ES2975914T3 - Suplemento de medio para cultivo industrial de alto rendimiento de anaerobios fastidiosos y composición de medio que lo contiene - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un suplemento de medio para cultivo de anaerobios de alto rendimiento que incluye N-acetilhexosamina, ácido L-aspártico, L-cisteína y cobalamina, un suplemento de medio de composición media para cultivo de anaerobios de alto rendimiento que incluye el suplemento medio, y un método de cultivo utilizando el mismo. Según la presente invención, es posible proporcionar un método innovador que sea capaz de lograr un cultivo de anaerobios en alta concentración, que son extremadamente difíciles de cultivar con alto rendimiento, y que sea rentable y, en particular, que sea capaz de cultivar grandes cantidades de aerobios fastidiosos adecuados para su uso en aplicaciones alimentarias y farmacéuticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Suplemento de medio para cultivo industrial de alto rendimiento de anaerobios fastidiosos y composición de medio que lo contiene
Campo técnico
La presente invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto. La presente divulgación se refiere a un nuevo suplemento de medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios fastidiosos, una composición de medio que contiene el mismo, y un procedimiento para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios fastidiosos utilizando el mismo, y más particularmente a un suplemento de medio, una composición de medio y un procedimiento de cultivo, que son capaces de producir grandes cantidades de anaerobios fastidiosos incluyendoAkkermansia mudniphilay son adecuados para aplicaciones farmacéuticas y alimentarias.
Técnica antecedente
El término "microbioma humano" hace referencia a las comunidades microbianas que colonizan el cuerpo humano y a los genomas de estas comunidades microbianas. El microbioma ha atraído mucha atención, ya que se ha descubierto que está estrechamente relacionado con la salud humana.
Con el rápido desarrollo de las técnicas de investigación en el campo de la biotecnología, como los modelos animales libres de gérmenes, la secuenciación de próxima generación (NGS) y el análisis multiómico, se hizo posible estudiar la relación entre la función del microbioma y las enfermedades, además de analizar la composición y estructura de la microbiota gastrointestinal, por lo que se han publicado más resultados de investigación. La terapéutica del microbioma o farmacobiótica (probióticos médicos) ha atraído recientemente la atención porque puede utilizarse como terapéutica alternativa para enfermedades infecciosas, inmunitarias y metabólicas contra las que no se dispone de terapias eficaces. Se espera que los productos terapéuticos o farmacobióticos del microbioma sean ventajosamente aplicables a diversas enfermedades intratables si pueden comercializarse mediante la producción en masa.
Dado que el interior del intestino humano se encuentra en un estado anaeróbico, la mayoría de los anaerobios que componen el microbioma son microorganismos anaeróbicos. Estos anaerobios son difíciles de producir en altas concentraciones y grandes cantidades para fines comerciales, porque las fuentes de carbono y nitrógeno disponibles para estos anaerobios son muy limitadas y estos anaerobios tienen la propiedad fisiológica de ser estrictamente anaerobios, lo que es extremadamente sensible al oxígeno. Los microorganismos estrictamente anaerobios son extremadamente difíciles de cultivar y más difíciles de obtener en altos rendimientos de biomasa.
Por ejemplo,Akkermansia muciniphila,que habita en la capa mucosa del intestino grueso y es un candidato farmacobiótico prometedor, puede cultivarse añadiendo mucina gástrica porcina (extraída del estómago porcino) como fuentes de carbono y nitrógeno a los medios (Derrien et al., 2004). Además, las cepas deAkkermansia muciniphilatambién se cultivan en caldo Columbia (CB) y en caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI). Todos estos medios contienen componentes de origen animal y, además, muestran en su mayoría una menor capacidad de cultivo que los medios basados en mucinas, por lo que permiten que las cepas crezcan hasta una densidad óptica final igual sólo a la mitad de la densidad óptica final obtenible con los medios basados en mucinas.
Dado que los componentes de origen animal pueden contener contaminantes de origen viral o bacteriano o pueden contener alérgenos, péptidos antigénicos u otros productos indeseables, se reconoce que estos componentes no son adecuados para su uso en el cultivo de anaerobios para usos alimentarios o farmacéuticos en humanos. Se han desarrollado alternativas a los medios derivados de animales; el documento CN110079474divulga medios de cultivo deAkkermansia muciniphilaque imitan las proporciones de aminoácidos de las mucinas de origen animal. A pesar de los considerables esfuerzos realizados hasta la fecha, los medios convencionales para el cultivo de anaerobios son difíciles de preparar, son caros y, además, no pueden lograr un cultivo de alto rendimiento de anaerobios. Por estas razones, estos medios tienen limitaciones que no pueden utilizarse para fines industriales que no sean fines especiales de investigación.
Divulgación de la invención
Problema técnico
La presente invención ha sido concebida para superar las limitaciones o problemas descritos anteriormente, y un objeto de la presente invención es proporcionar una composición de medio, que pueda producir anaerobios para ser utilizados como terapéuticos del microbioma o farmacobióticos en alto rendimiento de manera estable durante un largo período de tiempo durante el cultivo industrial en masa de estos anaerobios para que sean adecuados para su uso como productos farmacéuticos, alimentos o piensos.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de cultivo capaz de cultivar anaerobios fastidiosos de forma económica hasta una densidad óptica final elevada.
Solución al problema
En el presente documento se describe un suplemento de medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, que incluye N-acetilhexosamina, ácido L-aspártico, L-cisteína y cobalamina.
