ES2977457T3

ES2977457T3 - Polipéptidos de unión a la cadena ligera kappa modificados

Info

Publication number: ES2977457T3
Application number: ES15822919T
Authority: ES
Inventors: Gustav Rodrigo; Mats Ander; Tomas Bjorkman
Original assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Current assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2024-08-23
Anticipated expiration: 2035-12-11
Also published as: DK3233892T3; JP2020202855A; JP2024100775A; JP2022164689A; EP3233891B1; WO2016096643A1; JP6843438B2; US20170320919A1; CN107108701B; JP2018505657A; US10208092B2; CN116731129A; CN107108701A; US20170327545A1; EP3233891A1; CN107108700B; US11136357B2; EP3233892B1; US10208091B2; DK3233891T3

Abstract

Un polipéptido de unión a cadena ligera kappa que comprende o consiste esencialmente en uno o más dominios de unión de la Proteína L de Peptostreptococcus, seleccionándose cada uno de dichos dominios del grupo que consiste en el dominio 2, el dominio 3 y el dominio 4. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de unión a la cadena ligera kappa modificados

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al campo de la cromatografía de afinidad, y más específicamente a polipéptidos que comprenden dominios de unión a la cadena ligera kappa de la Proteína L, que son útiles en la cromatografía de afinidad de muchos tipos de inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulinas. La invención también se refiere a matrices de separación que contienen los polipéptidos y a métodos de separación que utilizan dichas matrices de separación.

Antecedentes de la invención

Las inmunoglobulinas y los fragmentos de inmunoglobulinas representan los productos biofarmacéuticos más frecuentes en fabricación o desarrollo en todo el mundo. La alta demanda comercial y, por tanto, el valor de este mercado terapéutico particular ha llevado a que se ponga énfasis en que las compañías farmacéuticas maximicen la productividad de sus respectivos procesos de fabricación mientras controlan los costes asociados.

La cromatografía de afinidad, normalmente en matrices que comprenden proteína A estafilocócica o variantes de la misma, se utiliza normalmente como una de las etapas clave en la purificación de moléculas de inmunoglobulina intactas. La unión altamente selectiva de la proteína A a la cadena Fc de las inmunoglobulinas proporciona una etapa genérica con un aclaramiento muy alto de impurezas y contaminantes.

Para fragmentos de anticuerpos, como Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), acopladores de células T biespecíficos (BiTE), anticuerpos de dominio, etc., que carecen de la cadena Fc pero tienen una cadena ligera kappa de subclase 1,3 o 4, matrices que comprenden proteína L derivada dePeptostreptococcus magnus(B Ákerstróm, L Bjórck; J. Biol. Chem. 264, 19740-19746, 1989; W Kastern et al.: J. Biol. Chem. 267, 12820-12825, 1992; B H K Nilson et al.: J. Biol. Chem. 267, 2234-2239, 1992 y patente de EE. UU. 6.822.075) son muy prometedores como plataforma de purificación que proporciona la alta selectividad necesaria. La proteína L descrita en patente de EE. UU. 6.822.075 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:1 más una secuencia AVEN adicional en el extremo N.

SEQ ID NO:1 (Proteína L)

KEETPETPETD SEEEVTIKAN LIFANGSTQT AEFKGTFEKA TSEAYAYADT

LKKDNGEYTV DVADKGYTLNIKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT

AEFKGTFEEA TAEAYRYADA LKKDNGEYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE

PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV

DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFAEA

TAEAYRYADL LAKENGKYTA DLEDGGYTIN IRFAGKKVDEKPEE

Las matrices de proteína L están disponibles comercialmente como Capto™ L de GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia (archivo de datos Capto L 29-0100-08 AC, 2014) y pueden utilizarse para la separación de proteínas que contienen cadenas ligeras kappa, tales como anticuerpos intactos, fragmentos Fab, fragmentos scFv y anticuerpos de dominio. etc. Aproximadamente el 75 % de los anticuerpos producidos por seres humanos sanos tienen una cadena ligera kappa y muchos anticuerpos monoclonales terapéuticos y fragmentos de anticuerpos contienen cadenas ligeras kappa.

Cualquier aplicación de cromatografía de bioprocesos requiere una atención integral para la eliminación definitiva de contaminantes. Dichos contaminantes pueden ser, por ejemplo, moléculas no eluidas adsorbidas en la fase estacionaria o matriz en un procedimiento cromatográfico, tales como biomoléculas o microorganismos no deseados, incluidos, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, bacterias y virus. La eliminación de dichos contaminantes de la matriz normalmente se realiza después de una primera elución del producto deseado para regenerar la matriz antes de su uso posterior. Dicha eliminación suele implicar un procedimiento conocido como limpieza in situ (CIP), en donde se utilizan agentes capaces de eluir contaminantes de la fase estacionaria. Una de esas clases de agentes que se utilizan a menudo con medios de cromatografía son las disoluciones alcalinas que se pasan sobre la matriz. En la actualidad, el agente limpiador y desinfectante más ampliamente utilizado es el NaOH, y es deseable utilizarlo en concentraciones que oscilan de 0,05 hasta por ejemplo 1 M, dependiendo del grado y naturaleza de la contaminación. Sin embargo, la proteína L es una proteína bastante sensible a los álcalis en comparación con, p. ej. la proteína A y solo tolera hasta aproximadamente NaOH 15 mM durante una gran cantidad de ciclos. Esto significa que se tienen que utilizar disoluciones de limpieza adicionales, menos deseables, p. ej., urea o sales de guanidinio para garantizar una limpieza suficiente.

Anteriormente, una extensa investigación se ha centrado en el desarrollo de ligandos de proteína A diseñados que exhiban una capacidad mejorada para resistir valores de pH alcalinos. Por ejemplo, la patente internacional WO2003/080655A1 describe que los dominios de la proteína A con mutaciones de asparagina particulares son considerablemente más estables a los álcalis que la proteína nativa. El documento EP 1114161 A1 describe un polipéptido de unión a cadena ligera kappa que comprende uno o más dominios de unión de la Proteína L dePeptostreptococcus.El documento WO 2005/033130 A2 describe además un dominio de unión a Ig sintético aislado de la Proteína L que tiene una afinidad de unión mejorada por un dominio VK de anticuerpo, que comprende un multímero del dominio 3 de unión de la Proteína L.

