ES2971299T3 - GH5 y GH30 en la molienda húmeda - Google Patents

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Kenneth Jensen
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Abstract

La presente solicitud proporciona métodos para mejorar el rendimiento total de almidón y/o gluten de los granos de maíz en un proceso de molienda húmeda, comprendiendo el método mezclar granos de maíz o una fracción de los granos de maíz con una composición enzimática que comprende una cantidad eficaz de uno o más enzimas hidrolíticas, en donde al menos una de dichas enzimas hidrolíticas se selecciona del grupo que consiste en un polipéptido GH30, un polipéptido GH5 o una combinación de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
GH5 y GH30 en la molienda húmeda
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para mejorar el rendimiento de almidón y/o gluten a partir de granos de maíz en un proceso de molienda húmeda, mediante el contacto de dichos granos de maíz con una composición enzimática que comprende un polipéptido GH30, un polipéptido GH5 o una combinación de los mismos durante el lavado de la fibra.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La molienda húmeda convencional del maíz es un proceso diseñado para la recuperación y purificación del almidón y de varios coproductos, que incluyen el germen, el gluten (proteína) y la fibra. La fibra es el coproducto menos valioso, por lo que la industria se ha esforzado por aumentar el rendimiento de los productos más valiosos, tales como el almidón y el gluten, a la vez que se reduce la fracción de fibra. El almidón de alta calidad es valioso, ya que puede usarse para diversos fines comerciales tras su transformación posterior en productos tales como el almidón deshidratado, el almidón modificado, las dextrinas, los edulcorantes y el alcohol. El gluten suele usarse para pienso animal, como harina de gluten de maíz (aproximadamente el 60 % de proteínas) o pienso de gluten de maíz (aproximadamente el 20 % de proteínas).
El proceso de molienda húmeda puede variar significativamente dependiendo del equipo de molienda específico usado, pero normalmente el proceso incluye: limpieza del grano, remojo, molienda, separación del germen, una segunda molienda, separación de la fibra, separación del gluten y separación del almidón. Después de limpiar los granos de maíz, suelen ablandarse empapándolos en agua o en una solución diluida de SO2 en condiciones controladas de tiempo y temperatura. A continuación, los granos se muelen para romper el pericarpio y el germen se separa del resto del grano. La suspensión restante, que consiste principalmente en fibra, almidón y gluten, se muele finamente y se tamiza en un proceso de lavado de la fibra, para separar la fibra del almidón y el gluten, antes de separar el gluten y el almidón y poder purificar el almidón en un proceso de lavado/filtración.
Se ha sugerido el uso de enzimas en varias fases del proceso de molienda húmeda, tal como el uso de enzimas para la etapa de remojo de los procesos de molienda húmeda. El producto enzimático comercial Steepzyme® (disponible de Novozymes A/S) ha demostrado ser adecuado para la primera etapa en los procesos de molienda húmeda, es decir, la etapa de remojo donde los granos se empapan en agua.
Más recientemente, se ha desarrollado la "molienda enzimática", un proceso modificado de molienda húmeda que usa proteasas para reducir significativamente el tiempo total de procesamiento durante la molienda húmeda del maíz y elimina la necesidad de dióxido de azufre como agente de procesamiento. Johnston et al., Cereal Chem, 81, p. 626 632 (2004).
El documento de patente US 6.566.125 divulga un método para obtener almidón a partir de maíz que implica empapar granos de maíz en agua para producir granos de maíz empapados, moler los granos de maíz empapados para producir una suspensión de maíz molido, e incubar la papilla de maíz molido con enzima (por ejemplo, proteasa).
El documento de patente US 5.066.218 divulga un método de molienda de grano, especialmente maíz, que comprende limpiar el grano, poner en remojo el grano en agua para ablandarlo y, a continuación, moler el grano con una enzima celulasa.
El documento de patente WO 2002/000731 divulga un proceso de tratamiento de los granos de la cosecha, que comprende empapar los granos en agua durante 1-12 horas, moler en húmedo los granos empapados y tratar los granos con una o más enzimas, incluida una proteasa ácida.
El documento de patente WO 2002/000911 divulga un proceso de separación del gluten de almidón, que comprende someter el almidón molido a una proteasa ácida.
El documento de patente WO 2002/002644 divulga un proceso de lavado de una suspensión de almidón obtenida de la etapa de separación del gluten de almidón de un proceso de molienda, que comprende lavar la suspensión de almidón con una disolución acuosa que comprende una cantidad eficaz de proteasa ácida.
Los documentos de patente WO 2014/082566 y WO 2014/082564 divulgan composiciones celulolíticas para su uso en molienda húmeda.
Aunque se ha investigado en la técnica el efecto del uso de enzimas en la molienda húmeda del maíz, durante el remojo/empapado de los granos de maíz, durante la molienda de los granos de maíz y en la separación del gluten y del almidón, sigue existiendo la necesidad de mejorar la tecnología enzimática para reducir el gasto energético y los costes asociados a la molienda húmeda del maíz y aumentar el rendimiento del almidón y el gluten.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para mejorar el rendimiento del almidón y/o el rendimiento del gluten totales que puede obtenerse a partir de granos de maíz en un proceso de molienda húmeda, comprendiendo el método: a) empapar los granos de maíz en agua para producir granos remojados; b) moler los granos empapados para producir granos empapados y molidos; c) separar los gérmenes de los granos empapados y molidos para producir una masa de granos de maíz que comprende fibra, almidón y gluten; y d) someter la masa de granos de maíz resultante a un procedimiento de lavado de la fibra; en donde dicha masa de granos de maíz se mezcla con una o más enzimas hidrolíticas, seleccionadas del grupo que consiste en un polipéptido de xilanasa GH30, un polipéptido de xilanasa GH5, durante la etapa d).
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al uso de una composición enzimática que comprende un polipéptido GH30 aislado, un polipéptido GH5 aislado o ambos, para mejorar el rendimiento de almidón y/o el rendimiento de gluten totales que puede obtenerse a partir de granos de maíz en un proceso de molienda húmeda.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La presente invención y, en particular, las realizaciones preferidas según la invención se describirán con más detalle haciendo referencia a las figuras adjuntas. Las figuras muestran formas de implementación de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes de otras posibles realizaciones comprendidas dentro del alcance del juego de reivindicaciones adjunto.
LaFigura 1ilustra esquemáticamente una primera realización de un sistema de lavado de la fibra en contracorriente según la presente invención,
LaFigura 2ilustra esquemáticamente otra realización de un sistema según la presente invención.
LaFigura 3ilustra esquemáticamente una unidad de tamiz con una incubadora incorporada
LaFigura 4ilustra esquemáticamente una unidad de tamiz en forma de un hidrociclón
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para mejorar los rendimientos de almidón y/o gluten que pueden obtenerse de los granos de maíz en un proceso de molienda húmeda, tratando los granos de maíz con una composición enzimática hidrolítica durante el procedimiento de lavado de la fibra. Los inventores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que el tratamiento enzimático de los granos de maíz con un polipéptido GH5 o un polipéptido GH30, o una combinación de los mismos, mejora la liberación de almidón y gluten unidos de la fibra y, por lo tanto, mejora los rendimientos de almidón y/o gluten que se pueden obtener.
El proceso de molienda húmeda:
Los granos de maíz se muelen en húmedo para abrir los núcleos y separar los núcleos en sus cuatro constituyentes principales: almidón, germen, fibra y gluten.
El proceso de molienda por vía húmeda puede variar significativamente de un molino a otro, aunque la molienda húmeda convencional suele comprender las siguientes etapas:
1. Remojo y separación de germen,
2. Procedimiento de lavado de la fibra
3. Separación almidón/gluten, y
4. Lavado de almidón.
1. Remojo, trituración y separación de germen
Los granos de maíz se ablandan empapándolos en agua durante entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 48 horas, preferiblemente 30 minutos y 15 horas, tal como aproximadamente 1 hora a aproximadamente 6 horas a una temperatura de aproximadamente 50 °C, tal como entre aproximadamente 45 °C y 60 °C. Durante el empapado, los granos absorben agua, aumentando sus niveles de humedad del 15 por ciento al 45 por ciento y duplicando con creces su tamaño. La adición opcional de, por ejemplo, 0,1 por ciento de dióxido de azufre (SO2) y/o NaHSOs al agua evita el crecimiento excesivo de bacterias en el ambiente caliente. A medida que el maíz se hincha y se ablanda, la ligera acidez del agua de remojo empieza a aflojar los enlaces del gluten dentro del maíz y a liberar el almidón. Una vez remojados los granos de maíz, se abren para liberar el germen. El germen contiene aceite de maíz. El germen se separa de la mezcla de mayor densidad de almidón, gluten y fibra esencialmente "haciendo flotar" el segmento de germen libre de las demás sustancias en condiciones estrechamente controladas. Este método sirve para eliminar cualquier efecto adverso de trazas de aceite de maíz en las etapas posteriores del procesamiento.
2. Procedimiento de lavado de la fibra
Para obtener la máxima recuperación de almidón y gluten, manteniendo la fibra en el producto final a un mínimo absoluto, es necesario lavar el almidón y el gluten libres de la fibra durante el procesamiento. La fibra se recoge, se mezcla y se tamiza para recuperar cualquier resto de almidón o gluten.
3. Separación del gluten y el almidón
La suspensión de almidón-gluten de la etapa de lavado de la fibra, denominada almidón de molino, se separa en almidón y gluten. El gluten tiene una baja densidad en comparación con el almidón. Al pasar el almidón de molino por una centrifugadora, el gluten se separa fácilmente.
4. Lavado de almidón
La suspensión de almidón de la etapa de separación de almidón contiene algunas proteínas insolubles y muchos solubles. Hay que eliminarlos antes de poder fabricar un almidón de máxima calidad (almidón de alta pureza). El almidón, con sólo uno o dos por ciento de proteína restante, se diluye, se lava de 8 a 14 veces, se vuelve a diluir y se lava de nuevo en hidroclones para eliminar el último rastro de proteína y producir almidón de alta calidad, normalmente más del 99,5 % de pureza.
Productos de la molienda húmeda: La molienda húmeda puede usarse para producir, sin limitación, extracto soluble de maíz, piensos de gluten de maíz, germen, aceite de maíz, harina de gluten de maíz, almidón de maíz, almidón de maíz modificado, jarabes, tales como el jarabe de maíz y etanol de maíz.
Definición de enzimas:
Enzima celulolítica o celulasa/polipéptido con actividad de celulasa o actividad celulolítica:Los términos "enzima celulolítica", "celulasa" y polipéptido con actividad de celulasa o actividad celulolítica se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una o más (por ejemplo, varias) enzimas que hidrolizan un material celulósico, que comprende cualquier material que comprenda celulosa, tal como la fibra. Las enzimas celulolíticas incluyen endoglucanasa(s) (C.E. 3.2.1.4), celobiohidrolasa(s) (C.E. 3.2.1.91 y C.E. 3.2.1.150), betaglucosidasa(s) (C.E.
3.2.1.21), o combinaciones de las mismas. Los dos enfoques básicos para medir la actividad de la enzima celulolítica incluyen: (1) medir la actividad de la enzima celulolítica total, y (2) medir las actividades de las enzimas celulolíticas individuales (endoglucanasas, celobiohidrolasas, y beta-glucosidasas), como se revisa en Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. La actividad de la enzima celulolítica total se puede medir utilizando sustratos insolubles, incluyendo papel de filtro Whatman N°1, celulosa microcristalina, celulosa bacteriana, celulosa de algas, algodón, lignocelulosa pretratada, etc. El ensayo de actividad celulolítica total más común es el ensayo de papel de filtro con papel de filtro Whatman N°1 como sustrato. El ensayo fue establecido por la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).
La actividad de la enzima celulolítica también puede determinarse midiendo el aumento de la producción/liberación de azúcares durante la hidrólisis de un material celulósico por la(s) enzima(s) celulolítica(s) en las siguientes condiciones: 1-50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulosa en rastrojo de maíz pretratado (PCS) (u otro material celulósico pretratado) durante 3-7 días a una temperatura adecuada tal como 40 °C-80 °C, por ejemplo, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C u 80 °C, y un pH adecuado, tal como 4-9, por ejemplo, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 o 9,0, en comparación con una hidrólisis de control sin adición de proteína enzimática celulolítica. Las condiciones típicas son reacciones de 1 ml, PCS lavado o sin lavar, 5 % de sólidos insolubles (peso seco), acetato sódico 50 mM 5 pH 5, 1 mM de MnSO4, 50 °C, 55 °C o 60 °C, 72 horas, análisis de azúcar mediante cromatografía en columna AMlNEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.)
