ES2970436T3 - Péptidos de chaperonina 60.1 de tuberculosis micobacteriana y usos de los mismos - Google Patents

Péptidos de chaperonina 60.1 de tuberculosis micobacteriana y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos péptidos derivables del polipéptido chaperonina 60.1 y a su uso en medicina, tal como para la prevención y/o el tratamiento de afecciones inflamatorias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos de chaperonina 60.1 de tuberculosis micobacteriana y usos de los mismos
La presente invención se refiere a nuevos péptidos obtenidos a partir de polipéptidos que se derivan de la chaperonina 60.1 de tuberculosis micobacteriana y a sus usos como medicamentos, tales como para la prevención y/o tratamiento de afecciones inflamatorias.
La solicitud de patente internacional, número de publicación WO02/040037 describe composiciones farmacéuticas que comprenden Cpn60.1 obtenidas a partir deMycobacterium tuberculosis(MtCpn60.1) y sus moléculas de ácido nucleico codificantes. Esta solicitud también describe una serie de fragmentos peptídicos específicos obtenidos a partir del polipéptido de longitud completa que poseen actividad biológica similar. También se divulga una variedad de usos terapéuticos para estas moléculas, incluyendo el tratamiento y/o prevención de trastornos autoinmunes, afecciones alérgicas, afecciones tipificadas por una respuesta inmune de tipo Th2 y afecciones asociadas con la eosinofilia.
La solicitud de patente internacional, con el número de publicación WO2009106819 describe una serie de péptidos novedosos derivables de MtCpn60.1 que incluyen un péptido denominado "Péptido 4" que tiene una secuencia de aminoácidos: DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1). La SEQ ID NO: 1 exhibe actividad antiinflamatoria y se ha demostrado que reduce significativamente el reclutamiento de eosinófilos en un modelo animal de inflamación alérgica de las vías respiratorias.
El documento WO2013057499 describe varios subfragmentos de SEQ ID NO: 1 que se muestra que poseen actividad biológica.
La presente invención se basa en el hallazgo inesperado de que ciertos subfragmentos y variantes novedosos de SEQ ID NO: 1 (DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD) exhiben actividad biológica y un perfil farmacocinético mejorado. El nuevo péptido de la presente invención es particularmente adecuado para el desarrollo como producto farmacéutico debido a su longitud de cadena de aminoácidos comparativamente corta, lo que lo hace conveniente para prepararlo y aislarlo con alto rendimiento. También se indica que el péptido de la invención posee una estabilidad biológica mejoradain vivocon respecto a MtCpn60.1 y fragmentos peptídicos conocidos del mismo. En particular, el péptido reivindicado en el presente documento posee una vida media mejorada. Por consiguiente, en un aspecto de la invención, la presente solicitud proporciona una molécula peptídica aislada o recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 18).
Los inventores de la presente han descubierto sorprendentemente que el péptido mencionado anteriormente es eficaz como agente antiinflamatorio y que al mismo tiempo tiene una vida media plasmática significativamente mejorada en relación con los péptidos conocidos derivados de la chaperonina 60.1 descritos anteriormente.
El péptido de la invención se puede sintetizar química o recombinantemente y tiene varias propiedades químicas, estructurales y funcionales diferentes a las de la chaperonina 60.1 de longitud completa.
El péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 18) reduce el tráfico de eosinófilos y/o neutrófilos a sitios de inflamación, permitiendo su uso en la prevención y/o tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos, incluidos asma, esclerosis múltiple, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide y la enfermedad inflamatoria intestinal.
Se pueden sintetizar o seleccionar variantes recombinantes que codifican el mismo polipéptido haciendo uso de la "redundancia" en el código genético. Se pueden introducir diversas sustituciones de codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o la expresión en un sistema procariótico o eucariótico particular.
Por "identidad" se entiende el número o porcentaje (dependiendo de la presentación de los resultados) de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia.
El porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos se puede determinar usando programas informáticos adecuados, por ejemplo el programa GAP del Grupo de Computación Genética de la Universidad de Wisconsin, con el que se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula en relación con los polipéptidos cuya secuencia se ha alineado de manera óptima. Alternativamente, la alineación se puede realizar utilizando el programa Clustal W(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80).Los parámetros utilizados pueden ser los siguientes: parámetros de alineación rápida por pares: tamaño de K-tupla (palabra); 1, tamaño de ventana; 5, penalización por brecha; 3, número de diagonales superiores; 5. Método de puntuación: x por ciento; múltiples parámetros de alineación: penalización por apertura de brecha; 10, penalización por extensión de brecha; 0,05. Matriz de puntuación: BLOSUM.
La identidad de secuencia se puede determinar, por ejemplo, usando el método Jotun Hein(Hein, J. (1990) Métodos Enzymol. 183:626-645).La identidad entre secuencias también puede determinarse mediante otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante diferentes condiciones de hibridación.
