ES2974073T3 - Uso terapéutico del afatinib en el cáncer - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona afatinib o una sal farmacéutica del mismo para uso en el tratamiento y/o prevención de un cáncer en un paciente que padece una enfermedad causada por un defecto en el mecanismo de reparación del daño del ADN. Sorprendentemente, cuando se administró afatinib a células FA, se confirmó que existía un efecto terapéutico anticancerígeno sin ningún efecto secundario tóxico en el ADN. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso terapéutico del afatinib en el cáncer

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea EP18382527.2 presentada el 16 de julio de 2018.

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la medicina. En particular, la invención proporciona el uso de afatinib en el tratamiento del cáncer, particularmente de un carcinoma epidermoide, en un sujeto que padece anemia de Fanconi.

Antecedentes de la técnica

El genoma humano está constantemente expuesto a diversas fuentes de daño al ADN y nuestro organismo dispone de una serie de mecanismos muy conservados y eficaces responsables de la reparación del ADN. Si estos mecanismos de reparación son defectuosos a causa de mutaciones en genes relevantes, pueden surgir enfermedades con deficiencias en la reparación del ADN.

Hoy en día, existe una serie de enfermedades caracterizadas por defectos genéticos en los mecanismos de reparación del ADN, tales como ataxia telangiectasia, síndrome de rotura de Nimega, síndrome de Werner, síndrome de Seckel, síndrome de Bloom, anemia de Fanconi, xerodermia pigmentosa, síndrome de Cockayne, tricotiodistrofia, entre otras. Aunque son heterogéneos en cuanto a los síntomas, estos trastornos raros comparten muchas características clínicas, tales como insuficiencia de la médula ósea, retraso del crecimiento, trastornos neurológicos, envejecimiento prematuro, afecciones cutáneas, incluidas la pigmentación anómala, la telangiectasia, la xerosis cutánea, la cicatrización patológica, así como un mayor riesgo de desarrollar diferentes tipos de cáncer.

La anemia de Fanconi (AF) es un trastorno autosómico recesivo raro que se caracteriza por anomalías del desarrollo, retraso del crecimiento e insuficiencia progresiva de la médula ósea. Los pacientes con AF muestran con frecuencia anomalías citogenéticas, así como defectos en el mecanismo de reparación del ADN.

Se están realizando muchos esfuerzos en la terapéutica de la anemia de Fanconi para tratar la insuficiencia de la médula ósea, uno de los signos principales y más potencialmente mortales de la enfermedad. Además, como la tasa de mortalidad por insuficiencia de la médula ósea se ha reducido drásticamente en los últimos años, gracias a los protocolos mejorados de trasplante de células madre hematopoyéticas y con la promesa de mejores enfoques, tales como la terapia génica, la siguiente etapa en el horizonte del tratamiento de la anemia de Fanconi debe centrarse en las neoplasias malignas, que es la principal complicación relacionada.

Los pacientes con AF tienen una tasa de supervivencia muy baja después de la aparición de tumores sólidos. Informes recientes respaldan la alta incidencia registrada de carcinoma epidermoide en estos casos, y especialmente de tumores en la zona de la cabeza y el cuello. Sin embargo, también se ha informado de carcinomas hepatocelulares asociados con esteroides anabólicos en pacientes que padecen AF.

Los carcinomas epidermoides de cabeza y cuello (CECC) son el tumor sólido más común en personas con AF. La incidencia es de 500 a 700 veces mayor que en la población general. La incidencia de tumores sólidos es de aproximadamente el 30 % a los 40 años, siendo el 50 % carcinomas epidermoides de cabeza y cuello.

Los CECC en AF muestran claras diferencias en comparación con los CECC observados en la población general. CECC:

- Aparecen a una edad más temprana (20-40 años) que en la población general;

- Se encuentran más habitualmente en la cavidad bucal (p. ej., en la lengua); y

- Presentes en un estadio avanzado.

Además de lo anterior, las personas con AF tienen un mayor riesgo de contraer segundos cánceres primarios en la piel y el aparato genitourinario. Incluso las personas con AF que reciben tratamiento con andrógenos para la insuficiencia de la médula ósea también tienen un mayor riesgo de padecer tumores hepáticos.

En la actualidad, las neoplasias malignas cancerosas se pueden tratar en estos sujetos mediante cirugía. La quimioterapia o radioterapia tradicionales casi se han ignorado en los pacientes con AF porque son extremadamente sensibles a la toxicidad del tratamiento. Una de las principales razones de esta sensibilidad en los pacientes con AF es que las terapias actuales pueden afectar (modificar) negativamente al ADN y, en enfermedades tales como la AF, en donde el mecanismo de reparación del ADN está dañado, esto puede significar la aparición de una complicación médica adicional. Shukla P.et al.,2012 se refiere a tratamientos del cáncer en pacientes con anemia de Fanconi, con, entre otros, fármacos de moléculas pequeñas.

