ES2973286T3 - Modelos de trastornos del desarrollo neurológico basados en la reprogramación y usos de los mismos - Google Patents

Modelos de trastornos del desarrollo neurológico basados en la reprogramación y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a iPSC producidas a partir de fibroblastos obtenidos de un sujeto afectado por un trastorno del desarrollo neurológico que conlleva discapacidad intelectual (DI) y/o un trastorno perteneciente al Trastorno del Espectro Autista (TEA) y/o Esquizofrenia (SZ) y sus usos. La presente invención también se refiere a una célula progenitora neural cortical o una célula neuronal glutamatérgica o gabaérgica cortical terminalmente diferenciada o una línea de células madre de la cresta neural, una línea de células madre mesenquimales producida a partir de la iPSC o la línea iPSC. La invención también se refiere a un método para identificar un compuesto para el tratamiento y/o prevención de un trastorno del desarrollo neurológico que conlleva discapacidad intelectual (DI) y/o un trastorno perteneciente al Trastorno del Espectro Autista (TEA) y/o Esquizofrenia (SZ) y a un inhibidor de LSD1 o un inhibidor de HDAC2 para uso en el tratamiento de tales trastornos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Modelos de trastornos del desarrollo neurológico basados en la reprogramación y usos de los mismos
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a inhibidores de LSD1 para su uso en la prevención y/o tratamiento de un trastorno del espectro autista (ASD), en donde el trastorno del espectro autista (ASD) es 7dupASD.
ANTECEDENTES
El potencial de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para la anotación funcional de genomas humanos y el modelado de enfermedades se basa en la alineación de lesiones genéticas bien definidas con datos clínicos a través de fenotipos molecularesin vitro.Para esto, el desafío crítico es doble: i) definir en qué medida los linajes de desarrollo tempranos son informativos sobre las vías relevantes para la enfermedad afectadas por mutaciones genéticas y, ii) evaluar la viabilidad de identificar de manera confiable esas vías más allá de las fuentes de variabilidad inherentes al enfoque basado en iPSC1.
En "iPSC-derived neurons as a higher-throughput readout for autism: promises and pitfalls"2 Prilutsky et al. presentan una descripción general de los esfuerzos para estudiar las neuronas derivadas de iPSC como un modelo para el autismo y exploran la plausibilidad del perfil de expresión genética como un marcador de enfermedad estable y reproducible. La elucidación de las etiologías de las enfermedades y el establecimiento de ensayos de detección robustos, escalables y de alto rendimiento para los trastornos del espectro autista (ASDs) se han visto obstaculizados tanto por la inaccesibilidad del tejido neuronal relevante para la enfermedad como por la heterogeneidad genética del trastorno. Las células neuronales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes con autismo pueden sortear estos obstáculos y servir como modelos celulares relevantes. Hasta la fecha, las células derivadas se caracterizan y analizan mediante la evaluación de sus fenotipos neuronales. Estas caracterizaciones suelen ser específicas de una etiología o carecen de reproducibilidad y estabilidad.
Ghosh et al.3 destacan que las crecientes tasas de trastorno del espectro autista (ASD) y la falta de medicamentos eficaces para tratar sus síntomas principales han llevado a un mayor sentido de urgencia para identificar terapias para este grupo de afecciones del desarrollo neurológico. Sin embargo, el desarrollo de fármacos para el ASD ha sido un desafío debido a una comprensión limitada de su fisiopatología, las dificultades para modelar la enfermedad in vitro e in vivo, la heterogeneidad de los síntomas y la escasez de experiencia previa en el desarrollo clínico. En los últimos años, estos desafíos se han visto mitigados por avances considerables en la comprensión de las formas de ASD provocadas por alteraciones de un solo gen, como el síndrome X frágil y la esclerosis tuberosa. En estos casos han adquirido conocimientos sobre los mecanismos fisiopatológicos subyacentes a estas afecciones. Además, han ayudado al desarrollo de modelos animales y compuestos con potencial para modificar enfermedades en el desarrollo clínico. Además, los estudios genéticos están arrojando luz sobre la fisiopatología molecular del ASD, y nuevas herramientas, tales como las células madre pluripotentes inducidas, ofrecen nuevas posibilidades para la detección de fármacos y el diagnóstico de enfermedades. Finalmente, las colaboraciones a gran escala entre la academia y la industria están comenzando a abordar algunas de las barreras clave para el desarrollo de fármacos para el ASD. En la Figura 6 de la revisión, se presenta el uso de iPSCs para el descubrimiento de fármacos para el ASD: los fibroblastos derivados de pacientes se pueden reprogramar para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) que se pueden diferenciar en neuronas para evaluar los fenotipos celulares asociados con el trastorno del espectro autista (ASD). Estos fenotipos pueden proporcionar una base para la detección de compuestos que reviertan los fenotipos asociados al ASD, lo que podría probarse en modelos animales y debería conducir a la identificación de fármacos candidatos para el desarrollo clínico.
Un avance particularmente interesante en este campo ha sido la demostración de que las iPSCs derivadas de pacientes con trastornos del desarrollo neurológico muestran fenotipos distintos de los de las células de voluntarios sanos. Por ejemplo, Muotri y colaboradores reportaron que las neuronas derivadas de iPSC de pacientes con síndrome de Rett tienen un defecto en la densidad de sinapsis y la actividad de la red4. De manera similar, se ha reportado que las neuronas derivadas de iPSC de pacientes con síndrome de Timothy muestran defectos electrofisiológicos5 Estos estudios sugieren que las iPSCs derivadas de pacientes proporcionan una vía para identificar fenotipos que pueden usarse para el descubrimiento de fármacos6,7.
El documento de Patente WO2011079307 se refiere al síndrome de Rett como un trastorno neurológico progresivo provocado por mutaciones en el gen ligado al cromosoma X que codifica MeCP2. Se utilizan células neurales humanas femeninas inactivadas con cromosoma X derivadas de una célula madre pluripotente inducida. Se describe un método para identificar un compuesto útil en el tratamiento del trastorno neurológico.
El documento de Patente WO2013163455 se refiere a un método para la detección de fármacos candidatos que inhiben una enfermedad neurológica asociada con una mutación de MeCP2, insuficiencia haploide o una mutación genética ligada al cromosoma X o actividad aberrante que comprende inducir iPSC de un sujeto masculino para que se someta a una diferenciación neuronal y analizar las células tratadas para detectar un aumento en redes neuronales, densidad de la columna dendrítica, sinapsis, tamaño del soma, excitación neuronal o señalización de calcio.
El documento de Patente US2007218068 se refiere a la identificación de un gen de susceptibilidad al autismo humano, que puede usarse para el diagnóstico, prevención y tratamiento del autismo y trastornos relacionados, así como para la detección de fármacos terapéuticamente activos. El documento describe que el gen PITX1 en el cromosoma 5 y diversos alelos del mismo están relacionados con la susceptibilidad al autismo y representan nuevos objetivos para la intervención terapéutica.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
La reprogramación celular promete transformar el estudio del impacto funcional de la variación genética humana en la salud y la enfermedad, permitiendo unir genotipos y fenotipos en entornos humanos relevantes para el desarrollo. En la presente memoria, los inventores aplican este paradigma experimental a dos trastornos provocados por variaciones simétricas del número de copias (CNV) de 7q11.23 y que muestran una sorprendente combinación de fenotipos tanto compartidos como simétricamente opuestos: el síndrome de Williams Beuren y el síndrome de microduplicación 7q asociado al trastorno del espectro autista. A través de una cohorte excepcionalmente grande e informativa de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de pacientes libres de transgenes, junto con sus derivados diferenciados, los inventores encuentran que las CNVs de 7q11.23 interrumpen los circuitos transcripcionales en vías relevantes para la enfermedad que ya se encuentran en el estado pluripotente. Después, estas alteraciones se amplifican selectivamente tras la diferenciación en linajes relevantes para la enfermedad, estableciendo de este modo el valor de grandes cohortes de iPSC en la elucidación de vías de desarrollo relevantes para la enfermedad. Además, los inventores definen funcionalmente la cuota de desregulación transcripcional provocada específicamente por desequilibrios de dosis en GTF2I, un factor de transcripción en 7q11.23 que se cree que desempeña un papel crítico en las dos afecciones, que los inventores encontraron asociadas a modificadores represivos clave de la cromatina.
En la presente memoria los inventores se centran en un par paradigmático de síndromes genéticos provocados por variaciones simétricas del número de copias (CNV) en 7q 11.23: síndrome de Williams-Beuren (WBS; OMIM 194050) y síndrome de duplicación de la región de Williams-Beuren (también conocido como síndrome de Somerville-van der Aa, OMIM 609757) que incluye el trastorno del espectro autista (7dupASD)8 WBS y 7dupASD implican, respectivamente, la pérdida o ganancia de 26-28 genes y tienen una prevalencia de entre 1 en 7500 y 1 en 10000910. El WBS se caracteriza por síntomas cardiovasculares y dismorfismo facial, junto con el perfil cognitivo-conductual distintivo que combina hipersociabilidad con capacidades lingüísticas comparativamente bien conservadas, pero con un procesamiento, conteo y planificación visuoespacial gravemente comprometidos911. 7dupASD, por el contrario, presenta diversos grados de ASD que varían desde un deterioro severo del habla hasta autismo en toda regla, junto con dismorfismos craneofaciales, entre los cuales algunos son similares y otros simétricamente opuestos a los de los pacientes con WBS1012. Finalmente, ambos síndromes están asociados con la ansiedad y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (ADHD). Por lo tanto, las dos afecciones son paradigmáticas de un aspecto fundamental de los pares de enfermedades basadas en CNV, a saber, el hecho de que las CNV simétricamente opuestas dan como resultado fenotipos compartidos así como simétricos. Sin embargo, a pesar de la importante información aportada por los modelos de ratón13'16, las vías moleculares específicamente afectadas por las CNV de 7q11.23 en los linajes humanos que son más relevantes para los fenotipos de la enfermedad aún no se han descubierto.
En la presente memoria, los inventores presentan la cohorte más grande de líneas de iPSC de WBS y 7dupASD y linajes diferenciados, en donde los inventores encuentran que la dosis de 7q11.23 afecta los programas transcripcionales relevantes para la enfermedad que ya se encuentran en el estado pluripotente. Estas alteraciones se dividen en otras compartidas y simétricamente opuestas y se exacerban aún más al diferenciarse en linajes relevantes para la enfermedad. Finalmente, los inventores analizan la contribución específica del factor transcripcional GTF2I (también conocido como TFII-I), un gen clave 7q1 1.23, al fenotipo molecular de las dos afecciones en linajes de desarrollo temprano.
Gracias al hallazgo de la presente invención, se proporciona un inhibidor de LSD1 para su uso en la prevención y/o tratamiento de un Trastorno del Espectro Autista (ASD) en donde el Trastorno del Espectro Autista (ASD) es 7dupASD y en donde dicho inhibidor de LSD1 se selecciona del grupo que consiste en:
hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida,
hidrocloruro de (trans)-N1-((1R, 2S)-2-fenilciclopropil)ciclohexan-1,4-diamina,
hidrocloruro de N-[4-[(1S,2R)-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida,
hidrocloruro de W-[4-[(1R,2S)-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida,
hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-4-(1-metil-4-piperidil)benzamida,
dihidrocloruro de N-[4-[frans-2-aminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzamida,
hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]benzamida,
hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]naftalen-1-carboxamida,
hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]naftalen-2-carboxamida,
hidrocloruro de trans N-[(4-(2-aminociclopropil)fenil)]-4-fenil-benzamida,
hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]-2-(1-naftil)acetamida, y
hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]-2-(2-naftil)acetamida,
y estereoisómeros, enantiómeros y diastereómeros de los mismos.
En la presente invención, una patología autista significa una afección que coincide con al menos un criterio en la definición del Trastorno del Espectro Autista (ASD), incluyendo las afecciones asociadas a una de las siguientes lesiones genéticas. De manera similar, esquizofrenia (SZ) significa una afección que coincide con al menos un criterio en la definición de esquizofrenia (SZ), incluyendo las afecciones asociadas a una de las siguientes lesiones genéticas. Las patologías de ASD y SZ están comprendidas en las siguientes:
Categorías OMIM relacionadas con el ASD:
46,xy inversión de sexo 9; srxy9 (616067). sitio de integración auxiliar de abelson 1; ahi1 (608894). acrodisostosis 2 con o sin resistencia hormonal; acrdys2 (614613). homeobox neuroprotector dependiente de actividad; adnp (611386). adenosina desaminasa; ada (608958). deficiencia de adenilosuccinasa (103050). familia de la aldehído deshidrogenasa 1, miembro a3; aldh1a3 (600463). familia de la aldehído deshidrogenasa 5, miembro a1; aldh5a1 (610045). alg 12, s. cerevisiae, homólogo de; alg12 (607144). síndrome de angelman; como región cromosómica del síndrome de Angelman, incluida; ancr, incluida (105830). aniridia; una catarata, congénita, con distrofia corneal de aparición tardía, incluida (106210). anquirina 3; ank3 (600465). homeobox relacionado con aristaless, ligado a x; arx (300382). gen repetido de armadillo eliminado en vcfs; arvcf (602269). artrogriposis múltiple congénita, tipo neurogénico; amcn (208100). artrogriposis, retraso mental y convulsiones; amrs (615553). síndrome de asperger, susceptibilidad a, 1; aspg1 (608638). síndrome de asperger, susceptibilidad a, 2; aspg2 (608631). síndrome de asperger, susceptibilidad a, 3; aspg3 (608781). síndrome de asperger, susceptibilidad a, 4; aspg4 (609954). síndrome de Asperger, ligado al cromosoma X, susceptibilidad a, 1; aspgx1 (300494). síndrome de Asperger, ligado al cromosoma X, susceptibilidad a, 2; aspgx2 (300497). síndrome de disgenesia del tronco encefálico de Athabaskan; síndrome abds bosley-salih-alorainy, incluido; bsas, incluido (601536). atpasa, clase v, tipo 10a; atp10a (605855). trastorno por déficit de atención e hiperactividad, susceptibilidad a, 1 (608903). trastorno por déficit de atención e hiperactividad, susceptibilidad a, 2 (608904). trastorno por déficit de atención e hiperactividad; adha (143465). antígeno australiano (209800). Autismo autismo, susceptibilidad a, 1, incluido; auts1, incluido (209850). autismo, susceptibilidad a, 10; auts10 (611016). autismo, susceptibilidad a, 11; auts11 (610836). autismo, susceptibilidad a, 12; auts12 (610838). autismo, susceptibilidad a, 13; auts13 (610908). autismo, susceptibilidad a, 15; auts15 (612100). autismo, susceptibilidad a, 16; auts16 (613410). autismo, susceptibilidad a, 17; auts17 (613436). autismo, susceptibilidad a, 18; auts18 (615032). autismo, susceptibilidad a, 19; auts19 (615091). autismo, susceptibilidad a, 3; auts3 (608049). autismo, susceptibilidad a, 5; auts5 (606053). autismo, susceptibilidad a, 6; auts6 (609378). autismo, susceptibilidad a, 7; auts7 (610676). autismo, susceptibilidad a, 8; auts8 (607373). autismo, susceptibilidad a, 9; auts9 (611015). autismo, susceptibilidad a, ligado al cromosoma X 1; autsx1 (300425). autismo, susceptibilidad a, ligado al cromosoma X 2; retraso mental autsx2, ligado al cromosoma X, incluido (300495). autismo, susceptibilidad a, ligado al cromosoma X 3; autsx3 (300496). autismo, susceptibilidad a, ligado al cromosoma X 5; autsx5 (300847). síndrome de bannayanriley-ruvalcaba; brrs (153480). síndrome de Beckwith-Wiedemann; región cromosómica del síndrome de beckwithwiedemann de bws, incluida; bwcr, incluido (130650). síndrome de braquidactilia-retraso mental; síndrome de deleción del cromosoma 2q37 de bdmr, incluido (600430). alfa-cetoácido deshidrogenasa quinasa de cadena ramificada; bckdk (614901). deficiencia de cetoácido deshidrogenasa quinasa de cadena ramificada; bckdkd (614923). síndrome de brunner (300615). cadherina 8; cdh8 (603008). canal de calcio, dependiente de voltaje, tipo l, subunidad alfa-1c; cacna1c (114205). canal de calcio, dependiente de voltaje, tipo l, subunidad alfa-1 d; cacna1d (114206). proteína activadora dependiente de calcio para la secreción 2; cadps2 (609978). catecol-o-metiltransferasa; actividad comt de catecol-o-metiltransferasa, baja, en glóbulos rojos, incluida (116790). lipofuscinosis ceroide, neuronal, 8; cln8 (600143). síndrome de carga (214800). proteína 2 de unión al cromodominio de la dna helicasa; chd2 (602119). proteína 8 de unión al cromodominio de la dna helicasa; chd8 (610528). marco de lectura abierto 57 del cromosoma 12; c12orf57 (615140). síndrome de duplicación del cromosoma 15q11-q13 autismo, susceptibilidad a, 4, incluido; auts4, incluido (608636). síndrome de eliminación del cromosoma 15q 11.2 (615656). Síndrome de eliminación del cromosoma 15q 13.3 (612001). síndrome de eliminación del cromosoma 15q25 (614294). síndrome de eliminación del cromosoma 16p11.2, locus 16 del rasgo cuantitativo del índice de masa corporal de 220 kb, incluido; bmiq16, incluido (613444). síndrome de eliminación del cromosoma 16p11.2, autismo de 593 kb, susceptibilidad a 14a, incluido; auts14a, incluido (611913). síndrome de duplicación del cromosoma 16p11.2 autismo, susceptibilidad a, 14b, incluido; auts14b, incluido (614671). síndrome de eliminación del cromosoma 16p12.1, sitio frágil 16p12 de 520 kb, incluido (136570). síndrome de eliminación del cromosoma 16p12.2-p 11.2, 7,1 a 8,7 mb (613604). síndrome de eliminación del cromosoma 16p13.3, proximal (610543). síndrome de duplicación del cromosoma 16p13.3 (613458). cromosoma 17p13.3, centromérico, síndrome de duplicación (613215). síndrome de eliminación del cromosoma 17q12 (614527). síndrome de duplicación del cromosoma 17q21.31 (613533). síndrome de eliminación del cromosoma 1q21.1, 1,35 mb (612474). síndrome de duplicación del cromosoma 1q21.1 (612475). síndrome de duplicación del cromosoma 22q11.2 (608363). síndrome de eliminación del cromosoma 2p16.1-p15 (612513). síndrome de eliminación del cromosoma 2p16.3 esquizofrenia 17, incluido; sczd17, incluido (614332). marco de lectura abierto 58 del cromosoma 3; c3orf58 (612200). síndrome de eliminación del cromosoma 3pter-p25 (613792). síndrome de eliminación del cromosoma 3q 13.31 (615433). síndrome de eliminación del cromosoma 3q29 (609425). síndrome de triplicación del cromosoma 4q32.1-q32.2 (613603). síndrome de eliminación del cromosoma xp22 (300830). función cognitiva 1, social; cgf1 (300082). contactina 4; cntn4 (607280). proteína similar a 2 asociada a contactina; cntnap2 (604569). síndrome de cornelia de lange 1; cdls1 (122470). proteína 2 de unión a contactina; cttnbp2 (609772). síndrome de Cowden 1; gangliocitoma displásico del cerebelo cws1, incluido (158350). craneosinostosis 3; crs3 (615314). síndrome de vómitos cíclicos; síndrome de vómitos cíclicos con enfermedad neuromuscular cvs, incluido (500007). inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1b; cdkn1b (600778). cistinuria cistinuria, tipo a, incluida (220100). proteína 1 que contiene el dominio dcn1; dcun1d1 (605905). anemia por diamante de Blackfan 6; dba6 (612561). toxicidad por 5-@fluorouracilo debido a deficiencia de dihidropirimidina deshidrogenasa, incluida (274270). homeobox 1 sin distal; dlx1 (600029). homeobox 2 sin distal; dlx2 (126255). doblecortina; dcx (300121). quinasa 1a regulada por fosforilación de tirosina de especificidad dual; dyrkla (600855). respuesta de crecimiento temprano 2; egr2 (129010). engrailed 2; en2 (131310). epilepsia, focal familiar, con foci variables; ffevf (604364). epilepsia, focal, con trastorno del habla y con o sin retraso mental; síndrome de fesd landau-kleffner, incluido; lks incluidos (245570). epilepsia, ligada al cromosoma X, con problemas de aprendizaje variables y trastornos de conducta (300491). encefalopatía epiléptica, de inicio en la infancia; eeoc (615369). encefalopatía epiléptica, infantil temprana, 1; eiee1 (308350). encefalopatía epiléptica, infantil temprana, 13; eiee13 (614558). encefalopatía epiléptica, infantil temprana, 6; eiee6 (607208). encefalopatía epiléptica, infantil temprana, 9; eiee9 (300088). deficiencia de épsilon-trimetillisina hidroxilasa; tmlhed (300872). épsilontrimetillisina hidroxilasa; tmlhe (300777). proteína 2 de unión al factor 4e de iniciación de la traducción eucariótica; eif4ebp2 (602224). factor de iniciación de traducción eucariota 4e; eif4e (133440). gen fmr1; sitio frágil de fmr1, tipo ácido fólico, raro, fraxq27.3, incluido; fraxa, incluido (309550). caja de la cabeza del tenedor p1; foxp1 (605515). caja de la cabeza del tenedor p2; foxp2 (605317). síndrome de retraso mental x frágil insuficiencia ovárica primaria, asociada a x frágil, incluido (300624). síndrome de temblor/ataxia del cromosoma x frágil; fxtas (300623). receptor de ácido gamma-aminobutírico, alfa-4; gabra4 (137141). receptor de ácido gamma-aminobutírico, alfa-5; gabra5 (137142). receptor del ácido gamma-aminobutírico, beta-3; gabrb3 (137192). receptor de ácido gamma-aminobutírico, gamma-3; gabrg3 (600233). receptor del péptido liberador de gastrina; grpr (305670). gefirina; Gen de fusión mll/gphn de gphn, incluido (603930). síndrome de Gilles de la Tourette; tics motores crónicos gts, incluidos (137580). receptor de glutamato, ionotrópico, n-metil-d-aspartato, subunidad 2b; grin2b (138252). receptor de glutamato, metabotrópico, 5; grm5 (604102). encefalopatía por glicina; hiperglicinemia gce, neonatal transitoria, incluida; tnh, incluido (605899). glioxalasa i; glo1 (138750). dominio hect y dominio 2 tipo rcc1; herc2 (605837). molécula de adhesión de células de hepatocitos; hepacam (611642). homeobox a1; hoxa1 (142955). homer, drosophila, homólogo de, 1; homer1 homer1a, incluido (604798). Síndrome de infección recurrente por hiper-IgE, autosómico dominante (147060). hiperlexia (238350). integrina, beta-3; trombocitopenia itgb3, aloinmune neonatal, incluida; nait, incluido (173470). locus 2 del rasgo cuantitativo de inteligencia (610294). 