ES2976061A1

ES2976061A1 - UGT2B10 como predictor de respuesta a la neoadyuvancia en pacientes con cáncer de mama HER2 positivo y receptores hormonales negativos

Info

Publication number: ES2976061A1
Application number: ES202231038A
Authority: ES
Inventors: Cejudo María Angeles Dominguez; Torralvo Ana Gil; Vacas Carmen Garrigos; Bofill Francisco Javier Salvador; Pinelo Sonia Molina
Original assignee: Roche Farma S A; Servicio Andaluz de Salud; Roche Farma SA
Current assignee: Roche Farma S A; Servicio Andaluz de Salud; Roche Farma SA
Priority date: 2022-12-01
Filing date: 2022-12-01
Publication date: 2024-07-22

Abstract

La presente invención refiere al uso in vitro de los niveles de expresión UGT2B10 predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos. Se desarrollan métodos in vitro para la obtención de datos útiles y para el pronóstico de la respuesta a la terapia neoadyuvante en este grupo de pacientes, así como kits para llevar a cabo los métodos de la invención.

Description

DESCRIPCIÓN

UGT2B10 como predictor de respuesta a la neoadyuvancia en pacientes con cáncer de mama HER2 positivo y receptores hormonales negativos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la oncología, y se refiere a un biomarcador para predecir la respuesta a la terapia neoadyuvante en pacientes con cáncer de mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer de mama es a nivel mundial el tumor con más frecuente y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. Su incidencia varía en función del sexo, siendo 100 veces más frecuente en mujeres que en hombres, y de la región geográfica, siendo más frecuente en Europa, Australia y América del norte. El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea, cuya valoración pronóstica clásica se ha basado en parámetros clínicos e histopatológicos. La estadificación de los casos se ha fundamentado sobre todo dos factores. Por un lado, en la afectación ganglionar, donde la supervivencia libre de recaída disminuye a medida que aumenta el número de ganglios afectados, y por otro lado, en el tamaño tumoral, observando que cuanto más pequeño sea el tumor mayor es la supervivencia libre de enfermedad. Se debe tener en cuenta que el grado histológico o grado de diferenciación de las células tumorales es un importante factor pronóstico del cáncer.

Los avances en las técnicas de biología molecular han permitido clasificar los tumores de mama en diferentes subtipos moleculares a partir del análisis de expresión diferencial mediante microarray. Gracias a estas técnicas Perou y Sorlie definieron por primera vez los siguientes subtipos moleculares dentro del cáncer de mama: luminal A (que representa el 25-45% de todos tumores de mama), luminal B (15-50%), HER2 positivo (5-15%) y triple negativo (10-20%). Cada uno de estos subtipos moleculares se asocia con diferencias tanto en el tratamiento como en el pronóstico del cáncer (1-3).

En la práctica clínica habitual se realiza una clasificación subrogada del tumor basándose en marcadores inmunohistoquímicos (IHQ), los cuales tienen valor pronóstico: la expresión de receptores hormonales (RH), siendo estos los receptores de estrógeno (ER) y los receptores de progesterona (PR), permite identificar pacientes de mejor pronóstico y candidatas a terapia hormonal; la medición de la sobreexpresión del receptor de membrana HER2 permite diferenciar a un grupo de tumores más agresivos pero candidatos a tratamiento diana siendo también un marcador pronóstico. Por otro lado, el índice de proliferación tumoral, determinado por la expresión de moléculas como el MIB-1 (ki67), tiene valor pronóstico ya que a mayor actividad proliferativa peor pronóstico (4).

Desde hace varias décadas existen tratamientos biológicos o terapias dirigidas diseñadas para actuar con precisión en los procesos moleculares específicos que necesita el tumor para su crecimiento y progresión, siendo de esta forma más eficaces y presentando perfiles de toxicidad menores. Por ejemplo, en el cáncer de mama HER2 positivo existen algunas terapias dirigidas específicas como los anticuerpos monoclonales trastuzumab o pertuzumab, entre otros.

