ES2970324T3 - Adormidera con alto contenido de tebaína y métodos para producirla - Google Patents

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Abstract

Esta divulgación se refiere a la producción de plantas de adormidera que tienen altos niveles de tebaína. Más particularmente, la divulgación se refiere a la producción de adormidera que tienen altos niveles de tebaína reduciendo simultáneamente la expresión de genes que codifican la tebaína 6-0-desmetilasa (T60DM) y la codeína 3-0-desmetilasa (CODM). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Adormidera con alto contenido de tebaína y métodos para producirla
Antecedentes de la divulgación
1. Campo de la divulgación
Esta divulgación se refiere a la producción de adormidera que tiene altos niveles de tebaína. Más particularmente, la divulgación se refiere a la producción de adormideras que tienen altos niveles de tebaína mediante la reducción de forma simultánea de la expresión/actividad de la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM).
2. Descripción de la técnica relacionada
Los opioides son sustancias psicoactivas derivadas de la adormidera (Papaver somniferum) o de sus análogos sintéticos. Los opioides tienen el potencial de causar dependencia de las sustancias, que se caracteriza por un fuerte deseo de tomar opioides, control alterado sobre el uso de opioides, uso persistente de opioides a pesar de las consecuencias nocivas, una mayor prioridad dada al consumo de opioides respecto a otras actividades y obligaciones, aumento de la tolerancia y una reacción de abstinencia física cuando se suspenden los opioides. A fecha de 2014, se estimaba que 17 millones de personas padecían dependencia de los opioides (es decir, adicción a los opioides). La mayoría de las personas dependientes de opioides consumen heroína cultivada y fabricada ilícitamente. Debido a sus efectos farmacológicos, opioides en dosis altas pueden causar depresión respiratoria y la muerte. A fecha de 2014, se estima que 69.000 personas mueren cada año en todo el mundo por sobredosis de opioides.
En el Informe Mundial sobre las Drogas 2016, la Oficina de las Naciones Unidas contra la Droga y el Delito indicó que las recientes disminuciones en la producción de opio no provocarían una escasez importante en el mercado mundial de heroína, dados los altos niveles de producción de opio de años anteriores. Por tanto, puede ser necesario un período de disminución sostenida de la producción de opio para que las repercusiones se perciban en el mercado de la heroína. Sería deseable contar con un método para interrumpir la producción de opio desactivando los genes de la planta de adormidera necesarios para la producción de alcaloides psicoactivos en el campo.
Los hidroximorfinanos, tales como oxicodona, naloxona, naltrexona, nalbufina y nalmefeno, son importantes derivados de opiáceos debido a su utilidad como potentes analgésicos y/o antagonistas narcóticos. Las rutas sintéticas más prácticas para la preparación de estos productos farmacéuticos utilizan el alcaloide, tebaína, como material de partida. Otros derivados opiáceos importantes, tales como los compuestos con puentes de anillo C, buprenorpina y etorfina, también se preparan de forma más práctica a partir de tebaína.
Desafortunadamente, la tebaína es costosa debido a su disponibilidad limitada. La síntesis total es difícil y en plantas de adormidera, la tebaína normalmente se acumula a niveles bajos de solo un 0,5 a un 2 % del total de alcaloides de la adormidera. Con referencia a la Figura 1, la tebaína existe en un punto de ramificación de la biosíntesis de la morfina, siendo el sustrato de dos enzimas que compiten. La tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) convierte la tebaína en oripavina y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) convierte la tebaína en neopinona.
Se ha notificado de mutantes de la adormidera que acumulan tebaína y oripavina en lugar de morfina y codeína, incluyendo la variedad TOP1 derivada a través de mutagénesis química (Millgate et al. 2004). Aunque se sugirió que el bloqueo metabólico en TOP1 era el resultado de un defecto en la enzima que cataliza la 6-O-desmetilación de la tebaína y la oripavina, no se determinó la base bioquímica del fenotipo. Por otra parte, se utilizó una micromatriz para identificar 10 genes subexpresados en TOP1, cuya lista no incluía ninguna enzima teóricamente capaz de realizar O-desmetilación. Se depositó una línea de plantas que contiene la mutación TOP1, en virtud del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection el 20 de marzo de 2008, bajo la designación de depósito de patente de la ATCC PTA-9110. El documento WO2009/109012 divulga la mutagénesis de la línea designada PtA-91 10 para producir una línea adicional que acumula altos niveles de tebaína, la cual se depositó, en virtud del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection el 20 de marzo de 2008, bajo la designación de depósito de patente de la ATCC® PTA-9109. Sin embargo, no se exploró la base bioquímica del fenotipo.
Los investigadores han estado interesados en utilizar enfoques moleculares para modificar por ingeniería genética la adormidera para producir opioides de elección durante varios años, sin embargo, los resultados han sido en ocasiones inesperados y frustrantes. Por ejemplo, Allen et al. (Nature Biotechnology 22:1559-1556) utilizaron ARN de interferencia (ARNi) para silenciar los genes que codifican la codeinona reductasa (COR), la penúltima enzima de la biosíntesis de morfina. La COR convierte codeinona en codeína. Sin embargo, en lugar de dar como resultado la acumulación de codeinona, la eliminación de la actividad COR dio como resultado la acumulación de reticulina, es decir, siete etapas enzimáticas antes de la COR. La sorprendente acumulación de reticulina sugiere un mecanismo de retroalimentación que impide que los intermediarios de la síntesis general de bencilisoquinolina entren en la rama específica de la morfina.
Hagel y Facchini (Nature Chem Bio. 273-275; 2010; DOI: doi:10.1038/nchembio) describieron dioxigenasas que catalizan las etapas de O-desmetilación de la biosíntesis de morfina en la adormidera.
Wijekoon y Faccini (The Plant Journal 2012. 69, 1052-1063) describieron la eliminación sistemática de las enzimas de la ruta de la morfina en la adormidera mediante el silenciamiento génico inducido por virus.
Kawano et al. (Pharmaceuticals 2012, 5, 133-154; doi:10.3390/ph5020133) describieron análisis genéticos y fenotípicos de un mutante de inserción de ADN-T de Papaversomniferum con una composición de alcaloides alterada.
El documento WO 2009/109012 A1 describe una paja de adormidera mejorada, un concentrado de paja de adormidera y de opio de Papaver somniferum para la producción de tebaína que contiene poca o ninguna oripavina, codeína o morfina. El documento WO 2009/109012 A1 también proporciona plantas, rodales y semillas de Papaver somniferum y métodos para la producción de tebaína.
Sumario
Esta divulgación se refiere a la producción de adormidera que tiene altos niveles de tebaína. Más particularmente, la divulgación se refiere a la producción de adormideras que tienen altos niveles de tebaína mediante la reducción de forma simultánea de la expresión/actividad de la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM). La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a un método para aumentar la acumulación de tebaína en una planta de adormidera, el método comprende modificar genéticamente la planta para reducir simultáneamente la actividad de la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y de la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta de adormidera. El T6ODM de tipo silvestre puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. La CODM de tipo silvestre puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
En algunos casos, modificar genéticamente la planta para reducir simultáneamente la actividad de T6ODM comprende introducir una construcción de expresión para reducir la acumulación de transcritos a partir de un gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, la secuencia de la construcción de expresión para reducir la acumulación de transcritos del gen endógeno que codifica la T6ODM comprende una porción de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4. En algunos casos, modificar genéticamente la planta para reducir simultáneamente la actividad de la T6ODM comprende introducir una mutación de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la T6ODM.
En algunos casos, modificar genéticamente la planta para reducir simultáneamente la actividad de CODM comprende introducir una construcción de expresión para reducir la acumulación de transcritos de un gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, la secuencia de la construcción de expresión para reducir la acumulación de transcritos del gen endógeno que codifica la CODM comprende una porción de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4. En algunos casos, modificar genéticamente la planta para reducir simultáneamente la actividad de la CODM comprende introducir una mutación de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la CODM.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a un método para producir una planta de adormidera con niveles aumentados de tebaína en relación con una planta de tipo silvestre, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): cruzar un primer parental que tiene al menos un alelo de pérdida de función del gen que codifica la tebaína 6-0-desmetilasa con un segundo parental que tiene al menos un alelo de pérdida de función del gen que codifica la codeína 3-O-desmetilasa; y permitir que la descendencia que tiene tanto el alelo de mutación de pérdida de función del gen que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa como el alelo de pérdida de función del gen que codifica la codeína 3-O-desmetilasa se autopolinice para producir una planta que sea homocigota para la alelo de mutación de pérdida de función del gen que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa y homocigota para el alelo de pérdida de función del gen que codifica la codeína 3-O-desmetilasa.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a un método para producir una planta de adormidera con contenido aumentado de tebaína, comprendiendo el método: disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) endógena en la planta; y disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta. En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM comprende introducir o producir un alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende introducir o producir un alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM.
En algunos casos, disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM comprende expresar una primera molécula de ácido nucleico heteróloga homóloga respecto a una porción del gen endógeno que codifica la T6ODM, en donde la primera molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende introducir o producir un alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende expresar una segunda molécula de ácido nucleico heteróloga homóloga respecto a una porción del gen endógeno que codifica la CODM, en donde la segunda molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la CODM.
En algunos casos, disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga homóloga respecto a una porción del gen endógeno que codifica la CODM, en donde la molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) disminuir la actividad de la T6ODM comprende introducir o producir un alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la pérdida de función del alelo comprende una alteración o mutación puntual en el gen. La alteración puede ser una deleción o una inserción. Una inserción puede ser un ADN-T o un elemento transponible.
En algunos casos, la primera molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM mediante interferencia de ARN.
En algunos casos, la segunda molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la CODM mediante interferencia de ARN.
En algunos casos, la molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la CODM mediante interferencia de ARN.
En algunos casos, la molécula de ácido nucleico heteróloga comprende una porción de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico heteróloga comprende una porción de la SEQ ID NO: 7. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico heteróloga comprende una porción de la SEQ ID NO: 8.
En algunos casos, la T6ODM tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y la CODM tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): i) usar una metodología molecular para identificar una primera planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); ii) establecer un cruce de dicha primera planta con una segunda planta que tiene un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); iii) permitir que la descendencia del cruce se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de plantas autofecundadas para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la segunda planta que tiene el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM se identifica utilizando una metodología molecular. En algunos casos, el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM se genera mediante modificación genética de la segunda planta o de un ancestro de la misma. En algunos casos, (no reivindicada explícitamente) la segunda planta que tiene el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM es una planta de la línea depositada como ATCC PTA-9110.
Diversos aspectos de la divulgación se relacionan (no se reivindican explícitamente) con un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una primera planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); ii) establecer un cruce de dicha primera planta con una segunda planta que tiene un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); iii) permitir que la descendencia del cruce se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de plantas autofecundadas para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, (no reivindicada explícitamente) la segunda planta que tiene el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM se identifica usando una metodología molecular. En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM se genera mediante modificación genética de la segunda planta o un ancestro de la misma. En algunos casos, (no reivindicada explícitamente) la segunda planta que tiene el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM es una planta de la línea depositada como ATCC PTA-9109.
Diversos aspectos de la divulgación (no reivindicados explícitamente) se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); ii) modificar genéticamente la planta para introducir un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Diversos aspectos de la divulgación se relacionan (no se reivindican explícitamente) con un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); ii) modificar genéticamente la planta para introducir un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) en la planta mediante modificación genética; iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Diversos aspectos de la divulgación (no reivindicados explícitamente) se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); ii) modificar genéticamente la planta para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM y que tenga una expresión reducida del gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, modificar genéticamente la planta para reducir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende introducir una construcción de expresión para expresar un ARN en horquilla dirigido al gen endógeno que codifica la CODM.
Diversos aspectos de la divulgación (no reivindicados explícitamente) se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); ii) modificar genéticamente la planta para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para que tenga una expresión reducida del gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, modificar genéticamente la planta para reducir la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM comprende introducir una construcción de expresión para expresar un ARN en horquilla de direccionamiento al gen endógeno que codifica la T6ODM.
En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) la metodología molecular comprende la metodología de direccionamiento a lesiones locales inducidas en genomas (TILLING, por sus siglas en inglés).
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a una planta de adormidera producida mediante un método como el descrito anteriormente.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a una planta o célula vegetal de adormidera modificada genéticamente que tiene actividad reducida de tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y de codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en relación con una planta de tipo silvestre, en donde la planta de adormidera está modificada genéticamente para tener una expresión reducida de T6ODM y de CODM o de ambas.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la planta comprende una primera construcción de expresión para reducir la expresión de T6ODM y una segunda construcción de expresión para reducir la expresión de CODM. En algunos casos, la primera construcción de expresión comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, el gen endógeno que codifica la T6ODM codifica un ARNm que comprende tener la secuencia de la SEQ ID NO: 15. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el primer ARN en horquilla comprende una porción de la SEQ ID NO: 2.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la segunda construcción de expresión comprende una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, el gen endógeno que codifica la CODM codifica un ARNm que comprende tener la secuencia de la SEQ ID NO: 16. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el segundo ARN en horquilla comprende una porción de la SEQ ID NO: 4.
En algunos casos, la planta o célula vegetal comprende una construcción de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico para reducir la expresión de T6ODM y de CODM. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico codifica un ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico codifica un ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la T6ODM. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico codifica un único ARN en horquilla suficiente para reducir la expresión de genes endógenos que codifican la T6ODM y la CODM. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una porción de la SEQ ID NO: 2, de la SEQ ID NO: 4 o de ambas.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la construcción de expresión comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la T6ODM y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la CODM. En algunos casos, el gen endógeno que codifica la T6ODM codifica un ARNm que comprende tener la secuencia de la SEQ ID NO: 15. En algunos casos, el gen endógeno que codifica la T6ODM codifica un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 1. En algunos casos, el gen endógeno que codifica la CODM codifica un ARNm que comprende tener la secuencia de la SEQ ID NO: 16. En algunos casos, el gen endógeno que codifica la T6ODM codifica un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 3. En algunos casos, cada una de la primera molécula de la primera molécula de ácido nucleico y de la segunda molécula de ácido nucleico comprenden una porción de la SEQ ID NO: 2, de la SEQ ID NO: 4 o de ambas.
En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el (los) ARN en horquilla comprende una porción de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el (los) ARN en horquilla comprende una porción de la SEQ ID NO: 7.
En algunos casos, la primera molécula de ácido nucleico comprende una porción de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la primera molécula de ácido nucleico comprende una porción de la SEQ ID NO: 7.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la segunda molécula de ácido nucleico comprende una porción de la SEQ ID NO: 8. En algunos casos, la segunda molécula de ácido nucleico comprende una porción de la SEQ ID NO: 7.
En algunos casos, la planta o célula vegetal se modifica genéticamente para tener actividad reducida de T6ODM y la actividad reducida de CODM se confiere mediante una mutación en el gen endógeno que codifica la CODM que no se introdujo mediante modificación genética de la planta o célula vegetal. En algunos casos, la mutación (no reivindicada explícitamente) en el gen endógeno que codifica la CODM que no se introdujo mediante modificación genética de la planta o célula vegetal es la mutación presente en las semillas de la planta depositada bajo la designación de depósito de patente PTA-9109.
