK humanos expresan altos niveles de proteína perforina y granzima B antes de la estimulación (Leonget al.,2011). Siendo el resultado que, cuando los linfocitos NK de ratón o humanos están recién aislados en cultivo, los linfocitos NK de ratón tienen actividad citolítica débil, mientras que los linfocitos NK humanos presentan capacidades citolíticas fuertes.
Los linfocitos NK de ratón y humanos también varían enormemente en sus marcadores de expresión, las cascadas de señalización y la distribución en tejidos. Por ejemplo, CD56 se usa como marcador de linfocitos NK humanos, mientras que los linfocitos NK de ratón no expresan este marcador en absoluto. Además, un mecanismo bien establecido para regular la citotoxicidad de los linfocitos NK es mediante ligando que se une a receptores de activación e inhibidores de los NK. Dos de los receptores de activación de los NK humanos más prominentes son conocidos como NKp30 y NKp44, de los que ninguno se expresa en linfocitos NK de ratón. Con respecto a los receptores inhibidores de los NK, mientras los linfocitos NK humanos expresan KIR que reconocen MHC de clase I y amortiguan la actividad citotóxica, los linfocitos NK de ratón no expresan KIR en absoluto, pero, en su lugar, expresan Ly49s (Trowsdaleet al.,2001). En conjunto, a pesar de que los linfocitos NK de ratón consiguen la misma función que los linfocitos NK humanos en su entorno fisiológico natural, los mecanismos que cumplen esta función varían significativamente entre especies.
Por tanto, existe una necesidad de linfocitos NK humanos alternativos y preferiblemente mejorados, por ejemplo, con un perfil más tóxico.
Un objeto de la invención es proporcionar linfocitos NK con un fenotipo más citotóxico. Un objeto adicional es proporcionar métodos para producir linfocitos NK modificados, composiciones que contienen las células y usos de dichas composiciones en el tratamiento de cánceres. Realizaciones más particulares tienen como objetivo proporcionar tratamientos para cánceres identificados, por ejemplo, cánceres hemáticos, tales como leucemias. Realizaciones específicas tienen como objetivo combinar dos o más modificaciones de linfocitos NK para potenciar más la citotoxicidad de las células modificadas.
Sumario de la invención
Se proporcionan en este documento linfocitos NK modificados con un fenotipo más citotóxico, y métodos de preparación de las células. También se proporcionan composiciones de linfocitos<n>K modificados, y usos de dichas composiciones para tratar el cáncer.
La invención proporciona un linfocito citolítico natural (NK) humano, que no es una línea celular NK, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el linfocito NK se ha modificado genéticamente para inactivar la expresión de CD279 (PD-1) y/o TIGIT.
Además, las composiciones de la invención incluyen linfocitos NK en que se proporcionan dos o más modificaciones, en donde múltiples modificaciones potencian más la actividad citotóxica de la composición.
Los cánceres particularmente tratables de acuerdo con la invención incluyen cánceres hemáticos, leucemias y específicamente leucemia mielógena aguda. Pueden tratarse en particular tumores y cánceres en seres humanos. Referencias a tumores en este documento incluyen referencias a neoplasias.
Detalles de la invención
Por consiguiente, la presente invención proporciona un linfocito citolítico natural (NK) humano, que no es una línea celular NK, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el linfocito NK se ha modificado genéticamente para inactivar la expresión de CD279 (PD-1) y/o TIGIT.
Como se describe en detalle a continuación en los ejemplos, los linfocitos NK se han modificado genéticamente para aumentar su actividad citotóxica contra el cáncer.
En determinadas realizaciones de la invención, se proporcionan linfocitos NK que tienen función adicional de receptor inhibidor del punto de control reducida o ausente. Por tanto, en los ejemplos a continuación, se producen linfocitos NK que tienen uno o más genes de receptores inhibidores del punto de control inactivados. Preferiblemente, estos receptores son receptores inhibidores del punto de control específicos. Preferiblemente aún, estos receptores inhibidores del punto de control son uno o más o todos de CD96 (TACTILE), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG-3), CD328 (SIGLEC7), SIGLEC9 y/o TIM-3.
En otras realizaciones, se proporcionan adicionalmente linfocitos NK en que una o más rutas de señalización del receptor inhibidor están inactivadas o presentan función reducida, de nuevo siendo el resultado una función del receptor inhibidor reducida o ausente. Por ejemplo, las rutas de señalización mediadas por SHP-1, SHP-2 y/o SHIP se inactivan por modificación genética de las células.
Los linfocitos NK resultantes presentan citotoxicidad mejorada y son de mayor uso, por lo tanto, en tratamiento contra el cáncer, especialmente tratamiento contra cáncer hemático, en particular tratamiento de leucemias y mieloma múltiple.
En una realización, la modificación genética se produce antes de que la célula se haya diferenciado en un linfocito NK. Por ejemplo, células madre pluripotentes (por ejemplo, iPSC) pueden modificarse genéticamente para perder la capacidad de expresar uno o más receptores inhibidores del punto de control. Las iPSC modificadas entonces se diferencian para producir linfocitos NK modificados genéticamente con citotoxicidad aumentada.
Se prefiere reducir la función de los receptores inhibidores del punto de control sobre otros receptores inhibidores, debido a la expresión de los primeros después de la activación de los linfocitos NK. Los receptores inhibidores normales 0 "clásicos", tal como la mayoría de la familia KIR, NKG2A y LIR-2, se unen a MHC de clase I y, por lo tanto, están implicados principalmente en la reducción del problema de autodirección. Preferiblemente, por lo tanto, se inactivan los receptores inhibidores del punto de control. La expresión inactivada de CD279 (PD-1) y/o TIGIT de acuerdo con la invención evita que las células cancerosas supriman la función efectora inmunitaria (lo que, de lo contrario, podría suceder si los receptores fueran completamente funcionales). Por tanto, una ventaja clave de estas realizaciones de la invención recae en los linfocitos NK que son menos susceptible a supresión de sus actividades citotóxicas por las células cancerosas; como resultado, son útiles en el tratamiento del cáncer.
Como se usa en este documento, referencias a receptores inhibidores en general se refieren a un receptor expresado en la membrana plasmática de un inmunocito efector, por ejemplo, un linfocito NK, tras cuya unión de su ligando complementario que produce señales intracelulares son responsables de reducir la citotoxicidad de dicho inmunocito efector. Estos receptores inhibidores se expresan durante los estados "de reposo" y "activado" del inmunocito efector y a menudo están asociados con proporcionar al sistema inmunitario un mecanismo de "autotolerancia" que inhibe las respuestas citotóxicas contra células y tejidos del organismo. Un ejemplo es la familia de receptores inhibidores "KIR" que se expresan en linfocitos NK y reconoce MHC de clase I expresado en células sanas del organismo.
También como se usa en este documento, los receptores inhibidores del punto de control se consideran habitualmente un subconjunto de los receptores inhibidores anteriores. A diferencia de otros receptores inhibidores, sin embargo, los receptores inhibidores del punto de control se expresan a mayores niveles durante activación prolongada y citotoxicidad de un inmunocito efector, por ejemplo, un linfocito NK. Este fenómeno es útil para amortiguar la citotoxicidad crónica en, por ejemplo, sitios de inflamación. Ejemplos incluyen los receptores inhibidores del punto de control PD-1, CTLA-4 y CD96, que todos ellos se expresan en linfocitos NK.
Un linfocito NK que carece de un gen puede referirse a una eliminación completa o parcial, mutación o de lo contrario que provoque que no se exprese producto génico funcional. En realizaciones, el linfocito NK carece de genes que codifican dos o más de los receptores inhibidores.
Realizaciones más específicas comprenden un linfocito NK que carece adicionalmente de un gen que codifica un receptor inhibidor del punto de control seleccionado de CD96 (TA<c>T<i>LE) y CD152 (CTLA4).
Descrito a continuación, los autores de la invención han mostrado de forma fiable los efectos citotóxicos de usar ARNi para atenuar la expresión del receptor inhibidor del punto de control CD96 en células KHYG-1. Las células KHYG-1 con atenuación (KD) de CD96 demostraron citotoxicidad potenciada contra células leucémicas a una diversidad de relaciones de efector:diana (E:T).
En otras realizaciones de la invención, se proporcionan linfocitos NK que expresan adicionalmente un ligando TRAIL o, preferiblemente, un ligando TRAIL mutante (variante). Como se describe adicionalmente en los ejemplos a continuación, las modificaciones potenciadoras de la citotoxicidad de los linfocitos NK, por tanto, también incluyen expresión aumentada del ligando TRAIL y/o también de variantes mutadas del ligando TRAIL.
Los linfocitos NK resultantes presentan unión aumentada a receptores de TRAIL y, como resultado, citotoxicidad aumentada contra cánceres, especialmente cánceres hemáticos, en particular leucemias.