Por tanto, todavía existe en este campo la necesidad de obtener una matriz de separación que contenga ligandos derivados de la proteína L que tenga una estabilidad mejorada frente a los procedimientos de limpieza alcalinos.Compendio de la invención

Un aspecto de la invención es proporcionar un polipéptido con estabilidad alcalina mejorada. Esto se consigue con un polipéptido como se define en la reivindicación 1.

Una ventaja es que la estabilidad alcalina mejora con respecto a la proteína L y los polipéptidos parentales. Una ventaja adicional es que la unión altamente selectiva hacia proteínas que contienen cadenas ligeras kappa demostrada para la proteína L se conserva en los polipéptidos de la invención.

Un segundo aspecto de la invención es proporcionar un ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido o multímero con estabilidad alcalina mejorada. Esto se consigue con un ácido nucleico o vector como se define en las reivindicaciones.

Un tercer aspecto de la invención es proporcionar un sistema de expresión capaz de expresar un polipéptido o multímero con estabilidad alcalina mejorada. Esto se consigue con un sistema de expresión como se define en las reivindicaciones.

Un cuarto aspecto de la invención es proporcionar una matriz de separación capaz de unirse selectivamente a proteínas que contienen cadenas ligeras kappa y mostrar una estabilidad alcalina mejorada. Esto se consigue con una matriz de separación como se define en las reivindicaciones.

Un quinto aspecto de la invención es proporcionar un método eficaz y económico para aislar una proteína que contiene una cadena ligera kappa. Esto se consigue con un método como se define en las reivindicaciones.

Otras realizaciones adecuadas de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes.

Definiciones

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se utilizan indistintamente en la presente memoria y se entiende que incluyen también fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y conjugados que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

Los términos un "polipéptido de unión a cadena ligera kappa" y "proteína de unión a cadena ligera kappa" en la presente memoria significan un polipéptido o proteína respectivamente, capaz de unirse a una cadena ligera kappa de subclase 1,3 o 4 de un anticuerpo (también llamado V<k i>, V<k iii>y V<k iv>, como en B H K Nilson et al: J. Biol. Chem. 267, 2234-2239, 1992), e incluir, p. ej.. proteína L, y cualquier variante, fragmento o proteína de fusión de la misma que haya mantenido dicha propiedad de unión.

El término "proteína que contiene cadena ligera kappa" se utiliza como sinónimo de "proteína que contiene cadena ligera kappa de inmunoglobulina" y en la presente memoria significa una proteína que comprende una cadena ligera kappa de subclase 1,3 o 4 (también denominada V<k i>, V<k iii>y V<kiv>, como en B H K Nilson et al: J. Biol. Chem. 267, 2234 2239, 1992) derivado de un anticuerpo e incluye cualquier anticuerpo intacto, fragmentos de anticuerpo, proteínas de fusión, conjugados o proteínas recombinantes que contengan una cadena ligera kappa de subclase 1, 3 o 4.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra una alineación de los cinco dominios de unión a la cadena ligera kappa de la proteína L como se describe en el documento US 6.822.075 y W Kastern et al.: J Biol. Chem. 267, 12820-12825, 1992.

La Fig. 2 muestra la estabilidad alcalina de diferentes dominios de unión a la cadena ligera kappa de la proteína L. La Fig. 3 muestra la estabilidad alcalina de los dominios de unión a la cadena ligera kappa mutados de la proteína L. La Fig. 4 muestra la estabilidad alcalina de los ligandos de la proteína L que comprenden cuatro dominios.

La Fig. 5 muestra la estabilidad alcalina de los dominios de unión a la cadena ligera kappa diméricos, tetraméricos y hexaméricos mutados de la proteína L en comparación con la proteína L.

Descripción detallada de las realizaciones

En un aspecto, la presente invención describe un polipéptido de unión a la cadena ligera kappa que comprende o consiste en un multímero de un dominio de unión de la proteína L dePeptostreptococcus magnus,en donde cada uno de estos dominios se selecciona del Dominio 3. El Dominio 3 puede tener una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 4, o puede tener al menos un 95 % de homología de secuencia con la SEQ ID NO: 4.

En la presente memoria se describen también, aunque no están incluidos en las reivindicaciones, el Dominio 2 y el Dominio 4. El dominio 2 puede tener una secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:l2, o puede tener al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, de homología de secuencia con SEQ ID NO:3 o 12. SEQ ID NO:12 es una variante de SEQ ID NO:3, con una alanina en la posición 31. El dominio 4 puede tener una secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO:5, o puede tener al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, de homología de secuencia con la SEQ ID NO:5.

El Dominio 1 de la proteína L dePeptostreptococcus,no incluido en las reivindicaciones, se describe adicionalmente en esta memoria. El dominio 1 puede tener una secuencia de aminoácidos como se define por SEQ ID NO:2, o puede tener al menos un 90 %, tal como al menos un 95 % de homología de secuencia con SEQ ID NO:2.

En ciertas realizaciones del polipéptido, al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 45 en la SEQ ID NO: 4 (p. ej., el aminoácido en la posición 45 en SEQ ID NO: 4) en uno o más, tal como en todos, los dominios de unión se ha mutado a un aminoácido que no es asparagina, prolina ni cisteína. El aminoácido en la posición 45 puede por ejemplo haberse mutado a alanina.

En algunas realizaciones del polipéptido, al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 10 en SEQ ID NO: 4 (p. ej., el aminoácido en la posición 10 en SEQ ID NO: 4) en uno o más, tal como en todos, los dominios de unión se ha mutado a un aminoácido que no es asparagina, prolina ni cisteína. El aminoácido en la posición 10 puede por ejemplo haberse mutado a glutamina.