En algunos casos (no reivindicados de forma explícita), la planta se modifica genéticamente para tener una actividad reducida de CODM y en donde la actividad reducida de T6ODM se confiere mediante una mutación en el gen endógeno que codifica la T6ODM que no se introdujo mediante modificación genética de la planta o célula vegetal. En algunos casos, (no reivindicado explícitamente) la mutación en el gen endógeno que codifica la T6ODM que no se introdujo mediante modificación genética de la planta o célula vegetal es la mutación presente en las semillas de la planta depositada bajo la designación de depósito de patente PTA-91 10.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a una planta o célula vegetal de adormidera modificada genéticamente que tiene una expresión reducida de genes endógenos que codifican la 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM), comprendiendo la planta genéticamente modificada: una construcción de expresión transgénica que disminuye la expresión de un gen endógeno que codifica la T6ODM en la planta o célula vegetal; y una construcción de expresión transgénica que disminuye la expresión de un gen endógeno que codifica la CODM en la planta o célula vegetal.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a la semilla de una planta de adormidera como se ha descrito anteriormente.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren al uso de una planta como se ha descrito anteriormente para la producción de tebaína.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a la paja de adormidera de una planta como se ha descrito anteriormente.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren al látex aislado de una planta como se ha definido anteriormente.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a un método para producir tebaína, comprendiendo dicho método aislar tebaína del látex o de la paja de adormidera recogida de una planta como se ha descrito anteriormente.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a una molécula de ácido nucleico aislada, en donde la secuencia de la molécula de ácido nucleico comprende una porción de la SEQ ID NO: 7.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren a un vector de expresión para reducir simultáneamente la expresión de genes endógenos que codifican la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en una planta de adormidera, el vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una porción de la SEQ ID NO: 7.
Diversos aspectos de la divulgación se refieren al uso de una porción de una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia que comprende una porción de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4 para reducir simultáneamente la expresión de genes endógenos que codifican la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en una planta de adormidera.
Otros aspectos y características de la presente divulgación resultarán evidentes para los expertos habituales en la materia tras la revisión de la siguiente descripción de realizaciones específicas de la invención junto con las figuras adjuntas.
Los métodos descritos en el presente documento pueden ser útiles para producir plantas de adormidera que tengan una relación aumentada de tebaína:morfina.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para aumentar la acumulación de tebaína en una planta o célula vegetal de adormidera, comprendiendo el método modificar genéticamente el genoma de la planta o célula vegetal para incluir una o más modificaciones genéticas estables para reducir simultáneamente la actividad de la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y de la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta o célula vegetal de adormidera.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a una planta o célula vegetal de adormidera modificada genéticamente que tiene actividad reducida de tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y de codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en relación con una planta o célula vegetal de tipo silvestre, en donde la planta o célula vegetal de adormidera modificada genéticamente comprende una o más modificaciones genéticas estables para reducir la expresión de T6ODM, de CODM o de ambas.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para producir una planta de adormidera con contenido de tebaína aumentado, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): (a) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) endógena en la planta; y (b) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta, en donde disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM comprende modificar genéticamente la planta para que tenga un alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para producir una planta de adormidera con contenido de tebaína aumentado, comprendiendo el método: (a) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) endógena en la planta; y (b) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta, en donde disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM comprende expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga homóloga respecto a una porción del gen endógeno que codifica la T6ODM, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para producir una planta de adormidera con contenido de tebaína aumentado, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): (a) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) endógena en la planta; y (b) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta, en donde disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende modificar genéticamente la planta para que tenga un alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para producir una planta de adormidera con contenido de tebaína aumentado, comprendiendo el método: (a) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica una tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) endógena en la planta; y (b) disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta, en donde disminuir la expresión del gen endógeno que codifica la CODM comprende expresar una molécula de ácido nucleico heteróloga homóloga respecto a una porción del gen endógeno que codifica la CODM, en donde la expresión de la molécula de ácido nucleico heteróloga disminuye la expresión del gen endógeno que codifica la CODM.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a una planta o célula vegetal de adormidera modificada genéticamente que tiene una expresión reducida de genes endógenos que codifican la 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM), comprendiendo la planta genéticamente modificada: una construcción de expresión transgénica heredada establemente para disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la T6ODM en la planta o célula vegetal; y una construcción de expresión transgénica heredada establemente para disminuir la expresión de un gen endógeno que codifica la CODM en la planta o célula vegetal.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): i) usar una metodología molecular para identificar una primera planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); ii) establecer un cruce de dicha primera planta con una segunda planta que tiene un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); iii) permitir que la descendencia del cruce se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de plantas autofecundadas para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): i) usar una metodología molecular para identificar una primera planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); ii) establecer un cruce de dicha primera planta con una segunda planta que tiene un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); iii) permitir que la descendencia del cruce se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de plantas autofecundadas para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método (no reivindicado explícitamente): i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); ii) modificar genéticamente la planta para introducir un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la divulgación (no reivindicados explícitamente) se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); ii) modificar genéticamente la planta para introducir un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) en la planta mediante modificación genética; iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la divulgación (no reivindicados explícitamente) se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); ii) modificar genéticamente la planta para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la T6ODM y que tenga una expresión reducida del gen endógeno que codifica la CODM.
Aspectos particulares de la divulgación (no reivindicados explícitamente) se refieren a un método para generar una planta de adormidera que tiene un contenido de tebaína aumentado en relación con una planta de adormidera de tipo silvestre, comprendiendo el método: i) usar una metodología molecular para identificar una planta que comprende un alelo de pérdida de función en un gen endógeno que codifica la codeína 3-O-desmetilasa (CODM); ii) modificar genéticamente la planta para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM); iii) permitir que la planta se autofecunde; y iv) seleccionar la descendencia de la planta autofecundada para detectar una planta que sea homocigota tanto para el alelo de pérdida de función en el gen endógeno que codifica la CODM como para que tenga una expresión reducida del gen endógeno que codifica la T6ODM.
Aspectos particulares de la presente divulgación se refieren a una molécula de ácido nucleico aislada, en donde la secuencia de la molécula de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 7.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren al uso de una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia que comprende una porción de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4 para reducir simultáneamente la expresión de genes endógenos que codifican la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en una planta de adormidera.
Aspectos particulares de la divulgación se refieren a la cosecha de paja de adormidera de una planta o célula vegetal como se reivindica.
Aspectos particulares de la divulgación referidos al látex recogido de una planta o una célula vegetal según se reivindica.
Breve descripción de los dibujos
En los dibujos que ilustran las realizaciones de la divulgación,
la Figura 1 es un diagrama esquemático de la ruta de biosíntesis de morfina en la adormidera, que muestra dos rutas desde la tebaína a la morfina.
La Figura 2 es un diagrama esquemático de un casete de expresión de ARN en horquilla para expresar un ARN en horquilla que comprende secuencias de T6ODM para la reducción simultánea de la expresión de los genes que codifican la CODM y la T6ODM.
La Figura 3 es una alineación de secuencias de ADNc que codifican la CODM y la T6ODM. La parte subrayada identifica secuencias de T6ODM utilizadas en la creación de la construcción de expresión de ARN en horquilla para reducir la expresión tanto del gen endógeno que codifica la CODM como del gen endógeno que codifica la T6ODM. Las diferencias entre las secuencias de codificación de la T6ODM y de la CODM dentro de la parte subrayada están resaltadas en negro.
La Figura 4 son histogramas que muestran la expresión de los genes endógenos que codifican la CODM y la T6ODM después de la expresión transitoria de la construcción de expresión.
La Figura 5 es un histograma que muestra la expresión de la construcción de expresión en las líneas transgénicas AM1, AM2 y AM3.
La Figura 6 son histogramas que muestran la expresión reducida de los genes endógenos que codifican (A) T6ODM y (B) CODM en las líneas AM1, AM2 y AM3.
La Figura 7 es una cromatografía que muestra la acumulación de tebaína en las líneas (A) AM1, (B) AM2 y (C) AM3, en relación con (D) la línea AM10 que no tiene la construcción de expresión.
Descripción detallada
Esta divulgación se refiere a plantas de adormidera modificadas genéticamente, semillas, células, paja, descendencia de las mismas o látex producido de las mismas, cuya planta genéticamente modificada produce un látex que tiene niveles aumentados de tebaína en relación con las plantas de tipo silvestre, debido a la reducción combinada de la actividad de las enzimas tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y codeína 3-O-desmetilasa (CODM) durante la biosíntesis de opiáceos. La divulgación también se refiere a métodos para obtener tales plantas de adormidera modificadas genéticamente.
Definiciones
"Planta de adormidera" o "adormidera" como se utiliza en el presente documento se refiere a una planta de la especie Papaver somniferum.
Un "campo" de plantas, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una pluralidad de plantas de opio cultivadas juntas en estrecha proximidad.
"Actividad" o como se utiliza en el presente documento se refiere al nivel de una función particularmente enzimática en una célula vegetal. En el contexto de la presente divulgación, la actividad reducida de T6ODM se refiere a una reducción en la actividad de O-desmetilación en la posición 6, si bien la actividad de CODM reducida se refiere a una reducción en la actividad de O-desmetilación en la posición 3. La reducción de la actividad puede ser el resultado de una funcionalidad disminuida de la proteína, por ejemplo, debido a una mutación o ser el resultado de una expresión reducida de la proteína, por ejemplo, debido a una traducción reducida.
Una "modificación genética", como se utiliza en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier combinación novedosa de material genético obtenido con técnicas de biotecnología moderna. Las modificaciones genéticas incluyen, pero sin limitación, "transgenes" en los que el material genético se ha alterado mediante la inserción de material genético exógeno. Sin embargo, las modificaciones genéticas también incluyen alteraciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) en genes endógenos introducidos de forma dirigida con técnicas tales como CRISPR/Cas9, TALENS, etc., como se analiza a continuación. Sin embargo, para los fines de esta divulgación, "modificación genética" no pretende incluir nuevas combinaciones de material genético resultantes de mutaciones generadas por medios tradicionales de mutagénesis aleatoria seguidas de medios tradicionales de reproducción.
"Transgén", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un gen recombinante o material genético que se ha transferido mediante técnicas de modificación por ingeniería genética al interior de la célula vegetal. "Plantas transgénicas" o "plantas transformadas", como se utiliza en el presente documento, se refieren a plantas que han incorporado o integrado secuencias de ácido nucleico exógeno o fragmentos de ADN en la célula vegetal. Un transgén puede incluir un promotor homólogo o heterólogo unido operativamente a una molécula de ADN que codifica el ARN o el polipéptido de interés.
"Unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia de ADN, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia de ADN. Generalmente, unido operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se están uniendo son contiguas.
Una planta o célula vegetal "modificada genéticamente", como se utiliza en el presente documento, se refiere ampliamente a cualquier planta o célula vegetal que posee una modificación genética como se define en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" abarca cualquier cadena de aminoácidos naturales o no naturales (D-o L-aminoácidos), independientemente de la longitud (por ejemplo, al menos 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100 o más aminoácidos) o modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación) o la presencia, por ejemplo, de uno o más grupos no amino acilo (por ejemplo, azúcar, lípido, etc.) unido covalentemente al péptido e incluye, por ejemplo, proteínas naturales, polipéptidos y péptidos sintéticos o recombinantes, moléculas híbridas, peptoides, peptidomiméticos, etc. Como se utiliza en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" pueden usarse indistintamente.
"Secuencia de nucleótidos", "secuencia polinucleotídica", "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", como se utilizan en el presente documento, se refieren a un polímero de ADN o ARN que puede ser monocatenario o bicatenario y que opcionalmente contiene bases de nucleótidos no naturales o alteradas sintéticas capaces de incorporarse a polímeros de ADN o de ARN. "Ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "secuencia polinucleotídica" o "molécula de ácido nucleico", abarca genes, ADNc, ADN y ARN, codificados por un gen. Los ácidos nucleicos, las secuencias de ácido nucleico, la secuencia polinucleotídica y la molécula de ácido nucleico, pueden comprender al menos 3, al menos 10, al menos 100, al menos 1000, al menos 5000 o al menos 10000 nucleótidos o pares de bases.
Un "fragmento", un "fragmento del mismo", "fragmento génico" o un "fragmento génico del mismo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una porción de una "secuencia de nucleótidos", "secuencia polinucleotídica", "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" que aún puede reducir la expresión del gen que codifica la CODM y/o la T6ODM. En una realización, el fragmento comprende al menos 20, al menos 40, al menos 60, al menos 80, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 150, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450 o al menos 500 nucleótidos contiguos.
Una "variante no natural" como se utiliza en el presente documento se refiere a secuencias de ácido nucleico nativas de un organismo pero que comprenden modificaciones en uno o más de sus nucleótidos introducidas por mutagénesis.
Un "alelo" o "variante alélica", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una forma alternativa del mismo gen en una localización específica del genoma.
"Tipo silvestre", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una planta o material vegetal que no se transformó con una molécula o construcción de ácido nucleico, modificada genéticamente o mutada de otro modo, como se describe en el presente documento. Un "tipo silvestre" también puede referirse a una planta o material vegetal en el que no se redujeron la actividad de T6ODM y la actividad de CODM.
El término "identidad", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la similitud de secuencia entre dos moléculas de polipéptido o polinucleótido. La identidad se puede determinar comparando cada posición en las secuencias alineadas. Un grado de identidad entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos está en función del número de aminoácidos o ácidos nucleicos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias, por ejemplo, sobre una región específica. La alineación óptima de secuencias para comparaciones de identidad se puede realizar utilizando una variedad de algoritmos, como se conoce en la técnica, incluyendo el programa Clustal W™, disponible en http://clustalw.genome.ad.jp, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nacional. Acad. Ciencia. USA 85:2444 y las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (tales como GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete del programa informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, Estados Unidos). La identidad de secuencia también se puede determinar usando el algoritmo BLAST (por ejemplo, BLASTn y BLASTp), descrito en Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10 (usando la configuración predeterminada publicada). El software para realizar análisis BLAST está disponible a través del Centro Nacional de Información de Biotecnología (a través de internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Por ejemplo, la identidad de secuencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos se puede determinar utilizando el algoritmo BLASTn con la siguiente configuración predeterminada: umbral esperado 10; tamaño de palabra 11; puntuaciones de coincidencia/falta de coincidencia 2, -3; existencia de costes de huecos 5, extensión 2. La identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo BLASTp con la siguiente configuración predeterminada: umbral esperado 10; tamaño de palabra 3; matriz BLOSUM 62; existencia de costes de huecos 11, extensión 1. En otra realización, la persona experta en la materia puede alinear fácil y adecuadamente cualquier secuencia dada y deducir la identidad/homología de la secuencia mediante mera inspección visual.
Como se utiliza en el presente documento, el ADN y el ARN "heterólogos", "extraños" y "exógenos", se usan indistintamente y se refieren al ADN o al ARN que no se produce de forma natural como parte del genoma de la planta en la que está presente o que se encuentra en una localización o localizaciones en el genoma que difiere(n) de esa en la que se produce en la naturaleza. Por tanto, el ADN o ARN heterólogo o extraño es un ácido nucleico que normalmente no se encuentra en el genoma del hospedador en un contexto idéntico (es decir, unido a secuencias 5' y 3' idénticas). En un aspecto, el ADN heterólogo puede ser el mismo que el ADN del hospedador, pero introducido en un lugar diferente en el genoma del hospedador y/o se ha modificado mediante métodos conocidos en la técnica, donde las modificaciones incluyen, pero sin limitación, inserción en un vector, vinculado a un promotor extraño y/u otros elementos regulatorios o repetido en múltiples copias. En otro aspecto, el ADN heterólogo puede ser de un organismo diferente, una especie diferente, un género diferente o un reino diferente, como el ADN del hospedador. Además, el ADN heterólogo puede ser un transgén. Como se utiliza en el presente documento, el "transgén" se refiere a un segmento de ADN que contiene una secuencia génica que se ha aislado de un organismo y que se introduce en un organismo diferente. En el contexto de la presente divulgación, las moléculas de ácido nucleico pueden comprender ácido nucleico que es heterólogo para la planta en la que se reduce la actividad de la CODM y de la T6ODM.
