ES2976165T3 - Anticuerpos anti-oxMIF mejorados con menor potencial de agregación y menor hidrofobia - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a anticuerpos anti-oxMIF con propiedades mejoradas tales como potencial de agregación reducido e hidrofobicidad reducida debido a sustituciones de aminoácidos seleccionados en los dominios variables de cadena ligera y pesada y funciones efectoras opcionalmente aumentadas debido a sustituciones adicionales en las regiones constantes de cadena pesada, y su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con oxMIF. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-oxMIF mejorados con menor potencial de agregación y menor hidrofobia

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos anti-oxMlF con propiedades mejoradas tales como menor potencial de agregación y menor hidrofobia debido a sustituciones de aminoácidos seleccionadas en los dominios variables de cadena ligera y pesada y opcionalmente funciones efectoras aumentadas debido a sustituciones adicionales en las regiones constantes de cadena pesada, y su uso en el tratamiento de afecciones relacionadas con oxMlF.

Antecedentes de la invención

La citocina factor inhibidor de la migración de macrófagos (FIM) se describió ya en 1966 (David, J.R., 1966; Bloom B.R. y Bennet, B., 1966). Sin embargo, MIF es muy diferente de otras citocinas y quimiocinas porque se expresa de forma constitutiva, se almacena en el citoplasma y está presente en la circulación de sujetos sanos. Debido a la naturaleza ubicua de esta proteína, MIF puede considerarse una diana inadecuada para la intervención terapéutica. Sin embargo, MIF se presenta en dos isoformas conformacionales inmunológicamente distintas, denominadas MIF reducida (redMIF) y MIF oxidada (oxMIF) (Thiele M.et al.,2015). Se descubrió que RedMIF es la isoforma de MIF que se expresa abundantemente y que puede encontrarse en el citoplasma y en la circulación de cualquier sujeto. RedMIF parece representar una forma de almacenamiento latente no activa (Schinagl. A.et al.,2018).

Por el contrario, oxMIF parece ser la isoforma fisiológicamente relevante y relacionada con la enfermedad que puede detectarse en el tejido tumoral, específicamente en tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal, pancreático, ovárico y pulmonar, lo que pone de manifiesto una elevada especificidad tumoral de oxMIF (Schinagl. A.et al.,2016), pero también en la circulación de pacientes con enfermedades inflamatorias (Thieleet al.,2015).

El número de dianas farmacológicas con éxito para tratar los cánceres, como las indicaciones anteriormente mencionadas positivas para oxMIF, está restringido. P. ej., se describen más de 300 posibles dianas inmunooncológicas, pero muchos estudios clínicos se centran en los anticuerpos anti-PD1 y anti-PDL1 (Tang J.,et al.

2018). Por ello, la comunidad científica y médica espera con impaciencia posibles fármacos dirigidos contra antígenos tumorales específicos para aumentar las opciones terapéuticas de los pacientes con cáncer de mal pronóstico.

Se describen anticuerpos monoclonales anti MIF en el documento WO2009/086920A1.

Los anticuerpos dirigidos contra oxMIF demostraron su eficacia en modelosin vitroein vivode inflamación y cáncer (Hussain F.et al.,2013; Schinagl. A.et al.,2016; Thieleet al.,2015). Un anticuerpo específico contra oxMIF (imalumab) demostró un perfil de seguridad aceptable, penetración satisfactoria en los tejidos e indicios de actividad antitumoral en un ensayo clínico de fase I (Mahalingam D.et al.,2015; Mahalingam D.et al.2020).

Los anticuerpos biespecíficos anti-oxMlF/anti-CD3 se divulgan en el documento WO2019/234241A1.

La agregación de proteínas, específicamente, la agregación de anticuerpos, se observa con frecuencia en varias etapas del bioprocesamiento, incluida la expresión de proteínas, la purificación y el almacenamiento. La agregación de anticuerpos puede afectar al rendimiento global de los procesos de fabricación de proteínas terapéuticas y puede contribuir a la estabilidad e inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos.

Así pues, la agregación proteínica de los anticuerpos sigue siendo un problema importante para su desarrollo y sigue siendo un área de gran interés en la producción de anticuerpos. La agregación de anticuerpos puede desencadenarse por el desdoblamiento parcial de sus dominios, dando lugar a la asociación entre monómeros seguida de nucleación y crecimiento de agregados. Aunque las propensiones a la agregación de los anticuerpos y las proteínas basadas en anticuerpos pueden verse afectadas por las condiciones experimentales externas, dependen en gran medida de las propiedades intrínsecas de los anticuerpos, determinadas por sus secuencias y estructuras.

Por ejemplo, la resistencia a la agregación puede conseguirse estabilizando el estado nativo (es decir, resistiendo el desdoblamiento) o reduciendo la propensión de los estados desdoblados o parcialmente plegados de la proteína a agregarse. Una desventaja de estabilizar el estado nativo es que las proteínas probablemente se expondrán a un entorno en el que se desplegarán. Generalmente, cuando una proteína se desnaturaliza o se despliega, los restos de aminoácidos que normalmente median los contactos intramoleculares en el interior de la proteína quedan expuestos. Esta exposición suele hacer que las proteínas sean propensas a formar contactos intermoleculares y agregarse. A diferencia de las proteínas que se resisten al desdoblamiento, una proteína con una propensión reducida a agregarse cuando se despliega simplemente se replegará a un estado bioactivo no agregado tras la exposición a dicho entorno.

La resistencia a la agregación o la propensión a la agregación de los anticuerpos y las proteínas que comprenden dominios de unión a antígenos suele estar limitada por el dominio o dominios más propensos a la agregación que contengan y por la fuerza de su interacción con los dominios circundantes (si están presentes).

Esto se debe a que una vez que ese dominio se despliega, si es incapaz de volver a plegarse, puede interactuar con otros dominios de la misma proteína o de otras proteínas y formar agregados. Los dominios constantes de los anticuerpos no suelen agregarse y no varían considerablemente. Por consiguiente, en general, se considera que los dominios más débiles de un anticuerpo con respecto al potencial de agregación y la estabilidad son los dominios variables (p. ej., el dominio variable de cadena pesada (V<h>) y/o el dominio variable de cadena ligera (V<l>), Ewert S.et al.,2003). En este sentido, la incorporación de dominios V<h>o V<l>propensos a la agregación en productos de anticuerpos recombinantes por lo demás estables a menudo confiere estos rasgos generalmente indeseables al nuevo diseño recombinante. Por tanto, es muy probable que la ingeniería de un dominio variable para que sea resistente a la agregación haga que toda la proteína que pueda comprender ese dominio variable sea resistente a la agregación. Se han propuesto varias estrategias para reducir la agregación de dominios variables, p. ej., diseño racional de proteínas resistentes a la agregación, injerto de la región determinante de la complementariedad (CDR), o introducción de enlaces disulfuro en un dominio variable. El diseño racional de proteínas resistentes a la agregación suele implicar el uso de análisis por simulación informática para predecir el efecto de una mutación puntual sobre la propensión a la agregación de una proteína. Sin embargo, este planteamiento plantea varias dificultades. Por ejemplo, no basta con identificar una mutación que pueda reducir la agregación de una proteína desplegada. En cambio, la mutación tampoco debe aumentar la agregación de una proteína plegada ni afectar a la función de la proteína plegada, especialmente las propiedades de unión, como la afinidad o la especificidad en el caso de los anticuerpos. Además, el diseño racional requiere un análisis estructural detallado de la proteína específica que se pretende mejorar y, por tanto, es difícil de utilizar con una proteína que no se ha caracterizado a fondo y no es fácilmente aplicable a diversas proteínas diferentes. El injerto de CDR consiste en trasplantar CDR de un dominio variable a regiones marco (FR) de otro dominio variable. Esta estrategia demostró ser útil para estabilizar un scFv anti-EGP-2 (Willuda J.et al.,1999). Las desventajas de esta estrategia incluyen la reducción de la afinidad que puede producirse tras el injerto de CDR. Esta pérdida de afinidad puede superarse introduciendo mutaciones en las FR, aunque dichas mutaciones pueden producir epítopos inmunogénicos en la proteína, por lo que la proteína resulta indeseable desde el punto de vista terapéutico. Además, el injerto de CDR suele requerir el análisis de la estructura cristalina o el modelado de la homología de los dominios variables donantes y aceptores para evaluar la idoneidad del injerto. Esta estrategia es laboriosa y requiere conocimientos especializados. Además, dado que cada dominio variable tiene una estructura diferente, el método no se aplica fácilmente a una gran variedad de moléculas. En cuanto a los métodos que implican la introducción de enlaces disulfuro en un dominio variable, aunque el enlace puede ayudar a que la proteína se vuelva a plegar correctamente, también introduce rigidez en el dominio variable. Dicha rigidez puede reducir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. Además, no todos los dominios variables pueden soportar la introducción de los restos de cisteína necesarios para la formación del enlace disulfuro sin pérdida de afinidad o sin introducir un epítopo inmunogénico. Además, la formación de enlaces disulfuro en altas concentraciones de proteína puede provocar su agregación, anulando así cualquier posible efecto positivo del enlace.

Sin embargo, se ha demostrado que la reducción de la propensión a la agregación va acompañada de un aumento del título de expresión, lo que demuestra que la reducción de la agregación de proteínas es beneficiosa en todo el proceso de desarrollo y puede conducir a un camino más eficiente hacia los estudios clínicos. Para las proteínas terapéuticas, los agregados son un importante factor de riesgo para las respuestas inmunitarias perjudiciales en los pacientes y pueden formarse mediante diversos mecanismos. El control de la agregación puede mejorar la estabilidad de la proteína, su fabricabilidad, su velocidad de desgaste, su seguridad, su formulación, sus títulos, su inmunogenicidad y su solubilidad (Wei Liet al.,2016; Van der Kant R.et al.,2017).

Otras propiedades intrínsecas de las proteínas, como la hidrofobia, también desempeñan un papel importante en la solubilidad de los anticuerpos. Se ha demostrado que la baja solubilidad de estas proteínas terapéuticas debida a su hidrofobia superficial dificulta el desarrollo de formulaciones y puede conducir a una mala biodistribución, un comportamiento farmacocinético no deseable e inmunogenicidadin vivo.Por tanto, la disminución de la hidrofobia superficial global de los anticuerpos monoclonales candidatos podría aportar beneficios y ahorros de costes relacionados la purificación y las pautas posológicas.

Se cree que en los efectos antineoplásicos intervienen múltiples mecanismos. En particular, las funciones efectoras dependientes del receptor Fc gamma (FcyR) NIA y dependientes del FcyRIIA pueden ser dos de los principales mecanismos críticos responsables de la eficacia clínica de los Ac terapéuticos. Se sabe que el FcyRIIIA es uno de los principales receptores desencadenantes de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en los linfocitos citolíticos naturales (NK) y que el FcyRIIA es uno de los principales receptores desencadenantes de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) en los macrófagos. La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), otra función efectora del anticuerpo, también se considera un posible mecanismo antitumoral. La mayoría de los anticuerpos terapéuticos que han sido autorizados y desarrollados como agentes médicos son del isotipo humano lgG1, que puede inducir ADCC y CDC. Estas funciones efectoras se activan a través de las interacciones del Fc con los FcyR o los complementos, y las interacciones se ven afectadas por oligosacáridos de tipo complejo biantenario ligados a N unidos a la región Fc del anticuerpo (Natsumeet al.,2009). Varios estudiosin vitroeinvivo han demostrado que la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)

es el modo de acción predominante contra las células cancerosas. Se ha demostrado la necesidad de una interacción directa entre los Ac y los receptores de la región Fc de los anticuerpos (FcR) para los efectos antitumorales de estos anticuerpos. Por consiguiente, las células efectoras inmunitarias portadoras de FcR desempeñan un papel importante en la mediación de sus efectos (lanello A. y Ahmad A., 2005). Sin embargo, Los anticuerpos dirigidos contra MIF conocidos en la técnica no inducen la lisis celular dependiente del complemento de las células sensibles a MIF ni la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (Hussainet al.,2013).

El documento US2011/236375A1 describe variantes de Fc con función efectora mejorada.

Una combinación de potencial de agregación reducido e hidrofobia reducida haría que las propiedades de los anticuerpos fueran muy ventajosas. Existe una necesidad en la técnica de anticuerpos dirigidos contra oxMIF resistentes a la agregación con hidrofobia reducida, pero también de anticuerpos anti-oxMlF con funciones efectoras mejoradas, que aún no ha sido satisfecha por las modificaciones actuales de los anticuerpos.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos mejorados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos dirigidos contra oxMIF y que tengan propensión a la agregación e hidrofobia reducidas.

El objetivo se resuelve mediante el objeto de la presente invención.

La presente invención divulga un anticuerpo anti-oxMlF recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene un potencial de agregación reducido y una hidrofobia reducida, que comprende los siguientes dominios variables:

(a1) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F o

(a2) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S y W93F, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales, con la condición de que se conserve la tirosina en la posición 36, y una de

(b1) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6; o

(b2) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y<w>97Y, o

(b3) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y W97Y, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales; en donde las posiciones de los aminoácidos se numeran según Kabat, y

en donde el potencial de agregación y la hidrofobia se reducen en comparación con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprenda la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 9 que carezca de las sustituciones de aminoácidos.

Específicamente, el anticuerpo recombinante anti-oxMlF comprende la sustitución de aminoácidos W93F con referencia a la SEQ ID NO: 9.

Específicamente, el anticuerpo recombinante anti-oxMlF comprende la sustitución de aminoácidos W97Y con referencia a la SEQ ID NO: 6.

De acuerdo con una realización específica adicional, el anticuerpo recombinante anti-oxMlF comprende las sustituciones de aminoácidos W93F y W97Y.

Sorprendentemente, se había demostrado que se podían sustituir posiciones seleccionadas incluso dentro de los dominios CDR para reducir el potencial de agregación y/o la hidrofobia sin tener ningún efecto negativo sobre la afinidad de unión a oxMIF.

Específicamente, el dominio variable de la cadena ligera comprende 1,2, 3, 4 o todas las sustituciones de aminoácidos M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F.

Específicamente, el anticuerpo recombinante anti-oxMlF comprende un dominio constante de cadena ligera (CL) de SEQ ID NO: 38.

De acuerdo con una realización específica, el anticuerpo recombinante anti-oxMlF descrito en el presente documento también tiene funciones efectoras mejoradas y comprende una región constante de cadena pesada que comprende

(a) la SEQ ID NO: 2 o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que comprenda los aminoácidos 239D y 332E; o

(b) la SEQ ID NO: 3, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y que comprenda los aminoácidos 239D, 268F, 324T y 332E; o

(c) la SEQ ID NO: 4, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 y que comprenda los aminoácidos 239D y 332E; o

(d) la SEQ ID NO: 5, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95%de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y que comprenda los aminoácidos 235V, 243L, 292P, 300L y 396L, en donde las posiciones de aminoácidos están numeradas según el índice de numeración de EU.

Específicamente, el anticuerpo anti-oxMlF descrito en el presente documento contiene un dominio VH o VL que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8, 10, 11, 12 y 13. De acuerdo con una realización alternativa, el anticuerpo anti-oxMlF contiene las SEQ ID NO: 6, 11 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5.

En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMlF contiene las SEQ ID NO: 7, 10 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMlF contiene las SEQ ID NO: 7, 11 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMlF contiene las SEQ ID NO: 8, 10 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

Además, en el presente documento se describe un anticuerpo anti-oxMlF que contiene las SEQ ID NO: 8, 11 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5, o la SEQ ID NO: 39, o la SEQ ID NO: 40.

En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMlF contiene las SEQ ID NO: 8, 13 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5, o la SEQ ID NO: 41, o la SEQ ID NO: 42.

En el presente documento se describe además un anticuerpo anti-oxMlF que comprende las SEQ ID NO: 39, 40, 41 o 42 o el anticuerpo anti-oxMlF que comprende las SEQ ID NO: 39, 44, 41 o 45.

Más específicamente, el anticuerpo anti-oxMIF recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo biespecífico.

En una realización específica, el anticuerpo anti-oxMlF descrito en el presente documento se selecciona entre el grupo que consiste en anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' y F(ab')2, Fab'-SH, fusión Fab-scFv, fusión Fab-(scFv)2, Fab-scFv-Fc, Fab-(scFv)2-Fc, proteínas de fusión de dos fragmentos variables monocatenarios (scFv) de diferentes anticuerpos (p. ej., BiTE), minicuerpo, TandAb®, DutaMab™, DART y CrossMab®.

Específicamente, el anticuerpo tal como se describe en el presente documento se utiliza en la preparación de un medicamento.

Específicamente, en el presente documento se proporciona una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de la invención, opcionalmente junto con un portador farmacéutico o adyuvante.

Específicamente, la composición comprende entre 10 y 250 mg/ml del anticuerpo descrito en el presente documento, que comprende específicamente >50 mg/ml.

Específicamente, dicha composición farmacéutica se formula para administración subcutánea.

Más específicamente, la composición farmacéutica puede usarse para el tratamiento de afecciones relacionadas con oxMIF.