En vista de lo anterior, existe la necesidad de una terapia antineoplásica eficaz y atóxica para pacientes que padecen una enfermedad causada por un defecto en el mecanismo de reparación del daño del ADN, tal como la anemia de Fanconi.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que el afatinib inhibe eficazmente el crecimiento del carcinoma escamoso de cabeza y cuello en xenoinjertos de ratones modelos de AF sin causar efectos secundarios tóxicos en las células de anemia de Fanconi.

Como se muestra a continuación, los inventores evaluaron en primer lugar el efecto del afatinib en el ADN de células cuya maquinaria de ADN funcionaba correctamente. Con este objetivo, evaluaron si el afatinib activaba la ubiquitinación de FANCD2, como una medida indirecta de la activación de la ruta de AF/BRCA. Como se muestra en la FIG. 1(A) y (B), no se detectó ninguna activación, lo que significa que incluso usando concentraciones altas de afatinib (10 |jM), no se produce ningún daño en el ADN (tales como ICL, horquillas de replicación detenidas o DSB). En vista de resultados tan prometedores, los inventores evaluaron además el efecto del afatinib en el ADN de las células de AF, en donde la maquinaria de reparación del daño del ADN no funciona correctamente. Con este objetivo, evaluaron si el afatinib inducía la formación de micronúcleos o la detención del ciclo celular en G2/M. Como se muestra en la FIG. 2(A) y (B), no se detectó inducción de la formación de micronúcleos ni detención en G2/M en líneas celulares linfoblastoides de AF, incluso con el uso de altas concentraciones de afatinib (10<j>M).

Por lo tanto, a partir de estos datos experimentales, la primera conclusión fue que el afatinib no causaba ningún efecto secundario tóxico basado en el ADN en modelos que padecían una enfermedad causada por un defecto en la maquinaria de reparación del ADN.

Los inventores también descubrieron que dicho "efecto inocuo" de la administración de afatinib en el ADN de las células de AF no disminuía, en ninguna medida, su efecto como agente antitumoral. Como se muestra a continuación, la administración oral del afatinib a dos líneas celulares de CECC derivadas de AF en modelos de ratones inmunodeficientes (uno inducido inyectando la línea celular 1604 y el otro inyectando la línea celular 1131) redujo notablemente el tamaño del tumor (FIG. 3A-3B y 4A-4B).

Además de lo anterior, también se descubrió que el afatinib era muy selectivo de las células tumorales frente a las células no tumorales (véase la FIG. 5).

En conjunto, estos resultados respaldan el uso de afatinib como una terapia segura y eficiente para el cáncer en pacientes que padezcan una enfermedad causada por un defecto en el mecanismo de reparación del daño del ADN. La presente invención supone un gran avance en el tratamiento del cáncer en esta población de pacientes que, hasta el momento, solo tenía la resección quirúrgica como principal enfoque terapéutico antineoplásico a causa de los diversos efectos secundarios tóxicos para el ADN de la quimioterapia o la radioterapia.

En vista de lo anterior, la presente invención proporciona el afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer en un sujeto que padece anemia de Fanconi.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1: (A) Se estimularon células U2OS durante una noche con diferentes concentraciones de afatinib o HU 2 mM (como control positivo). Las células se lisaron y se analizó la ubiquitinación de FANCD2 mediante transferencia de Western. Se usó vinculina como control de carga. (B) muestra un gráfico promediado del experimento independiente de células tratadas con afatinib, respectivamente. El eje Y representa el % de ubiquitinación frente a sin ubiquitinación en diferentes concentraciones de afatinib.

FIG. 2: (A) Se utilizaron líneas celulares linfoblastoides WT (barras marcadas con "a") y derivadas de AF ("barras marcadas con b") para analizar la formación de micronúcleos mediante ensayo de micronúcleos por citometría de flujo con diferentes concentraciones de afatinib. (B) muestra la detención del ciclo celular en G2/M, con diferentes concentraciones de afatinib. Se utilizó diepoxibutano (DEB) como control positivo. Las barras muestran la media /- ETM de tres experimentos independientes con resultados similares.

