ES2970282T3 - Potenciador de células T o células B que tienen función memoria, inhibidor de la recurrencia de tumores malignos e inductor para inducir la función memoria en células T o células B - Google Patents

Potenciador de células T o células B que tienen función memoria, inhibidor de la recurrencia de tumores malignos e inductor para inducir la función memoria en células T o células B Download PDF

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Koji Tamada
Yukimi Sakoda
Keishi Adachi
Takafumi Nakamura
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Yamaguchi University NUC
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Tottori University NUC
Yamaguchi University NUC
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Abstract

El objetivo de la presente invención es proporcionar, para continuar el rechazo de tumores malignos durante un largo período de tiempo, un potenciador de células T o células B endógenas que tienen una función de memoria y un inhibidor de la recurrencia de tumores malignos. La presente invención implica preparar: un potenciador para células T o células B que tienen una función de memoria, incluyendo dicho potenciador un medio de transporte de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica la interleucina 7 (IL-7) y un ácido nucleico que codifica una quimiocina (CC motivo) ligando 19 (CCL 19); un inductor que induce la función de memoria en las células T o B en un sujeto; y un inhibidor de la recurrencia de tumores malignos que incluye un medio de transporte de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica la interleucina 7 (IL-7) y un ácido nucleico que codifica CCL19. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Potenciador de células T o células B que tienen función memoria, inhibidor de la recurrencia de tumores malignos e inductor para inducir la función memoria en células T o células B
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición que comprende y composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica la interleucina-7 (IL-7) y un ácido nucleico que codifica el ligando 19 de quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para su uso en la inhibición de la recurrencia de un tumor maligno, en donde el vehículo de administración de ácido nucleico es una célula inmunitaria que tiene una molécula de superficie celular que reconoce un antígeno de célula tumoral maligna, y la recurrencia del tumor maligno es una recurrencia de tumor maligno atribuible a una célula tumoral maligna que no tiene antígeno de tumor maligno que se reconoce específicamente por la molécula de la superficie celular.
Antecedentes de la técnica
La patente internacional WO 2016/056228 A1 describe el vector de expresión CAR y las células T que expresan CAR.
La patente internacional WO 2017/159736 A1 describe células inmunocompetentes y vectores de expresión que expresan factores reguladores de la función inmunológica.
Zhang Y et al., Clin Cáncer Res. 1 de agosto de 2011; 17 (15): 4975-86 describe cómo la interleucina-7 inhibe las células T supresoras CD27-CD28 inducidas por tumores y las implicaciones para la inmunoterapia contra el cáncer.
El tumor maligno es una enfermedad que afecta a muchas personas en todo el mundo. En general, se practica ampliamente para ello quimioterapia, radioterapia o terapia quirúrgica. Sin embargo, ha habido varios problemas como la aparición de reacciones adversas, pérdida de algunas funciones y la irremediabilidad de la recurrencia o metástasis. En consecuencia, en los últimos años se ha puesto en marcha el desarrollo de la terapia con células inmunitarias para mantener alta la calidad de vida (QOL) de los pacientes. Esta terapia de células inmunitarias es una terapia que implica recolectar células inmunitarias de un paciente, tratar las células inmunitarias para mejorar su función inmunitaria, amplificar las células y transferir las células al paciente nuevamente. Específicamente, se conoce un método que implica recolectar células T de un paciente, introducir un ácido nucleico que codifica CAR en las células T, amplificar las células T y transferir las células T nuevamente al paciente (véase documento no de patente 1). Esta terapia se encuentra actualmente en ensayo clínico en todo el mundo y ha producido resultados que indican eficacia para tumores malignos hematopoyéticos como la leucemia o el linfoma.
Al menos varios cientos de tipos de factores tales como citocinas, quimiocinas y proteínas reguladoras de señales, se conocen como factores de control de la función inmunitaria de células inmunitarias tales como las células T. Entre ellas, la interleucina-7 (IL-7) es una citocina esencial para la supervivencia de las células T y se sabe que se produce por células no hematopoyéticas como las células estromales de la médula ósea, el timo y los órganos o tejidos linfoides. Las células T que expresan un receptor de citocina quimérico de IL-7 e IL-7R alfa fusionados entre sí (véase el documento de patente 1) se describen como células T que explotan la función de esta IL-7. Sin embargo, el receptor de citocina quimérico en estas células T se expresa como una proteína de fusión de una manera limitada a la superficie de la membrana de las células T que albergan el receptor de citocina quimérico, y simplemente transduce señales de citocina de IL-7R o similares a la auto-células de manera independiente del ligando. Por lo tanto, el receptor de citocina quimérico no ha logrado mejorar la función de las células T que no albergan el receptor.
Otras descripciones establecen que la expresión disminuida de CCL19, CCL21 o IL-7 es responsable del mantenimiento defectuoso de una zona de células T en los bazos de ratones mutantes SIRP alfa (véase el documento no de patente 2) y que CCL19, CCL21 o IL-7 actúa para mantener la homeostasis de las células T en los tejidos linfoides secundarios (bazo o ganglio linfático) (véase el documento no de patente 3). Sin embargo, estos documentos no de patente 2 y 3 muestran acción sobre células T no activadas que residen constantemente en las zonas de células T de los tejidos linfoides secundarios, y no muestran relación directa con la respuesta inmunitaria antitumoral. Además, las células que expresan CCL19, CCL21 o IL-7 en los documentos que no son de patente 2 y 3 son células del sistema reticuloendotelial, no células T, que residen en tejidos linfoides secundarios.
Mientras tanto, los presentes inventores han propuesto una terapia con células inmunitarias para suprimir notablemente el cáncer sólido mediante la coexpresión de IL-7 y CCL19 (véanse los documentos de patente 2 y 3). Este método puede mejorar la activación de células inmunitarias endógenas o su capacidad para acumularse en células tumorales en un huésped (receptor). Sin embargo, no está claro si la terapia con células inmunitarias puede prevenir la recurrencia, etc. durante un largo período de tiempo y continuar rechazando tumores malignos.
Documentos de la técnica anterior
Documentos de patente
Documento de patente 1: Publicación Internacional Núm. WO 2013/123061
Documento de patente 2: Publicación Internacional Núm. WO 2016/056228
Documento de patente 3: Publicación Internacional Núm. WO 2017/159736
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Yozo Nakazawa, The Shinshu Medical Journal, 61 (4): 197-203 (2013)
Documento no de patente 2: SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol. 187, núm. 1,291-7
Documento no de patente 3: SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol. 3, artículo 285
Documento no de patente 4: ZHANG Y et al., Clin Cancer Res. 2011, Volumen 17, núm. 15, 4975-86
Compendio de la invención
La presente invención proporciona una composición que comprende un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica la interleucina-7 (IL-7) y un ácido nucleico que codifica el ligando 19 de quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para su uso en la inhibición de la recurrencia de un tumor maligno, en donde el vehículo de administración de ácido nucleico es una célula inmunitaria que tiene una molécula de superficie celular que reconoce un antígeno de célula tumoral maligna, y la recurrencia del tumor maligno es una recurrencia del tumor maligno atribuible a una célula tumoral maligna que no tiene ningún antígeno del tumor maligno que sea reconocido específicamente por la molécula de la superficie celular.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición para uso según la invención, en donde la composición comprende un aditivo farmacéuticamente aceptable.
Objeto a resolver por la invención
Como se mencionó anteriormente, se ha desarrollado una terapia de células inmunitarias usando células T que expresan CAR, células T que expresan TCR o similares, que coexpresan IL-7 y CCL19, y está en marcha el desarrollo de técnicas para mejorar notablemente la capacidad de las células inmunitarias para proliferar, la capacidad de sobrevivir o la capacidad de las células inmunitarias del huésped para acumularse y que son adaptables a cánceres sólidos en donde se ha descubierto que la terapia con células inmunitarias convencionales no tiene suficiente efecto terapéutico. Sin embargo, el tumor maligno suele reaparecer. No está claro si la terapia con células inmunitarias continúa o no rechazando el tumor maligno durante un largo período de tiempo, incluso si el tumor maligno puede tratarse temporalmente. Además, no se han discutido medidas preventivas contra la recurrencia. Por consiguiente, un objeto de la descripción es describir un potenciador para células T o células B endógenas que tienen una función de memoria, un inhibidor de la recurrencia de tumores malignos y un inductor para inducir una función de memoria en células T o células B endógenas para continuar rechazando tumores malignos durante un largo período de tiempo.
Medios para resolver el objeto
Los presentes inventores han estudiado las posibilidades adicionales de las células T previamente desarrolladas que expresan CAR, IL-7 y CCL19 y en consecuencia encontraron que: la administración de las células T a un sujeto induce una función de memoria no sólo en las células T administradas sino en las células T endógenas del sujeto (huésped) y aumenta el número absoluto de células que tienen una función de memoria; y en un experimento modelo de recurrencia del tumor maligno, esta administración suprime la formación de tumores malignos en células que no tienen antígeno que se reconozca por CAR. Los presentes inventores han descubierto además que el uso de TCR en lugar de CAR o el uso de un virus en lugar de células T también produce efectos similares. Sobre la base de estos hallazgos, se ha completado la presente invención.
Efecto de la invención
Una composición que comprende un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica la interleucina-7 (IL-7) y un ácido nucleico que codifica el ligando 19 de quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para usar en la inhibición de la recurrencia de tumores malignos permite la inhibición de la recurrencia de tumores malignos después del tratamiento.
Efecto de la descripción
El uso del potenciador para células T o células B que tienen una función de memoria como se describe en la presente memoria permite la mejora en células T o células B que tienen una función de memoria en un sujeto de administración.
El uso del inhibidor de la recurrencia de tumores malignos como se describe en la presente memoria permite la inhibición de la recurrencia de tumores malignos después del tratamiento.
El uso del inductor para inducir una función de memoria en células T o células B como se describe en la presente memoria permite la inducción de una función de memoria en células T o células B en un sujeto de administración.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La Figura 1(a) es un diagrama que muestra los resultados sobre el Ejemplo 1 en donde se observó la localización de células T en tejidos tumorales malignos bajo un microscopio mediante tinción con un anticuerpo marcado. La Figura 1(b) es un gráfico que muestra las áreas (gm2) de células T del donante administradas y células T endógenas de un receptor mediante el procesamiento del análisis de imágenes de los resultados observados en la Figura 1 (a).
[Figura 2] La Figura 2 es un gráfico de volúmenes tumorales malignos (mm3) examinados el día 14 después de la administración cuando se administraron a ratones células T anti-CD20 humano que expresan CAR-IL-7/CCL19 (7 x 19) o un anticuerpo anti-CD90.2 (anti-CD90.2) junto con las células T en el Ejemplo 2.
[Figura 3] La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 3 en donde se examinaron las células T del donante administradas y las células T endógenas de un receptor para determinar su potencial de memoria.
[Figura 4] La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 3 en donde se examinaron las células T del donante administradas y las células T endógenas de un receptor para determinar su función de potencial de<memoria mediante la producción de>IFN-<y>.<La Figura 4 (a) muestra la relación de células positivas para>IFN-<y a células>T del donante positivas para CD90.1. La Figura 4 (b) muestra los resultados de la detección de células positivas para IFN-<y en células T positivas para CD90.2 y positivas para CD8 endógenas mediante citometría de flujo.>
[Figura 5A] La Figura 5A es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) antes del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena a: antes del tratamiento, CAR-positivo).
[Figura 5B] La Figura 5B es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) antes del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena a: antes del tratamiento, CAR-negativo).
[Figura 5C] La Figura 5C es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) después del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena a: después del tratamiento, CAR-positivo).
[Figura 5D] La Figura 5D es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) después del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena a: después del tratamiento, CAR-negativo).
[Figura 6A] La Figura 6A es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) antes del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena p: antes del tratamiento, CAR-positivo).
[Figura 6B] La Figura 6B es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) antes del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena p: antes del tratamiento, CAR-negativo).
[Figura 6C] La Figura 6C es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) después del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena p: después del tratamiento, CAR-positivo).
[Figura 6D] La Figura 6D es un gráfico que muestra los resultados sobre el Ejemplo 4 en donde se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) después del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 (cadena p: después del tratamiento, CAR-negativo).
