ES2972011T3 - Usos médicos para inducir o restablecer la inmunotolerancia - Google Patents

Abstract

Algunas afecciones autoinmunes raras y muy graves son de origen hereditario, como el síndrome APECED y IPEX, debido a una selección negativa alterada de células T autorreactivas en el timo o a la ausencia de células T reguladoras (Treg). Se han desarrollado estrategias innovadoras basadas en el uso de células T reguladoras. Los inventores han comparado ahora siete protocolos experimentales diferentes para identificar cuál permite obtener la mayor eficacia de Treg para tratar el síndrome autoinmune Scurfy, un modelo autoinmune grave que imita el síndrome IPEX. El protocolo optimizado comprendió un paso de preacondicionamiento con ciclofosfamida y un paso de postacondicionamiento con IL-2. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de la autoinmunidad en pacientes que lo necesitan, que comprende las etapas de i) administrar al paciente una cantidad de ciclofosfamida, ii) luego injertar al paciente una cantidad de la población de células Treg, y iii) finalmente administrar al paciente una cantidad de IL-2. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Usos médicos para inducir o restablecer la inmunotolerancia

Campo

La presente divulgación se encuentra en el campo de la autoinmunidad.

Antecedentes

La frecuencia global de enfermedades autoinmunitarias está entre el 3 y el 5% en los países desarrollados y ha aumentado continuamente en los últimos años. Se han notificado más de 100 enfermedades autoinmunitarias diferentes, todas las cuales corresponden a enfermedades crónicas desencadenadas por una pérdida de inmunotolerancia contra los autoantígenos. Las más frecuentes o descritas son la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico, debido a la producción de anticuerpos dirigidos contra autoantígenos, la enfermedad intestinal inflamatoria, la esclerosis múltiple y la diabetes tipo 1 debido a respuestas aberrantes de las células T. La mayoría tienen un origen multifactorial que implica factores tanto genéticos (entre ellos polimorfismos en los loci de HLA), endógenos (inflamación crónica, hormonas) y ambientales (estrés, nutrición, infecciones virales, tratamientos antineoplásicos), así como diversos órganos diana. Algunas afecciones autoinmunitarias poco frecuentes y muy graves son de origen hereditario, tales como el síndrome APECED e IPEX, debido a una selección negativa alterada de células T autorreactivas en el timo o a la ausencia de células T reguladoras (Treg). Los tratamientos incluyen terapia de reposición (por ejemplo, tratamiento con insulina), corticoides, tratamientos inmunosupresores, inmunoterapias (tratamientos anticitocinas) y, en los casos más graves, trasplante de células madre hematopoyéticas autólogas o alogénicas. La transferencia adoptiva de Treg también es adecuada para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, tales como la diabetes (Tang, Q. J. Exp. Med. 199, 1455-1465, 2004) o la enfermedad intestinal inflamatoria (Mottet, C. J. Immunol. Baltim. Md 1950170, 3939-3943, 2003). La transferencia adoptiva de Treg CD4+CD25++ sanas (4*105 células) en ratones“scurf/neonatales (de 1 ó 2 días de edad) (un modelo murino del síndrome IPEX) es suficiente para prevenir el desarrollo de la enfermedad (Fontenot, J. D. Nat. Immunol. 4, 330-336 (2003).39. Mottet, C., Uhlig, H. H. y Powrie, F. Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+ regulatory T cells. J. Immunol. Baltim. Md 1950170, 3939 3943 (2003)). Además, el restablecimiento transgénico de la expresión de FoxP3 previene la enfermedad que da lugar al fenotipo “scurfy" en ratones FoxP3sf/Y (Brunkow ME Nat Genet 2001). Sin embargo, hasta la fecha, todos los estudios se centraban en la prevención y no en el tratamiento de la enfermedad, que constituye el objetivo final de cualquier aplicación clínica. Por tanto, existe la necesidad de nuevos métodos para el tratamiento de la autoinmunidad.

La tolerancia específica del donante ha sido durante mucho tiempo el Santo Grial en los trasplantes, con el objetivo final de evitar complicaciones potencialmente mortales derivadas de la inmunosupresión a largo plazo. El trasplante combinado de riñón y médula ósea (CKBMT) se ha usado con éxito para inducir inmunotolerancia mediante quimerismo mixto, definido como un estado en el que coexisten células hematopoyéticas del donante y del receptor. Esta estrategia ha ofrecido una prueba de concepto de que puede inducirse tolerancia operativa en seres humanos. Sin embargo, este éxito tuvo un alto coste debido a los rigurosos regímenes citorreductores y a la infusión de linfocitos del donante, con las consiguientes complicaciones graves, incluyendo la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) mortal.

Por tanto, hay margen para mejorar los protocolos tolerogénicos actuales fomentando los mecanismos de tolerancia periférica. Las células T reguladoras que expresan FOXP3 (a continuación en el presente documento denominadas Treg) son reguladores periféricos clave del sistema inmunitario y son obligatorios para prevenir enfermedades autoinmunitarias. Cada vez hay más evidencias que implican a las Treg en la inducción de tolerancia a los trasplantes clínica y experimental. Se encontró una expansión significativa de Treg específicas del donante 6 meses después de CKBMT en pacientes tolerantes, a diferencia de los pacientes no tolerantes. Además, la administración de un producto de células enriquecidas en Treg específicas del donante permitió destetar y suspender con éxito los agentes inmunosupresores en siete de cada diez receptores de trasplante de hígado (Todo, Satoru,et al.“A pilot study of operational tolerance with a regulatory T-cell-based cell therapy in living donor liver transplantation”. Hepatology 64.2 (2016): 632-643). Por tanto, la terapia adoptiva con Treg es prometedora como alternativa a los fármacos inmunosupresores. Sin embargo, la terapia con células Treg en trasplantes enfrenta tres desafíos principales, incluyendo su aislamiento y expansión, la muy baja frecuencia de Treg específicas del donante y la gran cantidad de células necesarias para superar a las células T efectoras alorreactivas (Teff). A este respecto, algunos estudios piloto sugieren que la activación de Treg a través de la señalización de CD28-CAR conserva la función supresora. Las Treg-CAR han demostrado una eficiencia mucho mayor que las Treg policlonales en el control del rechazo y la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) en modelos de trasplante.

Se encontró que el estímulo con ciclofosfamida posterior al trasplante es muy eficiente para reducir el tamaño de la respuesta aloinmunitaria tanto en trasplantes de médula ósea (Robinson, Tara M.et al.“Haploidentical bone marrow and stem cell transplantation: experience with post-transplantation cyclophosphamide”. Seminars in hematology. Vol. 53. N.° 2. WB Saunders, 2016) como en trasplantes de órganos sólidos (Todo, Satoru,et al.“A pilot study of operational tolerance with a regulatory T-cell-based cell therapy in living donor liver transplantation”. Hepatology 64.2 (2016): 632-643), y se combinó con éxito con Treg específicas del donante para fomentar la tolerancia (Todo, Satoru,et al."A pilot study of operational tolerance with a regulatory T-cell-based cell therapy in living donor liver transplantation”. Hepatology 64.2 (2016): 632-643).

El documento WO2014/180943 da a conocer un vector que contiene ácido nucleico que codifica para Foxp3 y Mcl-1 o que contiene ácido nucleico que codifica para Foxp3 y/o Mcl-1 operativamente unido a un promotor de Foxp3, en particular para su uso en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por deficiencia de Treg. El documento WO2019/040655 da a conocer vectores lentivirales que expresan Foxp3 en células madre hematopoyéticas para tratar inmunodeficiencias y enfermedades autoinmunitarias.

El documento WO2019/012024 da a conocer métodos para aumentar la expansión y la capacidad inmunosupresora de una población de Treg CD8+CD45RCbajo/'.

Sumario

La presente invención se define por las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a una cantidad de ciclofosfamida, a una cantidad de una población de células Treg y a una cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso en un método para inducir o restablecer la inmunotolerancia en un paciente que padece síndrome IPEX que comprende las etapas de i) administrar al paciente la dicha cantidad de ciclofosfamida, ii) luego injertar al paciente con la dicha cantidad de la población de células Treg y iii) finalmente administrar al paciente la dicha cantidad de un polipéptido de IL-2.