La nomenclatura de derivados de aminoácidos y péptidos se ajusta a las reglas IUPAC-IUB(J. Ciencia de péptidos.
1999, 5, 465-471).Los D-aminoácidos se indican mediante abreviaturas en minúsculas, por ejemplo, Ala o A para L-alanina, ala o a para D-alanina.
En la presente invención la molécula peptídica aislada o recombinante consiste en una secuencia de aminoácidos bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 18). La MtCpn60.1 se puede clonar y expresar utilizando los métodos descritos enT.H. Kong y col., Proc. Nacional. Acad. Ciencia, 1993, 90, 2608-2612 y j C Lewthwaite et al, Infección e inmunidad, 2001, 69(12), 7349-7355.La MtCpn60.1 también está disponible comercialmente en Lionex (Alemania). El péptido de la presente invención se puede preparar y/o aislar usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, mediante síntesis en solución o en fase sólida usando métodos tradicionales o usando un sintetizador automatizado en fase sólida, por ejemplo tal y como se describe enI. Coin, Protocolos de la naturaleza, 2007, 2, 3247-3256.Preferiblemente, el péptido de la presente invención se prepara mediante síntesis en fase sólida de Fmoc usando métodos análogos a los descritos enGB Fields y R.L. Noble, Int. J. Proteína peptídica Res., 1990, 35(3), 161-214.Los péptidos pueden ciclarse usando métodos conocidos, por ejemplo, tal y como se describe enH. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) y en R. S. McDowell, et al., J. Amer. Química. Soc. 114, 9245-9253 (1992).Estos péptidos pueden fusionarse con moléculas transportadoras, como las inmunoglobulinas, para muchos fines, incluido el aumento de la valencia de los sitios de unión a proteínas.
Se entiende que los compuestos de la invención incluyen sales. También se incluyen metabolitos y profármacos. A los compuestos según la invención pertenecen también cualesquiera derivados isotópicos.
El péptido se puede utilizar según la invención cuando al paciente se le van a administrar uno o más agentes terapéuticos o cuando los péptidos se proporcionan en combinación con uno o más agentes terapéuticos. El agente terapéutico puede seleccionarse entre, entre otros, agentes modificadores de la enfermedad, incluidos inmunomoduladores biológicos, analgésicos, broncodilatadores, agentes antiinflamatorios, fármacos antialérgicos, inmunoterapia alérgena, antivirales, antibióticos, anticuerpos, esteroides y fármacos utilizados habitualmente en el tratamiento de cualquiera de las afecciones crónicas y remitentes recurrentes descritas en la presente.
Los agentes modificadores de la enfermedad incluyen, por ejemplo, hidroxicloroquina, sulfasalazina, leflunamida, metotrexato y minociclina y productos biológicos que se dirigen contra el TNFalfa, tales como abatacept, adalimumab, etanercept, infliximab y golimumab, o inmunomoduladores tales como alemtuzumab, interferón beta-1b, beta interferón-1a dimetilfumarato, copaxona, natalizumab y teriflunomida. Los analgésicos incluyen paracetamol, antiinflamatorios no esteroides como ibuprofeno y aspirina, codeína, tramadol, morfina, amitriptilina, gabapentina y opiáceos.
Los agentes antiinflamatorios incluyen antagonistas de los receptores de leucotrienos, teofilina e inhibidores de la PDE4 como roflumilast, corticosteroides en dosis baja, media y alta, por vía inhalatoria, subcutánea, intramuscular, sublingual, intravenosa y oral. Los antivirales incluyen oseltamivir. Los antibióticos incluyen amoxicilina. Los anticuerpos incluyen anticuerpos anti-IgE (por ejemplo, omaluzimab), anticuerpos que modifican la señalización de citoquinas (por ejemplo, anti-IL-5mab mepoluzimab). Los esteroides incluyen propionato de fluticasona y furorato de fluticasona, dipropionato de beclometasona, budesonida, ciclesonida, flunisolida y mometasona. Puede ser preferible el uso según la invención cuando uno o más agentes terapéuticos adicionales se seleccionan entre corticosteroides, antileucotrienos, anticuerpos monoclonales de citoquinas o teofilina. También se puede preferir el uso cuando el agente adicional es un broncodilatador. Los broncodilatadores preferidos incluyen agonistas de B2 de acción corta tales como salbutamol, agonistas de B2 de acción prolongada tales como salmeterol, formoterol, olodaterol y vilanterol, antagonistas de receptores muscarínicos de acción corta tales como bromuro de ipratropio y antagonistas de receptores muscarínicos de acción prolongada tales como bromuro de aclidinio, bromuro de tiotropio y bromuro de glicopirronio.
Usos de los péptidos
Según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un péptido tal y como el que se define en el presente documento para su uso como medicamento.