[Figura 7A] La Figura 7A es un diagrama que muestra los resultados de la medición de volúmenes tumorales en el Ejemplo 5 en donde se inoculó P815-hCD20 o la línea parental P815 que no expresa hCD20 en cada una de las regiones laterales derecha e izquierda de los abdómenes de ratones con tumor rechazado o ratones sin tratamiento previo de control el día 140 después de la inoculación de P815-hCD20.
[Figura 7B] La Figura 7B es un diagrama que muestra los resultados de la medición de volúmenes tumorales en el Ejemplo 5 en donde se inoculó 3LL-hCD20 o la línea parental 3LL que no expresa hCD20 en cada una de las regiones laterales derecha e izquierda de los abdómenes de ratones con tumor rechazado o ratones sin tratamiento previo de control el día 140 después de la inoculación de 3LL-hCD20.
[Figura 8] La Figura 8 es un diagrama que muestra un protocolo experimental para confirmar un efecto inhibidor de la recurrencia del tumor en el Ejemplo 6.
[Figura 9A] La Figura 9A es un diagrama que muestra los resultados sobre el Ejemplo 6 en donde después de la administración de ACC-MESO1-GFP-Luc mencionado más adelante, los ratones de los días 1, 3, 7, 10, 14, 21, 31 y 38 en un grupo que recibió células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 de anti-mesotelina humana (7 x 19 CAR-T) y un grupo que recibió células T que expresan CAR de anti-mesotelina humana convencional (CAR-T convencional) el día 1 fueron fotografiados durante un tiempo de exposición de 30 segundos.
[Figura 9B] La Figura 9B es un diagrama que muestra los resultados sobre el Ejemplo 6 en donde después de la administración de ACC-MESO1 -GFP-Luc mencionado más adelante, los ratones de los días 45, 59, 73, 87, 101, 115, 129 y 143 en un grupo que recibió células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 de anti-mesotelina humana (7 x 19 CAR-T) y un grupo que recibió células T que expresan CAR de anti-mesotelina humana convencional (CAR-T convencional) el día 1 fueron fotografiados durante un tiempo de exposición de 30 segundos. El segundo individuo contado desde la izquierda el día 129 estaba muerto, por lo que se omite su fotografía.
[Figura 10] La Figura 10 es un gráfico que muestra la relación entre el número de días desde la administración de ACC-MESO1-GFP-Luc mencionado más adelante y las tasas de supervivencia de los ratones en el Ejemplo 6.
[Figura 11] La Figura 11 es un gráfico que muestra la relación entre el número de días desde la administración de ACC-MESO1 -GFP-Luc mencionado más adelante y la cantidad total de fluorescencia en el Ejemplo 6.
[Figura 12] La Figura 12(a) es un diagrama que muestra los resultados sobre el Ejemplo 7 en donde la relación de células CD8+GFP+ a las células del bazo se analizaron mediante citometría de flujo. La Figura 12(b) es un diagrama que muestra los resultados sobre el Ejemplo 7 en donde el número absoluto de células CD8+GFP+ se analizó mediante citometría de flujo.
[Figura 13] La Figura 13(a) es un diagrama que muestra el número de células CD44+ en células del bazo CD8+ de ratones b Da /2 sin tratamiento previo y células del bazo CD8+GFP- o CD8+GFP+ de ratones tratados con células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A en el Ejemplo 7. La Figura 13(b) es un diagrama que muestra la relación de células CD44+ en la Figura 13 (a).
[Figura 14] La Figura 14 es un diagrama que muestra los resultados del Ejemplo 7 en donde después del cocultivo durante aproximadamente 5 días con mastocitos mucosos (MMC) tratados con P815, se detectó mediante ELISA la concentración de IFN-<y>en un sobrenadante del medio de cultivo (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas).
[Figura 15] La Figura 15(a) es un diagrama que muestra la estructura del virus vaccinia genéticamente recombinante LC16mO TK-SP-ratón IL-7-F2A-ratón CCL19-F2A-eGFP (TK-ICE) en el Ejemplo 8. La Figura 15(b) es un diagrama que muestra la estructura del virus vaccinia genéticamente recombinante LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP (TK-LE) en el Ejemplo 8.
[Figura 16] La Figura 16 es un diagrama que muestra imágenes de observación de la relación entre el efecto citopático del virus vaccinia genéticamente recombinante TK-ICE o TK-LE en células A549 y células CT26 infectadas con el virus vaccinia, y la emisión de fluorescencia de eGFP en el Ejemplo 8.
[Figura 17] La Figura 17 es un diagrama que muestra los resultados del examen de las cantidades de IL-7 y CCL19 secretadas en células A549 o células CT26 infectadas con el virus vaccinia genéticamente recombinante TK-ICE o TK-LE en el Ejemplo 8.
[Figura 18] La Figura 18 es un diagrama que muestra conceptualmente el trasplante subcutáneo de células CT26 de cáncer de intestino grueso de ratón a las partes abdominales derecha e izquierda de un ratón en el Ejemplo 8.
[Figura 19] La Figura 19 es un diagrama que muestra el cambio de transición en el tamaño del tumor (mm3) después de la administración intratumoral del virus vaccinia genéticamente recombinante TK-ICE o TK-LE a modelos de ratón BALB/c trasplantados de tumor bilateralmente por vía subcutánea obtenidos usando células cancerosas de intestino grueso de ratón CT26 en el Ejemplo 9.
Descripción detallada
En la presente memoria descriptiva, el "potenciador para células T o células B que tienen una función de memoria" no está particularmente limitado siempre que el potenciador comprenda un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifique IL-7 y un ácido nucleico que codifique CCL19. Este potenciador permite la mejora de las células T o las células B que tienen una función de memoria. En la presente memoria descriptiva, el "inductor para inducir una función de memoria en células T o células B" no está particularmente limitado siempre que el inductor comprenda un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifique IL-7 y un ácido nucleico que codifique CCL19. Este inductor permite la inducción de una función de memoria en las células T o las células B. De aquí en adelante, en la presente memoria descriptiva, el "potenciador para células T o células B que tienen una función de memoria" y el "inductor para inducir una función de memoria en células T o células B" también se denominan colectivamente como el "presente potenciador o inductor".
En la presente memoria descriptiva, el "inhibidor de la recurrencia de tumores malignos" no está particularmente limitado siempre que el inhibidor de la recurrencia de tumores malignos comprenda un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifique IL-7 y un ácido nucleico que codifique CCL19. Este inhibidor de la recurrencia de tumores malignos permite la inhibición de la recurrencia de tumores malignos. De aquí en adelante, en la presente memoria descriptiva, el "inhibidor de la recurrencia de tumores malignos" también se denomina como "inhibidor de la recurrencia de tumores malignos presentes".
Los ejemplos preferidos del ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 pueden incluir un ácido nucleico de origen humano. Cada uno de estos ácidos nucleicos puede seleccionarse apropiadamente según el tipo de células a introducir. La información de secuencia de cada uno de los ácidos nucleicos se puede recuperar apropiadamente de un documento conocido en la técnica o de una base de datos como NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/). Los ejemplos del ácido nucleico que codifica IL-7 pueden incluir la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, preferiblemente 85 % o más, más preferiblemente 90 % o más, más preferiblemente 95 % o más, lo más preferiblemente 98 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 1 se puede usar siempre que la IL-7 resultante tenga la acción de aumentar una tasa de proliferación celular o una tasa de supervivencia celular. Los ejemplos del ácido nucleico que codifica CCL19 pueden incluir la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos presentad en SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene 80 % o más, preferiblemente 85 % o más, más preferiblemente 90 % o más, más preferiblemente 95 % o más, lo más preferiblemente 98 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 2 se puede usar siempre que la CCL19 resultante tenga la acción de las células migratorias. La acción de aumentar la tasa de proliferación celular o la tasa de supervivencia celular mediante IL-7 y la acción de las células migratorias mediante CCL19 se pueden confirmar mediante métodos descritos en el documento de patente 2.
En la presente memoria descriptiva, el término "identidad" significa el grado de similitud de secuencia de polipéptido o polinucleótido (que se determina mediante la coincidencia de una secuencia de consulta con otra secuencia, preferiblemente, del mismo tipo (secuencia de ácido nucleico o proteína)). Los ejemplos preferidos del método de programa informático para calcular y determinar la "identidad" pueden incluir GCG BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineación local) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402; y Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12: 387), BLASTN 2.0 (Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996 2002), FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 2444-2448), y GCG GelMerge, que implica determinar y alinear un par de cóntigos con la superposición más larga (Wibur y Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44: 557-567; y Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453).
El ácido nucleico que codifica IL-7 y/o el ácido nucleico que codifica CCL19 se puede incorporar en un vector que contiene una secuencia de control tal como un promotor o un terminador, y una secuencia marcadora selectiva tal como un gen de resistencia a fármacos o un gen reportero. El vector puede contener además un ácido nucleico que codifica un gen suicida, o un ácido nucleico que codifica un péptido 2A o IRES. El vector, el ácido nucleico que codifica el gen suicida y el ácido nucleico que codifica el péptido 2A o IRES se pueden obtener o preparar con referencia a los documentos de patente 2 y 3. Los ejemplos del promotor pueden incluir el promotor del gen IE (inmediato temprano) del citomegalovirus (CMV), promotor temprano de SV40, promotor de retrovirus, promotor de metalotioneína, promotor de choque térmico, promotor de SRa, promotor de NFAT y promotor de HIF. Los ejemplos del vector pueden incluir un vector de retrovirus tal como el vector pMSGV (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) y el vector pMSCV (fabricado por Takara Bio Inc.), y un vector derivado de cualquiera de estos vectores.
Un ácido nucleico que codifica un factor de control de la función inmunitaria adicional tal como IL-15, CCL21, IL-2, IL-4, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, IP-10, CCL4, Flt3L, interferón-Y, MIP-1a, GM-CSF, M-CSF, TGF-p, TNF-a, un anticuerpo inhibidor de punto de control o un fragmento del mismo pueden estar contenidos junto con el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19. Sin embargo, el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, incluso libre del ácido nucleico que codifica el factor de control de la función inmunitaria adicional, puede ejercer suficientemente un efecto como el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos siempre que el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos contiene al menos el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 como ácidos nucleicos que codifican factores de control de la función inmunitaria.
Por "función de memoria" se entiende una función que activa de forma más rápida y fuerte de células T o células B que previamente han experimentado estimulación con un antígeno tumoral y vuelven a entrar en contacto con células tumorales malignas, en comparación con células T sin contacto previo o células B sin contacto previo, sin estimulación previa con el antígeno tumoral, y permitiendo así que las células T o las células B ejerzan una función inmunitaria elevada frente a las células tumorales malignas. Ejemplos de células T o células B que tienen una función de memoria pueden incluir células T de memoria central y células B de memoria. Estas células T o células B que tienen una función de memoria se pueden confirmar evaluando exhaustivamente la positividad/negatividad (+/-) o la intensidad de expresión de cada uno de CD44, CD62L y CD127 (IL-7R). La molécula de CD a medir se puede seleccionar apropiadamente según un sujeto tal como un ser humano o un ratón. De aquí en adelante, en la presente memoria descriptiva, la positividad y la negatividad también se describen como "+" y "-", respectivamente.
El "aumento de células T o células B que tienen una función de memoria" significa el aumento en la relación de células T o células B que tienen una función de memoria, el aumento en el número absoluto de células T o células B que tienen una función de memoria, o la mejora en la función de memoria por célula de las células T o células B que tienen una función de memoria, en una población de células que incluye las células T o las células B que tienen una función de memoria.
La "inducción de una función de memoria en células T o células B" significa la inducción de células T sin contacto previo o células B sin contacto previo para tener una función de memoria adquiriendo memoria inmunitaria en respuesta a la estimulación con un antígeno tumoral, la inducción de células T o células B que ya tienen una función de memoria para tener una función de memoria mayor, y el aumento en el número de células T o células B que ya tienen una función de memoria.in vivo,en una población de células que incluye las células T sin contacto previo o las células B sin contacto previo. Ejemplos específicos de los mismos pueden incluir la inducción de células T sin contacto previo en células T de memoria central.
Los ejemplos preferidos del sujeto de administración pueden incluir un mamífero y células de mamífero. Entre los mamíferos, ejemplos más preferidos de los mismos pueden incluir un ser humano, un ratón, un perro, una rata, una cobaya, un conejo, un pájaro, una oveja, un cerdo, un ganado vacuno, un caballo, un gato, un mono, y un chimpancé, de manera especialmente preferida un ser humano.