1 similar a la proteína accesoria del receptor de interleucina 1; gen de fusión il1rapl1/dmd de il1rapl1, incluido (300206). katanina, subunidad p60, proteína 2 similar a a; katnal2 (614697). gen kiaa0442; kiaa0442 (607270). gen kiaa2022; kiaa2022 (300524). proteína 2 relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad; lrp2 (600073). síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X lubs; mrxsl (300260). desmetilasa 5c específica de lisina; kdm5c (314690). síndrome de macrocefalia/autismo (605309). 2 similar a mage; magel2 (605283). quinasa 1 reguladora de afinidad de mapa/microtúbulos; mark1 (606511). subunidad 12 del complejo mediador; med12 (300188). leucoencefalopatía megalencefálica con quistes subcorticales 1; mlc1 (604004). leucoencefalopatía megalencefálica con quistes subcorticales 2a; mlc2a (613925). leucoencefalopatía megalencefálica con quistes subcorticales 2b, remitente, con o sin retraso mental; mlc2b (613926). retraso mental con deterioro del lenguaje y con o sin características autistas (613670). retraso mental, autosómico dominante 1; síndrome de eliminación del cromosoma 2q23.1 de mrd1, incluido (156200). retraso mental, autosómico dominante 20; síndrome de eliminación del cromosoma 5q14.3 de mrd20, incluido (613443). retraso mental, autosómico dominante 23; mrd23 (615761). Retraso mental, autosómico dominante 26; mrd26 (615834). retraso mental, autosómico dominante 5; mrd5 (612621). retraso mental, autosómico dominante 6; mrd6 (613970). retraso mental, autosómico dominante 7; mrd7 (614104). retraso mental, autosómico dominante, 28; mrd28 (615873). retraso mental, autosómico recesivo 34; mrt34 (614499). retraso mental, autosómico recesivo 38; mrt38 (615516). retraso mental, ligado al cromosoma X 21; mrx21 (300143). retraso mental, ligado al cromosoma X 72; mrx72 (300271). retraso mental, ligado al cromosoma X 98; mrx98 (300912). retraso mental, ligado al cromosoma X, sindrómico, tipo Claes-jensen; mrxscj (300534). protooncogén met; met (164860). proteína 1 del dominio de unión a metil-cpg; Complejo 1 de la proteína de unión a metil-cpg mbd1, incluido (156535). proteína 5 del dominio de unión a metil-cpg; mbd5 (611472). proteína 2 de unión a metil-cpg; mecp2 (300005). microftalmia, aislada 3; mcop3 (611038). microftalmia, aislada 8; mcop8 (615113). microftalmia, sindrómico 1; mcops1 (309800). proteína 2 asociada a microtúbulos; map2 (157130). gen mlc1; mlc1 (605908). modificador, ligado al cromosoma X, para defectos neurofuncionales (309840). síndrome de momo (157980). monoamino oxidasa a; comportamiento antisocial después del maltrato infantil maoa, susceptibilidad a, incluido (309850). mucopolisacaridosis, tipo iiib; mps3b (252920). síndrome de myhre; myhrs (139210). n-acetilglucosaminidasa, alfa-; naglu (609701). síndrome de nance-horan; nhs (302350). gen 2 similar a necdina; ndnl2 (608243). netrina g1; ntng1 (608818). neurexina i; nrxn1 (600565). neurexina ii; nrxn2 (600566). neurexina iii; nrxn3 (600567). neurobeachina; sitio frágil fra13a de nbea, incluido (604889). neuroligina 1; nlgn1 (600568). neuroligina 3; nlgn3 (300336). neuroligina 4, ligada a y; nlgn4y (400028). neuroligina 4; nlgn4 (300427). hipermelanosis nevoide, lineal y verticilada; hiperpigmentación lwnh, cribiforme progresiva y zosteriforme, incluidas; pczh, incluido (614323). subfamilia 1 del receptor nuclear, grupo i, miembro 3; nr1i3 (603881). receptor de opioides, mu-1; oprm1 (600018). cartílagos de la oreja osificados con deficiencia mental, atrofia muscular y cambios óseos (259050). gen de caja emparejada 6; pax6 (607108). proteína 1 que contiene dominio parche; ptchdl (300828). trastorno de la biogénesis de peroxisomas 9b; trastorno de la biogénesis del peroxisoma pbd9b, grupo de complementación 11, incluido; cg11, incluido (614879). Síndrome de Phelan-mcdermid (606232). homólogo de fosfatasa y tensina; síndrome tumoral de hamartoma pten pten, incluido; phts, incluidos (601728). proteína 3 que contiene el dominio de tetramerización del canal de potasio; kctd3 (613272). canal de potasio, dependiente de voltaje, subfamilia h, miembro 5; kcnh5 (605716). canal dependiente de voltaje de potasio, subfamilia relacionada con shal, miembro 2; kcnd2 (605410). síndrome de potocki-lupski; ptls (610883). síndrome similar a Prader-willi; pwls (615547). proteína fosfatasa 2, subunidad reguladora b, isoforma gamma; ppp2r2c (605997). protocadherina 10; pcdh10 (608286). factor de intercambio de nucleótidos de guanina rap; rapgef4 (606058). proteína rab39b asociada a ras; rab39b (300774). gen homeobox de la retina y del pliegue neural anterior; rax (601881). Síndrome de rett, variante congénita (613454). síndrome de rett; síndrome de rett rtt, variante zappella, incluido (312750). proteína ribosomal l10; rpl 10 (312173). síndrome de richieri-costa/guion-almeida (268850). proteína de unión a RNA fox1, c. elegans, homólogo de, 1; rbfox1 (605104). esquizofrenia 13; esquizofrenia sczd13, defecto neurofisiológico en, incluido (613025). esquizofrenia 15; sczd15 (613950). esquizofrenia 4; sczd4 (600850). esquizofrenia; sczd (181500). semaforina 5a; sema5a (609297). sh3 y múltiples dominios de repetición de anquirina 1; shank1 (604999). sh3 y múltiples dominios de repetición de anquirina 2; shank2 (603290). sh3 y múltiples dominios de repetición de anquirina 3; shank3 (606230). síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X tipo Siderius; mrxssd (300263). proteína gtpasa 2c activadora de slit-robo rho; srgap2c (614704). síndrome de smith-lemliopitz; slos (270400). canal de sodio, neuronal tipo i, subunidad alfa; scn1a (182389). canal de sodio, dependiente de voltaje, tipo ii, subunidad alfa; scn2a (182390). canal de sodio, dependiente de voltaje, tipo viii, subunidad alfa; scn8a (600702). familia de portadores de solutos 25 (portador mitocondrial, aralar), miembro 12; slc25a12 (603667). familia de portadores de solutos 35 (portador de udp-n-acetilglucosamina), miembro 3; slc35a3 (605632). familia de portadores de solutos 6 (portador de neurotransmisores, serotonina), miembro 4; slc6a4 (182138). familia de portadores de soluto 9 (intercambiador de sodio/hidrógeno), miembro 9; slc9a9 (608396). deterioro específico del lenguaje 3; sli3 (607134). deterioro específico del lenguaje 4; sli4 (612514). deterioro específico del lenguaje 5; sli5 (615432). proteína 1 de la envoltura nuclear que contiene repeticiones de espectrina; isoforma syne1 cpg2, incluida; cpg2, incluido (608441). trastorno del habla y el lenguaje 1; spch1 (602081). deficiencia de succínico semialdehído deshidrogenasa; ssadhd (271980). supresor de tumorigenicidad 7; st7 (600833). sinapsina i; syn1 (313440). proteína 1 activadora de ras-gtpasa sináptica; syngap1 (603384). sindecano 2; sdc2 (142460). síndrome de temtamy; temtys (218340). tiorredoxina reductasa 2;txnrd2 (606448). síndrome de timothy; ts (601005). topoisomerasa, dna, i; gen de fusión top1/nup98 de top1, incluido (126420). topoisomerasa, dna, ii, beta; top2b (126431). gen tsc1; tsc1 (605284). gen tsc2; tsc2 (191092). esclerosis tuberosa 1; tsc1 (191100). esclerosis tuberosa 2; angiomiolipomas tsc2 tsc2, renales, modificador de, incluido (613254). tirosina hidroxilasa; th (191290). ubiquitina-proteína ligasa e3a; ube3a (601623). upf3, levadura, homólogo de, b; upf3b (300298). síndrome de van maldergem 1; vmlds1 (601390). síndrome velocardiofacial (192430). síndrome de waardenburg, tipo 2e; ws2e (611584). gen wfsl; wfsl (606201). síndrome de duplicación de la región de williams-beuren síndrome de triplicación wbs, incluido (609757). síndrome de williams-beuren; wbs (194050). familia del sitio de integración mmtv tipo sin alas, miembro 2; wnt2 (147870). síndrome similar al wolfram, autosómico dominante; wfsl (614296). xerodermia pigmentosa, grupo de complementación c; xpc (278720). gen xpc; xpc (613208). proteína de dedos de zinc 407; znf407 (615894)
Categorías OMIM relacionadas con la esquizofrenia:
esquizofrenia; sczd (181500). esquizofrenia 12 (608543). esquizofrenia 16; sczd16 (613959). esquizofrenia 15; sczd15 (613950). esquizofrenia 13; esquizofrenia sczd13, defecto neurofisiológico, incluido (613025). esquizofrenia 14 (612361). esquizofrenia 10; sczd10 (605419). alteración en esquizofrenia 2; disc2 (606271). esquizofrenia 11 (608078). esquizofrenia 8; sczd8 (603206). esquizofrenia 5; sczd5 (603175). esquizofrenia 7; sczd7 (603176). esquizofrenia 18; trastorno esquizoafectivo sczd18, incluido (615232). esquizofrenia 1; sczd1 (181510). esquizofrenia 6; sczd6 (603013). esquizofrenia 2; sczd2 (603342). esquizofrenia 3; sczd3 (600511). esquizofrenia 4; sczd4 (600850). esquizofrenia 9; sczd9 (604906). alterado en esquizofrenia 1; disc1 (605210). síndrome de eliminación del cromosoma 2p16.3 esquizofrenia 17, incluido; sczd17, incluido (614332). prolina deshidrogenasa; prodh (606810). sinapsina ii; syn2 (600755). receptor de dopamina d3; drd3 (126451). catecol-o-metiltransferasa; Actividad catecol-o-metiltransferasa comt, baja, en glóbulos rojos, incluida (116790). receptor 2a de 5-hidroxitriptamina; htr2a (182135). receptor de reticulon 4; rtn4r (605566). familia de portadores de solutos 1 (portador de glutamato de alta afinidad neuronal/epitelial), miembro 1; slc1a1 (133550). activador de d-aminoácido oxidasa; daoa (607408). neurexina i; nrxn1 (600565). sh3 y múltiples dominios de repetición de anquirina 3; shank3 (606230). proteína 1 de unión a distrobrevina; dtnbp1 (607145). síndrome de duplicación del cromosoma 1 q21.1 (612475). 1 similar a quitinasa 3; chi3l1 (601525). apolipoproteína l-iv; apo14 (607254). síndrome de eliminación del cromosoma 1q21.1, 1,35-mb (612474). daminoácido oxidasa; dao (124050). neuregulina 1; factor de crecimiento glial 2 de nrg1, incluido; ggf2, incluido (142445). apolipoproteína l-ii; apol2 (607252). síndrome de eliminación del cromosoma 17q12 (614527). 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa; mthfr (607093). homólogo 1 del oncogén viral del timoma murino v-akt; akt1 (164730). síndrome de digeorge; región cromosómica del síndrome de digeorge dgs, incluida; dgcr, incluido (188400). retraso mental, ligado al cromosoma X 30; mrx30 (300558). receptor colinérgico, nicotínico neuronal, alfa polipéptido 7; chrna7 (118511). hiperprolinemia, tipo i; hpi (239500). síndrome similar al wolfram, autosómico dominante; wfsl (614296). enfermedad de darier-white; enfermedad de Dar Darier, tipo hemorrágico acral, incluida (124200). proteína 8 que contiene el dominio dhhc con dedo de zinc; zdhhc8 (608784). regulador 6 del transporte de iones que contiene el dominio fxyd; fxyd6 (606683). rna antisentido de daoa; daoaas (607415). casete de unión a atp, subfamilia a, miembro 13; abca13 (607807). sordera, autosómica recesiva 47; dfnb47 (609946). factor neurotrófico derivado del cerebro; bdnf (113505). receptor 6 asociado a aminas traza; taar6 (608923). receptor de dopamina d4; drd4 (126452). apolipoproteína e; apoe apolipoproteína e, deficiencia o defecto de, incluida (107741). sinapsina iii; syn3 (602705). proteína fosfatasa 3, subunidad catalítica, isoforma gamma; ppp3cc (114107). canal de potasio, activado por calcio, conductancia intermedia/pequeña, subfamilia n, miembro 3; kcnn3 (602983). serina racemasa; srr (606477). síndrome de duplicación del cromosoma 16p13.3 (613458). síndrome de eliminación del cromosoma 16p13.3, proximal (610543). factor sensible a n-etilmaleimida; nsf (601633). interactor clatrina 1; clint1 (607265). factor x asociado a translina; tsnax (602964). glutamato-cisteína ligasa, subunidad modificadora; gclm (601176). gen kiaa0513; kiaa0513 (611675). notch, drosophila, homólogo de, 4; Sitio 3 de integración del virus del tumor mamario de ratón notch4, incluido (164951). homólogo 4 del oncogén viral de la leucemia eritroblástica aviar v-rbo-b2; erbb4 (600543). receptor de dopamina d2; drd2 (126450). choque térmico proteína 6 de 70 kd; hspa6 (140555). receptor 2 del péptido intestinal vasoactivo; vipr2 (601970). síndrome de duplicación del cromosoma 15q 11-q13 autismo, susceptibilidad a, 4, incluido; auts4, incluido (608636). receptor colinérgico, muscarínico, 1; chrm1 (118510). neuregulina 3; nrg3 (605533). síndrome de eliminación del cromosoma 15q13.3 (612001). choque térmico proteína 7 de 70 kd; hspa7 (140556). síndrome de duplicación del cromosoma 16p11.2 autismo, susceptibilidad a, 14b, incluido; auts14b, incluido (614671). síndrome de duplicación del cromosoma 22q11.2 (608363). gefirina; gen de fusión mll/gphn de gphn, incluido (603930). relacionado con swi/snf, asociado a matriz, regulador de cromatina dependiente de actina, subfamilia a, miembro 2; smarca2 (600014). gen kiaa0391; kiaa0391 (609947). receptor acoplado a proteínas 50 g; gpr50 (300207). proteína 3 del dominio neuronal pas; npas3 (609430). factor de transcripción 2 del linaje de oligodendrocitos; olig2 (606386). síndrome velocardiofacial (192430). trastorno afectivo principal 1; mafd1 (125480). glutamato-cisteína ligasa, subunidad catalítica; gclc (606857). reelin; reln (600514). proteína de fasciculación y elongación zeta 1; fez1 (604825). síndrome de eliminación del cromosoma 16p11.2, autismo de 593 kb, susceptibilidad a 14a, incluido; auts14a, incluido (611913). gen 8 de la región crítica del síndrome de digeorge; dgcr8 (609030). proteína de activación de tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa, isoforma épsilon; ywhae (605066). gen mlc1; mlc1 (605908). receptor de dopamina d1; drd1 (126449). proteína de unión a nucleótidos de guanina, polipéptido de actividad activadora alfa, tipo olfativo; gnal (139312). fosfodiesterasa 4b, específica de camp; pde4b (600127). receptor de glutamato, metabotrópico, 3; grm3 (601115). proteína adaptadora (neuronal) de óxido nítrico sintasa 1; nos1ap (605551). receptor de glutamato, ionotrópico, n-metil-d-aspartato, subunidad 1; grin1 (138249). homeobox 2b similar a emparejado; phox2b (603851). proteína quinasa ii-beta dependiente de calcio/calmodulina; camk2b (607707). neurexina ii; nrxn2 (600566). elemento retrotransponible line 1; lre1 (151626). 1 similar a nde1; ndel1 (607538). triptófano hidroxilasa 1; tph1 (191060). óxido nítrico sintasa 1; óxido nítrico sintasa nos1, neuronal, incluida (163731). habilidad manual, relativa; hsr (139900). monoaminooxidasa b; maob (309860). tembloroso, ratón, homólogo de; qki (609590). síndrome de eliminación del cromosoma 3q29 (609425). ataxina 1; atxn1, marco de lectura alternativo, incluido (601556). sitio de integración del auxiliar de abelson 1; ahi1 (608894). anomalías congénitas de los riñones y del tracto urinario, susceptibilidad a; cakut (610805). dna metiltransferasa 1; dnmt1 (126375). factor silenciador de la transcripción re1; rest (600571). oncogén viral del sarcoma aviar v-src (schmidt-ruppin a-2); src (190090). autismo autismo, susceptibilidad a, 1, incluido; auts1, incluido (209850). metabolismo de fármacos, deficiente, metabolismo de fármacos relacionado con cyp2d6, ultrarrápido, relacionado con cyp2d6, incluido (608902). Deficiencia de leucodistrofia pseudoarilsulfatasa metacromática a, incluida (250100). trastorno depresivo principal; trastorno afectivo estacional mdd, incluido; triste, incluido (608516). material pericentriolar 1; gen de fusión pcm1/ret de pcm1, incluido (600299). canal de potasio, dependiente de voltaje, subfamilia h, miembro 2; kcnh2 (152427). distrofia muscular, tipo Becker; bmd (300376). apolipoproteína l-i; apol1 (603743). gen 1 inducido por ácido retinoico; rai1 (607642). familia de portadores de solutos 6 (portador de neurotransmisores, serotonina), miembro 4; slc6a4 (182138). dopamina betahidroxilasa, plasma; dbh (609312). factor neurotrófico ciliar; cntf (118945). proopiomelanocortina; melanotropina pomc, incluida (176830). proteína precursora de amiloide beta a4; app (104760). proteína 2 de unión a metil-cpg; mecp2 (300005). discinesia tardía (272620). receptor 4 de 5-hidroxitriptamina; htr4 (602164). regulador de la señalización de la proteína g 4; rgs4 (602516). retraso mental, ligado al cromosoma X, sindrómico, tipo raymond; mrxsr (300799). gen de fusión chrna7/fam7a; chrfam7a (609756). trastorno afectivo principal 2; mafd2 (309200). deficiencia de cetoácido deshidrogenasa quinasa de cadena ramificada; bckdkd (614923). frizzled, drosophila, homólogo de, 3; fzd3 (606143). neurocondrina; ncdn (608458). epilepsia, lóbulo frontal nocturno, 2; enfl2 (603204). fosfolipasa c, beta-1; plcb1 plcb1a, incluido (607120). proteasa 14 específica de ubiquitina; usp14 (607274). receptor 2c de 5-hidroxitriptamina; htr2c (312861). factor de crecimiento epidérmico; egf (131530). proteína fosfatasa 1, subunidad reguladora 1b; ppp1r1b (604399). hermanamiento, monocigótico (276410). receptor 3a de 5-hidroxitriptamina; htr3a (182139). receptor de colecistoquinina a; cckar (118444). leucoencefalopatía con ataxia; lkpat (615651). enfermedad de parkinson 17; park17 (614203). receptor de glutamato, metabotrópico, 2; grm2 (604099). búsqueda de la novedad de un rasgo de la personalidad asociado al comportamiento de toma de riesgos, incluido (601696). receptor de retinoides x, gamma; rxrg (180247). parvalbúmina; pvalb (168890). factor de transcripción sp4; sp4 (600540). autismo, susceptibilidad a, ligado al cromosoma X 5; autsx5 (300847). malformaciones del corazón conotruncal; truncus arteriosus communis cthm, incluido (217095). receptor de glutamato, ionotrópico, kainato 1; grik1 (138245). calcitonina/polipéptido relacionado con calcitonina, alfa; péptido relacionado con el gen calcitonina calca, incluido; cgrp, incluido (114130). nadph oxidasa 1; nox1 (300225). receptor de retinoides x, beta; rxrb (180246). síndrome de eliminación del cromosoma 16p12.1, sitio frágil 16p12 de 520 kb, incluido (136570). proteína 9 que contiene el dominio dhhc con dedo de zinc; zdhhc9 (300646). calcificación de ganglios basales, idiopática, 1; ibgc1 (213600). síndrome de duplicación del cromosoma xq28 (300815). cartílagos de la oreja osificados con deficiencia mental, atrofia muscular y cambios óseos (259050). receptor de ácido retinoico, beta; rarb (180220). dishevelled 1; dvl1 (601365). glutamato descarboxilasa 1; gad1 (605363). neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro 3; nbia3 (606159). enfermedad renal quística medular 1; mckd1 (174000). receptor de dopamina d5; distonía drd5, cervical primaria, incluida (126453).
proteína 1 activadora de ras-gtpasa sináptica; syngapl (603384). receptor del factor 2 estimulante de colonias, alfa; csf2ra (306250). síndrome de saethre-chotzen; síndrome de scs saethre-chotzen con anomalías del párpado, incluido (101400). proteína asociada a sinaptosomas, 25 kd; snap25 (600322). autoanticuerpos tiroideos de tiroiditis de Hashimoto, incluidos (140300). receptor del ácido gamma-aminobutírico, gamma-2; gabrg2 (137164). demencia frontotemporal; complejo ftd pick, incluido (600274). neuropéptido y; npy (162640). t-box 11; tbx1 (602054). Síndrome de Phelan-mcdermid (606232). familia de portadores de solutos 6 (portador de neurotransmisores, dopamina), miembro 3; slc6a3 (126455). cadena opuesta de ataxina 8; atxn8os (603680). ciclos circadianos de producción locomotora kaput; clock (601851). cadena ligera de ferritina; ftl (134790). hendidura orofacial 1; ofc1 (119530). gen wfs1; wfs1 (606201). arilsulfatasa a; arsa (607574). subfamilia de receptores nucleares 0, grupo b, miembro 1; nr0b1 (300473). enfermedad de huntington; hd (143100). enfermedad de alzheimer; enfermedad de alzheimer ad, familiar, 1, incluida; ad1, incluido (104300). apolipoproteína l-vi; apol6 (607256). apolipoproteína l-v; apol5 (607255). heparán sulfato 6-o-sulfotransferasa 3; hs6st3 (609401). micro rna 130b; mir130b (613682). receptor 5 asociado a amina traza; taar5 (607405). secuencia amplificada 1 del carcinoma de mama; bcas1 (602968). apolipoproteína l-iii; apol3 (607253). proteína 141 que contiene dominio en espiral; ccdc141 (616031). proteína 1 en espiral rica en arginina/serina; rsrc1 (613352). proteína 1 que interactúa con daz; zip1 (608671). proteína activadora de rho gtpasa 18; arhgap18 (613351). receptor 85 acoplado a proteínas g; gpr85 (605188). homer, drosophila, homólogo de, 3; homer3 (604800). rogdi, drosophila, homólogo de; rogdi (614574). homer, drosophila, homólogo de, 2; homer2 homer2a, incluido (604799). síndrome de kohlschutter-tonz; ktzs (226750). guanilato quinasa asociada a membrana, que contiene dominios ww y pdz, 1; magi1 (602625). síndrome de braquidactilia-retraso mental; síndrome de eliminación del cromosoma 2q37 bdmr, incluido (600430). glicoproteína asociada a mielina; mag (159460). familia de portadores de solutos 25 (portador mitocondrial, transportador de citrato), miembro 1; slc25a1 (190315). proteína 88a que contiene dominio en espiral; ccdc88a (609736). homer, drosophila, homólogo de, 1; homer1 homer1a, incluido (604798). proteína de unión a tatabox; tbp (600075). proteína 2 que interactúa con traf3; traf3ip2 (607043). Homocistinuria debido a deficiencia de actividad de n(5,10)-metilenetetrahidrofolato reductasa mthfr, tipo termolábil, incluida (236250). nude, a. nidulans, homólogo de, 1; nde1 (609449). síndrome de acoffin-lowry; cls (303600). glucógeno sintasa quinasa 3-beta; gsk3b (605004). proteína proteolípida 1; plp1 dm20, incluido (300401). ataxia espinocerebelosa 1; sca1 (164400)
Los presentes hallazgos, ejemplificados utilizando como modelo las afecciones WBS y 7dupASD, pueden extrapolarse a cualquier patología autista y esquizofrénica. De hecho, aunque el ASD y el SZ pueden ser provocados por CNV o mutaciones puntuales en una gran cantidad de genes o loci (que actualmente suman los 275 loci o genes enumerados anteriormente), los síntomas centrales del ASD y la SZ son muy similares independientemente de la CNV /mutación causante. Esto sugiere un alto grado de convergencia molecular en el mecanismo patológico y respalda muchos esfuerzos actuales para definir nodos de desregulación que, si bien se identificaron originalmente en un subconjunto específico de ASD o SZ, pueden obtenerse también en otras formas de ASD o SZ incluso cuando son provocados por una lesión genética diferente17'20.
