ES2972851T3

ES2972851T3 - Músculo del corazón multicapa genomanipulado

Info

Publication number: ES2972851T3
Application number: ES20203316T
Authority: ES
Inventors: Wolfram-Hubertus Zimmermann; Malte Tiburcy; Tim Meyer
Original assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Current assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2024-06-17
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: WO2022084429A1; EP3988138A8; CN116801922A; JP2023546466A; DK3988138T3; US20230390460A1; EP3988138A1; AU2021363610A1; KR20230093270A; EP3988138B1; IL302287A; CA3195739A1

Abstract

La solicitud describe un método para fabricar un músculo cardíaco diseñado multicapa. Específicamente, el método se refiere a (i) proporcionar una mezcla de reconstitución líquida en un molde y (ii) cultivar dicha mezcla. El método se caracteriza por una adición secuencial de una o más mezclas de reconstitución líquida adicionales para obtener un músculo cardíaco diseñado multicapa. Dicho músculo idealmente tiene la forma de un parche, una bolsa o un cilindro. Además, la solicitud se refiere a un músculo cardíaco diseñado multicapa que comprende colágeno, miocitos cardíacos y no miocitos que se originan en al menos 2 capas. Dicho músculo cardíaco diseñado multicapa forma la base para varias aplicaciones in vitro e in vivo tales como la producción de un músculo cardíaco diseñado multicapa para su uso en un paciente, por ejemplo para su uso en la reparación del corazón. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Músculo del corazón multicapa genomanipulado

Antecedentes de la invención

Regenerar un corazón defectuoso sigue siendo un gran desafío. Una causa común de la insuficiencia cardíaca es un ataque cardíaco. Un ataque cardíaco, o infarto de miocardio, se produce por un bloqueo del flujo sanguíneo arterial que da lugar a un tejido insuficientemente perfundido que, en consecuencia, se ve privado de oxígeno y nutrientes. Durante un ataque cardíaco, millones o incluso hasta mil millones de células sufren una rápida necrosis, que es la causa principal de un rendimiento reducido del corazón y, en términos clínicos, de insuficiencia cardíaca. Dado que el corazón es en gran medida tejido posmitótico, el tejido del corazón no puede regenerarse por sí solo. La implantación de un músculo del corazón genomanipulado es un objetivo buscado en el campo. Se han desarrollado diferentes formatos de músculo del corazón genomanipulado para su aplicación en el modelado de enfermedades, cribado de fármacos y reparación cardíaca. Los autores de la invención y otros han publicado varias aplicaciones de modelos de miocardio humano genomanipulados para estudios de maduración de cardiomiocitos e hipertrofiain vitro(Tiburcy et al. 2017), modelado de enfermedades (Hanses et al., 2020) y cribado de fármacos (Mills et al. 2019), así como reparación cardíaca invivo(Riegler et al. 2015).

Un planteamiento que apoya el autoensamblaje de los cardiomiocitos en tejido 3D es un planteamiento que contiene un andamio, en el que el andamio se apoya principalmente en colágeno o fibrina (Zimmermann et al. 2006, Tulloch et al. 2011, Soong et al. 2012, Zhang et al. al. 2013, Riegler et al. 2015, Weinberger et al. 2016, Tiburcy et al. 2017). Además, los no miocitos son fundamentales para la generación de un tejido 3D. Al igual que en los modelos de roedores (Naito et al. 2006), dichos no miocitos son principalmente fibroblastos o células estromales con actividad de fibroblastos (Kensah et al. 2013; Ronaldson-Bouchard et al. 2018; Tiburcy et al. 2017, Zhang et al. 2013).

Además de los componentes celulares y el andamio, el mayor grado de maduración se ha logrado con el apoyo de estímulos biofísicos, es decir, mecánicos, eléctricos o una combinación de ambos (Ronaldson-Bouchard et al. 2018; Tiburcy et al. 2017). La carga mecánica es un requisito absoluto para la genomanipulación de músculo del corazón con maduración avanzada.

En la producción de tejido de músculo del corazón artificial para el tratamiento de pacientes con debilidad del músculo del corazón, un músculo del corazón genomanipulado debe resistir la fuerza de un corazón humano que late. La pared cardíaca a tratar típicamente tiene entre 5 y 10 mm de grosor en el paciente (Kawel et al. 2012), es decir, lo ideal es que un implante alcance este grosor y también debe poder desarrollar fuerza mecánica para resistir la función de la pared cardíaca.

Un desafío clave al intentar obtener un músculo del corazón genomanipulado de dicho grosor es el suministro de oxígeno y nutrientes de las células incluidas en el músculo del corazón genomanipulado en todo momento. Así, existe una necesidad en la técnica de un músculo del corazón genomanipulado con un grosor adecuado para resistir un corazón humano. Los autores de la invención han superado este desafío mediante un proceso de colada repetitivo y secuencial del músculo del corazón genomanipulado.

Compendio de la invención

Para generar un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), una capa compactada (mezcla de reconstitución) de un hidrogel que contiene células se recubre con, por lo menos, otra capa. Este proceso repetitivo y secuencial asegura la formación de un músculo del corazón genomanipulado engrosado y reforzado, en el que por lo menos una capa nueva se fusiona con las capas anteriores. Dicho de otra manera, un músculo del corazón genomanipulado aumenta su grosor mediante capas repetitivas y secuenciales. Además, es importante que el músculo del corazón genomanipulado sea atravesado por una resistencia mecánica, en el que se extienden varillas a través del tejido genomanipulado para resistir las contracciones auxotónicas e introducir canales para el suministro de oxígeno y nutrientes en todo el tejido genomanipulado.

Una ventaja particular del método como se divulga en la presente memoria es que las células dentro de la mezcla de reconstitución/MEHM reciben suficiente suministro de nutrientes y oxígeno en todo momento. Se logra un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes al mantener la distancia mínima de difusión global desde la superficie del MEHM hasta el núcleo (centro) del MEHM en todo momento durante el proceso de fabricación al mismo tiempo que se produce un MEHM engrosado, que puede utilizarse, por ejemplo, como implante. Esto se logra mediante un diseño de MEHM perforado. Las perforaciones se introducen, p. ej., mediante las varillas de perforación utilizadas, entre otras cosas, para resistencia mecánica (como se muestra, p. ej., en las figuras 7 y 8). Las varillas son capaces de proporcionar oxígeno y/o nutrientes a las células del MEHM. Las varillas crean "canales" a través de la mezcla de reconstitución/MEHM para el suministro de oxígeno y/o nutrientes e introducen de forma independiente una carga mecánica en el MEHM.

Para obtener un MEHM tan grueso, se moldean mezclas de reconstitución que comprenden cardiomiocitos, no cardiomiocitos y colágeno de forma repetitiva y secuencial. Al vaciar repetidamente capas individuales encima de la capa anterior y/o debajo de la capa anterior, las capas se fusionan, lo cual es una ventaja clave del método divulgado.

Mediante la colada secuencial, una capa se ha condensado por lo menos en un 20 % del volumen original antes de que se añada una capa adicional. Las células incluidas reciben oxígeno y nutrientes mediante difusión desde la superficie del tejido para evitar, p. ej., hipoxia y/o necrosis. Las mezclas de reconstitución están perforadas por varillas, lo que amplía la superficie del tejido. Así, el grosor global del músculo se puede escalar según se desee teniendo en cuenta la difusión, así como los requisitos de nutrientes y oxígeno específicos de las células.

En un primer aspecto, se divulga un método para fabricar un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), en el que el método comprende las etapas de:

(i) proporcionar una mezcla de reconstitución líquida en un molde, en el que dicha mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas,

en el que dicha mezcla de reconstitución comprende (a) colágeno, (b) una mezcla celular de miocitos cardíacos y no miocitos y (c) un medio de reconstitución adecuado, mediante lo cual dicha mezcla de reconstitución experimenta gelificación en el molde,

(ii) cultivar la mezcla obtenida en la etapa (i) en dicho molde en un medio de cultivo adecuado, mediante lo cual la mezcla de reconstitución se compacta en el molde;

(iii) a) añadir una mezcla de reconstitución líquida adicional como se define en la etapa (i) por encima y/o por debajo de la mezcla de reconstitución compactada obtenida en la etapa (ii), mediante lo cual dicha mezcla de reconstitución líquida adicional experimenta gelificación, seguido de cultivo en las mismas condiciones que en la etapa ii), mediante lo cual dicha mezcla de reconstitución adicional se compacta en el molde; o

b) transferir la mezcla de reconstitución compactada obtenida en la etapa (ii) a un molde diferente, en el que dicha mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas, seguido de llevar a cabo la etapa (iii) a) en dicho molde diferente; mediante lo cual se obtiene un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM),

preferiblemente en el que el MEHM se engruesa al repetir la etapa (iii)a) y/o la etapa (iii)b) por lo menos una vez, y

(iv) opcionalmente cultivar el MEHM de la etapa (iii) en dicho molde en un medio de maduración adecuado, en el que el MEHM es capaz de contraerse, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm, según se define en las reivindicaciones.

En otro aspecto, se contempla un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) obtenido mediante un método como se describe en la presente memoria, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm, según se define en las reivindicaciones.

Además, se describe un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), en el que el MEHM comprende (a) colágeno y (b) una mezcla celular de miocitos cardíacos y no miocitos, y en el que el EHM comprende por lo menos 2 capas, en el que el MEHM es de 0,7 mm a 30 mm de grosor y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm, según se define en las reivindicaciones.

Además, la presente divulgación divulga un uso del MEHM obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria en una fabricaciónin vitrode un miocardio humano genomanipulado, según se define en las reivindicaciones.

Finalmente, se describe un EHM multicapa obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria para su uso en reparación cardíaca, preferiblemente para el tratamiento de un paciente que padece insuficiencia cardíaca, según se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

(iv) opcionalmente cultivar el MEHM de la etapa (iii) en dicho molde en un medio de maduración adecuado,

en el que el MEHM es capaz de contraerse, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm, según se define en las reivindicaciones.

En general, un músculo del corazón genomanipulado (EHM), tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un músculo del corazón artificial que comprende células y colágeno, que es capaz de contraerse. Además, un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) se origina a partir de por lo menos 2 capas de músculo del corazón genomanipulado (EHM). Para fabricar un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), las capas se añaden secuencialmente. Cuando se produce una estratificación secuencial, se añade una capa posterior a la capa original (primera). La capa posterior luego se fusiona con la capa original (primera). Este proceso de estratificación se puede repetir varias veces. En otras palabras, una capa posterior se fusiona con la capa añadida previamente. Cuando se lleva a cabo la estratificación, el MEHM se engruesa capa por capa. La ventaja clave de este método es que un MEHM engrosado es más estable y capaz de resistir fuerzas mayores que un EHM de una sola capa. Además, otra característica clave del MEHM es que es capaz de contraerse, de forma parecida a un miocardio cardíaco natural, preferiblemente como se define a continuación. Idealmente, dicho músculo del corazón multicapa genomanipulado es adecuado para su uso como implante tal como un implante de corazón.

En una realización, el MEHM obtenido mediante la etapa (iii) y opcionalmente la etapa (iv) tiene la capacidad de contraerse, lo que puede evaluarse mediante inspección visual. De forma alternativa, la contracción del MEHM se puede determinar mediante la capacidad de la mezcla de reconstitución de la etapa (i) para formar un músculo del corazón genomanipulado (EHM) generador de fuerza al llevar a cabo las etapas (i), (ii) y opcionalmente (iv), y en el que el músculo del corazón genomanipulado (EHM) es capaz de desarrollar fuerzas contráctiles de por lo menos 0,05 mN de fuerza de contracción (FOC) medida en condiciones isométricas estándar en la figura 6C suplementaria de Tiburcy et al. Circulation 135(19)1832-1847 (2017). Más específicamente, la contracción del MEHM se puede determinar adicionalmente al evaluar en paralelo la capacidad de la mezcla de reconstitución de la etapa (i) para formar un músculo humano genomanipulado generador de fuerza en formato bucle, como se describe en Tiburcy et al. Circulation 135(19)1832-1847 (2017), al llevar a cabo las etapas (i), (ii) y (iv), y en el que el músculo del corazón genomanipulado en formato bucle genera por lo menos 0,05 mN de fuerza de contracción (FOC), según se mide en la figura 6C suplementaria de Tiburcy et al. Circulation 135(19)18321847 (2017). En otras palabras, la contracción del MEHM se puede determinar al generar un EHM en formato bucle en paralelo al MEHM. La ventaja de este planteamiento en paralelo es que la formación de EHM en formato bucle se establece en pocillos (véase, por ej., Tiburcy et al. 2017 y 2020) y también se puede realizar en un formato de 48 pocillos. Además, la fuerza de contracción se puede determinar más cómodamente en formato bucle a medida que se mide la fuerza entre dos varillas. Así, la calidad de la mezcla de reconstitución y el medio se pueden evaluar más fácilmente en el formato bucle establecido en pocillos. Además, se espera que un EHM cultivado en pocillos en formato bucle también asegure que el MEHM se proporcione con la misma calidad. De forma alternativa, la fuerza de contracción (FOC) en un MEHM también se puede medir directamente. Por ejemplo, Zimmermann et al. (2000) describe la medición de FOC en tejido. Así, el experto en la materia también puede adaptar dicha configuración para la medición de un FOC en un MEHM. En una realización preferida, el MEHM genera una fuerza de contracción (FOC) de por lo menos 0,05 mN, más preferiblemente por lo menos 0,1 mN, más preferiblemente por lo menos 0,3 mN, más preferiblemente por lo menos 0,5 mN, más preferiblemente por lo menos 1 mN, más preferiblemente por lo menos 3 mN, incluso más preferiblemente por lo menos 5 mN y lo más preferiblemente por lo menos 10 mN.

El MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm, preferiblemente de 0,7 mm a 25 mm, más preferiblemente de alrededor de 0,9 mm a alrededor de 23 mm, más preferiblemente de alrededor de 1,5 mm a alrededor de 20 mm, más preferiblemente de alrededor de 2 mm a alrededor de 18 mm, más preferiblemente de alrededor de 2,8 mm a alrededor de 15 mm, más preferiblemente de alrededor de 3,3 mm a alrededor de 13 mm, más preferiblemente de alrededor de 3,8 mm a alrededor de 12 mm, más preferiblemente de alrededor de 4,2 mm a alrededor de 11 mm, más preferiblemente de alrededor de 4,6 mm a alrededor de 10,5 mm, y lo más preferiblemente de alrededor de 5 mm a alrededor de 10 mm. El término "alrededor de" en la presente memoria cuando se usa con referencia al grosor tanto de una capa individual de un músculo del corazón multicapa genomanipulado de la invención como el grosor de un músculo del corazón genomanipulado como se describe en la presente memoria significa que el grosor puede desviarse del valor numérico respectivo en el ±1 %, ±2 %, ±3 %, ±4 %, ±5 %, ±6 %, ±7 %, ±8 %, ±9 % o ±10 %. Esto significa, por ejemplo, que, si el grosor de una capa individual es de "alrededor de 0,3 mm", esta capa puede tener un grosor que varía entre 0,27 mm (una desviación del -10 %) y 0,33 mm (una desviación del 10 %). Asimismo, si el músculo del corazón genomanipulado como tal tiene un grosor de alrededor de 0,8 mm, el músculo del corazón genomanipulado incluye un grosor que varía entre 0,72 mm y 0,88 mm.

Idealmente, el MEHM coincide con el grosor de un miocardio humano, que tiene un grosor de 5 a 12 mm en un estado no contraído. Por ejemplo, Kawel et al. 2012 publicó que la pared del corazón humano tiene como máximo 12 mm en relajación máxima. Nowosielski et al. 2009 publicó que el grosor de la pared típicamente aumenta en un 60 % tras la contracción. Así, se estima que un corazón humano tiene un grosor máximo de 20 mm. En consecuencia, un MEHM para su uso como implante de corazón tiene preferiblemente un grosor entre 5 mm y 20 mm.

Hasta donde sabe el autor de la invención, este es el primer diseño de EHM engrosado en la técnica. La ventaja clave del método divulgado es que el MEHM se origina a partir de por lo menos 2 capas, que se fusionan juntas. Mediante esta estratificación secuencial y repetitiva, el MEHM se engruesa capa por capa, al mismo tiempo que se asegura que la distancia global de difusión entre la superficie y el tejido sea mínima en todo el MEHM. La distancia de difusión deseada entre la superficie y el tejido está asegurada por el diseño y la densidad de la varilla de perforación. Una difusión entre la superficie y el tejido mínima o metabólicamente adecuada asegura que las células reciben oxígeno y nutrientes en todo momento. Una mezcla de reconstitución o tejido multicapa de la misma sin perforaciones de, p. ej., varios centímetros, presentaría una necrosis rápida (núcleo de tejido) de las células en el centro de la mezcla de reconstitución ya que dichas células en el núcleo de tejido no recibirían suficiente oxígeno y/o nutrientes.

En otra realización, la contracción del MEHM también se puede medir videoópticamente. Por ejemplo, se puede medir el cambio de área fraccionaria (FAC) del MEHM. El método de evaluar el FAC se ha descrito previamente en Tiburcy et al. (2017). En síntesis, se compara el área del MEHM en un estado relajado y en el estado contraído y el cambio se informa en porcentaje. En una realización especialmente preferida, la contracción se determina mediante mediciones de cambio de área fraccionaria (FAC) del MEHM usando el método descrito en Tiburcy et al., Circulation 135(19)1832-1847 (2017), y en el que el cambio de área fraccionaria ( FAC) es por lo menos el 0,5 % tras estimulación eléctrica, preferiblemente en el que el FAC es por lo menos el 0,7 %, más preferiblemente por lo menos el 1 %, más preferiblemente por lo menos el 2 %, más preferiblemente por lo menos el 3 % e incluso más preferiblemente por lo menos el 5 %. En una realización especialmente preferida, el FAC es como máximo el 20 %, preferiblemente como máximo el 19 %, más preferiblemente como máximo el 18 %, incluso más preferiblemente como máximo el 17 %, incluso más preferiblemente como máximo el 16 %, e incluso más preferiblemente como máximo el 15 %. La estimulación eléctrica se puede lograr mediante un campo eléctrico o mediante estimulación puntual. En el ejemplo 4 se muestran ejemplos de un campo eléctrico. El experto en la materia también conoce la estimulación puntual con un electrodo. En general, la estimulación eléctrica provocará una contracción del MEHM. Puede derivarse de Tiburcy et al. 2017, que alrededor del 7 % de FAC corresponde a alrededor de 1 mN de FOC (figura 11 suplementaria). Basándose en esta figura, el experto en la materia puede correlacionar FOC y FAC, si lo desea.