El suplemento de medio de la presente divulgación puede incluir 5 g/L de N-acetilhexosamina, 8 g/L de ácido L-aspártico, 0,5 g/L de L-cisteína, y 0,0001 a 0,005 g/L de cobalamina.
Los anaerobios pueden ser microorganismos anaerobios estrictos gastrointestinales humanos, incluidos, entre otros,Faecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes caccae, Akkermansia muciniphila, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominisoBifidobacterium longum.
Un aspecto de la presente invención para lograr los objetos anteriores está dirigido a una composición de medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, la composición de medio que contiene: peptona vegetal; extracto de levadura; fosfato de potasio dibásico; como fuente de carbono, lactosa y al menos una de fructosa y maltosa; y como suplemento, N-acetilhexosamina, una mezcla de aminoácidos de ácido L-aspártico y L-cisteína, y cobalamina.
La composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios de acuerdo con la presente invención puede contener 2,5 g/L de fructosa, 2,5 g/L de lactosa, 20 g/L de peptona vegetal, 10 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de fosfato de potasio dibásico, 5 g/L de N-acetilhexosamina, 8 g/L de ácido L-aspártico, 0,5 g/L de L-cisteína, y 0,0001 a 0,005 g/L de cobalamina.
La peptona vegetal puede seleccionarse del grupo formado por la peptona de soja, la peptona de trigo, la peptona de algodón, la peptona de guisante, la peptona de haba, la peptona de altramuz y la peptona de patata, pero sin limitarse necesariamente a ellas.
Otro aspecto de la presente invención para lograr los objetos anteriores está dirigido a un procedimiento para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, el procedimiento incluye la inoculación de anaerobios en la composición de medio descrita anteriormente y el cultivo de los anaerobios inoculados en condiciones anaeróbicas.
El cultivo de los anaerobios inoculados puede realizarse en condiciones de un pH de 6,6 a 7,0, una temperatura de cultivo de 35 a 39°C, una velocidad de agitación de 40 a 50 rpm, un grado de saturación de nitrógeno de 80 a 90%, un grado de saturación de hidrógeno de 0 a 5% y un grado de saturación de dióxido de carbono de 5 a 20%.
En el procedimiento de cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención, los anaerobios cultivados pueden alcanzar una densidad celular correspondiente a un recuento de células viables de 1010 UFC/mL o más, medido por un procedimiento de recuento en placa.
Efectos ventajosos de la invención
Según varias realizaciones de la presente invención, los anaerobios que se van a utilizar como terapéuticos o farmacobióticos del microbioma se pueden producir de forma estable en alto rendimiento durante el cultivo industrial en masa de estos anaerobios para que sean adecuados para su uso como productos farmacéuticos, alimentos o piensos.
Según el suplemento de medio no incluido en el texto de las reivindicaciones y la composición de medio de la presente invención,Akkermansia muciniphila,que es un candidato farmacobiótico prometedor pero es una cepa fastidiosa que no puede producirse en grandes cantidades porque muere incluso por una cantidad mínima de oxígeno debido a su sensibilidad extremadamente alta al oxígeno, puede cultivarse en una concentración alta para que sea adecuada para aplicaciones farmacéuticas o alimentarias.
Los anaerobios cultivados en alto rendimiento utilizando el suplemento de medio no englobado en el tenor de las reivindicaciones o la composición de medio de la presente invención pueden utilizarse ampliamente para farmacobióticos, preparaciones de bacterias lácticas, productos lácteos y probióticos.
Breve descripción de los dibujos
Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la presente invención se comprenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:
La FIG. 1 es una vista esquemática que muestra el proceso del metabolismo del carbono en una cepa deAkkermansia muciniphila;
La FIG. 2 es una vista esquemática que muestra un proceso en el que se biosintetizan varios aminoácidos a partir del ácido aspártico;
La FIG. 3 representa imágenes que muestran las morfologías celulares de diferentes cepas de anaerobios cultivadas en medios que contienen el suplemento de medio descrito en el presente documento y no comprendido en el texto de las reivindicaciones;
La FIG. 4 representa fotografías que muestran cambios dependientes del tiempo de cultivo en el color de un medio en el que se ha cultivado una cepa deAkkermansia mudniphilaen un Ejemplo de la presente invención;
La FIG. 5 muestra el resultado de la observación microscópica deAkkermansia muciniphilay el resultado de analizar el cultivo de un cultivo mediante los resultados del análisis PCR realizado utilizando cebadores específicos;
La FIG. 6 representa gráficos que muestran una curva de crecimiento (FIG. 6A) y un cambio en el pH (FIG.
6B) de una cepa deAkkermansia muciniphilaen función del tiempo de cultivo en un medio que contiene fructosa de la presente invención;
La FIG. 7 representa gráficos que muestran una curva de crecimiento (FIG. 7A) y un cambio en el pH (FIG.
7B) de una cepa deAkkermansia muciniphilaen función del tiempo de cultivo en un medio que contiene maltosa de la presente invención; y
La FIG. 8 representa gráficos que muestran una curva de crecimiento (FIG. 8A) y un cambio en el pH (FIG.
8B) de una cepa deAkkermansia muciniphilaen función del tiempo de cultivo cuando la cepa se cultivó utilizando gas nitrógeno de alta pureza solo en un medio que contenía fructosa de la presente invención.
