ES2971466T3 - Combinación de un inhibidor de Mcl-1 y un tratamiento estándar de atención para cánceres hematológicos, usos y composiciones farmacéuticas de la misma - Google Patents

Abstract

Una combinación que comprende un inhibidor de Mcl-1 y un segundo agente anticancerígeno, en la que el segundo agente anticancerígeno se selecciona entre antraciclinas, citarabina y agentes hipometilantes, y composiciones y usos de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación de un inhibidor de Mcl-1 y un tratamiento estándar de atención para cánceres hematológicos, usos y composiciones farmacéuticas de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una combinación de un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico con un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas (tales como idarrubicina, daunorrubicina...), citarabina (también conocida como arabinósido de citosina o ara-C) y agentes hipometilantes (tales como decitabina, azacitidina...). La presente invención se refiere a una combinación de un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico con un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, citarabina, decitabina, azacitidina y guadecitabina, más particularmente idarrubicina, daunorrubicina, citarabina, decitabina y azacitidina. La invención también se refiere al uso de dicha combinación en el tratamiento del cáncer, en particular del cáncer hematológico, y más particularmente de la leucemia mieloide aguda (AML), los síndromes mielodisplásicos, la leucemia linfocítica aguda (ALL) y el linfoma. También se proporcionan formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración de tales combinaciones.

La presencia de múltiples mutaciones adquiridas dentro de múltiples clones en cada caso de AML hace que el concepto de focalización selectiva exitosa sea particularmente difícil. Esta invención propone el concepto de que los cánceres con composiciones moleculares diversas y multiclonales pueden tratarse con éxito con la combinación de un inhibidor de Mcl-1 y un fármaco citotóxico capaz de activar efectivamente la apoptosis celular de manera promiscua, conduciendo por ello a una muerte celular de amplia base de células cancerosas más allá de la lograda usando inhibidores de Mcl-1 o quimioterapia estándar de atención (SOC) por separado. Este enfoque podría conducir a mayores tasas de remisión y una mayor eliminación de la enfermedad residual mínima en el entorno de la quimioterapia de inducción y esto puede conducir a tasas reducidas de recaída de la enfermedad y tasas de curación generales más altas en AML como ejemplo. La AML se propone como ejemplo modelo debido a la capacidad de medir cuantitativamente cambios en la composición clonal en serie con tratamiento usando PCR digital y RT-qPCR.

Los inhibidores de Mcl-1 cuando se combinan con quimioterapia SOC de dosis bajas podrían mejorar la focalización de las células madre y progenitoras leucémicas al reducir el umbral apoptótico. Este enfoque podría usarse en el entorno posterior a la remisión como un enfoque de terapia de mantenimiento para eliminar las células madre residuales de AML y los clones de células madre preleucémicas compuestos por diversas anomalías moleculares y citogenéticas. El principio de demostrar la erradicación de progenitores leucémicos y preleucémicos se demostrará reduciendo los niveles de enfermedad residual mínima clonal o clones preleucémicos medidos en células mononucleares diferenciadas en el entorno posterior a la remisión después de la exposición a inhibidores de Mcl-1 en combinación con quimioterapia SOC.

Antecedentes de la invención

La apoptosis es una vía de muerte celular altamente regulada que se inicia mediante diversos estímulos citotóxicos, que incluyen el estrés oncogénico y los agentes quimioterapéuticos. Se ha mostrado que la evasión de la apoptosis es una característica del cáncer y que la eficacia de muchos agentes quimioterapéuticos depende de la activación de la vía mitocondrial intrínseca. Tres subgrupos distintos de las proteínas de la familia Bcl-2 controlan la vía de apoptosis intrínseca: (i) las proteínas proapoptóticas BH3 (la homología 3 de Bcl-2); (ii) los miembros pro-supervivencia tales como el propio Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w, Mcl-1 y Bcl-2a1; y (iii) las proteínas efectoras proapoptóticas BAX y BAK (Czabotar et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2014, 15, 49-63). La sobreexpresión de los miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2 se observa en muchos cánceres, particularmente en neoplasias malignas hematológicas tales como el linfoma de células del manto (MCL), el linfoma folicular/linfoma difuso de células B grandes (FL/DLCL) y el mieloma múltiple (Adams and Cory, Oncogene 2007, 26, 1324-1337). La inhibición farmacológica de las proteínas antiapoptóticas Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-w y Mcl-1 por los fármacos miméticos de BH3 recientemente desarrollados como ABT-199 (venetoclax), ABT-263 (navitoclax) y S63845 ha surgido como estrategia terapéutica para inducir la apoptosis y provocar la regresión tumoral en el cáncer (Zhang et al., Drug Resit. Updat. 2007, 10, 207-217; Kotschy et al., Nature 2016, 538, 477-482; Merino et al. Sci. Transl. Med. 2018, 9, eaam7049). Sin embargo, se han observado mecanismos de resistencia a los miméticos de BH3 (Choudhary et al., Cell Death and Disease 2015, 6 , e1593) y el uso de terapias combinadas podría mejorar la eficacia y retrasar o incluso anular el desarrollo de resistencia (Merino et al. Sci. T ransl. Med. 2018, 9, eaam7049).

La leucemia mieloide aguda (AML) es un cáncer de la sangre rápidamente mortal que surge de la transformación clonal de células madre hematopoyéticas que da como resultado parálisis de la función normal de la médula ósea y muertes debido a complicaciones de pancitopenia profunda. La AML representa el 25% de todas las leucemias en adultos, con las tasas de incidencia más altas en los Estados Unidos, Australia y Europa (OMS. GLOBOCAN 2012. Incidencia, mortalidad y prevalencia estimadas del cáncer en todo el mundo en 2012. Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer). A nivel mundial, se diagnostican aproximadamente 88.000 nuevos casos anualmente. La AML sigue teniendo la tasa de supervivencia más baja de todas las leucemias, con una supervivencia esperada a 5 años de sólo el 24%.