Específicamente, la composición es para administración como única sustancia, o en combinación con otra composición farmacéutica que comprende una o más sustancias activas, seleccionadas preferentemente entre el grupo que consiste en sustancias antivíricas, antiinflamatorias, antineoplásicas, antiangiogénicas y antibióticas.

En una realización adicional, la composición farmacéutica es para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad inflamatoria, un trastorno hiperproliferativo, una enfermedad infecciosa o cáncer, específicamente en el tratamiento de asma, vasculitis, artritis, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, síndrome de choque tóxico, síndrome de dificultad respiratoria adquirido, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, nefritis y psoriasis, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas y cáncer de pulmón.

Además, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la invención.

Además, en el presente documento se proporciona un vector de expresión, que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento.

En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora, que contiene el ácido nucleico o un vector de expresión descrito en el presente documento.

Además, se proporciona un método para producir el anticuerpo de la invención, que comprende el cultivo de una célula hospedadora y la recuperación de dicho anticuerpo a partir del cultivo celular.

Además, en el presente documento se proporciona un método para producir un anticuerpo de la invención, que comprende expresar un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en una célula hospedadora.

Figuras

Figura 1: Secuencias de aminoácidos

Figura 2: Perfiles SEC (A, B) e HIC (C) mejorados de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño.

Figura 3: Unión de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño a MIF inmovilizada (determinación de KD).

Figura 4: Unión diferencial de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño a oxMIF frente a redMIF.

Figura 5: Funciones efectoras mejoradas de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño en un bioensayo de ADCC modificado.

Figura 6: Penetración tumoral del anticuerpo anti-oxMlF de nuevo diseño C0083. A: Biodistribución de C0008 (5 mg/kg/d); B: Biodistribución de C0083 (5 mg/kg/d); C: ratones de control no tratados.

Figura 7: Producción mejorada del anticuerpo anti-oxMlF C0083 de nuevo diseño.

Figura 8: Producción mejorada de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con mejores funciones efectoras y menor hidrofobia y propensión a la agregación, en comparación con sus homólogos respectivos con funciones efectoras mejoradas pero que comprenden los dominios<v>H y VL de C0008 (comparación de C0097 frente a C0064, C0098 frente a C0065 y C0100 frente a C0067).

Figura 9: Perfiles cromatográficos que demuestran la reducción de la agregación y la hidrofobia de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño. (A) Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y de los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con funciones efectoras mejoradas en una columna de filtración en gel Enrich 650 utilizando 1xPBS como fase móvil; (B) Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y los anticuerpos de nuevo diseño C0083, C0090, C0108 y C0109 en una columna HiTrap Butyl HP HIC.

Figura 10: Reducción de la unión no específica de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño en células A2780 MIF' /- determinada por FACS. Las células A2780 MIF-/- se tiñeron con los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0090, C0109 (A); C0083, C0108 (B) o el anticuerpo de control C0008, así como una IgG isotipo como control negativo. La media geométrica (intensidad de fluorescencia media para AF488), de células viables se representó gráficamente frente a la concentración de anticuerpo.

Figura 11: Curvas de unión de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas a oxMIF inmovilizada (estimación de K<d>); como anticuerpo de referencia se utilizó el anticuerpo anti-oxMlF C0008.

Figura 12: Unión diferencial de los anticuerpos de nuevo diseño a oxMIF frente a redMIF. Se utilizó C0008 como anticuerpo de referencia y una IgG isotipo como control negativo.

Figura 13: Farmacocinética de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090 en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008 en ratones BALB/c desnudos. La concentración plasmática de los anticuerpos se determinó mediante un ELISA cuantitativo anti-oxMIF a las 4, 10, 24, 48 y 96 h tras una inyección intravenosa única de 10 mg/kg de anticuerpos anti-oxMIF y las semividas se calcularon mediante un modelo de decaimiento de una fase en GraphPad Prism.

Figura 14: Funciones efectoras mejoradas de los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 determinadas mediante ensayos indicadores. (A-B) Bioensayo indicador de ADCC con los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con funciones efectoras mejoradas utilizando células efectoras Jurkat modificadas que expresan de forma estable FcyRIIIa (alotipo V de alta respuesta, alotipo F de baja respuesta) y células diana HCT116-pMIF (A) o A2780-pMIF (B) en comparación con el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 con Fc ts; (C) Bioensayo indicador de ADCP con los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con funciones efectoras mejoradas utilizando células efectoras Jurkat diseñadas que expresan de forma estable FcyRIla y células diana HCT116-pMIF en comparación con el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 con Fc ts. Se muestran la media y el EEM (n = 2-4).

Figura 15: Actividad ADCC mejorada de los anticuerpos anti-oxMIF de nuevo diseño C0108 y C0109 que contienen mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc, determinada mediante un ensayo de citotoxicidad mediada por PBMC. Bioensayo de ADCC con anticuerpos anti-oxMlF C0108 y C0109 de nuevo diseño y PBMCs como células efectoras (A: 22 % de células NK, B: 7 % de células NK) y HCT116-pMIF como células diana en comparación con el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 con Fc ts. Se muestra la media y el EEM de dos o tres réplicas utilizando PBMC de dos donantes sanos.

Figura 16: Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño muestran una fuerte reducción de la liberación inespecífica de citocinas a partir de PBMC humanas. Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 con mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc (70 nM) y el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008 (70 nM) se incubaron con PBMC humanas durante una noche, y los sobrenadantes se analizaron en ensayos citométricos de microesferas LegendPlex (BioLegend) para IL-6 humana (A) y MCP-1 humana (B). Se muestran las medias /- EEM de las concentraciones de citocinas de tres donantes diferentes de PMBC.

Descripción detallada

La información técnica expuesta a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Dicha información técnica adicional que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención.

Salvo que se indique o defina lo contrario, todos los términos utilizados en el presente documento tienen su significado habitual en la técnica, que será evidente para un experto en la materia. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándar, como Sambrooket al.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (4.a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Krebset al.,"Lewin's Genes XI", Jones & Bartlett Learning, (2017), y Murphy y Weaver, "Janeway's Immunobiology" (9.a Ed., o ediciones más recientes), Taylor & Francis Inc, 2017.

El objeto de las reivindicaciones se refiere específicamente a productos artificiales o a métodos que emplean o producen dichos productos artificiales, que pueden ser variantes de productos nativos (de tipo silvestre). Aunque puede haber un cierto grado de identidad de secuencia con la estructura nativa, se entiende generalmente que los materiales, métodos y usos de la invención, p. ej., refiriéndose específicamente a secuencias de ácido nucleico aisladas, secuencias de aminoácidos, construcciones de fusión, construcciones de expresión, células hospedadoras transformadas y proteínas modificadas, son "artificiales" o sintéticas, por lo que no se consideran resultado de las "leyes de la naturaleza".

Los términos "comprende", "contiene", "tiene" e "incluye", tal y como se utilizan en el presente documento, pueden usarse como sinónimos y se entenderán como una definición abierta, permitiendo más miembros o partes o elementos. Se considera que la expresión "que consiste" es una definición cerrada sin elementos adicionales a los de la característica de definición consistente. Por lo tanto, "que comprende" es más amplio y contiene la definición de "que consiste".

El término "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al mismo valor o a un valor que difiere en /-5 % del valor dado.

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, la forma en singular, por ejemplo, "un", "una" y "el" o "la" incluye el plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en el presente documento, aminoácidos se refiere a los veinte aminoácidos de origen natural codificados por sesenta y un tripletes de codones. Estos 20 aminoácidos pueden dividirse en los que tienen cargas neutras, cargas positivas y cargas negativas:

A continuación se muestran los aminoácidos "neutros" junto con su respectivo código de tres letras y de una sola letra y su polaridad: Alanina (Ala, A; no polar, neutro), Asparagina (Asn, N; polar, neutro), Cisteína (Cys, C; no polar, neutro), Glutamina (Gln, Q; polar, neutro), Glicina (Gly, G; no polar, neutro), Isoleucina (lle, I; no polar, neutro), Leucina (Leu, L; no polar, neutro), Metionina (Met, M; no polar, neutro), Fenilalanina (Phe, F; no polar, neutro), Prolina (Pro, P; no polar, neutro), Serina (Ser, S; polar, neutro), Treonina (Thr, T; polar, neutro), Triptófano (Trp, W; no polar, neutro), Tirosina (Tyr, Y; polar, neutro), Valina (Val, V; no polar, neutro), e Histidina (His, H; polar, positivo (10 %) neutro (90 %)).

Los aminoácidos con carga "positiva" son: Arginina (Arg, R; polar, positivo), y Lisina (Lys, K; polar, positivo).

Los aminoácidos con carga "negativa" son: Ácido aspártico (Asp, D; polar, negativo), y el Ácido glutámico (Glu, E; polar, negativo).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención comprende al menos un sitio de unión que reconoce específicamente a oxMIF y presenta una propensión reducida a la agregación y una hidrofobia reducida debido a sustituciones de aminoácidos dirigidas en los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con el anticuerpo no modificado que carece de dichas sustituciones de aminoácidos como se define en las reivindicaciones.

La reducción del potencial de agregación se debe a sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas dentro de los dominios variables del anticuerpo descrito en el presente documento.

El grado de agregación de anticuerpos puede medirse mediante diversas técnicas conocidas, incluida la espectrometría de masas, la cromatografía de exclusión por tamaño molecular (SEC), la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), la dispersión dinámica de la luz (DLS), el bloqueo de la luz (LO), técnicas de análisis dinámico de partículas por imágenes (DIP A), como la imagen de microflujo (MFI) y el contador de Coulter (CC), fluorimetría de barrido diferencial (DSF).

La hidrofobia reducida y el potencial de agregación reducido, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a una reducción de la hidrofobia superficial y un potencial de agregación reducido del anticuerpo de nuevo diseño en comparación con un anticuerpo de referencia, como el anticuerpo C0008, que comprende las SEQ ID NO: 1, 6, 38 y 9, como se divulga en el presente documento. La secuencia de C0008 contiene la secuencia de imalumab, publicada en la Lista 111 de DCI propuestas (Información de Fármacos de la OMS, Vol. 28, N.° 2, 2014), pero sin la lisina carboxiloterminal. La medición puede realizarse utilizando diversas técnicas conocidas que incluyen, entre otras, la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) o la espectroscopia de nanopartículas de autointeracción por captura de afinidad (AC-SINS), Estep P.et al.,2015).

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo dirigido contra oxMIF de la invención que tiene un potencial de agregación reducido y una hidrofobia reducida comprende específicamente un dominio variable de cadena ligera que tiene al menos una de las sustituciones de aminoácidos M30l , F49Y, A51G, P80S, W93F según la numeración de Kabat, o un dominio variable de cadena ligera con al menos un 95, específicamente al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia respecto de la SEQ ID NO: 9 que comprende la tirosina natural en la posición 36 y además al menos una de las sustituciones de aminoácidos M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F en combinación con un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 o en combinación con un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con las sustituciones de aminoácidos L5Q y/o W97Y según la numeración de Kabat, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:6 con 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos y que además comprende al menos una de las sustituciones de aminoácidos L5Q o W97Y.

En una realización alternativa, el dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 tiene 1,2, 3, 4, 5 sustituciones de aminoácidos con la condición de que se conserve la tirosina natural en la posición 36 y que además se sustituya al menos uno de los aminoácidos en las posiciones M30, F49, A51, P80, W93.

Específicamente, se prefieren las sustituciones de aminoácidos en las posiciones W93 y W97.

Además, se prefiere una sustitución de aminoácidos en la posición F49.

En el presente documento se describe además un anticuerpo anti-oxMlF con un potencial de agregación y una hidrofobia reducidos, que comprende específicamente un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 o un dominio variable de cadena ligera con al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 que comprende una tirosina en la posición 36 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 y la sustitución de aminoácidos W97Y o las sustituciones de aminoácidos L5Q y W97Y, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos y que comprende además la sustitución de aminoácidos W97Y, opcionalmente en combinación con L5Q.

La tirosina natural en la posición 36 de la cadena ligera se mantiene sin modificar para preservar las propiedades de unión del anticuerpo descrito en el presente documento. Cualquier modificación en dicha posición de aminoácidos puede dar lugar a una alteración no deseada de las propiedades de unión.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 10, y el dominio variable de cadena pesada contiene la SEQ ID NO: 7.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 10, y el dominio variable de cadena pesada contiene la SEQ ID NO: 8.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena pesada es de SEQ ID NO: 6.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena pesada contiene la SEQ ID NO: 7.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 11, y el dominio variable de cadena pesada contiene la SEQ ID NO: 8.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 12, y el dominio variable de cadena pesada es de SEQ ID NO: 6.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 12, y el dominio variable de cadena pesada contiene la SEQ ID NO: 8.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 13, y el dominio variable de cadena pesada es de SEQ ID NO: 6.

Específicamente, el dominio variable de cadena ligera contiene la SEQ ID NO: 13, y el dominio variable de cadena pesada contiene la SEQ ID NO: 8.

Por"función efectora"como se usa en el presente documento, se entiende un acontecimiento bioquímico que resulta de la interacción de la región Fc de un anticuerpo con un receptor o ligando de Fc. Las funciones efectoras incluyen, entre otras, la ADCC, la ADCP y la CDC.

Por"célula efectora"se entiende una célula del sistema inmunitario que expresa uno o más receptores Fc y media en una o más funciones efectoras. Las células efectoras incluyen, entre otras, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, linfocitos B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, linfocitos citolíticos naturales (NK) y linfocitos T y pueden ser de cualquier organismo, incluido, pero sin limitación, el ser humano, ratones, ratas, conejos y monos. En una realización específica, los anticuerpos anti-oxMlF descritos en el presente documento también han mejorado sus funciones efectoras debido a sustituciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas de la región constante de la cadena pesada. El aumento de las funciones efectoras de estos anticuerpos debido a una mayor actividad mediada por el complemento y los F<cy>R puede incluir una mayor citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). La ADCC mediada por el receptor Fc es un importante mecanismo de acción por el que los anticuerpos se dirigen a las células enfermas para su eliminación. Cuando la porción efectora Fc de los anticuerpos unidos a la diana también se une a los receptores FcyRIIIA de la superficie celular de las células efectoras, se produce una reticulación múltiple de los dos tipos de células, que conduce a la activación de la vía de ADCC.

Los anticuerpos con actividades del complemento mejoradas pueden determinarse mediante ensayos de CDC basados en células y la unión mejorada a C1q puede determinarse, p. ej., mediante SPR o ELISA.

Se determina que la mejora o el aumento de la actividad de CDC es de al menos 1,5 veces, específicamente al menos 1.6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, más concretamente al menos 5 veces, más concretamente, un aumento de al menos 6 veces en comparación con un anticuerpo de referencia, es decir, no modificado, de tipo salvaje, p. ej., C0008.

Se determina que el aumento de la actividad de ADCC es de al menos 1,5 veces, específicamente al menos 1,6 veces, 1.7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, más concretamente al menos 5 veces, más concretamente, una potencia al menos 6 veces mayor en comparación con un anticuerpo de referencia, es decir, anticuerpo no modificado de tipo silvestre, p. ej., C0008.

Además de los dominios variables de cadena ligera y pesada descritos anteriormente, el anticuerpo dirigido contra oxMIF puede comprender además una región constante de cadena pesada que comprenda la SEQ ID NO: 1 con al menos las sustituciones de aminoácidos S239D e I332E según el índice de numeración de EU, o una variante funcional que tenga al menos un 95 %, específicamente al menos un 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y que comprenda al menos las sustituciones de aminoácidos S239D, I332E y opcionalmente otras sustituciones de aminoácidos H268F y/o S324T.

Específicamente, el anticuerpo dirigido contra oxMIF contiene una región constante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2 o una región constante de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que comprende los aminoácidos 239D y 332E.

Como alternativa, el anticuerpo dirigido contra oxMIF contiene una región constante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3, o una región constante de cadena pesada que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y que comprende los aminoácidos 239D, 268F, 324T y 332E.

Como alternativa, el anticuerpo dirigido contra oxMIF puede comprender además una región constante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 4, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 y que comprenda los aminoácidos 239D, y 332E.

En una realización alternativa adicional, el anticuerpo anti-oxMlF puede comprender además una región constante de cadena pesada de SEQ ID NO: 5, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y que comprenda los aminoácidos 235V, 243L, 292P, 300L y 396L.

En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 7, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 7, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 7, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 7, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 7, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 8, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 8, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 8, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo antioxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 8, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 8, 10 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 6, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 6, 11 y 38.

En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 6, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 6, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 7, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 7, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 7, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 7, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 7, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo antioxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 8, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 8, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 8, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 8, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 8, 11 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1,6, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMlF comprende las SEQ ID NO: 2, 6, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID<n>O: 3, 6 , 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 6, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 7, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo antioxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 7, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 7, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 7, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 7, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 8, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 8, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 8, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID n O: 4, 8, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 8, 12 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 6, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMlF comprende las SEQ ID NO: 2, 6, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo antioxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 6, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 6, 13 y 150. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 6, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 7, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 7, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 7, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 7, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 7, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 1, 8, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 2, 8, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 3, 8, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo antioxMIF comprende las SEQ ID NO: 4, 8, 13 y 38. En una realización adicional, el anticuerpo anti-oxMIF comprende las SEQ ID NO: 5, 8, 13 y 38.