En estos pacientes con subtipo de cáncer de mama HER2 positivo, la quimioterapia neoadyuvante es el tratamiento de elección con cáncer de mama localizado o localmente avanzado no metastásico. Una buena respuesta a la quimioterapia neoadyuvante, tal que permita alcanzar la respuesta completa patológica o "pCR” por sus siglas en inglés, aumenta la supervivencia libre de enfermedad de las pacientes. Aunque hay diversos criterios para definir respuesta completa patológica o "pCR”, en general se define como la desaparición completa en un análisis anatomo-patológico de la pieza quirúrgica del componente infiltrante del tumor, tanto en la mama como en la axila. Dicho de otra forma, se trata de la ausencia de enfermedad residual en la mama y en los ganglios linfáticos situados en la axila.

Otro de los objetivos de la quimioterapia como tratamiento neoadyuvante es mejorar las opciones quirúrgicas para un paciente, convirtiendo tumores inoperables en operables, lo que a su vez permite obtener mejores resultados estéticos tras la cirugía.

Así pues, resulta de especial interés tratar de identificar predictores moleculares de la respuesta a la quimioterapia como tratamiento neoadyuvante, de forma que se pueda predecir qué pacientes conseguirán una respuesta completa patológica o "pCR”, o cuáles tendrán un pronóstico favorable, aunque no alcancen una respuesta completa patológica.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El propósito de la presente invención es identificar qué pacientes con cáncer de mama HER2 positivo (HER+) y receptores hormonales negativo (RH-) van a tener un beneficio real como respuesta al tratamiento neoadyuvante.

En la presente invención, se identifica que la sobreexpresión del gen UGT2B10 en el tejido tumoral se correlaciona con la ausencia de una respuesta patológica completa (pCR) a la terapia neoadyuvante en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos. La invención se refiere también a un método para predecir la respuesta al tratamiento neoadyuvante en este tipo de pacientes con cáncer de mama, permitiendo discernir dos grupos de pacientes con el mismo diagnóstico pero distinto comportamiento clínico.

Los genes UDP-glucuronosiltransferasa (UGT) codifican enzimas que participan en la glucuronidación, proceso en el que las enzimas UGT transfieren la fracción polar del ácido UDP-glucurónico a una amplia variedad de compuestos endógenos, incluidas las hormonas esteroideas. Son enzimas metabolizadoras de fármacos de fase II, con capacidad de eliminación de esteroide/lípidos en el hígado y varios tejidos diana de los esteroides. La superfamilia de genes UGT que se divide en UGT1 y UGT2 según las similitudes en la secuencia de aminoácidos y los sustratos diana dictados por la especificidad de sus extremos amino-terminales. En concreto dentro de UGT1 se engloban: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9 y UGT1A10 y dentro de UGT2 se engloban: UGT2A1, UGT2A2, UGT2A3, UGT2B4, UGT2B7, UGT2B10, UGT2B11, UGT2B15, UGT2B17 y UGT2B28. Por tanto, el gen UGT2B10 estaría dentro de la familia de genes UGT2B.

Tal y como se ha podido comprobar en la presente invención, la cuantificación de la expresión del gen UGT2B10 en el tejido tumoral permite discernir a las pacientes con una respuesta patológica completa (pCR) de aquellas que no van a presentarla. La respuesta patológica completa (pCR) se ha propuesto como marcador pronóstico de los resultados clínicos a largo plazo, como la supervivencia libre de enfermedad (SLE) y la supervivencia global (SG). En la práctica clínica, reconocer a las pacientes con probabilidad de lograr tales respuestas resulta un reto para la medicina de precisión por lo que es vital la identificación de nuevos biomarcadores útiles.

Identificara prioria las pacientes que no se van a beneficiar con la neoadyuvancia evitaría exponer a las pacientes a la toxicidad, el gasto y el tiempo que conlleva dicho tratamiento, a la vez que les posibilitaría recibir un tratamiento alternativo con mayor posibilidad de éxito.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de gen UGT2B10 como biomarcador para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer de mama en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos. Preferentemente, el tratamiento neoadyuvante consiste en quimioterapia y / o terapia dirigida contra HER2, y más preferentemente la terapia dirigida contra HER2 consiste en la administración de anticuerpos monoclonales como trastuzumab y/o pertuzumab.

Según se deriva de los resultados que se describen más adelante en los ejemplos de realización de la invención, la sobreexpresión del gen UGT2B10 en el tejido tumoral se correlaciona con la ausencia de respuesta patológica completa a la terapia neoadyuvante.