Enzimas hidrolíticas o hidrolasa/polipéptido con actividad hidrolasa:"Enzimas hidrolíticas" y polipéptido con actividad hidrolasa se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier proteína catalítica que utilice agua para descomponer sustratos. Las enzimas hidrolíticas incluyen celulasas (EC 3.2.1.4), xilanasas (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55 (alfa-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor), celobiohidrolasa I (E.C. 3.2.1.150), celobiohidrolasa II (E.C. 3.2.1.91),<celobiosidasa (E.C. 3.2.1.176), betaglucosidasa (E.C. 3.2.1.21), betaxilosidasas>(E<c 3.2.1.37).>
Xilanasas/polipéptido con actividad xilanasa:Los términos "xilanasa" y polipéptido con actividad xilanasa se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una 1,4-beta-D-xilano-xilohidrolasa (E.C. 3.2.1.8) que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos. La actividad xilanasa puede determinarse con 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como sustrato en 0,01 % de TRITON® X-100 y fosfato sódico 200 mM a pH 6 a 37 °C. Una unidad de actividad xilanasa se define como la cantidad de actividad xilanasa que produce 1,0 pmol de azurina por minuto a 37 °C, pH 6 a partir de 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como sustrato en fosfato sódico 200 mM a pH 6.
Otras definiciones:
En el presente contexto, los términos se usan de la forma habitual para un experto. Algunos de estos términos se explican a continuación:
Tiempo de contacto:para que una o más enzimas reaccionen con un sustrato, la una o más enzimas tienen que estar en contacto con el sustrato. Por "tiempo de contacto" se entiende el periodo de tiempo durante el cual una cantidad efectiva de una o más enzimas está en contacto con al menos una fracción de una masa de sustrato. Las enzimas pueden no estar en contacto con toda la masa de sustrato durante el tiempo de contacto, pero la mezcla de una o varias enzimas con una masa de sustrato permite la hidrólisis catalizada enzimáticamente de una fracción de la masa de sustrato durante el tiempo de contacto.
Granos de maíz:se conoce una variedad de granos de maíz, incluyendo, por ejemplo, maíz dentado, maíz flint, maíz de vaina, maíz rayado, maíz dulce, maíz ceroso y similares.
Algunos granos de maíz tienen una cubierta exterior denominada "pericarpio" que protege el germen en los granos. Resiste al agua y al vapor de agua y es indeseable para insectos y microorganismos. La única zona de los granos que no está cubierta por el "pericarpio" es la "punta del pericarpio", que es el punto de unión del grano a la mazorca.
Granos de maíz o una fracción de los granos de maíz:este término se usa para describir los granos de maíz a través del proceso de molienda húmeda. Cuando los granos de maíz se descomponen y procesan, todas las partes fraccionadas del grano de maíz se consideran incluidas cuando se usa este término. El término incluye, por ejemplo: granos empapados, granos triturados, masa de granos de maíz, una primera fracción, una segunda fracción, una o más fracciones de la masa de granos de maíz, etc.
Masa de granos de maíz:se usa preferentemente para referenciar una masa que comprende fibra, gluten y almidón, que se consigue preferentemente vaporizando y triturando los granos de cultivo y separando la masa que comprende fibra, gluten y almidón de los gérmenes. A medida que la masa de granos de maíz pasa por el lavado de la fibra, se separa en varias fracciones, incluyendo una primera fracción (s) y una segunda fracción (f). Por lo tanto, "fracciones de masa de granos de maíz" y "una o más fracciones de masa de granos de maíz" se refieren, entre otras cosas, a estas primera (s) y segunda fracciones (f).
ADNc:el término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura cortada y empalmada obtenida de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de las secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa por medio de una serie de etapas, que incluyen corte y empalme, antes de aparecer como ARNm maduro empalmado.
Secuencia codificante:La expresión “secuencia codificante” significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante generalmente se determinan mediante un marco de lectura abierto, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG o TTG, y termina con un codón de parada tal como TAA, TAG o TGA. La secuencia codificante puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una combinación de los mismos.
Secuencias de control:La expresión “secuencias de control” significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica el polipéptido, o nativa o extraña entre sí. Secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a una secuencia conductora, de poliadenilación, secuencia propeptídica, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de detención transcripcionales y traduccionales. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica un polipéptido.
Expresión:El término “expresión” incluye cualquier etapa implicada en la producción de un polipéptido, que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.
Vector de expresión:La expresión “vector de expresión” significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está operativamente unido a secuencias de control que proporcionan su expresión.
Fragmento:el término "fragmento" significa un polipéptido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo de un polipéptido maduro, en donde el fragmento tiene actividad de pectina liasa.
Germen:el "germen" es la única parte viva del grano de maíz. Contiene la información genética, las enzimas, las vitaminas y los minerales esenciales para que el grano se convierta en una planta de maíz. En el maíz amarillo, aproximadamente el 25 por ciento del germen es aceite de maíz. El endospermo cubierto o rodeado por el germen comprende aproximadamente el 82 por ciento del peso seco del grano y es la fuente de energía (almidón) y proteína de la semilla en germinación. Existen dos tipos de endospermo, blando y duro. En el endospermo duro, el almidón está fuertemente compactado. En el endospermo blando, el almidón está suelto.
Polipéptido GH5:se refiere a un polipéptido con actividad enzimática, clasificándose el polipéptido como miembro de la familia de las glucósido hidrolasas 5 en la base de datos Carbohydrate-Active enZYmes (CAZymes) (http://www.cazy.org/).
Polipéptido GH30:se refiere a un polipéptido con actividad enzimática, clasificándose el polipéptido como miembro de la familia de las glucósido hidrolasa 30 en la base de datos Carbohydrate-Active enZYmes (CAZymes) (http://www.cazy.org/).
Gluten:el gluten es una proteína formada por dos proteínas más pequeñas, la glutenina y la gliadina.
El término "gluten" se refiere en el presente documento a la mayoría de las proteínas que se encuentran en los granos de maíz. Los principales productos de gluten de la molienda húmeda del maíz son la harina de gluten de maíz (aproximadamente el 60 % de proteínas) y el pienso de gluten de maíz (aproximadamente el 20 % de proteínas).
Triturar o trituración:El término "triturar" se refiere a descomponer los granos de maíz en componentes más pequeños.
Célula hospedadora:La expresión "célula hospedadora" significa cualquier tipo de célula que sea susceptible de transformación, transfección, transducción o similar con una construcción de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.
Aislado:El término “aislado” significa una sustancia en una forma o entorno que no se encuentra en la naturaleza. Ejemplos no limitantes de sustancias aisladas se incluyen (1) cualquier sustancia que no se produzca de forma natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero no se limite a, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se haya separado al menos parcialmente de uno o más o de todos los componentes naturales con los que está asociada en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre en relación con la sustancia que se encuentra en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia en relación con otros componentes con los que está asociada de forma natural (por ejemplo, producción recombinante en una célula hospedadora; copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; y uso de un promotor más fuerte que el promotor asociado naturalmente al gen que codifica la sustancia).
Tiempo de incubación:tiempo en el que la una o más fracciones de la masa del grano de maíz están en contacto con la enzima hidrolítica durante el lavado de la fibra, sin ser tamizadas.
En muchas realizaciones preferidas, un método según la presente invención utiliza un sistema que comprende un espacio (V), o "incubadora", dentro del cual el material se "deja afectar" por las enzimas y, en tales situaciones, el tiempo de incubación puede determinarse por:
volumen de incubadora [m3] * densidad de flujo de entrada a la incubadora
flujo másico de entrada por unidad de tiempo a la incubadora
Alternativamente, si el flujo de entrada a la incubadora se expresa en términos de volumen por unidad de tiempo:
Polipéptido maduro:La expresión "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación pos-traduccional, tal como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro es los aminoácidos 21 a 678 de SEQ ID NO: 2 basándose en el programa informático SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que predice que los aminoácidos 1 a 20 de SEQ ID NO: 2 son un péptido señal. Se conoce en la técnica que una célula hospedadora puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C terminal y/o N terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido. También se sabe en la técnica que diferentes células hospedantes procesan polipéptidos de manera diferente, y de este modo, una célula hospedante que expresa un polinucleótido puede producir un polipéptido maduro diferente (por ejemplo, que tiene un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) en comparación con otra célula hospedante que expresa el mismo polinucleótido.
Secuencia codificante de polipéptido maduro:el término "secuencia codificante de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro.
Equipo de molino:"equipo de molino" se refiere a todo el equipo usado en un molino. El proceso de molienda húmeda variará dependiendo del equipo de molino disponible. Ejemplos de equipos de molino pueden ser tanques de empapado, evaporador, prensa de tornillo, secadora rotatoria, tamiz de deshidratación, centrífuga, hidrociclón, etc. El tamaño y el número de cada equipo de molienda/líneas de molienda pueden variar en molinos diferentes, lo que afectará al proceso de molienda. Por ejemplo, el número de unidades de tamices de lavado de la fibra puede variar, al igual que el tamaño de una centrífuga.
Construcción de ácido nucleico:el término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, de cadena simple o doble, que está aislada de un gen natural o está modificada para contener segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no existiría de otro modo en la naturaleza o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.
Unida de forma funcional:La expresión "unida de forma funcional" significa una configuración en la que una secuencia de control está colocada en una posición apropiada con respecto a la secuencia codificante de un polinucleótido de manera que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.
Tiempo de retención:el tiempo en el que se deja reaccionar a una o más enzimas hidrolíticas y granos de maíz o a una fracción de los granos de maíz durante el procedimiento de lavado de la fibra.
En algunas realizaciones, el tiempo de retención es el periodo de tiempo durante el cual la masa de granos de maíz, recibida en la primera unidad de tamiz (S1) y una o más fracciones de la misma, se ponen en contacto con una cantidad eficaz de una o más enzimas hidrolíticas antes de abandonar el sistema de lavado de la fibra. Durante el tiempo de retención, la una o más fracciones de masa de grano de maíz se incuban con una o más enzimas hidrolíticas en un espacio (V), antes de abandonar el sistema de lavado de la fibra, como parte de una primera fracción (s1) de la unidad de tamiz más aguas arriba (S1) o como parte de una segunda fracción (f4) de la unidad de tamiz más aguas abajo (S4).
El tiempo de retención puede estimarse preferentemente como la duración promedio del tiempo que la materia sólida pasa en un sistema de lavado de la fibra como se define en relación con la presente invención. Esto puede estimarse mediante la siguiente relación:
Alternativamente, si el flujo de entrada al sistema se expresa en términos de volumen por unidad de tiempo:
volumen del sistema [m3]
tit =
flujo volumétrico de entrada por unidad de tiempo al sistema [mVs]
El volumen del sistema es normalmente igual a la suma de los volúmenes de todos los huecos en el sistema; sin embargo, como los tubos del sistema se fabrican normalmente pequeños, puede ser preferible no tener en cuenta el volumen de los tubos.
Tamizado:el término "tamizado" o "tamizar" se refiere al proceso de separación de la masa de granos de maíz en una primera fracción s y una segunda fracción f y al movimiento de estas fracciones de una unidad de tamiz a otra. Un periodo de no tamizado es un periodo de no separación proporcionado para la incubación de la masa de granos de maíz o fracciones de la misma con enzimas.
Identidad de secuencia:La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o una posterior. Se usó la versión 6.1.0.
Los parámetros opcionales utilizados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle etiquetada como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera: (Residuos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación-Número total de huecos en la alineación).
Almidón:el término "almidón" significa cualquier material compuesto de polisacáridos complejos de plantas, compuesto de unidades de glucosa que se presenta ampliamente en los tejidos vegetales en forma de gránulos de almacenamiento, que consisten en amilosa y amilopectina, y representado como (C6H10O5)n, donde n es cualquier número.
Remojo o empapado:el término "remojo" significa empapar el grano de cultivo con agua y, opcionalmente, SO2
Descripción de la invención:Un aspecto de la presente invención es proporcionar un método para mejorar el rendimiento de almidón y/o rendimiento de gluten totales que pueden obtenerse a partir de granos de maíz en un proceso de molienda húmeda, comprendiendo el método: a) empapar los granos de maíz en agua para producir granos empapados; b) triturar los granos empapados para producir granos empapados y triturados; c) separar los gérmenes de los granos empapados y triturados para producir una masa de granos de maíz que comprende fibra, almidón y gluten; y d) someter la masa de granos de maíz resultante a un procedimiento de lavado de la fibra; en donde dicha masa de granos de maíz se mezcla con dicha una o más enzimas hidrolíticas, seleccionadas del grupo que consiste en un polipéptido de xilanasa GH30, un polipéptido de xilanasa GH5, durante la etapa d).