Los mutantes/variantes preferiblemente tienen menor afinidad (o de hecho nada de afinidad) por receptores "de señuelo", en comparación con la unión de TRAIL natural a receptores de señuelo. Dichos receptores de señuelo representan una clase de receptores de TRAIL que se unen al ligando TRAIL, pero no tienen la capacidad de iniciar la muerte celular y, en algunos casos, actuar antagonizando la ruta de señalización de muerte. Los ligandos TRAIL mutantes/variantes pueden prepararse de acuerdo con el documento WO 2009/077857.
Los mutantes/variantes pueden tener por separado afinidad aumentada por receptores de TRAIL, por ejemplo, DR4 y DR5. Se sabe típicamente que TRAIL natural tiene una Kd de >2 nM por DR4, >5 nM por DR5 y >20 nM por el receptor de señuelo DcR1 (documento WO 2009/077857; medida por resonancia de plasmones superficiales), o de aproximadamente 50 a 100 nM por DR4, de 1 a 10 nM por DR5 y de 175 a 225 nM por DcR1 (Truneh, A.et al.2000; medida por calorimetría de valoración isotérmica y ELISA). Por lo tanto, una afinidad aumentada por DR4 se define adecuadamente como una K<d>de <2 nM o <50 nM, respectivamente, mientras que una afinidad aumentada por DR5 se define adecuadamente como una Kd de <5 nM o <1 nM, respectivamente. Una afinidad reducida por el receptor de señuelo DcR1 se define adecuadamente como una Kd de >50 nM o >225 nM, respectivamente. En cualquier caso, un aumento o disminución en la afinidad presentada por la variante/mutante de TRAIL es relativa a una afinidad basal presentada por TRAIL natural. La afinidad está aumentada preferiblemente al menos un 10 %, más preferiblemente al menos un 25 %, en comparación con la presentada por TRAIL natural.
La variante de TRAIL preferiblemente tiene una afinidad aumentada por DR5 en comparación con su afinidad por DR4, DcR1 y DcR2. Preferiblemente, la afinidad es al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces o más por DR5 que por uno o más de DR4, DcR1 y DcR2. Más preferiblemente, la afinidad es al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces o incluso 1000 veces o más por DR5 que por al menos dos, y preferiblemente todos, de DR4, DcR1 y DcR2.
Una ventaja clave de estas realizaciones de la invención recae en linfocitos NK que tienen mayor potencia en destruir células cancerosas.
Realizaciones específicas adicionales comprenden un linfocito NK que expresa adicionalmente un ligando TRAIL mutante que tiene afinidad reducida o nada de afinidad por receptores de señuelo de TRAIL. Realizaciones específicas adicionales comprenden un linfocito NK que expresa adicionalmente un ligando TRAIL mutante que tiene afinidad reducida 0 nada de afinidad por receptores de señuelo de TRAIL y afinidad aumentada por DR4 y/o DR5.
Descrito en más detalle a continuación, los linfocitos NK se modificaron genéticamente para expresar un TRAIL mutante. Células KHYG-1 modificadas expresaban TRAIL mutante, y NK-92 expresaba un TRAIL mutante. Las células KHYG-1 modificadas presentaban citotoxicidad mejorada contra líneas celulares cancerosasin vitro.Las células KHYG-1 expresan receptores de TRAIL (por ejemplo, DR4 y DR5), pero a niveles bajos. Otras realizaciones preferidas de los linfocitos NK modificados expresan adicionalmente nada o sustancialmente nada de receptores de TRAIL, o lo hacen solamente a un nivel bajo, suficientemente bajo para que la viabilidad de los linfocitos NK modificados no se vea influida adversamente por la expresión del TRAIL mutante.
En una realización opcional, el tratamiento de un cáncer usando linfocitos NK modificados que expresen TRAIL o una variante de TRAIL se potencia administrando a un paciente un agente que pueda regular por aumento la expresión de receptores de muerte de TRAIL en células cancerosas. Este agente puede administrarse antes de, en combinación con o posteriormente a la administración de los linfocitos NK modificados. Es preferible, sin embargo, que el agente se administre antes de administrar los linfocitos NK modificados.
En una realización preferida, el agente regula por aumento la expresión de DR5 en células cancerosas. El agente opcionalmente puede ser un medicamento quimioterápico, por ejemplo, bortezomib, y se administra en una dosis baja que puede regular por aumento la expresión de DR5 en el cáncer.
La invención no se limita a ningún agente particular que pueda regular por aumento la expresión de DR5, pero ejemplos de agente inductores de DR5 incluyen bortezomib, gefitinib, piperlongumina, doxorrubicina, succinato de alfatocoferilo e inhibidores de HDAC.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el ligando TRAIL mutante/variante está ligado a uno o más dominios coestimuladores de los linfocitos NK, por ejemplo, 41BB/CD137, CD3zeta/CD247, DAP12 o DAP10. La unión de la variante a su receptor en una célula diana, por tanto, promueve señales apoptóticas dentro de la célula diana, así como señales citotóxicas estimulantes en el linfocito NK.
La presente invención también proporciona linfocitos NK modificados adicionalmente para expresar uno o más CAR.
Adecuadamente para usos en tratamiento contra el cáncer, los CAR se unen específicamente a uno o más ligandos en células cancerosas, por ejemplo, CS1 (SLAMF7) en células de mieloma. Para su uso en el tratamiento de cánceres específicos, por ejemplo, mieloma múltiple, el CAR puede unirse a CD38. Por ejemplo, el CAR puede incluir las propiedades de unión de, por ejemplo, regiones variables derivadas de, similares a, o idénticas a las del anticuerpo monoclonal conocido daratumumab. Dichos linfocitos NK pueden usarse en tratamiento contra el cáncer en combinación con un agente que inhibe la angiogénesis, por ejemplo, lenalidomida. Para su uso en tratamiento de cánceres, especialmente leucemias y AML en particular, el CAR puede unirse a CLL-1.
Los CAR-NK pueden ser biespecíficos, en donde su afinidad es por dos ligandos/antígenos distintivos. Los CAR-NK biespecíficos pueden usarse para aumentar el número de posibles sitios de unión en células cancerosas o, como alternativa, para localizar células cancerosas para otros inmunocitos efectores que expresen ligandos específicos para el NK-CAR. Para su uso en tratamiento contra el cáncer, un CAR biespecífico puede unirse a una célula tumoral diana y a una célula efectora, por ejemplo, un linfocito T, linfocito NK o macrófago. Por tanto, por ejemplo, en el caso de mieloma múltiple, un CAR biespecífico puede unirse a un antígeno de linfocitos T (por ejemplo, CD3, etc.) y un marcador de células tumorales (por ejemplo, CD38, etc.). Un CAR biespecífico puede unirse, como alternativa, a dos marcadores de células tumorales separados, aumentando la afinidad de unión global del linfocito NK por la célula tumoral diana. Esto puede reducir el riesgo de que las células cancerosas desarrollen resistencias al regular por disminución uno de los antígenos diana. Un ejemplo en este caso, en mieloma múltiple, sería un CAR que se une tanto a CD38 como a CS-1/SLAMF7. Otro marcador de células tumorales adecuadamente abordado por el CAR es un marcador del tipo "no me comas" en tumores, ejemplificado por CD47.
Rasgos característicos opcionales de la invención incluyen proporcionar más modificaciones a los linfocitos NK descritos anteriormente, en donde, por ejemplo, se expresa un receptor de Fc (que puede ser CD16, CD32 o CD64, incluyendo subtipos y derivados) sobre la superficie de la célula. En uso, estas células pueden mostrar reconocimiento aumentado de células cancerosas recubiertas con anticuerpo y mejorar la activación de la respuesta citotóxica.
Rasgos característicos opcionales adicionales de la invención incluyen adaptar los linfocitos NK modificados para una mejor migración dirigida a regiones diana específicas del organismo. Los linfocitos NK de la invención pueden dirigirse a ubicaciones específicas de células cancerosas. En realizaciones preferidas para el tratamiento de cánceres hemáticos, los efectores NK de la invención están adaptados a migración dirigida a la médula ósea. Linfocitos NK específicos se modifican por fucosilación y/o sialilación para una migración dirigida a la médula ósea. Esto puede conseguirse modificando genéticamente los linfocitos NK para que expresen la fucosiltransferasa y/o sialiltransferasa apropiada, respectivamente. La migración dirigida aumentada de los linfocitos NK efectores a los sitios tumorales también puede hacerse posible mediante alteración de la vasculatura tumoral, por ejemplo, mediante quimioterapia metronómica, o usando fármacos dirigidos a la angiogénesis (Meleroet al.,2014) para normalizar la infiltración de linfocitos NK mediante los vasos sanguíneos cancerosos.