Las terapias actuales para el tratamiento de AML incluyen la administración de citarabina sola o en combinación con una antraciclina tal como daunorrubicina o idarrubicina. El tratamiento con citarabina en dosis bajas y agentes desmetilantes tales como azacitidina y decitabina también se recomiendan como opciones de baja intensidad para pacientes que no son elegibles para quimioterapia intensiva (Dohner et al., DOI l0.1182/blood-2016-08-733196). Aunque la terapia estándar para la leucemia mieloide aguda (citarabina en combinación con antraciclinas) se concibió hace más de cuatro décadas, la introducción de terapias dirigidas exitosas para esta enfermedad sigue siendo un objetivo difícil de alcanzar. El concepto de terapia dirigida en la AML se ha visto obstaculizado por la comprensión de que esta enfermedad evoluciona como una jerarquía multiclonal, con un rápido crecimiento de subclones leucémicos como una de las principales causas de resistencia a los fármacos y recaída de la enfermedad (Ding et al., Nature 2012, 481, 506-510). Investigaciones clínicas recientes han demostrado la eficacia de los inhibidores de Bcl-2 en el tratamiento de AML (Konopleva et al., American Society of Hematology 2014, 118) mientras que se están realizando varios ensayos clínicos para evaluar los inhibidores de Bcl-2 en combinación con quimioterapia SOC (Levy et al., Expert Opinion on Investigational Drugs 2017, 26, 293-301). Recientemente, se especuló que el uso del inhibidor de Mcl-1 con otros agentes anticáncer conduciría a una mayor eficiencia (Letai, Cancer Cell 2016, 30, 834-835)

Sigue existiendo la necesidad de nuevos tratamientos y terapias para el tratamiento del cáncer hematológico, en particular AML, síndromes mielodisplásicos, ALL y linfoma, y más particularmente para el tratamiento de AML. La presente invención proporciona una nueva combinación de un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2 trifluoroetil)-1H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico y un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, y más preferiblemente idarrubicina, daunorrubicina, citarabina, decitabina y azacitidina. Los resultados muestran que el inhibidor de Mcl-1 en combinación con un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de idarrubicina, citarabina y decitabina, interactúa sinérgicamente en líneas celulares de AML (Figura 1; Tablas 3, 4 y 5). También mostramos que la combinación de un inhibidor de Mcl-1 con un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de idarrubicina o decitabina, exhibe una actividad proapoptótica sinérgica en muestras de AML primaria humana (Figuras 2 y 6 ; Tabla 6). También mostramos que un subconjunto de muestras de AML primaria era sensible a la combinación de un inhibidor de Mcl-1 con citarabina, mientras que las células progenitoras CD34+ humanas normales eran resistentes a la misma dosis (Figura 3). También mostramos que el inhibidor de Mcl-1 combinado con decitabina fue bien tolerado sin perder peso durante el tratamiento y, aún así, conduce a una mayor actividad contra la AML humana en un modelo de xenoinjerto derivado de un pacientein vivo(Figuras 4, 5 y 6). Finalmente, mostramos que la combinación de un inhibidor de Mcl-1 con citarabina podría proporcionar beneficios al tratamiento de pacientes con ALL (Tabla 7).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una combinación que comprende:

(a) un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1-(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico, y

(b) un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para uso simultáneo, secuencial o por separado.

Dichos inhibidores de Mcl-1, su síntesis, su uso en el tratamiento del cáncer y formulaciones farmacéuticas de los mismos, se describen en los documentos WO 2015/097123, WO 2016/207216, WO 2016/207217, WO 2016/207225, WO 2016/207226, y WO 2017/125224.

En una primera realización, la invención proporciona una combinación que comprende:

(a) Compuesto 1: ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y

(b) un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para uso simultáneo, secuencial o por separado.

Alternativamente, la invención proporciona una combinación que comprende:

(a) Compuesto 2: ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y

(b) un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para uso simultáneo, secuencial o por separado.

En una realización particular, el segundo agente anticáncer es una antraciclina seleccionada de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, más particularmente, idarrubicina y daunorrubicina, incluso más particularmente, idarrubicina.

En una realización particular, el segundo agente anticáncer es un agente hipometilante seleccionado de decitabina, azacitidina y guadecitabina, más particularmente, decitabina y azacitidina, incluso más particularmente, decitabina.

En una realización particular, el segundo agente anticáncer es idarrubicina, daunorrubicina, citarabina, decitabina y azacitidina, más preferiblemente, idarrubicina, citarabina y decitabina.

En otra realización, la invención proporciona una combinación como se describe aquí, para uso en el tratamiento del cáncer, más particularmente, el tratamiento del cáncer hematológico. Se prefiere particularmente el tratamiento de AML, síndromes mielodisplásicos, leucemia linfocítica aguda y linfoma. Más particularmente, se prefiere el tratamiento de AML.

En otra realización, la invención proporciona un medicamento que contiene, por separado o juntos,

(a) un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1-(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico, y

(b) un segundo agente anticáncer, en el que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para administración simultánea, secuencial o separada, y en el que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades efectivas para el tratamiento del cáncer.

En otra realización, el inhibidor de Mcl-1 es ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico (Compuesto 1).

En otra realización, el inhibidor de Mcl-1 es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico (Compuesto 2).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra un efecto de inhibición del crecimiento celular ejemplar y matrices de combinación de sinergia para la inhibición del crecimiento celular (izquierda) y la inhibición excesiva de Loewe (derecha) proporcionada por el Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1) en combinación con idarrubicina en la línea celular de AML OCI-AML3 en dos experimentos independientes. Los valores en la matriz de efectos varían de 0 (sin inhibición) a 100 (inhibición total). Los valores en la matriz de sinergia representan el grado de inhibición del crecimiento en exceso de la aditividad teórica calculada en base a las actividades de agente único del Compuesto 2 y la idarrubicina a las concentraciones ensayadas.