La descripción detallada, las figuras y el ejemplo siguientes no se encuentran dentro del alcance de la presente invención y se presentan con propósitos de compresión e ilustración únicamente. Además, cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, a las composiciones farmacéuticas y a los medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano mediante terapia.

Descripción detallada

Algunas afecciones autoinmunitarias poco frecuentes y muy graves son de origen hereditario, tales como el síndrome APECED e IPEX, debido a una selección negativa alterada de células T autorreactivas en el timo o a la ausencia de células T reguladoras (Treg). Se han desarrollado estrategias innovadoras basadas en el uso de células T reguladoras. Ahora se han comparado 7 protocolos experimentales diferentes para identificar cuál de ellos permite obtener la mayor eficacia de Treg para tratar el síndrome autoinmunitario que da lugar al fenotipo“scurfy”,un modelo autoinmunitario grave que imita el síndrome IPEX. El protocolo optimizado comprendía una etapa de acondicionamiento previo usando ciclofosfamida y una etapa de acondicionamiento posterior usando IL-2.

Por tanto, el primer objeto dado a conocer en el presente documento se refiere a una cantidad de ciclofosfamida, a una cantidad de una población de células Treg y a una cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso en un método para inducir o restablecer la inmunotolerancia en un paciente que padece síndrome IPEX que comprende las etapas de i) administrar al paciente la dicha cantidad de ciclofosfamida, ii) luego injertar al paciente con la dicha cantidad de la población de células Treg y iii) finalmente administrar al paciente la dicha cantidad de un polipéptido de IL-2.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunotolerancia” se refiere a un estado de falta de respuesta del sistema inmunitario a sustancias o tejidos específicos que tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria al tiempo que conservan las respuestas inmunitarias frente a otras sustancias u otros tejidos. Tal como se usa en el presente documento, el término “respuesta inmunitaria” incluye respuestas inmunitarias mediadas por células T y/o mediadas por células B. Las respuestas inmunitarias a modo de ejemplo incluyen respuestas de células T, por ejemplo, producción de citocinas y citotoxicidad celular; además, el término respuesta inmunitaria incluye respuestas inmunitarias que se ven afectadas indirectamente por la activación de células T, por ejemplo, producción de anticuerpos (respuestas humorales) y activación de células sensibles a citocinas, por ejemplo, macrófagos. Las células inmunitarias implicadas en la respuesta inmunitaria incluyen linfocitos, tales como células B y células T (células CD4+, CD8+, Th1 y Th2); células presentadoras de antígeno (por ejemplo, células presentadoras de antígeno profesionales tales como células dendríticas); células citolíticas naturales; células mieloides, tales como macrófagos, eosinófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “síndrome IPEX” tiene su significado general en la técnica y es una enfermedad que resulta en la mayoría de los casos de mutaciones en FoxP3. El síndrome IPEX suele desarrollarse durante los primeros días o semanas de vida y afecta exclusivamente a niños varones. Se manifiesta con la aparición secuencial de la tríada de enteropatía, endocrinopatías autoinmunitarias y afectación cutánea, pero las características clínicas y la gravedad de la enfermedad pueden variar considerablemente entre individuos. La enteropatía autoinmunitaria grave se manifiesta con diarrea secretora intratable que conduce a hipobsorción, alteración de electrolitos y retraso del crecimiento. También pueden observarse vómitos, íleo, gastritis o colitis. Los pacientes también presentan endocrinopatías autoinmunitarias, generalmente diabetes mellitus insulinodependiente (DM tipo 1), pero también tiroiditis que conduce a hipotiroidismo o hipertiroidismo. La afectación cutánea consiste en una erupción pruriginosa generalizada que se asemeja a eccema, psoriasis y/o dermatitis atópica o exfoliativa. Con menor frecuencia puede observarse alopecia u onicodistrofia. Los pacientes pueden desarrollar citopenias autoinmunitarias, trombocitopenia, anemia hemolítica y neutropenia. La afectación autoinmunitaria también puede conducir a neumonitis, hepatitis, nefritis, miositis, esplenomegalia y/o linfadenopatía. Pueden producirse infecciones locales o sistémicas (por ejemplo, neumonía, infecciones porStaphylococcus aureus,candidiasis), pero parece ser que se deben a la pérdida de las barreras cutáneas e intestinales, a las terapias inmunosupresoras y a la mala nutrición más que a una inmunodeficiencia primaria. El síndrome IPEX es causado por mutaciones en el gen FOXP3 (Xp11.23). En IPEX se notifican más de 20 mutaciones de FOXP3 y el síndrome es letal si no se trata. El diagnóstico se basa en el examen clínico, los antecedentes familiares y los hallazgos de laboratorio que revelan enteropatía autoinmunitaria (autoanticuerpos anti-enterocitos, anti-harmonina y anti-vilina), DM tipo 1 (anticuerpos contra insulina, contra células de los islotes pancreáticos o anti-glutamato descarboxilasa), tiroiditis (anticuerpos anti-tiroglobulina y anticuerpos antiperoxidasa microsómica) y citopenia (anticuerpos anti-plaquetas y anti-neutrófilos, prueba de Coombs positiva). Las pruebas genéticas moleculares confirman el diagnóstico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” o “tratar” se refiere tanto al tratamiento profiláctico o preventivo como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de pacientes en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que han contraído la enfermedad, así como pacientes que están enfermos o han sido diagnosticados con una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento puede administrarse a un paciente que padece un trastorno médico o que finalmente puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición, reducir la gravedad o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un paciente más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Por “cantidad terapéuticamente eficaz” se entiende una cantidad suficiente de células generadas con la presente divulgación para el tratamiento de la enfermedad con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá que el uso total de estas células lo decidirán los médicos responsables dentro del ámbito del juicio médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el momento de administración, la vía de administración y la tasa de supervivencia de las células empleadas; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentes con las células administradas; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, es bien conocido en la habilidad de la técnica iniciar dosis de células a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta lograr el efecto deseado.

Etapa i): administrar una cantidad de ciclofosfamida:

En particular, el término “ciclofosfamida” tiene su significado general en la técnica y se refiere al nombre genérico para 2-óxido de 2-[bis(2-cloroetil)amino]-tetrahidro-2H-1,3,2-oxazafosforina monohidratado.

Se halló que puede usarse una cantidad de ciclofosfamida de entre 40 y 200 mg/m2. En particular, puede usarse una cantidad de aproximadamente 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ó 200 mg/m2. Preferiblemente, se usa una cantidad de 150 mg/m2.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente”, tal como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En particular, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto.

En particular, la cantidad de ciclofosfamida se administra al paciente en un bolo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días antes de injertar al paciente con la cantidad de células Treg. Preferiblemente, la cantidad de ciclofosfamida se administra al paciente 4 días antes del injerto.

Etapa ii): injertar una cantidad de células Treg

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula T” se refiere a un tipo de linfocitos que desempeñan un papel importante en la inmunidad mediada por células y se distinguen de otros linfocitos, tales como células B, por la presencia de un receptor de células T en la superficie celular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “células T reguladoras” o “células Treg” se refiere a células que suprimen, inhiben o impiden la actividad de células T. Tal como se usa en el presente documento, las células Treg tienen el siguiente fenotipo CD4+CD25+FoxP3+ en reposo y, por tanto, se caracterizan por la expresión de FoxP3.

Tal como se usa en el presente documento, el término “progenitores de células T” se refiere a progenitores de las células T que migran a y colonizan el timo. Los progenitores en desarrollo dentro del timo, también conocidos como timocitos, experimentan una serie de etapas de maduración que pueden identificarse basándose en la expresión de diferentes marcadores de superficie celular. La mayoría de las células en el timo dan lugar a células T ap.

Tal como se usa en el presente documento, el término “FoxP3” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un factor de transcripción perteneciente a la familia de cabeza de tenedor/horquilla alada de reguladores transcripcionales. Parece que FOXP3 funciona como regulador (factor de transcripción) maestro en el desarrollo y la función de células T reguladoras. FoxP3 dota a las células T de función reguladora y aumenta la expresión de CTLA-4 y CD25, pero disminuye la producción de IL-2 actuando como represor transcripcional. FoxP3 se une a y suprime el factor nuclear de células T activadas (NFAT) y el factor nuclear kappaB (NFKB) (Bettelli, E.M.et al.,2005, Proc Natl Acad Sci U S A 102:5138).

