ES2976116A1 - Biomarcadores nucleares de la enfermedad de Alzheimer (EA), sus usos y métodos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, este procedimiento cuantifica los productos de expresión de los genes LMNA Y EMD, en una muestra de nervioso periférico o musculo liso.

Description

DESCRIPCIÓN
Biomarcadores nucleares de la enfermedad de Alzheimer (EA), sus usos y métodos
La invención se refiere a biomarcadores de la enfermedad de Alzheimer (EA), y sus usos y métodos para el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad. Así, la invención pertenece al campo de la medicina y de instrumentos de medición de muestras biológicas.
1. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los métodos de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer son una necesidad imperiosa en la sociedad actual donde cada año se produce un incremento significativo de personas afectadas. Actualmente se sabe que los primeros cambios en las neuronas comienzan años, incluso décadas antes de que se manifieste la enfermedad y se evidencien los síntomas, normalmente en los estadios III-IV de patología citoesquelética (ovillos de fosfotau en el citoplasma y placas de beta amiloide en el neuropilo) según la clasificación de Braak and Braak.
Hasta el momento el único método de diagnóstico real es mediante técnicas inmunohistoquímicas post-morten del cerebro. Durante los últimos años las investigaciones se han focalizado en la cuantificación de biomarcadores como beta amiloide o diversas fosfoTAU en muestras de líquido cefalorraquídeo COMO DESCRIBE LA SOLICITUD DE PATENTE WO2021/202777. SIN EMBARGO, pero los resultados obtenidos no son concluyentes y la punción medular presenta dificultades de maniobra y de preparación hospitalaria. Por otra parte, las pruebas por imagen como la resonancia magnética para ver anatómicamente el nivel de atrofia y la PET o la SPECT para ver la actividad cerebral no proporcionan un diagnóstico preciso. En consecuencia, se hace necesario acceder/proporcionar a biomarcadores específicos y sensibles de detección precoz que permitan establecer un tratamiento antes de que el daño neuronal sea irreversible.
En el momento actual, clínicamente el Alzheimer es diagnosticado exclusivamente en el SNC, aunque según nuestros hallazgos las células de músculo liso anexas a las neuronas mesentéricas no muestran el biomarcador Lámina A en las fibras de la musculatura lisa de individuos sanos; sin embargo a partir de las muestras de EA temprano (Braak I-II) se presentan de forma anómala expresión de algunas moléculas en núcleos de las células musculares lisas; observándose en las muestras de EA tardío (Braak V-VI) un elevado número de fibras musculares lisas con anómala sobreexpresión del marcador Lámina A .
Lamina A regula la expresión génica ya que está directa o indirectamente implicada en la replicación, transcripción y reparación del ADN, así como con el control del ciclo celular (Shimi et al. 2008). En consecuencia, la LN está íntimamente asociada a procesos biológicos básicos y complejos como el desarrollo, la diferenciación y el envejecimiento de células y órganos (van Steensel et al. 2017; Kim et al. 2019).
Lamina A apenas se expresa en las neuronas de cerebro humano (Gil et al. 2020) de acuerdo con estudios previos en cerebro de ratón, cerebro de rata y neuronas retinianas de rata (Takamori et al. 2018; Wakabayashi et al. 2011). Sin embargo, hemos demostrado histológicamente por primera vez que en cerebros con EA, las neuronas del hipocampo y de la corteza entorrinal expresan de forma anómala lámina A desde las etapas iniciales de la enfermedad (Gil et al. 2020, 2021, 2022; Rodríguez-Leyva et al.
2020). Estos resultados han sido avalados por RT-PCR (Méndez-López et al. 2019) y confirmados en modelos de ratones transgénicos de AD (Gil et al. 2020)
La Lamina A se expresa inicialmente como Prelamina A que tras un proceso de escisión se convierte en el producto. El término Lamina A se refiere a la proteína de 646 aminoacidos (número UniProt W8QEH3), o al gen que codifica dicha proteína LMNA (número de acceso ENSEMBLE: ENSG00000160789).
La Prelamina A es la forma precursora de Lamina A, contiene un motivo CAAX-box en el extremo C-terminal que es sujeto de farnesilación en la cisteina, siendo eliminados los aminoácidos AAX, y posteriormente tiene lugar una rotura endoproteolitica que elimina los 18 últimos aminoácidos para generar la lamina A madura, capaz de integrarse en la envoltura nuclear. El término Prelamina se refiere a la proteína de 664 aminoacidos con 70kD (número UniProt P02545), o al gen que codifica dicha proteína LMNA (número de acceso ENSEMBLE: ENSG00000160789).