Otro rasgo característico opcional más de la invención es proporcionar linfocitos NK modificados con una capacidad intrínseca aumentada de rápido crecimiento y proliferación en cultivo. Esto puede conseguirse, por ejemplo, transfectando las células para que sobreexpresen las citocinas inductoras del crecimiento IL-2 e IL-15. Además, esta alteración opcional proporciona una alternativa rentable a la reposición del medio de cultivo con citocinas en una base continua. En realizaciones preferidas, el linfocito NK modificado o composición es para su uso en el tratamiento de cánceres hemáticos, incluyendo leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, incluyendo linfomas de linfocitos T y linfomas de linfocitos B, mieloma asintomático, mieloma múltiple asintomático (SMM), mieloma activo o mieloma de cadena ligera.
Los linfocitos NK modificados y composiciones de los mismos descritos en este documento, anteriormente y a continuación, son adecuados para el tratamiento del cáncer, en particular cáncer en seres humanos, por ejemplo, para el tratamiento de cánceres de glóbulos sanguíneos o cánceres sólidos. Los linfocitos NK y derivados son preferiblemente linfocitos NK humanos. Para tratamiento en seres humanos, se usan preferiblemente linfocitos NK humanos.
Los expertos en la materia conocerán diversas vías de administración para administrar los agentes activos y combinaciones de los mismos a un paciente que lo necesite. Realizaciones de la invención son para el tratamiento de cáncer hemático. La administración de los linfocitos NK modificados puede ser sistémica o localizada, tal como, por ejemplo, mediante vía intraperitoneal.
En otras realizaciones, el agente activo se administra más directamente. Por tanto, la administración puede ser directamente intratumoral, adecuada especialmente para tumores sólidos.
Se cree que los linfocitos NK en general son adecuados para la invención. Aunque no están dentro del alcance de la invención, las células usadas en determinados ejemplos en este documento pueden ser linfocitos NK obtenidos de una línea celular cancerosa. Un linfocito NK, por ejemplo, tratado para reducir su oncogenia, por ejemplo, al hacer que sea mortal y/o incapaz de dividirse, puede obtenerse de una línea celular de cáncer hemático y usarse en métodos para tratar el cáncer hemático.
Ejemplos
Aunque está limitada por el alcance de las reivindicaciones, la invención se ilustra ahora con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
la figura 1 muestra la secuencia de ADN de la región diana del gen LIR2 y marca las regiones flanqueantes de ARNg; la figura 2 muestra la secuencia de ADN de la región diana del gen CTLA4 y marca las regiones flanqueantes de ARNg;
la figura 3 muestra la construcción de ARNg (vector de expresión) usada para transfección;
la figura 4 muestra las bandas de electroforesis en gel para ADN original y mutado de LIR2, antes y después de transfección;
la figura 5 muestra las bandas de electroforesis en gel para ADN original y mutado de CTLA4, antes y después de transfección;
la figura 6A es un diagrama de FACS que muestra la atenuación satisfactoria de CD96 usando electroporación; la figura 6B es un diagrama de FACS que muestra la atenuación satisfactoria de CD96 usando electroporación; la figura 7 es un gráfico de barras que muestra la citotoxicidad aumentada de células KHYG-1 con atenuación de CD96 frente a células K562 a diversas relaciones de E:T;
la figura 8 muestra la atenuación de CD328 (Siglec-7) en células NK-92;
la figura 9 muestra la citotoxicidad potenciada de linfocitos NK con la atenuación de CD328 (Siglec-7);
la figura 10 muestra un diagrama de FACS de la expresión basal de TRAIL en células KHYG-1;
la figura 11 muestra un diagrama de FACS de la expresión de TRAIL y variante de TRAIL después de transfección de células KHYG-1;
la figura 12 muestra un diagrama de FACS de la expresión de CD107a después de transfección de células KHYG-1; la figura 13 muestra los efectos de transfectar células KHYG-1 con TRAIL y variante de TRAIL sobre la viabilidad celular;
la figura 14 muestra un diagrama de FACS de la expresión basal de DR4, DR5, DcR1 y DcR2 sobre células KHYG-1 y también sobre células NK-92;
las figuras 15, 16 y 17 muestran los efectos de expresar TRAIL o variante de TRAIL en células KHYG-1 sobre la apoptosis de tres poblaciones de células diana: K562, RPMI8226 y MM1.S, respectivamente;
la figura 18 muestra dos diagramas de FACS de la expresión de DR5 sobre células RPMI8226 y células MM1.S, respectivamente, en donde se muestran los efectos de tratamiento con bortezomib sobre la expresión de DR5; la figura 19 muestra diagramas de FACS de la apoptosis en células MM1.S pretratadas con bortezomib/sin tratar cocultivadas con células KHYG-1 con/sin la variante de TRAIL;
la figura 20 muestra un diagrama de FACS de los niveles de expresión de perforina en células KHYG-1 tratadas con CMA 100 nM durante 2 horas;
la figura 21 muestra diagramas de FACS de la viabilidad celular de KHYG-1 después de tratamiento con CMA 100 nM o vehículo;
la figura 22 muestra diagramas de FACS de la apoptosis en células MM1.S cocultivadas con células KHYG-1 con/sin la variante de TRAIL y pretratadas con/sin CMA;
la figura 23 muestra diagramas de FACS de la apoptosis en células K562 cocultivadas con células KHYG-1 con ARNip de CD96 y/o expresión de la variante de TRAIL; y
la figura 24 muestra diagramas de FACS de la apoptosis en células MM1.S cocultivadas con células KHYG-1 con ARNip de CD96 y/o expresión de la variante de TRAIL.
Las secuencias de ADN, ARN y aminoácidos se remiten a continuación, en las que:
SEQ ID NO: 1 es la secuencia completa de ADN de LIR2;
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de LIR2;
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de ARNg de LIR2 g9;
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de ARNg de LIR2 g18;
SEQ ID NO: 5 es la secuencia del cebador directo de LIR2;
SEQ ID NO: 6 es la secuencia del cebador inverso de LIR2;
SEQ ID NO: 7 es la secuencia completa de ADN de CTLA4;
SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de CTLA4;
SEQ ID NO: 9 es la secuencia de ARNg de CTLA4 g7;
SEQ ID NO: 10 es la secuencia de ARNg de CTLA4 g15;
SEQ ID NO: 11 es la secuencia del cebador directo de CTLA4; y
SEQ ID NO: 12 es la secuencia del cebador inverso de CTLA4.
Ejemplo 1 - Inactivación de la función del receptor inhibidor
CRISPR/Cas9
Se prepararon células como sigue, que tienen la función del receptor inhibidor eliminada. Se diseñaron construcciones de ARNg y se prepararon para abordar genes que codifican el receptor inhibidor "clásico" LIR2 y el receptor inhibidor "del punto de control" CTLA4 en el genoma humano de linfocitos NK. Entonces se usó la edición genómica con CRISPR/Cas9 para inactivar los genes diana LIR2 y CTLA4.
Se seleccionaron dos ARNg candidatos para cada gen diana y se determinaron sus eficacias de escisión en células K562. Las secuencias de los candidatos de ARNg se muestran en la tabla 1 y el motivo adyacente a protoespaciador (PAM) se refiere a las 3 últimas bases de la secuencia. Las regiones flanqueantes de las secuencias de ARNg en el gen de LIR2 (SEQ ID NO: 1) y el gen de CTLA4 (SEQ ID NO: 7) se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente.
Tabla 1. Candidatos de ARNg y secuencias
Se transfectaron células K562 con las construcciones de ARNg preparadas (figura 3) y posteriormente se recogieron para amplificación por PCR. La presencia de expresión de GFP se usó para informar de la incorporación satisfactoria de la construcción de ARNg en las células K562. Esto confirmó la expresión del gen Cas9 y, por lo tanto, la capacidad de inactivar la expresión de los genes de LIR2 y CTLA4.
La actividad de escisión de las construcciones de ARNg se determinó usando un ensayo de detección de discordanciasin vitro.La endonucleasa I de T7E1 reconoce y escinde ADN no emparejado perfectamente, lo que permite que los genes originales de LIR2 y CTLA4 se comparen con los genes mutados después de transfección con CRISPR/Cas9 y unión de extremos no homólogos (NHEJ).
La figura 4 muestra las bandas resultantes después de electroforesis en gel de agarosa tras inactivación del gen de LIR2 con las secuencias de ARNg g9 y g18. Las tres bandas correspondientes a cada mutación se refieren al gen original y las dos hebras resultantes después de la detección de una discrepancia en la secuencia de ADN después de transfección. La secuencia de ARNg g9 produjo una tasa de éxito de transfección de un 11 %, mientras que el ARNg g18 produjo un 10 %.
La figura 5 muestra las bandas resultantes después de electroforesis en gel de agarosa tras inactivación del gen de CTLA4 con las secuencias de ARNg g7 y g15. La secuencia de ARNg g7 produjo una tasa de éxito de transfección de un 32 %, mientras que el ARNg g15 produjo un 26 %.
Después de la inactivación satisfactoria de LIR2 y CTLA4 en células K562, las células KHYG-1 se transfectaron con construcciones de ARNg.
