ES2971281T3 - Composiciones para usar en el tratamiento de la osteoporosis y de fracturas óseas - Google Patents

Abstract

Una composición para mejorar el tratamiento de dolencias ortopédicas estimula la iNOS y mejora el tratamiento de dolencias ortopédicas cuando se administra una cantidad farmacéuticamente eficaz durante un período de tiempo suficiente. La composición comprende jengibre, Muira puama, Paullinia cupana y al menos uno del grupo formado por L-arginina y L-citrulina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para usar en el tratamiento de la osteoporosis y de fracturas óseas

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades ortopédicas. De acuerdo con una realización, la presente invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo. De acuerdo con tal realización, una composición nutracéutica que estimula la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) mejora la curación de fracturas óseas, como lo demuestran las propiedades biomecánicas. El uso de la composición nutracéutica inmediatamente después de una fractura ósea mejora la curación de la fractura. Además, la presente invención se refiere a composiciones, formas farmacéuticas y métodos para tratar, inhibir el inicio y/o ralentizar la tasa de desarrollo de la osteoporosis. En particular, la presente invención se refiere a composiciones nutracéuticas, a formas farmacéuticas y a métodos para el tratamiento y/o prevención de la osteoporosis a través de la regulación positiva de la iNOS.

2. Descripción de la técnica relacionada

La fuerza o presión sobre una extremidad que excede la resistencia del hueso (por ejemplo, fuerzas de flexión, de par de torsión y/o de compresión) puede provocar fracturas óseas. Las fracturas abiertas o compuestas se producen cuando el hueso roto penetra la piel, si bien en las fracturas cerradas, la piel permanece intacta. Las fracturas pueden ser transversales, longitudinales y/o los huesos pueden romperse en múltiples lugares. Además del traumatismo físico, la fractura patológica de huesos puede estar provocada por una enfermedad, tal como la osteoporosis o el cáncer de huesos. Independientemente de la causa, el dolor y la disfunción significativos asociados con la fractura ósea son a menudo una experiencia que alteran la vida, agravada por el largo tiempo necesario para que los huesos sanen lo suficiente como para funcionar normalmente. Desde hace mucho tiempo se siente la necesidad de medicamentos y de métodos de tratamiento que aceleren la curación de las fracturas.

La curación de las fracturas es el resultado de una cascada compleja y secuencial de eventos celulares que restauran el hueso a su condición anterior a la fractura. El espacio entre los dos extremos de la fractura se llena de un hematoma rico en células mesenquimales y citocinas, que representa el callo blando que pasa finalmente por una fase inflamatoria, seguida de una fase reparadora y a continuación, de remodelación.

Aunque los mecanismos reguladores exactos para estas fases aún no se comprenden completamente, la neovasculatura y el reclutamiento de osteoblastos en el sitio del callo parecen desempeñar un papel clave para una curación exitosa.

En cuanto a la osteoporosis, la osteoporosis es una afección médica que da como resultado la pérdida de masa ósea que da como resultado el deterioro de la arquitectura ósea y un aumento en el riesgo de fractura. La osteoporosis puede ocurrir primaria o secundariamente como resultado de otra afección médica. La osteoporosis comúnmente afecta tanto a hombres como a mujeres de 50 años o más, aunque la osteoporosis secundaria puede afectar a una persona a cualquier edad. Si bien existen varias formas de tratar la osteoporosis, sigue siendo necesaria una forma más simple, fiable y rentable de tratar a los afectados por osteoporosis.

La ciencia detrás del uso de suplementos dietéticos para tratar enfermedades ha aumentado en las últimas décadas. Esto incluye el uso de alimentos o productos naturales junto con compuestos específicos. Sin embargo, los papeles biológicos y bioquímicos de estos productos naturales aún se están dilucidando, por lo que sigue existiendo una imprevisibilidad significativa incluso para cambios pequeños en las formulaciones y/o dependiendo de diversos factores específicos de los pacientes.

Se sabe desde hace décadas que la arginina y otros aminoácidos desempeñan funciones importantes en la función biológica de los seres humanos y de los animales en general. El jengibre y otras plantas a menudo se combinan en los alimentos. En la Solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2002/0051826 de Darlandet al.,se enseña una combinación de romero con otros ingredientes (por ejemplo, curcumina y quercetina), para usar en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación. Además de esos ingredientes principales, Darland también sugiere utilizar opcionalmente limoneno, que puede provenir de D-limoneno o la hesperidina o el uso de entre 180 mg y 220 mg de jengibre; la formulación puede incluir opcionalmente de 180 mg a 220 mg de citrulina y otras vitaminas. Estos informes sugieren la seguridad de ingredientes tales como el jengibre, la citrulina y la arginina como suplementos dietéticos a largo plazo. Si bien las formulaciones complejas, tales como las divulgadas en la técnica anterior, están indicadas para tener beneficios generales para la salud, existe la necesidad de realizar más pruebas de formulaciones específicas y determinar su impacto, tanto positivo como negativo, sobre diferentes aspectos de la salud.

Por tanto, sigue habiendo una imprevisibilidad sustancial en los beneficios y los perjuicios de las plantas naturales, con una amplia gama de enseñanzas contradictorias y poco fiables, muchos de ellos basados en informes anecdóticos que no pueden reproducirse de forma fiable. Con el fin de hacer una recomendación de tratamiento médico, un personal experto habitual en la materia de la investigación médica occidental requiere datos de estudios que utilicen métodos científicos aceptados. Tales métodos científicos incluyen controles (por ejemplo, placebo o formulaciones basales), análisis objetivos independientes, historiales de pacientes y seguimiento del paciente antes, durante y después de cada estudio. Cuando sea posible, los métodos científicos deben incluir ensayos clínicos con doble enmascaramiento y composiciones uniformes con ingredientes y análisis fiables y coherentes. De lo contrario, los datos y/o conclusiones están sujetos a crítica como subjetivos, anecdóticos y/o erróneos basados en estudios realizados adecuadamente, por ejemplo, estudios del tipo aceptado por la Agencia de Medicamentos y Alimentos de EE. UU. (FDA de EE. UU.), que puede incluir un protocolo IRB (protocolo del Institutional Review Board presentado y aprobado por otros científicos).

Se prefiere tener resultados de estudios en los que puedan confiar los facultativos capacitados en la medicina y en la ciencia modernas. Si bien es deseable utilizar productos naturales que tengan una seguridad bien establecida como alimentos en lugar de formulaciones farmacéuticas químicas sintéticas, tal uso debe basarse en estudios suficientes para justificar el reemplazo o el complemento de medicamentos que hayan superado el escrutinio regulador y científico. Los presentes inventores se enfrentaron al problema de encontrar composiciones y métodos para el tratamiento y la inhibición de la osteoporosis que sean prácticos para la administración rutinaria a largo plazo (evitando al mismo tiempo los efectos secundarios de las formulaciones existentes), que permitan el tratamiento y la prevención de la osteoporosis en pacientes que no pueden utilizar tratamientos anteriores para la osteoporosis y/o proporcionen nuevas composiciones prácticas y rentables para prevenir así como tratar la osteoporosis.

Sumario de la invención

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas en donde la composición comprende de 250 mg a 2 g de jengibre o de derivado del jengibre.

Otro objeto además de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas en donde el derivado de jengibre se deriva deZingiber officinaleRoscoe o de rizomas deZingiber officinaleRoscoe.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye de 10 mg a 3 g de L-arginina, de L-citrulina o de una mezcla de L-arginina y L-citrulina.

Otro objeto además de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye de 10 mg a 2 g de L-arginina, de L-citrulina o de una mezcla de L-arginina y L-citrulina.

También es un objeto de la presente invención proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye de 100 mg a 3 g de muira puama.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye de 500 mg a 1,5 g de muira puama.

Otro objeto además de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye al menos 250 mg dePaullinia cupana.

También es un objeto de la presente invención proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye 500 mg dePaullinia cupana.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas que incluye de 250 mg a 2 g de jengibre o de derivado del jengibre, de 250 mg a 2 g de L-arginina, de L-citrulina o de una mezcla de L-arginina y L-citrulina, de 500 mg a 1,5 g de muira puama y 500 mg dePaullinia cupana.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición para mejorar el tratamiento de enfermedades ortopédicas en donde la composición está en una forma farmacéutica oral que comprende un comprimido, cápsula, pastilla para chupar o una suspensión.

Otros objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada cuando se observen junto con los dibujos adjuntos, que exponen ciertas realizaciones de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática que explica los tres mecanismos para la regulación positiva de la ruta del óxido nítrico - cGMP.

La Figura 2 es una representación esquemática de las rutas biológicas sobre las que actúa la presente composición nutracéutica para regular positivamente la ruta del óxido nítrico - cGMP con el fin de tratar fracturas.