Algo del almidón y/o gluten en los granos o fracciones de granos de maíz pueden estar ligados a la fracción de fibra y no liberarse nunca durante el proceso de molienda húmeda. Sin embargo, la adición de enzimas hidrolíticas, que pueden incluir cualquier proteína catalítica que pueda usar el agua para descomponer los sustratos presentes en los granos de maíz, puede liberar parte del almidón y/o gluten ligados y mejorar así el rendimiento total de almidón y/o gluten en el proceso de molienda húmeda. Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que los polipéptidos GH5 y GH30 son particularmente eficaces para disminuir la cantidad de almidón y gluten ligados en la fracción de fibra.
En una realización, el método de la presente invención conduce a un aumento de la cantidad de almidón y/o gluten liberado de la fibra durante el proceso, tal como durante el procedimiento de lavado de la fibra.
El procedimiento específico y el equipo usado en el proceso de molienda húmeda pueden variar, pero los principios fundamentales del proceso siguen siendo los mismos (véase la descripción del proceso de molienda húmeda). En una realización, el método de la invención comprende las etapas de:
a) empapar los granos de maíz en agua para producir granos empapados;
b) triturar los granos empapados para producir granos empapados y triturados;
c) separar los gérmenes de los granos empapados y triturados para producir una masa de granos de maíz que comprenda fibra, almidón y gluten; y
d) someter la masa de granos de maíz resultante a un procedimiento de lavado de la fibra.
Para obtener la máxima recuperación de almidón y gluten, manteniendo la fibra en el producto final a un mínimo absoluto, es necesario lavar el almidón y el gluten libres de la fracción de fibra durante el procesado. La fibra se recoge, se suspende y se criba, normalmente después de remojar, triturar y separar los gérmenes de los granos de maíz (véase la descripción del proceso de molienda húmeda), para recuperar cualquier resto de almidón o gluten en la masa de granos de maíz. Este proceso se denomina en el presente documento procedimiento de lavado de la fibra.
Dichos granos de maíz o una fracción de dichos granos de maíz se mezclan con una o más enzimas hidrolíticas durante la etapa de someter la masa de granos de maíz a un procedimiento de lavado de la fibra.
En una realización, dichos granos de maíz o una fracción de dichos granos de maíz se dejan reaccionar con dicha una o más enzimas hidrolíticas durante al menos 15 minutos, tales como al menos 20 minutos, al menos 25 minutos, al menos 30 minutos, al menos 35 minutos, al menos 40 minutos, al menos 45 minutos, al menos 50 minutos, al menos 55 minutos, al menos 60 minutos, al menos 70 minutos, al menos 80 minutos, al menos 90 minutos, al menos 100 minutos, al menos 110 minutos o al menos 120 minutos.
El equipo específico usado en el procedimiento de lavado de la fibra puede variar, pero el principio fundamental del proceso sigue siendo el mismo.
En una realización, dicho procedimiento de lavado de la fibra comprende el uso de un sistema de lavado de la fibra optimizado para la introducción de una o más enzimas hidrolíticas, en donde el sistema de lavado de la fibra comprende un espacio (V) configurado para proporcionar un tiempo de reacción total en el sistema de lavado de la fibra (tiempo de retención) de al menos 35 minutos, tal como al menos 40 minutos, al menos 45 minutos, al menos 50 minutos, al menos 60 minutos, al menos 70 minutos, al menos 80 minutos, al menos 90 minutos, al menos 100 minutos, al menos 110 minutos o al menos 120 minutos y menos de 48 horas, tales como menos de 40 horas, menos de 36 horas, menos de 30 horas, menos de 24 horas, menos de 20 horas, menos de 12 horas, menos de 10 horas, menos de 8 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas. En una realización, el tiempo de retención total en el sistema de lavado de la fibra es entre 35 minutos y 48 horas, tal como por ejemplo entre 35 minutos y 24 horas, 35 minutos y 12 horas, 35 minutos y 6 horas, 35 minutos y 5 horas, 35 minutos y 4 horas, 35 minutos y 3 horas, 35 minutos y 2 horas, 45 minutos y 48 horas, 45 minutos y 24 horas, 45 minutos y horas, 45 minutos y 6 horas, 45 minutos y 5 horas, 45 minutos y 4 horas, 45 minutos y 3 horas, 45 minutos y 2 horas 1-48 horas, 1-24 horas, 1-12 horas, 1-6 horas, 1-5 horas, 1-4 horas, 1-3 horas, 1-2 horas.
En una realización, el sistema de lavado de la fibra comprende:
- una pluralidad de unidades de tamiz (S1... S4) conectadas fluidamente en una configuración de lavado en contracorriente; estando cada unidad de tamiz configurada para separar una corriente de masa de granos de maíz y líquido en dos fracciones: una primera fracción (s) y una segunda fracción (f), conteniendo dicha segunda fracción (f) una cantidad mayor medida en % en peso de fibra que la primera fracción (s);
- un espacio (V) dispuesto en el sistema y que está conectado fluidamente para recibir dicha primera fracción (s), dicha segunda fracción (f), o una mezcla de primera y segunda fracción (s,f), preferentemente solo una segunda fracción (f), y configurado para proporcionar un tiempo de incubación para una o ambas fracciones recibidas en el espacio; y la salida de una o ambas fracciones incubadas de este modo a una unidad de tamiz aguas abajo (S4),
en donde el sistema está configurado para
- la entrada de la masa de granos de maíz y del líquido en la unidad de tamiz situada más aguas arriba (S1)
- la salida de la primera fracción (s1) de la unidad de tamiz más aguas arriba (S1) como corriente de producto que contiene almidón,
- la entrada de agua de proceso, preferentemente dispuesta para la entrada de agua de proceso a una unidad de tamiz más aguas abajo (S4),
- la salida de la segunda fracción (f4) de la unidad de tamiz más aguas abajo (S4) como masa de granos de maíz lavados que contiene una menor cantidad de almidón y gluten a la masa de granos de maíz original.
- introducir enzimas hidrolíticas en el sistema.
La Figura 1 ilustra esquemáticamente una realización de un sistema de lavado de la fibra como el descrito anteriormente. Como se ilustra en la Figura 1, el sistema de lavado de la fibra comprende una pluralidad de unidades de tamiz S1, S2, S3, S4 conectadas fluidamente en una configuración de lavado en contracorriente. "Conectadas fluidamente" significa normalmente que las unidades de tamiz están conectadas mediante el uso de líneas de flujo, tales como tuberías para el transporte de materia entre las unidades de tamiz. Cada una de las unidades de tamiz S1-S4 está configurada para separar una corriente de masa de granos de maíz y líquido en dos fracciones: una primera fracción s (s1, s2, s3, s4) y una segunda fracción f (f1, f2, f3, f4). Como comprenderá el experto, el número de primeras fracciones producidas en el sistema de lavado de la fibra depende del número de unidades de tamiz incluidas en el sistema. Preferentemente, el número de unidades de tamiz del sistema está comprendido entre 2 y 8, y en tales realizaciones el número de primeras y segundas fracciones estará también comprendido entre 2 y 8. Las unidades de tamiz están normalmente configuradas de modo que la materia sólida se separa en una corriente separada, de modo que la segunda fracción f contiene una cantidad mayor, medida en peso de fibra, que la primera fracción s. En la figura, la notación "s" se refiere preferentemente a una corriente sin fibra (que contiene almidón) y la notación "f" se refiere preferentemente a una corriente que contiene fibra. El índice en f y s se refiere al origen del flujo. Cabe señalar que, aunque se prefiere que la primera fracción s no contenga ninguna fibra, esto puede ser difícil de conseguir en la práctica.
El flujo en el sistema tiene una dirección aguas abajo y una dirección aguas arriba: cada unidad de tamiz, por ejemplo<la unidad de tamiz S3, recibe un flujo, por ejemplo f2, de una unidad de tamiz aguas arriba, por ejemplo s>2,<y entrega>un flujo, por ejemplo s3, a la unidad de tamiz aguas arriba, por ejemplo S2. Similarmente, la unidad de tamiz S3 recibe una corriente s4 de una unidad de tamiz aguas abajo S4 y entrega una corriente f3 a la unidad de tamiz aguas abajo
S4.
Como se ilustra en la Figura 1, el agua de proceso, que es normalmente agua que se usa como agua de lavado en el sistema, se proporciona a la unidad de tamiz más aguas abajo S4, y el agua de proceso es normalmente agua que no contiene fibra. La masa de granos de maíz es normalmente una suspensión líquida (normalmente una suspensión en agua), proporcionada a la unidad de tamiz más aguas arriba S1. En la fig. 1, esto se indica con la flecha "De la molienda". De este modo, y mediante la conexión de líquidos entre las unidades de tamiz, la masa de granos de maíz y las fracciones f de la misma fluyen aguas abajo en el sistema y el agua de proceso se mueve aguas arriba en el sistema. Así, la configuración de líquidos en el sistema puede verse a medida que la masa de granos de maíz es lavada en la unidad de tamiz más aguas arriba S1 por un líquido que contiene alta cantidad de almidón y en la unidad de tamiz más aguas abajo S4 lavada por un líquido que contiene baja cantidad de almidón. Además, la masa de granos de maíz en la unidad de tamiz aguas arriba S1 contiene una mayor cantidad de almidón que la fracción f de la masa de granos de maíz en la unidad de tamiz aguas abajo S4.
Un objetivo de uso del sistema de lavado de la fibra descrito anteriormente es proporcionar un tiempo de contacto de al menos 35 minutos, por ejemplo, al menos 40 minutos, al menos 45 minutos, al menos 50 minutos, al menos 60 minutos, al menos 70 minutos, al menos 80 minutos, al menos 90 minutos, al menos 100 minutos, al menos 110 minutos o al menos 120 minutos, entre la masa de granos de maíz o fracciones de la misma y las enzimas del sistema, a fin de aumentar la eficacia de la eliminación del almidón de la fibra. El tiempo de contacto/reacción entre las enzimas y la masa de granos de maíz o sus fracciones en el sistema de lavado de la fibra se denomina también tiempo de retención. El tiempo de contacto/reacción entre las enzimas y la masa de granos de maíz o sus fracciones en el espacio
(V) se denomina tiempo de incubación.
En una realización, el tiempo de incubación en dicho espacio (V) configurado en el sistema de lavado de la fibra es de al menos 5 minutos, tal como al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 40 minutos, al menos 45 minutos, al menos 50 minutos, al menos 60 minutos, al menos 70 minutos, al menos
80 minutos, al menos 90 minutos, al menos 100 minutos, al menos 110 minutos o al menos 120 minutos y menos de
48 horas, tal como menos de 40 horas, menos de 36 horas, menos de 30 horas, menos de 24 horas, menos de 20 horas, menos de 12 horas, menos de 10 horas, menos de 8 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas.
En una realización, el tiempo de incubación en dicho espacio (V) es entre 35 minutos y 48 horas, tal como entre 35 minutos y 24 horas, 35 minutos y horas, 35 minutos y 6 horas, 35 minutos y 5 horas, 35 minutos y 4 horas, 35 minutos y 3 horas, 35 minutos y 2 horas, 45 minutos y 48 horas, 45 minutos y 24 horas, 45 minutos y 12 horas, 45 minutos y 6 horas, 45 minutos y 5 horas, 45 minutos y 4 horas, 45 minutos y 3 horas, 45 minutos y 2 horas 1-48 horas, 1-24 horas,
1-12 horas, 1-6 horas, 1-5 horas, 1-4 horas, 1-3 horas, 1-2 horas.
En una realización, la temperatura de incubación en dicho espacio (V) es entre 25 y 95 °C, tal como entre 25 y 90 °C,
, 25 y , 30 y , 35 y , 39 y
Se ha descubierto que es ventajoso añadir enzimas en la posición aguas abajo de una unidad de tamiz más aguas arriba S1 y aguas arriba de una unidad de tamiz más aguas abajo S4; en la realización de la fig. 1, la adición de enzimas se ilustra en la posición de líquido de la unidad de tamiz S3 (ilustrada por la flecha en la fig. 1 etiquetada "Enzimas").