El "vehículo de administración de ácido nucleico" puede ser al menos un miembro seleccionado de una célula inmunitaria, un virus, un anaerobio, un liposoma, una célula madre mesenquimal (MSC) y una nanopartícula, dos o más de las cuales pueden mezclarse y usarse.
En este contexto, la célula inmune no está particularmente limitada siempre que la célula esté involucrada en la respuesta inmunitaria y pueda expresar IL-7 y CCL19 mediante la introducción del ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19. Se prefiere una célula inmunitaria separada (recogida) de un cuerpo vivo. Los ejemplos de los mismos pueden incluir una forma separada de una célula de linaje linfoide tal como una célula T, una célula asesina natural (célula NK) y una célula B, una célula presentadora de antígeno tal como un monocito, un macrófago y una célula dendrítica, o un granulocito tal como un neutrófilo, un eosinófilo, un basófilo y un mastocito, y puede incluir preferiblemente una célula T separada de un mamífero tal como un ser humano, un perro, un gato, un cerdo o un ratón, preferiblemente una célula T separada de un ser humano. Las células T separadas pueden incluir adicionalmente células distintas de las células T y pueden incluir las células T en una proporción del 50 % o más, preferiblemente del 60 % o más, más preferiblemente del 70 % o más, aún más preferiblemente del 80 % o más, lo más preferiblemente 90 % o más. Las células T se pueden obtener separando una población de células que incluye la célula inmunitaria de un fluido corporal tal como sangre o líquido de médula ósea, un tejido tal como el tejido del bazo, un tejido tímico o un ganglio linfático, o células inmunitarias que se infiltran en un tejido canceroso tal como tumor primario, tumor metastásico o ascitis cancerosa. Para elevar la relación de células T incluidas en la población celular, la población celular así separada puede someterse adicionalmente a aislamiento o purificación, si es necesario, mediante un método estándar para obtener las células T. Alternativamente, se pueden utilizar células T preparadas a partir de células ES o células iPS. Ejemplos de células T de este tipo pueden incluir una célula T alfa-beta, una célula T gamma-delta, una célula T CD8+, una célula T CD4+, una célula T infiltrante de tumor, una célula T de memoria, una célula T sin contacto previo y una célula T NK. El origen de la célula inmunitaria y el sujeto de administración pueden ser el mismo o diferentes y preferiblemente es el mismo. Cuando el sujeto de la administración es un ser humano, se puede usar como célula inmunitaria una célula autóloga recolectada de un paciente como sujeto de la administración, o una célula alogénica recolectada de otra persona. Específicamente, el donante y el receptor pueden ser el mismo o diferentes y preferiblemente son el mismo.
El virus no está particularmente limitado siempre que el virus pueda encerrar el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y sea capaz de infectar células tumorales malignas. Se prefiere un virus oncolítico. El virus oncolítico significa un virus que rara vez prolifera tras la infección en células normales, pero prolifera tras la infección en células tumorales malignas y tiene la capacidad de destruir las células tumorales malignas (citotoxicidad frente a células tumorales malignas). El virus oncolítico se revisa, por ejemplo, en Molecular Therapy, vol. 18, núm. 2, febrero de 2010, p. 233-234. Este virus oncolítico no está particularmente limitado siempre que el virus oncolítico tenga la capacidad de matar células tumorales malignas infectando las células tumorales malignas. Los ejemplos de los mismos pueden incluir virus vaccinia oncolítico, adenovirus oncolítico, virus del herpes simple oncolítico, reovirus oncolítico, virus del sarampión oncolítico, virus de la enfermedad de Newcastle oncolítico, virus de la viruela vacuna oncolítica, virus de las paperas oncolítico y virus de coxsackie oncolítico. Los ejemplos del virus vaccinia oncolítico que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un virus descrito en Kim MK et al., Science Translational Medicine.
15 de mayo de 2013; 5 (185): 185ra63, Heo J, et al., Nature Medicine, 2013 (3): 329-36. doi: 10.1038/nm.3089. Publicación electrónica del 10 de febrero de 2013, y Publicación Internacional Núm. WO 2012/094386. Los ejemplos del adenovirus oncolítico que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un virus descrito en Tedcastle A et al., Mol Ther. 2016; 24: 796-804, Marino N, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderón H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017; 12 (5): e0177810, Freedman JD, et al., EMBO Mol Med 9: 1067-1087 (2017), Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018), James M. et al., The Journal of Oncology, 188 (6): 2391-7, 2012, y patentes japonesas núms. 3867968 y 5574284. Los ejemplos del virus del herpes simple oncolítico que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un virus descrito en Mazzacurati et al., Mol Ther, enero de 2015; 23 (1): 99-107, Hirooka Y, et al., BMC Cancer 2018, 18, 596, Nakatake R, et al., Cancer Sci. marzo de 2018, 109 (3); 600-610, y Andtbacka RHI, et al., J Clin Oncol. 2015; 33: 2780-2788. Los ejemplos del reovirus oncolítico que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un virus descrito en Mahalingam, et al., Cancers 2018, 10, 160. Los ejemplos del virus oncolítico de la enfermedad de Newcastle que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un virus descrito en Journal of Virology. junio de 2016; 90 (11): 5343-5352. Los ejemplos del virus de la estomatitis vesicular oncolítico que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un virus descrito en Muik A. et al., Cáncer Res; 74 (13); 3567-78. Algunos virus oncolíticos tienen una función de expresión de proteínas añadida mediante modificación genética y se les puede permitir expresar IL-7 y CCL19 descritas anteriormente en lugar de o además de dicha proteína.
El anaerobio no está particularmente limitado siempre que el anaerobio pueda expresar IL-7 y CCL19 introduciendo el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en su célula. Se prefiere una bacteria anaerobia gram positiva que tenga la capacidad de acumularse en células tumorales malignas. Ejemplos de las mismas pueden incluir una bacteria del géneroBifidobacteriacomo bifidus, una bacteria del géneroLactobacillus,y una bacteria del géneroListeria,Se sabe que el anaerobio se acumula fácilmente en las células tumorales malignas porque crece fácilmente en un ambiente que contiene menos oxígeno.
El liposoma no está particularmente limitado siempre que el liposoma pueda administrar el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 a células tumorales y sea una nanocápsula lipídica constituida por una bicapa de fosfolípidos. El liposoma se puede obtener mediante el uso de un producto disponible comercialmente o mediante síntesis según un método rutinario.
La MSC no está particularmente limitada siempre que la MSC pueda expresar IL-7 y CCL19 introduciendo el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en la célula, y tenga la capacidad de acumularse en células tumorales malignas.
La nanopartícula no está particularmente limitada siempre que la nanopartícula tenga la capacidad de poder administrar el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 a células tumorales, y esté en forma de partícula del orden nanométrico, preferiblemente de 5 a 800 nm de diámetro. Ejemplos de las mismas pueden incluir una nanopartícula metálica tal como una nanopartícula de oro y una nanopartícula de sílice. La nanopartícula se puede obtener mediante el uso de un producto disponible comercialmente o mediante síntesis según un método rutinario.
La frase "el vehículo de administración de ácido nucleico tiene la capacidad de acumularse en células tumorales malignas" significa que el vehículo de administración de ácido nucleico tiene la capacidad de acumularse específicamente en células tumorales malignas. Ejemplos específicos de dicha capacidad pueden incluir a) la capacidad del vehículo de administración de ácido nucleico para acumularse en células tumorales malignas mediante la acción de una sustancia que reconoce una molécula de la superficie celular de las células tumorales malignas, siendo transportada la sustancia mediante el vehículo de administración de ácido nucleico, y b) la capacidad del vehículo de administración de ácido nucleico para acumularse en células tumorales malignas mediante un efecto EPR (permeabilidad y retención mejoradas) que explota una abertura de varios cientos de nm que se abre en la pared vascular de un tejido tumoral y es más ancho en un solo dígito o más que el del vaso vascular de un tejido normal. Ejemplos de la sustancia que reconoce una molécula de superficie celular de células tumorales malignas, transportada por el vehículo de administración de ácido nucleico, pueden incluir un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un receptor de células T (TCR). Un receptor descrito en los documentos de patente 2 y 3 se puede usar como el CAR o el TCR. Por tanto, los ejemplos del vehículo de administración de ácido nucleico que tiene la capacidad de acumularse en células tumorales malignas pueden incluir una célula inmunitaria que expresa CAR y una célula inmunitaria que expresa TCR. El receptor de antígeno quimérico (CAR) es una proteína quimérica artificial en donde el Fv de cadena sencilla (scFv) que reconoce un antígeno de la superficie celular de las células cancerosas se fusiona con una región de transducción de señales que induce la activación de las células T.
La "capacidad de proliferar específicamente en células tumorales malignas" significa la capacidad de proliferar raramente en células normales infectadas, pero proliferar en células tumorales malignas infectadas. Ejemplos de lo mismo pueden incluir la capacidad de un virus oncolítico para proliferar específicamente en células tumorales malignas. Por tanto, los ejemplos del vehículo de administración de ácido nucleico que tiene la capacidad de proliferar específicamente en células tumorales malignas pueden incluir un virus oncolítico.
La "citotoxicidad contra células tumorales malignas" significa la capacidad de lisar o destruir células tumorales malignas dañando las células tumorales malignas. Las células tumorales malignas se lisan o destruyen de manera que un antígeno tumoral maligno en las células tumorales malignas se libera al entorno de las células lisadas o muertas.
La "molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno" puede ser cualquier molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno en la superficie celular de un tumor maligno. Ejemplos de los mismos pueden incluir un receptor de antígeno quimérico (CAR) y un receptor de células T (TCR). Un receptor descrito en los documentos de patente 2 y 3 se puede usar como CAR o TCR. Por tanto, los ejemplos de células inmunitarias que tienen la molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno pueden incluir una célula inmunitaria que expresa CAR y una célula inmunitaria que expresa TCR.
Por antígeno tumoral maligno se entiende una sustancia, tal como una proteína o un glicolípido, que se expresa más intensamente en células tumorales malignas que en células normales o que se expresa específicamente en células tumorales malignas. Los ejemplos de dicho antígeno tumoral maligno pueden incluir un péptido epítopo de un antígeno asociado a tumor, un antígeno de cáncer de testículo, un antígeno asociado a angiogénesis o un antígeno recién generado en un tumor maligno mediante mutación genética (neoantígeno) y puede incluir específicamente un proteína como WT1, MART-1, NY-ESO-1, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, Glipicano-3, KIF20A, Survivina, AFP-1, gp100, MUC1, PAP-10, PAP-5, TRP2-1, SART-1, VEGFR1, VEGFR2, NEIL3, MPHOSPH1, DEPDC1, FOXM1, CDH3, TTK, TOMM34, URLC10, KOC1, UBE2T, TOPK, ECT2, mesotelina, NKG2D, P1A, 5T4, B7-H6, BCMA, CD123, CD133, CD138, CD171, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CEA, cMet, CS1, EGFR, EGFRvIII, EphA2, ErbB2, FAP, FR-a, HER2, IL13Ra2, MUC1, MUC16, NKG2D, PSCA, PSMA, ROR1, TARP, DLL3, PRSS21, Claudina18.2, Claudina18, CAIX, L1 -CAM, FAP-a, CTAG1B y FR-a, y un glicolípido tal como GD2 y GM2.
La frase "que comprende un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica IL-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19" también incluye un aspecto en donde el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 están contenidos en el vehículo de administración de ácido nucleico. Cuando el vehículo de administración de ácido nucleico es, por ejemplo, una célula inmunitaria, el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 pueden estar contenidos en la célula inmunitaria. La célula inmune puede contener el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en un estado integrado en el genoma o en un estado no integrado en el genoma (p. ej., en un estado episomal).