"Expresión" o "que expresa", como se utiliza en el presente documento, se refiere al proceso mediante el cual la información de un gen se usa en la síntesis de un producto génico funcional y puede referirse a la producción de cualquier nivel detectable de un producto o de actividad de un producto, codificado por un gen. La expresión génica se puede modular (es decir, iniciar, aumentar, disminuir, terminar, mantener o excluir) a muchos niveles, incluida la transcripción, procesamiento del ARN, traducción, modificación postraduccional, degradación de proteínas. La expresión génica también se puede modular mediante la introducción de mutaciones que afectan a la actividad del producto génico, por ejemplo, la capacidad de un producto génico para convertir un sustrato. En el contexto de la presente divulgación, la expresión reducida del gen endógeno que codifica la CODM y/o la T6ODM o la expresión reducida de los polipéptidos CODM y/o T6ODM, puede efectuarse mediante la transcripción reducida del gen endógeno que codifica la CODM y/o la T6ODM, mediante la traducción reducida de transcritos de ARNm que codifican la CODM y/o la T6ODM o mediante la introducción de mutaciones que impiden la traducción de polipéptidos funcionales o que dan como resultado la traducción de polipéptidos con capacidades reducidas para convertir sustrato. Tal expresión reducida de los genes endógenos puede ser el resultado de la expresión de transgenes que comprenden construcciones de expresión diseñadas para reducir la expresión de los genes endógenos.
"Paja de adormidera", como se utiliza en el presente documento, se refiere al material de paja resultante de la trilla de las cápsulas de adormidera maduras y de los tallos de las cápsulas de adormidera para eliminar las semillas.
"Látex", como se utiliza en el presente documento, se refiere al exudado secado al aire lechoso de las cápsulas alanceadas de adormidera inmaduras.
La expresión "contenido de tebaína aumentado" o "nivel aumentado de tebaína" como se utiliza en el presente documento se refiere a niveles significativamente aumentados de tebaína en uno o más tejidos en comparación con los niveles de tebaína en una planta de tipo silvestre correspondiente. El término "aumentado" también abarca niveles de tebaína que están significativamente aumentados en uno o más tejidos en comparación con los mismos tejidos de una planta de tipo silvestre, si bien los niveles de tebaína de tipo silvestre persisten en otras partes de la planta.
La expresión "contenido reducido de morfina", como se utiliza en el presente documento, se refiere a niveles significativamente disminuidos de morfina en uno o más tejidos en comparación con los niveles de morfina en una planta de tipo silvestre correspondiente. El término "reducido" también abarca niveles de morfina que están significativamente reducidos en uno o más tejidos en comparación con los mismos tejidos de una planta de tipo silvestre, si bien los niveles de morfina de tipo silvestre persisten en otras partes de la planta.
"Disminuir la expresión", "disminuir la actividad", "reducir la expresión" y "reducir la actividad", pretenden abarcar términos equivalentes bien conocidos en relación con la expresión y la actividad, tales como "inhibir", "regular negativamente", "atenuar", "silenciar", etc.
"Sustancialmente sin" cuando se refiere al contenido de alcaloides significa que el alcaloide particular o la combinación de alcaloides constituye menos de un 0,6 % en peso, preferentemente, menos de un 0,5 % en peso, más preferentemente, menos de un 0,4 % en peso o menos de un 0,2 % en peso de la combinación de alcaloides de la paja de adormidera, concentrado de paja de adormidera o de opio.
La expresión "construcción de expresión" pretende incluir cualquier tipo de construcción genética que contenga un ácido nucleico que codifique un producto génico en el que parte o la totalidad de la secuencia que codifica el ácido nucleico pueda transcribirse. La transcripción puede traducirse en una proteína, pero no tiene por qué ser así. En determinadas realizaciones, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción del ARNm en un producto génico. En otras realizaciones, la expresión solo incluye la transcripción del ácido nucleico que codifica un gen de interés en un ARNip, por ejemplo.
Una construcción de expresión de la molécula de ácido nucleico de la divulgación puede comprender además un promotor y otros elementos reguladores, por ejemplo, un potenciador, un silenciador, un sitio de poliadenilación, un terminador de la transcripción, un marcador seleccionable o un marcador detectable.
Como se utiliza en el presente documento, un "vector" o una "construcción" puede referirse a cualquier molécula de polinucleótido recombinante, tal como un plásmido, cósmido, virus, vector, molécula polinucleotídica que se replica de forma autónoma, fago o molécula polinucleotídica de ADN o ARN monocatenario o bicatenario, lineal o circular, obtenidas de cualquier fuente. Un "vector" o una "construcción" puede comprender un promotor, un sitio de poliadenilación, un potenciador o silenciador y un terminador de transcripción, además de una secuencia de nucleótidos que codifica un gen o un fragmento de gen de interés. Como se utiliza en el presente documento, un "vector de transformación" puede referirse a un vector utilizado en la transformación o en la introducción de ADN en células, plantas o materiales vegetales.
Como se utiliza en el presente documento, un "promotor" se refiere a una secuencia de nucleótidos que dirige el inicio y la velocidad de transcripción de una secuencia codificante (revisado en Roeder, Trends Biochem Sci, 16: 402, 1991). El promotor contiene el sitio al que se une la ARN polimerasa y también contiene sitios para la unión de otros elementos reguladores (tales como factores de transcripción). Los promotores pueden ser de origen natural o sintéticos (véase Datla et al. Biotech Ann. Rev 3:269, 1997 para revisión de promotores de plantas). Además, los promotores pueden ser específicos de especie (por ejemplo, activos solo en B. napus); específicos de tejidos (por ejemplo, los promotores específicos de semillas de napina, faseolina, zeína, globulina, dlec2, Y-kafirina); específicos del desarrollo (por ejemplo, activo solo durante la embriogénesis); constitutivos (por ejemplo, promotores del gen de ubiquitina de maíz, ubiquitina de arroz, actina de arroz, actina de Arabidopsis, virus baciliforme de caña de azúcar, CsVMV y CaMV 35S, poliubiquitina de Arabidopsis, poliubiquitina de Solanum bulbocastanum, nopalina sintasa derivada de Agrobacterium tumefaciens, octopina sintasa y manopina sintasa); o inducibles (por ejemplo, el promotor de estilbeno sintasa y los promotores inducidos por luz, calor, frío, sequía, heridas, hormonas, estrés y productos químicos). Un promotor incluye un promotor mínimo que es una secuencia corta de ADN compuesta por una caja TATA o un elemento Inr y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de inicio de la transcripción, a lo que se añaden elementos reguladores para el control de la expresión. Un promotor también puede referirse a una secuencia de nucleótidos que incluye un promotor mínimo más elementos de ADN que regulan la expresión de una secuencia codificante, tales como potenciadores y silenciadores. Por tanto, en un aspecto, la expresión de las construcciones de la presente divulgación puede regularse seleccionando un promotor específico de especie, uno específico de tejido, uno específico de desarrollo o uno inducible.
"Promotor constitutivo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un promotor que impulsa la expresión de la región codificante localizada aguas abajo en una pluralidad o en todos los tejidos, independientemente de los factores ambientales o de desarrollo.
La persona experta entenderá que sería importante utilizar un promotor que dirija eficazmente la expresión de la construcción en el tejido en el que se sintetiza tebaína. Por ejemplo, podrían usarse los promotores endógenos de T6ODM o de CODM. Como alternativa, se pueden emplear promotores constitutivos, específicos de tejido o inducibles, útiles en las condiciones adecuadas para dirigir la expresión de alto nivel de la construcción de expresión introducida durante la biosíntesis de opioides.
Los potenciadores y los silenciadores son elementos del ADN que afectan positiva o negativamente a la transcripción de un promotor vinculado, respectivamente (revisado en Blackwood y Kadonaga, Science, 281: 61, 1998).
El sitio de poliadenilación se refiere a una secuencia de ADN que señala a la maquinaria de transcripción del ARN que añada una serie del nucleótido A a aproximadamente 30 pb aguas abajo del sitio de poliadenilación.
Los terminadores de la transcripción son secuencias de ADN que señalan la terminación de la transcripción. Los terminadores de la transcripción son conocidos en la técnica. El terminador de la transcripción puede derivar de Agrobacterium tumefaciens, tal como los aislados de los genes de la nopalina sintasa, manopina sintasa, octopina sintasa y otros marcos de lectura abiertos de plásmidos Ti. Otros terminadores pueden incluir, sin limitación, los aislados de CaMV y otros virus de ADN, genes de dlec2, zeína, faseolina, lipasa, osmotina, peroxidasa, Pinll y ubiquitina, por ejemplo, de Solanum tuberosum.
En el contexto de la divulgación, la construcción de ácido nucleico puede comprender además un marcador seleccionable. Se pueden usar marcadores seleccionables para seleccionar plantas o células vegetales que contienen el material genético exógeno. El material genético exógeno puede incluir, pero no se limita a, una enzima que confiere resistencia a un agente, tal como un herbicida o un antibiótico o una proteína que notifica la presencia de la construcción.
En la técnica se conocen numerosos sistemas de marcadores seleccionables de plantas y son coherentes con esta invención. El siguiente artículo de revisión ilustra estos sistemas bien conocidos: Miki y McHugh; Journal of Biotechnology 107: 193-232; Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety (2004).
Los ejemplos de un marcador seleccionable incluyen, pero sin limitación, un neogen, que codifica la resistencia a la kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina, Nptll, G418, hpt, etc.; un gen de resistencia a amp para la selección con el antibiótico ampicilina; un gen de higromicinaR para resistencia a higromicina; un gen BAR (que codifica la fosfinotricina acetil transferasa) que codifica la resistencia al bialafos, incluyendo los descritos en el documento WO/2008/070845; un gen mutante de la EPSP sintasa, aadA, que codifica la resistencia al glifosato; un gen de nitrilasa, que confiere resistencia al bromoxinilo; un gen mutante de la acetolactato sintasa (ALS), que confiere resistencia a imidazolinonas o sulfonilureas, ALS y un gen DHFR resistente al metotrexato.
Además, los marcadores detectables que pueden usarse en el contexto de la invención incluyen, pero sin limitación, un gen de p-glucuronidasa o uidA (GUS), que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogénicos, proteína fluorescente verde (GFP) y luciferasa (LUX).
Producción de alcaloides en Papaver somniferum
La Figura 1 es un diagrama esquemático que representa dos rutas de biosíntesis de morfina a partir de tebaína. La O-desmetilación de la tebaína en la posición 6 (anillo C) se cataliza mediante la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM), si bien la O-desmetilación en la posición 3 (anillo A) se cataliza mediante la codeína O-desmetilasa (CODM). Por tanto, la tebaína puede sufrir O-desmetilación en la posición 6 o 3 para producir neopinona u oripavina, respectivamente. La neopinona se convierte espontáneamente en codeinona, que a continuación, se reduce a codeína mediante la codeinona reductasa (COR). La CODM desmetila la codeína en la posición 3 para producir morfina. La desmetilación de oripavina en la posición 6 por T6ODM produce morfinona, que a continuación, se reduce a morfina mediante la COR.
El presente inventor planteó la hipótesis de que podría ser posible producir plantas que contuvieran niveles elevados de tebaína y niveles reducidos de codeína y de morfina, en comparación con las plantas parentales, mediante la reducción simultánea de la actividad de las enzimas T6ODM y CODm .
Las secuencias de aminoácidos de tipo silvestre de las enzimas T6ODM y CODM se presentan en las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente. La secuencia de ADNc correspondiente al gen endógeno que codifica la enzima T6ODM se presenta como la SEQ ID NO: 2 y la secuencia de ADNc correspondiente al gen endógeno que codifica la enzima CODM se presenta como la SEQ ID NO: 4. Sin embargo, la persona experta comprenderá fácilmente que pueden existir variaciones naturales en los genes de T6ODM y CODM entre variedades, con secuencias de ácidos nucleicos ligeramente diferentes que codifican la misma proteína funcional.
Reducción de la actividad o expresión de CODM y de T6ODM
La expresión y/o actividad de la CODM y de la T6ODM en plantas genéticamente modificadas de la presente divulgación se puede reducir mediante cualquier método que dé como resultado una actividad reducida de estas enzimas en la planta. Esto se puede lograr, por ejemplo, alterando la actividad de CODM y de T6ODM en el ADN, ARNm y/o niveles de proteínas.
Como se utiliza en el presente documento, "actividad" se refiere a la reacción bioquímica de una enzima con su sustrato afín. En el contexto de la invención, la actividad reducida de T6ODM (o CODM) puede ser el resultado de niveles reducidos de proteína de la enzima T6ODM (o CODM) y/o la velocidad reducida a la que una enzima T6ODM (o CODM) cataliza su reacción con la tebaína.
Genes endógenos mutantes que codifican la CODM y la T6ODM
En un aspecto (no reivindicado de forma explícita), la presente divulgación se refiere a modificaciones genéticas de direccionamiento a los genes endógenos que codifican la CODM y la T6ODM para alterar la expresión y/o actividad de la CODM y la T6ODM. Los genes endógenos de CODM y de T6ODM pueden verse alterados por, sin limitación, atenuación de los genes de CODM y de T6ODM; o inserción en un ADN heterólogo para alterar los genes de CODM y de T6ODM. La persona experta entenderá que estos enfoques pueden aplicarse a las secuencias codificantes, el promotor u otros elementos reguladores necesarios para la transcripción génica. Por ejemplo, se pueden utilizar tecnologías como CRISPR/Cas9 y TALENS para introducir mutaciones de pérdida de función tanto en los genes endógenos que codifican la CODM como la T6ODM. Las plantas que tienen al menos un alelo de cada gen que comprende tales mutaciones de pérdida de función pueden autofecundarse después para producir una descendencia homocigota para los alelos de pérdida de función en los genes que codifican la CODM y la T6ODM. En algunas realizaciones (no reivindicadas explícitamente), la modificación genética del gen endógeno que codifica la enzima CODM (o T6ODM) da como resultado un polipéptido que difiere en la secuencia en una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos y que tiene actividad de CODM (o T6ODM) disminuida o nula.
Las deleciones implican la falta de uno o más restos de la proteína endógena. Para los fines de esta divulgación, una variante de deleción incluye realizaciones en las que no se traducen aminoácidos de la proteína endógena, por ejemplo, donde se sustituye o elimina la metionina inicial de "inicio".
Las mutaciones de inserción normalmente implican la adición de material en un punto no terminal del polipéptido, pero pueden incluir proteínas de fusión que comprenden adiciones amino terminal y carboxi terminal. Las variantes con sustitución normalmente implican una sustitución de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína y pueden estar diseñadas para modular una o más propiedades del polipéptido. Las sustituciones de este tipo, en algunas realizaciones, pueden ser conservadoras, es decir, donde un aminoácido se reemplaza por uno de forma, tamaño, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, etc. similar. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.
Por consiguiente, la enzima CODM puede tener una secuencia de aminoácidos que posee al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, la enzima T6ODM puede tener una secuencia de aminoácidos que posee al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.
Expresión de transgenes de direccionamiento a genes endógenos
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a la reducción de la expresión y/o de la actividad de la CODM y de la T6ODM mediante el direccionamiento a sus transcritos de ARNm respectivos. En este sentido, los niveles de transcritos de ARNm T de CODM y T6ODM se pueden reducir mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen, aunque no de forma limitativa, co-supresión, expresión no codificante, expresión de horquillado pequeño (ARNhp), expresión de ARN de interferencia (ARNi), expresión de doble cadena (ARNbc), expresión repetida invertida de ARNbc, micro ARN (miARN) de interferencia, expresión simultánea de secuencias codificantes y no codificantes o una combinación de las mismas.