Se seleccionaron clones derivados de KHYG-1 que tienen eliminaciones homocigóticas. Se usó un vector de expresión de Cas9/puromicina acetiltransferasa (PAC) para este propósito. Las células transfectadas satisfactoriamente se seleccionaron, en función de su resistencia al antibiótico puromicina.
RNP Cas9
Otro protocolo usado para inactivar los receptores inhibidores del punto de control en linfocitos NK fue el de transfección de RNP Cas9. Una ventaja de usar este protocolo fue que se pueden conseguir eficacias de transfección similares, pero con toxicidad significativamente menor en comparación con el uso de los plásmidos de ADN del protocolo de CRISPR/Cas9.
Se recogieron 1 * 106 células KHYG1 para cada experimento de transfección. Las células se lavaron con PBS y se centrifugaron en una centrífuga. Entonces se descartó el sobrenadante. Los materiales de RNP CRISPR (proteína de unión a ARN) se prepararon entonces como sigue:
(1) Se preparó una solución 20 pM del ARNcr y ARNt sintetizados requeridos (adquiridos de Dharmacon).
(2) Se mezclaron conjuntamente 4 pl de ARNcr (20 pM) y 4 pl de ARNt (20 pM).
(3) La mezcla entonces se añadió a 2 pl de proteína Cas9 (5 pg/pl).
(4) Todos los componentes se mezclaron e incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Siguiendo el sistema de transfección Neon®, las células se mezclaron con RNP Cas9 y se realizó electroporación usando los siguientes parámetros:
Voltaje: 1450 V
Ancho de impulso: 30 ms
Número de impulsos: 1
Las células entonces se transfirieron aun pocillo de una placa de 12 pocillos que contenía medio de cultivo (inc. IL-2 e IL-15).
Las células se recogieron después de 48-72 horas para confirmar la edición génica mediante ensayo de endonucleasa T7 y/o secuenciación de Sanger. Se confirmó la presencia de indels, lo que indica inactivación satisfactoria de CTLA4, PD1 y CD96 en células KHYG1.
Nucleasas específicas de sitio
Otro protocolo usado para inactivar los receptores inhibidores del punto de control en linfocitos NK fue el de transfección de TALEN XTN. Una ventaja de usar este protocolo fue que se puede conseguir un nivel de especificidad particularmente alto en comparación con CRISPR natural.
Etapa 1: Preparación de reactivos
Se ensayaron células KHYG-1 para determinados atributos, incluyendo eficacia de transfección, eficacia de clonación de una sola célula y cariotipo/número de copias. Las células entonces se cultivaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
Dependiendo del receptor inhibidor del punto de control que se inactiva, se prepararon nucleasas por diseño personalizado de al menos 2 pares de TALEN XTN. La etapa de diseño personalizado incluye evaluación de locus génico, número de copias y evaluación funcional (es decir, homólogos, evaluación inespecífica).
Etapa 2: Manipulación de línea celular
Las células se transfectaron con las nucleasas de la etapa 1; esta etapa se repitió hasta 3 veces para obtener altos niveles de corte y los cultivos se dividieron y se mantuvieron cultivos intermedios antes de cada transfección.
El cribado inicial se produjo varios días después de cada transfección; las combinaciones de células se ensayaron para la eficacia de corte mediante el ensayo Cel-1. Después de que el nivel de corte alcanzara niveles aceptables o estables después de las transfecciones repetidas, las células se consideraron listas para clonación de una sola célula.
Las células combinadas se clasificaron a una célula por pocillo en una placa de 96 pocillos; el número de placas para cada combinación dependió de la eficacia de clonación de una sola célula determinada en la etapa 1. Las placas se dejaron incubar durante 3-4 semanas.
Etapa 3-Cribado y expansión
Una vez que las células fueron confluyentes en las placas de 96 pocillos, los cultivos se consolidaron y se dividieron en placas de 96 pocillos triplicadas; una placa se congeló como reserva, una placa se volvió a sembrar en placa para continuar la expansión de los clones y la placa final se usó para la confirmación del genotipo.
Cada clon en la placa de genotipo se analizó para la pérdida de señal de qPCR, lo que indica que todos los alelos se habían modificado. Los clones negativos se amplificaron por PCR y se clonaron para determinar la naturaleza de los indels y la ausencia de cualquier indel natural o en la misma pauta de lectura.
Los clones con la inactivación confirmada se consolidaron en no más de una placa de 24 pocillos y se expandieron más; típicamente se produjeron 5-10 crioviales congelados que contenían 1 * 106 células por vial para hasta 5 clones individuales por inactivación.
Etapa 4-Validación
Las células se conservaron en condiciones asépticas.
Los criterios de aprobación básicos para todas las células conservadas incluyeron el número de células viables (antes de congelación y después de descongelación), confirmación de la identidad mediante STR, certeza de esterilidad básica y ensayo de micoplasma; se aplicaron otros criterios de aprobación cuando fue necesario (cariotipo, expresión de marcadores superficiales, alto nivel de esterilidad, evaluación de inactivación del transcrito o la proteína, etc.).
Ejemplo 2 - Atenuación de la función del receptor inhibidor del punto de control CD96 mediante iARN
La atenuación por ARNip de CD96 en células KHYG-1 se realizó por electroporación. Se usó el kit de nucleofección T, junto con el Amaxa Nucleofector II, de Lonza, ya que es apropiado para su uso con líneas celulares y puede transfectar satisfactoriamente tanto células en división como células que no se dividen y consigue eficacias de transfección de hasta un 90 %.
El ARNip de control (número de catálogo: sc-37007) y el ARNip de CD96 (número de catálogo: sc-45460) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology. Se usó RPMI-1640 sin antibiótico que contenía FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM para cultivo tras nucleofección.
El anticuerpo de ratón anti-CD96 humano-APC (número de catálogo: 338409) se obtuvo de Biolegend para tinción.
Se preparó una solución madre de ARNip 20 jM . El ARNip bicatenario liofilizado se resuspendió en 33 j l del agua sin RNasa (tampón de dilución de ARNip: sc-29527) para FITC-control/control-ARNip, en 165 j l del agua sin RNasa para el ARNip de gen diana (ARNip de CD96). El tubo se calentó hasta 90 °C durante 1 minuto y después se incubó a 37 °C durante 60 minutos. La solución madre de ARNip entonces se almacenó a -20 °C hasta que se necesitó.
Las células KHYG-1 se pasaron de uno a dos días después de la nucleofección, ya que las células deben estar en fase de crecimiento logarítmico.
La solución de Nucleofector se calentó hasta temperatura ambiente (100 ul por muestra). También se precalentó una alícuota de medio de cultivo que contenía suero y complementos a 37 °C en un tubo de 50 ml. Se prepararon placas de 6 pocillos añadiendo 1,5 ml de medio de cultivo que contenía suero y complementos. Las placas se preincubaron en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2.
Se mezclaron 2 * 106 células en 100 j l de solución de nucleofección suavemente con 4 j l de solución de ARNip 20 jM (1,5 jg de ARNip). Se evitaron las burbujas de aire durante la mezcla. La mezcla se transfirió a cubetas certificadas Amaxa y se colocaron en el portacubetas de Nucleofector y se seleccionó el programa U-001.
Se permitió que finalizara el programa, y las muestras de las cubetas se retiraron inmediatamente. Entonces se añadieron 500 j l de medio de cultivo preequilibrado a cada cubeta. La muestra de cada cubeta se transfirió entonces suavemente a un pocillo correspondiente de la placa de 6 pocillos preparada, para establecer un volumen final de 2 ml por pocillo.
Las células entonces se incubaron en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2 hasta que se realizó el análisis de transfección. Se realizó análisis de citometría de flujo 16-24 horas después de la electroporación, para medir los niveles de expresión de CD96. Este protocolo de electroporación se realizó múltiples veces y se encontró que producía de forma fiable la atenuación de CD96 en células KHYG-1 (véanse, por ejemplo, las figuras 6A y 6B).
Ejemplo 3 - Citotoxicidad potenciada de linfocitos NK con una atenuación de CD96
Células KHYG-1 con y sin la atenuación de CD96 se cocultivaron con células K562 a diferentes relaciones de efector:diana (E:T).
La citotoxicidad se midió 4 horas después del cocultivo, usando el kit de citotoxicidad DELFIA EuTDA de PerkinElmer (número de catálogo: AD0116).
Las células diana K562 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM y antibióticos. Se compraron placas con fondo en V de 96 pocillos (número de catálogo: 83.3926) de SARSTEDT. Se usó una centrífuga Eppendorf 5810R (con rotor de placa) para centrifugar la placa. Se usó un VARIOSKAN FLASH (con programa informático Scanlt 2.4.3) para medir la señal de fluorescencia producida por las células K562 lisadas.
