ES2972471T3 - Materiales de referencia celulares multiplex - Google Patents

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Bharathi Anekella
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Abstract

Se divulgan ácidos nucleicos, que comprenden una pluralidad de secuencias de nucleótidos, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende un genotipo que está asociado con una enfermedad o afección. Por ejemplo, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad puede ser una secuencia de nucleótidos humana y cada genotipo puede ser una mutación somática asociada con una neoplasia o una afección cardíaca (por ejemplo, miocardiopatía). También se describen células que comprenden el ácido nucleico, por ejemplo, en las que la célula es una célula humana. Un material de referencia biológico relacionado comprende una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico y una pluralidad de células que no comprenden el ácido nucleico (por ejemplo, células no transfectadas). Las células del material de referencia pueden fijarse (p. ej., con formalina) o incluirse en parafina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Materiales de referencia celulares múltiplex
ANTECEDENTES
Los materiales de referencia basados en células son útiles como controles de procesos al analizar muestras o validar métodos. Sin embargo, los materiales de referencia convencionales son limitados porque puede ser necesaria una biblioteca de controles para analizar una muestra con características desconocidas. Por ejemplo, ciertos ensayos de cáncer detectan varios biomarcadores diferentes, y cada biomarcador puede requerir un material de referencia diferente, lo que complica el análisis. Por lo tanto, son deseables enfoques simplificados para analizar muestras con características desconocidas.
El documento WO 2015/073080 A1 divulga una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos que comprenden múltiples variantes de una secuencia de referencia. La divulgación proporciona además plásmidos, células, métodos y kits que los comprenden.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La invención es tal como se establece en las reivindicaciones.
Aspectos de la divulgación se relacionan con un ácido nucleico, que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende un genotipo que está asociado con una enfermedad o afección. Cada secuencia de nucleótidos tiene una longitud de 600 a 10.000 pares de bases; y la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos de al menos 2 cromosomas diferentes. Por ejemplo, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad puede ser una secuencia de nucleótidos humana, y cada genotipo puede ser una mutación somática o heredable que esté asociada con una neoplasia. Algunos aspectos se relacionan con una célula que comprende el ácido nucleico, por ejemplo, en donde la célula es una célula humana. Otros aspectos se refieren a un material de referencia biológico que comprende una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico y, opcionalmente, una pluralidad de células que no comprenden el ácido nucleico (por ejemplo, células no transfectadas). Las células del material de referencia pueden fijarse (por ejemplo, con formalina) e incluirse en parafina. Alternativamente, el material biológico de referencia comprende una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico y un líquido, opcionalmente en donde el líquido es plasma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un diagrama de la producción de un material biológico de referencia. Las células humanas, como la línea celular GM24385 bien caracterizada, pueden transfectarse con un ácido nucleico que comprende varios genotipos diferentes (variantes multiplexadas). Los genotipos pueden ser de uno o más genes, y cada genotipo puede estar asociado con una enfermedad, como una neoplasia. Las células pueden fijarse (por ejemplo, en formalina), incluirse en parafina y seccionarse. El material de referencia biológico final pueden ser secciones de células fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) proporcionadas en un vial o tubo.
La Figura 2 es un gráfico que representa la cuantificación por PCR digital de ocho genotipos diferentes en materiales de referencia que comprenden células GM24385, en donde algunas de las células GM24385 contienen un ácido nucleico que comprende cada genotipo. Las células se han diluido con células GM24385 que no contienen el ácido nucleico, de modo que el porcentaje de cada genotipo con respecto al alelo de tipo salvaje en el material de referencia es aproximadamente el 4%, aproximadamente el 7% o aproximadamente el 15%.
La Figura 3 es un gráfico que representa la cuantificación de secuenciación de próxima generación de quince genotipos diferentes en materiales de referencia que comprenden células GM24385, en donde algunas de las células GM24385 contienen un ácido nucleico que comprende cada genotipo. Las células se han diluido con células GM24385 que no contienen el ácido nucleico, de modo que el porcentaje de cada genotipo con respecto al alelo de tipo salvaje en el material de referencia es aproximadamente el 4%, aproximadamente el 7% o aproximadamente el 15%.
La Figura 4 es un mapa de plásmido de un plásmido descrito en el Ejemplo 2, que comprende mutaciones genéticas hereditarias en subsecuencias de diversos genes, incluida la mutación c.942+3A>T del gen MSH2 (homólogo 2 de mutS); mutaciones c.2056_2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13), c.2308_2312delGGTAAinsT, c.2641delGinsAAAAy c.3163_3164insG del gen MSH6 (homólogo 6 de mutS); mutación c.1852_1854delAAG del gen MLH1 (homólogo 1 de mutL); mutaciones c.2445+1 G>C, c.2243_2246delAGAAy c.861_864delACAG del gen PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de errores de coincidencia); y mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A).
La Figura 5 es un mapa de plásmido de un plásmido descrito en el Ejemplo 2, que comprende mutaciones genéticas hereditarias en subsecuencias de diversos genes, incluidas las mutaciones c.8975_9100del126, c.1310_1313delAAGA, c.1813dupA y c.9342_9343insAluY del gen BRCA2 (cáncer de mama 2) y mutaciones c.5266_5267insC, c.5177_5180delGAAA, c.3756_3759delGTCT, c.3481_3491delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14), c.3113A>G, c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15), c.2834_2836delins C, y c.68_69delAG del gen BRCA1 (cáncer de mama 1).
La Figura 6 es un mapa de plásmido de un plásmido descrito en el Ejemplo 2, que comprende mutaciones genéticas hereditarias en subsecuencias de diversos genes, incluida la mutación c.942+3A>T del gen MSH2 (homólogo 2 de mutS); mutación c.1662-12 1677del del gen MSH2; mutaciones c.2056_2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13), c.2308_2312delGGTAAinsT, c.2641delGinsAAAA y c.3163_3164insG del gen MSH6 (homólogo 6 de mutS), cada una de las cuales ocurre en la misma secuencia de nucleótidos; mutación c.232_243delinsATGTAAGG del gen MLH1 (homólogo 1 de mutL), mutación c.1852_1854delAAG del gen MLH1; y mutaciones c.2445+1G>C, c.2243_2246delAGAA y c.861_864delACAG del gen PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de errores de coincidencia).
La Figura 7 es un mapa plasmídico de un plásmido descrito en el Ejemplo 2, que comprende mutaciones genéticas hereditarias en subsecuencias de diversos genes, incluida la mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A); mutaciones c.8975_9100del126, c.1310_1313delAAGA, c.1813dupA y c.9342_9343insAluY del gen BRCA2 (cáncer de mama 2); y mutaciones c.5266_5267insC, c.5177_5180delGAAA, c.3756_3759delGTCT, c.3481_3491delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14), c.3113A>G, c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15), c.2834_2836delinsC, y c.68_69delAG del gen BRCA1 (cáncer de mama 1 ).
La Figura 8 describe la estrategia para diseñar un material de referencia múltiple que comprende 10 genotipos diferentes asociados con la miocardiopatía. Se clonaron 10 secuencias de nucleótidos que comprenden mutaciones puntuales o indeles asociados con miocardiopatía en un solo plásmido, y el plásmido se combinó con ADN genómico en varias proporciones diferentes. Las 10 secuencias de nucleótidos también se clonaron en 10 plásmidos diferentes y se combinaron con ADN genómico en varias proporciones diferentes como control, para evaluar el rendimiento del formato multiplexado en relación con un formato combinado.
La Figura 9 muestra resultados de PCR digital en gotas para el lote 102315 del material de referencia de miocardiopatía múltiple, que comprende un plásmido linealizado del material de referencia y ADN genómico mezclados con una frecuencia alélica del 50%, para servir como material de referencia heterocigoto. La PCR identificó correctamente el mutante MYBPC3 3628-41_3628-17del con la frecuencia esperada.
La Figura 10 muestra los resultados de PCT digital en gotas para el lote 102315 del material de referencia de miocardiopatía múltiple, que comprende un plásmido linealizado del material de referencia y ADN genómico mezclados con una frecuencia alélica del 50%, para servir como material de referencia heterocigoto. La PCR identificó correctamente el mutante TNNI3532_534delAAG con la frecuencia esperada.
La Figura 11 muestra la frecuencia alélica promedio calculada de cuatro materiales de referencia según lo determinado por la secuenciación de próxima generación. De izquierda a derecha, las barras etiquetadas "0,45" corresponden al lote 102304, una mezcla de 10 plásmidos diferentes y ADN genómico con una frecuencia alélica del 45%; las barras etiquetadas con “0,5” corresponden al lote 102305, una mezcla de 10 plásmidos diferentes y ADN genómico con una frecuencia alélica del 50%; las barras etiquetadas “0,55” corresponden al lote 102306, una mezcla de 10 plásmidos diferentes y ADN genómico con una frecuencia alélica del 05%; y las barras etiquetadas "0,5" corresponden al lote 102315, una mezcla del plásmido multiplex y ADN genómico con una frecuencia alélica del 50%.
La Figura 12 muestra la frecuencia alélica observada del lote 102315, una mezcla de un plásmido múltiple y ADN genómico con una frecuencia alélica del 50%, según lo determinado por la secuenciación de próxima generación. La mutación 3628-41_3628-17del mostró una frecuencia de alelos considerablemente menor que las otras variantes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Los aspectos proporcionados en el presente documento se relacionan con ácidos nucleicos que comprenden una pluralidad de secuencias de nucleótidos en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende un genotipo que está asociado con una enfermedad o afección; cada secuencia de nucleótidos tiene una longitud de 600 a 10.000 pares de bases; y la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende secuencias de al menos 2 cromosomas diferentes. Los ácidos nucleicos son adecuados para su uso en la producción de materiales de referencia biológicos. Un material de referencia biológico puede comprender una pluralidad de células que comprenden dicho ácido nucleico y parafina, en donde la pluralidad de células están fijadas e incluidas en la parafina. Alternativamente, el material biológico de referencia comprende una pluralidad de células que comprenden el ácido nucleico y un líquido. Puede usarse un único ácido nucleico que comprende varios genotipos diferentes de interés para transfectar un grupo de células para generar un material de referencia que comprende cada genotipo del ácido nucleico. El formato de ácido nucleico único es deseable por muchas razones. Por ejemplo, tener varios genotipos en un único ácido nucleico simplifica la cuantificación del ácido nucleico porque un ácido nucleico necesita cuantificarse con precisión sólo una vez. Este formato también permite "mega" mezclas (mezclas de múltiples ácidos nucleicos, cada una con múltiples genotipos diferentes) que permiten incorporar cientos de genotipos en el mismo control, por ejemplo, permitiendo así un control biosintético que ¡mita múltiples variantes heterocigotas. Además, los ácidos nucleicos que comprenden varios genotipos diferentes permiten transfectar cuantitativamente cada genotipo en una célula a la misma concentración. Las ventajas para los usuarios finales incluyen la confirmación de que los genotipos se evaluaron en un ensayo determinado y la confirmación de que se detectaron genotipos difíciles de secuenciaren una secuenciación utilizando el material de referencia como control positivo. Finalmente, los controles multiplexados son más baratos que las bibliotecas de numerosos controles de un solo mutante.
I. Ácidos Nucleicos
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un ácido nucleico, que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende un genotipo que está asociado con una enfermedad o afección; cada secuencia de nucleótidos tiene una longitud de 600 a 10.000 pares de bases; y la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos de al menos 2 cromosomas diferentes. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. Cuando el término se refiere a ARN, cada timina T de una secuencia de nucleótidos puede sustituirse con uracilo U. Un ácido nucleico como se describe en el presente documento puede denominarse "ácido nucleico de longitud completa" para mayor claridad, por ejemplo, para diferenciar un ácido nucleico y fragmento del mismo.
Un genotipo puede estar asociado con una enfermedad o afección si un sujeto que tiene el genotipo tiene un mayor riesgo de desarrollar la enfermedad o afección. Por ejemplo, una mutación BRCA aumenta el riesgo de que un sujeto desarrolle cáncer de mama. Un genotipo puede estar asociado con una enfermedad o afección si su presencia o ausencia se correlaciona con la progresión o gravedad de una enfermedad o afección. Por ejemplo, ciertas mutaciones somáticas se correlacionan con la agresividad del cáncer, por ejemplo, las mutaciones de ganancia de función ras son mutaciones somáticas que se correlacionan con la agresividad en diversas neoplasias, incluidos adenocarcinomas, carcinomas de células de transición, neuroblastomas, AML, CML, CMML, JMML, ALL, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, mieloma de células plasmáticas, carcinoma hepatocelular, carcinoma de pulmón de células grandes, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de células escamosas, neoplasia de pulmón, adenocarcinomas ductales, tumores endocrinos, carcinoma de células básales, melanomas malignos, angiosarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma, rabdomiosarcoma, mixoma, histiocitoma fibroso malignosarcoma pleomórfico, germinoma, seminoma, carcinoma anaplásico, carcinoma folicular, carcinoma papilar y carcinoma de células de Hurtóle. La enfermedad o afección puede ser cualquiera de las neoplasias anteriores.
La enfermedad o afección puede ser un cáncer hereditario (por ejemplo, tal como un cáncer asociado con una mutación BRCA1 o BRCA2). La enfermedad o afección puede ser un síndrome de cáncer, como el síndrome de cáncer de mama y ovario hereditario o el cáncer de colon hereditario sin poliposis (síndrome de Lynch). La enfermedad o afección puede ser un cáncer ambiental, es decir, un cáncer que no se hereda genéticamente.
La enfermedad o afección puede ser miocardiopatía, hipercolesterolemia, retraso en el desarrollo o pérdida auditiva congénita.
La enfermedad o afección puede ser un trastorno genético, por ejemplo, un trastorno genético autosómico recesivo. La enfermedad o afección puede ser un trastorno genético autosómico dominante, autosómico recesivo, dominante ligado al X, recesivo ligado al X, ligado al Y o mitocondrial.
La enfermedad o afección puede ser un trastorno monogénico o un trastorno multigénico.
La enfermedad o afección puede ser hipercolesterolemia familiar, poliquistosis renal, neurofibromatosis tipo I, esferocitosis hereditaria, síndrome de Marfan o enfermedad de Huntington.
La enfermedad o afección puede ser anemia falciforme, fibrosis quística, enfermedad de Tay-Sachs, fenilcetonuria, mucopolisacaridosis, deficiencia de lipasa ácida lisosomal, enfermedad por almacenamiento de glucógeno o galactosemia.
La enfermedad o afección puede ser distrofia muscular de Duchenne o hemofilia.
La enfermedad o afección puede ser asma, una enfermedad autoinmune (por ejemplo, esclerosis múltiple), una ciliopatía, diabetes, enfermedad cardiaca, hipertensión, enfermedad inflamatoria intestinal, discapacidad intelectual, trastorno del estado de ánimo, obesidad, error refractivo o infertilidad.
Una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende al menos 2 secuencias de nucleótidos, por ejemplo, al menos 2 secuencias de nucleótidos que no se superponen en el ácido nucleico. Una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 secuencias de nucleótidos. Una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender de 2 a 1.000 secuencias de nucleótidos (por ejemplo, de 2 a 1.000 secuencias de nucleótidos que no se superponen). Una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender de 2 a 100 secuencias de nucleótidos, tales como de 2 a 50, de 2 a 20, de 2 a 12, de 3 a 1.000, de 3 a 100, de 3 a 50, de 3 a 20, de 3 a 12, de 4 a 1.000, 4 a 100, 4 a 50, 4 a 20, 4 a 12, 5 a 1.000, 5 a 100, 5 a 50, 5 a 20, 5 a 12, 6 a 1.000, 6 a 100, 6 a 50, 6 a 20, 6 a 12, 7 a 1.000, 7 a 100, 7 a 50, 7 a 20, 7 a 12, 8 a 1.000, 8 a 100, 8 a 50, 8 a 20, 8 a 12, 9 a 1.000, 9 a 100, 9 a 50, 9 a 20, 9 a 12, 10 a 1.000, 10 a 100, 10 a 50, 10 a 20, 10 a 16 o 10 a 12 secuencias de nucleótidos. Una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede consistir en 2, 3, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 o 200 secuencias de nucleótidos diferentes.