La Emerina es la proteína de la membrana perinuclear que tiene demostrada interacción directa, coordinada y enlazada con las moléculas de lámina A, siendo así un marcador estructural de esta, encontrándose que la detección de Emerina es equivalente a la detección de Lamina A (L. Clemente et al. 2000). El término EMERINA se refiere a la proteína de 254 aminoacidos de 34Kd (número UniProt P50402), o al gen que codifica dicha proteína EMD (número de acceso ENSEMBLE: ENSG00000102119).
Los genes LMNA y EMD, codifican Prelamina A a Lamin A y Emerina que son proteínas nucleares. Entre sus funciones se conoce su papel en el ensamblaje del núcleo, mantenimiento de la estabilidad de la cromatina y la regulación de la expresión génica (Ovsiannikova NL et al. 2021; Forsberg F et al. 2019; Puckelwartz MJ et al. 2011; Ghosh S et al. 2015; Fernandez A et al. 2022; Wilson KL et al. 2005; Koch AJ et al. 2014).
2. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Análisis inmunohistoquímico de la proteína Lamina A en núcleos de neuronas mesentéricas de colón, de tejidos sanos (a,b), tejidos procedentes de diagnosticados post-morten de EA temprano (Braak I-II) (c,d) y de EA tardío (Braak V-VI) (e,f). Barra de escala en b,d,f : 100 mm; en D, a,b,e: 10 mm.
Fig. 2. Utilizándose el Software ImageJ para evaluar el nivel de intensidad de la señal de Lamina A nuclear en las neuronas mesentéricas de las muestras (NIH, Bethesda, MD (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html).
Fig. 3. Análisis inmunohistoquímico de la proteína Lamina A en neuronas mesentéricas de tejidos procedentes de diagnosticados post-morten de EA tardío (Braak V-VI) (a, f). Barra de escala en 100 mm.
Fig. 4. Análisis inmunohistoquímico de la proteína Lamina A en núcleos de células de músculo liso, de tejidos sanos (a,b), tejidos procedentes de diagnosticados post-morten de EA temprano (Braak I-II) (c,d) y de EA tardío (Braak V-VI) (e,f). Barra de escala en b,d,f : 100 mm; en D, a,b,e: 10 mm.
Fig. 5. Análisis inmunohistoquímico de la proteína Lamina A en núcleos de neuronas de SNP (a,b,c) y núcleos de células de músculo liso (d,e,f) de próstata, en tejidos procedentes de diagnosticados
Fig. 6 El test de Anova de un factor determina que la proporción de positivos es diferente entre las tres muestras con una significación del 0.05. mm.
Fig. 7 El Anova en ambos casos tiene una significación de 0, claramente por debajo del 0,05, en ambos test, tanto el de diferencia de varianzas como de medias.
3. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los inventores han determinado que la detección de los de los productos de expresión de los genes de Lamina A, Prelamina A (LMNA) y Emerina (EMD) en tejido nervioso periférico o musculo liso pueden ser usados como biomarcadores del diagnóstico y/o de pronóstico de EA. En función del nivel de expresión, grado de acumulación y extravasación al espacio perinuclear de estos biomarcadores, es posible también determinar el grado de afectación del paciente
En un aspecto la invención hace referencia a un procedimiento in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende
a) detectar o medir la concentración, cantidad o actividad de biomarcador de EA en el que el biomarcador está en forma de una proteína nuclear o perinuclear, en una muestra biológica aislada de un sujeto en donde la muestra se aísla de tejido nervioso periférico o musculo liso; y
b) determinar o diagnosticar la presencia o el riesgo de desarrollar EA en base a la detección, concentración, cantidad o actividad de dicho biomarcador, en donde la detección o incremento de la concentración, cantidad o actividad de dicho biomarcador en comparación con una concentración o cantidad de referencia de dicho biomarcador es indicativo de la presencia o riesgo de desarrollo de la EA
Así, en otro aspecto, la invención hace referencia a un procedimiento in vitro para la determinación del estado/afectación/la fase de gravedad de la EA en el sujeto que comprende:
a) detectar o medir la concentración, cantidad o actividad de biomarcador de EA en el que el biomarcador está en forma de una proteína nuclear o perinuclear, en una muestra biológica aislada de un sujeto en donde la muestra se aísla de tejido nervioso periférico o musculo liso; y
b) identificar o clasificar la gravedad de la EA, mediante un procedimiento en base a la detección, concentración, cantidad o actividad de dicho biomarcador, en donde la detección o incremento de la concentración, cantidad o actividad de dicho biomarcador en comparación con unas concentraciones o cantidades de referencia de dicho biomarcador es indicativo del grado de gravedad y desarrollo de EA en un sujeto.