Para fabricar dicho MEHM, se proporciona una mezcla de reconstitución líquida en un molde. En general, una mezcla "líquida" puede fluir y llenar un molde. Además, el medio se puede disolver en la mezcla de reconstitución líquida. Como se usa aquí, una mezcla "líquida" se entiende en contraste con una mezcla "tipo gel", dado que una mezcla parecida a un gel no puede fluir y el medio no se puede disolver libremente en una mezcla similar a un gel y se define como a continuación.

Una “mezcla de reconstitución”, tal como se usa en la presente memoria, comprende colágeno, una mezcla celular y un medio de reconstitución adecuado, en el que la mezcla celular está formada por miocitos cardíacos y no miocitos. El experto en la materia comprende fácilmente que la mezcla de reconstitución forma la base del MEHM, ya que los diferentes componentes de la mezcla de reconstitución construyen las partes clave del músculo del corazón genomanipulado, es decir, reconstituyen las partes clave de un músculo del corazón para obtener un MEHM mediante ingeniería de tejidos.

El colágeno es uno de los componentes de la mezcla de reconstitución. El colágeno es la principal proteína estructural de la matriz extracelular de diversos tejidos conjuntivos del cuerpo. El colágeno consiste en aminoácidos para formar una triple hélice de fibrillas alargadas, lo cual es conocido por el experto en la materia. Además, el colágeno admite tejidos genomanipulados tales como el MEHM y proporciona a las células un soporte estructural desde el exterior. El experto en la materia también sabe que el colágeno se puede adquirir de diversos proveedores, tales como por ejemplo “Collagen Solutions”. Por ejemplo, la mezcla de reconstitución puede proporcionar una concentración final de 0,5 y 3 mg/ml de colágeno, preferiblemente entre 0,55 y 2,5 mg/ml de colágeno, más preferiblemente entre 0,6 y 2,2 mg/ml de colágeno, 0,65 y 2 mg/ml de colágeno, más preferiblemente entre 0,7 y 1,75 mg/ml de colágeno, más preferiblemente entre 0,75 y 1,5 mg/ml de colágeno, más preferiblemente entre 0,8 y 1,2 mg/ml de colágeno, incluso más preferiblemente entre 0,85 y 1 mg/ml de colágeno y lo más preferiblemente alrededor de 0,9 mg/ml de colágeno. En una realización preferida, el colágeno de la etapa (i) se selecciona del grupo que consiste en colágeno tipo I, colágeno tipo III, colágeno tipo IV, colágeno tipo V, colágeno tipo VI, colágeno tipo XII, colágeno tipo XIII, colágeno tipo XIV, colágeno tipo XV y una mezcla de los mismos. El experto en la materia sabe que el colágeno tipo I es el colágeno más abundante en el cuerpo humano. En una realización particularmente preferida, por lo menos el 90 % del colágeno de la mezcla de reconstitución de la etapa (i) es colágeno tipo I. En particular si el MEHM se utiliza como implante, el colágeno de la mezcla de reconstitución de la etapa (i) puede ser de grado médico.

Por supuesto, el colágeno puede derivarse de diversas fuentes y distintos proveedores. Por ejemplo, el colágeno puede ser de origen bovino, de origen equino, de origen humano o de origen marino. En una realización especialmente preferida, el colágeno es de origen bovino. En una realización especialmente preferida, el colágeno utilizado está libre del retrovirus endógeno porcino y de cualquier encefalopatía espongiforme transmisible. También se contempla que el colágeno en la mezcla de reconstitución de la etapa (i) comprenda además uno o más componentes de matriz extracelular adicionales distintos del colágeno. El término "proteína de matriz extracelular" se refiere a cualquier proteína de matriz extracelular (ECM) conocida por el experto medio (Hynes y Naba (2012)). Además, el experto en la materia conoce la composición de matrices extracelulares de, p. ej., Mouw J. K., et al. (2014), que puede utilizarse para la generación de un EHM. En una realización especialmente preferida, dicho uno o más componentes de matriz adicionales se selecciona del grupo que consiste en elastina, laminina, entactina, nidogen, proteoglicanos (p. ej., decorina), glucosaminoglucanos (p. ej., ácido hialurónico) y fibronectina. Además, el experto en la materia sabe que existen miméticos sintéticos de dichas proteínas extracelulares disponibles comercialmente y que dichos miméticos sintéticos también son adecuados para la fabricación de un MEHM. Por ejemplo, el experto en la materia conoce literatura tal como O'Leary et al. (2011), que describe el autoensamblaje de un péptido mimético de colágeno de triple hélice a nanofibra e hidrogel.

En una realización preferida, la mezcla celular en la etapa (i) proporciona una concentración celular final en la mezcla de reconstrucción de 1 -26,5 x 106 células por ml, preferiblemente de 2-13,2 x 106 células por ml, más preferiblemente de 3-10 x 106 células por ml, más preferiblemente de 3,5-9 x 106 células por ml, más preferiblemente de 4-8 x 106 células por ml, más preferiblemente de 4,3-7 x 106 células por ml, más preferiblemente de 4,6-6 x 106 células por ml, incluso más preferiblemente de alrededor de 5 x 106 células por ml. Sin embargo, el experto en la materia es capaz de determinar una concentración adecuada de células en la mezcla de reconstitución. El experto en la materia puede, por ejemplo, guiarse para determinar una concentración y composición celular adecuadas según Tiburcy et al. (2017) o Schlick et al. (2019).

La mezcla celular está constituida por miocitos cardíacos y no miocitos. Los miocitos cardíacos son las células musculares (miocitos) que constituyen el músculo cardíaco (músculo del corazón) en el tejido natural. Cada miocito cardíaco contiene miofibrillas, que son orgánulos especializados constituidos por largas cadenas de sarcómeros, las unidades contráctiles fundamentales de las células musculares. El experto en la materia sabe que los miocitos cardíacos se pueden obtener comercialmente o mediante diferenciación de células madre pluripotentes, p. ej., de células madre pluripotentes inducidas. En una realización especialmente preferida, los miocitos cardíacos son miocitos cardíacos humanos. En otra realización particularmente preferida, los miocitos cardíacos se derivan de células madre embrionarias, en el que las células no se producen usando un proceso que implique modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos o que implique el uso de un embrión humano con fines industriales o comerciales. Por ejemplo, los miocitos cardíacos pueden derivarse de células madre pluripotentes inducidas, células madre partenogenéticas, células somáticas programadas o células madre adultas, preferiblemente en el que los miocitos cardíacos derivan de células madre pluripotentes inducidas. El experto en la materia conoce las células madre pluripotentes inducidas, las células madre partenogenéticas o las células madre adultas, como se describe en la técnica. Las células somáticas programadas se reprograman directamente en un tipo de célula deseado. Este método evita la inducción de pluripotencia y los procedimientos de diferenciación posteriores (véase, por ejemplo, leda et al.

2010, Song et al. 2012, Nam et al. 2013). En particular, el experto en la materia conoce diversos protocolos en la literatura, que describen la generación de miocitos cardíacos, tales como, por ejemplo, mediante diferenciación sin suero, como se describe en el documento WO2015/040142 o protocolos alternativos, como los revisados en Burridge et al. (2012), Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming, Cell Stem Cell. 6 de enero de 2012; 10(1 ):16-28. Además, el capítuloEngineeredHeartMuscle Models in Phenotypic Drug Screensde Zimmermann en el libro de Schafer-Korting, Stuchi Maria-Engler, Landsiedel (87017223) Organotypic Models in Drug Development, Handbook of Experimental Pharmacology (Springer, 2020) resume diversos protocolos para obtener miocitos cardíacos, que pueden usarse para el método como se divulga en la presente memoria. En dichos protocolos, también se contempla que los miocitos cardíacos pueden ser miocitos cardíacos fetales o neonatales derivados de células madre de primates no humanos. El experto en la materia también conoce métodos para evaluar la identidad de los miocitos cardíacos, tales como mediante citometría de flujo o secuenciación de ARN. Dichos métodos permiten, por ejemplo, determinar la expresión de los marcadores ACTN2, TTN, RYR2 y/o troponinas, que son característicos de los miocitos cardíacos.

En una realización, la mezcla celular de la etapa (i) comprende por lo menos el 10 % de miocitos cardíacos, preferiblemente por lo menos el 20 %, más preferiblemente por lo menos el 30 %, incluso más preferiblemente por lo menos el 40 % y lo más preferiblemente por lo menos el 50 %. El experto en la materia es capaz de determinar la relación óptima de cardiomiocitos y no miocitos. La optimización de la relación óptima se guiará por la compactación del EHM y en particular de la capacidad del EHM para contraerse. Por ejemplo, Tiburcy et al. (2017) y Schlick et al. (2019) demuestran que se requieren cardiomiocitos y no miocitos, tales como las células estromales, para la contracción del miocardio humano genomanipulado y la compactación. Específicamente, los cardiomiocitos provocan la contracción, mientras que los no miocitos, tales como las células estromales, provocan la compactación. Además, los no miocitos excretan proteínas de la matriz extracelular, tales como los colágenos, que sostienen la organización tridimensional del EHM y/o se unen a la matriz extracelular por medio de integrinas. En una realización preferida, la contracción del MEHM se produce por los miocitos cardíacos lo que genera la aparición de una fuerza contráctil del MEHM.

Los no miocitos, tal como se usan en la presente memoria, son el otro componente celular de la mezcla celular además de los miocitos cardíacos. Los no miocitos son fundamentales para el desarrollo de un MEHM. Como se demuestra, por ejemplo, en Schlick et al. (2019), el miocardio humano genomanipulado no se compacta cuando no se proporcionan no miocitos en la mezcla de reconstitución. En una realización preferida, los no miocitos se seleccionan entre uno o más del grupo que consiste en células estromales, células endoteliales, células de músculo liso y células madre mesenquimales, preferiblemente en el que los no miocitos son células estromales o células endoteliales, más preferiblemente en el que los no miocitos son células estromales, incluso más preferiblemente en el que las células estromales son células estromales cardíacas, incluso más preferiblemente en el que las células estromales cardíacas tienen propiedades de fibroblastos, incluso más preferiblemente en el que las células estromales cardíacas son fibroblastos. Típicamente, los no miocitos excretan proteínas de la matriz extracelular y/o se unen a la matriz extracelular por medio de integrinas para permitir la formación de MEHM. En otras palabras, y en una realización preferida, los no miocitos idealmente son capaces de compactar la reconstitución por medio de interacciones célulamatriz en la etapa (ii). Así, cualquier célula capaz de realizar interacciones biofísicas entre la célula y la matriz y capaz de secretar proteínas de la matriz extracelular son no miocitos adecuados. En una realización particularmente preferida, los no miocitos expresan CD90, según se determina con citometría de flujo, preferiblemente en el que los no miocitos expresan CD90, CD74 y CD44. Como se ha mencionado anteriormente, lo ideal es que los no miocitos excreten proteínas de la matriz extracelular, en particular colágeno, y/o expresen integrinas para facilitar las interacciones célula-matriz, en las que los no miocitos compactan la mezcla de reconstitución. Los no miocitos se pueden obtener de diversas fuentes. Por ejemplo, los no miocitos pueden derivarse de células madre pluripotentes inducidas, células madre partenogenéticas, células somáticas programadas, células madre adultas o células madre mesenquimales, preferiblemente en las que los no miocitos derivan de células madre pluripotentes inducidas. Además, los no miocitos pueden derivarse de células madre embrionarias, en las que las células no se producen usando un proceso que implique modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos o que implique el uso de un embrión humano con fines industriales o comerciales. En otra realización preferida, los no miocitos se derivan de biopsias obtenidas de sujetos humanos, preferiblemente de pacientes, incluso más preferiblemente de pacientes para la administración autóloga o alogénica de EHM. Los no miocitos derivados de pacientes autólogos tienen la ventaja de que las células se obtienen del mismo paciente y, por tanto, estas células son inmunológicamente compatibles con dicho paciente. Esto es una ventaja particular en caso de que el MEHM se utilice como implante para un paciente. Las células alogénicas también tienen la ventaja de que son derivadas del paciente y, por tanto, estas células son parecidas al paciente que necesita un implante MEHM. El experto en la materia puede utilizar una gran cantidad de protocolos para obtener no miocitos adecuados. Por ejemplo, el documento EP20188364.2 describe un método sin suero para obtener células estromales cardíacas con propiedades de fibroblastos. Además, Witty et al. (2014), Iyer D., et al. (2015), Bao X., et al. (2016), o Bao X., et al. (2017) describen protocolos para obtener no miocitos adecuados.

En una realización particularmente preferida, los no miocitos de la mezcla celular de la etapa (i) son células estromales, como se describe, por ejemplo, en el documento EP20188364.2, preferiblemente en el que las células estromales son células estromales humanas. En caso de que los no miocitos sean células estromales, la mezcla celular de la etapa (i) puede comprender por lo menos el 10 % de células estromales, preferiblemente por lo menos el 20 %, más preferiblemente por lo menos el 30 %, incluso más preferiblemente por lo menos el 40 %, e incluso más preferiblemente por lo menos el 50 %. El experto en la materia entiende que los miocitos cardíacos y los no miocitos juntos constituyen la mezcla celular, es decir, el 100 %. Una relación ejemplar de miocitos cardíacos y no miocitos sería 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 o 90:10, respectivamente. Por supuesto también se podría elegir cualquier relación intermedia. Como se describe anteriormente, se han probado varias relaciones y se pueden encontrar en la literatura, como en Tiburcy et al. (2017) y Schlick et al. (2019).

Típicamente, el medio de reconstitución comprende (a) un medio basal y (b) un suplemento sin suero. El suplemento sin suero puede estar comprendido dentro del medio de reconstitución y, de este modo, dentro de la mezcla de reconstitución, el medio de cultivo y/o el medio de maduración. En una realización preferida, el suplemento sin suero se puede formular para proporcionar una concentración final (1) en la mezcla de reconstitución, (2) el medio de cultivo y/o (3) el medio de maduración. Por supuesto, las concentraciones y los ingredientes se pueden seleccionar independientemente para (1) en la mezcla de reconstitución, (2) el medio de cultivo o (3) el medio de maduración.

Por ejemplo, el suplemento sin suero se puede formular para proporcionar una concentración final en cualquiera de (1) a (3) de los componentes siguientes: 0,5-50 mg/ml de albúmina (preferiblemente 1 -40 mg/ml, más preferiblemente 2-30 mg/ml, más preferiblemente 3-20 mg/ml, más preferiblemente 4-10 mg/ml y lo más preferiblemente 4,5 7,5 mg/ml, tal como aproximadamente 5 mg/ml);

1-100 pg/ml de transferrina (preferiblemente 2-90 pg/ml, más preferiblemente 3-80 pg/ml, más preferiblemente 4 70 pg/ml, más preferiblemente 5-60 pg/ml, más preferiblemente 6-50 pg /ml, más preferiblemente 7-40 pg/ml, más preferiblemente 8-30 pg/ml, más preferiblemente 9-20 pg/ml, tal como alrededor de 10 pg/ml);

0,1-10 pg/ml de etanolamina (preferiblemente 0,2-9 pg/ml, más preferiblemente 0,3-8 pg/ml, incluso más preferiblemente 0,4-7 pg/ml, incluso más preferiblemente 0,5-6 pg/ml, más preferiblemente 0,6-5 pg/ml, más preferiblemente 0,7-4 pg/ml, más preferiblemente 0,8-3 pg/ml, lo más preferiblemente 1-2,5 pg/ml, tal como alrededor de 2 pg/ml);

14.4- 1.446 nM de selenio o una sal biodisponible del mismo (preferiblemente 40-700 nM, más preferiblemente 70 300 nM, incluso más preferiblemente 130-160 nM, lo más preferiblemente alrededor de 144,6 nM);

0,4-40 pg/ml de L-carnitina HCl (preferiblemente 0,5-30 pg/ml, más preferiblemente 1-20 pg/ml, incluso más preferiblemente 2-10 pg/ml, más preferiblemente 3-5 pg/ml, y lo más preferiblemente alrededor de 4 pg/ml);

1-100 pg/ml de suplemento de ácido graso (preferiblemente 1,4-80 pg/ml, más preferiblemente 1,8-40 pg/ml, incluso más preferiblemente 2-24 pg/ml, más preferiblemente 2,4-8 pg/ml, y lo más preferiblemente 3,2-6 pg/ml, tal como alrededor de 4 pg/ml); y

0,0004-0,04 pg/ml de triodo-L-tironina (T3) (preferiblemente 0,0010-0,02 pg/ml, más preferido 0,0016-0,010 pg/ml, aún más preferido 0,002-0,006 pg/ml, lo más preferido alrededor de 0,004 pg/ml).

El suplemento de ácido graso puede incluir, por ejemplo, ácido linoleico y/o ácido linolénico.

Por ejemplo, una sal biodisponible de selenio es selenito de sodio, de modo que se proporciona una concentración final de selenito de sodio en la mezcla de reconstitución, el medio de cultivo o de reconstitución de 0,003-0,3 pg/ml (preferiblemente 0,005-0,16 pg/ml, más preferiblemente 0,010-0,1 pg/ml, incluso más preferiblemente 0,02-0,05 pg/ml y lo más preferiblemente 0,03 pg/ml).

En otra realización, el suplemento sin suero también puede comprender uno o más de vitamina A, D-galactosa, progesterona y putrescina. Estos componentes son favorables para la viabilidad celular. El experto en la materia conoce las concentraciones adecuadas de los componentes respectivos o pueden determinarse fácilmente mediante experimentación rutinaria.