La Figura 2 ilustra que la combinación de un inhibidor de Mcl-1 con idarrubicina tiene actividad sinérgica en la AML. Se incubaron una serie de muestras de AML primaria de pacientes con diversas características citogenéticas y moleculares durante 48 horas con el Compuesto 2 o idarrubicina solos, o en combinación y se determinó el efecto letal LC<50>. Este mostró una sinergia sustancial de esta combinación en una gran proporción de muestras de AML primaria.

La Figura 3 ilustra una actividad de comparación frente a muestras de AML primaria en relación con células de donante CD34+ sanas para citarabina, el Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1) y el Compuesto 2 en combinación con citarabina. Se muestra la viabilidad de las células de AML primaria y de las células CD34+ normales (línea gris) normalizadas con respecto al vehículo control después de la exposición a citarabina, al Compuesto 2 y al Compuesto 2 en combinación con citarabina (en nM).

La Figura 4 ilustra el mantenimiento del peso corporal normal durante la terapia. Se trataron ratones NSG con inyección IP de 0.4 mg/kg o 0.8 mg/kg de decitabina o 0.4 mg/kg o 0.8 mg/kg de decitabina en combinación con el Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1) 25 mg/kg (IV) durante 1 semana.

La Figura 5 ilustra la toxicidad hematológica en ratones NSG durante la terapia. Se trataron ratones NSG con inyección IP de 0.4 mg/kg o 0.8 mg/kg de decitabina o 0.4 mg/kg o 0.8 mg/kg de decitabina en combinación con el Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1) 25 mg/kg (IV) durante 1 semana y se determinó el recuento de glóbulos blancos (WBC), plaquetas, hemoglobina (Hb) y glóbulos rojos (RBC) usando el analizador de sangre Hemavet.

La Figura 6 ilustra la eficacia superior de decitabina en combinación con el Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1) en comparación con cualquiera de los agentes solos. Se trasplantaron ratones NRG-SG3 con 10<6>células primarias de AML (AML54). El injerto se confirmó a las 6 semanas mediante la detección de hCD45 en sangre periférica. Luego se trataron cohortes de ratones con a) vehículo, b) Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1) 25 mg/kg IV (x 2 días), c) decitabina 0.4 mg/kg/d por IP (x 5 días) o d) combinación del Compuesto 2 decitabina. Los ratones fueron sacrificados el día 8 después del tratamiento y se evaluó la carga leucémica mediante tinción con citometría de flujo de fémures lavados que muestra el porcentaje de células CD45+ humanas, después de los tratamientos indicados.

Descripción detallada de la invención

Por lo tanto, la invención proporciona en la Realización E1, una combinación que comprende:

(a) un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1-(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico, y

(b) un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para uso simultáneo, secuencial o por separado.

Se describen aquí realizaciones (E) enumeradas adicionales de la invención. Se reconocerá que las características especificadas en cada realización se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invención.

E2. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer es una antraciclina seleccionada de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, más particularmente, idarrubicina y daunorrubicina, incluso más particularmente, idarrubicina.

E3. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer es un agente hipometilante seleccionado de decitabina, azacitidina y guadecitabina, más particularmente, decitabina y azacitidina, incluso más particularmente, decitabina.

E4. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de idarrubicina, daunorrubicina, citarabina, decitabina y azacitidina.

E5. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer es idarrubicina.

E6. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer es citarabina.

E7. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer es decitabina.

E8. Una combinación según E1, en la que el segundo agente anticáncer es azacitidina.

E9. Una combinación según cualquiera de E1 a E8, en la que el inhibidor de Mcl-1 es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-ácido pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico.

E10. Una combinación según cualquiera de E1 a E8 , en la que el inhibidor de Mcl-1 es ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico.

E11. Una combinación según E1, que comprende:

(a) un inhibidor de Mcl-1 seleccionado de ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1-(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico, y

(b) un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de idarrubicina, citarabina, decitabina y azacitidina,

para uso simultáneo, secuencial o separado.

E12. Una combinación según E10 o E11, en la que la dosis de ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico durante el tratamiento combinado es de 25 mg a 1500 mg.

E13. Una combinación según E10, E11 o E12, en la que el ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico se administra durante el tratamiento combinado una vez a la semana.

E14. Una combinación según cualquiera de E1 a E13, en la que el inhibidor de Mcl-1 se administra oralmente. E15. Una combinación según cualquiera de E1 a E13, en la que el inhibidor de Mcl-1 se administra intravenosamente. E16. Una combinación según cualquiera de E1 a E15, para uso en el tratamiento del cáncer.

E17. Una combinación según E16 en la que el cáncer es leucemia mieloide aguda.

E18. Una combinación según E16 en la que el cáncer es leucemia linfocítica aguda.

E19. La combinación para uso según cualquiera de E16 a E18, en la que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades que son terapéuticamente efectivas en conjunto para el tratamiento del cáncer.

E20. La combinación para uso según E19, en la que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades que son sinérgicamente efectivas para el tratamiento del cáncer.

E21. La combinación para uso según E20, en la que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades sinérgicamente efectivas que permiten una reducción de la dosis requerida para cada compuesto en el tratamiento del cáncer, proporcionando al mismo tiempo un tratamiento eficaz contra el cáncer, finalmente con una reducción de los efectos secundarios.

E22. Una combinación según cualquiera de E1 a E15, para uso en el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en pacientes que alcanzan la remisión.

E23. Una combinación según cualquiera de E1 a E22, que comprende además uno o más excipientes.