El sitio de unión a oxMIF del anticuerpo descrito en el presente documento es específico para la forma oxidada de MIF, es decir, para oxMIF de origen animal, específicamente de mamífero, tal como, pero sin limitación, oxMIF de ratón, rata, mono y ser humano, específicamente de ser humano, pero no muestra reactividad cruzada sustancial con MIF reducida. oxMIF es la isoforma estructural de MIF relacionada con la enfermedad que puede detectarse específica y predominantemente en la circulación de sujetos con enfermedades inflamatorias y en el tejido tumoral de pacientes con cáncer. En una realización, el sitio de unión anti-oxMlF humanizada o humana comprende una o más (p. ej., las tres) regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera de un dominio de unión anti-oxMlF humanizada o humana descrito en el presente documento, como las CDR incluidas, p. ej., en las SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12 o 13 y/o una o más (p. ej., las tres) regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio de unión anti-oxMlF humanizada o humana descrito en el presente documento, p. ej., las SEQ ID NO: 6, 7 u 8.

La especificidad de unión a oxMIF puede determinarse mediante cualquier ensayo adecuado para determinar la unión selectiva a oxMIF, como cualquier ensayo de competición contra un anticuerpo de control, tal como imalumab, con respecto a la unión a la oxMIF o a diversos ensayos conocidos en la técnica y según se divulga en el presente documento.

El término"anticuerpo"se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio y abarca polipéptidos o proteínas que consisten en o comprenden dominios de anticuerpo, que se entienden como dominios constantes y/o variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de las inmunoglobulinas, con o sin una secuencia enlazadora. El término engloba diversas estructuras de anticuerpos, que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos, tales como anticuerpos biespecíficos, anticuerpos triespecíficos y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad de unión al antígeno deseada, es decir, la unión a oxMIF. El término también engloba las proteínas de fusión, como fusiones con inmunotoxinas o conjugados de anticuerpos, tales como conjugados anticuerpo-fármaco que se unen a oxMIF.

Los dominios de anticuerpos pueden ser de estructura nativa o modificada por mutagénesis o derivatización, p. ej., para modificar las propiedades de unión al antígeno o cualquier otra propiedad, como la estabilidad o las propiedades funcionales, tales como la unión a los receptores de Fc, como el FcRn y/o el receptor de Fc-gamma. Las secuencias polipeptídicas se consideran dominios de anticuerpos, si comprenden una estructura de barril beta formada por al menos dos hebras beta de una estructura de dominio de anticuerpo conectadas por una secuencia de bucle.

Se entiende que el término "anticuerpo" incluye los derivados de unión a antígeno y fragmentos de los mismos. Un derivado es cualquier combinación de uno o más dominios de anticuerpos o anticuerpos de la invención y/o una proteína de fusión en la que cualquier dominio del anticuerpo de la invención puede fusionarse en cualquier posición de una o más proteínas, como otros anticuerpos o formatos de anticuerpos, p. ej., una estructura de unión que comprenda bucles CDR, un polipéptido receptor, sino también ligandos, proteínas de andamiaje, enzimas, marcadores, toxinas y similares.

El término "anticuerpo" se referirá en particular a polipéptidos o proteínas que presentan propiedades de unión al antígeno diana oxMIF.

Un"fragmento de anticuerpo"se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de unión al antígeno de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, moléculas de anticuerpos monocatenarios (p. ej. scFv), fusión Fab-scFv, Fab-(scFv)<2>, Fab-scFv-Fc, Fab-(scFv)<2>-Fc, F(ab')<2>, ScFv-Fc, diacuerpos, fragmentos cross-Fab; anticuerpos lineales; y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo. Además, los fragmentos de anticuerpos comprenden polipéptidos monocatenarios que tienen las características de un dominio VH, a saber, ser capaz de ensamblarse junto con un dominio VL, o de un dominio VL, a saber, ser capaz de ensamblarse junto con un dominio VH formando un sitio de unión a antígeno funcional y proporcionar así la propiedad de unión a antígeno de los anticuerpos de longitud completa. Los fragmentos de anticuerpo a los que se hace referencia en el presente documento también abarcan dominios Fc que comprenden una o más regiones de bucle estructural que contienen regiones de unión a antígeno como Fcab™ o formatos de anticuerpo de longitud completa con estructuras IgG en las que la región Fc ha sido sustituida por un Fcab™ que contiene un segundo sitio de unión a antígeno distinto.

La expresión"variante funcional"o "variante funcionalmente activa" también incluye las variantes alélicas de origen natural, así como mutantes o cualquier otra variante no natural. Como se conoce en la técnica, una variante alélica, o también denominada homóloga, es una forma alternativa de un ácido nucleico o péptido que se caracteriza por tener una sustitución, eliminación o adición de uno o más nucleótidos o aminoácidos que no altere esencialmente la función biológica del ácido nucleico o polipéptido. Específicamente, una variante funcional puede comprender una sustitución, eliminación y/o adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19 o 20 restos de aminoácidos o una combinación de los mismos, siendo dichas sustituciones, eliminaciones y/o adiciones modificaciones conservativas y que no alteran las propiedades de unión al antígeno. Específicamente, una variante funcional tal como se describe en el presente documento no comprende más de o hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos, que son modificaciones conservadoras y no alteran la función del anticuerpo. Específicamente, una variante funcionalmente activa como la descrita en el presente documento comprende hasta 15, preferentemente hasta 10 o 5, sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos, que son modificaciones conservadoras y no alteran la función del anticuerpo.

Las variantes funcionales pueden obtenerse mediante alteraciones de la secuencia del polipéptido o de la secuencia de nucleótidos, p. ej., mediante una o varias mutaciones puntuales, en donde las alteraciones de la secuencia conservan o mejoran una función del polipéptido o de la secuencia de nucleótidos inalterados, cuando se usan en combinación en la invención. Estas alteraciones de la secuencia pueden incluir, pero sin limitación, sustituciones (conservadoras), adiciones, eliminaciones, mutaciones e inserciones. Las sustituciones conservadoras son aquellas que se producen dentro de una familia de aminoácidos con cadenas laterales y propiedades químicas relacionadas. Algunos ejemplos de dichas familias son aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas no polares, con cadenas laterales aromáticas no polares, con cadenas laterales polares no cargadas, con pequeñas cadenas laterales, con grandes cadenas laterales, etc.

Una mutación puntual se entiende particularmente como la ingeniería de un polinucleótido que resulta en la expresión de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos no diseñada en la sustitución o intercambio, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos individuales (no consecutivos) o dobletes de aminoácidos por aminoácidos diferentes.

Como se usa en el presente documento,"Fragmento Fab o Fab"se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de cadena ligera que comprende un dominio VL y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada. Los anticuerpos de la invención pueden comprender al menos un fragmento Fab, en donde se intercambian las regiones variables o las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera. Debido al intercambio de las regiones variables o de las regiones constantes, dicho fragmento Fab también se denomina "fragmento cross-Fab" o "fragmento Fab cruzado". Dos composiciones de cadena diferentes de una molécula Fab cruzada son posibles y están comprendidas en los anticuerpos de la invención: Pueden intercambiarse las regiones variables de la cadena pesada y ligera del Fab, es decir, la molécula Fab cruzada comprende una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL). Esta molécula Fab cruzada también se denomina CrossFab(VLVH). Cuando se intercambian las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera del Fab, la molécula Fab cruzada puede comprender una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena pesada (VH) y la región constante de la cadena ligera (CL), y una cadena peptídica compuesta por la región variable de la cadena ligera (VL) y la región constante de la cadena pesada (CH1). Esta molécula Fab cruzada también se denomina CrossFab(CLCH1).

Un"(scFv)2"se refiere a un anticuerpo monoclonal artificial que es una proteína de fusión formada por dos fragmentos variables monocatenarios (scFvs) de anticuerpos diferentes o del mismo anticuerpo, o de cuatro o dos genes diferentes, en una única cadena peptídica de aproximadamente 50 kilodalton.

Un"bs(scFv)2"se refiere a un anticuerpo monoclonal artificial que es una proteína de fusión formada por dos fragmentos variables monocatenarios (scFvs) de anticuerpos con diferentes antígenos diana, o secuencias de aminoácidos de cuatro genes diferentes, en una sola cadena peptídica de aproximadamente 50 kilodalton.

Un"fragmento Fab monocatenario"o"scFab"es un polipéptido formado por un dominio variable (VH) de cadena pesada de anticuerpo, un dominio constante 1 (CH1) de anticuerpo, un dominio variable de la cadena ligera (VL) de anticuerpo, un dominio constante de cadena ligera (CL) de anticuerpo y un enlazador, en donde dichos dominios de anticuerpo y dicho enlazador pueden tener los siguientes órdenes en dirección de aminoterminal a carboxiloterminal: VH-CH1-enlazador-VL-CL, VL-CL-enlazador-VH-CH1, VH-CL-enlazador-VL-CH1 o VL-CH1-enlazador-VH-CL; y en donde dicho enlazador es un polipéptido de al menos 20 aminoácidos, al menos 30 aminoácidos, específicamente entre 32 y 50 aminoácidos. Dichos fragmentos Fab monocatenarios VH-CH1-enlazador-VL-CL, VL-CL-enlazador-VH-CH1, VH-CL-enlazador-VL-CH1 y VL-CH1-enlazador-VH-CL, puede estabilizarse mediante el enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. Además, estas moléculas Fab monocatenarias podrían estabilizarse aún más mediante la generación de enlaces disulfuro entre cadenas a través de la inserción de restos de cisteína.

El término "aminoterminal" denota el último aminoácido extremo aminoterminal.

El término "carboxiloterminal" denota el último aminoácido del extremo aminoterminal.

Un"BiTE"de "acoplador a linfocitos T biespecífico" se refiere a un anticuerpo monoclonal artificial que es una proteína de fusión que consiste en dos fragmentos variables monocatenarios (scFvs) de diferentes anticuerpos, o secuencias de aminoácidos de cuatro genes diferentes, en una única cadena peptídica de aproximadamente 50 kilodalton. Uno de los scFv puede, por ejemplo, pero sin limitación, unirse a un linfocito T, p. ej., a través de CD3, y la otra a una célula tumoral a través de oxMIF. Específicamente, el BiTE es de aproximadamente 50 kDa.

El término"minicuerpo"se refiere a un anticuerpo compuesto por un par de fragmentos Fv monocatenarios unidos mediante dominios CH3 (Fv-CH3 monocatenarios) y Fv con especificidad distinta, que se empareja con la primera parte mediante un proceso de heterodimerización (Hu S.Z.et al.,1996, Cancer Research, 56, 3055-3061). Para promover la eficacia de la heterodimerización, se pueden introducir mutaciones de un solo resto en cada dominio CH3 para lograr un enfoque de "botón en ojal". Además, también pueden introducirse restos adicionales de cisteína en los dominios CH3 para estabilizar la estructura del minicuerpo biespecífico. Una versión de un minicuerpo, el minicuerpo TriBi, comprende una cadena, que está diseñada para reconocer antígenos a través de sus dos fragmentos Fv, mientras que la otra cadena, que posee un fragmento Fv, se encarga de reclutar células efectoras, tales como linfocitos T citotóxicos o células NK. Con la adición de este dominio de unión adicional, la avidez del minicuerpo TriBi es superior a la del minicuerpo biespecífico. Específicamente, el minicuerpo es de aproximadamente 75 kDa.

El término"DART®"se refiere a los anticuerpos de doble afinidad que son la forma más simple de anticuerpos biespecíficos (BsAb). Una molécula DART consiste en dos fragmentos Fv diseñados que tienen su propio VH intercambiado con el otro. El Fv1 está formado por un VH del anticuerpo A y un VL del anticuerpo B, mientras que el Fv2 está formado por VH de Ab-B y VL de Ab-A. Este intercambio de dominios Fv libera fragmentos variantes de la restricción conformacional por el péptido de enlace corto.

El término"DutaMab™"se refiere a un formato de BsAb, que se forma al unir dos paratopos independientes en una sola cadena de inmunoglobulina.

El término"TandAb®"o "anticuerpo en tándem" se refiere a anticuerpos que tienen en tándem dos pares de VL/VH de dos Fv distintos, lo que también significa que los anticuerpos en tándem no llevan dominios Fc. Los TandAb son más pequeños que las IgG enteras o los Ac biespecíficos derivados de IgG, pero más grandes que los Ac biespecíficos de dominio único. Su tamaño moderado también confiere a los TandAb una mayor capacidad de penetración en los tejidos y una semivida sérica más prolongada. Además, la propiedad tetravalente, lo que significa bivalente para cada antígeno, puede mejorar su eficacia de unión y el consiguiente resultado terapéutico. Específicamente, el TandAb es de aproximadamente 100 kDa.

El término"diacuerpo"se refiere a un dímero no covalente de fragmento Fv monocatenario (scFv) que consta de las regiones variable de cadena pesada (V<h>) y variable de cadena ligera (V<l>) conectadas por un pequeño enlazador peptídico. Otra forma de diacuerpo es el (Fv)2 monocatenario, en el que dos fragmentos scFv están unidos covalentemente entre sí. Además, al enlazar en tándem los genes de cada cadena con un enlazador interno, pueden expresarse cuatro dominios VH y VL en tándem y plegarse como un diacuerpo monocatenario (scDb), que también es una estrategia eficaz para la producción de anticuerpos biespecíficos. Además, al fusionar dominios variables recombinantes con una región Fc o un dominio CH3 (scDb-Fc y scDb-CH3, diacuerpo-CH3) se puede duplicar la valencia del producto final. El aumento de tamaño también puede prolongar la semivida del diacuerpo en suero. Específicamente, el diacuerpo-CH3 es de aproximadamente 125 kDa.

El término"crossMab®"(donde mab se refiere a anticuerpo monoclonal) es un formato de Ac biespecíficos derivados de anticuerpos precursores independientes. La deformación de la cadena pesada se evita aplicando el método de botón en ojal (KIH). La desadaptación de la cadena ligera se evita ya que el anticuerpo biespecífico se produce con intercambio de dominios de anticuerpo, mientras que los dominios variables o los dominios constantes (CL y CH1) de un brazo de Fab se intercambian entre las cadenas ligera y pesada. Este "cruce" mantiene la afinidad de unión al antígeno y también preserva los dos brazos diferentes para evitar el desajuste de la cadena ligera. Algunos ejemplos de CrossMabs pueden ser, pero sin limitación, Fab, VH-VL y CH1-CL intercambiados en diferentes regiones. En los Fab CrossMAb se intercambian las regiones completas VH-CH1 y VL-CL; en el formato CrossMAb VH-VL solo se intercambian las regiones VH y VL; en el formato CrossMAb CH1-CL1 se intercambian las regiones CH1 y CL del anticuerpo biespecífico. Específicamente, el CrossMab es de aproximadamente 150 kDa.

El término"IgG-scFv"se refiere a un tipo de anticuerpos biespecíficos cuya biespecificidad se obtiene fusionando dos scFv respectivamente a una IgG monoespecífica. La especificidad de cada scFv puede ser igual o diferente. Además, el extremo amino o el extremo carboxílico de cada cadena ligera o pesada puede ir acompañado de dominios variables de anticuerpos emparejados, lo que conduce a la producción de diversos tipos de BsAb IgG-scFv: lgG(H)-scFv o scFv-(H)lgG: lgG(H)-scFv, dos scFv con la misma especificidad unidos al extremo carboxílico de la HC de IgG de longitud completa; scFv-(H)lgG, que es igual que lgG(H)-scFv, salvo que los scFv están unidos al extremo amino de la HC. lgG(L)-scFv o scFv-(L)lgG: los dos scFv iguales conectados al extremo carboxilo o amino de la cadena ligera de IgG, que forma el lgG(L)-scFv o scFv-(L)lgG, respectivamente. 2scFv-lgG o lgG-2scFv: generado mediante la fusión de dos scFv emparejados con diferente especificidad en el extremo amino (2scFv-lgG) o en el extremo carboxilo (lgG-2scFv). Específicamente, el lgG(H)-scFv es de aproximadamente 200 kDa.

De acuerdo con una realización específica, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender uno o más marcadores para purificación y/o detección, tales como, pero sin limitación, marcadores de afinidad, marcadores de mejora de la solubilidad y marcadores de seguimiento.

Específicamente, el marcador de afinidad se selecciona del grupo que consiste en marcador de poli-histidina, marcador de poli-arginina, sustrato peptídico para anticuerpos, dominio de unión a quitina, péptido de RNasa S, proteína A, pgalactosidasa, marcador FLAG, marcador Strep II, péptido de unión a estreptavidina (SBP), péptido de unión a calmodulina (CBP), glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP), marcador S, marcador HA y marcador c-Myc, específicamente el marcador es un marcador de His que comprende una o más H, tal como un marcador de hexahistidina.