Por tanto, un segundo aspecto de la invención refiere a un perfil de expresión del biomarcador UGT2B10 para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer de mama en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos, donde sobreexpresión del gen UGT2B10 es indicador de ausencia de respuesta patológica completa a la terapia neoadyuvante.

En esta memoria se define UGT2B10 como el gen miembro B10 de la familia 2 de UDP glucuronosiltransferasas(Homo sapiens),Gene ID: 7365, con número de acceso NC_000004.12 en NCBI.

En el contexto de la presente invención, UGT2B10 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína UGT2B10, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 2. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína UGT2B10. Preferiblemente, moléculas de ácido nucleico que se transcriben en la secuencia de ARNm con código de acceso NM 001075.5.es la SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 1

GGAAAAGAATTATCACATTGCACAAGGATGGCTCTGAAATGGACTACAGTTCTGCTGAT ACAACTCAGTTTTTACTTTAGCTCTGGGAGTTGTGGAAAGGTGCTGGTATGGGCCGCAG AATACAGCCTTTGGATGAATATGAAGACAATCCTGAAAGAACTTGTTCAGAGAGGTCATG AGGTGACTGTACTGGCATCTTCAGCTTCCATTCTTTTTGATCCCAACGACTCATCCACTC TTAAACTTGAAGTTTATCCTACATCTTTAACTAAAACTGAATTTGAGAATATCATCATGCA ATTGGTTAAGAGATTGTCAGAAATTCAAAAAGATACATTTTGGTTACCTTTTTCACAAGAA CAAGAAATCCTGTGGGCAATTAATGACATAATTAGAAACTTCTGTAAAGATGTAGTTTCA AATAAGAAACTTATGAAAAAACTACAAGAGTCAAGATTTGACATCGTTTTTGCAGATGCTT ATTTACCCTGTGGTGAGCTGCTGGCTGAGCTATTTAACATACCCTTTGTGTACAGTCACA GCTTCAGTCCTGGCTACTCATTTGAAAGGCACAGTGGAGGATTTATTTTCCCTCCTTCCT ACGTACCTGTTGTTATGTCAAAATTAAGTGATCAAATGACTTTCATGGAGAGGGTAAAAA ATATGCTCTATGTGCTTTATTTTGACTTTTGGTTCCAAATATTTAATATGAAGAAGTGGGA TCAGTTTTACAGTGAAGTTTTAGGAAGACCCACTACATTATCTGAGACAATGAGGAAAGC TGACATATGGCTTATGCGAAACTCCTGGAATTTTAAATTTCCTCATCCATTCTTACCAAAT GTTGATTTTGTTGGAGGACTCCACTGCAAACCTGCCAAACCCCTACCTAAGGAAATGGA GGAGTTTGTACAGAGCTCTGGAGAAAATGGTGTTGTGGTGTTTTCTCTGGGGTCAATGG TCAGTAACATGACAGAAGAAAGGGCCAACGTAATTGCAACAGCCCTTGCCAAGATCCCA CAAAAGGTTCTTTGGAGATTTGATGGGAATAAACCAGATGCCTTAGGTCTCAATACTCGA CTGTACAAGTGGATACCCCAGAATGACCTTCTAGGTCATCCAAAAACCAGAGCTTTTATA ACTCATGGTGGAGCCAATGGCATCTATGAGGCAATCTACCATGGGATCCCTATGGTGG GCATTCCATTGTTTTTTGATCAACCTGATAATATTGCTCACATGAAGGCCAAGGGAGCAG CTGTTAGAGTGGACTTCAACACAATGTCGAGTACAGACCTGCTGAATGCACTGAAGACA GTAATTAATGATCCTTCATATAAAGAGAATATTATGAAATTATCAAGAATTCAACATGATC AACCAGTGAAGCCCCTGGATCGAGCAGTCTTCTGGATTGAATTTGTCATGCGCCACAAA GGAGCCAAACATCTTCGAGTTGCAGCCCACAACCTCACCTGGTTCCAGTACCACTCTTT GGATGTGATTGGGTTCCTGCTGGCTTGTGTGGCAACCGTGCTATTTATCATCACAAAGT GTTGTCTGTTTTGTTTCTGGAAGTTTGCTAGAAAAGGAAAGAAGGGAAAAAGGGATTAGT TATATCTGAGATTTGAAGCTGGAAAACCTGATAGATAGGAATACTTCAGTTGATTCCAGC AATAAATATTGTGATGCAAGATTTCTTTCTTCCTGTGACAAAAAAAAATCCTTTCGAAGTC TACCTTGTCAAGTAAAAATTTGTTTTTCAGAGATTTACCACCCAGTTAATGGTTAGAAATA TTCTGTGGCAATGAAGAAAACACTAGGGGAAATAAAAAATAATATAAAGCCATATGAGCT TGTATTGAAATTTGTTGCACTTATATTGAAATGTGATCATGGCTCACTTCAGCCTCAACTT ACTAAGCTCAAGAGGTTCTCTCACCTCAGCCCCCCAAGTAGCTGGGACCATAGGTGCAT GTCACCATGTCCAACTAATTTTTTATTTTTTGTAGTGATGAGATCTCATTGTGTTCTCCAT GCTGATTTCAAACTCCTGGGCTCAAACAATCCTCCCATTTTAGCATCCCAAAGGGATGA GATTACAGGTATGTACCACCATAACTTTACAAAATGAGATTTTTATATAAGAATGATTCAA ATGTTCAGGGATGAAAGAGTCACTAACATAAAAGAAGAATGGGATGAGGTGAGAAGGAT GAATACAAAAATAATTAGATATTCTTGAAATCAGAAATGTGCTCCCTAATTATATGAAATG TTGTTTGATTACATAAAATAAAGTGGAAATGAATGATTGACTGAACAGCCCACAAGAAGA ATCACTTAATGCTCTGAAAATTACCAGTAAACTGATTAAAATCTAAAATTGCTTTCTGTTA AAGCTTTACTGATTAGTTTTTCTTCCAAAGCTCTCTTGTTTCTAGTTGTTTTCTTGGTCTTA ACTACCCATTATATGCTTTGTTAAAGTGTTTATGCCCTGATTCAATGTGATTATCTCAATT TTTATTTCATTCTGTCCTAACTCTTGCAACCTGCATGTCCTCTTTATTATTGATCAATCCA ACTGCAAAGTTCACCTTACCTGACTAAGGATTATTCATTAAGTTTTACTTGTTTATCTGAC ATTTATTATTTTGTCTCTTTGCTAGTCACTCTGAGCCATGGTCATGATGACTTAGGATTCT GGATCTCTTATGAATAACAAATTTATCCTTAATAAAGTCTCTATACT