Se puede preparar un ejemplo de suplemento sin suero según protocolos publicados (véase también Brewer et al. (1993)) o se puede comprar comercialmente. Por ejemplo, se puede utilizar B27 menos insulina (Tabla 1). En una realización preferida, el suplemento sin suero se proporciona con el 0,2-20 % (v/v) de B27 menos insulina en la mezcla de reconstitución, el medio de cultivo o reconstitución, preferiblemente el 1-16 % (v/v), más preferiblemente el 2-12 % (v/v), más preferiblemente el 3-8 % (v/v), incluso más preferiblemente el 3-8 % (v/v), incluso más preferiblemente el 3.4- 5 % (v/v) de B27 menos insulina, y lo más preferiblemente alrededor del 4 % (v/v) de B27 menos insulina en la mezcla de reconstitución, el medio de cultivo o de reconstitución, tal como se obtiene comercialmente o se prepara preferiblemente según la Tabla 1. De forma alternativa, también se puede aplicar B27 con insulina. La composición óptima de B27 se puede determinar experimentalmente para cada tipo de célula utilizada. El experto en la materia sabe cómo determinar la composición óptima de B27 y/o su concentración. Por ejemplo, Tiburcy et al. (2017) compararon el uso de B27 y B27 menos insulina en la figura IIIF de datos suplementarios disponibles solo en línea. El músculo genomanipulado producido con B27 menos insulina muestra una fuerza mayor en comparación con el músculo producido con B27. Sin embargo, dicha figura también muestra que B27 (con insulina) se puede utilizar para generar satisfactoriamente un miocardio humano genomanipulado para lograr una buena contractilidad.

Además, el medio basal del medio de reconstitución, el medio de cultivo y/o el medio de maduración pueden comprender adicionalmente ácido ascórbico o un derivado del mismo. Por ejemplo, cuando el ácido ascórbico está comprendido en el medio basal del medio de reconstitución, el medio de cultivo y/o el medio de maduración, se proporciona una concentración de 10-1000 pM, preferiblemente 50-400 pM, más preferiblemente 100-300 pM, incluso más preferiblemente 150-250 pM, y más preferiblemente alrededor de 200 pM en la mezcla de reconstitución, el medio de cultivo y/o el medio de maduración. Aún más preferido es el ácido ascórbico en forma de ascorbato-2-fosfato.

Además, el medio basal del medio de reconstitución, el medio de cultivo y/o el medio de maduración puede ser RPMI, que además comprende piruvato. Un intervalo de concentración especialmente preferido de piruvato en RPMI es de 0,1 a 10 mM de piruvato, más preferiblemente de 0,2 a 5 mM de piruvato, incluso más preferiblemente de 0,4 a 2,5 mM de piruvato, incluso más preferiblemente de 0,8 a 1,5 mM de piruvato, incluso más preferiblemente de 0,9 a 1,2 mM de piruvato, lo más preferiblemente alrededor de 1 mM de piruvato.

El medio basal del medio de reconstitución puede seleccionarse, por ejemplo, entre medio de Iscove, RPMI, aMEM y DMEM o una mezcla de los mismos, preferiblemente en el que el medio basal se selecciona entre medio de Iscove, RPMI, aMEM o una mezcla de los mismos, más preferiblemente en el que el medio basal es una mezcla de medio de Iscove y RPMI. Sin embargo, se puede utilizar cualquier medio basal adecuado para el método. Los medios basales están disponibles comercialmente o pueden producirse según recetas disponibles públicamente, p. ej., de los catálogos de la ATCC. En general, los medios, tal como se usan en la presente memoria, combinan cantidades adecuadas de glucosa, lactato y/o ácidos grasos como nutrientes esenciales. La glucosa, el lactato y/o los ácidos grasos aseguran un suministro adecuado de nutrientes a las células incluidas en la mezcla de reconstitución.

Si se considera apropiado, el medio basal podrá complementarse con aminoácidos. Si se utiliza aMEM como medio basal, entonces no es necesario, por ejemplo, complementar el medio basal con aminoácidos no esenciales. Los aminoácidos no esenciales están disponibles comercialmente como un suplemento combinado. Un suplemento de este tipo comprende, por ejemplo, 750 mg/L de glicina, 890 mg/L de L-alanina, 1.320 mg/L de L-asparagina, 1.330 mg/L de ácido L-aspártico, 1.470 mg/L de ácido L-glutámico, 1.150 mg/L de L-prolina y 1.050 mg/L de L-serina.

En una realización especialmente preferida, el medio de reconstitución comprende además (c) 35-790 pM de ácido ascórbico, (d) 5-500 ng/ml de IGF-1, (e) 0,3-26 ng/ml de VEGF, (f) 0,5-53 ng/ml de FGF-2 y (g) 0,5-10 ng/ml de T G Fpl. En una realización especialmente preferida, el medio de reconstitución comprende además (c) 75-300 pM de ácido ascórbico, (d) 26-105 ng/ml de IGF-1, (e) 1,3-5,2 ng/ml de VEGF, (f) 2,6-10,5 ng/ml de FGF-2 y (g) 1-6 ng/ml de TGFp1. En una realización aún más preferida, el medio comprende además (c) alrededor de 158 pM de ácido ascórbico, (d) alrededor de 53 ng/ml de IGF-1, (e) alrededor de 2,6 ng/ml de VEGF (f) alrededor de 5,3 ng/ml de FGF-2 y alrededor de 3 ng/ml de TGFp1.

Se prefiere especialmente que el VEGF sea VEGF<165>. El experto en la materia conoce los protocolos publicados para los medios de reconstitución adecuados, tales como Tiburcy et al. (2017) o Tiburcy et al. (2020), y el experto en la materia es capaz de identificar protocolos igualmente adecuados.

El "molde" tal como se utiliza en la presente memoria se puede seleccionar libremente y su forma puede variar geométricamente. Es clave que el molde contenga la mezcla de reconstitución y que la mezcla de reconstitución experimenta gelificación en el molde. El molde puede fabricarse a medida para el fin previsto. Por ejemplo, si el propósito es un implante para el cuerpo humano, el molde hecho a medida puede coincidir con el defecto miocárdico. En caso de que el propósito del MEHM sea someter a prueba, p. ej., la eficacia del fármaco, se puede usar una forma diferente. El experto en la materia puede adaptar la forma del molde dependiendo de sus necesidades u objetivos. Por ejemplo, el experto en la materia puede utilizar una impresora 3D para adaptar la forma del molde individualmente. En una realización preferida, el molde se forma para facilitar la formación de un MEHM de forma plana, un MEHM en forma de bolsa o un MEHM de forma cilindrica. En una realización preferida, el molde tiene la forma de un parche, una bolsa o un cilindro. Se prefiere además que el MEHM tenga la forma de un parche, una bolsa o un cilindro. En una realización aún más preferida, el parche tiene forma de disco.

Si el molde se forma para facilitar la formación de un MEHM de forma plana, el molde puede tener la forma de un disco, preferiblemente la forma de un disco circular o poligonal, más preferiblemente la forma de un disco hexagonal. En la figura 2 y la figura 7 también se muestran discos hexagonales ejemplares como se divulga en la presente memoria, y se utilizan para la formación de un MEHM como se describe en el ejemplo 2.

Si el molde se forma para facilitar la formación de un MEHM en forma de bolsa, el molde puede tener la forma de una bolsa, preferiblemente la forma de una bolsa en forma de esfera o elipsoide. En una realización especialmente preferida, dicho molde está formado por una esfera interior y una pared exterior en forma de elipsoide, y más preferiblemente la esfera interior o pared en forma de elipsoide es inflable. En la figura 8A, como se divulga en la presente memoria, se pueden ver ejemplos de un molde en forma de bolsa. Además, los documentos WO2008/058917 A1 y EP2842581 A1 divulgan métodos para generar un tejido del corazón genomanipulado en forma de bolsa como se representa en la figura 1 de los mismos. Asi, el experto en la materia conoce en general la generación de tejido del corazón genomanipulado en forma de bolsa.

Sin embargo, el experto en la materia no conoce un EHM en forma de bolsa multicapa, en el que las mezclas de reconstitución (que forman MEHM) están perforadas por, por lo menos, dos varillas. Como se ha mencionado anteriormente, los moldes se pueden imprimir en 3D para ajustar, p. ej., el radio de la bolsa. Después de completar la generación del MEHM en forma de bolsa, la bolsa se separa del molde y se puede cortar en rodajas, si se desea.

Si el molde se forma para facilitar la formación de un MEHM en forma de cilindro, el molde puede tener la forma de un cilindro, preferiblemente el molde es un molde cilindrico. En una realización especialmente preferida, el molde cilindrico está formado por una pared cilindrica interior y exterior. En otra realización, el molde cilindrico está formado por una pared cilindrica única. La pared cilindrica única se puede cubrir con la mezcla de reconstitución mediante centrifugación. En la figura 8B se muestra un molde cilindrico ejemplar como se divulga en la presente memoria. Como se ha mencionado anteriormente, los moldes se pueden imprimir en 3D para ajustar, p. ej., la longitud o el diámetro del cilindro. Una ventaja clave de un MEHM de forma cilindrica es que se puede generar un MEHM grande utilizando un espacio relativamente pequeño. Asi, se pueden generar varios MEHM en paralelo. Un MEHM cilindrico se puede cortar en rodajas a lo largo del eje largo antes de su uso potencial, p. ej., en un paciente.

Como se muestra en las figuras 2, 7 y 8 ejemplares, la mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas. En una realización, las varillas son flexibles y por tanto capaces de introducir carga mecánica en el MEHM. En general, las varillas son clave para la fabricación de un MEHM, ya que sirven por lo menos para dos propósitos: En primer lugar, las varillas que atraviesan el MEHM producen canales que permiten un suministro suficiente de oxigeno y nutrientes a las células dentro de la mezcla de reconstitución/MEHM. En segundo lugar, las varillas proporcionan un estimulo fisico para el músculo en desarrollo. El experto en la materia sabe que los estimulos quimicos y fisicos son fundamentales para el desarrollo de un músculo genomanipulado. En otras palabras, las varillas apoyan el desarrollo de la fuerza del MEHM, ya que el entrenamiento del músculo es fundamental para su desarrollo. En una realización, los canales creados por las varillas de perforación pueden permitir la perfusión del MEHM con el medio de cultivo en la etapa (ii), (iii), y opcionalmente con el medio de maduración en la etapa (iv), y con oxigeno en las etapas (ii), (iii) y opcionalmente (iv). En una realización especialmente preferida, la perfusión del medio de cultivo y/o del medio de maduración da lugar a un suministro nutritivo adecuado de los miocitos cardiacos y los no miocitos durante las etapas (ii), (iii) y/u opcionalmente (iv).

En una realización preferida, la mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas, en el que las varillas de perforación introducen canales en la mezcla de reconstitución/MEHM y aumentan así el área superficial de la mezcla de reconstitución/MEHM. En una realización aún más preferida, la mezcla de reconstitución/MEHM está perforada por, por lo menos, dos varillas, en el que el aumento en el área superficial del MEHM controla la distancia de difusión de oxígeno y nutrientes en el MEHM. Dicho aumento en el área superficial proporciona en promedio una distancia reducida de las células a la superficie de la mezcla de reconstitución/MEHM de modo que las células reciben suficiente suministro de oxígeno y/o nutrientes, como puede determinarse mediante, p. ej., un sensor de hipoxia (por ejemplo, Hesse et al. 2014) o muerte celular (p. ej., utilizando colorantes de ensayo de viabilidad bien conocidos) como se describe con más detalle a continuación. La distancia entre varillas es de 0,1 a 5 mm, preferiblemente de 2 mm a 5 mm, incluso más preferiblemente de 2,5 mm a 5 mm, incluso más preferiblemente de 3 mm a 5 mm, incluso más preferiblemente de 3,1 mm a 5 mm, incluso más preferiblemente de 3,2 mm a 5 mm, incluso más preferiblemente de 3,3 mm a 4 mm, incluso más preferiblemente de 3,4 mm a 3,7 mm y lo más preferiblemente alrededor de 3,5 mm, como se define adicionalmente en las reivindicaciones. La figura 8 muestra una realización muy preferida. La distancia óptima entre varillas es de particular importancia para un MEHM, que son más gruesas que la distancia entre varillas, ya que las células pueden tener una distancia más corta hasta la varilla de perforación siguiente que hasta la superficie superior o inferior.

En una realización, la mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas por debajo y/o por encima. En concreto, la mezcla de reconstitución puede estar perforada en todo su grosor. Esto significa que las varillas se extienden a través de la mezcla de reconstitución. En una realización especialmente preferida, por lo menos dos varillas perforan la mezcla de reconstitución por debajo y el molde tiene forma de disco. Además, por lo menos dos varillas se extienden por debajo del molde a través de la mezcla de reconstitución. Es incluso más preferido que las varillas estén unidas permanentemente al molde o a una placa base. Por ejemplo, las varillas pueden estar firmemente unidas al área de colada del molde o a una placa base extraíble. Dicha placa base también podrá transferirse a un molde diferente. La ventaja de una placa base es que la placa base se puede extraer y, por lo tanto, transferir a un molde diferente, si se desea (véase, por ej., la figura 8). Por ejemplo, las varillas pueden ser una parte integral del molde como elementos unidos permanentemente o extraíbles, más preferiblemente en el que el molde y el elemento de por lo menos dos varillas están impresas en 3D, y aún más preferiblemente en el que el molde con las por lo menos dos varillas se imprime en 3D como una sola entidad. Es aún más preferido que el molde que comprende por lo menos dos varillas se imprima en 3D como una sola entidad. La impresión 3D tiene la ventaja de que el molde, tal como el disco, se puede fabricar a medida y/o adaptar. Una placa base tiene la ventaja de que un MEHM es extraíble y puede transferirse fácilmente desde el molde al lugar de uso, p. ej., el quirófano en un contenedor de transporte adecuado.

En otra realización, las por lo menos dos varillas perforan la mezcla de reconstitución por encima y en el que el molde tiene la forma de un disco. En una realización especialmente preferida, las por lo menos dos varillas se introducen por encima en la mezcla de reconstitución líquida. Las por lo menos dos varillas pueden introducirse, por ejemplo, por encima como un peine en forma de rejilla.

En otra realización, por lo menos dos varillas perforan la mezcla de reconstitución por debajo y en el que el molde está diseñado para permitir la formación de una bolsa. En una realización especialmente preferida, la bolsa está formada por una esfera interior y exterior o una pared en forma de elipsoide. Es aún más preferido que las por lo menos dos varillas se extiendan desde la pared interior en forma de esfera o elipsoide y de ese modo perforen la mezcla de reconstitución. En una realización aún más preferida, las por lo menos dos varillas están unidas permanentemente a la pared interior en forma de esfera o elipsoide.

En otra realización, por lo menos dos varillas perforan la mezcla de reconstitución por encima y el molde está diseñado para permitir la formación de una bolsa. En una realización especialmente preferida, la bolsa está formada por una esfera interior y una pared exterior en forma de elipsoide. En una realización aún más preferida, las por lo menos dos varillas se extienden desde la pared exterior en forma de esfera o elipsoide y perforan de este modo la mezcla de reconstitución. Se prefiere aún más que las por lo menos dos varillas estén unidas permanentemente a la pared exterior en forma de esfera o elipsoide.

En otra realización, las por lo menos dos varillas perforan la mezcla de reconstitución por debajo y el molde es un molde cilíndrico. En una realización preferida, el molde cilíndrico está formado por una pared cilíndrica interior y exterior. Se prefiere aún más que por lo menos dos varillas se extiendan desde la pared cilíndrica exterior a través de la mezcla de reconstitución y de ese modo perforen la mezcla de reconstitución. En una realización aún más preferida, las varillas están unidas permanentemente a la pared cilíndrica exterior. En particular, la pared cilíndrica exterior que comprende por lo menos dos varillas puede imprimirse en 3D como una sola entidad. La impresión 3D tiene la ventaja de que se puede crear cualquier forma, tal como por ejemplo un cilindro con por lo menos 2 varillas, y el tamaño se puede ajustar individualmente.

En otra realización, las por lo menos dos varillas perforan la mezcla de reconstitución por encima y el molde es un molde cilíndrico. En una realización preferida, el molde cilíndrico está formado por una pared cilíndrica interior y exterior. En una realización más preferida, por lo menos dos varillas se extienden desde la pared cilíndrica interior a través de la mezcla de reconstitución. En una realización aún más preferida, las varillas están unidas permanentemente a la pared cilíndrica interior. En particular, la pared cilíndrica interior que comprende por lo menos dos varillas puede imprimirse en 3D como una sola entidad. La impresión 3D tiene la ventaja de que se puede crear cualquier forma, tal como por ejemplo un cilindro con por lo menos dos varillas, y el tamaño se puede ajustar individualmente. El molde y/o las varillas pueden producirse mediante cualquier método de genomanipulación adecuado, incluida la impresión 3D, el moldeo por colada, el fresado o el soplado de vidrio. Específicamente, el molde puede fabricarse mediante moldeo por inyección o fresado, p. ej., en un bloque de PTFE. En una realización muy preferida, el molde y/o las varillas se imprimen en 3D.

La mezcla de reconstitución se vacía en el molde y llena total o parcialmente el molde, es decir, el área de colada. El experto en la materia podrá determinar el volumen óptimo dependiendo del tamaño del molde. Típicamente, una mezcla de reconstitución líquida tiene un grosor de 1 mm a alrededor de 10 mm. Dependiendo del área de colada y del grosor deseado, el experto en la materia puede determinar el volumen óptimo mediante una multiplicación sencilla. En una realización preferida, cada mezcla de reconstitución líquida tiene un volumen de 0,5-200 ml, preferiblemente 1-150 ml, más preferiblemente 1,5-100 ml, más preferiblemente 2-50 ml, más preferiblemente 2,5-40 ml, más preferiblemente 3-30 ml. ml, más preferiblemente 3,5-25 ml, más preferiblemente 4-20 ml, más preferiblemente 4,5 15 ml, más preferiblemente 5-11,5 ml, más preferiblemente 6-9,5 ml, incluso más preferiblemente 6,5-8,5 y lo más preferiblemente alrededor de 8 ml. En la figura 2 se muestra un EHM ejemplar, en el que se ha utilizado un volumen de 8 ml, como se divulga en la presente memoria.