Por"fusionado"o"conectado"se entiende que los componentes (p. ej., una molécula Fab y una subunidad de dominio Fc) están unidos por enlaces peptídicos, ya sea directamente o a través de uno o más enlaces peptídicos.

El término"enlazador", como se usa en el presente documento, se refiere a un enlazador peptídico y es preferentemente un péptido con una secuencia de aminoácidos con una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más aminoácidos, preferentemente con una longitud de 2-10, más preferentemente 3-5 aminoácidos.

El término"inmunoglobulina"se refiere a una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo de origen natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuesto por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas unidas por disulfuro. De aminoterminal a carboxiloterminal, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominado dominio variable pesado o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamada región constante de cadena pesada. De forma similar, de aminoterminal a carboxiloterminal, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominado dominio variable ligero o dominio variable de cadena ligera, seguido de un dominio constante de cadena ligera (CL), también denominada región constante de cadena ligera. Una inmunoglobulina de la clase IgG consta esencialmente de dos moléculas Fab y un dominio Fc, unidas a través de la región bisagra de la inmunoglobulina. La cadena pesada de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de cinco tipos, llamados a (IgA), 8 (IgD), £ (IgE),<y>(IgG) o p (IgM), algunos de los cuales pueden dividirse a su vez en subtipos, p. ej., Yi (IgGi), Y2 (IgG2), Y3 (IgG3), Y4 (lgG4), ai (IgAi) y a2 (lgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de dos tipos, denominados (k) y lambda (A).

La expresión"anticuerpo quimérico"se refiere a un anticuerpo en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera procede de una fuente o especie concreta, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera procede de una fuente o especie diferente, normalmente preparados mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir una región variable murina o de conejo y una región constante humana. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN que codifican regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas de ADN recombinante y transfección génica convencionales bien conocidas en la técnica (Morrison, S.L.,et al.,1984).

Un"anticuerpo humano"posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias codificantes de anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos. Como también se ha mencionado para los anticuerpos quiméricos y humanizados, la expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, también comprende los anticuerpos modificados en la región constante, p. ej., por "cambio de clase", es decir, cambio o mutación de las partes Fc (p. ej., de lgG1 a lgG4 y/o mutación de lgG1/lgG4).

La expresión"anticuerpo humano recombinante",como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como anticuerpos aislados de una célula hospedadora como una célula HEK, NS0 o de una célula CHO o de un animal (p. ej., un ratón) transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados mediante un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden y están relacionadas con las secuencias de línea germinal humana, pueden no existir en la naturaleza dentro del repertorio de anticuerpos humanosin vivo.

Un"marco consenso humano"es un marco que representa los restos de aminoácidos que aparecen más frecuentemente en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana procede de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como se describe en Kabatet al.,1991.

Un anticuerpo"humanizado"se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende restos de aminoácidos de HVR no humanos y restos de aminoácidos de regiones marco (FR) humanas se han humanizado. En ciertas realizaciones, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos un, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (p. ej., CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Otras formas de anticuerpos humanizados abarcadas por la presente invención son aquellas en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto a la del anticuerpo original para generar las nuevas propiedades, p. ej., con respecto a la unión a C1 q y/o la unión al receptor Fc (FcR).

El término"biespecífico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la reacción de unión al menos con un antígeno oxMIF y otro antígeno, tal como, pero sin limitación, p. ej., un antígeno CD3. Un anticuerpo biespecífico puede comprender específicamente al menos dos sitios con propiedades de unión específicas, en donde el anticuerpo reconoce dos antígenos diana diferentes, oxMIF y un antígeno adicional. Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo puede comprender dos sitios de unión, en donde cada uno de los sitios de unión es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente, p. ej., CD3 y oxMIF. Otro formato biespecífico ilustrativo puede comprender más de dos sitios de unión, en donde uno o más sitios de unión se unen a oxMIF y uno o más sitios de unión son capaces de unirse específicamente a uno o más antígenos diferentes, p. ej., CD3.

Los"anticuerpos biespecíficos"según la invención son anticuerpos que tienen dos especificidades de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos, tal como se describe en el presente documento. Los heterodímeros de inmunoglobulina Fc pueden diseñarse mediante modificaciones de la interfaz del dominio CH3, con diferentes mutaciones en cada dominio de forma que los fragmentos Fc diseñados, que portan el par variante de CH3, forman preferentemente heterodímeros en lugar de homodímeros (Ha J-H.et al.,2016). Algunos ejemplos de formatos de anticuerpos biespecíficos pueden ser, pero sin limitación, las IgG biespecíficas (BsIgG), IgG a las que se añade una molécula de unión a antígeno, fragmentos BsAb, proteínas de unión biespecíficas, conjugados de BsAb, bsIgG híbridos, moléculas de anticuerpo biespecíficas de dominio variable únicamente, proteínas de fusión de CH1/CL, proteínas de fusión de Fab, proteínas de fusión de Fc y CH3 modificadas, fusiones de IgG-HC adjuntas, fusiones de IgG-LC adjuntas, fusiones de IgG-HC y LC adjuntas, fusiones de Fc, fusiones de CH3, fusiones de IgE/IgM CH2, fusiones de F(ab')2, CH1/CL, IgG modificadas, proteínas de fusión distintas de inmunoglobulinas, IgG modificadas en Fc, diacuerpos, etc. como se describe en Spiess C.et al.,2015, y Brinkmann U. y Kontermann R.E., 2017.

El anticuerpo dirigido contra oxMIF de la invención puede comprender además al menos un sitio de unión que reconozca específicamente otro epítopo, p. ej., de CD3, específicamente un epítopo de CD3 humano, incluida la cadena CD3y (gamma), la cadena CD38 (delta) y dos cadenas CD3e (épsilon) presentes en la superficie celular. El agrupamiento de CD3 en los linfocitos T, tal como mediante anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, da lugar a una activación de los linfocitos T similar al acoplamiento del receptor de linfocitos T, pero independiente de su especificidad clonal típica. En ciertas realizaciones, el dominio de unión a CD3 del anticuerpo descrito en el presente documento muestra no solo potentes afinidades de unión a CD3 con CD3 humano, sino que también muestra una excelente reactividad cruzada con las respectivas proteínas CD3 del macaco cangrejero. En algunos casos, el dominio de unión CD3 del anticuerpo tiene reactividad cruzada con CD3 de macaco cangrejero. En una realización, el sitio de unión anti-CD3 comprende una o más (p. ej., las tres) regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera de un dominio de unión anti-CD3 descrito en el presente documento, y/o una o más (p. ej., las tres) regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio de unión anti-CD3 descrito en el presente documento, p. ej., un dominio de unión anti-CD3 que comprende una o más, p. ej., las tres, CDR de LC y una o más, p. ej., las tres, CDR de HC.

Específicamente, el anticuerpo anti-oxMlF comprende una segunda especificidad de unión o una adicional que se dirige a CD3 como se describe en el documento WO2019234241A1. Dicho anticuerpo biespecífico anti-oxMlF puede comprender un sitio de unión que reconozca específicamente CD3 que comprende

(a) una región variable de cadena pesada que comprende

una secuencia de CDR1-H2 que comprende o tiene al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de cualquiera de las secuencias seleccionadas entre el grupo

que consiste en RYTMH (SEQ ID NO: 14), GYGMH (SEQ ID NO: 15) y SFPMA (SEQ ID NO: 16), y

una CDR2-H2 que comprende o tiene al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de, cualquiera de las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en YINPSRGYTNYNQKFKD (SEQ ID NO: 17), VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 18) y TISTSGGRTYYRDSVKG (SEQ ID NO: 19), y

una CDR3-H2 que tiene al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de cualquiera de las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en YYDDHYCLDY (SEQ ID NO: 20), QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 21), FRQYSGGFDY (SEQ ID NO: 22) y YYDDHYSLDY (SEQ ID NO: 23), y

(b) una región variable de cadena ligera que comprende

una CDR1-L2 que comprende o tiene al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de, cualquiera de las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en RASSSVSYMN (SEQ ID NO: 24), SASSSVSYMN (SEQ ID NO: 25), RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 26) y TLSSGNIENNYVH (SEQ ID NO: 27), y

una CDR2-L2 que comprende o tiene al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de, cualquiera de las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en DTSKVAS (SEQ ID NO: 28), DTSKLAS (SEQ ID NO: 29), DASNRAT (SEQ ID NO: 30) y DDDKRPD (SEQ ID NO: 31), y

una CDR3-L2 que comprende o tiene al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de, cualquiera de las secuencias seleccionadas entre el grupo que consiste en QQWSSNPLT (SEQ ID NO: 32), QQWSSNPFT (SEQ ID NO: 33), QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 34), SQWLYGMDV (SEQ ID NO: 35) y QQWSSNP (SEQ ID NO: 36).

Más específicamente, un anticuerpo biespecífico anti-oxMIF/anti-CD3 comprende 0, 1 o 2 mutaciones puntuales en cada una de las secuencias de<c>D<r>enumeradas anteriormente.

Otra realización específica se refiere a un bs(scFv)2 anti-oxMIF/anti-CD3 en donde están dispuestas las correspondientes regiones variables de cadena pesada (VH) y las correspondientes regiones variables de cadena ligera (VL), de aminoterminal a carboxiloterminal, en el orden, VH(oxMIF)-VL(oxMIF)-VH(CD3)-VL(CD3), VH(CD3)-VL(CD3)-VH(oxMIF)-VL(oxMIF) o VH(CD3)-VL(CD3)-VL(oxMIF)-VH(oxMIF).

En una realización adicional, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, seleccionado específicamente entre el grupo que consiste en IgG biespecífica, IgG con un sitio de unión a CD3 adjunto, fragmentos BsAb, proteínas de unión biespecíficas, conjugados BsAb.

El término"antígeno"utilizado en el presente documento indistintamente con los términos"diana"o"antígeno diana", se referirá a una molécula diana completa o a un fragmento de dicha molécula reconocido por un sitio de unión de anticuerpo. Específicamente, dicho sitio de unión puede reconocer las subestructuras de un antígeno, por ejemplo, una estructura polipeptídica o carbohidratada, generalmente denominadas "epítopos", p. ej., epítopos de células B o epítopos de linfocitos T, que son inmunológicamente relevantes.

El término"epítopo", tal como se utiliza en el presente documento, se referirá en particular a una estructura molecular que puede constituir completamente una pareja de unión específica o formar parte de una pareja de unión específica a un sitio de unión de un formato de anticuerpo de la presente invención. Un epítopo puede estar compuesto por un hidrato de carbono, una estructura peptídica, un ácido graso, una sustancia orgánica, bioquímica o inorgánica o sus derivados y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo está comprendido en una estructura peptídica, tal como un péptido, un polipéptido o una proteína, suele incluir al menos 3 aminoácidos, específicamente de 5 a 40 aminoácidos y específicamente, menos de 10 aminoácidos, específicamente entre 4 a 10 aminoácidos. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales. Un epítopo lineal está compuesto por un único segmento de una secuencia primaria de un polipéptido o cadena de carbohidratos. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o solaparse. Los epítopos conformacionales se componen de aminoácidos o carbohidratos reunidos por plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria y los aminoácidos no son necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal. Dicho epítopo de oxMIF puede ser la secuencia EPCALCS (SEQ ID NO: 43) localizada dentro de la región central de oxMIF.

La expresión"dominio de unión a antígeno"o "dominio de unión" o "sitio de unión" se refiere a la parte de una molécula de unión a antígeno que comprende el área que se une específicamente a un antígeno y es complementaria a una parte o a la totalidad del mismo. Cuando un antígeno es grande, una molécula de unión a antígeno solo puede unirse a una parte concreta del antígeno, y dicha parte se denomina epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede proporcionarse mediante, por ejemplo, uno o más dominios variables de anticuerpos (también denominados regiones variables de anticuerpos). Preferentemente, un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo.

La expresión"sitio de unión", tal como se utiliza en el presente documento con respecto al anticuerpo de la presente invención, se refiere a una estructura molecular capaz de interactuar con un antígeno. Normalmente, el sitio de unión está situado dentro de la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo, también denominada "sitio de unión de CDR", que es una región específica con estructuras variables que confieren una función de unión a diversos antígenos. Las distintas estructuras pueden derivarse de repertorios naturales de anticuerpos, p. ej., repertorios murinos o humanos, o pueden producirse de forma recombinante o sintética, p. ej., mediante mutagénesis y, específicamente, mediante técnicas de aleatorización. Estos incluyen regiones CDR mutagenizadas, regiones de bucle de los dominios variables de anticuerpos, en particular los bucles CDR de los anticuerpos, tales como los bucles CDR1, CDR2 y CDR3 de cualquiera de los dominios VL y/o VH de anticuerpos. El formato de anticuerpo utilizado según la invención comprende típicamente uno o más sitios de unión CDR, cada uno específico de un antígeno.

El término"específico"tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una reacción de unión que es determinante del ligando afín de interés en una población heterogénea de moléculas. En el presente documento, la reacción de unión es al menos con un antígeno de oxMIF. Por tanto, en las condiciones indicadas, p. ej., condiciones de inmunoensayo, el anticuerpo que se une específicamente a su diana particular no se une en cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra, en concreto, no muestra una reactividad cruzada sustancial con la MIF reducida.

Un sitio de unión específico no suele presentar reactividad cruzada con otras dianas. Aun así, el sitio de unión específico puede unirse específicamente a uno o más epítopos, isoformas o variantes de la diana, o tener reactividad cruzada con otros antígenos diana relacionados, p. ej., homólogos o análogos.

La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, alta, media o baja afinidad de unión o avidez, según se seleccione. La unión selectiva se consigue normalmente si la constante de unión o la dinámica de unión a un antígeno diana como la oxMIF es al menos 10 veces diferente, preferentemente la diferencia es de al menos 100 veces, y más preferentemente de al menos 1000 veces en comparación con la constante de unión o la dinámica de unión a un antígeno que no es el antígeno diana.

El término"valente"tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, indica la presencia de un número determinado de sitios de unión en una molécula de anticuerpo. Por tanto, los términos "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de unión, cuatro sitios de unión, y seis sitios de unión, respectivamente, en una molécula de anticuerpo.

El término"monovalente"tal como se utiliza en el presente documento con respecto a un sitio de unión de un anticuerpo, se refiere a una molécula que comprende un solo sitio de unión dirigido contra un antígeno diana. El término "valencia" se entiende como el número de sitios de unión dirigidos contra el mismo antígeno diana, que se unen específicamente al mismo epítopo o a epítopos diferentes de un antígeno.

Se entiende que el anticuerpo de la presente invención comprende un sitio de unión monovalente, bivalente, tetravalente o multivalente que une específicamente a oxMIF.

De acuerdo con una realización adicional, el anticuerpo puede comprender uno o más sitios de unión adicionales que reconocen específicamente uno o más antígenos expresados en linfocitos T efectores, células NK o macrófagos, específicamente uno o más de CD3, ADAM17, CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11a, CD11b, CD14, CD16, CD16b, CD25, CD28, CD30, CD32a, CD40, CD 40L, CD44, CD45, CD56, CD57, CD64, CD69, CD74, CD89, CD90, CD137, CD177, CEAECAM6, CEACAM8, cadena HLA-Dra, KIR, LSECtin o SLC44A2.

De acuerdo con una realización alternativa, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo biespecífico que comprende además uno o más de los dominios de unión variable CD3 del mosunetuzumab, pasotuxizumab, cibisatamab, otelixizumab, teplizumab, visilizumab o foralumab.

De acuerdo con una realización específica, el sitio de unión anti-CD3 comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) seleccionadas entre el grupo que consiste en muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab (Nuvion), solitomab, blinatumomab, pasotuxizumab, cibisatamab, mosunetuzumab, SP34, X35, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 y WT-31 y cualquier derivado humanizado de los mismos, si procede.

Específicamente, una o más CDR de regiones variables anti-CD3 o CDR que comprendan o tengan al menos un 70 %, específicamente un 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia respecto de cualquiera de las secuencias de CDR de muromonab, otelixizumab, teplizumab, visilizumab, solitomab, blinatumomab, pasotuxizumab, cibisatamab, mosunetuzumab pueden usarse como dominios de unión a CD3 de acuerdo con la invención.

La expresión"región hipervariable"o "HVR", como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que tienen secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (H1, h 2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden generalmente restos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo estas últimas las que tienen la mayor variabilidad de secuencia y/o las que están implicada en el reconocimiento del antígeno (Kabatet al.,1991). Las regiones hipervariables (HVR) también se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR), y estos términos se utilizan aquí indistintamente en referencia a las porciones de la región variable que forman las regiones de unión al antígeno. El número exacto de restos que engloba una determinada CDR variará en función de la secuencia y el tamaño de la CDR.