En una realización, la presente divulgación se refiere al uso de moléculas de ácido nucleico que son complementarias o esencialmente complementarias, de al menos una porción de las moléculas expuestas en la SEQ ID NO: 2 o en la SEQ ID NO: 4. Las moléculas de ácido nucleico que son "complementarias" son las que son capaces de aparear bases de acuerdo con las reglas complementarias convencionales de Watson-Crick. Como se utiliza en el presente documento, el término "secuencias complementarias" significa secuencias de ácidos nucleicos que son sustancialmente complementarias, como se puede evaluar mediante la misma comparación de nucleótidos establecida anteriormente o como se ha definido como capaz de hibridarse con el segmento de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4 en condiciones relativamente estrictas, tales como las descritas en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser sustancialmente complementarias (o son homólogas/tienen identidad) si las dos secuencias se hibridan entre sí en condiciones moderadamente estrictas o preferiblemente estrictas. La hibridación con secuencias unidas a filtros en condiciones moderadamente estrictas puede realizarse, por ejemplo, en NaHPO40,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7 %, EDTA 1 mM a 65 °C y lavado en 0,2*SSC/SDS al 0,1 % a 42 °C (véase Ausubel, et al. (ed.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, págs. 2,10,3). Como alternativa, la hibridación con secuencias unidas a filtros en condiciones estrictas puede realizarse, por ejemplo, en NaHPO40,5 M, SDS al 7 %, EDTA 1 mM a 65 °C y lavado en 0,1*SSC/SDS al 0,1 % a 68 °C (véase Ausubel, et al. (ed.),1989, anteriormente citado). Las condiciones de hibridación pueden modificarse de acuerdo con métodos conocidos dependiendo de la secuencia de interés (véase Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y.). Generalmente, las condiciones estrictas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos.
El fenómeno de cosupresión en plantas se refiere a la introducción de copias transgénicas de un gen que da como resultado la expresión reducida del transgén, así como del gen endógeno. El efecto observado depende de la identidad de secuencia entre el transgén y el gen endógeno.
La expresión "interferencia de ARN" (ARNi) se refiere a métodos bien conocidos para regular negativamente o silenciar la expresión de un gen natural en una planta hospedadora. El ARNi emplea una molécula de ARN bicatenario o un ARN en horquilla corto para cambiar la expresión de una secuencia de ácido nucleico con la que comparten una homología sustancial o total. Para una revisión, véase, por ejemplo, Agrawal, N. et al. (2003) Microbiol Mol Biol Rev.
67(4): 657-685. El ARN es tanto un iniciador como una diana en el proceso. Este mecanismo se dirige al ARN de virus y transposones y también desempeña un papel en la regulación del desarrollo y el mantenimiento del genoma. Brevemente, el ARN bicatenario se escinde mediante la enzima dicer, lo que da como resultado fragmentos cortos de 21 a 23 pb (ARNip). Una de las dos cadenas de cada fragmento se incorpora al complejo silenciador inducido por ARN (RISC, por sus siglas en inglés). La cadena de ARN asociada a RISC se empareja con el ARNm e induce la escisión del ARNm. Como alternativa, los pares de cadenas de ARN asociados a RISC con el ADN genómico dan como resultado cambios epigenéticos que afectan la transcripción génica. El micro ARN (miARN) es un tipo de ARN transcrito del propio genoma y funciona de manera similar. De forma similar, el ARNhp puede escindirse mediante dicer y asociarse con RISC, lo que da como resultado la escisión del ARNm.
Se han notificado ejemplos específicos de silenciamiento de genes en la adormidera utilizando enfoques de ARNi. En 2008, Allen et al. notificaron la supresión del gen que codifica la enzima salutaridinol 7-O-acetiltransferasa (SalAT) de la ruta del morfinano en la adormidera. La supresión de SalAT mediada por ARN en horquilla dio como resultado la acumulación de salutaridina en un 23% del total de alcaloides. Como se ha analizado anteriormente en la descripción de la técnica relacionada, Allen et al. (2004) silenciaron la codeinona reductasa (COR) en la adormidera utilizando una construcción quimérica de ARN en horquilla diseñada para silenciar a todos los miembros de la familia COR multigénica a través de ARNi.
La supresión no codificante de la expresión génica no implica la catálisis de la degradación del ARNm, sino que implica que fragmentos de ARN monocatenario se unan al ARNm y bloqueen la traducción de proteínas.
Tanto la supresión no codificante como la supresión codificante están mediadas por ARN silenciadores (ARNs) producidos a partir de un híbrido codificante-no codificante o a partir de un ARN bicatenario (ARNbc) generado por una ARN polimerasa dependiente de ARN. Las principales clases de ARNs incluyen ARN de interferencia corto (ARNic) y microARN (miARN), que difieren en su biosíntesis.
El procesamiento de precursores de ARNbc mediante complejos similares a Dicer produce ARNip de 21 nucleótidos y los miARN guían la escisión de los transcritos diana desde el interior de los complejos silenciadores inducidos por ARN (RISC).
La expresión de T6ODM y de CODM se puede suprimir usando uno o más genes sintéticos o genes no relacionados que contengan regiones de aproximadamente 21 pb o más de homología elevada (preferentemente un 100 % de homología) con las secuencias codificantes endógenas para T6ODM y CODM.
Véase, por ejemplo, Jorgensen R A, Doetsch N, Müller A, Que Q, Gendler, K y Napoli C A (2006) A paragenetic perspective on integration of RNA silencing into the epigenome and in the biology of higher plants. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 71:481-485. Para una revisión adicional, véase, por ejemplo, Ossowski S, Schwab R y Weigel D (2008) Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs. The Plant Journal 53:674-690.
También se pueden usar en el contexto de la divulgación moléculas de ácido nucleico que son sustancialmente idénticas a porciones de las secuencias codificantes endógenas para CODM y T6ODM. Como se utiliza en el presente documento, una molécula de ácido nucleico puede ser "sustancialmente idéntica" a otra si las dos moléculas tienen al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 82,5 %, al menos un 85 %, al menos un 87,5 %, al menos un 90 %, al menos un 92,5 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia. Por tanto, una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 92,5 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 2 o a la SEQ ID NO: 4, puede ser adecuada para su uso en el contexto de esta divulgación. En una realización, las dos moléculas de ácido nucleico comprenden cada una al menos 20 nucleótidos contiguos idénticos.
Se pueden usar fragmentos de secuencias de ácido nucleico que codifican la CODM o la T6ODM. Dichos fragmentos pueden tener longitudes de al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 300 o al menos 400 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácido nucleico que codifica una CODM o una T6ODM, según sea el caso. Como alternativa, tales fragmentos pueden tener una longitud mínima de al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45 o al menos 50 nucleótidos contiguos y una longitud máxima de menos de 3000, menos de 2000, menos de 1750, menos de 1500, menos de 1250, menos de 1000, menos de 750 o menos de 500 nucleótidos contiguos o cualquier combinación de tales longitudes mínima y máxima de una secuencia de ácido nucleico que codifica la CODM o la T6ODM, según sea el caso.
En una realización (no reivindicada explícitamente), una planta de adormidera modificada genéticamente de la divulgación comprende, integrado establemente en su genoma, una primera molécula de ácido nucleico heteróloga respecto a la planta. La primera molécula de ácido nucleico codifica un ARN, por ejemplo, un ARN en horquilla, para reducir la expresión de la enzima CODM. La planta de adormidera modificada genéticamente comprende además una segunda molécula de ácido nucleico heteróloga respecto a la planta. La segunda molécula de ácido nucleico codifica un ARN, por ejemplo, un ARN en horquilla, para reducir la expresión de la enzima T6ODM.
La primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden estar presentes en una única construcción genética o en múltiples construcciones. En una realización (no reivindicada explícitamente), la primera y/o la segunda molécula(s) de ácido nucleico puede(n) estar dispuesta(s) en orientación codificante en relación con un promotor. En otra realización (no reivindicada de forma explícita), la primera y/o la segunda molécula(s) de ácido nucleico puede(n) estar dispuesta(s) en orientación no codificante en relación con un promotor. En una realización adicional, una construcción genética puede comprender al menos dos moléculas de ácido nucleico en ambas orientaciones codificante y no codificante, en relación con un promotor. Una construcción genética que comprende ácidos nucleicos, tanto en orientaciones codificantes como no codificantes, puede dar como resultado transcritos de ARNm capaces de formar estructuras de tallo-lazo (horquilla).
Una o ambas moléculas de ácido nucleico pueden estar bajo control transcripcional del mismo promotor.
En diversos casos (no reivindicados explícitamente), la primera y segunda moléculas de ácido nucleico heterólogas comprenden respectivamente:
al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 300 o al menos 400 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácido nucleico que posee al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4;
al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 300 o al menos 400 nucleótidos contiguos de una secuencia de ácido nucleico que posee al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
En diversos casos (no reivindicados explícitamente), la primera y segunda moléculas de ácido nucleico comprenden respectivamente:
una molécula de ácido nucleico con una longitud mínima de al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45 o al menos 50 nucleótidos contiguos y una longitud máxima de menos de 1750, menos de 1500, menos de 1250, menos de 1000, menos de 750 o menos de 500 nucleótidos contiguos o cualquier combinación de dichas longitudes mínima y máxima de una secuencia de ácido nucleico que posea al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4; y
una molécula de ácido nucleico con una longitud mínima de al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45 o al menos 50 nucleótidos contiguos y una longitud máxima de menos de 1750, menos de 1500, menos de 1250, menos de 1000, menos de 750 o menos de 500 nucleótidos contiguos o cualquier combinación de dichas longitudes mínima y máxima de una secuencia de ácido nucleico que posea al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % de identidad de secuencia respecto de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
La persona experta también apreciará que la reducción de la actividad de la CODM y de la T6ODM puede no estar limitada por el número de moléculas de ácido nucleico diferentes introducidas en una planta o célula vegetal. En una realización, una molécula de ácido nucleico puede dirigirse a uno o ambos genes endógenos que codifican las enzimas. Por consiguiente, en otra realización, una planta de adormidera modificada genéticamente de la divulgación comprende, integrado establemente en su genoma, una molécula de ácido nucleico heteróloga respecto a la planta. La molécula de ácido nucleico codifica un transcrito único que comprende un ARN (por ejemplo, un ARN en horquilla) para reducir la expresión de la enzima CODM y un ARN (por ejemplo, un ARN en horquilla) para reducir la expresión de la enzima T6ODM. En la realización funcional ilustrada específicamente en esta divulgación, la molécula de ácido nucleico codifica un único transcrito que comprende un único ARN en horquilla para reducir la expresión tanto de la enzima CODM como de la enzima T6ODM.
En un aspecto, una molécula de ácido nucleico puede comprender una(s) porción(ones) de la secuencia codificante de CODM (SEQ ID NO: 4); T6ODM (SEQ ID<n>O: 2); una variante alélica de la misma; una variante no natural de la misma; un fragmento de la misma; o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, un fragmento de la secuencia codificante de T6ODM (SEQ ID NO: 2) es adecuado para la producción de una construcción de expresión que codifica una horquilla de ARNi que se dirige a la expresión de las secuencias codificantes endógenas tanto de CODM como de T6ODM. En la realización funcional ilustrada específicamente en esta divulgación, tal fragmento comprende la SEQ ID NO: 7. En la realización funcional ilustrada específicamente en esta divulgación, tal construcción de expresión comprende la SEQ ID NO: 5. En la realización funcional ilustrada específicamente en esta divulgación, la horquilla de ARNi está codificada por un ácido nucleico que comprende la SEQ iD NO: 6.
Una construcción de expresión que comprende ácidos nucleicos en ambas orientaciones en relación con un promotor puede comprender además un espaciador para separar las moléculas de ácido nucleico en orientación codificante y las de la orientación no codificante. Como se utiliza en el presente documento, un "espaciador" puede comprender al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 150 o al menos 200 nucleótidos.
La persona experta también comprenderá fácilmente que aunque en los ejemplos ilustrativos anteriores se sugirieron secuencias codificantes parciales de CODM y de T6ODM para construir las construcciones de CODM y de T6ODM, también se pueden utilizar secuencias de codificación completas de CODM y de T6ODM, secuencias codificantes alternativas de CODM y/o de T6ODM, 5'UTR y/o 3'UTR o derivados mutados de estas secuencias. El número máximo de moléculas de ácido nucleico que se pueden usar en el contexto de la invención puede estar limitado únicamente por el tamaño máximo de la construcción que se puede administrar a una planta o célula vegetal diana usando un método de transformación determinado.
En diversas realizaciones (no reivindicadas explícitamente), las plantas genéticamente modificadas de la presente divulgación pueden comprender además una tercera molécula de ácido nucleico heteróloga respecto a la planta. La tercera molécula de ácido nucleico sirve para aumentar la expresión de Cyp80B3 para aumentar el nivel total de morfinanos.
Expresión de transgenes de direccionamiento a los polipéptidos endógenos CODM y T6ODM
En un aspecto adicional, (no reivindicado explícitamente) la divulgación se refiere a la reducción de la actividad de la CODM y/o de la T6ODM mediante el direccionamiento a la CODM y a la T6ODM al nivel de proteína. Por ejemplo, la actividad de CODM (o T6ODM) puede reducirse mediante la afectación de la modificación postraduccional de la enzima; o mediante la introducción de una proteína heteróloga (por ejemplo, se puede expresar una forma mutada de CODM o (T6ODM) de modo que se asocie con la enzima de tipo silvestre y altere su actividad o sea más competitiva que la enzima de tipo silvestre por el sustrato sin poder convertir el sustrato; o un anticuerpo que se una específicamente a la enzima CODM (o T6ODM).
La persona experta también apreciará que en el contexto de la invención se puede utilizar una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de un promotor del gen de CODM o de T6ODM y/u otros elementos reguladores. En una realización, se puede usar una molécula de ácido nucleico heteróloga que comprende secuencias de un promotor génico de CODM (o de T6ODM, según sea el caso) y/o de un elemento regulador para desviar la maquinaria celular de un promotor génico endógeno de CODM (o de T6OD<m>, según sea el caso), por tanto, dando como resultado una expresión reducida de CODM (o de T6ODM).
El tamaño o longitud de la construcción de ácido nucleico o de los elementos de la misma, no se limita a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. Por ejemplo, la persona experta apreciaría que el tamaño de un elemento transgénico puede definirse más bien por la función del elemento transgénico; y en cambio, que el elemento promotor puede determinarse como uno que sea capaz de impulsar la transcripción a un nivel suficiente y en los tejidos deseados. De forma similar, la estructura de tallo-lazo formada por el ARNm transcrito por una construcción de ácido nucleico de la invención, puede comprender varios segmentos de genes que pueden variar en longitud. Por ejemplo, el tallo-lazo puede comprender 3 segmentos de genes de aproximadamente 21-30 pares de bases cada uno, además de un espaciador, tal como un intrón (126 pb más intrón).
La persona experta apreciará que el tamaño de los segmentos génicos puede establecerse mediante la suma de los tamaños de los elementos combinados y puede depender del método de transformación utilizado para suministrar el transgén en el organismo diana. Por ejemplo, cada método de transformación (Agrobacterium, biolística, sistemas de suministro basados en VIGS) pueden estar limitados a tamaños máximos teóricos de transgenes.