Cuando el vehículo de administración de ácido nucleico es una célula inmunitaria, el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos se pueden preparar introduciendo el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en la célula inmunitaria, es decir, introduciendo un ácido nucleico extraño que codifica IL-7 y ácido nucleico que codifica CCL19 (preferiblemente un ácido nucleico extraño que codifica IL-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19 operativamente unido más abajo de un promotor) a la célula inmunitaria. El método de introducción puede ser cualquier método para introducir ADN en una célula inmunitaria. Ejemplos del mismo pueden incluir un método tal como un método de electroporación (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), un método de fosfato de calcio (Publicación de solicitud de patente japonesa no examinada núm. 2-227075), un método de lipofección (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)), y un método de infección viral. Los ejemplos del método de infección viral pueden incluir un método que implica transfectar células empaquetadoras tales como células GP2-293 (fabricadas por Takara Bio Inc.), células Plat-GP (fabricadas por Cosmo Bio Co., Ltd.), células PG13 (ATCC CRL-10686), o células PA317 (ATCC CRL-9078) con un vector que comprende un ácido nucleico a introducir y un plásmido empaquetador para preparar un virus recombinante, e infectar células T con el virus recombinante (documento de patente 2).
Cuando el vehículo de administración de ácido nucleico es un virus, se puede preparar un "virus que tiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y expresa IL-7 y CCL19" introduciendo el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 al virus, es decir, introducir un ácido nucleico extraño que codifica IL-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19 (preferiblemente un ácido nucleico extraño que codifica IL-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19 unidos operativamente situado más abajo de un promotor) al virus. El virus así preparado puede usarse como el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos.
Asimismo, cuando el vehículo de administración de ácido nucleico es un anaerobio, un liposoma o una célula madre mesenquimal (MSC), un "anaerobio, liposoma o célula madre mesenquimal (MSC) que tiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y expresa IL-7 y CCL19" se puede preparar introduciendo el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en el anaerobio, el liposoma o la célula madre mesenquimal (MSC), es decir, introduciendo un ácido nucleico extraño que codifica IL-7 y ácido nucleico que codifica CCL19 (preferiblemente un ácido nucleico extraño que codifica IL-7 y un ácido nucleico que codifica CCL19 operativamente unido más abajo de un promotor) al anaerobio, el liposoma o la célula madre mesenquimal (MSC). El anaerobio, el liposoma o la célula madre mesenquimal (MSC) así preparados pueden usarse como el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos. Además, el "virus que tiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y expresa IL-7 y CCL19", el "anaerobio que tiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y expresa IL-7 y CCL19", el "liposoma que tiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y expresa IL-7 y CCL19", o la "célula madre mesenquimal (MSC) que tiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y expresa IL-7 y CCL19" pueden usarse como inhibidor de la proliferación de tumores malignos.
Otro método para introducir el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en la célula inmunitaria puede ser un método que implica integrar el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en el genoma de la célula inmunitaria mediante el uso de una técnica de edición de genes conocida en la técnica de manera que estos ácidos nucleicos sean expresables bajo el control de un promotor adecuado. Los ejemplos de la técnica de edición de genes conocida en la técnica pueden incluir una técnica que usa una endonucleasa tal como nucleasa con dedos de zinc, TALEN (nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción) o sistema Cas CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas).
En el caso de preparar una "célula inmune que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y tiene CAR como molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno, es decir, una célula inmune que contiene ácidos nucleicos que codifican CAR, IL-7 y CCL19 y expresa CAR, IL-7 y CCL19" como el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, esta célula inmunitaria se puede preparar mediante cualquiera de los siguientes métodos:
(1) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, y un vector de expresión CAR que contiene el ácido nucleico que codifica CAR, a la célula inmunitaria;
(2) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión CAR-IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión CAR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(3) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión CAR-IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(4) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión CAR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica CCL19, y un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(5) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión CAR-IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(6) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión CAR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR y el ácido nucleico que codifica CCL19, y un vector de expresión IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7, a la célula inmunitaria; y
(7) un método para introducir simultánea o secuencialmente tres tipos de vectores, un vector de expresión CAR que contiene el ácido nucleico que codifica CAR, un vector de expresión IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y un vector de expresión CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria.
Asimismo, en el caso de preparar una "célula inmunitaria que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 y tiene TCR como molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno, es decir, una célula inmunitaria que contiene ácidos nucleicos que codifica TCR, IL-7 y CCL19 y expresa TCR, IL-7 y CCL19" como el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, esta célula inmunitaria se puede preparar mediante cualquiera de los siguientes métodos:
(1) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, y un vector de expresión de TCR que contiene el ácido nucleico que codifica TCR, a la célula inmunitaria;
(2) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión TCR-IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica TCR y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión TCR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica TCR y el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(3) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión TCR-IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica TCR y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(4) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión TCR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica TCR y el ácido nucleico que codifica CCL19, y un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(5) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión TCR-IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica TCR y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria;
(6) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión TCR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica TCR y el ácido nucleico que codifica CCL19, y un vector de expresión de IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7, a la célula inmunitaria; y
(7) un método para introducir simultánea o secuencialmente tres tipos de vectores, un vector de expresión de TCR que contiene el ácido nucleico que codifica TCR, un vector de expresión de IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y un vector de expresión CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria.
En el caso de preparar la "célula inmunitaria que expresa TCR, IL-7 y CCL19", se prepara de antemano una célula inmunitaria que expresa TCR específico para el antígeno tumoral deseado, y la célula inmunitaria que expresa TCR, IL-7 y CCL19 puede prepararse mediante cualquiera de los siguientes métodos usando la célula inmunitaria que expresa TCR:
(1) un método para introducir un vector de expresión IL-7-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 a la célula inmunitaria que expresa TCR; y
(2) un método para introducir simultánea o secuencialmente dos tipos de vectores, un vector de expresión de IL-7 que contiene el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CCL19, a la célula inmunitaria que expresa TCR.
Además, se puede preparar una "célula inmunitaria que expresa CAR, TCR, IL-7 y CCL19" como el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos. Los ejemplos específicos del método para ello pueden incluir un método de preparación que permite además que todos o cualquiera de los vectores descritos en el "caso de preparar una célula inmunitaria que expresa CAR, IL-7 y CCL19" contengan el ácido nucleico que codifica TCR de modo que TCR también se expresa, un método de preparación que permite además que todos o cualquiera de los vectores descritos en el "caso de preparación de una célula inmunitaria que expresa TCR, IL-7 y CCL19" contengan el ácido nucleico que codifica CAR de manera que CAR también se exprese, y un método de preparación para introducir los vectores descritos en el "caso de preparación de una célula inmunitaria que expresa CAR, IL-7 y CCL19" en la "célula inmunitaria que expresa TCR".
Además, cuando la célula inmunitaria en el presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos tiene CAR, se puede preparar una "célula inmune que expresa una pluralidad de CAR, preferiblemente dos tipos, que reconocen diferentes antígenos de tumores malignos". Los ejemplos específicos del método para ello pueden incluir un método de preparación que permite que los vectores descritos en el "caso de preparación de una célula inmunitaria que expresa CAR, IL-7 y CCL19" contengan ácidos nucleicos que codifican una pluralidad de, preferiblemente dos tipos de CAR que reconocen diferentes antígenos de tumores malignos de manera que se expresen la pluralidad de, preferiblemente los dos tipos de CAR. En particular, por ejemplo, un vector de expresión CAR-IL-7 que reconoce el antígeno tumoral maligno X que contiene el ácido nucleico que codifica CAR que reconoce el antígeno tumoral maligno X y el ácido nucleico que codifica IL-7, y un vector de expresión CAR-CCL19 que contiene el ácido nucleico que codifica CAR que reconoce el antígeno tumoral maligno Y y el ácido nucleico que codifica CCL19 se preparan y se introducen en la célula inmunitaria. La célula inmunitaria resultante puede tener una mayor especificidad tumoral porque IL-7 y CCL19 se secretan al entorno de las células que tienen los antígenos tumorales malignos X e Y.
Cuando el vehículo de suministro de ácido nucleico es una célula inmunitaria, un virus, un anaerobio o una célula madre mesenquimal, se puede usar un producto de cultivo que se obtiene cultivando la célula inmunitaria, el virus, el anaerobio o la célula madre mesenquimal y contiene la célula inmunitaria
La "recurrencia de tumores malignos" para el inhibidor de la recurrencia de tumores malignos significa la aparición de un tumor maligno nuevamente después del tratamiento del tumor maligno mediante quimioterapia general, radioterapia o terapia quirúrgica, etc. La recurrencia del tumor maligno es preferiblemente una recurrencia atribuible a células tumorales malignas que tienen resistencia a la capacidad del vehículo de administración de ácido nucleico para acumularse en células tumorales malignas, o la capacidad del vehículo de administración de ácido nucleico para proliferar específicamente en células tumorales malignas.
En este contexto, los ejemplos de la "recurrencia atribuible a células tumorales malignas que tienen resistencia a la capacidad de acumularse en células tumorales malignas" pueden incluir el caso en donde el vehículo de administración de ácido nucleico es una célula inmunitaria que tiene una molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno, y la recurrencia del tumor maligno es recurrencia del tumor maligno atribuible a células tumorales malignas que no tienen ningún antígeno tumoral maligno que sea reconocido específicamente por la molécula de la superficie celular, o que han perdido el antígeno tumoral maligno que se reconoce específicamente por la molécula de la superficie celular. Los ejemplos de la "recurrencia atribuible a células tumorales malignas que tienen resistencia a la capacidad del vehículo de administración de ácido nucleico para proliferar específicamente en células tumorales malignas" pueden incluir recurrencia tumoral atribuible a células tumorales malignas que no tienen sensibilidad a la infección con un virus oncolítico para tumores malignos, o que han perdido la sensibilidad a la infección por un virus oncolítico para el tumor maligno. La "recurrencia atribuible a células tumorales malignas que tienen resistencia a la capacidad de acumularse en células tumorales malignas" se puede confirmar, por ejemplo, examinando un antígeno tumoral maligno en células tumorales malignas de un tejido que ha experimentado una recurrencia.
El inhibidor de la recurrencia de tumores malignos se puede usar para la administración a un sujeto que tiene un tumor maligno tratado mediante inmunoterapia. El inhibidor de la recurrencia de tumores malignos puede usarse para la administración a un sujeto que tiene un tumor maligno tratado mediante inmunoterapia, el día 100 o más tarde después del tratamiento mediante inmunoterapia con el fin de inhibir la recurrencia durante un período prolongado.
El presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos pueden contener un aditivo farmacéuticamente aceptable. El presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos pueden contener además una instrucción para su uso. El presente potenciador o inductor o el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos se pueden preparar en una composición farmacéutica que contiene un aditivo farmacéuticamente aceptable. De aquí en adelante, la "composición farmacéutica que contiene el presente potenciador y un aditivo farmacéuticamente aceptable", la "composición farmacéutica que contiene el presente inductor y un aditivo farmacéuticamente aceptable" y la "composición farmacéutica que contiene el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos y un aditivo farmacéuticamente aceptable" también se denominan colectivamente la "presente composición farmacéutica". Los ejemplos del aditivo pueden incluir solución salina, solución salina tamponada, un medio de cultivo para cultivo celular, dextrosa, agua inyectable, glicerol, etanol y una combinación de los mismos, un estabilizante, un solubilizante, un tensioactivo, un tampón, un antiséptico, un agente de tonicidad, una carga y un lubricante.
El presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos o la presente composición farmacéutica se pueden administrar a un sujeto que necesita tratamiento para un tumor maligno o inhibición de su recurrencia mediante el uso de un método conocido por los expertos en la técnica. Los ejemplos del método de administración pueden incluir inyección intravenosa, intratumoral, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intramedular, intracardíaca, intraarticular, intrasinovial, intracraneal, intraespinal y subaracnoidal (líquido cefalorraquídeo).
Ejemplos del método para administrar el presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos o la presente composición farmacéutica pueden incluir la administración realizada de forma independiente cuatro veces, tres veces, dos veces o una vez al día, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, una vez a la semana, cada 8 días, cada 9 días, cada 10 días, dos veces por semana, una vez al mes o dos veces al mes.
La dosis del presente potenciador o inductor, del presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos o de la presente composición farmacéutica se puede determinar apropiadamente según la edad, el sexo, la salud y el peso corporal, etc. de un sujeto. Cuando el vehículo de administración de ácido nucleico es, por ejemplo, una célula inmunitaria, los ejemplos del mismo pueden incluir 1 x 103 a 1 x 109 células, preferiblemente 1 x 104 a 1 x 108 células, más preferiblemente 1 x 105 a 1 x 107 células, por kg de peso corporal a un adulto humano. Cuando el vehículo de administración de ácido nucleico es un virus oncolítico, los ejemplos del mismo pueden incluir aproximadamente 102 a 1010 unidades formadoras de placa (PFU), preferiblemente 105 a 106 unidades formadoras de placa (PFU), por dosis a un adulto humano.