El molde puede contener un volumen de 1 a 400 ml. El volumen que puede contener el molde se puede determinar multiplicando el área de colada por la posible altura del MEHM. Por ejemplo, si el molde permite la formación de un disco, el volumen del molde se puede calcular con el área de colada multiplicada por la altura del molde. En la figura 7A se muestra un molde de colada ejemplar para generar un disco hexagonal. Si el molde tiene forma de bolsa, el volumen del molde es la diferencia entre el volumen de la esfera o elipsoide de la pared exterior e interior. De forma parecida, si el molde en forma de cilindro tiene una pared exterior y una interior, el volumen del molde puede determinarse por la diferencia de volumen entre la pared exterior y la interior del cilindro. En caso de que el molde en forma de cilindro solo comprenda una pared exterior, el molde en forma de cilindro podría contener teóricamente todo el volumen del cilindro. En una realización preferida, el molde contiene un volumen de 2 a 300 ml, más preferiblemente de 3 a 200 ml, más preferiblemente de 4 a 100 ml, más preferiblemente de 5 a 80 ml, más preferiblemente de 6 a 60 ml, más preferiblemente de 6,5 a 50 ml, más preferiblemente de 7 a 40 ml, más preferiblemente de 7,5 a 30 ml, más preferiblemente de 8 a 23 ml, más preferiblemente de 13 a 19 ml, incluso más preferiblemente de 13 a 17 ml, e incluso más preferiblemente alrededor de 15 ml. Como se describe anteriormente, el molde puede tener forma de parche, de bolsa o de cilindro.

Como se describe anteriormente, el molde tiene un área de colada. La mezcla líquida de reconstitución se vacía en el área de colada. En otras palabras, el tamaño del molde describe el tamaño del área de colada. Además, el experto en la materia es capaz de determinar el área de colada ideal del molde dependiendo de las necesidades del experto en la materia. Por ejemplo, si se desea utilizar el MEHM como implante, el molde puede hacerse a medida, p. ej., con una impresora 3D. En una realización preferida, el molde tiene un tamaño de 1-400 cm2, preferiblemente de 2 a 300 cm2, más preferiblemente de 3 a 200 cm2, más preferiblemente de 4 a 100 cm2, más preferiblemente de 5 a 80 cm2, más preferiblemente de 6 a 60 cm2, más preferiblemente de 7 a 50 cm2, más preferiblemente de 8 a 40 cm2, más preferiblemente de 9 a 30 cm2, más preferiblemente de 10 a 23 cm2, más preferiblemente de 12 a 19 cm2 incluso más preferiblemente de 13 a 17 cm2, incluso más preferiblemente alrededor de 16 cm2. En una realización muy preferida, el molde se utiliza para la formación de un MEHM en forma de parche.

Como se ha mencionado anteriormente, la mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas. En una realización preferida, la mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, tres varillas. En una realización aún más preferida, las varillas están dispuestas como una rejilla, más preferiblemente en la que las varillas están dispuestas como una rejilla triangular o rectangular, incluso más preferiblemente como una rejilla triangular. Una disposición de rejilla triangular ejemplar se muestra, p. ej., en la figura 7 como se divulga en la presente memoria. Sin embargo, el experto en la materia podrá identificar otras disposiciones de rejilla adecuadas.

El número adecuado, así como el diámetro de las varillas que perforan la mezcla de reconstitución, dependen del tamaño del molde. Las varillas que perforan la mezcla de reconstitución tienen dos propósitos: En primer lugar, las varillas aseguran la formación de canales para un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes a las células dentro de la mezcla de reconstitución. En segundo lugar, las varillas resisten el entrenamiento del músculo en desarrollo, es decir, las varillas resisten el desarrollo de la fuerza del músculo. El experto en la materia podrá determinar el número óptimo de varillas dependiendo del tamaño del molde. Con una experimentación sencilla, el experto en la materia puede determinar si las células no reciben suficiente oxígeno y/o nutrientes. Por ejemplo, Hesse et al. (2014) describen que se puede utilizar un sensor de hipoxia en tejidos genomanipulados, tal como el músculo del corazón genomanipulado, para determinar si las células están sufren hipoxia. Además, las células pueden morir si no se les suministra suficiente oxígeno y/o nutrientes, lo que también puede determinarse mediante experimentación estándar con métodos de tinción. Además, el experto en la materia es capaz de determinar el número y diámetro óptimos de las varillas mediante la contractilidad del MEHM. Como se describe anteriormente, la contracción se puede medir mediante FAC o FOC como se describe, p. ej., en Tiburcy et al. (2017) o Zimmermann et al. (2000). En una realización preferida, la mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, 5 varillas, más preferiblemente por lo menos 7 varillas, más preferiblemente por lo menos 14 varillas, aún más preferiblemente por lo menos 20 varillas, aún más preferiblemente por lo menos 30 varillas, aún más preferiblemente por lo menos 37 varillas, y lo más preferiblemente por lo menos 52 varillas. Los moldes de colada ejemplares representados en las figuras 7A y 7C en la presente memoria muestran 52 y 14 varillas respectivamente. Según el conocimiento de los autores de la invención, no existen límites superiores fijos para el número de varillas. Por ejemplo, la mezcla de reconstitución podría perforarse por como máximo 2.000, preferiblemente como máximo 1.500, incluso más preferiblemente como máximo 1.000. A la luz de la presente divulgación, el experto en la materia puede combinar libremente los límites del número de varillas. En otra realización especialmente preferida, las varillas tienen un diámetro de 0,5 a 3 mm, preferiblemente de 0,6 a 2,5 mm, más preferiblemente de 0,65 a 2 mm, incluso más preferiblemente de 0,7 a 1,7 mm, e incluso más preferiblemente de alrededor de 0,8 a 1,5 mm. Como se muestra con más detalle en la figura 7C, también se han probado experimentalmente diámetros variables de 0,8 a 1,1 mm. En una realización especialmente preferida, la mezcla de reconstitución puede estar perforada por, por lo menos, siete varillas, estando dispuestas las varillas en una rejilla y en el que los diámetros de las varillas forman un gradiente a lo largo de un eje plano. En la figura 7C se representa un ejemplo de un gradiente del diámetro, como se divulga en la presente memoria. Además, un gradiente de diámetro puede provocar el efecto técnico de que el FAC medido a lo largo del gradiente es mayor que el FAC medido a lo largo de varillas con el mismo grosor de varilla. Este hallazgo también está respaldado por datos experimentales, como se muestra en la figura 7C.

Por ejemplo, el molde de colada como se representa en la figura 7A comprende 52 varillas y cada mezcla de reconstitución líquida tiene un volumen de 8 ml. El experto en la materia también puede extrapolar el volumen de la mezcla de reconstitución y el número de varillas a partir de este ejemplo.

En una realización preferida, cada varilla tiene un área de base y la base puede ser circular, rectangular, elíptica, triangular o poligonal, preferiblemente en la que el área de base es circular. El área de base circular de las varillas también se representa, p. ej., en las figuras 7 y 8 de la presente memoria.

Ventajosamente, las varillas crean fuerzas restauradoras para simular la tensión de la pared de un corazón normal y/o un infarto de corazón durante un ciclo de contracción. La fuerza restauradora es una fuerza que actúa para llevar un cuerpo a su posición de equilibrio. Como se describe anteriormente, las varillas típicamente son flexibles para introducir carga mecánica en el MEHM. Así, lo ideal es que las varillas tengan propiedades elásticas (flexibilidad). En general, las propiedades elásticas de las varillas se cuantifican mediante el módulo de elasticidad, o módulo de Young, que define la cantidad de tensión necesaria para lograr una unidad de deformación. Por ejemplo, un módulo más alto indica que el material es más difícil de deformar. En general, la unidad SI de este módulo es el pascal (Pa). Por ejemplo, Rump et al. (2007) y Pislaru et al. (2014) describen las propiedades viscoelásticas del miocardio normal y el infarto de miocardio. El tejido genomanipulado ideal imita las propiedades contráctiles (alrededor de 0,3 a 60 mN/mm2; Wiegerinck et al. 2009, Muleri et al. 1992) y viscoelásticas (5 a 27 kPa; Rump et al. 2007) del miocardio normal y/o el infarto de miocardio.

En una realización especialmente preferida, la fuerza de restauración de las varillas coincide idealmente con la tensión de la pared del miocardio normal y/o enfermo (10 a 200 kdinas/cm2 o 1 a 20 kPa; Fujita et al. 1993). Las propiedades elásticas pueden estar definidas por la constante del resorte de trabajo. En el presente caso, la constante del resorte de trabajo se puede evaluar en el punto en el que el MEHM está en contacto con las varillas. En general, la constante del resorte se define como la cantidad de fuerza que se necesita para deformar un resorte en una unidad de distancia. Las unidades de medida de la constante del resorte típicamente son N/mm (newtons por milímetro) o mN/mm (millinewtons por milímetro). En una realización muy preferida, las propiedades elásticas de las varillas, según se definen en el módulo de elasticidad, crean fuerzas de recuperación de 0,5 a 50 mN/mm, preferiblemente de 0,7 a 40 mN/mm, más preferiblemente de 0,9 a 30 mN/mm, incluso más preferiblemente de 1 a 20 mN/mm, incluso más preferiblemente de 2 a 10 mN/mm, incluso más preferiblemente de 3 a 5 mN/mm y lo más preferiblemente alrededor de 4 mN/mm. En una realización especialmente preferida, las fuerzas de restauración de las varillas coinciden con la tensión de la pared de un corazón humano normal y/o enfermo, incluso más preferiblemente en la que la tensión de la pared es de 1 a 20 kPa. Dicho intervalo también se divulga en Fujita et al. (1993).

Las propiedades elásticas de las varillas pueden presentar módulos elásticos variables para establecer una anisotropía biomecánica. En otras palabras, los módulos elásticos presentan variaciones entre las varillas. En otra realización, las propiedades elásticas de las varillas presentan módulos elásticos parecidos para establecer una isotropía biomecánica. En otras palabras, los módulos elásticos son uniformes en todas las varillas.

En otra realización, las varillas están rodeadas por una pared circunferencial en la parte inferior de las varillas, en el que la pared circunferencial forma una rampa en forma de anillo alrededor de las varillas, y en el que la rampa en forma de anillo se estrecha por debajo hacia arriba. En la figura 4B se representan dimensiones ejemplares de la pared circunferencial para EHM en forma de anillo. Además, el documento WO 2017/207431 A1 describe detalladamente dicha pared circunferencial. La ventaja de una pared circunferencial por debajo de las varillas es que una mezcla de reconstitución compactada se mueve hacia arriba a lo largo de la rampa debido a la compactación y/o al desarrollo de la fuerza muscular. Este deslizamiento hacia arriba debido a la compactación y/o al desarrollo de la fuerza muscular facilita la adición de una mezcla de reconstitución adicional por debajo, como se describe en la etapa (iii) del método.

En otra realización, las varillas se estrechan de forma cónica y las varillas tienen el diámetro mayor por debajo. Un estrechamiento por debajo hasta la parte superior de las varillas tiene una ventaja parecida a la de la pared circunferencial: El EHM puede desprenderse del molde y deslizarse hacia arriba para facilitar la adición de una mezcla de reconstitución adicional, en particular una adición por debajo.

El experto en la materia conoce las condiciones adecuadas para realizar experimentos de cultivo de tejidos. En una realización preferida, las etapas (i), (ii) y/u opcionalmente (iv) se llevan a cabo en un intervalo de temperatura de 36,4 37,6 °C, preferiblemente en un intervalo de temperatura de 36,6-37,4 °C, preferiblemente en un intervalo de temperatura de 36,8-37,2 °C, más preferiblemente a alrededor de 37 °C. Además, y en otra realización preferida, las etapas (i), (ii) y/u opcionalmente (iv) se llevan a cabo en una incubadora de cultivo celular humidificada en presencia del 2-10 % de CO<2>, preferiblemente el 2,5-8 % de CO<2>, más preferiblemente el 3-7 % CO<2>, incluso más preferiblemente el 3,5-6,5 % CO<2>, incluso más preferiblemente el 4-6 % CO<2>y lo más preferiblemente alrededor del 5 % CO<2>. En general, el cultivo puede realizarse en oxígeno ambiental o en portadores de oxígeno, p. ej., pueden estar presentes portadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOC) y portadores de oxígeno basados en perfluorocarbonos (PFOC) (Iyer et al. 2007). En otra realización preferida, las etapas (i), (ii) y/u opcionalmente (iv) se llevan a cabo en una incubadora de cultivo celular humidificada en presencia del 5-40 % de O<2>, preferiblemente el 10-30 % del O<2>, más preferiblemente el 15-35 % de O<2>, incluso más preferiblemente el 17-33 % de O<2>, incluso más preferiblemente el 19 25 % de O<2>y lo más preferiblemente alrededor del 21 % de O<2>. Además, el experto en la materia sabe, por el conocimiento general común, que dichos intervalos de temperatura e intervalos de CO<2>son condiciones de cultivo de tejidos estándar en la técnica. Además, el 21 % de O<2>se corresponde con la concentración habitual de oxígeno en el aire seco.

En la etapa (i), la mezcla líquida de reconstitución experimenta gelificación. Cuando la mezcla de reconstitución ha experimentado gelificación, la mezcla de reconstitución ya no es líquida, es decir, no líquida. En una realización preferida, la gelificación se caracteriza por que la mezcla de reconstitución obtenida en la etapa (i) es similar a un gel. Se produce la gelificación de la mezcla de reconstitución debido al colágeno en la mezcla de reconstitución. Por ejemplo, si en la mezcla de reconstitución se utiliza colágeno solubilizado en ácido de tipo I de corium (piel) bovino altamente purificado, el valor del pH de la mezcla de reconstitución se ajusta a un pH fisiológico, p. ej., entre 7,0 y 8,0. Tras este cambio del valor del pH, el colágeno forma un gel. De hecho, las condiciones ideales para la formación de gel (andamio 3D) de colágeno son un pH de alrededor de 7. Bioquímicamente, las moléculas de colágeno nativas reticulan residuos de hidroxilisina y lisina de forma covalente. Así, las moléculas de colágeno nativo pueden autoensamblarse en fibrillas de colágeno y formar hidrogeles mediante reticulación a 37 °C y pH casi neutroin vitro.Dicho proceso de gelificación de autoensamblaje puede iniciarse mediante el cambio de pH y se produce de manera óptima a 37 °C. Las propiedades físicoquimicas de los hidrogeles de colágeno están influenciadas por la concentración de colágeno, el pH de polimerización y la fuerza iónica durante la reticulación. El experto en la materia conoce este proceso y dicho proceso se ha realizado para diversas aplicaciones de genomanipulación de tejidos con el fin de formar un andamio 3D (p. ej., Tiburcy et al. 2017). En una realización especialmente preferida, la mezcla de reconstitución tiene un pH de 7,0 a 7,8, preferiblemente un pH de 7,2 a 7,6, más preferiblemente de 7,3 a 7,5, y lo más preferiblemente en el que la mezcla de reconstitución tiene un pH de alrededor de 7,4.

En otra realización preferida, la gelificación en la etapa (i) se caracteriza por que el medio de cultivo rodea la mezcla de reconstitución y no disuelve la mezcla de reconstitución, si se añade al molde. El experto en la materia puede, por ejemplo, evaluar la gelificación de la mezcla de reconstitución probando si el medio de cultivo disuelve la mezcla de reconstitución después de diversos puntos de tiempo. Esta prueba también podría realizarse en tubos experimentales en paralelo a la fabricación de un MEHM. Además, la gelificación en la etapa (i) se puede caracterizar por que la mezcla de reconstitución es opaca, preferiblemente según se determina con inspección visual como se muestra en la figura 3B de Tiburcy M, et al. (2014).

En una realización muy preferida, la etapa (i) se lleva a cabo durante por lo menos 15 minutos, preferiblemente durante como máximo 24 horas, más preferiblemente de 20 minutos a 15 horas, más preferiblemente de 30 minutos a 8 horas, incluso más preferiblemente de 45 minutos a 1,5 horas, y más preferiblemente durante alrededor de 1 hora.

En otra realización, el medio de cultivo en la etapa (ii), comprende (a) un medio basal, (b) un suplemento sin suero, (c) L-glutamina, (d) ácido ascórbico, (e) IGF-1, (f) VEGF y (g) TGFp1. Sin embargo, el experto en la materia es capaz de identificar medios de cultivo adecuados. Por ejemplo, Tiburcy et al. (2017), (2020) y Schlick et al. (2019) proporcionan medios de cultivo ejemplares adecuados para cultivar EHM. Cada uno de los factores, tales como IGF-1, VEGF y/o TGFp1, puede sustituirse por un factor con un efecto igual o parecido. Por ejemplo, el TGFp1 puede sustituirse por cualquier otro factor que estimule los no miocitos, en particular las células estromales, para iniciar la compactación de la mezcla de reconstitución.

En una realización preferida, el medio basal del medio de cultivo se selecciona entre medio de Iscove, aMEM, DMEM y RPMI, preferiblemente el medio basal es medio de Iscove o aMEM, más preferiblemente en el que el medio basal es medio de Iscove. Sin embargo, se puede utilizar cualquier medio basal adecuado para el método. Los medios basales están disponibles comercialmente o pueden producirse según recetas disponibles públicamente, p. ej., de los catálogos de la ATCC. Si se considera apropiado, el medio basal podrá complementarse con aminoácidos. En otra realización preferida, el medio de cultivo puede comprender un suplemento sin suero. El suplemento sin suero puede proporcionar una concentración final en el medio de cultivo como se define anteriormente. En otra realización preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) puede comprender L-glutamina de 0,4 a 10 mM, preferiblemente L-glutamina de 0,8 a 6 mM, más preferiblemente L-glutamina de 1,2 a 5 mM, más preferiblemente L-glutamina de 1,5 a 4 mM, más preferiblemente L-glutamina de 1,7 a 3 mM y lo más preferiblemente alrededor de 2 mM de L-glutamina. En una realización muy preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) puede comprender 30-3.000 pM de ácido ascórbico o un derivado del mismo, preferiblemente 100-1.000 pM de ácido ascórbico o un derivado del mismo, más preferiblemente 180-500 pM de ácido ascórbico o un derivado del mismo, más preferiblemente 220-370 pM de ácido ascórbico o un derivado del mismo, más preferiblemente 270-330 pM de ácido ascórbico o un derivado del mismo y lo más preferiblemente alrededor de 300 pM de ácido ascórbico o un derivado del mismo. Un ejemplo de un derivado del ácido ascórbico es el ascorbato-2-fosfato.