El método está desarrollado específicamente para el tejido neuronal periférico somatodendrítico y tejido muscular liso que, como se ha mencionado anteriormente, está formado por núcleos y citoplasmas perinucleares, excluyendo los axones. El método de la invención utiliza de manera preferente la diferencia de EXPRESION DE lámina A, una proteína que no se expresa en el núcleo normal de neuronas sanas.
Así, en otro aspecto la invención hace referencia al uso de los biomarcadores seleccionados de Lamina A, sus productos de expresión génica y Proteína Emerina para diagnosticar/determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer y determinar su el grado estado/afectación/la fase de gravedad de la EA en el sujeto.
Así, en otro aspecto, la invención hace referencia al uso de un kit que comprende medios necesarios para la detección y/o cuantificación de al menos uno de los biomarcadores para el diagnóstico y/o pronóstico de EA en un sujeto.
En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende:
(a) medios para detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención,
(b) medios para comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados en (a) con una muestra de referencia,
En realizaciones particulares, el kit se selecciona de (a) un kit adecuado para RT-PCR, (b) un kit adecuado para Northern Blot/Western Blot, (c) un kit adecuado para análisis de micromatrices y (d) un inmunoensayo. También se pueden combinar dos o más de estas realizaciones, de modo que el kit pueda comprender, por ejemplo, tanto (a) como (c) .
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención en cualquiera de los métodos de la invención.
Como entiende un experto en la materia, el kit puede comprender cualquier componente útil la puesta en práctica de la presente invención, tales como, cebadores, sondas, transcriptasas, anticuerpos, soluciones tamponadoras, vehículos de entrega, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Además de los componentes mencionados, los kits podrán incluir también instrucciones para practicar el objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.
Descripción de la Terminología utilizada
El término “biomarcador”, tal y como se usa en la presente descripción se refiere a una sustancia, cuya presencia se puede determinar y cuantificar objetivamente, que se utiliza como indicador de la presencia/ausencia de la enfermedad o del pronóstico de la misma. El biomarcador de la invención se puede detectar y/o cuantificar, es decir, se puede únicamente detectar su presencia o bien se pueden detectar y/o cuantificar cambios en la cantidad. Los biomarcadores de la invención pueden detectarse de forma directa en forma de proteína en las muestras de los pacientes o de manera indirecta a partir del producto de expresión de los genes que codifican dichas proteínas. En la presente invención el biomarcador es Lamina A, Prelamina A y Proteína Emerina.
La expresión “detectar o medir la concentración, cantidad o actividad de biomarcador” de la etapa a) del método de diagnóstico o método de predicción de la invención se refiere a cualquier procedimiento que posibilite la cuantificación del biomarcador mencionado en la presente invención, es decir de las proteínas nucleares Lamina A, Prelamina a y Emerina o a los productos de expresión de sus correspondientes genes.
Así, los marcadores proteicos se pueden detectar y cuantificar con técnicas de proteómica como inmunoensayos (ELISA), CBA (cytometric Bead assay), inmunohistoquímica, western blot, Northern blot, micromatrices, o espectrometría de masas. Por su parte, para la detección del producto de expresión de los genes que codifican Lamina A, Prelamina A y Proteína Emerina se utilizan técnicas genéticas que permiten la identificación y cuantificación del mRNA, principalmente qPCR, RTqPCR.
-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): La PCR es una técnica molecular ampliamente utilizada en biología molecular. Se basa en la replicación in vitro de segmentos específicos de ADN. Implica la desnaturalización del ADN objetivo a alta temperatura, seguida de la hibridación de cebadores específicos y la síntesis de nuevas cadenas de ADN por una enzima polimerasa. Este proceso se repite en ciclos, amplificando exponencialmente el ADN objetivo. La PCR es esencial para la detección de enfermedades genéticas, brindando una herramienta precisa y sensible para la amplificación selectiva de material genético.
-RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa): La RT-PCR combina la amplificación de ácidos nucleicos mediante PCR con la conversión previa de ARN a ADN mediante la transcriptasa inversa. Este método es crucial para detectar ARN, como en el diagnóstico a través de ARN mensajero. La transcriptasa inversa convierte el ARN en ADN complementario (cADN), que luego sirve como molde para la PCR. La RT-PCR es fundamental en la investigación biomédica y el diagnóstico clínico, proporcionando una herramienta valiosa para estudiar la expresión génica.
-Los inmunoensayos por inmunohistoquímica (IHC) son técnicas utilizadas en biología y medicina para detectar y visualizar la presencia de antígenos específicos en tejidos o células. Estos antígenos pueden ser proteínas, carbohidratos u otros componentes moleculares. La técnica se basa en la interacción entre anticuerpos específicos y los antígenos de interés. es ampliamente utilizada en la investigación biomédica y la patología para el diagnóstico de enfermedades, la caracterización de tumores y la investigación de la expresión de proteínas en tejidos específicos.
-Inmunoensayos de Inmunofluorescencia: Los inmunoensayos de inmunofluorescencia implican la utilización de anticuerpos conjugados con fluorocromos para detectar la presencia de antígenos específicos. Los anticuerpos se unen selectivamente a los antígenos, y la fluorescencia emitida permite la visualización directa bajo un microscopio de fluorescencia. La inmunofluorescencia permite análisis cuantitativos y cualitativos, siendo una técnica valiosa en investigación biomédica y diagnóstico clínico. En una realización preferida de la invención el anticuerpo es antilamina A
-Western-Blot: El Western-Blot es una técnica de biología molecular utilizada para detectar proteínas específicas en una muestra. Inicia con la separación de proteínas por tamaño mediante electroforesis y luego traslada las proteínas a una membrana. La membrana se incuba con anticuerpos específicos, que se unen a las proteínas de interés. La detección se realiza mediante reacciones químicas o fluorocromos. El Western-Blot es crucial para estudios de expresión proteica, identificación de modificaciones post-traduccionales y diagnóstico de enfermedades, proporcionando información detallada sobre las proteínas presentes en una muestra.
-Northern blot: La técnica de Northern Blot es una metodología utilizada en biología molecular para estudiar la expresión génica, se utiliza para detectar ARN. Mediante cinco pasos: Extracción de ARN, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a una membrana, Hibridación y Autorradiografía o detección.
-Visualización Directa: La visualización directa implica la observación microscópica directa de una muestra. Es una técnica rápida y simple que permite la detección de características morfológicas, como la presencia de cambios estructurales. La visualización directa es valiosa para analizar la histología y patología para un diagnóstico rápido. Puede utilizarse en muestras clínicas y tejidos biológicos, facilitando la identificación y caracterización de elementos de interés.
-Contaje Manual: El contaje manual es un método de cuantificación en el cual los observadores cuentan directamente el número de entidades de interés en una muestra, como células o partículas. Esta técnica implica la visualización de la muestra a través de un microscopio u otra herramienta de observación, donde los elementos de interés son identificados y contados uno a uno. Aunque es un enfoque simple y directo, el contaje manual puede ser laborioso y está sujeto a la variabilidad y subjetividad del observador.
-Hibridación In Situ: La hibridación in situ es una técnica molecular que emplea sondas de ácidos nucleicos para detectar secuencias específicas en células o tejidos. Las sondas son secuencias complementarias de ARN o ADN que se unen de manera específica a la secuencia diana. Durante el proceso, las sondas marcadas con moléculas fluorescentes o enzimas son hibridadas con las moléculas de ácido nucleico objetivo, revelando la presencia y la ubicación de las secuencias específicas bajo un microscopio. Esta técnica no solo proporciona información sobre la presencia de material genético, sino también sobre su distribución espacial en el tejido, permitiendo estudios detallados de genética molecular y patologías.
-Las micromatrices: también conocidas como microarrays o arrays, son herramientas tecnológicas utilizadas en biología molecular y genómica para estudiar la expresión génica, identificar variantes genéticas, y analizar la presencia o abundancia de moléculas específicas en muestras biológicas. Existen principalmente dos tipos de micromatrices: las de ácido desoxirribonucleico (ADN) y las de ácido ribonucleico (ARN).