La Figura 3 muestra imágenes de qCT representativas de tres (3) grupos. Las imágenes de qCT se tomaron 1 mm por debajo de cada sitio de fractura para eliminar el solapamiento de los fragmentos óseos al nivel de la fractura. El contenido mineral total y el volumen de callo de una fractura se calcularon mediante la combinación de los valores de tres secciones, en el lugar de la fractura y 1 mm por encima y por debajo. La barra lateral derecha indica la densidad mineral ósea.

La Figura 4 muestra el par de torsión máximo (resistencia) y la rigidez de la fractura en curación el Día 42. Los resultados se expresan como media ± E.T. *p< 0,05 comparado con el grupo de control. ;La Figura 5 muestra el efecto del tadalafilo y del COMB-4 (la composición nutracéutica de la presente invención) en la expresión de la iNOS el Día 14 y el Día 42 después de la fractura femoral. La expresión de iNOS se determinó mediante inmunohistoquímica a los 14 días o 42 días después de la fractura y el tratamiento con tadalafilo o con COMB-4 comenzó diariamente inmediatamente después de la fractura. Se muestra el análisis de imagen cuantitativo de la intensidad por celda y los resultados se expresan como media ± E.T. *p< 0,05 comparado con el grupo de control.

La Figura 6 es una representación esquemática de las rutas biológicas sobre las que actúa la presente composición para regular positivamente la ruta del óxido nítrico - cGMP con el fin de tratar la osteoporosis.

La Figura 7 es una representación esquemática del diseño experimental empleado de acuerdo con la prueba de la eficacia de la presente composición en el tratamiento de la osteoporosis.

Las Figuras 8 - 27 presentan datos de pruebas que respaldan la eficacia de la presente composición en el tratamiento de la osteoporosis.

Las Figuras 28 - 32 presentan datos que demuestran que la presente composición, en las dosis utilizadas en el estudioin vivo,no tienen un efecto inhibidor sobre la proliferación de osteoblastos.

Descripción de las realizaciones preferidas

Las realizaciones detalladas de la presente invención se divulgan en el presente documento. Se debe entender, sin embargo, que las realizaciones divulgadas son meramente ilustrativas de la invención, las cuales pueden materializarse de diversas formas. Por tanto, los detalles divulgados en el presente documento no deben interpretarse como limitantes, sino meramente como una base para enseñar a una persona experta en la técnica cómo realizar y/o utilizar la invención.

La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades ortopédicas. En particular, la presente invención proporciona una composición nutracéutica para tratar un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo. La presente invención también proporciona una composición nutracéutica para tratar la osteoporosis. La composición nutracéutica (a la que se hace referencia en el presente documento y en diversas figuras como COMB-4) comprende cantidades eficaces de jengibre o de un derivado de jengibre seleccionado del grupo que consiste en jengibre vegetal fresco, parcialmente seco, jengibre vegetal seco, 6-gingerol y mezclas de los mismos; al menos uno del grupo que consiste en arginina y citrulina (preferentemente, L-arginina, L-citrulina o una combinación de L-arginina y L-citrulina); muira puama; yPaullinia cupana(guaraná).

El jengibre es una composición natural compleja que tiene numerosas propiedades supuestas cuando se usa solo y/o junto con otros compuestos. Por ejemplo, las medicinas tradicionales chinas han utilizado o incluido jengibre en composiciones para tratar o prevenir diversas enfermedades basándose en diversas razones metafísicas. Durante el siglo pasado, los métodos científicos han demostrado que muchas medicinas tradicionales chinas no producen los efectos supuestos y/o incluso pueden empeorar las enfermedades objetivo. No obstante, se ha descubierto que algunas medicinas tradicionales chinas contienen agentes activos que pueden ser de uso médico, incluso si no son eficaces o seguros para el uso supuesto por la medicina tradicional china. La complejidad del jengibre y sus innumerables propiedades se reflejan en ciertos compuestos constituyentes que tienen la siguiente estructura:

en donde, por ejemplo, en 6-gingerol, la cadena lateral R del grupo funcional vanillilo (es decir, grupo 4-hidroxi-3-metoxifenilo) es:

Por tanto, el 6-gingerol (también llamado gingerol) es (S)-5-hidroxi-1-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-3-decanona y tiene la siguiente estructura:

Dado que el jengibre contiene múltiples compuestos, de diversa complejidad y actividad química, existen enseñanzas contradictorias en la técnica sobre la actividad biológica de los compuestos que podrían ser útiles para inducir la producción de óxido nítrico (NO) o que de otro modo tendrían un papel potencial en un tratamiento. Además, sigue habiendo una considerable imprevisibilidad sobre cómo entender, mucho menos controlar, las rutas metabólicas relevantes. Sin embargo, los presentes solicitantes han descubierto que el jengibre, cuando se combina con muira puama,Paullinia cupana(guaraná) y al menos uno del grupo que consiste en arginina y citrulina (preferentemente, L-arginina, L-citrulina o una combinación de L-arginina y L-citrulina) se puede utilizar eficazmente para tratar enfermedades ortopédicas.

Una forma farmacéutica oral de la composición nutracéutica de acuerdo con la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en un comprimido, cápsula, pastilla para chupar, polvo o suspensión, que comprende los ingredientes anteriores. Las suspensiones preferidas son acuosas y/o de base alcohólica (etanol).

Las materias primas y los ingredientes pueden secarse, por ejemplo mediante criodesecación o secado al vacío, antes de la preparación de compuestos en formas farmacéuticas orales. Las formas farmacéuticas individuales pueden comprender comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar o pueden presentarse en sobres. Se pueden proporcionar formulaciones de suspensiones. El jengibre, extracto de la raíz de jengibre, L-arginina, L-citrulina, muira puama yPaullinia cupana,están disponibles comercialmente por separado, con fuentes preferidas y análisis proporcionados más adelante. Preferentemente, los ingredientes se combinan y se encapsulan en cápsulas de gelatina, pero se anticipan otras formas farmacéuticas que producirán resultados equivalentes.

Se pueden emplear aromatizantes o agentes enmascaradores del sabor. Los comprimidos u otras formas farmacéuticas pueden incluir diluyentes (por ejemplo, lactosa), disgregantes (por ejemplo, carmelosa cruzada de sodio) o aglutinantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona). Se pueden emplear lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio u otros excipientes convencionales (por ejemplo, sílices, hidratos de carbono, etc.). Se pueden proporcionar comprimidos recubiertos con película.

Los principios activos de las composiciones de la presente divulgación se combinan usando procesos y agentes convencionales y bien conocidos. Preferentemente, una cápsula de gelatina contiene los ingredientes combinados en forma de polvo. Los ingredientes convencionales en formulaciones en polvo se usan para preparar y combinar formulaciones ilustrativas preferidas de la presente invención. Por ejemplo, puede utilizarse sílice de vehículo (por ejemplo, Spernat 50S® de Evonik Degusa Industries de Parsippany, Nueva Jersey, EE. UU.) para convertir líquidos en polvos fluidos y/o se puede utilizar para mejorar la fluidez y la semivida de productos en polvo (especialmente polvos propensos a apelmazarse). Puede utilizarse estearato de magnesio (ácido octadecanoico, sal de magnesio, por ejemplo, LIGAMe D de Peter Greven de Países Bajos) como un diluyente con propiedades lubricantes útiles para evitar que la composición y sus ingredientes se peguen al equipo de fabricación y también puede servir como agente aglutinante. Los ingredientes, en forma de polvo, se inspeccionan, se pesan, se licúan y se encapsulan en cápsulas de gelatina. El proceso de mezcla incluye un cribado convencional, una mezcla y detección de metales a temperaturas estándar y en un ambiente estéril al menos suficiente para complementos alimenticios.

Las fuentes de principios activos pueden incluir:

FUENTES ILUSTRATIVAS DE PRINCIPIOS ACTIVOSJENGIBREPROVEEDOR 1. Extracto de raíz de JENGIBRE de SOLARAY

Raíz de jengibre - 250 mg (gingeroles al 5 %)

Gingeroles -12,5 mg/5 %

Otros ingredientes: Estearato de magnesio, Croscamelosa de sodio

Park City, Utah

w w w.Solaray.com

PROVEEDOR 2. NATURE'S ANSWER, INC. Extracto de rizoma de jengibre

Extracto de rizoma de jengibre -125 mg estandarizado para gingeroles shogaoles al 5 %)

Otros ingredientes: Celulosa vegetal, harina fina de arroz, fosfato de dicalcio, silicato de calcio Hauppauge, Nueva York 11788-3943

http: //www.naturesanswer.com/

PROVEEDOR 3. Extracto de raíz de JENGIBRE de SOLGAR

Extracto de raíz de jengibre - 300 mg (fenoles de jengibre al 5 %)

Jengibre Crudo en Polvo -150 mg

C-ácido ascórbico, beta-caroteno, estearato de magnesio, celulosa monocristalina

Veronica, Nueva Jersey

JENGIBRE en polvo de SOLGAR

Jengibre en polvo - 500 mg

Extracto de raíz de jengibre 4:1 - 5 mg

L-CITRULINA

Suplemento de aminoácidos de forma libre de L-citrulina de SOURCE NATURALS: L-Citrulina 2 g

Otros ingredientes: gelatina (cápsula), celulosa microcristalina, dióxido de silicio coloidal y estearato de magnesio. Source Naturals, Inc.