En particular, las células Treg se preparan según cualquier método bien conocido en la técnica. En particular, las células Treg se preparan transfectando o transduciendo una población de células Tex vivocon un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para FoxP3. Normalmente, el vector es un vector retroviral. Tal como se usa en el presente documento, el término “vector retroviral” se refiere a un vector que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales que se derivan principalmente de un retrovirus. En particular, el vector retroviral de la presente divulgación se deriva de un retrovirus seleccionado del grupo que consiste en alfaretrovirus (por ejemplo, virus de la leucosis aviar), beta-retrovirus (por ejemplo, virus de tumor mamario de ratón), gamma-retrovirus (por ejemplo, virus de la leucemia murina), delta-retrovirus (por ejemplo, virus de la leucemia bovina), épsilon-retrovirus (por ejemplo, virus del sarcoma dérmico de Walley), lentivirus (por ejemplo, VIH-1, VIH-2) y espumavirus (por ejemplo, espumavirus humano). En particular, el vector retroviral de la presente divulgación es un vector lentiviral. Tal como se usa en el presente documento, el término “vector lentiviral” se refiere a un vector que contiene elementos genéticos estructurales y funcionales que se derivan principalmente de un lentivirus. En particular, el vector lentiviral de la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en vectores de VIH-1, VIH-2, VIS, VIF, VAIE, VIB, VISNA y VEAC. En particular, el vector lentiviral es un vector de VIH-1.

Tal como se usa en el presente documento, el término “células madre hematopoyéticas” (HSC) se refiere a células madre pluripotentes que pueden autorrenovarse y que se caracterizan por su capacidad para dar lugar, en condiciones permisivas, a todos los tipos de células del sistema hematopoyético. Las células madre hematopoyéticas no son células totipotentes, es decir, no pueden desarrollarse en un organismo completo.

En particular, puede aplicarse un enfoque de edición génica para el restablecimiento específico de sitio de la expresión del gen FOXP3 de tipo natural a células T y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T que portan mutaciones de FOXP3 para corregir defectos funcionales de Treg. Tal como se usa en el presente documento, el término "enfoque de edición génica" se refiere a un sistema que comprende uno o más dominios o componentes de unión al ADN y uno o más dominios o componentes modificadores del ADN, o ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, uno o más vectores, que codifican para dichos dominios o componentes de unión al ADN y modificadores del ADN. Los sistemas de edición génica se usan para modificar el ácido nucleico de un gen diana y/o para modular la expresión de un gen diana. En los sistemas de edición génica conocidos, por ejemplo, el uno o más dominios o componentes de unión al ADN están asociados con el uno o más dominios o componentes modificadores del ADN, de manera que el uno o más dominios de unión al ADN dirigen al uno o más dominios o componentes modificadores del ADN a un sitio de ácido nucleico específico. Los componentes polipeptídicos de un sistema de edición génica se denominan en el presente documento “proteínas de edición génica”. Los sistemas de edición génica son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, nucleasas con dedos de zinc, nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN); sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/Cas y sistemas de meganucleasas.

Por tanto, en particular, las células T y/o las células madre hematopoyéticas (HSC) y/o los progenitores de células T se ponen en contacto con una endonucleasa asociada a CRISPR y al menos un ARN guía.

Tal como se usa en el presente documento, el término “endonucleasa asociada a CRISPR” tiene su significado general en la técnica y se refiere a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas asociadas que son los segmentos de ADN procariota que contiene repeticiones cortas de secuencias de bases. En particular, la endonucleasa asociada a CRISPR es una nucleasa Cas9. En particular, la endonucleasa asociada a CRISPR es una nucleasa Cpf1. Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína Cpf1” se refiere a una proteína Cpf1 de tipo natural derivada de sistemas CRISPR-Cpf1 de tipo V, modificaciones de proteínas Cpf1, variantes de proteínas Cpf1, ortólogos de Cpf1, y combinaciones de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “ARN guía” o “ARNg” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un ARN que puede ser específico para un ADN diana y puede formar un complejo con la endonucleasa asociada a CRISPR.

En particular, la endonucleasa asociada a CRISPR y el ARN guía se proporcionan a las células a través de expresión a partir de uno o más vectores de expresión. En particular, la endonucleasa de CRISPR puede estar codificada por el mismo ácido nucleico que las secuencias de ARN guía. Los vectores pueden incluir, por ejemplo, vectores virales (tales como adenovirus (“Ad”), virus adenoasociados (VAA), y virus de la estomatitis vesicular (VEV) y retrovirus), liposomas y otros complejos que contienen lípidos, y otros complejos macromoleculares que pueden mediar en la administración de un polinucleótido a una célula huésped.

En particular, la endonucleasa asociada a CRISPR puede complejarse previamente con un ARN guía para formar un complejo de ribonucleoproteína (RNP). Tal como se usa en el presente documento, el término “complejo de ribonucleoproteína” o “partícula de ribonucleoproteína” se refiere a un complejo o a una partícula que incluye una nucleoproteína y un ácido ribonucleico. Una “nucleoproteína”, tal como se proporciona en el presente documento, se refiere a una proteína que puede unirse a un ácido nucleico (por ejemplo, ARN, ADN). Cuando la nucleoproteína se une a un ácido ribonucleico, se denomina “ribonucleoproteína”. La interacción entre la ribonucleoproteína y el ácido ribonucleico puede ser directa, por ejemplo, mediante enlace covalente, o indirecta, por ejemplo, mediante enlace no covalente (por ejemplo, interacciones electrostáticas (por ejemplo, enlace iónico, enlace de hidrógeno, enlace de halógeno), interacciones de van der Waals (por ejemplo, dipolodipolo, dipolo inducido por dipolo, dispersión de London), apilamiento de anillos (efectos pi), interacciones hidrófobas, y similares). Por tanto, el complejo de RNP puede introducirse en las células. Normalmente, el complejo de RNP se produce simplemente mezclando Cas9 y uno o más ARN guía en un tampón apropiado. Esta mezcla se incuba durante 5-10 min a temperatura ambiente antes de la electroporación.

En particular, la población de células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T se modifica genéticamente para codificar para productos de expresión deseados, tal como se describirá adicionalmente a continuación. El término “genéticamente modificado” indica que las células comprenden una molécula de ácido nucleico que no está presente de manera natural en una población no modificada de células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T o una molécula de ácido nucleico presente en un estado no natural en dicha población de células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T (por ejemplo, amplificada). La molécula de ácido nucleico puede haberse introducido en dichas células o en un progenitor de las mismas. Pueden usarse varios enfoques para modificar genéticamente una población de células, tales como administración génica mediada por virus, administración génica no mediada por virus, ADN desnudo, tratamientos físicos, etc. Para este fin, el ácido nucleico se incorpora habitualmente en un vector, tal como un virus recombinante, un plásmido, un fago, un episoma, un cromosoma artificial, etc. Los ejemplos de medios mediante los cuales puede introducirse el ácido nucleico que porta el gen en las células incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, transducción o transfección usando DEAE-dextrano, lipofección, fosfato de calcio u otros procedimientos conocidos por el experto en la técnica.

El ácido nucleico usado para modificar genéticamente la población de células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T puede codificar para diversos productos biológicamente activos, incluyendo polipéptidos (por ejemplo, proteínas, péptidos, etc.), ARN, etc. En particular, el ácido nucleico codifica para un polipéptido que tiene una actividad inmunosupresora. Otra categoría preferida de ácidos nucleicos son aquellos que codifican para un receptor de células T y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T, o una subunidad o un equivalente funcional del mismo, tal como un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para un antígeno de interés o un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR) que comprende un autoantígeno. Por ejemplo, la expresión de TCR o CAR recombinantes específicos para un antígeno produce células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T humanos, que pueden actuar de manera más específica y eficiente sobre las células T efectoras y/o las células madre hematopoyéticas (HSC) y/o los progenitores de células T para inhibir las respuestas inmunitarias en un paciente que lo necesita. Los principios básicos del diseño del receptor de antígeno quimérico (CAR) se han descrito ampliamente (por ejemplo, Sadelainet al.,2013). Por tanto, en particular, las células Treg y/o las células madre hematopoyéticas (HSC) y/o los progenitores de células T de la divulgación se modifican genéticamente y expresan al menos un CAR, un CAAR y/o un receptor nativo unido a moléculas de señalización intracelular. Los ejemplos de CAR incluyen, sin limitarse a, CAR de primera generación, CAR de segunda generación, CAR de tercera generación, CAR que comprenden más de tres dominios de señalización (dominios coestimuladores y dominios de activación) y CAR inhibidores (iCAR).