Añadiendo las enzimas en un punto óptimo del sistema de lavado de la fibra, puede prolongarse el tiempo de retención, que puede aumentar la eficiencia de la eliminación o separación del almidón de la fibra. Con el fin de proporcionar un tiempo de retención más largo que el proporcionado por un molino típico, puede disponerse en el sistema un espacio
V (no mostrado en la fig. 1) y que esté conectado de forma fluida para recibir una de dichas primeras fracciones s, una de dichas segundas fracciones f, o una mezcla de primera y segunda fracciones s, f, preferiblemente solo una segunda fracción f, y configurado para proporcionar un tiempo de incubación para una o ambas fracciones recibidas en el espacio; y la salida de la fracción o fracciones así incubadas a una unidad de tamiz aguas abajo S4. Se observa que, aunque puede preferirse tener una unidad de incubadora separada en el sistema, las líneas de flujo que conectan las unidades de tamiz también pueden usarse para proporcionar el espacio.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 2 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación entre la primera y la segunda unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 2.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 3 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación en la segunda unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 3, más preferentemente en la unidad de tamiz 2, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 2 y 3.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 4 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación en la segunda o tercera unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 4, más preferentemente en la unidad de tamiz 2, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 2 y 3.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 5 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación en la segunda, tercera o cuarta unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 5, más preferentemente en la unidad de tamiz 3, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 3 y 4.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 6 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación en la segunda, tercera, cuarta o quinta unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 6, más preferentemente en la unidad de tamiz 4, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 4 y 5.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 7 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación en la segunda, tercera, cuarta, quinta o sexta unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 7, más preferentemente en la unidad de tamiz 4 o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 4 y 5.
Según las realizaciones en donde el sistema de lavado de la fibra comprende 8 unidades de tamiz, se prefiere la dosificación en la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y séptima unidad de tamiz, o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 1 y la unidad de tamiz 8, más preferentemente en la unidad de tamiz 5 o en un espacio configurado entre la unidad de tamiz 5 y 6.
Así, un sistema según realizaciones preferidas de la invención está configurado para
- la entrada de masa de granos de maíz y líquido a la unidad de tamiz más aguas arriba S1, preferentemente mediante un sistema de entrada de materia a la unidad de tamiz más aguas arriba S1;
- la salida de la primera fracción s1 de la unidad de tamiz más aguas arriba S1 como una corriente de producto que contiene almidón, preferentemente mediante una salida de la unidad de tamiz más aguas arriba que alimenta una corriente sin fibras fuera del sistema;
- la entrada de agua de proceso, preferiblemente dispuesta para la entrada de agua de proceso a una unidad de tamiz S4 más aguas abajo; la entrada de agua de proceso es preferiblemente una entrada a la unidad de tamiz S4 más aguas abajo;
- la salida de la segunda fracción f4 de la unidad de tamiz más aguas abajo S4 como una masa de granos de maíz lavados que contiene una cantidad de almidón y gluten inferior a la masa de granos de maíz original; preferentemente, comprendiendo una salida de la unidad de tamiz más aguas abajo.
El sistema también está configurado para introducir enzimas hidrolíticas en el sistema, que puede ser una entrada dispuesta en una posición preferida para permitir el contacto entre la masa de granos de maíz o fracciones de la misma y la una o más enzimas hidrolíticas.
Se hace referencia a la fig. 2 que ilustra esquemáticamente otra realización de un sistema según la presente invención. En la fig. 2 se usa la misma notación que en la fig. 1. Como se presenta en la fig. 2, todas las unidades de tamiz S1 a S4 comprenden un elemento de tamizado (tamiz) indicado por una línea de puntos inclinada dentro de las unidades de tamiz. Esta línea de puntos inclinada ilustra un dispositivo configurado para separar una fracción f que contiene fibra y una fracción que preferiblemente no contiene ninguna fibra; esto podría, por ejemplo, ser proporcionado por un filtro de banda o un filtro en general dispuesto dentro de las partes de pared que definen un vacío interior de una unidad de tamiz.
En la realización mostrada en la fig. 2, las distintas fracciones a mezclar se ilustran como mezcladas fuera de las unidades de tamiz S1-S4. Sin embargo, pueden ser mezclados dentro de las unidades de tamiz.
Como también se ilustra en la fig. 2, el espacio V es un recipiente separado que está conectado fluidamente a la unidad de tamiz S3, de modo que la unidad de tamiz S3 recibe el líquido con fibras y enzimas después de que el líquido con fibras y enzimas haya tenido un tiempo de incubación en el espacio V. Como se ilustra esquemáticamente en la fig. 2, el espacio V puede tener placas deflectoras para asegurar que el líquido no fluya en línea recta desde la entrada hasta la salida del recipiente, lo que de otro modo podría acortar el flujo para proporcionar un tiempo de incubación.
La fig. 2 también ilustra que las enzimas se aplican a los flujos f2 y s4 que van al espacio V. En la realización mostrada, las enzimas se dosifican mediante una bomba dosificadora 10 ilustrada esquemáticamente como una bomba de pistón accionada por un cigüeñal donde la cantidad de enzimas dosificadas se controla mediante la rotación del cigüeñal (en el cilindro o la culata hay válvulas unidireccionales de entrada y salida, pero no se ilustran).
Por lo tanto, un sistema según la presente invención está configurado preferentemente para introducir enzimas hidrolíticas en dicha primera fracción (s), y/o en dicha segunda fracción (f), y/o en una primera y segunda fracciones mezcladas y/o en la corriente de agua de proceso suministrada al sistema.
El número de unidades de tamiz S puede seleccionarse según, por ejemplo, la capacidad volumétrica para separar en dos corrientes y/o de otros objetivos de diseño. Sin embargo, un sistema según la presente invención tendrá en general una unidad de tamiz aguas arriba, una unidad de tamiz aguas abajo y preferiblemente una o más unidades de tamiz intermedias dispuestas fluídicamente entre las unidades de tamiz aguas arriba y aguas abajo. Es decir, con referencia a las fig. 1 y 2, un sistema preferido comprenderá una unidad de tamiz más aguas arriba S1 y una unidad de tamiz más aguas abajo S4 y un número de unidades de tamiz (por ejemplo, 2) dispuestas entre ellas, donde dispuestas entre ellas se refiere a estar conectadas de forma fluida como se ilustra en las fig. 1 y 2.
En detalle, la configuración de lavado en contracorriente conectada de forma fluida, tal como se divulga en las fig. 1 y 2, comprende normalmente la pluralidad de unidades de pantalla S1 ...S4 dispuestas de manera que:
una segunda fracción f1 producida por una unidad de tamiz aguas arriba S1 se mezcla con una primera fracción s3 producida por una unidad de tamiz aguas abajo S3, y dichas fracciones mezcladas se separan mediante una unidad de tamiz S2, que está intermedia entre dichas unidades de tamiz aguas arriba y aguas abajo S1, S3, en una primera fracción s2 y una segunda fracción f2.
Aunque esta divulgación se hace con referencia a la unidad de tamiz S3, la misma descripción puede aplicarse a cualquier unidad de tamiz intermedia, tal como la unidad de tamiz S2, u otras unidades de tamiz intermedias, donde la unidad de tamiz intermedia se refiere a una unidad de tamiz dispuesta aguas abajo de la unidad de tamiz más aguas arriba y aguas arriba de una unidad de tamiz más aguas abajo.
Como se ilustra en la fig. 2, en algunas realizaciones se prefiere que la mezcla de una segunda fracción f1 y una primera fracción s3 se produzca antes de su entrada en una unidad de tamiz intermedia S2. Dicha mezcla puede ser proporcionada por la entrada de las dos fracciones en una cámara de mezcla que comprende medios de agitación que proporcionan normalmente una agitación vigorosa del líquido o la mezcla se puede proporcionar por un colector que tiene una entrada para cada corriente y una salida para la corriente mezclada.
Como alternativa a la mezcla previa a la entrada en una unidad de tamiz, la mezcla de una segunda fracción f1 y una primera fracción 3 puede producirse dentro de una unidad de tamiz intermedia S2. Esto puede lograrse, por ejemplo, equipando el interior de la unidad de tamiz con un medio de agitación que proporcione una agitación enérgica del líquido dentro de la unidad de tamiz.
Aunque las realizaciones divulgadas en las figs. 1 y 2 se muestra que comprenden más de dos unidades de tamiz, se considera que un sistema es plenamente operativo con tan solo dos unidades de pantalla. Por lo tanto, en general se prefiere que el sistema comprenda 2-8 unidades de pantalla dispuestas normalmente como se ilustra en la fig. 1 o 2.
Además, la dimensión del espacio (en m3) está configurada preferentemente para proporcionar un tiempo de incubación de al menos 5 minutos, como al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, al menos 25 minutos, al menos 30 minutos, al menos 35 minutos, al menos 40 minutos, al menos 45 minutos, al menos 50 minutos, al menos 55 minutos, al menos 60 minutos, al menos 70 minutos, al menos 80 minutos, al menos 90 minutos, al menos 100 minutos, al menos 110 minutos, al menos 120 minutos. El espacio (V) designado a la incubación tiene preferentemente un volumen de al menos 30 m3, al menos 40 m3, al menos 50 m3, al menos 60 m3, al menos 70, m3, al menos 80, m3, al menos 90, m3, al menos 100 m3, al menos 110 m3, al menos 120 m3, al menos 130 m3, al menos 140 m3, al menos 150 m3, al menos 160 m3, al menos 170 m3, al menos 180 m3, al menos 190 m3, al menos 200 m3, al menos 210 m3, al menos 220 m3, al menos 230 m3, al menos 240 m3, al menos 250 m3, al menos 260 m3, al menos 270 m3, al menos 280 m3, al menos 290 m3, al menos 300 m3, al menos 400 m3, o al menos 500 m3. El tiempo de incubación también puede estar en más de un espacio V con un volumen total o combinado de al menos 100 m3, al menos 110 m3, al menos 120 m3, al menos 130 m3, al menos 140 m3, al menos 150 m3, al menos 160 m3, al menos 170 m3, al menos 180 m3, al menos 190 m3, al menos 200 m3, al menos 210 m3, al menos 220 m3, al menos 230 m3, al menos 240 m3, al menos 250 m3, al menos 260 m3, al menos 270 m3, al menos 280 m3, al menos 290 m3, al menos 300 m3, al menos 400 m3, al menos 500 m3.
Durante el tiempo de incubación, se prefiere que el líquido recibido en el espacio V no se tamice. Así, el líquido que sale del espacio V tiene la misma composición, por ejemplo de almidón y fibra, que el líquido recibido en el espacio V, aunque preferiblemente contiene una mayor proporción de almidón que se ha desprendido de las fibras.
Para asegurar un contacto íntimo entre las enzimas y la fibra, puede ser preferible configurar el espacio V para la agitación de la materia contenida en dicho espacio V, por ejemplo mediante un rotor o impulsor.
Como se ilustra en la fig. 2, se prefiere disponer el espacio V aguas abajo de la unidad de tamiz más aguas arriba S1 y aguas arriba de dicha unidad de tamiz más aguas abajo S4; en particular, la realización de la fig. 2 ilustra que el espacio V está dispuesto para alimentar líquido a la segunda unidad de tamiz más aguas abajo S3.
Como se divulga en el presente documento, el espacio puede proporcionarse de diferentes maneras y, como se ilustra en la fig. 2, el espacio V puede proporcionarse preferiblemente como una unidad de incubadora separada. La unidad de incubadora puede estar configurada mediante líneas para líquidos adecuadas para recibir una primera fracción s, una segunda fracción f o una combinación de una primera y una segunda fracción s,f, preferentemente solo una segunda fracción f, y suministrar el material así incubado a una unidad de tamiz aguas abajo S3.
Se hace referencia a la fig. 3, que ilustra esquemáticamente una unidad de tamiz con una incubadora/espacio V incorporado. Como se ilustra, la unidad de tamiz/incubadora comprende, en el extremo inferior, un elemento de tamiz 14 y, por encima, un espacio V. En el interior del espacio se han dispuesto placas deflectoras para evitar que se produzcan cortes en el flujo de líquido desde el extremo superior (que recibe, en la realización divulgada de la fig. 3, las fracciones f1 y s3) hacia el elemento de tamizado 14. Como también se ilustra, la corriente sin fibras s2 se tamiza proporcionando una fracción que contiene fibras f2.
La enzima usada para liberar el almidón de la masa del grano de maíz tiene normalmente una ventana térmica dentro de la cual la liberación de la enzima es más eficiente y, por lo tanto, puede ser ventajoso poder controlar la temperatura en posiciones seleccionadas del sistema, tal como en el espacio V. Para ello, un sistema según la presente invención puede comprender preferiblemente elementos térmicos para proporcionar una temperatura de incubación del líquido dentro de dicho espacio (V), preferiblemente en el intervalo de 35-70 °C, tal como en el intervalo de 40-60 °C, tal como en el intervalo de 39-53 °C, tal como en el intervalo de 45-53 °C, tal como en el intervalo de 39-48 °C, tal como 47 °C. En la realización donde el espacio se proporciona como una unidad de incubación separada (como en la fig. 2), los elementos térmicos pueden estar dispuestos dentro de la unidad de incubación y/o en una carcasa que define el recinto de la unidad de incubación.