SEQ ID NO: 2 MALKWTTVLLIQLSFYFSSGSCGKVLVWAAEYSLWMNMKTILKELVQRGHEVTVLASSASIL FDPNDSSTLKLEVYPTSLTKTEFENNMQLVKRLSEIQKDTFWLPFSQEQEILWAINDMRNFCK DVVSNKKLMKKLQESRFDIVFADAYLPCGELLAELFNIPFVYSHSFSPGYSFERHSGGFIFPP SYVPVVMSKLSDQMTFMERVKNMLYVLYFDFWFQIFNMKKWDQFYSEVLGRPTTLSETMR KADIWLMRNSWNFKFPHPFLPNVDFVGGLHCKPAKPLPKEMEEFVQSSGENGVVVFSLGS MVSNMTEERANVIATALAKIPQKVLWRFDGNKPDALGLNTRLYKWIPQNDLLGHPKTRAFIT HGGANGIYEAIYHGIPMVGIPLFFDQPDNIAHMKAKGAAVRVDFNTMSSTDLLNALKTVINDP SYKENIMKLSRIQHDQPVKPLDRAVFWIEFVMRHKGAKHLRVAAHNLTWFQYHSLDVIGFLL ACVATVLFIITKCCLFCFWKFARKGKKGKRD

Métodos de la invención

Otro aspecto de la invención se refiere a un métodoin vitrode obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos, de ahora en adelante primer método de la invención, que comprende:

a) determinar los niveles de expresión de UGT2B10 en una muestra previamente aislada de un paciente, y

b) comparar los valores de la expresión de UGT2B10 obtenidos en a) con una cantidad de referencia.