Los expertos en la materia pueden determinar rutinariamente qué restos comprenden una CDR particular dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Kabat definió un sistema de numeración para las secuencias de regiones variables que es aplicable a cualquier anticuerpo. Un experto en la materia puede asignar inequívocamente este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo concreto mediante alineamiento en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia con la numeración de Kabat "estándar". Como se usa en el presente documento, "Numeración Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabatet al.,1983, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest". A menos que se especifique lo contrario, las referencias a la numeración de posiciones específicas de restos de aminoácidos en la región variable de un anticuerpo se hacen según el sistema de numeración de Kabat. La numeración de la región constante se ajusta al índice de numeración de EU.

Las CDR también comprenden "restos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son restos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR se encuentran en regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas o CDRa. A menos que se indique lo contrario, los restos de HVR y otros restos del dominio variable (p. ej., restos FR) se numeran en el presente documento según Kabatet al, citado anteriormente.

Una"mutación puntual"se entiende particularmente como la ingeniería de un polinucleótido que resulta en la expresión de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos no diseñada en la sustitución o intercambio, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos individuales (no consecutivos) o dobletes de aminoácidos por aminoácidos diferentes. Las mutaciones puntuales preferidas se refieren al intercambio de aminoácidos de la misma polaridad y/o carga. En este sentido, aminoácidos se refiere a los veinte aminoácidos de origen natural codificados por sesenta y un tripletes de codones. Estos 20 aminoácidos pueden dividirse en los que tienen cargas neutras, cargas positivas y cargas negativas.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia"con respecto a las secuencias peptídicas identificadas en el presente documento, se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica específica, después de alinear la secuencia e introducir huecos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas.

De acuerdo con la presente invención, la identidad de secuencia de las secuencias de región variable o constante es de al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 100 % con las secuencias respectivas descritas en el presente documento.

Un"sujeto"es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales domesticados (p. ej., vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (p. ej., humanos y primates no humanos como los monos), conejos y roedores (p. ej., ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un"ácido nucleico aislado"se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que normalmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una localización cromosómica diferente a la de su localización cromosómica natural.

"Ácido nucleico aislado que codifica un anti-oxMIF"se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de las mismas), incluyendo dichas moléculas de ácido nucleico en un único vector o en vectores independientes y dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.

"Sin reactividad cruzada sustancial"significa que una molécula (p. ej., un anticuerpo) no reconoce ni se une específicamente a un antígeno diferente del antígeno diana real de la molécula (p. ej., un antígeno estrechamente relacionado con el antígeno diana), específicamente MIF reducida, especialmente cuando se compara con ese antígeno diana. Por ejemplo, un anticuerpo puede unirse en menos de aproximadamente un 10% a menos de aproximadamente un 5 % a un antígeno distinto del antígeno diana real, o puede unirse a dicho antígeno distinto del antígeno diana real en una cantidad consistente en menos de aproximadamente un 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o 0,1 %, preferentemente menos de aproximadamente un 2 %, 1 % o 0,5 %, y más preferentemente menos de aproximadamente un 0,2% o 0,1 % a un antígeno diferente del antígeno diana real. La unión puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como, pero sin limitación, ELISA o resonancia de plasmones superficiales.

La producción recombinante del anticuerpo de la invención emplea preferentemente un sistema de expresión, p. ej., incluyendo construcciones o vectores de expresión que comprendan una secuencia de nucleótidos que codifique el formato del anticuerpo.

La expresión"sistema de expresión"se refiere a moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de control en unión operativa, de tal forma que los hospedadores transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para efectuar la transformación, el sistema de expresión puede incluirse en un vector; sin embargo, el ADN correspondiente también puede integrarse en el cromosoma del hospedador. Como alternativa, se puede utilizar un sistema de expresión para la transcripción/traducciónin vitro.

Los"vectores de expresión"utilizados en el presente documento se definen como secuencias de ADN necesarias para la transcripción de secuencias de nucleótidos recombinantes clonadas, es decir, de genes recombinantes y la traducción de su ARNm en un organismo hospedador adecuado. Los vectores de expresión comprenden el casete de expresión y, además, suelen incluir un origen para la replicación autónoma en las células hospedadoras o un sitio de integración del genoma, uno o más marcadores de selección (p. ej., un gen de síntesis de aminoácidos o un gen que confiera resistencia a antibióticos como la zeocina, kanamicina, G418 o higromicina), varios sitios de corte por enzimas de restricción, una secuencia promotora adecuada y un terminador de la transcripción, cuyos componentes están unidos entre sí de forma operativa. Los términos "plásmido" y "vector" utilizados en el presente documento incluyen secuencias de nucleótidos de replicación autónoma, así como secuencias de nucleótidos de integración genómica.

Específicamente, el término se refiere a un vehículo por el que una secuencia de ADN o ARN (p. ej., un gen extraño), p. ej., una secuencia de nucleótidos que codifica el formato de anticuerpo de la presente invención, puede introducirse en una célula hospedadora, con el fin de transformar el huésped y promover la expresión (p. ej., la transcripción y la traducción) de la secuencia introducida. Los plásmidos son los vectores preferidos de la invención.

Los vectores comprenden normalmente el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta ADN extraño. Una forma común de insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que cortan el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción.

Un"casete"se refiere a una secuencia codificante de ADN o a un segmento de ADN que codifica un producto de expresión que puede insertarse en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción del casete están diseñados para garantizar la inserción del casete en el marco de lectura adecuado. Generalmente, el ADN extraño se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector, y luego se transporta por el vector a una célula hospedadora junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN con ADN insertado o añadido, como un vector de expresión, también puede denominarse "construcción de ADN". Un tipo común de vector es un "plásmido", que generalmente es una molécula de ADN bicatenario autocontenida que puede aceptar fácilmente el ADN (extraño) adicional y que puede introducirse fácilmente en una célula hospedadora adecuada. Un vector de la invención suele contener ADN codificante y secuencias de control de la expresión, p. ej., ADN promotor, y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN exógeno. El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia particular de aminoácidos para un polipéptido o proteína particular, como un formato de anticuerpo de la invención. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula, o de otro modo media o controla la expresión del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden proceder del mismo gen o de genes diferentes, y pueden proceder del mismo organismo o de organismos diferentes. Los vectores de clonación recombinantes de la invención incluirán a menudo uno o más sistemas de replicación para la clonación o la expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedador, p. ej., resistencia a los antibióticos y uno o más casetes de expresión.

Los procedimientos utilizados para ligar secuencias de ADN, p. ej., proporcionar o codificar los factores de la presente invención y/o la proteína de interés, un promotor, un terminador y otras secuencias, respectivamente, e insertarlos en vectores adecuados que contengan la información necesaria para la integración o la replicación en el hospedador, son bien conocidos por los expertos en la materia, p. ej., como se describe por Sambrooket al.,2012.

Porcélula hospedadorase entiende específicamente una célula, una célula recombinante o línea celular transfectada con una construcción de expresión, tal como un vector de acuerdo con la invención.

La expresión"línea celular hospedadora"como se usa en el presente documento, se refiere a un clon establecido de un tipo celular concreto que ha adquirido la capacidad de proliferar durante un periodo de tiempo prolongado. La expresión línea celular hospedadora se refiere a una línea celular utilizada para expresar un gen endógeno o recombinante para producir polipéptidos, tal como el formato de anticuerpo recombinante de la invención.

Una"célula hospedadora de producción"o "célula de producción" se entiende comúnmente como una línea celular o cultivo de células listas para su uso para su cultivo en un biorreactor con el fin de obtener el producto de un proceso de producción, el formato de anticuerpo recombinante de la invención. El tipo de célula hospedadora según la presente invención puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

El término"recombinante"como se usa en el presente documento, significa "preparado mediante ingeniería genética" o "resultado de la ingeniería genética", p. ej., empleando específicamente secuencias heterólogas incorporadas en un vector recombinante o en una célula hospedadora recombinante.

Un anticuerpo de la invención puede producirse utilizando cualquier sistema de expresión conocido y bien establecido y tecnología de cultivo de células recombinantes, por ejemplo, mediante expresión en hospedadores bacterianos (sistemas procariotas), o sistemas eucariotas como las levaduras, hongos, células de insecto o células de mamífero. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede producirse en organismos transgénicos como una cabra, una planta o un ratón transgénico, una estirpe de ratón modificada por ingeniería que tiene grandes fragmentos de los locus de inmunoglobulina humanos y es defectuoso en la producción de anticuerpos de ratón. También puede producirse un anticuerpo mediante síntesis química.

De acuerdo con una realización específica, la célula hospedadora es una línea celular de producción de células seleccionadas entre el grupo que consiste en CHO, PerC6, CAP, HEK, HeLa, NSO, SP2/0, hibridoma y Jurkat. Más específicamente, la célula hospedadora se obtiene de células CHO.

La célula hospedadora de la invención se cultiva o mantiene específicamente en un cultivo sin suero, p. ej., con otros componentes, tales como proteínas plasmáticas, hormonas y factores de crecimiento, como alternativa al suero.

Se prefieren particularmente células hospedadoras, cuando se establecen, adaptan y cultivan por completo en condiciones sin suero y opcionalmente en medios que carecen de cualquier proteína o péptido de origen animal.

Los anticuerpos anti-oxMIF de la invención pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales.

La expresión"formulación farmacéutica"se refiere a un preparado que se encuentra en una forma que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administraría la formulación.

Un"vehículo farmacéuticamente aceptable"se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, aminoácidos, tales como glicina o histidina, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Algunos ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de adyuvantes, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo.

Como se usa en el presente documento,"tratamiento","tratar" o "tratando" se refiere a una intervención clínica con la intención de alterar el curso natural del individuo que se está tratando y puede realizarse con fines profilácticos o durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, pero sin limitación, prevenir la aparición o recidiva de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación de la patología y la remisión o pronóstico mejorado. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar su progresión.

El anticuerpo anti-oxMlF de la invención y las composiciones farmacéuticas que lo comprenden, pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos, diagnósticos o profilácticos diferentes. Algunos agentes terapéuticos adicionales incluyen otros antineoplásicos, antitumorales, antiangiogénicos, quimioterápicos, esteroides o inhibidores de los puntos de control en función de la enfermedad que se vaya a tratar.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden encontrarse en diversas formas, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. ej., soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo previsto de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de los seres humanos. El modo de administración preferido es parenteral (p. ej., intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados.

Debido a las propiedades optimizadas y ventajosas del anticuerpo de la invención, pueden administrarse dosis elevadas de la composición de anticuerpos. Específicamente, la composición comprende entre 10 y 250 mg/ml del anticuerpo, concretamente de 25 a 100 mg/ml, específicamente >50 mg/ml.

El anticuerpo anti-oxMlF puede administrarse una vez, pero más preferentemente se administra varias veces. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse desde tres veces al día hasta una vez cada seis meses o más. La administración puede realizarse de forma programada, por ejemplo, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses.

La invención también se refiere a composiciones que comprenden un anticuerpo anti-oxMIF o una porción de unión a antígeno del mismo, para el tratamiento de un sujeto que necesite tratamiento para afecciones relacionadas con MIF, específicamente enfermedades inmunológicas como las enfermedades inflamatorias y los trastornos hiperproliferativos. En algunas realizaciones, el sujeto que necesita tratamiento es un ser humano.

El término"cáncer", como se usa en el presente documento, se refiere a enfermedades proliferativas, específicamente a tumores sólidos, tales como el cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, melanoma, carcinoma epidermoide (CE) (p. ej., de cabeza y cuello, esofágico y de la cavidad oral), carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma colorrectal, cáncer de riñón, cáncer medular de tiroides, cáncer papilar de tiroides, tumor astrocítico, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, cáncer cervicouterino, carcinoma endometrial, cáncer de mama, cáncer de próstata y seminoma maligno, incluidas las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.

Los trastornos hiperproliferativos, les como enfermedades cancerosas o cánceres, que pueden tratarse con anticuerpos anti-oxMlF de la invención pueden afectar a cualquier tejido u órgano e incluyen, entre otros, los cánceres de cerebro, pulmón, epidermoides, de vejiga, gástricos, páncreas, mama, cabeza, cuello, hígado, renal, ovario, próstata, colorrectal, esófago, ginecológico, nasofaríngeo o tiroideo, melanomas, linfomas, leucemias o mielomas múltiples. En particular, los anticuerpos anti-oxMlF de la invención son útiles para tratar carcinomas de ovario, páncreas, colon y pulmón.

En una realización específica, los anticuerpos muy adecuados para el tratamiento de enfermedades cancerosas, específicamente para el tratamiento de tumores sólidos son anticuerpos anti-oxMlF recombinantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen un potencial de agregación reducido y una hidrofobia reducida, que comprende los siguientes dominios variables:

(a1) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S, W93F o

(a2) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S y W93F, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales, con la condición de que se conserve la tirosina en la posición 36; y uno de

(b1) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6; o

(b2) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y W97Y, o

(b3) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y W97Y, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales, en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat, y en donde el potencial de agregación y la hidrofobia se reducen en comparación con un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 9 que carece de las sustituciones de aminoácidos.

Como alternativa, el tratamiento de tumores sólidos puede realizarse con anticuerpos anti-oxMlF recombinantes que comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 o un dominio variable de cadena ligera con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 que comprende una tirosina en la posición 36 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 y sustituciones de aminoácidos W97Y y/o L5Q, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos y que comprende además las sustituciones de aminoácidos W97Y y/o L5Q.

En una realización específica adicional, los anticuerpos muy adecuados para el tratamiento de enfermedades cancerosas, específicamente para el tratamiento de tumores sólidos, son anticuerpos recombinantes anti-oxMlF descritos que también tienen funciones efectoras mejoradas con una región constante de cadena pesada que comprende

(a) la SEQ ID NO:2 o una variante funcional que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que comprenda los aminoácidos 239D y 332E; o

(b) la SEQ ID NO: 3, o una variante funcional que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y que comprenda los aminoácidos 239D, 268F, 324T y 332E; o

(c) la SEQ ID NO: 4, o una variante funcional que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 y que comprenda los aminoácidos 239D y 332E; o

(d) la SEQ ID NO: 5, o una variante funcional que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y que comprenda los aminoácidos 235V, 243L, 292P, 300L y 396L.

La invención también abarca una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención para su uso en métodos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias como vasculitis, artritis, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, síndrome de choque tóxico, síndrome de dificultad respiratoria adquirido, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, nefritis, dermatitis atópica, asma, conjuntivitis, fiebre, malaria, EHNA (esteatosis hepática no alcohólica), esclerosis múltiple, pancreatitis aguda y crónica, diabetes de tipo 1, nefropatía por IgA, cistitis intersticial, síndrome post COVID, psoriasis, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, nefritis y peritonitis, lupus eritematoso sistémico (LES, incluida la nefritis lúpica), asma, artritis reumatoide (AR) y enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en un sujeto, incluido un ser humano, que comprende la etapa de administrar a dicho sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-oxMIF o una porción de unión a antígeno del mismo.

En una realización específica, los anticuerpos muy adecuados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o infecciosas son los anticuerpos anti-oxMlF recombinantes o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen un potencial de agregación reducido y una hidrofobia reducida, los siguientes dominios variables:

(a1) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, p 80S y W93F, o

(a2) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones de aminoácidos, seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S y W93F, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales, con la condición de que se conserve la tirosina en la posición 36, y una de

(b1) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6; o

(b2) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y<w>97Y, o

(b3) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y W97Y, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales; en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat y en donde el potencial de agregación y la hidrofobia se reducen en comparación con un anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 9 que carece de las sustituciones de aminoácidos.

Como alternativa, el tratamiento de enfermedades inflamatorias o infecciosas puede realizarse con anticuerpos antioxMlF recombinantes que comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 o un dominio variable de cadena ligera con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 9 que comprende una tirosina en la posición 36 y un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 y sustituciones de aminoácidos W97Y y/o L5Q, o un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos y que comprende además las sustituciones de aminoácidos W97Y y/o L5Q.

En una realización específica adicional, los anticuerpos muy adecuados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o infecciosas, son los anticuerpos recombinantes anti-oxMlF descritos que también han aumentado la unión preferente al receptor inhibidor FcyRIIB, o tienen hiperasialilación ligada a 2,6-N.

Ejemplos

Los ejemplos descritos en el presente documento son ilustrativos de la presente invención y no pretenden ser una limitación de la misma.

Por consiguiente, debe entenderse que los ejemplos son únicamente ilustrativos y no son limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1: Menor propensión a la agregación y menor hidrofobia de los anticuerpos de nuevo diseño.

Tabla 1: ID de variantes de los anticuerpos de nuevo diseño y combinaciones de secuencias de moléculas en los ejemplos

Para evaluar la hidrofobia y la agregación, los anticuerpos de nuevo diseño se analizaron por filtración en gel (SEC) utilizando dos columnas de SEC y condiciones de tampón de funcionamiento diferentes y por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) y se compararon con el anticuerpo anti-oxMIF C0008.