Modo de la invención
La presente invención se describirá en detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "medio" o "medio de cultivo" se refiere a un medio sólido, semisólido o líquido que contiene todos los nutrientes y parámetros físicos de crecimiento necesarios para el crecimiento o la proliferación microbiana.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cultivo" o "crecimiento" de microorganismos significa multiplicar organismos microbianos dejándolos reproducirse en un medio de cultivo predeterminado en condiciones propicias para su crecimiento.
Tal como se utiliza aquí, el término "suplemento" de medio se refiere a un aditivo que consiste en componentes seleccionados para promover el crecimiento, la proliferación u otras características de uno o más anaerobios deseados.
Tal como se utiliza aquí, el término "anaerobios" se refiere a microorganismos que no crecen en presencia de oxígeno debido a su sensibilidad al oxígeno. Los anaerobios pueden incluir microorganismos anaerobios estrictos u obligados y microorganismos anaerobios facultativos.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "incluye", "comprende", "contiene" y sus variaciones no tienen un significado limitativo cuando estos términos aparecen en la descripción y las reivindicaciones.
Además, en la presente memoria descriptiva, la referencia de intervalos numéricos por extremos incluye todos los números comprendidos dentro del intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, etc.).
Se divulga en el presente documento y no está comprendido en el texto de las reivindicaciones un suplemento de medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, el suplemento de medio incluye N-acetilhexosamina, ácido L-aspártico, L-cisteína y cobalamina. El suplemento de medio de la presente divulgación puede incluir 5 g/L de N-acetilhexosamina, 8 g/L de ácido L-aspártico, 0,5 g/L de L-cisteína y de 0,0001 a 0,005 g/L de cobalamina.
El suplemento de medio de la presente divulgación se utiliza principalmente para el cultivo de anaerobios, y estos anaerobios son microorganismos anaerobios estrictos gastrointestinales.
Ejemplos de estos anaerobios incluyen, pero no se limitan a,Faecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes caccae, Akkermansia muciniphila, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis,oBifidobacterium longum.
El suplemento de medio para cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente divulgación incluye N-acetilhexosamina. La N-acetilhexosamina puede incluir la N-acetilglucosamina (GlcNAc) o la N-acetilglactosamina (GaINAc), preferentemente la N-acetilglucosamina (GlcNAc). La FIG. 1 es una vista esquemática que muestra el proceso del metabolismo del carbono enAkkermansia muciniphila.En referencia a la FIG. 1, puesto que laAkkermansia muciniphilatiene la enzima p-galactosidasa que convierte la lactosa en galactosa y glucosa y la enzima a-glucosidasa que convierte la maltosa en glucosa, las fuentes de carbono como la lactosa, la maltosa y la fructosa se utilizan para formar la molécula de alta energía ATP a través de la glucólisis. La N-acetilglucosamina (Glc-NAc) que se suministra externamente se utiliza para la síntesis de la pared celular (biosíntesis del peptidoglicano) y el metabolismo energético, y la N-acetilglucosamina se metaboliza para producir amoníaco, que neutraliza el citoplasma y también puede funcionar como fuente de nitrógeno. Además de N-acetilglucosamina (Glc-NAc), puede añadirse N-acetilgalactosamina (Gal-NAc).
La N-acetilhexosamina puede incluirse en una cantidad que oscila entre aproximadamente 2,5 y 5 g/L. Los aminoácidos son importantes para mantener la función metabólica de las células cultivadas en medios de cultivo celular. Para mantener un buen crecimiento durante el cultivo de anaerobios en alta concentración, es esencial contar con una fuente externa de proteínas. Los presentes inventores han descubierto que una combinación de ácido aspártico y cisteína entre varios aminoácidos es muy eficaz como fuente de proteínas o de nitrógeno para los anaerobios. Los aminoácidos incluyen L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-cisteína, L-ácido glutámico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-hidroxiprolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina y L-valina, y las mucinas que pueden ser degradadas por laAkkermansia mudniphilase caracterizan por secuencias repetitivas de aminoácidos ricas en serina, treonina, prolina y cisteína. Sin embargo, según la presente invención, laAkkermansia muciniphilapuede cultivarse en alto rendimiento añadiendo ácido aspártico y cisteína entre estos aminoácidos. El ácido aspártico y la cisteína pueden existir en forma D y L.
La FIG. 2 es una vista esquemática que muestra un proceso en el que se biosintetizan varios aminoácidos a partir del ácido aspártico. En referencia a la FIG. 2, el ácido aspártico puede convertirse en homoserina, que es un intermediario en la biosíntesis de la treonina y la metionina, y varios aminoácidos, entre ellos la serina y la prolina, pueden biosintetizarse a partir del ácido aspártico. Además, el ácido aspártico puede producir pentosas fosfato y nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos, ácidos grasos y glutatión (un antioxidante muy importante en algunas bacterias), mejorando así la resistencia al estrés ácido. Además, la biosíntesis de lisina y treonina a partir del ácido aspártico favorece el crecimiento de algunas especies microbianas, y la ingesta de ácido aspártico puede aumentar la diversidad de la microbiota gastrointestinal.
El suplemento de medio de la presente divulgación puede incluir ácido aspártico y cisteína en cantidades en los intervalos de, por ejemplo, aproximadamente 4 a 8 g/L y aproximadamente 0,5 a 1 g/L, respectivamente.