En la presente invención, una célula progenitora neural cortical significa una célula derivada de iPSC humana tras su diferenciación en el linaje neural y que expresa al menos uno de los siguientes marcadores definitorios: PAX6, SOX2, FOXG1, OTX2, CDC42, RAC1, ZO1.
En la presente invención, una célula madre de la cresta neural significa una célula derivada de iPSC humana tras su diferenciación en el linaje de la cresta neural y que expresa al menos ambos de los siguientes marcadores definitorios: HNK1 y NGFR.
En la presente invención, una célula madre mesenquimatosa significa una célula derivada de iPSC humana tras su diferenciación en el linaje mesenquimatoso y que expresa al menos ambos de los siguientes marcadores definitorios: CD44 y CD73.
En la presente invención, "analizar células derivadas de iPSC neurales diferenciadas para determinar su morfología y/o función" significa evaluar cuantitativamente redes neuronales, densidad de espinas dendríticas, sinapsis, tamaño de soma, excitación neuronal o señalización de calcio, parámetros electrofisiológicos.
Los trastornos del desarrollo neurológico abarcan una amplia gama de enfermedades humanas caracterizadas por un desarrollo anormal del sistema nervioso, especialmente de la corteza. Los trastornos del espectro autista (ASD), la esquizofrenia (SZ) y la discapacidad intelectual (ID) son los principales trastornos del neurodesarrollo, que muestran dominios de déficit específicos así como compartidos.
En la presente invención, un inhibidor de LSD1 se describe, por ejemplo, en los documentos de Patente WO2013057322, WO2011131576, WO2014086790, WO2012135113 y solicitudes de Patente EP 14170656.4, EP14193312.7 y EP 14183755.9, incluidas por referencia. En particular, la fórmula general y las diversas definiciones de sustituyente, incluyendo las realizaciones preferidas descritas en dichos documentos, forman parte de la presente solicitud.
El inhibidor de LSD1 para su uso según la presente invención se selecciona del grupo que consiste en: hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida, hidrocloruro de (trans)-N1-((1R,2S)-2-fenilciciopropil)ciclohexan-1,4-diamina, hidrocloruro de N-[4-[(1S,2R)-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida, hidrocloruro de W-[4-[(1R,2S)-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida, hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-4-(1-metil-4-piperidil)benzamida, dihidrocloruro deN-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzamida, hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]benzamida, hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]naftaleno-1-carboxamida, hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]naftalen-2-carboxamida, hidrocloruro de trans N-[(4-(2-aminociclopropil)fenil)]-4-fenil-benzamida, hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]-2-(1-naftil)acetamida, y hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]-2-(2-naftil)acetamida, y estereoisómeros, enantiómeros y diastereómeros de los mismos.
En la presente invención, un inhibidor de HDAC2 es cualquier inhibidor de HDAC2 conocido, por ejemplo aquellos descritos en Dokmanovic M et al.21 y Kim HJ et al.22.
La invención se ilustrará mediante ejemplos no limitantes con referencia a las siguientes figuras.
Figura 1 Cohorte de pacientes y expresión del intervalo del gen 7q11.23 según el genotipo(a) Cohorte de pacientes reclutados, incluyendo el número de clones de iPSC independientes derivados por paciente y un diagrama que muestra el repertorio de síntomas clínicos y rasgos de comportamiento cognitivo. Mi significa leve, Mo significa moderado. Cada afección genética y el tipo de reordenamiento genético se representan con colores específicos: eliminación típica de WBS (WBS, rojo), eliminación atípica (AtWBS, naranja) y microduplicaciones de 7q 11.23 (7dupASD, azul). También se muestran líneas de iPSC derivadas de individuos sanos (CTL, verde; R significa relativo), así como controles externos (EXT) añadidos para el análisis de expresión diferencial. (b) Representación esquemática del intervalo genético de WBS y los límites de las CNVs detectadas por aCGH. (c) Cuantificación con nanocuerdas de la expresión de genes incluidos en el intervalo genómico de WBS en el estadio de iPSC. Para cada gen, se muestran 4 contenedores (1 por genotipo). 1er contenedor: AtWBS; 2° contenedor: WBS; 3er contenedor: CTL; 4° contenedor: 7dupASD. Las barras de error representan la desviación estándar en cada afección genética, mientras que las barras horizontales sobre las comparaciones respectivas indican la significancia estadística. FOV significa Campos de visión. También se incluyeron dos genes cercanos fuera de la CNV (véase la Figura 13a para genes inmediatamente flanqueantes).
Figura 2 Análisis de los cambios transcriptómicos provocados por las CNVs de 7q11.13 e identificación de la contribución transcripcional de GTF2I.(a) Número y distribución de genes expresados diferencialmente (DEGs) entre las tres comparaciones. (b) Principales enriquecimientos más específicos para procesos biológicos GO entre los DEGs. Se filtraron las categorías de padres con categorías de hijos enriquecidas; el código de color indica categorías de padres que se han seleccionado aproximando la mejor combinación de padres que no se superponen. Los DEGs muestran un enriquecimiento de las categorías que recapitulan todos los aspectos de las enfermedades. (c-d) Validación de los niveles de GTF2I en líneas celulares knocked-down (KD) de GTF2I en ambos mRNA (RNAseq) (FPKM significa fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) (d) y nivel de proteínas, incluyendo el análisis de densitometría. (c).El efecto de la infección sobre los niveles de proteína y mRNA de GTF2I fue estadísticamente significativo según la prueba T pareada de dos colas. Scr significa horquilla scramble; sh significa horquilla corta frente a GTF2I. (e) Proporción de DEGs que son atribuibles a GTF2I, considerando el cambio porcentual (FC) (concordante) en KD, el análisis de expresión diferencial de las líneas KD o la regresión lineal con los niveles de expresión de GTF2I en todo el conjunto de datos de KD. FDR significa tasa de descubrimiento falso (f) Los principales procesos biológicos más específicos enriquecidos en el subconjunto de DEGs atribuibles a GTF2I (cambio porcentual promedio superior al 20%).
Figura 3 Complejo proteico de GTF2I y su ocupación en todo el genoma(a) Tinción con azul-comassie del complejo de GTF2I inmuno-precipitado en líneas de iPSC de WBS r, control y 7dupASD iPSC representativas (una por genotipo). Los asteriscos (*) indican las bandas correspondientes a GTF2I. MW significa peso molecular; IgG significa inmunoglobulina G. (b) Validación de la interacción de GTF2I con LSD1. (c) Distribución de picos de GTF2I conservados en elementos funcionales identificados en la segmentación combinada del genoma H1 de ENCODE. IP significa inmunoprecipitación. (d) Distribución de GTF2I en todos los genes que están unidos en todas las muestras de un genotipo determinado. (e) Distribución de los objetivos principales de GTF2I según su nivel de expresión, mostrando para cada intervalo de expresión la posición del pico en relación con el sitio de inicio de la transcripción (TSS). (f) Mapa de calor de las señales de LSD1 (primera columna) y GTF2I (en tres líneas de control) en una ventana de /-5 kb alrededor de los picos de LSD1. (g) Mapa de calor de señales de LSD1 y GTF2I en una ventana de /-5 kb alrededor de picos GTF2I conservados.
Figura 4 GTF2I reprime BEND4 de una manera dependiente de la dosis.(a) Expresión de BEND4 en iPSC medida mediante RNA-seq. (b) Expresión de BEND4 en todas las líneas de iPSC medida mediante RT-qPCR. Las barras de error representan la variación entre líneas de cada genotipo y los asteriscos indican significación estadística según una prueba T de dos colas (*: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001). (c) Validación por RT-qPCR de eliminaciones de GTF2I utilizando diferentes horquillas cortas (sh2, sh52 y sh08) en al menos dos líneas por genotipo. (d) Validación por RT-qPCR de los niveles de mRNA de BEND4 en las líneas celulares sh2, sh52, sh08-GTF2I eliminadas. (e) Medición de RNA-seq de la expresión de BEND4 en las mismas líneas celulares, (f) Medición por RT-qPCR de BEND4 tras la inhibición irreversible de LSD1 a partir del día 0 (D0) y el día 4 (D4) de la formación del cuerpo embrioide en una línea de iPSC de control, mostrando que en ambos estadios, ambos inhibidores conducen a la regulación positiva de BEND4. Todos los niveles de RT-qPCR se reportan como porcentajes de GAPDH. RA significa ácido retinoico. IEO-DDP significa IEO Drug Discovery Program. En los paneles c-d-f,las barras de error representan variaciones entre 2 réplicas técnicas. Se obtuvieron resultados similares con el gen Vimentin (véase Figura 10). (g) La correlación global de las puntuaciones z genéticas agrupa las muestras según los antecedentes genéticos en lugar de si fueron tratadas con DMSO o con el inhibidor, lo que indica que la inhibición del LSD1 es muy específica en su efecto. (h) En cambio, tras la eliminación del LSD1 utilizando horquillas cortas, se toman muestras según el tratamiento, lo que indica que la eliminación del LSD1 tiene un efecto mucho más dramático. (i) Entre los genes desregulados en las enfermedades y atribuibles (directa o indirectamente) a GTF2I, 30 muestran una expresión diferencial estadísticamente significativa (utilizando una prueba T pareada) tras el tratamiento con LSD1.
Figura 5 Derivación y caracterización transcripcional de linajes relevantes para enfermedades(a) Esquema de protocolos de diferenciación de iPSC hacia rosetas polarizadas (arriba) o cresta neural (NCSC) y células madre mesenquimatosas (MSC) (abajo). FBS significa suero fetal bovino. (b) Las células madre/progenitoras corticales derivadas de iPSC recapitulan la aparición de poblaciones de células madre en la corticogénesis humana. Las rosetas se tiñeron para detectar marcadores de proliferación (Ki67), mitóticos (fosfohistona H3) y células madre neurales (NESTIN, ZO1 y PAX6) (arriba). La especificación predeterminada del prosencéfalo se evidencia mediante la expresión de los marcadores OTX2, FOXG1 y SOX2 (abajo). (c) Principales enriquecimientos para procesos biológicos<g>O entre los DEGs de NPC. (d-e-f-g) Caracterización de células madre de la cresta neural y células madre mesenquimatosas específicas de cada paciente. (d) Análisis de citometría de flujo de NCSC para los marcadores HNK1 y NGFR. Se muestran cuatro líneas representativas de cada genotipo. (e) Principales enriquecimientos para procesos biológicos GO entre los DEGs de NCSC. (f) Análisis de citometría de flujo de MSCs para células CD73+ y CD44+ en el día 10 de diferenciación. (g) Principales enriquecimientos más específicos para procesos biológicos entre los DEGs de MSC. (h) Agrupación jerárquica no supervisada de correlaciones entre transcriptomas completos de MSCs, lo que muestra que las muestras se agrupan según su genotipo. (i) El análisis de la vía de ingenio en DEGs de MSC revela una red molecular enriquecida para el desarrollo del sistema cardiovascular. (j) Expresión de miembros clave de la red en MSC. Para cada gen, se muestran 4 contenedores (1 por genotipo). 1er contenedor: AtWBS; 2° contenedor: WBS; 3er contenedor: CTL; 4° contenedor: 7dupASD. Las barras de error representan la desviación estándar, mientras que las barras horizontales representan la significancia estadística.
Figura 6 Retención específica del linaje de DEGs de iPSC.(a) Superposición de DEGs identificados en cada linaje. (b-c-d) Para cada linaje diferenciado, el mapa de árbol de enriquecimientos que se habían encontrado entre los DEGs de iPSC (Figura 2b) se reproduce, trazando como un mapa de calor la proporción de DEGs de iPSC en cada categoría retenida a través de la diferenciación.
Figura 7 (a)Representación gráfica de la retención específica del linaje de DEGs. HDF: Fibroblasto Derivado Humano. (b) Representación esquemática de los datos recopilados en WikiWilliams/7qGB de acceso abierto.
Figura 8 Un enfoque para aislar progenitores corticales que expresan FOXG1 derivados de iPSC.La figura describe la prueba de principio de experimentos destinados a aislar progenitores corticales mediante selección y clasificación FACS. Brevemente, los inventores diseñaron un constructo lentiviral (esquema superior izquierdo) que expresa GFP a partir de un promotor ubicuo y el gen de resistencia a la puromicina bajo el control del promotor FOXG1. Los paneles de la derecha muestran la infección de una línea de iPSC de control (reprogramada a partir de un familiar de un paciente con WBS) con diferentes concentraciones de este vector lentiviral, y la evaluación de la eficacia de la infección mediante fluorescencia de GFP (tanto por inmunofluorescencia como por FACS, paneles superior e inferior respectivamente).).
Figura 9 Ensayo de puntuación basado en qRT-PCR para la detección de HTS.La figura muestra el flujo de trabajo automatizado que los inventores ya validaron para la puntuación de la expresión de GTF2I y BAZ1B (mediante qRT-PCR multiplex) en iPSC cultivadas en un formato de 96 pocillos. Este es el formato en el que se realizará la detección. (a) El panel superior izquierdo muestra que, con una prueba muy sólida de 5 réplicas, los inventores pudieron medir consistentemente los niveles de GTF2I en 3 concentraciones diferentes de iPSC sembradas (de 6000 a 12000), encontrando la relación lineal esperada entre el número de células y la expresión de GTF2I, con excelente consistencia en diferentes pocillos de la misma placa. (b) El panel superior derecho muestra que incluso entre pocillos de diferentes placas, las mediciones de qRT-PCR son extremadamente consistentes. El panel central derecho muestra que la expresión tanto de GTF2I como de BAZ1B se puede medir de manera muy reproducible en 2 placas diferentes sembradas con iPSC reprogramadas de pacientes con WBS. Los niveles de expresión se compararon con los de las células iPSC de control de tipo nativo y se confirmó la reducción a la mitad reproducible de la dosis de expresión en iPSC de WBS tanto para GTF2I como para BAZ1B. Las tablas a continuación muestran la cuantificación de estos datos, mostrando un coeficiente de variación (CV) mínimo en las mediciones intra e interplaca.
Figura 10 (a) La regulación de BEND4 mediada por GTF2I depende de LSD1.(panel superior) Los niveles de BEND4 aumentan tras la inhibición de LSD1 utilizando dos inhibidores irreversibles de LSD1 hasta una concentración final de 5 uM (Oryzon) y 10 uM (DDP26095). Los tratamientos se realizaron durante 5 días en el día 0 y el día 4 de un ensayo de formación de cuerpos embrioides (EBs). Se obtuvieron resultados similares para ICAM1 y VlM (vimentina) sin (panel inferior izquierdo) o en presencia de ácido retinoico (RA), añadido a una concentración final de 10 uM durante 5 días (panel inferior derecho). (b) GTF2I y LSD1 regulan negativamente la expresión de genes objetivo. Modelo propuesto que representa el mecanismo de acción del complejo GTF2I/LSD1 en genes objetivo (BEND4 se muestra como un objetivo representativo). El complejo GTF2I-LSD1 reprime los genes objetivo mediante la unión a sus regiones promotoras, como se ejemplifica en el panel superior cuando se administra a las células una horquilla de scrambled sh RNAi de control. El panel central muestra el alivio de la represión transcripcional tras la eliminación de GTF2I lograda con una horquilla de sh RNAi específica dirigida a GTF2I. El panel inferior muestra el mismo resultado obtenido mediante la inhibición química del LSD1 con los dos inhibidores que se muestran en Figura 10a.
Figura 11 Establecimiento de líneas de iPSC inducibles clónales transducidas con NGN2.(a) Representación esquemática de la estrategia para establecer líneas clonales en donde el transgén NGN2 y su coactivador se integren de forma estable mediante transducción lentiviral. Las líneas de iPSC infectadas se expanden, se clasifican como células individuales para crear clones y, posteriormente, se analizan de 3 a 5 clones por línea para determinar la activación de GFP. Después, los clones positivos para GFP se expanden y congelan para experimentos posteriores de diferenciación a gran escala. El DNA genómico se puede extraer para cuantificar el número de sucesos de integración entre clones mediante PCR digital. (b) La señal de GFP se puede ver desde el día 2 después de la inducción, mientras que en el día 21 las líneas transducidas con NGN2 clonal inducidas expresan marcadores neuronales maduros tales como MAP2, TUJ1 y el marcador glutamatérgico VGLUT.
Figura 12 Derivación de líneas de iPSC.(a) Representación esquemática de la reprogramación mediada por mRNA. (b) Seguimiento de GFP de la transición mesenquimatosa a epitelial. (c) Para cada afección genética, expresión de fosfatasa alcalina (ALP) mediante inmunohistoquímica, inmunofluorescencia para marcadores de pluripotencia y tinción de tres teratomas representativos derivados de iPSC que expresan marcadores específicos para las tres capas germinales (derecha). H&E: hematoxilina & eosina. DES: desmina. CK: citoqueratina. (d) Mediciones de nanocuerdas para marcadores de pluripotencia. FOV: campo de visión.
Figura 13 Expresión de genes de la región de WBS en iPSC.(a) Expresión de genes incluidos en y que las flanquean directamente las CNVs medida mediante RNA-seq (véase la validación de nanocuerdas en la Figura 1c). Para cada gen, se muestran 4 contenedores (1 por genotipo). 1er contenedor: AtWBS; 2° contenedor: WBS; 3er contenedor: CTL; 4° contenedor: 7dupASD. El orden de los genes refleja su posición cromosómica relativa y las barras de color horizontales indican qué genes están incluidos en las CNVs. (b-c-d) transferencia de Western (b) y análisis de densitometría (c-d) de los niveles de proteína GTF2I y BAZ1B en un subconjunto representativo de líneas de iPSC. Los cambios en los niveles de proteína GTF2I son estadísticamente significativos según una prueba t de dos colas (*: p<0,05, **: p<0,01); las diferencias en los niveles de proteína BAZ1B, aunque muestran una tendencia clara, no son estadísticamente significativas en este ensayo. FPKM: Fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados.
Figura 14 Perfil transcripcional de iPSCs derivadas de pacientes y control.(a-b-c) Procesos biológicos GO enriquecidos entre DEGs entre control frente a 7dupASD (a),WBS frente a control (b) y WBS frente a 7dupASD (c). (d) Enriquecimiento para procesos biológicos GO entre la unión de DEGs al excluir del análisis las líneas de control externo.
Figura 15 Genes expresados diferencialmente de manera simétrica en iPSC de WBS y 7dupASD.
Figura 16 Comparación de diferentes anticuerpos analizados para ChIP-Seq y ensayos de inmunoprecipitación,(a) Validación por transferencia Western de la eficacia de la inmunoprecipitación de dos anticuerpos de GTF2I diferentes en una línea de iPSC de control. (b) La mayoría de los objetivos genéticos identificados con el anticuerpo Bethyl también se identifican con los otros anticuerpos. (c) Gráfico de enriquecimiento que muestra la distribución de lecturas en todo el genoma; las muestras que utilizan anticuerpos Bethyl tienen un grado de enriquecimiento claramente mayor en comparación con las otras muestras. (d) Validación de ChIP-qPCR de objetivos GTF2I centrales y sensibles a la dosis. Se han utilizado los promotores EOMES y SNAP25 como controles negativos. Para cada gen, se muestran 3 contenedores (1 por genotipo). 1er contenedor: WBS; 2° contenedor: CTL; 3er contenedor: 7dupASD.
Figura 17 Caracterización de líneas de NCSC y MSC derivadas de líneas de iPSC de WBS, atWBS, 7dupASD y control.La microscopía de contraste de fases de NCSC (a) y MSC (b) muestra una morfología similar entre los cuatro genotipos. (c) El análisis de inmunofluorescencia indica positividad para dos marcadores de NCSC (HNK1 y NGFR) en una línea de NCSC representativa derivada de iPSC. DAPI tiñe los núcleos, HNK1 y NGFR tiñen el citoplasma. (d e) El análisis de citometría de flujo indica un alto porcentaje de células doblemente positivas HNK1-NGFR y CD73-CD44 respectivamente en líneas de NCSC (d) y m Sc (e). (f) Gráfico de los niveles de expresión de RNAseq de genes incluidos en el intervalo genómico de WBS en el estadío de MSCs. Para una mejor visualización, los genes se separaron en expresión baja/media (panel derecho) y alta (panel izquierdo). Para cada gen, se muestran 4 contenedores (1 por genotipo). 1er contenedor: AtWBS; 2° contenedor: WBS; 3er contenedor: CTL; 4o contenedor: 7dupASD.
Figura 18 Caracterización de DEGs encontrados tanto en iPSC como en MSC.(a) Los DEGs de MSC que también son DEGs en iPSC tienen una expresión más alta. (b) La proporción de DEGs superpuestos en MSCs no se correlaciona con los niveles de expresión en iPSC. (c) La gran mayoría de los DEGs en el estadío de iPSC están regulados a la baja en MSCs diferenciadas y la superposición entre DEGs de iPSC y MSC aumenta con mayores cambios de iPSC a MSC.