FIG. 3: el afatinib inhibe el crecimiento de la línea celular de CECC AF 1604in vivoen experimentos de xenoinjerto de ratón (A) Tumores extirpados en el punto final. Los números indican el ID del animal. (B) Volumen tumoral: los valores representados como triángulos corresponden al volumen tumoral en el modelo de AF sin tratamiento con afatinib. La flecha indica el inicio del tratamiento. Los valores representados como cruces corresponden al volumen tumoral una vez administrado el fármaco. (C) Peso tumoral medio en el punto final del ensayo: la barra "a" corresponde al grupo que no recibió afatinib; la barra "b" corresponde al grupo que recibió afatinib.

FIG. 4: el afatinib inhibe el crecimiento de la línea celular de CECC AF 1131in vivoen experimentos de xenoinjerto de ratón. (A) Volumen tumoral: los valores representados como triángulos corresponden al volumen tumoral en el modelo de AF sin tratamiento con afatinib. La flecha indica el inicio del tratamiento. Los valores representados como cruces corresponden al volumen tumoral una vez administrado el fármaco. (B) Peso tumoral medio en el punto final del ensayo: la barra "a" corresponde al grupo que no recibió afatinib; la barra "b" corresponde al grupo que recibió afatinib.

FIG. 5: Ensayos de supervivencia en células de AF (FA551, fibroblastos primarios; cuadrado negro) y tres líneas celulares de CECC AF diferentes para afatinib (1365 (línea "a"), 1131 (línea "b") y 1604 (línea "c")). El cociente de CI5o no tumoral frente a tumoral es aproximadamente 340,1.

Descripción detallada de la invención

Todos los términos como se usan en el presente documento en la presente solicitud, salvo que se especifique lo contrario, se entenderán en su significado habitual, como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos usados en la presente solicitud son las que se establecen a continuación y se pretende aplicarlas de manera uniforme a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones a menos que una definición expresamente establecida de otra manera proporcione una definición más amplia.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención proporciona el afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer en un sujeto que padece anemia de Fanconi.

Afatinib es la denominación común internacional (DCI) de la (E)-N-[4-(3-cloro-4-fluoroanilino)-7-[(3S)-oxolan-3-il]oxiquinazolin-6-il]-4-(dimetilamino)but-2-enamida y tiene el número de CAS 850140-72-6. El afatinib tiene la fórmula (I):

Como se usa en el presente documento, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a las sales que son, dentro del ámbito del buen criterio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares, y son acordes con una relación de beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticas aceptables son bien conocidas en la técnica. Son ejemplos de sales de adición de ácidos no tóxicas farmacéuticamente aceptables las sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, o con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o usando otros métodos utilizados en la técnica, tales como el intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases adecuadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos y amonio. Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Las sales farmacéuticas aceptables adicionales incluyen, cuando sea adecuado, amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados usando contraiones, tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquilo inferior y sulfonato de arilo.

El experto en la materia es capaz de preparar sales farmacéuticamente aceptables de afatinib siguiendo métodos rutinarios.

En la presente divulgación, la expresión "enfermedad causada por un defecto en el mecanismo de reparación del daño del a Dn" se refiere a cualquier afección causada por una reducción de la funcionalidad de la maquinaria de reparación del ADN celular. El defecto en el mecanismo de reparación del daño del ADN suele deberse a mutaciones genéticas. Dependiendo de las mutaciones particulares, la enfermedad puede comprender al menos uno de los siguientes síntomas: retraso del crecimiento, trastornos neurológicos, envejecimiento prematuro, cicatrización patológica de heridas, afección cutánea o disfunción hematológica, entre otros.

En la presente divulgación, la expresión "retraso del crecimiento" se refiere a anomalías del desarrollo, retraso mental y/o retraso psicomotor.

En la presente divulgación, la expresión "envejecimiento prematuro" significa que el proceso de envejecimiento, debido a mutaciones en la maquinaria de reparación del ADN, se acelera. Como consecuencia de esta aceleración, la célula/tejido resultante tiene características físicas que no corresponden a la edad real del sujeto sino a una etapa más avanzada.

En la presente divulgación, la expresión "afección cutánea" se refiere a un estado de la piel que no es saludable, por ejemplo, sequedad cutánea a causa de aspereza de la piel, piel seca, flácida y con arrugas, manchas, pecas o dermopatías causadas por el oxígeno activo, y similares. En una realización, la afección cutánea es pigmentación anómala.