-Cromatografía: La cromatografía es una técnica analítica que separa y detecta componentes individuales en una muestra según sus propiedades químicas. Existen varios tipos de cromatografía, como la cromatografía líquida y la cromatografía de gases. En este método, la muestra se coloca en una fase estacionaria y se moviliza a través de un medio poroso. Los componentes de la muestra se separan según sus interacciones con la fase estacionaria y móvil, lo que resulta en diferentes tiempos de retención. La detección se realiza al analizar la salida del sistema. La cromatografía es ampliamente utilizada en química analítica, bioquímica y farmacología para separar y cuantificar sustancias en mezclas complejas.
-Espectroscopía: La espectroscopía es una técnica que analiza la interacción entre la radiación electromagnética y una muestra. En el contexto de cuantificación, la espectroscopía permite obtener información sobre la composición química y la estructura molecular de la muestra. Diferentes formas de espectroscopía, como la espectroscopía de absorción, emisión o resonancia magnética nuclear se utilizan para estudiar diferentes propiedades de las moléculas.
En la presente invención se entiende por “diagnóstico” al procedimiento por el cual se determina que un sujeto sufre o padece de una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad a identificar es EA, y el parámetro clínico es la detección y/o cuantificación de un biomarcador en una muestra aislada de tejido nervioso periférico o musculo liso de un sujeto, donde el biomarcador es Lamina A, Prelamina A y Proteína Emerina.
Tanto el uso diagnóstico de la invención como el uso predictivo de la invención se hacen sobre una muestra aislada de tejido nervioso periférico o musculo liso en un sujeto, donde dicha muestra es obtenida por métodos y procedimientos bien establecidos y conocidos para el experto en la materia. El término “muestra aislada” tal y como se usa en la presente descripción se refiere a una parte o cantidad pequeña de una cosa que se considera representativa del total y que se toma o se separa de ella para someterla a estudio, análisis o experimentación. En la presente invención, dicho estudio, análisis o experimentación hace referencia a la presencia o cantidad Lamina A, Prelamina A y Emerina. en una muestra aislada de tejido nervioso periférico o musculo liso. Las técnicas para obtener muestras biológicas de un individuo son ampliamente conocidas en el estado de la técnica, y cualquiera de ellas puede emplearse en la puesta en práctica de la presente invención.
El término “tejido nervisoso periferico” tal como se usa en la presente descripción se refiere a la parte del sistema nervioso que está fuera del sistema nervioso central (SNC), está formado por nervios, ganglios nerviosos y receptores sensoriales que se encuentran en diversas partes del cuerpo.
El término “musculo liso” se refiere a un tipo de tejido muscular caracterizado presentar células musculares alargadas y delgadas, sin la organización regular de fibras estriadas, sin bandas transversales y con capacidad para contraerse de manera involuntaria, habitualmente situado en las paredes de órganos internos como el estómago, los intestinos, los vasos sanguíneos, los bronquios, el útero y otros órganos.
Una "muestra de referencia", tal como se usa en la presente descripción, significa una muestra obtenida de un grupo de sujetos sanos que no tiene un estado de enfermedad o fenotipo particular. La “cantidad/concentración/actividad de referencia” pueden ser determinados mediante la medición de los niveles de los biomarcadores de la invención y los productos de expresión de dichos genes en un grupo de sujetos sanos, y esos niveles de referencia se puede ajustar a las poblaciones específicas. Por ejemplo, un nivel de referencia puede estar relacionada con la edad, por lo que las comparaciones se pueden hacer entre los niveles de expresión en las muestras de los sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para una enfermedad particular, el fenotipo, o falta de ella en un determinado grupo de edad. En una realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de varios sujetos. El experto en la técnica apreciará que el tipo de muestra de referencia puede variar dependiendo del método específico a realizar.
Como hemos señalado anteriormente, los usos de la presente invención se hacen en muestras aisladas de un sujeto. En una realización preferida del uso diagnóstico de la invención o del uso predictivo de la invención, el sujeto es un ser humano de cualquier sexo, edad o raza.