El suplemento medio de la presente divulgación incluye cobalamina, es decir, vitamina B 12. La cobalamina es un cofactor que utilizan las células. Cuando un medio de cultivo no contiene mucina, se requiere una cantidad importante de cobalamina para que los anaerobios crezcan a alta densidad. Por ejemplo, el término "cobalamina" puede incluir cianocobalamina, metilcobalamina, adenosilcobalamina, hidroxilcobalamina. El suplemento de medio de cultivo de la presente divulgación puede incluir cobalamina en una cantidad que oscila entre aproximadamente 0,0001 y 0,005 g/L.
Las vitaminas incluyen biotina, cloruro de colina, ácido fólico, mioinositol, niacinamida, piridoxina HCl, ácido D-pantoténico (hemiCa), riboflavina, tiamina HCl, etc. Sin embargo, cuando se añade cobalamina a un medio, aumenta la abundancia relativa de anaerobios, e incluso si se añaden otras vitaminas, el efecto de la adición de estas vitaminas no difiere significativamente del efecto de la adición de cobalamina sola. El análisis del genoma de laAkkermansia muciniphilaindicó que la mayoría de las cepas, incluida una cepa ATCC BAA-835 y una cepa EB-AMDK19, tienen genes relacionados con la biosíntesis de las vitaminas del grupo B (B1, B2, B3, B5, B6, B7 y b 9), pero no tienen genes relacionados con la biosíntesis de la vitamina B12. Además, en laAkkermansia muciniphila,la cobalamina puede actuar como una coenzima importante en la síntesis de propionato a partir de succinato.
Un aspecto de la presente invención está dirigido a una composición de medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, la composición de medio que contiene peptona vegetal; extracto de levadura; fosfato de potasio dibásico; como fuente de carbono, lactosa y al menos una de fructosa y maltosa; y como suplementos, N-acetilhexosamina, una mezcla de aminoácidos de ácido L-aspártico y L-cisteína, y cobalamina.
Un medio basal para preparar la composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención es preferiblemente un medio líquido con fines de producción industrial mediante cultivo en masa. Este medio basal es un medio que contiene peptona vegetal, extracto de levadura y fosfato potásico dibásico.
La composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención se basa en un medio que contiene peptona vegetal, extracto de levadura y fosfato de potasio dibásico, y contiene, como fuente de carbono, fructosa y lactosa, y como suplemento, N-acetilhexosamina, una mezcla de aminoácidos de ácido L-aspártico y L-cisteína, y cobalamina.
La composición del medio de la presente invención es adecuada para el cultivo de anaerobios, en particular microorganismos anaerobios estrictos. Ejemplos no limitativos de microorganismos anaerobios estrictos incluyen, pero no se limitan necesariamente a,Faecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes caccae, Akkermansia muciniphila, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis,oBifidobacterium longum.La composición del medio de la presente invención es particularmente adecuada para cultivar el géneroAkkermansia,específicamenteAkkermansia muciniphila,en alto rendimiento a escala industrial.
La composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención puede contener 20 g/L de peptona vegetal, 10 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de fosfato de potasio dibásico, 2,5 g/L de fructosa, 2,5 g/L de lactosa, 5 g/L de N-acetilhexosamina, 8 g/L de ácido L-aspártico, 0,5 g/L de L-cisteína, y 0,0001 a 0,005 g/L de cobalamina.
La composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención contiene peptona vegetal S. La peptona vegetal es un hidrolizado de proteínas vegetales. Puede proceder de cualquier planta. La peptona vegetal puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo formado por la peptona de soja, la peptona de trigo, la peptona de algodón, la peptona de guisante, la peptona de haba, la peptona de altramuz y la peptona de patata. La peptona vegetal puede estar contenida en una cantidad de, por ejemplo, unos 15 a 20 g/L.
La composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención contiene extracto de levadura. Cuando se añade extracto de levadura, un aumento de la fuente de proteínas puede incrementar aún más el crecimiento de anaerobios en el medio no derivado de animales. El extracto de levadura puede ser un autolisado de levadura, un extracto de levadura ultrafiltrado o un extracto de levadura sintética. La concentración del extracto de levadura puede ser de 5 g/L a 10 g/L, por ejemplo, unos 10 g/L.
La composición del medio de la presente invención contiene además el componente K2HPO4 que contiene fosfato. Este componente se añade a la composición del medio de cultivo celular para mantener las condiciones isotónicas y evitar el desequilibrio osmótico. El pH de la composición del medio de la presente invención se mantiene dentro del intervalo de 6,5 a 8,0, preferiblemente de 6,0 a 7,0, más preferiblemente alrededor de 6,8 ± 1.
La composición del medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios según la presente invención puede contener fructosa y lactosa como fuente de carbono y como fuente de energía, y puede contener opcionalmente maltosa. La concentración de fructosa o maltosa puede ser de 2,5 g/L a 5,0 g/L, por ejemplo, aproximadamente 2,5 g/L.
Cuando se añade glucosa, ésta no dura mucho tiempo a pesar de inducir el crecimiento exponencial de los microorganismos. Además, la glucosa puede ser suministrada por la degradación de la lactosa unida a la galactosa por enlaces p(1^4)-glucosídicos, y la N-acetilglucosamina y la glucosa son intercambiables en la ruta metabólica. Por estas razones, una combinación de fructosa y lactosa es más preferible que la glucosa.
En la presente invención, el medio de cultivo puede proporcionarse en forma de polvo o concentrado, también denominado generalmente "medio en polvo" o "medio concentrado", que incluye una pluralidad de componentes o puede combinarse con un volumen predeterminado de agua para proporcionar un medio líquido con las concentraciones deseadas de los componentes particulares. Este medio en polvo o concentrado puede disolverse en agua adecuada, normalmente agua estéril, antes de su uso.