E24. Una combinación según E1, que comprende además un tercer agente anticáncer.

E25. Una combinación según E24 en la que el segundo agente anticáncer es citarabina y el tercer agente anticáncer es daunorrubicina o idarrubicina.

E26. Un medicamento que contiene, por separado o juntos,

(a) un inhibidor de Mcl-1 como se define en E1, y

(b) un segundo agente anticáncer, en el que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para administración simultánea, secuencial o separada, y en el que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades efectivas para el tratamiento del cáncer.

E27. El medicamento según E26, en el que el segundo agente anticáncer se selecciona de idarrubicina, daunorrubicina, citarabina, decitabina y azacitidina.

"Combinación" se refiere a una combinación de dosis fija en una forma de dosificación unitaria (por ejemplo, cápsula, comprimido o bolsita), combinación de dosis no fija, o un kit de partes para la administración combinada en la que un compuesto de la presente invención y uno o más compañeros de combinación (por ejemplo, otro fármaco como se explica a continuación, también denominado "agente terapéutico" o "coagente") pueden administrarse de forma independiente al mismo tiempo o por separado dentro de intervalos de tiempo, especialmente cuando estos intervalos de tiempo permitan que los compañeros de combinación muestren un efecto cooperativo, p. ej., sinérgico.

Los términos "coadministración" o "administración combinada" o similares tal como se utilizan aquí pretenden incluir la administración del compañero de combinación seleccionado a un único sujeto que lo necesita (p. ej. un paciente), y se pretende que incluyan regímenes de tratamiento en los que los agentes no se administran necesariamente por la misma vía de administración o al mismo tiempo.

La expresión "combinación de dosis fija" quiere decir que los ingredientes activos, p. ej., un compuesto de fórmula (I) y uno o más compañeros de combinación se administran ambos a un paciente simultáneamente en forma de una única entidad o dosificación.

La expresión "combinación de dosis no fija" quiere decir que los ingredientes activos, p. ej., un compuesto de la presente invención y uno o más compañeros de combinación, se administran ambos a un paciente como entidades separadas ya sea simultánea o secuencialmente, sin límites de tiempo específicos, en la que dicha administración proporciona niveles terapéuticamente efectivos de los dos compuestos en el cuerpo del paciente. Esto último también se aplica a la terapia cóctel, p. ej., la administración de tres o más ingredientes activos.

"Cáncer" quiere decir una clase de enfermedad en la que un grupo de células muestra un crecimiento descontrolado. Los tipos de cáncer incluyen cánceres hematológicos que incluyen la leucemia mieloide aguda, los síndromes mielodisplásicos, la leucemia linfocítica aguda y el linfoma. Los tipos de cáncer también incluyen tumores sólidos que incluyen carcinoma, sarcoma o blastoma.

La expresión "terapéuticamente efectiva conjuntamente" quiere decir que los agentes terapéuticos pueden administrarse por separado (de manera escalonada cronológicamente, especialmente de una manera específica de secuencia) en intervalos de tiempo tales que ellos prefieran, en el animal de sangre caliente, especialmente en el ser humano, ser tratados, todavía muestran una interacción (preferiblemente sinérgica) (efecto terapéutico conjunto). Si este es el caso, entre otros, se puede determinar siguiendo los niveles en sangre, que muestran que ambos compuestos están presentes en la sangre del ser humano a tratar al menos durante ciertos intervalos de tiempo.

"Fármaco estándar de atención" o "quimioterapia estándar de atención" quiere decir idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, citarabina, decitabina, guadecitabina o azacitidina. En particular, "fármaco estándar de atención" o quimioterapia "estándar de atención" quiere decir idarrubicina, daunorrubicina, citarabina, decitabina o azacitidina.

"Sinérgicamente efectivo" o "sinergia" quiere decir que el efecto terapéutico observado tras la administración de dos o más agentes es mayor que la suma de los efectos terapéuticos observados tras la administración de cada agente individual.

Como se usa aquí, el término "tratar", "que trata" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refiere en una realización, a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, retardar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluidos aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización más, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico), o ambos.

Tal como se usa aquí un sujeto “necesita” un tratamiento si dicho sujeto se beneficiaría biológica, médicamente o en calidad de vida de dicho tratamiento".

El término "remisión" se refiere a una disminución o desaparición de los signos y síntomas del cáncer.

En otro aspecto que no se reivindica, se proporciona un método para sensibilizar a un ser humano que es (i) refractario a al menos un tratamiento de quimioterapia, o (ii) en recaída después del tratamiento con quimioterapia, o ambos (i) y (ii), en el que el método comprende administrar al paciente un inhibidor de Mcl-1 en combinación con un segundo agente anticáncer, como se describe aquí. Un paciente que está sensibilizado es un paciente que responde al tratamiento que implica la administración de un inhibidor de Mcl-1 en combinación con un segundo agente anticáncer, como se describe aquí, o que no ha desarrollado resistencia a dicho tratamiento.

"Medicamento" quiere decir una composición farmacéutica, o una combinación de varias composiciones farmacéuticas, que contiene uno o más ingredientes activos en presencia de uno o más excipientes.

"AML" quiere decir leucemia mieloide aguda.

'ALL' quiere decir leucemia linfocítica aguda.

En las composiciones farmacéuticas según la invención, la proporción de ingredientes activos en peso (peso de ingredientes activos sobre el peso total de la composición) es de 5 a 50%.

Entre las composiciones farmacéuticas según la invención se usarán más especialmente aquellas que sean adecuadas para la administración por vía oral, parenteral y especialmente intravenosa, per- o trans-cutánea, nasal, rectal, perlingual, ocular o respiratoria, más específicamente comprimidos, grageas, comprimidos sublinguales, cápsulas de gelatina dura, glossettes, cápsulas, pastillas para chupar, preparaciones inyectables, aerosoles, colirios para los ojos o la nariz, supositorios, cremas, pomadas, geles dérmicos, etc.