Preferentemente, terapia neoadyuvante consiste en quimioterapia y/o con terapia dirigida contra HER2, y más preferentemente la terapia dirigida contra HER2 consiste en la administración de trastuzumab y/o pertuzumab.

Otro aspecto de la invención se refiere a un métodoin vitropara predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos, de ahora en adelante segundo método de la invención, que comprende los pasos (a) - (b) según el primer método de la invención, y además comprende:

c) asignar al individuo que presenta en un análisis los niveles de expresión de UGT2B10 sobreexpresados con respecto a los valores medios de un individuo normal, al grupo de pacientes que no presenta respuesta patológica completa a la terapia neoadyuvante.

Una "muestra biológica" tal como se define aquí, es una pequeña parte de un sujeto, representativa del conjunto y puede estar constituida por una biopsia o una muestra de fluido corporal.

Preferiblemente, la muestra biológica es una muestra de tejido del tumor sólido de la mama y / o de los ganglios linfáticos del paciente.

El método de la presente invención se puede aplicar con muestras de individuos de cualquier sexo, es decir, hombres o mujeres, y a cualquier edad. Preferiblemente se aplica a muestras obtenidas de mujeres.

En la presente invención se entiende por "pronóstico" la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad, así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se van a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores de significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.

El primer método de la invención implica la comparación de los niveles de expresión de UGT2B10 con los niveles de UGT2B10 de una muestra de referencia o con un valor mediano. En el contexto de la presente invención, se entiende por "muestra de referencia" la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de UGT2B10 de la presente invención. En una realización preferida, el valor de referencia se obtiene de los valores de expresión obtenidos de una muestra con individuos respondedores al tratamiento con terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos.

Preferiblemente, se toman muestras de referencia de varios individuos y se combinan, de modo que el valor de referencia refleje el valor medio de dichas moléculas en la población de individuos respondedores al tratamiento neoadyuvante. "Valor de referencia" es el nivel de expresión de UGT2B10 en una muestra de referencia. El perfil de expresión en la muestra de referencia de preferencia puede ser generado a partir de una población de dos o más personas. La población, por ejemplo, pueden contener 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más personas.

La detección la cantidad de producto de expresión de UGT2B10, puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica.

Los niveles de expresión van a dar un determinado “perfil de expresión”. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto" o "cantidad de producto de expresión" se refiere al material bioquímico, en concreto ARNm.

La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión, está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN. Dicha señal (a la que también podemos referirnos como señal de intensidad) puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática).

El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.

El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad del productos de expresión de UGT2B10 de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de UGT2B10 de una o varias muestras de referencia. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el resultado se puede obtener mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

(i) un método de generación de perfiles de ARNm, como un microarray, y/o

(ii) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tal como PCR en tiempo real; y/o

(iii) transferencia Northern, y/o

(iv) inmunoensayo.

En la invención, el método para determinar el resultado, es decir, el nivel de expresión de UGT2B10, no necesita estar particularmente limitado.

La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) cuantitativa en tiempo real (generalmente abreviada como RQ-PCR, RT-qPCR, rt-PCR o qPCR) es una técnica de cuantificación de la expresión de ARNms sensible y reproducible que se puede usar particularmente para perfilar la expresión de ARNm en células y tejidos. Se puede utilizar cualquier método para evaluar los resultados de la RT-PCR, y se puede preferir el método ACt y el método AACt. El método AACt se describe en detalle por Livak et al. (Methods 2001, 25: 402-408). (Ct = Valores umbral de ciclo). Al poner en práctica la presente invención, el método AACt descrito por Livak et al. (Methods 2001, 25: 402-408) se utilizarán preferentemente. El AACtmethod incluirá una 'muestra de control' y una 'muestra de sujeto'. La 'muestra de sujeto' es una muestra del sujeto a analizar. Típicamente, se utilizan varias réplicas para cada concentración diluida para derivar la eficiencia de amplificación. La eficiencia de la amplificación por PCR se puede definir como porcentaje de amplificación (de 0 a 1). Durante la reacción de qPCR, un software mide típicamente para cada muestra el número de ciclo en el que la fluorescencia (indicador de amplificación por PCR) cruza una línea arbitraria, el umbral. Este punto de cruce es el valor Ct.