Como se usa aquí, el término "medio" o "composición del medio" incluye tanto los medios finales que tienen componentes en concentraciones adecuadas para el cultivo de anaerobios, como los medios en polvo o concentrados adecuados para la dilución.
El medio de cultivo de la presente invención contiene un agente reductor para el cultivo de anaerobios. Los agentes reductores adecuados pueden favorecer el crecimiento de los anaerobios disminuyendo el potencial de oxidaciónreducción del medio de cultivo y eliminando el oxígeno disuelto (barrido de oxígeno). Algunos ejemplos de agentes reductores adecuados son la L-cisteína.
Como se divulga en el presente documento y no está incluido en el texto de las reivindicaciones, el medio de la presente invención puede hacerse anaeróbico sustituyendo el oxígeno en el medio por un gas mixto obtenido mezclando nitrógeno (N2), hidrógeno (H2) y dióxido de carbono (CO2) en una proporción de volumen de 100:0:0 a 90:5:5. Según una realización de la presente invención, la presión en el medio puede ser de 0,1 a 0,3 atm, preferiblemente 0,2 atm (0,02 MPa).
Otro aspecto de la presente invención está dirigido a un procedimiento de cultivo de anaerobios de alto rendimiento, que incluye la inoculación de anaerobios en la composición del medio descrita anteriormente y el cultivo de los anaerobios inoculados en condiciones anaeróbicas.
Las condiciones de cultivo de los microorganismos pueden afectar a la tasa de crecimiento de los microorganismos, como es bien sabido por los expertos en la materia. En la presente invención, el cultivo de los anaerobios inoculados puede realizarse en condiciones de un pH de 6,6 a 7,0, una temperatura de cultivo de 35 a 39°C, una velocidad de agitación de 40 a 50 rpm, un grado de saturación de nitrógeno de 80 a 90%, un grado de saturación de hidrógeno de 0 a 5% y un grado de saturación de dióxido de carbono de 5 a 20%.
En la presente invención, el cultivo de los anaerobios puede realizarse para alcanzar una densidad celular correspondiente a una densidad óptica (DO600) de 0,6 o más, medida a una longitud de onda de 600 nm utilizando un lector de microplacas. En este momento, los anaerobios pueden cultivarse a alta concentración para alcanzar una densidad celular correspondiente a un recuento de células viables de 1010 UFC/mL, medido por un procedimiento de recuento en placa.
La temperatura de cultivo para el cultivo de alta concentración de los anaerobios es preferentemente de 35 a 39°C, en particular de 36 a 38°C. Durante el cultivo, la composición inoculada con la suspensión microbiana puede agitarse. Por ejemplo, las revoluciones por minuto (rpm) de la incubadora pueden ser de 40 rpm a 50 rpm, pero no están limitadas a ello. El período de cultivo puede ajustarse adecuadamente en función del estado de crecimiento de los anaerobios, pero generalmente es de unas 20 a 100 horas, en particular de unas 24 a 48 horas.
Según una divulgación de la presente invención, el medio de la presente invención puede hacerse anaeróbico sustituyendo el oxígeno en el medio por un gas mixto obtenido mezclando nitrógeno (N2), hidrógeno (H2) y dióxido de carbono (CO2) en una proporción de volumen de 90:5:5 a 80:0:20. La sustitución del oxígeno en el medio por el gas mezclado se realiza preferiblemente durante 30 segundos o más, más preferiblemente 2 minutos, en base a 1 mL del volumen del medio.
LaAkkermansia mudniphilautiliza iones de hidrógeno para la síntesis de ATP en la vía metabólica, y el hidrógeno (H2) es importante para la respiración anaeróbica por la hidrogenasa dependiente de Ni en condiciones anaeróbicas. Por lo tanto, para el cultivo de alta concentración de una cepa deAkkermansia muciniphilaEB-AMDK19 en el medio de la presente invención, es necesario inyectar un gas mixto que contenga hidrógeno o un gas que contenga dióxido de carbono, que puede disolverse en agua y generar ácido carbónico e iones de hidrógeno.
La presente invención se describirá con más detalle haciendo referencia a ejemplos, pero el ámbito de la presente invención no se limita a estos ejemplos. A menos que se especifique lo contrario, todas las partes y porcentajes mencionados en estos ejemplos son en peso, y todas las temperaturas se expresan en grados Celsius.
Además, en los ejemplos siguientes, la concentración de anaerobios (cantidad de biomasa producida) se determinó midiendo la densidad óptica del medio de cultivo a 600 nm utilizando un espectrofotómetro durante el periodo de cultivo. La A DO se calculó como la diferencia de absorbancia entre la fase inicial del cultivo y después de 48 horas (o 72 horas) de cultivo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Optimización de la composición del componente de sustitución de la mucina en el medio de cultivo
Basándose en el caldo de digestión de caseína de soja (caldo de soja triptico (TSB)), se investigó la combinación óptima de sustratos y componentes que pueden sustituir a la mucina. Para ello, se inoculó una cepa deAkkermansia muciniphilaEB-AMDK19 (KCTC 13761BP) en cada uno de los medios preparados en una proporción de 0,1% v/v, como se muestra en la Tabla 1 siguiente, y luego se cultivó a 37°C en condiciones anaeróbicas (90% N2, 5% CO2y 5% H2) durante 24 a 48 horas, y se midieron los cambios en su densidad óptica (DO600). Los resultados de la medición figuran en la tabla 1.