En determinadas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad es la secuencia de nucleótidos de un gen natural o una subsecuencia del mismo. Un gen natural incluye genotipos sanos y genotipos asociados con una enfermedad o afección. El término "genotipo" se refiere a un rasgo genético, tal como alelomorfismo, polimorfismo, variante de empalme, variante reguladora, mutación, indel (mutación de inserción o deleción), repetición de trinucleótido, codón de parada prematuro, translocación, reordenamiento somático, fusión genética o la presencia de una secuencia de nucleótidos extraña o exógena, como un virus, provirus o bacteria. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad puede comprender una subsecuencia de un gen, en donde la subsecuencia comprende un alelomorfismo o una mutación somática, tal como un indel. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad comprende un genotipo, por ejemplo, una mutación o polimorfismo. El genotipo puede ser un polimorfismo de un solo nucleótido, una mutación puntual, un codón de parada prematuro, una repetición de trinucleótido, una translocación, un reordenamiento somático, un alelomorfo, una variante de un solo nucleótido, una inserción o deleción ("indel"), una variante reguladora o una fusión genética. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede comprender un genotipo sano en una posición en la que se sabe que ocurren mutaciones. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede comprender un exón de un gen o una subsecuencia de un exón. De este modo, un genotipo puede causar la mutación, deleción y/o inserción de al menos un aminoácido del polipéptido o proteína codificado por el gen (o exón) o causar un truncamiento o adición al polipéptido o proteína codificado por el gen (o exón), por ejemplo, si el genotipo inserta o elimina un codón de parada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede consistir en una secuencia de nucleótidos de un gen o una subsecuencia del mismo. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede consistir en un exón de un gen o una subsecuencia de un exón.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen (por ejemplo, un gen humano) o una región reguladora del mismo.
En determinadas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad es suficientemente larga para identificarse mediante secuenciación de ácidos nucleicos, por ejemplo, secuenciación de próxima generación (NGS). En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de una pluralidad comprende un genotipo de interés en una posición que puede identificarse mediante secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el genotipo de interés, tal como una mutación, puede estar situado en o cerca de la mitad de una secuencia de nucleótidos.
Un ácido nucleico puede tener una longitud de aproximadamente 1.000 nucleótidos a aproximadamente 100.000 nucleótidos, tal como de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 60.000 nucleótidos de longitud, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 50.000 nucleótidos de longitud, o de aproximadamente 8.000 a aproximadamente 20.000 nucleótidos de longitud.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad tiene al menos 600 nucleótidos (o pares de bases) de longitud. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede tener de 600 a 10.000 nucleótidos (o pares de bases) de longitud, tal como de 600 a 5.000, de 600 a 2.000, de 600 a 1.000, de 600 a 2.000, de 600 a 3.000 o de 600 a 1.200 nucleótidos (o pares de bases) de longitud. Por consiguiente, una subsecuencia de un gen (y/o región reguladora del mismo) puede tener de 600 a 10.000 nucleótidos (o pares de bases) de longitud, tal como de 600 a 5.000, de 600 a 2.000, de 600 a 1.000, de 600 a 3.000 o de 600 a 1.200. nucleótidos (o pares de bases) de longitud.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede comprender un genotipo de interés en una posición que está al menos a 20 nucleótidos (o pares de bases) del extremo 5' y/o del extremo 3' de la secuencia de nucleótidos, tal como al menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200 o 250 nucleótidos (o pares de bases) del extremo 5' y/o 3' de la secuencia de nucleótidos. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad puede comprender un genotipo de interés en una posición que está de 20 a 5.000 nucleótidos (o pares de bases) desde el extremo 5' y/o el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos, tal como de 25 a 5.000, de 30 a 5.000, 40 a 5.000, 50 a 5.000, 60 a 5.000, 70 a 5.000, 80 a 5.000, 90 a 5.000, 100 a 5.000, 120 a 5.000, 150 a 5.000, 200 a 5.000, 250 a 5.000, 25 hasta 2.000, 30 a 2.000, 40 a 2.000, 50 a 2.000, 60 a 2.000, 70 a 2.000, 80 a 2.000, 90 a 2.000, 100 a 2.000, 120 a 2.000, 150 a 2.000, 200 a 2.000, 250 a 2.000, 25 a 1.000, 30 a 1.000, 40 a 1.000, 50 a 1.000, 60 a 1.000, 70 a 1.000, 80 a 1.000, 90 a 1.000, 100 a 1.000, 120 a 1.000, 150 a 1.000, 200 a 1.000, 250 a 1.000, 25 a 750, 30 a 750, 40 a 750, 50 a 750, 60 a 750, 70 a 750, 80 a 750, 90 a 750, 100 a 750, 120 a 750, 150 a 750, 200 a 750, 250 a 750, 25 a 500, 30 a 500, 40 a 500, 50 a 500, 60 a 500, 70 a 500, 80 a 500, 90 a 500, 100 a 500, 120 a 500, 150 a 500, 200 a 500, o de 250 a 500 nucleótidos desde el extremo 5' y/o 3' de la secuencia de nucleótidos.
En algunas realizaciones, un ácido nucleico puede comprender poliadenosina, por ejemplo, una cola de poliadenosina 3' (cola poli-A). El ADN o el ARN pueden comprender poliadenosina. Si el ADN comprende poliadenosina, el ADN puede ser bicatenario, de modo que una secuencia complementaria de politimidina se transcribe en un ARNm que comprende una cola de poliadenosina.
Un ácido nucleico puede estar metilado o sustancialmente libre de nucleótidos metilados.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende un origen de replicación. El origen de replicación puede permitir la clonación y/o la producción por lotes del ácido nucleico. El origen de replicación puede ser un origen de replicación a partir de levadura (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae)o bacteria (por ejemplo,Escheríchia coli),por ejemplo, de manera que el ácido nucleico puede clonarse y/o producirse en levadura (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae)o bacterias (por ejemplo,Escheríchia coli).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende un promotor, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es ADN. Un promotor se une a una ARN polimerasa, como la ARN polimerasa SP6. Un promotor puede ser un promotor SP6. La secuencia de nucleótidos de un promotor puede ser de una especie diferente (por ejemplo, virus, bacteria, levadura) que una secuencia de nucleótidos de una pluralidad, por ejemplo, para la transcripciónin vitrode la pluralidad de secuencias de nucleótidos, que pueden ser secuencias de nucleótidos humanas, o Secuencias de nucleótidos de patógenos humanos. La secuencia de nucleótidos de un promotor puede ser de una especie diferente (por ejemplo, virus, bacterias, levaduras) de cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un plásmido, tal como un plásmido superenrollado, un plásmido circular relajado o un plásmido lineal.
También se describe en el presente documento una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico, en donde cada ácido nucleico de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico es un fragmento de un ácido nucleico de longitud completa como se describe en el presente documento, supra, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos del ácido nucleico de longitud completa está codificada por al menos un fragmento de ácido nucleico de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico. Se puede obtener una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, procesando múltiples copias de un único ácido nucleico de ADN de longitud completa que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, transfectando células con el único ácido nucleico de ADN de longitud completa (por ejemplo, mediante electroporación), fijar las células (por ejemplo, con formalina), incrustar las células (por ejemplo, en parafina) y/o extraer ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN) de las células. El procesamiento de múltiples copias de un único ácido nucleico de ADN de longitud completa correspondiente a uno de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento, supra, puede degradar el único ácido nucleico de ADN de longitud completa en fragmentos de ADN más pequeños, por ejemplo, una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico. Esta pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede comprender la misma pluralidad de secuencias de nucleótidos que el ácido nucleico de ADN único, pero cualquier secuencia de nucleótidos dada de la pluralidad de secuencias de nucleótidos puede aparecer en diferentes fragmentos de ácido nucleico de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en lugar de en el mismo fragmento de ácido nucleico. La secuenciación de próxima generación se puede utilizar para identificar secuencias de nucleótidos que se producen en dos o más fragmentos de ácido nucleico de una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico. Por tanto, la secuenciación de una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico debería identificar la misma pluralidad de secuencias de nucleótidos que la secuenciación del único ácido nucleico de ADN de longitud completa a partir del cual se originó la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico. Se puede mezclar una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico con ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, ARN y/o ADN) de células transfectadas con el único ácido nucleico de ADN de longitud completa y/o células no transfectadas (por ejemplo, células no transfectadas añadidas a un material de referencia, verinfra).Por lo tanto, se pueden mezclar una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico con ADN celular, por ejemplo, ADN genómico.
También se describe en el presente documento un método para producir un ácido nucleico como se describe en el presente documento (por ejemplo, a una temperatura a la que la ADN polimerasa muestra actividad polimerasa). El método puede comprender incubar una mezcla de reacción que comprende un molde de ADN, ADN polimerasa y ribonucleótidos trifosfato, produciendo así un ácido nucleico de ADN. El molde de ADN también puede ser un ácido nucleico como se describe en el presente documento.
También se describe en el presente documento una mezcla de reacción que comprende un ácido nucleico como se describe en el presente documento, una polimerasa y trifosfatos de ribonucleótidos o trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP). La polimerasa puede ser una ADN polimerasa (por ejemplo, para usar con desoxirribonucleótidos trifosfatos) o una ARN polimerasa (por ejemplo, para usar con ribonucleótidos trifosfatos). La polimerasa puede ser de una especie diferente a una secuencia de nucleótidos de una pluralidad. La mezcla de reacción puede comprender un inhibidor de ADNasa, por ejemplo, de una especie diferente a una secuencia de nucleótidos de una pluralidad.
Un ácido nucleico puede comprender secuencias de nucleótidos de cualquier origen, tal como origen viral, bacteriano, protista, fúngico, vegetal o animal. En determinadas realizaciones, las secuencias de nucleótidos de una pluralidad son secuencias de nucleótidos humanos. Las secuencias de nucleótidos de una pluralidad también pueden comprender secuencias de nucleótidos de patógenos humanos, por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender secuencias de nucleótidos virales, bacterianos, protistas o fúngicos, en donde el virus, bacteria, protista u hongo es un patógeno humano.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una composición que comprende un ácido nucleico como se describe en el presente documento y ADN genómico. En determinadas realizaciones, la relación de (a) el número de copias de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un gen en el ácido nucleico con respecto a (b) el número de copias del gen en el ADN genómico es de aproximadamente 1:15.000 a aproximadamente 500:1. en la composición, tal como aproximadamente 1:10.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:5.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:2.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:1.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:500 a aproximadamente 500:1, de 1:5.000 a aproximadamente 100:1 , de aproximadamente 1 :2.000 a aproximadamente 100:1 , de aproximadamente 1 :1.000 a aproximadamente 100:1, de aproximadamente 1:500 a aproximadamente 100:1, de aproximadamente 1:250 a aproximadamente; de aproximadamente 100:1 , aproximadamente 1:200 a aproximadamente 100:1 , aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:50 a aproximadamente 50:1, aproximadamente 1:25 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 1:20 a aproximadamente; de aproximadamente 20:1, o aproximadamente 1:10a aproximadamente 10:1 en la composición. En determinadas realizaciones, la relación de (a) el número de copias de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un gen en el ácido nucleico con respecto a (b) el número de copias del gen en el ADN genómico es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 2:1., de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1, o de aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:2. En determinadas realizaciones, la relación de (a) el número de copias de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un gen en el ácido nucleico con respecto a (b) el número de copias del gen en el ADN genómico es aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:15, aproximadamente 1:10 o aproximadamente 1:5.
En determinadas realizaciones, la relación entre el número de copias del ácido nucleico y el número de copias del ADN genómico en la composición es de aproximadamente 1:15.000 a aproximadamente 500:1 en la composición, tal como de aproximadamente 1:10.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:5.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:2.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:1.000 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:500 a aproximadamente 500:1, 1:5.000 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:2.000 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:1.000 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:500 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:250 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:200 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1, aproximadamente 1:50 a aproximadamente 50:1, aproximadamente 1:25 a aproximadamente 25:1, aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1, o aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1 en la composición. En determinadas realizaciones, la relación entre el número de copias del ácido nucleico y el número de copias del ADN genómico en la composición es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 2:1, de aproximadamente 1:50 a aproximadamente 1:1o aproximadamente 1:30 a aproximadamente 1:2. En determinadas realizaciones, la relación entre el número de copias del ácido nucleico y el número de copias del ADN genómico en la composición es aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:15, aproximadamente 1:10 o aproximadamente 1:5.
Una composición puede comprender al menos dos ácidos nucleicos como se describe en el presente documento, por ejemplo, en donde al menos dos de los ácidos nucleicos comprenden diferentes pluralidades de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, una composición puede comprender una pluralidad de ácidos nucleicos como se describe en el presente documento, en donde 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 2 a 20, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5 o 2 a 4 ácidos nucleicos de la pluralidad comprenden cada uno diferentes pluralidades de secuencias de nucleótidos.
Un ácido nucleico comprende secuencias de nucleótidos de diferentes genes. Al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser de diferentes genes humanos. Un ácido nucleico comprende secuencias de nucleótidos de genes que se encuentran en diferentes genes. Una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender secuencias de nucleótidos de genes que se encuentran en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 genes humanos diferentes.
Un ácido nucleico comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos cromosomas diferentes. Al menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser de al menos dos cromosomas humanos diferentes. Un ácido nucleico comprende secuencias de nucleótidos de genes que se encuentran en al menos dos cromosomas diferentes. Una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender secuencias de nucleótidos de genes que se encuentran en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cromosomas humanos diferentes.
II. REALIZACIONES RELACIONADAS CON EL CÁNCER
La enfermedad o afección puede ser, por ejemplo, una neoplasia, tal como cáncer. Las neoplasias incluyen cáncer de pulmón, cáncer linfoide, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena crónica, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, mieloma de células plasmáticas, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de intestino grueso, cáncer de colon, cáncer de tracto urinario, cáncer del sistema nervioso central, neuroblastoma, cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular y cáncer de tejidos blandos. La enfermedad o afección puede ser adenocarcinoma, carcinoma de células transicionales, carcinoma de mama, adenocarcinoma cervical, adenocarcinoma de colon, adenoma de colon, neuroblastoma, AML, CML, CMML, JMML, ALL, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin, mieloma de células plasmáticas, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de pulmón de gran tamaño, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células escamosas, neoplasia de pulmón, adenocarcinoma ductal, tumor endocrino, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de piel de células básales, carcinoma de piel de células escamosas, melanoma, melanoma maligno, angiosarcoma, leiomiosarcoma, liposarcoma, rabdomiosarcoma, mixoma, histiocitoma fibroso malignosarcoma pleomórfico, adenocarcinoma de estómago, germinoma, seminoma, carcinoma anaplásico, carcinoma folicular, carcinoma papilar o carcinoma de células de Hurthle. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede estar asociada con un tumor sólido. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede estar asociada con un tumor sólido.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABL1, ALK, BCR, CBFB, FGFR1, JAK2, KMT2A, MECOM, MKL1, NOTCH1, NUP214, PDGFRA, PDGFRB, PICALM, RARA, RUNX1, RUNX1T1, TAL1 y TCF3. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABL1, ALK, BCR, CBFB, FGFR1, JAK2, KMT2A, MECOM, MKL1, NOTCH1, NUP214, PDGFRA, PDGFRB, PICALM, RARA, RUNX1, RUNX1T1, TAL1 y TCF3.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1 y GNAS. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en MTOR, MPL, NRAS, PARP1, AKT3, DNMT3A, MSH2, IDH1, VHL, MLH1, MYD88, CTNNB1, ATR, PIK3CA, FGFR3, PDGFRA, KIT, FBXW7, APC, GABRG2, NPM1, EGFR, MET, BRAF, EZH2, JAK2, GNAQ, RET, PTEN, ATM, KRAS, PTPN11, FLT3, RB1, PARP2, ARHGAP5, AKT1, RAD51, IDH2, TP53, NF1, SMAD4, AKT2, ERCC1 y GNAS.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y STK11. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en AKT1, ATM, BRAF, CDKN2A, CSF1R, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB4 ("HER4"), FGFR1, FGFR2, FGFR3, GNA11, HRAS, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, NOTCH1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y STK11.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6, MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2 y VHL. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABL1, AKT1, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ATM, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6 , CDKN2A, CDKN2B, CSF1R, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6, EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HER/ERBB2, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MET, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6 , MTOR, MYC, MYCN, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS, NTRK1, PALB2, PDGFRA, PDGFRB, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2 y VHL.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2 y KRAS. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2 y KRAS.