Una micromatriz es una matriz sobre un sustrato sólido (generalmente una lámina de vidrio o una célula de película delgada de silicio) que analiza grandes cantidades de material biológico, en el presente caso una gran cantidad de ARNm o, preferiblemente, sus transcritos de ADN inversos, que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre el sustrato sólido.

Una transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección posterior con una sonda de hibridación complementaria a (parte de) la secuencia diana del ARN de interés.

El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de un anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a UGT2B10. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoroforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, autoradiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente.

En el método de la presente invención, la expresión del ARNm puede normalizarse, preferiblemente en relación con la expresión de otra molécula de ARN. Existen métodos de normalización bien conocidos en el estado de la técnica.

Una vez que los niveles de expresión en relación con los valores de referencia se han determinado, es necesario identificar si existen alteraciones en la expresión (aumento o disminución de la expresión). La expresión (y los niveles del producto de expresión del gen) se considera aumentada en una muestra de la materia objeto de estudio cuando los niveles de incremento con respecto a la muestra de referencia son al menos de un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, al menos un 25%, por lo menos 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%, por menos por lo menos 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100%, por lo menos 110 %, por lo menos 120%, por lo menos 130%, por lo menos 140%, por lo menos 150%, o más. Del mismo modo, la expresión se considerada disminuida cuando sus niveles disminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, por lo menos el 25%, al menos un 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%), por lo menos el 65%, por lo menos 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100% (es decir, ausente).

La invención proporciona un método para asignar a un sujeto humano en uno de los dos grupos: el grupo, que comprende sujetos identificables por el método de la invención y el grupo 2, que representa los sujetos restantes. Los individuos identificables por el método de la invención serían aquellos donde los niveles de expresión de UGT2B10 se encuentran sobreexpresados. Este grupo de pacientes se catalogaría como "no respondedor” al tratamiento con terapia neoadyuvante. También podemos definir a este grupo de pacientes como grupo con ausencia de respuesta patológica completa al tratamiento con terapia neoadyuvante. Finalmente, este grupo sería el considerado como grupo no candidato al tratamiento con terapia neoadyuvante.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo o fármaco anti-HER2, o cualquier composición farmacéutica que lo contenga, incluyendo opcionalmente excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen cáncer de mama HER2 positivo, en el que el paciente es un paciente respondedor caracterizado por un nivel de expresión de UGT2B10 más bajo que un valor umbral preestablecido.

Kit y usos

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el nivel de expresión de UGT2B10.

En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende:

(a) medios para detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto los niveles de expresión de UGT2B10.

En una realización más preferida el kit o dispositivo de la invención además comprende:

(b) medios para comparar el nivel de expresión (a) con una muestra de referencia.

En una realización aun más preferida el kit o dispositivo de la invención además comprende:

(c) instrucciones para que un profesional médico no administre terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer a pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos y que presenten niveles sobreexpresados de UGT2B10.

En realizaciones particulares, el kit se selecciona de (a) un kit adecuado para PCR, (b) un kit adecuado para Northern Blot, (c) un kit adecuado para análisis de micromatrices y (d) un inmunoensayo. También se pueden combinar dos o más de estas realizaciones, de modo que el kit pueda comprender, por ejemplo, tanto (a) como (c).

En una realización preferida el kit o dispositivo que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar con UGT2B10.

Se prefiere que dicho oligonucleótido(s) sea capaz de hacerlo en condiciones de astringencia. La astringencia es un término usado en experimentos de hibridación que refleja el grado de complementariedad entre el oligonucleótido y el ácido nucleico; cuanto mayor sea la astringencia, mayor porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. El experto en la materia sabe bien que la temperatura y las concentraciones de sal tienen un efecto directo sobre los resultados que se obtienen. Se reconoce que los resultados de la hibridación están relacionados con el número de grados por debajo de la Tm (temperatura de fusión) del ADN en el que se realiza el experimento. A menudo, las condiciones rigurosas se definen como un lavado con 0.1X SSC (solución salina-citrato de sodio (SSC) tampón a 65 °C. (SSC se proporciona generalmente como una solución madre 20X, que consiste en cloruro de sodio 3 M y citrato de trisodio 300 mM (ajustado a pH 7,0 con HCl)).