En ciertas realizaciones del polipéptido, al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 60 en SEQ ID NO: 4 (p. ej., el aminoácido en la posición 60 en SEQ ID NO: 4) en uno o más, tal como en todos, los dominios de unión se ha mutado a un aminoácido que no es asparagina, prolina ni cisteína. El aminoácido en la posición 60 puede por ejemplo haberse mutado a glutamina.

Específicamente, uno o más, tal como todos, los dominios de unión pueden tener mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en N10Q; N45A; N60Q; N10Q,N45A; N45A,N60Q, N10Q,N60Q y N10Q,N45A,N60Q o alternativamente seleccionadas del grupo que consiste en N45A; N10Q,N45A; N45A,N60Q y N10Q,N45A,N60Q

En la presente descripción también se describe, un polipéptido, no incluido en las reivindicaciones, en donde al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 19 en SEQ ID NO:2-5 (p. ej., el aminoácido en la posición 19 en SEQ ID NO:2-5 o 12) en uno o más, tal como todos, de los dominios de unión se ha mutado a un aminoácido que no es glutamina, asparagina, prolina o cisteína. El aminoácido en la posición 19 puede, p.ej. mutarse a un ácido glutámico o una alanina. Específicamente, uno o más, tal como todos, los dominios de unión pueden tener mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en Q19E y Q19A.

En ciertas realizaciones del polipéptido, uno o más, tal como todos, de dichos dominios de unión tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias definidas por SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11. El polipéptido puede comprender además en el extremo N una pluralidad de residuos de aminoácidos que se originan en el proceso de clonación o que constituyen un residuo de una secuencia de señalización escindida. El número de residuos de aminoácidos adicionales puede, p. ej. ser 15 o menos, tal como 10 o menos o 5 o menos. Como un ejemplo específico, el polipéptido puede comprender una secuencia AQV en el extremo N.

SEQ ID NO:7 (Dominio 3, mutación N45A)

PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLNIKF AGKEKTPEE

SEQ ID NO:8 (Dominio 3, mutación N10Q,N45A)

PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLN IKF AGKEKTPEE

SEQ ID NO:9 (Dominio 3, mutación N45A,N60Q)

PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLQ IKF AGKEKTPEE

SEQ ID NO:10 (Dominio 3, mutación N10Q,N60Q)

PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV

DVADKGYTLQ IKF AGKEKTPEE

SEQ ID NO:11 (Dominio 3, mutación N10Q,N45A,N60Q)

PKEEYTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE

SEQ ID NO:12 (variante del Dominio 2)

PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA AAEAYRYADA LKKDNGEYTV

DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE

SEQ ID NO:13 (Dominio 3, mutación Q19A)

PKEEVTIKAN LIYADGKTAT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV

DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE

SEQ ID NO:14 (Dominio 3, mutación Q19E)

PKEEVTIKAN LIYADGKTET AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV

DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE

El polipéptido es un multímero que comprende, o consiste en, una pluralidad de dominios mutados o no mutados como se define en cualquier realización descrita anteriormente. El multímero puede, p. ej., ser un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero o un hexámero. Puede ser un homomultímero, donde todas las unidades del multímero son idénticas o puede ser un heteromultímero, donde al menos una unidad difiere de las demás. Ventajosamente, todas las unidades en el multímero son estables en álcali, por ejemplo, comprendiendo las mutaciones descritas anteriormente. Los dominios pueden unirse entre sí directamente mediante enlaces peptídicos entre los extremos C y N de los dominios. Alternativamente, dos o más unidades en el multímero pueden unirse mediante elementos que comprenden especies oligoméricas o poliméricas, tales como elementos que comprenden hasta 15 o 30 aminoácidos, tales como 1-5, 1-10 o 5-10 aminoácidos. Es preferible que la naturaleza de dicha unión no desestabilice la conformación espacial de los dominios. Esto puede conseguirse, p. ej., evitando la presencia de cisteína en las uniones. Además, dicha unión también debería ser preferiblemente suficientemente estable en ambientes alcalinos para no perjudicar las propiedades de los dominios. Para ello, es ventajoso que las uniones no contengan asparagina. También puede resultar ventajoso que las uniones no contengan glutamina. El multímero puede comprender además en el extremo N una pluralidad de residuos de aminoácidos que se originan en el proceso de clonación o que constituyen un residuo de una secuencia de señalización escindida. El número de residuos de aminoácidos adicionales puede ser, p.ej. 15 o menos, tal como 10 o menos o 5 o menos. Como ejemplo específico, el multímero puede comprender una secuencia AQV en el extremo N.

En ciertas realizaciones, el multímero puede comprender, o consistir, en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18, tal como un secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y S<e>Q ID NO:18.

SEQ ID NO:15 (Dominio 3, tetrámero)

PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV

DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA

TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN

LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKENGKYTV DVADKGYTLN

IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAN LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL

LAKENGKYTV DVADKGYTLN IKFAGKEKTPEE

SEQ ID NO:16 Dominio 3 (N10Q,N45A,N60Q)2

PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA

TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE

SEQ<id>NO:17 Dominio 3 (N10Q,N45A,N60Q)4

PKEEVTIKAQ LTYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLQ IKF AGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA

TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKF AGKEKTPEE PKEEVTIKAQ

LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ

IKF AGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL

LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE

SEQ ID NO:18 Dominio 3 (N10Q,N45A,N60Q)6

PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA

TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ

LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ

IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL

LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT

AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE

PKEEVTIKAQ LIYADGKTQT AEFKGTFEEA TAEAYRYADL LAKEAGKYTV

DVADKGYTLQ IKFAGKEKTPEE

En algunas realizaciones, el polipéptido y/o multímero, como se describe anteriormente, comprende además en el extremo C o extremo N uno o más elementos de acoplamiento, seleccionados del grupo que consiste en un residuo de cisteína, una pluralidad de residuos de lisina y una pluralidad de residuos de histidina. El elemento de acoplamiento puede ser, p. ej,, una sola cisteína en el extremo C. El elemento o elementos de acoplamiento pueden estar unidos directamente al extremo C o N, o puede(n) estar unido(s) mediante un conector que comprende hasta 15 aminoácidos, tales como 1-5, 1-10 o 5-10 aminoácidos. Preferiblemente, este tramo también debería ser suficientemente estable en ambientes alcalinos para no perjudicar las propiedades de la proteína mutada. Para ello, es ventajoso que el tramo no contenga asparagina. También puede resultar ventajoso que el tramo no contenga glutamina. Una ventaja de tener una cisteína C- o N-terminal es que el punto final de acoplamiento de la proteína se puede lograr mediante la reacción del tiol de la cisteína con un grupo electrófilo sobre un soporte. Esto proporciona una excelente movilidad de la proteína acoplada, que es importante para la capacidad de unión.