En la presente divulgación, la expresión "disfunción hematológica" se refiere a una insuficiencia en uno o más de los órganos que forman parte del sistema hematológico, tales como la médula ósea, el timo u órganos linfáticos secundarios (tales como el bazo, el TLAM, el hígado y los ganglios linfáticos). La insuficiencia orgánica da lugar a una alteración de los niveles de uno o más de los componentes celulares que forman parte de la sangre, tales como eritrocitos, leucocitos y plaquetas, factores de coagulación, antitrombóticos naturales y proteínas del sistema fibrinolítico. En una realización, la disfunción hematológica se debe a una insuficiencia de la médula ósea, que da lugar a una concentración drásticamente reducida de eritrocitos.

En otra realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el cáncer se selecciona de leucemia (leucemia mieloide), carcinoma epidermoide (oral, esofágico o vulvar) y carcinomas hepatocelulares. En otra realización más, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el cáncer es carcinoma epidermoide. En otra realización más, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el cáncer es un cáncer escamoso de cabeza y cuello.

En una realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la invención se refiere al uso del afatinib o la sal farmacéutica del mismo en el tratamiento y/o la prevención de un carcinoma epidermoide o carcinoma hepatocelular en un paciente con AF. En otra realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la invención se refiere al uso del afatinib o la sal farmacéutica del mismo en el tratamiento y/o la prevención de un carcinoma epidermoide en un paciente con AF. En otra realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la invención se refiere al uso del afatinib o la sal farmacéutica del mismo en el tratamiento y/o la prevención de un carcinoma epidermoide de cabeza y cuello en un paciente con AF. En una realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la invención se refiere al uso de, por ejemplo, dimaleato de afatinib (número de CAS 850140-73-7) en el tratamiento y/o la prevención de un carcinoma epidermoide o carcinoma hepatocelular en un paciente con AF. En otra realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la invención se refiere al uso de, por ejemplo, dimaleato de afatinib en el tratamiento y/o la prevención de un carcinoma epidermoide en un paciente con AF. En otra realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la invención se refiere al uso de, por ejemplo, dimaleato de afatinib en el tratamiento y/o la prevención de un carcinoma epidermoide de cabeza y cuello en un paciente con AF.

En otra realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el afatinib o la sal farmacéutica del mismo se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz en forma de una composición farmacéutica, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de afatinib o sal farmacéutica del mismo que, cuando se administra, es suficiente para prevenir el desarrollo de, o aliviar hasta cierto punto, uno o más de los síntomas de la enfermedad que se está tratando. La dosis particular del agente administrado según la presente invención se determinará, por supuesto, según las circunstancias particulares del caso, incluidas la vía de administración, la afección particular que se va a tratar y consideraciones similares.

La expresión "excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composición farmacéutica. También debe ser adecuado para su uso en contacto con el tejido u órgano de seres humanos y animales no humanos sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones en línea con una relación de beneficio/riesgo razonable. Son ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares. Excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como por la producción de cualquier efecto biológico no deseable o la interacción de otro modo de forma perjudicial con cualquier otro componente o componentes de la composición farmacéutica, su uso se contempla dentro del alcance de la presente invención.

La composición farmacéutica proporcionada por la presente invención puede ser oral.

Resulta evidente para el experto que la composición se puede preparar usando excipientes de la técnica anterior y aplicando tecnologías farmacéuticas habituales.

La forma farmacéutica puede ser, por ejemplo, una composición farmacéutica sólida tal como comprimidos o comprimidos recubiertos, polvos, gránulos finos, gránulos, cápsulas, p. ej., cápsulas de gelatina dura o blanda, trociscos (pastillas), una embolada y preparaciones masticables que contienen afatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

La preparación de formas farmacéuticas del tipo mencionado anteriormente es bien conocida en sí a partir de la técnica anterior. La dosis de afatinib o de una composición que contiene una sal farmacéuticamente aceptable de la invención que se va a administrar puede controlarse adecuadamente dependiendo de las formas de dosificación de las preparaciones farmacéuticas deseadas.

La composición farmacéutica que contiene afatinib de la invención se puede administrar a un paciente en una dosis diaria en porciones una o varias veces al día si está en la forma farmacéutica de una preparación sólida administrada por vía oral, tal como un comprimido o una preparación líquida por vía oral o parenteral.

La cantidad de sustancia eficaz también puede formularse en una dosis única, en la medida en que sea razonable desde el punto de vista de la forma farmacéutica de la preparación farmacéutica.