En particular, la población de células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T es autóloga del paciente, lo que significa que la población de células se deriva del mismo paciente.

En particular, las células Treg y/o las células madre hematopoyéticas (HSC) y/o los progenitores de células T se formulan recogiéndolos en primer lugar de su medio de cultivo y luego lavando y concentrando las células en un medio y sistema de recipiente adecuada para la administración (un portador “farmacéuticamente aceptable”) en una cantidad eficaz para el tratamiento. Normalmente, la población de células Treg y/o células madre hematopoyéticas (HSC) y/o progenitores de células T de la presente divulgación se administra al paciente en forma de composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede producirla un experto empleando principios de tratamiento aceptados. La composición farmacéutica puede administrarse mediante cualquier medio que logre su propósito previsto. Por ejemplo, la administración puede ser por vía parenteral, subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica o bucal. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral mediante inyección en bolo o mediante perfusión gradual a lo largo del tiempo. Las composiciones farmacéuticas normalmente comprenden portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y sustancias auxiliares que pueden facilitar el procesamiento de los compuestos activos en las preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente.

En particular, se injerta una cantidad de entre 1*106/kg y 10*106/kg de células Treg en el paciente. En particular, se injerta una cantidad de 1*106/kg, 2*106/kg, 3*106/kg, 4*106/kg, 5*106/kg, 6*106/kg, 7*106/kg, 8*106/kg, 9*106/kg o 10*106/kg de células Treg en el paciente. Preferiblemente, se injerta una cantidad de aproximadamente 5*106/kg de Treg en el paciente.

En particular, el injerto se realiza en combinación con otro agente biológicamente activo. Tal como se usa en el presente documento, el término “agente biológicamente activo” es un agente, o su sal farmacéuticamente aceptable, o una mezcla de compuestos, que tiene efectos terapéuticos, profilácticos, farmacológicos o fisiológicos sobre un mamífero. Normalmente, se considera que el agente biológico potencia las propiedades inmunosupresoras de las Treg y/o las células madre hematopoyéticas (HSC) y/o los progenitores de células T. el agente biológicamente activo puede seleccionarse del grupo de (a) proteínas o péptidos, (b) ácidos nucleicos y (c) sustancias orgánicas o químicas.

Etapa iii): administrar una cantidad de un polipéptido de IL-2

Tal como se usa en el presente documento, el término “IL-2” tiene su significado general en la técnica y se refiere a la interleucina-2 que normalmente se requiere para la proliferación de células T y otras actividades cruciales para la regulación de la respuesta inmunitaria. Por tanto, el término “polipéptido de IL-2” tiene su significado general en la técnica e incluye IL-2 que se produce de manera natural y variantes conservativas de función y formas modificadas de la misma (es decir, “muteína”). La IL-2 puede provenir de cualquier fuente, pero normalmente es una IL-2 de mamífero (por ejemplo, ser humano y primate no humano), y más particularmente una IL-2 humana. Una secuencia de aminoácidos humana a modo de ejemplo para IL-2 está representada por SEQ ID NO:1. En particular, el polipéptido de IL-2 es una muteína de IL-22 que consiste en la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:1, en la que el residuo (V) en la posición 91 se sustituye por un residuo (K). En particular, el polipéptido de IL-2 es AMG 592 que es una muteína de IL-2 diseñada para una mayor selectividad de Treg y una semivida más larga en comparación con IL-2 recombinante (Tchao, Nadia,et al.“Amg 592 Is an Investigational IL-2 Mutein That Induces Highly Selective Expansion of Regulatory T Cells” (2017): 696-696).

SEQ ID NO:1 >sp|P60568|IL2_Interleucina-2 HUMANA OS=HomosapiensOX=9606 GN=IL2 PE=1 SV=1

MYRMQLLSCIALSLALVTNSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRML

TFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSE

TTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

En particular, puede usarse una cantidad del polipéptido de IL-2 de entre 0,5 MUI (millones de unidades internacionales)/día y 1,5 millones de MUI/día. En particular, se usa una cantidad de 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; ó 1,5 MUI/día. Preferiblemente, se usa una cantidad de 1 MUI/día.

En particular, la cantidad del polipéptido de IL-2 se administra al paciente diariamente desde el día 1 hasta el día 5 (el periodo de inducción) después del injerto, y luego cada 2 semanas desde el día 15 hasta el día 180 (el periodo de mantenimiento) después del injerto.

La divulgación se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Figuras

La figura 1 representa el experimento 1.

La figura 2 representa el experimento 2.

La figura 3 representa el experimento 3.

La figura 4 representa el experimento 4.

La figura 5 representa el experimento 6.

La figura 6 representa el experimento 6.

La figura 7 representa el experimento 7.

Materiales y métodos

Ratones

El fenotipo“scurfy”se obtuvo mediante retrocruzamiento sobre el acervo genético B6.129S7-Rag1tm1Mom/J, lo que permitió la generación de hembras XSf/XSf.Rag1-/- homocigóticas. El cruce de estas hembras con ratones C57BL/6J WT dio como resultado el nacimiento únicamente de machos XSf/Y.Rag1-/+ enfermos.

Células T CD4 WT

Se recogieron esplenocitos de C57BL/6J mediante retirada aséptica. Después de una suave trituración de los bazos a través de un filtro de malla de 70 pM, las células T CD4+ se aislaron mediante selección negativa usando el kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón EasySep (StemCell Technologies, Grenoble, Francia). La pureza superó el 90 %.

Células T CD4“scu fy

A partir de ratones XSf/Y.Rag1-/+ de 10 días, se recogieron los ganglios linfáticos y se separaron las células T c D4+ usando el kit de aislamiento de células T CD4+ murinas (Miltenyi Biotec, París, Francia). Brevemente, se marcaron las CD4+ recogidas de los ganglios linfáticos con un cóctel de anticuerpos biotinilados que seleccionan como diana células CD4-, seguido del marcaje con perlas magnéticas anti-biotina. Las células se separaron en una columna LS (Miltenyi Biotec) y las células CD4+ se recogieron en la fracción no retenida. La pureza superó el 90 %.

Treg CD4+CD25+ WT

Se recogieron esplenocitos y los ganglios linfáticos de B6LY5.1 CD45.1 (8-12 semanas) y se aislaron las células T CD4+ usando el kit de aislamiento de células T CD4+ de ratón EasySep. Se realizó una tinción de las células CD25+ con un anticuerpo anti-CD25 PE (clon PC61, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia), y luego se clasificaron las células CD4+CD25+ en clasificadores de células SH800 (Sony Biotechnology, Weybridge, RU) o ARIA II (BD Biosciences) con una boquilla de 100 pm. Para el ensayo de supresión de Treg, también se clasificaron las células CD4+CD25-.

Vector lentiviral

Se clonó el ADNc para ALNGFR humano con codones optimizados truncado y/o FOXP3 humano con codones optimizados en una estructura principal de pCCL con diferentes diseños. Vectores bidireccionales con la arquitectura de promotores bidireccionales, uno que permite la expresión de FOXP3 bajo el control del factor de elongación 1 alfa (EF1a ) ubicuo y ALNGFR bajo el control del promotor humano de fosfoglicerato cinasa (PGK) y su homólogo simulado que contiene únicamente el indicador ALNGFR (LNGFRp-eFOXP3 y LNGFRp-e) y uno que permite la expresión de FOXP3 bajo el control de PKG y ALNGFR bajo el control de una versión corta de EF1a (EFS) (LNGFRe-pFOXP3 y LNGFRe-p).