Transformación de plantas
La introducción de ADN en células vegetales mediante transferencia mediada por Agrobacterium es bien conocida por los expertos en la técnica. Si, por ejemplo, los plásmidos Ti o Ri se utilizan para la transformación de la célula vegetal, al menos el borde derecho, aunque lo más frecuente es que tanto el borde derecho como el izquierdo del ADN-T contenido en el plásmido Ti o Ri deben unirse a los genes que se van a insertar como región flanqueante. Si se utilizan agrobacterias para la transformación, el ADN que se va a integrar debe clonarse en plásmidos especiales y específicamente en un vector intermedio o binario. Los vectores intermedios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri de las agrobacterias mediante recombinación homóloga debido a unas secuencias, que son homólogas a secuencias en el ADN-T. Este también contiene la región vir, que es necesaria para la transferencia de ADN-T. Los vectores intermedios no pueden replicarse en las agrobacterias. El vector intermedio se puede transferir a Agrobacterium tumefaciens mediante un plásmido auxiliar (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse en E. coli, así como en agrobacterias. Contienen un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador enmarcado por la región de borde derecha e izquierda del ADN-T. Se pueden transformar directamente en agrobacterias. El Agrobacterium que actúa como célula hospedadora debe contener un plásmido que lleve una región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede haber<a>DN-T adicional. Tal Agrobacterium transformado se utiliza para la transformación de células vegetales. El uso del ADN-T para la transformación de células vegetales se ha estudiado intensamente y se ha descrito adecuadamente en artículos de revisión y manuales convencionales sobre transformación de plantas. Para la transferencia de ADN al interior de la célula vegetal se pueden utilizar explantes de plantas cultivadas con este fin con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes.
La transformación de Agrobacterium se puede utilizar para transformar plantas de adormidera (Chitty et al. (Meth. Molec. Biol, 344:383-391; Chitty et al. (Functional Plant Biol, 30: 1045-1058); Facchini et al. (Plant Cell Rep., 27(4):719-727)). Facchini et al. (2008) divulgaron un protocolo de transformación genética mediada por A. tumefaciens mediante embriogénesis somática para la producción de plantas de adormidera resistentes a herbicidas fértiles. La transformación estuvo mediada por el uso de pCAMBIA3301, un vector de transformación que alberga el gen de la fosfinotricina acetiltransferasa (pat) impulsado por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el gen de la p-glucuronidasa (GUS) también impulsado por el promotor 35S del CaMV. Los explantes se cultivaron conjuntamente con A. tumefaciens en presencia de 50 ATP 1 M y 50 MgCl2 1 M. A continuación, se utilizaron para la transformación explantes de raíces cultivados previamente en medio de inducción de callos. El callo proliferante resistente a herbicidas se obtuvo a partir de explantes en un medio que contenía ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y 6-benciladenina (BA). El callo embriogénico globular se indujo mediante la eliminación del BA del medio y se colocó en un medio sin hormonas para formar embriones somáticos. Los embriones somáticos se convirtieron en plántulas en condiciones de cultivo específicas y se transfirieron al suelo. Se dejó que las plantas maduraran y produjeran semillas. Se detectaron transcritos de PAT y GUS y actividades enzimáticas en las líneas transgénicas analizadas.
No obstante, la presente invención no se limita a ningún método particular para transformar células vegetales y la persona experta comprenderá fácilmente que se puede utilizar cualquier otro método adecuado de transferencia de ADN a una planta. Los métodos para introducir ácidos nucleicos en células (también denominados en el presente documento "transformación") son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación: métodos víricos (Clapp. Clin Perinatol, 20: 155-168, 1993; Lu et al. J Exp Med, 178: 2089-2096, 1993; Eglitis and Anderson. Biotechniques, 6: 608 614, 1988; Eglitis et al., Avd Exp Med Biol, 241: 19-27, 1988); métodos físicos, tales como microinyección (Capecchi. Cell, 22: 479-488, 1980), electroporación (Wong y Neumann. Biochim Biophys Res Commun, 107: 584-587, 1982; Fromm et al., Proc Natl Acad Sci USA, 82: 5824-5828, 1985; Patente de Ee . UU. n.° 5.384.253) y la pistola génica (Johnston y Tang. Methods Cell Biol, 43: 353-365, 1994; Fynan et al. Proc Natl Acad Sci USA, 90: 11478-11482, 1993); métodos químicos (Graham y van der Eb. Virology, 54: 536-539, 1973; Zatloukal et al. Ann NY Acad Sci, 660: 136 153, 1992); y métodos mediados por receptores (Curiel et al. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 8850-8854, 1991; Curiel et al. Hum Gen Ther, 3: 147-154, 1992; Wagner et al. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 6099-6103, 1992).
Otro método para introducir ADN en células vegetales es la biolística. Este método implica el bombardeo de células vegetales con partículas microscópicas (como partículas de oro o tungsteno) recubiertas con ADN. Las partículas se aceleran rápidamente, normalmente mediante gas o descarga eléctrica, a través de la pared celular y las membranas, mediante lo cual el ADN se libera en la célula y se incorpora al genoma de la célula. Este método se utiliza para la transformación de muchos cultivos, incluyendo maíz, trigo, cebada, arroz, especies de árboles leñosos y otros. Se ha demostrado que el bombardeo biolístico es eficaz en la transfección de una amplia variedad de tejidos animales, así como en microbios tanto eucariotas como procarióticos, mitocondrias y cloroplastos microbianos y vegetales (Johnston. Nature, 346: 776-777, 1990; Klein et al. Bio/Technol, 10: 286-291, 1992; Pecorino y Lo. Curr Biol, 2: 30-32, 1992; Jiao et al., Bio/Technol, 11: 497-502, 1993).
Otro método para introducir ADN en células vegetales es mediante electroporación. Este método implica un pulso de alto voltaje aplicado a protoplastos/células/tejidos, lo que da como resultado poros transitorios en la membrana plasmática que facilita la absorción de ADN extraño. El ADN extraño entra a través de los orificios al citoplasma y a continuación, al núcleo.
Las células vegetales se pueden transformar mediante transferencia de genes mediada por liposomas. Este método se refiere al uso de liposomas, moléculas lipídicas circulares con un interior acuoso, para suministrar ácidos nucleicos a las células. Los liposomas encapsulan fragmentos de ADN y a continuación, se adhieren a las membranas celulares y se fusionan con ellas para transferir fragmentos de ADN. Por tanto, el ADN entra a la célula y a continuación, al núcleo.
Otros métodos bien conocidos para transformar células vegetales que son coherentes con la presente invención incluyen, pero sin limitación, transformación del polen (véase la Patente de EE. UU. n.° 5.177.010 de la University of Toledo, 1993); tecnología de bigotes (véanse las Patentes de EE. UU. n.° 5.464.765 y 5.302.523).
Las construcciones de ácido nucleico de la presente invención pueden introducirse en protoplastos de plantas. Los protoplastos vegetales son células en las que su pared celular se elimina total o parcialmente utilizando medios mecánicos o enzimáticos y que pueden transformarse con métodos conocidos, que incluyen, precipitación a base de fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol y electroporación (ver, por ejemplo, Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199: 183, 1985; Marcotte et al., Nature, 335: 454, 1988). El polietilenglicol (P<e>G) es un polímero de óxido de etileno. Se utiliza ampliamente como portador de genes poliméricos para inducir la captación de ADN en los protoplastos de las plantas. Se puede utilizar PEG junto con cationes divalentes para precipitar el ADN y efectuar la absorción celular. Como alternativa, el PEG puede formar complejos con otros polímeros, tales como poli(etilenimina) y poli L lisina.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención también puede dirigirse al genoma de una célula vegetal mediante varios métodos que incluyen, aunque no de forma limitativa, recombinación de direccionamiento, recombinación homóloga y recombinación específica de sitio (véase la revisión Baszcynski et al. Transgenic Plants, 157: 157-178, 2003, para la revisión de sistemas de recombinación específicos de sitio en plantas). La recombinación homóloga y el direccionamiento génico en plantas (revisado en Reiss. International Review of Cytology, 228: 85-139, 2003) y en células de mamíferos (revisado en Sorrell y Kolb. Biotechnology Advances, 23: 431-469, 2005) son conocidos en la técnica.
Como se utiliza en el presente documento, "recombinación de direccionamiento" se refiere a la integración de una construcción de ácido nucleico en un sitio del genoma, donde la integración está facilitada por una construcción que comprende secuencias correspondientes al sitio de integración.
La recombinación homóloga se basa en la identidad de secuencia entre un fragmento de ADN que se introduce en una célula y el genoma de la célula. La recombinación homóloga es un evento extremadamente raro en eucariotas superiores. Sin embargo, la frecuencia de la recombinación homóloga puede aumentarse con estrategias que impliquen la introducción de roturas de ADN de doble cadena, oligonucleótidos formadores de triplex o virus adenoasociados.
Como se utiliza en el presente documento, "recombinación específica de sitio" se refiere a la recombinación enzimática que se produce cuando al menos dos secuencias de ADN discretas interactúan para combinarse en una única secuencia de ácido nucleico en presencia de la enzima. La recombinación específica de sitio se basa en enzimas tales como las recombinasas, transposasas e integrasas, que catalizan el intercambio de cadenas de ADN entre moléculas de ADN que tienen una homología de secuencia limitada. Se conocen en la técnica mecanismos de recombinación específica de sitio (revisado en Grindley et al. Annu Rev Biochem, 75: 567-605, 2006). Los sitios de reconocimiento de recombinasas específicas de sitio (por ejemplo, sitios Cre y att) suelen tener 30-50 pb. Los pares de sitios entre los que se produce la recombinación suelen ser idénticos, pero hay excepciones, por ejemplo, attP y attB de A integrasa (Landy. Ann Rev Biochem, 58: 913-949, 1989).
Se podrían seleccionar métodos adicionales a partir de los últimos años de desarrollo de métodos y composiciones para dirigir y escindir ADN genómico mediante nucleasas específicas de sitio, por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc, ZFN, meganucleasas, nucleasas efectoras de tipo activador transcripcional, TALENS y repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas/nucleasa asociada a CRISPR (CRISPR/Cas) con un ARNcr/ARNtracr modificado por ingeniería genética), para inducir mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de secuencias de ADN celular y facilitar la recombinación dirigida de un polinucleótido de ADN donante exógeno dentro de un locus genómico predeterminado. Los métodos actuales para la inserción dirigida de ADN exógeno normalmente implican la cotransformación de tejido vegetal con un polinucleótido de ADN donante que contiene al menos un transgén y una nucleasa específica de sitio, por ejemplo, ZFN, que está diseñada para unirse y escindir un locus genómico específico de una secuencia codificante transcrita activamente. Esto hace que el polinucleótido de ADN donante se inserte establemente dentro del locus genómico escindido, dando como resultado la adición de genes dirigidos en un locus genómico específico que comprende una secuencia codificante transcrita activamente.
Como se utiliza en el presente documento, "dedos de zinc", define regiones de una secuencia de aminoácidos dentro de un dominio de unión a proteína de unión al ADN cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion zinc.
Una "proteína de unión a ADN de dedos de zinc" (o dominio de unión) es una proteína o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de forma específica de la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza a través de la coordinación de un ion de zinc. La expresión proteína de unión al ADN de dedo de zinc frecuentemente se abrevia como proteína de dedo de zinc o ZFP. Los dominios de unión de dedos de cinc pueden "modificarse por ingeniería genética" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada. Los ejemplos no limitativos de métodos para modificar por ingeniería genética proteínas de dedos de zinc son el diseño y la selección. Una proteína de dedos de zinc diseñada es una proteína que no existe en la naturaleza y cuyo diseño/composición es el resultado principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños ZFP existentes y datos de unión. (Patente de EE. UU. n.° 6.453.242; véase también el documento WO 98/53058).
Un "dominio de unión al ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más de dominios/unidades repetidas de TALE. Los dominios repetidos están implicados en la unión de TALE a su secuencia de ADN diana afín. Una sola "unidad de repetición", también denominada como una "repetición", normalmente tiene una longitud de 33 35 aminoácidos y presenta al menos cierta homología de secuencia con otras secuencias repetidas de TALE dentro de una proteína TALE de origen natural. (Publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0301073).
El sistema de nucleasa CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas)/Cas (asociado a CRISPR). Brevemente, un "dominio de unión al ADN CRISPR" es una molécula de ARN de cadena corta que, actuando en conjunto con la enzima CAS, puede reconocer, unirse y escindir selectivamente ADN genómico. El sistema CRISPR/Cas puede modificarse por ingeniería genética para crear una rotura de doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés) en una diana deseada en un genoma y la reparación de la DSB puede verse influenciada por el uso de inhibidores de reparación para provocar un aumento en la reparación propensa a errores. (Jinek et al. (2012) Science 337, págs. 816-821).
Los dedos de zinc, CRISPR y los dominios de unión a TALE pueden "modificarse por ingeniería genética" para que se unan a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, a través de modificación por ingeniería genética (alterando uno o más aminoácidos) de la región de la hélice de reconocimiento de un dedo de cinc de origen natural. De forma similar, las TALE pueden "modificarse por ingeniería genética" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, mediante modificación por ingeniería genética de los aminoácidos implicados en la unión del ADN (el dirresto variable de repetición o región RVD, por sus siglas en inglés). Por tanto, las proteínas de unión al ADN modificadas por ingeniería genética (dedos de cinc o TALE) son proteínas que no son de origen natural. Los ejemplos no limitativos de métodos para modificar por ingeniería genética proteínas de unión al ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN diseñada es una proteína que no existe en la naturaleza y cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños ZFP y/o TALE existentes y datos de unión. (Patente de EE. UU. n.° 6.453.242; véase también el documento WO 98/53058; y la Publicación de EE. UU. n.° 2011/0301073).
Una proteína de dedos de zinc "seleccionada", CRISPR o TALE es una proteína que no existe en la naturaleza cuya producción es el resultado principalmente de un proceso empírico, tal como la presentación en fagos, trampa de interacción o selección de híbridos.
En un aspecto (no reivindicado de forma explícita), el polinucleótido codifica una proteína de dedos de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido T6ODM o COD<m>, dando como resultado una expresión reducida del gen. En realizaciones particulares, la proteína de dedos de zinc se une a una región reguladora de un gen que codifica la T6ODM o la CODM. En otras realizaciones, la proteína de dedos de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido T6ODM o CODM e impide su traducción. Se han descrito métodos para seleccionar sitios para el direccionamiento mediante proteínas de dedos de zinc, por ejemplo, en el documento US 6.453.242 y se describen métodos para usar proteínas de dedos de zinc para inhibir la expresión de genes en plantas, por ejemplo, en el documento US2003/0037355. Se han descrito métodos para seleccionar sitios para el direccionamiento mediante proteínas TALE, por ejemplo, en Moscou MJ, Bogdanov A<j>, 2009, A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science 326:1501.
La molécula de ácido nucleico se integra establemente en el genoma de la planta de manera que es hereditaria para las células hijas, con el fin de que las generaciones sucesivas de células vegetales hayan reducido la expresión de CODM y de T6ODM. Esto puede implicar que las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se integren, por ejemplo que se integren aleatoriamente, en el genoma de la célula vegetal. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden permanecer como ADN autorreplicante exógeno que es hereditario para las células hijas. Como se utiliza en el presente documento, el ADN autorreplicante exógeno que es hereditario para las células hijas también se considera "integrado establemente en el genoma de la planta".