Para la SEC, las muestras se diluyeron a 0,1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato 5x que incluía Tween al 0,02 % (5xPBST) y se aplicaron 50 pl de muestra a una columna de filtración en gel Superdex 200 increase 10/300 GL (GE Healthcare) con un caudal de 0,75 ml/min. Las separaciones y el equilibrio se realizaron en 5xPBST a 22 °C. Los picos de proteínas se controlaron mediante absorbancia a 214 nm y los espectros se analizaron utilizando el paquete de software de emulación Unicorn (GE Healthcare). Además, las muestras se diluyeron a 0,2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato 1x (IxPBS) y se aplicaron 100 pl de muestra a una columna de filtración en gel Enrich 650 (Bio-Rad) a un caudal de 1 ml/min. Las separaciones y el equilibrado se realizaron en 1xPBS a 22 °C. Los picos de proteína se controlaron mediante absorbancia a 280 nm y los espectros se analizaron con el paquete de software Chromlab (Bio-Rad). Los resultados se presentan en volumen de retención (Vr, ml) para el pico principal y la presencia de agregados se clasificó manualmente.

Para el análisis de la HIC, todas las muestras se diluyeron hasta una concentración final de 0,2 mg/ml utilizando fosfato 50 mM y sulfato amónico 0,75 M, pH 6,9. Las muestras altamente purificadas de anticuerpos se cargaron independientemente en una columna HiTrap Butyl HP de 1 ml. Se inyectaron muestras de 50 pl y el caudal de la columna se mantuvo a 1 ml/min a 22 °C. La separación de los picos se llevó a cabo en un gradiente de 20 volúmenes de columna (CV) de 0-100 % de B (tampón B: fosfato 50 mM, isopropanol al 20 %; pH 7,0). Los picos de proteínas se controlaron mediante absorbancia a 280 nm y los espectros se analizaron utilizando el paquete de software de emulación Unicorn (GE healthcare). Los resultados se expresan en Vr (ml) en el pico máximo, para cada pico.

Resultados: El anticuerpo de control (C0008) demostró un volumen de retención cercano al volumen del lecho de las columnas de exclusión por tamaño molecular (~24 ml Superdex 200, ~18 ml Enrich 650), que corresponde a un peso molecular muy inferior al esperado para una IgG humana (figura 2A y B). La inusual larga retención se debió principalmente a interacciones hidrófobas con la superficie de la fase estacionaria. Además del elevado volumen de retención, cantidades significativas de dímeros y agregados de IgG estaban presentes para C0008. Todos los anticuerpos de nuevo diseño mostraron un volumen de retención (Vr) reducido, lo que demuestra una menor interacción con la columna y, por tanto, una menor hidrofobia de las moléculas (tabla 2, figura 2A y B). C0083 y C0090 mostraron el volumen de retención más bajo (tabla 2, figura 2B) y el Vr correspondía al peso molecular de una IgG humana monomérica, cuando se compara con un patrón de peso molecular. Además, los dímeros de anticuerpos y la agregación se redujeron significativamente en las muestras de anticuerpos de nuevo diseño C0073, C0078, C0083 y C0090 (figura 2 A y B). Especialmente C0083 y C0090 mostraron un único pico de monómero.

Utilizando los volúmenes de retención de la columna de HIC, los anticuerpos se clasificaron de la IgG más hidrófoba a la menos hidrófoba (de menor a mayor volumen de retención) (figura 2C, tabla 3) y los resultados confirmaron los datos del análisis de SEC. El anticuerpo de nuevo diseño C0083 (volumen de retención de 12,37) fue el menos hidrófobo, mientras que C0008 (volumen de retención de 14,92 ml) mostró la mayor hidrofobia.

Tabla 2 Cromatografía de exclusión por tamaños

Tabla 3 Cromatografía de Interacción hidrófoba

La figura 2 muestra los perfiles cromatográficos que demuestran la reducción de la agregación y la hidrofobia de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño. (A) Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y anticuerpos de nuevo diseño en una columna de filtración en gel Superdex 200 increase 10/300 GL utilizando 5xPBST como fase móvil. (B) Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y anticuerpos de nuevo diseño en una columna de filtración en gel Enrich 650 utilizando 1xPBS como fase móvil (C) Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y anticuerpos de nuevo diseño en una columna HiTrap Butyl HP HIC.

Ejemplo 2Unión de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño a MIF inmovilizada (determinación de K<d>)

La MIF humana recombinante diluida en PBS a 1 pg/ml se inmovilizó en placas ELISA durante una noche a 4 °C (transformando la MIF en oxMIF según Thieleet al.,2015). Después del bloqueo, se añadieron a las placas diluciones seriadas de anticuerpos anti-oxMlF. Finalmente, los anticuerpos unidos se detectaron utilizando un conjugado de proteína L-HRP y tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. La reacción cromogénica se detuvo con H<2>SO<4>3M y se midió la DO a 450 nm. Los datos de diferentes experimentos se normalizaron a la DO máxima del anticuerpo antioxMlF C0008 (=100 %) del experimento respectivo y los valores de CE<50>se determinaron mediante un ajuste de 4 parámetros utilizando GraphPad Prism (y se muestra la media de dos experimentos).

Resultados: La unión de los anticuerpos de nuevo diseño con MIF inmovilizada (oxMIF) se midió en un amplio rango de concentraciones y las curvas de unión resultantes se ilustran en la figura 3. El anticuerpo anti-oxMlF (C0008) se utilizó como referencia para la unión a oxMIF. Las curvas de unión y los valores de CE<50>calculados, que representa la K<d>, mostraron claramente que los anticuerpos de nuevo diseño C0073, C0076, C0078, C0083 y C0090 conservaron su afinidad (intervalo de CE500,5-1,6 nM, que está dentro de la variabilidad del ensayo) para oxMIF, en comparación con C0008 (CE500,7 nM) (figura 3A). Sorprendentemente, C0077 mostró una reducción de 5 veces en la afinidad por oxMIF por solo una mutación puntual adicional (Y36F) en VL en comparación con C0076 (figura 3A), aunque la hidrofobia de C0077 se redujo notablemente (figura 2A).

En otra serie de experimentos, los anticuerpos de nuevo diseño que albergan mutaciones en la porción Fc para aumentar las funciones efectoras, mostraron valores de CE<50>en el intervalo de 0,4-0,8 nM, que de nuevo coincide exactamente con la afinidad aparente del anticuerpo de control C0008 (figura 3B).

La figura 3 muestra la unión de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño a MIF inmovilizado (determinación de K<d>). (A) Curvas de unión de anticuerpos de nuevo diseño con porciones Fc de tipo silvestre. (B) Curvas de unión de anticuerpos de nuevo diseño que albergan mutaciones en la porción Fc para aumentar las funciones efectoras. C0008 se utilizó como anticuerpo de referencia.

Tabla 4 Valores de K<d>de los anticuerpos anti-oxMlF

Ejemplo 3:Unión diferencial de anticuerpos anti-oxMIF de nuevo diseño a oxMIF frente a redMIF.

Los anticuerpos anti-oxMlF se inmovilizaron en microplacas durante una noche a 4 °C a una concentración de 15 nM. Después del bloqueo, se incubaron con 50 ng/ml de redMIF o del sustituto de oxMIF NTB-MIF (Schinaglet al.,2018). La oxMIF capturada se detectó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MIF biotinilado y un conjugado de estreptavidina-HRP. Las placas se tiñeron con tetrametilbencidina (t Mb ) y la reacción cromogénica se detuvo añadiendo H2SO4 al 30 %. La DO se midió a 450 nm. Los datos de diferentes experimentos se normalizaron a la DO máxima del anticuerpo anti-oxMlF C0008 (=100 %) del experimento respectivo, y se muestra la media de dos a tres experimentos.

Resultados: La unión de los anticuerpos de nuevo diseño con la oxMIF soluble y redMIF se representa en la figura 4. Los resultados mostraron claramente que los anticuerpos de nuevo diseño C0073, C0076, C0078, C0083 y C0090 demostraron una fuerte unión a oxMIF pero ninguna unión a redMIF, de este modo, los anticuerpos con hidrofobia y agregación reducidas conservaron su capacidad para discriminar entre oxMIF y redMIF. Los anticuerpos de nuevo diseño mostraron DO similares en comparación con el anticuerpo de control C0008, que se ha descrito para discriminar entre oxMIF y redMIF (Thieleet al.,2015) (figura 4A). Sorprendentemente, C0077 mostró que la unión a oxMIF se reducía significativamente por una sola mutación puntual adicional (Y36F) en VL en comparación con C0076 (figura 4A). C0077 muestra una hidrofobia notablemente reducida (figura 2A) pero no consiguió mantener las propiedades de unión.

En otra serie de experimentos, los anticuerpos de nuevo diseño que contienen mutaciones en la porción Fc (C0097-C0100) para aumentar las funciones efectoras, también conservaron su capacidad para discriminar entre oxMIF y redMIF, y mostraron DO similares en comparación con el anticuerpo C0008 (figura 4B).

La figura 4 muestra la unión diferencial de los anticuerpos de nuevo diseño a oxMIF frente a redMIF. (A) Unión diferencial de anticuerpos de nuevo diseño con porciones Fc de tipo silvestre. (B) Unión diferencial de anticuerpos de nuevo diseño que albergan mutaciones en la porción Fc para aumentar las funciones efectoras. C0008 se utilizó como anticuerpo de referencia.

Ejemplo 4:Aumento de las funciones efectoras de los anticuerpos anti-oxMIF con mutación de Fc de nuevo diseño.

Como se ha descrito anteriormente, se pueden realizar esfuerzos para aumentar el potencial de ADCC de los anticuerpos mediante mutaciones en la porción Fc. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediada por receptores Fc es un importante mecanismo de acción por el que los anticuerpos se dirigen a las células enfermas para su eliminación. Cuando la porción efectora Fc de los anticuerpos unidos a la diana también se une a los receptores FcyRIIIA de la superficie celular de las células efectoras, se produce una reticulación múltiple de los dos tipos de células, que conduce a la activación de la vía de ADCC. Para determinar la actividad ADC<c>de los anticuerpos se utilizaron células Jurkat de ingeniería que expresaban de forma estable el receptor F<cy>RIIIA, variante V158 (alta afinidad), y un elemento de respuesta NFAT que impulsaba la expresión de luciferasa de luciérnaga como células efectoras, que se cuantificó a través de la luciferasa producida como resultado de la activación de la ruta de NFAT.

El ensayo indicador de ADCC se realizó esencialmente como recomienda el fabricante (Promega n.° G7010) con algunas modificaciones. Brevemente, la MIF humana recombinante diluida en PBS a 1 pg/ml se inmovilizó en placas ELISA durante una noche a 4 °C (transformando la MIF en oxMIF según Thieleet al.,2015). Después del bloqueo, se añadieron diluciones seriadas de los anticuerpos de nuevo diseño descritos en el presente documento (C0097-C0100) junto con células efectoras Jurkat y se incubaron las placas durante 6 h a 37 °C/5 % de CO2 en una incubadora humidificada. Finalmente, se añadió el reactivo Bio-Gio Luciferase y se midió la luminiscencia (URL) en un lector multiplaca Tecan (tiempo de integración de 0,5 s). C0008 se utilizó como anticuerpo de referencia.

Resultados: Todas las variantes de nuevo diseño que albergaban mutaciones de Fc (C0097-C0100) mostraron una respuesta a la dosis significativa con concentraciones crecientes de los anticuerpos de nuevo diseño, mientras que el anticuerpo C0008 no indujo la activación mediada por F<cy>RIIIA de las células indicadoras Jurkat (figura 5).

La figura 5 muestra las funciones efectoras mejoradas de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño en un bioensayo indicador de ADCC modificado (Promega n.° G7010). A diferencia de C0008, todos los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño inducen la activación mediada por FcyRIIIA de las células indicadoras Jurkat (n=2).

Ejemplo 5:Biodistribución de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño

Se investigó la biodistribución del anticuerpo anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 en comparación con C0008 en ratones Balb/c hembra portadores de tumores subcutáneos del modelo de cáncer de colon singénico CT26. Los ratones Balb/c hembra recibieron inyecciones subcutáneas unilaterales de 3x105 células CT26 en PBS (100 pl/animal). Al alcanzar volúmenes tumorales individuales de 150-300 mm3, los ratones fueron asignados a grupos de tratamiento y recibieron una dosis intravenosa única de 5 mg/kg/d de C0008 marcado con IRDye 800CW o de C0083 marcado con IRDye 800CW. Se utilizaron dos ratones como controles "sin señal" no tratados.

C0008 y C0083 se marcaron con IRDye 800CW utilizando IRDye 800CW Protein labeling kit - high MW de LI-COR Biosciences siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del proceso de marcado y antes de la inyección de anticuerpos marcados en ratones, se determinó la concentración de proteína y la eficacia de marcaje del anticuerpo marcado con IRDye 800CW mediante la tecnología Nanodrop, y se dosificaron los ratones en función de la concentración de proteína tras el marcaje. La obtención de imágenesin vivose realizó en un dispositivo de obtención de imágenes LI-COR Pearl® Trilogy tras la administración de anticuerpos marcados en los siguientes puntos temporales: 1h, 6-8h, 24h, 48h, 72h, 96h, 168h después de la dosificación. Se realizó un análisis de imagen para cuantificar las unidades de fluorescencia relativas (URF) del anticuerpo en el tumor (URF = URF área tumoral - URF fondo)

Resultados: Se determinó una distribución intratumoral significativa de C0008 (figura 6A) y C0083 (figura 6B) marcados con 800CW administrados por vía intravenosa, con un pico a las 24 horas y una retención tumoral de hasta 7 días. Esto demuestra claramente que las propiedades de penetración tumoral de C0083 se mantuvieron o incluso mejoraron en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008. Los dos anticuerpos se probaron en experimentos individuales y la escala de las imágenes se optimizó para el experimento respectivo. Sin embargo, utilizando la misma escala para ambos experimentos, la mejor penetración y retención en el tumor de C0083 (figura 6D) en comparación con C0008 se hace mucho más evidente. Si se evalúa digitalmente la intensidad de los píxeles en la región tumoral, la mejora de la penetración tumoral y la retención de C0083 es de nuevo mucho más evidente (figura 6E). No se detectó ninguna señal en los ratones de control no tratados (figura 6C).

La figura 6 muestra la penetración tumoral del anticuerpo anti-oxMlF C0083 de nuevo diseño mediante imágenesin vivopor infrarrojos de ratones portadores de tumores CT26 subcutáneos. Las fotos se tomaron 1h, 6h, 24h, 48h, 72h, 96h y 168h después de la inyección del anticuerpo marcado con IRDye 800CW. A: Ratones que recibieron C0008 marcado con IRDye 800CW (5 mg/kg); B: Ratones que recibieron C0083 marcado con IRDye 800CW (5 mg/kg/d); C: ratones de control no tratados, D: Ratones que recibieron C0083 marcado con IRDye 800CW (5 mg/kg/d) y las imágenes se ilustran utilizando la misma escala que en A; E: penetración tumoral y retención de C0083 y C0008 cuantificadas mediante análisis de imagen digital.

Ejemplo 6:Mejora de la producción del anticuerpo de nuevo diseño C0083.

El anticuerpo anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 se produjo por expresión transitoria en células ExpiCHO (Thermo Fisher) en comparación con C0008. Brevemente, se transfectaron transitoriamente 50-200 ml de células ExpiCHO en crecimiento exponencial utilizando el kit ExpiFectamine CHO (Thermo Scientific) y se cultivaron durante 8 días siguiendo las instrucciones del fabricante "protocolo estándar" (Thermo Scientific) a 37 °C en una incubadora humidificada. Las células se eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes se diluyeron 1:1 con 40 mM de fosfato sódico, cloruro de sodio 300 mM, pH 7,2. Los sobrenadantes diluidos se filtraron a través de un filtro de 0,2 pm y se aplicaron a una columna Mab Select Prism A (Cytiva) utilizando un sistema de cromatografía NGC QUEST 10 (Bio-Rad) a temperatura ambiente. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2 y los anticuerpos se eluyeron en 10 volúmenes de columna de glicina 100 mM, pH 3,5. Los anticuerpos se neutralizaron inmediatamente a pH 5 y se formularon en 1xPBS pH 7,2 mediante cartuchos desaladores Bio-Scale P-6 y se concentraron a ~1 mg/ml utilizando dispositivos centrífugos Amicon Ultra-15 (Merck Millipore). La concentración de proteínas se determinó utilizando la tecnología NanoDrop y sus respectivos coeficientes de extinción. La cantidad de anticuerpo purificado tras Mab Select Prism A y neutralización (rendimiento final del anticuerpo respectivo) se dividió por el volumen de cultivo celular y el valor resultante se denomina en el presente documento título de anticuerpo (mg/l).

Resultados: 3 producciones individuales de C0083 en comparación con C0008 mostraron claramente que el anticuerpo de nuevo diseño C0083 se producía significativamente mejor (prueba de la t para datos independientes, p=0,03). Se obtuvieron títulos de anticuerpos más elevados (117 mg/l) en comparación con C0008 (93 mg/l) (figura 7).

La figura 7 muestra la producción mejorada del anticuerpo anti-oxMlF C0083 de nuevo diseño.