En diseños de T2A, la expresión está bajo el control de EF1a . Se construyeron dos constructos: ALNGFR seguido por la secuencia T2A y FOXP3 o FOXP3 seguido por T2A y ALNGFR.

Transducción de células T

Se sembraron células T CD4+ recién aisladas a 1.106 células/ml en una placa de fondo redondo en medio RPMI 1640 GlutaMax (GIBCO, Thermo Fisher Scientific, Montigny-Le-Bretonneux, Francia) complementado con suero bovino fetal al 10 % (GIBCO), penicilina-estreptomicina al 1 % (GIBCO), 2-mercaptoetanol al 0,1 % (GIBCO). El medio se complementó con IL-2 murina recombinante (Peprotech, Rocky Hill, EE.UU.) a una concentración de 100 UI/ml para células T CD4 WT o 300 UI/ml para células T CD4“scurfy’.Las células se activaron y expandieron con Dynabeads anti-CD3/CD28 (GIBCO) en una razón perlas:células de 1:1. La transducción se realizó según el protocolo descrito previamente43 (ref. artículo LB). Brevemente, se añadió medio de transducción (RPMI complementado con Lentiboost 0,25 mg/ml (Sirion Biotech, FlashTherapeutics, Toulouse, Francia)) a las células con vector lentiviral a una MOI de 10 simultáneamente con la activación y se incubaron durante la noche. Las células transducidas se tiñeron el día 5 después de la transducción con anticuerpos contra ALNGFR PE (clon ME20.4-1.H4, Miltenyi Biotec) y se clasificaron en el dispositivo SH800 (Sony Biotechnology).

Transferencia adoptiva de células T

En primer lugar, los ratones“scurfy" setrataron con un inmunosupresor: se inyectó temsirolimús (LC Laboratories, Woburn, EE.UU.) por vía s.c. a una dosis de 2 mg/kg el día 8 y el día 10 después del nacimiento. Este tratamiento se continuó dos veces a la semana en algún experimento. Se inyectó Fab'2 anti-CD3 (clon 145-2C11, BioXCell, West Lebanon, EE.UU.) por vía s.c. a 20 pg/día durante 5 días el día 8 después del nacimiento. Se inyectó ciclofosfamida (patrón de referencia de la Farmacopea Europea (EP), Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) por vía i.p. a 50, 100 ó 150 mg/kg 10 días después del nacimiento. El día 10 o el día 14, se inyectaron células CD4+CD25+CD45.1+ (que contienen supuestas Treg) o células T CD4+ modificadas por ingeniería (Foxp3.LNGFR o LNGFR) de ratones“scurfy’a 0,5*10® 0,75*106 ó 1*106 células, respectivamente, mediante inyecciones por vía i.p. Se inyectó vehículo (es decir, PBS) en el mismo volumen por vía i.p. para los ratones que no recibieron inyección de células. Debido al bajo título del vector LNGFRp-e simulado, que obstaculizó la producción de grandes cantidades de células<c>D4<lngfr>, se usaron células T CD4“scurfytransducidas con LNGFRe-p para completar el grupo de ratones tratados CD4LNGFR. En los experimentos indicados, junto con las células, se inyectó proleucina (IL-2 humana, aldesleucina, Novartis) a 1,000 Ul/g por vía i.p. y durante 5 días, luego una vez a la semana.

Citometría de flujo

Se obtuvieron suspensiones de una sola célula de bazo y ganglios linfáticos mediante una suave trituración de los bazos a través de un filtro de malla de 70 pM. Se prepararon muestras de pulmón e hígado después de la digestión con colagenasa IV (Thermo Fischer Scientific) seguida de una suave trituración de los bazos a través de un filtro de malla de 100 pM.

Las muestras se prepararon para citometría de flujo usando el siguiente método: las células se resuspendieron en 100 ul de tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato (PBS, Corning)/suero bovino fetal al 2 % [GIBCO]) y se incubaron con 2 ul de cada anticuerpo y 7AAD (Miltenyi Biotec) durante 20-30 min a 4 °C.

Las células se lavaron una vez en tampón FACS antes del análisis. Para la tinción intracelular de FoxP3, en primer lugar se tiñeron las células con marcadores de superficie celular y colorante de viabilidad fijable eF780 (eBioscience, Thermo Fischer Scientific) tal como se describió anteriormente. Después del lavado, las células se fijaron y permeabilizaron utilizando el conjunto de tampón de tinción de FoxP3 (eBioscience, Thermo Fischer Scientific) según las instrucciones del fabricante. Se añadió FoxP3-APC humano (eBioscience, Thermo Fischer Scientific) durante 30-60 minutos a TA. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo MACSquant (Miltenyi Biotec), un citómetro BD LSR Fortessa (BD Biosciences) o un dispositivo Sony Spectral SH6800 (Sony Biotechnology). Los datos se analizaron usando FlowJo V10 (TreeStar). Se usaron los siguientes anticuerpos: clon MEL-14 del anticuerpo anti-CD62L de ratón conjugado con APC-Cy7, clon IM7 del anticuerpo anti-CD44 conjugado con APC (BD Biotechnology), clon A20 del anticuerpo anti-CD45.1 conjugado con APC-Cy7, clon 104 del anticuerpo anti-CD45.2 conjugado con PeCy7, clon del anticuerpo anti-CD134 (OX-40) conjugado con Brilliant Violet 421, clon 29F.1A12 del anticuerpo anti-CD279 (PD-1) conjugado con Brilliant Violet 605, clon PC61 del anticuerpo anti-CD25 conjugado con Brilliant Violet 711, clon 1G9 del anticuerpo anti-TIGIT (Vstm3) conjugado con PE, clon DTA-1 del anticuerpo anti-CD357 (GITR) conjugado con PerCP/Cy5.5, clon Duha59 del anticuerpo anti-CD39 conjugado con PE/Cy7 y clon UC10-4B9 del anticuerpo anti-CD152 conjugado con PE/Dazzle (Sony Biotechnology) y clon ME20.4-1.H4 del anticuerpo anti-ALNGFR humano conjugado con PE (Miltenyi Biotec), clon 22F6 del anticuerpo anti-Helios conjugado con eF450 y clon PCH101 del anticuerpo anti-FOXP3 humano conjugado con APC (eBioscience, Thermo Fischer Scientific).

Histología

Se recogió pulmón, hígado y oreja después del sacrificio de los ratones y se fijó en PFA al 4 % (Sigma). Se tiñó el corte tisular con HE y se analizó la inflamación tal como describieron Workmanet al.

Análisis estadístico

Los valores se representan como medias ± DE, a menos que se indique lo contrario. Se usó GraphPad Prism 6.0 para todos los análisis estadísticos. El valor de p se calculó con un intervalo de confianza del 95 % para indicar la significación estadística entre los grupos. La prueba estadística incluyó la prueba de Mann-Whitney no paramétrica, la prueba exacta de Fischer o ANOVabilateral, en función del conjunto de datos. Un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Las diferencias estadísticamente significativas entre grupos se observan en cifras con asteriscos (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Las correlaciones se realizaron con una correlación de Spearman no paramétrica. La supervivencia se analizó con la prueba de rangos logarítmicos (Mantel-Cox).

Ética

El procedimiento con animales recibió el acuerdo del comité de ética de la presente institución y el acuerdo del Ministerio de Agricultura según la directiva europea 2010/63/UE.

EJEMPLO 1: ESTUDIOS PRECLÍNICOS

Se estableció una puntuación de fenotipo“scurfy”basándose en las subpuntuaciones para cada tipo de síntoma clínico: aspecto general, conducta, pérdida de peso, grado de descamación de la cola, blefaritis, formación de costras en las orejas y eccema. Esos 7 síntomas no requieren ninguna manipulación o muestreo y, por tanto, están de acuerdo con las reglas de las 3R. Los datos son fáciles de recopilar y permiten impedir la variabilidad entre pacientes.