Los elementos térmicos son preferiblemente elementos de calefacción/refrigeración termostatables que están adaptados para medir la temperatura y cambiar el flujo de calor hacia/desde el espacio para controlar la temperatura del material contenido en el espacio para que esté dentro de un intervalo predefinido.
En algunas realizaciones preferidas, los elementos calefactores termostatables comprenden elementos calefactores/enfriadores eléctricos o elementos calefactores/enfriadores líquidos y sensores de temperatura.
Como se presenta en el presente documento, la unidad de tamiz proporciona una separación del líquido en dos fracciones s y f, y la unidad de tamiz tamiza normalmente de una manera mecánica en la que una o más, tales como todas las unidades de tamiz, comprenden uno o más elementos de tamizado que tienen aberturas (como se ilustra, por ejemplo, en la fig. 2 con una línea de puntos inclinada) configuradas para permitir el paso de materia sólida por debajo de un tamaño predefinido. El tamaño predefinido puede definirse en función de una serie de criterios de diseño. Sin embargo, normalmente se prefiere que no se permita el paso de ninguna fibra a través de la abertura. Por otra parte, una abertura demasiado pequeña puede tener una tendencia a bloquearse y, en muchos casos, el tamaño real de las aberturas se selecciona teniendo en cuenta el aspecto de bloqueo y el aspecto de tamizado, lo que puede dar lugar a que se permita el paso de cantidades más pequeñas de fibras.
En algunas realizaciones preferidas, una o varias, tal como todas las unidades de tamiz, comprenden palas de rotor y/o tamices configurados para proporcionar dichas dos fracciones s, f. Como alternativa a los elementos de tamizado formados por aberturas, una o varias, tal como todas las unidades de tamiz, pueden ser hidrociclones 16, como se ilustra esquemáticamente en la fig. 4.
Como se ha divulgado anteriormente, el sistema está configurado para introducir enzimas hidrolíticas en dicha primera fracción s y/o en dicha segunda fracción f y/o en una primera y segunda fracción mezcladas y/o en el agua de proceso, mediante un dispositivo de dosificación - véase la fig. 2.
Dicho dispositivo de dosificación de se adapta normalmente para proporcionar una cantidad de dosificación controlable de enzimas, preferiblemente según una relación específica predeterminada entre la cantidad de enzimas y la entrada de masa de granos de maíz al sistema. Para realizar esto, el dispositivo de dosificación 10 puede ser una bomba dosificadora, como se ilustra en la figura 2 por una bomba de pistón.
Alternativamente, el dispositivo de dosificación puede ser un dosificador de flujo por gravedad que tenga una válvula de salida controlable configurada para controlar la cantidad de enzima que fluye a través de la válvula de flujo.
El polipéptido GH5 de la presente invención tiene actividad de xilanasa.
El polipéptido GH30 de la presente invención tiene actividad de xilanasa. En una realización el polipéptido GH5 de la presente invención tiene una cantidad de actividad de xilanasa que es suficiente para liberar una cantidad de almidón y gluten que es al menos 15 % (p/p) de materia seca de fibra, tal como al menos 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % 21 % o al menos 22 % (p/p) de materia seca de fibra, en un procedimiento que comprende las etapas de:
i. Proporcionar una muestra de fibra prensada de una planta de molienda húmeda de maíz; ii. Resuspender la muestra en tampón (pH 4, acetato de Na 0,02 M) para obtener una suspensión que contenga 5 % de sólidos secos.
iii. Añadir polipéptido GH5 a la suspensión en cantidades correspondientes a 35 pg de proteína enzimática (PE) por g de sustrato de sólidos secos, tal como 70 pg de proteína enzimática (PE) por g de sustrato de sólidos secos, en combinación con enzimas celulolíticas en una cantidad correspondiente a 280 pg de proteína enzimática (PE) por g de sustrato de sólidos secos;
iv. Incubación de la muestra a una temperatura de 40 o 52 °C en una incubadora calentada por aire con agitación constante durante 120 minutos.
v. Enfriar rápidamente la muestra en agua helada (5 °C) antes del procesamiento
vi. Transferir la suspensión a un tamiz de 150 micras y recogida del filtrado que los atraviesa. vii. Prensar la fibra de retención en el tamiz y recoger el filtrado que pasa a través, combinar el filtrado recogido con el primer filtrado.
viii. Transferir la fibra prensada a un vaso de precipitados con 200 ml de agua y agitar la mezcla. ix. Transferir la suspensión a un tamiz de 150 micras y recoger el filtrado que los atraviesa, combinar el filtrado recogido con el primer filtrado.
x. Prensar la fibra de retención en el tamiz y recoger el filtrado que pasa a través, combinar el filtrado recogido con el primer filtrado.
xi. Repetir la etapa viii a x una vez más.
xii. Filtrar a vacío el filtrado combinado a través de un papel de microfiltro de vidrio (Whatman) que retiene los sólidos insolubles que se desprendieron de la fibra que atravesó el tamiz de 150 micras. xiii. Pasar 200 ml de agua sobre el papel de filtro para eliminar las trazas de solubles.
xiv. Secar y pesar los sólidos insolubles totales retenidos en el papel de filtro, indicados como almidón y gluten liberados (p/p) de la materia seca de la fibra.
En una realización, el polipéptido GH5 de la presente invención comprende además una o más de las siguientes actividades: actividad de endo-p-1,4-glucanasa / celulasa (EC 3.2.1.4), actividad de endo-p-1,4-xilanasa (EC 3.2.1.8), actividad de p-glucosidasa (EC 3.2.1.21), actividad de p-manosidasa (EC 3.2.1.25), actividad de p-glucosNceramidasa (EC 3.2.1.45), actividad de glucano-p-1,3-glucosidasa (EC 3.2.1.58), actividad de liqueninasa (EC 3.2.1.73), actividad de exo-p-1,4-glucanasa / celodextrinasa (EC 3.2.1.74) y/o actividad de glucano endo-1,6-p-glucosidasa (EC 3.2.1.75), actividad de manano endo-p-1,4-manosidasa (EC 3.2.1.78), actividad de celulosa p-1,4-celobiosidasa (EC 3.2.1.91), actividad de esteril p-glucosidasa (EC 3.2.1.104), actividad de endoglucoceramidasa (EC 3.2.1.123), actividad de quitosanasa (EC 3.2.1.132), actividad de p-primeverosidasa (EC 3.2.1.149), actividad de endo-p-1,4-glucanasa específica de xiloglucano (EC 3.2.1.151), actividad de endo-p-1,6-galactanasa (EC 3.2.1.164), actividad de hesperidin 6-O-a-L-ramnosil-p-glucosidasa (EC 3.2.1.168), actividad de p-1,3-mananasa (EC 3.2.1.-) y actividad de endo-p-1,4-xilanasa específica de arabinoxilano (EC 3.2.1.-) y actividad de manano transglucosilasa (EC 2.4.1.-).
En una realización, el polipéptido GH30 de la presente invención comprende además una o más de las siguientes<actividades: actividad de endo-p-1,4-xilanasa>(E<c 3.2.1.8), actividad de p-glucosidasa (EC 3.2.1.21), actividad de p->glucuronidasa (EC 3.2.1.31), actividad de p-xilosidasa (EC 3.2.1.37), actividad de p-fucosidasa (EC 3.2.1.38), glucosilceramidasa (EC 3.2.1.45), p-1,6-glucanasa (EC 3.2.1.75), glucuronoarabinoxilano endo-p-1,4-xilanasa (EC 3.2.1.136), endo-p-1,6-galactanasa (EC 3.2.1.164) y p-xilosidasa (EC 3.2.1.-).
En una realización, el polipéptido GH5 de la presente invención se selecciona de un grupo que consiste en:
i) Un polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NO: 1-3; SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12;
ii) un polipéptido maduro que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de i), tal como al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%de identidad de secuencia.
iii) Una subsecuencia de cualquiera de los polipéptidos maduros de i) y ii); preferiblemente la subsecuencia tiene actividad de xilanasa.
En una realización, el polipéptido GH30 de la presente invención se selecciona de un grupo que consiste en:
i) un polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7;
ii) un polipéptido maduro que tiene al menos 60 % de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de i), tal como al menos un least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100%de identidad de secuencia.
iii) Una subsecuencia de cualquiera de los polipéptidos maduros de i) y ii); preferiblemente la subsecuencia tiene actividad de xilanasa.
El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como el procesamiento aminoterminal, el truncamiento carboxi-terminal, la glucosilación, la fosforilación, etc.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 655. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 28 a 655 de SEQ ID NO: 1, siendo los aminoácidos 1 a 27 de SEQ ID NO: 1 un péptido señalizador. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 36 a 655 de s Eq ID NO: 1, siendo los aminoácidos 28 a 35 de SEQ ID NO: 1 una marca His. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 37 a 655 de SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 40 a 655 de SEQ ID NO: 1. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 45 a 655 de la SEQ ID NO: 1.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 555 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 7 a 555 de SEQ ID NO: 2, siendo los aminoácidos 1 a 6 de SEQ ID NO: 2 una marca His. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 10 a 555 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 15 a 555 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 20 a 555 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 30 a 555 de SEQ ID NO: 2.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 585 de SEQ ID NO: 3. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 28 a 585 de SEQ ID NO: 3, siendo los aminoácidos 1 a 27 de SEQ ID NO: 3 un péptido señalizador. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 36 a 585 de SEQ ID NO: 3, siendo los aminoácidos 28 a 35 de SEQ ID NO: 3 una marca His. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 37 a 585 de SEQ ID NO: 3.
En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 40 a 585 de SEQ ID NO: 3. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 45 a 585 de la SEQ ID NO: 3.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 391 de SEQ ID NO: 4. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 comprende/consiste/consiste esencialmente de los aminoácidos 5 a 391 de la SEQ ID NO: 4. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 10 a 391 de SEQ ID NO: 4. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 15 a 391 de SEQ ID NO: 4. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 comprende/consiste/consiste esencialmente de aminoácidos 20 a 391 de SEQ ID NO: 4. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 30 a 391 de SEQ ID NO: 4.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 comprende/consiste/consiste esencialmente de aminoácidos 1 a 417 de s Eq ID NO: 5. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 5 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 27 a 417 de SEQ ID NO: 5, siendo los aminoácidos 1 a 26 de SEQ ID NO: 5 un péptido señalizador.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 6 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 417 de SEQ ID NO: 6. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 6 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 27 a 417 de SEQ ID NO: 6, siendo los aminoácidos 1 a 26 de SEQ ID NO: 6 un péptido señalizador.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 7 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 417 de SEQ ID NO: 7. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 7 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 27 a 417 de SEQ ID NO: 7, siendo los aminoácidos 1 a 26 de SEQ ID NO: 7 un péptido señalizador.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 8 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 557. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 8 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 8 a 557 de SEQ ID NO: 8, siendo los aminoácidos 1 a 7 de SEQ ID NO: 8 una marca His. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 8 comprende/consiste/consiste esencialmente en al menos los aminoácidos 28 a 557 de SEQ ID NO: 8.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 576 de SEQ ID NO: 10. En otra realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 24 a 576 de SEQ ID NO: 10, siendo los aminoácidos 1 a 23 de SEQ ID NO: 10 un péptido señalizador.
En una realización, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 12 comprende/consiste/consiste esencialmente en los aminoácidos 1 a 565 de SEQ ID NO: 12.
En el contexto de la presente invención, el término "subsecuencia" significa un polipéptido en el que uno o más (por ejemplo, varios) residuos de aminoácidos están ausentes del extremo amino (N) y/o del extremo carboxi (C) de un polipéptido maduro; en donde la subsecuencia tiene actividad de xilanasa. En algunas realizaciones, el número de residuos de aminoácidos que están ausentes en una "subsecuencia" es como máximo 20, tal como como máximo 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o como máximo 1 residuo de aminoácido.