En otra realización preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) comprende 10-1000 ng/ml de IGF1, preferiblemente 50-500 ng/ml de IGF1, más preferiblemente 70-200 ng/ml de IGF1, incluso más preferiblemente 90-120 ng/ml de IGF1, y más preferiblemente alrededor de 100 ng/ml de IGF1. En particular, el IGF1 puede ser IGF1 humano.

En otra realización preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) comprende 2,5-10 ng/ml de VEGF, preferiblemente 3 9 ng/ml de VEGF, más preferiblemente 3,5-8 ng/ml de VEGF, más preferiblemente 4-7 ng/ml de VEGF, más preferiblemente 4,5-6 ng/ml de VEGF, lo más preferiblemente alrededor de 5 ng/ml de VEGF. En particular, el VEGF puede ser VEGF humano, preferiblemente en el que VEGF es VEGF<165>.

En otra realización preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) comprende 5-20 ng/ml de FGF-2, preferiblemente 6 18 ng/ml de FGF-2, más preferiblemente 7-16 ng/ml de FGF-2, más preferiblemente 8 -14 ng/ml, más preferiblemente 9-12 ng/ml de FGF-2, lo más preferiblemente alrededor de 10 ng/ml de FGF-2. En particular, el FGF-2 puede ser FGF-2 humano.

En otra realización preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) comprende 2-8 ng/ml de TGFp1, preferiblemente 3 7 ng/ml de TGFp1, más preferiblemente 4-6 ng/ml de TGFp1, incluso más preferiblemente 4,5-5,5 ng/ml de TGFp1, incluso más preferiblemente alrededor de 5 ng/ml de TGFp1, y lo más preferiblemente en el que el TGFp1 es TGFp1 humano.

En otra realización preferida, el medio de cultivo en la etapa (ii) comprende alrededor de 750 mg/L de glicina, alrededor de 890 mg/L de L-alanina, alrededor de 1320 mg/L de L-asparagina, alrededor de 1.330 mg/L de ácido L-aspártico, alrededor de 1.470 mg/L de ácido L-glutámico, alrededor de 1.150 mg/L de L-prolina y alrededor de 1.050 mg/L de L-serina.

Durante la etapa (ii) se compacta la mezcla de reconstitución. La etapa (ii) da como resultado una mezcla de reconstitución compactada. En una realización preferida, la mezcla de reconstitución en la etapa (ii) se compacta en por lo menos alrededor del 20 % del volumen de la mezcla de reconstitución original, preferiblemente en por lo menos alrededor del 25 %, más preferiblemente en por lo menos alrededor del 30 %, más preferiblemente en por lo menos alrededor del 40 %, más preferiblemente por lo menos alrededor del 50 %, incluso más preferiblemente por lo menos alrededor del 60 %, más preferiblemente por lo menos alrededor del 70 %, más preferiblemente por lo menos alrededor del 80 %, incluso más preferiblemente por lo menos alrededor del 90 %, según lo determinado preferiblemente mediante inspección visual y/o análisis videoóptico. El volumen de EHM se puede evaluar, por ejemplo, mediante métodos planimétricos, suponiendo que la compactación del volumen de EHM es simétrica en todas las dimensiones. Además, el grosor se puede determinar con precisión, por ejemplo, mediante ultrasonidos, interferometría láser o tomografía por coherencia óptica. Mediante una combinación de mediciones planimétricas de área y grosor se puede determinar el volumen EHM. En una realización preferida, la finalización de la etapa (ii) se determina al (a) generar un músculo del corazón genomanipulado (EHM) en formato bucle en paralelo al MEHM llevando a cabo las etapas (i) y (ii), y (b) determinar el desprendimiento del músculo del corazón genomanipulado (EHM) en formato bucle del molde, como se describe en la figura 3C de Tiburcy M, et al., Collagen-based engineered heart muscle, Methods Mal Biol. (2014) ;1181: 167-176. El desprendimiento del molde se puede evaluar fácilmente al generar un EHM en formato bucle en paralelo, ya que el desprendimiento es claramente visible. Por ejemplo, la figura 5C en la presente memoria también muestra un claro desprendimiento del EHM en formato bucle del molde. En una realización preferida adicional, la finalización de la etapa (ii) se puede determinar adicionalmente al generar un EHM en formato bucle en paralelo al MEHM siguiendo las etapas (i) y (ii), y en el que la mezcla de reconstitución en formato bucle se compacta mediante por lo menos el 20 % del área de la sección transversal de la mezcla de reconstitución original, preferiblemente por lo menos el 25 %, más preferiblemente por lo menos el 30 %, más preferiblemente por lo menos el 40 %, más preferiblemente por lo menos el 50 %, más preferiblemente por lo menos el 60 %, más preferiblemente por lo menos el 70 %, más preferiblemente por lo menos el 80 %, incluso más preferiblemente por lo menos el 90 %. Dicha compactación puede evaluarse mediante inspección visual y/o análisis videoóptico del EHM. La figura 5C de la presente memoria muestra una compactación óptima de un EHM en formato bucle a modo de ejemplo.

En una realización especialmente preferida, la etapa (ii) se lleva a cabo durante por lo menos 12 horas, preferiblemente durante como máximo 15 días, más preferiblemente de 12 horas a 7 días, preferiblemente de 14 horas a 6 días, más preferiblemente de 16 horas a 5,5 días, más preferiblemente de 18 horas a 5 días, más preferiblemente de 20 horas a 4,5 días, incluso más preferiblemente de 22 horas a 4 días, incluso más preferiblemente de 23 horas a 3,5 días, y lo más preferiblemente de 24 horas a 3 días.

En la etapa (iii), se añade otra mezcla de reconstitución por encima y/o por debajo de la mezcla de reconstitución de la etapa (ii). En una realización preferida, en la etapa (iii)a) se añade una mezcla de reconstitución adicional encima de la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii). En otra realización preferida, en la etapa (iii)a) se añade una mezcla de reconstitución adicional por debajo de la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii). En otra realización preferida, en la etapa (iii)a) se añade una mezcla de reconstitución adicional a la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) por encima y por debajo simultáneamente. En una realización aún más preferida, en la etapa (iii)a) la mezcla de reconstitución adicional recubre la mezcla de reconstitución compactada de la etapa ii) por encima y/o por debajo. Por ejemplo, el área superficial de la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) y la mezcla de reconstitución adicional de la etapa (iii)a) es la misma. A título ilustrativo, el EHM de cinco capas como se muestra en la figura 3 se ha generado recubriendo la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) y en el que el área superficial de la mezcla de reconstitución adicional de la etapa (iii)a) y la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) es el mismo. En otro ejemplo, en la etapa (iii)a) la mezcla de reconstitución adicional recubre un área restringida de la mezcla de reconstitución compactada de la etapa ii) por encima o por debajo. El área superficial de la mezcla de reconstitución adicional de la etapa (iii)a) puede ser menor que el área superficial de la mezcla de reconstitución de la etapa (ii). A título ilustrativo, la figura 8C2 representa entradas que se pueden colocar sobre la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) para proporcionar una mezcla de reconstitución líquida de menor tamaño encima de la reconstitución compactada de la etapa (ii). Por ejemplo, un área superficial más pequeña de la mezcla de reconstitución de la etapa (iii)a) puede ajustarse a un defecto específico del paciente u otra forma deseada. Esto tiene la ventaja de que un MEHM para su uso en reparación cardíaca puede aplicarse más en un área restringida concreta en comparación con el resto del MEHM.

En otra realización, el área superficial de la mezcla de reconstitución adicional es mayor que el área superficial de la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii). Por ejemplo, en la etapa (iii)b) el molde diferente tiene un área de colada mayor que el molde de la etapa (i), preferiblemente en el que la mezcla de reconstitución adicional recubre por lo menos la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) por encima o por debajo. Es incluso más preferido que la mezcla de reconstitución adicional recubra la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii) por encima o por debajo y llene el área de colada más grande del molde diferente. A título ilustrativo, la figura 8C1 representa mezclas de reconstitución compactadas de menor tamaño que se han transferido a un molde con una superficie mayor. Por ejemplo, un área de superficie mayor del molde diferente en la etapa (iii)b) puede ajustarse a un defecto específico del paciente. Esto tiene la ventaja de que un MEHM para su uso en reparación cardíaca puede adaptarse a la necesidad específica.

Al añadir la mezcla de reconstitución adicional en la etapa (iii), se genera una capa adicional del EHM. Así, la adición de la mezcla de reconstitución adicional engruesa el EHM capa por capa. El grosor deseado lo puede determinar el experto en la materia. Por ejemplo, el MEHM se puede utilizar como implante para un corazón humano. Preferiblemente, se obtienen imágenes del defecto humano mediante técnicas de formación de imágenes de última generación, tales como ecocardiografía, resonancia magnética nuclear o tomografía computarizada, y se pueden determinar el grosor y las dimensiones deseados. En una realización preferida, la etapa (iii)a) o (iii)b) se repite por lo menos 2 veces, preferiblemente por lo menos 3 veces, más preferiblemente por lo menos 4 veces, más preferiblemente por lo menos 5 veces, más preferiblemente por lo menos 6 veces, más preferiblemente por lo menos 7 veces, más preferiblemente por lo menos 8 veces, incluso más preferiblemente por lo menos 9 veces y lo más preferiblemente por lo menos 10 veces. En una realización aún más preferida, la etapa (iii)a) o (iii)b) se repite 2-200 veces, preferiblemente 2-100 veces, más preferiblemente 2-80 veces, más preferiblemente 2-70 veces, más preferiblemente 2-60 veces, más preferiblemente 2-50 veces, más preferiblemente 2-40 veces, más preferiblemente 3-30 veces, más preferiblemente 3-25 veces, más preferiblemente 4-20 veces, más preferiblemente 4-15 veces, más preferiblemente 4-10 veces, incluso más preferiblemente 5-9 veces y lo más preferiblemente 5-8 veces. Sin embargo, el experto en la materia es capaz de determinar cuántas veces se debe repetir la etapa (iii) y si se debe realizar la etapa (iii)a) o (iii)b). El experto en la materia se guiará por las dimensiones y geometrías deseadas y evaluará con ello si las capas deben tener la misma superficie o si las capas individuales deben ser más pequeñas o más grandes. Por ejemplo, el experto en la materia puede desear un implante de corazón. Así, la superficie de las capas individuales se adaptará al tamaño del defecto miocárdico. Además, el grosor del MEHM coincide idealmente con el grosor del tejido sano. Por ejemplo, una mezcla de reconstitución compactada puede tener un grosor de, p. ej., ~500 pm. Para lograr el grosor deseado de la pared del corazón de hasta 10 mm (Kawel et al. (2012)), se pueden colocar en capas 20 mezclas de reconstitución compactadas. En otro ejemplo, una mezcla de reconstitución compactada puede tener un grosor inferior a 500 pm. A continuación, es posible que sea necesario estratificar 50 mezclas de reconstitución para obtener un grosor típico de la pared del corazón. El experto en la materia es capaz de determinar cuántas mezclas de reconstitución se requieren para obtener un MEHM con el grosor de un corazón humano típico y/o el defecto miocárdico de un paciente.

Después de completar la etapa (iii), el EHM puede madurarse aún más en un medio de maduración. El experto en la materia puede encontrar composiciones ejemplares de medio de maduración, por ejemplo, en Tiburcy et al. (2017) o Tiburcy et al. (2020). En una realización particularmente preferida, el medio de maduración en la etapa (iv) se define como el medio de cultivo anterior, excepto que el TGFp1 se omite del medio de maduración en comparación con el medio de cultivo. En una realización aún más preferida, la etapa (iv) se lleva a cabo durante 4-200 días, preferiblemente 6-150 días, más preferiblemente 8-120 días, más preferiblemente 9-110 días, más preferiblemente 10-90 días, más preferiblemente 15 -70 días, más preferiblemente 20-50 días, y lo más preferiblemente 28-42 días.

En una realización preferida, el MEHM de la etapa (iii) se cultiva en un medio de maduración adecuado en la etapa (iv), mediante lo cual el MEHM de la etapa (iv) presenta una maduración mejorada según se determina con un aumento abundante de proteína sarcomérica de los cardiomiocitos, tal como actinina alfa sarcomérica, proteínas de cadena pesada de miosina, proteínas de cadena ligera de miosina y troponinas determinadas, por ejemplo, mediante microscopía de fluorescencia después del marcaje con anticuerpos de una o varias de las proteínas indicadas, inmunoelectrotransferencia, citometría de flujo o secuenciación de ARN para determinar la abundancia de las transcripciones respectivas de codificación de proteínas como se describe en Tiburcy et al. Circulation 135(19)1832-1847 (2017). Además, el MEHM de la etapa (iv) puede presentar un mayor desarrollo de fuerza en comparación con el MEHM de la etapa (iii), en el que el mayor desarrollo de fuerza se determina mediante una medición del cambio de área fraccionaria (FAC) usando el método descrito en Tiburcy et al. Circulation 135(19)1832-1847 (2017), y en el que el cambio de área fraccionaria (FAC) del MEHM de la etapa (iv) es por lo menos el 0,5 % tras estimulación eléctrica, preferiblemente por lo menos el 1 %, más preferiblemente por lo menos el 1,2 %, más preferiblemente por lo menos el 1 %, más preferiblemente por lo menos el 2 %, más preferiblemente por lo menos el 3 % e incluso más preferiblemente por lo menos el 5 %.

Una ventaja particular del método como se divulga en la presente memoria es que las células dentro de la mezcla de reconstitución/MEHM reciben suficiente suministro de nutrientes y oxígeno en todo momento. Idealmente, el suministro suficiente de nutrientes se logra al asegurar una distancia de difusión del tejido superficial mínimamente aceptable con la creación de canales por medio de las varillas de perforación en todo momento durante el proceso de fabricación al mismo tiempo que se produce un MEHM engrosado, que puede utilizarse, por ejemplo, como implante. Por ejemplo, la distancia entre varillas puede ser de 3,5 mm de modo que la distancia de difusión sea de 1,75 mm, es decir, la distancia desde la varilla (superficie del tejido) hasta el núcleo del tejido (centro entre dos varillas; figura 8 y descrita anteriormente). En otras palabras, la distancia de difusión desde la superficie del tejido (varilla o superficie superior/inferior) hasta el núcleo del tejido se mantiene óptima. Dicha distancia de difusión se puede ajustar con el número de varillas de perforación y el diseño de la varilla. La distancia óptima de difusión entre la superficie y el tejido se puede determinar con mediciones de hipoxia tisular (p. ej., utilizando el indicador de hipoxia ODD-Luc descrito en Hesse A. R., et al. (2014)) o ensayos de supervivencia celular (p. ej., utilizando tintes de viabilidad bien conocidos). Los tintes de viabilidad, también conocidos como tintes de células vivas/muertas, son conocidos en la técnica y pueden adquirirse comercialmente de diversos proveedores. Por ejemplo, una esterasa intracelular puede hidrolizar un tinte para producir un compuesto hidrófilo fuertemente fluorescente en células vivas de modo que pueda medirse una señal fluorescente, p. ej., Ex/Em = 485/530 nm en células vivas. Los tintes de células muertas entran en las membranas celulares dañadas y pueden experimentar un aumento de fluorescencia de 40 veces al unirse al ácido nucleico, lo que produce una fluorescencia de color rojo brillante (Ex/Em = 495/635 nm) en las células muertas. En las formulaciones de MEHM, la distancia superficie-tejido se define por la distancia entre varillas de las varillas de perforación. En la figura 8 se representa un ejemplo de una distancia entre varillas adecuada de 3,5 mm que da como resultado una distancia máxima de difusión entre la superficie y el núcleo de 1,75 mm. A modo de ejemplo, con la elección de una distancia entre varillas de 3,5 mm, habrá una distancia máxima de difusión entre la superficie y el núcleo del tejido de 1,75 mm, independientemente del grosor del MEHM. La persona experta en la materia puede, con la información proporcionada en la presente memoria, determinar y adaptar la distancia entre varillas óptima en el MEHM según sea necesario para asegurar el suministro de oxígeno y nutrientes en todo el MEHM de las dimensiones y grosor deseados. Por ejemplo, una mezcla de reconstitución líquida de 8 ml se compacta a alrededor de 0,8 ml cuando se genera un EHM de una sola capa, p. ej., siguiendo las etapas (i) y (iv), y como se muestra en la figura 3C, lado derecho. Estos EHM de una sola capa pueden tener un tamaño de entre 0,5 mm y 1 mm. Así, la mezcla de reconstitución puede compactarse alrededor del 90 % durante todo el proceso. Sin embargo, lo ideal es que un tejido del corazón artificial para su uso en el ámbito clínico tenga un grosor de por lo menos 5 mm para mantener la tensión del corazón que late y resistir el corazón que late. Como experimento de reflexión y para obtener un EHM con un grosor de por lo menos 5 mm con una única mezcla de reconstitución, el experto en la materia necesitaría moldear una mezcla de reconstitución de por lo menos 80 ml, lo que corresponde a un grosor de la mezcla de reconstitución líquida de 50 mm (5 cm). Sin embargo, las células en el centro de una mezcla de dicha reconstitución única tan gruesa no sobrevivirían a dicho método ya que dichas células sufrirían necrosis en el núcleo de la mezcla de reconstitución y posteriormente compactación del tejido a causa de la hipoxia y la falta de nutrientes. La introducción de varillas de perforación elude esta limitación ya que establece una distancia de difusión óptima deseada entre la superficie y el núcleo del tejido para asegurar un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes en todo el MEHM.