Ejemplo 7:Producción mejorada de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con mayor actividad ADCC.

Los anticuerpos anti-oxMlF (C0097, C0098 y C0100) albergan mutaciones para reducir la hidrofobia y la propensión a la agregación, pero también se produjeron mutaciones de Fc para mejorar la actividad de ADCC mediante expresión transitoria en células ExpiCHO (Thermo Fisher). Brevemente, se transfectaron transitoriamente 50 ml de células ExpiCHO en crecimiento exponencial utilizando el kit ExpiFectamine CHO (Thermo Scientific) y se cultivaron durante 8 días siguiendo las instrucciones del fabricante ("protocolo estándar", Thermo Scientific) a 37 °C en una incubadora humidificada. Se eliminaron las células por centrifugación y se añadió a los sobrenadantes 1/10 volumen de fosfato sódico 200 mM, cloruro sódico 1500 mM, pH 7,2. Los sobrenadantes diluidos se filtraron a través de un filtro de 0,2 pm y se aplicaron a una columna HiTrap Fibro PrismA (Cytiva) utilizando un sistema de cromatografía NGC QUEST 10 (Bio-Rad) a temperatura ambiente. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,2 y los anticuerpos se eluyeron en 10 volúmenes de columna de glicina 100 mM, pH 3,5. Los anticuerpos se neutralizaron inmediatamente a pH 5 con glicina hasta una concentración final de 250 mM de glicina. La concentración de proteínas se determinó utilizando la tecnología NanoDrop y sus respectivos coeficientes de extinción. La cantidad de anticuerpo purificado tras HiTrap Fibro Prism A y neutralización (rendimiento final del anticuerpo respectivo) se dividió por el volumen de cultivo celular y el valor resultante se denomina en el presente documento título de anticuerpo (mg/l). Por comparación, los anticuerpos anti-oxMlF sin optimización VH/VL en cuanto a hidrofobia/agregación, pero con idénticas mutaciones Fc para mejorar la actividad ADCc (C0064, C0065 y C0067), se produjeron siguiendo el mismo procedimiento.

Resultados: La producción de anticuerpos anti-oxMlF con propensión mejorada a la hidrofobia/agregación (C0097, C0098 y C0100) dio lugar a títulos significativamente más altos en comparación con sus homólogos respectivos, que comprenden los dominios VH y VL de C0008 (C0064, C0065 y C0067) (figura 8).

La figura 8 muestra la producción mejorada de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas y propensión a la agregación e hidrofobia reducidas, en comparación con sus homólogos respectivos con funciones efectoras mejoradas, pero que comprenden los dominios VH y VL de C0008 (comparación de C0097 frente a C0064, C0098 frente a C0065 y C0100 frente a C0067).

Ejemplo 8:Menor propensión a la agregación y menor hidrofobia de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas

Para evaluar la hidrofobia y la agregación, los anticuerpos de nuevo diseño se analizaron por filtración en gel (SEC) y por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF C0008.

Para la SEC, las muestras se diluyeron a 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato 1x (1xPBS) y se aplicaron 100 pl de muestra a una columna de filtración en gel Enrich 650 (Bio-Rad) a un caudal de 1,25 ml/min. Las separaciones y el equilibrio se realizaron en 1xPBS a temperatura ambiente. Los picos de proteínas se controlaron mediante absorbancia a 280 nm y los espectros se analizaron utilizando el paquete de software Chromlab (Bio-Rad). Los resultados se indicaron en volumen de retención (Vr, ml) para el pico principal y la presencia de agregados se clasificó manualmente.

Para el análisis de la HIC, todas las muestras se diluyeron hasta una concentración final de 1 mg/ml utilizando fosfato 50 mM y sulfato amónico 0,75 M, pH 6,8. Las muestras altamente purificadas de anticuerpos (~100 pg) se cargaron independientemente en una columna HiTrap Butyl HP de 1 ml. Se inyectaron muestras de 100 pl y el caudal de la columna se mantuvo a 1 ml/min a temperatura ambiente. La separación de los picos se llevó a cabo en un gradiente de 20 volúmenes de columna (CV) de 0-100 % de B (tampón B: fosfato 50 mM, isopropanol al 20 %; pH 7,0). Los picos de proteínas se controlaron mediante absorbancia a 280 nm y los espectros se analizaron utilizando el paquete de software de emulación Unicorn (GE healthcare). Los resultados se expresaron en Vr (ml) en el pico máximo, para cada pico.

Resultados: El anticuerpo de control C0008 mostró un volumen de retención cercano al volumen vacío de la columna de exclusión por tamaño (~16 ml), lo que corresponde a un peso molecular muy inferior al esperado para una IgG humana (figura 9A). La inusual larga retención se debió principalmente a interacciones hidrófobas con la superficie de la fase estacionaria. Además del elevado volumen de retención, cantidades significativas de dímeros y agregados de IgG estaban presentes para C0008. Los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 mostraron un volumen de retención (Vr) significativamente reducido, lo que demuestra una menor interacción con la columna y, por tanto, una menor hidrofobia de las moléculas (figura 9A, tabla 5). El Vr correspondía al peso molecular de una IgG humana monomérica, cuando se compara con un patrón de peso molecular. Además, los dímeros de anticuerpos y la agregación estuvieron ausentes en las muestras de anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 (figura 9A).

Utilizando HIC, el Vr es directamente proporcional a la hidrofobia de los anticuerpos analizados, es decir, cuanto mayor es el Vr, más hidrófoba es la molécula. El análisis HIC de los nuevos anticuerpos diseñados (C0083, C0090, C0108 y C0109) confirmaron que son significativamente menos hidrófobos (figura 9B, volumen de retención de 15,2-16,2 ml, tabla 6) en comparación con el anticuerpo de control C0008 (figura 9B, volumen de retención de 20,8 ml, tabla 6).

Conclusiones: De los análisis por SEC e HIC se desprende que los nuevos anticuerpos diseñados presentan propiedades bioquímicas mejoradas, en particular la reducción de la hidrofobia, y la propensión a la agregación.

Tabla 5 Cromatografía de exclusión por tamaños

Muestra Memoria intermedia Columna Vr (ml) Agregados

C0008 1xPBS Enrich 650 14,5

C0108 1xPBS Enrich 650 11,9 -

C0109 1xPBS Enrich 650 11,9 -

Tabla 6 Cromatografía de Interacción hidrófoba

Muestra Vr (ml)

C0008 20,8

C0083 15,4

C0090 16,2

C0108 15,2

C0109 16,0

La figura 9 muestra los perfiles cromatográficos que demuestran la reducción de la agregación y la hidrofobia de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño.(A)Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y de los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con funciones efectoras mejoradas en una columna de filtración en gel Enrich 650 utilizando 1xPBS como fase móvil;(B)Comparación de los perfiles de elución de C0008 (anticuerpo de control, área gris) y los anticuerpos de nuevo diseño C0083, C0090, C0108 y C0109 en una columna HiTrap Butyl HP HIC.

Ejemplo 9:Reducción de la unión inespecífica de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090 a las células A2780 MIF'/_.

La línea celular A2780 MIF'/_ se generó mediante edición génica CRISPR/Cas9 del gen MIF humano en la línea celular de carcinoma ovárico A2780. La ausencia de proteína MIF humana endógena en la línea celular A2780 MIF'/_ se confirmó mediante secuenciación de Sanger y mediante transferencia de Western utilizando anticuerpos policlonales anti-MIF humana.

Las células A2780 MIF'/_se separaron con Cell Stripper (Corning, n.° de cat. 25-056-CI), se lavaron con tampón de tinción (PBS BSA al 5 %) y se colocaron en placas de 96 pocillos de fondo en U a 2x105 células por pocillo. Las células se tiñeron con colorante de viabilidad fijable eFluo780 (diluido a 1:2000 en PBS) durante 20 min a 4 °C y se lavaron con tampón de tinción. Las células se resuspendieron en 50 pl de tampón de tinción y se añadieron 50 pl de diluciones seriadas de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083, C0090, C0108, C0109, el anticuerpo antioxMlF de control C0008 o una IgG de isotipo (concentraciones finales 37 nM-9,4 nM). Después de incubar durante 40 min a 4 °C, las células se lavaron con tampón de tinción y se resuspendieron en 100 pl de anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H+L)-AlexaFluor 488, diluido a 1:100). Después de incubar durante 30 min a 4 °C, las células se lavaron con tampón de tinción, se resuspendieron en PBS+BSA al 2 % y se adquirieron en el citómetro de flujo Cytoflex-S. Los datos se analizaron con FlowJo y la media geométrica (intensidad de fluorescencia media para AF488) de las células viables se representó gráficamente frente a la concentración de anticuerpos en GraphPad Prism.

Resultados y conclusiones: De la figura 10 se desprende que los anticuerpos anti-oxMlF C0083, C0090, C0108 y C0109 no se unen a las células A2780 MIF'/_, ya que su media geométrica es muy próxima a la del control negativo de isotipo IgG. Por el contrario, el anticuerpo de referencia anti-oxMlF C0008 mostró una unión significativa a las células A2780 MIF<-/->, aunque no expresan MIF. Por tanto, la reducción de la hidrofobia dio lugar a una fuerte reducción o eliminación de la unión inespecífica de los anticuerpos anti-oxMIF de nuevo diseño C0083, C0090, C0108 y C0109 a A2780 MIF<-/->, mientras que el anticuerpo de control anti-oxMIF C0008 se une inespecíficamente a la superficie celular debido a sus propiedades hidrófobas.

La figura 10 muestra la reducción de la unión inespecífica de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño a las células A2780 MIF<-/->determinada por FACS. Las células A2780 MIF<-/->se tiñeron con los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0090, C0109(A);C0083, C0108(B)o el anticuerpo de control C0008, así como una IgG isotipo como control negativo. La media geométrica (intensidad de fluorescencia media para AF488), de células viables se representó gráficamente frente a la concentración de anticuerpo.

Ejemplo 10:Unión de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas a MIF inmovilizado (estimación de K<d>)

La MIF humana recombinante diluida en PBS a 1 pg/ml se inmovilizó en placas ELISA durante una noche a 4 °C (transformando la MIF en oxMIF según Thieleet al.,2015). Después del bloqueo, se añadieron a las placas diluciones seriadas de anticuerpos anti-oxMlF. Finalmente, los anticuerpos unidos se detectaron con el anticuerpo conjugado de cabra anti-lgG(Fc)-HRP humana y tetrametilbencidina (TMB) como sustrato. La reacción cromogénica se detuvo con H<2>SO<4>3M y se midió la DO a 45o nm. Los datos de diferentes experimentos se normalizaron a la DO máxima del anticuerpo anti-oxMlF C0008 (=100 %) del experimento respectivo y los valores de CE<50>se determinaron mediante un ajuste de 4 parámetros utilizando GraphPad Prism (se muestra la media /- EEM de dos experimentos).

Resultados y conclusiones: La unión de los anticuerpos de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas hacia la MIF inmovilizada (oxMIF) se midió en un amplio rango de concentraciones y las curvas de unión resultantes se ilustran en la figura 11. El anticuerpo anti-oxMIF C0008 se utilizó como referencia para la unión a oxMIF. Las curvas de unión y los valores de CE<50>calculados, que representa la K<d>, mostraron claramente que los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 conservaban su baja afinidad nanomolar por oxMIF, en comparación con C0008 (figura 11, tabla 7).

La figura 11 muestra las curvas de unión de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas a oxMIF inmovilizada (estimación de K<d>); como anticuerpo de referencia se utilizó el anticuerpo anti-oxMlF C0008.

Tabla 7: Estimación de la afinidad de los anticuerpos anti-oxMlF (ELISA)

Ejemplo 11:Unión diferencial de anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas a oxMIF frente a redMIF.

Los anticuerpos anti-oxMlF y un control lgG1 humano irrelevante se inmovilizaron en microplacas durante la noche a 4 °C a una concentración de 15 nM. Después del bloqueo, se incubaron con 50 ng/ml de redMIF o del sustituto de oxMIF NTB-MIF (Schinaglet al.,2018). La oxMIF capturada se detectó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-MIF e IgG-HRP de cabra anti-conejo. Las placas se tiñeron con tetrametilbencidina (TMB) y la reacción cromogénica se detuvo añadiendo H2SO4 al 30 %. La DO se midió a 450 nm. Los datos de dos experimentos se normalizaron a la DO máxima del anticuerpo anti-oxMlF C0008 (=100 %) del experimento respectivo, y se muestra la media /- EEM de dos a tres experimentos.

Resultados y conclusiones: La unión de los anticuerpos de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas hacia oxMIF y redMIF solubles se ilustra en la figura 12. Los resultados mostraron claramente que los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 demostraron una fuerte unión a oxMIF pero ninguna unión detectable a redMIF. Los anticuerpos de nuevo diseño mostraron DO muy comparables a las del anticuerpo de referencia C0008, que se ha descrito para discriminar entre oxMIF y redMIF (Thieleet al.,2015). No se observó ninguna unión específica para el control de lgG1 irrelevante. Por tanto, los anticuerpos de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas e hidrofobia y agregación reducidas conservaron su capacidad para discriminar entre oxMIF y redMIF.

La figura 12 muestra la unión diferencial de los anticuerpos de nuevo diseño a oxMIF frente a redMIF. Se utilizó C0008 como anticuerpo de referencia y una IgG isotipo como control negativo.

Ejemplo 12:Determinación de la afinidad de anticuerpos de nuevo diseño frente a oxMIF humana y de ratón mediante SPR

Los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109, así como el anticuerpo de control anti-oxMIF C0008 se inmovilizaron en chips sensores ópticos Biacore CM5 (GE Healthcare) utilizando condiciones estándar de acoplamiento de amina a una densidad de aproximadamente 2500, 1500 o 100 UR en celdas de flujo FC2, FC3 y FC4, respectivamente. FC1 se utilizó como celda de referencia y solo reaccionó con tampones. La MIF recombinante humana o de ratón se diluyó en tampón HBS-EP (GE Healthcare) hasta concentraciones de 50, 75, 100 o 150 nM en presencia de un 0,2% de Proclin300 (componente activo 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona; Sigma) para transformar la MIF en un sucedáneo de oxMIF (Thiele Met al.,2015) durante 3 h a temperatura ambiente. La MIF tratada con Proclin300 se aplicó a anticuerpos anti-oxMlF inmovilizados a una velocidad de flujo de 30 pl/min durante 3 min utilizando un instrumento Biacore™ 3000 (GE Healthcare). El tiempo de disociación fue de 300 segundos, y el chip se regeneró utilizando HCI 10 mM durante 3 minutos. La cinética de la serie de concentraciones se analizó mediante el ajuste local simultáneo de asociación/disociación de cada curva de unión tras sustraer el fondo de la célula de referencia (FC1) utilizando el modelo iterativo de interacción de Langmuir 1:1 con compensación de transferencia de masa proporcionado por el software BiaEvaluation 4.1 (GE Healthcare). Los datos se representan como media /- DE (desviación estándar) de los valores de K<d>calculados de las celdas de flujo 2-4.

Resultados y conclusiones: La unión de los anticuerpos de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas hacia la oxMIF soluble humana y de ratón determinada por SPR se muestra en la tabla 8. Los resultados mostraron claramente que los anticuerpos de nuevo diseño tienen afinidades nanomolares de aproximadamente 3 nM, que está en el mismo rango que el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008. La afinidad por oxMIF de ratón fue aproximadamente 5-8 veces menor en comparación con oxMIF humana para todos los anticuerpos anti-oxMlF. Por tanto, los anticuerpos de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas e hidrofobia y agregación reducidas conservaron su afinidad hacia oxMIF humana y de ratón.

Tabla 8: Afinidad de los anticuerpos anti-oxMlF (SPR)

Ejemplo 13:Farmacocinética de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090 en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008 en ratones BALB/c desnudos

Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090 y el anticuerpo anti-oxMIF de control C0008, se inyectaron por vía intravenosa en ratones hembra BALB/c desnudos a una dosis de 10 mg/kg. Se recogieron 20 pl de sangre 4, 10, 24, 48 y 96h después de la inyección mediante punción en la vena caudal utilizando capilares recubiertos de K<2>-EDTA y se transfirieron a viales recubiertos de K<2>-EDTA que contenían 60 pl de PBS. Después de la centrifugación, los sobrenadantes (= plasma diluido 1:4) se analizaron mediante un ELISA cuantitativo anti-oxMlF.

Brevemente, la MIF humana recombinante (OncoOne) diluida en PBS a 1 pg/ml se inmovilizó en placas de ELISA (MaxiSorp, Nunc) durante una noche a 4 °C. Tras el bloqueo con tampón de dilución (DB, gelatina de pescado al 2 %/TBST), se añadieron a las placas muestras de plasma diluidas (dilución final 1:100-1:100.000). Los anticuerpos unidos se detectaron utilizando un conjugado lgG(Fc)-HRP de cabra antihumano (1:40.000 en TBST), Thermo Scientific n.° 32420). Se añadió tetrametilbencidina (TMB, Thermo Scientific n.° 34029) como sustrato y se detuvo la reacción cromogénica con 50 pl de H<2>SO<4>al 30 % y se midió la DO a 450 nm. Se utilizaron diluciones seriadas de C0008, C0083 y C0090 para generar curvas patrón utilizando el análisis de regresión de hipérbola en GraphPad Prism y calcular la concentración plasmática de los anticuerpos. La concentración media de los anticuerpos por punto temporal se representó gráficamente frente al tiempo de recogida y las semividas se calcularon mediante un modelo de decaimiento de una fase en GraphPad Prism.