P.O. Box 2118

Santa Cruz, California 95062

http://www.sourcenaturals.com/

L-ARGININA

L-ARGININA de THE VITAMIN SHOPPE

L-Arginina - 500 mg

Vitamina B610 mg

Otros ingredientes: gelatina, harina fina de arroz, estearato de magnesio

MUIRA PUAMA

PROVEEDOR 1. Muira puamaPtychopetalum olacoidesde SOLARAY Suplemento Dietético:

Muira puamaPtychopetalum olacoides(raíz) - 600 mg

Otros ingredientes: Cápsula de gelatina y celulosa.

Fabricado por Nutraceutical Corp.

Park City, Utah 84060

http://www.solaray.com

PROVEEDOR 2. Extracto de alcohol orgánico de muira puama de NATURE'S ANSWER:

Extracto de raíz de muira puama (1:1) - 2000 mg

Otros ingredientes: Agua purificada, glicerina vegetal, alcohol orgánico certificado al 12-15 %

PAULLINIA CUPANA (GUARANA)

Suplemento dietético energizante de guaraná de SOURCE NATURALS:

Extracto de semilla de guaraná (cafeína al 22 %) - 900 mg

Otros ingredientes: Celulosa microcristalina, fosfato cálcico dibásico, ácido esteárico, goma de celulosa modificada y dióxido de silicio coloidal.

Source Naturals, Inc.

P.O. Box 2118

Santa Cruz, California 95062

http://www.sourcenaturals.com/

Dado que ciertas formulaciones preferidas de la presente composición nutracéutica comprenden compuestos que se encuentran en los alimentos o se extraen de alimentos, se les puede denominar "nutracéuticos". Si bien las composiciones nutracéuticas se han encontrado tradicionalmente en un formato medicinal, tal como cápsulas o comprimidos, se han enriquecido un número cada vez mayor de alimentos con nutracéuticos. Los análogos y/u homólogos de los componentes del jengibre junto con muira puama,Paullinia cupana(guaraná) y L-arginina y/o L-citrulina se usan de acuerdo con la presente invención para promover la iNOS suficiente para mejorar, detener o revertir eventos fibróticos asociados con la osteoporosis o mejorar la curación ósea asociada con fracturas. Por tanto, la presente composición nutracéutica se puede administrar en una amplia variedad de modos y formas que se ajusten al estilo de vida y a las preferencias dietéticas de los usuarios, como suplementos dietéticos una o dos veces al día, mezclados con alimentos o "batidos", etc.

Se han logrado importantes avances médicos gracias al uso de productos naturales, en su forma nativa, como extractos o concentrados. Por ejemplo, el ácido acetilsalicílico (o aspirina) se deriva de los sauces. Asimismo, el fármaco anticancerígeno Taxol se aisló del tejo occidental. Como resultado, desde hace muchos años se utilizan productos naturales para el tratamiento de diversas enfermedades. Se ha supuesto que muchos productos naturales aumentan la potencia sexual, tratan problemas sexuales o actúan como afrodisíacos.

Sin embargo, existe mucha imprevisibilidad debido a la complejidad de los sistemas biológicos, variaciones en las plantas y sus derivados en función del suelo y el clima, así como interacciones con otros compuestos, etc. Los presentes solicitantes han descubierto que mediante el uso de la presente composición nutracéutica los síntomas de la osteoporosis parecen reducirse más allá de la biodisponibilidad prevista de la composición nutracéutica de las presentes divulgaciones.

De forma similar, los presentes solicitantes han descubierto que la composición nutracéutica de la presente divulgación mejora la curación de fracturas óseas.

"Cantidad eficaz", como se utiliza en la presente divulgación, pretende significar que una forma farmacéutica de la composición nutracéutica contiene una cantidad de cada ingrediente suficiente cuando se administra a un paciente humano durante un período de tiempo suficiente para producir un efecto ortopédico beneficioso, por ejemplo, en el tratamiento de fracturas óseas y/o aumentando la tasa de curación del mismo o en el tratamiento, en la inhibición de la aparición y/o en la ralentización de la tasa de desarrollo de la osteoporosis. El efecto beneficioso incluye, en el contexto del tratamiento de un hueso fracturado, al menos uno de aumento en la densidad mineral ósea (DMO), aceleración de la curación de fracturas, curación de la consolidación defectuosa o de la pseudoartrosis (primaria o conjuntamente) y un crecimiento óseo más rápido hacia el interior o sobre implantes que requieren crecimiento óseo para una función óptima. El efecto beneficioso incluye, en el contexto de la osteoporosis, al menos uno de aumento en la densidad mineral ósea (DMO), aceleración de la curación de fracturas, curación de la consolidación defectuosa o de la pseudoartrosis (primaria o conjuntamente) y un crecimiento óseo más rápido hacia el interior o sobre implantes que requieren crecimiento óseo para una función óptima.

"Dosificación individual", como se usa en el presente documento, significa la cantidad de la composición nutracéutica en una dosis única de la composición nutracéutica administrada a un paciente humano como parte de un régimen de dosificación.

"Dosis diaria total", como se utiliza en el presente documento, significa la cantidad acumulada de la composición nutracéutica administrada a un paciente humano en el transcurso de un día, tanto si se administra la composición nutracéutica una vez al día o bien múltiples veces al día como parte de un régimen de dosificación.

"Aproximadamente", como se utiliza en el presente documento, significa que se refiere a un intervalo de valores ± 10 % de un valor especificado.

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA FACILITAR LA CURACIÓN DE UNA FRACTURA ÓSEA

Se ha demostrado que la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) desempeña un papel importante en el proceso de curación de fracturas. La presente invención considera los efectos de los reguladores positivos de iNOS en la curación de fracturas. En particular, se consideran los efectos del tadalafilo (un inhibidor de la fosfodiesterasa (PDE)) y de la composición nutracéutica COMB-4 de la presente invención (que consiste en L-citrulina,Paullinia cupana,jengibre y muira puama), administrados solos o en combinación, sobre la curación de fracturas óseas. Los experimentos en un modelo de rata, que se consideran una base excelente para la aplicabilidad en seres humanos, confirman los beneficios de la administración de la composición nutracéutica de la presente divulgación sobre la curación de fracturas óseas. Por ejemplo, las formulaciones de la composición nutracéutica de la presente divulgación se administraron diariamente a ratas que tenían fracturas abiertas unilaterales y después del sacrificio temprano (Día 14) y tardío (Día 42), se analizó la curación de las fracturas. Se descubrió sorprendentemente que la composición nutracéutica de la presente divulgación provocaba una mejora significativa en la curación de fracturas óseas. En cambio, el tadalafilo, a pesar de su conocida actividad de iNOS, no demostró una mejora significativa en la curación de las fracturas. Si bien se podría utilizar una dosis más alta de tadalafilo, se desafiarían los límites prácticos de la tolerabilidad de la dosis. En vista de los conocidos efectos secundarios del tadalafilo (y de otros inhibidores de la PDE), la composición nutracéutica de la presente invención tiene beneficios sorprendentes, incluyendo que se tolera bien en dosis incluso más altas que las utilizadas en el estudio y que está formada por ingredientes que se han utilizado ampliamente sin efectos adversos para la salud. Los siguientes detalles experimentales demuestran un ejemplo no limitativo de uso de la composición nutracéutica de la presente divulgación, sola o junto con un inhibidor de PDE, para mejorar la curación de fracturas óseas.

De acuerdo con una realización preferida, la dosis diaria total de la composición nutracéutica es

• hasta aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 2 g) de jengibre o de derivado del jengibre,

• de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2 g (preferentemente de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 2 g) de una L-citrulina, L-arginina o una combinación de L-arginina y L-citrulina,

• de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 1,5 g) de muira puama y

• al menos aproximadamente 125 mg (preferentemente aproximadamente 500 mg) dePaullinia cupana(guaraná).

Una dosis individual específica que forma la base de los resultados de las pruebas presentadas en el presente documento, donde la composición nutracéutica se toma solo una vez al día, incluye

• aproximadamente 500 mg de jengibre o de derivado del jengibre,

• aproximadamente 1.600 mg de L-citrulina,

• aproximadamente 500 mg de muira puama y

• aproximadamente 500 mg dePaullinia cupana.

Si bien durante las pruebas se utilizó una administración diaria de la composición nutracéutica de la presente invención, se aprecia que la composición nutracéutica se puede administrar múltiples veces al día y por tanto, las dosis individuales se ajustarían para no exceder la dosis diaria total preferente como se ha esbozado anteriormente. Tanto si la composición nutracéutica se administra una vez al día o bien múltiples veces a lo largo del día, la composición nutracéutica se administra durante un período de tiempo suficiente para tratar un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo. Además, las formulaciones dePaullinia cupanautilizadas en la elaboración de composiciones de la presente invención pueden incluir opcionalmente cafeína.