La estabilidad alcalina del polipéptido o multímero se puede evaluar acoplándolo a un chip SPR, p. ej. a chips sensores CM5 de Biacore como se describe en los ejemplos, y midiendo la capacidad de unión a la cadena ligera kappa del chip, utilizando, p. ej., una proteína que contiene una cadena ligera kappa específica o IgG humana policlonal (donde la mayoría de las moléculas de IgG tienen una cadena ligera kappa), antes y después de la incubación en disoluciones alcalinas a una temperatura específica, p. ej. 22 /- 2 °C. La incubación puede realizarse p.ej. en NaOH 0,1 M durante un número de ciclos de 10 min, tal como 50, 96 o 100 ciclos. La capacidad de unión de la matriz después de 96-100 ciclos de incubación de 10 min en NaOH 0,1 M a 22 /- 2 °C puede ser al menos 40, tal como al menos 50, o al menos 55 % de la capacidad de unión antes de la incubación. Alternativamente, la capacidad de unión restante después de 96-100 ciclos para un mutante particular medida como anteriormente se puede comparar con la capacidad de unión restante para el polipéptido/multímero parental. En este caso, la capacidad de unión restante para el mutante puede ser al menos 105 %, tal como al menos 110 %, al menos 125 %, al menos 150 % o al menos 200 % del polipéptido/multímero parental.

La invención también describe un polipéptido de unión a la cadena ligera kappa que comprende al menos un dominio de unión mutado de proteína L dePeptostreptococcus,en donde al menos un residuo de asparagina de un dominio parental definido por, o que tiene al menos un 95 % o un 98 % de homología de secuencia con, SEQ ID NO: 4 se ha mutado a otro residuo de aminoácido que no es asparagina, prolina o cisteína. El polipéptido puede comprender al menos la mutación N45A y/o la mutación N60Q. En realizaciones específicas, la(s) mutación(ones) se selecciona(n) del grupo que consiste en N45A; N10Q,N45A; N45A,N60Q,N10Q,<n>60Q y N10Q,N45A,N60Q, o alternativamente se seleccionan del grupo que consiste en N45A; N10Q,N45A; N45A,N60Q y N10Q,N45A,N60Q. La estabilidad alcalina con respecto a un polipéptido parental se puede mejorar y se mide como se describe anteriormente.

En algunas realizaciones, el polipéptido comprende o consiste esencialmente en una pluralidad de dominios de unión mutados, tales como 2, 3, 4, 5 o 6 dominios, en donde cada dominio comprende al menos una de las mutaciones N10Q, N45A y N60Q, tales como N45A y /o N60Q. Específicamente, la(s) mutación(ones) en cada dominio se puede(n) seleccionar del grupo que consiste en N45A; n 10Q,N45A; N45A,N60Q, N10q ,n 60Q y N10Q,N45A,N60Q, o seleccionarse alternativamente del grupo que consiste en N45A; N10Q,N45A; N45A,N60Q y N10Q,N45A,N60Q. Opcionalmente, los dominios pueden estar unidos entre sí mediante elementos que comprenden hasta 15 aminoácidos.

En un segundo aspecto, la presente invención describe un ácido nucleico que codifica un polipéptido o multímero según cualquier realización descrita anteriormente. Por tanto, la invención abarca todas las formas de la presente secuencia de ácido nucleico, tales como el ARN y el ADN que codifican el polipéptido o multímero. La invención abarca un vector, tal como un plásmido, que además de la secuencia codificante comprende las secuencias señal requeridas para la expresión del polipéptido o multímero según la invención. En una realización, el vector comprende ácido nucleico que codifica un multímero según la invención, en donde los ácidos nucleicos separados que codifican cada unidad pueden tener secuencias de ADN homólogas o heterólogas.

En un tercer aspecto, la presente invención describe un sistema de expresión que comprende un ácido nucleico o un vector como se describe anteriormente. El sistema de expresión puede ser, p. ej., un sistema de células huésped procariotas grampositivas o gramnegativas, p.ej.Bacillus sp.oEscherichia co lique ha sido modificado para expresar el presente polipéptido o multímero. En una realización alternativa, el sistema de expresión es un sistema de células huésped eucariotas, tal como una levadura, p.ej.Pichea pastorisoSaccharomyces cerevisiae.

En un cuarto aspecto, la presente invención describe una matriz de separación, en donde una pluralidad de polipéptidos o multímeros según cualquier realización descrita anteriormente se han acoplado a un soporte sólido. Dicha matriz es útil para la separación de proteínas que contienen cadenas ligeras kappa y, debido a la estabilidad alcalina mejorada de los polipéptidos/multímeros, la matriz resistirá condiciones altamente alcalinas durante la limpieza, lo cual es esencial para el uso repetido a largo plazo en una configuración de separación del bioproceso. La estabilidad alcalina de la matriz se puede evaluar midiendo la capacidad de unión a las cadenas ligeras kappa, utilizando, p. ej., una proteína que contiene una cadena ligera kappa específica o una IgG humana policlonal, antes y después de la incubación en disoluciones alcalinas a una temperatura específica, p. ej. 22 /- 2 °C. La incubación puede realizarse p.ej. en NaOH 0,1 M durante un número de ciclos de 15 min, tales como 100, 200 o 300 ciclos. La capacidad de unión de la matriz después de 100 ciclos de incubación de 15 min en NaOH 0,1 M a 22 /- 22C puede ser al menos 80, tal como al menos 85, al menos 90 o al menos 95 % de la capacidad de unión antes de la incubación. Alternativamente, la incubación se puede realizar en NaOH 0,1 M durante varios ciclos de 4 h, tal como 6 ciclos que dan un tiempo total de incubación de 24 h. La capacidad de unión de la matriz después de 24 h min de tiempo total de incubación en NaOH 0,1 M a 22 /- 2 °C puede ser al menos 80, tal como al menos 85, al menos 90 o al menos 95 % de la capacidad de unión antes de la incubación.