Las composiciones farmacéuticas según la invención comprenden uno o más excipientes o vehículos seleccionados de diluyentes, lubricantes, aglutinantes, agentes de desintegración, estabilizantes, conservantes, absorbentes, colorantes, edulcorantes, saborizantes, etc.

A modo de ejemplo no limitativo se pueden mencionar:

♦ como diluyentes; lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa, glicerol,

♦ como lubricantes; sílice, talco, ácido esteárico y sus sales de magnesio y calcio, polietilenglicol,

♦ como aglutinantes; silicato de aluminio y magnesio, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y polivinilpirrolidona,

♦ como desintegrantes; agar, ácido algínico y su sal sódica, mezclas efervescentes.

Los compuestos de la combinación pueden administrarse simultánea o secuencialmente. La vía de administración es preferiblemente la infusión o inyección intravenosa, y las composiciones farmacéuticas correspondientes pueden permitir la liberación instantánea o retardada de los principios activos. Los compuestos de la combinación pueden además administrarse en forma de dos composiciones farmacéuticas separadas, que contienen cada una de las sustancias activas, o en forma de una única composición farmacéutica, en la que los principios activos están mezclados.

El régimen de dosificación útil varía según el sexo, la edad y el peso del paciente, la vía de administración, la naturaleza del cáncer y de cualquier tratamiento asociado y varía de 25 mg a 1500 mg de inhibidor de Mcl-1 por semana, más preferiblemente de 50 mg a 1400 mg por semana. La dosis del segundo agente anticáncer, como se describe aquí, será la misma que la usada cuando se administra solo.

Datos farmacológicos

Ejemplo 1: efecto in vitro sobre la proliferación de la combinación de inhibidores de Mcl-1 con idarrubicina, citarabina y decitabina en líneas celulares de leucemia mieloide aguda (AML)

Material y método

Las líneas celulares se obtuvieron y mantuvieron en los medios básicos suplementados con FBS como se indica en la Tabla 1. Además, todos los medios contenían penicilina (100 Ul/ml), estreptomicina (100 pg/ml) y L-glutamina (2 mM).

Las líneas celulares se cultivaron a 37°C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO<2>y se expandieron en matraces T-150. En todos los casos, las células se descongelaron de reservas congeladas, se expandieron por medio de > 1 paso usando diluciones apropiadas, se contaron y se evaluó su viabilidad usando un contador de células CASY antes de sembrar 150 pL/pocillo a las densidades indicadas en la Tabla 1 en placas de 96 pocillos. Se determinó que todas las líneas celulares estaban libres de contaminación interna por micoplasma. Se prepararon disoluciones madre de compuestos a una concentración de 5 mM en DMSO y se almacenaron a -20°C.

Para analizar la actividad de los compuestos como agentes únicos, se sembraron células y se trataron con nueve diluciones en serie dos veces de cada compuesto dispensadas individualmente directamente en las placas de ensayo celular. Los efectos de los compuestos sobre la viabilidad celular se evaluaron después de 3 días de incubación a 37°C/5% CO<2>mediante cuantificación de los niveles de ATP celular usando CellTiterGlo a 75 pl de reactivo/pocillo. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. La luminiscencia se cuantificó en un lector de placas multipropósito. Se calcularon las IC<50>de un solo agente usando el ajuste de curvas estándar de cuatro parámetros. IC<50>se define como la concentración del compuesto a la que la señal CTG se reduce al 50% de la medida para el vehículo (DMSO) control (Tabla 2).

Para analizar la actividad de los compuestos en combinación con citarabina (Tabla 3), idarrubicina (Tabla 4) y decitabina (Tabla 5), se sembraron células y se trataron con siete u ocho diluciones en serie 3.16 veces de cada compuesto dispensado, ya sea individualmente o en todas las permutaciones posibles en forma de tablero de ajedrez, directamente en las placas de ensayo celular como se indica en la Figura 1. Los efectos de los agentes individuales, así como sus combinaciones de tablero de ajedrez, sobre la viabilidad celular se evaluaron después de 3 días de incubación a 37°C/5% CO2<2>mediante cuantificación de los niveles de ATP celular usando CellTiterGlo a 75 pl de reactivo/pocillo. Se realizaron dos experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. La luminiscencia se cuantificó en un lector de placas multipropósito.

Las potenciales interacciones sinérgicas entre combinaciones de compuestos se evaluaron usando la matriz 2D de exceso de inhibición según el modelo de aditividad de Loewe y se dan como puntuación de sinergia (Lehar et al., Nature Biotechnology 2009, 27(7), 659-66). Todos los cálculos se realizaron usando Chalize<™>Bioinformatics Software disponible en el sitio web de Horizon. El tiempo de duplicación indicado en la Tabla 1 es la media del tiempo de duplicación obtenido en los diferentes pases (en matraces T-150) realizados desde la descongelación de las células hasta su siembra en las placas de 96 pocillos.

Puntuación de sinergia

SS ~ 0 ^ Aditivo

SS > 1 ^ Sinergia débil

SS >2 ^ Sinergia

Tabla 1.Condiciones de identidad y ensayo para las 13 líneas celulares de AML usadas en los experimentos de combinación.

Tabla 2.Se indican los valores de IC<50>de un solo agente para el Compuesto 1, el Compuesto 2, citarabina, idarrubicina y decitabina en 13 líneas celulares de AML.

Tabla 3.Puntuaciones de sinergia para inhibidores de Mcl-1 en combinación con citarabina en las líneas celulares de AML indicadas. Las interacciones se consideraron sinérgicas cuando se observaron puntuaciones > 2.0. Se indican las concentraciones iniciales de los compuestos, la media de la inhibición máxima y la desviación estándar (sd) de las puntuaciones de sinergia.