Las células K562 se lavaron con medio de cultivo y el número de células se ajustó a 1 * 106 células/ml con medio de cultivo. Se añadieron 2-4 ml de células a 5 j l de reactivo BATDA y se incubaron durante 10 minutos a 37 °C. Dentro de la célula, los enlaces éster se hidrolizan para formar un ligando hidrófilo, que ya no pasa a través de la membrana. Las células se centrifugaron a 1500 RPM durante 5 min para lavar las células K562 cargadas. Esto se repitió 3-5 veces con medio que contenía Probenecid 1 mM (Sigma P8761). Después del lavado final, el sedimento celular se resuspendió en medio de cultivo y se ajustó hasta aproximadamente 5 *104 células/ml.
Los pocillos se configuraron para detección del fondo, liberación espontánea y liberación máxima. Se transfirieron 100 j l de células diana cargadas (5000 células) a pocillos de una placa con fondo en V y se añadieron 100 j l de células efectoras (células KHYG-1) a concentraciones celulares variables, para producir relaciones de efector a diana que varían de 1:1 a 20:1. La placa se centrifugó a 100 xg durante 1 minuto y se incubó durante 4 horas en una atmósfera humidificada de un 5 % de CO2 a 37 °C. Para pocillos de liberación máxima, se añadieron 10 j l de tampón de lisis a cada pocillo 15 minutos antes de recoger el medio. La placa se centrifugó a 500 xg durante 5 minutos.
Se transfirieron 20 j l de sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo plano con 200 j l de solución de europio precalentada añadida. Esto se incubó a temperatura ambiente durante 15 min usando un agitador de placas. Como las células K562 se lisan por las células KHYG-1, liberan ligando al medio. Este ligando entonces reacciona con la solución de europio para formar un quelato fluorescente que se correlaciona directamente con la cantidad de células lisadas.
La fluorescencia entonces se midió en un fluorímetro con resolución temporal usando VARIOSKAN FLASH. La liberación específica se calculó usando la siguiente fórmula:
% de liberación específica = liberación experimental - liberación espontánea/liberación máxima - liberación espontánea
El análisis estadístico se realizó usando el programa informático Graphpad Prism 6.04. Se usó un ensayo de latpara datos emparejados para comparar la diferencia entre células KHYG-1 con atenuación de CD96 por ARNip y grupos de control (n = 3).
Se encontró que la liberación específica estaba significativamente aumentada en cocultivos que contenían las células KHYG-1 con atenuación de CD96. Este fue el caso a todas las relaciones de E:T (véase la figura 7).
Como la fluorescencia se correlaciona directamente con la lisis celular, se confirmó que la atenuación de la expresión de CD96 en células KHYG-1 provocaba un aumento en su capacidad de destruir células diana cancerosas K562.
Ejemplo 4 - Citotoxicidad potenciada de linfocitos NK con una atenuación de CD328 (Siglec-7)
Atenuación mediada por ARNip de CD328 en células NK-92
Materiales, reactivos e instrumentos
El ARNip de control (número de catálogo: sc-37007) y el ARNip de CD328 (número de catálogo: sc-106757) se compraron de Santa Cruz Biotechnology. Para conseguir eficacias de transfección de hasta un 90 % con alta viabilidad celular (>75 %) en células NK-92 con el dispositivo Nucleofector™ (Nucleofector II, Lonza), se usó un kit T Nucleofector™ de Lonza. Se usó RPMI-1640 que contenía FBS al 10%, L-glutamina 2 mM, sin antibióticos, para cultivo tras nucleofección. El anticuerpo de ratón anti-CD328 humano-APC (número de catálogo: 339206) se compró de Biolegend.
Protocolo
Para preparar solución madre de ARNip 10 pM
• El ARNip bicatenario liofilizado se resuspende en 66 pl del agua sin RNasa (tampón de dilución de ARNip: sc-29527) para FITC-control/control-ARNip, en 330 pl del agua sin RNasa para el ARNip de gen diana (ARNip de CD328).
• El tubo se calienta hasta 90 °C durante 1 minuto.
• Se incuba a 37 °C durante 60 minutos.
• Se almacena la solución madre de ARNip a -20 °C si no se usa directamente.
• Una muestra de nucleofección contiene (para cubeta convencional de 100 pl)
• Número de células: 2 * 106 células
• ARNip: 4 pl de solución madre 10 pM
• Solución de Nucleofector: 100 pl
Nucleofección
• Se cultiva el número requerido de células. (Pase de uno a dos días antes de nucleofección, las células deben estar en fase de crecimiento logarítmico).
• Se prepara ARNip para cada muestra.
• Se precalienta la solución de Nucleofector hasta temperatura ambiente (100 pl por muestra).
• Se precalienta una alícuota de medio de cultivo que contiene suero y complementos a 37 °C en un tubo de 50 ml. Se preparan placas de 6 pocillos llenando con 1,5 ml de medio de cultivo que contiene suero y complementos y se preincuban las placas en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2.
• Se toma una alícuota de cultivo celular y se cuentan las células para determinar la densidad celular.
• Se centrifuga el número requerido de células a 1500 rpm durante 5 min. Se descarta el sobrenadante completamente de modo que nada de medio residual cubra el sedimento celular.
• Se resuspende el sedimento celular en solución de Nucleofector a temperatura ambiente hasta una concentración final de 2 * 106 células/100 pl. Se evita almacenar la suspensión celular más de 15-20 min en solución de Nucleofector, ya que esto reduce la viabilidad celular y la eficacia de transferencia génica.
• Se mezclan 100 |jl de suspensión celular con ARNip.
• Se transfiere la muestra en una cubeta certificada Amaxa. Se garantiza que la muestra cubra el fondo de la cubeta, se evitan las burbujas de aire mientras se pipetea. Se cierra la cubeta con el tapón azul.
• Se selecciona el programa de Nucleofector apropiado (A-024 para células NK-92). Se inserta la cubeta en el portacubetas (Nucleofector II: se rota el carrusel en dirección horaria hasta la posición final) y se presiona el botón "x" para iniciar el programa.
• Para evitar daños a las células, se retirar las muestras de la cubeta inmediatamente después de que el programa haya acabado (la pantalla muestra "OK"). Se añaden 500 j l del medio de cultivo precalentado a la cubeta y se transfiere la muestra a la placa de 6 pocillos preparada.
• Se incuban las células en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2. Se realiza análisis citométrico de flujo y ensayo de citotoxicidad después de 16-24 horas.
Resultados: seguimos el protocolo anterior y realizamos análisis de citometría de flujo del nivel de expresión de CD328 en células NK-92. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 8, que confirma la atenuación satisfactoria.
La atenuación de CD328 potencia la citotoxicidad
Materiales, reactivos e instrumentos
Se compró el kit de citotoxicidad DELFIA EuTDA basado en ligando potenciador de la fluorescencia (número de catálogo: AD01l6) de PerkinElmer. Las células diana K562 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y antibióticos. Se compraron placas con fondo en V de 96 pocillos (número de catálogo: 83.3926) de SARSTEDT. Se usó una centrífuga Eppendorf 5810R (con rotor de placa) para centrifugar la placa. Se usó VARIOSKAN FLASH (con programa informático Scanlt 2.4.3) para medir la señal de fluorescencia producida por las células K562 lisadas.
Protocolo
• Se cargan células K562 diana con el reactivo DELFIA BATDA de ligando potenciador de la fluorescencia • Se lavan las células K562 con medio, se ajusta el número de células hasta 1 * 106 células/ml con medio de cultivo. Se añaden 2-4 ml de células a 5 j l de reactivo BATDA, se incuban durante 10 minutos a 37 °C.
• Se centrifugan a 1500 RPM durante 5 minutos para lavar las células K562 cargadas 3-5 veces con medio que contiene Probenecid 1 mM (Sigma P8761).
• Después del lavado final, se resuspende el sedimento celular en medio de cultivo y se ajusta hasta aproximadamente 5 * 104 células/ml.
Ensayo de citotoxicidad
• Se configuran los pocillos para detección del fondo, liberación espontánea y liberación máxima.
• Se pipetean 100 j l de células diana cargadas (5000 células) a una placa con fondo en V.
• Se añaden 100 j l de células efectoras (NK-92) de concentraciones celulares variables. La relación de efector a diana varía de 1:1 a 20:1.
• Se centrifuga la placa a 100 xg de RCF durante 1 minuto.
• Se incuba durante 2 horas en una atmósfera humidificada de un 5 % de CO2 a 37 °C. Para pocillos de liberación máxima, se añaden 10 j l de tampón de lisis a cada pocillo 15 minutos antes de recoger el medio.
• Se centrifuga la placa a 500 xg durante 5 minutos.
• Se transfieren 20 j l de sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo plano, se añaden 200 j l de solución de europio precalentada, se incuban a temperatura ambiente durante 15 minutos usando agitador de placas.