Como entenderá el experto, el polipéptido o multímero expresado debe purificarse en un grado apropiado antes de inmovilizarse en un soporte. Estos métodos de purificación son bien conocidos en el campo y la inmovilización de ligandos basados en proteínas en soportes se lleva a cabo fácilmente utilizando métodos estándar. Los métodos y soportes adecuados se discutirán a continuación con más detalle.

El soporte sólido de la matriz según la invención puede ser de cualquier tipo adecuado bien conocido. Una matriz de separación por afinidad convencional es a menudo de naturaleza orgánica y se basa en polímeros que exponen una superficie hidrófila a los medios acuosos utilizados, es decir, exponen grupos hidroxi (-OH), carboxi (-COOH), carboxamido (-CONH<2>, posiblemente en formas N-sustituidas), amino (-NH<2>, posiblemente en forma sustituida), oligo o polietilenoxi en sus superficies externas y, si están presentes, también en las superficies internas. El soporte sólido puede ser adecuadamente poroso. La porosidad se puede expresar como un valor Kav o Kd (la fracción del volumen de poro disponible para una molécula sonda de un tamaño particular) medido mediante cromatografía de exclusión de tamaño inversa, p. ej. según los métodos descritos en Gel Filtration Principies and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, págs.. 6-13. Por definición, tanto el valor de Kd como el de Kav siempre se encuentran dentro del intervalo de 0 - 1. El valor de Kav puede ser ventajosamente 0,6 a 0,95, p. ej. 0,7 - 0,90 o 0,6 - 0,8, medido con dextrano de Pm 110 kDa como molécula sonda. Una ventaja de esto es que el soporte tiene una gran fracción de poros capaces de acomodar tanto los polipéptidos/multímeros de la invención como las inmunoglobulinas que se unen a los polipéptidos/multímeros y proporcionar transporte masivo de las inmunoglobulinas hacia y desde los sitios de unión.

Los polipéptidos o multímeros pueden unirse al soporte mediante técnicas de acoplamiento convencionales utilizando, p. ej., grupos tiol, amino y/o carboxi presentes en el ligando. Bisepóxidos, epiclorhidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS), etc. son reactivos de acoplamiento bien conocidos. Entre el soporte y el polipéptido/multímero se puede introducir una molécula conocida como espaciador, que mejora la disponibilidad del polipéptido/multímero y facilita el acoplamiento químico del polipéptido/multímero al soporte. Se pueden introducir espaciadores adecuados, p. ej., mediante activación del soporte con epiclorhidrina, diepóxido de butanodiol, éter alilglicidílico, etc. Alternativamente, el polipéptido/multímero puede unirse al soporte mediante un enlace no covalente, tal como adsorción física o adsorción bioespecífica.

La matriz puede comprender de 5 a 20, tal como de 5 a 15 mg/ml, de 5 a 11 mg/ml o de 8 a 11 mg/ml del polipéptido o multímero acoplado al soporte. La cantidad de polipéptido/multímero acoplado se puede controlar mediante la concentración de polipéptido/multímero utilizado en el proceso de acoplamiento, mediante las condiciones de acoplamiento utilizadas y/o mediante la estructura de poros del soporte utilizado. Como regla general, la capacidad de unión absoluta de la matriz aumenta con la cantidad de polipéptido/multímero acoplado, al menos hasta un punto en donde los poros se estrechan significativamente por el polipéptido/multímero acoplado. La capacidad de unión relativa por mg de polipéptido/multímero acoplado disminuirá a niveles de acoplamiento elevados, lo que dará como resultado un coste-beneficio óptimo dentro de los intervalos especificados anteriormente.

En algunas realizaciones, los polipéptidos se acoplan al soporte mediante una unión multipunto. Esto se puede hacer adecuadamente utilizando condiciones de acoplamiento tales que, una pluralidad de grupos reactivos en el polipéptido reaccionen con grupos reactivos en el soporte. Normalmente, la unión multipunto puede implicar la reacción de varios grupos reactivos intrínsecos de residuos de aminoácidos en la secuencia, tal como aminas en lisinas, con los grupos reactivos en el soporte, tal como epóxidos, ásteres de cianato (p. ej,, a partir de activación de CNBr), ásteres de succinimidilo (p. ej., por activación de NHS), etc. Sin embargo, tambián es posible introducir deliberadamente grupos reactivos en diferentes posiciones en los polipáptidos para afectar a las características de acoplamiento. Para proporcionar un acoplamiento multipunto mediante lisinas, la reacción de acoplamiento se lleva a cabo adecuadamente a un pH en donde una fracción significativa de las aminas primarias de lisina se encuentran en el estado nucleófilo no protonado, p. ej., a pH superior a 8,0, tal como superior a 10.