[Tabla 1]
Se demostró que la cepaAkkermansia muciniphilarara vez crecía en el medio TSB, pero podía cultivarse cuando se añadían N-acetilglucosamina (GlcNAc) y treonina como componentes capaces de sustituir a la mucina. Sin embargo, se demostró que, cuando se sustituía la treonina por aspartato, la capacidad de cultivo de la cepa mejoraba a la misma concentración (4 g/L), y la capacidad de cultivo aumentaba hasta que se añadía aspartato a una concentración de hasta 8 g/L.
Como puede verse en la Tabla 1, el cambio de absorbancia en cada medio obtenido añadiendo N-acetilglucosamina, lactosa, aspartato y vitamina a TSB fue de aproximadamente 0,4, y el recuento de células viables en este medio fue de 109 UFC/mL. En comparación con esto, el cambio de absorbancia en el medio PM fue de aproximadamente 0,1, y el recuento de células viables en este medio PM se midió en 108 UFC/mL, que era más de 10 veces diferente al del medio TSB.
Se cree que esto se debe a que la familia de aminoácidos oxaloacetato/aspartato está formada por lisina, asparagina, metionina, treonina e isoleucina, y el aspartato puede convertirse en lisina, asparagina, metionina y treonina durante el metabolismo.
Ejemplo 2: Comparación de la capacidad de cultivo en medios con diferentes fuentes de carbono
Para excluir un componente de origen animal o un componente preparado utilizando una enzima de origen animal, se probó la capacidad del suplemento de medio de la presente invención para cultivar anaerobios a base de peptona vegetal y extracto de levadura.
La peptona de soja como peptona vegetal y el extracto de levadura se combinaron entre sí en concentraciones de 5, 10, 15 y 20 g/L y se probaron, y como resultado, una combinación de 20 g/L de peptona de soja y 10 g/L de extracto de levadura mostró la mejor capacidad de cultivo. Además, se añadió fosfato potásico dibásico para ajustar el pH a una concentración de 2,5 g/ L, con lo que se preparó el medio basal.
Para examinar el efecto de las fuentes de carbono en la capacidad de cultivo del anaerobioAkkermansia muciniphila ,se añadieron varias fuentes de carbono a cada medio basado en fuentes de nitrógeno como se muestra en la Tabla 2 a continuación, y se inoculó una cepa deAkkermansia muciniphilaEB-AMDK19 (KCTC 13761BP) en el medio en una proporción de 0,1% v/v y luego se cultivó a 37°C bajo condiciones anaeróbicas (90% N2, 5% CO2, y 5% H2) durante 24 a 48 horas. A continuación, se midieron los cambios en la densidad óptica (DO600) de la cepa, y los resultados de la medición se muestran en la Tabla 3 a continuación.
[Tabla 2]
[Tabla 3]
Como puede observarse en los resultados de la Tabla 3 anterior, se demostró que la capacidad de cultivo de la cepaAkkermansia mudniphilaera mucho mejor en el medio obtenido añadiendo fructosa al medio basado en lactosa como fuente de carbono que en el medio obtenido añadiendo acetilglucosamina o una combinación de N-acetilglucosamina y glucosa al medio basado en lactosa. El cambio en la absorbancia (ADO) resultó ser de aproximadamente 0,5 a 0,6 de media, y el recuento de células viables se midió en aproximadamente 1010 UFC/mL. Así, se confirmó que el recuento de células viables en el medio de la presente invención aumentó de 10 a 100 veces, lo que indica que la capacidad de cultivo en el medio de la presente invención mejoró significativamente. Además, cuando se añadió maltosa a la que dos moléculas de glucosa están unidas por enlaces p(1^4)-glucosídicos, la capacidad de cultivo mejoró en comparación con cuando se añadió glucosa.
Ejemplo 3: La selección de la vitamina del grupo B es importante para mejorar la capacidad de cultivo
En este Ejemplo, se examinó si la adición de vitamina del grupo B al medio de cultivo de la cepaAkkermansia muciniphilamejoraba la capacidad de cultivo. Para seleccionar las vitaminas específicas que influyen en el crecimiento de los anaerobios, se realizaron pruebas para cada una de todas las vitaminas (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B10 y B12) pertenecientes al grupo de la vitamina B o para los complejos de vitamina B.
Como se muestra en la Tabla 4 a continuación, la cepaAkkermansia muciniphilase inoculó en cada medio preparado en una proporción de 0,1% v/v, y luego se cultivó a 37°C en condiciones anaeróbicas (90% N2, 5% CO2y 5% H2) durante 24 a 48 horas, y se midieron los cambios en la densidad óptica (DO600) de la cepa. Los resultados de la medición figuran en la tabla 4.
[Tabla 4]
Como puede observarse en los resultados de la Tabla 4 anterior, se confirmó que la capacidad de cultivo aumentaba sólo cuando el medio contenía cobalamina (vitamina B12) (B12, o B2 B6 B9 B12, B1 B2 B3 B5 B6 B7 B9 B12, o B1 B2 B3 B5 B6 B7 B9 B10 B12), y no hubo diferencias significativas entre la adición de vitamina B12 sola y la adición de complejos de vitamina B.
Además, para encontrar la concentración óptima de cobalamina, se cultivó la cepa mientras se cambiaban las concentraciones de cobalamina, y luego se midieron los cambios en la densidad óptica (DO600) de la cepa. Los resultados de la medición figuran en la tabla 5.