Figura 19 La plataforma web WikiWilliams/7q11GB.Captura de pantalla representativa de la base de datos Wik¡W¡ll¡ams/7q11GB tal como aparece a los usuarios que buscan un gen de interés específico. Todos los datos transcriptómicos y genómicos presentados en este artículo, así como los conjuntos de datos publicados anteriormente, pueden consultarse fácilmente en un formato de múltiples capas integrado con varias bases de datos biológicas.DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN MÉTODOS
Un compendio de qué experimentos se realizaron en qué línea celular se proporciona en la Tabla 1.
Muestras humanas
La participación en este estudio de pacientes y familiares junto con las donaciones de biopsias de piel y los procedimientos de consentimiento informado fueron aprobados por el Ethics Committee of the Genomic and Genetic Disorder Biobank (Casa Sollievo della Sofferenza, San Giovanni Rotondo, Italia) y The University of Perugia (Azienda Ospedaliera -Universitaria "S. Maria della Misericordia", Perugia, Italia).
Cultivo y reprogramación de fibroblastos.
Las líneas celulares primarias de fibroblastos WBS1-2-3-4, 7Dup-ASD2, AtWBS1, CTL1R se obtuvieron del Genetic Disease Biobank. El fibroblasto primario 7Dup-ASD1 se obtuvo de Azienda Ospedaliera-Universitaria "S. Maria della Misericordia", Perugia, Italia. Los fibroblastos se cultivaron en medio HF compuesto como sigue: RPMI 1640, 1% de L-Glutamina, 1% de Pen-Strep, 15% de FBS durante algunos pases antes de la reprogramación.
Las líneas de fibroblastos de WBS1-2-3-4, 7Dup-ASD1-2, AtWBS1, CTL1R y CTL2 se reprogramaron utilizando el kit de reprogramación de mRNA (Stemgent). Para la reprogramación de las líneas 7Dup-ASD2 y CTL1R se utilizó el kit de refuerzo de microRNA (Stemgent) para mejorar la reprogramación. La línea de CTL3 se reprogramó utilizando el vector lentiviral policistrónico STEMCC<a>seguido de una escisión exitosa mediada por cre del policistrón integrado. Para la reprogramación mediada por mRNA, la transición epitelial a mesenquimatosa se controló desde el día 5 mediante el seguimiento de células positivas para GFP. Se analizó la pluripotencia de las colonias reprogramadas con éxito el día 20 utilizando un anticuerpo vivo TRA-1-60 (Stemgent) y se seleccionaron para una mayor expansión como se detalla a continuación.
Cultivo de iPSC
Las líneas de iPSC se cultivaron en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) inactivados con mitomicina C como se describió anteriormente23 en un medio compuesto como sigue: DMEM-F12 (Gibco) en una proporción 1:1 suplementado con 20 % de KSR, 1 % de aminoácidos no esenciales, 1 % de Pen-Strep, 1 % de glutamina, 0,1 % de beta-mercaptoetanol, 10 ng /ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, Gibco). Las colonias se pasaron y expandieron dos veces mediante fraccionamiento físico con una aguja estéril y se volvieron a sembrar en MEFs recién sembrados para el establecimiento de la línea. Después de algunos pases, las iPSCs se adaptaron para crecer en condiciones sin alimentador en placas recubiertas con Matrigel (BD Biosciences) calificado para humanos diluido 1:40 en medio DMEM-F12 y mTeSR-1 (StemCell Technologies) y se pasaron por fraccionamiento físico sobre un tratamiento de 2 minutos con Dispasa (Sigma) a 37°C. Las iPSCs sin alimentador también se adaptaron para crecer en cultivos de células individuales disociandolas mediante un tratamiento de 3 minutos con Accutase (Sigma) a 37°C y finalmente se re-suspendieron en un volumen adecuado de mTeSR-1 suplementado con Y-27632 5 pM (Sigma).
Ensayo de teratoma e inmunohistoquímica.
El ensayo de teratoma se realizó inyectando por vía subcutánea 1-3*106 iPSCs en Matrigel calificado para humanos (BD Biosciences) en los flancos dorsales de ratones macho NOD-SCID IL2RG. Los teratomas se aislaron cuando el diámetro alcanzó >1,5 cm y se fijaron en formalina tamponada al 4%. Después, las muestras se incluyeron en OCT, se seccionaron y se tiñeron para H&E y anticuerpos específicos de la capa germinal: desmina (Dako), S-100 (Dako) y citoqueratina (Dako).
Inmunocitoquímica
Las células se fijaron en PFA al 4% durante 20' y posteriormente se bloquearon en FBS al 10% Triton al 0,1% durante 30' a temperatura ambiente. Las células se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C y después con anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios y secundarios se re-suspendieron en FBS al 10%. Los anticuerpos primarios utilizados fueron OCT3/4 (SantaCruz), NANOG (Everest Biotech), SSEA3 (Invitrogen), Tra1-60 (Stemgent), TBR2 (Abcam), SOX2 (R&D), PAX6 (HBDS), NESTIN (Abcam), FOXG1 (StemCulture), ZO1 (Invitrogen), OTX2 (Millipore), Ki67 (Abcam), PHH3 (Millipore) HNK1 (SIGMA), NGFr (p75, Advanced Targeting Systems). La tinción con fosfatasa alcalina se realizó utilizando el kit Alkaline Phoshatase Detection Kit (Sigma).
Las imágenes se adquirieron con un microscopio Olympus AX70.
Extracción de DNA, RNA y proteínas.
El DNA genómico se extrajo de fibroblastos y las líneas de iPSC sin alimentador utilizando el kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen) según las especificaciones del fabricante. El RNA se extrajo de líneas de iPSC utilizando el kit RNeasy Micro Plus (Qiagen) según las especificaciones del fabricante, sustituyendo la columna de eliminación de DNA genómico por aguja y tratamiento con Dnase (Qiagen). La calidad y concentración de DNA y RNA se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoDropSpectrophotometer (NanoDrop Technologies).
Las proteínas se extrajeron como sigue: las células se rasparon de la placa y se centrifugaron a 1100 g a 4°C durante 3 minutos, después se lavaron en PBS y se lisaron en tampón RIPA más un combinado de inhibidores de proteasa (Sigma) en una rueda giratoria a 4°C durante 30 minutos. Los lisados se sonicaron utilizando el sistema Bioruptor Sonication System (UCD200) durante 3 ciclos de 30 segundos con descansos de 60 segundos a alta potencia. Los lisados se centrifugaron a 13000 g durante 15 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a un tubo nuevo. La cuantificación de proteínas se realizó mediante el ensayo de proteínas de Bradford (BioRad) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
Inmunotransferencia
Para la inmunotransferencia, se procesaron de 20 a 40 pg de extracto de proteína por muestra en un gel Nupage Bistris al 4-12% prefabricado (Life Technologies), se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon en TBS-T y leche al 5%. Los anticuerpos utilizados para la detección fueron GTF2I (Cell signalling), BAZ1B (Abcam) y GAPDH (Abcam). Las transferencias se escanearon utilizando un sistema LI-COR Odyssey Infrared Imaging System y las bandas se cuantificaron utilizando el software ImageJ.
Nanocuerda
La cuantificación de nanocuerdas se realizó según las instrucciones del fabricante y la normalización de los datos se realizó con el software nSolver Analysis Software 1.1, utilizando GAPDH, TUBB y POLR1B como normalizadores.
RNAseq
La preparación de la biblioteca para la secuenciación de RNA se realizó utilizando los kits Poly-A, RiboZero y Single Stranded (Illumina) según las instrucciones del fabricante.
Para fines de análisis de expresión diferencial, los inventores complementaron su conjunto de datos de poliA con los perfiles transcriptómicos de tres líneas de iPSC de control disponibles en la bibliografía (muestras de GEO GSM1153507, GSM1153512 y GSM1153513, de líneas celulares ADRC40, WT-9 y WT-126 respectivamente), que se seleccionaron sobre la base de la similitud de sus condiciones de cultivo y protocolos de secuenciación con los nuestros. Los inventores excluyeron del análisis genes (292, de los cuales 43 serían de otro modo DEGs entre genotipos) que se encontraron expresados diferencialmente entre los controles de su cohorte y los controles externos.
Las lecturas se alinearon con el transcriptoma hg 19 utilizando TopHat 2.0.10. La alineación se realizó primero en el transcriptoma RefSeq y todas las lecturas que tenían una distancia de edición > 1 se realinearon en el genoma, permitiendo una distancia máxima de edición de lectura de 3 y 3 (lecturas de 100 bp) y 2 (lecturas de 50 bp) desajustes máximos. Se analizaron lecturas de cadena de 50 bp (transcriptomas de MSC, así como transcriptomas de líneas inhibidas y eliminadas) utilizando la opción "fr-firststrand". La cuantificación de las lecturas sobre el transcriptoma RefSeq se realizó con Cufflinks 2.2.1 utilizando correcciones de sesgo de secuencia y lectura múltiple. La expresión genética diferencial se estimó utilizando Cufflinks 2.2.1, utilizando modelos de dispersión por afección (excepto en el experimento de eliminación en donde se utilizó un modelo global debido al bajo número de réplicas). Para el estadio de iPSC, dada la presencia de muestras tanto de poliA como de Ribo-zero, los inventores consideraron la unión de los DEGs identificados mediante un análisis global de todas las muestras (FDR < 0,05) con los identificados mediante un análisis independientes de las muestras de poliA y Ribo-zero. En el último caso, los inventores consideraron genes expresados diferencialmente que tenían un FDR < 0,2 en ambos conjuntos de datos (comparando los mismos genotipos), y para los cuales el cambio fue en la misma dirección.
Prueba de reducción de resolución
La gran mayoría de los genes expresados diferencialmente identificados en este estudio todavía se encontraron al eliminar los controles externos, y la mayoría de los DEGs restantes estaban cerca de ser significativos, lo que argumenta en contra de la introducción de un sesgo importante mediante el uso de controles externos.
Para evaluar el efecto, en el análisis transcripcional, de tener menos muestras, los inventores repitieron el análisis de su conjunto de datos de poliA (centrándose en la comparación para la cual los inventores tenían la mayor cantidad de muestras, es decir, el análisis global de iPSC de WBS vs c Tl ), utilizando sólo subconjuntos de las muestras. La eliminación aleatoria de 1 clon por paciente condujo a una reducción dramática en el número de DEGs (48 a 76% perdidas) y a la identificación de DEGs que están falsificados por los datos descartados. El impacto de la eliminación de todos los clones de un paciente por afección (lo que equivale a menos muestras que eliminando un clon por paciente) fue aún mayor. Por el contrario, la profundidad de la secuenciación pareció hacer poca diferencia: reducir la cobertura a la mitad provocó la pérdida del 11% de las DEGs y muy pocos falsos positivos.
Pruebas aleatorias
Para evaluar la posibilidad de que la expresión diferencial observada pudiera surgir debido a variaciones aleatorias, los inventores realizaron una serie de análisis de expresión diferencial entre muestras seleccionadas al azar, descartando comparaciones en donde los dos grupos no estaban equilibrados en cuanto a sexo y/o genotipo. Se probaron un mínimo de 3 de dichas combinaciones por tejido y los genes resultantes se combinaron con el fin de realizar un análisis de enriquecimiento.
En el estadio de iPSC (utilizando el conjunto de datos de poliA), los inventores primero asignaron aleatoriamente todos los pacientes a dos grupos, pero los inventores no pudieron obtener genes estadísticamente significativos en ninguna de las combinaciones. Por lo tanto, los inventores eliminaron gradualmente a los pacientes hasta que se obtuvieron genes significativos, lo que no ocurrió hasta una comparación que implicó 6 vs 6 muestras (en cada grupo, 3 muestras de 2 pacientes). Por el contrario, cuando los clones se seleccionaron y se asignaron a grupos de una manera que maximizaba el número de pacientes representados en cada grupo, los inventores tuvieron que reducir a 3 vs 3 (3 muestras por grupo, provenientes de 3 pacientes diferentes) para obtener genes estadísticamente significativos (18 DEGs, que no muestran un enriquecimiento significativo de GO). De manera similar, la asignación aleatoria de las muestras de control (incluyendo los controles externos, equilibrados entre grupos) produjo muy pocos DEGs (máximo 17) y ningún enriquecimiento significativo de GO.
Estos resultados sugieren que la fuente principal de expresión diferencial "espuria" es la variación genética entre individuos, que sólo se mitiga utilizando líneas derivadas de varios pacientes.
Finalmente, es interesante observar que a pesar de arrojar muy pocos DEGs (máximo 78), algunas de las comparaciones 6 vs 6 mostraron un enriquecimiento estadísticamente significativo para las categorías GO de organización de la matriz extracelular y organización de la estructura extracelular (FDR 2.5E-7 en la prueba aleatorio, versus 2.3E-10 en la comparación entre genotipos), señalando que estos genes varían particularmente en expresión entre líneas y/o individuos.
En tipos de células diferenciadas, las pruebas aleatorias utilizando (3 combinaciones de) muestras 3vs3 no produjeron una expresión diferencial significativa (NCSC) o muy pocos genes (NPC) que no mostraron enriquecimientos significativos, con la excepción del conjunto de datos de MSC. La unión de genes que se encontraron significativos a partir de combinaciones aleatorias de las muestras de MSC mostró varios enriquecimientos de GO, incluyendo (aunque en un nivel más bajo) algunas categorías que se encontraron significativas entre las afecciones genéticas. Sin embargo, la eliminación de estos genes no alteró significativamente las principales categorías enriquecidas entre los DEGs entre afecciones genéticas (Tabla 2).
Preparación de cDNA y qPCR.
Los cDNAs retrotranscritos se obtuvieron a partir de 1 pg de RNA total empobrecido en DNA utilizando el kit de retrotranscripción superscript VILO de Life Technologies según las instrucciones del fabricante.
Para el análisis de q-PCR en tiempo real se ha utilizado una cantidad total de cDNA correspondiente a 10-50 ng de RNA de partida para cada reacción. Se ha utilizado la mezcla maestra FAST SYBR green de Life Technologies y un par de cebadores 10 pM. Las reacciones de qPCR se han realizado en una máquina Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR siguiendo el protocolo de amplificación estándar.
Los pares de oligos usados para qPCR fueron: GAPDH (F: GCACCGTCAAGGCTGAGAAC (SEQ ID No. 1), R: AGGGATCTCGCTCCTGGAA (SEQ ID No. 2)), BEND4 (F: GGAAAAGGAAAAGGTCAGTGC (SEQ ID No. 3), R: GTTTATCTGCTCTTCCGAGGG (SEQ ID No. 4)) y GTF2I (F: GATCTTGCAACCCTGAAATGG (SEQ ID No. 5), R: CACCTGGAGATAGTATTGACCTG (SEQ ID No. 6)).
Inmunoprecipitación de cromatina acoplado con secuenciación (ChIPseq)
Se utilizaron 108 iPSCs para cada inmunoprecipitación. Las células se separaron usando accutase, se resuspendieron en PBS que contenía formaldehído al 1% para su fijación y se inactivaron con glicina 125 mM. Las células se lisaron utilizando tampón de lisis ChIP (SDS al 1%, EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,1) y se sonicaron utilizando el Covaris Sonicator para generar fragmentos de DNA de 250 bp. La cromatina soluble se diluyó 10 veces en tampón de dilución ChIP (0,01% de SDS, 1,1% de Triton-X100, EDTA 1,2 mM, Tris-HCl 16,7 mM, pH 8,1, NaCl 167 mM). La cromatina se incubó durante la noche a 4°C con el anticuerpo y se recuperó al día siguiente usando Dynabeads Protein G (Life Technologies). Las perlas se lavaron secuencialmente con tampón de lavado bajo en sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,1, NaCl 150 mM), tampón de lavado alto en sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X- 100, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,1, NaCl 500 mM), tampón de lavado de LiCl (LiCl 0,25 M, NP40 al 1 %, desoxicolato al 1 %, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,1) y TE. Los inmunocomplejos se eluyeron en tampón de elución ChIP (0,1 % de SDS, 1 % de Triton-X100, EDTA 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,1, NaCl 500 mM) y la desreticulación se realizó durante la noche a 65°C. El DNA se purificó utilizando columnas de PCR Qiaquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Se prepararon bibliotecas de ADN según Blecher-Gonenet al.24 y el DNA se secuenció en una plataforma Illumina HiSeq 2000.
La validación de los resultados de ChIPseq se ha realizado mediante análisis qPCR utilizando los siguientes pares de oligo: EOMES (F: GCTGCCATCTTCCTCTGGTAA (SEQ ID No. 7), R: GCTGCCATCTTCCTCTGGTAA (SEQ ID No.
8)), SNAP25 (F: CCTCCTGCATAGCTTCAACAAA (SEQ ID No. 9), R: GGTCAGAGGGCAACACAGA (SEQ ID No.
10), DTX3L (F: CACCAGCCCTTGACATCAG (SEQ ID No. 11), R: TCCCTCCAACTCTACCCTTTAG (SEQ ID No. 12)), HDAC1 (F: TGATGTGGAGAGTTTGAGTGG (SEQ ID No. 13), R: GAAAAGATGAGGAAGGGACGG (SEQ ID No. 14)), SEMA4B (F: AT GTT AAGGGAGCAGT GAGC (SEQ ID No. 15), R: AT GGT CAGCT CT CAAGAATGG (SEQ ID No. 16)), CRB2 (F: GAACCCAGATCTCTTACGCTG (SEQ ID No. 17), R: CATCTTTAATCCCCTGCCTCTC (SEQ ID No. 18)), MYO1B (F: GGAAACCAGATTAGAGACGGG (SEQ ID No. 19), R: GTTT GT AGTT ACCT CTCCAGCG (SEQ ID No.
20)), MFAP2 (F: GAAATCAAGCCTCCCAAAGTG (SEQ ID No. 21), R: TGGAGAGGCAGAAGGAAAAC (SEQ ID No.
22)), ADAM19 (F: AAGCCTTCTCCGGTCATAATG (SEQ ID No. 23), R: T GAT GTCCGT GTTT CT CAGG (SEQ ID No.
24)), S1PR5 (F: CCTGTGAACTGAGGTTCCTG (SEQ ID No. 25), R: CCACTGAAGACTCCTGCTAAG (SEQ ID No.
26)), JKAMP (F: ACAAGCCCGAAGTCCAAAG (SEQ ID No. 27), R: TCCTGTTCCTGCACAACG (SEQ ID No. 28)), PTPN5 (F: CCTCAACCAGAAACAAGCAG (SEQ ID No. 29), R: CCACCGACCCTTTAGCTTTAG (SEQ ID No. 30)), TMEM20 (F: GCTCCTGTAATTAGTGTCGGG (SEQ ID No. 31), R: GGGATCACTTTTCAGGGTCAG (SEQ ID No. 32)).
Análisis de ChIPseq
Las lecturas se recortaron para detectar contaminación del adaptador usando Scythe 0.981 con una coincidencia mínima de 3 antes de alinearse con el genoma HG19 usando BowTie 1.0, permitiendo 2 discrepancias y descartando lecturas de alineación múltiple. Los picos se nombraron usando Mac 2.0.9 con la configuración predeterminada e ignorando lecturas duplicadas. Para la ChIPseq de GTF2I, dada la variabilidad entre muestras, los inventores utilizaron dos enfoques complementarios para identificar los sitios de unión de GTF2I. Los inventores consideraron los picos (independientemente de FDR) que se superponían entre todas las muestras de control y 7dupASD (2079 picos; 436 genes objetivo) como "picos conservados", a partir de los cuales los inventores dedujeron los genes objetivo centrales de GTF2I. Además, los inventores nombraron picos en las lecturas agrupadas de todas las muestras (contra las entradas agrupadas) para identificar un conjunto más amplio de sitios de unión putativos, considerando solo regiones con un enriquecimiento de veces sobre la entrada de al menos 5 y FDR < 0,001 (10691 picos; 1554 genes objetivo). En todos los casos, los genes objetivos se identificaron como genes con un pico en -2,5 kb/+1 kb alrededor de su TSS.
Los dominios bivalentes se definieron como regiones que tienen picos H3K4me3 y H3K27me3 con una diferencia de 1 kb entre sí en los datos de ENCODE a partir de la línea de células madre embrionarias humanas (hESC) H9. Para evaluar la calidad del ChIPseg de LSD1, los inventores lo compararon con el ChIPseq de ENCODE para H3K4me2 en la línea hESC de H1. Como era de esperar, el 95 % de los picos de LSD1 definidos por los inventores se superponen con un pico de H3K4me2.
Finalmente, las asociaciones entre TSS y potenciadores distales se infirieron a partir de una fuerte correlación, en todos los conjuntos de datos ENCODE, entre la firma de cromatina potenciadora y la expresión en el TSS objetivo putativo; más específicamente, los inventores consideraron solo asociaciones con un FDR < 0,001 y una correlación de Pearson mínima de 0,5 con H3K27ac, H3K4me1 y -0,5 con metilación del DNA, para un total de 5996 asociaciones potenciador-TSS.
Inmunoprecipitación y análisis de MS del complejo GTF2I.
Se recogieron y lisaron aproximadamente 25-35 millones de células en tampón de lisis de baja rigurosidad (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM, EDTA 0,5 mM, Nonidet P-40 al 0,5%) y se sonicaron utilizando un sonificador digital Branson 250.
Se utilizaron 3 mg de extracto proteico para la inmunoprecipitación con 10 pg de anticuerpo de GTF2I (Bethyl) y con inmunoglobulina IgG inespecífica rotando O.N a 4°C. Al día siguiente, se añaden 50 pl de NovexDynabeads Protein G (Life Technologies) a cada muestra y se incubaron en rotación durante 2 horas a 4°C. Después de tres etapas de lavado usando el tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM, Triton al 0,1%, glicerol al 5%), las perlas se trataron con un volumen de tampón de muestra 4X Novex LDS (DTT 50 mM) (Life Technologies) y el mismo volumen de muestra se carga en un gel Novex prefabricado al 12%-4% (Life Technologies) para SDS-PAGE. Los geles se tiñeron utilizando Colloidal Blue Coomassie (Fermentas). Se cortaron y analizaron 7 bandas discretas mediante cromatografía líquida-MS en tándem.
Análisis por cromatografía líquida-MS en tándem (LC-MS/MS)
Se cortaron bandas de interés de geles y se tripsinizaron como lo describieron previamente Shevchencko et al.25. Los péptidos fueron desalados y concentrados en una etapa casera26 secados en un Speed-Vac y se resuspendieron en 10 pL de ácido fórmico al 0,1%. Se realizó LC-ESI-MS/MS de 5 pl de cada muestra en un espectrómetro de masas LTQ con transformada de Fourier (FT-LTQ, Thermo Electron, San José, CA). La separación de péptidos se logró en un gradiente lineal desde 100 % de disolvente A (5 % de ACN, 0,1 % de ácido fórmico) hasta 20 % de disolvente B (acetonitrilo, 0,1 % de ácido fórmico) durante 30 min y de 20 % a 80 % de disolvente B en 20 min a un caudal constante de 0,3 pL/min en el sistema de separación cromatográfica Agilent 1100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania), donde el sistema de LC se conectó a un emisor de sílice fundida de 15 cm de 75 pm de diámetro interno (New Objective, Inc. Woburn, MA USA), empaquetados internamente con perlas ReproSil-Pur C18-AQ de 3 pm (Dr. MaischGmbh, Ammerbuch, Alemania) utilizando un cargador de bombas de alta presión (Proxeon, Odense, Dinamarca).