En una realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la forma farmacéutica sólida, tal como una cápsula, un comprimido, una pastilla, un gránulo, un polvo o un líquido u otra forma farmacéutica para aplicación oral puede contener afatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como dimaleato de afatinib, en una cantidad que permita proporcionar entre 10 y 60 mg o entre 20 y 50 mg del principio activo por dosis individual. En una realización, opcionalmente, junto con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, la forma farmacéutica sólida, tal como una cápsula, un comprimido, una pastilla, un gránulo, un polvo o un líquido u otra forma farmacéutica para aplicación oral puede contener afatinib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, tal como dimaleato de afatinib, en una cantidad que permita proporcionar 20, 30, 40 o 50 mg del principio activo por dosis individual. La autorización de la AEMP proporciona también información detallada sobre dosis, vías y composiciones farmacéuticas concretas.

En la preparación de la composición que contiene afatinib, se pueden emplear diversos aditivos utilizados en la actualidad, tales como uno o más de un material de relleno, un agente espesante, un agente gelificante, un aglutinante, un disgregante, un tensioactivo, un lubricante, un agente de recubrimiento, un agente de liberación prolongada, un diluyente y/o uno o más excipientes. Además de lo anterior, el agente de la presente invención puede comprender además, si es necesario, otros aditivos tales como un agente solubilizante, un agente tampón, un conservante, un agente isotónico, un agente emulsionante, un agente de suspensión, un dispersante, un agente endurecedor, un absorbente, un adhesivo, un agente elastificante, un adsorbente, un perfume, un agente colorante, un corrector, un antioxidante, un humectante, un agente protector de la luz, un abrillantador, un potenciador de la viscosidad, un aceite, un adyuvante para la formación de comprimidos y/o un agente antiestático.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, diluyentes tales como manitol, dextrosa, lactosa, lactosa anhidra, celulosa microcristalina, almidón, almidón pregelatinizado y lactitol.

La composición puede incluir, además, disgregantes, tales como croscarmelosa sódica, crospovidona, glicolato sódico de almidón, polacrilina potásica, almidón pregelatinizado y similares y mezclas de los mismos.

En la forma farmacéutica oral sólida de la presente invención se pueden incluir otras categorías de excipientes tales como lubricantes o deslizantes.

La forma de dosificación oral sólida se envasa en un recipiente junto con un medio resistente a la humedad, tal como un desecante.

Por otra parte, también es posible preparar preparaciones farmacéuticas recubiertas mediante el uso de un agente de recubrimiento usado en la actualidad, tal como hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa o polivinilpirrolidona.

Si es necesario, también se puede utilizar un edulcorante no tóxico para AF, tal como en trociscos, jarabes y preparaciones masticables entre otros.

Como solubilizantes no tóxicos para AF se puede utilizar cualquier solubilizante conocido adecuado en el sector médico, por ejemplo, polietilenglicoles, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno (p. ej., poloxámero 188), glicofurol, arginina, lisina, aceite de ricino, propilenglicol, solcetal, polisorbato, glicerol, polivinilpirrolidona, lecitina, colesterol, éster PEG660 de ácido 12-hidroxiesteárico, monoestearato de propilenglicol, polioxi-40-aceite de ricino hidrogenado, polioxil-10-oleiléter, polioxil-20-ceto-esteariléter y polioxil-40-estearato o una mezcla de los mismos. Se puede utilizar cualquier conservante de AF no tóxico conocido para su uso en el campo farmacéutico, por ejemplo, ácido benzoico y sus sales de sodio o potasio, ácido sórbico y sus sales de sodio o potasio, entre otros.

El sistema de tampón utilizado para alcanzar un valor de pH deseado puede ser, por ejemplo, glicina, una mezcla de glicina y HCl, una mezcla de glicina y una solución de hidróxido de sodio, y sus sales de sodio y potasio, una mezcla de ftalato ácido de potasio y ácido clorhídrico, una mezcla de ftalato ácido de potasio y una solución de hidróxido de sodio o una mezcla de ácido glutámico y glutamato.

Son agentes gelificantes adecuados, por ejemplo, la celulosa y sus derivados, como, por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alcohol poli(vinílico), polivinilpirrolidonas, poliacrilatos, poloxámeros, tragacanto, carragenina, almidón y sus derivados o cualquier otro agente gelificante utilizado en la tecnología farmacéutica.

Como potenciadores de la viscosidad se pueden citar, por ejemplo, los agentes gelificantes antes mencionados en pequeñas cantidades, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol o polioles, como el sorbitol y otros alditoles.

Los emulsionantes utilizados, además de los emulsionantes conocidos de la técnica anterior, puede incluir derivados de polioxietileno de aceite de ricino o éteres alquílicos de polioxietileno.

Se pueden utilizar agentes colorantes sintéticos o naturales adecuados, conocidos en el campo farmacéutico, tales como carmín de índigo.