El péptido de la invención puede usarse en un ser humano o en un animal no humano, generalmente un mamífero. Preferiblemente, el péptido de la presente invención se usa para el tratamiento y/o prevención de afecciones inflamatorias agudas y/o crónicas. Los ejemplos preferidos de afecciones inflamatorias agudas y/o crónicas incluyen la inflamación asociada con una infección (como shock séptico, sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)), lesión por isquemia-reperfusión que incluye trombosis coronaria y bloqueo de la arteria cerebral, síndrome de shock pulmonar, mortalidad por endotoxinas, artritis (particularmente artritis reumatoide o artritis inflamatoria crónica), rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, asma no alérgica, asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
Otras condiciones inflamatorias preferidas incluyen; insuficiencia orgánica aguda asociada con cirugía, tales como lesión renal aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda asociado con las siguientes intervenciones quirúrgicas (lista no exhaustiva); cirugía cardíaca, derivación [bypass] de arteria coronaria, aneurisma aórtico, cirugía valvular, esofagectomía, enfermedades renales, injerto de derivación [bypass] de arteria coronaria, raíz aórtica y cirugía de reparación de aneurisma de aorta ascendente.
En una realización alternativa, la presente invención proporciona el uso de un péptido tal y como el que se define en el presente documento para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
En una realización alternativa, la presente invención proporciona el uso de un péptido tal y como el que se define en el presente documento para la prevención y/o el tratamiento de trastornos autoinmunes.
Dentro del término "trastornos autoinmunes", tal como se utiliza en el presente documento, se incluyen afecciones en las que se puede demostrar que el proceso autoinmune contribuye a la patogénesis de una enfermedad. Estos trastornos suelen estar asociados con una respuesta inmunitaria de tipo linfocito T colaborador 1 (Th-1).
Ejemplos de trastornos autoinmunes que pueden prevenirse y/o tratarse con las moléculas peptídicas de la presente invención incluyen trastornos autoinmunes, tales como anemia hemolítica, trombocitopenia, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, miastenia gravis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, aterosclerosis, encefalitis autoinmune, enfermedad del tejido conectivo, esclerosis múltiple, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis autoinmune, enfermedad de injerto contra huésped y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune. Los trastornos autoinmunes preferidos incluyen artritis reumatoide y esclerosis múltiple.
En una realización alternativa, la presente invención proporciona el uso de un péptido tal y como se define en el presente documento para la prevención y/o el tratamiento de afecciones alérgicas. Ejemplos de afecciones y trastornos alérgicos que pueden prevenirse y/o tratarse con las moléculas peptídicas de la presente invención incluyen eczema, dermatitis, rinitis alérgica (fiebre del heno), enfermedades alérgicas de las vías respiratorias, síndrome hipereosinofílico, dermatitis de contacto; enfermedades respiratorias caracterizadas por inflamación eosinofílica de las vías respiratorias e hiperreactividad de las vías respiratorias, como asma, incluido el asma alérgica y el asma intrínseca, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía eosinofílica, bronquiectasias bronquitis alérgica, asma ocupacional, síndrome de enfermedad reactiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar intersticial, síndrome hipereosinofílico, enfermedad pulmonar parasitaria; anafilaxia, enfermedad del suero, reacciones a medicamentos, alergias alimentarias, alergias a venenos de insectos, mastocitosis, neumonitis por hipersensibilidad, urticaria, angioedema, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, eritema multiforme, síndrome de Stevens-Johnson, conjuntivitis alérgica, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis venérea y conjuntivitis papilar gigante. Otras afecciones en las que se desea inmunomodulación (incluido, por ejemplo, el trasplante de órganos) también pueden tratarse usando una molécula peptídica de la presente invención. Los trastornos y afecciones alérgicos preferidos incluyen asma, rinitis alérgica y dermatitis atópica.
Dentro de los términos "trastornos alérgicos" y "condiciones alérgicas" como se utilizan en el presente documento se incluyen condiciones asociadas con una respuesta inmune de tipo linfocito T colaborador-2 (Th-2). En las reacciones alérgicas, se producen niveles elevados de IgE y las respuestas inmunes Th-2 predominan sobre las respuestas Th-1, lo que resulta en una respuesta inflamatoria.
El documento WO2013057499 describe ensayos adecuados para evaluar;
(a) los efectos terapéuticos de los polipéptidos o sus antagonistas sobre las reacciones alérgicas, (b) citotoxicidad por timocitos o esplenocitos
(c) respuestas de inmunoglobulinas dependientes de células T y cambio de isotipo (que identificarán, entre otras, proteínas que modulan las respuestas de anticuerpos dependientes de células T y que afectan los perfiles Th1/Th2),
(d) ensayos de reacción mixta de linfocitos (MLR) (que identificarán, entre otras, proteínas que generan respuestas predominantemente Th1 y CTL),
(e) ensayos dependientes de células dendríticas (que identificarán, entre otras, proteínas expresadas por células dendríticas que activan células T vírgenes [o células T naive]),
(f) supervivencia/apoptosis de los linfocitos (que identificará, entre otras, proteínas que previenen la apoptosis después de la inducción de superantígenos y proteínas que regulan la homeostasis de los linfocitos),
(g) proteínas que influyen en los primeros pasos del compromiso y desarrollo de las células T (h) los efectos inmunomoduladores de las moléculas peptídicas de la presente invención contra la artritis reumatoide pueden determinarse en un sistema modelo animal experimental.