Los escaneos de MS de Survey se adquirieron en el FT dem/z350-1650 con resolución de 100000. Los cinco iones con carga doble y triple más intensos se seleccionaron automáticamente para la fragmentación. Los iones objetivo ya seleccionados para MS/MS se excluyeron dinámicamente durante 60 s.
Procesamiento y análisis de datos.
BÚSQUEDA EN BASE DE DATOS: Los archivos MS sin procesar se convirtieron en listas de picos (archivos msm) a través de Raw2msm ver 1.10_2007.06.14. Todas las muestras de MS/MS se analizaron utilizando Mascot (Matrix Science, London, UK; versión 2.3.02) configurada con los siguientes parámetros: base de datos Database UniProt_CP_Human_20130724 (versión desconocida, 88378 entradas), taxonomía Homo sapiens, enzima tripsina, escisión máxima faltante 2, carbamidometilo de modificación fija (C), oxidación de modificación variable (M), tolerancia al acetil péptido (proteína N-terminal) 10 ppm, tolerancia MS/Ms 0,5 Da.
CRITERIOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: Se utilizó Scaffold (versión Scaffold _4.3.4, Proteome Software Inc., Portland, OR) para validar las identificaciones de péptidos y proteínas basadas en MS/MS. Se aceptaron identificaciones de péptidos si el algoritmo de Peptide Prophet27 podía establecer que tenían una probabilidad superior al 95,0 % con corrección por delta-masa de Scaffold. Se aceptaron identificaciones de proteínas si podían establecerse con una probabilidad superior al 99,0 % y contenían al menos 2 péptidos identificados. Las probabilidades de las proteínas se asignaron mediante el algoritmo Protein Prophet28. Las proteínas que contenían péptidos similares y que no podían diferenciarse basándose únicamente en el análisis MS/MS se agruparon para satisfacer los principios de parsimonia. Las proteínas que compartían evidencia peptídica significativa se agruparon en grupos.
Producción de lentivirus
La eliminación de GTF2I se realizó utilizando el vector pLKO.1 TRC validado (TRCN0000019315 denominado sh2, TRCN0000364552 denominado sh52 y TRCN0000369208 denominado sh08).
Como control negativo se utilizó un pLKO.1 TRC previamente descrito que contenía una horquilla corta scrambled29. Las partículas virales se produjeron utilizando vectores de empaquetamiento psPAX2 y pMD2.G en células 293T. Las partículas virales se recogieron a las 24 y 36 horas después de la transfección y se concentraron 250X mediante ultracentrifugación a 24000 g durante 2 horas a 16°C. Las líneas de iPSC se infectaron con diferentes cantidades de partículas virales, y se seleccionó para los siguientes experimentos la cantidad que dio lugar al 50% de supervivencia tras el tratamiento con 1 pg/ml de puromicina durante 72 horas.
Las células infectadas se mantuvieron en mTeSR que contenía puromicina durante toda la duración de los experimentos.
Diferenciación
La diferenciación en el linaje telencefálico dorsal se logró mediante inhibición dual de Smad en presencia de SB431542 (Tocris) y Noggin (R&D)3031. La diferenciación de NCSC y MSC se realizó como se describió anteriormente32, mediante la activación de la señalización de Wnt y el bloqueo de la vía de Smad mediante la administración de las pequeñas moléculas GSK3i (Calbiochem) y SB431542 (Tocris).
Producción de cuerpos embrioides (EBs) y tratamientos con inhibidores de LSD1.
En un experimento de diferenciación se colocaron aproximadamente 1,5*104 células/pocillo (CTR1R-C3) en una placa cónica de 96 pocillos en medio mTeSR que contiene 10 mM de un inhibidor de LSD1: hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida
o el Ejemplo 5 como se describe en el documento de Patente WO2013057322: Hidrocloruro de (trans)-N1-((1R,2S)-2-fenilciclopropil)ciclohexan-1,4-diamina se centrifugaron placas de 96 pocillos a 850 g durante 10 minutos a temperatura ambiente y los EBs en formación se incubaron a 37 grados durante 24 horas. Se añadieron 10 uM de RA el día 0 o el día 4. En el día 1, los EBs se colocaron en placas en un plato de baja adherencia y el medio se reemplazó con KO-DMEM (+P/S Glut)(medio EB) que contenía FBS al 20%. El medio, RA, inhibidores y vehículo se cambiaron cada dos días durante los siguientes 6 días. A continuación, se realizó la extracción de RNA y la preparación de cDNA como se describe anteriormente.
El inhibidor de LSD1 también se ha probado en condiciones no diferenciadoras según el siguiente procedimiento experimental: aproximadamente 2,5*105 células se sembraron el día 0 en condiciones sin alimentador en una placa de 6 cm (diámetro) recubierta con Matrigel diluido calificado para humanos (BD Biosciences) y en medio mTeSR-1 (StemCell Technologies) suplementado con Y-27632 5 pM (Sigma). mTeSR-1 se reemplazó el día 1 y el día 2. En el día 3, el medio se reemplazó con mTeSR-1 que contenía 10 mM de un inhibidor de LSD1 hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il) benzamida y se incubó a 37 grados durante 24 horas. A continuación, las células se disociaron primero mediante un tratamiento de 3 minutos con Accutase (Sigma) a 37°C y después se recogieron para la extracción de RNA, cDNA y la preparación de la biblioteca como se describió anteriormente.
Citometría de flu jo
1*106 células se fijaron en PFA al 4% y posteriormente se bloquearon en BSA al 10%. Las células se incubaron durante una hora con el anticuerpo conjugado primario resuspendido en BSA al 1-2%. Los anticuerpos conjugados primarios utilizados fueron CD57-FITC (HNK1, BD), CD271-647 (NGFR, BD), CD44-APC (EBIOS) y CD73-PE (BD). Los análisis se realizaron en FACSCalibur (BD Biosciences) y los datos se analizaron con el software FCS express (Tree Star inc.).
Matriz CGH
Se aisló DNA de fibroblastos parentales y iPSC utilizando el kit Qiagen como se describe anteriormente. La concentración y pureza del DNA se determinaron con un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Berlín, Alemania), mientras que el análisis de las variaciones del número de copias (CNVs) del genoma completo se realizó utilizando la plataforma de matriz CytoScan HD (Affymetrix, Santa Clara, CA). El ensayo CytoScan HD se realizó según el protocolo del fabricante, comenzando con 250 ng de DNA. Brevemente, el DNA genómico total se digirió con una enzima de restricción (NspI), se ligó a un adaptador apropiado para la enzima y se sometió a amplificación por PCR utilizando un cebador único. Después de la digestión con DNasa I, los productos de la PCR se marcaron con un análogo de nucleótido biotinilado, utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y se hibridaron con la micromatriz. La hibridación se llevó a cabo en el horno Hybridization Oven 645 mientras que el lavado y la tinción posteriores se realizaron utilizando la Fluidics Station 450.
Análisis de matriz de CGH
Después, cada matriz se escaneó con el Scanner 30007G y tanto la etapa de control de calidad como el análisis del número de copias se realizaron utilizando el software Chromosome Analysis Suite versión 2.0: i) el archivo de datos sin procesar (.CEL) se normalizó usando las opciones predeterminadas; ii) se realizó un análisis no emparejado utilizando como referencia 270 muestras de HapMap para obtener el valor de los números de copia de archivos .CEL, mientras que las regiones amplificadas y/o eliminadas se detectaron utilizando un método estándar del Hidden Markov Model (HMM).
Micromatriz
El análisis de micromatrices se realizó con el paquete Affy usando el archivo de anotación Hugene 2.1st RefSeq de Marc Carlson, versión 18. La normalización de fondo se realizó usando el método RMA, mientras que la normalización entre muestras se realizó usando el método de normalización de cuantil. La cuantificación de la expresión se obtuvo utilizando sondas perfectamente coincidentes solo con un resumen medianpolish, promediando conjuntos de sondas para obtener expresión a nivel de gen. Conjuntos de sondas que no están asignados a genes conocidos o que no tienen log<2>cambios de veces < 0,5 se descartaron y se evaluó la expresión diferencial mediante una prueba t de 2 colas. A los efectos de los análisis de enriquecimiento, se consideraron DEGs con un FDR < 0,2.
Análisis de enriquecimiento de ontología genética.
Para los datos de RNAseq, el análisis de enriquecimiento se realizó utilizando el paquete R de GOseq para corregir el sesgo en la longitud del transcripto considerando solo categorías con al menos 10 genes anotados y descartando categorías que tenían menos de 8 genes significativos. Para los genes medidos por otros métodos, el análisis de enriquecimiento se realizó con el paquete TopGO utilizando el algoritmo clásico y la prueba de Fisher con los mismos límites descritos anteriormente. Para crear mapas de árbol de enriquecimiento, primero se eliminaron las categorías padres que tenían hijos enriquecidos y después se crearon mapas con el paquete Treemap, utilizando como colores la combinación de categorías padres no superpuestas que representan la mayor proporción de categorías trazadas. Todos los valores de FDR reportados se calcularon utilizando el método de Benjamini-Hochberg.
Establecimiento y caracterización de la línea clonal de NGN2.
1) Preparar partículas lentivirales de UbC-rtTA y FUW-TetO-NGN2-EGFP-Puro o FUW-TetO-NGN2-Puro como en Pang et al33 y concentrar por ultracentrifugación,
2) Sembrar 3*10® iPSCs por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio mTeSR, 1 día antes de la infección y reemplazar el medio agotado con mTeSR fresco e infectar las células añadiendo de 0,5 a 1,5 ul de concentrado lentiviral UbC-rtTA y la misma cantidad de concentrado lentiviral FUW-TetO-NGN2-EGP-Puro/ FUW-TetO-NGN2-Puro a cada pocillo,
3) Dividir las iPSCs confluentes, infectadas y no inducidas de un pocillo de una placa de 24 pocillos a un pocillo de una placa de 12 pocillos 1:1,
4) Dividir las células de los pocillos de una placa de 12 pocillos a un pocillo de una placa de 6 pocillos 1:1,
5) Dividir las células de una placa de 6 pocillos en 3 platos de 6 cm 1:3,
6) tras el cambio diario del medio, el medio agotado no se descarta sino que se mantiene a 4°C. Después se filtra y se mezcla 1:1 con medio nuevo, formando el "medio de recuperación". Este medio es necesario para mantener la supervivencia de las células individuales después de la clasificación,
7) trás alcanzar la confluencia en platos de 6 cm, se congela 1 plato como "población cruda sin clasificar". Los otros 2 platos se dividen usando Accutase y se resuspenden en 800 ul de PBS con 1% de Pen-Strep por plato.
8) Las células en PBS se clasifican como células individuales DAPI negativas, cada célula en un pocillo de una placa de 96 pocillos y que contiene 150 ul de "medio de recuperación" suplementado con inhibidor de Rock 5 uM, usando un BD FACSAria II. Las células DAPI negativas están vivas; el medio de recuperación con inhibidor de Rock favorece la supervivencia de las iPSCs individuales,
9) Las células crecen en la incubadora durante un promedio de 10 a 12 días. El medio se cambia sustituyendo el 50% con medio nuevo y solo después de 5 días (cambiarlo antes puede dañar pequeños grupos de células). Después se cambia el medio diariamente hasta que emergen las colonias. Las colonias se puntúan visualmente bajo un microscopio de campo claro para determinar la morfología pluripotente de las células y la forma redonda de la colonia, a fin de descartar la presencia de dos células en el mismo pocillo. Se eligen de 3 a 5 pocillos para establecer nuevas líneas; cada uno de estos pocillos da lugar a líneas celulares estables que surgen de una única iPSC con su propio perfil de integración transgénica, de ahí el término líneas "clonales".
10) Las colonias que ocupan aproximadamente la mitad de la superficie de los 96 pocillos se dividen lavando las células con 100 ul de PBS y después incubándolas con 30 ul de reactivo de disociación Gentle durante 3 minutos a 37°C. Se descarta el reactivo de disociación Gentle y las células se resuspenden aproximadamente en 200 ul de mTeSR. La resuspensión es muy breve para evitar la ruptura los grupos de colonias en células individuales. Después, los grumos resuspendidos se colocan en pocillos de placas de 48 pocillos, en un volumen total de 300 ul de mTeSR sin inhibidor de Rock por pocillo.
11) Posteriormente se pasan las células para llegar a placas de 24, 12 y 6 pocilios. Esta etapa tarda aproximadamente de 15 a 20 días, ya que es importante dividir las células sin diluirlas más de 1:5. Cada división se realiza utilizando reactivo de disociación Gentle y sin inhibidor de Rock. Al pasar las células del formato de 24 pocillos al formato de 12 pocillos, las células se dividen en 2 pocillos. Dos días después de la división, se intercambia el mTeSR en uno de los dos pocillos con Medio 1 con doxiciclina,
12) después de la inducción con doxiciclina de un solo pocillo de la placa de 12 pocillos (preferiblemente después de 24 horas), se puntúa la positividad de GFP. Después, los clones positivos para GFP se expanden aún más a platos de 6 pocillos y 6 cm a partir del pocillo no inducido.
13) Los platos confluentes de 6 cm de líneas celulares clonales positivas para GFP se congelan como reservas y se pueden descongelar y expandir fácilmente a voluntad como líneas de iPSC.
Para inducir la diferenciación neuronal es suficiente sustituir mTeSR por medio 1 doxiciclina de la siguiente manera: 14) cambiar el medio de mTeSR a "Medio 1" como se detalla en Zhang et al.34:
N2/DMEM/F12/NEAA
BDNF humano (10 mg/l)
NT-3 humano (10 mg/l)
Laminina de ratón (0,2 mg/l)
Se añade doxiciclina (2 mg/l) preferiblemente el mismo día para inducir NGN2 y se retiene en el medio hasta el final del experimento.
15) después de la inducción (preferiblemente un día), se añade puromicina al medio (1 mg/l) durante 24 horas. 16) después de la administración de puromicina (preferiblemente un día), se añaden 6*105 astrocitos de ratón a cada pocillo y el medio se cambia a "Medio 2" como se detalla en Zhang et al. 2013:
Neurobasal suplementado con B27/Glutamax
BDNF humano (10 mg/l)
NT-3 humano (10 mg/l)
Ara-C (2 g/l)
17) 8 días después de la adición de glia, se añade FBS (2,5%) al medio para apoyar la viabilidad de los astrocitos.
18) Las células se analizan mediante inmunofluorescencia en el día en un intervalo entre 14 y 31 después de la inducción.
Todas las placas están recubiertas con matrigel calificado por hESC (diluido 1:40 en DMEM/F12/Gln/Pen-Strep) a menos que se especifique lo contrario. Las células siempre se incuban a 37°C con 3% de O2 y 5% de CO2. Las células siempre se dividen usando accutasa y se siembran en mTeSR suplementado con inhibidor de Rock 5 uM, que luego se elimina después del primer cambio de medio.
El método comprende opcionalmente la extracción de DNA genómico de cada línea celular estable para cuantificar mediante PCR digital o TaqMan la cantidad exacta de números de copias del transgén de UbC-rtTA y TetO-NGN2-EGFP-Puro.
El presente método permite:
• Evitar preparar partículas virales para infectar líneas de iPSC (una ventaja especialmente si es necesario infectar grandes cantidades de iPSCs)
• Evitar infectar iPSCs para cada experimento de diferenciación.
• Realizar experimentos de diferenciación a gran escala: las iPSCs pueden crecer como tales prácticamente indefinidamente y después pueden diferenciarse simultáneamente
• Obtener una población homogénea ya que todas las líneas estables provienen de sucesos de integración únicos • Obtener experimentos de diferenciación reproducibles ya que se han suprimido dos fuentes importantes de variabilidad (producción de virus e infección por iPSC)
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: Establecimiento de una gran cohorte de líneas de células madre pluripotentes inducidas sin transgenes de pacientes con WBS y 7dupASD
Los inventores seleccionaron una cohorte altamente informativa de pacientes con WBS y 7dupASD, cuyas biopsias de fibroblastos se depositaron en the Genomic and Genetic Disease Biobank (http://www.telethon.it/en/scientists/biobanks) y que fueron evaluados por un equipo multidisciplinar^ de especialistas para una ficha clínica detallada (Figura 1a y Tabla 3).
Esta cohorte incluye: i) cuatro pacientes que llevan la eliminación típica de WBS; ii) un paciente que lleva una eliminación atípica de WBS que preserva varios genes, incluyendo BAZ1B, que muestra dismorfismos craneofaciales más leves35 y carecen de anomalías cardiovasculares, lo que respalda el papel de BAZ1B en linajes derivados de la cresta neural36; iii) dos pacientes que llevan la típica duplicación del intermedio 7q11.23 asociado a deterioro del lenguaje, trastorno del espectro autista y dismorfismos craneofaciales37; y iv) un pariente no afectado de un paciente con WBS típico, elegido como control genéticamente medio coincidente (se incluyeron tres líneas de iPSC de dos individuos adicionales no relacionados como controles adicionales, Figura 1a). Todos los pacientes fueron diagnosticados a nivel molecular mediante una combinación de FISH (hibridación fluorescente in situ), MLPA (amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple), aCGH (hibridación genómica comparativa de matrices) y qPCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, Figura 1b).
Los inventores lograron reprogramar fibroblastos de piel de cada paciente/control en iPSC mediante la transfección diaria de mRNAs sintéticos que codifican los cinco factores de pluripotencia OCT4 (también conocido como POU5F1), SOX2, KLF4, LIN28 y c-MYC.2338 Figura 12a-b), lo que indica que la hemieliminación/duplicación de 7q11.23 no impide el restablecimiento de la pluripotencia. Además de una mayor eficiencia en términos de número de colonias reprogramadas y cinética, este enfoque sin integración evita la permanencia residual de los transgenes de reprogramación y su impacto perjudicial en términos de heterogeneidad entre clones, variabilidad en la capacidad de diferenciación, mutagénesis de inserción y daño del DNA inducido por factores de reprogramación38,39 Los inventores caracterizaron 3 líneas de iPSC independientes de cada paciente o pariente no afectado, junto con 2 líneas de iPSC independientes del individuo de control no relacionado, y una línea de iPSC adicional previamente reprogramada mediante un vector lentiviral condicional después de la escisión mediada por Cre del integrante de copia única que asciende a una cohorte total de 27 líneas de iPSC independientes (Figura 1a). Las líneas de iPSC mostraron una morfología típica, expresaron la gama completa de marcadores de pluripotencia, incluyendo ALP (fosfatasa alcalina), OCT4, NANOG, Tra-1-60, SOX2 y SSEA-4 (Figura 12c-d) y contribuyeron a las tres capas germinales embrionarias tras la diferenciación del teratomain vivo(Figura 12c). También se evaluó la integridad genómica de las líneas de iPSC en comparación con los respectivos fibroblastos parentales mediante matrices CytoScan de alta densidad. Como se muestra en la Tabla 4,prácticamente todas las líneas de iPSC tenían variantes de números de copias. Varios de estos fueron adquiridosde novodurante el proceso de reprogramación, como un aspecto inherente a las manipulaciones de laboratorio (tal como el uso de factores de reprogramación y el desencadenante de una proliferación sostenida), y como tal las distinguen unívocamente de las células somáticas parentales originalmente obtenidas de los participantes de la investigación. Otros, en cambio, ya preexistían en los fibroblastos parentales, lo que coincide con la evidencia reciente de un mosaicismo pronunciado de CNV en la piel humana, del cual las CNV específicas de iPSC 'denovo’emergen y se vuelven detectables como resultado de la expansión clonal40. En resumen, las iPSC de esta cohorte son claramente distintas de: i) cualquier otra iPSC reportada hasta el momento, debido a la composición genética única que incluye CNVs específicas inducidas por la reprogramación, y al método empleado para la reprogramación; ii) cualquier célula somática procedente originalmente de los participantes de la investigación, debido a las CNVs específicas que se introdujeron durante la reprogramación.
Tabla 4: Variaciones del número de copias (CNVs) identificadas a través de aCGH
Compendio de los datos de aCGH en líneas de iPSC, que indican las coordenadas genómicas (en la versión del genoma humano de referencia hg19) de CNVs específicas de iPSC. "+" indica una ganancia en el número de copias, mientras que "-" indica una pérdida. Por ejemplo, la línea 7dupASD1-C1 ha perdido una copia de la región que abarca los pares de bases 254253 a 381137 del cromosoma 6.
EJEMPLO 2: La expresión de los genes 7q11.23 sigue la dosis del gen en el estado pluripotente
Para determinar si el estado pluripotente representaba un estadio significativo en donde probar el efecto de la dosis de 7q11.23, los inventores preguntaron primero si la expresión del mRNA de los genes 7q1 1.23 sigue a la dosis del gen. Para ello, los inventores recurrieron a la alta precisión de la cuantificación basada en Nanocuerdas, así como a RNAseq, y descubrieron que la expresión de todos los genes del intermedio (incluyendo los expresados en niveles muy bajos) refleja la dosis de genes (Figura 1c y Figura 13a), excluyendo así los efectos compensatorios del alelo de tipo nativo. Después, los inventores confirmaron que también a nivel de proteína la expresión tanto de GTF2I como de BAZ1B, los genes asociados a características clave de WBS y 7DupASD3441'45, reflejó la dosis simétrica de las dos afecciones (Figura 13b-c-d).
EJEMPLO 3: El desequilibrio de la dosis de 7q11.23 provoca una desregulación transcripcional en vías relevantes para la enfermedad que ya se encuentran en el estado pluripotente
Para evaluar la expresión diferencial entre genotipos, los inventores perfilaron mediante RNAseq el panel de líneas de iPSC derivadas de pacientes y controles, y complementaron este conjunto de datos también con líneas de control adicionales de la bibliografía (en lo sucesivo denominadas controles externos, véanse métodos), excluyendo de análisis más detallado de los genes que se expresaron diferencialmente entre los controles de la cohorte de inventores y los controles externos. Una comparación entre pares de los tres genotipos identificó 757 genes expresados diferencialmente (DEGs) (Figura 2a). Sorprendentemente, el análisis de ontología genética (GO) de la unión de DEGs reveló enriquecimientos significativos para procesos biológicos de obvia relevancia para los fenotipos característicos y los sistemas de órganos objetivos de las dos afecciones.