• Se mide la fluorescencia en un fluorímetro con resolución temporal usando VARIOSKAN FLASH. La liberación específica se calculó usando la siguiente fórmula:
• % de liberación específica = liberación experimental - liberación espontánea/liberación máxima - liberación espontánea
Resultados: seguimos lo anterior para determinar el efecto sobre la citotoxicidad de la atenuación de CD328. Los resultados de un experimento representativo se muestran en la figura 9. Como se observa, la citotoxicidad contra las células diana se aumentó en células con la atenuación de CD328.
Ejemplo 5 - Protocolo para tratamiento contra cáncer hemático por atenuación/inactivación de receptores inhibidores del punto de control
Como se demuestra en los ejemplos anteriores, la función del receptor inhibidor del punto de control puede atenuarse o inactivarse de una diversidad de formas. El siguiente protocolo se desarrolló para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer hemático:
Después del diagnóstico de un paciente con un cáncer tratado adecuadamente con la invención, puede descongelarse una alícuota de linfocitos NK modificados y cultivarse antes de su administración al paciente.
Como alternativa, puede prepararse una mutación transitoria usando, por ejemplo, ARNip en un día o dos, como se describe anteriormente. La plataforma de electroporación MaxCyte Flow ofrece una solución adecuada para conseguir transfecciones rápidas a gran escala en clínica.
La eliminación de determinados receptores inhibidores del punto de control puede ser más beneficiosa que de otros. Esto probablemente depende del paciente y el cáncer. Por esta razón, el cáncer opcionalmente se biopsia y las células cancerosas se cultivan en cultivoex vivo.Por tanto, puede ensayarse una serie de linfocitos NK con diferentes modificaciones del receptor inhibidor del punto de control para la citotoxicidad contra el cáncer específico. Esta etapa puede usarse para seleccionar el linfocito NK más apropiado o derivado del mismo para tratamiento.
Después de la modificación satisfactoria, las células se resuspenden en un vehículo adecuado (por ejemplo, solución salina) para inyección intravenosa y/o intratumoral en el paciente.
Ejemplo 6 - Inserción en KHYG-1 de TRAIL/variante de TRAIL
Se transfectaron células KHYG-1 tanto con TRAIL como con variante de TRAIL, para evaluar su viabilidad y capacidad de destruir células cancerosas después de transfección.
La variante de TRAIL usada es como se describe en el documento WO 2009/077857. Está codificada por el gen de TRAIL natural que contiene la mutación D269H/E195R. Esta mutación aumenta significativamente la afinidad de la variante de TRAIL por DR5, mientras reduce la afinidad por ambos receptores de señuelo (DcR1 y DcR2).
Expresión basal de TRAIL
La expresión basal de TRAIL (CD253) en células KHYG-1 se ensayó usando citometría de flujo.
Se usaron anticuerpo de ratón anti-CD253 humano-APC (número de catálogo de Biolegend: 308210) y control de isotipo (número de catálogo de Biolegend: 400122) para teñir muestras celulares y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto II.
Se cultivaron células KHYG-1 en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 mg/ml) e IL-2 (10 ng/ml). Se recogieron 0,5-1,0 * 106 células/ensayo por centrifugación (1500 rpm * 5 minutos) y se aspiró el sobrenadante. Las células (suspensión monocelular) se lavaron con 4 ml de tampón de FACS helado (PBS, BSA al 0,5-1 %, azida sódica NaN3 al 0,1 %). Las células se resuspendieron en 100 pl de tampón de FACS helado, se añadieron 5 ul de anticuerpo a cada tubo y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron 3 veces por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Las células entonces se resuspendieron en 500 pl de tampón de FACS helado y se mantuvieron temporalmente en la oscuridad en hielo.
Las células posteriormente se analizaron en el citómetro de flujo (BD FACS Canto II) y los datos generados se procesaron usando el programa informático FlowJo 7.6.2.
Como puede observarse en la figura 10, el análisis de FACS mostró expresión basal débil de TRAIL en la superficie celular de KHYG-1.
Inserción de TRAIL/variante de TRAIL por electroporación
Se sintetizó el ARNm de TRAIL natural y el ARNm de la variante de TRAIL (D269H/195R) por TriLink BioTechnologies, se dividió el alícuotas y se almacenó a -80 °C. Se usaron anticuerpo de ratón anti-CD253 humano-APC (número de catálogo de Biolegend: 308210) y control de isotipo (número de catálogo de Biolegend: 400122), y de ratón anti-CD107a humano-PE (número de catálogo de eBioscience: 12-1079-42) y control de isotipo (número de catálogo de eBioscience: 12-4714) para teñir muestras celulares y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto II. Se usó tinte de ADN SYTOX-Green (número de catálogo de Life Technologies: S7020; solución 5 mM en DMSO). Para conseguir eficacias de transfección de hasta un 90 % con alta viabilidad celular en células KHYG-1 con el dispositivo Nucleofector™ (Nucleofector II, Lonza), se usó un kit T Nucleofector™ de Lonza. Se usó RPMI 1640 sin antibióticos que contenía FBS al 10 %, L-glutamina (2 mM) e IL-2 (10 ng/ml) para cultivo tras nucleofección.
Las células KHYG-1 y NK-92 se pasaron uno o dos días después de la nucleofección, ya que las células deben estar en fase de crecimiento logarítmico. La solución de Nucleofector se precalentó hasta temperatura ambiente (100 pl por muestra), junto con una alícuota de medio de cultivo que contenía suero y complementos a 37 °C en un tubo de 50 ml. Se prepararon placas de 6 pocilios llenando con 1,5 ml de medio de cultivo que contenía suero y complementos y se preincubaron en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2. Se preparó una alícuota de cultivo celular y se contaron las células para determinar la densidad celular. Se centrifugó el número requerido de células a 1500 rpm durante 5 min, antes de descartar el sobrenadante completamente. El sedimento celular se resuspendió en solución de Nucleofector a temperatura ambiente hasta una concentración final de 2 * 106 células/100 pl (tiempo máximo en suspensión = 20 minutos). Se mezclaron 100 pl de suspensión celular con 10 pg de ARNm (volumen de ARN <10 pl). La muestra se transfirió a una cubeta certificada Amaxa (garantizando que la muestra cubría el fondo de la cubeta y evitando las burbujas de aire). Se seleccionó el programa apropiado de Nucleofector (es decir, U-001 para células KHYG-1). Las cubetas entonces se insertaron en el portacubetas. Se añadieron 500 pl de medio de cultivo precalentado a la cubeta y la muestra se transfirió a una placa de 6 pocillos preparada inmediatamente después de que hubiera acabado el programa, para evitar daños a las células. Las células se incubaron en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2. Se realizó análisis citométrico de flujo y ensayos de citotoxicidad 12-16 horas después de la electroporación. Se realizó tinción de citometría de flujo como anteriormente.
Como puede observarse e las figuras 11 y 12, la expresión de TRAIL/variante de TRAIL y CD107a (marcador de activación de los NK) aumentó tras la transfección, lo que confirma la inserción satisfactoria de los genes de TRAIL en las células KHYG-1.
La figura 13 proporciona evidencias de la viabilidad celular de KHYG-1 antes y después de la transfección mediante electroporación. Puede observarse que no se observan diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular después de la transfección de las células con TRAIL/variante de TRAIL, lo que confirma que la expresión de TRAIL natural o variante es atóxica para las células. Esta observación contradice los hallazgos correspondientes en células NK-92, que sugieren que la inserción del gen de la variante de TRAIL es tóxica para las células (datos no mostrados). No obstante, probablemente esto se explica por los niveles de expresión relativamente altos de los receptores de TRAIL D<r>4 y DR5 en la superficie celular de NK-92 (véase la figura 14).
Efectos de TRAIL/variante de TRAIL sobre la citotoxicidad celular de KHYG-1
Se usó anticuerpo de ratón anti-CD2 humano-APC (número de catálogo de BD Pharmingen: 560642). Se usó anticuerpo contra anexina V-FITC (número de catálogo de ImmunoTools: 31490013). Se usó tinte de ADN SYTOX-Green (número de catálogo de Life Technologies: S7020). Se usó placa de cultivo celular de 24 pocillos (número de catálogo de SARSTEDT AG: 83.3922). Se usaron línea celular de leucemia mielógena K562, línea celular de mieloma múltiple RPMI8226 y MM1.S como células diana. Se cultivaron K562, RPMI8226, MM1.S en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM y penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 mg/ml).
Como se explica anteriormente, se transfectaron células KHYG-1 con TRAIL/variante de TRAIL.
Las células diana se lavaron y centrifugaron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. Las células KHYG-1 transfectadas se diluyeron hasta 0,5 * 106/ml. La densidad de células diana entonces se ajustó en medio RPMI 1640 precalentado, para producir relaciones de efector:diana (E:T) de 1:1.