[Tabla 5]
Como puede observarse en los resultados de la Tabla 5 anterior, como resultado de realizar el experimento para encontrar la concentración óptica de vitamina B12 que se añadía al medio, se confirmó que, a una concentración de vitamina B12 inferior a 0,1 mg/L, la capacidad de cultivo disminuía gradualmente, y a una concentración de vitamina B12 que oscilaba entre 0,1 mg/L y 5 mg/L, no aparecía ninguna diferencia significativa en la capacidad de cultivo, lo que indicaba que una concentración de vitamina B12 de 0,1 mg/L era la concentración óptima.
Ejemplo 4: Optimización de los componentes del medio
Con el fin de encontrar los componentes esenciales necesarios para el cultivo de alta concentración de anaerobios y una combinación óptima de los mismos, se cultivó la cepaAkkermansia mudniphilaen medios con varias combinaciones de componentes en las mismas condiciones. Los resultados figuran en la tabla 6.
[Tabla 6]
Como resultado del examen del efecto de cada componente en el cultivo en el medio de la presente invención, se confirmó que, en las combinaciones descritas anteriormente, la N-acetilglucosamina que era un derivado de monosacárido que contenía nitrógeno se identificó como el componente más esencial para el cultivo deAkkermansia mudniphila, y la N-acetilglucosamina y la fructosa y la lactosa, que eran fuentes de carbono que compartían una parte de la vía metabólica, eran componentes necesarios para el cultivo de alta concentración. Además, se confirmó que una combinación de peptona de soja, aspartato y cianocobalamina, que eran las principales fuentes de aminoácidos, era importante para mejorar la capacidad de cultivo.
La maltosa pudo sustituir a la glucosa o la fructosa, y la tasa de crecimiento al inicio del cultivo fue mayor en el medio que contenía maltosa que en el que contenía fructosa o glucosa, y no hubo diferencias significativas en la capacidad de cultivo entre los dos medios. Sin embargo, en la actualidad, la maltosa es algo cara en comparación con la fructosa o la glucosa, por lo que la fructosa se considera el componente del medio industrial más adecuado. En conclusión, como puede verse en la Tabla 6, todos los componentes del medio de la presente invención son necesarios para el cultivo de alta concentración de la cepaAkkermansia muciniphila, y la combinación de todos los componentes presenta la mejor capacidad de cultivo.
Ejemplo 5: Examen de la capacidad de cultivo de varias Akkermansia muciniphila en el medio de la presente invención
Se realizó un experimento de la misma manera que en el Ejemplo 1 anterior, excepto que se utilizó el medio mostrado en la Tabla 2 anterior y se cambió el tipo de cepa cultivada como se muestra en la Tabla 7 a continuación. Concretamente, cada cepa deAkkermansia muciniphilase inoculó en el medio en una proporción de 0,1% v/v, y luego se cultivó a 37°C en condiciones anaeróbicas (90% N2, 5% CO 2y 5% H2) durante 24 a 48 horas. Se midieron los cambios en la densidad óptica (DO600) de cada cepa, y los resultados de la medición se muestran en la Tabla 7 a continuación.
[Tabla 7]
Como puede verse en los resultados de la Tabla 7 anterior, como resultado del examen de la capacidad de cultivo de la cepa estándar deAkkermansia muciniphila(ATCC BAA-835T) y de diferentes cepas deAkkermansia muciniphilautilizando el medio de la presente invención, se pudo confirmar que el medio de la presente invención mostraba niveles de cultivo similares para todas las cepas deAkkermansia muciniphilay, por lo tanto, se puede utilizar como medio para el cultivo de alta concentración de todas las cepas deAkkermansia muciniphila.
Ejemplo 6: Comparación de la capacidad de cultivo de varios microorganismos anaerobios estrictos de tipo fastidioso
Se realizó un experimento de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se cambió el tipo de cepa cultivada como se muestra en la Tabla 8 a continuación. Concretamente, se inoculó una cepa deFaecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes caccaeoBifidobacterium longumen el medio de la presente invención en una proporción de 0,1% v/v, y luego se cultivó a 37°C en condiciones anaeróbicas (90% N2, 5% CO2y 5% H2) durante 24 a 48 horas. A continuación, se midieron los cambios en la densidad óptica (DO600) de cada cepa, y los resultados de la medición se muestran en la Tabla 8 a continuación. Para comparar, cada una de las cepas también se cultivó en medios de control conocidos por mostrar una excelente capacidad de cultivo, y la capacidad de cultivo de cada cepa en los medios de control se comparó con la capacidad de cultivo en el medio de la presente invención. Concretamente, Fprausnitziise cultivó en un medio de infusión de cerebro y corazón (BHI) (suplementado con 5 g/L de extracto de levadura, 1 g/L de celobiosa y 1 g/L de maltosa) como medio de control. A.caccaese cultivó en un medio TSB suplementado con 5 g/L de extracto de levadura, yB. longumse cultivó en caldo BL.
[Tabla 8]
Como puede observarse en los resultados de la Tabla 8 anterior, como resultado de las pruebas de capacidad de cultivo de microorganismos anaerobios estrictos fastidiosos comoFaecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes caccaeyBifidobacterium longum,se confirmó que la capacidad de cultivo de las cepas en el medio de la presente invención era mejor que la de los medios de control conocidos por mostrar una excelente capacidad de cultivo.