Cada subsecuencia puede comprender una mutación que esté asociada con la enfermedad o afección o un genotipo sano en una posición en la que se sabe que ocurren dichas mutaciones.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2 y KRAS, y la subsecuencia comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en la mutación V600E del gen BRAF, mutación T790M del gen EGFR, mutación delL747-P753insS del gen EGFR, mutación A775_G776insYVMA del gen ERBB2 y mutación G12D del gen KRAS. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, EGFR, ERBB2 y KRAS, y cada subsecuencia comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en la mutación V600E del gen BRAF, mutación T790M del gen EGFR, mutación delL747-P753insS del gen EGFR, mutación A775_G776insYVMA del gen ERBB2 y mutación G12D del gen KRAS.
Varias mutaciones somáticas y de línea germinal diferentes se correlacionan con el cáncer, y se puede seleccionar un genotipo de una secuencia de nucleótidos a partir de dichas mutaciones.
La base de datos COSMIC (Catálogo de Mutaciones Somáticas en el Cáncer) se puede usar para identificar genes y genotipos (por ejemplo, variantes) que están asociados con neoplasias, que se pueden usar para seleccionar una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos (http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado de cualquier gen en la base de datos COSMIC, por ejemplo, en donde la subsecuencia comprende un genotipo (por ejemplo, una variante, tal como una mutación) que está asociado con el cáncer. En algunas realizaciones, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados de los genes en la base de datos COSMIC. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado de cualquier gen en la base de datos COSMIC.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de una secuencia de nucleótidos en la base de datos COSMIC, por ejemplo, en donde la subsecuencia comprende un genotipo que está asociado con el cáncer. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de las secuencias de nucleótidos en la base de datos COSMIC. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de una secuencia de nucleótidos en la base de datos COSMIC.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado de ABI1, ABL1, ABL2, ACSL3, ACURI, AF15Q14, AF1Q, AF3P21, AF5Q31, AKAP9, AKT1, AKT2, AKT3, AL017, ALDH2, ALK, AMER1, APC, APEX1, AR, AR1D1A, ARAF, ARHGAP5, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATP11B, ATP1A1, ATP2B3, ATR, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL2L1, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC2, BIRC3, BLM, BMPR1A, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIP1, BTG1, BUB1B, C120RF9, C150RF21, C150RF55, C160RF75, C20RF44, CACNA1D, CALR, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CASP8, CBFA2T1, CBFA2T3, CBFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6 , CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD44, CD74, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2A(PL4), CDKN2B, CDKN2C, CDX2, CEBPA, CEP1, CEP89, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHN1, CIC, CUTA, CLIP1, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1A1, COL2A1, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CSF1R, CSF3R, CSNK2A1, CTNNB1, CUX1, CYLD, D10S170, DAXX, DCTN1, DDB2, DDIT3, DDR2, DDX10, DDX5, DDX6 , DEK, DICERL, DNM2, DNMT3A, DLTX4, EBFL, ECT2L, EGFR, EIF3E, EIF4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERBB2 ("HER2"), ERBB3, ERBB4 ("HER4"), ERC1, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ESR1, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EXT1, EXT2, EZH2, EZR, FACL6 , FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FAS, FBXOI1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFR10P, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FH, FHIT, FIP1L1, FLJ27352, FLT3, FLU, FNBP1, FOX03A, FOX04, FOXA1, FOXL2, FOXOIA, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GABRA6, GABRG2, GAS6, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, H3F3B, HCMOGT-1, HEAB, HERPUD1, HEY1, HIP1, HIST1H3B, HIST1H4L, HLA-A, HLF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNF1A, HNRNPA2B1, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HPAS, HRAS, HSPCA, HSPCB, IDH1, IDH2, IGF1R, IGH, IGK, IGL, IHD2, IKZF1, IL2, IL21R, IL6 , IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIAA1598, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KMT2A, KMT2D, KRAS, KTN1, LAF4, LASP1, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LM02, LMNA, LMOL, LPP, LRIG3, LSM14A, LYL1, MAF, MAFB, MALAT1, MALT1, MAML2, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAX, MCL1, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECOM, MECT1, MED 12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLH1, MLL, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MTOR, MUC1, MUTYH, MY018A, MY05A, MYB, MYC, MYC1, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NAB2, NACA, NBSL, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFATC2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2- 1, NKX2-1, NKX2-8, NONO, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NR4A3, NRAS, NRAS/CSDE1, NRG1, NSD1, NT5C2, NTRK1, NTRK3, NUMA1, NUP214, NUP98, NUTM2A, NUTM2B, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB2, PARP1, PARP2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDCD1LG2, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PHF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG1, PLCG1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNP, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPFIBP1, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1A, PSIP1, PTCH1, PTEN, PTPN11, PTPRB, PTPRC, PTPRK, PWWP2A, RAB5EP, RAC1, RAD21, RAD51, RAD51L1, RAF1, RAFT, RALGDS, RANBP17, RAP1GDS1, RARA, RB1, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RHEB, RHOA, RIT1, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RPS6KB1, RSP02, RSP03, RUNDC2A, RUNX1, RUNX1T1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRC, SRGAP3, SRSF2, SS18, SS18L1, SSX1, SSX2, SSX4, STAG2, STAT3, STAT5B, STAT6 , STK11, STL, SUFU, SUZ12, SYK, TAF15, TAL1, TAL2, TALI, TBL1XR1, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6 , TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIAF1, TIF1, TLX1, TLX3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TRRAP, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, UBR5, USP6 , VHL, VT11A, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WWTR1, XPA, XPC, XP01, YWHAE, ZCCHC8, ZNF145, ZNF198, ZNF217, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, y ZRSR2, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de las anteriores. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de cualquiera de los genes anteriores y/o las respectivas regiones reguladoras de los mismos. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado de cualquiera de los genes anteriores y/o sus respectivas regiones reguladoras. Cada uno de los genes descritos en este párrafo corresponde a un "nombre de gen" que figura en la base de datos COSMIC (http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Por lo tanto, la base de datos COSMIC puede usarse para identificar sinónimos del nombre del gen, la secuencia de un gen y variantes (por ejemplo, genotipos) que pueden usarse para seleccionar una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en MSH2 (homólogo 2 de mutS), MSH6 (homólogo 6 de mutS), MI,H1 (homólogo 1 de mutL), PMS2 (homólogo 2 de PMS1), componente del sistema de reparación de errores de coincidencia), CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A), BRCA2 (cáncer de mama 2) y BRCA1 (cáncer de mama 1), y/o las respectivas regiones reguladoras de cualquiera de los anteriores. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en MSH2, MSH6, MLH1, PMS2, CDKN2A., BRCA2 y BRCA1, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en MSH2, MSH6 , MLH1, PMS2, CDKN2A, BRCA2 y BRCA1, y/o las respectivas regiones reguladoras de cualquiera de los anteriores.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BMPR1A (receptor de proteína morfogenética ósea, tipo IA), BRCA1 (cáncer de mama 1), BRCA2 (cáncer de mama 2), CDH1 (cadherina-1), CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A), EPCAM (molécula de adhesión de células epiteliales), MI,H1 (homólogo mutL 1), MSH2 (homólogo mutS 2), MSH6 (homólogo mutS 6), MUTYH (ADN glicosilasa mutY), PALB2 (compañero y localizador de BRCA2), PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de desajustes), PTEN (homólogo de fosfatasa y tensina), SMAD4 (miembro 4 de la familia SMAD; madres contra homólogo 4 decapentapléjico), STK11 (serina/treonina quinasa 11), y TP53 (proteína tumoral p53), y/o las respectivas regiones reguladoras de cualquiera de los anteriores. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en BMPR1A, BRCA1, BRCA2, CDH1, CDKN2A., EPCAM, MLH1, MSH2, MSH6, MUTYH, PALB2, PMS2, PTEN, SMAD4, STK11 y TP53, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BMPR1A, BRCA1, BRCA2, CDH1, CDKN2A, EPCAM, MLH1, MSH2, MSH6, MUTYH, PALB2, PMS2, PTEN, SMAD4, STK11 y TP53, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en AKT1, AKT2, AKT3, APC, ARHGAP5, ATM, ATR, BRAF, CTNNB1, DNMT3A, EGFR, ERBB2, ERCC1, EZH2, FBXW7, FGFR3, FLT3, GABRA6 , GABRG2, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, MSH2, MTOR, MYD88, NF1, NPM1, NRAS/CSDE1, PARP1, PARP2, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RAD51, RB1, RET, SMAD4, TP53 y VHL, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de las anteriores. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en AKT1, AKT2, AKT3, APC, ARHGAP5., Cajero automático, ATR, BRAF, CTNNB1, DNMT3A, EGFR, ERBB2, ERCC1, EZH2, FBXW7, FGFR3, FLT3, GABRA6, GABRG2, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, MSH2, MTOR, MYD88, NF1, NPM1, NRAS/CSDE1, PARP1, PARP2, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RAD51, RB1, RET, SMAD4, TP53 y VHL, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de las anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en AKT1, AKT2, AKT3, APC, ARHGAP5, ATM, ATR, BRAF, CTNNB1, DNMT3A, EGFR, ERBB2, ERCC1, EZH2, FBXW7, FGFR3, FLT3, GABRA6 , GABRG2, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, MSH2, MTOR, MYD88, NF1, NPM1, NRAS/CSDE1, PARP1, PARP2, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RAD51, RB1, RET, SMAD4, TP53 y VHL, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de las anteriores. Las mutaciones de los genes anteriores que están asociadas con el cáncer se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1. Mutaciones somáticas seleccionadas enumeradas en la base de datos COSMIC.
Una secuencia de nucleótidos puede comprender un genotipo seleccionado del grupo que consiste en la mutación c.145G>A del gen AKT1, la mutación c.49G>A del gen AKT1, la mutación c.268G>T del gen AKT2, la mutación c.371A>T del gen AKT3, mutación c.4248delC del gen APC, mutación c.4348C>T del gen APC, mutación c.4666_4667insA del gen APC, mutación c.1864G>A del gen ARHGAP5, mutación c.1058_1059delGT del gen ATM, mutación c. 5557G>A del gen ATM, mutación c.3790_3796delATAAAAG del gen ATR, mutación c. 1799T>A del gen BRAF, mutación c.121A>G del gen CTNNB1, mutación c.2644C>T del gen DNMT3A, mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR, mutación c.2310_2311insGGT del gen EGFR, mutación c.2369C>T a gen EGFR, mutación c.2573T>G del gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2, mutación c.287C>Adel gen ERCC1, mutación c.1937A>T del gen EZH2, mutación c.1394G>A del gen FBXW7, mutación c.746C>G del gen FGFR3, mutación c.2503G>T del gen FLT3, mutación c.763G>C del gen GABRA6, mutación c. 1355A>G del gen GABRG2, mutación c.626A>C del gen GNAQ, mutación c.601C>T del gen GNAS, mutación c.394C>T del gen IDH1, mutación c.515G>A del gen IDH2, mutación c. 419G>A del gen IDH2, mutación c.1849G>T del gen JAK2, mutación c.2447A>T del gen KIT, mutación c.1679T>A del gen KIT, mutación c.35G>A del gen KRAS, mutación c. 3757T>G del gen MET, mutación c.1151T>A del gen MLH1, mutación c.1544G>T del gen MPL, mutación c.2250delG del gen MSH2, mutación c.2359_2360delCT del gen MSH2, mutación c.2664A>T del gen MTOR, mutación c.794T>C del gen MYD88, mutación c.2987_2988insAC del gen NF1, mutación c.4084C>T del gen NF1, mutación c.7501delG del gen NF1, mutación c.863_864insTCTG del gen NPM1, mutación c.182A> G del gen NRAS, mutación c.2738delG del gen PARP1, mutación c.398A>C del gen PARP2, mutación c.1694_1695insA del gen PDGFRA, mutación c.2525A>T del gen PDGFRA, mutación c.1633G>A del gen PIK3CA, mutación c.3140A>Gto gen PIK3CA, mutación c.3204_3205insA del gen PIK3CA, mutación c.388C>T del gen PTEN, mutación c.741_742insA del gen PTEN, mutación c.800delA del gen PTEN, mutación c.226G>A del gen PTPN11, mutación c.433C>T del gen RAD51, mutación c.958C>T del gen RB1, mutación c.2753T>C del gen RET, mutación c.1394_1395insT del gen SMAD4, mutación c.818G>A del gen TP53, mutación c.743G>A del gen TP53, mutación c.723delC del gen TP53, mutación c.524G>A del gen TP53, mutación c.263delC del gen TP53 y mutación c.426_429delTGAC del gen VHL. Al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden comprender un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores.
Una secuencia de nucleótidos puede comprender un genotipo seleccionado del grupo que consiste en la mutación c.942+3A>T del gen MSH2 (homólogo 2 de mutS), la mutación c.1662-12 1677del del gen MSH2, la mutación c.2056 _2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO : 13) del gen MSH6 (homólogo 6 de mutS), mutación c.2308_2312delGGTAAinsT del gen MSH6, mutación c.2641delGinsAAAA del gen MSH6 , mutación c.3163_3164insG del gen MSH6, mutación c.232_243delinsATGTAAGG del gen MLH1 (homólogo 1 de mutL), mutación c ,1852_1854delAAG del gen MI,H1, mutación C.2445+ 1 G>C del gen PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de errores de coincidencia), mutación c.2243_2246delAGAA del gen PMS2, mutación c.2253T>C del gen PMS2, mutación c.861_864delACAG del gen PMS2, mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A (inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 2A), mutación c.8975_9100del126 del gen BRCA2 (cáncer de mama 2), mutación c.9203del126 del gen BRCA2, mutación c.1310_1313delAAGA del gen BRCA2, mutación c.1813dupA del gen BRCA2, mutación c.9342_9343insAluY del gen BRCA2, mutación c.5266_5267insC del gen BRCA1 (cáncer de mama 1), mutación c.5177_5180delGAAA del gen BRCA1, mutación c.3756_3759delGTCT del gen BRCA1, mutación c.3481_3491delGAAGAT ACTAG (SEQ ID NO: 14) del gen BRCA1, mutación c.3113A>G del gen BRCA1, mutación c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15) del gen BRCA1, mutación c.2834_2836delinsC del gen BRCA1, y mutación c.68_69delAG del gen BRCA1. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden comprender un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores.