En la presente memoria descriptiva, el tumor maligno puede ser un tumor sólido maligno o un tumor sanguíneo maligno. Ejemplos de los mismos pueden incluir un cáncer tal como glioma, melanoma, mesotelioma maligno, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, cáncer anaplásico, cáncer de células grandes, cáncer de células pequeñas, cáncer de piel, cáncer de glándula tiroides, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de vejiga urinaria, cáncer vaginal, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuello, cáncer de útero, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer de pulmón, cáncer de tráquea, cáncer de bronquios, cáncer de intestino grueso, cáncer de colon, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de esófago, cáncer de vías biliares, cáncer de vesícula biliar, cáncer de testículo, cáncer de ovario y tumor cerebral, un cáncer de un tejido óseo, un tejido cartilaginoso, un tejido adiposo, un tejido muscular, un tejido vascular o unos tejidos hematopoyéticos así como un sarcoma tal como condrosarcoma, sarcoma de Ewing, hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, osteosarcoma y sarcoma de tejido blando, un blastoma tal como hepatoblastoma, meduloblastoma, nefroblastoma, neuroblastoma, pancreatoblastoma, blastoma pleuropulmonar y retinoblastoma, tumor de células germinales, linfoma, leucemia y mieloma.
El presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos o la presente composición farmacéutica se pueden usar en combinación con un agente antitumoral adicional. Además, un método que usa el presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos o la presente composición farmacéutica se puede combinar con un método de tratamiento del cáncer que usa radiación. Los ejemplos del agente antitumoral adicional pueden incluir un fármaco alquilante tal como ciclofosfamida, bendamustina, ifosfamida y dacarbazina, un fármaco antimetabólico como pentostatina, fludarabina, cladribina, metotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina y enocitabina, un fármaco de direccionamiento molecular como rituximab, cetuximab y trastuzumab, un inhibidor de la quinasa como imatinib, gefitinib, erlotinib, afatinib, dasatinib, sunitinib y trametinib, un inhibidor del proteosoma como bortezomib, un fármaco inhibidor de la calcineurina como ciclosporina y tacrólimus, un antibiótico anticancerígeno como como idarrubicina y doxorrubicina-mitomicina C, un alcaloide vegetal como irinotecán y etopósido, un fármaco que contiene platino como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino, una hormona terapéutica como tamoxifeno y bicalutamida, y un fármaco regulador inmunológico como interferón, nivolumab, y pembrolizumab.
Los ejemplos del método que usa el presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos o la presente composición farmacéutica en combinación con el agente antitumoral adicional pueden incluir un método que usa el agente antitumoral adicional y luego usa el presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, o la presente composición farmacéutica, un método que usa simultáneamente el presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, o la presente composición farmacéutica y el agente antitumoral adicional, y un método que usa el presente potenciador o inductor, la presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, o la presente composición farmacéutica y luego usa el agente antitumoral adicional. En el caso de usar el presente potenciador o inductor, el presente inhibidor de la recurrencia de tumores malignos, o la presente composición farmacéutica y el agente antitumoral adicional en combinación, se mejora aún más el efecto terapéutico sobre un cáncer mientras que sus respectivas reacciones adversas se pueden reducir disminuyendo sus respectivas frecuencias de administración o dosis.
Ejemplos
De aquí en adelante, la presente invención se describirá más específicamente con referencia a los ejemplos. Sin embargo, el alcance técnico de la presente invención no está limitado por estos ejemplos.
(Preparación de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano y células T que expresan CAR anti-CD20 humano)
Las "células T que expresan CAR anti-CD20 humano, IL-7 de ratón y CCL19 de ratón (células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano; también denominadas "7 * 19" en los siguientes ejemplos o dibujos)" y las "células T que expresan CAR anti-CD20 humano; también denominadas "Conv." en los siguientes ejemplos o dibujos)" usadas en los ejemplos mencionados más adelante se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en el documento de patente 3 y el artículo de Tamada et al. (Nature Biotechnology doi: 10.1038/nbt.4086). De aquí en adelante, se describirá brevemente el método de preparación. Las "células T que expresan CAR anti-CD20 humano, IL-7 de ratón y CCL19 de ratón" son células T que tienen CAR anti-CD20 humano como molécula de superficie celular que reconoce un antígeno de célula tumoral maligna y comprenden el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19. ;;Para las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, primero se preparó de antemano un vector pMSGV de expresión de CAR-IL-7-CCL19 anti-CD20 humano que contiene el ácido nucleico que codifica el CAR anti-CD20 humano, el ácido nucleico que codifica IL-7 de ratón, y el ácido nucleico que codifica CCL19 de ratón. Posteriormente, el vector se introdujo usando retrovirus en células T de ratón separadas de los bazos y ganglios linfáticos de ratones congénicos CD90.1 positivo (CD90.1+) y CD90.2-negativo (CD90.2-) (fabricados por The Jackson Laboratory) usando el kit II de aislamiento de células T Pan (fabricado por Miltenyi Biotec) para preparar las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. Mientras tanto, las células T que expresan CAR anti-CD20 humano (células T que expresan CAR anti-CD20 humano) se prepararon preparando un vector pMSGV de expresión de CAR anti-20 humano de antemano e introduciendo el vector en las células T de ratón separadas usando un retrovirus. Las células T de ratón separadas sin introducción de genes (células T no transducidas) también se denominan "no transducidas" en los siguientes ejemplos o dibujos. En este contexto, se usó un vector pMSGV como el vector de retrovirus para introducir el ácido nucleico que codifica CAR anti-CD20 humano, el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en las células T de ratón separadas como se describe anteriormente. Por lo tanto, en el caso de cultivar las células T de ratón que albergan los ácidos nucleicos para la proliferación, algunas células T de ratón contienen el vector del retrovirus en sus citoplasmas, mientras que el ácido nucleico que codifica CAR anti-CD20 humano, el ácido nucleico que codifica IL- 7, y el ácido nucleico que codifica CCL19 están integrados en los genomas de la mayoría de las células T de ratón. Las células T de ratón expresan CAR anti-CD20 humano, IL-7 y CCL19 a partir de un constructo recombinante extraño cuando se integran el ácido nucleico que codifica CAR anti-CD20 humano, el ácido nucleico que codifica IL-7 y el ácido nucleico que codifica CCL19 en sus genomas. ;;El cultivo de células T empleó medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10 %, 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 pM, HEPES 25 mM y L-glutamina 2 mM. ;;[Ejemplo 1] ;;<Localización de células T> ;;Para examinar el efecto antitumoral de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19, se examinó si las células T endógenas derivadas del huésped (receptor) infiltrarían los tejidos tumorales, como en las células T del donante administrado. Primero, se inocularon por vía subcutánea 2,5 x 106 células de 3LL-hCD20 (células derivadas de cáncer de pulmón de ratón 3LL a las que se permitió expresar CD20 humano mediante recombinación de genes) a cada uno de los ratones C57BL/6 de 7 a 10 semanas de edad (fabricados por Japan SLC, Inc.) (día 0). Luego, el día 7, se les administró por vía intraperitoneal un agente anticancerígeno ciclofosfamida (CPA; 100 mg/kg). El día 10, se les administraron por vía intravenosa 1x106 células T que expresan CAR anti-CD20 humano o células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano producidas a partir de ratones congénicos CD90.1 positivo (CD90.1+) y CD90.2-negativo (CD90.2-), o células T de ratón separadas sin introducción de genes como se describe anteriormente. El día 19, se extirparon los tejidos tumorales de los ratones. Un anticuerpo anti-CD90.1 marcado con biotina (clon OX-7 fabricado por BioLegend, Inc.; que se une a las células T del donante) y un anticuerpo anti-CD3 (clon 17A2; fabricado por Tonbo Biosciences Inc.; que se une tanto a las células T del donante como a las células T endógenas del receptor) se usaron en combinación en la tinción primaria, y estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488 (fabricada por Thermo Fisher Scientific, Inc.; verde) e IgG2b anti-rata conjugada con Alexa Fluor 647 (fabricados por Abcam PLC; rojo) se usaron en la tinción secundaria. Los núcleos se tiñeron con DAPI (fabricado por Thermo Fisher Scientific Inc.; azul). La observación al microscopio se realizó a x400. Los resultados se muestran en la Figura 1 (a). La tinción secundaria indica las células unidas con el anticuerpo anti-CD90.1 marcado con biotina en color verde y las células unidas con el anticuerpo anti-CD3 en color rojo. Por lo tanto, las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano como células T donantes eran amarillas (color verde color rojo; CD90.1 CD3+), y las células T endógenas del receptor eran rojas (CD90.1- CD3+). En la Figura 1 (a), las células se indican en escala de grises. ;;La Figura 1 (b) muestra los resultados de la cuantificación de cada región positiva etiquetada en la Figura 1 (a) utilizando el programa Hybrid Cell Count (fabricado por Keyence Corp.). En la Figura 1 (b), la columna llena representa el área de las células T endógenas del receptor (huésped) (roja en la imagen de la derecha de la Figura 1 (a)), y la columna abierta representa el área de las células T del donante administradas (amarillas en la imagen derecha de la Figura 1(a)). Las Figuras 1 (a) y 1 (b) demostraron que la administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano mejora la acumulación local no solo de las células T administradas sino también las células T endógenas del receptor (huésped) al tumor, en otras palabras, mejora la acumulación local incluso de las células T endógenas al tumor al secretar localmente IL-7 y CCL19 al tumor. ;;[Ejemplo 2] ;;<Implicación de las células T en el efecto antitumoral> ;;Se inocularon por vía subcutánea 2,5 x 106 células de 3LL-hCD20 en cada uno de los ratones C57BL/6 (día 0). Luego, el día 3, se les administró por vía intravenosa 1 x 106 células T que expresan CAR anti-CD20 humano (Convencional: Conv.) o células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano (7 x 19) producidas a partir de ratones congénicos CD90.1 positivo (CD90.1+) y CD90.2 negativo (CD90.2-). Se administró por vía intraperitoneal un anticuerpo anti-CD90.2 (anti-CD90.2; preparado usando un hibridoma adquirido de ATCC por los presentes inventores), un anticuerpo contra CD90.2 (Thy1.2) expresado en las células T endógenas, dos veces a la semana desde el día 1. Las dos primeras dosis se fijaron en 1 mg/ratón y las dosis posteriores se fijaron en 0,5 mg/ratón. La Figura 2 muestra la media ± DE de los volúmenes tumorales del día 14 en cada grupo (n = 5) o representa el valor de cada ratón. ;;Como se muestra en la Figura 2, la administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano suprimió la proliferación del tumor maligno y el tumor desapareció debido a un efecto antitumoral muy alto. Sin embargo, la administración del anticuerpo anti-CD90.2 redujo el efecto antitumoral en aproximadamente un 50 %. Estos resultados demostraron que las células T endógenas receptoras también están implicadas en el efecto antitumoral provocado por las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, en otras palabras, no sólo las propias células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, sino las células T endógenas receptoras están implicadas en gran medida en el efecto antitumoral provocado por las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. ;;[Ejemplo 3] ;;<Potencial de memoria de las células T endógenas del receptor> ;;Se evaluaron las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano para la adquisición de una función de memoria mediante las células T CAR-T del donante y las células T endógenas y el aumento en el número de células que tienen una función de memoria, usando marcadores de células de memoria CD44 y CD62L. ;;Se inocularon por vía subcutánea 2,5 x 106 células de 3LL-hCD20 en cada uno de los ratones C57BL/6 (día 0). Luego, el día 3, se les administró por vía intravenosa 1 x 106 células T que expresan CAR anti-CD20 humano (Conv.) o células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano (7 x 19) producidas a partir de los ratones congénicos CD90.1 positivo (CD90.1+) y CD90.2 negativo (CD90.2-) como se describe anteriormente. El día 28, se recogieron células del bazo y se usaron en el siguiente análisis. ;;Las células T del donante se identificaron como células CD90.1 positivas (CD90.1+), y las células T receptoras se identificaron como células CD90.2 positivas (CD90.2+). La expresión de los marcadores de células T de memoria (CD44 y CD62L) y CAR en células T CD4 positivas y CD8 positivas se detectó mediante citometría de flujo. Los valores numéricos de los diagramas de puntos o histogramas representan la proporción de células en cada puerta. Los resultados se muestran en la