En alguna realización, una subsecuencia de cualquiera de los polipéptidos maduros puede tener al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud o al menos 600 aminoácidos de longitud o al menos 650 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 1 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud o al menos 600 aminoácidos de longitud o al menos 650 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 2 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 3 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud o al menos 560 aminoácidos de longitud o al menos 570 aminoácidos de longitud o al menos 580 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 4 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 360 aminoácidos de longitud o al menos 370 aminoácidos de longitud o al menos 380 aminoácidos de longitud o al menos 390 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 5 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 360 aminoácidos de longitud o al menos 370 aminoácidos de longitud o al menos 380 aminoácidos de longitud o al menos 390 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 6 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 360 aminoácidos de longitud o al menos 370 aminoácidos de longitud o al menos 380 aminoácidos de longitud o al menos 390 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 7 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 150 aminoácidos de longitud o al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 360 aminoácidos de longitud o al menos 370 aminoácidos de longitud o al menos 380 aminoácidos de longitud o al menos 390 aminoácidos de longitud.
En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 8 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud o al menos 600 aminoácidos de longitud o al menos 650 aminoácidos de longitud. En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 10 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud o al menos 600 aminoácidos de longitud o al menos 650 aminoácidos de longitud. En una realización, una subsecuencia de SEQ ID NO: 12 de los polipéptidos maduros puede tener al menos 200 aminoácidos de longitud o al menos 250 aminoácidos de longitud o al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 350 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud o al menos 450 aminoácidos de longitud o al menos 500 aminoácidos de longitud o al menos 550 aminoácidos de longitud o al menos 600 aminoácidos de longitud o al menos 650 aminoácidos de longitud.
En una realización, la composición enzimática que comprende una o más enzimas hidrolíticas comprende además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en: celulasas (EC 3.2.1.4), xilanasas (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55 (alfa-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor), celobiohidrolasa I (EC 3.2.1.150), celobiohidrolasa II (E.C. 3.2.1.91), celobiosidasa (E.C. 3.2.1.176), betaglucosidasa (E.C. 3.2.1.21), betaxilosidasas (E.C. 3.2.1.37) y proteasas (E.C. 3.4).
En una realización, la una o más enzimas hidrolíticas se expresan en un organismo con un acervo de celulasa, comoTrichoderma reesei.Según estas realizaciones, los polipéptidos GH5 y/o GH30 definidos según la invención se expresan junto con celulasas endógenas deTrichoderma.
En una realización, la composición enzimática que comprende una o más enzimas hidrolíticas puede comprender celulasas expresadas enTrichoderma reeseiy otras enzimas hidrolíticas que se añaden a la composición enzimática en forma purificada o semipurificada.
En una realización, se purifican una o más enzimas hidrolíticas. Las enzimas purificadas pueden usarse en una composición enzimática como se describe en otras realizaciones de la presente invención.
En una realización, una o más enzimas hidrolíticas está/n en una composición líquida. La composición puede ser homogénea o heterogénea.
En una realización, una o más enzimas hidrolíticas está/n en una composición sólida.
En una realización, la cantidad efectiva de una o más enzimas hidrolíticas mezcladas con una o más fracciones de dicha masa de granos de maíz es entre 0,005 y 0,5 kg de proteína enzimática (PE)/tonelada métrica (TM) de granos de maíz que entran en el proceso de molienda húmeda, tal como entre 0,010-0,5 kg de PE/TM de grano de maíz, tal como entre 0,05-0,5 kg/TM de grano de maíz o 0,075-0,5 kg/MT o 0,1-0,5 kg/TM de grano de maíz o 0,005-0,4 kg/TM de grano de maíz o 0,01-0,4 kg/TM de grano de maíz o 0,05-0,4 kg/TM de grano de maíz o 0,075-0,4 kg/TM de grano de maíz o 0,1-0,4 kg/TM de grano de maíz o 0,005-0,3 kg/TM de grano de maíz o 0,01-0,3 kg/TM de grano de maíz o 0,05-0,3 kg/TM de grano de maíz o 0,075-0,3 kg/TM o 0,1-0,3 kg/TM de grano de maíz o 0,005-0,2 kg/TM de grano de maíz o 0,010-0,2 kg/TM de grano de maíz o 0,05-0,2 kg/TM de grano de maíz o 0,075-0,2 kg/TM o 0,1-0,2 kg/TM de grano de maíz o tal como 0,075-0,10 kg/TM de grano de maíz o 0,075-0,11 kg/TM de grano de maíz.
El tratamiento enzimático de granos de maíz o de una fracción de granos de maíz con una composición enzimática hidrolítica, que comprende al menos un polipéptido GH5 o al menos un polipéptido GH30 o una combinación de al menos un polipéptido GH5 y al menos un polipéptido GH30, proporciona almidón de maíz, gluten de maíz y productos de fibra de maíz, que difieren de los productos producidos por otros métodos conocidos en la técnica.
En una realización, la composición enzimática según la invención, en donde al menos una de dichas enzimas hidrolíticas se selecciona del grupo consistente en un polipéptido GH30, un polipéptido GH5 o una combinación de los mismos, comprende además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en celulasas (EC 3.2.1.4), xilanasas (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55 (Extremo no reductor alfa-L-arabinofuranosidasas); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor), celobiohidrolasa I (EC 3.2.1.150), celobiohidrolasa II (E.C. 3.2.1.91), celobiosidasa (E.C. 3.2.1.176), betaglucosidasa (E.C. 3.2.1.21), betaxilosidasas (E.C. 3.2.1.37) o proteasas (E.C. 3.4).
En realizaciones preferidas, la composición enzimática comprende celulasa obtenida de un cultivo deTrichoderma reesei,tal como un cultivo deTrichoderma reeseiATCC 26921. Existen celulasas adecuadas; por ejemplo, de Novozymes A/S con el nombre comercial Celluclast® .
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido GH30 en la molienda húmeda de maíz.
El polipéptido GH30 puede ser, en particular, un polipéptido como el definido anteriormente. Preferiblemente, la molienda húmeda del maíz se realiza mediante un proceso de molienda húmeda como el definido anteriormente.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un polipéptido GH5 en la molienda húmeda de maíz. El polipéptido GH5 puede ser, en particular, un polipéptido como el definido anteriormente en el presente documento. Preferentemente, la molienda húmeda de maíz se realiza usando un proceso de molienda húmeda como se define en cualquiera de los anteriores.
Todavía otro aspecto de la invención proporciona el uso de una composición enzimática como se ha descrito anteriormente en la molienda húmeda de maíz, preferentemente en un proceso de molienda húmeda de maíz como se ha definido anteriormente.
Preferiblemente, el polipéptido GH30, el polipéptido GH5 y/o la composición enzimática, cuando se usan según la invención, se usan con el fin de aumentar el rendimiento de almidón y/o el rendimiento de gluten totales de los granos de maíz en un proceso de molienda húmeda.
Polipéptidos con actividad de xilanasa
En una realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %, que tienen actividad de xilanasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, del polipéptido maduro de<s>E<q>ID NO: 10.
Un polipéptido de la presente invención comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una variante alélica de la misma; o es un fragmento del mismo que tiene actividad de xilanasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 24 a 576 de SEQ ID NO: 10.
En una realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 12 de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %, que tienen actividad de xilanasa. En un aspecto, los polipéptidos difieren en hasta 10 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, del polipéptido maduro de<s>E<q>ID NO: 12.
Un polipéptido de la presente invención comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o una variante alélica de la misma; o es un fragmento del mismo que tiene actividad de xilanasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 12.
En otra realización, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de pectina liasa codificada por un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia con la secuencia codificante de polipéptido maduro de SEQ ID NO: 9 o SEQ I<d>NO: 11, o la secuencia de ADNc de la misma de al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, o el 100 %.
En otra realización, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 que comprenden una sustitución, deleción y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12 es de hasta 10, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones conservadoras de aminoácidos que no afecten significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxiterminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido conector de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos de carácter básico (arginina, lisina e histidina), aminoácidos de carácter ácido (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones aminoacídicas que en general no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, En, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
Como alternativa, los cambios aminoacídicos son de una naturaleza tal que se alteran las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, cambios aminoacídicos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.
Los aminoácidos esenciales de un polipéptido pueden identificarse según procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de una sola alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad de pectin liasa para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse mediante el análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcado por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos putativos del sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899 904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede deducirse de un alineamiento con un polipéptido relacionado.
Se pueden realizar y testar sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos únicos o múltiples utilizando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o mezcla aleatoria, seguidos de un procedimiento de rastreo relevante, tales como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; documentos de patente WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden usarse incluyen PCR propensa a errores, visualización de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de EE. UU. n.° 5.223.409; WO 92/06204) y mutagénesis dirigida a regiones (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
Los métodos de mutagénesis/barajado pueden combinarse con métodos de tamizado automatizados de alto rendimiento para detectar la actividad de polipéptidos clonados y mutagenizados expresados por células hospedadoras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospedadoras y secuenciarse rápidamente usando métodos habituales en la técnica. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de residuos aminoacídicos individuales en un polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el que una región de un polipéptido se fusiona en el extremo N o en el extremo C de una región de otro polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión escindible en el que se fusiona otro polipéptido en el extremo N o el extremo C del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce fusionando un polinucleótido que codifica otro polipéptido a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en el mismo marco y que la expresión del polipéptido de fusión esté bajo el control del mismo promotor(es) y terminador. Polipéptidos de fusión también se pueden construir utilizando tecnología inteína, en la que los polipéptidos de fusión se crean post-traduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión puede comprender, además, un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Tras la secreción de la proteína de fusión, el sitio se escinde liberando los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero no se limitan a, los sitios divulgados en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Fuentes de polipéptidos con actividad de xilanasa
Un polipéptido con actividad de xilanasa de la presente invención puede obtenerse de microorganismos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, la expresión "obtenido de" tal como se utiliza en esta memoria en relación con una fuente dada significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la que se ha insertado el polinucleótido de la fuente. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente dada se secreta extracelularmente.
El polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido bacteriano Gram-positivo tal como un polipéptido deBacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus,orStreptomycesque tenga actividad de pectin-liasa, o un polipéptido bacteriano Gram-negativo tal como un polipéptido deCampylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella,orUreaplasma
En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido deBacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis,orBacillus thuringiensis.
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido deStreptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis,orStreptococcus equisubsp.Zooepidemicus.
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido deStreptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus,orStreptomyces lividans.
El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido de levadura, tal como un polipéptido deCandida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces,orYarrowia; o un polipéptido de hongo filamentoso tal como un polipéptido deAcremonium, Agaricus, Alternaría, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex,Lentinula, Leptospaeria,Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella,orXylaria.
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido deSaccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis,orSaccharomyces oviformis.
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido deAcremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei,orTrichoderma viride.
Se entenderá que para las especies antes mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, independientemente del nombre de la especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.
Cepas de estas especies son de fácil acceso para el público en un cierto número de colecciones de cultivos, tales como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
El polipéptido puede identificarse y obtenerse de otras fuentes, incluidos microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, suelo, compost, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, compost, agua, etc.) usando las sondas antes mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. A continuación, se puede obtener un polinucleótido que codifica el polipéptido rastreando de manera similar una colección de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mixto. Una vez que se ha detectado un polinucleótido que codifica un polipéptido con la(s) sonda(s), el polinucleótido puede aislarse o clonarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, arriba).
Polinucleótidos
Las técnicas utilizadas para aislar o clonar un polinucleótido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico o ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de los polinucleótidos a partir de ADN genómico puede efectuarse, por ejemplo, usando la conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el cribado de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada por ligamiento (LAT) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA).
La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para sintetizar polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. La expresión "sustancialmente similares" al polipéptido se refiere a formas que no se producen de forma natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna manera manipulada del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en actividad específica, termoestabilidad, pH óptimo o similares. Las variantes pueden construirse basándose en el polinucleótido presentado como la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de ADNc del mismo,por ejemplo,una subsecuencia de la misma, y/o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que no dan lugar a un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codones del organismo hospedador destinado a la producción de la enzima, o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Construcciones de ácido nucleico
El polinucleótido puede manipularse de diversas formas para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando procedimientos de ADN recombinante son bien conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedadora para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control transcripcional que median en la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora, incluidos promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula hospedadora.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedadora fúngica filamentosa son los promotores obtenidos de los genes de acetamidasa deAspergillus nidulans,alfa-amilasa neutra deAspergillus niger,alfa-amilasa estable ácida deAspergillus niger,glucoamilasa deAspergillus nigeroAspergillus awamori (glaA),TAKA amilasa deAspergillus oryzae,proteasa alcalina deAspergillus oryzae,triosa fosfato isomerasa deAspergillus oryzae,proteasa similar a la tripsina deFusarium oxysporum(documento de patente WO 96/00787), amiloglucosidasa deFusarium venenatum(documento de patente WO 00/56900),Fusarium venenatumDaria (documento de patente WO 00/56900),Fusarium venenatumQuinn (documento de patente WO 00/56900), lipasa deRhizomucor miehei,proteinasa aspártica deRhizomucor miehei,beta-glucosidasa deTrichoderma reesei,celobiohidrolasa I deTrichoderma reesei,celobiohidrolasa II deTrichoderma reesei,endoglucanasa I deTrichoderma reesei,endoglucanasa II deTrichoderma reesei,endoglucanasa III deTrichoderma reesei,endoglucanasa V deTrichoderma reesei,xilanasa I deTrichoderma reesei,xilanasa II deTrichoderma reesei,xilanasa III deTrichoderma reesei,beta-xilosidasa deTrichoderma reeseiy factor de elongación de la traducción de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfaamilasa neutra deAspergillusen el que el conductor no traducido ha sido sustituido por un conductor no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa deAspergillus;ejemplos no limitantes incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra deAspergillus nigeren el que el conductor no traducido ha sido sustituido por un conductor no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa deAspergillus nidulansoAspergillus oryzae);y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos. Otros promotores se describen en la Patente de EE.UU. N° 6.011.147.