Tabla 2. Mutaciones heredables seleccionadas
Una secuencia de nucleótidos puede comprender un genotipo seleccionado del grupo que consiste en la mutación c.675+1G>C del gen BMPR1A, la mutación c.817C>T del gen BMPR1A, la mutación c.1016dupA del gen BRCA1, la mutación c.1175_1214delTGTTAGGTTCTGATGACTCACATGATGGGGAGTCTGAATC (SEQ ID NO: 23) del gen BRCA1, mutación c.1387_1390delinsGAAAG del gen BRCA1, mutación c.181 T>Gdelgen BRCA1, mutación c.1953_1956delGAAA del gen BRCA1, mutación c.2834 _2836delinsC del gen BRCA1, mutación c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15) del gen BRCA1, mutación c.3113A>G del gen BRCA1, mutación c.3481_3491 delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14) del gen BRCA1, mutación c.3756_3759delGTCT del gen BRCA1, mutación c.406_407insA del gen BRCA1, mutación c.4964_4982delCTGGCCTGACCCCAGAAGA (SEQ ID NO: 19) del gen BRCA1, mutación c.5096G>Adel gen BRCA1, mutación c.5177_5180delGAAA del gen BRCA1, mutación c.5177_5180delGAAA del gen BRCA1, mutación c.5266_5267insC del gen BRCA1, mutación c.68_69delAG del gen BRCA1, mutación c.815_824dupAGCCATGTGG (SEQ ID NO: 25) del gen BRCA1, mutación c. 10095delCinsGAATTATATCT (SEQ ID NO: 29) del gen BRCA2, mutación c.1310_1313delAAGA del gen BRCA2, mutación c.1310_1313delAAGA del gen BRCA2, mutación c.156_157insAluYa5 del gen BRCA2, mutación c.1813dupA del gen BRCA2, mutación c.2588dupA del gen BRCA2, mutación c.2808_281 IdelACAA del gen BRCA2, mutación c.4037_4043delinsT del gen BRCA2, mutación c.5073dupA del gen BRCA2, mutación c.5350_5351delAA del gen BRCA2, mutación c.5946delT del gen BRCA2, mutación c.6275_6276delTT del gen BRCA2, mutación c.7762_7764delinsTT del gen BRCA2, mutación c.8537_8538delAG del gen BRCA2, mutación c.8902_8913delinsTCCC del gen BRCA2, mutación c.9203del126 del gen BRCA2, mutación c.9253dupA del gen BRCA2, mutación c.9342_9343insAluY del gen BRCA2, mutación c .1792C>T del gen CDH1, mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A, mutación c.429G>A del gen EPCAM, mutación c.523C>T del gen EPCAM, mutación c.556-14A>G del gen EPCAM, mutación c ,1852_1854delAAG del gen MI,H1, mutación c.
1852_1854delAAG del gen MI,H1, mutación c.232_243delinsATGTAAGG del gen MI,H1, mutación c.382delG del gen MLH1, mutación c.704_723delATAAAACCCTAGCCTTCAAA (SEQ ID NO: 33) del gen MI.H1, mutación c.1076G>C del gen MSH2, mutación c.1662-12_1677del del gen MSH2, mutación c.942+3A>T del gen MSH2, mutación c.942+3A>T delgenMSH2, mutación c.2056_2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13) del gen MSH6, mutación c.2308_2312delGGTAAinsT del gen MSH6, mutación c.2641delGinsAAAA del gen MSH6, mutación c.3163_3164insG del gen MSH6, mutación c.3261delC del gen MSH6 , mutación c.3939_3957dupTCAAAAGGGACATAGAAAA (SEQ ID NO: 36) del gen MSH6, mutación c.741del un del gen MSH6, mutación c.1147delC del gen MUTYH, mutación c.1187G>A del gen MUTYH, mutación c.1435G>T del gen MUTYH, mutación c.536A>G del gen MUTYH, mutación c.933+3A>C del gen MUTYH, mutación c.2386G>T del gen PALB2, mutación c.3113G>A del gen PALB2, mutación c. 1261C>T del gen PMS2, mutación c.137G>T del gen PMS2, mutación c.2117delA del gen PMS2, mutación c.2243_2246delAGAA del gen PMS2, c.2253T>C del gen PMS2, mutación c.2445+1 G>C del gen PMS2, mutación c.861_864delACAG del gen PMS2, mutación c.861_864delACAG del gen PMS2, mutación c.511C>T del gen PTEN, mutación c.758_759insAT del gen PTEN, mutación c.987_996dupTAAAGACAAA (SEQ ID NO: 38) del gen PTEN, mutación c.1206_1207insT del gen SMAD4, mutación c.1353_1354insGCTACTGCACAAGCTGCAGCAGCTGCCC (SEQ ID NO: 40) del gen SMAD4, mutación c.1529delG del gen SMAD4, mutación c.842_843insC del gen STK11, mutación c.637C>T del gen TP53 y mutación c.916C>T del gen TP53. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden comprender un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores.
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores. Al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1., KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de las anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores.
Una secuencia de nucleótidos puede comprender un genotipo seleccionado del grupo que consiste en la mutación c.1799T>A del gen BRAF, la mutación c.121A>G del gen CTNNB1, la mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR, la mutación c.2369C>T del gen EGFR, mutación c.2573T>G del gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2, mutación c.394C>T del gen IDH1, mutación c.1679T>A del gen KIT, mutación c.35G>A del gen KRAS, mutación C. 182A>Gdel gen NRAS/CSDE1, mutación c.2525A>T del gen PDGFRA, mutación c. 1633G>A del gen PIK3CA, mutación c.3140A>G del gen PIK3CA, mutación c.800delA del gen PTEN, mutación c.2753T>C del gen RET y mutación c.524G>A del gen TP53. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden comprender un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo seleccionado de las mutaciones anteriores. Por ejemplo, una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede consistir en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 secuencias de nucleótidos; cada secuencia de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen humano seleccionado de BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53; y cada genotipo de una secuencia de nucleótidos puede seleccionarse entre la mutación c.1799T>A del gen BRAF, la mutación c.121A>G del gen CTNNB1, la mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR, la mutación c.2369C>T del gen EGFR, la mutación c.2573T>G del gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2, mutación c.394C>T del gen IDH1, mutación c.1679T>Adel gen KIT, mutación c.35G>Adel gen KRAS, mutación c. 182A>G del gen NRAS/CSDE1, mutación c.2525A>T del gen PDGFRA, mutación c.1633G>A del gen PIK3CA, mutación c.3140A>Gto del gen PIK3CA, mutación c.800delA del gen PTEN, mutación C.2753T >C del gen RET, y la mutación c.524G>A del gen TP53, en donde cada secuencia de nucleótidos comprende un genotipo diferente.
Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo diferente. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender o no una subsecuencia de genes diferentes. Por ejemplo, una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una primera secuencia de nucleótidos que comprende la mutación genotípica c.2369C>T del gen EGFR y una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la mutación genotípica c.2573T>G del gen EGFR, y dicha pluralidad comprendería dos secuencias de nucleótidos que comprenden subsecuencias del mismo gen EGFR. Estos genotipos son proximales del gen EGFR (separados por 204 nucleótidos) y las subsecuencias pueden superponerse parcial o completamente o no superponerse en absoluto. En comparación, una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una primera secuencia de nucleótidos que comprende la mutación c.2369C>T del gen EGFR y una segunda secuencia de nucleótidos que comprende la misma mutación c.2369C>T del gen EGFR sólo si al menos una de la primera o segunda secuencia de nucleótidos también comprende un genotipo diferente (por ejemplo, c.2573T>G del gen EGFR) porque cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo diferente.
Un ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1. Un ácido nucleico puede consistir en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1. Un ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO:1. Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener la secuencia de nucleótidos que abarca los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO:1 (mutación c.800delAdel gen PTEN), los nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO:1 (mutación C.1799T >A del gen BRAF), nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO:1 (mutación c.121A>G del gen CTNNB1), nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2573T>G del gen EGFR), nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR), nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2369C>T del gen EGFR), nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2), nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 (mutación c.35G>A del gen KRAS), nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 (mutación C.182A >G del gen NRAS), nucleótidos 3051 a 3660 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2525A>T del gen PDGFRA), nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1633G>A del gen PIK3CA), nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ IDNO:1 (mutación c.3140A>G del gen PIK3CA), nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2753T>C del gen RET), nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 (mutación c.524G>A del gen TP53), nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1679T>A del gen KIT), o nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO:1 (mutación c.394C>T del gen IDH1). Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede tener al menos aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos que abarca los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO:1. (mutación c.800delA del gen PTEN), nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1799T>A del gen BRAF), nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO:1 (mutación c.121 A>G a gen CTNNB1), nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2573T>G del gen EGFR), nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR), nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2369C>T del gen EGFR), nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2), nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 (mutación c.35G>A del gen KRAS), nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 (mutación c.182A>G del gen NRAS), nucleótidos 3051 a 3660 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2525A>T a gen PDGFRA), nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1633G>A del gen PIK3CA), nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ ID NO:1 (mutación c.3140A>G del gen PIK3CA), nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2753T>C del gen RET), nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 (mutación c.524G>A del gen TP53), nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO: 1 (mutación c.1679T>A del gen KIT), o nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO: 1 (mutación c.394C>T del gen IDH1). Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad podría no tener una homología de secuencia del 100% con una secuencia de nucleótidos que abarca las regiones mencionadas anteriormente de SEQ ID NO:1, por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos de la pluralidad tiene una longitud diferente que la secuencia de nucleótidos que abarca o si la secuencia de nucleótidos de la pluralidad se ha modificado para incluir sitios de restricción.
Un ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3. Un ácido nucleico puede consistir en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3. Un ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente un 80%, aproximadamente un 85%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3.
III. REALIZACIONES RELACIONADAS CON ENFERMEDADES DEL CORAZÓN
En algunos aspectos, una enfermedad o afección puede ser una afección cardíaca, tal como una miocardiopatía. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad está asociada con una afección cardíaca, tal como miocardiopatía. En la Tabla 3 se enumeran polimorfismos, variantes y mutaciones de un solo nucleótido seleccionados que están asociados con la miocardiopatía.
Tabla 3. Variantes Genéticas Seleccionadas Asociadas con Miocardiopatía
Una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede ser una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en proteína C de unión a miosina cardíaca (MYBPC3); miosina, cadena pesada 7, músculo cardíaco, beta (MYH7); troponina I tipo 3 (TNNI3); troponina T cardíaca (TNNT2); y cadena de tropomiosina alfa-1 (TPM1), y/o las respectivas regiones reguladoras de cualquiera de los anteriores. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en MYBPC3, MYH7, TNNI3, TNNT2 y TPM1, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en MYBPC3, MYH7, TNNI3, TNNT2 y TPM1, y/o las respectivas regiones reguladoras de cualquiera de los anteriores.
Cada subsecuencia puede comprender una mutación que esté asociada con la enfermedad o afección (por ejemplo, miocardiopatía) o un genotipo sano en una posición en la que se sabe que ocurren dichas mutaciones.
Una secuencia de nucleótidos puede comprender un genotipo seleccionado del grupo que consiste en la mutación 1504C>T del gen MYBPC3, la mutación 2373_2374¡nsG del gen MYBPC3, la mutación 3628-41_3628-17del del gen MYBPC3, la mutación 1988G>A del gen MYH7, la mutación 1357C>T del gen MYH7, mutación 1750G>C del gen MYH7, mutación 532_534delAAG del gen TNNI3, mutación 575G>A del gen TNNI3, mutación 487_489delGAG del gen TNNT2 y mutación 574G>A del gen TPM1. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden comprender genotipos seleccionados de la mutación 1504C>T del gen MYBPC3, mutación 2373_2374¡nsG del gen MYBPC3, mutación 3628 -41_3628-17del del gen MYBPC3, mutación 1988G>A del gen MYH7, mutación 1357C>T del gen MYH7, mutación 1750G>C del gen MYH7, mutación 532_534delAAG del gen TNNI3, mutación 575G>A del gen TNNI3, mutación 487_489delGAG del gen TNNT2 y mutación 574G>A del gen TPM1. En algunas realizaciones, cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende un genotipo seleccionado de la mutación 1504C>T del gen MYBPC3, la mutación 2373_2374¡nsG del gen MYBPC3, la mutación 3628-41J3628-17del del gen MYBPC3, la mutación 1988G>A del gen MYH7, mutación 1357C>T del gen MYH7, mutación 1750G>C del gen MYH7, mutación 532_534delAAG del gen TNNI3, mutación 575G>A del gen TNNI3, mutación 487_489delGAG del gen TNNT2 y mutación 574G>A del gen TPM1.
Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en ABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CASQ2, CAV3, CHRM2, CRYAB, CSRP3, DES, DMD, DOLK, DSC2, DSG2., DSP, DTNA, EMD, FHL2, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MURC, MYBPC3, MYH6 , MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRDM16, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TRDN, TTN, TTR y VCL, y/o el respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CASQ2, CAV3, CHRM2, CRYAB, CSRP3, DES, DMD, DOLK, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, FHL2, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MURC, MYBPC3, MYH6 , MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRDM16, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TRDN, TTN, TTR y VCL y/o el respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores.
Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 1, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos pueden ser subsecuencias de genes seleccionados del grupo que consiste en ABCC9, ACTC1, ACTN2, AKAP9, ANK2, ANKRD1, BAG3, BRAF, CACNA1C, CACNB2, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, FKTN, GATAD1, GLA, GPD1L, HCN4, HRAS, ILK, JPH2, JUP, KCNE1, KCNE2, KCNE3, KCNH2, KCNJ2, KCNJ5, KCNJ8, KCNQ1, KRAS, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MAP2K1, MAP2K2, MTND1, MTND5, MTND6 , MTTD, MTTG, MTTH, MTTI, MTTK, MTTL1, MTTL2, MTTM, MTTQ, MTTS1, MTTS2, MYBPC3, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, NKX2.5, NRAS, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RANGRF, RBM20, RYR2, SCN1B, SCN3B, SCN4B, SCN5A, SGCD, SNTA1, SOS1, TAZ, TCAP, TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, TTR y VCL, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos puede comprender una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABCC9, ACTC1, ACTN2, AKAP9, ANK2, ANKRD1, BAG3, BRAF, CACNA1C, CACNB2, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, FKTN, GATAD1, GLA, GPD1L, HCN4, HRAS, ILK, JPH2, JUP, KCNE1, KCNE2, KCNE3, KCNH2, KCNJ2, KCNJ5, KCNJ8, KCNQ1, KRAS, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MAP2K1, MAP2K2, MTND1, MTND5, MTND6, MTTD, MTTG, MTTH, MTTI, MTTK, MTTL1, MTTL2, MTTM, MTTQ, MTTS1, MTTS2, MYBPC3, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, NKX2.5, NRAS, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RANGRF, RBM20, RYR2, SCN1B, SCN3B, SCN4B, SCN5A, SGCD, SNTA1, SOS1, TAZ, TCAP, TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, TTR y VCL, y/o las respectivas regiones regulatorias de cualquiera de los anteriores.
Un ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:4. Un ácido nucleico puede consistir en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:4. Un ácido nucleico puede tener al menos aproximadamente un 95%, aproximadamente un 96%, aproximadamente un 97%, aproximadamente un 98% o aproximadamente un 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:4.
IV. COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN UNA PLURALIDAD DE FRAGMENTOS DE ÁCIDO NUCLEICO Sin embargo, un único ácido nucleico multiplexado puede fragmentarse y/o degradarse durante la fabricación, el almacenamiento y/o el procesamiento. Un ácido nucleico multiplexado que comprende múltiples secuencias de nucleótidos diferentes presenta muchas ventajas para preparar materiales de referencia. Sin embargo, la fragmentación y/o degradación no necesariamente afecta el rendimiento de un material de referencia, porque las estrategias de secuenciación de próxima generación ensamblan secuencias de nucleótidos relativamente largas a partir de ácidos nucleicos relativamente cortos. Además, la fragmentación y/o degradación de un único ácido nucleico multiplexado puede ser deseable, por ejemplo, porque los ácidos nucleicos más cortos replican más estrechamente los ARNm de un transcriptoma después de haber sido extraído de una célula.