Figura 3. ;;La adquisición de la función del potencial de memoria, es decir, la reactividad con estimulación, se examinó mediante la producción de IFN-<y>. En primer lugar, las células del bazo recogidas el día 28 se estimularon mediante cocultivo con 3LL-hCD20 o la línea parental 3LL que no expresaba hCD20, se trataron con mitomicina C (fabricada por Kyowa Kirin Co., Ltd.) a 37 °C durante 90 minutos. La producción de IFN-<y>se examinó mediante tinción con citocinas intracelulares. Los resultados se muestran en la Figura 4. Los valores numéricos en los histogramas de la Figura 4 (a) representan la relación de células positivas para IFN-<y>y células T del donante positivas para CD90.1. La Figura 4 (b) muestra los resultados de la detección de células positivas para IFN-y en células T CD90.2 positivas y CD8 positivas endógenas mediante citometría de flujo. Los valores numéricos de los diagramas de puntos representan las relaciones de células en 4 cuadrantes. ;;Como se muestra en la Figura 3, en el caso de administrar células T que expresan CAR anti-CD20 humano (Conv.), las células seleccionadas de CD90.2 (células T endógenas receptoras) incluían células T de memoria central (marcador de células T de memoria- de células CD44 positivas y CD62L positivas) en el 5,5 % de las células CD4 positivas y el 24,8 % de las células CD8 positivas. Por otro lado, en el caso de administrar células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano (7 x 19), las células seleccionadas de CD90.2 (células T endógenas receptoras) incluían células T de memoria central en el 6,76 % de las células CD4 positivas y el 49,2 % de las células CD8 positivas. La relación de células T de memoria central aumentó en ambos casos. Estos resultados demostraron que la administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano (7 x 19), es decir, la secreción conjunta de IL-7 y CCL19 de células individuales, puede activar a las células T endógenas del receptor al tiempo que induce la diferenciación de las células T endógenas receptoras en células T de memoria central para aumentar el número de células T de memoria central y también aumentar la relación de células T de memoria central a un grupo de células del bazo. En otras palabras, es evidente que las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano pueden usarse como un inductor para células T que tienen una función de memoria en un sujeto de administración, o como un potenciador para células T que tienen una función de memoria en un sujeto de administración. ;;Por otro lado, las células seleccionadas de CD90.1 (células T del donante) incluían células T de memoria central en el 75,8 % de las células CD4 positivas y en el 90,7 % de las células CD8 positivas, lo que confirma que las propias células T del donante eran inducidas en las células T de memoria central. En el caso de usar Conv., las células seleccionadas de CD90.1 fueron 0 % y las células CD90.1 positivas no se detectaron (n.d.) porque Conv. no expresaron ni IL-7 ni CCL19 y mostraron una baja tasa de supervivencia de las células T que expresan CAR. ;;Como se muestra en la Figura 4, las células del donante incluían un 90,5 % de células CD4 positivas y un 93,6 % de células CD8 positivas que producían IFN-<y>mediante estimulación con 3LL. Además, entre las células T endógenas receptoras (que no expresan CAR-T), aunque el 0,957 % de las células CD4 positivas produjeron IFN-y mediante el tratamiento Conv., el 14,9 % de las células CD4 positivas produjeron IFN-<y>mediante el tratamiento 7 x 19. Estos resultados demostraron que mediante la secreción de IL-7 y CCL19 usando células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano, tanto las células T del donante como las células receptoras producen IFN-y mediante estimulación y adquieren una función de memoria. ;;[Ejemplo 4] ;;<Cambio en el patrón de expresión génica del receptor de células T> ;;Para examinar la diversidad de epítopos de células T, se examinó el cambio en el repertorio del receptor de células T (TCR) entre antes y después del tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19. Se inocularon por vía subcutánea 5 x 105 células de P815-hCD20 (células de mastocitoma de ratón P815 a las que se les permitió expresar CD20 humano mediante recombinación de genes) en ratones DBA/2 (n = 5) (día 0). Luego, el día 10, se les administraron por vía intravenosa ciclofosfamida (CPA; 100 mg/kg) y 1 * 106 células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano para tratar el tumor. El día 140 después de la administración de células tumorales P815, se recogieron células del bazo de ratones completamente curados mediante el tratamiento del tumor como se describe anteriormente (ratones con tumor rechazado) y se cultivaron con P815-hCD20 o la línea parental P815 que no expresa hCD20 (hCD20 negativo: hCD20-) durante 4 días para la proliferación de células T<c>A<r>positivas o células T CAR negativas clasificadas usando un clasificador de células (SH800; fabricado por Sony Corp.). Luego, para el análisis del repertorio de TCR, la población CD8 positiva y c Ar positiva (CD8+CAR+) o CD8 positiva y CAR negativa (CD8+CAR-) se clasificó usando un citómetro de flujo. Se seleccionó como control una población CD8 positiva y CAR positiva o CD8 positiva y CAR negativa antes de la administración a ratones. El repertorio de TCR se analizó con un secuenciador de próxima generación y la frecuencia de uso de las regiones V y J en las cadenas a y p se indicó mediante un gráfico 3-D. Los resultados se muestran en las Figuras 5A a 5D y 6A a 6D. Las Figuras 5A a 5D muestran los resultados sobre la cadena a y las Figuras 6A a 6D muestran los resultados sobre la cadena p. Las Figuras 5A, 5B, 6A y 6B muestran los resultados obtenidos antes de la administración de células de cada línea, y las Figuras 5C, 5D, 6C y 6D muestran los resultados obtenidos después de la administración de células de cada línea. Los valores numéricos superiores izquierdos en los diagramas representan índices de diversidad calculados por el índice de uniformidad de Pielou (un número más alto indica una menor diversidad) y significan que un valor numérico más bajo indica una diversidad más alta.
El receptor de células T es una molécula receptora de antígeno expresada en las membranas celulares de las células T. El receptor de células T existe como un heterodímero que consiste en una cadena a y una cadena p o una cadena Y y una cadena 5, y se sabe que activa las células T al reconocer una molécula de antígeno unida al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
Como es evidente a partir de los índices de diversidad mostrados en las Figuras 5A a 5D y 6A a 6D, el valor de los índices de diversidad aumentó tanto para la cadena a como para las cadenas p mediante la administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. Por lo tanto, la diversidad de TCR se redujo no sólo en las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano administradas sino también en las células T endógenas del receptor, lo que demuestra que las células T presumiblemente tienen una función de memoria contra el antígeno tumoral al secretar localmente IL-7 y CCL19 al tumor mientras que destruyendo las células tumorales aumentan selectivamente en número.
[Ejemplo 5]
<Inhibición de la recurrencia del tumor - 1 >
Se prepararon modelos de recurrencia del cáncer que explotan un animal mediante el siguiente método: primero, se examinó la respuesta de memoria específica del tumor de las células T receptoras en ratones tratados con células T que expresan CD20 CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. Se inocularon por vía subcutánea 5 x 105 células de P815-hCD20 en cada uno de los ratones portadores de cáncer de 7 a 10 semanas de edad (DBA/2; n = 4; fabricado por Japan SLC, Inc.). Luego, el día 10, se les administró por vía intraperitoneal un agente anticancerígeno ciclofosfamida (CPA; 100 mg/kg). El día 14, se inocularon por vía intravenosa 1 x 106 células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano. El día 140 después de la inoculación de P815-hCD20, se inoculó P815-hCD20 o la línea parental P815 que no expresa hCD20 en cada una de las regiones laterales derecha e izquierda de los abdómenes de ratones con tumor rechazado o ratones de control sin tratamiento previo. Los volúmenes tumorales se midieron dos veces por semana. Los resultados se muestran en la Figura 7A. También se realizó un análisis similar usando ratones C57BL/6 inoculados con 3LL-hCD20 o la línea parental 3LL que no expresa hCD20 en lugar de P815-hCD20. Los resultados se muestran en la Figura 7B. Las líneas parentales P815 y 3LL no expresan CD20 humano y, por lo tanto, sirven como células tumorales malignas que no tienen ningún antígeno tumoral maligno que sea reconocido específicamente por la molécula de la superficie celular de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano.
La abscisa de la Figura 7A representa el número de días desde el día en que se administró inicialmente P815-hCD20 o P815 (día 0) para los ratones sin tratamiento previo, y el número de días desde el día en que se inoculó nuevamente P815-hCD20 el día 140 después de la inoculación inicial de P815-hCD20 (día 0) para los ratones con tumor rechazado. La abscisa de la Figura 7B representa el número de días desde el día en que se administró inicialmente 3LL-hCD20 o 3LL (día 0) para los ratones sin tratamiento previo, y el número de días desde el día en que se inoculó nuevamente 3LL-hCD20 (día 0) para los ratones con tumor rechazado. Las ordenadas de las Figuras 7A y 7B representan los volúmenes tumorales (mm3).
Como se muestra en los gráficos inferiores de las Figuras 7A y 7B, no se formó ningún tumor en los ratones con tumor rechazado inoculados con P815-hCD20 o 3LL-hCD20. Estos resultados demostraron que el tratamiento del tumor con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano puede inhibir la recurrencia del tumor atribuible a células tumorales que tienen un antígeno que es reconocido por CAR. Como se muestra en los gráficos superiores de las Figuras 7A y 7B, sorprendentemente, la formación de tumores se inhibió notablemente en los ratones con tumores rechazados inoculados con la línea parental P815 o 3LL que no tenían CD20 en la superficie celular, en comparación con los ratones sin tratamiento previo. Estos resultados demostraron que el tratamiento con células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano también puede inhibir la formación de tumores atribuibles a células tumorales que no tienen ningún antígeno es reconocido por CAR, en otras palabras, la recurrencia del tumor atribuible a células tumorales que no tienen antígeno que es reconocido por CAR. Un evento de este tipo en donde la administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano influye en la función inmunitaria de un sujeto de administración e inhibe la recurrencia al permitir que el sujeto de administración continúe rechazando el tumor derivado de la línea parental que no expresa ningún antígeno dirigido por CAR durante un largo período fue inesperada desde el punto de vista de la reactividad específica de la molécula objetivo de las células CAR-T. Cuando se toma en conjunto con los resultados sobre el cambio en el patrón de expresión génica del receptor de células T en el Ejemplo 4, la administración de las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano causó la destrucción de células tumorales, y como resultado, las células T endógenas del receptor parecieron reaccionar con el antígeno tumoral originalmente transportado por las células tumorales para inducir una función de memoria a largo plazo. Esto sugiere que la administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano destruye las células tumorales mientras secreta localmente IL-7 y CCL19 al tumor, inhibiendo así la recurrencia de tumores malignos al inducir de manera muy eficaz un fenómeno de propagación de epítopos e inducir y mejorar una función de memoria. Para los modelos de recurrencia de cáncer anteriores, primero se inoculó subcutáneamente P815-hCD20, P815, 3LL-hCD20 o 3LL, y el día 140, se inocularon las células de cada línea en cada una de las regiones laterales derecha e izquierda del abdomen. Por lo tanto, la administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano no solo inhibió la recurrencia de tumores malignos, sino que también puede inhibir la metástasis de tumores malignos. Por lo tanto, las células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 anti-CD20 humano probablemente también estén disponibles como "inhibidores de metástasis de tumores malignos".
[Ejemplo 6]
<Inhibición de la recurrencia del tumor - 2>
Para confirmar un efecto inhibidor de la recurrencia del tumor, se formó el tumor administrando una línea celular de mesotelioma pleural maligno humano a ratones, y luego, se examinó la presencia o ausencia de recurrencia del tumor durante 143 días mediante la presencia o ausencia de administración de células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 de anti-mesotelina humana. La Figura 8 muestra un protocolo experimental específico. Los métodos para preparar "ACC-MESO1-GFP-Luc", "células T que expresan CAR anti-mesotelina", "células T que expresan CAR-IL-7/CCL19 antimesotelina" se muestran en la Figura 8, y un método para activar las células T son los siguientes.
(Preparación de la línea ACC-MESO1-GFP-Luc)
Se introdujo un gen de la proteína fluorescente verde-luciferasa (GFP-Luc) usando lentivirus en la línea celular de mesotelioma maligno humano ACC-MESO1, una línea celular tumoral positiva para mesotelina amablemente proporcionada por el profesor Yoshitaka Sekido del Instituto de Investigación del Centro de Cáncer de Aichi.