La composición nutracéutica puede incluir excipientes, rellenos, aglutinantes y colorantes farmacéuticamente aceptables opcionales y pueden envasarse en cápsulas de gelatina convencionales o formarse en comprimidos sólidos, tomarse en forma de partículas o mezclarse y/o suspenderse en solución.

La composición nutracéutica actual refleja la capacidad de una combinación de jengibre, muira puama,Paullinia cupana(guaraná) y L-citrulina y/o L-arginina, para tratar un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo. La composición nutracéutica se puede tomar durante un período indefinido para mantener los efectos beneficiosos.

Considerando ahora los mecanismos por los cuales funciona la presente composición, se sabe que el óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en muchos sistemas fisiológicos. El óxido nítrico también se conoce como una potente molécula antioxidante y antiapoptótica (lo que significa que combate la muerte celular). Aún más, se sabe que el óxido nítrico media los efectos favorables a la supervivencia del 17 beta estradiol en los osteoblastos a través de la activación de la sGC (guanilil ciclasa soluble). Maratheet al.Pro-Survival effects of 17 beta-estradiol on osteocytes are mediated by nitric oxide/cGMP via differential actions of cGMP-dependent protein kinases 1 and 11. J Biol Chem 2012; 287(2):978-88) Treatment with a combination of ginger, L-citrulline, Muira puama and Paullinia cupana can reverse the progression of corporal smooth muscle loss, fibrosis and veno-occlusive dysfunction in the aging rat. Andrology (Los Angel). Junio de 2015;4(1). pii: 132. Publicación electrónica 25 de mayo de 2015. Se reconoce además que la estimulación mecánica induce la proliferación de osteoblastos a través de la ruta del óxido nítrico, del cGMP (monofosfato de guanosina cíclico) y de la PKG (proteína quinasa G), como se analiza a continuación con mayor detalle. Rajfer Ret al.Enhancement of fracture healing in the rat, modulated by compounds that stimulate inducible nitric oxide synthase: Acceleration of fracture healing via inducible nitric oxide synthase. BJR Febrero de 2017;6(2):90-97. El óxido nítrico en sí puede trabajar directamente dentro de las mitocondrias para apagar o detener el estrés oxidativo o el óxido nítrico puede convertir una molécula llamada GTP (trifosfato de guanosina) en cGMP. La presente composición nutracéutica regula positivamente la ruta del óxido nítrico - cGMP para mejorar la función/proliferación osteoblástica con el fin de tratar un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo.

La neovascularidad y el reclutamiento osteoblástico son efectos conocidos del óxido nítrico, que parece estar implicado en el proceso de curación de las fracturas. Hikiji H, Shin WS, Oida S,et al.Direct action of nitric oxide on osteoblastic differentiation. FEBS Lett 1997; 410:238-242. Baldik Y, Talu U, Altinel L,et al.Bone healing regulated by nitric oxide: an experimental study in rats. Clin Orthop Relat Res 2002:343-352.

El óxido nítrico se produce por una de las tres isoformas de la óxido nítrico sintasa (NOS), dependiendo de la localización del tejido y de la función fisiológica. Bredt DS. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and pathophysiology. Free Radic Res 1999;31:577-596. Forstermann U, Gath I, Schwarz P,et al.Isoforms of nitric oxide synthase. Properties, cellular distribution and expressional control. Biochem Pharmacol 1995;50:1321-1332. Si bien estas tres isoformas de la NOS están implicadas en el proceso de curación de fracturas, la NOS inducible (iNOS) parece ser la principal isoforma implicada en la estimulación de los osteoblastos por el óxido nítrico. Corbett SA, Hukkanen M, Batten J,et al.Nitric oxide in fracture repair. Differential localisation, expression and activity of nitric oxide synthases. J Bone Joint Surg [Br] 1999;81-B:531-537. Diwan AD, Wang MX, Jang D,et al.Nitric oxide modulates fracture healing. J Bone Miner Res 2000;15:342-351. Zhu W, Murrell GA, Lin J,et al.Localization of nitric oxide synthases during fracture healing. J Bone Miner Res 2002;17:1470-1477. Hukkanen M, Hughes FJ, Buttery LD,et al.Cytokine-stimulated expression of inducible nitric oxide synthase by mouse, rat, and human osteoblast-like cells and its functional role in osteoblast metabolic activity. Endocrinology 1995;136:5445-5453. Wimalawansa SJ. Nitric oxide and bone. Ann N Y Acad Sci 2010;1192:391-403. Además, cuando se elimina selectivamente el gen de la iNOS, la curación de fracturas se ve afectada. Esto se puede revertir mediante el tratamiento con el gen de la iNOS. Baldik Y, Diwan AD, Appleyard RC,et al.Deletion of iNOS gene impairs mouse fracture healing. Bone 2005;37:32-36.

Los efectos del óxido nítrico normalmente están mediados a través de su segundo mensajero, cGMP, que está regulado por la fosfodiesterasa (PDE) intracelular. Katsuki S, Arnold W, Mittal C, Murad F. Stimulation of guanylate cyclase by sodium nitroprusside, nitroglycerin and nitric oxide in various tissue preparations and comparison to the effects of sodium azide and hydroxylamine. J Cyclic Nucleotide Res 1977;3:23-35. Arnold WP, Mittal C<k>, Katsuki S, Murad F. Nitric oxide activates guanylate cyclase and increases guanosine 3':5'-cyclic monophosphate levels in various tissue preparations. Proc Natl Acad Sci u Sa 1977;74:3203-3207. Weiss B. Differential activation and inhibition of the multiple forms of cyclic nucleotide phosphodiesterase. Adv Cyclic Nucleotide Res 1975;5:195-211. Los inhibidores de la PDE, tal como tadalafilo, se sabe que aumentan el cGMP intracelular y se ha demostrado que aceleran la curación temprana de fracturas en ratones. Recientemente, Ferriniet al.notificaron que una combinación de los cuatro compuestos de plantas, L-citrulina, jengibre,Paullinia cupanay muira puama (COMB-4), concebidas originalmente como un compuesto antifibrótico, pareció producir en un estudioin vivouna marcada estimulación de la enzima iNOS en ratas. Histing T, Marciniak K, ScheuerC,et al.Sildenafil accelerates fracture healing in mice. J Orthop Res 2011;29:867-873. Togral G, Arikan M, Korkusuz P,et al.Positive effect of tadalafil, a phosphodiesterase-5 inhibitor, on fracture healing in rat femur.Eklem Hastalik Cerrahisi2015;26:137-144. Ferrini MG, Hlaing SM, Chan A, Artaza JN. Treatment with a combination of ginger, L-citrulline, Muira puama and Paullinia cupana can reverse the progression of corporal smooth muscle loss, fibrosis and veno-occlusive dysfunction in the aging rat. Andrology (Los Angeles) 2015;4:132.

Teniendo en cuenta lo anterior, la presente composición nutracéutica, compuesta por (1) jengibre o derivado de jengibre, (2) L-citrulina, L-arginina o mezcla de L-arginina y L-citrulina, (3) muira puama y (4)Paullinia cupana,es útil en el tratamiento de un hueso fracturado y/o en el aumento de la tasa de curación del mismo. Esta composición nutracéutica da como resultado una regulación positiva de la ruta del óxido nítrico - cGMP, que da como resultado el tratamiento del hueso fracturado y/o el aumento de la tasa de curación del mismo.

Como se muestra en la Figura 1, existen tres mecanismos para la regulación positiva de la ruta del óxido nítrico -cGMP. De acuerdo con el primer mecanismo, el óxido nítrico se produce a partir de L-arginina a través de la acción de una enzima denominada óxido nítrico sintasa (NOS). NOS es una enzima que convierte la L-arginina en óxido nítrico. Cuando se usa L-arginina para producir óxido nítrico como se ha mostrado anteriormente, la L-arginina se convierte en L-citrulina. El cuerpo es muy inteligente y las células tomarán L-citrulina y la reconvertirán nuevamente en L-arginina a través de otra ruta enzimática.

De acuerdo con un segundo mecanismo, se aprecia que una vez se forma óxido nítrico, existe como un gas que solo dura unos segundos, si es el caso. Pero es tan potente, que estimulará otra enzima llamada guanilil ciclasa soluble (sGC). La sGC es la enzima que convierte el GTP en el segundo mensajero en la ruta del óxido nítrico - cGMP, el GMP cíclico. Así que de nuevo, teóricamente, si se regula positivamente la sGC, se logra una producción más eficiente del cGMP.

Finalmente y de acuerdo con el tercer mecanismo, los inhibidores de la PDE se utilizan para impedir la descomposición del cGMP en 5'GMP. Cuando se produce el cGMP o cualquiera de los nucleótidos cíclicos como el AMP cíclico (monofosfato de adenosina), el cuerpo dispone de enzimas (es decir, PDE5) para descomponerlos con el fin de moderar o de regular el proceso fisiológico. El cGMP se descompone dentro de la célula para producir 5'GMP, que es un compuesto inactivo. Si se bloquea la enzima PDE5, los niveles de cGMP se elevan, porque el cGMP no se degrada en su manera normal.