La secuencia de control también puede ser un terminador de la transcripción, que es reconocido por una célula hospedadora para terminar la transcripción. El terminador está enlazado operativamente al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora puede utilizarse en la presente invención.
Terminadores preferidos para células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen de los genes de acetamidasa deAspergillus nidulans,antranilato sintasa deAspergillus nidulans,glucoamilasa deAspergillus niger,alfa-glucosidasa deAspergillus niger,TAKA amilasa deAspergillus oryzae,proteasa tipo tripsina deFusarium oxysporum,betaglucosidasa deTrichoderma reesei,celobiohidrolasa I deTrichoderma reesei,celobiohidrolasa II deTrichodermareesei,endoglucanasa I deTrichoderma reesei,endoglucanasa II deTrichoderma reesei,endoglucanasa III deTrichoderma reesei,endoglucanasa V deTrichoderma reesei,xilanasa I deTrichoderma reesei,xilanasa II deTrichoderma reesei,xilanasa III deTrichoderma reesei,beta-xilosidasa deTrichoderma reeseiy factor de elongación de la traducción deTrichoderma reesei.
La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora del ARNm aguas abajo de un promotor y aguas arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.
La secuencia de control también puede ser un conductor, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula hospedadora. El conductor está enlazado operativamente al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Puede utilizarse cualquier conductor que sea funcional en la célula hospedadora.
Conductores preferidos para las células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de la TAKA amilasa deAspergillus oryzaey la triosa fosfato isomerasa deAspergillus nidulans.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente al extremo 3' del polinucleótido y, cuando se transcribe, la célula hospedadora la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedadora.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células hospedadoras fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de antranilato sintasa deAspergillus nidulans,glucoamilasa deAspergillus niger,alfa-glucosidasa deAspergillus niger,amilasa TAKA deAspergillus oryzaey proteasa similar a la tripsina deFusarium oxysporum.
La secuencia de control también puede ser una región codificante de un péptido señal que codifica un péptido señal enlazado al extremo N de un polipéptido y dirige el polipéptido hacia la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener inherentemente una secuencia codificante del péptido señal enlazada de forma natural en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Puede ser necesaria una secuencia codificante de péptido señal extraña, en los casos en los que la secuencia codificante no contiene de forma natural una secuencia codificante de péptido señal. Alternativamente, una secuencia codificante del péptido señal extraño puede simplemente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural con el fin de potenciar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede utilizarse cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de una célula hospedadora.
Secuencias codificantes del péptido señal efectivas para células hospedadoras de hongos filamentosos son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas de los genes para amilasa neutra deAspergillus niger, glucoamilasa deAspergillus niger,amilasa TAKA deAspergillus oryzae,celulasa deHumicola insolens,endoglucanasa V deHumicola insolens,lipasa deHumicola lanuginosay proteinasa aspártica deRhizomucor miehei.
La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un propéptido posicionado en el extremo N de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido a partir del propolipéptido. La secuencia de codificación del propéptido puede obtenerse de los genes de la proteasa alcalina(aprE) de Bacillus subtilis,la proteasa neutra(nprT)deBacillus subtilis,la lacasa deMyceliophthora thermophila(documento de patente WO 95/33836), la proteinasa aspártica deRhizomucor miehei yel alfafactorde Saccharomyces cerevisiae.
En los casos en los que están presentes secuencias tanto del péptido señal como del propéptido, la secuencia del propéptido se sitúa junto al extremo N de un polipéptido y la secuencia del péptido señal se sitúa junto al extremo N de la secuencia del propéptido.
También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que regulen la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula hospedadora. Ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que provocan que la expresión del gen se active o desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En hongos filamentosos, se puede utilizar el promotor de glucoamilasa deAspergillus niger,el promotor de alfa-amilasa TAKA deAspergillus oryzaey el promotor de glucoamilasa deAspergillus oryzae,el promotor de celobiohidrolasa I deTrichoderma reeseiy el promotor de celobiohidrolasa II deTrichoderma reesei.Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En los sistemas eucariotas, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría enlazado operativamente a la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
Las diversas secuencias de nucleótidos y de control pueden unirse para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido en dichos sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede expresarse insertando el polinucleótido o una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y puede provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedadora en la que se ha de introducir el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en los que se ha integrado. Además, puede usarse un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contengan el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula hospedadora, o un transposón.
El vector contiene preferentemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de las células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona resistencia a biocidas o virus, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.
Los marcadores seleccionables para su uso en una célula hospedadora fúngica filamentosa incluyen, entre otros,adeA(fosforibosilaminoimidazol-succinocarboxamida sintasa),adeB(fosforibosil-aminoimidazol sintasa),amdS(acetamidasa),argB(ornitina carbamoiltransferasa),bar(fosfinotricina acetiltransferasa),hph(higromicina fosfotransferasa),niaD(nitrato reductasa),pyrG(orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) ytrpC(antranilato sintasa), así como sus equivalentes. Para su uso en una célula deAspergillusse prefieren los genesamdSypyrG de Aspergillus nidulansoAspergillus oryzaey un genbar de Streptomyces hygroscopicus.Para su uso en una célula deTrichodermase prefieren los genesadeA, adeB, amdS, hphypyrG.
El marcador seleccionable puede ser un sistema de marcador seleccionable dual tal como se describe en el documento de patente WO 2010/039889. En un aspecto, el marcador seleccionable dual es un sistema de marcador seleccionable dualhph-tk.
El vector contiene preferiblemente un o unos elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedadora o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula hospedadora, el vector puede basarse en la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula hospedadora en una ubicación o ubicaciones precisas en el o los cromosomas. Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integradores deben contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para potenciar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula hospedadora. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificantes o codificantes. Por otra parte, el vector puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora mediante recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permita que el vector se replique de forma autónoma en la célula hospedadora en cuestión. El origen de la replicación puede ser cualquier replicador plasmídico que medie la replicación autónoma que funcione en una célula. La expresión "origen de replicación" o "replicador plasmídico" significa un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se repliquein vivo.
Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; documento de patente WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen se pueden lograr de acuerdo con los métodos descritos en el documento de patente WO 00/24883.
Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedadora para aumentar la producción de un polipéptido. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedadora o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido en los casos en los que células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, con ello, copias adicionales del polinucleótido se pueden seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos usados para ligar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrooket al.,1989, arriba).
Células hospedadoras
Una construcción o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedadora de modo que la construcción o vector se mantiene como integrante cromosómico o como vector extracromosómico autorreplicante, tal como se ha descrito anteriormente. El término "célula hospedadora" abarca cualquier progenie de una célula progenitora que no sea idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula hospedadora dependerá en gran medida del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula hospedadora puede ser una célula fúngica. "Hongos", tal como se utiliza en esta memoria incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, así como el filo Oomycota y todos los hongos mitospóricos (tal como se define por Hawksworth et al., En, Dictionary of The Fungi de Ainsworth y Bisby, 8a edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido).
La célula hospedadora fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según la definición de Hawksworthet al.,1995, arriba). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta de quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio.
La célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula deAcremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes,orTrichoderma.
Por ejemplo, la célula hospedadora fúngica filamentosa puede ser una célula deAspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum,Fusarium trichothecioides,Fusarium venenatum,Humicola insolens,Humicola lanuginosa,Mucor miehei,Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei,orTrichoderma viride.
Las células fúngicas pueden transformarse mediante un proceso que incluya la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera en sí conocida. Procedimientos adecuados para la transformación de células hospedadoras deAspergillusyTrichodermase describen en el documento de patente EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Procedimientos adecuados para transformar especies deFusariumse describen por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, y el documento de patente WO 96/00787.
Métodos de producción
Las células hospedadoras se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden cultivar mediante cultivo en matraz de agitación, o fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar el polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales, o pueden prepararse según las composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se secreta en el medio nutriente, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta, se puede recuperar a partir de lisados celulares.
El polipéptido puede detectarse utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección incluyen, pero no se limitan al uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
El polipéptido puede recuperarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a recogida, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación. En un aspecto, se recupera un caldo de fermentación que comprende el polipéptido.
El polipéptido puede purificarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, entre otros, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, Janson y Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.
En un aspecto alternativo, el polipéptido no se recupera, sino que se utiliza una célula hospedadora de la presente invención que expresa el polipéptido como fuente del polipéptido.
Composiciones enzimáticas
Las composiciones pueden comprender un polipéptido de la presente invención como componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, las composiciones pueden comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una o más (por ejemplo, varias) enzimas seleccionadas del grupo que consiste en hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidorreductasa o transferasa, por ejemplo, una alfa-galactosidasa, alfa-glucosidasa, aminopeptidasa, amilasa, beta-galactosidasa, beta-glucosidasa, beta-xilosidasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, glucoamilasa, invertasa, lacasa, lipasa, mannosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa.
Las composiciones pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica y pueden presentarse en forma líquida o seca. Las composiciones pueden estabilizarse según métodos conocidos en la técnica.
EJEMPLOS
Ejemplo 1:
En este ejemplo, se midió la cantidad de almidón y gluten separados de la fibra, tras la incubación con y sin enzima.
La muestra de fibra se obtuvo de una planta de molienda húmeda tras el prensado de la fibra con un contenido total de materia seca del 20 %. La muestra se resuspendió en tampón (pH 4, acetato de Na 0,02 M) hasta obtener una suspensión de 100 g con un 5 % de sólidos secos. A esta suspensión se le añadió enzima en una proporción final de 350 pg por g de sustrato de sólidos secos (SS). Véanse los detalles de la muestra en la tabla 1.
Tabla 1
Tabla 1:Temperatura y composición enzimática de cada muestra analizada. *La composición de enzimas celulolíticas usada es Celluclast® de Novozymes. AEl polipéptido GH5 usado es el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 3. "El polipéptido GH30 usado es el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 4.
° * 30" (pg de PE/g SS)
Las muestras se incubaron a una temperatura de 52 ° y 40 °C (véase la tabla 1) en una incubadora calentada por aire con agitación constante durante 120 minutos. Tras la incubación, las muestras se enfriaron rápidamente en agua helada (5 °C) antes de procesarlas. La suspensión se transfirió a un tamiz de 150 micras, recogiendo al mismo tiempo el filtrado que los atravesaba.
La fibra que quedó retenida sobre el tamiz se prensó usando una espátula para recuperar la mayor cantidad posible de filtrado. A continuación, la fibra prensada se transfirió a un vaso de precipitados que contenía 200 ml de agua y se agitó. La suspensión se pasó por el tamiz de 150 micras y el filtrado recogido se combinó con el primero. Las etapas de prensado, lavado y filtrado anteriores se repitieron una vez más, de modo que se recuperó un filtrado final que se combinó con los dos primeros. A continuación, el filtrado combinado se filtró al vacío, esta vez a través de un papel de microfiltro de vidrio (Whatman) que retiene los sólidos insolubles que se desprendieron de la fibra y pasaron por la malla de 150 micras. Después de pasar 200 ml de agua sobre el papel de filtro para eliminar cualquier traza de solubles, el total de sólidos insolubles retenidos en el papel de filtro se seca y se pesa. El peso seco se informa como Almidón+Gluten liberado como porcentaje (p/p) de materia seca fibrosa del sustrato de partida. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
El efecto de la adición de las enzimas GH5 y/o GH30 es evidente por el aumento de los rendimientos de almidón y gluten a 40 °C y 52 °C.