Tal y como se usa en el presente documento, "tratamiento" significa reducir, aliviar o eliminar uno o más síntomas de la afección que se está tratando, en relación con los síntomas previos al tratamiento. Por ejemplo, los síntomas que pueden verse afectados incluyen eosinofilia, disminución de la secreción de citoquinas particulares, respuesta inmune basada en Th2, respuesta alérgica y presencia de autoanticuerpos.
Como se usa en el presente documento, "prevención" significa retrasar o prevenir la aparición de una afección o reducir su gravedad, según lo evaluado por la aparición o el alcance de uno o más síntomas de dicha afección.Composiciones farmacéuticas
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula peptídica como se define anteriormente y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos descritos en el presente documento pueden formularse para administración de cualquier forma conveniente. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula peptídica como se define anteriormente y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Puede usarse cualquier vía de administración adecuada. Por ejemplo, puede ser adecuada cualquiera de las vías de administración oral, tópica, parenteral, ocular, rectal, vaginal, por inhalación, bucal, sublingual e intranasal.
La molécula peptídica y la composición farmacéutica de la invención se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea, o se pueden administrar mediante técnicas de infusión. Se utilizan mejor en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben tamponarse adecuadamente (preferiblemente a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas en condiciones estériles se logra fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.
Los medicamentos y composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los medicamentos y composiciones pueden presentarse en envases monodosis o multidosis, por ejemplo ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en estado de congelación en seco (liofilizado) requiriendo únicamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.
Las moléculas, medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar por vía intranasal o por inhalación y se administran convenientemente en forma de un inhalador de polvo seco o una presentación en aerosol desde un recipiente, bomba, aerosol o nebulizador presurizado con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono u otros gas. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. El recipiente, bomba, aerosol o nebulizador presurizado puede contener una solución o suspensión del agente activo, por ejemplo usando una mezcla de etanol y el propulsor como disolvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo, trioleato de sorbitán. Las cápsulas y cartuchos (hechos, por ejemplo, de gelatina) para uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla en polvo de un agente de la invención y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Las formulaciones en aerosol o en polvo seco se disponen preferiblemente de manera que cada dosis medida o "bocanada" contenga al menos 200 pg de una molécula de la invención para su administración al paciente. Se apreciará que la dosis diaria global con un aerosol variará de un paciente a otro y se puede administrar en una dosis única o, más habitualmente, en dosis divididas a lo largo del día.
La molécula peptídica y las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar por vía oral. El proceso puede emplear un proceso natural para la absorción oral de vitamina B12 y/o vitamina D en el cuerpo para coadministrar proteínas y péptidos. Montando la vitamina B12 y/o sistema de absorción de vitamina D, las moléculas y formulaciones farmacéuticas de la invención pueden moverse a través de la pared intestinal. Se sintetizan complejos entre análogos de la vitamina B12 y/o análogos de la vitamina D y el fármaco que conservan una afinidad significativa por el factor intrínseco (IF) en la parte de vitamina B12 y la parte de vitamina D del complejo y bioactividad significativa del principio activo del complejo.
La molécula peptídica y las composiciones farmacéuticas de la invención normalmente se administrarán por cualquier vía parenteral o intranasal, y en algunas realizaciones por vía oral, en forma de una composición farmacéutica que comprende el ingrediente activo. Dependiendo del trastorno y del paciente a tratar, así como de la vía de administración, las composiciones pueden administrarse en dosis variables.
En terapia humana, la molécula peptídica y las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar solas, pero generalmente se administrarán mezcladas con un excipiente, diluyente o vehículo farmacéutico [portador] adecuado seleccionado con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar.
Preferiblemente, la composición farmacéutica de la presente invención es una dosificación unitaria que contiene una dosis diaria o unidad, subdosis diaria o una fracción apropiada de la misma, del ingrediente activo.
Por ejemplo, la molécula peptídica y las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía oral, bucal o sublingual en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, o controlada. La molécula peptídica y las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar mediante inyección intracavernosa.
Dichos comprimidos pueden contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, desintegrantes tales como almidón (preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), glicolato de almidón de sodio, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos, y aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga. Además, se pueden incluir agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico y behenato de glicerilo.
También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferidos a este respecto incluyen lactosa, almidón, celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular. Para suspensiones y/o elixires acuosos, los agentes de la invención se pueden combinar con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, materias colorantes o tintes, con agentes emulsionantes y/o suspensores y con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos. Para la administración oral y parenteral a pacientes humanos, el nivel de dosificación diaria de las moléculas, medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención será normalmente de 200 pg a 100 mg por adulto por día administrados en dosis únicas o divididas.