El kit o dispositivo de la invención puede comprender controles, instrucciones de programa e información necesaria para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit o dispositivo de la invención en el método de la invención en cualquiera de sus realizaciones, aunque su uso no está particularmente limitado.

Automatización del método de la invención implementándolo en un programa de ordenador

Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones para realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención.

En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa y que se haya adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes.

Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible; por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios.

La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento.

Otros aspectos de la invención se refieren al medio de almacenamiento legible y a la señal transmisible que comprende instrucciones de programa necesarias para la ejecución del método de invención por un ordenador.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Transcritos diferencialmente expresados entre pacientes que presentan respuesta patológica completa (pCR) y los que no (no-pCR). Representación que muestra los transcritos que cumplen los criterios de selección de un logaritmo delfold changemayor a 1’5 o menor a -1’5 y un p-valor = 0.05.

Figura 2. Datos de expresión obtenidos en el microarray Clariom D pico array de Affymetrix.

Figura 3. Curva ROC de expresión del gen UGT2B10.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Pacientes y muestras biológicas

El presente estudio se realizó en 18 pacientes intervenidas quirúrgicamente de cáncer de mama. Las pacientes fueron inscritas en el Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla. Se obtuvo el consentimiento informado de todas las pacientes y el Comité Ético del hospital aprobó el estudio. Todas las pacientes fueron tratadas con quimioterapia más terapia dirigida contra HER2 con trastuzumab y en algunos casos con trastuzumab y pertuzumab. Se resumen las características clínicas de las pacientes en la Tabla 1.

Tabla 1. Datos clínicos de las pacientes incluidas en el estudio.

RH: receptores hormonales; HER2: sobreexpresión del receptor de membrana HER2; pCR: respuesta patológica completa.

Las pacientes se estratificaron de acuerdo a la respuesta al tratamiento neoadyuvante. Aquellas pacientes que realizaron una respuesta completa patológica (pCR) forman el grupo de las respondedoras, mientras que la determinación de enfermedad residual tras analizar la pieza quirúrgica siguiendo los criterios RCB (Residual Cancer Burden) (5) se usó como motivo de inclusión en el grupo de las no respondedoras.

Aislamiento de ARN e hibridación con Clarion D microarray

El ARN total se extrajo usando el kit commercial RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation (Ambion, Austin, TX, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se midió usando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Tech, DE, USA). Un total de 18 muestras se etiquetaron e hibridaron con microarray Clariom D pico Array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se sintetizó el ADN complementario de doble hebra (cDNA) y el ARN complementario (cRNA) a partir de 30 ng de ARN, luego, el cDNA biotinilado se hibridó durante 16 horas en un horno de hibridación Affymetrix GeneChip 645 a 45°C. Las matrices (microarray) se tiñeron utilizando GeneChip Fluidics Station 450. Posteriormente, el chip se escaneó con el escáner GeneChip™ 3000. Los archivos .CEL de Affymetrix Clariom D con datos de intensidad se normalizaron para producir valores de expresión de señal a nivel de sonda y mediante el software Transcriptome Analysis Console (TAC) se analizó el patrón de expresión de los genes, exones, variantes de splicing y vías relacionadas implicadas en la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante.

Análisis estadístico

El análisis estadístico fue realizado con el software R para Windows versión 4.1.1 y SPSS versión 28. Para el análisis de expresión diferencial entre respondedoras y no respondedoras se aplicó la prueba U de Mann-Whitney y se realizó un análisis de curvas ROC para determinar el punto de corte de señal de expresión con mayor sensibilidad y especificidad, así como área bajo la curva ROC (AUC, del inglésarea under the curve).La significancia estadística se estableció para p-valores <0,05

Identificación de transcritos diferencialmente expresados

El ensayo Clariom D permite un amplio y profundo análisis de transcriptomas y el descubrimiento de biomarcadores. En este trabajo lo hemos combinado con el software de Applied Biosystems ™ Transcriptome Analysis Console (TAC 4.0). Estos microarrays permiten obtener información sobre la expresión de ARN codificante y no codificante. En este estudio y con el objetivo de identificar aquellos transcritos que mostraban expresión diferencial entre las respondedoras y no respondedoras se establecieron los siguientes filtros: que el logaritmo del cambio de expresión (fold change) fuese mayor a 1’5 o menor a -1’5 y que el p-value fuese menor de 0,05.