Pruebas para la reducción de la actividad o expresión de CODM y de T6ODM
La alteración de genes endógenos que codifican la CODM y la T6ODM, su expresión o la actividad enzimática de CODM y de T6ODM, puede confirmarse mediante métodos conocidos en la técnica de biología molecular. Por ejemplo, la alteración de genes endógenos puede evaluarse mediante PCR seguida de análisis de transferencia de Southern. Los niveles de ARNm de CODM y de T6ODM pueden medirse, por ejemplo, mediante PCR en tiempo real, RT-PCR, análisis de transferencia de Northern, análisis de genes con micromatrices y protección de ARNasa. Los niveles de proteínas CODM y T6ODM pueden medirse, sin limitación, mediante ensayos de actividad enzimática, análisis ELISA y de transferencia Western. La expresión de CODM y de T6ODM o la falta de ella, puede usarse como predictor de una acumulación aumentada de tebaína. La actividad enzimática de CODM y/o T6ODM se puede evaluar bioquímica o funcionalmente.
Por ejemplo, la actividad de CODM (y/o T6ODM) se puede medir bioquímicamente mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen, aunque no de forma limitativa, la detección de productos formados por la enzima en presencia de cualquier número de sustratos heterólogos, por ejemplo, tebaína. La actividad de CODM (y/o T6ODM) también se puede medir funcionalmente, por ejemplo, mediante la evaluación de los niveles de tebaína en los tejidos de la adormidera.
Una planta de adormidera genéticamente modificada de la presente divulgación puede dar como resultado la reducción de la actividad de CODM y/o de T6ODM en dicha planta o su semilla, plántula, paja, cápsulas o descendencia de la misma, en al menos un 57 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o un 100 % en relación con una semilla, plántula, paja, cápsulas o descendencia de la misma de tipo silvestre.
Detección dirigida de mutaciones de pérdida de función en CODM y/o en T6ODM.
La presente divulgación se refiere además a métodos para generar plantas de adormidera con elevados niveles de tebaína que implican la detección dirigida de mutaciones de pérdida de función en los genes endógenos que codifican la CODM y/o la T6ODM y el posterior cultivo de plantas para combinar las mutaciones para obtener plantas homocigotas para las mutaciones de pérdida de función en ambos loci (no reivindicado explícitamente). Los obtentores de adormidera han utilizado una variedad de técnicas de selección en el desarrollo de cultivares mejorados. Sin embargo, el método de reproducción más exitoso implica la hibridación de parentales con una variedad de características deseadas diferentes. Tal enfoque se ha utilizado con éxito para aumentar el número de cápsulas, semillas y producción de opio, contenido de morfina y resistencia al encamado.
La expresión "inserción de ADN-T" se refiere a métodos que utilizan ADN de transferencia (ADN-T) para alterar genes mediante mutagénesis por inserción. Por tanto, la regulación negativa o el silenciamiento de la expresión del (de los) gen(es) endógeno(s) que codifica(n) la CODM y/o la T6ODM en una planta de adormidera se puede lograr mediante mutagénesis del ADN-T, en donde el ADN-T se utiliza para insertarse aleatoriamente en el genoma de la planta para introducir mutaciones. Posteriormente, se pueden detectar las plantas de inserciones de ADN-T en los genes que codifican la CODM y/o la T6ODM mediante PCR, usando un par de cebadores que comprende un cebador específico para el ADN-T y un cebador específico para el gen que codifica la CODM (o la T6ODM, según sea el caso) u otras tecnologías de alto rendimiento. Para una revisión del ADN-T como mutágeno de inserción, véase, por ejemplo, krysan, P.J. et al. (1999) Plant Cell, 11: 2283-2290. También podría emplearse mutagénesis por inserción utilizando transposones.
Las mutaciones (incluyendo deleciones, inserciones y mutaciones puntuales) también pueden introducirse aleatoriamente en el genoma de una célula vegetal mediante diversas formas de mutagénesis para producir variantes no naturales (no reivindicado explícitamente). Los métodos de mutagénesis de materiales vegetales, incluidas las semillas y la detección o selección posterior de los fenotipos deseados son bien conocidos, como se describe en el documento WO2009109012. Las plantas mutagenizadas y las células vegetales pueden examinarse específicamente para detectar mutaciones en los genes que codifican la CODM y/o la T6ODM, por ejemplo, mediante TILLING (direccionamiento a lesiones locales inducidas en genomas, por sus siglas en inglés). El EcoTILLING puede identificar las mutaciones de pérdida de función presentes en poblaciones de plantas naturales.
Una vez identificadas las mutaciones de pérdida de función en los genes endógenos que codifican la CODM y la T6ODM, se pueden combinar mediante procesos de mejoramiento tradicionales para producir plantas homocigotas para mutaciones de pérdida de función en ambos loci. Como alternativa, una mutación de pérdida de función identificada en el gen endógeno que codifica la CODM se puede combinar con mutaciones en el gen endógeno que codifica la T6ODM que se introducen mediante modificación genética y viceversa. Como alternativa, una mutación de pérdida de función identificada en el gen endógeno que codifica la CODM se puede combinar con una modificación genética que comprende una construcción de expresión diseñada para reducir la expresión de la T6ODM, como se ha descrito anteriormente y viceversa.
Recogida de alcaloides y análisis
El cultivo de la adormidera y la recolección del opio tradicionalmente implicaban procesos de alanceado manual de la cápsula de la semilla y de recolección del látex. Sin embargo, los métodos para extraer morfina y compuestos relacionados de la paja de adormidera evitan la técnica tradicional y permiten obtener semillas de alta calidad y materias primas de valor farmacéutico simultáneamente. La recuperación de tebaína de la paja de adormidera o del látex de una planta de adormidera es bien conocida en la técnica, como se analiza en el documento WO2009109012. Además de los métodos particulares que se describen a continuación, los métodos para analizar extractos de alcaloides de la paja o del látex de adormidera también se analizan en el documento WO2009109012.
Ejemplos
Con referencia a la Figura 2, el presente inventor utilizó una construcción de horquilla única dirigida a genes que codifican las enzimas CODM y T6ODM para probar la hipótesis de que las plantas que contienen niveles elevados de tebaína (y niveles reducidos de codeína y morfina) en comparación con las plantas parentales pueden producirse reduciendo simultáneamente la actividad de las enzimas T6ODM y CODM.
Con referencia a la Figura 3, las secuencias codificantes de los genes de CODM y de T6ODM tienen un nivel de identidad muy alto. Por consiguiente, el inventor creó una construcción de expresión única para dirigirse tanto al gen endógeno que codifica la CODM como al gen endógeno que codifica la T6ODM a partir de una porción de la secuencia codificante de T6ODM mediante ARNi. La porción de la secuencia codificante de T6ODM utilizada para las porciones codificantes y no codificantes de la construcción génica de ARNi representada en la Figura 2 está subrayada en la Figura 3. Se amplificó un fragmento codificante de 342 pares de bases a partir de ADNc aislado de material vegetal de adormidera utilizando los cebadores AAAGGCGCGCCCCTTGTCCCTCAACCAAAT y AAAATTTAAATTCCACTTTTAAACAAAGC). Se amplificó un fragmento no codificante de 342 pares de bases a partir de ADNc aislado de material vegetal de adormidera utilizando cebadores AAAACTAGTCCTTGTCCTCAACCAAAT), OPP026 (AAAGGATCCTCCACTTTTAAACAAAGC). Estos dos fragmentos se utilizaron para crear una molécula de nucleótidos con estos fragmentos interpuestos por secuencias de p-glucuronidasa.
La secuencia de la molécula de ácido nucleico que se va a transcribir para producir un ARN en horquilla se proporciona como la SEQ ID NO: 6. Las secuencias de T6ODM están subrayadas, si bien la secuencia en "horquilla" intermedia entre las secuencias de T6ODM se deriva de secuencias codificantes para p-glucuronidasa.
La construcción de expresión completa, que comprende la SEQ ID NO: 6 junto con el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y las secuencias de terminación de transcripción y de traducción de la octopina sintasa, se clonó en un vector de transferencia de ADN-T. Las secuencias entre los bordes izquierdo y derecho del vector se proporcionan como se proporciona en la SEQ ID NO: 5. La secuencia 5' respecto a la primera región subrayada (es decir, la secuencia específica de T6ODM "codificante") comprende la secuencia promotora 35S, si bien las secuencias 3' respecto a la segunda región subrayada (es decir, la secuencia específica de T6ODM "no codificante") comprende las secuencias de terminación de transcripción y de traducción de la octopina sintasa.
Si bien esta construcción de expresión se generó utilizando una combinación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tradicional y técnicas de clonación (por ejemplo, con enzimas de restricción y ligaciones), la persona experta comprenderá que podrían usarse diversas técnicas convencionales para producir la construcción, incluyendo la clonación mediante PCR de extensión superpuesta o la síntesis directa.
La secuencia del ADN-T completo que comprende la SEQ ID NO: 6, desde el borde derecho al borde izquierdo, se proporciona como la SEQ ID NO: 4.
Se utilizó el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS, por sus siglas en inglés) para probar transitoriamente la capacidad del casete génico para silenciar los genes endógenos que codifican la T6ODM y la CODM. VIGS es una técnica de silenciamiento de ARN vegetal que utiliza vectores víricos que transportan un fragmento de un gen de interés para generar ARN bicatenario, lo que inicia el silenciamiento del gen diana. Vectores VIGS basados en TRV pTRVI (plásmido auxiliar) y pTRV2 (vector binario) para expresar la construcción de expresión. Los tejidos se tomaron en 48 horas, 72 h, 5 días, 7 días y 2 semanas después de la infiltración. Como se indica en las Figuras 4a y 4b, la expresión transitoria de la construcción de expresión dio como resultado una regulación negativa sustancial de los transcritos a partir de los genes endógenos que codifican CODM y T6ODM a las 48 h después de la transformación (primera barra desde la derecha en las Figuras 3a y 3b anteriores).
A continuación, se generaron plantas transformadas establemente con la construcción de expresión de acuerdo con el siguiente protocolo.
PROTOCOLO DE TRANSFORMACIÓN
Transformación de hipocotilos/raíces de adormidera
Medios requeridos:
LB
Medio de suspensión de Agrobacterium
Sales y vitaminas de B5 que contiene 20 g/l de sacarosa, pH - 5,6 - 5,8 ± 0,2.
Medio de germ inación de brotes
Medio basal de Murashige y Skoog de concentración media suplementado con 20 g/l de sacarosa, 8 g/l de agar. pH -5,8 ± 0,2.
Medio de inducción de callo prim ario
Medio B5 que contiene 30 g/l de sacarosa, 2,0 mg/l de NAA y 0,1 mg/l de BAP, 8 g/l de agar.
Medio de inducción de em briones som áticos
Medio B5 que contiene 1,0 mg/l NAA, 0,5 mg/l de PAB, 50 mg/l de paromomicina, 300 mg/l de timentina y 8 g/l de agar.
Medio de inducción de em briones
Medio basal de Murashige y Skoog suplementado con 30 g/l de sacarosa, 0,25 g/l de MES, 0,2 g/l de mioinositol, 1 mg/l de 2,4-D, 2,5 mg/l de AgNO<3>, 8 g/l de agar. pH - 5,6 ± 0,2. (Más antibiótico - Timentina 300 mg/l )
M aduración y germ inación de em briones
Medio basal de Murashige y Skoog suplementado con 30 g/l de sacarosa, 0,25 g/l de MES, 0,2 g/l de mioinositol, 1 mg/l de benciladenina, 1 mg/l de zeatina, 2,5 mg/l de AgNO<3>, 8 g/l de agar. pH - 5,6 ± 0,2. (Más antibiótico - Timentina 300 mg/l)
Medio de regeneración de plantas sin fitohormonas
Medio B5 que contiene 50 mg/l de paromomicina, 300 mg/l de timentina y 8 g/l de agar
Medio de elongación de brotes
Medio basal de Murashige y Skoog suplementado con 30 g/l de sacarosa, 0,25 g/l de MES, 0,2 g/l de mioinositol, 0,5 mg/l de benciladenina, 2,5 mg/l de AgNO<3>, 8 g/l de agar. pH - 5,6 ± 0,2. (Más antibiótico - Timentina 300 mg/l)
Medio de enraizam iento
Medio basal de Murashige y Skoog suplementado con 30 g/l de sacarosa, 0,25 g/l de MES, 0,2 g/l de mioinositol, 2,5 mg/l de AgNO<3>, 8 g/l de agar. pH - 5,6 ± 0,2. (Más antibiótico - Timentina 300 mg/l)
E sterilización y germ inación de sem illas
Las semillas se esterilizaron superficialmente con etanol al 70 % (vv-1) durante 30 s y solución de hipoclorito de sodio al 1 % (vv-1) durante 2 min cada tres veces, a continuación, se enjuagaron cinco veces con agua esterilizada. Se colocaron aproximadamente 50 semillas en frascos en 25 ml de medio de cultivo solidificado con agar. El medio basal consistió en A medio basal Murashige y Skoog suplementado con 30 g/l de sacarosa (Gamborg et al. 1968) y solidificado con agar al 0,8 % (pv-1). El medio se ajustó a un pH 5,6-5,8 antes de añadir el agar y a continuación, se esterilizó en autoclave. Las semillas se germinaron en una cámara de crecimiento a 25 °C bajo tubos fluorescentes blancos fríos estándar y un fotoperiodo de 16 h.
Preparación de A grobacterium tum efaciens
El vector binario pORE::ALM-MIRMAC se movilizó mediante electroporación en la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens. Los cultivos de A. tumefaciens se cultivaron a 28 °C en un agitador giratorio a 180 rpm en medio líquido de Luria-Bertani [triptona al 1 %, extracto de levadura al 0,5 % y NaCl al 1 %, pH 7,0] que contiene 50 mg/l de kanamicina y rifampicina 100 mg/l, a A600=0,8. Las células bacterianas se recogieron mediante centrifugación durante 10 minutos a 4000 rpm y se resuspendieron a una densidad celular de A600=0,5 en medio de inoculación líquido (sales y vitaminas de B5 que contiene 20 g/l de sacarosa).
Producción de p lantas transgénicas
Los cotiledones extirpados de plántulas de 12 días, línea 118, se aislaron mediante bisección longitudinal del hipocotilo. Los hipocotilos se sumergieron en el cultivo de A. tumefaciens en medio de inoculación líquido durante 15 min, se secaron con papel de filtro estéril y se incubaron en la oscuridad a 25 °C en medio de inducción de callo primario. Después de 2 días de cocultivo con A. tumefaciens, los hipocotilos se transfirieron a un medio de inducción de callo primario fresco que contenía 50 mg/l de paromomicina y 300 mg/l de timentina. Después de 4-5 semanas de incubación, los callos primarios se subcultivaron en medio de inducción de embriones somáticos. Después de 3 semanas de cultivo en medio de inducción, los embriones somáticos se transfirieron a un medio de regeneración de plantas sin fitohormonas. Los embriones maduros se colocaron en un medio sin fitohormonas y los embriones inmaduros se transfirieron a un medio de maduración y germinación de embriones. A continuación, cuando aparecieron los primeros cotiledones, se trasplantaron a un medio de elongación de brotes. Finalmente, cuando los brotes medían 0,5-1 cm, se colocaron en medio de enraizamiento. Las supuestas plántulas transgénicas regeneradas se cultivaron en una cámara de crecimiento a 25 °C en condiciones convencionales de color blanco frío y un fotoperiodo de 16 h. A continuación, las plántulas enraizadas se transfirieron a macetas que contenían tierra tratada en autoclave, se cubrieron con bolsas de polietileno durante 1 semana para mantener una humedad elevada y se mantuvieron en la cámara de crecimiento a 25 °C durante 1-2 semanas antes de transferir las plantas al invernadero.