Ejemplo 2:
Enzimas:
GH30 Xilanasa A: GH30 xilanasa derivada deBacillus subtilis(SEQ ID NO:5)
GH30 Xilanasa B: GH30 xilanasa derivada deBacillus subtilis(SEQ ID NO:6)
GH30 Xilanasa C: GH30 xilanasa derivada deBacillus subtilis(SEQ ID NO:7)
Celluclast/Celluclast 1,5 L: Una composición de celulasa disponible en el mercado (Novozymes A/S, Dinamarca).
Se realizó un ensayo de 10 g de fibra a pH 3,8, con incubación a 52 °C durante 1 hora y una dosis de 35 ug de proteína enzimática por gramo de maíz; usando mezclas enzimáticas que contenían GH30 Xilanasa A, GH30 Xilanasa B o GH30 Xilanasa C, en combinación con Celluclast. Las mezclas consistían en un 20 % (p/p) de GH30 Xilanasa A, GH30 Xilanasa B o GH30 Xilanasa C, y el 80 % restante (p/p) de Celluclast. Para comparación, se incluyó una composición enzimática que solo contenía Celluclast. En el ensayo de fibra se usó como sustrato una fibra de maíz con un 15,52 % de almidón residual y un 12,00 % de proteína residual en fibra. Se midió la liberación de almidón gluten (sustancia seca) de la fibra de maíz a la dosis especificada; los resultados se proporcionan en la tabla siguiente.
Tabla 3
La adición de GH30 Xilanasa A, GH30 Xilanasa B y GH30 Xilanasa C en combinación con una enzima celulasa, como Celluclast, puede aumentar significativamente el rendimiento de almidón gluten en un proceso de molienda húmeda de maíz.
Ejemplo 3: Tratamiento en laboratorio de fibra de molienda húmeda de maíz con xilanasa GH5 Enzimas:
Xilanasa GH5: GH5_21 xilanasa derivada Cryseobacterium sp., que tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína madura de SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 26 del documento de patente WO 2016/005522 ).
Mezcla enzimática D: consiste principalmente en celobiohidrolasas (CBH I y II), de un donante exógeno, y endoglucanasas (EG1 y 2) del hospedador nativo Trichoderma.
Mezcla enzimática T: consiste principalmente (-80 %) en celobiohidrolasas y endoglucanasas del hospedadora nativo Trichoderma, y el -20 % restante de proteína total consiste en xilanasa GH10 de un donante exógeno.
Frontia Fiberwash® es un producto comercial, compuesto por una mezcla de xilanasas y celulasas. (Novozymes A/S, Dinamarca).
El ensayo de fibra de 10 g incluye generalmente la incubación de muestras de fibra húmeda obtenidas de la planta de molienda húmeda, en presencia de enzimas, en condiciones pertinentes para el proceso (pH de 3,5 a 4, temperatura en torno a 52 °C) y durante un periodo de tiempo de entre 1 y 4 horas. Tras la incubación, la fibra se transfiere y se prensa sobre un tamiz (normalmente de 75 micras o menos), donde se recogen los filtrados compuestos principalmente por el almidón y el gluten separados. Se realizan varios lavados sobre el tamiz, y los lavados se recogen junto con el filtrado inicial. A continuación, el filtrado recogido se pasa por un filtro de embudo (filtro de vidrio con una abertura de 0,45 micras) para separar aún más los sólidos insolubles (principalmente almidón y gluten) del resto del filtrado (principalmente sólidos disueltos). Estos sólidos insolubles recuperados se lavan y, a continuación, se secan en horno hasta sequedad. La masa seca insoluble se pesa y luego se analiza para determinar el contenido de almidón, usando una modificación del método de Ewers (hidrólisis ácida y medición de la glucosa por cromatografía líquida). El ensayo de fibra de 10 g se realiza a pH 4, incubando la fibra a 50 °C durante 2 horas con diferentes tratamientos enzimáticos como se describe a continuación. El control es la incubación de la fibra sin ninguna enzima añadida. Frontia Fiberwash® es un producto comercial usado para esta aplicación industrial, que consiste en una mezcla de xilanasas y celulasas. GH5 se dosifica en combinación con dos mezclas enzimáticas diferentes, ambas derivadas de fermentaciones deTrichoderma reesei.GH5 se dosificó en un 20 % del total de proteínas enzimáticas añadidas, y el 80 % restante consistió en el acervo de la mezcla enzimática. La cantidad total de proteínas enzimáticas añadidas en todos los tratamientos fue de 500 microgramos por gramo de fibra seca. La mezcla enzimática D consiste principalmente en celobiohidrolasas (CBH I y II), de un donante exógeno, y endoglucanasas (EG1 y 2) del hospedador nativo Trichoderma. La mezcla enzimática T consiste principalmente (-80 %) en celobiohidrolasas y endoglucanasas del hospedador Trichoderma nativo, y el -20 % restante de proteína total consiste en xilanasa GH10 de un donante exógeno. Los resultados se presentan en la tabla siguiente:
Tabla 4
EJEMPLO 4
Descripción de método Ensayo de lavado de fibra de 15 ml
El ensayo de fibra fina de 15 ml generalmente incluye la incubación de muestras de fibra fina húmeda obtenidas de una planta de molienda húmeda de maíz en presencia de enzimas, en condiciones relevantes para el proceso (pH 4,0, temp aproximadamente 40 °C)
D®4 con mezcla minuciosa
con mezcla minuciosa en una incubadora de hibridación durante una hora.
Después de la incubación, la fibra se filtra al vacío a través de una unidad de filtro superior de tubo Steriflip de Millipore. La fibra se resuspende hasta un volumen de 30 ml con agua destilada, se agita a fondo en un vórtex y se filtra al vacío por segunda vez. El filtrado recogido consiste en el almidón y el gluten extraídos. El filtrado se centrifuga en una Avanti J-E a 5.000 rpm durante 7 minutos para granular el almidón. El sobrenadante se elimina lentamente con una pipeta serológica de 50 ml para no alterar el sedimento de almidón y gluten. Este procedimiento de lavado y centrifugación se repite dos veces más para eliminar los oligómeros solubilizados.
T ras el lavado, queda un volumen total de 5 ml, incluido el sedimento de almidón. El exceso de agua se elimina usando un evaporador de disolventes EZ-2 Elite (método: acuoso, máximo 65 °C, 3 horas, 3.000 rpm, 120 mbar). Después de esto, el sedimento (que contiene almidón y gluten) se resuspende en 500 ul de ácido clorhídrico 1,6 M y se calienta a 90 °C durante 45 minutos; 1.000 rpm. Esta incubación descompone el gránulo de almidón en monómeros de azúcar. Después de la hidrólisis ácida, la reacción se apaga usando 625 ul de hidróxido de sodio 1,4 M y se enfría a temperatura ambiente. A continuación, se determina la cantidad de azúcares reductores mediante la adición de 345 ul de reactivo de ácido dinitrosalicílico (DNS). Las muestras se incuban durante 10 minutos a 95 °C, 300 rpm. - aumento del espectro rojo-naranja (Miller, Analytical Chemistry 1959). A continuación, las muestras se centrifugan a 5.000 rpm, 30 segundos para recoger el condensado y se enfrían a temperatura ambiente. Se transfieren 800 ul de cada muestra a una placa de 96 pocillos profundos y se diluyen en agua destilada usando una pipeta multicanal. A continuación, se transfieren 200 ul con una pipeta multicanal a una placa Nunc F de 96 pocillos. La absorbancia a 560 nanómetros (nm) se lee usando un Tecan Infinite M1000
Mejora de GH5 con respecto a Frontia Fiberwash®
El ensayo de fibra fina de 15 ml se realiza a pH 4, incubando la fibra durante una hora a 40 °C con diferentes tratamientos enzimáticos. El control es la incubación de la fibra sin enzima. Frontia Fiberwash® es una enzima comercial usada para liberar el almidón de las fibras en un proceso de molienda húmeda. La mezcla GH5 consiste en un complejo completo de celulosa de Trichoderema reesei (80 %) y la xilanasa GH5 que tiene la secuencia de aminoácidos de la proteína madura de SEQ ID NO:8 (20 %). Todas las mezclas de enzimas se añadieron con un total de 500 microgramos de proteína enzimática por gramo de sólidos de fibra seca (ug/g de SS). Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. La absorbancia se leyó a 560 nm, y se convirtió en glucosa (g/l) usando un patrón de glucosa. La glucosa calculada se normalizó usando sólidos secos de la fibra y se informó como almidón liberado de la fibra. Los valores de absorbancia y la liberación de almidón de la fibra se informan en la Tabla 5.
Tabla 5:Resultados del ensa o de fibra de 15 ml
Ejemplo 5 - Diversidad de GH5
El ensayo de fibra fina de 15 ml se realiza a pH 4, incubando la fibra durante una hora a 40 °C con diferentes tratamientos enzimáticos en laTabla 6.El control es la incubación de la fibra sin enzima. Todas las mezclas de enzimas contenían 400 ug/g de SS deT. reesei(control). Se añadieron GH5 auxiliares a los tratamientos apropiados a 25 ug/g de SS como se indica en la Tabla 6.La absorbancia se leyó a 560 nm, y se convirtió en glucosa (g/l) usando un patrón de glucosa. La glucosa calculada se normalizó usando sólidos secos de la fibra y se informó como almidón liberado de la fibra. Los valores de absorbancia y la liberación de almidón de la fibra se informan en laTabla 7.
Tabla 7: Diversidad de GH5 probada
Tabla 8:Resultados de la diversidad de GH5

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para mejorar el rendimiento de almidón y/o rendimiento de gluten totales de granos de maíz en un proceso de molienda húmeda, en donde se aumenta la cantidad de almidón y/o gluten liberado de la fibra durante el proceso de molienda húmeda, comprendiendo el método las etapas de:
a) empapar los granos de maíz en agua para producir granos empapados;
b) triturar los granos empapados para producir granos empapados y triturados;
c) separar los gérmenes de los granos empapados y triturados para producir una masa de granos de maíz que comprenda fibra, almidón y gluten; y
d) someter la masa de granos de maíz resultante a un procedimiento de lavado de la fibra;
en donde dicha masa de grano de maíz se mezcla con dicha una o más enzimas hidrolíticas, seleccionadas del grupo que consiste en un polipéptido de xilanasa GH30, un polipéptido de xilanasa GH5, durante la etapa d).
2. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos granos de maíz o una fracción de dichos granos de maíz se dejan reaccionar con dicha una o más enzimas hidrolíticas durante al menos 15 minutos.
3. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicho procedimiento de lavado de la fibra comprende el uso de un sistema de lavado de la fibra optimizado para la introducción de una o más enzimas hidrolíticas y en donde el sistema de lavado de la fibra comprende un espacio configurado para proporcionar un tiempo de retención total en el sistema de lavado de la fibra de al menos 35 minutos y menos de 48 horas.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el tiempo de incubación en dicho espacio configurado en el sistema de lavado de la fibra es de al menos 5 minutos y menos de 48 horas.
5. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido GH5 se selecciona de un grupo que consiste en:
i) un polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 12;
ii) un polipéptido maduro que tiene al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de i)
iii) una subsecuencia de cualquiera de los polipéptidos maduros en i) y ii).
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido GH30 se selecciona de un grupo que consiste en:
i) un polipéptido maduro de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7;
ii) un polipéptido maduro que tiene al menos 80 % de identidad con el polipéptido maduro de i)
iii) una subsecuencia de cualquiera de los polipéptidos maduros en i) y ii).
7. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha composición enzimática que comprende una o más enzimas hidrolíticas comprende además una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en celulasas (EC 3.2.1.4), xilanasas (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55 (alfa-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidasas de extremo no reductor); celobiohidrolasa I (EC 3.2.1.150), celobiohidrolasa II (E.C. 3.2.1.91), celobiosidasa (E.C. 3.2.1.176), betaglucosidasa (E.C. 3.2.1.21), betaxilosidasas (E.C. 3.2.1.37) o proteasas (E.C. XXXX).
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la una o más enzimas hidrolíticas se expresan en un organismo con un acervo de celulasa, tal comoTrichoderma reesei.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad efectiva de una o más enzimas hidrolíticas mezcladas con una o más fracciones de dicha masa de granos de maíz es entre 0,005-0,5 kg de proteína enzimática/tonelada métrica de granos de maíz que entran en el proceso de molienda húmeda.
10. Uso de un polipéptido GH30 y/o un polipéptido GH5 en un método para mejorar el rendimiento de almidón y/o el rendimiento de gluten totales de granos de maíz en un proceso de molienda húmeda como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
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