Los polipáptidos o multímeros se pueden acoplar al soporte mediante enlaces tioáter. Los mátodos para realizar dicho acoplamiento son bien conocidos en este campo y los realiza fácilmente el experto en este campo utilizando tácnicas y equipos estándar. Los enlaces tioáter son flexibles y estables y generalmente adecuados para su uso en cromatografía de afinidad. En particular, cuando el enlace tioáter se realiza a travás de un residuo de cisteína terminal o casi terminal en el polipáptido o multímero, se mejora la movilidad del polipáptido/multímero acoplado, lo que proporciona una capacidad de unión y una cinática de unión mejoradas. El polipáptido/multímero se puede acoplar mediante una cisteína C-terminal proporcionada en la proteína como se describe anteriormente. Esto permite un acoplamiento eficaz del tiol de la cisteína a grupos electrófilos, p. ej. grupos epóxido, grupos halohidrina, etc. sobre un soporte, lo que da como resultado un acoplamiento por puente tioáter. El polipáptido/multímero puede acoplarse, p.ej. mediante fijación de un solo punto, p. ej. mediante una única cisteína o mediante una unión multipunto dirigida, utilizando, p.ej. una pluralidad de lisinas u otros grupos de acoplamiento cerca de un extremo del polipáptido/multímero.

En determinadas realizaciones, el soporte comprende un polímero polihidroxi, tal como un polisacárido. Ejemplos de polisacáridos incluyen, p. ej. dextrano, almidón, celulosa, pululano, agar, agarosa, etc. Los polisacáridos son inherentemente hidrófilos con bajos grados de interacciones no específicas, proporcionan un alto contenido de grupos hidroxilo reactivos (activables) y generalmente son estables frente a las disoluciones de limpieza alcalinas utilizadas en bioprocesamiento.

En algunas realizaciones, el soporte comprende agar o agarosa. Los soportes utilizados en la presente invención se pueden preparar fácilmente según mátodos estándar, como la gelificación en suspensión inversa (S Hjertán: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Alternativamente, las matrices base son productos disponibles comercialmente, tales como perlas de agarosa reticuladas vendidas con el nombre de SEPHAROSE™ FF (GE Healthcare). En una realización, que resulta especialmente ventajosa para separaciones a gran escala, el soporte se ha adaptado para aumentar su rigidez utilizando los mátodos descritos en los documentos US6602990 o US7396467 y, por tanto, hace que la matriz sea más adecuada para caudales elevados.

El soporte, tal como un soporte de polisacárido o agarosa, puede estar reticulado, tal como con reticulaciones de áter hidroxialquílico. Los reactivos reticulantes que producen dichas reticulaciones pueden ser, por ejemplo, epihalohidrinas como la epiclorhidrina, diepóxidos como el butanodioldiglicidiláter, reactivos alilantes como los haluros de alilo o el alilglicidiláter. La reticulación es beneficiosa para la rigidez del soporte y mejora la estabilidad química. Las reticulaciones de hidroxialquiláter son estables a los álcalis y no causan una adsorción inespecífica significativa.

Alternativamente, el soporte sólido se basa en polímeros sintáticos, tales como alcohol polivinílico, acrilatos de polihidroxialquilo, metacrilatos de polihidroxialquilo, poliacrilamidas, polimetacrilamidas, etc. En el caso de polímeros hidrófobos, tales como matrices basadas en bencenos sustituidos con divinilo y monovinilo, la superficie de la matriz a menudo se hidrofiliza para exponer los grupos hidrófilos como se definen anteriormente a un líquido acuoso circundante. Dichos polímeros se producen fácilmente según mátodos estándar, váanse, p. ej., "Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'industria 70(9), 70-75 (1988)). Alternativamente, se utiliza un producto disponible comercialmente, como SOURCE™ (GE Healthcare). En otra alternativa, el soporte sólido según la invención comprende un soporte de naturaleza inorgánica, p. ej. sílice, óxido de circonio, etc.

Además, el soporte sólido puede tener otra forma, tal como una superficie, un chip, capilares o un filtro (p. ej., una membrana o una matriz de filtro profundo).

En cuanto a la forma de la matriz según la invención, según la presente descripción la matriz puede tener la forma de un monolito poroso. En una variante alternativa, la matriz está en forma de perlas o partículas que pueden ser porosas o no porosas. Las matrices en forma de perlas o partículas se pueden utilizar como lecho empaquetado o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen aquellas conocidas como lechos expandidos y suspensiones puras, en donde las partículas o perlas pueden moverse libremente. En el caso de monolitos, lechos compactos y lechos expandidos, el procedimiento de separación suele seguir la cromatografía convencional con un gradiente de concentración. En caso de suspensión pura, se utilizará el modo por lotes.

En un sexto aspecto, la presente invención describe un mátodo para aislar una proteína que contiene una cadena ligera kappa, en donde se utiliza una matriz de separación como la descrita anteriormente.

En determinadas realizaciones, el método comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra líquida que comprende una proteína que contiene una cadena ligera kappa con una matriz de separación como se describe anteriormente,

b) lavar dicha matriz de separación con un líquido de lavado,

c) eluir la proteína que contiene la cadena ligera kappa de la matriz de separación con un líquido de elución, y

d) limpiar la matriz de separación con un líquido limpiador.

El método también puede comprender las etapas de, antes de la etapa a), proporcionar una matriz de separación por afinidad según cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente y proporcionar una disolución que comprende una proteína que contiene una cadena ligera kappa y al menos otra sustancia como una muestra líquida y de, después de la etapa c), recuperar el eluato y opcionalmente someter el eluato a etapas de separación adicionales, p. ej. mediante cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía multimodal y/o cromatografía de interacción hidrófoba. Las composiciones adecuadas de la muestra líquida, el líquido de lavado y el líquido de elución, así como las condiciones generales para realizar la separación, son bien conocidas en la técnica de la cromatografía de afinidad y en particular en la técnica de la cromatografía de proteína L. La muestra líquida que comprende una proteína que contiene una cadena ligera kappa y al menos otra sustancia puede comprender proteínas de la célula huésped (HCP), tal como proteínas de la célula de ovario de hámster chino (CHO),E. colio células de levadura. Los contenidos de proteínas de células CHO yE. colipueden determinarse convenientemente mediante inmunoensayos dirigidos a estas proteínas, p.ej., los kits ELISA HCP CHO o HCPE. colide Cygnus Technologies. Las proteínas de la célula huésped o las proteínas de célula CHO/E. co/i/levadura pueden desorberse durante la etapa b).