Así, por ejemplo, el vial, los comprimidos o las cápsulas de las moléculas de la invención pueden contener de 200 pg a 100 mg de agente activo para administración uno solo o dos o más a la vez, según corresponda. En cualquier caso, el médico determinará la dosis real que será más adecuada para cualquier paciente individual y variará según la edad, el peso y la respuesta del paciente en particular. Las dosis anteriores son ejemplares del caso promedio. Por supuesto, puede haber casos individuales en los que se ameriten intervalos de dosificación más altos o más bajos y éstos están dentro del alcance de esta invención.
Alternativamente, las moléculas, medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en forma de supositorio o pesario, o se pueden aplicar tópicamente en forma de loción, solución, crema, gel, pomada o polvo. Las moléculas de medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar por vía transdérmica, por ejemplo, mediante el uso de un parche cutáneo. También pueden administrarse por vía ocular, particularmente para el tratamiento de enfermedades oculares.
Para uso oftálmico, las moléculas, medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica, de pH ajustado, estéril, o, preferiblemente, como soluciones en solución salina isotónica, de pH ajustado, estéril, opcionalmente en combinación con un conservante tal como un cloruro de bencilalconio. Alternativamente, pueden formularse en una pomada como la vaselina.
Para aplicación tópica a la piel, las moléculas, medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular como una pomada adecuada que contiene el agente activo suspendido o disuelto, por ejemplo, en una mezcla con uno o más de los siguientes: aceite mineral, vaselina líquida [petrolato liquido], vaselina blanca, propilenglicol, agente polioxietilenpolioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, pueden formularse como una loción o crema adecuada, suspenderse o disolverse, por ejemplo, en una mezcla de uno o más de los siguientes: aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polietilenglicol, parafina líquida, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Las formulaciones adecuadas para administración tópica en la boca incluyen pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un portador líquido adecuado.
Para uso veterinario, las moléculas, medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención se administran como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria normal y el cirujano veterinario determinará el régimen de dosificación y la vía de administración que serán más apropiadas para un animal en particular.
Convenientemente, la formulación es una formulación farmacéutica. Ventajosamente, la formulación es una formulación veterinaria.
Ventajosamente, en el uso según la invención, el nivel de dosificación diaria será de 10 pg a 100 mg. Preferiblemente, el nivel de dosificación diaria será de 20 pg a 50 mg, 20 pg a 10 mg o 20 pg a 8 mg, administrados en dosis únicas o divididas.
Las formulaciones farmacéuticas preferidas incluyen aquellas en las que el ingrediente activo está presente en al menos un 0,000001 % hasta un 5 % en peso. Es decir, la proporción de ingrediente activo a los otros componentes (es decir, la adición de adyuvante, diluyente y portador) de la composición farmacéutica es al menos 1:99 (por ejemplo, al menos 10:90, preferiblemente al menos 30:70 y lo más preferiblemente al menos 50:50) en peso.
Preferiblemente, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención se formula para permitir la administración por al menos una ruta seleccionada del grupo que comprende o consiste en: intranasal; oral; parenteral; actual; oftálmico; supositorio; pesario; o vías de inhalación. Las formulaciones adecuadas para dichas vías de administración son bien conocidas por expertos en la materia en farmacia y medicina, y los ejemplos de las formulaciones se describen anteriormente y en los ejemplos adjuntos.
Normalmente, el tiempo entre la administración de la dosis al paciente es de entre seis y doce horas; en una realización preferida, el tiempo entre la administración de dosis al paciente es de entre nueve y doce horas después de la dosis anterior; más preferiblemente, el tiempo entre la administración de dosis al paciente es de entre doce horas y doce días; incluso más preferiblemente, el tiempo entre la administración de dosis al paciente es de entre doce días y seis meses.
Preferiblemente, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención se formula para permitir la administración por al menos una ruta seleccionada del grupo que comprende o consiste en: intranasal; sublingual, oral; parenteral; actual; oftálmico; supositorio; pesario; o vías de inhalación. Las formulaciones adecuadas para dichas vías de administración son bien conocidas por expertos en la materia en farmacia y en medicina, y los ejemplos de las formulaciones se describen anteriormente y en los ejemplos adjuntos.
Descripción de figuras
A continuación se describirán ejemplos no limitantes con referencia a las siguientes figuras. Los datos para secuencias peptídicas distintas de la SEQ ID NO: 18 son solo para referencia y se relacionan con temas no cubiertos por la presente invención:
La figura 1 muestra el efecto de la SEQ ID NO: 1 (0,5 pg/ratón i.v) sobre el influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS en el ratón cuando la SEQ ID NO: 1 se administra con 0, 30 y 60 minutos antes de la administración de LPS.