EJEMPLO
Detección de la sobreexpresión de Lámina A en neuronas del sistema nervioso periférico y musculo liso
Materiales
La invención se realiza de manera preferente a partir de una muestra aislada de neuronas mesentéricas y músculo liso de colon de un paciente con sintomatología de enfermedad de Alzheimer con las siguientes características:
-Tener entre 60 y 90 años, ya que se consideran sólo los casos de enfermedad de Alzheimer, esporádicos
-Cumplir los criterios diagnósticos de demencia según FM3R
-No presentar patología digestiva tumoral ni inflamatoria
En este caso de ejemplo se ha comparado dos cohortes, una de afectados por la EA con una n de 6 individuos previamente diagnosticados histológicamente de la EA con marcadores específicos (phospho Tau) y otra cohorte de individuos previamente diagnosticados como sanos con una n de 6 (Tabla 1). La cohorte de diagnosticados histológicamente postmorten cerebralmente de EA se ha subdividido en:
(1) EA temprano, con muy pocas manifestaciones de ovillos citoplasmáticos de la proteína fofo-tau y con expresión anómala de Lámina A en el núcleo de sus neuronas cerebrales (Braak I-II)
(2) EA tardío donde es masiva la presencia de ovillos citoplasmáticos y la sobreexpresión de Lámina A nuclear en las neuronas cerebrales (Braak V-VI).
Todos estos biomarcadores cerebrales de EA han sido reportados previamente en las referencias anexas. Histológicamente en todas las muestras seleccionadas la expresión anómala de Lámina A en los núcleos de las neuronas del sistema nervioso periférico mesentérico y de las fibras musculares lisas anexas (Tabla 1).
Tabla 1
Métodos
El Kit del ejemplo preferido selecciona (d) como inmunoensayo una técnica inmunohistoquímica para resaltar la acumulación de Lámina A como marcador de deterioro del núcleo celular neuronal de manera visual. Dirigida a la determinación del diagnóstico y riesgo de desarrollo precoz de enfermedad de Alzheimer mediante la detección de Lámina A, debido a que esta proteína no se expresa en el núcleo normal de neuronas sanas.
La localización inmunohistoquímica de Lámina A se ha llevado a cabo con el anticuerpo Lamin A (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.) en secciones parafinadas de 4 mm. La técnica Inmunohistoquímica (IHC) utilizada en los tejidos seleccionados se procesó mediante secciones de tejido utilizándose las siguientes etapas:
-Etapa 1. Desparafinacion utilizando protocolos estándar.
-Etapa 2. Recuperación del antígeno mediante el uso de un tampón citrato de pH bajo 6,0 (Dakocytomation, Glostrup, Dinamarca) a 96 C durante 20 minutos en un Dako PTLink (Dakocytomation, Glostrup, Dinamarca).
-Etapa 3. Bloqueo de peroxidasas endógenas con Dako
-Etapa 4. Preincubación de 1 h a 37 C con una solución de bloqueo que contenía albúmina sérica bovina.
-Etapa 5. Incubación con anticuerpo primario antilamina A monoclonar y/o policlonal (Thermo Fisher Scientific, Rockford, EE.) diluido 1:100 en Dako Antibody Diluyente (Dakocytomation Glostrup, Dinamarca) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
-Etapa 6. La tinción se visualizó usando Ratón EnVision FLEX+ (enlazador) (DakoCytomation Glostrup, Dinamarca), y con tetraclorhidrato de 303-diaminobencidina (DAB) y contratinción de hematoxilina.
Todos los pasos se realizaron a temperatura ambiente, y entre incubaciones las secciones se lavaron con tampón de lavado Dako.
La tinción IHC incluye un control positivo para el anticuerpo antiLámina A.
La contabilización Del número total y relativo de células neuronales mesentéricas y de musculo liso con núcleos positivos a la expresión de Lamina A se realizó por contaje manual en tres campos ópticos. Se tomaron en consideración el número de células musculares positivas a Lámina A por cada sección.
Resultados del caso de ejemplo preferido
Las muestras de neuronas mesentéricas y músculo liso de colon obtenidas de sujetos con EA muestran sobreexpresión de Lamina A. Los niveles de expresión de estas proteínas en dichas muestras determinan un nivel de riesgo de EA o diagnóstico (CIE) en el caso de ir acompañado de sintomatología necesaria para la definición de la patología de EA.
La presente invención presenta datos robustos sobre su eficacia como método diagnóstico. Estos datos son derivados de los análisis realizados de muestras postmortem obtenidas por nuestro equipo de investigación. Obteniéndose los resultados tras el análisis por IHC en todos los casos presentados en la Tabla 1, donde no se evidenció el biomarcador Lámina A en las neuronas mesentéricas de las muestras sanas y la sobreexpresión del biomarcador en las muestras del intestino de los diagnosticados con EA (Fig. 1).