La elución se puede realizar utilizando cualquier disolución adecuada utilizada para la elución de medios de proteína L. Esta puede ser, p. ej., una disolución o tampón con pH 4 o inferior, tal como pH 2,5 - 4 o 2,8 - 3,5. En algunas realizaciones, el tampón de elución o el gradiente de tampón de elución comprende al menos un ácido carboxílico mono, di o trifuncional o una sal de dicho ácido carboxílico. En determinadas realizaciones, el tampón de elución o el gradiente de tampón de elución comprende al menos una especie aniónica seleccionada del grupo que consiste en acetato, citrato, glicina, succinato, fosfato y formiato.

En algunas realizaciones, el líquido limpiador es alcalino, tal como con un pH de 12 - 14. Dichas disoluciones proporcionan una limpieza eficaz de la matriz, en particular en el extremo superior del intervalo.

En ciertas realizaciones, el líquido limpiador comprende NaOH o KOH 0,01 - 1,0 M, tal como NaOH o KOH 0,05 - 1,0 o 0,05 - 0,1 M. La alta estabilidad de los polipéptidos de la invención permite el uso de dichas disoluciones alcalinas comparativamente fuertes.

En algunas realizaciones, las etapas a) - d) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces o 50 - 200 veces. Esto es importante para la economía de procesos porque la matriz se puede reutilizar muchas veces.

Ejemplos

Mutagénesis de proteínas

Se diseñaron constructos monoméricos a partir de una proteína L descrita en el documento US6822075 (SEQ ID NO:1), que contiene cuatro dominios de unión a cadena ligera kappa. Estos están numerados 1,2, 3 y 4, comenzando desde el extremo N (Fig.1). Los fragmentos de ADN se adquirieron en una empresa de síntesis de ADN (DNA2.0). Se prepararon cuatro constructos monoméricos en un vector de clonación pJexpress201, cada uno con una cisteína N-terminal. Para obtener una descripción general de los constructos, consulte SEQ ID NO: 2 (referencia), 4 (invención), 5 (referencia),12 (referencia).

Los constructos se subclonaron en el vector de expresión pGO, que contenía el promotor GAP deE. coliy la secuencia del péptido señal OmpA para la localización periplasmática de la proteína diana. La secuencia que codifica los cuatro dominios se preparó mediante la amplificación con oligonucleótidos que contenían los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para FspI y PstI en el lado 5' y el lado 3', respectivamente. El fragmento de ADN preparado que codifica cada dominio se digirió con FspI y PstI (New England Biolabs). Por separado, se preparó el vector de expresión con digestión con FspI y PstI y se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se recuperó. Ambos se mezclaron y ligaron con el kit de ligadura Quick (New England Biolabs). El plásmido ligado que expresa cada dominio se transformó en una cepa K12 deE. colicon método de choque térmico.

Se prepararon mutaciones adicionales de los aminoácidos N10, N45, Q19 y N60 en el dominio 3 en el vector de expresión pJexpress401 (DNA2.0) que contiene el promotor T5 bajo un mecanismo de control del operón lac (SEQ ID NO:7-11,13-14). Se diseñaron los constructos con y sin péptido señal OmpA pero sin cisteína C-terminal.

También se prepararon tetrámeros del dominio 3, dímero, tetrámero y hexámero del dominio 3 con mutaciones N45, N10 y N60 en pJexpress401, con y sin cisteína C-terminal (SEQ ID NO:15-18).

Expresión y purificación de constructos

Las células reeomblnantesE. coliK12 se cultivaron en matraces de agitación con caldo LB (10 g de peptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCI) suplementado con 25 mg/l de kanamicina a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó 0,8. En este punto, la expresión de proteínas se indujo con p-D-1-tiogaIactopiranósido de isopropilo (VWR International) con una concentración final de 1 mM. Tras la inducción, la temperatura se redujo a 30 °C y los cultivos se incubaron durante 5 horas. Se detuvo el cultivo y las células se centrifugaron durante 15 minutos a 4000 x g y se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1/10 del volumen de cultivo con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se sonicaron usando sonicación por pulsos con un tiempo activo de 2 minutos. Las muestras sonicadas se aclararon de los restos celulares mediante centrifugación a 6000xg durante 30 minutos, seguido de microfiltración con una membrana que tenía un tamaño de poro de 0,2 pm.

Los ligandos purificados se analizaron con LC-MS para determinar la pureza y asegurar que el peso molecular correspondía al esperado (basado en la secuencia de aminoácidos).

Ejemplo 1

Los ligandos monoméricos purificados enumerados en la Tabla 1, que comprenden además, en los casos de dominios individuales no mutados, una cisteína en el extremo C y una secuencia AQV en el extremo N, se inmovilizaron en chips sensores CM5 de Biacore (GE Healthcare, Suecia), utilizando el kit de acoplamiento de aminas de GE Healthcare (para el acoplamiento de carbodiimida de aminas en los grupos carboximetilo del chip) en una cantidad suficiente para dar una intensidad de señal de aproximadamente 1000 RU en un instrumento Biacore (GE Healthcare, Suecia). Para seguir la capacidad de unión de IgG de la superficie inmovilizada, se hizo fluir 1 mg/ml de IgG policlonal humana (Gammanorm) sobre el chip y se anotó la intensidad de la señal. Luego la superficie se limpió in situ (CIP), es decir, se lavó con NaOH 100 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 /- 2 °C). Esto se repitió durante 96 ciclos y se siguió la estabilidad alcalina del ligando inmovilizado como la pérdida relativa de la capacidad de unión de IgG (intensidad de la señal) después de cada ciclo. Los resultados para los dominios no mutados se muestran en la Fig. 2 e indican que el Dominio 1 tiene una estabilidad alcalina claramente menor que los otros dominios y que el Dominio 3 tiene la estabilidad alcalina más alta. Los resultados para mutantes de asparagina de dominio único del Dominio 3 se muestran en la Fig. 3 y muestran una estabilidad alcalina mejorada para todos los mutantes en comparación con el Dominio 3 parental, que se utilizó como referencia en paralelo con las mutaciones.