La figura 2 muestra el efecto de la SEQ ID NO: 3 (50 pg/ratón i.v) sobre el influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS en el ratón cuando la SEQ ID NO: 3 se administra con 0, 30 y 60 minutos antes de la administración de LPS.
La figura 3 muestra el efecto de la SEQ ID NO: 3 (50 pg/ratón i.v) sobre el influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS en el ratón cuando la SEQ ID NO: 3 se administra con 0, 30, 60 y 120 minutos después de la administración de LPS.
La figura 4 muestra el efecto de la SEQ ID NO: 1 (50 pg/ratón i.v) sobre el influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS en el ratón cuando la SEQ ID NO: 1 se administra con 0, 30, 60 y 120 minutos después de la administración de LPS.
La figura 5 muestra el efecto de la SEQ ID NO: 17 (0,05, 0,5 y 5 pg/dosis) sobre el influjo de neutrófilos inducido por LPS al pulmón del ratón.
La figura 6 muestra el efecto de las SEQ ID NO: 21,22 y 18 (50 pg/ratón) sobre la afluencia de neutrófilos inducida por LPS al pulmón del ratón.
La figura 7 muestra el efecto de la SEQ ID NO: 4 (0,5, 5 y 500 pg/dosis) sobre el influjo de neutrófilos inducido por LPS al pulmón del ratón.
Ejemplos
Los ejemplos relacionados con secuencias peptídicas distintas de la SEQ ID NO: 18 son solo para referencia y no están cubiertos por la presente invención.
Ejemplo 1
Síntesis
La síntesis y purificación utilizó la síntesis automatizada de péptidos en fase sólida de fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc SPSS). Los péptidos se sintetizaron en resinas de 2-clorotritilo o TentaGel, se derivatizaron con uno de varios conectores escindibles, utilizando una estrategia de síntesis en fase sólida basada en Fmoc/t-butilo. El grupo Fmoc proporcionó protección temporal del grupo N-amino, utilizándose éteres t-butílicos para la protección de las cadenas laterales de hidroxilo de tirosina, serina y treonina, mientras que los ésteres t-butílicos protegieron las cadenas laterales de los residuos de ácido aspártico y glutámico. Las cadenas laterales de histidina y lisina se protegieron como sus derivados N-tritilo y N-Boc, respectivamente, la cisteína como su derivado S-tritilo y el resto arginina guanidina como su derivado Pbf.
Una vez completada la síntesis, los péptidos se escindieron del soporte sólido, con eliminación de los grupos protectores de la cadena lateral, mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) que contenía triisobutilsilano y agua como eliminadores. Después de eliminar el TFA y los eliminadores mediante evaporación y trituración en éter dietílico, se realizó la purificación del péptido mediante HPLC preparativa de fase inversa, seguida de liofilización. El producto purificado se analizó posteriormente mediante HPLC de fase inversa y mediante espectrometría de masas. Ejemplo 2
Actividad de nuevos péptidos en un modelo de inflamación LPS.
La SEQ ID NO: 3 es un péptido de acuerdo con la invención que es un fragmento del péptido SEQ ID NO: 1 (tabla 1) (péptido 4 divulgado en WO2009/106819).
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3
Método del ratón LPS
Varios ratones BALB/c hembra y macho, de 6 a 8 semanas de edad (Harlan, Reino Unido) recibieron 25 pg/ratón deE. colilipopolisacárido (LPS) por vía intranasal inmediatamente después de recibir el péptido intranasal diluido en solución salina estéril o solo en solución salina. Después de 4 horas, los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de uretano y se insertó una cánula en la tráquea expuesta y se inyectaron tres alícuotas de 0,5 ml de solución salina en los pulmones. Del líquido BAL (del inglés"bronchoalveolar lavage"o en español"lavado broncoalveolar"),se añadió una alícuota (50 pl) a 50 pl de solución de hemólisis (solución de Turk, Fluka, Reino Unido). El número total de células en el lavado se contó con un hemocitómetro Neubauer mejorado. Para recuentos celulares diferenciales, se prepararon preparaciones de citospin a partir de alícuotas de líquido BAL (100 pl) centrifugadas a 1000 rpm durante 1 min a temperatura ambiente. Las células se tiñeron con Diff Quick y se contaron un total de 100 células para determinar la proporción de neutrófilos, eosinófilos y monocitos utilizando criterios morfológicos estándar.
La SEQ ID NO: 1 es extremadamente potente en el modelo de LPS de ratón cuando se dosifica por vía intravenosa inmediatamente antes de la exposición a LPS y muestra una inhibición significativa del influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS. Sin embargo, la SEQ ID NO: 1 pierde su actividad en este modelo cuando se administra en momentos anteriores (figura 1) o posteriores (figura 4).