Tabla 1: Puntuación de fenotipo“scurfy”de la presente divulgación

Tal como se muestra en las figuras 1-7, se compararon 7 protocolos experimentales diferentes para identificar cuál permite someter a prueba la eficacia de las Treg para tratar el síndrome autoinmunitario que da lugar al fenotipo "scurfy". La tabla 2 resume los diferentes experimentos. Las Treg se clasificaron según la expresión de CD4 y CD25 de ratones B6 congénicos CD45.1 y se inyectaron a una dosis de 5*105 por vía intraperitoneal el día 10 ó 14. El criterio fue la puntuación de fenotipo"scurfy’medida cada 3 a 4 días desde el nacimiento, y cuando los signos de eficiencia evidenciaron puntuaciones mejoradas para los ratones trasplantados con Treg, se siguió la supervivencia. Se sometieron a prueba tres fármacos como regímenes de acondicionamiento: temsirolimús inyectado por vía subcutánea a una dosis de 2 mg/kg al día desde el día 4 hasta el día 28 o desde el día 4 hasta el día 9 (posterior al nacimiento), Fab'2 anti-CD3 inyectado por vía subcutánea a una dosis de 20 microgramos/receptor diariamente desde el día 8 hasta el día 12, ciclofosfamida en 3 dosis diferentes (50, 100 y 150 mg/kg) inyectada el día 10. Tal como se muestra en las figuras 1-3, el temsirolimús y el anticuerpo anti-CD3 no permitieron revelar ninguna mejora en la puntuación de fenotipo "scurfy’después de la infusión de Treg. Tal como se muestra en la figura 4, la ciclofosfamida en todas las dosis retrasó la muerte de los ratones "scurfy’a más de 60 días. Sin embargo, 100 y 150 mg/kg condujeron a una toxicidad general revelada por el estado de salud de los ratones. Esta toxicidad estuvo ausente a la dosis de 50 mg/kg. La dosis de 50 mg/kg condujo a una puntuación de fenotipo"scurfymás estable y permitió observar el beneficio de la infusión de Treg para retrasar el empeoramiento de la puntuación de fenotipo“scurfyy la muerte. Por tanto, el régimen de acondicionamiento final consiste en la inyección de 50 mg/kg de ciclofosfamida el día 10 antes de la inyección de Treg el día 14.

Las Treg requieren IL-2 para su supervivencia (Fontenot, Jason D.,et al.“A function for interleukin 2 in Foxp3-expressing regulatory T cells". Nature immunology 6.11 (2005): 1142. Y Setoguchi, Rukaet al."Homeostatic maintenance of natural Foxp3+ CD25+ CD4+ regulatory T cells by interleukin (IL)-2 and induction of autoimmune disease by IL-2 neutralization". Journal of Experimental Medicine 201.5 (2005): 723-735). Se inyectó proleucina-2 humana por vía intraperitoneal a una dosis de 1000 Ul/g diariamente desde el día 14 hasta el día 18, y posteriormente una vez a la semana. Tal como se muestra en la figura 5, siguiendo el protocolo que incluye IL-2 y ciclofosfamida, las Treg retrasan la muerte de los pacientes y se detectan en todos los órganos sometidos a prueba, demostrando que este régimen de acondicionamiento permitió su injerto y persistencia en los receptores.

[Tabla 2: Resumen de los diferentes experimentos]

xperimento ectura

ntuación fenotipo a semana,curfy”,1 Temsirolimús<Por vía>vía peso,subcutánea2 mg/kg comenzando CD4+CD25+ Por vía

(CD45.1+) intraperitoneal<5.E+05 Día 10>subcutánea, recuento de conjunto células, stología ntuación fenotipocurfy”,2 Temsirolimús<Por vía>+ Por vía

subcutánea2 mg/kg Día 4 y día 8 CD4+CD25

(CD45.1+)intraperitoneal5.E+05 Día 10 Ninguno peso, recuento de conjunto células, tología tuación fenotipocurfy’,3 eso, ento de conjunto células, tología tuación fenotipo 4curfy’,eso, rvivencia

tuación aramene e fenotipo 5 Ciclofosfamida<Por vía>50

intraperitoneal mg/kgDía 10 CD4+CD25+ Por vía

(CD45.1+) intraperitoneal<5.E+05 Día 10>durante 5 días“scurfy’,peso, rvivencia

ntuación fenotipo aramenecurfy’,6A Ciclofosfamida<Por vía>50 Por vía

intraperitoneal mg/kgDía 10 CD4+CD25+

(CD45.1+) intraperitoneal<5.E+05 Día 10>durante 5 días peso, después de la recuento de inyección de subconjunto células T, de células, luego histología

semanalmente

ntuación fenotipo curfy”,B Ciclofosfamida<Por vía>50 Por vía

intraperitoneal mg/kgDía 10 CD4+CD25+

(CD45.1+) intraperitoneal<5.E+05 Día 10>durante 5 días peso, después de la recuento de inyección de subconjunto células T, de células, luego histología

semanalmente EJEMPLO 2

Una combinación específica de ciclofosfamida, IL-2 y Treg cura el síndrome que da lugar al fenotipo“scurfy’

El fenotipo“scurfy”incluía blefaritis, eccema de cola y oreja y retraso del crecimiento. Los ratones XSf/Y.Rag1-/+ macho desarrollaron un fenotipo“scurfy’similar a los ratones XSf/Y.Rag1+/+ macho con una aparición de la enfermedad el día 8 de vida (datos no mostrados). Para permitir una evaluación reproducible del fenotipo de ratones“scurfy”,se desarrolló un método de puntuación específico que incluía signos de enfermedad que da lugar al fenotipo“scurfy’(blefaritis, eccema de oreja y cuerpo completo, eccema de cola, edema de las extremidades, peso corporal, conducta y aspecto de los ratones) en una escala de 0 a 21 (tabla 1 complementaria). El peso de cada criterio en esta puntuación de gravedad de fenotipo“scurfy’se ajustó en función de la gravedad de las lesiones. Este método se validó en más de 50 ratones y por dos investigadores independientes.

Se evaluaron diferentes estrategias inmunosupresoras que incluyen temsirolimús (un profármaco de rapamicina que aumenta la esperanza de vida cuanto está presente el fenotipo “scufy”), anticuerpo anti-CD3 y ciclofosfamida (Cy) para (i) controlar los síntomas que dan lugar al fenotipo“scurfy’,aumentar la supervivencia de los ratones y, por tanto, la ventana terapéutica, (ii) imitar los tratamientos inmunosupresores convencionales de los pacientes con IPEX y (iii) agotar el compartimento de Tconv activadas para favorecer el injerto de Treg. El esquema experimental que se usó incluía la inyección del fármaco inmunosupresor, seguida del trasplante de 5.105 Treg CD45.1 WT CD4+CD25alto congénicas (figura 3 y datos no mostrados). La puntuación de fenotipo“scurfy”se evaluó cada dos días. El injerto de Treg WT se cuantificó en diversos tejidos al final del estudio. Las inyecciones de temsirolimús dos veces a la semana desde la aparición de la enfermedad (es decir, el día 8) dieron como resultado una reducción de la puntuación de fenotipo“scurfy”y una duplicación de la esperanza de vida tal como demostraron Chenget al.(datos no mostrados). Sin embargo, la puntuación de fenotipo“scurfy'no mejoró con la transferencia Treg WT el día 10 de acuerdo con menos del 1 % de quimerismo (datos no mostrados). Fab'2 anti-CD3 inyectado en una dosis única de 20 pg dio como resultado una cifra mínima de agotamiento después de 5 días y una recuperación de células T CD4+ que comienza después de 10 días (datos no mostrados). Se inyectó Fab'2 anti-CD3 durante 5 días consecutivos y se transfirieron Treg el día 14 de vida. A pesar de una mayor tasa de injerto (1,9 ± 0,3 % de CD45.1+ en células T CD4+ en ganglios linfáticos y 1,0 ± 0,4 % de CD45.1+ en bazo), la transferencia de Treg no mejoró la puntuación de fenotipo“scurfy’con este régimen de acondicionamiento basado en anticuerpo anti-CD3 (figura 3). Se administró ciclofosfamida (Cy) a machos“scurfy’el día 10 de vida en dosis de 50, 100 ó 150 mg/mg de peso corporal. El agotamiento de células T no fue diferente con las tres dosis. La cifra mínima de agotamiento se observó entre los días 3 y 5 después de la inyección de ciclofosfamida. La supervivencia aumentó significativamente después de la inyección de Cy desde 30 hasta 90 días en comparación con los ratones no tratados (datos no mostrados, p=0,01), lo que permitió un aumento significativo de la ventana terapéutica. Sin embargo, se observó cierta toxicidad, incluyendo retraso del crecimiento y alopecia transitoria correlacionados con las dosis de Cy. Según estos criterios de seguridad y eficacia, se eligió la dosis más baja de Cy (es decir, 50 mg/kg) para limitar la toxicidad. La transferencia de Treg se realizó el día 14 en ratones acondicionados mediante una única inyección de Cy el día 10 (datos no mostrados). Se observó una tendencia hacia una disminución de la puntuación de gravedad en ratones que recibieron Cy y Treg (datos no mostrados). Sin embargo, las células CD45.1+ no fueron detectables en el momento del sacrificio en los ganglios linfáticos y el bazo (datos no mostrados). Basándose en informes previos que muestran el efecto beneficioso de dosis bajas de IL-2 sobre la expansión de Treg en modelos murinos y humanos de autoinmunidad y trasplante27'29. Los receptores“scurfy’fueron tratados con IL-2 una vez al día durante 5 días y luego una vez a la semana (datos no mostrados). Con la asociación de Cy, Treg e IL-2, la puntuación de fenotipo“scurfycomenzó a disminuir después del día 28 después del trasplante (p=0,007) (datos no mostrados). Luego, 49 días después de la transferencia de Treg, el quimerismo CD45.1+ en células T CD4+ alcanzó el 2,2 % ± 0,6 en ganglios linfáticos, el 3,7 % ± 1,4 en bazo, el 2,1 % ± 0,5 en sangre, el 3,5 % ± 3,2 en hígado y el 3,3 % ± 0,8 en pulmón (datos no mostrados). Finalmente, la esperanza de vida de los ratones aumentó con una supervivencia media de 69 días en comparación con 39 días en los ratones que no recibieron Treg (p=0,0004). Curiosamente, la IL-2 por sí sola aumentó la supervivencia desde una supervivencia media hasta 51 días (p=0,03) (datos no mostrados). Además, la tinción de CD62L aumentó en las células T CD4 de ratones tratados con Treg, lo que demuestra el restablecimiento de una población de CD4 sin tratar en los ganglios linfáticos (datos no mostrados).