La otra ventaja clave del método como se divulga en la presente memoria es que las capas se añaden secuencialmente. Así, cada mezcla de reconstitución adicional se fusiona con la mezcla de reconstitución compactada de la etapa (ii). Debido a dicha fusión, el MEHM resultante se origina a partir de varias capas, sin embargo, las capas son inseparables. En otras palabras, el MEHM en formación se comporta como un solo músculo, ya que las capas individuales se fusionan para formar una sola entidad. Esta es una ventaja particular en comparación con una fusión de miocardios cardíacos genomanipulados apilados individualmente como se divulga en el documento WO2007054286, Zimmermann et al. 2006 y Naito et al. 2006

En una realización preferida, la hipoxia se determina con un indicador de hipoxia. En una realización particularmente preferida, los miocitos cardíacos en el MEHM reciben suficiente oxígeno, preferiblemente en el que el suministro de oxígeno está determinado por el indicador de hipoxia ODD-Luc como se describe en Hesse A. R., et al. (2014). Esta realización también está respaldada por la experimentación como se ilustra en la figura 3D. En dicho experimento, los cardiomiocitos de la capa más interna del MEHM y el EHM de una sola capa comprenden el indicador de hipoxia ODD-Lux. Como se puede observar en la comparación en la figura 3D, de hecho, el EHM de una sola capa muestra más hipoxia que el EHM de 5 capas. En una realización particularmente preferida, los miocitos cardíacos en el MEHM reciben suficiente oxígeno, lo que se determina mediante el indicador de hipoxia ODD-Luc como se describe en Hesse A. R. et al. (2014), preferiblemente en el que se asegura un suministro de oxígeno suficiente si la luminiscencia relativa media de los miocitos cardíacos del MEHM es como máximo 6 veces mayor que en un EHM de una sola capa según se obtiene siguiendo las etapas (i), (ii) y opcionalmente (iv) del método, más preferiblemente como máximo 5 veces, más preferiblemente como máximo 4 veces, más preferiblemente como máximo 3 veces, más preferiblemente como máximo 2,5 veces, incluso más preferiblemente como máximo 2 veces e incluso más preferiblemente como máximo 1,5 veces. En una realización aún más preferida, los miocitos cardíacos en el MEHM reciben suficiente oxígeno, lo que se determina mediante el indicador de hipoxia ODD-Luc como se describe en Hesse A. R. et al. (2014), y en el que la luminiscencia relativa media de los miocitos cardíacos del MEHM no es mayor que la luminiscencia relativa media medida en miocitos cardíacos de un EHM de una sola capa, como, p. ej., se muestra experimentalmente en la figura 3C.

En otro aspecto, también se describe un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) obtenido con el método como se divulga en la presente memoria. Además, también se describe un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) que se puede obtener mediante el método como se divulga en la presente memoria.

En otro aspecto, se describe un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), en el que el MEHM comprende (a) colágeno y (b) una mezcla celular de miocitos cardíacos y no miocitos, y en el que el EHM comprende por lo menos 2 capas. Se prefiere que el MEHM sea un parche, una bolsa o un cilindro. Es incluso más preferido que el MEHM tenga un grosor de por lo menos 0,2 mm. Se prefiere además que el MEHM se haya generado mediante un método de estratificación repetitivo y secuencial, en el que el MEHM se origine a partir de 2-200 capas. Se prefiere además que las capas se hayan fusionado entre sí y, por lo tanto, amplíen el grosor del MEHM. El experto en la materia sabe que la mezcla celular necesita un medio para suministrar nutrientes a las células. Se prefiere aún más que cada capa del MEHM se origine a partir de una mezcla de reconstitución, en la que la mezcla de reconstitución comprende (a) colágeno, (b) una mezcla celular de miocitos cardíacos y no miocitos, y (c) un medio de reconstitución adecuado.

En una realización preferida, se describe un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) en el que el MEHM se caracteriza por que el MEHM se ha generado mediante un método de estratificación repetitivo y secuencial, en el que el MEHM se origina a partir de 2-200 capas, en el que las capas se han fusionado entre sí y de este modo expanden el grosor del MEHM, en el que cada capa se origina a partir de una mezcla de reconstitución, y en el que cada mezcla de reconstitución comprende (a) colágeno, (b) una mezcla celular de miocitos cardíacos y no miocitos y (c) un medio de reconstitución adecuado.

Se prefiere aún más que el MEHM sea capaz de contraerse, según se mide al determinar el cambio de área fraccionaria (FAC) del<M e H M>usando el método descrito en Tiburcy et al. Circulation 135(19)1832-1847 (2017). En una realización aún más preferida, el FAC es por lo menos el 0,5 % tras la estimulación eléctrica, preferiblemente en el que el FAC es por lo menos el 0,7 %, más preferiblemente por lo menos el 1 %, más preferiblemente por lo menos el 2 %, más preferiblemente por lo menos el 3 % e incluso más preferiblemente por lo menos el 5 %.

En una realización muy preferida, el MEHM se origina a partir de 2 a 100 capas, preferiblemente de 2 a 80 capas, más preferiblemente de 2 a 70 capas, más preferiblemente de 2 a 60 capas, más preferiblemente de 2 a 50 capas, más preferiblemente de 2 a 40 capas, más preferiblemente de 3 a 30 capas, más preferiblemente de 3 a 25 capas e incluso más preferiblemente de 4 a 20 capas. Por ejemplo, 20 capas con un grosor individual completamente compactado de 0,5 mm por mezcla de reconstitución pueden ser una configuración deseable para la fabricación de un MEHM para su uso como implante humano.

Como resultado de las por lo menos dos capas, el MEHM es de 0,7 mm a 30 mm, preferiblemente de alrededor de 0,7 mm a alrededor de 25 mm, más preferiblemente de alrededor de 0,9 mm a alrededor de 20 mm, más preferiblemente de alrededor de 1 mm a alrededor de 17 mm, más preferiblemente de alrededor de 2,3 mm a alrededor de 15 mm, más preferiblemente de alrededor de 2,8 mm a alrededor de 14 mm, más preferiblemente de alrededor de 3,3 mm a alrededor de 13 mm, más preferiblemente de alrededor de 3,8 mm a alrededor de 12 mm, más preferiblemente de alrededor de 4,2 mm a alrededor de 11 mm, más preferiblemente de alrededor de 4,6 mm a alrededor de 10,5 mm, y lo más preferiblemente de alrededor de 5 mm a alrededor de 10 mm.

Es incluso más preferido que el MEHM no esté vascularizado y/o el MEHM no esté bajo el control del sistema nervioso central. En una realización preferida, el MEHM está perforado por, por lo menos, 2 varillas con distancias de difusión parecidas en todo el MEHM para asegurar el suministro de nutrientes y oxígeno de la mezcla celular. Por ejemplo, los miocitos cardíacos en el MEHM reciben suficiente oxígeno, preferiblemente en el que el suministro de oxígeno lo determina el indicador de hipoxia ODD-Luc como se describe en Hesse A. R. et al. (2014). Específicamente, los miocitos cardíacos en el MEHM pueden recibir suficiente oxígeno, lo que se determina mediante el indicador de hipoxia ODD-Luc como se describe en Hesse A. R. et al. (2014), preferiblemente en el que se puede asegurar un suministro suficiente de oxígeno si la luminiscencia relativa media de los miocitos cardíacos del MEHM es como máximo 6 veces mayor que en un EHM de una sola capa, lo que se puede obtener siguiendo las etapas (i), (ii) y opcionalmente (iv) del método como se describe en la presente memoria, más preferiblemente como máximo 5 veces, más preferiblemente como máximo 4 veces, más preferiblemente como máximo 3 veces, más preferiblemente como máximo 2,5 veces, incluso más preferiblemente como máximo 2 veces, e incluso más preferiblemente como máximo 1,5 veces.

Se prefiere especialmente que los miocitos cardíacos en el MEHM reciban suficiente oxígeno, lo que se determina mediante el indicador de hipoxia ODD-Luc como se describe en Hesse A. R. et al. (2014), y en el que la luminiscencia relativa media de los miocitos cardíacos del MEHM no es mayor que la luminiscencia relativa media medida en los miocitos cardíacos de un EHM de una sola capa.

El MEHM tal como se divulga en la presente memoria puede mostrar cualquier característica divulgada con respecto al método divulgado en la presente memoria.

En otro aspecto, el MEHM se obtiene al llevar a cabo las etapas (i) (iii) del método como se divulga en la presente memoria.

En un aspecto adicional, se divulga un músculo del corazón genomanipulado, preferiblemente un parche cardíaco genomanipulado, una bolsa cardíaca genomanipulada o un cilindro cardíaco genomanipulado, en el que el EHM comprende (a) colágeno, (b) una mezcla celular de miocitos cardíacos y no miocitos, en el que el EHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm, como se define adicionalmente en las reivindicaciones. Dicho EHM es un MEHM y comprende por lo menos 2 capas.

En otro aspecto, también se describe un uso del MEHM obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria en un modeloin vitropara el cribado de fármacos. En particular, el MEHM se puede utilizar en un modeloin vitropara el cribado de toxicidad de fármacos o el cribado de eficacia de fármacos.

Además, también se describe un uso del MEHM obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria en una fabricaciónin vitrode un miocardio humano genomanipulado. En una realización preferida, el MEHM tiene la forma tridimensional para coincidir con el defecto miocárdico específico del paciente, más preferiblemente en el que el defecto miocárdico específico del paciente se evalúa mediante resonancia magnética, ultrasonido, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones y/o tomografía por coherencia óptica. El experto en la materia conoce todos estos métodos ya que son una práctica estándar en la técnica. Después de evaluar el defecto miocárdico tridimensional específico del paciente, el experto en la materia puede generar un MEHM con dimensiones personalizadas. Por ejemplo, el experto en la materia puede producir un MEHM según el grosor de la pared de miocardio del paciente, preferiblemente según el grosor de la pared de miocardio del paciente antes de que se produjera el defecto.

El MEHM obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria también se puede utilizar como herramienta de investigación.

En un aspecto adicional, también se contempla el MEHM obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria para su uso en medicina. En particular, se contempla el MEHM obtenido con el método como se divulga en la presente memoria o el MEHM como se divulga en la presente memoria para su uso en reparación cardíaca. Por ejemplo, el MEHM puede ser un implante. Dicho implante puede usarse para el tratamiento de un paciente que padece insuficiencia cardíaca. En una realización preferida, el MEHM se aplica permanentemente al corazón del paciente. Esta aplicación permanente del MEHM al corazón se puede lograr mediante procedimientos quirúrgicos estándar tales como coser, grapar o encolar. Por ejemplo, el MEHM puede coserse al corazón del paciente.

Descripción de las figuras

Figura 1: Descripción general de la estratificación repetitiva para obtener un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) como se divulga en la presente memoria. En general, la capa recién añadida (mezcla de reconstitución) se fusiona con la capa anterior (mezcla de reconstitución compactada). Mediante estratificación repetitiva, se obtiene un músculo del corazón genomanipulado grueso y reforzado. Se obtiene una "estratificación por encima" al añadir una nueva mezcla de reconstitución encima de la mezcla de reconstitución compactada. Se obtiene un "patrón en cebolla" al sumergir la primera pila y las pilas formadas consecutivamente de las capas fusionadas en una mezcla de reconstitución recién añadida. Se obtiene una "estratificación por debajo" al añadir una nueva mezcla de reconstitución por debajo de la mezcla de reconstitución compactada. Esta estratificación se puede repetir indefinidamente teniendo en cuenta los requisitos de difusión de oxígeno y nutrientes de las células incluidas. El suministro de oxígeno y nutrientes se logra mediante la inmersión en un medio de cultivo oxigenado que contiene nutrientes (en particular glucosa, lactato y/o ácidos grasos) y una superficie de tejido aumentada por diseño, es decir, mediante la creación de canales por medio de varillas de perforación (no mostradas en el esquema; véase las figuras 2 y 3). La primera capa inicial se indica como una línea de puntos; las capas posteriores se indican en negro.

Figura 2: Escalabilidad del músculo del corazón genomanipulado. Las fotografías muestran formatos típicos de músculo del corazón genomanipulados utilizados por los autores de la invención para el modelado de enfermedades, el cribado de fármacos y la reparación cardíaca. Los volúmenes indicados representan los volúmenes iniciales de las mezclas de reconstitución respectivas del músculo del corazón genomanipulado. En un planteamiento de estratificación para generar un MEHM como se divulga en la presente memoria, cada mezcla de reconstitución puede tener estos volúmenes ejemplares. La carga mecánica se realiza mediante la integración de varillas flexibles en las respectivas formulaciones de tejido. Las geometrías y la escala se pueden adaptar aún más según sea necesario. Una vez completado el proceso de autoorganización de una capa, el grosor de EHM (dimensión z) típicamente es de 0,5±0,1 mm en las formulaciones visualizada. Mediante estratificación repetitiva, como se divulga en la presente memoria, el MEHM se engruesa y se refuerza. Barra de escala: 1 cm.

Figura 3: Escalado del grosor de EHM mediante estratificación secuencial/repetitiva y suministro suficiente de oxígeno y nutrientes. A: Molde de colada de diseño personalizado con dispositivo de ensanchamiento (compuesto de varillas flexibles impresas en 3D con un espaciado definido fijadas a una placa base sólida) para permitir el diseño de EHM perforado y facilitar las contracciones auxotónicas del EHM o MEHM en desarrollo frente a una resistencia definida. B: Vista esquemática del diseño del parche perforado en capas C: Vistas superior y lateral de un EHM de 5 capas (izquierda) y de una sola capa (derecha); el EHM de 5 capas tenía un grosor de alrededor de 5-6 mm y el EHM de una sola capa tenía un grosor de alrededor de 1 mm. D: Al aprovechar una línea iPSC indicadora de hipoxia ODD-Luc humana para la construcción de una capa intermedia en la construcción de 5 capas (tanto el EHM de 5 capas como el de una sola capa contienen la misma cantidad de cardiomiocitos ODD-Luc, Hesse et al. al. 2014 para el método de hipoxia ODD-Lux), no hubo indicios de hipoxia mejorada en el diseño de 5 capas sustancialmente más grueso. El código de tono gris a la derecha indica actividad ODD-Luc alta y baja como signo de detección de hipoxia. La escala de grises representa la luminiscencia de la línea celular informadora. La intensidad de la señal ODD-Luc fue menor en el EHM de 5 capas (izquierda) en comparación con la señal ODD-Luc de referencia en el parche solo (derecha). En otras palabras, la intensidad de la señal luminiscente parece ser por lo menos la misma en el EHM de una sola capa en comparación con el EHM multicapa, si no más brillante en el EHM de una sola capa. Así, el EHM de 5 capas no sufre hipoxia.

Figura 4: Formato de placa en pocillos múltiples para la colada automatizada en formato bucle. A: ensanchadores hechos a medida (varillas flexibles fijadas en una placa base) para resistir las contracciones auxotónicas del miocardio cardíaco genomanipulado en formato bucle que muestra las dimensiones típicas de las disposiciones y dimensiones de las varillas. B: Formato de placa en pocillos múltiples para la colada automatizada, cultivo paralelo y análisis videoóptico de 48 miocardios cardíacos genomanipulados en formato bucle con vista en primer plano de un solo pocillo que muestra la cavidad para la colada y las varillas flexibles para la maduración según una carga mecánica definida (véase Tiburcy et al. 2020 para obtener detalles adicionales)

Figura 5: Formación de EHM en formato bucle. A: Colada automatizada de EHM en una placa en pocillos múltiples. B: 1 hora después de la colada, el EHM se convierte a un estado no líquido (la gelificación de colágeno da como resultado un aspecto opaco de la mezcla de reconstitución de EHM) C: Compactación y suspensión destacada de EHM sobre varillas flexibles para la carga mecánica 24 horas después de la colada. D: El EHM después de completar la compactación el día de cultivo 18 con el EHM completamente suspendido en las varillas flexibles que imponen una carga mecánica bidireccional y resisten las contracciones auxotónicas en condiciones de precarga. Barra de escala: 5 mm

Figura 6: A: Análisis videoóptico de la contracción del EHM con o sin estimulación. A: Captura de pantalla de la herramienta de análisis videoóptico personalizada para el fenotipado funcional de EHM mediante mediciones del cambio de área fraccionaria (FAC). B: Dispositivo de estimulación eléctrica de EHM para inducir contracciones a un ritmo definido. La estimulación del campo eléctrico aumenta hasta que los EHM son inducidos a contraerse a una tasa de latido definida (típicamente a 2 V/cm). (C) De forma alternativa, se puede aplicar estimulación puntual local con electrodos que tocan el EHM para inducir contracciones sincrónicas de EHM para los análisis de FAC.

Figura 7: Moldes de colada de EHM multicapa en formato parche. A: Molde de colada de diseño personalizado con dos rebajes diseñados para sostener una placa base con varillas (abajo) y un medio de cultivo (arriba). En el rebaje izquierdo con varillas flexibles se representa una mezcla de reconstitución compactada para su clarificación. Las capas se apilan encima, se introducen debajo o se formulan alrededor de la primera capa. B: Rebaje pensado en sección transversal en molde de colada con varillas de perforación verticalmente (gris y blanco) con e Hm en capas en negro. C: Ejemplos de diseños de varillas con y sin gradiente de grosor de varillas; obsérvese que con el diseño de las varillas (propiedades elásticas, diámetro o geometría de las varillas) homogéneas (sin gradiente, todas las varillas tienen 0,9 mm de diámetro en este ejemplo) y heterogéneas (ejemplo de un gradiente de arriba a abajo, las varillas tienen un diámetro de 1,1 mm a 0,7 mm de arriba a abajo con etapas de 0,1 mm) se puede controlar la carga mecánica impuesta al EHM. D: Ejemplo de un EHM, que desarrolló patrones de contracción isotrópicos (sin gradiente; en el que las varillas tienen el mismo diámetro) o anisotrópicos (gradiente vertical; en el que las varillas tienen un gradiente de diámetro). Los patrones de contracción se analizan comparando el FAC de la parte superior e inferior del EHM. Cuando todas las varillas tienen el mismo diámetro, la parte superior e inferior del EHM mostraron una contracción parecida de alrededor del 1 % del FAC. Por el contrario, un gradiente vertical da lugar a un aumento en la fuerza de contracción de la parte superior a alrededor del 1,2 % del FAC (diámetro de varilla más grande) y da lugar a una disminución en la fuerza de contracción de la parte inferior a alrededor de un 0,7 % del FAC (diámetro de varilla más pequeño).