Resultados: La figura 13 muestra la farmacocinética de los anticuerpos anti-oxMlF siguiendo una función de decaimiento monoexponencial. Las semividas calculadas fueron de 11 h para el anticuerpo anti-oxMIF de control C0008 y de 15 h para los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090, respectivamente. Además, se calculó el área bajo la curva (ABC) por debajo de la función de decaimiento monoexponencial para estimar la exposición total al anticuerpo y la biodisponibilidad. Se calcularon las ABC de 1600, 3784 y 3266 para C0008, C0083 y C0090, respectivamente.

Se muestra la farmacocinética de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090 en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008 en ratones BALB/c desnudos. La concentración plasmática de los anticuerpos se determinó mediante un ELISA cuantitativo anti-oxMIF a las 4, 10, 24, 48 y 96 h tras una inyección intravenosa única de 10 mg/kg de anticuerpos anti-oxMIF y las semividas se calcularon mediante un modelo de decaimiento de una fase en GraphPad Prism.

Conclusiones: Las sustituciones en las regiones variables de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0083 y C0090 dieron lugar a una semivida 1,4 veces más larga y una biodisponibilidad (ABC) >2 veces mayor en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008.

Ejemplo 14:Aumento de las funciones efectoras de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 determinado mediante ensayos indicadores

Utilizando células Jurkat modificadas que expresan de forma estable el receptor humano FcyRIIIa, V158 (alotipo de alta afinidad) o F158 (alotipo de baja afinidad) para dilucidar la ADCC o el receptor humano FcYRIla alotipo H131 para dilucidar la ADCP, y un elemento de respuesta NFAT que impulsa la expresión de luciferasa de luciérnaga como células efectoras, se cuantificó la actividad biológica del anticuerpo a través de la luciferasa producida como resultado de la activación de la vía de NFAT.

Para generar células diana altamente receptivas, se transfectaron células HCT116 y A2780 con un plásmido huMIF-pDisplay (Invitrogen), se seleccionaron con geneticina y se clasificaron por FACS para generar líneas celulares que expresan de forma estable MIF humana monomérica anclada a membrana (HCTll6-pMIF o A2780-pMIF), es decir, MIF se muestra como proteína monomérica en la que un epítopo oxMIF es accesible a los anticuerpos anti-oxMlF (Schinaglet al,Biochemistry 2018). Estas líneas celulares muestran una mayor presentación de oxMIF en la superficie celular y son, por tanto, una herramienta sensible para el análisisin vitro.

Los ensayos indicadores de ADCC o ADCP se realizaron esencialmente según las recomendaciones del fabricante (Promega n.° G7010 y n.° G9991). En resumen, se sembraron 1x104 células/pocillo de células HCT116-pMIF (figura 14 A y C) o A2780-pMIF (figura 14 B) en 100 pl de medio de cultivo (medio RPMI 1640 suplementado con Pen/Strept/L-Glutamin y 5 % de FBS bajo en IgG) en placas de 96 pocillos y se incubaron durante una noche a 37 °C/5 % de CO2 en una incubadora humidificada para que se adhirieran. Posteriormente, se incubaron diluciones seriadas de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño con funciones efectoras mejoradas C0108 y C0109 o del anticuerpo de control C0008 con Fc ts (concentración final 0,01-100 nM) y células efectoras Jurkat (figura 14 A-B, células efectoras FcYRIIIa; figura 14 C, células efectoras FcYRIla) a una proporción de células efectoras a células diana de aproximadamente 6:1 durante 6 h a 37 °CI5 % de CO2 en una incubadora humidificada. Finalmente, las placas de ensayo se equilibraron a temperatura ambiente y se añadió el reactivo Bio-Gio Luciferase. La luminiscencia (URL) se midió tras 10-20 min de incubación utilizando un lector multiplaca Tecan (tiempo de integración de 0,5 s).

Resultados: De la figura 14 A-C se desprende que los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 que albergan mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc mostraron una fuerte activación de las células informadoras de ADCC (figura 14 A-B) o ADCP (figura 14 C), mientras que el anticuerpo de control C0008 no indujo ninguna activación mediada por FcyRIIIa (ADCC, Figura 14 A-B) o FcyRI la (ADCP, figura 14 C), o solo indujo una activación menor, de células indicadoras Jurkat cuando se cocultivaron con células HCT116-pMIF (figura 14 A, C) o A2780-pMIF (figura 14 B).

Conclusiones: Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109, con mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc, mostraron una actividad de ADCC y ADCP altamente incrementada en bioensayos indicadores, en comparación con el anticuerpo de control C0008 que porta Fc ts.

La figura 14 muestra las funciones efectoras mejoradas de los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 determinadas mediante ensayos indicadores.(A-B)Bioensayo indicador de ADCC con los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con funciones efectoras mejoradas utilizando células efectoras Jurkat modificadas que expresan de forma estable FcyRIIIa (alotipo V de alta respuesta, alotipo F de baja respuesta) y células diana HCT116-pMIF(A)o A2780-pMIF(B)en comparación con el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 con Fc ts;(C)Bioensayo indicador de ADCP con los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con funciones efectoras mejoradas utilizando células efectoras Jurkat diseñadas que expresan de forma estable FcyRIla y células diana HCT116-pMIF en comparación con el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 con Fc ts. Se muestran la media y el EEM (n = 2-4).

Ejemplo 15:Función ADCC mejorada de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 determinada mediante un bioensayo de lisis celular de PBMC.

Este ensayo se realizó para determinar la lisis celular resultante de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) inducida por los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño. La citotoxicidad se midió mediante el ensayo HiBiT Detection (Promega), que cuantifica la liberación de una proteína marcada con HiBiT de las células diana utilizando un reactivo de detección no lítico que contiene LgBit (LargeBiT) y furimazina (sustrato). HiBiT y LgBiT se ensamblan espontáneamente en una enzima NanoBiT® funcional y emiten una señal de luminiscencia cuantificable en presencia del sustrato.

Para generar células diana indicadoras altamente sensibles, se transfectaron células HCT116 con el plásmido HaloTag-HiBiT (Promega n.° CS1956B17), se seleccionaron con blasticidina y se clasificaron por FACS como grupos de células. A continuación, se transfectaron grupos estables de células que expresaban HiBiT con un plásmido huMIF-pDisplay (Invitrogen), se seleccionaron con geneticina y clasificadas por FACS para generar grupos celulares que expresen de forma estable HiBiT intracelular y oxMIF humana monomérica anclada a membrana (HCT116-HiBiT-pMIF), es decir, la MIF se muestra como proteína monomérica en la que un epítopo oxMIF es accesible a los anticuerpos anti-oxMlF (Schinaglet al.,Biochemistry 2018). Estas líneas celulares muestran una mayor presentación de oxMIF en la superficie celular y son, por tanto, una herramienta sensible para el análisisin vitro.

En resumen, se sembraron1x10<4>células/pocillo de células diana HCT116-HiBiT-pMIF en 50 pl de medio de cultivo (medio RPMI 1640 suplementado con Pen/Strept/L-Glutamin y 5 % de FBS ultrabajo en IgG) en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C/5 % de CO<2>en una incubadora humidificada para que se adhirieran. Posteriormente, se añadieron a las placas diluciones seriadas de 50 pl de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 o del anticuerpo anti-oxMlF de control C0008 con Fc ts en medio de cultivo (concentración final 0,01 100 nM) y 50 pl de células efectoras PBMC humanas de dos donantes sanos individuales (4x10<5>células/pocillo; proporción de células efectoras respecto a células diana; 40:1). Las PBMC de los dos donantes diferentes se caracterizaron mediante análisis FAC<s>para evaluar su contenido de células NK, que son el tipo celular pertinente para este ensayo. Después de añadir anticuerpos y PBMC, la placa se incubó durante la noche a 37 °C y 5 % de CO<2>en una incubadora humidificada. Al día siguiente se añadieron 10 pl de reactivo de detección extracelular Nano-Gio HiBiT (Promega n.° N2421) y se midieron las señales de luminiscencia (URL, tiempo de integración 0,1 s) en un lector de placas Tecan. El ensayo se realizó incluyendo duplicados o triplicados de las muestras analizadas y de los donantes.

Resultados: La figura 15 muestra que los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc mostraron una mayor actividad de ADCC con PBMC de ambos donantes (figura 15A, 22 % de células NK); (figura 15B, 7 % de células<n>K) en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008.

Conclusiones: Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109, que contienen mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc, mostraron una actividad ADCC altamente incrementada en un ensayo de destrucción celular mediado por PBMC, en comparación con el anticuerpo anti-oxMlF de control portador de Fc ts.

La figura 15 muestra la actividad de ADCC mejorada de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 que albergan mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc determinada por un bioensayo de toxicidad celular mediado por PBMC. Bioensayo de ADCC con anticuerpos anti-oxMlF C0108 y C0109 de nuevo diseño y PBMCs como células efectoras (A: 22 % de células NK,B: 7 % de células NK) y HCT116-pMIF como células diana en comparación con el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 con Fc ts. Se muestra la media y el EEM de dos o tres réplicas utilizando PBMC de dos donantes sanos.

Ejemplo 16:Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño muestran una liberación de citocinas inespecífica fuertemente reducida a partir de PBMC s humanas.

El síndrome de liberación de citocinas (SLC) es una forma de síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS) que puede desencadenarse por diversos factores, como las infecciones. El SLC también se conoce como un efecto adverso de algunos medicamentos de anticuerpos monoclonales. El SLC se produce cuando un gran número de glóbulos blancos, incluidos los linfocitos B, linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, las células dendríticas y los monocitos se activan y liberan citocinas inflamatorias, como IL-6, IFN-gamma, IL-8, MCP-1, entre otras, que activan más glóbulos blancos en un bucle de retroalimentación positiva de inflamación patógena. Este proceso, cuando está desregulado, puede ser potencialmente mortal debido a la hiperinflamación sistémica, el choque hipotensivo y el fallo multiorgánico. Por tanto, se evaluó el potencial de los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño para liberar citocinas inflamatorias de las PMBC en un ensayoin vitro.

En resumen, los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 (ambos a 70 nM) y el anticuerpo de control anti-oxMlF C0008 (70 nM) se incubaron con PBMC recién descongeladas (4-5x10<5>células por pocillo) de tres donantes sanos en 150 pl de medio RPMI1640 suplementado con un 5 % de suero de IgG ultrabajo en placas de 96 pocillos. Tras una incubación de una noche a 37 °C/5 % de CO<2>en una incubadora humidificada, se centrifugaron las placas a 300 x g durante 5 minutos para sedimentar las células y se transfirieron los sobrenadantes a las placas de fondo en V de 96 pocillos. Los sobrenadantes aclarados se analizaron mediante el ensayo citométrico de microesferas BioLegend LegendPlex para IL-6 humana y MCP-1 humana según el protocolo del fabricante. La medición se realizó en un citómetro CytoFlex-S con cargador de placas de 96 pocillos (Beckman Coulter). El canal de clasificación de las microesferas fue APC (excitación del láser 638 nm, filtro de paso de banda 660/10 nm), mientras que el canal indicador fue PE (excitación del láser amarillo 561 nm, filtro de paso de banda 585/42 nm). Los datos se analizaron utilizando el software de análisis LegendPlex (BioLegend) y los gráficos se elaboraron en GraphPad Prism. Se muestran las medias /- EEM de 3 donantes de PM<b>C diferentes.

Resultados y conclusiones: De la figura 16 se desprende que los anticuerpos de nuevo diseño C0108 y C0109 con mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc sorprendentemente no mostraron liberación de IL-6 y MCP-1 a partir de PBMC a concentraciones de hasta 70 nM o solo mostraron una liberación insignificante en comparación con C0008. Cabía esperar que C0108 y C0109 indujeran mayores niveles de liberación de citocinas debido a su alta afinidad por los receptores Fcy que el anticuerpo anti-oxMlF de referencia C0008 que contiene una porción Fc ts. Sin embargo, C0008 indujo una liberación significativa de IL-6 y MCP-1 a la misma concentración (70 nM) debido obviamente a la mayor propensión a la agregación y a la unión inespecífica debida a su hidrofobia. Se sabe que la agregación de anticuerpos terapéuticos, aunque sea menor, potencia fuertemente la liberación de citocinas de las células inmunitarias.

La figura 16 muestra que los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño muestran una liberación de citocinas inespecífica fuertemente reducida a partir de PBMC humanas. Los anticuerpos anti-oxMlF de nuevo diseño C0108 y C0109 con mutaciones potenciadoras de ADCC/ADCP en la porción Fc (70 nM) y el anticuerpo anti-oxMlF de control C0008 (70 nM) se incubaron con PBMC humanas durante una noche, y los sobrenadantes se analizaron en ensayos citométricos de microesferas LegendPlex (BioLegend) para IL-6 humana (A) y MCP-1 humana (B). Se muestran las medias /- EEM de las concentraciones de citocinas de 3 donantes diferentes de PMBC.

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Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-oxMIF recombinante o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene un potencial de agregación reducido y una hidrofobia reducida, que comprende

los siguientes dominios variables:

(a1) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S y W93F, o

(a2) un dominio variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9 con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre M30L, F49Y, A51G, P80S y W93F, y con 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales, con la condición de que se conserve la tirosina en la posición 36, y una de

(b1) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6; o

(b2) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y w 97Y, o

(b3) un dominio variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6 con 1 o 2 sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre L5Q y w 97Y, y con 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos adicionales,

en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat y en donde el potencial de agregación y la hidrofobia se reducen en comparación con un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 9 que carece de las sustituciones de aminoácidos.

2. El anticuerpo anti-oxMIF recombinante de la reivindicación 1, que comprenden las sustituciones de aminoácidos W93F y/o W97Y.

3. El anticuerpo anti-oxMIF recombinante de la reivindicación 1 o 2, que tiene funciones efectoras mejoradas, que comprende una región constante de cadena pesada que comprende

(a) la SEQ ID NO: 2, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y que comprenda los aminoácidos 239D y 332E; o

(b) la SEQ ID NO: 3, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3 y que comprenda los aminoácidos 239D, 268F, 324T y 332E; o

(c) la SEQ ID NO: 4, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4 y que comprenda los aminoácidos 239D y 332E; o

(d) la SEQ ID NO: 5, o una región constante de cadena pesada que tenga al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y que comprenda los aminoácidos 235V, 243L, 292P, 300L y 396L,

en donde las posiciones de aminoácidos se numeran de acuerdo con el índice de numeración de EU.

4. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la SEQ ID NO: 8 y una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 11, 12, y 13.

5. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las SEQ ID NO: 6, 11 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

6. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las SEQ ID NO: 7, 10 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

7. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las SEQ ID NO: 7, 11 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

8. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las SEQ ID NO: 8, 11 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

9. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las SEQ ID NO: 8, 13 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

10. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende las SEQ ID NO: 8, 10 y una cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5.

11. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las SEQ ID NO: 8, 11,4 y 38.

12. El anticuerpo anti-oxMIF de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende las SEQ ID NO: 8, 13, 4, y 38.

13. El anticuerpo anti-oxMIF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, seleccionado entre el grupo que consiste en anticuerpos biespecíficos, scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' y F(ab')2, Fab'-SH, fusión Fab-scFv, fusión Fab-(scFv)2, Fab-scFv-Fc, Fab-(scFv)2-Fc, proteínas de fusión de dos anticuerpos monocatenarios de especies diferentes (BiTE), y minicuerpo.

14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para su uso en la preparación de un medicamento.

15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, opcionalmente junto con un portador farmacéutico o adyuvante.

16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la composición comprende de 10 a 250 mg/ml del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende específicamente >50 mg/ml.

17. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde dicha composición farmacéutica se formula para administración subcutánea.

18. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en donde la composición es para su administración como única sustancia o con una composición farmacéutica adicional que comprende una o más sustancias activas, seleccionadas preferentemente entre el grupo que consiste en sustancias antivíricas, antiinflamatorias, antineoplásicas, antiangiogénicas y antibióticas.

19. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso en el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad inflamatoria, un trastorno hiperproliferativo, una enfermedad infecciosa o cáncer, específicamente en el tratamiento de asma, vasculitis, artritis, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, síndrome de choque tóxico, síndrome de dificultad respiratoria adquirido, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, nefritis y psoriasis, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas y cáncer de pulmón.

20. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

21. Un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 20.

22. Una célula hospedadora que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 20 o un vector de expresión de la reivindicación 21.

23. Un método para producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende cultivar una célula hospedadora de la reivindicación 22 y recuperar dicho anticuerpo del cultivo celular.