Método:
1. Elegir una sola colonia de la construcción deseada en Agrobacterium e inocularla en 2 ml de medio líquido LB que contenga antibióticos adecuados; cultivar durante la noche a 28 ° C para preparar un cultivo iniciador.
2. Inocular 100 ml de medio líquido LB que contenga antibióticos adecuados con el cultivo iniciador e incubar durante la noche a 28 °C. Incubar las células hasta alcanzar la DO<600>= 0,5-0,8 deseada.
3. Granular las células por centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos.
4. Resuspender las células en medio de suspensión de Agrobacterium hasta una DO<600>= 0,5 final.
5. Las raíces y los segmentos de hipocotilo de plántulas de 12 días se cortaron en segmentos de ~ 5 mm al tiempo que se sumergían en la suspensión de Agrobacterium.
6. Incubar las raíces y los segmentos de hipocotilo en una placa Petri durante 15 minutos en la suspensión de Agrobacterium con removimientos ocasionales.
7. Secar las raíces y los segmentos de hipocotilo en un papel de filtro estéril y transferir a placas que contengan medio de inducción de callo primario. Incubar las placas durante 2 días a 22 ± 2 °C en una cabina de crecimiento en la oscuridad (cubierta con papel de aluminio).
8. Después de 2 días de cocultivo, lavar la raíz y los segmentos del hipocotilo con agua destilada estéril, secar sobre un papel de filtro estéril y transferir a placas que contengan medio de inducción de callo primario (se añadió el antibiótico paromomicina).
9. Incubar las placas en la cámara de crecimiento en condiciones convencionales (fotoperiodo de 16/8 h) en la oscuridad (cubiertas con papel de aluminio) durante aproximadamente 4-5 semanas.
10. Después de 4-5 semanas de incubación, los callos primarios se subcultivaron en medio de inducción de embriones somáticos (se añadió paromomicina antibiótica).
11. Después de 3 semanas de cultivo en medio de inducción, los embriones somáticos maduros se transfirieron a un medio sin fitohormonas (sin antibióticos). Los embriones inmaduros se colocaron en otra ronda de selección en medio de maduración y germinación de embriones (sin antibióticos) y se incubaron a 22 ± 2 °C en una cabina de crecimiento con un fotoperiodo de 16/8 h hasta que los embriones maduraron y comenzaron a germinar.
12. Transferir los embriones en germinación a placas que contengan medio de elongación de brotes hasta que aparezcan los brotes y posteriormente transferir al medio de enraizamiento.
13. Transferir los brotes de ~ 0,5 a 1,0 cm al medio de enraizamiento.
14. Las plántulas enraizadas se lavan con agua del grifo para eliminar todo el agar adherido y a continuación, se transfieren a tierra estéril en macetas pequeñas, se cubrieron con película de plástico transparente y se incubaron en una cabina de crecimiento para su aclimatación.
15. Los transformantes putativos obtenidos se analizan para determinar la presencia y la expresión del transgén.
N otas: - sin antibióticos en los medios de enraizamiento.
Productos quím icos
1. 50 mg/ml de solución de reserva de sulfato de paromomicina: Preparar disolviendo el polvo en agua y esterilizar mediante filtración, alícuota y almacenar a -20 °C.
2. 50 mg/ml de solución de reserva de kanamicina: Preparar disolviendo el polvo en agua y esterilizar mediante filtración, alícuota y almacenar a -20 °C.
3. 100 mg/ml de solución de reserva de rifampicina: Preparar disolviendo el polvo en DMSO, alícuota y almacenar a -20 °C.
4. 300 mg/ml de solución de reserva de Timentina: Preparar disolviendo el polvo en agua y esterilizar mediante filtración, alícuota y almacenar a -20 °C.
5. 2,0 mg/ml de solución de reserva de NAA: Preparar disolviendo el polvo en NaOH 1N, ajustar el volumen con agua y esterilizar mediante filtración, alícuota y almacenar a -20 °C.
6. 2,0 mg/ml de solución de reserva de BAP: Preparar disolviendo el polvo en NaOH 1N, ajustar el volumen con agua y esterilizar mediante filtración, alícuota y almacenar a -20 °C.
7. 5 mg/ml de solución de reserva de AgNO3: Preparar disolviendo el polvo en agua y esterilizar mediante filtración y almacenar a 4 °C.
8. 1,0 mg/ml de solución de reserva de zeatina: Preparar disolviendo el polvo en NaOH 1N, ajustar el volumen con agua y esterilizar mediante filtración, alícuota y almacenar a -20 °C.
9. Todos los productos químicos utilizados para los medios se añaden al medio esterilizado en autoclave una vez que se ha enfriado a aproximadamente 50 °C. Agitar para mezclar bien el medio antes de verterlo en placas Petri de 90 x 25 mm.
CARACTERIZACIÓN DE PLANTAS TRANSGÉNICAS REGENERADAS
El ADN-T que comprende la construcción de expresión incluía el gen nptll, que confiere resistencia a la paromicina. Se identificaron seis plántulas (AM1 a AM6) como resistentes a paromomicina, sugiriendo que estas plantas fueron transformadas con la construcción de expresión. La reacción en cadena de la polimerasa en ADN genómico aislado de estas plántulas usando cebadores específicos para la construcción de expresión en horquilla (SEQ ID NO: 9, TAACCGACTTGCTGCCCCGA; SEQ ID NO: 10, AAATAGAGATGCTTGCAGAAGATCCCG) mostró que las plantas AM1, AM2 y AM3 contienen amplicones de ADN genómico. Se utilizaron cebadores para actina (<s>E<q>ID NO: 11, CGTTTGAATCTTGCTGGCCGTGAT; SEQ ID NO: 12, TAGACGAGCTGCCTTTGGAAGTGT) como un control positivo para confirmar que las muestras contenían ADN genómico de Papaver somniferum.
Con referencia a la Figura 4, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) se realizó en extractos de ARN de plantas AM1 a AM6 usando cebadores específicos para la horquilla (SEQ ID NO: 9, TAACCGACTTGCTGCCCCGA; SEQ ID NO: 10, AAATAGAGATGCTTGCAGAAGATCCCG) y demostró que la construcción de expresión se expresó en plantas AM1, AM2 y AM3.
Se realizó una RT-PCR en los extractos de ARN de las plantas AM1 a AM6 utilizando cebadores específicos para transcritos endógenos que codifican la CODM y la T6ODM. Con referencia a la Figura 5, la expresión de la construcción de expresión pareció suficiente para regular negativamente la expresión del gen endógeno que codifica la T6ODM en relación con las plantas que no expresaban la construcción de expresión. Con referencia a la Figura 6, la expresión de la construcción de expresión pareció suficiente para regular negativamente la expresión del gen endógeno que codifica la CODM en relación con las plantas que no expresaban la construcción de expresión.
Análisis de alcaloides
Extracción con ácido: se mezclaron 0,100 g de cápsula molida o de tallos (de adormidera) con 5 ml de una solución de ácido acético al 10 %, agua al 10 % y metanol al 80 %, seguido de agitación durante 30 minutos y a continuación, se filtró. El filtrado se inyectó directamente en la HPLC.
Todas las muestras se procesaron en un sistema de gradiente de HPLC que tenía una columna Kinetex 2,6 um C18, 50 x 2,1 mm, con un volumen de inyección de 2 microlitros, operando a 280 nm a una temperatura de 45 °C y un caudal de 0,8 ml/min. El eluyente A fue tampón acetato de amonio 10 mM, pH 5,5, si bien el Eluyente B fue Acetonitrilo (100 %). El perfil de gradiente es el siguiente
Etapa n.° Tiempo (min) % A % B
1 0 95 5
2 0,25 85 15
3 2,00 60 40
4 2,01 95 5
5 3,00 20 80
6 4,00 10 90
7 5,00 0 100
Las cifras indicadas son porcentajes en peso del material de partida seco.
Con referencia a las Figuras 7A a 7D, el análisis de alcaloides en la cápsula de AM 1 y en las hojas de AM2 y AM3 indicó una acumulación aumentada de tebaína y una acumulación disminuida de morfina en comparación con una planta en la que la construcción de expresión no estaba presente y tenía un nivel de expresión de la T6ODM y de la CODM de tipo silvestre. El análisis posterior de los alcaloides en las cápsulas de las plantas de AM2 y AM3 mostró que la tebaína se acumuló a un 4,82 % de alcaloides en las cápsulas de AM2 y a un 3,13 % del total de alcaloides en las cápsulas AM3. Las plantas de AM1, AM2 y AM3 se detectaron como sustancialmente sin morfina.
Tabla 1. Concentración de alcaloides en plantas transgénicas por 100 mg de cápsulas secas.
Codeína (% en peso concentr.) Tebaína (% en peso concentr.)
AM1 0,23 3,87
AM2 ' 0,11 4,82
AM3 0,12 3,13
La descendencia de los transformantes AM1, AM2 y AM3 autofecundados parecen segregar 3:1, lo que indica que los transgenes están integrados y que se heredan establemente.
Se aislaron seis transformantes individuales adicionales que portan la construcción de expresión y en los que no se pudieron detectar los transcritos de CODM y T6ODM endógenos (AM12, AM13, AM16, AM17 y<a>M19). El análisis en las cápsulas de estas plantas adicionales mostró que la tebaína acumuló hasta un 8,28 % de alcaloides en las cápsulas (véase la Tabla 2).
Tabla 2. Concentración de tebaína en plantas transgénicas por 100 mg de cápsulas secas.
Tebaína (% en peso concentr.)
AM12 5,87
AM13 6,20
(continuación)
Tebaína (% en peso concentr.)
AM16 8,28
AM17 7,18
AM19 4,95
Las plantas se cultivaron a partir de semillas de la descendencia de AM1 que contenían la construcción de expresión. La concentración de morfina, oripavina, codeína y morfina en paja de adormidera de seis descendientes de AM1 que portan la construcción de expresión, se proporcionan en la Tabla 3.
Tabla 3. Concentración de tebaína, codeína, oripavina y morfina en paja de adormidera de la descendencia de AM1.
Cantidad de cada componente (% p/p)
Individuo Morfina Oripavina Codeína Tebaína
AM1-1 0,07 0,01 0,09 4,94
AM1-13 0,05 0,20 0,10 4,46
AM1-28 0,10 0,01 0,08 3,69
AM1-30 0,07 0,02 0,14 6,68
AM1-38 0,05 0,01 0,07 3,20
AM1-82 0,06 0,03 0,13 5,31
Operación
Si bien se han descrito e ilustrado las realizaciones específicas de la presente divulgación, tales realizaciones deben considerarse ilustrativas de la invención únicamente y no limitativas de la invención tal como se interpreta de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Esta descripción contiene un listado de secuencias en formato electrónico en formato de texto ASCII. Las secuencias en el listado de secuencias se reproducen en la siguiente Tabla.
Tabla de secuencias
SEQ ID NO: 1 (T6ODM)
Met Glu Lys Ala Lys Leu Met Lys Leu Gly Asn Gly Met Glu lie Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu lie Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Val Cys Ala Asn Glu Asn Leu Leu Leu Pro Met Gly Ala Ser Val
35 40 45
lie Asn Asp His Glu Thr lie Pro Val lie Asp lie Glu Asn Leu Leu 50 55 60 Ser Pro Glu Pro lie lie Gly Lys Leu Glu Leu Asp Arg Leu His Phe
65 70 75 80
Ala Cys Lys Glu Trp Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Val Asp 85 90 95 Ala Ser Leu Val Asp Ser Val Lys Ser Glu lie Gln Gly Phe Phe Asn
100 105 110
Leu Ser Met Asp Glu Lys Thr Lys Tyr Glu Gln Glu Asp Gly Asp Val
115 120 125
Glu Gly Phe Gly Gln Gly Phe lie Glu Ser Glu Asp Gln Thr Leu Asp
130 135 140
Trp Ala Asp lie Phe Met Met Phe Thr Leu Pro Leu His Leu Arg Lys
145 150 155 160
Pro His Leu Phe Ser Lys Leu Pro Val Pro Leu Arg Glu Thr lie Glu 165 170 175 Ser Tyr Ser Ser Glu Met Lys Lys Leu Ser Met Val Leu Phe Asn Lys
180 185 190
Met Glu Lys Ala Leu Gln Val Gln Ala Ala Glu lie Lys Gly Met Ser
195 200 205
Glu Val Phe lie Asp Gly Thr Gln Ala Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Gln Pro Asn Leu Ala lie Gly Leu Thr Ser His Ser Asp
225 230 235 240
Phe Gly Gly Leu Thr lie Leu Leu Gln lie Asn Glu Val Glu Gly Leu 245 250 255 Gln lie Lys Arg Glu Gly Thr Trp lie Ser Val Lys Pro Leu Pro Asn
260 265 270
Ala Phe Val Val Asn Val Gly Asp lie Leu Glu lie Met Thr Asn Gly
275 280 285
lie Tyr His Ser Val Asp His Arg Ala Val Val Asn Ser Thr Asn Glu
290 295 300
Arg Leu Ser lie Ala Thr Phe His Asp Pro Ser Leu Glu Ser Val lie
305 310 315 320
Gly Pro lie Ser Ser Leu lie Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys 325 330 335 Ser Gly Ser Thr Tyr Gly Asp Leu Val Glu Glu Cys Lys Thr Arg Lys
340 345 350
Leu Asp Gly Lys Ser Phe Leu Asp Ser Met Arg lie
355 360
SEQ ID NO: 2 (T6ODM)
gttcttaatt cattaattaa tttagaaaaa tcatggagaa agcaaaactt atgaagctag 60 gtaatggtat ggaaatacca agtgttcaag aattggctaa actcacgctt gccgaaattc 120 catctcgata cgtatgcgcc aatgaaaacc ttttgttgcc tatgggtgca tctgtcataa 180 atgatcatga aaccattcct gtcatcgata tagaaaattt attatctcca gaaccaataa 240 tcggaaagtt agaattagat aggcttcatt ttgcttgcaa agaatggggt ttttttcagg 300 tagtgaacca tggagtcgac gcttcattgg tggatagtgt aaaatcagaa attcaaggtt 360 tctttaacct ttctatggat gagaaaacta aatatgaaca ggaagatgga gatgtggaag 420 gatttggaca aggctttatt gaatcagagg accaaacact tgattgggca gatatattta 480 tgatgttcac tcttccactc catttaagga agcctcactt attttcaaaa ctcccagtgc 540 ctctcaggga gacaatcgaa tcctactcat cagaaatgaa aaagttatcc atggttctct 600 ttaataagat ggaaaaagct ctacaagtac aagcagccga gattaagggt atgtcagagg 660 tgtttataga tgggacacaa gcaatgagga tgaactatta tcccccttgt cctcaaccaa 720 atctcgccat cggtcttacg tcgcactcgg attttggcgg tttgacaatc ctccttcaaa 780 tcaacgaagt ggaaggatta cagataaaaa gagaggggac atggatttca gtcaaacctc 840 tacctaatgc gttcgtagtg aatgttggag atattttgga gataatgact aatggaattt 900 accatagtgt cgatcaccgg gcagtagtaa actcaacaaa tgagaggctc tcaatcgcaa 960 catttcatga ccctagtcta gagtcggtaa taggcccaat atcaagcttg attactccag 1020 agacacctgc tttgtttaaa agtggatcta catatgggga tcttgtggag gaatgtaaaa 1080 caaggaagct cgatggaaaa tcatttcttg actccatgag gatttgaaaa ctcaagaaaa 1140 aataatacga cgtgattgca tgtcagattc aactatcctt ttgtcgtttt ttggtgctcg 1200 agtccttaat tgttttgatc attgcttttg attctaatta ataagacttt tctcaagaac 1260 cacatgtaat gtacctttac tttcagaaaa taaaaagtat tgaggcacaa atgagaaaat 1320 tgagagagtg cttgagaagt gtaatttctc gaaagtgcgt tgtgtttgaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaa 1386