Como se ha explicado anteriormente, el óxido nítrico se produce en el cuerpo a través de tres mecanismos diferentes. El mecanismo contemplado de acuerdo con la presente invención implica la utilización de la enzima iNOS, que se produce dentro de las células. iNOS es una enzima que normalmente solo se encuentra en las células que combaten una infección. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que una vez que las personas empiezan a envejecer, la iNOS comienza a producirse dentro de las células.

Con referencia a la Figura 2, la presente invención se centra en osteoblastos, que son células íntimamente implicadas en el metabolismo óseo. Los osteoblastos, entre otros papeles que no se comprenden completamente, secretan la matriz para la formación de hueso. La composición nutracéutica de la presente divulgación aumenta la ruta del óxido nítrico - cGMP mediante el aumento de la producción de óxido nítrico y la disminución de la conversión de cGMP en 5'GMP. Esto da como resultado un aumento en la proliferación, diferenciación y supervivencia de los osteoblastos, aumentando la pERK (quinasa regulada por señales extracelulares fosforilada), pAKT (AKT (proteína quinasa B) fosforilada y genes OB (genes de obesidad).

Como se ha mencionado de forma breve anteriormente, se probó la eficacia de la presente composición nutracéutica. Cincuenta y ocho ratas Sprague-Dawley macho (10 semanas de edad, peso corporal (PC): 344 ± 11 g) se utilizaron para este estudio, el cual estuvo aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Charles R. Drew University of Medicine and Science. Las ratas se alojaron durante una semana antes de los procedimientos experimentales para permitir la aclimatación y a continuación, se asignaron aleatoriamente a tres grupos. El grupo de control (n = 19 ratas) recibió 0,2 ml de vehículo compuesto por dimetilsulfóxido (DMSO) al 10%, mantequilla de cacahuete y agua, por administración retrolingual. El grupo de tadalafilo (n = 20 ratas) recibió una dosis oral diaria de 2,0 mg/kg de peso corporal (PC) del inhibidor de la PDE5, tadalafilo (Eli Lilly, Indianápolis, Indiana), mezclado con vehículo. Se ha demostrado que esta dosis es equivalente a una dosis diaria de 20 mg/día en seres humanos.

El grupo de COMB-4 (Naturex, Hackensack, Nueva Jersey; n = 19 ratas), es decir, el grupo que recibe la composición nutracéutica de acuerdo con la presente invención, recibió una combinación de muira puama (45 mg/kg de peso corporal PC),Paullinia cupana(45 mg/kg PC), jengibre (45 mg/kg PC) y L-citrulina (133 mg/kg PC) disueltos en vehículo. La dosis adecuada para ratas de cada uno de los cuatro componentes de COMB-4 se calculó en función de la dosis diaria equivalente recomendada en seres humanos, como se ha notificado anteriormente. Véase la Publicación de patente internacional n.° WO 2012/067745 A1 para más detalles sobre los ingredientes de COMB-4, gamas de ingredientes y sus efectos beneficiosos en el tratamiento de la disfunción eréctil y de las enfermedades cardiovasculares.

Todos los animales recibieron el vehículo solo durante los tres días previos a la cirugía para adaptarlos al sabor y comenzaron a recibir su dosis diaria experimental o de control asignada respectivamente, de tadalafilo o de COMB-4, el mismo día inmediatamente después de la fractura (Día 0).

Todas las cirugías se realizaron por un cirujano ortopédico que desconocía la asignación experimental de las ratas. La anestesia se indujo con isoflurano al 3 % y se mantuvo con isoflurano al 2,5 % durante toda la cirugía. Todas las ratas recibieron inyecciones subcutáneas de buprenorfina 0,05 mg/kg de peso corporal para el control del dolor pre y postoperatorio.

A continuación, cada rata se sometió a una fractura unilateral de fémur con fijación interna. En síntesis, después de afeitar la piel, la rata se colocó en posición supina y se realizó una incisión longitudinal de 1,5 cm de largo centrada sobre la rótula superior justo medial a la línea media. Se realizó una incisión en la fascia subyacente en el borde medial del tendón rotuliano y se dislocó la rótula lateralmente. Se abrió la tróclea con una broca de 1,0 mm y se fresaron el canal intramedular y el trocánter mayor con una aguja hipodérmica de calibre 21-3. El canal intramedular se fresó secuencialmente con una aguja de calibre 18 y el epicóndilo se abrió aún más con una aguja de calibre 16. Se accedió a la diáfisis femoral barriendo lateralmente el vasto medial. Se utilizaron unas tijeras de garras de gato (Petco, San Diego, California), situadas en la unión del tercio medio y distal de la diáfisis femoral, para realizar una fractura transversal. Se utilizó una tabla de aleatorización para determinar la lateralidad de la osteotomía. Al tiempo que se mantenía el control de ambos fragmentos de fractura, se aplicó un tornillo intramedular de compresión de titanio (RISystem, Davos, Suiza) de forma retrógrada, al tiempo que se visualizaba directamente la reducción de la fractura. Se observó una pequeña cantidad de compresión en el sitio de la fractura, que indica que el tornillo intramedular obtuvo la fijación proximal en el trocánter mayor y el sitio se probó manualmente para detectar cualquier movimiento.

La fascia y la piel se cerraron en dos capas utilizando pegamento para la piel Vicryl 4-0 (Ethicon Inc., Somerville, Nueva Jersey) y VetBond (3M, St. Paul, Minnesota). Se aplicó sobre la piel una pequeña cantidad de ungüento antibiótico triple (Actavis, Parsippany, Nueva Jersey). Se realizó un rango de movimiento en la cadera y de la rodilla para garantizar que no hubiera penetración del tornillo en dirección proximal y que la rótula se desplazara adecuadamente. Se permitió soportar peso sin protección inmediatamente después de la operación y el Día 14, se sacrificaron 5 ratas de cada grupo utilizando CO2 inhalado y se recogieron los fémures la evaluación de qCT (tomografía computarizada cuantitativa) e histológica. El Día 42, se sacrificaron quince (15) ratas de cada grupo para la evaluación de qCT e histológica. Se sacrificó a las ratas restantes para las pruebas biomecánicas.

Análisis del desarrollo de callos a través de qCT

Contenido mineral y volumen de callo. Se obtuvo una determinación cuantitativa del desarrollo de callos los Días 14 y 42 a través de tomografía computarizada cuantitativa (qCT: XCT 3000, Stratec, Pforzheim, Alemania). Se seleccionó la qCT porque permite imágenes tridimensionales, la evaluación cuantitativa de la curación de fracturas, incluyendo el desarrollo de callos en el sitio de la fractura. Se cuantificaron tres parámetros: área transversal de la sección transversal, contenido mineral óseo y densidad ósea.

Después de retirar el tornillo intramedular, se analizó una sección ósea de 3 mm de longitud, que incluía la fractura en el medio, mediante tres exploraciones de qCT transversales consecutivas de 1,1 mm de espesor y 0,1 x 0,1 mm de tamaño de píxel. Se obtuvieron tres imágenes: una imagen para el fragmento óseo proximal a la fractura, una imagen para el sitio de la fractura en sí y una imagen para el fragmento de hueso distal. Se utilizó el paquete de software de la serie XCT (versión 5.21, Stratec, Pforzheim, Alemania) para calcular el contenido mineral, el área del callo mineralizado y la densidad mineral ósea de cada imagen.

El contenido mineral total y el volumen de callo del segmento de 3 mm se calcularon combinando los valores de las tres secciones. Para evaluar la progresión de la remodelación, se midió el callo de mayor densidad (> 500 mg/cm3) y se separó del callo total (> 299 mg/cm3). La densidad mineral superior a 850 mg/cm3 se consideró densidad ósea cortical y se eliminó de los cálculos de callos recién formados.

Expresión inmunohistoquímica de iNOS. Después de las mediciones de qCT, las muestras se fijaron en p-formaldehído al 4 % y se descalcificaron en ácido fórmico al 10 % durante cinco días. Cada fémur se lavó con solución salina tamponada con fosfato, se retiraron ambas epífisis y se cortó el eje longitudinalmente en dos mitades. Se procesaron ambas mitades para secciones de inclusión en parafina. Se emplearon secciones embebidas en parafina de cinco micrómetros para la inmunotinción con anticuerpo policlonal contra iNOS. En síntesis, las secciones se desparafinaron mediante una serie de baños de xileno y se rehidrataron mediante alcoholes graduados.