Figura 8: Músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) en geometrías variables. Ejemplos de músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM). El MEHM se puede producir en formatos de bolsa (A), cilindro (B) y parche (C) con grosor y dimensiones x-y variables (ejemplificado en formato de parche en C). En la geometría en forma de bolsa de MEHM (A), los MEHM se moldean en un molde circular o esférico con un elemento central (sólido o flexible para la carga biomecánica del EHM compactado; parecido a como se describe en Zimmermann W. H., Yildirim Y, Eschenhagen T.: Pouch-like engineered heart muscle tissue. WO2008058917 y Yildirim et al. (2007) Circulation). En el ejemplo representado, la distancia entre varillas es de 3,5 mm con un diámetro de varilla de 1,5 mm de forma análoga a una realización preferida descrita para parches de EHM (figura 7). Las varillas se pueden adaptar en tamaño, geometría y distancia entre varillas según sea necesario para crear una carga y perforación óptimas para el suministro de oxígeno y nutrientes. En el caso de las geometrías de cilindro (B), las varillas se pueden fabricar para que apunten hacia dentro o hacia fuera y con orificios preferiblemente en los cilindros con las varillas que apuntan hacia fuera. La estratificación puede apoyarse en fuerzas centrífugas (>2 g; "recubrimiento por giro'') inducida por rotación controlada. (C) Se demuestran estrategias multicapa heterogéneas ("parche en parche"), bien al colocar un conjunto de parches perforado, que incluye el elemento de varilla perforador, en un molde nuevo para admitir estratificación adicional (C1) o al aprovechar insertos para aislar un volumen de moldeo definido dentro de un diseño de molde de colada más grande (C2). Esto permite un diseño de MEHM libre con grosor y dimensiones x-y variables para facilitar la fabricación de un parche personalizado/que coincide con el corazón del paciente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar más la invención, pero no se limitan a ella.

Ejemplo 1: producción escalable de músculo del corazón genomanipulado (EHM) en formato bucle y formato de parche (ejemplo comparativo)

Como han descrito previamente los autores de la invención en Tiburcy et al. (2017) y Tiburcy et al. (2020), el miocardio humano genomanipulado se puede producir en formato bucle y en forma de parches. En particular en el usoin vivopara reparación cardíaca, los parches del corazón genomanipulados son de suma importancia. La figura 2 proporciona una descripción general de diferentes tamaños y formatos que se han producido y publicado previamente (Tiburcy et al. (2017) y Tiburcy et al. (2020)).

Ejemplo 2: escalado del grosor de EHM mediante estratificación secuencial y repetitiva sostenida por varillas perforadoras que aseguran una carga mecánica y un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes. Para la producción de músculo del corazón en el tratamiento de pacientes con insuficiencia cardíaca, lo ideal es que un músculo del corazón genomanipulado resista la fuerza de un corazón humano que late. La pared cardíaca a tratar típicamente tiene un grosor de 5 a 10 mm en el paciente, es decir, un implante idealmente alcanza este grosor y es geométricamente adaptable para satisfacer las demandas específicas del paciente en cuanto a la resistencia mecánica de la pared cardíaca cuyo rendimiento es insuficiente.

Para generar un EHM multicapa engrosado (y reforzado), los autores de la invención desarrollaron un método de estratificación secuencial y repetitivo. Específicamente, la figura 1 muestra tres formas diferentes de estratificación repetitiva y secuencial para obtener un parche cardíaco genomanipulado engrosado (obsérvese que, para simplificar, se excluyen las varillas de perforación). Como principio general, la primera mezcla de reconstitución, después de la compactación hasta una capa definida, se recubre con mezclas de reconstitución adicionales. El recubrimiento puede ser por encima, por debajo o desde ambos lados, como se muestra esquemáticamente en la figura 1. El proceso se repite hasta lograr el grosor de tejido deseado. Mediante el diseño del molde de colada se puede crear cualquier forma y dimensión x-y deseada (diseño de parche personalizado). Un requisito previo para el proceso de recubrimiento/estratificación es que la primera capa y las capas producidas posteriormente formen un tejido compacto. Esta formación de tejido compacto se logra mediante estratificación repetitiva y secuencial a medida que las mezclas de reconstitución individuales se fusionan entre sí. La compactación del tejido es función del tipo y contenido de las células estromales (Tiburcy et al. (2017), Schlick et al. (2019)). El tipo y el contenido de las células estromales se eligen para alcanzar una compactación del >20 % de la mezcla de reconstitución original (la figura 5B-C demuestra la compactación de EHM a modo de ejemplo en un formato bucle). Esto proporciona la estructura y el espacio físico para recubrir el EHM compactado con una capa adicional por encima y/o por debajo o capas de recubrimiento en ambas superficies. Los autores de la invención típicamente añaden nuevas capas 24 h después de la colada de la capa anterior. Estos tiempos se pueden acortar o ampliar según se desee y se determinan experimentalmente, ya que el proceso de compactación del tejido deseado depende del tipo y la densidad de las células estromales, la composición celular en general y la composición del hidrogel y del medio de cultivo (p. ej., la adición de concentraciones eficaces de TGFb1 puede acelerar el proceso según se aprovechan en Tiburcy et al. (2017) y el documento WO2017/207431 para la formación de EHM). Se pueden añadir más mezclas de reconstitución al molde para recubrir el músculo del corazón genomanipulado multicapa y compactado. Al realizar este método, el EHM se engruesa capa por capa, de modo que un EHM multicapa puede alcanzar el grosor clínicamente deseado de 5 mm a 10 mm o incluso más. Dado que el grosor de la pared celular humana está entre 5 mm y 10 mm, se supone que un parche cardíaco engrosado de este tipo también es capaz de mantener la estabilidad mecánica suficiente para resistir la función de la pared cardíaca. Además, se espera que la contractilidad de los cardiomiocitos incluidos dentro del EHM resista la contracción del corazón natural.

La figura 3A representa un molde de colada con un dispositivo de ensanchamiento (compuesto de varillas flexibles impresas en 3D con un espaciado definido fijadas a una placa base sólida extraíble) para permitir el diseño de EHM perforado y facilitar las contracciones auxotónicas del parche en desarrollo frente a una resistencia definida. Por supuesto, se puede adaptar el tamaño del molde de colada, así como el número de varillas y el tamaño de las varillas. La figura 3B muestra una descripción general esquemática de un EHM multicapa como se divulga en la presente memoria. En la figura 3C, se muestran un EHM generado de 5 capas y un EHM de una sola capa uno al lado del otro. En el panel inferior de la figura 3C, se compara específicamente el grosor del EHM, lo que demuestra que un EHM de 5 capas tiene aproximadamente 5-6 milímetros de grosor. Mediante el uso del diseño introducido de estratificación perforada, no hay limitación en el grosor total del tejido con distancias de difusión constantes como resultado de los canales producidos por las varillas de perforación. Por supuesto, la distancia y el tamaño de las varillas se pueden adaptar para aumentar el número de canales y alterar el tamaño de los canales y la distancia entre canales.

Un desafío clave al tratar de obtener un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) tan grueso es asegurar el suministro de oxígeno y nutrientes a las células incluidas en el músculo del corazón genomanipulado. Mediante el diseño de EHM perforado, los autores de la invención aseguran un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes en cualquier diseño multicapa determinado. Esto se ejemplifica mediante estudios de los autores de la invención que utilizan un modelo indicador de hipoxia ODD-Luc humano (desarrollado por los autores de la invención basándose en la experiencia previa en un modelo de ratón; Hesse et al. (2014)). Los cardiomiocitos derivados de una línea de células madre pluripotentes humanas ODD-Luc en una sola y cinco capas (de 5 a 6 mm de grosor) no mostraron diferencias en la intensidad de la señal ODD-Luc por encima de la referencia (se informa en el EHM de una sola capa). El diámetro y la densidad del canal en el diseño de EHM demostrado se definieron por el diámetro de la varilla (1,5 mm) y la distancia de circunferencia a circunferencia de la varilla (3,5 mm). En estas condiciones (la distancia eficaz máxima de la superficie en el EHM es 1,75 mm) no se observó hipoxia. El formato parche perforado muestra la diferencia de la densidad vascular del corazón humano (2.000-5.000 capilares/mm2, con una distancia intercapilar de <25 gm). Por lo tanto, fue sorprendente, y también a diferencia de las suposiciones teóricas, que el suministro de oxígeno por difusión a una distancia de >100 gm daría como resultado la detección de condiciones hipóxicas por parte de los cardiomiocitos (Radisic et al. (2005). Esta discrepancia puede explicarse por la alta resistencia a la hipoxia en los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes en presencia de nutrientes (glucosa, lactato y/o medio de cultivo que contiene ácidos grasos).

Al realizar estratificación repetitiva y secuencial, así como en particular el diseño del parche perforado, se asegura que las células dentro del EHM no sufren hipoxia y reciben suficientes nutrientes. Otra opción teórica de generar un EHM engrosado de, p. ej., 10 mm sería vaciar directamente un gran volumen de mezcla de reconstitución en una etapa de colada. Para obtener un EHM de 10 mm de grosor, la mezcla de reconstitución única necesitaría tener un grosor de alrededor de 100 mm. Las células dentro de dicha mezcla necesitarían recibir oxígeno y nutrientes en una distancia de 1 a 10 centímetros, dependiendo de la etapa y el grado de compactación del tejido. Como el EHM no está vascularizado, las células incluidas sufrirían apoptosis y necrosis inducidas por hipoxia en EHM a escala de centímetros. Para superar este obstáculo, los autores de la invención han desarrollado un método para realizar estratificación repetitiva y secuencial en moldes de colada equipados con varillas de perforación (figuras 3 y 7), como se divulga en la presente memoria. Este planteamiento es ventajoso sobre otros planteamientos, que no aseguran un suministro suficiente de oxígeno y nutrientes.

Además, es fundamental que las varillas que atraviesan instalen elementos mecánicos de resistencia para resistir las contracciones auxotónicas.

Materiales y métodos del ejemplo 2

Generación de EHM de 5 capas: Los EHM se construyeron en moldes de colada hechos a medida (figura 7) utilizando una mezcla de reconstitución descrita en Tiburcy et al. (2017) y el documento WO2015025030. Después de vaciar la mezcla de reconstitución (8 ml; véase la figura 2), se observó la compactación de EHM en 3 días hasta menos del 50 % del volumen de reconstitución original. Después de retirar el medio de cultivo, se pipeteó una segunda capa (compuesta de 6 ml de mezcla de reconstitución, el volumen se puede ajustar y depende del diseño/área de la superficie y uso del molde, y se puede adaptar según la compactación de EHM) en el molde de colada para cubrir el EHM compactado por encima y por debajo. Por ejemplo, también se podrían haber añadido 8 ml o un volumen menor, tal como 2 ml, para cubrir un área restringida (véase el ejemplo 5 para obtener más ilustraciones). Después de aproximadamente 1 h, se completó la gelificación de la mezcla de reconstitución recién pipeteada y se añadió medio de cultivo al molde. Este proceso se repitió hasta obtener 5 capas. El volumen de la mezcla de reconstitución para la estratificación repetitiva y el tiempo depende de las dimensiones del molde de colada y de la compactación del EHM mediada por células estromales.

Generación de una línea indicadora de hipoxia. Se clonó un plásmido piggyBAC-ODD-Luc que contiene luciferasa de luciérnaga fusionada al dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) de HIF1a bajo el control del promotor de actina de pollo (CAG). En condiciones normóxicas, el sistema ubiquitina-proteosoma degrada rápidamente el dominio ODD. En condiciones de hipoxia, el dominio ODD se estabiliza, lo que da lugar a una luminiscencia mensurable (Hesse et al. (2014)). Las iPSC TC1133 se sometieron a electroporación con constructos piggyBAC-ODDLuc junto con un vector de transposasa. 48 horas después de la electroporación, se seleccionaron las células con una concentración creciente de neomicina (250-500-750 gg/ml) durante 7 días antes de que las colonias se recogieran y expandieran manualmente.

Validación de la línea indicadora de hipoxia. Se lisaron células madre pluripotentes que expresan luciferasa de luciérnaga fusionadas al dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) de HIF1a bajo el control del promotor de actina de pollo (CAG) en 1x tampón de lisis pasivo (Sistemas de ensayo de indicador Dual-Luciferase®, Promega) con proteasa e inhibidores de fosfatasa (ambos de Roche) tras haberse expuesto a hipoxia (5 o 1 % de O<2>). Los lisados que contenían células o sin células (solo tampón de lisis) se mezclaron con el reactivo de ensayo de luciferasa II (Sistemas de ensayo de indicador Dual-Luciferase®, Promega) y la luminiscencia se midió con un lector de microplacas multimodo FlexStation 3 (Molecular Devices); media ±SEM; n=3:

El aumento de la señal de luminiscencia del indicador ODD-Luc integrado genéticamente de forma estable en respuesta a concentraciones de oxígeno más bajas demostró la utilidad del modelo ODD-Luc en la detección de hipoxia en modelos de células madre pluripotentes humanas. Imágenes de bioluminiscencia del indicador de hipoxia de EHM. EHM ODD-Luc se sumergieron en solución salina tamponada con fosfato que contenía 1 mg/ml de Xenolight D-Luciferin (Perkin Elmer). Se tomaron imágenes de la luminiscencia de EHM a 37 °C utilizando un sistema IVIS Lumina III (Perkin Elmer). La luminiscencia se representa en escala de grises en la figura 3D. El EHM de 5 capas mostró menos luminiscencia que el EHM de una sola capa.

Ejemplo 3: Generación de EHM en formato bucle en una placa en pocillos múltiples que ilustra el proceso de condensación de miocardio humano genomanipulado

La figura 5 proporciona una descripción general demostrativo preliminar de la condensación (después de 1 h de gelificación) y la compactación (después de 24 h y 18 días) de la mezcla de reconstitución para formar un EHM generador de fuerza en formato bucle. Por ejemplo, se puede generar EHM en formato bucle con ensanchadores hechos a medida (varillas flexibles fijadas en una placa base) para resistir las contracciones auxotónicas del miocardio humano genomanipulado (figura 4A). Como se divulga previamente en Tiburcy et al. (2020), se pueden producir 48 EHM en formato bucle en paralelo utilizando una placa definida en pocillos múltiples (figura 4B). La placa en pocillos múltiples también se describe con más detalle en el documento WO 2017/207431. La placa en pocillos múltiples se caracteriza por que cada molde tiene forma de canal anular. Cada EHM se vierte en un canal anular. Durante la condensación y compactación de la mezcla de reconstitución, el miocardio humano genomanipulado se desprende del canal anular, se mueve hacia arriba y envuelve estrechamente las dos varillas.

En una primera etapa, la mezcla de reconstitución se proporcionó en el molde de la placa en pocillos múltiples como se describe previamente en Tiburcy et al. 2017 o Tiburcy et al. 2020. Cuando la mezcla de reconstitución se vierte en el molde, la mezcla de reconstitución es una solución líquida viscosa translúcida. Después de una hora de incubación a 37 °C en una incubadora humidificada con el 5 % de CO<2>, el miocardio humano genomanipulado se volvió opaco a medida que la mezcla de reconstitución se consolidaba principalmente mediante gelificación independiente de las células del hidrogel de colágeno (véase también Tiburcy et al. (2014), Schlick et al. (2019)). Después de la consolidación (por ejemplo, 1 hora, figura 5B), se añadió medio de cultivo a los moldes, lo que proporcionó nutrientes y factores de crecimiento (véase, p. ej., Tiburcy et al. (2017) y Tiburcy et al. (2020) para composiciones de medio ejemplares. Después de cultivar durante, p. ej., 24 horas, el bucle se desprendió del molde de modo que era visible un espacio entre la mezcla de reconstitución y el molde. Además, después de 24 horas, la mezcla de reconstitución se desprendió del canal anular y se envolvió estrechamente alrededor de las dos varillas (figura 5C). El proceso de formación de EHM alrededor de las varillas flexibles es una función del componente de las células estromales y puede facilitarse aún más mediante la adición de concentraciones eficaces de TGFb1. Después de que el miocardio humano genomanipulado se coloca en las varillas flexibles, se utilizó medio de mantenimiento de miocardio humano genomanipulado sin TGFb1. En los 17 días siguientes, la mezcla se condensa aún más alrededor de las dos varillas, como se representa en la figura 5D, y se desarrolla un miocardio humano genomanipulado compacto y contraído. Las varillas se elaboran para doblarse en respuesta a las contracciones del EHM y para separar el EHM hasta una longitud de reposo definida durante la fase de relajación del EHM para simular los ciclos de contracción auxotónica natural del corazón.

Ejemplo 4: Excitabilidad del músculo del corazón genomanipulado (EHM)

La excitación de los cardiomiocitos típicamente da lugar a una contracción de estas células. Para medir la contracción dentro de los EHM, Tiburcy et al. (2017) describieron el cambio del área fraccionaria (FAC) del parche tras la contracción. El FAC es una medición videoóptica, en la que se compara el área de la superficie del parche en un estado contraído y no contraído. Al utilizar dicha herramienta de análisis videoóptico, los EHM se pueden fenotipar y comparar. La figura 6A representa una herramienta de análisis videoóptico hecha a medida para facilitar la medición.

La figura 6B muestra un dispositivo de estimulación eléctrica de EHM para inducir contracciones a un ritmo definido. La intensidad de estimulación del campo eléctrico se aumenta (típicamente hasta 2 V/cm2) hasta que los EHM son inducidos a contraerse a una tasa de latido definida (típicamente controlada a 0,1-3 Hz). De forma alternativa, se puede aplicar estimulación puntual local con electrodos que tocan el EHM para inducir contracciones sincrónicas de EHM a una tasa de latido deseada para los análisis de fAc (figura 6C).

El FAC (cambio del área fraccionaria) se mide comparando el área de la superficie de EHM en imágenes videoópticas en sístole máxima (estado de máxima contracción) y diástole máxima (estado de máxima relajación). El cambio en el área de la superficie se registra en función del tiempo.