La Figura 2b muestra una representación de mapa de árbol de los procesos biológicos enriquecidos más específicos, en donde los tamaños de los cuadrados son proporcionales a la importancia del enriquecimiento (los enriquecimientos de GO para cada comparación se muestran en las Figuras 14a-a-b-c). Las categorías de mayor rango están relacionadas con la organización de la matriz extracelular (EM) (FDR ~2,3E-15), que parece especialmente significativa a la luz de la amplia gama de alteraciones del tejido conectivo que caracterizan al WBS, y al sistema nervioso (por ejemplo, diferenciación neuronal FDR -2,7E-7, desarrollo de proyección neuronal FDR ~3,6E-6), proporcionando un contexto molecular para las características definitorias del desarrollo neurológico de las dos afecciones. Además, otros enriquecimientos se refieren a características notablemente específicas de las dos enfermedades. Éstas incluyen:
i) homeostasis del ion de calcio celular (FDR ~0,0012), una categoría de posible relevancia en todas las áreas de enfermedades pero que adquiere particular importancia a la luz de la alta prevalencia de hipercalcemia en la WBS46 (DEGs en categoría: ATP1A2, ATP2A2, ATP7B, CACNA1A, CALCR, CAV1, CCDC47, CCKBR, CD40, DIAPH1, EDNRB, EPHX2, GRIK2, GSTO1, GTF2I, HRC, ITPR3, KDR, RYR1, RYR2, SLC30A1, SLC8A3, TACR1, TRDN);
ii) morfogénesis del oído interno (FDR ~0,0046), consistente con la combinación de hiperacusia y pérdida auditiva neurosensorial que prácticamente siempre está presente en la WBS47, así como con los trastornos del equilibrio y del procesamiento sensorial que se encuentran en el ASD48 (DEGs en categoría: COL11A1, COL2A1, FZD2, g Bx 2, MAFB, MYO6, NTN1, SOX9, WNT3A, ZEB1, ZIC1);
iii) una serie de categorías relevantes para el fenotipo craneofacial, tal como el desarrollo de órganos del músculo esquelético (FDR -0,0067), la migración (FDR -4,2E-8) y la diferenciación de las células de la cresta neural (FDR ~0,011) (DEGs en cualquiera de los tres categorías: ;
iv) categorías tales como el desarrollo de vasos sanguíneos (FDR ~0,0068) y el desarrollo del sistema cardiovascular (FDR -0,0043), que reflejan la amplia gama de problemas cardiovasculares en la WBS;
v) desarrollo del epitelio renal (FDR -0,0026), en consonancia con las anomalías renales altamente prevalentes de la WBS49.
Es importante destacar que la eliminación de los controles externos no condujo a cambios significativos en los enriquecimientos que obtuvieron los inventores (Figura 14d), lo que indica que la cohorte de líneas reprogramadas internas de la presente invención ya fue suficiente para capturar las características clave de la desregulación transcripcional dependiente de 7q11.23. Además, para excluir la posibilidad de que dichos enriquecimientos pudieran surgir por casualidad, los inventores realizaron una serie de pruebas de mezcla que implicaban comparaciones entre grupos de muestras asignados aleatoriamente (véanse métodos). En los raros casos en donde estas pruebas arrojaron genes expresados diferencialmente, estos no mostraron enriquecimiento con la excepción de la estructura de la matriz extracelular (véanse métodos y como se describió anteriormente), confirmando así que los enriquecimientos que encontraron los inventores son provocados específicamente por los desequilibrios en la dosis de 7q11.23.
Los inventores descubrieron que la mayoría de los DEGs muestran un patrón simétricamente opuesto en las dos afecciones o tienen un cambio en la misma dirección que los controles, lo que indica que los desequilibrios de dosis simétricos afectan principalmente a los mismos programas transcripcionales, ya sea en la misma o en formas simétricamente opuestas. Los inventores procedieron así a descubrir cuáles eran los genes más altamente simétricos, tomando los DEGs para los cuales la expresión media en muestras de control estaba dentro de un intervalo del 20-80% entre las medias de WBS y 7DupASD (~39% de los DEGs) y que tenía una correlación absoluta de Pearson de al menos 0,5 con la dosis del gen de WBS. Este conjunto de alta confianza incluía 166 DEGs simétricos (Figura 15), estableciendo que, en el estado pluripotente, la simetría en la dosis se refleja en al menos un 22% de la desregulación transcripcional. En particular, este conjunto mostró solo un enriquecimiento significativo de GO, concretamente para la categoría de transmisión sináptica (FDR ~0,023; los DEGs en la categoría son: ADCY2, CACNA1A, ETV5, GAb Br 2, GRIN2D, HCN1, ITPR3, KCNK6, KIT, MYO6, NCALD, NPTX1, PCDHB5, PLCB2, RASD2, SLC1A1, SNCAIP, STX1A, STX1B, STXBP1, SYT1). Además, el conjunto de genes simétricamente desregulados incluye genes asociados a fenotipos característicos de las 2 afecciones, como en el caso de PDLIM1 y MYH14, el primero asociado al trastorno por déficit de atención50, crecimiento de neuritas51, defectos cardiovasculares e hiperacusia, y el último implicado en la discapacidad auditiva37.
EJEMPLO 4: La dosis de GTF2I representa una fracción significativa de la desregulación transcripcional en el estado pluripotente.
La evidencia convergente de pacientes atípicos y modelos experimentales13’41’52'54 señalaron el factor de transcripción general GTF2I como un gen crítico para la patogénesis de los déficits cognitivos/conductuales de las dos afecciones. A la luz de los hallazgos anteriores, los inventores preguntaron qué cuota de desregulación transcripcional de 7q11.23 podría atribuirse a GTF2I, utilizando RNAi lentiviral para i) revertir la dosis de GTF2I de 7DupASD a niveles de control, ii) modelar la haploinsuficiencia de GTF2I mediante la eliminación de GTF2I en controles y seleccionar clones cuyos niveles residuales de GTF2I fueran similares a los de las líneas de WBS, iii) exacerbar la desregulación de los objetivos transcripcionales de GTFI que son insensibles a la haploinsuficiencia al eliminar el mRNA de GTF2I también en líneas de WBS (Figura 2c-d). Los inventores seleccionaron y perfilaron mediante RNAseq dos líneas celulares estables de eliminación de GTF2I (KD) por genotipo y sus respectivos controles de horquilla corta scrambled. Dependiendo del enfoque, los inventores estiman que GTF2I es responsable del 10 al 20 % de la desregulación transcripcional dependiente de 7q11.23 (Figura 2e). Curiosamente, los DEGs imputables a GTF2I muestran enriquecimientos significativos en categorías relacionadas con la mayor parte del espectro relevante para la enfermedad (Figura 2f). Por lo tanto, aunque hasta ahora los modelos anteriores han enfatizado el papel de GTF2I en las características cognitivas y conductuales de la WBS13, estos datos indican que GTF2I tiene un papel más amplio en varias vías relevantes para la enfermedad desde el inicio del desarrollo.
EJEMPLO 5: GTF2I ensambla un complejo correpresor transcripcional que contiene LSD1 y HDAC2
Para dilucidar el mecanismo a través del cual GTF2I regula esta parte significativa de la expresión genética relevante para la enfermedad, los inventores purificaron su complejo proteico y definieron su ocupación en todo el genoma. En primer lugar, los inventores probaron la capacidad de dos anticuerpos de GTF2I para inmunoprecipitar GTF2I en su forma nativa (Figura 16a) y seleccionaron los más eficientes para Ip (inmunoprecipitación) a gran escala en una línea de iPSC representativa para cada genotipo, seguido de espectrometría de masas (MS) de bandas discretas de eluatos de IP y la validación de los candidatos seleccionados (Figura 3a-b). Sorprendentemente, los inventores encontraron dos modificadores de cromatina transcripcionalmente represivos, la histona desmetilasa LSD1 (también conocida como KDM1A) y la histona desacetilasa HDAC2 (Q92769), que estaban asociados subestequiométricamente a GTF2I. Además, los inventores identificaron dos factores de transcripción, ZMYM2 y ZMYM3 (A6NHB5), previamente reportados como parte de complejos transcripcionales que contienen LSD1 (complejo BHC)55-57. Es importante destacar que los inventores también encontraron el correpresor RCOR2 (Q8IZ40), reportado recientemente, en lugar de RCOR1, como el principal compañero del LSD1 en el estado pluripotente58. Las otras proteínas identificadas en el complejo son DNMT3B (P11388-4) y FXR1 (P51114).
EJEMPLO 6: Identificación de objetivos de GTF2I en iPSCs derivadas de pacientes con WBS y 7DupASD
La observación de que en GTF2I de iPSCs se asocia con represores transcripcionales fue inesperada a la luz de los informes publicados sobre sus efectos transcripcionales5960 y del hallazgo de los inventores de que los DEGs atribuibles a GTF2I se distribuyen uniformemente entre objetivos reprimidos y activados. Esto plantea la hipótesis de que GTF2I se une directamente sólo a un subconjunto de sus objetivos imputables. Por lo tanto, para discriminar los cambios transcripcionales directos de los indirectos, los inventores determinaron los perfiles de unión de GTF2I mediante ChIP-seq (inmunoprecipitación de cromatina acoplada con secuenciación). Los inventores primero probaron tres anticuerpos disponibles (Cell Signaling, Bethyl y Santa Cruz) en una línea de iPSC de control (Figura 16b), y seleccionaron para experimentos adicionales el anticuerpo con la relación señal-ruido más alta (Figura 16c) y mayor eficiencia en inmunoprecipitación. Los inventores perfilaron 1-2 líneas de iPSC de cada paciente y control, para un total de 12 muestras, e identificaron un total de 1554 genes con un sitio de unión de GTF2I en la región de -2,5 kb/+1 kb alrededor del sitio de inicio de la transcripción (TSS). Después, los inventores se concentraron en los picos que se conservaban en todas las muestras de control y 7dupASD, y consideraron los 436 genes con un pico de confianza tan alto en su promotor como "objetivos principales de GTF2I", cuya anotación funcional se muestra en Figura 3c.
Los 436 genes son los siguientes:
Objetivos principales de GTF2I (pico del promotor conservado en todas las muestras de control):
A R C O , AC0T12, ACTA2, ACTN3, ADA. ADAM I9. ADAMTS10, ADAMTSL5. ADCY3. ADRBK2, AHS. AGPAT3, AGXT2L2, AHCY, ALDH18A1, ANOS, APC2, ARAP1, ARF l. ARHOAP40, ARHGEFl, AR1IGEFIÜL, ARJIGEFI6, ARJD3A, ARMCj , ARPCIB, ATE!, ATG16L1, ATG4D, ATP2C2, ATXN10, AVPI1, B3GNT3, R4GALT4, BCLUB, RCL7R. RCL9, RIK, RRFl, RSND, RTRD11, RTRD6, BTBDR. C Liorna, CI6orP95, ClOorfOO, C19urf66, C 19orf71, C2orT48, C7orF55, C7orf55-LUC7L2, CACT1N-AS1, CAMK1, CAMK2G, CAND2, CASKINI, CBFA2T2, CBX3, CCDC34, CCDC71, CCM2, CCRIO, CD209, CD3EAP, CD83, CDC25B, CDH5, CDK9, CEBPG. CELF5, CUSTI2, CLK3, CNN2, CNTNAP1, COAS Y, COL16A1, CPA5, CPPED1, CRB2, CRER3L4, CRX, CRYBBL. CRYL1, CSRNP1, CST6, CTDSPl, CYB5B, CYB5R3, DAK, DAPK3, D D B l, DDXI7. DEAF1, DEPDC5, DI API 12, DIRAS!, DOCK6. DPM2, DPP3, DPP4, DPPA2. DRG2. DYRK1A, EARS2, EFHDl. EFNB3, EFR3A. EHD2, E1F4EIB, ÉLF4G2, ELAVL3. ELL. EMID1, EML2, EPC2, EXOC2, FAM220A, FAM49B, FAM92B, FAS-ASI, FASTKDS, FBLNI, FBLN2, FBX3, FBXÜ3I, FCHOI, FGF22, FHADI, FOSL2, FOXA3, F$TL5, FUS. FXN, FXYD7, F7.DI, F7D2, GADD45R GALNT10, GALNTI1, GAMT, GARFMF, GAS2L1, GATSL3. GDPD3, G N A I2S GRIP2S GRK6, GKPEL2, GTF2F1, GTPBP3, H6PD, HDAC1, HLA-DPA!, HLCS, HNRNPA2B1, HPS4, ICAM1, IFI30, 1QCA1, IQCE, 1SOC2, JLNB, JUND. KANK2. KCNK15, KCNSl, KCTD14, KCTD21, KDM4A, KHDRBS3, K1FI2. K1F13A, KIF16B, KPTN, KRKMFN2, KRTAP10-4, K X D I, L 1 T D I, L A M O , LARPl, LDLR, LDLRAP1, LGALS!. LGR6, L1NC00620. L1NC00862, LINGOI, LM IK3, LG C10012S39S. LOC100131655, LOC100506082, l.OCl 00506100, LOC100507600, LOC284751, LOC387723, LOC389033, LOXL4, LPAR2, LP1NI, LRRC25, LRRC32, LRRC33, LSR. LUC7L2, MAGI3, MAP1LC3B, MAP4K2, MAPKAP1, MB, MCOLN2, MDS2, MECF9, MFAP2, MFF, MGAT3, M1AT, MJCALL2, M IDN, M1R286L, MIR318S, MIR3190, MIR319I, MIR3529, M1R3960, M1R428I, MIR4497, MÍR4632, MÍR4736, MKNK2, MMP28, MRPS5, MTFPl, M YO IB , MYOCD, N A C O , NAE1, NAPA-ASI, NCOR2, NDEl. NOUFA3, NEK6. NIPSNAPI, NKD1, NLRX1, NM U R l, NPAS1. NPY4R, NR2F6, NR6AI. NTAXI, XUDT3. NUDTS, NYAPl. OGD1IL. OSCAR, PAK4, PAPPA, PASK, PDC4A, PDESA, PDUM1, PJDLIM7, PFARI, PEX5, PGPFPI, PHACTR4, PIIYH, PlANP, PION. PK N I, PLAUR, PLCDI, PUN3, PL1N5, P1.K5, FLOD1, PNPLA6, POLR3K, PP1A,
PPPIRI3L, PPPIR1GA, PPPIR1 A, PPPIR7 PRKCD. PRRT3, PSIP!, P$MG3, PSMG3-AS1,
PTG1S. PTPNII, PTPRU, RABIA, RAB3IL1, RAC1, RAPIGAP, RASCEFIC, RELB,
RHPN2, KJLPLI, RILPL2, RIN3, RPLlS. RPL4, RPSI8, RPSAP58, RRM2, SAIB. SAFB2, SCNBA, SCRNL SEMA4B, SEMA6B, SEPTO, SEPWl, SETDIA, SGSMl, SH2D5.
SH3GLR2, SH3PXD2B, SFI1SAS. SHISA6, S1RPA, SLC12A4, SLCI5A3, SLC1A6,
SLC29A3, SLC2A1, SLC2AI-ASI, SLC38A10, SLC39A1, SLC39A10, SLC43AI, SLC44AI,
SLCS2A3, SLC5AS, SLC6A20, SLC6A4, SNORDló, SNORDISA, SNRNP25, SOGAl, SORBSI, SPATA2, KPIIK2, SPOCDl, SRFBF1, SRPKI, SRPK2, SRRD. SRXN1, SSRP4, ST6GA1.NAC6, STRBP, STXlB, SWSAPL SYMPK. SYN1, SYNGRl, SYNJ2, SYT2,
TADA1, TAFGL, TAGLN, TBCID2, TBX6, TBXA2R. TCEA2, TCB, TCIRG1, TCTN3,
TESO, TEX40, TFE3, THUMPD2, TINAGL l, TJP3, TKT, TMCó, TMC7, TMEN1I20A,
TMEM14B, TMEM161A, TMEM194B, TMEM200B, TMEM229B. TMEMSO, TNFAIP8L1,
TNNT2, TNRC1B, TOPORS-ASl, TP531II, TPM4, TPST2, TRIM26, TRIM50, TRMTI, TRPV4. ISCI, TSPO, TTC38 TUB, TVP23A, UBE2QI, UBFDI, UBOX5, USHBPl, USP35,
VAVI, VPS37C, YPS37D. VPSS2, VSTM2L, WRSCR27, WDR38, WNT+, WSCD2, XKR7.
YIPFI, ZBTB47. ZCCHCI4, ZDUIICI2, ZDHHC24 ZFAND4, ZMYM6NB, ZNF234,
ZNF23G, ZNF335, ZNF500, ZNF579. ZNF6Ü6, ZNF646, ZNF663, ZNFS1%ZNRF4,
ZSWJM4, ZWILCH
Todos los objetivos de GTF2I (pico de promotor significativo en el análisis combinado):
ABC A 7, ABCC3, ABCD4, ABHD3, ABHDS, ACADIO, ACBD4, ACMSD, ACOT12, ACP?.
ACTA2, ACTLS, ACTN3. A{ YR2B, ADA, ADAMI9, ADAM32, ADAMTSIO, ADAMTS14, ADAMTSL5, A DAR. ADCY3, ADMS, ADORA 2A, ADRBK2, ADSL, AES, A F API 1.2, AFG3L2, AGPAT3, AGI, AGXT2L2, AHCY. AJMl, AIMIL. AIRE. AKl, AK3, AKNA.
ALDH18AI ALDH1BI, AUDH3B1, ALDH4A1, ALGB, ALS2GL, ALX4, ALYREF, AMIGA I, AMN. ANAPCl, ANAPC11. ANGPT1, ANKLE2, ANKMY1, ANKRD24, ANKRD9, ANOS. AN09, AP4SL APBA3, APÍ'2, APCDD1L, APCDDIL-AS], APOE, APOO, ARAPI. ARFE ARHGAPIB, ARHGAP22, ARHGAP23, ARHGAP27, ARHGAP40, ARHGEF1, ARHGEF10L, ARHGEFI6, ARHGEFI9, ARHGEF3, ARIDIA, ARID3A, ARÍD5A, ARL5A, ARL6IPS, ARMC3, ARPCIB, ARPC4, ARPC4-TTLL3, ARRDC3-AS1, ARSI, ASAP3, ASS1, ASTN2. ATAD2, ATCAY, ATE1, ATE!-ASI, ATGI6L1, ATGI6L2, ATG4D, ATP1A2, ATP2C2, ATPBB3, ATXNlO, AVPI1, AVPRIA, B3GALT5, B3GNT3, I33GNT5, B4GALNT3, B4GALT4, B4GALT5, BAÍAP3, RAX, BCASI, BCAT1, BCL11B, BCL2LI3, BCL7B. BCLO, BCL9L, BCSIL, BENDd, BFSPl. BIK, BLVRB, BMP7, BNIP3,□ PIFB3, GRAP, BRF1, B5ND. B5PRY, BST2. BTBDli, BLEDO, BTBDS, BZRAPI, BZRAPI-AS1, ClOoifSí, OíorflSS, Cl lorfBti, C12üíf49. Clítirt'&S. CHcrfl, Cl6orfS4, Ci6orfí>2. Ciborio. Clóorfitó, C17orf53. C17crf99, C I9qtí25. C 19*05* ClíorfíS. C19orf47, C1OortOO. C 19orfa6, Cl9orf7l. ClDorfBI, Cl ôrfB3. C'lorfl37. CtQC. CIQTNF6, C2lorfR&. C2orf4&, C2orl50. Oarflfc, CJorHÍS. COornOO, C7arrS5, C7oifí?-LL'C7L2, C7orfM, C9orl'40, C9orfV, CABP1, CAC'NAlF, CACNA1H, CACNB3. CACTIN, CACTIIRAS I, CAGE1* CALCA, CALR, CAMKl, CAMK2G. CAMKKI, CAND2. CAPI, CAPN12, CAPN2. CARDID, CARI1SP1, CARNSI, CASC8, CASKINI, CATff-ASl, CBFA2T2, CBLN3, CBXI, CRX3, CRX7, CCDCttO, CCDCBO, CCDCMR. CCDC22, CCDC23. CCDC34, CCDC63. CCDC69. CCDC71, CCL2, CCM2L. CCN12, CCR10, CD19, CD209, CD276. CD3EAP, CD4QLG, CD79B, CDS3. CD99L2, CDA, CDAN1, t DC25B, CDC42BPÜ. CDC42EP2, CDC42EP4. CDH5. CDK2AP2, CDK9, CEACAM í6, CEBPE, CEBPG. CECR5, CELF5, CEMIP, CEMPA. CEP6S, CERS4. CFD, CON, CHADL, ClIDH. CHSTI2, CHST9, CHLK. CILP2, CÍZI, CLASP1, CLDNI4, CLECIOA, CLEC17A, CLEC2L, CLEC4G, CLEC4GP1, CLIP3, CLK3. CLMP, CLPSL2, CLSTÍÍ1, CLU. CLVSl. CMTM3. CNN!, CMN2. CNOT8, CNP, CNPY4, CN1D2, CNTFR, CNTNAPl, COAS Y, C0L16A1, COL0A3, COQ7, COXI0, COXIO-AS!, COX17, CPA5, CPLX2, ETNE5, CPPEDl, CPSFó, CPTtA, CPTlC, CRABP1, CRB2, CREB3U, CREB3L4, CRLFI, CROÍ'C. CRX, CRYBA2, CRYBA4, CRYRR1, CRYGN, CRYLI, CSFI, CSK. CSRXPl, CST11, CST3, CSTO, CSTR, CTD-227QF17J, CTDSPl, CTF1* CXorfSS, CXXC5, CYB5B. CYB5RJ, CYGB, CYHRl, CYLD, CYP20A1t CYP26A1, CYP2W1, CYP4F22, DACT3, DACT3-AS1. DAGI.R, DAK, DAND5. DAPK3, DCK. üCLKI, DCTN6, DCTPPl, DDBI, DDJAS, DDM7, ÜDX54, DEAFI, DEGS2, DF.PDC?, DFFA, DHRSL2, DHRSI-\ DHX35, DIAPH2, DIRAS 1, DLGAP4, DNAAF3, DNAJBS-ASl. UNAJC17, DNMTl, DNMT3B, DOCK11, DOCKO, DOLPPI, DPEPl, DPM2. DPPl, DPP4, DPPA2, DRAH1, DRCl, DRG2, DUS3L, DUSP2S. DUSPS, DYRKIA, E4F1. EARS2, ECD, EEF2K, EFCAB6, EFCAB7, EFHDI, EFNA4, FFNB3, EFR3A, EGR4, EIIRPII I, FIID2, FIF2BY EIF4EIB, EIF4F2, ETF4EJ. FIF4G2, ELAVL3, ELF>, ELFNI, ELFN2. ELL, EMID!, EML2, EML3, ENG. EPB4IL3, EPC2, EPS! 5, ERÍCH2, ERMAP ERP4J, EVAIB, EXÍX'2. EYA2, F11R, F2R. FAMUCA, FAM149A, FAMI60B2, FAM166B, FAM167R, FAMI74B, FAMI7SA, FAMI79A, FAM1ÍÍB, FAM193B, HAMI99X, FAM220A, FAM222A, FAM222A-AS1, FAM49B. FAM64A. FAMOSA, FAM&9B, FAMS3A-ASJT FAM92A1, FAM92B, FANCA. FAS-ASI, FASTKD5. FBLN1, FBLN2. FBN3. FBXL19, FBX02 ], FBX031, FBX04S, FBXW8. FCER2, FCHOl. FGF22, FGFS, FGFRl, FGFR2, FHAD1. FIBCD1; FKBPII FUI,FLJ21408. ¡'LJ26B50. FLJ3Í534, FMNI, F0SL2, FOXA3. FOXNl, FRRS1L, FSD1, FSIPL FSTL5, Fl R1N, FUS. FUTS, FXN. FXYD5, FXVD7, F7D1. FZD2. GABRP GABRR3. GADD45B, GALVriO, ÚALNT] I, GAMT, GAPDHS, GARLML, GAS2L!, GAS7. GAIA2. GATSL3, GBGTI, GCM2, GDPD3, GOPD5. GENIÍM7, GGTI* GKDC GI\TS2. GJPR, GKN2. GNAI2, GNB5, GOLGA3. GOLGA5, G01-TIA. GOTl. GP9, GPAM, GPBPll-l, GPN2. GPR27, GPR64, GFR68, GPX1, GREBI, GRHL3, GRIN3B, GR1P2, GRK5, GRK6, GRFEL2. GSAP, GSC2. GTDCU GTF2E2, GTF2F1, GTT3CI, GTPBP3, GLCVIB2, GUCY2C, H6PD. HAPLN4, HAUS5, MCK, IIDACt. IID AGI I. HEATR5A, HEMKI, H1IEX. MIC']. IIIF3A, HÍRJP3, HLA-DPA1, HLCS, HM13-ASI, HMCN2, HMGN1, HMHAl, NNRNPA2R L HNRNPM, HFD, HPN-AS1, HPSl, HPS4L HRH2. HS1BP3. HS3ST3A1, HSP81, HTR6, K AMI, ICAM3, ID1. IHR3JPL, ÍFI30, IFTI22, IFT43, IGSFI, 1L12RBI, ILJ7RA, IL17RB. II.19. IIJKU. IL2IR. II.4R, INF2, JNHBA, 1NO80, INOBOE. INPP5J. INSR, IN5RK, ÍNTS8. INVS, 1PO0 1P09-ASI, IQCA1, ÍQCD. ÍQCF., ÍQGAP2, IRF2RPI. IRX6, ¡SM2, JSOC2. ISYNAL I I GAL. ITGB3BF, JPH3, JUSB. JUND, KANK2, KANK3, KANTR, KAT2B, KAZN. KCMFI, KCND1, KCNH3, KCNIP3, KCM12, KCNR KCNKt5, KCNK6, KCNMB1, KCN04, KCKSl, KCTD14, KCTD2. KCTD2I, KCTD2UASI, K0LLK3. KDM4A, KEAPl, KHDRBS3, K1AA0556, KIAAII91. K1AA1279, KIAAI&44, KIAAI671. K1AA17SS. KIAA19J9. KIAA20I8, KJFI2, KIFI3A. KIFI6B. KIF3B, K1F6, KLHLI7, KLHL2I, KLHL35, KLHL4, KPNA1, KPNB1, KPTN KRFMEN1. KRF.MFN2. KRTAP102, KKTAPIQ-4. KRTAP5-AS1, KXDL LlTDl, LAMC2, LAMC3, LAMTOKI, LAPTM5, LARPt, LDBI, LDHD, LDLR, LDLRAP1. LEFTY2, LGALS1. LGR6. LHPP, LINC00U2. LINCOÜ2ÜO, LINC’00207. LINC00263. LINCQQ311, LJNC00479. LINC004S9, LINCQ0523, UNCÜQ535, LINCÚ0Ó2Q, L1NC00690. UNCG0862, LINC00877, LÍNCÜÜ959, LINGO 1100, LINGO 1270, LINGO 1272. LINGOI. LIPC, LfTAF, LMNTD2, LMTK3, LOGICO 128398. LOC100128531, LOGICO! 2S5b8, LOC100129973, LOC10013023S, LOCI00I31655. LOC100288366, LOC100335030, LOG100505622, LOG100505666. LOG100505942. LOC100506082, LOG 100506100, LOG 100506119, LOG 100506700, LOG 100506360. LOC 100506985, LOG 100507501, LOG 100507534, LOG 100507600. LOÍ 100996351, LOG JO 1926888, LOG 101927124. LOG 101927272, LOG 101927323, LOC 101927380. LOC 10 J 927954. LOC 101928069, LOC 101928093, LOG I0I9281O7, LOC 101928244, LOC 101928736, LOC 10192*737. LOGIC 1929116, LOC 101929125, LOCIQ19293S4, LOC 101929526, LOC10I929567, LOC 101929657, LOC 102503427, LOCIÜ254629S. LOC 102577424, 1.0002723385, l.OC 102724020, LOC 102724827, LOC 149684. LOC 150381, LOC253044, LOC284751, LOC3S7723, LOC388282, LOC389033, LOC40H77.