La actividad de la peroxidasa endógena se interrumpió con peróxido de hidrógeno al 0,3 % durante 20 minutos y la unión no específica se bloqueó con suero de cabra normal al 10 % durante 40 minutos. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 grados Celsius (C) con anticuerpo policlonal primario contra iNOS (BO Pharmagen, dilución 1:250). A continuación, las secciones se incubaron con anti-IgG de conejo biotinilada, respectivamente, seguido del complejo ABC (Vector labs, Temecula, California) y los portaobjetos de 3,3'diaminobencidina (Sigma) se contratiñeron con una solución de hematoxilina. Las secciones teñidas se deshidrataron y a continuación, se montaron con Permount. Se tomaron al menos seis fotografías por sección con un microscopio Leica con un aumento de 20x. La densidad óptica integrada (100) por célula se determinó utilizando el software Image Pro 7.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, EE. UU.). Después que se calibraran las imágenes para la iluminación de fondo, 100 resultados son proporcionales a la densidad óptica promedio no ponderada que se utiliza para determinar la concentración de antígeno inmunorreactivo.

Cada portaobjetos ensayado tuvo su correspondiente control negativo. En todos los casos, se examinaron seis campos no superpuestos por secciones de tejido y se analizaron al menos tres secciones por animal.

Evaluación Biomecánica. Después de la eutanasia el Día 42, se recogió cada fémur y ambos extremos del fémur se incrustaron en bloques de polimetacrilato de metilo (PMMA) después de retirar el tornillo intramedular. Solo quedó expuesto un segmento de hueso de 12 mm de largo, que incluía la fractura en el centro. A continuación, la muestra se aseguró en un aparato de prueba de torsión montado en un marco de carga biaxial MTS (MTS mini-bionix 858, Mineápolis, Minnesota). La torsión hasta la rotura se aplicó a una tasa de 12 grados/min.

Se derivaron dos parámetros de la curva del par de torsión-desplazamiento para la carga de cada espécimen respecto a la prueba de fallos: rigidez torsional y par de torsión máximo. Adicionalmente, usando el patrón de fallos, cada espécimen se clasificó en una de las cuatro etapas biomecánicas de reparación de fracturas descritas por Whiteet al.,(The four biomechanical stages of fracture repair, J Bone Joint Surg Am. 1977 Mar;59(2):188-92.) Las fracturas de la etapa I eran gomosas, indicando solo la formación de callos blandos. Las etapas II a IV presentaron mayor rigidez, indicando fallo del hueso con tejido mineralizado progresivamente superior. Las fracturas de las etapas I y II fallaron a través de la línea de fractura original. El fallo de la etapa III se produjo parcialmente a través de la línea de fractura original y parcialmente a través del hueso intacto, si bien el fallo de la etapa IV se produjo completamente a través del hueso intacto.

Análisis estadístico. Se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) para comparar las variables de los resultados, incluyendo el volumen de callo, contenido mineral óseo, densidad ósea, rigidez torsional y par de torsión máximo en el fallo. Las variables independientes fueron el Día 14 y el Día 42 y el tipo de tratamiento (cuatro categorías incluyendo el control). Al ANOVA le siguieron las pruebas post-hoc de diferencia mínima significativa (LSD, por sus siglas en inglés) para comparar pares individuales de grupos.

Se utilizaron pruebas no paramétricas para comparar las etapas de reparación de fracturas entre los cuatro grupos. Para el análisis de imágenes cuantitativo de las observaciones histológicas, los valores se expresaron como la media ± ETM. La distribución de normalidad de los datos se estableció mediante la prueba de Wilk-Shapiro. Se analizaron comparaciones múltiples mediante un análisis de la varianza de factor único seguido de comparaciones post hoc con la prueba de Tukey, de acuerdo con Prism (versión 5.1) de GraphPad para Windows (GraphPad Software, San Diego, California). Las diferencias se consideraron significativas para un valorp< 0,05.

Resultados. Se excluyeron cinco ratas (2 de 14 días y 3 de 42 días) del estudio debido a una infección descubierta en el sitio de la fractura (n = 4) o una fractura conminuta posoperatoria (n = 1).

Análisis del desarrollo de callos

Contenido mineral y volumen de callo. Los tres grupos demostraron un aumento de aproximadamente un 50 % tanto en el contenido mineral como en el volumen del callo mineralizado en el sitio de la osteotomía el Día 42 en comparación con el Día 14 (véase la Tabla 1). Sin embargo, en ambos puntos temporales ni el grupo de tadalafilo ni el de COMB-4 demostraron diferencias estadísticas en comparación con el grupo de control. Si bien el callo es relevante para el proceso de curación, el hecho de que no se observara ninguna diferencia estadística se consideró que no influía en la eficacia de COMB-4 en el tratamiento de las fracturas óseas.

Tabla 1. Callo recién formado, callo total y duro y callo duro recién formado en el sitio de la osteotomía en los Días 14 42 media ± D.T.

La Figura 3 muestra imágenes de TC representativas de los tres grupos en los dos puntos temporales diferentes.

Propiedades biomecánicas. El Día 42, los valores medios para los tres parámetros biomecánicos (etapa de reparación de la fractura, par de torsión máximo y rigidez torsional) fueron más altos en el grupo de COMB-4 (véanse la Tabla 2 y la Figura 2).

T l 2.Pr i i m ni l fr r r l Dí 42 l r r i n m i ± D.T.

Este grupo de COMB-4 sorprendentemente presentó una resistencia máxima un 46 % mayor(p= 0,093) y una rigidez un 92 % mayor (p = 0,016) que los del grupo de control. El grupo de tadalafilo presentó una resistencia máxima un 15 % mayor y una rigidez un 28 % mayor con respecto al grupo de control, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa.

Todas las fracturas sanaron el Día 42 y fueron mayores que la Etapa II de la clasificación biomecánica de la reparación de fracturas. No se observaron reparaciones de fracturas en la Etapa IV con tadalafilo, ni en los grupos de control, pero se observaron en un 22 % del grupo de tratamiento de COMB-4.

Las fracturas restantes en los tres grupos fueron en la Etapa II o en la Etapa III (véase la Tabla 2).

Expresión de iNOS en la curación de fracturas. A los 14 días de la fractura, la expresión de iNOS medida a nivel del callo aumentó significativamente en los grupos de tadalafilo y de COMB-4 en comparación con el grupo de control, si bien el Día 42, la expresión de iNOS en los tres grupos, como se esperaba, había regresado a los valores basales (véase la Figura 5).

Los experimentos anteriores se diseñaron para determinar si la regulación positiva prolongada de la ruta del NO-cGMP a través de iNOS iniciada inmediatamente después de una fractura mejoraría el proceso de curación de la fractura. Esta hipótesis se basó en la observación de que a) el NO está implicado en la curación de las fracturas, como lo demuestra la inducción de las tres isoformas de la NOS de una manera secuencial específica durante el proceso de curación de las fracturas) se sabe que la iNOS se expresa en diferentes tejidos en respuesta a una lesión y su inducción en tales tejidos lesionados se considera un mecanismo protector contra la cicatrización anormal). iNOS es la primera isoterma de NOS inducida inmediata y rápidamente después de una fractura, pero a continuación, disminuye gradualmente después de alcanzar su punto máximo alrededor de una o dos semanas. iNOS está más íntimamente implicada en la función de los osteoblastos y en la formación de hueso.

Además, aunque la inhibición de las tres enzimas NOS dará como resultado un retraso tanto de la formación ósea como de la curación normal de las fracturas, se ha demostrado que la inhibición o eliminación específica de la enzima iNOS afectará negativamente al proceso de curación de las fracturas, al tiempo que la sustitución del gen de iNOS deficiente en animales con deficiencia de iNOS dará como resultado una curación normal de las fracturas.

Como se ha analizado anteriormente, los inhibidores de la fosfodiesterasa (PDE) son compuestos que pueden regular positivamente la iNOS a través de la ruta del NO-cGMP y se ha notificado que mejoran la curación de fracturas y promueven la diferenciación de células precursoras osteogénicas en osteoblastos. Sin embargo, después de 42 días de tadalafilo diario, la curación de fracturas, medida por la etapa de reparación biomecánica de la fractura, el par de torsión máximo o la rigidez torsional, no mejoró significativamente en comparación con los controles.

En cambio, el COMB-4 tuvo beneficios sorprendentes para la curación de fracturas óseas. COMB-4 comprende una mezcla de L-citrulina, jengibre, muira puama yPaullinia cupanay mejora significativamente la curación de las fracturas, medida tanto por la etapa de reparación de la fractura como por la rigidez torsional. En cuanto al par de torsión máximo, COMB-4 mostró un valor un 46 % mayor que el control y un 29 % mayor que el grupo de tadalafilo. Esto sugiere que hay una tendencia hacia mejoras en la resistencia máxima del par de fuerzas en el tiempo. El menor volumen de callo mineralizado y el callo recién mineralizado observado en estos animales de COMB-4 pueden ser indicativos de una remodelación más rápida del callo puente que contribuye a las propiedades biomecánicas superiores del grupo de COMB-4 en comparación con los grupos de tadalafilo y de control.