La aplicación de los filtros reveló una expresión diferencial de 954 transcritos de los cuales 643 se encontraban sobreexpresados y 311 infraexpresados (Figura 1).

En la Figura 2 se muestran los datos de expresión en UGT2B10, que cumple los criterios de selección obtenidos en el microarray Clariom D pico array de Affymetrix.

Las señales de hibridación obtenidas para cada una de las muestras analizadas se representan mediante un diagrama de puntos de dispersión. Las diferencias estadísticas se calcularon aplicando la prueba U de Mann-Whitney. En la figura 2 para el gen UGT2B10 vemos una diferencia entre mediana señal de no respondedoras (4 pacientes, mediana 5,05) y respondedoras (14 pacientes, mediana 3,94) significativa con un p-valor de 0,0712.

Por otro lado con la finalidad de determinar la exactitud diagnóstica de este gen como predictor de respuesta se realizó curva ROC de la expresión de UGT2B10. El análisis de la curva ROC constituye un método estadístico para determinar el punto de corte (señal de expresión) en el que se alcanza la sensibilidad y especificidad más alta, así como la capacidad discriminativa del test, es decir, la capacidad de predecir pacientes no respondedoras al tratamiento neoadyuvante.

La curva ROC se representa en la Figura 3. En ella vemos representado gen UGT2B10 con un punto de corte de 4,12 la sensibilidad del test alcanza el 100% y la especificidad el 64%. El área bajo la curva (lo cual refleja la capacidad discriminativa del test) es mayor a 0,80 lo cual indica que UGT2B10 tiene una capacidad aceptable de discriminar pacientes respondedores y no respondedores a tratamiento neoadyuvante de cáncer de mama HER2 positivo RH negativo.

Referencias

1. Perou CM, Surlie T, Eisen MB, Rijn M Van De, Jeffrey SS, Rees CA, et al. Molecular portraits of human breast tumours. letters to nature 748. Nature. 2000;533(May):747-52.

2. S0rlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T, Geisler S, Johnsen H, et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Sep 11;98(19):10869-74.

3. memoria2020online [Internet]. [cited 2021 Aug 26]. Available from: https://www.geicam.org/memoria2020online/mobile/index.html#p=12

4. Yerushalmi R, Woods R, Ravdin PM, Hayes MM, Gelmon KA. Ki67 in breast cancer: prognostic and predictive potential. Lancet Oncol. 2010 Feb 1;11(2):174-83.

5. http://www3.mdanderson.org/app/medcalc/index.cfm?pagename=jsconvert3.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Usoin vitrode los niveles de expresión de UGT2B10 como biomarcador para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer de mama en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos.

2. Uso según la reivindicación anterior donde la terapia neoadyuvante consiste en quimioterapia y/ o terapia dirigida.

3. Uso según la reivindicación anterior donde la terapia dirigida consiste en la administración de trastuzumab y/o pertuzumab.

4. Un perfil de expresión del biomarcador UGT2B10 para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer de mama en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos donde sobreexpresión del gen UGT2B10 es indicador de ausencia de respuesta patológica completa.

5. Métodoin vitrode obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos, que comprende:

6. Métodoin vitropara predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos, que incluye los pasos (a) - (b) de la reivindicación anterior y que además comprende:

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, donde la muestra biológica es tejido del tumor sólido de la mama y / o de ganglios linfáticos.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que los valores de expresión de UGT2B10 se obtienen mediante:

a) un método de generación de perfiles de ARNs, como un microarray, y/o

b) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa), tal como PCR en tiempo real;

c) transferencia Northern y/o

d) inmunoensayo.

9. Un kit que comprende los elementos necesarios para cuantificar en una muestra biológica obtenida del sujeto el nivel de expresión de UGT2B10.

10. El kit según la reivindicación anterior que además comprende medios para comparar el nivel de expresión de UGT2B10 con una muestra de referencia.

11. El kit según la reivindicación anterior que además comprende instrucciones para que un profesional médico no administre terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer a pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos y que presenten niveles sobreexpresados de UGT2B10.

12. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para predecir o pronosticar la respuesta a la terapia neoadyuvante en el tratamiento del cáncer en pacientes con cáncer mama HER2 positivo y con receptores hormonales negativos en un individuo.