Entonces se mezclaron 0,5 ml de células KHYG-1 y 0,5 ml de células diana en una placa de cultivo de 24 pocillos y se pusieron en una estufa de incubación humidificada de 37 °C/5 % de CO2 durante 12 horas. Entonces se usó análisis citométrico de flujo para ensayar la citotoxicidad de las células KHYG-1; las células cocultivadas (en diferentes puntos temporales) se lavaron y después se tiñeron con anticuerpo contra CD2-APC (5 pl/ensayo), contra anexina V-FITC (5 pl/ensayo) y SYTOX-Green (5 pl/ensayo) usando tampón de unión de anexina V.
Los datos se analizaron adicionalmente usando el programa informático FlowJo 7.6.2. Se establecieron las ventanas de adquisición CD2-positiva y CD2-negativa, que representan poblaciones de células KHYG-1 y células diana, respectivamente. Las células positivas a anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población CD2-negativa se analizaron entonces para apoptosis inducida por TRAIL.
Las figuras 15, 16 y 17 muestran los efectos de células KHYG-1 que expresan TRAIL o variante de TRAIL sobre la apoptosis para las tres líneas celulares diana: K562, RPMI8226 y MM1.S, respectivamente. Es evidente para todas las poblaciones de células diana, que la expresión de TRAIL en células KHYG-1 aumentaba el nivel de apoptosis, en comparación con células KHYG-1 normales (no transfectadas con TRAIL). Además, la expresión de la variante de TRAIL sobre células KHYG-1 aumentó más la apoptosis en todas las líneas de células diana, en comparación con células KHYG-1 transfectadas con TRAIL natural.
Las células de la invención, que expresan la variante de TRAIL, ofrecen una ventaja significativa en tratamiento contra el cáncer, debido a que presentan afinidades mayores por el receptor de muerte DR5. Cuando se exponen a estas células de la invención, se evita que las células cancerosas desarrollen estrategias defensivas para esquivar la muerte mediante una determinada ruta. Por tanto, los cánceres no pueden esquivar de forma eficaz la muerte celular inducida por TRAIL al regulador por aumento los receptores de señuelo de TRAIL, ya que las células de la invención están modificadas de modo que sigan siendo citotóxicas en esas circunstancias.
Ejemplo 7 - Protocolo para tratamiento contra cáncer hemático usando linfocitos NK con variantes de TRAIL insertadas
Se transfectaron células KHYG-1 con variante de TRAIL, como se describe anteriormente en el ejemplo 6. El siguiente protocolo se desarrolló para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer hemático:
Después del diagnóstico de un paciente con un cáncer tratado adecuadamente con la invención, se administra un agente inductor de DR5, por ejemplo, Bortezomib, antes de la administración de los linfocitos NK modificados y, por tanto, se usa a bajas dosis para regular por aumento la expresión de DR5 en el cáncer, haciendo que el tratamiento con linfocitos NK modificados sea más eficaz.
Entonces se descongela una alícuota de linfocitos NK modificados, se cultiva y se administra al paciente. Como la variante de TRAIL expresada por los linfocitos NK usados en tratamiento tiene una menor afinidad por receptores de señuelo que TRAIL natural, hay unión aumentada de receptores de muerte en la superficie de las células cancerosas y, por tanto, más apoptosis de las células cancerosas como resultado.
Otra opción, antes de la implementación del protocolo anterior, es biopsiar el cáncer y cultivar las células cancerosasex vivo.Esta etapa puede usarse para identificar aquellos cánceres que expresan niveles particularmente altos de receptores de señuelo, y/o bajos niveles de receptores de muerte, para ayudar a determinar si un agente inductor de DR5 es apropiado para un paciente dado. Esta etapa también puede realizarse durante el tratamiento con el protocolo anterior, ya que un cáncer dado podría tener capacidad de adaptarse para, por ejemplo, reducir su expresión de DR5 y, por tanto, puede llegar a ser adecuado para tratamiento con un agente inductor de DR5 en algún momento del tratamiento.
Ejemplo 8 - Bortezomib a baja dosis sensibiliza las células cancerosas a los linfocitos NK que expresan variante de TRAIL
El bortezomib (Bt) es un inhibidor del proteasoma (fármaco similar a quimioterapia) útil en el tratamiento de mieloma múltiple (MM). Se sabe que el bortezomib regula por aumento la expresión de DR5 en varios tipos diferentes de células cancerosas, incluyendo células MM.
Se transfectaron células KHYG-1 con variante de TRAIL, como se describe anteriormente en el ejemplo 6 , antes de usarse para abordar células MM con o sin exposición a bortezomib.
Expresión de DR5 inducida por bortezomib
Se compró bortezomib de Millennium Pharmaceuticals. El anticuerpo de ratón anti-DR5 humano-AF647 (número de catálogo: 565498) se compró de BD Pharmingen. Las muestras celulares teñidas se analizaron en BD FACS Canto II. (1) Las líneas celulares MM RPMI8226 y MM1.S se cultivaron en medio RPMI1640 (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.) complementado con L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio 24 mM, un 0,01 % de antibióticos y un 10 % de suero fetal bovino (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.), en atmósfera de un 5 % de CO2 a 37 °C.
(2) Las células MM se sembraron en placas de 6 pocillos a 1 * 106/ml, 2 ml/pocillo.
(3) Las células MM entonces se trataron con diferentes dosis de bortezomib durante 24 horas.
(4) Entonces se analizó la expresión de DR5 en células MM tratadas con bortezomib/sin tratar por citometría de flujo (figura 18).
Se encontró que el tratamiento con bortezomib a baja dosis aumenta la expresión de DR5 en ambas líneas celulares MM (figura 18). La regulación por aumento de DR5 estaba asociada con una inducción mínima de apoptosis (datos no mostrados). Se descubrió, sin embargo, que la expresión de DR5 no podía estar regulada por aumento por dosis altas de bortezomib, debido a la alta toxicidad que provoca que la mayoría de las células MM mueran.
Sensibilización inducida por bortezomib de células cancerosas
Se transfectaron células KHYG-1 con la variante de TRAIL (TRAIL D269H/E195R), como se describe anteriormente en el ejemplo 6.
(1) Se usaron células MM1.S tratadas con bortezomib/sin tratar como células diana. Las células MM1.S se trataron con 2,5 nM de bortezomib o vehículo (control) durante 24 horas.
(2) A las 6 horas después de la electroporación del ARNm de la variante de TRAIL, las células KHYG-1 entonces se cultivaron con células MM en placa de 12 pocillos. Después del lavado, las concentraciones celulares se ajustaron hasta 1 * 106/ml, antes de mezclar las células KHYG-1 y MM1.S a una relación 1:1 para cultivarlas durante 12 horas. (3) Se realizó análisis citométrico de flujo de la citotoxicidad de las células KHYG-1. Las células cocultivadas se recogieron, se lavaron y después se tiñeron con anticuerpo contra CD2-APC (5 ul/ensayo), contra anexina V-FITC (5 ul/ensayo) y SYTOX-Green (5 ul/ensayo) usando tampón de unión de anexina V.
(4) Los datos se analizaron adicionalmente usando el programa informático FlowJo 7.6.2. La población CD2-negativa representa células MM1.S. Las células KHYG-1 son fuertemente positivas para CD2. Finalmente, se analizaron las células positivas para anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población CD2-negativa.
Se realizó análisis citométrico de flujo de la apoptosis en células MM1.S pretratadas con bortezomib/sin tratar cocultivadas con células KHYG-1 sometidas a electroporación con/sin variante de TRAIL (figura 19).
Se descubrió que el bortezomib inducía la sensibilidad de las células MM a células KHYG-1 que expresaban la variante de TRAIL. Por lo tanto, los datos indicaron que un agente que inducía la expresión de DR5 era eficaz en el modelo en aumentar la citotoxicidad contra las células cancerosas y, por tanto, puede ser útil en potenciar el tratamiento contra el cáncer de la presente invención.
Ejemplo 9 - Confirmación de la apoptosis inducida por la variante de TRAIL
A pesar de las evidencias concluyentes de citotoxicidad aumentada de los linfocitos NK resultante de la expresión de la variante de TRAIL en los ejemplos previos, deseábamos confirmar si la citotoxicidad aumentada resultaba de inducir la apoptosis de las células cancerosas (muy probablemente) o al activar involuntariamente los linfocitos NK para que presentaran un fenotipo más citotóxico y, por tanto, destruyeran las células cancerosas mediante la secreción de perforina.
Se ha demostrado que la concanamicina A (CMA) inhibe la actividad citotóxica mediada por perforina de los linfocitos NK, principalmente debido a degradación acelerada de la perforina mediante un aumento en el pH de los gránulos líticos. Investigamos si la citotoxicidad de las células KHYG-1 que expresan la variante de TRAIL podría resaltarse cuando se anulara parcialmente la citotoxicidad mediada por perforina con CMA.
Reducción inducida por CMA de la expresión de perforina
El anticuerpo de ratón antiperforina humana-AF647 (número de catálogo: 563576) se compró de BD Pharmingen. La concanamicina A (número de catálogo: SC-202111) se compró de Santa Cruz Biotechnology. Las muestras celulares teñidas se analizaron usando un BD FACS Canto II.