Son componentes oleosos adecuados que pueden estar presentes cualquiera de las sustancias oleosas conocidas de la técnica anterior para la preparación de productos farmacéuticos, tales como, por ejemplo, aceites vegetales, en particular, p. ej., aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de maní, aceite de maíz, aceite de colza, aceite de sésamo y aceite de soja, o triglicéridos de longitud de cadena moderada, p. ej., aceite de coco fraccionado o isopropilmiristato, palmitato o aceites minerales u oleato de etilo.

Los antioxidantes utilizados pueden ser cualquiera de los antioxidantes conocidos de la técnica anterior, por ejemplo, a-tocoferol, butilhidroxitolueno (BHT) o butilhidroxianisol (BHA).

Las composiciones farmacéuticas que contienen estos aditivos se pueden preparar según cualquier método conocido en este campo, dependiendo de la forma farmacéutica. Naturalmente, en las formulaciones utilizadas según la presente invención se pueden emplear otros aditivos que no se han mencionado de forma explícita.

A lo largo de la descripción y en las reivindicaciones, no se pretende que la palabra "comprender" y variaciones de la misma excluya otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Asimismo, la palabra "comprender" abarca el caso de "consistir en". Objetos, ventajas y características adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse poniendo en práctica la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitantes de la presente invención. Los signos de referencia relacionados con los dibujos y puestos entre paréntesis en una reivindicación son únicamente para intentar aumentar la inteligibilidad de la reivindicación y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la reivindicación. Asimismo, la presente invención abarca todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos

Líneas celulares y reactivos

Se cultivaron fibroblastos primarios deficientes en FANCA (FA551) y líneas celulares U2OS, HNSCC VU040-T (WT), VU1131-T2.8 (FANCC<' /_>), VU1604-T (FANCL<' /_>) y VU1365-T (FANCA<' /_>), en DMEM (Biowest) complementado con FBS termoinactivado al 10 % y plasmocina (ant-mpt, Invivogen).

La línea celular linfoblastoide LFA139 proviene de un donante sano, LFA55 provienen de un paciente con anemia de Fanconi con mutaciones bialélicas en el genFANCA.Esta línea celular está disponible en el Departamento de Genética y Microbiología de la Universitat Autónoma de Barcelona. Las líneas celulares linfoblastoides se cultivaron en medio RPMI complementado con un 20 % de FBS termoinactivado, penicilina-estreptomicina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y p-mercaptoetanol, y se mantuvieron entre 0,5-1,5x10<6>células por mililitro.

Los CECC fueron amablemente proporcionados por la Dra. Josephine Dorsman. El bromuro de monoazida de etidio (EMA) era de ThermoFischer Scientific (Cat. n.° e1374).

El IGEPAL era de Sigma (Cat. n.° I8896). La RNasa A era de Invitrogen (Cat. n.° 12091021). La mitomicina C (MMC, ref. M-0503), DAPI (Cat. n.° D9542), sulforodamina B (ref. S1402), ácido tricloroacético (ref. T6399) y p-escina (E1378) eran de Sigma. El dimaleato de afatinib (11492) era de Cayman Chemical.