Ejemplo 7: Optimización de las condiciones de procedimiento para el cultivo masivo - Análisis comparativo de la capacidad de cultivo en cada condición de cultivo
Usando un sistema de fermentación anaeróbica a escala de 3 L mostrado en la FIG. 4 y cada medio obtenido cambiando el tipo de fuente de carbono en el medio de la Tabla 2, el cultivo se realizó en las condiciones indicadas en la Tabla 9 siguiente. Se obtuvo una curva de crecimiento de la cepaAkkermansia muciniphilay se examinaron los cambios en su pH. Además, se examinaron los cambios en el número de células microbianas y los cambios morfológicos de las mismas mediante observación microscópica, y los resultados se muestran en la FIG. 5. Además, se contó el número de células viables utilizando un procedimiento de recuento en placa, y los resultados se muestran en la Tabla 10 a continuación.
[Tabla 9]
[Tabla 10]
Como resultado del cultivo de la cepaAkkermansia muciniphilaEB-AMDK19 en el sistema de fermentación anaerobia utilizando el medio de la presente invención, se confirmó que la fase exponencial de la cepa se producía entre 5 y 25 horas después de la inoculación y que el cambio de pH se producía rápidamente entre 9 y 18,5 horas después de la inoculación. A las 24 horas de cultivo, la densidad óptica (DO 600) era de aproximadamente 0,798, y el recuento de células viables en ese momento era de 5,5 x 1010 UFC/mL (véase FIG. 6 y tabla 10).
Se confirmó que, cuando la fructosa del medio de la presente invención se sustituyó por maltosa, la fase exponencial de la cepa se produjo entre 3,5 y 21 horas después de la inoculación y que el cambio de pH se produjo rápidamente entre 7 y 14 horas después de la inoculación. Al comparar los resultados del cultivo de la cepa utilizando el medio que contiene fructosa, la fase de latencia en el medio que contiene maltosa de la presente invención se acortó en 1,5 horas. A las 24 horas de cultivo, la absorbancia en el medio que contenía maltosa era de aproximadamente 0,632, ligeramente inferior a la del medio que contenía fructosa, pero el recuento de células viables en ese momento era de 5,1 x 1010 UFC/ mL, que difería significativamente del del medio que contenía fructosa (véase la FIG. 7 y tabla 9).
Como resultado del cultivo de la cepa en el medio que contiene fructosa de la presente invención utilizando un gas libre de hidrógeno (un gas nitrógeno de alta pureza (100% N2) o un gas mixto consistente en 80% N2 y 20% CO2), que es más económico y adecuado para la industrialización, en lugar de un gas mixto (90% N2, 5% CO2, y 5% H2), se demostró que la capacidad de cultivo en el gas nitrógeno de alta pureza era significativamente inferior a la del cultivo convencional, pero la capacidad de cultivo en el gas compuesto de 80% N2 y 20% CO2 no difería significativamente de la del cultivo convencional (véase la FIG. 8 y tabla 10).
Además, como puede verse en los resultados de la Tabla 10 anterior, se descubrió que todos los componentes del medio de la presente invención son necesarios para el cultivo de alta concentración de la cepaAkkermansia muciniphilay que la inyección de un gas mezclado que contiene hidrógeno o dióxido de carbono es adicionalmente necesaria para el cultivo de alta concentración de la cepaAkkermansia muciniphila.

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composición de medio para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, comprendiendo la composición de medio: peptona vegetal; extracto de levadura; fosfato de potasio dibásico; como fuente de carbono, lactosa y al menos una de fructosa y maltosa; y como suplementos, N-acetilhexosamina, una mezcla de aminoácidos de ácido L-aspártico y L-cisteína, y cobalamina.
2. La composición de medio de la reivindicación 1, en la que los anaerobios son microorganismos anaerobios estrictos.
3. La composición de medio de la reivindicación 1, en la que los anaerobios sonFaecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes caccae, Akkermansia muciniphila, Butyricicoccus pullicaecorum, Roseburia inulinivorans, Roseburia hominis,oBifidobacterium longum.
4. La composición de medio de la reivindicación 1, que contiene 20 g/L de peptona vegetal, 10 g/L de extracto de levadura, 2,5 g/L de fosfato de potasio dibásico, 2,5 g/L de fructosa, 2,5 g/L de lactosa, 5 g/L de N-acetilhexosamina, 8 g/L de ácido L-aspártico, 0,5 g/L de L-cisteína, y de 0,0001 a 0,005 g/L de cobalamina.
5. La composición de medio de la reivindicación 1, en la que la peptona vegetal se selecciona del grupo que consiste en peptona de soja, peptona de trigo, peptona de algodón, peptona de guisante, peptona de haba, peptona de altramuz y peptona de patata.
6. Un procedimiento para el cultivo de alto rendimiento de anaerobios, comprendiendo el procedimiento inocular anaerobios en la composición de medio de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y cultivar los anaerobios inoculados en condiciones anaerobias.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que el cultivo se realiza en condiciones de un pH de 6,6 a 7,0, una temperatura de cultivo de 35 a 39°C, una velocidad de agitación de 40 a 50 rpm, un grado de saturación de nitrógeno de 80 a 90%, un grado de saturación de hidrógeno de 0 a 5%, y un grado de saturación de dióxido de carbono de 5 a 20%.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que los anaerobios cultivados alcanzan una densidad celular correspondiente a un recuento de células viables de 1010 UFC/mL o más, medido por un procedimiento de recuento en placa.
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