Por consiguiente, también se describe en el presente documento una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico. El ensamblaje de secuencias de las secuencias de nucleótidos de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede dar como resultado la secuencia de nucleótidos completa de un ácido nucleico de longitud completa como se describe en las secciones l-lll, supra. El término "ensamblaje de secuencia" se refiere al alineamiento y fusión de las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en secuencias de nucleótidos más largas con el fin de reconstruir la secuencia de nucleótidos original (véase, por ejemplo, El-Metwally, S. et al.,PLoS Computational Biology9(12): e1003345 (2013); Nagarajan, N. y M. Pop,Nature Reviews Genetics14(3): 157 (2013); Paszkiewicz, K. y DJ Studholme,Briefings Bioinformatics11 (5): 457 (2010)). El ensamblaje de secuencias de las secuencias de nucleótidos de una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede dar como resultado menos de la secuencia de nucleótidos completa de un ácido nucleico de longitud completa siempre que cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos del ácido nucleico de longitud completa (por ejemplo, como se describe en las secciones l-lll) esté codificado por al menos un fragmento de ácido nucleico de la pluralidad de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ensamblaje de secuencias de las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ácido nucleico de la pluralidad puede dar como resultado secuencias ensambladas que se alinean con al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%., 98% o 99% de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico de longitud completa. Las secuencias de nucleótidos omitidas pueden incluir, por ejemplo, secuencias de nucleótidos inestables y/o secuencias de nucleótidos específicas que se agotan intencionalmente o se seleccionan de otro modo (por ejemplo, durante una etapa de hibridación o amplificación).
Se puede producir una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico a partir de un ácido nucleico de longitud completa como se describe en las secciones l-lll, supra (por ejemplo, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico se puede producir a partir de varias copias del mismo ácido nucleico de longitud completa). La pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede consistir en fragmentos o productos de degradación de un ácido nucleico de longitud completa como se describe en las secciones l-lll, supra (por ejemplo, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede consistir en fragmentos o productos de degradación de varias copias del mismo ácido nucleico de longitud completa).
Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos de un ácido nucleico de longitud completa como se describe en las secciones l-lll, supra, puede estar codificada por al menos un fragmento de ácido nucleico de una pluralidad de fragmentos de ácidos nucleicos.
Se pueden fragmentar/degradar diferentes copias del mismo ácido nucleico de muchas maneras diferentes y, por tanto, una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede comprender o no fragmentos de ácido nucleico idénticos. Además, pueden perderse porciones de ácidos nucleicos individuales, por ejemplo, durante una etapa de purificación, o degradarse a una longitud que carezca de contenido secuenciable. Sin embargo, la secuenciación de próxima generación puede volver a ensamblar la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original, no fragmentado y de longitud completa a partir de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico siempre que la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico contenga suficiente redundancia. Por ejemplo, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede comprender una cobertura de aproximadamente 2x a aproximadamente 1.000.000X de la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico de longitud completa original, no fragmentado, tal como de aproximadamente 10x a aproximadamente 100.000x, de aproximadamente 20x a aproximadamente 50.000x, cobertura de aproximadamente 100x a aproximadamente 10.000x, o de aproximadamente 100x a aproximadamente 1.000x. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original, no fragmentado y de longitud completa puede identificarse secuenciando la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico mediante secuenciación de próxima generación.
La pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede comprender una cobertura de aproximadamente 2x a aproximadamente 1.000.000x de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos de un ácido nucleico de longitud completa original, no fragmentado, tal como de aproximadamente 10x a aproximadamente 100.000x, de aproximadamente 20x a aproximadamente Cobertura de 50.000x, de aproximadamente 100x a aproximadamente 10.000x, o de aproximadamente 100x a aproximadamente 1.000x. Por lo tanto, cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos del ácido nucleico de longitud completa original, no fragmentado, puede identificarse secuenciando la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico mediante secuenciación de próxima generación.
Una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede comprender además sustancialmente todo el genoma de una célula. La relación de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original, no fragmentado y de longitud completa (por ejemplo, el ácido nucleico a partir del cual se originó la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico) a una única copia del genoma de la célula puede ser de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1.000:1, tal como aproximadamente 1:5 a aproximadamente 500:1, aproximadamente 1:3 a aproximadamente 300:1, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 200:1, o aproximadamente 1:1a aproximadamente 100:1 en la composición . La proporción de cada copia de una secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos del ácido nucleico original, no fragmentado y de longitud completa (por ejemplo, el ácido nucleico a partir del cual se originó la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico) a una única copia del genoma de la célula puede ser de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1.000:1, tal como de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 500:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 300:1, de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 200:1, o aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 100:1 en la composición.
Una composición que comprende una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede comprender además una célula. La célula puede ser la célula del genoma, supra, es decir, la composición puede comprender sustancialmente todo el genoma de una célula porque la composición comprende una célula. La célula puede ser una célula humana. La célula puede ser un fibroblasto o un linfocito, tal como un linfocito B inmortalizado. La célula puede ser GM24385. La célula puede ser cualquiera de las células descritas en el presente documento, más adelante.
La composición puede comprender una pluralidad de células. La pluralidad de células puede comprender la célula, supra, por ejemplo, en la que el genoma de la composición es el genoma de la célula. Cada célula de una pluralidad de células puede comprender sustancialmente el mismo genoma. "Sustancialmente el mismo genoma" se refiere a genomas del mismo individuo (por ejemplo, persona), de la misma célula madre o de la misma línea celular, que pueden contener ligeras diferencias, tales como diferencias epigenéticas, mutaciones espontáneas y mutaciones que surgen del procesamiento, como la transfección y la fijación de células (por ejemplo, que pueden afectar la integridad del ADN celular).
La pluralidad de fragmentos de ácido nucleico de una composición pueden ser fragmentos de ácido nucleico intracelulares, por ejemplo, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede existir intracelularmente, por ejemplo, en el citoplasma y/o núcleo de una célula. La pluralidad de células puede comprender la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico de la composición. La pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede haberse introducido en células de la composición (por ejemplo, una pluralidad de células) mediante transfección. "Transfección" se refiere a la introducción de material exógeno en una célula, y el término incluye la introducción de ácidos nucleicos exógenos mediante transformación, transfección, infección (por ejemplo, con un virus recombinante) y electroporación, así como otros métodos conocidos. Un ácido nucleico de longitud completa como se describe en las secciones l-lll, supra, puede introducirse en células de la composición mediante transfección, y el ácido nucleico de longitud completa puede fragmentarse y/o degradarse en la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico durante la transfección. o después de la transfección, generando así la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico.
En algunos casos descritos en el presente documento, cada célula de la pluralidad de células es fija. Los métodos para fijar células se describen en el presente documento a continuación e incluyen la fijación con formalina. En algunos casos descritos en el presente documento, las células de la composición están incluidas en parafina.
En algunos casos descritos en el presente documento, la composición no comprende células. Por ejemplo, la composición puede comprender simplemente una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico generados a partir de un ácido nucleico de longitud completa descrito en las secciones l-lll, supra. La composición puede comprender ácidos nucleicos extraídos de las células descritas en los párrafos anteriores, por ejemplo, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico se puede extraer de una pluralidad de células como se describe en los párrafos anteriores, por ejemplo, junto con los genomas de la pluralidad de células. Por tanto, la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede haber sido extraída de una célula o de una pluralidad de células.
La composición puede comprender además urea (por ejemplo, urea de 100 mM a 8 M), guanidina (por ejemplo, guanidina de 100 mM a 6 M), un inhibidor de ADNasa, un quelante de metales (por ejemplo, etilendiaminotetraacetato), una proteasa (por ejemplo, proteinasa K)., una ARNasa, etanol (por ejemplo, 10-99% de etanol), isopropanol (por ejemplo, 10-99% de isopropanol) y/o una ADN polimerasa (por ejemplo, Taq polimerasa). Son bien conocidos los métodos de extracción y purificación de ADN de células utilizando los reactivos anteriores. La pluralidad de fragmentos de ácido nucleico puede estar asociada con un soporte sólido, tal como perlas (por ejemplo, perlas magnéticas), para ayudar en la purificación.
V. CÉLULAS
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una célula que comprende un ácido nucleico como se describe en el presente documento. Un ácido nucleico de la divulgación puede integrarse en el genoma de una célula, o puede estar presente en un plásmido o como un ácido nucleico lineal, tal como un plásmido lineal. Un ácido nucleico puede estar presente en una célula, pero no integrado en el genoma de la célula.
Una célula puede comprender al menos dos ácidos nucleicos como se describe en el presente documento, por ejemplo, en donde al menos dos de los ácidos nucleicos comprenden diferentes pluralidades de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, una célula puede comprender una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico como se describe en el presente documento, en los que 2 a 50, 2 a 40, 2 a 30, 2 a 20, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6 , 2 a 5 o 2 a 4 fragmentos de ácido nucleico de la pluralidad comprenden cada uno diferentes pluralidades de secuencias de nucleótidos.
Una célula puede comprender más de una copia del mismo ácido nucleico. Por ejemplo, una célula puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90., 100, 120, 150 o 200 copias del mismo ácido nucleico. Una célula puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 o 200 copias del mismo ácido nucleico. Una célula puede comprender de 1 a 1.000, de 2 a 1.000, de 5 a 1.000, de 10 a 1.000, de 20 a 1.000, de 50 a 1.000, de 100 a 1.000, de 150 a 1.000, de 200 a 1.000, de 250 a 1.000, de 1 a 500, de 2 a 500, 5 a 500, 10 a 500, 20 a 1.000, 50 a 500, 100 a 500, 150 a 500 o 200 a 500, 250 a 500, 1 a 400, 2 a 400, 5 a 400, 10 a 400, 20 a 400, 50 a 400, 100 a 400, 150 a 400, 200 a 400 o 250 a 400 copias del mismo ácido nucleico.
Un ácido nucleico puede fragmentarse o degradarse de otro modo antes, durante o después de la transfección del ácido nucleico en una célula. Por consiguiente, en algunas realizaciones, una célula puede comprender una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico (por ejemplo, que son fragmentos de un único ácido nucleico de longitud completa como se describe en el presente documento, supra, o fragmentos de múltiples copias de un único ácido nucleico de longitud completa), ácido nucleico como se describe en el presente documento, supra). La pluralidad de fragmentos de ácido nucleico se puede mezclar con los ácidos nucleicos de la célula, por ejemplo, ácidos nucleicos citosólicos y/o nucleares. La célula puede comprender múltiples copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos, tales como 1 a 1.000, 2 a 1.000, 5 a 1.000, 10 a 1.000, 20 a 1.000, 50 a 1.000, 100 a 1.000, 150 a 1.000., 200 a 1.000, 250 a 1.000, 1 a 500, 2 a 500, 5 a 500, 10 a 500, 20 a 1.000, 50 a 500, 100 a 500, 150 a 500, o 200 a 500, 250 a 500, 1 a 400, 2 a 400, 5 a 400, 10 a 400, 20 a 400, 50 a 400, 100 a 400, 150 a 400, 200 a 400 o 250 a 400 copias de cada secuencia de nucleótidos. Una célula puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 o 200 copias de cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos como se describe en el presente documento, supra. Una célula puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150 o 200 copias de cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos como se describe en el presente documento, supra. Cada secuencia de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos que se origina a partir del mismo ácido nucleico de longitud completa puede estar presente en una pluralidad de fragmentos de ácido nucleico en aproximadamente el mismo número de copias. Sin embargo, algunas secuencias de nucleótidos son más o menos estables que otras secuencias de nucleótidos y, por lo tanto, una célula puede contener diferentes secuencias de nucleótidos de una pluralidad de secuencias de nucleótidos con diferentes números de copias. Una copia de una secuencia de nucleótidos puede ocurrir, por ejemplo, en un único fragmento de ácido nucleico de la pluralidad de fragmentos de ácido nucleico.
Una célula puede ser una célula humana. Una célula puede ser un fibroblasto o un linfocito. Una célula puede ser la célula de una línea celular. Una célula puede ser una célula adherente o una célula en suspensión.
Se puede seleccionar una célula del grupo que consiste en 721, 293T, 721, A172, A253, A2780, A2780ADR, A2780cis, A431, A-549, células BCP-1, BEAS-2B, BR 293, BxPC3, Cal-27, CML T1, COR-L23, COR-L23/5010, COR-L23/CPR, COR-L23/R23, COV-434, DU145, DuCaP, EM2, EM3, FM3, H1299, H69, HCA2, HEK-293, HeLa, HL-60, HMEpC, HT-29, HUVEC, Jurkat, células JY, células K562, células KBM-7, KCL22, KG1, Ku812, KY01, LNCap, Ma-Mel, MCF-10A, MCF-7, MDA- MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-361, MG63, MONO-MAC 6, MOR/0.2R, MRC5, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, Peer, Raji, células Saos-2, SiHa, SKBR3, SKOV-3, T2, T-47D, T84, U373, U87, U937, VCaP, WM39, WT-49 y YAR.
Una célula puede ser cualquier célula disponible en la ATCC (por ejemplo, http://www.atcc.org). En determinadas realizaciones, la célula es una célula de mamífero, tal como una célula humana (por ejemplo, disponible en la ATCC). La célula puede ser una célula de cualquiera de las líneas celulares del Repositorio de Células Genéticas Humanas del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) disponibles en el Instituto Coriell de Investigación Médica (https://catal0g.c0riell.0rg/l/NIGMS), tal como línea celular de la colección "Aparentemente Saludable". La célula puede ser un fibroblasto, un linfoblasto o un linfocito. La célula puede transformarse, por ejemplo, con el virus de Epstein-Barr. La célula puede ser una célula inmortalizada. Por ejemplo, la célula puede ser un linfocito inmortalizado, tal como un linfocito B inmortalizado. La célula puede ser un linfocito transformado por el virus de Epstein-Barr, tal como un linfocito B transformado por el virus de Epstein-Barr. La célula puede ser GM12878 (véase Zook, JM et al.,Nature Biotechnology32:246 (2014)). La célula puede ser GM12878, GM24149, GM24143, GM24385, GM24631, GM24694 o GM24695 (ver Zook, JM et al.,Scientific Data3:160025 (2016)). En determinadas realizaciones, la célula es GM24385.
Una célula puede ser una célula bacteriana, de levadura, de insecto, de ratón, de rata, de hámster, de perro o de mono, por ejemplo, para clonar o validar una construcción. Por ejemplo, la célula puede serE. colioSaccharomyces cerevisiae,por ejemplo, para clonar un ácido nucleico de la divulgación.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una composición que comprende una primera pluralidad de células y una segunda pluralidad de células (denominada "composición que comprende células"). La primera pluralidad de células consiste en células que comprenden de 5 a 500 copias del ácido nucleico. La segunda pluralidad de células está formada por células que no comprenden el ácido nucleico. La primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células son células humanas, tales como linfocitos inmortalizados, tales como células GM24385. Las células de la primera pluralidad y de la segunda pluralidad se mezclan en la composición. La relación entre el número de células de la primera pluralidad y el número de células de la segunda pluralidad es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1 :10.000, tal como de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:2.000, o de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1.000 en la composición. La relación puede depender en parte del número de copias promedio del ácido nucleico en la primera pluralidad de células o del número de copias promedio de las secuencias de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos en la primera pluralidad de células. La relación entre el número de células de la primera pluralidad de células y el número de células de la segunda pluralidad de células se puede ajustar, por ejemplo, de manera que la composición comprenda aproximadamente 0,01 copias del ácido nucleico (o aproximadamente 0,01 copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos) a aproximadamente 100 copias del ácido nucleico (o aproximadamente 100 copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos) por célula de la composición. La proporción se puede ajustar de manera que la composición comprenda de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 copias, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 copias, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 copias del ácido nucleico por célula de la composición (o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 copias, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20 copias, o aproximadamente 1 a aproximadamente 10 copias de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos por célula de la composición).
Se puede fijar una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células. En determinadas realizaciones, una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se fija con formalina. Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se puede fijar con glutaraldehído, etanol, metanol, acetona, benzoato de metilo, xileno, ácido acético, picrato, fijador HOPE, tetróxido de osmio y/o acetato de uranilo.
Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se pueden deshidratar, por ejemplo, usando etanol o un disolvente orgánico.
Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se pueden incluir en parafina. Por ejemplo, una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se pueden fijar en formalina e incluir en parafina. Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se pueden incluir en parafina y seccionar. Se puede montar una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células en un portaobjetos.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una sección de parafina que comprende una pluralidad de células o una composición que comprende células. La sección de parafina puede comprender de 1 a aproximadamente 1.000.000 de células, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 100.000 células, de aproximadamente 50 a aproximadamente 50.000 células, de aproximadamente 100 a aproximadamente 10.000 células, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5.000 células, de aproximadamente 200 a aproximadamente 2.000 células, aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 células, o de aproximadamente 50 a aproximadamente 1.000 células. La sección de parafina puede tener un espesor de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 50 pm, tal como de aproximadamente 2 pm a aproximadamente 25 pm de espesor, o de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 20 pm de espesor. La sección de parafina puede tener aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 pm de espesor. La sección de parafina puede tener aproximadamente 1 mm a aproximadamente 100 mm de largo, ancho o diámetro, tal como aproximadamente 5 mm a aproximadamente 50 mm, o aproximadamente 10 mm a aproximadamente 40 mm. Por ejemplo, una sección de parafina puede tener aproximadamente 5 mm a aproximadamente 50 mm de longitud, aproximadamente 5 mm a aproximadamente 50 mm de ancho y aproximadamente 5 pm a aproximadamente 20 pm de espesor. Una sección de parafina puede tener aproximadamente 5 mm a aproximadamente 50 mm de diámetro y aproximadamente 5 pm a aproximadamente 20 pm de espesor.
Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células puede estar presente en un sedimento celular. Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se pueden suspender en plasma sanguíneo, tal como plasma sanguíneo de mamífero. En determinadas realizaciones, una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células se pueden suspender en plasma sanguíneo humano o en una solución diseñada para replicar plasma sanguíneo humano.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método para elaborar un material biológico de referencia, que comprende transfectar una pluralidad de células con un ácido nucleico descrito en el presente documento.
Un método puede comprender fijar una pluralidad de células o una composición que comprende células. Por ejemplo, el método puede comprender fijar una pluralidad de células o una composición que comprende células con formalina. Un método puede comprender fijar una pluralidad de células o una composición que comprende células con glutaraldehído, etanol, metanol, acetona, benzoato de metilo, xileno, ácido acético, picrato, fijador HOPE, tetróxido de osmio y/o acetato de uranilo.
Un método puede comprender incrustar una pluralidad de células o una composición que comprende células en parafina. Un método puede comprender seccionar células incluidas en parafina. Un método puede comprender montar una pluralidad de células en un portaobjetos, por ejemplo, células incluidas en parafina o células que no están incluidas en parafina.
Un método puede comprender montar una pluralidad de células o una composición que comprende células en un portaobjetos.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un material de referencia biológico que comprende una pluralidad de células como se describe en el presente documento y parafina, en donde la pluralidad de células están fijadas e incrustadas en la parafina. El material de referencia biológico puede ser una sección de células embebidas en parafina, por ejemplo, en donde la sección tiene un espesor de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 50 pm, tal como de aproximadamente 5 pm a aproximadamente 20 pm de espesor.
Un material de referencia biológico puede comprender además células no transfectadas, por ejemplo, en las que las células no transfectadas no comprenden el ácido nucleico. En determinadas realizaciones, las células no transfectadas son de la misma especie que las células de la pluralidad, por ejemplo, las células no transfectadas pueden ser de la misma fuente (por ejemplo, línea celular) que las células de la pluralidad. La proporción de células de la pluralidad de células con respecto a células no transfectadas puede ser de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:10.000, tal como de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:5.000, de aproximadamente 1 :1 a aproximadamente 1 :1.000, de aproximadamente 1 :10. a aproximadamente 1 :1.000, o aproximadamente de 1:50 a aproximadamente 1:500. La proporción de células de la pluralidad de células con respecto a células no transfectadas puede ser aproximadamente 45:55, aproximadamente 50:50, aproximadamente 55:45, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:6, aproximadamente 1:7, aproximadamente 1:8, aproximadamente 1:9, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:25, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:200, aproximadamente 1:250, aproximadamente 1:500 o aproximadamente 1:1.000.
En algunas realizaciones, la relación entre el número de copias del ácido nucleico y el número de copias de genomas celulares en el material biológico de referencia es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10.000, tal como de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:1.000, aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:50, o aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:20. En general, cada genoma contiene dos copias de un gen (por ejemplo, en el caso de genes que se encuentran en cromosomas diploides, como los autosomas). El número de copias de un ácido nucleico con respecto al número de copias de un gen en el genoma celular en el material biológico de referencia puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10.000, tal como de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:1.000, aproximadamente 1 : 1 a aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:50, o aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:40. Por tanto, la relación entre un genotipo de un ácido nucleico y el número de copias de un gen en el genoma celular que está asociado con el genotipo (por ejemplo, el alelo de tipo salvaje) en el material de referencia biológico puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1 :10.000, tal como aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:1.000, aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:50, o aproximadamente 1:4 a aproximadamente 1:40.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un material de referencia biológico que comprende una pluralidad de células como se describe en el presente documento y un líquido, tal como solución salina, solución salina tamponada con fosfato o plasma sanguíneo, como plasma sanguíneo de mamífero. Una célula, una pluralidad de células o una composición que comprende células de un material biológico de referencia se puede suspender en plasma, tal como plasma sanguíneo humano o una solución diseñada para replicar plasma sanguíneo humano.
Un material de referencia biológico puede ser un sedimento celular, por ejemplo, elaborado centrifugando una pluralidad de células o una composición que comprende células como se describe en el presente documento.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una composición que comprende un ácido nucleico purificado y un tampón acuoso, en donde el ácido nucleico purificado se aísla de un material de referencia biológico como se describe en el presente documento. La composición puede comprender un tampón, tal como tampón tris (es decir, tris(h¡drox¡met¡l)am¡nometano o una sal del mismo). La composición puede comprender un agente quelante, tal como ácido etilendiaminotetraacético o una sal del mismo. La composición puede comprender trazas de formaldehído y/o parafina, aunque la composición puede estar libre de formaldehído y parafina.
EJEMPLIFICACIÓN
Ejemplo 1. Diseño de ácidos nucleicos para objetivos oncológicos.
Se diseñó un ácido nucleico (ADN) que comprende 16 secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos comprende uno de los 16 genotipos enumerados en la Tabla 4. Cada uno de estos genotipos está asociado con un tumor sólido neoplásico. Cada una de las secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen humano que contiene el genotipo. Cada secuencia de nucleótidos tiene aproximadamente 600 nucleótidos de longitud. Cada genotipo aparece cerca de la mitad de una subsecuencia, es decir, cada genotipo aparece a unos 300 nucleótidos tanto del extremo 5' como del extremo 3' de una secuencia de nucleótidos.
Tabla 4.
La secuencia del ácido nucleico se establece en SEQ ID NO: 1. Los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO: 1 son una subsecuencia del gen humano PTEN y corresponden a la mutación del genotipo c.800delA del gen PTEN. Los nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO: 1 son una subsecuencia del gen humano BRAF y corresponden a la mutación del genotipo c. 1799T>A del gen BRAF. Los nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO: 1 son una subsecuencia del gen humano CTNNB1 y corresponden a la mutación genotípica c.121A>G del gen CTNNB1. Los nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO: 1 son una subsecuencia del gen humano EGFR y corresponden a la mutación genotípica c.2573T>G del gen EGFR. Los nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen EGFR humano y corresponden a la mutación del genotipo c.2236_2250del15 del gen EGFR. Los nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano EGFR y corresponden a la mutación genotípica c.2369C>T del gen EGFR. Los nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano ERBB2 y corresponden a la mutación del genotipo c.2324_2325ins12 del gen ERBB2. Los nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano KRAS y corresponden a la mutación del genotipo c.35G>A del gen KRAS. Los nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano NRAS y corresponden a la mutación del genotipo c.182A>G del gen NRAS. Los nucleótidos 3051 a 3660 de SEQ ID NO: 1 son una subsecuencia del gen humano PDGFRA y corresponden a la mutación del genotipo c.2525A>T del gen PDGFRA. Los nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano PIK3CA y corresponden a la mutación genotípica c.1633G>A del gen PIK3CA. Los nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano PIK3CA y corresponden a la mutación genotípica c.3140A>G del gen PIK3CA. Los nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano RET y corresponden a la mutación genotípica c.2753T>C del gen RET. Los nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano TP53 y corresponden a la mutación del genotipo c.524G>Adel gen TP53. Los nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen KIT humano y corresponden a la mutación del genotipo c.1679T>A del gen KIT. Los nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO:1 son una subsecuencia del gen humano IDH1 y corresponden a la mutación del genotipo c.394C>T del gen IDH1.
El ácido nucleico se utilizó para transfectar células GM24385, que es una línea celular humana bien caracterizada. Se midió el número de copias del ácido nucleico en las células GM24382 transfectadas y las células transfectadas se diluyeron con células GM24382 no transfectadas para llegar a composiciones que comprendían una frecuencia alélica de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 7% o aproximadamente el 4%. La frecuencia del alelo se define como la frecuencia de un genotipo en el ácido nucleico con respecto a la frecuencia del alelo de tipo salvaje en los genomas de las células GM24382 en la composición. Por tanto, la frecuencia alélica de un genotipo EGFR es la misma que la frecuencia de un genotipo TP53 en la composición, aunque el ácido nucleico comprende tres secuencias de nucleótidos de EGFR y una secuencia de nucleótidos de TP53.
Se fijaron con formalina tres composiciones de células que comprendían frecuencias alélicas de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 7% o aproximadamente el 4%, se incluyeron en parafina y se seccionaron en un rizo de 10 pm (Figura 1). Se extrajo ADN de secciones correspondientes a diferentes frecuencias alélicas y las frecuencias alélicas se verificaron mediante PCR digital. La Figura 2 muestra que se detectaron ocho genotipos mediante PCR digital con frecuencias alélicas observadas correspondientes a las frecuencias alélicas reales. También se extrajo ADN de secciones fijadas con formalina e incluidas en parafina, se amplificó utilizando Ion AmpliSeq™ Cáncer Hotspot Panel v2 y se secuenció utilizando un Ion Torrent. La Figura 3 muestra que se detectaron quince genotipos mediante secuenciación de próxima generación con frecuencias alélicas observadas correspondientes a frecuencias alélicas reales.
Ejemplo 2. Diseño de ácidos nucleicos para objetivos oncológicos hereditarios
Varios polimorfismos genéticos hereditarios diferentes se correlacionan con una mayor incidencia de cáncer, incluidas las mutaciones enumeradas en la Tabla 5.
Tabla 5. Mutaciones seleccionadas que se correlacionan con cáncer
Se diseñaron dos plásmidos para su uso en la fabricación de materiales de referencia que puedan servir como controles. Un primer plásmido comprende la mutación c.942+3A>T del gen MSH2 (homólogo 2 de mutS); mutaciones c.2056 _2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13), c.2308_2312delGGTAAinsT, c.2641delGinsAAAA y c.3163_3164insG del gen MSH6 (homólogo 6 de mutS), cada una de las cuales ocurre en la misma secuencia de nucleótidos; mutación c,1852_1854delAAG del gen MLH1 (homólogo 1 de mutL); mutaciones c.2445+1G>C, c.2243_2246delAGAA del gen PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de errores de coincidencia) y c.861_864delACAG del gen PMS2, cada una de las cuales ocurre en diferentes secuencias de nucleótidos; y la mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A) (Figura 4). Un segundo plásmido comprende las mutaciones c.8975_9100del126, c.1310_1313delAAGA, c.1813dupA y c.9342_9343insAluY del gen BRCA2 (cáncer de mama 2) y las mutaciones c.5266_5267insC, c.5177_5180delGAAA, c.3756_3759delGTCT. c.3481_3491delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14), c.3113A>G, c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15), c.2834_2836delinsC y c.68_69delAG del gen BRCA1 (cáncer de mama 1) (Figura 5).
Se diseñaron plásmidos ligeramente diferentes para su uso en la fabricación de materiales de referencia que puedan servir como controles. Un primer plásmido comprende la mutación c.942+3A>T del gen MSH2 (homólogo 2 de mutS); mutación c.1662-12 1677del del gen MSH2; mutaciones c.2056 _2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13), c.2308_2312delGGTAAinsT, c.2641delGinsAAAAy c.3163_3164insG del gen MSH6 (homólogo 6 de mutS), cada una de las cuales ocurre en la misma secuencia de nucleótidos; mutación c.232_243delinsATGTAAGG del gen MI,H1 (homólogo 1 de mutL), mutación c.1852_1854delAAG del gen MI.H1; y mutaciones c.2445+1 G>C, c.2243_2246delAGAA del gen PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de errores de coincidencia); y c.861_864delACAG del gen PMS2 (Figura 6 ; SEQ ID NO:2). Un segundo plásmido comprende la mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A); mutaciones c.8975_9100del126, c.1310_1313delAAGA, c.1813dupAy c.9342_9343insAluY del gen BRCA2 (cáncer de mama 2); y mutaciones c.5266_5267insC, c.5177_5180delGAAA, c.3756_3759delGTCT, c.3481_3491 delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14), c.3113A>G, c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15), c.2834_2836delin se, y c.68_69delAG del gen BRCA1 (cáncer de mama 1) (Figura 7; SEQ ID NO:3).
Ejemplo 3. Diseño de ácidos nucleicos para objetivos de miocardiopatía
Se diseñó un ácido nucleico múltiple para detectar diez mutaciones asociadas con la miocardiopatía (Tabla 6; Figura 8). Se seleccionaron aproximadamente 1.000 pares de bases de cada gen diana de modo que la mutación residiera cerca de la mitad de cada secuencia. Estos segmentos de -1.000 pares de bases se sintetizaron secuencialmente en un vector de clonación genérico. Se colocaron sitios de restricción Notl tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' del constructo para separar el constructo del gen de miocardiopatía del esqueleto del vector. La secuencia utilizada como inserto se muestra en SEQ ID NO:4. Cada gen diana también se sintetizó en un plásmido separado como control (10 plásmidos individuales, cada plásmido contenía un inserto de - 1.000 pares de bases con una única variante de miocardiopatía).
Tabla 6. Objetivos genéticos para materiales de referencia multiplex de miocardiopatía
Para un experimento piloto, las construcciones no se incorporaron a las células, sino que se analizó el ADN para determinar si el diseño múltiple sintético era compatible con los métodos de prueba NGS.
Los plásmidos se Idealizaron y cuantificaron mediante PCR digital en gotas, tanto para el plásmido único que contenía 10 genes diana como para los 10 plásmidos, cada uno de los cuales contenía un único gen diana. Los 10 plásmidos individuales se reunieron en un conjunto de plásmidos equimolares. El ADN genómico de la línea celular de referencia GM24385 se extrajo mediante el método manual Qiagen Puregene y se cuantificó mediante ensayos de PCR digital de múltiples gotas. El plásmido linealizado (o conjunto de plásmidos) se mezcló con ADN genómico en tres frecuencias alélicas: 45%, 50% y 55%. Dado que el plásmido contenía secuencias mutantes y el ADN genómico contenía secuencias de tipo salvaje, la mezcla resultante debería tener una frecuencia de alelos similar a una dilución objetivo. (50% es la frecuencia de alelos heterocigotos). La Tabla 7 resume los números de lote que se prepararon.
Tabla 7. Resumen de lotes piloto
Se utilizaron dos ensayos de PCR en tiempo real basados en TaqMan para evaluarlas mezclas de ácidos nucleicos en un sistema de PCR digital de gotas BioRad QX-200. Los objetivos del ensayo, así como las secuencias de cebadores y sondas, se muestran en la Tabla 8. La PCR digital de gotitas se realizó por triplicado. Los resultados del lote 102315, que contiene el plásmido único con 10 objetivos, se muestran en las Figuras 9 y 10.
Tabla 8. Secuencias de cebadores y sondas para dos objetivos de miocardiopatía.