Tabla 4.Puntuaciones de sinergia para inhibidores de Mcl-1 en combinación con idarrubicina, en las líneas celulares de AML indicadas. Las interacciones se consideraron sinérgicas cuando se observaron puntuaciones > 2.0. Se indican las concentraciones iniciales de los compuestos, la media de la inhibición máxima y la desviación estándar (sd) de las puntuaciones de sinergia.

Tabla 5.Puntuaciones de sinergia para inhibidores de Mcl-1 en combinación con decitabina en las líneas celulares de AML indicadas. Las interacciones se consideraron sinérgicas cuando se observaron puntuaciones > 2.0. Se indican las concentraciones iniciales de los compuestos, la media de la inhibición máxima y la desviación estándar (sd) de las puntuaciones de sinergia.

Resultados

Se evaluó el efecto sobre la proliferación de combinar los inhibidores de Mcl-1 de la invención con citarabina, idarrubicina y decitabina en un panel de 13 líneas celulares de AML. Los inhibidores de Mcl-1 como agentes únicos inhibieron fuertemente el crecimiento de la mayoría de las 13 líneas de AML analizadas (valores IC<50>de 1 nM a 2.2 pM - Tabla 2). En combinación con los fármacos estándar de atención citarabina, idarrubicina y decitabina, se observó una inhibición sinérgica del crecimiento (es decir, puntuaciones de sinergia superiores a 2 (Lehar et al., 2009)) para la mayoría de las líneas celulares analizadas (Tablas 3, 4 y 5). ). Estos datos indican que la combinación de inhibidores de Mcl-1 con los fármacos estándar de atención para el tratamiento del cáncer hematológico podría brindar beneficios al tratamiento de pacientes con AML.

Ejemplo 2: actividad proapoptótica sinérgica de combinar inhibidores de Mcl-1 con idarrubicina en muestras de a Ml humana primaria

Material y método: células de paciente con AML.

Se recogieron muestras de médula ósea de pacientes con AML después del consentimiento informado de acuerdo con las pautas aprobadas por el Alfred Hospital Human Research Ethics Committee.

Las células mononucleares se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Australia) y la lisis de glóbulos rojos se realizó usando NH<4>Cl 0.156 M, Tris-HCl 0.017 M, pH 7.2 como se describió anteriormente (Rijal et al., Blood 2015, 125, 2815-2824). Luego, las células se resuspendieron en disolución salina tamponada con fosfato que contenía suero fetal bovino al 2% (FBS; Sigma, Australia). Luego se suspendieron las células mononucleares en medio RPMI-1640 (GIBCO, Australia) que contenía penicilina y estreptomicina (GIBCO) y suero bovino fetal inactivado por calor al 15% (Sigma). Las células se lavaron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía FBS al 2% antes de su uso.

Ensayos de viabilidad celular.

Las células mononucleares recién purificadas de muestras de pacientes con AML se ajustaron a una concentración de 2.5 x 10<5>/ml y se alicuotaron 100 pl de células por pocillo en placas de 96 pocillos (Sigma). Luego se trataron las células con idarrubicina y el Compuesto 2 en un intervalo de concentración de 5 log de 1 nM a 10 pM durante 48 horas. Para los ensayos de combinaciones, los fármacos se añadieron en una relación de 1:1 de 1 nM a 10 pM y las células se incubaron a 37°C y 5% de CO<2>. Luego, las células se tiñeron con tinción de ácido nucleico azul Sytox (Invitrogen, Australia) y se midió la fluorescencia mediante análisis de citometría de flujo usando el LSR-II Fortessa (Becton Dickinson, Australia). Se usó el software FACSDiva para la recogida de datos y el software FlowJo para el análisis. Las células blásticas se bloquearon usando propiedades de dispersión frontal y lateral. Las células viables excluyendo el azul Sytox se determinaron a 6 concentraciones para cada fármaco y se determinó la concentración letal del 50% (LC<50>, en pM).

Tabla 6.Actividad proapoptótica singérgica en muestras de AML primaria

Resultados

El efecto sobre la supervivencia de combinar los inhibidores de Mcl-1 de la invención con idarrubicina se evaluó en varias muestras de AML humana primaria (Figura 2; Tabla 6). Incluso si varias muestras son sensibles a los inhibidores de Mcl-1 y a los fármacos estándar de atención para el tratamiento de AML como monoterapia, un mayor número de muestras en las que la monoterapia es inefectiva o poco efectiva son sinérgicamente sensibles a la combinación de inhibidores de Mcl-1 con fármacos estándar de atención para el tratamiento del cáncer hematológico que muestran que la combinación podría brindar beneficios al tratamiento de pacientes con AML.

Ejemplo 3: los blastos leucémicos mostraron una mayor sensibilidad a los inhibidores de Mcl-1 combinados con citarabina que los precursores hematopoyéticos CD34+

Material y método: ensayos de colonias

Los ensayos de formación de colonias se realizaron en fracciones mononucleares recién purificadas y congeladas de pacientes con AML.

Las células primarias se cultivaron por duplicado en placas de 35 mm (Griener-bio, Alemania) a de 1 x 104 a 1x105. Las células se sembraron en agar al 0.6% (Difco, Australia): AIMDM 2x (IMDM en polvo-Invitrogen, suplementado con NaHCÜ3, dextrano, Pen/Strep, mercaptoetanol B y asparagina): suero fetal bovino (Sigma) en una relación de 2:1:1. Para condiciones de crecimiento óptimas, todas las placas contenían GM-CSF (100 ng por placa), IL-3 (100 ng/placa R&D Systems, EE. UU.), SCF (100 ng/placa R&D Systems) y EPO (4 U/placa). El crecimiento fue durante 2-3 semanas en presencia y ausencia del fármaco a 37°C al 5% de CO2 en una incubadora de alta humedad. Después de la incubación, las placas se fijaron con glutaraldehído al 2.5% en disolución salina y se puntuaron usando el GelCount de Oxford Optronix (Abingdon, Reino Unido).