Los datos disponibles muestran que la cuantificación relativa de la tinción de Lámina A se normalizó respecto al grupo EA1 (Fig.2). El test de Anova de un factor determina que el nivel de intensidad es diferente entre las tres muestras (sanas, EA temprano (Braak I-II) y EA tardío (Braak V-VI) evidenció con significación estadística del 0.03 los resultados diferenciales entre sujetos sanos respecto a EA temprano y de 0 con respecto a EA tardío, determinando así esta prueba diagnóstica como un método eficiente para diferenciar los pacientes con EA.
La sobreexpresión de Lámina A en neuronas mesentéricas de las muestras de digestivo procedentes de fallecidos diagnosticados histológicamente de EA tardío se presenta en la Fig. 3, lo que sustenta el uso de la metodología presentada su uso como diagnóstico IN VITRO de Alzheimer para pacientes vivos.
El análisis por IHC de las células de músculo liso anexas a las neuronas mesentéricas no muestran el biomarcador Lámina A en las fibras de la musculatura lisa de las muestras sanas; sin embargo las muestras de EA temprano (Braak I-II) presentan de forma anómala expresión en algunos núcleos de las células musculares lisas; observándose en las muestras de EA tardío (Braak V-VI) un elevado número de fibras musculares lisas con anómala sobreexpresión del marcador Lámina A (Fig. 4). Este mismo análisis se realizó en muestras de neuronas periféricas y músculo liso en otros órganos y sistemas, como en tejido prostático (Fig. 5), con similares resultados.
Al contabilizar el número total y relativo de células de musculo liso con núcleos positivos a la expresión de Lamina A se obtuvo en tres campos ópticos. Se tomaron en consideración el número de células musculares positivas a Lámina A por cada sección (Fig. 6 y 7). Determinándose una especificidad y sensibilidad de la prueba cercana al 100% con un tamaño muestral que es estadísticamente suficiente para demostrar la utilidad de esta prueba diagnóstica debido a los excelentes resultados obtenidos.
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. - Un procedimiento in vitro para diagnosticar o para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende
a) detectar o cuantificar los productos de expresión de los genes LMNA Y EMD, en una muestra biológica aislada de un sujeto en donde la muestra se aísla de tejido nervioso periférico o musculo liso; y
b) determinar o diagnosticar la presencia o el riesgo de desarrollar EA en base a la detección, o cuantificación de los productos de expresión de c LMNA Y EMD en donde la detección o cuantificación de los productos de expresión superior a un nivel de referencia, es indicativo de la presencia o riesgo de desarrollo de la EA
2. - Un procedimiento in vitro para determinar el estadio de la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto, que comprende
a) detectar o cuantificar los productos de expresión de los genes LMNA Y EMD, en una muestra biológica aislada de un sujeto en donde la muestra se aísla de tejido nervioso periférico o musculo liso; y
b) determinar el estadio de EA, en base a la detección, o cuantificación de los productos de expresión de c LMNA Y EMD en donde la detección o cuantificación de los productos de expresión superior a un nivel de referencia, es indicativo del estadio de la EA del sujeto.
3. - Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de uno o varios de los biomarcadores seleccionados, Prelamina A, Lamina A y Emerina.
4. - Un método según la reivindicación 1, que incluye los medios y técnicas de detección y/o cuantificación utilizados para el diagnóstico como PCR, RT-PCR, inmunoensayos, inmunofluorescencia, Western-blot, visualización directa, contaje manual, Hibridación in situ, Cromatografía, Espectroscopía.
5. - Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de un kit que comprende medios de detección y/o cuantificación para al menos uno de los biomarcadores seleccionados de Prelamina A, Lamina A y Emerina, en el diagnóstico, determinación del riesgo de desarrollo de la EA en un sujeto o del estado de afectación del sujeto, que, opcionalmente, que contiene instrucciones sobre cómo usar el kit en un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para diagnosticar la presencia o el riesgo de desarrollo de la EA.
6. - Uso de un kit que comprende medios necesarios para la detección y/o cuantificación de al menos uno de los biomarcadores para el diagnóstico y/o pronóstico de EA en un sujeto.
7. - Uso de los biomarcadores seleccionados de Lamina A, Prelamina A y Proteína Emerina, en un procedimiento in vitro de acuerdo con las reivindicaciones anteriores, para diagnosticar, determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad de Alzheimer y determinar su estado/afectación/ fase de gravedad de la EA en el sujeto.
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