Los beneficios de la presente invención en el tratamiento de fracturas óseas se han demostrado mediante los experimentos anteriores, que es el primer estudio aleatorizado de control con enmascaramiento que demuestra en mamíferos la eficacia de un producto natural para mejorar la resistencia funcional del hueso después de una fractura. COMB-4 por sí solo dio como resultado excelentes propiedades biomecánicas asociadas con la curación de fracturas en comparación con las observadas con el grupo de control o de tadalafilo. Se sabe que L-citrulina, muira puama,Paullinia cupanay jengibre, los constituyentes de COMB-4, tienen un perfil de efectos secundarios inocuos en seres humanos. La L-arginina se puede utilizar para sustituir parcial o totalmente la L-citrulina, aunque se prefiere la L-citrulina debido a su biodisponibilidad, entre otras cosas.

En una realización, un inhibidor de PDE, tal como, aunque no de forma limitativa, tadalafilo, se combina con una composición que comprende COMB-4 y se administra a un ser humano u otro mamífero en una cantidad farmacéuticamente eficaz durante un período de tiempo suficiente después de la fractura ósea para mejorar la curación de la fractura ósea. En otra realización, COMB-4 se usa solo; esto es especialmente beneficioso para los pacientes que no toleran los inhibidores de la PDE.

El tratamiento de la fractura ósea, de acuerdo con la presente invención, incluye la administración repetida de las composiciones nutracéuticas de la presente invención a un paciente durante un/a período de tiempo suficiente para obtener el resultado deseado. Una persona experta en la técnica reconocerá que las dosis administradas en el modelo de rata se ajustan al tamaño del mamífero (por ejemplo, ser humano) que recibe la dosis. Si bien la composición nutracéutica de COMB-4 se puede administrar como una composición única, sus ingredientes individuales se pueden administrar por separado durante cada administración periódica durante un período de tiempo suficiente para obtener el beneficio deseado para la curación de fracturas óseas.

MÉTODO Y COMPOSICIÓN PARA EL TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN DE LA OSTEOPOROSIS

Además del uso de la composición nutracéutica de la presente divulgación en el tratamiento de fracturas, la presente invención proporciona una composición nutracéutica para el tratamiento y/o prevención de la osteoporosis.

La composición nutracéutica actual refleja la capacidad de una combinación de jengibre, muira puama,Paullinia cupana(guaraná) y L-citrulina y/o L-arginina para tratar y/o prevenir la osteoporosis e incluso revertir procesos fisiológicos que causan la osteoporosis, de modo que los resultados beneficiosos puedan continuar durante un período de tiempo después de la administración. La composición nutracéutica se puede tomar durante un período indefinido para mantener los efectos beneficiosos y/o posponer o reducir la progresión de la osteoporosis.

Como se ha mencionado anteriormente y de acuerdo con una realización preferida, la dosis diaria total de la composición nutracéutica es •

• hasta aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 2 g) de jengibre o de derivado del jengibre,

• de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2 g (preferentemente de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 2 g) de una L-citrulina, L-arginina o una combinación de L-arginina y L-citrulina,

• de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 1,5 g) de muira puama y

• al menos aproximadamente 125 mg (preferentemente aproximadamente 500 mg) dePaullinia cupana(guaraná).

Una dosis individual específica que forma la base de los resultados de las pruebas presentadas en el presente documento, donde la composición nutracéutica se toma solo una vez al día, incluye

• aproximadamente 500 mg de jengibre o de derivado del jengibre,

• aproximadamente 1.600 mg de L-citrulina,

• aproximadamente 500 mg de muira puama y

• aproximadamente 500 mg dePaullinia cupana.

Si bien durante las pruebas se utilizó una simple administración diaria de la composición nutracéutica de la presente invención, se aprecia que la composición nutracéutica se puede administrar múltiples veces al día y por tanto, las dosis individuales se ajustarían para no exceder la dosis diaria total preferente como se ha esbozado anteriormente. Tanto si la composición nutracéutica se administra una vez al día o bien múltiples veces a lo largo del día, la composición nutracéutica se administra durante un período de tiempo suficiente para tratar y/o prevenir la osteoporosis. Además, las formulaciones dePaullinia cupanautilizadas en la elaboración de composiciones de la presente invención pueden incluir opcionalmente cafeína.

La composición nutracéutica puede incluir excipientes, rellenos, aglutinantes y colorantes farmacéuticamente aceptables opcionales y pueden envasarse en cápsulas de gelatina convencionales o formarse en comprimidos sólidos, tomarse en forma de partículas o mezclarse y/o suspenderse en solución.

La composición nutracéutica actual refleja la capacidad de una combinación de jengibre, muira puama,Paullinia cupana(guaraná) y L-citrulina y/o L-arginina para tratar y/o prevenir la osteoporosis. La composición nutracéutica se puede tomar durante un período indefinido para mantener los efectos beneficiosos.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, una forma farmacéutica oral comprende una composición nutracéutica de acuerdo con la presente invención, en donde la forma farmacéutica se selecciona del grupo que consiste en un comprimido, cápsula, pastilla para chupar, polvo o suspensión, que comprende los ingredientes anteriores. Las suspensiones preferidas son acuosas y/o de base alcohólica (etanol).

Considerando ahora los mecanismos por los cuales funciona la presente composición nutracéutica, se ha descrito anteriormente que se sabe que el óxido nítrico (NO) es una molécula de señalización importante en muchos sistemas fisiológicos.

Teniendo en cuenta lo anterior, la presente composición nutracéutica, compuesta por (1) jengibre o derivado de jengibre, (2) L-citrulina, L-arginina o mezcla de L-arginina y L-citrulina, (3) muira puama y (4)Paullinia cupanason útiles en el tratamiento y/o prevención de la osteoporosis. Esta composición nutracéutica da como resultado una regulación positiva de la ruta del óxido nítrico - cGMP que da como resultado el tratamiento y/o prevención de la osteoporosis.

Como se muestra en la Figura 1 y como se ha analizado anteriormente, existen tres mecanismos para la regulación positiva de la ruta del óxido nítrico - cGMP.

Con referencia a la Figura 6, la presente invención se centra en osteoblastos, que son células íntimamente implicadas en el metabolismo óseo. Los osteoblastos, entre otros papeles que no se comprenden completamente, secretan la matriz para la formación de hueso. La composición nutracéutica de la presente invención aumenta la ruta del óxido nítrico - cGMP mediante el aumento de la producción de óxido nítrico y la disminución de la conversión de cGMP en 5'GMP. Esto da como resultado un aumento en la proliferación, diferenciación y supervivencia de los osteoblastos, aumentando la pERK (quinasa regulada por señales extracelulares fosforilada), pAKT (AKT (proteína quinasa B) fosforilada y genes OB (genes de obesidad).

Como se muestra en la Figura 7, el diseño experimental utilizado para establecer la eficacia de la presente composición nutracéutica en el tratamiento de la osteoporosis incluyó el tratamiento de ratas reproductoras retiradas Sprague Dawley de 6 meses de edad con un tratamiento preventivo con la aplicación de la composición nutracéutica comenzando el primer día del experimento o con un tratamiento curativo con la aplicación de la composición nutracéutica comenzando 90 días después del inicio del experimento.

De acuerdo con el tratamiento preventivo con la aplicación de la composición nutracéutica comenzando el primer día del experimento, también se realizó una operación simulada (en inglés, SHAM) o una ovariectomía (OVX) el primer día del experimento. Se realizó una 1a exploración de DEXA (absorciometría de rayos X de energía dual) después de 60 días de tratamiento y a continuación, de nuevo después de 100 días de tratamiento. De acuerdo con el tratamiento curativo, se realizó una operación simulada o una ovariectomía (OVX) el primer día del experimento y la aplicación de la composición nutracéutica no comenzó hasta 90 días después del inicio del experimento. Con fines comparativos, las ratas se trataron de manera similar con estradiol (E2), una composición conocida por su uso en el tratamiento de la osteoporosis. Después de esto, se realizó una 1a exploración de DEXA 190 días después del inicio del experimento (o 100 días después del inicio del tratamiento con la composición nutracéutica).

Las ratas se estudiaron a través de exploración de DEXA para determinar la DMO, LEAN (tejido magro excluyendo la grasa, por sus siglas en inglés) CMO (contenido mineral óseo), Grasa y % Grasa. Además, se estudiaron y cuantificaron marcadores óseos en suero (en particular, osteocalcina y TRAP5c).

Los gráficos mostrados en las Figuras 8 a 27 resumen los datos, que establecen la eficacia de la composición nutracéutica en el tratamiento y prevención de la osteoporosis.