LOC440G28, LOC64377G. LOC728743, LOC729%ó, LOXL4, LPAR2, LP1N1. LPP. LPP-AS2, [ PPR2, ERP>, LRRC2S, LRRC32,I.RRC33, LRRTM3, E5R, ETRP4, LUC7L2, LUZP6, LYPD6B, MAG11-AS1, MAGO, MAN2CI, MAPILC3B, MAPlS, MAP2K3, MAP4K2, MAF7DE MAPKAP1, MARRE U MARK4, MASTL MATK, MÍE MBD4, Y1COENE MCOLN2, MDS2, MECR, MRD12L, MED 16, MED 17, MFíf>7. MEF2B, MEGFIO, MEGF8, MEGF9, MEIS3, MELK, MEOX1, MEITL14, MEX3A, MFAP2, \1FF, MFHAS I, MFNG, MFSD4, MGAT3, MÍAT, MICALL2, MIDN, MIEF2, M1ERI, MNP, MJRI229, MIRI249, MIR135B. MI R1470, MIR2L9A2, MIR286I. M1R318S, MTR3190. MIR3I9I, MIR3193. M3R330, MIR3529, MIR3613, M1R365A, MíR39óü, M1R4254, MIR4281, M1R4285, MIR4291, MIR4308, MIR4309, MIR4311, MIR4322, MIR4323. MIR4492, MIR4497, M1R4Í19. M1R4G32. MIR4<j<SG, MIR4672, MIR4686, MIR47I0, MIR4714, MIR4736, MIR4756, MIR4767, MIR4776-I, MIR47S3, MIR50ÜI, MIRS48Z, M1R5689, MIR5690. MIR65I5, MIR6763, V1IR6789, MIR6790, MIR6813, M1R6S43, MKLI, MKL2, MKNK2, MMP28, MOGA) ], MPHOSPH9, MPl, MPKIP, MPVI7L2, MRPL11, MRPL20, MRPL34, MRPL41, MRPL48, MRPL54. MRPSI2, MRPS15, MRPSI7, MRPS2S, MRPS5, MTFPl, MTFR2, MTPN, MTUS1, MTUS2, MUCI2, MYBPC2, MYEOV2, MYHlt, MYH9, MYL2, MYLK, MYOIB, MYOCD, MYRF, N4BP3, NAA35, NACCl, NACC2, NAEl, NANS, NAPA-ASI, NATDI, NOAN, NCMAP, NCOR2, NDEL, NDRG4, NDUFA3, INDIJFA6, NDUFA6-AS1, NDUFAS, \DUFB4, NDCFS4, NEBI,, NEBL-AS1, NEDDI. NEIL1, NEKÓ, NEK9t NEN1F, NES, NEURLIB, NEUROG3, NFATC2, NFE2L3, \FlC t NGFAAPl, NIFK-AS1, NINJ1, NIPALE NIPAL4, N1PSNAP1, NKD1, NKX3-1, NLRP14, NLRXl, NML'RI, NOC2L, NOSJP, NPASl, NPIIP3, NPHP3-ACAD1J. NPHP3-AS1, NPY4R, NR2C2AP, NR2FI. NR2E3, NR2F6, NR6A1, NRGN. NRROS, NRTN, NT5DC3, NITANl, NTNI, NTN5, NTRKE NUCKSI. NUDT21, NUDT3, NUDTS, NUP2I0, NUP2I0L NWDI, NXPH3, NYAP1, OACYLP, OAS2, OCELE OCIAÜ2, OCSTAMP, OGDHL, OGFOD1 OLIG2, ONECUT3, OPCML, OPRL1, ORIOH3, OR2D3, OR3AI, OSCAR, OSGIN1, OTLB2, OVOL3, P2RY6, PAC SIN 3, PAD14, PADlfi, PAH, PAK4, PALM, PAPE, PAPEN, FAPPA, PAPPA-ASI, PAQR7, PARP!5, PASK, PAWR, PC, PCDIII2, PCGFG, POSK4, PDE2A, PDE4A, PDE4C, PDE8A, PDGFD, PDGFRIE PDUME PDEIM7, PEARI, PEF], PEX13, PEX5, PFDN4, PFKFB3, PFKFB4, PGAMS, PGAP2, PGEYRP2, PGPEPl, PHACTR3, PHACTR4, PHFI9, PHEDA2, PHOSPHOI, PHYH, PHYKPL, PIANP, PIGB. PION, PITENME PKÜ2L2, PKNl, PLA2R!, PLAGL2, PLAUR, PLCI33, PLCDl, PLCD3, PLD3, PLEKHA2, PLEKHJ1, PEÍNE PI.1M, PLK5, PI ODI PI.TP, PI.XDC2, PLXNCl. PLXNDI, PMVK, PNKP, PNPEA4, PNPEA5, PNPEA6, PNPLA7, POFUT1, POLG, POLR3K.
POMGNTl, PON2, POP5, POU2F2, PPIA, PPMIH, PPPIRI3L, PPPIR16A, PPPIRI6B, PPPIRIA, PPPIR7, PPP2RIA, PPP2R5D. PPP4R1. PPP5C. PQI.C3. PRCP, PRDVltl, PRDM13, PRELID2, PRELP, PRKCD, PROC'Al. PROSER2, PRPI 40B, PRRI5. PRR29, PRR5. PRRC1. PRRG2. PRRT3. PRX. PSIPI. PSMB4. PSMD9, PSMG3, PSMG3-ASI, PTGIS. PTGS1, PTP4A3, PTPDCI, PTPN1, PTPNII, PTPN3, PTPRA, PTPRS, PTPRU. PUS 10. PVR. PVRL2, PXMP4, PYGM. PYGOl. PYROXD2, QPCT. QSOX2. R3HDML, RABI 1FIP1, RABIA, RAB25, RAB3Ó. RAB39A, RAB3D, RAB3IL1, RAB4B, RAB4B-F.G1.N2, RAB8A. RABF.PI. RABF.PK, RAC1. RAC2. RAD2ILI. RA11. RAI.GAPB, RAI.Y, RANBP3. RAP1GAP, RARA. RARB. RARS. RASD2, RASGFF1 A, RASGEF1C. RASGRP2, RASGRP4. RASSF7, RAX2, RBPMS. RBPMS2. RCAN2. RCAN3, RCAN3AS, RCCI, RCCDI. RCN3, RDHI3. REEP6. RELB. REPIN1, REPS1. REXOl, RFX1. RGAG1. RGCC, RGSI9. RIIBDF2, RHBDL2, RIIOD, RHOH, RMPN2, RII.PI.I, RILPL2, RIMS2, RINI, RÍN3. RIOKI, RIPPI.Y3. RITAI, RNFI80. RNFI87. RNF44. RNF6. RNU6-33P. RNU6-34P. ROM1. ROR1. RPA2, RIJL18. RPL27A. RPL29, RPL4. RPN2, RPP25. RJ’Sl I. RPS18. RPS7, RPSAP58. RRM1. RRM2. RSP04. RTBDN. RTDR1, RT\2. RXRA, RYRI, S100A3. S100A4, S1PR5, SAFB, SAFB2, SAMD4B, SARS2, SBF2-AS1, SCAP. SCMLI. SCMB, SCN8A, SCNNIB, SCNN1G. SCOC, SCRN’I, SCRN2. SDC4, SDHAP3, SDK1, SEC14L5, SEC31B. SEMA4B. SEMA4G, SEMA6B. SEPT5. SEPT9, SEPWI, SERPINA1, SERPINBI, SF.RPIN'HI. SF.TD1 A, SF3A2, SGK3, SGSMI, SGTA. SH2D2A, SH2D3A. SH2D3C, SH2D5, SH3BP2. SH3GLB2. SH3PXD2B. SHANK2. SHD. SHISA5. SHISA6. SH1SA8. SIGLECI, SIPA1L3, SIRPA, SIRT1. SIRT6, SLC12A3, SLCI2A4, SLC13A3, SLC15A3, SLC16A6, SLCIA5, SLC1A6, SLC22AI5, SLC22A23, SLC22A7, SLC25AI7, SLC25A39, SLC25A42. SLC25A47. SLC29A3. SLC2A1, SLC2AI0, SLC2A13, SLC2A1-ASE SLC31A2, SLC35G1, SLC37AI. SLC38A10, SLC39AI. SLC39AI0. SLC3A2, SLC43A1, SLC44AI, SLC52A3. SLC5A5. SLC6A1. SLC6A12. SLC6A2, SLC6A20, SLC6A4. SLC7AI0. SLC7A2. SMIM2-AS1. SNHG5, SNN. SNORA45A, SNORD16. SNORDI8A. SNORD50A, SNORD50B. SNPH, SNRNP25. SNUPN, SNXI9, SNX22. SNX3I. SOCS7. SOD3, SOGAI. SORBSI, SORBS2, SOWAHD, SOX2. SP6, SPAG1, SPAG9. SPATA2. SPHK2, SPIB, SPOCDI, SPTBN4, SPTBN5, SRC, SREBFI, SRF.BF2, SRPKI. SRPK2, SRRD, SRRT, SRSFI2, SRXNI, SSBP4. SSC5D. SSH1, ST3GAL5, ST5, ST6GALNAC6, STARD4. STARD4-ASI, STPGI, STRAO, STRADA, STRBP, STRN3, STXIB, STXBPI, SULTIC2, SULT2BI, SULT4A1. SUOX. SUPT4H1. SUSD3, SWSAP1. SYCE2. SYCP3. SYMPK. SYNI. SYNE3. SYNGRI, SYNJ2. S \rNP02, SA'NRG. SYTI2, SYT2, SYT3. TADAI, TADA3, TAF1B. TAF6, TAF6L. TAGLN, TBCIDI6, TBCID2. TBX6, TBXA2R, TCEA2, TCERGIL. TCF3,TCIRGI, TCLIA, TCL1B. TOTA, TCTEI, TCTN3, TESC, TEX40, TFBIM, TFE3, TFF3,
TGFB3, TGM6, TU, THEG, THOP1, TUPO. TFIUMPD2, TICAMI. TIGD1, TIMMIO,
T1NAGLJ, TJP3, TKT, TLE2, TLE6, TM9SF4, TMC6, TMC7, TMC8, TMED2, TMEMI14,
TMEMI19, TMEM120A, TMEMI47, TMEMI4B, TMEMI5IA, TMEMI61 A, TMEMI94B.
TMEM200B. TMEM21I, TMEM229B. TMEM30C, TMEM37, TMEM40, TMEM54,
TMEM56, TMEM56-RWDD3. TMEM6I, TMEM69, TMEM80, TMEM9, TMEM92,
TMEM9B, TMEM9B-AS1, TMIGD2, TMPRSS13, TMPRSS2, TMPRSS6, TNC, TNFAIP8,
TNFAIPSU, TNFSFI4, TNNT2, TNP02, TNRC18, TNRC6B, TOPORS-AS1, TORIAIP2,
TORIB. TP53I11, TP53RK, TPCNI. TPD52LI. TPM4. TPST2. TR AFI, TRAF5. TRAPPC12,
TRAPPC3, TRIB3. IRIM26. TRIM32. TRIM56, TRIM59, TRIOBP, TR1TI. TRMT1.
TRMTIOC, TRPM6, TRPV4, TSCI, TSPO, TSSC1, TTC'25, TTC'28, TTC'33, TTC38, TTC5,
TTLLI3, TTI.E5, TTYH3, TUB, TUFM, TVP23A, TWSGI. TXN, TXNRDI. TYROBP,
UBA1, LT3A3. UBAC2, ÜBAC2-AS1, UBF.20I. UBE2S. UBFDI, UBOX5, UBXN8, L'PFl,
l'PKlA-ASI, LPKIB. USHBPI, USP35, UTPI1L, VAT1L. VAVI. VEGFC. VPS37B,
VTS37C, VPS37D, VPS52, VSTM2L, VSTM4. VWA8. VWA8-AS1, WARS, VVASF2,
WBSCR27, WDR2S, WDR34. WDR38. WDR52. WDR78. WDR87. WIPF2, WIPF3, VVISP1.
WNT2B, WNT4, VVRB, WSCD2, XKR7, XP07, YBX2. YIFIA, YIFIB, YIPFI, ZBTB40,
ZBTB47, ZCCHC14, ZCCHC18, ZCC’HC'8, ZDHHC12, ZDHHC24, ZFAND4, ZFP64,
ZFYVE19, ZMIZ1, ZMIZ1-AS1, ZMYM6, ZMYM6NB, ZMYND8, ZNF135, ZNFI42,
ZNF2I4. ZNF234, ZNF236, ZNF24, ZNF296, ZNF335, ZNF337, ZNF423. ZNF500, ZNF536,
ZNF579. ZNF592. ZNF606. ZNF613. ZNF646. ZNF668. ZNF687. ZNF689. ZNF710.
ZNF792, ZN! 839, ZNRF4, ZSWIM4, ZUFSP, ZWILCH
Objetivos de GTF2I expresados diferencialmente en iPSC:
ABCA7, ACTN3. ADAMTS10, ALDH18A1, ARL6IP5, ATP1A2, B3GALT5, B3GNT3,
BCL7B, BEND4, BST2, CAPN2. CGN. CHST9, CILP2, CNTFR, CNTNAP1, CPTIC,
CRABP1, CRLF1, CYP4F22, DAGLB, DPPA2, FAM65A. FZD2, GUCY2C, 1LI7RA.
IQGAP2. KCNK6, KL11L4. LAMC3, L1TAF, LOC100130238, LTBP4, MEGFIO, MEGF8,
MEIS3, NTN1. NUP210, PAWR. PDLÍM1. PLOD1. PI.XND1. RASD2, RCN3, RHBDF2,
R1IOH. RPSAP58, RRM2. RYR1. SIPR5. SCAI». SEMA4B, SH2D3A, SHISA6. SLC5A5.
STX1B, STXBP1, SYT2, TBC1D2, TCLIA. TLE2, TMEMI51 A, TMEM161 A. TMEM92,
TRIB3, TR1TI, UBXN8, VAT1L, VPS37D, WBSCR27.
Es importante destacar que, como se muestra en Figura 3d,las líneas de WBS retienen solo un subconjunto de estos objetivos principales de GTF2I, lo que es consistente con una pérdida progresiva de ocupación de GTF2I dependiente de la dosis. A continuación, los inventores confirmaron mediante ChIP-qPCR (ChIP acoplado con PCR cuantitativa en tiempo real) la ocupación dependiente de la dosis en un subconjunto de objetivos principales de GTF2I. Además, validaron un enriquecimiento generalmente más bajo, en WBS, para objetivos sensibles a la dosis, con niveles de unión comparables a las regiones de control negativo (Figura 16d).
Además, los inventores descubrieron que GTF2I se une preferentemente a dominios bivalentes (valor de p <1,58e-03 para objetivos principales y 1,13e-10 para todos los objetivos). Curiosamente, sin embargo, como se reportó anteriormente60,61, la distribución de la unión de GTF2I frente al TSS no se correlaciona con la expresión (Figura 3e, pastel interior). Solo una minoría de los DEGs totales que los inventores descubrieron en iPSC están unidos a GTF2I (~9 %, siendo el 3 % objetivos principales de GTF2I) y, a su vez, solo ~5 % de los objetivos de GTF2I se expresan diferencialmente. Finalmente, dentro de la proporción de DEGs que los inventores encontraron atribuibles al GTF2I tras su eliminación, sólo el 8% parecen ser objetivos directos.
Para comprender la discrepancia entre el impacto transcripcional y la ocupación de GTF2I, los inventores exploraron primero la posibilidad de que la desregulación transcripcional dependiente de la dosis de GTF2I pudiera estar mediada por la unión distal, observando los potenciadores unidos a GTF2<i>asociados a genes objetivo putativos. Sin embargo, los inventores encontraron sólo uno de los 89 potenciadores unidos a GTF2I asociado a un TSS expresado diferencialmente (PHC2) atribuible a GTF2I, excluyendo así que GTF2I actúe principalmente en potenciadores y respaldando el modelo alternativo de un impacto en gran medida indirecto mediado por una minoría de objetivos directos del GTF2I. Por lo tanto, los inventores buscaron, entre los objetivos directos de GTF2I, factores de transcripción candidatos que pudieran mediar su impacto transcripcional general, e identificaron BEND4, un TF que se expresa altamente en el cerebro y es parte de una gran CNV que se ha reportado en un paciente con ASD62. Se confirmó que BEND4 se expresa diferencialmente entre genotipos (Figura 4a-b) y tras la eliminación de GTF2I utilizando varios vectores de expresión de horquilla corta independientes (Figura 4c-d-e). Sorprendentemente, los niveles de BEND4 y GTF2I están significativamente anticorrelacionados en el cerebro humano (coeficiente de Pearson de -0,71 entre los promedios regionales) según un compendio muy reciente de expresión genética en varias regiones del cerebro de más de cien individuos63 (también se encontró una correlación más débil pero significativa entre las regiones del Atlas Allen del cerebro)64.
A continuación, para investigar si GTF2I ejerce su efecto represivo sobre BEND4 a través del componente de LSD1 de su complejo represivo asociado, los inventores probaron el efecto de la inhibición de LSD1 sobre la expresión de BEND4 en la diferenciación de iPSC. Como se muestra en Figura 4f, los inventores encontraron que la inhibición de la actividad de LSD1 utilizando dos inhibidores de LSD1 irreversibles e independientes provocaba una regulación positiva de BEND4, lo que subraya el impacto funcional de los correpresores asociados a GTF2I en sus genes objetivo.
Por lo tanto, los inventores decidieron perfilar la ocupación de LSD1 en iPSCs para probar si podía discriminar objetivos de GTF2I independientes y dependientes de la dosis. La comparación entre los perfiles de GTF2I y LSD1 reveló que, si bien GTF2I ocupa solo una fracción relativamente pequeña de los objetivos de LSD1 (Figura 3f), los inventores pudieron detectar picos significativos de LSD1 en el 53% de los picos conservados de GTF2I (Figura 3g). Curiosamente, aunque menos del 11% de todos los DEGs están unidos por LSD1, esta proporción aumenta al 33% cuando se consideran solo los DEGs unidos a GTF2I (p~3e-8) y la gran mayoría de estos (78%) están regulados a la baja al aumentar la dosis de GTF2I, apoyando un modelo en donde el LSD1 media una parte importante de la actividad represiva de GTF2I.