SEQ ID NO: 3 (CODM)
Met Glu Thr Pro lie Leu lie Lys Leu Gly Asn Gly Leu Ser lie Pro
1 5 10 15
Ser Val Gln Glu Leu Ala Lys Leu Thr Leu Ala Glu lie Pro Ser Arg
20 25 30
Tyr Thr Cys Thr Gly Glu Ser Pro Leu Asn Asn lie Gly Ala Ser Val
35 40 45
Thr Asp Asp Glu Thr Val Pro Val lie Asp Leu Gln Asn Leu Leu Ser 50 55 60 Pro Glu ProVal Val Gly Lys Leu Glu Leu Asp Lys Leu His Ser Ala
65 70 75 80
Cys Lys GluTrp Gly Phe Phe Gln Leu Val Asn His Gly Val Asp Ala 85 90 95 Leu Leu Met Asp Asn lie Lys Ser Glu lie Lys Gly Phe Phe Asn Leu
100 105 110
Pro Met Asn Glu Lys Thr Lys Tyr Gly Gln Gln Asp Gly Asp Phe Glu
115 120 125
Gly Phe Gly Gln Pro Tyr lie Glu Ser Glu Asp Gln Arg Leu Asp Trp 130 135 140 Thr Glu ValPhe Ser Met Leu Ser Leu Pro Leu His Leu Arg Lys Pro
145 150 155 160
His Leu PhePro Glu Leu Pro Leu Pro Phe Arg Glu Thr Leu Glu Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser Lys Met Lys Lys Leu Ser Thr Val Val Phe Glu Met Leu
180 185 190
Glu Lys Ser Leu Gln Leu Val Glu lie Lys Gly Met Thr Asp Leu Phe
195 200 205
Glu Asp Gly Leu Gln Thr Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Arg Pro Glu Leu Val Leu Gly Leu Thr Ser His Ser Asp Phe Ser Gly
225 230 235 240
Leu Thr lie Leu Leu Gln Leu Asn Glu Val Glu Gly Leu Gln lie Arg 245 250 255 Lys Glu Glu Arg Trp lie Ser lie Lys Pro Leu Pro Asp Ala Phe lie
260 265 270
Val Asn Val Gly Asp lie Leu Glu lie Met Thr Asn Gly lie Tyr Arg
275 280 285
Ser Val Glu His Arg Ala Val Val Asn Ser Thr Lys Glu Arg Leu Ser
290 295 300
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Ser Ser LeuVal Thr Pro Glu Thr Pro Ala Leu Phe Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Tyr Glu Asp lie Leu Lys Glu Asn Leu Ser Arg Lys Leu Asp Gly Lys
340 345 350
Ser Phe Leu Asp Tyr Met Arg Met
355 360
SEQ ID NO: 4 (CODM)
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SEQ ID NO: 5
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SEQ ID NO: 6
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SEQ ID NO: 7
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SEQ ID NO: 8
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SEQ ID NO: 9
TAACCGACTTGCTGCCCCGA
SEQ ID NO: 10
AAATAGAGATGCTTGCAGAAGATCCCG
SEQ ID NO: 11
CGTTTGAATCTTGCTGGCCGTGAT
SEQ ID NO: 12
TAGACGAGCTGCCTTTGGAAGTGT
SEQ ID NO: 13
CGTCTTGCGCACTGATTTGAA
SEQ ID NO: 14
CGTTTGAATCTTGCTGGCCGTGAT
SEQ ID NO: 15 (T6ODM)
guucuuaauu cauuaauuaa uuuagaaaaa ucauggagaa agcaaaacuu augaagcuag 60 guaaugguau ggaaauacca aguguucaag aauuggcuaa acucacgcuu gccgaaauuc 120 caucucgaua cguaugcgcc aaugaaaacc uuuuguugcc uaugggugca ucugucauaa 180 augaucauga aaccauuccu gucaucgaua uagaaaauuu auuaucucca gaaccaauaa 240 ucggaaaguu agaauuagau aggcuucauu uugcuugcaa agaauggggu uuuuuucagg 300 uagugaacca uggagucgac gcuucauugg uggauagugu aaaaucagaa auucaagguu 360 ucuuuaaccu uucuauggau gagaaaacua aauaugaaca ggaagaugga gauguggaag 420 gauuuggaca aggcuuuauu gaaucagagg accaaacacu ugauugggca gauauauuua 480 ugauguucac ucuuccacuc cauuuaagga agccucacuu auuuucaaaa cucccagugc 540 cucucaggga gacaaucgaa uccuacucau cagaaaugaa aaaguuaucc augguucucu 600 uuaauaagau ggaaaaagcu cuacaaguac aagcagccga gauuaagggu augucagagg 660 uguuuauaga ugggacacaa gcaaugagga ugaacuauua ucccccuugu ccucaaccaa 720 aucucgccau cggucuuacg ucgcacucgg auuuuggcgg uuugacaauc cuccuucaaa 780 ucaacgaagu ggaaggauua cagauaaaaa gagaggggac auggauuuca gucaaaccuc 840 uaccuaaugc guucguagug aauguuggag auauuuugga gauaaugacu aauggaauuu 900 accauagugu cgaucaccgg gcaguaguaa acucaacaaa ugagaggcuc ucaaucgcaa 960 cauuucauga cccuagucua gagucgguaa uaggcccaau aucaagcuug auuacuccag 1020
agacaccugc uuuguuuaaa aguggaucua cauaugggga ucuuguggag gaauguaaaa 1080 caaggaagcu cgauggaaaa ucauuucuug acuccaugag gauuugaaaa cucaagaaaa 1140 aauaauacga cgugauugca ugucagauuc aacuauccuu uugucguuuu uuggugcucg 1200 aguccuuaau uguuuugauc auugcuuuug auucuaauua auaagacuuu ucucaagaac 1260 cacauguaau guaccuuuac uuucagaaaa uaaaaaguau ugaggcacaa augagaaaau 1320 ugagagagug cuugagaagu guaauuucuc gaaagugcgu uguguuugaa ¿aaaaaaaaaa. 1380 aaaaaa 1386
SEQ ID NO: 16 (CODM)
guaaagauug auauaugauc ugaagaucug acaagaaagu ucaucaaaua uagaguucau 60 ggagacacca auacuuauca agcuaggcaa ugguuuguca auaccaagug uucaggaauu 120 ggcuaaacuc acgcuugcag aaauuccauc ucgauacaca ugcaccggug aaagcccguu 180 gaauaauauu ggugcgucug uaacagauga ugaaacaguu ccugucaucg auuugcaaaa 240 uuuacuaucu ccagaacccg uaguuggaaa guuagaauug gauaagcuuc auucugcuug 300 caaagaaugg gguuucuuuc agcugguuaa ccauggaguc gacgcuuuac ugauggacaa 360 uauaaaauca gaaauuaaag guuucuuuaa ccuuccaaug aaugagaaaa cuaaauacgg 420 acagcaagau ggagauuuug aaggauuugg acaacccuau auugaaucgg aggaccaaag 480 acuugauugg acugaagugu uuagcauguu aagucuuccu cuccauuuaa ggaagccuca 540 uuuguuucca gaacucccuc ugccuuucag ggagacacug gaauccuacc uaucaaaaau 600 gaaaaaacua ucaacgguug ucuuugagau guuggaaaaa ucucuacaau uaguugagau 660 uaaagguaug acagacuuau uugaagaugg guugcaaaca augaggauga acuauuaucc 720 uccuuguccu cgaccagagc uuguacuugg ucuuacguca cacucggauu uuagcgguuu 780 gacaauucuc cuucaacuua augaaguuga aggauuacaa auaagaaaag aagagaggug 840 gauuucaauc aaaccucuac cugaugcguu cauagugaau guuggagaca uuuuggagau 900 aaugacuaau gggauuuacc guagcgucga gcaccgggca guaguaaacu caacaaagga 960 gaggcucuca aucgcgacau uucaugacuc uaaacuagag ucagaaauag gcccaauuuc 1020 gagcuugguc acaccagaga caccugcuuu guucaaaaga gguagguaug aggauauuuu 1080 gaaggaaaau cuuucaagga agcuugaugg aaaaucauuu cucgacuaca ugaggaugug 1140 agaaagugug aacauauauu auacuccaca uuguguuuaa uauaugauga aauaaguugc 1200 uuuugaagua ugaugaaaua aguugguuuu gaagaauuca uauugugcuu aaauuucgug 1260 gaugacugag agauuuauua uguaauaaua auguauuggu uugaagauuc ucgucucacu 1320 auauguaaga cucuguuugg gucaagugau guaaucacgg uugaaauaag uugcuuuuga 1380 agaauucaua uggugcuuaa uauuauguaa uaaauaaugu auuggauuga aaaaaaaaaa 1440 aaaaaaaaaa aa 1452

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para aumentar la acumulación de tebaína en una planta de adormidera, comprendiendo el método transformar el genoma de la planta para incluir una molécula de ácido nucleico que codifica un ARN en horquilla para reducir simultáneamente la actividad de la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y de la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta de adormidera, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 7.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la T6ODM tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la CODM tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la T6ODM tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y la CODM tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde reducir simultáneamente la actividad de T6ODM y de CODM comprende:
reducir la acumulación de transcritos de un gen endógeno que codifica la T6ODM y de un gen endógeno que codifica la CODM.
4. Una planta o célula vegetal de adormidera que tiene actividad reducida de tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y de codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en relación con una célula vegetal de tipo silvestre, en donde la célula de la planta de adormidera comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un ARN en horquilla para reducir la expresión de un gen endógeno que codifica la T6ODM y de un gen endógeno que codifica la CODM, en donde la molécula de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 7.
5. La planta o célula vegetal de la reivindicación 4, en donde la T6ODM tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y la CODM tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
6. La planta o célula vegetal de la reivindicación 4 o 5, en donde:
el gen endógeno que codifica la T6ODM codifica un ARNm que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 15; el gen endógeno que codifica la T6ODM codifica un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 1; el gen endógeno que codifica la CODM codifica un ARNm que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 16; el gen endógeno que codifica la CODM codifica un polipéptido que tiene la secuencia de la SEQ ID NO 3; o cualquier combinación de los mismos.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada, en donde la secuencia de la molécula de ácido nucleico comprende la SEQ ID NO: 7.
8. Uso de una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia que comprende la SEQ ID NO: 7 para transformar una planta de adormidera para reducir simultáneamente la expresión de genes endógenos que codifican la tebaína 6-O-desmetilasa (T6ODM) y la codeína 3-O-desmetilasa (CODM) en la planta de adormidera.
9. Uso de una planta que comprende una célula vegetal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para la producción de tebaína.
10. Paja de adormidera de una planta o de una planta que comprende una célula vegetal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
11. Látex de una planta o célula vegetal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el látex comprende una molécula de ácido nucleico que comprende la s Eq ID NO: 7.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3553177T3 (da) 2013-03-15 2021-02-15 Univ Leland Stanford Junior Benzylisoquinolinalkaloider (bia) som producerer mikrober, og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
CN112410379B (zh) 2013-11-04 2024-12-31 小利兰·斯坦福大学托管委员会 产生苄基异喹啉生物碱(bia)前体的微生物以及制备和使用所述前体的方法
EP3292203A4 (en) 2015-05-04 2019-10-09 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University BENZYL ISOCHINOLIN ALKALOID (BIA) Precursor Producing Microbicides and Method for the Preparation and Use Thereof
JP7266966B2 (ja) 2015-05-08 2023-05-01 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー エピメラーゼ及びベンジルイソキノリンアルカロイドを産生する方法
WO2018075670A1 (en) 2016-10-18 2018-04-26 Antheia, Inc. Methods of producing nor-opioid and nal-opioid benzylisoquinoline alkaloids
AU2018203033B2 (en) * 2017-05-02 2021-07-01 Sun Pharmaceutical Industries Australia Pty Limited Modified plant
WO2019028390A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Antheia, Inc. ALKALOID BENZYLISOQUINOLEIN GENETICALLY MODIFIED EPIMERASES AND METHODS FOR PRODUCING BENZYLISOQUINOLINE ALKALOIDS
EP3758728A4 (en) * 2018-03-02 2021-12-22 Tasmanian Alkaloids Pty. Ltd. PAPAVER SOMNIFERUM PLANT WITH AN MODIFIED ALKALOID PROFILE
CN120399912A (zh) 2019-03-08 2025-08-01 小利兰·斯坦福大学托管委员会 产生莨菪烷生物碱(ta)的非植物宿主细胞及其制备和使用方法
JP7555091B2 (ja) * 2020-02-29 2024-09-24 国立大学法人千葉大学 代謝物センサ及び酵素活性のスクリーニング方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6067749A (en) * 1996-07-11 2000-05-30 Tasmanian Alkaloids Pty. Ltd. Papaver somniferum strain with high concentration of thebaine and oripavine
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
CA2317508A1 (en) 1998-01-08 1999-07-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods for plant transformation and regeneration
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6730838B1 (en) 1999-02-12 2004-05-04 Council Of Scientific And Industrial Research Opiumless and alkaloid-free non-narcotic opium poppy (Papaver somniferum) variety “Sujata”
AUPP946399A0 (en) 1999-03-26 1999-04-22 Johnson & Johnson Research Pty. Limited Codeinone reductase from alkaloid poppy
EP1270727A1 (en) 2001-06-11 2003-01-02 Institut für Pflanzenbiochemie Salutaridinol 7-O-acetyltransferase and derivatives thereof
CH695417A5 (de) * 2001-11-15 2006-05-15 Ddr Wassyl Nowicky Dipl Ing Verfahren zur Umsetzung von Alkaloiden.
US6790959B1 (en) 2003-06-05 2004-09-14 Halsey Drug Company, Inc. Process for manufacturing thebaine
US6864370B1 (en) 2003-06-05 2005-03-08 Zhaiwei Lin Process for manufacturing oxycodone
EP1512748A1 (en) 2003-09-03 2005-03-09 Johnson & Johnson Research Pty Limited O-methyltransferases of tetrahydrobenzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in papaver somniferum
EP1632565A1 (en) 2004-08-12 2006-03-08 Johnson & Johnson Research Pty Limited Modulation of alkaloid biosynthesis in plants and plants having altered alkaloid biosynthesis
DE102005005449A1 (de) * 2005-02-04 2006-08-10 Grünenthal GmbH Verfahren zur Herstellung einer gegen Missbrauch gesicherten Darreichungsform
AU2006216715A1 (en) 2005-02-22 2006-08-31 Ceres Inc. Modulating plant alkaloids
WO2006115575A1 (en) 2005-04-20 2006-11-02 Ceres Inc. Regulatory regions from papaveraceae
US9131649B2 (en) * 2008-03-07 2015-09-15 Tasmanian Alkaloids Pty. Ltd Papaver somniferum strain with high concentration of thebaine
US8541647B2 (en) 2008-05-29 2013-09-24 Tasmania Alkaloids Pty, Ltd. Papaver somniferum with high concentration of codeine
US8586526B2 (en) 2010-05-17 2013-11-19 Sangamo Biosciences, Inc. DNA-binding proteins and uses thereof
WO2011058446A2 (en) * 2009-11-12 2011-05-19 Uti Limited Partnership Thebaine 6-o-demethylase and codeine o-demethylase from papaver somniferum
CA2872079A1 (en) * 2012-04-30 2013-11-07 Tpi Enterprises Ltd Papaver bracteatum with modified alkaloid content

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