Por tanto, la combinación de un acondicionamiento de baja dosis de Cy con tratamiento con IL-2 después del trasplante permitió no sólo retrasar los síntomas de la enfermedad, aumentando así la ventana terapéutica, sino también aumentar el injerto de Treg. Estos resultados mostraron por primera vez el efecto beneficioso de las Treg sobre la enfermedad que da lugar al fenotipo“scurfy’después de su aparición. Este modelo murino optimizado se usó luego para someter a prueba la funcionalidad supresora de células T CD4“scurfy’con genes corregidos.

Las células T CD4“scurfy’modificadas por ingeniería con el vector LNGFR.FOXP3 rescatan a los ratones“scurfy’después de la aparición de la enfermedad

Para someter a prueba la capacidad de CD4LNGFRFOXP3 qUe se requiere para controlar la enfermedad que da lugar al fenotipo“scurfy",se trataron machos XSf/Y.Rag1-/+ con una inyección por vía i.p. de Cy el día 10 tal como se describió previamente, seguida de una inyección de 5.105 Treg CD45.1 congénicas o 5.105, 7,5.105 ó 1.106 CD4LNGFRFOXP3“scurfy’ alos 14 días de vida. El seguimiento de la puntuación de fenotipo“scurfy’mostró una inhibición dependiente de la dosis de los síntomas que dan lugar al fenotipo“scurfy’según el número de CD4LNGFRFOXP3 inyectadas (prueba de ANOVA, valor de p=0,0039, datos no mostrados). Además, después de 50 días de seguimiento, la inyección de 7,5.105 CD4LNGFRFOXP3 demostró resultados similares en cuanto a la puntuación de fenotipo“scurfy’,pero también en cuanto al porcentaje de quimerismo en comparación con 5.105 Treg (datos no mostrados). Por tanto, se seleccionó la dosis de 7,5.105 CD4LNGFRFOXP3 para su evaluación adicional. Sorprendentemente, la tinción de CD62L no fue diferente en las tres dosis de CD4LNGFRFOXP3 (datos no mostrados).

Luego, con el fin de comparar la eficacia de CD4LNGFRFOXP3 con las Treg, se realizó la transferencia adoptiva de Treg CD45.1 WT, CD4LNGFRFOXP3 y su homólogo simulado CD4LNGFR o vehículo (PBS). Los ratones fueron monitorizados cuidadosamente hasta su sacrificio el día 50 de vida. Cabe señalar que los VCN fueron similares entre los tres vectores (1,3 para LNGFRp-eFOXP3, 1,2 para LNGFRp-e y 1,5 para vectores LNGFRe-p). La puntuación de fenotipo“scurfyaumentó de manera similar en todos los grupos hasta el día 27 (datos no mostrados). El día 32, aunque continúa aumentando del mismo modo en ratones que recibieron Cy e IL-2 solas o con CD4LNGFR, se observó una disminución significativa en los ratones tratados con Treg WT y CD4LNGFRFOXP3 (valor de p=0,007 y 0,0008, respectivamente). Más específicamente, los ratones tratados con Treg WT y CD4LNGFRFOXP3 se recuperaron de la alopecia inducida por Cy, presentaron un leve eccema de la cola, un bajo nivel de blefaritis y aumento de peso, mientras que los ratones tratados con diluyente y CD4LNGFR presentaron un retraso del crecimiento y un grave eccema de cuerpo completo (datos no mostrados).

El análisis del quimerismo mostró un porcentaje medio de Treg CD45.1 de 5,0 que oscilaba desde el 1,7 hasta el 12,6 % en células T CD4 de ganglios linfáticos, bazo, sangre, hígado y pulmón (datos no mostrados). El quimerismo ALNGFR+ en ratones tratados con células T CD4LNGFRFOXP3 fue ligeramente menor, con una media del 3,4 % que oscilaba desde el 0,2 hasta el 4,6 % en ganglios linfáticos, bazo, sangre, hígado y pulmón (datos no mostrados). Por el contrario, las células T CD4LNGFR no se expandieron y el porcentaje permaneció inferior al 1,5 % en todos los tejidos. Es importante destacar que la expresión de FOXP3 humana persistió en ALNGFR+ CD4+ recogidas de ganglios linfáticos de ratones tratados con CD4LNGFRFOXP3 (datos no mostrados). Las células ALNGFR+ se clasificaron a partir de linfocitos de ganglios linfáticos y se cuantificó el análisis de VCN a 2,3±0,8 para el vector LNFGR.FOXP3 y 1,6±0,7 para el vector LNGFR (datos no mostrados).

El análisis de la tinción de CD62L en ganglios linfáticos ilustrado en la figura 4G demostró que se restableció un subconjunto de células T CD4+ sin tratar en ratones tratados con Treg y células CD4LNGFRFOXP3. Las células T CD4+ en ganglios linfáticos contenían el 15,7±0,6 % de células CD62L+ en ratones tratados con Cy e IL-2 frente al 78,1±2,4 % en ratones WT. El tratamiento con Treg aumentó este nivel hasta el 44,0±6,2 % y con células T CD4LNGFRFOXP3“scurfyhasta el 31,1±11,8 %, en comparación con el 20,8±2,5 % con células T CD4 CD62L+ después del trasplante de células T CD4LNGFR. El análisis de histología no mostró ninguna diferencia significativa en la puntuación de inflamación en pulmón, hígado y piel (datos no mostrados).