Un fragmento de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 es eficaz en el modelo de ratón LPS cuando se dosifica por vía intravenosa. Sorprendentemente, la SEQ ID NO: 3 también es eficaz en este modelo contra el influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS cuando se dosifica hasta 60 minutos antes de la exposición a LPS (figura 2) y hasta 120 minutos después de la exposición a LPS (figura 3) a diferencia de la SEQ ID NO: 1, que solo demuestra eficacia cuando se dosifica inmediatamente antes de la exposición a LPS (figuras 1 y 4).
Conclusión
Las opciones de dosificación extendidas para la SEQ ID NO: 3 permiten emplear clínicamente protocolos de dosificación tanto terapéuticos como profilácticos. Este perfil amplía el número de indicaciones que pueden tratarse con este péptido.
Ejemplo 3
Pequeños fragmentos de la SEQ ID NO: 1 que muestran una mejora significativa en la estabilidad del plasma.Muchos péptidos tienen una estabilidad plasmática deficiente debido al metabolismo por proteasas. Un pequeño fragmento peptídico de la SEQ ID NO: 1 (el péptido 4 en el documento WO2009/106819) se sintetizó y se probó su eficacia en el modelo de neutrofilia pulmonar de ratón LPS y su estabilidad plasmática en plasma de ratón, rata y humano (SEQ ID NO: 17). Luego se realizaron modificaciones de este péptido y las moléculas resultantes se probaron en los mismos sistemas.
Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 21, 22 y 18
Estabilidad del plasma en plasma de ratón, rata y humano a 37 °C
Plasma: ratón (C57 Black 6 Male), rata (Sprague Dawley) y humano que contiene heparina como anticoagulante. Se incubaron muestras de plasma por duplicado con péptido a 3 pM en un volumen de 600 pl a 37 °C con agitación. Se retiraron alícuotas de 50 pl después de 2, 5, 30, 60 y 120 minutos y se enfriaron en 150 pl de metanol helado que contenía el estándar interno (tolbutamida). Las muestras se almacenaron a -20 °C durante > 2 horas para permitir la precipitación de proteínas. Luego, las muestras se centrifugaron a 2500 x g y los sobrenadantes resultantes se transfirieron a una placa de 96 pocillos para análisis LC-MS/MS. Se calculó Tmedio en todas las matrices para cada péptido.
Resultados
Tabla 3: Resultados de estabilidad del plasma para SEQ ID NO: 17, 21, 22 y 18
La adición de un grupo beta-alanina, ya sea en el extremo N (SEQ ID NO: 18), en el extremo C (SEQ ID NO: 21) o en ambos extremos (SEQ ID NO: 22) mejoró la estabilidad plasmática de los péptidos.
Las figuras 5, 6 y 7 muestran los resultados de probar los péptidos en el método de ratón LPS tal y como se describe anteriormente para el ejemplo 2.
Las figuras 5 y 6 muestran el efecto de la SEQ ID NO: 17 sobre el influjo de neutrófilos pulmonares inducido por LPS en el ratón, con una reducción en el número de neutrófilos tras la administración de diferentes dosis de la SEQ ID NO: 17 (0,5, 5 ó 50 pg/ ratón).
La figura 7 muestra el efecto de las SEQ ID NO: 21, 22 y 18 (50 pg/ratón, i.v) sobre la afluencia de neutrófilos pulmonares inducida por LPS en el ratón.
La SEQ ID NO: 18 conserva actividad antiinflamatoria en el modelo de ratón LPS al tiempo que muestra una mejora significativa en la vida media plasmática (Th) con respecto al péptido original SEQ ID NO: 17 en plasma de ratón, rata y humano (tabla 3). Las SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 muestran una Th superior a SEQ ID NO: 17 pero pierde eficacia en el modelo de inflamación pulmonar de ratón con LPS. En consecuencia, la adición de un grupo beta-alanina en el extremo C sólo mejora la estabilidad del plasma al tiempo que preserva la eficacia.
Ejemplo 4
La tabla 4 muestra datos de estabilidad plasmática en tres especies para las SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 5: (fragmentos peptídicos 2 y 3 del documento WO2013057499).
Tabla 4
Se sintetizó un fragmento más largo (SEQ ID NO: 4), una forma extendida del fragmento 3, y se analizó su estabilidad en plasma. Este fragmento mostró una vida media superior (tabla 5) y se mantuvo eficacia in vivo en el modelo de inflamación pulmonar LPS de ratón (figura 7).
Tabla 5
Ejemplo 5
Estabilidad plasmática de péptidos modificados
A continuación, se realizaron modificaciones estructurales al péptido SEQ ID NO: 17 para mejorar la estabilidad plasmática tal y como se establece en la tabla 6. Luego se evaluó la estabilidad plasmática de los péptidos en las mismas condiciones descritas anteriormente.
Tabla 6
Las vidas medias plasmáticas de los péptidos mencionados anteriormente en ratón, rata o ser humano se establecen en la tabla 7.