Ensayo de supervivencia

En la validación antitumoral, las células se sembraron por sextuplicado en placas de 96 pocillos y se dejaron sin tratar durante 24 horas. A continuación, los cultivos se expusieron a 9 concentraciones diferentes de MMC o afatinib, se dejaron 7 días y se tiñeron y midieron con el ensayo de sulforodamina B (SRB) (Vichai, V.et al.,2006). En resumen, las células se fijaron con ácido tricloroacético (TCA) al 30 % durante 1 hora a temperatura ambiente (TA), las placas se lavaron con agua destilada y se secaron. Las células fijadas se tiñeron con 40 ml/pocillo de SRB al 0,4 % en ácido acético al 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron en una solución de ácido acético al 1 %, se secaron y se fijaron con SRB en células disueltas en 200 ml/pocillo de Tris 10 mM, pH 10. Se midió la absorbancia a 495 nm en un lector de microplacas (Sunrise, Tecan). La viabilidad celular se midió aplicando la siguiente ecuación: (DO<495>células tratadas - DO<495>medio)/(DO<495>células de control - DO<495>medio)*100 La CI<50>del afatinib se determinó calculando líneas de tendencia logarítmicas con GraphPad. También se calculó el cociente de CI<50>de líneas celulares no tumorales (fibroblastos primarios) frente a CI<50>promediada de las tres líneas celulares de CECC AF (FIG. 5). ;Transferencia de Western ;Las líneas celulares de CECC y U2OS se lisaron con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (tampón RIPA, 20-188, Millipore), se complementaron con inhibidores de proteasa (04693159001, Sigma), inhibidores de fosfatasa (04906837001, Sigma) y benzonasa (70746, Novagen) y se sonicaron (Branson 250). ;Se realizó una transferencia de Western para detectar la expresión de FANCD2 (Ab2187 de Abcam) y vinculina (Ab18058 de Abcam). ;Ensayoin vitrode micronúcleos por citometría de flujo (FCM) ;El ensayo FCM se ha descrito anteriormente (Bryce S.M.et al.,2007; Avlasevich S.et al.,2011). En resumen, se sembraron 60.000 células/pocillo usando placas de 96 pocillos en un volumen total de 120 pl/pocillo. A continuación, las células se trataron con diepoxibutano (DEB, 0,1 pg/ml) o afatinib durante 3 días. Después del tratamiento, las células se centrifugaron a 800 rpm durante 8 min. Se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron mediante agitación vorticial. Se añadieron 62,5 pl de solución de EMA (0,125 mg/ml en PBS con 2 % de<f>B<s>) a la suspensión celular. Para la etapa de fotoactivación, las placas se colocaron en hielo bajo la luz visible de una bombilla ubicada a 30 cm por encima de las células durante 20 min. Después de la etapa de fotoactivación (el EMA se une covalentemente al ADN de las células con la integridad de la membrana alterada: células muertas o moribundas), las placas se protegieron de la exposición a la luz durante las etapas restantes del procedimiento de tinción. Se añadieron 200 pl de PBS frío con FBS al 2 % y las células se centrifugaron a 800 rpm durante 8 min. Se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron mediante agitación vorticial. La suspensión celular se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 minutos antes de la lisis celular. A continuación, las células se lisaron en un procedimiento de dos etapas. Se añadieron 100 pl de solución de lisis 1 (0,584 mg/ml de NaCl, 1 mg/ml de citrato de sodio, 0,3 pl/ml de IGEpAL, 1 mg/ml de RNasa A, 1 |jg/ml de DAPI). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de la incubación, se añadieron 100 j l de solución de lisis 2 (85,6 mg/ml de sacarosa, 15 mg/ml de ácido cítrico y 1 jg/ml de DAPI) a las muestras y se agitaron en vórtex inmediatamente. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se almacenaron en una cámara frigorífica durante una noche hasta que se midieron las muestras. El análisis de citometría de flujo se realizó con un citómetro FACS Fortessa. ;Se seleccionaron al menos 20.000 acontecimientos positivos para DAPI-negativos para EMA (núcleos divididos) por muestra. Se analizaron 3 repeticiones por condición. Para excluir acontecimientos que no fueran MN o núcleos de células vivas, se utilizaron diferentes selecciones para el análisis que incluye dispersión directa, dispersión lateral, fluorescencia DAPI y EMA. ;La frecuencia de los micronúcleos se expresó como el número de micronúcleos por cada mil núcleos obtenidos. El porcentaje de células detenidas en la fase G2/M se obtuvo en el gráfico con núcleos. ;Experimentos de xenoinjertosin vivo;A ratones NOD-SCID (ambos sexos, edades comprendidas entre 6 y 9 semanas de edad) se les inyectó por vía subcutánea una mezcla 1:1 de 1*10® células VU1131 o VU1604: matrigel en el flanco derecho.

Los animales se supervisaron dos veces por semana (peso y volumen tumoral) hasta que los tumores alcanzaron “ 150 mm3. Once días después de la inoculación, los animales fueron aleatorizados (volumen tumoral y sexo) en 4 grupos experimentales y comenzaron a recibir tratamiento (n=8 animales/grupo): 11) Vehículo (metilcelulosa); 2) Afatinib. Se administró tratamiento a base de afatinib (20 mg/kg) 5 días a la semana por vía oral (sonda) durante aproximadamente 2 semanas.

Los animales se supervisaron tres veces por semana (peso corporal y volumen tumoral) hasta que los tumores alcanzaron “ 1000 mm3. En el punto final, los animales fueron sacrificados y se extirparon quirúrgicamente los tumores. Las muestras de tumores se procesaron para establecer muestras FFPE (fijadas con formalina e incluidas en parafina) y congeladas (-80 °C).