Resultados

En los ensayos clonogénicos, un subconjunto de muestras de AML primaria y células progenitoras CD34+ humanas normales fueron resistentes al Compuesto 2100 nM. Por el contrario, los fármacos estándar de atención, tales como citarabina 10 nM, fueron tóxicos para el crecimiento clonogénico de enfermedades leucémicas y células progenitoras normales. Finalmente, un subconjunto de muestras de AML primaria fue sensible al Compuesto 2 citarabina 10 nM, mientras que las células progenitoras CD34+ humanas normales se vieron menos afectadas por esta dosis (Figura 3).

Ejemplo 4: el inhibidor de Mcl-1 combinado con decitabina es bien tolerado in vivo

Para determinar la tolerabilidad del Compuesto 2 en combinación con decitabina, se trataron ratones NSG con:

a) inyección IP de decitabina 0.4 mg/kg o 0.8 mg/kg, o

b) decitabina 0.4 mg/kg o 0.8 mg/kg en combinación con el Compuesto 2 25 mg/kg (IV), durante 1 semana y se determinaron recuentos de glóbulos blancos (WBC), plaquetas, hemoglobina (Hb), glóbulos rojos (RBC) usando el analizador de sangre Hemavet.

El Compuesto 2 combinado con decitabina fue bien tolerado (Figura 5) y los ratones no perdieron peso durante el tratamiento (Figura 4).

En conjunto, los Ejemplos 2, 3 y 4 muestran que la combinación de un inhibidor de Mcl-1 y un fármaco estándar de atención para el tratamiento del cáncer hematológico es un enfoque novedoso para tratar en particular AML, sin necesidad de quimioterapia adicional y con una ventana de seguridad terapéutica aceptable.

Ejemplo 5: el inhibidor de Mcl-1 combinado con decitabina inhibe sinérgicamente PDX de AML in vivo

Material y método

Se inyectaron intravenosamente blastos leucémicos de médula ósea de la muestra de paciente con AML AML54 en ratones NOD--IL2Rycnull (NRG) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, EE. UU.) para su expansión. Se monitorizó el desarrollo de leucemia en los ratones NRG-SG3 mediante análisis de citometría de flujo de sangre periférica para células humanas CD45 positivas (hCD45+). Para establecer modelos de ratón de AML primaria de pacientes, se inyectaron 1 x 106 blastos leucémicos en ratones NRG-SG3 mediante inyección en la vena de la cola y se monitorizó la progresión de la leucemia en los animales mediante análisis de citometría de flujo de sangre periférica para detectar células hCD45+. Se usaron recuentos de células hCD45+ en la médula ósea de los fémures de animales sacrificados para determinar el grado de infiltración de la leucemia. Las células de la médula ósea se extrajeron lavando los fémures en PBS suplementado con suero bovino fetal al 2%. Para determinar la eficacia en la AML, se trataron cohortes de ratones con vehículo control, decitabina (0.4 mg/kg) diariamente IP durante 5 días, inyección IV dos veces por semana con el Compuesto 2 (inhibidor de Mcl-1,25 mg/kg) o decitabina en combinación. con el Compuesto 2. La eficacia del fármaco se determinó mediante análisis de citometría de flujo de células hCD45+ en médula ósea aislada de fémures de ratones en vehículo.

Resultados

Como se muestra en la Figura 6 , hubo una disminución notable en el número de células de AML humana en ratones tratados con decitabina en combinación con el Compuesto 2, representando las células hCD45+ menos del 9% de los leucocitos de la médula ósea. Estos resultados indican que la combinación de un inhibidor de Mcl-1 y un fármaco estándar de atención para el tratamiento del cáncer hematológico mata efectivamente la mayor parte de células blásticas de AML humana en el modelo PDX de AML54.

Ejemplo 6: actividad proapoptótica sinérgica de la combinación de inhibidores de Mcl-1 con fármacos estándar de atención en muestras de ALL primaria humana

Material y método: muestras de paciente con ALL primaria.

Se recogieron muestras de médula ósea o sangre periférica de pacientes con ALL después del consentimiento informado de acuerdo con las pautas aprobadas por el Alfred Hospital Human Research Ethics Committee. Las células mononucleares se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Australia), seguida del agotamiento de los glóbulos rojos en tampón de lisis de cloruro de amonio (NH4Cl) a 37°C durante 10 minutos. Luego, las células se resuspendieron en disolución salina tamponada con fosfato que contenía suero fetal bovino al 2% (Sigma, Australia). Luego se suspendieron las células mononucleares en medio RPMI-1640 (GIBCO, Australia) que contenía penicilina y estreptomicina (GIBCO) y suero bovino fetal inactivado por calor al 15% (Sigma).

Viabilidad celular

Las células mononucleares recién purificadas de muestras de pacientes con ALL se ajustaron a una concentración de 2.5 x 105/ml y se alicuotaron 100 pl de células por pocillo en placas de 96 pocillos (Sigma). Luego, las células se trataron con los fármacos indicados en un intervalo de concentración de 6 log de 1 nM a 10 pM durante 48 horas. Para los ensayos de combinaciones, los fármacos se añadieron en una relación de 1:1 de 1 nM a 10 pM y se incubaron a 37°C con 5% de CO<2>. Luego, las células se tiñeron con tinción de ácido nucleico azul sytox (Invitrogen, Australia) y se midió la fluorescencia mediante análisis de citometría de flujo usando el LSR-II Fortessa (Becton Dickinson, Australia). Se usó el software FACSDiva para la recogida de datos y el software FlowJo para el análisis. Las células blásticas se bloquearon usando propiedades de dispersión frontal y lateral. Las células viables excluyendo el azul sytox se determinaron a 6 concentraciones para cada fármaco y se determinó la concentración letal del 50% (LC<50>, en gM).