Ejemplo 5: Diversas geometrías para diseños de músculo del corazón multicapa genomanipulado

En general, el MEHM se puede generar en diversas formas tridimensionales. El principio general es un molde equipado con varillas de perforación con formas y dimensiones homogéneas o heterogéneas para (i) imponer resistencia mecánica al EHM en formación y (ii) crear canales de perforación para el suministro de nutrientes y oxígeno. En la geometría en forma de bolsa de EHM (como se representa en la figura 8A), los EHM se moldean en un molde circular o esférico con un elemento central (sólido o flexible para la carga biomecánica del EHM compactado; parecido a como se describe en Zimmermann W. H., Yildirim Y, Eschenhagen T.: Pouch-like engineered heart muscle tissue. WO2008058917 y Yildirim et al. (2007) Circulation). A diferencia del documento WO2008058917 y para crear de forma fiable, p. ej., bolsas > 1 mm de grosor con una formación muscula controlada, se crean varillas de perforación encima del elemento central. En el ejemplo representado de la figura 8A, la distancia entre varillas es de 3,5 mm con un diámetro de varilla de 1,5 mm de forma análoga a una realización preferida descrita para parches de EHM (figura 7). Las varillas se pueden adaptar en tamaño, geometría, y distancia entre varillas según sea necesario para crear una carga y perforación óptimas para el suministro de oxígeno y nutrientes.

En otro ejemplo, el MEHM también puede tener forma de cilindro. En el caso de las geometrías cilíndricas (figura 8B), las varillas se pueden fabricar para que apunten hacia dentro o hacia fuera de modo que perforan la mezcla de reconstitución. Una ventaja clave de un EHM de forma cilíndrica es que se pueden producir muchos EHM en paralelo utilizando comparativamente poco espacio. Después de completar la producción del MEHM cilíndrico, el MEHM se puede cortar en rodajas en un lado para obtener un parche o dejarlo intacto para producir un cilindro/tubo de MEHM de las dimensiones deseadas. Las dimensiones del MEHM se pueden escalar adaptando libremente la circunferencia de los cilindros del molde interior y/o exterior con varillas que se extienden/irradian hacia dentro o hacia fuera. Los moldes en forma de cilindros con varillas de perforación se fabrican, por ejemplo, mediante impresión 3D de prototipos para ajustarse en un contenedor. Dicho contenedor suministra la pared exterior para la producción de EHM cilíndrico (por ejemplo, un tubo de polipropileno o de vidrio de 50 ml). El contenedor se llena con mezcla de reconstitución suficiente para cubrir el lado interior o exterior del cilindro. La estratificación puede apoyarse en fuerzas centrífugas (>2 g; "recubrimiento por giro'') inducida por rotación controlada. El EHM tubular/cilíndrico generado en biorreactores cilíndricos de giro longitudinal debe realizarse a >2 g. El ensanchador tubular introducido contiene varillas que se extruyen radialmente para perforar el EHM. La fuerza centrífuga experimentada por el EHM se puede controlar ajustando la velocidad de rotación para imitar el aumento de la presión diastólica durante la maduración. Además, la centrifugación asegura una distribución igual de la mezcla de reconstitución para asegurar un grosor del EHM igual. El recubrimiento igual en un diseño de cilindro radiante hacia fuera se puede mejorar aún más usando un cilindro de molde interno con orificios que permiten una distribución igual de la mezcla de reconstitución durante un procedimiento de recubrimiento por giro. Después del recubrimiento y la gelificación, se puede añadir medio de cultivo para facilitar la compactación. La estratificación múltiple se puede repetir hasta conseguir la composición de capas deseada. Se pueden añadir capas por encima y/o por debajo de la mezcla de reconstitución anterior.

La figura 8C muestra otro ejemplo de diseño de MEHM. La figura 8C muestra estrategias multicapa heterogéneas ("parche en parche") para crear MEHM con grosores variables según las necesidades en la producción de MEHM personalizado, por ejemplo, para uso clínico en reparación cardíaca: En primer lugar, colocar un conjunto de parche perforado en un nuevo molde para admitir estratificación adicional (C1), y en segundo lugar, aprovechar insertos para aislar un volumen de colada definido dentro de un diseño de molde de colada más grande (C2). Esto permite un diseño libre de EHM con (i) grosor variable y (ii) dimensiones x-y para facilitar la fabricación de un parche personalizado/que coincide con el corazón del paciente. Los elementos descritos se pueden preparar mediante impresión 3D de prototipos como se describe en Tiburcy et al. (2017), moldeo por colada u otros métodos de genomanipulación adecuados. Los moldes típicamente se crean a partir de teflón, PDMS o agarosa mediante fresado o moldeo por colada, mientras que los conjuntos de varillas de perforación típicamente se imprimen mediante impresión 3D, por ejemplo, con una impresora 3D Connex350 (Stratasys), o mediante moldeo por colada. En la impresión 3D, se puede aplicar un polímero MED610 biocompatible para componentes rígidos (por ejemplo, placa base en el caso del diseño de parche perforado o los elementos del molde exterior del diseño en forma de bolsa) en combinación con un polímero TangoBlack para los elementos flexibles, tales como las varillas y los cilindros.

Tablas

Tabla 1: Composición del suplemento sin suero “B27 menos insulina” (concentración 50x, líquido) 20 ml de “B27 menos insulina” por 500 ml de medio corresponden al 4 % de B27 menos insulina (v/v);

Lista de referencias

EP2099508

EP20188364.2

EP2842581 A1

EP2840132 B1

WO 2007/054286

WO 2008/058917 A1

WO 2015/025030

WO 2017/207431

Bao X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xenofree conditions. Nat Biomed Eng. 2016;1; o

Bao X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nat Protoc. Sept. 2017;12(9):1890-1900.

Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K. y Price, P. J. (1993), Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented neurobasal™, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res., 35: 567-576. Fujita N. , Duerinekx A. J., Higgins C. B. Variation in left ventricular regional wall stress with cine magnetic resonance imaging: normal subjects versus dilated cardiomyopathy. Am Heart J. 1993 125:1337-45.

Hanses, U., Kleinsorge, M., Roos, L., Yigit, G., Li, Y., Barbarics, B., EI-Battrawy, I., Lan, H., Tiburcy, M., Hindmarsh, R., et al. (2020). Intronic CRISPR Repair in a Preclinical Model of Noonan Syndrome-Associated Cardiomyopathy. Circulation

Hesse A. R., Levent E., Zieseniss A., Tiburcy M., Zimmermann W. H., Katschinski D. M. (2014) Lights on for HIF-1a: Genetically Enhanced Mouse Cardiomyocytes for Heart Tissue Imaging. Cell Physiol Biochem. 34:455-462

Hynes R. O., Naba A. Overview of the matrisome-an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012;4(1):a004903.

Ieda M., Fu J. D., Delgado-Olguin P., Vedantham V., Hayashi Y., Bruneau B. G., Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 6 de agosto de 2010; 142(3):375-86. lyer D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 15 de abril de 2015; 142(8): 1528-41;

Iyer R. K., Radisic M., Cannizzaro C., Vunjak-Novakovic G. Synthetic oxygen carriers in cardiac tissue engineering. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2007;35(1): 135-48.

Kawel N., Turkbey E. B., Carr J. J., Eng J., Gomes A. S., Hundley W. G., Johnson C., Masri S. C., Prince M. R., van der Geest R. J., Lima J. A., Bluemke D. A. Normal left ventricular myocardial thickness for middle-aged and older subjects with steady-state free precession cardiac magnetic resonance: the multi-ethnic study of atherosclerosis. Circ Cardiovasc Imaging. Julio de 2012; 5(4):500-8.

Kensah, G., Roa Lara, A., Dahlmann, J., Zweigerdt, R., Schwanke, K., Hegermann, J., Skvorc, D., Gawol, A., Azizian, A., Wagner, S., et al. (2013). Murine and human pluripotent stem cell-derived cardiac bodies form contractile myocardial tissue in vitro. Eur Heart J 34, 1134-1146

Mills, R.J., Parker, B.L., Quaife-Ryan, G.A., Voges, H.K., Needham, E.J., Bornot, A., Ding, M., Andersson, H., Polla, M., Elliott, D.A., et al. (2019). Drug Screening in Human PSC-Cardiac Organoids Identifies Pro-proliferative Compounds Acting via the Mevalonate Pathway. Cell Stem Cell 24, 895-907 e896.

Mouw J. K., Ou G., Weaver V. M. Extracellular matrix assembly: a multiscale deconstruction. Nat Rev Mal Cell Biol.

2014; 15(12):771 -785. doi:10.1038/nrm3902

Mulieri L. A., Hasenfuss G., Leavitt B., Allen P. D., Alpert N. R. Altered myocardial force-frequency relation in human heart failure. Circulation. Mayo de 1992;85(5): 1743-50.

Nam Y. J., Song K., Luo X., Daniel E., Lambeth K., West K., Hill J. A., DiMaio J. M., Baker L. A., BasselDuby R., Olson E. N. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci US A. 2 de abril de 2013; 110(14):5588-93.

Nowosielski M., Schocke M., Mayr A., Pedarnig K., Klug G., Kohler A., Bartel T., Müller S., Trieb T., Pachinger O, Metzler B.. Comparison of wall thickening and ejection fraction by cardiovascu lar magnetic resonance and echocardiography in acute myocardial infarction. J Cardiovasc Magn Reson. 9 de julio de 2009; 11 (1):22.

Naito, H., Melnychenko, I., Didie, M., Schneiderbanger, K., Schubert, P., Rosenkranz, S., Eschenhagen, T., y Zimmermann, W. H. (2006). Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation 114, 172-78

O'Leary L. E., Fallas J. A., Bakota E. L., Kang M. K., Hartgerink J. D. Multi-hierarchical self-assembly of a collagen mimetic peptide from triple helix to nanofibre and hydrogel. Nat Chem. 28 de agosto de 2011 ;3(10):821 -8. doi: 10.1038/nchem.1123. PMID: 21941256.

Pislaru C., Urban M. W., Pislaru S. V., Kinnick R. R., Greenleaf J. F. Viscoelastic properties of normal and infarcted myocardium measured by a multifrequency shear wave method: comparison with pressure-segment length method. Ultrasound Med Biol. Agosto de 2014; 40(8): 1785-95

Radisic M., Deen W., Langer R., Vunjak-Novakovic G. Mathematical model of oxygen distribution in engineered cardiac tissue with parallel channel array perfused with culture medium containing oxygen carriers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. Marzo de 2005; 288(3):H1278-89

Riegler, J., Tiburcy, M., Ebert, A., Tzatzalos, E., Raaz, U., Abilez, O. J., Shen, Q., Kooreman, N. G., Neofytou, E., Chen, V. C., et al. (2015). Human Engineered Heart Muscles Engraft and Survive Long Term in a Rodent Myocardial Infarction Model. Circulation research 117, 720-730

Ronaldson-Bouchard, K., Ma, S. P., Yeager, K., Chen, T., Song, L., Sirabella, D., Morikawa, K., Teles, D., Yazawa, M., y Vunjak-Novakovic, G. (2018). Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature 556, 239-243

Rump, J., Klatt, D., Braun, J., Warmuth, C. y Sack, I. (2007), Fractional encoding of har monic motions in MR elastography. Magn. Reson. Med., 57: 388-395

Schlick S. F., Spreckelsen F., Tiburcy M., Iyer L. M., Meyer T., Zelarayan L. C., Luther S., Parlitz U., Zimmermann W. H., Rehfeldt F. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Prag Biophys Mal Biol. Julio de 2019; 144:51-60.

Song K., Nam Y. J., Luo X., Qi X., Tan W., Huang G. N., Acharya A., Smith C. L., Tallquist M. D., Neilson E. G., Hill J. A., Bassel-Duby R., Olson E. N. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature.

13 de mayo 2012; 485(7400):599-604.

Soong P. L., Tiburcy M., y Zimmermann (2012) Cardiac differentiation of human embryonic stem cells and their assembly into engineered heart muscle. Curr Protoc Cell Biol. Capítulo 23: Unidad 23.8.

Stoker M. E., Gerdes A. M., May J. F. Regional differences in capillary density and myocyte size in the normal human heart. Anat Rec. 1982 febrero;202(2): 187-91.

Tulloch N. L., Muskheli V., Razumova M. V., et al. (2011) Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ Res 109(1):47-59.

Tiburcy M., Meyer T., Soong P. L., Zimmermann W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods Mal Biol.

2014; 1181:167-76. doi: 10.1007/978-1 -4939-1047-2_15. PMID: 25070336.

Tiburcy, M., Hudson, J. E., Balfanz, P., Schlick, S., Meyer, T., Chang Liao, M. L., Levent, E., Raad, F., Zeidler, S., Wingender, E., et al. (2017). Defined Engineered Human Myocardium With Advanced Maturation for Applications in Heart Failure Modeling and Repair. Circulation 135, 1832-1847.

Tiburcy, M., Meyer, T., Liaw, N. Y., y Zimmermann, W. H. (2020). Generation of Engineered Human Myocardium in a Multi-well Format.<S t A r>Protocols.

Wiegerinck R. F., Cojoc A., Zeidenweber C. M., Ding G., Shen M., Joyner R. W., Fernandez J. D.,

Kanter K. R., Kirshbom P. M., Kogan B. E., Wagner M. B. Force frequency relationship of the human s ventricle increases during early postnatal development. Pediatr Res. 2009; 65:414-419.

Weinberger F., Breckwoldt K., Pecha S., et al. (2016) Cardiac repair in guinea pigs with human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells. Sci Transl Med 8(363):363ra148.

Witty A. D., Mihic A., Tam R.Y., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014;32(10): 1026-1035;

Yildirim Y., Naito H., Didie M., Karikkineth B. C., Biermann D., Eschenhagen T., Zimmermann W. H. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 11 de septiembre de 2007;116(11 Suppl): 116-23.

Zhang, D., Shadrin, I. Y., Lam, J., Xian, H. Q., Snodgrass, H. R., y Bursae, N. (2013). Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials 34, 5813-5820 Zimmermann W. H., Melnychenko I., Wasmeier G., et al. (2006) Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nat Med 12(4):452-8.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para fabricar un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), comprendiendo el método las etapas de:

(iii) a) añadir una mezcla de reconstitución líquida adicional como se define en la etapa (i) por encima y/o por debajo de la mezcla de reconstitución compactada obtenida en la etapa (ii), mediante lo cual dicha mezcla de reconstitución líquida adicional experimenta gelificación, seguido de cultivo en las mismas condiciones que en la etapa ii), mediante 10 cual dicha mezcla de reconstitución adicional se compacta en el molde; o

b) transferir la mezcla de reconstitución compactada obtenida en la etapa (ii) a un molde diferente, en el que dicha mezcla de reconstitución está perforada por, por lo menos, dos varillas, seguido de llevar a cabo la etapa (iii) a) en dicho molde diferente;

mediante lo cual se obtiene un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM),

en el que el MEHM es capaz de contraerse, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la capacidad del MEHM para contraerse se evalúa mediante inspección visual.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,9 mm a 20 mm, preferiblemente de 1,5 mm a 17 mm, más preferiblemente de 2 mm a 15 mm, más preferiblemente de 2,8 mm a 14 mm, más preferiblemente de 3,3 mm a 13 mm, más preferiblemente de 3,8 mm a 12 mm, más preferiblemente de 4,2 mm a 11 mm, más preferiblemente de 4,6 mm a 10,5 mm y lo más preferiblemente de 5 mm a 10 mm.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células no miocitos se seleccionan entre uno o más del grupo que consiste en células estromales, células endoteliales, células de músculo liso y células madre mesenquimales, preferiblemente en el que los no miocitos son células estromales o células endoteliales, más preferiblemente en el que los no miocitos son células estromales, incluso más preferiblemente en el que las células estromales son células estromales cardíacas, incluso más preferiblemente en el que las células estromales cardíacas tienen propiedades de fibroblastos, incluso más preferiblemente en el que las células estromales cardíacas son fibroblastos.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el MEHM tiene la forma de un parche, una bolsa o un cilindro.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la gelificación en la etapa (i) se caracteriza por que la mezcla de reconstitución es opaca.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las varillas tienen un diámetro de 0,5 a 3 mm, preferiblemente de 0,6 a 2,5 mm, más preferiblemente de 0,65 a 2 mm, incluso más preferiblemente de 0,7 a 1,7 mm, e incluso más preferiblemente de alrededor de 0,8 a 1,5 mm.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (iii)a) o la etapa (iii)b) se repite de 2 a 200 veces, preferiblemente de 2 a 100 veces, más preferiblemente de 2 a 80 veces, más preferiblemente de 2 a 70 veces. más preferiblemente 2 a 60 veces, más preferiblemente 2 a 50 veces, más preferiblemente 2 a 40 veces, más preferiblemente 3 a 30 veces, más preferiblemente 3 a 25 veces, más preferiblemente 4 a 20 veces, más preferiblemente 4 a 15 veces, más preferiblemente de 4 a 10 veces, incluso más preferiblemente de 5 a 9 veces y lo más preferiblemente de 5 a 8 veces.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los miocitos cardíacos en el MEHM reciben suficiente oxígeno.

10. Un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM) obtenido mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm.

11. Un músculo del corazón multicapa genomanipulado (MEHM), preferiblemente un parche cardíaco genomanipulado, una bolsa cardíaca diseñada o un cilindro cardíaco genomanipulado, en el que el MEHM comprende (a) colágeno y (b) una mezcla celular de miocitos y no miocitos cardíacos, en el que el MEHM comprende por lo menos 2 capas, en el que el MEHM tiene un grosor de 0,7 mm a 30 mm y en el que el MEHM tiene una distancia entre varillas de 0,1 mm a 5 mm.

12. El MEHM de la reivindicación 11, en el que el MEHM se ha generado mediante un método de estratificación repetitivo y secuencial.

en el que el MEHM se origina a partir de 2 a 200 capas, y

en el que las capas se han fusionado entre sí y, por tanto, amplían el grosor del MEHM.

13. El MEHM de la reivindicación 11 o 12, en el que los miocitos cardíacos en el MEHM reciben suficiente oxígeno.

14. Uso del MEHM obtenido con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el MEHM según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en una fabricaciónin vitrode un miocardio humano genomanipulado, preferiblemente en el que el MEHM tiene la forma tridimensional para coincidir con un defecto miocárdico específico del paciente, más preferiblemente en el que el defecto específico del paciente se evalúa mediante IRM, ultrasonido, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones y/o tomografía por coherencia óptica.

15. Un EHM multicapa (MEHM) obtenido con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el MEHM según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para su uso en reparación cardíaca, preferiblemente para el tratamiento de un paciente que padece insuficiencia cardíaca.