El día 0, se sembró ACC-MESO1 a 1 x 103 células/pocillo a una placa de 96 pocillos. El medio de cultivo usado fue RPMI1640 (fabricado por Gibco) suplementado con 10 % de FBS. El día 1, se añadió RediFect Red-FLuc-GFP (fabricado por PerkinElmer, Inc.), partículas de lentivirus para la preparación de células luminiscentes, a MOI 100 para iniciar la transducción. Para mejorar la eficacia de la introducción de genes, se añadió bromuro de hexadimetrina (fabricado por Sigma-Aldrich Co. LLC) a este medio de cultivo de modo que la concentración final fuera de 4 pg/ml. 24 horas después de la adición del virus (el día 2), se eliminó el medio de cultivo que contenía el virus y el medio de cultivo se reemplazó por uno nuevo. Después de la continuación del cultivo, sólo se clasificaron las células que expresaban GFP usando SH800 (fabricado por Sony Corp.) y se usaron como la línea ACC-MESO1 -GFP-Luc.
(Preparación de células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana y células T que expresan CAR-anti-mesotelina humana)
Las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana y las células T que expresan CAR antimesotelina humana (células T que expresan CAR convencionales) se prepararon sobre la base de los métodos descritos en la solicitud de patente japonesa núm. 2017-247109 y Publicación Internacional núm. WO 2016/056228. Como se describe brevemente, se preparó un constructo CAR de tercera generación (SEQ ID NO: 6) que tenía Fv de cadena sencilla anti-mesotelina humana que consistía en la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada descrita en SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de un conector descrita en SEQ ID NO: 4, y la secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera descrita en SEQ ID NO: 5, una región transmembrana de CD8 humano y un motivo de señal intracelular CD28-4-1BB-CD3Z humano en este orden. Un gen de un constructo que tiene IL-7 humano descrito en la SEQ ID NO: 1, el posterior péptido 2A derivado de picornavirus (F2A) descrito en la SEQ ID NO: 7, CCL19 humano descrito en la SEQ ID NO: 2, y el gen de timidina quinasa derivado del virus herpes (HSV-tk) en este orden en el extremo C terminal del constructo se preparó y se insertó en el vector de expresión retroviral pMSGV1 (Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002)) para preparar el vector de expresión retroviral pMSGV1 para la expresión de IL-7/CCL19 y HSV-tk humanos. El vector de expresión retroviral pMSGV1 obtenido se introdujo en células T de ratón usando retrovirus para preparar las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana. Asimismo, se introdujo el vector de expresión retroviral pMSGV1 para la expresión del constructo CAR de tercera generación que tiene Fv anti-mesotelina de cadena sencilla humana, una región transmembrana CD8 humana y un motivo de señal intracelular CD28-4-1BB-CD3Z humana en este orden en vez del vector de expresión retroviral pMSGV1 para la expresión de IL-7/CCL19 y HSV-tk humanos en células T de ratón usando retrovirus para preparar las células T que expresan CAR anti-mesotelina humana (células T que expresan CAR anti-mesotelina humana convencionales). El péptido señal usado fue un péptido señal descrito en SEQ ID NO: 8.
(Activación de células T)
El día 0, se inició el cultivo del 2 x 106 células mononucleares de sangre periférica recolectadas de donantes humanos sanos, junto con 200 IU/mL de IL-2 (fabricada por PeproTech, Inc.) a 37°C en una placa de 6 pocillos para cultivo celular en donde se inmovilizaron 25 pL/mL de RetroNectin (fabricado por Takara Bio Inc.) y 5 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 humano (fabricado por Invitrogen Corp., 5 pg/ml), usando una incubadora de CO<2>al 5 %. La disolución de cultivo usada contenía OpTmizer CTS (fabricado por Gibco) suplementado con L-glutamina 2 mM (fabricado por Gibco), penicilina-estreptomicina al 1 % (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 25 pg/ml de fungizona (fabricado por Bristol-Myers Squibb Company). Después del cultivo durante 3 días, se confirmó bajo un microscopio que las células T del día 3 estaban activadas y cambiadas morfológicamente.
(Observación de recurrencia tumoral)
Primero, el día 0, se administró ACC-MESO1-GFP-Luc por vía intratorácica a 2 x 106 células/ratón a ratones inmunodeficientes NSG hembra de 8 semanas de edad. El día 1, se confirmó el injerto tumoral intratorácico usando un sistema de formación de imágenesin vivo(IVIS). El día 1, las células T que expresan CAR convencionales, las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana y las células T activadas mediante el método, que se habían preparado a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donante sano y se habían criopreservado, fueron descongeladas. Las células T que expresan CAR de anti-mesotelina humana convencionales y las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 de anti-mesotelina humana tuvieron una tasa de expresión de CAR del 49,6 % y el 32,5 %, respectivamente. Por lo tanto, las células T activadas se añadieron a las células T que expresan CAR anti-mesotelina humana convencionales para igualar sus tasas de expresión de CAR. Entonces, se proporcionaron un grupo que recibió 1 x 105 células de las células T que expresan CAR anti-mesotelina humana convencionales (N = 5), y un grupo que recibió 1 x 105 células de las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 antimesotelina humana (N = 5). La administración de las células T que expresan CAR de anti-mesotelina humana convencionales y las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 de anti-mesotelina humana se realizó mediante administración intravenosa a través de las venas de la cola. El día 3 o más tarde, se midió la intensidad de la fluorescencia del tumor (flujo total (fotones/s) usando IVIS. Los resultados se muestran en las Figuras 9A y 9B. La Figura 10 muestra gráficamente la relación entre el número de días desde la administración y las tasas de supervivencia del ratón en los resultados descritos anteriormente. La Figura 11 muestra gráficamente la relación entre el número de días desde la administración y la cantidad total de fluorescencia (fotones/segundo) en los resultados descritos anteriormente. En las Figuras 9A, 9B, 10 y 11, los ratones que recibieron las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 anti-mesotelina humana se indican con "7 x 19 CAR-T", y los ratones que reciben las células T que expresan CAR anti-mesotelina convencional se indican con "CAR-T convencional". En este Ejemplo 6, se usaron como receptores ratones inmunodeficientes NSG defectuosos en células T endógenas. Por lo tanto, se eliminó la influencia de las células T endógenas receptoras y se evaluó el efecto de las células T que expresan CAR-IL-7-CCL19 antimesotelina humana administradas.
Como se muestra en las Figuras 9A, 9B, 10 y 11, rara vez se observó intensidad de fluorescencia tumoral tanto en CAR-T 7 x 19 como en CAR-T convencional en o alrededor del día 21 . Luego, no se observó fluorescencia tumoral en CAR-T 7 x 19 hasta el día 143, confirmando que la recurrencia estaba completamente inhibida. Por otro lado, la fluorescencia del tumor se volvió observable en CAR-T convencional en o alrededor del día 45, y la intensidad de la fluorescencia del tumor se elevó el día 115, con uno muerto el día 129 y los cuatro restantes también muertos el día 143. Estos resultados demostraron que la recurrencia de tumores malignos se puede inhibir mediante la administración de células T que expresan CAR-IL-7-CCL19, es decir, que secretan localmente IL-7 y CCL19 al tumor mientras se destruyen las células tumorales.
[Ejemplo 7]
<Potencial de memoria de las células T endógenas del receptor>
Los ejemplos descritos anteriormente emplearon células T que tenían CAR como molécula de superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno. El potencial de memoria de las células T endógenas receptoras se examinó usando células T que tenían un receptor de células T (TCR) en lugar de CAR como molécula de la superficie celular que reconoce un antígeno tumoral maligno.
(Preparación de células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A)
Se prepararon células T que expresan TCR específico para el antígeno tumoral P1A de P815, IL-7 de ratón, CCL19 de ratón y GFP de acuerdo con el método descrito en el documento de patente 3. El método de preparación se describirá brevemente a continuación.
Se sintetizó artificialmente un fragmento de ADN de IL-7-F2A-CCL19 que codifica IL-7 de ratón (sin un codón de parada), el posterior péptido 2A derivado de picornavirus (F2A) y CCL19 de ratón (Life Technologies Corp.). El fragmento de ADN IL-7-F2A-CCL19 así sintetizado se insertó en el sitio de multiclonación del vector de expresión retroviral pMSGV (documento de patente 3) que tiene una secuencia F2A-eGFP mediante tratamiento con enzimas de restricción (NCOI y ECORI) y ligadura para obtener el vector pMSGV que comprende un fragmento de ADN IL-7-<F2A-CCL19-F2A-eGFP (SEQ i>D<NO: 9) (vector de expresión IL-7 x CCL19-eGFP). Además, se preparó como control>el vector pMSGV que comprende eGFP y que no comprende ni IL-7 ni CCL19 (vector de control de eGFP). En la SEQ ID NO: 9, los nucleótidos 1 a 462 corresponden a un ácido nucleico que codifica IL-7 (los nucleótidos 1 a 75 corresponden a un ácido nucleico que codifica una secuencia señal de IL-7), los nucleótidos 463 a 537 corresponden a un ácido nucleico que codifica F2A, los nucleótidos 538 a 861 corresponden a un ácido nucleico que codifica CCL19 (los nucleótidos 538 a 612 corresponden a un ácido nucleico que codifica una secuencia señal de CCL19), los nucleótidos 868 a 942 corresponden a un ácido nucleico que codifica F2A, los nucleótidos 946 a 1662 corresponden a un ácido nucleico que codifica eGFP, y los nucleótidos 1663 a 1665 corresponden a un codón de parada.
Se recogieron células del bazo de ratones transgénicos que expresaban TCR específico para antígeno tumoral restringido en H-2Ld P1A de P815 (Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med.
189:811.) obtenido de Y. Liu. Se obtuvieron de ahí células T de ratón derivadas de células del bazo que expresan TCR específico para el antígeno tumoral P1A de P815 (células T con TCR específico de P1A). Posteriormente, se preparó el retrovirus que albergaba el vector de expresión IL-7 x CCL19-eGFP o el vector de control eGFP, y las células obtenidas activando las células del bazo (3 x 106 células/pocillo), incluidas las células T con TCR específico de P1A con péptido P1A durante 48 horas, se transdujeron con el retrovirus para obtener células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A (P1A-CTL 7 x 19) o células T que expresan TCR/eGFP específicas de P1A (P1A-CTL conv.). La transducción con cada vector de expresión se confirmó mediante análisis de citometría de flujo para detectar eGFP como marcador sustituto. El nivel de expresión de eGFP de las células T obtenidas de cada línea fue del 70 al 80 % en todos los experimentos.
Las Figuras 12(a) y 12(b) muestran los resultados del análisis de la relación de células CD8+GFP+ a células del bazo y el número absoluto de células CD8+GFP+ en ratones tratados con células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A o células T que expresan TCR/eGFP específicas de P1A mediante citometría de flujo. Se confirmó que el tratamiento con células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A aumenta la relación de células CD8+GFP+ a células del bazo y el número absoluto de células CD8+GFP+.
Las Figuras 13(a) y 13(b) muestran los resultados del análisis de la expresión de CD44 en células del bazo CD8+ de ratones BDA/2 sin tratamiento previo y células del bazo CD8+GFP- o CD8+GFP+ de ratones tratados con células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A mediante citometría de flujo. La Figura 13 (a) muestra el número representativo de células CD44+. La Figura 13(b) muestra la proporción de células CD44+. Como se muestra en las Figuras 13(a) y 13(b), no sólo las células T administradas (seleccionadas GFP+) sino las células T endógenas del receptor (seleccionadas GFP-) tenían la proporción de células CD44+ aumentada dos o más veces en comparación con las células T sin contacto previo. Por lo tanto, se confirmó que las células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A tienen la acción de impartir potencial de memoria a las células T intrínsecas del receptor, es decir, la acción de inducir una función de memoria en las células T intrínsecas del receptor y mejorar la función de memoria en las células T intrínsecas del receptor.