En particular, los objetivos sensibles a la dosis de GTF2I unidos a LSD1 incluyen otros genes relevantes para la enfermedad, como en el caso paradigmático de CRB2 (Figura 16d), que está implicado en el desarrollo del paladar hendido y del labio leporino65, y cuya sensibilidad a la dosis podría proporcionar un vínculo molecular con los defectos simétricos del filtrum (respectivamente expandidos o reducidos) que se observan en pacientes con WBS y 7dupASD.
Finalmente, los inventores ampliaron sus observaciones más allá del caso específico de BEND4 (Figura 4) con el fin de explorar, a nivel de todo el genoma, la utilidad potencial de los inhibidores específicos de LSD1 para revertir al menos parcialmente los déficits moleculares atribuibles al aumento de la dosis de 7q11.23. Con este fin, compararon el impacto transcriptómico, en su cohorte de líneas de iPSC, de la inhibición de LSD1 mediante la eliminación de RNA de interferencia estable (RNAi) versus inhibidores químicos irreversibles. Curiosamente, a nivel de todo el transcriptoma, mientras que el RNAi de LSD1 elimina líneas agrupadas en lugar de por genotipo (es decir, por CNV de 7q11.23), lo que indica un efecto global importante de este tipo de inhibición de LSD1, las líneas de iPSC tratadas con el inhibidor de LSD1 todavía agrupadas con la línea celular correspondiente tratada con vehículo (DMSO) (Figura 4g). Este resultado indica que la inhibición química del LSD1 tiene un efecto menos dramático en el transcriptoma general en comparación con la eliminación lograda mediante la integración estable de vectores de RNAi (Figura 4h), preservando la identidad transcripcional de líneas celulares individuales probablemente efectuando cambios transcripcionales más selectivos a través de objetivos más específicos. Por lo tanto, examinaron qué porción de los genes expresados diferencialmente imputables a GTF2I (tal como fueron identificados en el experimento de eliminación de GTF2I) también cambian tras la inhibición de LSD1. El análisis de las 2 primeras muestras inhibidas descubrió que 30 genes caen en esta categoría (utilizando una tasa de descubrimiento falso "FDR" de 0,07 y un umbral de cambio >1,15) (Figura 4i), con muchos de ellos perteneciendo a categorías de ontología genética altamente específicas que incluyen: regulación positiva de la fosforilación (IGF1R, CDH2, ARRB1, NRK, EPHA4, IGFBP3), desarrollo del sistema nervioso (IGF1R, CDH2, SERINC5, PRICKLE1, NLGN2, PTPRD, COX7B , ADCY1, MAP2, EPHA4, COL9A1) y morfogénesis de proyección neuronal (IGF1R, PTPRD, ADCY1,<m>A<p>2, EP<h>A4, CO<l>9<a>1). Es importante destacar que una porción significativa de los genes incluidos en esta lista (aproximadamente el 60%) se regula positivamente tras la inhibición de LSD1 según la actividad represiva transcripcional de LSD1 en la lisina 4 de las colas de histona H3. Además, estos objetivos sensibles al LSD1 también incluyen genes críticos que ya se han asociado causalmente con el ASD, tal como NLGN2, MAP2 y PRICKLE1. Curiosamente, sin embargo, dentro de este subconjunto de objetivos sensibles a LSD1, sólo RHBDF2 tiene un pico de GTF2I en su promotor. Esto puede indicar la presencia de una regulación basada en el potenciador distal mediante GTF2I-LSD1 (que escapa a un análisis centrado en el promotor), o la posibilidad de que, además de su papel en los complejos que contienen GTF2I, la inhibición química de LSD1 pueda rescatar varios genes importantes encontrados expresados diferencialmente en las enfermedades, incluso cuando solo están modulados indirectamente por GTF2I (Figura 4i).
EJEMPLO 7: La desregulación transcripcional específica de iPSC se amplifica durante el desarrollo de una manera específica del linaje
El hecho de que las CNVs de 7q11.23 desencadenen una desregulación transcripcional relevante para la enfermedad ya en el estado pluripotente sugiere que estas condiciones iniciales pueden provocar la acumulación de alteraciones transcripcionales aún mayores durante el desarrollo. Además, predice que la desregulación agregada en iPSC en categorías que abarcan varias vías de desarrollo y sistemas de órganos se canalizará tras la diferenciación, lo que dará como resultado la amplificación selectiva de dominios específicos de desregulación específica de iPSC de una manera dependiente del linaje.
Para probar esta hipótesis, los inventores diferenciaron las líneas de iPSC de la presente invención en tres linajes de relevancia cardinal para las dos afecciones (Figura 5a): i) Células madre neurales telencefálicas Pax6+ y progenitores (NPC)30,31; ii) células madre de la cresta neural (NCSC)32, que originan las estructuras craneofaciales junto con varios otros linajes relevantes para la enfermedad; iii) células madre mesenquimatosas (MSC)32, jerárquicamente anteriores a los osteocitos, condrocitos, células del músculo liso y otros tipos de células fisiopatológicamente significativas.
Los inventores confirmaron que los NPCs derivados de pacientes expresaban marcadores clave del prosencéfalo tales como FOXG1, OTX2 y ZO1, y normalmente estaban dispuestos en rosetas neurales con progenitores intermedios de TBR2+ que rodean a progenitores apicales de Pax6+ (Figura 5b). Los inventores perfilaron 15 líneas de NPC derivadas de pacientes y controles y descubrieron que la mayoría de los genes expresados diferencialmente estaban enriquecidos en categorías de GO relacionadas con la función neuronal, tal como la guía de los axones, la regulación de la secreción del transmisor y la regulación negativa de la axonogénesis (Figura 5c).
Paralelamente, los inventores diferenciaron la misma cohorte de líneas de iPSC en NCSC que mostraban una morfología distinta (Figura 17a) y se tiñeron positivamente de manera homogénea para h NK1 y NGFR, una combinación definitoria de marcadores de NCSC, tanto en inmunofluorescencia (Figura 17c) como en citometría de flujo (Figura 5d y Figura 17d). El perfil transcripcional reveló la expresión diferencial en 364 genes (los enriquecimientos de GO se muestran en Figura 5e), incluyendo genes clave relacionados con dismorfismos craneofaciales (ATP2C1, HHAT, LMNB1, MAPK8, PTCH1 y SATB<2 ) 66-73>y señalización de RhoA/Señalización por GTPasas de la familia Rho (WASF1, GFAP, ACTR2, STMN1, MAPK8, ARHGEF11 y PLXNA1 )7475. Es importante destacar que recientemente se ha demostrado que la señalización de la RhoA de la GTPasa pequeña rescata la formación de haces de filamentos de actina SM de las células del músculo liso en un modelo de WBS76.
Finalmente, para definir el impacto de la desregulación transcripcional cebada por iPSC sobre una mayor diferenciación, los inventores indujeron NCSC derivado del paciente hacia el destino de MSC, caracterizado por una morfología típica similar a MSC (Figura 17b) y la expresión de los marcadores clave de MSC CD44 y CD73 (<95%) (Figura 5f y Figura 17e). El perfil transcriptómico confirmó que, con la notable excepción de ELN, también en MSC la expresión de los genes 7q11.23 recapituló la dosis (Figura 17f) y arrojó 422 DEGs que muestran enriquecimiento para varias categorías de GO relacionadas con la morfología del tejido (Figura 5g). Aunque las pruebas de mezclas (véanse métodos) produjeron enriquecimientos en algunas de estas categorías, la eliminación de estos genes potencialmente falsos dejó sin cambios las categorías principales enriquecidas entre los DEGs (Tabla complementaria 7). Sorprendentemente, las muestras se agruparon por genotipo a nivel de transcriptoma completo (Figura 5h), indicando que los desequilibrios de dosis de 7q 11.23 tienen una penetrancia especialmente alta en esta etapa de desarrollo. Sorprendentemente, la muestra atípica (AtWBS1-C2) se agrupó con los controles, lo que sugiere que los genes preservados son particularmente importantes en este linaje, en línea con informes recientes sobre el papel de BAZ1B en la migración de la cresta neural36. Además, un análisis de la vía del ingenio (IPA) sobre DEGs entre WBS y CTL reveló una red molecular (la red de mayor rango) enriquecida para genes relacionados con el desarrollo del sistema cardiovascular (Figura 5i) y que incluye reguladores clave del desarrollo cardiovascular (Figura 5j).
Dada la importancia fisiopatológica de la desregulación transcripcional en MSC, los inventores preguntaron a continuación qué proporción de DEGs específicos de MSC también se vieron afectados en el estado de iPSC. Como se muestra en Figura 6a, 18% de DEGs de MSC ya se expresaban diferencialmente en iPSC (25 % al excluir el control externo de iPSC), y la superposición aumenta constantemente a medida que los inventores consideraron los DEGs de MSC con una expresión más alta en MSC, con un 45 % de los DEGs de MSC expresados por encima de 50 FPKM (Fragmentos por kilobase de exón por millón de fragmentos mapeados) que se encuentran afectados también en iPSC (Figura 18a). Curiosamente, sin embargo, la proporción de DEGs superpuestos no se correlacionó con la expresión en el estadio de iPSC (Figura 18b), argumentando en contra de la hipótesis de una mayor precisión en niveles de expresión más altos. Por lo tanto, los inventores plantearon la hipótesis de que los genes que están desregulados tanto en iPSC como en MSC serían preferentemente aquellos que se activan específicamente tras la diferenciación en MSC. De hecho, los inventores encontraron que de los DEGs de iPSC que están regulados negativamente tras la diferenciación a MSC (más del 60%), muy pocos permanecen expresados diferencialmente también en MSC (Figura 18c). Por el contrario, como los inventores consideran DEGs de iPSC que aumentan la expresión tras la diferenciación en MSC, la proporción de DEGs mantenida también en MSC aumenta a casi el 30 %. Sobre la base de este análisis, los inventores plantearon a continuación la hipótesis de que el subconjunto de DEGs de iPSC que se conserva tras la diferenciación en cada linaje determinado debería enriquecerse preferentemente en categorías relevantes para el linaje. Así, los inventores evaluaron, para cada uno de los tres linajes diferenciados estudiados, la proporción de DEGs conservados para las categorías de GO que ya se habían encontrado enriquecidos en iPSC. Como se muestra en las Figuras 6b-c-d y representado esquemáticamente en Figura 7a,tras la diferenciación, los DEGs de iPSC se retienen preferentemente por categoría de una manera apropiada para el linaje de modo que, para cada linaje objetivo, la proporción de DEGs de iPSC conservados sea mucho mayor en categorías relevantes para ese linaje (tal como la axonogénesis y la guía de axones en el linaje neural, categorías relacionadas con la sinapsis en NCSC que originarán el sistema nervioso periférico y categorías relacionadas con el músculo liso en MSC).
Finalmente, los inventores observaron que la proporción de genes simétricamente desregulados es significativamente mayor entre los DEGs que son comunes entre iPSC y linajes diferenciados (proporción impar promedio ~1,75, p~5e-03 evaluados a partir de pruebas de Chi-cuadrado específicas de linaje compuestas mediante el método de Fisher), que respalda la idea de que los patrones simétricos, probablemente bajo un control más directo mediante una dosis de 7q11,23, son particularmente relevantes para la cuota de desregulación transcripcional relevante para la enfermedad que ya se siembra en el estado pluripotente.
EJEMPLO 8: Una plataforma web para síndromes CNV de 7q11.23
Finalmente, los inventores diseñaron una nueva plataforma web llamada WikiWilliams-7qGeneBase para que sus datos sean accesibles a la comunidad de científicos y profesionales que trabajan en estas dos enfermedades, a través de una interfaz centrada en genes fácil de usar. Además de integrar, de manera multicapa, todos sus resultados con datos de la bibliografía, WikiWilliams está abierto a contribuciones de otros grupos mediante la presentación a los curadores de la base de datos, con el objetivo de reunir en un solo sitio todos los datos moleculares sobre los síndromes de 7q11.23. (Figura 7b y Figura 19). La plataforma es de libre acceso en http://bio.ieo.eu/wbs/.
EJEMPLO 9: Un enfoque para aislar progenitores corticales que expresan FOXG1 derivados de iPSC
La prueba de principio de los experimentos destinados a aislar progenitores corticales mediante selección y clasificación FACS se describe en la Figura 8. Brevemente, los inventores diseñaron un constructo lentiviral que expresa GFP a partir de un promotor ubicuo y el gen de resistencia a la puromicina bajo el control del promotor de FOXG1. La figura muestra la infección de una línea de iPSC de control (reprogramada a partir de un familiar de un paciente con WBS) con diferentes concentraciones de este vector lentiviral, y la evaluación de la eficacia de la infección mediante fluorescencia de GFP (tanto por inmunofluorescencia como por FACS).
EJEMPLO 10: El ensayo de detección basado en qRT-PCR
Los inventores ya han validado el flujo de trabajo automatizado para la puntuación de la expresión de GTF2I y BAZ1B (mediante qRT-PCR multiplex) en iPSC cultivadas en un formato de 96 pocillos (Figura 9). Este es el formato en donde se realizará la detección. Los inventores pudieron medir consistentemente los niveles de GTF2I en 3 concentraciones diferentes de iPSC sembradas (de 6000 a 12000), encontrando la relación lineal esperada entre el número de células y la expresión de GTF2I, con una excelente consistencia en diferentes pocillos de la misma placa. Incluso en pocillos de diferentes placas, las mediciones de qRT-PCR son extremadamente consistentes. La cuantificación muestra un coeficiente de variación (CV) mínimo en las mediciones tanto intra- como inter- placas.
EJEMPLO 11: Establecimiento de líneas celulares clonales transducidas con NGN2
Los inventores modificaron el protocolo para la diferenciación directa de iPSCs hacia el linaje glutamatérgico cortical mediante la inducción de un factor transducido lentiviral, NGN234 Brevemente, el protocolo original emplea dos vectores lentivirales para integrar i) el transactivador de tetraciclina inducible (rtTA) expresado constitutivamente bajo el promotor de UbC y ii) un cDNA que codifica el polipéptido NGN2-EGFP-Puro cuya transcripción es impulsada por el transactivador en presencia de doxiciclina. La ventaja en el uso de este protocolo radica en su simplicidad, su rapidez y la homogeneidad de la población diferenciada resultante. Para mejorar aún más estas características y permitir aumentar la producción neuronal (para detecciones de alto rendimiento que requieren grandes cantidades de neuronas homogéneas), los inventores han ideado una estrategia para establecer líneas celulares clonales que sean fácilmente inducibles mediante la adición de doxicilina en el medio. Los clones se establecen: i) clasificando una población de iPSC co-infectada en una placa de 96 pocillos; ii) seleccionando y expandiendo colonias con una morfología similar a ES (indiferenciada); iii) dividiendo las colonias seleccionadas en dos pocillos y probando uno para determinar la expresión de GFP tras la inducción; iv) expandiendo y almacenando de 3 a 5 líneas de iPSCs positivas para GFP.
Se ha probado la diferenciación de dichas líneas (hasta el día 21 desde la inducción) y muestran los mismos marcadores neuronales maduros, incluyendo los marcadores glutamatérgicos, independientemente del genotipo (Figura 11).
DISCUSIÓN
Los inventores eligieron el par paradigmático de síndromes genéticos provocados por 7q11.23 CNV 7q11.23 simétrico para probar el potencial de las iPSCs para definir cómo la dosis de genes afecta las vías relevantes para la enfermedad en los linajes de desarrollo temprano. Sus hallazgos tienen una gran importancia para la patogénesis molecular de WBS y 7dupASD, así como para el campo del modelado de enfermedades basado en la reprogramación en su conjunto.
Primero, la variabilidad ha sido reconocida recientemente como una preocupación clave para el modelado de enfermedades basado en iPSC, lo que invita a tener precaución en la interpretación de los resultados de unas pocas líneas que no muestrean adecuadamente la variabilidad entre individuos o entre líneas reprogramadas del mismo individuo1. Por lo tanto, al presentar la cohorte más grande de líneas de iPSC caracterizadas hasta el momento para cualquier afección genética individual, combinada con el primer uso a gran escala de la reprogramación sin integración basada en mRNA, la presente invención compara la posibilidad de detectar alteraciones sólidas dependientes de la dosis en los programas transcripcionales, incluso cuando estos son provocados por desequilibrios sutiles en las dosis.
En segundo lugar, el tamaño y la calidad de la cohorte de las iPSCs de la presente invención permitieron dos observaciones clave sobre el impacto molecular de la CNV de 7q11.23: i) que provocaban una desregulación transcripcional significativa en las vías relevantes para la enfermedad ya en el estado pluripotente; y ii) que esta desregulación se amplificó selectivamente de una manera específica del linaje, con vías relevantes para la enfermedad preferente y progresivamente más afectadas en linajes diferenciados que coinciden con dominios de la enfermedad específicos. La importancia de esta observación para el campo del modelado de iPSC radica en el hecho de que el estado pluripotente es, con diferencia, el mejor caracterizado y más estandarizado entre los estadios del desarrollo humano capturadasin vitro.Es importante destacar que también es el más susceptible de ampliación de alto rendimiento. Por lo tanto, la observación de que el estado pluripotente no es sólo estadio viable en donde medir los efectos transcripcionales de las alteraciones genéticas relevantes para la enfermedad, sino que estos efectos también predicen una mayor desregulación en linajes diferenciados, fundamenta la viabilidad de la caracterización de iPSCs de rendimiento medio a alto para anotar funcionalmente genomas humanos, antes de seleccionar líneas y ensayos para cursos de diferenciación más laboriosos.
En términos de la patogénesis molecular de WBS y 7dupASD, además de descubrir el impacto de la dosis de 7q11.23 ya en estado pluripotente, estos resultados también proporcionan un primer punto de entrada para la disección molecular de la característica sobresaliente que caracteriza a estas dos afecciones, a saber, la coexistencia, frente a CNV simétricamente opuestas, de fenotipos tanto compartidos como simétricamente opuestos. Al analizar muchas muestras de ambas afecciones, los inventores pudieron definir un subconjunto de DEGs que sigue una tendencia dependiente de la dosis simétricamente opuesta. Es importante destacar que los inventores descubrieron que esta cuota se retiene significativamente tras la diferenciación, lo que indica que los patrones simétricamente opuestos de expresión génica sembrados ya en el estado pluripotente, probablemente bajo el control directo de la dosis de 7q11.23, se vuelven cada vez más prominentes en los linajes diferenciados relevantes para la enfermedad, por lo que proporcionando una sólida justificación para estudiar estas dos enfermedades (y, por implicación, otros pares de enfermedades simétricas basadas en CNV) juntas. Es importante destacar que el análisis de los inventores de objetivos simétricamente desregulados también descubrió los siguientes genes como candidatos principales para mediar en la patogénesis molecular de aspectos definitorios de las dos afecciones: i) PDLIM1, que se ha asociado con el trastorno por déficit de atención, el crecimiento de neuritas, los defectos cardiovasculares, e hiperacusia; ii) MYH14, que estaba implicado en la discapacidad auditiva; iii) BEND4, un factor de transcripción que alberga el dominio BEN que distingue a una familia de represores neuronales recientemente caracterizada, y que era sensible tanto a la dosis de GTF2I como a su actividad represiva mediada por LSD1, un hallazgo que resuena también con el patrón inversamente correlacionado de GTF2I y la expresión del gen BEND4 en el cerebro humano.
En tercer lugar, tanto los datos epidemiológicos de pacientes atípicos así como los estudios con ratones habían señalado al GTF2I como uno de los genes clave que median los fenotipos de las dos afecciones, especialmente en lo que respecta a los aspectos cognitivo-conductuales. Al rescatar selectivamente los niveles de GTF2I en el fondo de los tres genotipos de 7q11.23 y perfilar la ocupación de todo el genoma de GTF2I en la heterogeneidad de muestras humanas, los inventores proporcionan una disección mecanicista de su contribución, descubriendo que GTF2I representa, en su mayor parte de forma indirecta, una parte significativa y específica del impacto transcripcional dependiente de la dosis de 7q11.23. Es importante destacar que los inventores descubrieron que en el estado pluripotente humano GTF2I ensambla un complejo represor de cromatina con LSD1 y HDAC2 y se une preferentemente a promotores de cromatina bivalentes, cuya resolución temporal ha sido demostrada por nosotros y varios otros grupos como esencial para el desarrollo normal, especialmente a lo largo del linaje neuronal77-80 Esto proporciona el marco conceptual y experimental para investigar el impacto epigenético y transcripcional en objetivos dependientes de la dosis de GTF2I durante el desarrollo. Este resultado también confirma que los inhibidores de LSD1 y/o inhibidores de HDAC2 pueden usarse para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno del desarrollo neurológico que conlleva discapacidad intelectual (ID) y/o que pertenece al Trastorno del Espectro Autista (ASD) y/o Esquizofrenia (SZ).
Finalmente, los inventores proporcionan una plataforma web de código abierto y fácil de usar en donde reunieron los conjuntos de datos de múltiples capas de esta primera cohorte de muestras de WBS y 7dupASD, y que fue diseñada para integrar las contribuciones continuas de toda la comunidad científica que trabaja en estos dos enfermedades, sirviendo así también como una primera plantilla para el intercambio de datos a partir de la anotación del genoma funcional basada en iPSC.
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Claims (1)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de LSD1 para su uso en la prevención y/o tratamiento de un trastorno del espectro autista (ASD) en donde el trastorno del espectro autista (ASD) es 7dupASD, en donde dicho inhibidor de LSD1 se selecciona del grupo que consiste en:
Hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida,
Hidrocloruro de (trans)-N1-((1R,2S)-2-fenilciclopropil)ciclohexan-1,4-diamina,
Hidrocloruro de N-[4-[(1S,2R)-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida,
Hidrocloruro de N-[4-[(1 R,2S)-2-aminociclopropil]fenil]-3-(2-oxooxazolidin-3-il)benzamida,
Hidrocloruro de N-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-4-(1-metil-4-piperidil)benzamida,
DihidroclorurodeW-[4-[trans-2-aminociclopropil]fenil]-4-(4-metilpiperazin-1-il)benzamida,
Hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]benzamida,
Hidrocloruro de trans N-[4-(2-am¡noc¡cloprop¡l)fen¡l]naftalen-1-carboxam¡da,
Hidrocloruro de trans N-[4-(2-am¡noc¡cloprop¡l)fen¡l]naftalen-2-carboxam¡da,
Hidrocloruro de trans N-[(4-(2-aminociclopropil)fenil)]-4-fenil-benzamida,
Hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]-2-(1-naftil)acetamida, y
Hidrocloruro de trans N-[4-(2-aminociclopropil)fenil]-2-(2-na1til)acetamida,
y estereoisómeros, enantiómeros y diastereómeros de los mismos.
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