(1) Se cultivaron células KHYG-1 en medio RPMI1640 que contenía FBS (suero fetal bovino) al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml)/estreptomicina (100 mg/ml) e IL-2 (10 ng/ml).
(2) Las células KHYG-1 (6 horas después de la electroporación, cultivadas en medio RPMI1640 sin penicilina/estreptomicina) se trataron adicionalmente con CMA 100 nM o un volumen igual de vehículo (DMSO) durante 2 horas.
(3) Las células se recogieron (1 * 106 células/ensayo) por centrifugación (1500 rpm * 5 minutos) y se aspiró el sobrenadante.
(4) Las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % en solución de PBS a temperatura ambiente durante 15 minutos. (5) Las células se lavaron con 4 ml de tampón de FACS (PBS, BSA al 0,5-1 %, azida sódica al 0,1 %) dos veces. (6) Las células se permeabilizaron con 1 ml de PBS/tampón de saponina al 0,1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente.
(7) Las células se lavaron con 4 ml de PBS/tampón de saponina al 0,1 %.
(8) Las células se resuspendieron en 100 ul de PBS/tampón de saponina al 0,1 %, antes de añadir 5 ul del anticuerpo a cada tubo e incubar durante 30 minutos en hielo.
(9) Las células se lavaron con PBS/tampón de saponina al 0,1 % 3 veces por centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos.
(10) Las células se resuspendieron en 500 ul de tampón de FACS helado y se mantuvieron en la oscuridad en hielo o a 4 °C en un frigorífico brevemente hasta el análisis.
(11) Las células se analizaron en el citómetro de flujo (BD FACS Canto II). Los datos se procesaron usando el programa informático FlowJo 7.6.2.
El tratamiento con CMA disminuyó significativamente el nivel de expresión de perforina en las células KHYG-1 (figura 20) y no tuvo efectos negativos sobre la viabilidad de las células KHYG-1 (figura 21).
Citotoxicidad de variantes de TRAIL en linfocitos NK en presencia de CMA
Se transfectaron células KHYG-1 con la variante de TRAIL (TRAIL D269H/E195R), como se describe anteriormente en el ejemplo 6.
(1) Se usaron células MM1.S como células diana.
(2) A las 6 horas después de la electroporación del ARNm de TRAIL, las células KHYG-1 se trataron con CMA 100 mM o un volumen igual de vehículo durante 2 horas.
(3) Las células KHYG-1 se lavaron con medio RPMI1640 por centrifugación, y resuspendieron en medio RPMI1640 que contenía IL-2, ajustando las concentraciones celulares hasta 1 * 106/ml.
(4) Las células MM1.S se resuspendieron en medio RPMI1640 que contenía IL-2 ajustando las concentraciones celulares hasta 1 * 106/ml.
(5) Las células KHYG-1 y MM1.S se mezclaron a una relación 1:1 y se cocultivaron durante 12 horas.
(6) Se realizó análisis citométrico de flujo de la citotoxicidad de las células KHYG-1. Las células cocultivadas se lavaron y tiñeron con anticuerpo contra CD2-APC (5 ul/ensayo).
(7) Después del lavado, se realizó tinción adicional con anexina V-FITC (5 ul/ensayo) y SYTOX-Green (5 ul/ensayo) usando tampón de unión de anexina V.
(8) Los datos se analizaron adicionalmente usando el programa informático FlowJo 7.6.2. La población CD2-negativa representa células MM1.S. Las células KHYG-1 son fuertemente positivas para CD2. Entonces se analizaron las células positivas para anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población CD2-negativa.
De nuevo se mostró que los linfocitos NK que expresan la variante de TRAIL muestran mayor citotoxicidad que las células de control que carecen de expresión de la variante de TRAIL (figura 22). En este ejemplo, sin embargo, se mostró además que la CMA no podía disminuir significativamente la actividad citotóxica de los linfocitos NK que expresan la variante de TRAIL, en contraste con el hallazgo para los linfocitos NK de control tratados con CMA.
Se mostró que los linfocitos NK son la variante de TRAIL (linfocitos NK de control o simulados) inducen un 48 % de muerte de las células cancerosas en ausencia de CMA y un 35,9 % de muerte de las células cancerosas en presencia de CMA (figura 22). Los linfocitos NK que expresan la variante de TRAIL pudieron inducir más muerte de las células cancerosas que los linfocitos NK de control tanto en presencia como en ausencia de CMA. De hecho, incluso con CMA presente, los linfocitos NK que expresan variante de TRAIL indujeron más muerte de las células cancerosas que los linfocitos NK de control en ausencia de CMA.
Por tanto, estos datos muestran la importancia de la variante de TRAIL en el aumento de la citotoxicidad de los linfocitos NK contra células cancerosas mediante un mecanismo menos susceptible a regulación por disminución relacionada con perforina. Como la perforina se usa normalmente por los linfocitos NK para destruir células diana, y muchas células cancerosas han desarrollado mecanismos para reducir la expresión de perforina en los linfocitos NK, para evadir el ataque citotóxico, los linfocitos NK de la invención representan una alternativa poderosa menos susceptible a atenuación por parte de las células cancerosas.
Ejemplo 10 - Expresión combinada de variante de TRAIL mutante y atenuación del receptor inhibidor del punto de control CD96 en células KHYG-1
Se observaron aumentos en la citotoxicidad de los linfocitos NK cuando se atenuaba la expresión del receptor inhibidor del punto de control CD96 y también cuando se expresaba la variante de TRAIL. También se ensayó combinar las dos modificaciones genéticas para provocar un efecto sinérgico sobre la citotoxicidad de los linfocitos NK.
La expresión de CD96 se atenuó en las células KHYG-1, como se describe en el ejemplo 2.
Se transfectaron células KHYG-1 con la variante de TRAIL (TRAIL D269H/E195R), como se describe anteriormente en el ejemplo 6.
(1) A las 12 horas después de la electroporación, las células KHYG-1 se cocultivaron con células diana (K562 o MM1.S) a una concentración de 1 * 106/ml en placas de 12 pocillos (2 ml/pocillo) durante 12 horas. La relación de E:T fue 1:1. (2) A las 12 horas después del cocultivo, las células se recogieron, se lavaron, se tiñeron con CD2-APC, se lavaron de nuevo y se tiñeron adicionalmente con anexina V-FITC (5 ul/ensayo) y SYTOX-Green (5 ul/ensayo) usando tampón de unión de anexina V.
(3) Las muestras celulares se analizaron usando un citómetro de flujo BD FACS canto II. Los datos se analizaron adicionalmente usando el programa informático FlowJo 7.6.2. La población CD2-negativa representa células MM1.S. Las células KHYG-1 son fuertemente positivas para CD2. Entonces se analizaron las células positivas para anexina V-FITC y SYTOX-Green en la población CD2-negativa.
Se descubrió que atenuar la expresión de CD96 y simultáneamente expresar la variante de TRAIL en células KHYG-1 potenciaba sinérgicamente la citotoxicidad de las células contra células diana K562 (figura 23) y también contra células diana MM1.S (figura 24). Esto se indicó por el hecho de que en ambos grupos de células diana, se producía más muerte celular a partir de la modificación genética simultánea que la se producía a partir de las modificaciones individuales en aislamiento.
Al mismo tiempo, se obtuvieron más evidencias que muestra que la atenuación de CD96 aumenta la citotoxicidad de los linfocitos NK (figura 23 y 24), además de más evidencias que muestran que la expresión del mutante/variante de TRAIL aumenta la citotoxicidad de los linfocitos NK (figura 23 y 24).
Por tanto, la invención proporciona linfocitos NK para su uso en tratamiento contra cáncer hemático.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un linfocito citolítico natural (NK) humano, que no es una línea celular NK, para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde el linfocito NK se ha modificado genéticamente para inactivar la expresión de CD279 (PD-1) y/o TIGIT.
2. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es un cáncer hemático.
3. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el cáncer hemático es leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, incluyendo linfomas de linfocitos T y linfomas de linfocitos B, mieloma asintomático, mieloma múltiple asintomático (SMM), mieloma activo o mieloma de cadena ligera.
4. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además una modificación para expresar IL-2 o IL-15.
5. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además una modificación para expresar fucosiltransferasa o sialiltransferasa.
6. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además una modificación para expresar una variante de TRAIL.
7. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad aumentada, con respecto a TRAIL natural, por receptores de TRAIL, por ejemplo, DR4 y/o DR5.
8. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde la variante de TRAIL tiene una afinidad reducida, con respecto a TRAIL natural, por receptores de señuelo de TRAIL.
9. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además una modificación para expresar un receptor quimérico de antígeno (CAR).
10. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el CAR se une específicamente a uno o más ligandos en células cancerosas.
11. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el CAR se une a CD38.
12. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el CAR se une a CLL-1.
13. Un linfocito NK humano para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el CAR se une a CS1 (SLAMF7).
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