El plásmido multiplexado (10 variantes en un plásmido) se desempeñó de manera similar al conjunto de plásmidos individuales tanto para ddPCR (datos no mostrados) como para la secuenciación de próxima generación (Figuras 11 y 12). La secuenciación se realizó en un ensayo de secuenciación del exorna completo utilizando el sistema de enriquecimiento de objetivos SureSelectXT para la biblioteca de secuenciación multiplexada de extremos emparejados de lllumina y se realizó en un instrumento MiSeq. Se identificaron mutaciones de sustitución con la frecuencia esperada en la muestra múltiple (Figuras 11 y 12). Las mutaciones Indel se identificaron con una frecuencia inferiora la esperada en cada muestra (Figuras 11 y 12), lo que coincide con las limitaciones actuales de la tecnología de secuenciación de próxima generación. En particular, la mutación 3628-41_3628-17del mostró una frecuencia alélica considerablemente menor que las otras variantes. Se sabe que las eliminaciones grandes son difíciles para la alineación y detección de secuenciación de próxima generación, y los materiales de referencia multiplexados pueden ser particularmente útiles para abordar este problema.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico, que comprende una pluralidad de secuencias de nucleótidos, en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad comprende un genotipo que está asociado con una enfermedad o afección; cada secuencia de nucleótidos tiene una longitud de 600 a 10.000 pares de bases; y la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos de al menos 2 cromosomas diferentes.
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde:
(a) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad es una mutación somática o una mutación hereditaria; y/o
(b) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad es un polimorfismo de un solo nucleótido, mutación puntual, codón de parada prematuro, repetición detrinucleótido, translocación, reordenamiento somático, alelomorfo, variante de un solo nucleótido, inserción o deleción ("indel"), variante reguladora, o fusión de genes; y/o
(c) la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos de al menos 3 cromosomas diferentes; y/o
(d) el ácido nucleico es ADN; y/o
(e) la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos de al menos 3 o al menos 5 cromosomas diferentes; y/o
(f) cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad es una subsecuencia de un gen o región reguladora del mismo, opcionalmente en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad es una subsecuencia de un gen, opcionalmente en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad es una subsecuencia de un exón, opcionalmente en donde el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad provoca una mutación, eliminación o inserción de al menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos codificada por el exón; y/o
(g) el ácido nucleico es como se establece en (e) o (f) y cada gen es un gen humano; y/o
(h) cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad es una secuencia de nucleótidos humana.
3. El ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en donde:
(a) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una neoplasia, opcionalmente un tumor sólido; y/o
(b) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una neoplasia que es cáncer de pulmón, cáncer linfoide, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mielógena crónica, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de intestino grueso, cáncer del tracto urinario, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de riñón, cáncer de mama y/o cáncer de tejidos blandos, opcionalmente un tumor sólido; y/o
(c) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una neoplasia en (a) o (b) y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en ABL1, AKT1, AKT2, AKT3, ALK, APC, AR, AR1D1A, ARAF, ARHGAP5, ATM, ATR, BCL2, BCR, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CBFB, CCND1, CCND2, CCNE1, CDH1, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2B, CSF 1R, CTNNB1, DDR2, DNMT3A, EGFR, ERBB2 ("HER2"), ERBB3, ERBB4 ("HER4"), ERCC1, ESR1, ETV1, ETV4, ETV6 , EWSR1, EZH2, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, FOXL2, GABRA6, GABRG2, GATA3, GNA11, GNAQ, GNAS, HNF1A, HPAS, HRAS, IDH1, IDH2, IHD2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KMT2A, KRAS, MAP2K1, MAP2K2, MECOM, MET, MKL1, MLH1, MLL, MPL, MSH2, MSH6 , MTOR, MYC, MYCN, MYD88, NF1, NF2, NFE2L2, NOTCH1, NPM1, NRAS/CSDE1, NTRK1, NUP214, PALB2, PARP1, PARP2, PDGFRA, PDGFRB, PICALM, PIK3CA, PMS2, PTCH1, PTEN, PTPN11, RAD51, RAFT, RARA, RB1, RET, RHEB, RHOA, RIT1, ROS1, RUNX1, RUNX1T1, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TAL1, TCF3, TERT, TMPRSS2, TP53, TSC1, TSC2 y VHL; y/o
(d) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una neoplasia como en (a) o (b) y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste de AKT1, AKT2, AKT3, APC, ARHGAP5, ATM, ATR, BRAF, CTNNB1, DNMT3A, EGFR, ERBB2, ERCC1, EZH2, FBXW7, FGFR3, FLT3, GABRA6 , GABRG2, GNAQ, GNAS, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, MSH2, MTOR, MYD88, NF1, NPM1, NRAS/CSDE1, PARP1, PARP2, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RAD51, RB1, RET, SMAD4, TP53 y VHL, opcionalmente en donde el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la mutación 145G}A del gen AKT1, mutación c.49G}A del gen AKT1, mutación c.268G}T del gen AKT2, mutación c.371A}T del gen AKT3, mutación c.4248delC del gen APC, mutación c.4348C}T del gen APC, mutación c.4666_4667insA del gen APC, mutación c. 1864G}A del gen ARHGAP5, mutación c.1058_1059delGT del gen ATM, mutación c.5557G}A del gen ATM, mutación c.3790_3796delATAAAAG del gen ATR, mutación c.1799T}A del gen BRAF, mutación c.121A}G del gen CTNNB 1, mutación c.2644C}T del gen DNMT3A, mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR, mutación c.2310_2311insGGT del gen EGFR, mutación c.2369C}T del gen EGFR, mutación c.2573T}G del gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2, mutación c.287C}A del gen ERCC1, mutación c.1937A}T del gen EZH2, mutación c.1394G}A del gen FBXW7, mutación c.746C)G del gen FGFR3, mutación c.2503G)T del gen FLT3, mutación c.763G}C del gen GABRA6 , mutación c.1355A}G del gen GABRG2, mutación c.626A)C del gen GNAQ, mutación c.601C)T del gen GNAS, mutación c.394C}T del gen IDH1, mutación c.515G}A del gen IDH2, mutación c.419G}A del gen IDH2, mutación c.1849G}T del gen JAK2, mutación c.2447A}T del gen KIT, mutación c.1679T}A del gen KIT, mutación c.35G}A del gen KRAS, mutación c.3757T}G del gen MET, mutación c.1151T}A del gen MLH1, mutación c.1544G)T del gen MPL, mutación c.2250delG del gen MSH2, mutación c.2359_2360delCT del gen MSH2, mutación c.2664A}T del gen MTOR, mutación c.794T}C del gen MYD88, mutación c.2987_2988insAC del gen NF1, mutación c.4084C)T del gen NF1, mutación c.7501delG del gen NF1, mutación c.863_864insTCTG del gen NPM1, mutación c.182A}G del gen NRAS, mutación c.2738delG del gen PARP1, mutación c.398A}C del gen PARP2, mutación c.1694_1695insA del gen PDGFRA, mutación c.2525A}T del gen PDGFRA, mutación c.1633G}A del gen PIK3CA, mutación c.3140A}G del gen PIK3CA, mutación c.3204_3205insA del gen PIK3CA, mutación c.388C}T del gen PTEN, mutación c.741_742insA del gen PTEN, mutación c.800delA del gen PTEN, mutación c.226G)A del gen PTPN11, mutación c.433C}T del gen RAD51, mutación c.958C}T del gen RB1, mutación c.2753T}C del gen RET, mutación c.1394_1395insT del gen SMAD4, mutación c.818G}A del gen TP53, mutación c.743G}A del gen TP53, mutación c.723delC del gen TP53, mutación c.524G}A del gen TP53, mutación c.263delC del gen TP53 y mutación c.426_429delTGAC del gen VHL; y/o
(e) el ácido nucleico es como se establece en la parte (d) y
cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53; y/o
(f) el ácido nucleico es el establecido en la parte (d) o (e) y
la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende al menos 5 secuencias de nucleótidos;
cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen humano; y
cada gen se selecciona del grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, ERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53; y/o
(g) el ácido nucleico es como se establece en la parte (e) o (f) y
el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la mutación c.1799T}A del gen BRAF, mutación c.121A}G del gen CTNNB1, mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR, mutación c.2369C}T del gen EGFR, mutación c.2573T}G del gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2, mutación c.394C}T del gen IDH1, mutación c.1679T}Adel gen KIT, mutación c.35G}A del gen KRAS, mutación c.182A}G del gen NRAS/CSDE1, mutación c.2525A)T del gen PDGFRA, mutación c.1633G}A del gen PIK3CA, mutación c.3140A}G del gen PIK3CA, mutación c.800delA del gen PTEN, mutación c.2753T}C del gen RET y mutación c.524G}A del gen TP53; y/o
(h) el ácido nucleico es como se establece en la parte (g) y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos que abarca los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO:1 (mutación c ,800delA del gen PTEN), nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1799T)A del gen BRAF), nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO:1 (mutación c.121 A)G del gen CTNNB 1), nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2573T>G del gen EGFR), nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR), nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2369C)T del gen EGFR), nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2), nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 (mutación c.35G)A del gen KRAS), nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 (mutación c.182A)G del gen NRAS), nucleótidos 3051 a 3660 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2525A)T del gen PDGFRA), nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1633G)A del gen PIK3CA), nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ ID NO:1 (mutación c.3140A)G del gen PIK3CA), nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2753T)C del gen RET), nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 (mutación c.524G)A del gen TP53), nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1679T)A del gen KIT), o los nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO:1 (mutación c.394C}T del gen IDH1), opcionalmente en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos tiene la secuencia de nucleótidos que abarca los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO:1 (mutación c.800delA del gen PTEN), los nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO :1 (mutación c.1799T}A del gen BRAF), nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO:1 (mutación c.121 A}G del gen CTNNB 1), nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2573T>G del gen EGFR), nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR), nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2369C)T del gen EGFR), nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2), nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 (mutación c.35G)A del gen KRAS), nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 (mutación c. 182A)G del gen NRAS), nucleótidos 3051 a 3660 de SEO ID NO:1 (mutación c.2525A)T del gen PDGFRA), nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1633G)A del gen PIK3CA), nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ ID NO:1 (mutación c.3140A)G del gen PIK3CA), nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2753T)C del gen RET), nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 (mutación c.524G)A del gen TP53), nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1679T)A del gen KIT), o los nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO:1 (mutación c.394C)T del gen DH1).
4. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 parte (g), en donde:
(a) la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende al menos 5 secuencias de nucleótidos;
cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen humano;
cada gen se selecciona del grupo que consiste en BRAF, CTNNB1, EGFR, EERBB2, IDH1, KIT, KRAS, NRAS/CSDE1, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, RET y TP53; y
el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad se selecciona del grupo que consiste en la mutación c.1799T)A del gen BRAF, mutación c.121A)G del gen CTNNB1, mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR, mutación c.2369C)T del gen EGFR, mutación c.2573T)G del gen EGFR, mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2, mutación c.394C)T del gen IDH1, mutación c.1679T)A del gen KIT, mutación c.35G)A del gen KRAS, mutación c.182A)G del gen NRAS/CSDE1, mutación c.2525A)T del gen PDGFRA, mutación c.1633G)A del gen PIK3CA, mutación c.3140A)G del gen PIK3CA, mutación c.800delA del gen PTEN, mutación c.2753T)C del gen RET y mutación c.524G)A del gen TP53; y/o
(b) el ácido nucleico es como se establece en la parte (a) y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos que abarca los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO:1 (mutación c. 800delA del gen PTEN), nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1799T)A del gen BRAF), nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO:1 (mutación c.121 A)G del gen CTNNB1), nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2573T>G del gen EGFR), nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR), nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2369C)T del gen EGFR), nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2), nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 (mutación c.35G)A del gen KRAS), nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 (mutación c.182A)G del gen NRAS), nucleótidos 3051 a 3660 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2525A)T del gen PDGFRA), nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1633G)A del gen PIK3CA), nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ ID NO:1 (mutación c.3140A)G del gen PIK3CA), nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2753T)C del gen RET), nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 (mutación c.524G)A del gen TP53), nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1679T)A del gen KIT), o los nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO:1 (mutación c.394C)T del gen IDH1), opcionalmente en donde cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos tiene la secuencia de nucleótidos que abarca los nucleótidos 8545 a 9153 de SEQ ID NO:1 (mutación c.800delA del gen PTEN), los nucleótidos 7937 a 8544 de SEQ ID NO :1 (mutación c.1799T)A del gen BRAF), nucleótidos 7327 a 7936 de SEQ ID NO:1 (mutación c.121 A>G del gen CTNNB 1), nucleótidos 6712 a 7326 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2573T>G del gen EGFR), nucleótidos 6115 a 6711 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2236_2250del15 del gen EGFR), nucleótidos 5503 a 6114 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2369C)T del gen EGFR), nucleótidos 4879 a 5502 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2324_2325ins12 del gen ERBB2), nucleótidos 4271 a 4878 de SEQ ID NO:1 (mutación c.35G)A del gen KRAS), nucleótidos 3661 a 4270 de SEQ ID NO:1 (mutación c.182A)G del gen NRAS), nucleótidos 3051 a 3660 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2525A)T del gen PDGFRA), nucleótidos 2445 a 3050 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1633G)A del gen PIK3CA), nucleótidos 1839 a 2444 de SEQ ID NO:1 (mutación c.3140A)G del gen PIK3CA), nucleótidos 1227 a 1838 de SEQ ID NO:1 (mutación c.2753T)C del gen RET), nucleótidos 1 a 610 de SEQ ID NO:1 (mutación c.524G)A del gen TP53), nucleótidos 611 a 1226 de SEQ ID NO:1 (mutación c.1679T)A del gen KIT), o los nucleótidos 9154 a 9854 de SEQ ID NO:1 (mutación c.394C)T del gen IDH1); y/o
(c) el ácido nucleico tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1.
5. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 3 partes (a)-(b), en donde:
(a) cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado de ABI1, ABL1, ABL2, ACSL3, ACURI, AF15Q14, AF1Q, AF3P21, AF5Q31, AKAP9, AKT1, AKT2, AKT3, AL017, ALDH2, ALK, AMER1, APC, APEX1, AR, AR1D1 A, ARAF, ARHGAP5, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATP11B, ATP1A1, ATP2B3, ATR, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL2L1, BCL3, BCL5, BCL6 , BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC2, BIRC3, BLM, BMPR1A, BRAF, BRC42, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIP1, BTG1, BUB1B, C120RF9, C150RF21, C150RF55, C160RF75, C20RF44, CACNA1D, CALR, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CASP8, CBFA2T1, CBFA2T3, CBFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6 , CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD44, CD74, CD79A, CD79B, CDC73, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN2A, CDKN2A(PL4), CDKN2B, CDKN2C, CDX2, CEBPA, CEP1, CEP89, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHN1, CIC, CUTA, CLIP1, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1A1, COL2A1, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CSF1R, CSF3R, CSNK2A1, CTNNB1, CUX1, CYLD, D10S170, DAXX, DCTN1, DDB2, DDIT3, DDR2, DDX10, DDX5, DDX6 , DEK, DICERL, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFL, ECT2L, EGFR, EIF3E, EIF4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERBB2 ("HER2"), ERBB3, ERBB4 ("HER4"), ERC1, ERCC1, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ESR1, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6 , EVI1, EWSR1, EXT1, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM46C, FANCA, FANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL, FAS, FBXOI1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFR10P, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FH, FHIT, FIP1L1, FLJ27352, FLT3, FLU, FNBP1, FOX03A, FOX04, FOXA1, FOXL2, FOXOIA, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GABRA6 , GABRG2, GAS6, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, H3F3B, HCMOGT-1, HEAB, HERPUD1, HEY1, HIP1, HIST1H3B, HIST1H4L, HLA-A, HLF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNF1A, HNRNPA2B1, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HPAS, HRAS, HSPCA, HSPCB, IDH1, IDH2, IGF1R, IGH, IGK, IGL, IHD2, IKZF1, IL2, IL21R, IL6, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIAA1598, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KMT2A, KMT2D, KRAS, KTN1, LAF4, LASP1, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LM02, LMNA, LMOL, LPP, LRIG3, LSM14A, LYL1, MAF, MAFB, MALAT1, MALT1, MAML2, MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4, MAX, MCL1, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECOM, MECT1, MED 12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLH1, MLL, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6 , MSI2, MSN, MTCP1, MTOR, MUC1, MUTYH, MY018A, MY05A, MYB, MYC, MYC1, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NAB2, NACA, NBSL, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFATC2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2- 1, NKX2-1, NKX2-8, NONO, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NR4A3, NRAS, NRAS/CSDE1, NRG1, NSD1, NT5C2, NTRK1, NTRK3, NUMA1, NUP214, NUP98, NUTM2A, NUTM2B, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB2, PARP1, PARP2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDCD1LG2, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PHF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG1, PLCG1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNP, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPFIBP1, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1A, PSIP1, PTCH1, PTEN, PTPN11, PTPRB, PTPRC, PTPRK, PWWP2A, RAB5EP, RAC1, RAD21, RAD51, RAD51L1, RAF1, RAFT, RALGDS, RANBP17, RAP1GDS1, RARA, RB1, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RHEB, RHOA, RIT1, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RPS6KB1, RSP02, RSP03, RUNDC2A, RUNX1, RUNX1T1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMAD4, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRC, SRGAP3, SRSF2, SS18, SS18L1, SSX1, SSX2, SSX4, STAG2, STAT3, STAT5B, STAT6 , STK11, STL, SUFU, SUZ12, SYK, TAF15, TAL1, TAL2, TALI, TBL1XR1, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCL1A, TCL6 , TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIAF1, TIF1, TLX1, TLX3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TRRAP, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, UBR5, USP6 , VHL, VT11A, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WWTR1, XPA, XPC, XP01, YWHAE, ZCCHC8, ZNF145, ZNF198, ZNF217, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2, y ZRSR2;
(b) cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado entre BMPR1A (receptor de proteína morfogenética ósea, tipo IA), BRCA1 (cáncer de mama 1), BRCA2 (cáncer de mama 2), CDH1 (cadherina-1), CDKN2A (inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 2A), EPCAM (molécula de adhesión de células epiteliales), MI,H1 (homólogo mutL 1), MSH2 (homólogo mutS 2), MSH6 (homólogo mutS 6), MUTYH (ADN glicosilasa mutY), PALB2 (compañero y localizador de BRCA2), PMS2 (homólogo 2 de PMS1, componente del sistema de reparación de desajustes), PTEN (homólogo de fosfatasa y tensina), SMAD4 (miembro 4 de la familia SMAD; madres contra el homólogo decapentapléjico 4), STK11 (serina/treonina quinasa 11) y TP53 (proteína tumoral p53);
(c) el ácido nucleico es como se establece en la parte (b) y cada genotipo de una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la mutación c.942+3A)T del gen MSH2, mutación c.1662-12 1677del del gen MSH2, mutación c.2056_2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13) del gen MSH6 , mutación c.2308_2312delGGTAAinsT del gen MSH6, mutación c.2641delGinsAAAA del gen MSH6 , mutación c. 3163_3164insG del gen MSH6 , mutación c.232_243delinsATGTAAGG del gen MI,H1, mutación c.1852_1854delAAG del gen MLH1, mutación c.2445+1 G)C del gen PMS2, mutación c.2243_2246delAGAA del gen PMS2, mutación c.2253T)C del gen PMS2, mutación c.861_864delACAG del gen PMS2, mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A, mutación c.8975_9100del126 del gen BRCA2, mutación c.9203del126 del gen BRCA2, mutación c.1310_1313delAAGA del gen BRCA2, mutación c.1813dupA del gen BRCA2, mutación c.9342_9343insAluY del gen BRCA2, mutación c.5266_5267insC del gen BRCA1, mutación c.5177_5180delGAAA del gen BRCA1, mutación c.3756_3759delGTCT del gen BRCA1, mutación c.3481_3491delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14) del gen BRCA1, mutación c.3113A>G del gen BRCA1, mutación c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15) del gen BRCA1, mutación c.2834_2836delinsC del gen BRCA1 y mutación c.68_69delAG del gen BRCA1;
(d) el ácido nucleico es el establecido en la parte (b) o (c) y
el ácido nucleico tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3, o
tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3;
(e) el ácido nucleico es como se establece en la parte (b) y cada genotipo de una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la mutación c.675+1 G)C del gen BMPR1A, mutación c.817C)T del gen BMPR1A, mutación c.1016dupA del gen BRCA1, mutación c.1175_1214delTGTTAGTTCTGATGACTCACATGATGGGGAGTCTGAATC (SEQ ID NO: 23) del gen BRCA1, mutación c.1387_1390delinsGAAAG del gen BRCA1, mutación c.181T)G del gen BRCA1, mutación c.1953_1956delGAAA del gen BRCA1, mutación c.2834_2836delinsC del gen BRCA1, mutación c.3084_3094delTAATAACATTA (SEQ ID NO: 15) del gen BRCA1, mutación c.3113A>Gdel gen BRCA1, mutación c.3481_3491 delGAAGATACTAG (SEQ ID NO: 14) del gen BRCA1, mutación c.3756_3759delGTCT del gen BRCA1, mutación c.406_407insA del gen BRCA1, mutación c.4964_4982delCTGGCCTGACCCCAGAAGA (SEQ ID NO: 19) del gen BRCA1, mutación c.5096G)A del gen BRCA1, mutación c.5177_5180delGAAA del gen BRCA1, mutación c.5177_5180delGAAA del gen BRCA1, mutación c.5266_5267insC del gen BRCA1, mutación c.68_69delAG del gen BRCA1, mutación c.815_824dupAGCCATGTGG (SEQ ID NO: 25) del gen BRCA1, mutación c.10095delCinsGAATTATATCT (SEQ ID NO: 29) del gen BRCA2, mutación c.1310_1313delAAGA del gen BRCA2, mutación c.1310_1313delAAGA del gen BRCA2, mutación c.156_157insAluYa5 del gen BRCA2, mutación c.1813dupA del gen BRCA2, mutación c.2588dupA del gen BRCA2, mutación c.2808_281 IdelACAA del gen BRCA2, mutación c.4037_4043delinsT del gen BRCA2, mutación c.5073dupA del gen BRCA2, mutación c.5350_5351delAA del gen BRCA2, mutación c.5946delT del gen BRCA2, mutación c. 6275_6276delTT del gen BRCA2, mutación c.7762_7764delinsTT del gen BRCA2, mutación c.8537_8538delAG del gen BRCA2, mutación c.8902_8913delinsTCCC del gen BRCA2, mutación c.9203del126 del gen BRCA2, mutación c.9253dupA del gen BRCA2, mutación c.9342_ 9343insAluY a gen BRCA2, mutación c.1792C)T del gen CDH1, mutación c.9_32dup24 del gen CDKN2A, mutación c.429G)A del gen EPCAM, mutación c.523C)T del gen EPCAM, mutación c.556-14A)G del gen EPCAM, mutación c.1852_1854delAAG del gen MLH1, mutación c.1852_1854delAAG del gen MLH1, mutación c.232_243delinsATGTAAGG del gen MLH1, mutación c.382delG del gen MLH1, mutación c.704_723delATAAAACCCTAGCCTTCAAA (SEQ ID NO: 33) del gen MLH1, mutación c.1076G>C del gen MSH2, mutación c.1662-12_1677del del gen MSH2, mutación c.942+3A)T del gen MSH2, mutación c.942+3A)T del gen MSH2, mutación c.2056_2060delinsCTTCTACCTCAAAAA (SEQ ID NO: 13) del gen MSH6 , mutación c.2308_2312delGGTAAinsT del gen MSH6, mutación c.2641delGinsAAAA del gen MSH6 , mutación c.3163_3164insG del gen MSH6 , mutación c.3261delC del gen MSH6, mutación c.3939_3957dupTCAAAAGGGACAATAGAAAA (SEQ ID NO: 36) del gen MSH6, mutación c.741delA del gen MSH6, mutación c.1147delC del gen MUTYH, mutación c.1187G)Adel gen MUTYH, mutación c.1435G)T del gen MUTYH, mutación c.536A)G del gen MUTYH, mutación c.933+3A)C del gen MUTYH, mutación c.2386G)T del gen PALB2, mutación c.3113G)A del gen PALB2, mutación c.1261C)T del gen PMS2, mutación c.137G)T del gen PMS2, mutación c.2117delA del gen PMS2, mutación c.2243_2246delAGAA, c.2253T)C del gen PMS2, mutación c.2445+1 G)C del gen PMS2, mutación c.861_864delACAG del gen PMS2, mutación c.861_864delACAG del gen PMS2, mutación c.511C)T del gen PTEN, mutación c.758_759insAT del gen PTEN, mutación c.987_996dupTAAAGACAAA (SEQ ID NO: 38) del gen PTEN, mutación c.1206_1207insT del gen SMAD4, mutación c.1353_1354insGCTACTGCACAAGCTGCAGCAGCTGCCC (SEQ ID NO: 40) del gen SMAD4, mutación c.1529delG del gen SMAD4, mutación c.842_843insC del gen STK11, mutación c.637C)T del gen TP53 y mutación c.916C)T del gen TP53.
6. El ácido nucleico de la reivindicación 1 o 2, en donde:
(a) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una afección cardíaca, opcionalmente miocardiopatía;
(b) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está
asociado con una afección cardíaca, opcionalmente miocardiopatía, y
cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos comprende una subsecuencia de un gen seleccionado del grupo que consiste en proteína C de unión a miosina cardíaca (MYBPC3); miosina, cadena pesada 7, músculo cardíaco, beta (MYH7); troponina I tipo 3 (TNNI3); troponina T cardíaca (TNNT2); y cadena alfa-1 de tropomiosina (TPM1); y
cada subsecuencia comprende una mutación asociada con miocardiopatía;
opcionalmente
en donde cada mutación se selecciona del grupo que consiste en:
una mutación del gen de la proteína C de unión a miosina cardíaca (MYBPC3) seleccionada del grupo que consiste en 1504C}T, 2373_2374¡nsG y 3628-41_3628-17del;
una mutación del gen de la miosina, cadena pesada 7, músculo cardíaco, beta (MYH7) seleccionada del grupo que consiste en 1988G}A, 1357C}T y 1750G}C;
una mutación del gen de la troponina I tipo 3 (TNNI3) seleccionada del grupo que consiste en 532_534delAAG y 575G}A;
una mutación del gen de la troponina T cardíaca (TNNT2), en donde la mutación es 487_489delGAG; y una mutación del gen de la cadena alfa-1 de tropomiosina (TPM1), en donde la mutación es 574G}A;
(c) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una afección cardíaca, opcionalmente miocardiopatía, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado de MYBPC3, MYH7, TNNI3, TNNT2, y TPM1, opcionalmente en donde cada genotipo de una secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la mutación 1504C}T del gen MYBPC3, mutación 2373_2374¡nsG del gen MYBPC3, mutación 3628-41_3628-17del del gen MYBPC3, mutación 1988G}A del gen MYH7, mutación 1357C}T del gen MYH7, mutación 1750G}C del gen MYH7, mutación 532_534delAAG del gen TNNI3, mutación 575G}A del gen TNNI3, mutación 487_489delGAG del gen TNNT2 y mutación 574G}A del gen TPM1;
(d) el genotipo de cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos está asociado con una afección cardíaca, opcionalmente miocardiopatía, y cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad de secuencias de nucleótidos es una subsecuencia de un gen seleccionado de ABCC9, ACTC1, ACTN2, AKAP9, ANK2, ANKRD1, BAG3, BRAF, CACNA1C, CACNB2, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, FKTN, GATAD1, GLA, GPD1L, HCN4, HRAS, ILK, JPH2, JUP, KCNE1, KCNE2, KCNE3, KCNH2, KCNJ2, KCNJ5, KCNJ8, KCNQ1, KRAS, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MAP2K1, MAP2K2, MTND1, MTND5, MTND6, MTTD, MTTG, MTTH, MTTI, MTTK, MTTL1, MTTL2, MTTM, MTTQ, MTTS1, MTTS2, MYBPC3, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, NKX2.5, NRAS, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RANGRF, RBM20, RYR2, SCN1B, SCN3B, SCN4B, SCN5A, SGCD, SNTA1, SOS1, TAZ, TCAP, TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTN, TTR y VCL; y/o
(e) el ácido nucleico tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:4 o tiene la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:4.
7. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:
(a) cada secuencia de nucleótidos de la pluralidad tiene al menos 600 nucleótidos de longitud, aproximadamente 600 nucleótidos a aproximadamente 2.000 nucleótidos de longitud,
aproximadamente 600 nucleótidos a aproximadamente 1200 nucleótidos de longitud,
aproximadamente 1.000 nucleótidos a aproximadamente 10.000 nucleótidos de longitud; y/o
(b) el ácido nucleico comprende además un origen de replicación, opcionalmente en donde el origen de replicación es un origen de replicación deEscheríchia colioSaccharomyces cerevisiaey/o
(c) el ácido nucleico comprende además al menos un nucleósido o nucleótido metilado; y/o
(d) el ácido nucleico comprende además un promotor, opcionalmente en donde el promotor es un promotor SP6; y/o
(e) el ácido nucleico comprende además un promotor,
en donde el promotores de una especie diferente a las secuencias de nucleótidos de la pluralidad, opcionalmente en donde el promotor es un promotor SP6; y/o
el ácido nucleico es un plásmido.
8. Una célula que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. La célula de la reivindicación 8, en donde:
(a) la célula es una célula humana; y/o
(b) en donde la célula es un fibroblasto o un linfocito, opcionalmente un linfocito B inmortalizado; y/o
(c) la célula es GM12878, GM24149, GM24143, GM24385, GM24631, GM24694 o GM24695, opcionalmente GM24385; y/o
(d) la célula comprende de 1 a 1.000 copias o de 5 a 500 copias del ácido nucleico; o
(e) la célula esE. coli.
10. Una composición que comprende una primera pluralidad de células y una segunda pluralidad de células, en donde:
la primera pluralidad de células consiste en células según la reivindicación 9, parte (d), cuyas células comprenden de 5 a 500 copias del ácido nucleico;
la segunda pluralidad de células consiste en células que no comprenden el ácido nucleico;
la primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células son células humanas;
la primera pluralidad de células y la segunda pluralidad de células se mezclan en la composición; y
la relación entre el número de células de la primera pluralidad y el número de células de la segunda pluralidad es de aproximadamente 1 :1 a aproximadamente 1 :10.000 en la composición.
11. Un método para elaborar un material biológico de referencia, que comprende transfectar una pluralidad de células con el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-7; opcionalmente comprende, además: (a) fijar las células de la pluralidad, opcionalmente en donde fijar las células comprende fijar las células con formalina; y/o
(b) incrustar las células en parafina; y/o
(c) diluir la pluralidad de células con células no transfectadas, opcionalmente en donde diluir la pluralidad de células con células no transfectadas comprende diluir en una proporción de células transfectadas a células no transfectadas de aproximadamente 1 :1 a aproximadamente 1 :10.000.
12. Un material biológico de referencia, que comprende
(a) una pluralidad de células de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 partes (a)-(d) y parafina, en donde la pluralidad de células están fijadas e incrustadas en la parafina,
que además comprende opcionalmente células no transfectadas, en donde las células no transfectadas no comprenden el ácido nucleico, opcionalmente en donde la proporción de células que comprenden el ácido nucleico con respecto a las células no transfectadas es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1 :10.000, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:5.000 o de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:1.000; o (b) una pluralidad de células de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 partes (a)-(d); y un líquido, opcionalmente en donde el líquido es plasma.
13. Una composición que comprende un ácido nucleico y un tampón acuoso, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que se ha extraído del material de referencia de la reivindicación 12 , opcionalmente en donde el tampón comprende tr¡s(h¡droximet¡l)am¡nometano y ácido etilendiaminotetraacético, o una sal de cualquiera de los anteriores.
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