Tabla 7
La adición de un grupo de beta-alanina en un extremo de la SEQ ID NO: 17 mejoró significativamente la estabilidad del plasma mientras que se mantenía la actividad, en tanto que la adición del grupo a ambos extremos mejoró aún más la estabilidad (véase la SEQ ID NO: 22) pero dio como resultado una pérdida de actividad biológica. Se sabe que la adición de beta-alanina mejora la capacidad de los fragmentos de proteínas sintéticas para sobrevivir a la acción degradativa de las aminopeptidasas y las enzimas proteolíticas séricas.
La reconfiguración del fragmento usando aminoácidos de la configuración d, (SEQ ID NO: 19 y 20), que rara vez se encuentran en organismos vivos, muestra una estabilidad plasmática mejorada que probablemente también se deba a una protección mejorada contra la proteólisis por aminopeptidasas y enzimas proteolíticas séricas. La adición de acetilación en el extremo N a estos péptidos, que se sabe que tienen actividad estabilizadora, contribuyó aún más a la mejora de la estabilidad del plasma.
Sorprendentemente, la ciclación (SEQ ID NO: 25), uno de los métodos más utilizados para aumentar la estabilidad conformacional de los péptidos, no mejoró la estabilidad del plasma.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Molécula peptídica aislada o recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 18).
2. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 1 para su uso como medicamento.
3. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de afecciones inflamatorias agudas y/o crónicas.
4. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 3 para el uso según la reivindicación 3, en la que la afección inflamatoria está asociada con eosinofilia y/o neutrofilia.
5. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 para el uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en la que la afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en inflamación asociada con una infección (tal como un shock séptico, sepsis o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)), lesión por isquemia-reperfusión, mortalidad por endotoxinas, artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, asma no alérgica, asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica, fibrosis quística, fibrosis pulmonar, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
6. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 para el uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que la afección inflamatoria es una insuficiencia orgánica aguda asociada con cirugía, tal como lesión renal aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda asociado con intervenciones quirúrgicas tales como la cirugía torácica que incluyen, entre otras, cirugía cardíaca, derivación de arteria coronaria, aneurisma aórtico, cirugía valvular, enfermedades renales, injerto de derivación de arteria coronaria, raíz aórtica y cirugía de reparación de aneurisma de aorta ascendente.
7. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
8. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos autoinmunes, opcionalmente en la que el trastorno autoinmune se selecciona del grupo que consiste en anemia hemolítica, trombocitopenia, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes autoinmune, diabetes mellitus dependiente de insulina, miastenia gravis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, aterosclerosis, encefalitis autoinmune, enfermedad del tejido conectivo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmune, síndrome de Guillain-Barré, tiroiditis autoinmune, miastenia gravis, enfermedad de injerto contra huésped y enfermedad ocular inflamatoria autoinmune.
9. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento y/o prevención de trastornos alérgicos.
10. Molécula peptídica aislada o recombinante según la reivindicación 9 para el uso según la reivindicación 9, en la que el trastorno alérgico se selecciona del grupo que consiste en eccema, dermatitis, rinitis alérgica (fiebre del heno), enfermedades alérgicas de las vías respiratorias, síndrome hipereosinofílico, dermatitis de contacto; enfermedades respiratorias caracterizadas por la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias e hiperreactividad de las vías respiratorias, tales como asma, incluyendo asma alérgica y asma intrínseca, aspergilosis broncopulmonar alérgica, neumonía eosinofílica, bronquiectasias bronquitis alérgica, asma ocupacional, síndrome de enfermedad reactiva de las vías respiratorias, enfermedad pulmonar intersticial, síndrome hipereosinofílico, enfermedad pulmonar parasitaria; anafilaxia, enfermedad del suero, reacciones a medicamentos, alergias alimentarias, alergias a venenos de insectos, mastocitosis, neumonitis por hipersensibilidad, urticaria, angioedema, eccema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, eritema multiforme, síndrome de Stevens-Johnson, conjuntivitis alérgica, queratoconjuntivitis atópica, queratoconjuntivitis venérea y conjuntivitis papilar gigante.
11. Composición farmacéutica que comprende una molécula peptídica tal y como se define en la reivindicación 1 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
12. Molécula peptídica aislada o recombinante, una molécula peptídica aislada o recombinante para su uso, o una composición farmacéutica, todo según las reivindicaciones anteriores, en donde al paciente se le van a administrar uno o más agentes terapéuticos o cuando los péptidos se proporcionan en combinación con uno o más agentes terapéuticos.
13. Molécula peptídica aislada o recombinante, una molécula peptídica aislada o recombinante para su uso, o una composición farmacéutica, todo según la reivindicación 12, en las que el agente terapéutico se selecciona entre agentes modificadores de la enfermedad, analgésicos, broncodilatadores, agentes antiinflamatorios, fármacos antialérgicos, agentes alérgenos inmunoterapéuticos, antivirales, antibióticos, anticuerpos, esteroides corticosteroides, antileucotrienos, anticuerpos monoclonales citoquinas y teofilina.
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