Tabla 7. Actividad proapoptótica singérgica en muestras de ALL primaria

Resultados

El efecto sobre la supervivencia de combinar los inhibidores de Mcl-1 de la invención con citarabina se evaluó en varias muestras de LLA primaria humana (Tabla 7). Incluso si varias muestras son sensibles a los inhibidores de Mcl-1 y a los fármacos estándar de atención para el tratamiento de la ALL como monoterapia, un mayor número de muestras en las que la monoterapia es inefectiva o poco efectiva son sinérgicamente sensibles a la combinación de inhibidores de Mcl-1 con fármacos estándar de atención para el tratamiento del cáncer hematológico que muestran que la combinación podría brindar beneficios para el tratamiento de pacientes con ALL.

Ejemplo 7: el inhibidor de Mcl-1 combinado con decitabina inhibe sinérgicamente PDX de AML in vivo

Material y método

Para establecer modelos de ratón de AML primaria de pacientes, se inyectaron 1 x 106 blastos leucémicos en ratones NOD-IL2RcYnuN (NRG-SG3) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) mediante inyección en la vena de la cola y se monitorizó los animales para detectar la progresión de la leucemia mediante análisis de citometría de flujo de sangre periférica para detectar células hCD45+. Se usaron recuentos de células hCD45+ en la médula ósea de los fémures de animales sacrificados para determinar el grado de infiltración de la leucemia. Las células de la médula ósea se extrajeron lavando los fémures en PBS suplementado con suero bovino fetal al 2%. Para determinar la eficacia del Compuesto 1 más decitabina, los ratones recibieron 25 mg/kg del Compuesto 1 dos veces por semana IV y decitabina IP diariamente (D1-D5) 0.4 mg/kg. La eficacia del fármaco se determinó mediante análisis de citometría de flujo de células hCD45+ en médula ósea aislada de fémures lavados. Los esternones se fijaron en formalina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina o anti-hCD45 para evaluar la carga leucémica y la celularidad.

Resultados

Los resultados obtenidos muestran que la combinación de inhibidores de Mcl-1 con fármacos estándar de atención para el tratamiento del cáncer hematológico podría proporcionar beneficio al tratamiento de pacientes con AML.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación que comprende:

(a) un inhibidor de Mcl-1 que es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico o ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico,

y (b) un segundo agente anticáncer, en la que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para uso simultáneo, secuencial o por separado.

2. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el segundo agente anticáncer es idarrubicina.

3. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el segundo agente anticáncer es citarabina.

4. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el segundo agente anticáncer es decitabina.

5. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el segundo agente anticáncer es azacitidina.

6. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de Mcl-1 es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(5-fluorofuran-2-il)tieno[2,3-d]pirimidin-4-iÍ]oxi}-3-(2-{[1 -(2,2,2-trifluoroetil)-1 H-pirazol-5-il]metoxi}fenil)propanoico.

7. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de Mcl-1 es ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico.

8. Una combinación según la reivindicación 7, en la que la dosis de ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxil-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico durante el tratamiento combinado es de 25 mg a 1500 mg.

9. Una combinación según la reivindicación 7 u 8 , en la que el ácido (2R)-2-{[(5S<a>)-5-{3-cloro-2-metil-4-[2-(4-metilpiperazin-1 -il)etoxi]fenil}-6-(4-fluorofenil)tieno[2,3-d]pirimidin-4-il]oxi}-3-(2-{[2-(2-metoxifenil)pirimidin-4-il]metoxi}fenil)propanoico se administra durante el tratamiento combinado una vez a la semana.

10. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de Mcl-1 se administra oralmente.

11. Una combinación según la reivindicación 1, en la que el inhibidor de Mcl-1 se administra intravenosamente.

12. Una combinación según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento del cáncer.

13. Una combinación para uso según la reivindicación 12, en la que el cáncer es leucemia mieloide aguda o leucemia linfocítica aguda.

14. La combinación para uso según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en la que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades que son terapéuticamente efectivas conjuntamente para el tratamiento del cáncer.

15. La combinación para uso según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en la que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades que son sinérgicamente efectivas para el tratamiento del cáncer.

16. La combinación para uso según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en la que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades sinérgicamente efectivas que permiten una reducción de la dosis requerida para cada compuesto en el tratamiento del cáncer, al mismo tiempo que proporciona un tratamiento eficaz del cáncer, finalmente con una reducción de los efectos secundarios.

17. Una combinación según la reivindicación 13, para uso en el tratamiento de leucemia mieloide aguda en pacientes que alcanzan la remisión.

18. Una combinación según la reivindicación 1, que comprende además uno o más excipientes.

19. Una combinación según la reivindicación 1, que comprende además un tercer agente anticáncer.

20. Una combinación según la reivindicación 19, en la que el segundo agente anticáncer es citarabina y el tercer agente anticáncer es daunorrubicina o idarrubicina.

21. Un medicamento que contiene, por separado o juntos,

(a) un inhibidor de Mcl-1 como se define en la reivindicación 1, y

(b) un segundo agente anticáncer, en el que el segundo agente anticáncer se selecciona de antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina y mitoxantrona, citarabina y agentes hipometilantes seleccionados de decitabina, azacitidina y guadecitabina, para administración simultánea, secuencial o separada, y en el que el inhibidor de Mcl-1 y el segundo agente anticáncer se proporcionan en cantidades efectivas para el tratamiento del cáncer.