Pruebas adicionales, como se resume a través de los gráficos mostrados en las Figuras 28 a 32 respaldan la conclusión de que la composición nutracéutica de la presente invención no es tóxica para la proliferación de osteoblastos, si bien el jengibre (véase la Figura 29) y muira puama (véase la Figura 30), dos de los cuatro componentes que se encuentran en COMB-4, de hecho, son tóxicos para la proliferación de los osteoblastos cuando los osteoblastos se exponen individualmente a estos dos componentes en las dosis contenidas en COMB-4. La prueba se realizó estudiando la densidad óptica (DO) de un cultivo celular de osteoblastos durante un período de tiempo después de la administración de tres de las cuatro composiciones en diversas dosis. Por ejemplo, el jengibre, la muira puama, laPaullinia cupana(guaraná) y la composición nutracéutica (COMB-4) se probaron en diversas concentraciones. En particular, se probaron las siguientes concentraciones para determinar su efecto sobre la proliferación celular: jengibre en concentraciones de 0,02 mg/ml y 0,325 mg/ml (jengibre 0,02 y jengibre 0,325, como se designa respectivamente en las Figuras 28 y 29); muira puama (MP) en concentraciones de 0,90 mg/ml y 14,4 mg/ml (MP 0,90 y MP 14,4, como se designa respectivamente en las Figuras 28 y 30); Paullinia cupana (PC) en concentraciones de 0,90 mg/ml y 0,045 mg/ml (PC 0,90 y PC 0,045, como se designa respectivamente en las Figuras 28 y 31); y la composición nutracéutica (compuesta por 500 mg de jengibre o derivado del jengibre, aproximadamente 1.600 mg de L-citrulina, aproximadamente 500 mg de muira puama y aproximadamente 500 mg dePaullinia cupana)en concentraciones de 0,67 mg/ml y 1,70 mg/ml (COMB-40,67 y COMB-4 1,70, como se designa respectivamente en las Figuras 28 y 32).

La composición nutracéutica de la presente invención evitó una disminución en la DMO en tándem con un aumento de la osteocalcina sérica y una disminución en TRAP-5 (fosfatasa ácida resistente a tartrato). Como resultado, la composición nutracéutica de la presente invención se puede usar para tratar y/o prevenir la osteoporosis. Los tratamientos pueden consistir en dosis orales autoadministradas a corto plazo tomadas periódicamente (por ejemplo, al menos una vez al día u otro período de tiempo entre dosis hasta alcanzar el efecto deseado o como parte de un tratamiento individual a largo plazo, incluso toda la vida como nutrición diaria).

Se aprecia que la composición nutracéutica de la presente invención para el tratamiento de la osteoporosis puede incluir además otros compuestos, pero el jengibre, la muira puama, laPaullinia cupanay la L-arginina o L-citrulina son fundamentales en su composición y su capacidad para tratar la osteoporosis.

Como se ha analizado anteriormente, la dosis diaria total preferida de jengibre en la composición nutracéutica de la presente invención comprende entre aproximadamente 250 mg y aproximadamente 2 g. La dosis diaria total de la composición nutracéutica de la presente invención comprende además de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2 g de L-citrulina. Se pueden usar de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2 gramos de L-arginina en sustitución y/o además de L-citrulina. Sin embargo, dado que se ha descubierto que una mayor cantidad de L-argininain vivopara usar en la producción endógena de óxido nítrico puede inducirse mediante una dosis menor de L-citrulina que de L-arginina oral, las composiciones preferidas de la presente invención incluyen L-citrulina en sustitución y/o además de L-arginina (véase Schwedhelmet al.,British Journal of Clinical Pharmacology, 65: págs.

51-59, (2007)). Aún más, la dosis diaria total de muira puama en la composición nutracéutica de la presente invención es de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 500 mg a aproximadamente 1,5 g) y la dosis diaria total dePaullinia cupana(guaraná) en la composición nutracéutica de la presente invención es al menos aproximadamente 125 mg (preferentemente aproximadamente 500 mg). Teniendo esto en cuenta y como se ha analizado anteriormente, una dosis individual, donde la composición nutracéutica se toma solo una vez al día, incluye aproximadamente 500 mg de jengibre o de derivado del jengibre, aproximadamente 1.600 mg de L-citrulina, aproximadamente 500 mg de muira puama y aproximadamente 500 mg dePaullinia cupana.Como se ha explicado anteriormente, se aprecia que la composición nutracéutica se puede administrar varias veces al día y por tanto, la dosis individual se ajustaría para no exceder la dosis diaria total preferente como se ha esbozado anteriormente. Tanto si se toma una dosis única cada día o bien múltiples dosis a lo largo del día, se proporcionan dosis repetidas de las composiciones de la presente invención durante periodos de tiempo prolongados hasta que se obtenga el efecto deseado. La administración repetida de las composiciones de la presente invención a pacientes que demuestran síntomas de osteoporosis se realiza hasta que se obtienen los resultados deseados del tratamiento de la osteoporosis y puede continuarse posteriormente como un profiláctico.

En una realización y como se ha analizado anteriormente, una dosis individual, donde la composición nutracéutica se toma solo una vez al día, utilizada de acuerdo con la presente invención incluye aproximadamente 500 mg de jengibre o de derivado del jengibre, aproximadamente 1.600 mg de L-citrulina, aproximadamente 500 mg de muira puama y aproximadamente 500 mg dePaullinia cupana.Tanto si la composición nutracéutica se administra una vez al día como se ha divulgado anteriormente o bien la composición nutracéutica se administra múltiples veces durante el transcurso del día, la composición nutracéutica se administra durante un período de tiempo suficiente para tratar la osteoporosis y lograr los resultados deseados. Sin embargo, las pruebas han demostrado que las cantidades de los diversos elementos pueden variarse y la dosis diaria total de la composición nutracéutica puede contener hasta aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 250 mg a aproximadamente 2 g) de jengibre o de derivado del jengibre, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2 g (preferentemente de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 3 g) de una L-citrulina, L-arginina o una combinación de L-arginina y L-citrulina, de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 3 g (preferentemente de aproximadamente 500 mg a 1,5 g) de muira puama y al menos aproximadamente 125 mg (preferentemente aproximadamente 500 mg) dePaullinia cupana(guaraná). La dosis anterior puede contener adicionalmente o en lugar de jengibre entre aproximadamente 20 mg y aproximadamente 1000 mg de 6-gingerol, preferentemente aproximadamente 220 mg de 6-gingerol, aunque los presentes inventores han encontrado preferible utilizar jengibre.

Si bien se describen detalles de ciertas realizaciones de la presente invención, se proporcionan como ejemplos ilustrativos para permitir a las personas normalmente versadas en la materia poner en práctica las invenciones. Los detalles proporcionados no pretenden limitar el alcance de las presentes invenciones, sino ser ilustrativos. Cuando ciertos elementos de las presentes invenciones puedan implementarse parcial o totalmente utilizando componentes conocidos, se describen solo las porciones de tales componentes conocidos que son necesarias para comprender y realizar la presente invención y se omiten descripciones detalladas de otros componentes o procesos de formulación para simplificar la explicación de la invención. Además, la presente invención abarca equivalentes conocidos presentes y futuros de las composiciones y métodos a los que se hace referencia en el presente documento. Las invenciones tienen capacidad para otras realizaciones y se pueden poner en práctica o llevarse a cabo de diversas maneras y como tales, las personas expertas en la materia apreciarán que la concepción en la que se basa la presente divulgación puede utilizarse fácilmente como base para el diseño de otros métodos y composiciones para llevar a cabo los diversos fines de la presente invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para usar en un método para tratar, inhibir el inicio y/o ralentizar la tasa de desarrollo de la osteoporosis y un método para tratar un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo, en donde la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición durante un período de tiempo suficiente estimula la iNOS y mejora el tratamiento de enfermedades ortopédicas; en donde la composición comprende: jengibre o un derivado del jengibre seleccionado de jengibre fresco, jengibre vegetal parcialmente seco, jengibre vegetal seco, 6-gingerol, extracto de rizoma de jengibre, extracto de la raíz de jengibre, jengibre en polvo y mezclas de los mismos; muira puama;Paullinia cupana;y al menos uno del grupo que consiste en L-arginina y L-citrulina.

2. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición comprende de 250 mg a 2 g de jengibre o de derivado del jengibre.

3. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye de 10 mg a 3 g de L-arginina, L-citrulina o una mezcla de L-arginina y L-citrulina.

4. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye de 10 mg a 2 g de L-arginina, L-citrulina o una mezcla de L-arginina y L-citrulina.

5. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que

incluye de 100 mg a 3 g de muira puama.

6. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que

incluye de 500 mg a 1,5 g de muira puama.

7. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye al menos 250 mg dePaullinia cupana.

8. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que

incluye 500 mg dePaullinia cupana.

9. La composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye de 250 mg a 2 g de jengibre o de derivado del jengibre, de 250 mg a 2 g de L-arginina, de L-citrulina o de una mezcla de L-arginina y L-citrulina, de 500 mg a 1,5 g de muira puama y 500 mg dePaullinia cupana.

10. La composición para usar de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la administración de la cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición durante un período de tiempo suficiente aumenta la tasa de curación de fracturas óseas.

11. La composición para usar de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde la administración de la cantidad farmacéuticamente eficaz de la composición durante un período de tiempo suficiente es eficaz en el tratamiento de la osteoporosis.

12. Composición para usar de acuerdo con cualquier reivindicación anterior para usar en la estimulación de iNOS y para tratar, inhibir el inicio y/o ralentizar la tasa de desarrollo de la osteoporosis y para tratar un hueso fracturado y/o aumentar la tasa de curación del mismo.