La supervivencia aumentó significativamente tras el tratamiento con Cy+IL-2+CD4LNGFRFOXP3 en comparación con los ratones“scurfytratados con Cy con una supervivencia media de 64 días con respecto a 47 días, respectivamente (p=0,0195). De manera similar, la supervivencia media aumentó significativamente con Treg en comparación con Cy con una supervivencia superior a 89 días (valor de p<0,0001). La supervivencia media para ratones tratados con Cy+IL-2+Treg no fue significativamente diferente en comparación con ratones tratados con Cy+IL-2+CD4LNGFRFOXP3 (p=0,1047). La supervivencia no fue diferente entre ratones tratados con Cy+IL-2+PBS y Cy+IL-2+CD4LNGFR, con una supervivencia media de 54,5 días y 53 días, respectivamente (p=0,8729) (figura 3H). Después de 90 días de seguimiento, las Treg CD45.1 y el quimerismo CD4LNGFRFOXP3 en células T CD4+ disminuyeron en comparación con los análisis en el día 50, con un porcentaje medio del 1,5 % y el 1,1 %, respectivamente. Es importante destacar que hFOXP3 todavía era detectable en CD4LNGFRFOXP3, lo que demuestra la estabilidad de hFOXP3 en células T CD4+ transducidasin vivo.

Estos resultados demostraron que la expresión de FOXP3 en células T CD4+“scurfyrecapituló una función supresora y que las CD4LNGFRFOXP3 transducidas pudieron rescatar la grave enfermedad autoinmunitaria que da lugar al fenotipo“scurfy.

CONCLUSIÓN:

Se ha demostrado que la transferencia de esplenocitos o Treg clasificadas en ratones con deficiencia del fenotipo“scurfypreviene los síntomas que dan lugar al fenotipo“scurfycuando se transfieren en el plazo de los dos primeros días de vida. En este estudio, se demostró que la transferencia de Treg el día 14 de vida permitió el rescate a largo plazo de los síntomas que dan lugar al fenotipo“scurfysi se combinaba con acondicionamiento con Cy seguido de una dosis baja de inyecciones de IL-2. Esto se demostró con parámetros robustos que incluían una puntuación clínica, tinción de células T CD4+, análisis de quimerismo y supervivencia. En las diferentes estrategias sometidas a prueba para la transferencia adoptiva de Treg, Cy permitió el mejor control de la autoinmunidad. Se ha demostrado que Cy agota el nicho de células T en ratones. La cifra mínima de células T CD4 se obtuvo 4 días después de la inyección y el recuento de células se normalizó a los 10 días. Además, Cy permite un deterioro funcional de las células T activadas que da como resultado un enriquecimiento relativo en Treg. Sin embargo, en animales jóvenes, incluso dosis bajas de Cy dieron como resultado toxicidades como alopecia y retraso del crecimiento. Otro condicionamiento para inclinar el equilibrio entre Treg y Tconv basado en un agotamiento más específico de células T activadas sería un gran requisito para la aplicación clínica. Por ejemplo, podrían resultar interesantes los anticuerpos anti-CD3 no mitogénicos. Sin embargo, en el presente modelo de ratones“scurfy”,no pudo demostrarse su eficacia para permitir un injerto apropiado de Treg. Luego, se ha demostrado que una dosis baja de IL-2 favorecen la expansión de Treg y, por tanto, tiene efectos terapéuticos beneficiosos en el contexto de varias enfermedades autoinmunitarias tales como la diabetes tipo I, el lupus eritematoso sistémico y otras. La IL-2 también mejora la proliferación de Treg específicas del donante y fomenta la tolerancia en el trasplante alogénico. En ratones NOD de 10 semanas de edad, se ha demostrado que la inyección diaria de 25,000 UI/día durante cinco días pudo revertir la diabetes. Con el fin de adaptar esta dosis baja de IL-2 a ratones“scurfy’de 14 días de edad, se decidió usar 1,000 Ul/g de ratones. Además, basándose en el estudio TRANSREG, esta terapia de inducción se completó con una terapia de mantenimiento de inyecciones semanales de IL-2. Es importante destacar que el tratamiento con una dosis baja de IL-2 no empeoró la autoinmunidad en entornos“scurfy’.La cuestión restante se referiría al final del tratamiento con IL-2. En conjunto, esta estrategia terapéutica permitió evaluar la actividad supresora de las células en el modelo de autoinmunidad“scurfy in vivo.

En estos entornos, las células T CD4“scurfy’transducidas con el vector LNGFR.FOXP3 pudieron rescatar la enfermedad que da lugar al fenotipo“scurfy’,lo que demuestra la eficiencia del vector lentiviral para inducir funciones reguladoras con una media de 2 VCN por célula. Esto sugirió que la homología entreFOXP3humano y murino permite que la expresión deFOXP3humano en células T CD4+ murinas por sí solas sea suficiente para inducir la función supresora de células CD4+. Curiosamente, las células T CD4+“scurfy'transducidas con el vector LNGFR.FOXP3 se expandieron preferentemente en comparación con células T CD4+“scurfytransducidas con el vector LNGFR simulado. Esto podría explicarse por su mayor sensibilidad a IL-2 debido al mayor nivel de CD25. Además, estas Treg sometidas a transferencia adoptiva se mantuvieron estables hasta los 90 díasin vivoen un contexto inflamatorio, y expresaron FOXP3 de forma duradera. En el presente ensayo, la transferencia de Treg de buena fe permitió un control ligeramente mejor de la enfermedad que da lugar al fenotipo“scurfyen comparación con las células T CD4+ genéticamente modificadas. Varios factores podrían explicar esas diferencias. En primer lugar, el nivel de quimerismo fue la mitad del de las Treg WT en el día 50 y también en el seguimiento a largo plazo en el día 90. En consecuencia, aumentar la infusión recurrente o la dosis de células podría mejorar el resultado. Luego, el presente vector permitió la expresión de la proteína FOXP3 humana, que presenta el 86 % de homología con FOXP3 murina y puede no recapitular completamente el programa transcriptómico de las Treg. Además, las células<cd>4LNGFRFOXP3 reguladoras modificadas por ingeniería se recogieron de ratones“scurfyy se cultivaron durante 5 días. En consecuencia, podrían ser más sensibles a la clasificación y manipulación. Más allá, la preselección de células T sin tratar podría dar como resultado células supresoras más eficientes, tal como demostraron Passeriniet al.para CD4LNGFRFOXP3. En el presente trabajo, después de la transferencia adoptiva de Treg o CD4LNGFRFOXP3, algunos ratones“scurfymurieron principalmente por la recurrencia de los síntomas que dan lugar al fenotipo“scurfy.Por tanto, podrían considerarse inyecciones múltiples de Treg o aumentar la dosis de IL-2 o las frecuencias de inyección para mejorar el control de la enfermedad que da lugar al fenotipo“scurfy .

Referencias

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica a la que pertenece esta divulgación.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de una población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso en un método para inducir o restablecer la inmunotolerancia en un paciente que padece síndrome IPEX que comprende las etapas de i) administrar al paciente la dicha cantidad de ciclofosfamida, ii) luego injertar al paciente con la dicha cantidad de la población de células Treg y iii) finalmente administrar al paciente la dicha cantidad de un polipéptido de IL-2.

2. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que se usa la dicha cantidad de ciclofosfamida de entre 40 y 200 mg/m2, preferiblemente se usa una cantidad de 150 mg/m2.

3. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que la cantidad de ciclofosfamida se administra al paciente en un bolo 2, 3. 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días antes de injertar al paciente con la cantidad de células Treg.

4. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que las células Treg se preparan transfectando o transduciendo una población de células Tex vivocon un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para FoxP3.

5. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que las células Treg se preparan mediante un enfoque de edición génica para el restablecimiento específico de sitio de la expresión del gen FOXP3 de tipo natural aplicado a células T y/o células madre hematopoyéticas (HSPC) y/o progenitores de células T que portan mutaciones de FOXP3 para corregir defectos funcionales de Treg.

6. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que las células Treg se modifican genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR).

7. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que se injerta una cantidad de entre 1*106/kg y 10*106/kg de células Treg en el paciente.

8. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que el polipéptido de IL-2 es una muteína de IL-2.

9. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que se usa una cantidad del polipéptido de IL-2 de entre 0,5 MUI (millones de unidades internacionales)/día y 1,5 millones de MUI/día.

10. Cantidad de ciclofosfamida, cantidad de la población de células Treg y cantidad de un polipéptido de IL-2 para su uso según la reivindicación 1, en la que el polipéptido de IL-2 se administra al paciente diariamente desde el día 1 hasta el día 5 (el periodo de inducción) después del injerto, y luego cada 2 semanas desde el día 15 hasta el día 180 (el periodo de mantenimiento) después del injerto.