Experimentos de toxicidadin vivo

La generación de ratones con una alteración dirigida en el gen A de la anemia de Fanconi se ha descrito previamente (Rio P.et al.,2002). Se aleatorizaron por peso ratones naturales y con deficiencia de FANCA (hembras, con edades comprendidas entre 8 y 20 semanas) en 2 grupos experimentales y estos comenzaron a recibir tratamiento (n=6 animales/grupo): 1) Vehículo (metilcelulosa); 2) Afatinib. Se administró tratamiento a base de afatinib (20 mg/kg) 5 días a la semana por vía oral (sonda), durante dos semanas.

Los animales se supervisaron tres veces por semana (peso corporal) y se tomaron muestras de sangre de la cola a 0 (pretratamiento), 7 y 14 días (punto final) del tratamiento.

En el punto final, los animales fueron sacrificados y se extrajo la médula ósea de los fémures para su posterior análisis. Resultados

Afatinib no activa la vía de la anemia de Fanconi

Para descartar un efecto tóxico directo sobre el ADN que pudiera perjudicar su uso en pacientes con AF, las células U2OS se trataron con afatinib para analizar la vía AF/BRCA mediante ubiquitinación de FANCD2. Como se ve en la FIG. 1A y 1B, el afatinib no activa la ubiquitinación de FANCD2 ni, por tanto, la vía AF/BRCA, hasta 10 jM, lo que sugiere que no induce ICL, horquillas de replicación detenidas o DSB en el ADN.

Al evaluar su capacidad para inducir micronúcleos o detención del ciclo celular en G2/M en células AF, que son muy sensibles a los ICL, tales como el diepoxibutano, se descubrió que dosis altas de afatinib (10 jM ) no podían inducir micronúcleos ni detención en G2/M en líneas celulares linfoblastoides WT o AF, descartando además un efecto de toxicidad dirigido al ADN (FIG. 2A y 2B).

El afatinib inhibe el crecimiento de CECC de AF en xenoinjertos de ratón

Para comprobar de forma más fisiológica el efecto del afatinib sobre el crecimiento de CECC de AF, se llevaron a cabo experimentos de xenoinjertos en ratones inmunodeficientes NOD-SCID.

Se inyectaron células de CECC por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones y, una vez que alcanzaron un tamaño promedio de 150 mm3 se administró el tratamiento farmacológico por vía oral cinco veces por semana. Se descubrió que las 1604 crecieron muy rápidamente en los grupos de control en solo dos semanas. El tratamiento con afatinib pudo inhibir eficazmente el crecimiento de ambas líneas celulares de CECC. Los mejores resultados se obtuvieron con CECC 1604, donde el fármaco pudo inhibir el tamaño del tumor en todos los ratones, dando una respuesta parcial en 7/8 ratones y enfermedad estable en 1/8 (FIG. 3A y 3B). En CECC 1131, se descubrió que esta línea celular crecía a un ritmo mucho mayor y el tamaño del tumor en el punto final era dos veces mayor que con células de CECC 1604 (figura 4A y 4B).

En resumen, estos resultados permiten concluir que el afatinib puede inhibir la proliferación de células cancerosas escamosas sin inducir toxicidad en líneas celulares de AF, ni activar la vía AF/BRCA ni producir fragilidad cromosómica.

En conjunto, estos resultados respaldan el uso de afatinib como una terapia segura y eficaz para el CECC en la anemia de Fanconi, que podría mejorar eficientemente la evolución natural de esta enfermedad rara.

Lista de citas

Avlasevich S.et al.,"Flow cytometric analysis of micronuclei in mammalian cell cultures: past, present and future", 2011, Mutagenesis, 26, 147-152;

Bryce S.M.et al., "In vitromicronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity", 2007, Mutat. Res. Toxicol. Environ. Mutagen., 630, 78-91;

Rio P.et al., "In vitrophenotypic correction of hematopoietic progenitors from Fanconi anemia group A knockout mice", 2002, Blood, 100, 2032-9;

Shukla P.et al.,"Current and emerging therapeutic strategies for Fanconi anemia", 2012, The HUGO Journal, 6 (1), 1-8.

Vichai V.et al.,"Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening", 2006, Nat. Protoc., 1, 1112-6;

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevención del cáncer en un paciente que padece anemia de Fanconi.

2. Afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso según la reivindicación 1, en donde el cáncer se selecciona entre un cáncer escamoso o un carcinoma hepatocelular.

3. Afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el cáncer es un cáncer escamoso.

4. Afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el cáncer es un cáncer escamoso de cabeza y cuello.

5. Afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que se administra en forma de composición farmacéutica, junto con uno o más excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

6. Afatinib o una sal farmacéutica del mismo para su uso según la reivindicación 5, que se administra en forma de composición farmacéutica oral.

7. Sal de dimaleato de afatinib para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.