Para confirmar aún más la adquisición de la función del potencial de memoria, es decir, la reactividad con la estimulación, esta adquisición se examinó mediante la producción de IFN-y. Las células T se aislaron magnéticamente de células del bazo y se cocultivaron durante aproximadamente 5 días con mastocitos de la mucosa (MMC) tratados con P815. La Figura 14 muestra los resultados de la detección de la concentración de IFN-<y>en un sobrenadante del medio de cultivo mediante ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas). Como se muestra en la Figura 14, se confirmó que las células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A son ricas en la producción de IFN-<y>. Por lo tanto, se confirmó que las células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A mejoran la actividad antitumoral de las células T endógenas receptoras. Esto sugirió que las células T que expresan TCR/IL-7/CCL19/eGFP específicas de P1A inducen un efecto inhibidor de la recurrencia en los receptores.
[Ejemplo 8]
<Virus que expresan IL-7 y CCL19>
Los ejemplos descritos anteriormente emplearon una célula inmunitaria como vehículo de administración de ácido nucleico. La mejora en las células T o las células B que tienen una función de memoria o la inhibición de la recurrencia de tumores malignos en un sujeto de administración debe lograrse sin el uso de la célula inmunitaria siempre que IL-7 y CCL19 se secreten localmente al tumor. En consecuencia, el análisis se realizó usando un virus en lugar de una célula inmunitaria como vehículo de administración de ácido nucleico.
(Preparación de virus vaccinia genéticamente recombinante que expresa IL-7 de ratón y CCL19 de ratón)
Se preparó un virus vaccinia genéticamente recombinante que expresa IL-7 de ratón y CCL19 de ratón mediante el siguiente método de acuerdo con el método descrito en el documento de patente 3 y la Publicación Internacional núm. WO 2011/125469. Se amplificó una región del gen de la proteína fluorescente azul (BFP) con ADN del vector pTagBFP-N (FP172, Evrogen) como plantilla usando dos cebadores (5'-ATG GCC GGA CCG GCC ACC GGT CGC CAC CAT GAG CGA G-3': SEQ ID NO: 10) y (5'-TCG AAT TCG CTA GCG GCC GCT TAA TTA AGC TTG TGC CCC AG-3': SEQ ID NO: 11). El producto de la PCR se escindió con las enzimas de restricción SfiI y EcoRI, y el resultante se clonó en el sitio de restricción correspondiente del vector pTK-SP-LG (Publicación Internacional núm. WO 2011/125469) para construir pTK-SP-BFP en donde el gen BFP estaba unido bajo el promotor sintético del virus vaccinia (Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66 (1): 135-138). Posteriormente, se escindió el vector pAmCyan1-N1 (fabricado por Takara Bio Inc.) con las enzimas de restricción AgeI y NotI, y el fragmento de proteína fluorescente AmCyan1 resultante se clonó en un sitio, se trató con las mismas enzimas de restricción que allí, de pTK-SP-BFP para construir pTK-SP-AmCyan1.
El plásmido pMSGV que comprende un fragmento de ADN que codifica IL-7 de ratón, el posterior péptido 2A derivado de picornavirus (F2A), CCL19, F2A y eGFP de ratón (documento de patente 3) se escindió con la enzima de restricción BamHI, se trató para obtener el extremo romo y luego se escindió con NcoI. El fragmento obtenido de IL-7-F2A de ratón-CCL19-F2A-eGFP de ratón se clonó en un sitio obtenido mediante la escisión de pTK-SP-AmCyan1 con NheI y tratamiento para el extremo romo, seguido de escisión con NcoI para construir el plásmido del vector de transferencia pTK-SP-IL-7-F2A de ratón- CCL19-F2A-eGFP de ratón.
Se amplificó una región del gen de la luciferasa de luciérnaga con ADN de pGL4.20 (fabricado por Promega Corp.) como una plantilla usando dos cebadores (5'-GCT CCG GAC GCC ACC ATG GAA GAT GCC AAA AAC-3' (SEQ ID NO: 12) y 5'-GCG AAT TCC ACG GCG ATC TTG CCG CCC TTC T-3' (SEQ ID NO: 13)). El producto de PCR se escindió con las enzimas de restricción BspEI y EcoRI, y el fragmento Luc obtenido, y un fragmento que comprende una porción de eGFP, obtenido mediante la escisión de pTK-SP-IL-7-F2A de ratón-CCL19-F2A-eGFP de ratón con las enzimas de restricción EcoRI y BsrGI se clonaron simultáneamente en un sitio de pTK-SP-IL-7-F2A de ratón-CCL19-F2A-eGFP de ratón escindido con enzimas de restricción BspEI y BsrGI para construir el plásmido del vector de transferencia pTK-SP-Luc-F2A-eGFP.
Para recuperar un virus vaccinia recombinante que tiene el genoma viral mostrado en la Figura 15(a) o 15(b), se infectaron células CV1 cultivadas con una confluencia del 80 % en una placa de 6 pocillos con virus vaccinia (LC16mO) a MOI = 0,02 a 0,1. Después de la adsorción a temperatura ambiente durante 1 hora, se añadió a las células el ADN plasmídico del vector de transferencia (pTK-SP-IL-7-F2A de ratón-CCL19-F2A-eGFP de ratón o pTK-SP-Luc-F2A-eGFP) mezclado con FuGENE HD (fabricado por Promega Corp.) según el manual para que las células incorporaran el ADN. Las células se cultivaron a 37 °C durante 2 a 5 días. Las células se recuperaron, se congelaron y descongelaron, luego se sonicaron, se diluyeron adecuadamente e inocularon en células BSC1 casi confluyentes. Se añadió al mismo medio de cultivo Eagle MEM que contenía 0,8 % de metilcelulosa y 5 % de FBS, y las células se cultivaron a 37 °C durante 2 a 5 días. Se eliminó el medio de cultivo y las placas que expresaban BFP se rasparon con la punta de una pipeta y se suspendieron en medio de cultivo Opti-MEM (fabricado por Invitrogen Corp.). Esta operación se repitió tres o más veces usando células BSC1 para purificar las placas. Se sonicó la suspensión de las placas recogidas después de la purificación de las placas. Luego, se extrajo el ADN genómico de una alícuota de 200 gl del mismo usando el kit de ácido nucleico viral de alta pureza (fabricado por F. Hoffmann-La Roche, Ltd.) según el manual y se sometió a detección mediante PCR. La PCR se realizó usando dos cebadores (5'-ATT TCT CCG TGA TAG GTA TCG ATG-3' (SEQ ID NO: 14) y 5'-AAC GGT TTA CGT TGA AAT GTC C-3' SEQ ID NO: 15), y los clones con un tamaño predeterminado de un producto de PCR detectado se secuenciaron directamente para confirmar la secuencia de nucleótidos del producto de PCR. Se seleccionó un clon de virus que no tenía problemas en la secuencia de nucleótidos y se amplificó en células A549, seguido de una medición del título de virus en células RK13. El virus obtenido se sometió como virus vaccinia genéticamente recombinante LC16mO TK-SP-IL-7-F2A de ratón-CCL19-F2A-eGFP de ratón (TK-ICE; Figura 15(a)) o LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP (TK-LE; Figura 15(b)) al siguiente experimento.
Se sembraron células A549 (1 x 105 células/pozo) o células CT26 (5 x 104 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos y se cultivaron a 37 °C. Luego, las células A549 y las células CT26 se infectaron con TK-ICE o TK-LE a MOI = 0,1 y MOI = 10, respectivamente (n = 3). 24, 48 y 72 horas después de la infección, las células se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (fabricado por Olympus Corp.) (Figura 16), y se recuperaron los sobrenadantes de las mismas. El sobrenadante recuperado de las células de cada línea 24, 48 o 72 horas después se diluyó 100 veces y las cantidades de IL-7 y CCL19 secretadas en 0,5 ml del sobrenadante se midieron usando DuoSet ELISA de ratón IL-7 (DY407 fabricado por R&D Systems, Inc.), DuoSet ELISA de ratón CCL-19 (DY440 fabricado por R&D Systems, Inc.) y el kit de reactivo secundario DuoSet 2 (DY008 fabricado por R&D Systems, Inc.). Los resultados de la medición se muestran en la Figura 17.
Como se muestra en las Figuras 16 y 17, la emisión de fluorescencia de eGFP de las células A549 y las células CT26 24, 48 o 72 horas después de la infección estaba en el mismo nivel entre TK-ICE y TK-LE. La emisión de fluorescencia de eGFP se detectó en casi todas las células A54948 horas después de la infección. La emisión de fluorescencia de eGFP aumentó en las células CT26 con el paso del tiempo. IL-7 y CCL19 se detectaron 24 horas después de la infección en las células A549 y células CT26 infectadas con TK-ICE. Las cantidades de IL-7 y CCL19 en las células A549 alcanzaron casi una meseta 48 horas después de la infección. Las cantidades de IL-7 y CCL19 en las células CT26 aumentaron con el paso del tiempo. Por otro lado, las cantidades de IL-7 y CCL19 fueron iguales o inferiores a los límites de detección en las células infectadas con TK-LE. A partir de estos resultados, se confirmó que TK-ICE secreta IL-7 y CCL19 mientras destruyen las células tumorales.
[Ejemplo 9]
<Efecto antitumoral>
En el Ejemplo 8, se confirmó que el virus vaccinia genéticamente recombinante TK-ICE preparado como se describe anteriormente secreta IL-7 y CCL19 mientras destruye células cancerosas infectando las células tumorales. En consecuencia, se examinó el efecto antitumoral del virus vaccinia genéticamente recombinante TK-ICE.
Como se muestra en la Figura 18, las células CT26 de cáncer de intestino grueso de ratón (5 x 105 células) se trasplantaron por vía subcutánea a las partes abdominales derecha e izquierda de cada uno de los ratones BALB/c y se dejaron crecer. Posteriormente, cada virus vaccinia genéticamente recombinante (3 a 5 x 107 unidades formadoras de placa (PFU)) se administraron por vía intratumoral un total de tres veces (días 0, 2 y 4) a uno más grande seleccionado entre tumores formados en las partes abdominales derecha e izquierda. Luego, se estudió el efecto antitumoral del virus midiendo el diámetro del tumor en las partes abdominales derecha e izquierda. El tumor en el lado de la administración antes de la primera dosis era de 43 a 102 mm3, y el tumor en el lado donde no se administró antes de la primera dosis era de 24 a 82 mm3. Los resultados se muestran en la Figura 19.
A partir del resultado de la Figura 19, la proliferación del tumor en el lado de la administración se suprimió en el grupo al que se le administró TK-LE que no expresa ni IL-7 ni CCL19 (N = 7) en comparación con un grupo de administración de PBS (N = 8). mientras que no se observó ningún efecto supresor de tumores en el grupo sin administración. Por el contrario, la supresión de la proliferación tumoral se observó no sólo en el tumor del lado de la administración sino también en el tumor del lado sin administración en el grupo que recibió TK-ICE que expresa IL-7 y CCL19 (N = 4) en comparación con un grupo de administración de PBS (N = 4). Se confirmó que el virus vaccinia genéticamente recombinante administrado al tumor en un lado de las partes abdominales no migró al tumor del otro lado, mediante un método para detectar de forma no invasiva un virus mediante la administración de un sustrato (luciferina) para una enzima luminiscente (luciferasa) expresada en células tumorales infectadas con TK-LE, y de confirmar la presencia o ausencia de luminiscencia (no mostrado). Esto sugiere que la destrucción de células tumorales por TK-ICE, así como la secreción local de IL-7 y CCL19 al tumor, desencadena la inmunidad tumoral en un sujeto de administración al tiempo que mejora la función de memoria de las células T endógenas, confirmando así no sólo la desaparición de tumor en el lado de administración, sino la supresión de la proliferación tumoral en el lado sin administración, e inhibición de la recurrencia del tumor maligno.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un vehículo de administración de ácido nucleico, un ácido nucleico que codifica la interleucina-7 (IL-7) y un ácido nucleico que codifica el ligando 19 de quimiocina (motivo C-C) (CCL19) para usar en la inhibición de una recurrencia de un tumor maligno, en donde el vehículo de administración de ácido nucleico es una célula inmunitaria que tiene una molécula de superficie celular que reconoce un antígeno de célula tumoral maligna, y la recurrencia de tumor maligno es una recurrencia de tumor maligno atribuible a una célula tumoral maligna que no tiene antígeno de tumor maligno que sea reconocido específicamente por la molécula de superficie celular.
2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la molécula de la superficie celular que reconoce un antígeno de célula tumoral maligna es un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR).
3. La composición para uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la célula inmunitaria es una célula T.
4. Una composición farmacéutica que comprende la composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición comprende un aditivo farmacéuticamente aceptable.
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