Tabla 1

Ejemplo 2

Los ligandos multidominio purificados enumerados en la Tabla 2 se inmovilizaron en chips sensores CM5 de Biacore (GE Healthcare, Suecia), utilizando el kit de acoplamiento de aminas de GE Healthcare (para el acoplamiento de carbodiimida de aminas en los grupos carboximetilo del chip) en una cantidad suficiente para dar una intensidad de señal de aproximadamente 1000 RU en un instrumento Biacore (GE Healthcare, Suecia). La proteína L tenía una secuencia AIHNRA adicional en el extremo N. Para seguir la capacidad de unión de IgG de la superficie inmovilizada, se hizo fluir 1 mg/ml de IgG policlonal humana (Gammanorm) sobre el chip y se anotó la intensidad de la señal. Luego la superficie se limpió in situ (CIP), es decir, se lavó con NaOH 100 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 /- 2 °C). Esto se repitió durante 96 ciclos y se siguió la estabilidad alcalina del ligando inmovilizado como la pérdida relativa de la capacidad de unión de IgG (intensidad de la señal) después de cada ciclo. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y la Fig, 4 y muestran que el Dominio 3 tetramérloo tiene una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la Proteína L que se procesó en paralelo como referencia,

Tabla 2

Ejemplo 3

Los ligandos multidominio purificados enumerados en la Tabla 3 se inmovilizaron en chips sensores CM5 de Biacore y se evaluaron mediante los métodos utilizados en el Ejemplo 2, -cys al final de la designación del ligando indica que el ligando tiene una cisteína C-terminal además de la secuencia definida por SEQ ID NO:16-18, Los resultados se muestran en la Tabla 3 y la Fig, 5 y muestran que todos los dímeros, tetrámeros y hexámeros del Dominio 3 mutados tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la proteína L que se procesó en paralelo como referencia, Tabla 3

Ejemplo 4

Los ligandos di, tetra y hexaméricos purificados de la Tabla 4 se inmovilizaron en perlas de agarosa utilizando los métodos descritos a continuación y se evaluó su capacidad, Los resultados se muestran en la Tabla 4,

Tabla 4

Activación

La matriz base utilizada fue perlas de agarosa reticuladas rígidas de 85 micrómetros (ponderado en volumen) de diámetro mediano, preparadas según los métodos de los documentos US6602990 y con un tamaño de poro correspondiente a un valor Kav de cromatografía de filtración en gel inversa de 0,70 para dextrano de Pm 110 kDa, según los métodos descritos en Gel Filtration Principies and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, págs, 6-13, Se mezclaron 25 mi (g) de matriz base drenada, 10,0 mi de agua destilada y 2,02 g de NaOH (s) en un matraz de 100 mi con agitación mecánica durante 10 min a 25 °C, Se añadieron 4,0 mi de epiclorhidrina y la reacción avanzó durante 2 horas, El gel activado se lavó con 10 volúmenes de sedimento de gel (GV) de agua,

Acoplamiento

El gel activado se lavó con 5 GV de fosfato 0,2 M/EDTA 1 mM, pH 11,5 (tampón de acoplamiento}. Se mezclaron 15 mi de gel 13 mg de ligando/ml de gel (5,0 ml} 5,5 ml de tampón de acoplamiento 4,7 g de sulfato sódico en un matraz de 50 ml y se agitaron a 30 sC durante 18,5 h. El pH se midió como 10,8.

Después de la inmovilización, los geles se lavaron 3<x>GV con agua destilada y luego 5<x>GV con fosfato 0,1 M/EDTA 1 mM, pH 8,5. Se mezclaron los geles 1 GV {fosfato 0,1 M/EDTA 1 mM/tioglicerol al 7,5 %, pH 8,5} y el matraz se agitó a 450C durante 2 h 20 min. Luego, el gel se lavó alternativamente con 1xGV de HAc 0,1 M y 1xGV {TRIS 0,1 M /NaCI 0,15 M pH 8,5} y luego 6<x>GV con agua destilada. Las muestras de gel se enviaron a un laboratorio externo para el análisis de aminoácidos y el contenido de ligando (mg/ml de gel} se calculó a partir del contenido total de aminoácidos. El protocolo de acoplamiento utilizado proporciona un acoplamiento multipunto, con varias lisinas de cada dominio unidas al gel.

2 ml de resina se envasó en TRICORN™ 5100 columnas.

Proteína

a} Fab purificado preparado a partir de un IgG mAb digerido con papaína, diluido a 1 mg/ml en tampón de equilibrado.

b) Dab purificado preparado a partir de sobrenadante deE. co litratado térmicamente, diluido a 1 mg/ml en tampón de equilibrado. El Dab contenía únicamente una cadena ligera kappa, sin ningún sitio de unión al antígeno. Tampón de equilibrado

Tampón de fosfato APB 20 mM NaCI 0,15 M, pH 7,4 (Medicago)

Tampón de adsorción

Tampón de fosfato APB 20 mM NaCI 0,15 M, pH 7,4 (Medicago).

Tampón de elución

Citrato 25 mM pH 2,5

La capacidad de penetración se determinó con un sistema ÁKTAExplorer 10 con un tiempo de residencia de 4 minutos. El tampón de equilibrado se pasó a través de la columna de derivación hasta que se obtuvo una línea base estable. Esto se hizo antes de la puesta a cero automática. Se aplicó muestra a la columna hasta que se obtuvo una señal UV del 100 %. Luego, se aplicó nuevamente el tampón de equilibrado hasta que se obtuvo una línea base estable. La muestra se cargó en la columna hasta que se alcanzó una señal UV del 85 % de la absorbancia máxima. Luego se lavó la columna con tampón de equilibrado y se eluyó a pH 2,5 a un caudal de 0,5 ml/min.

Para el cálculo de la capacidad de penetración al 10 %, se utilizó la siguiente ecuación. Esa es la cantidad de Fab/Dab que se carga en la columna hasta que la concentración de Fab/Dab en el efluente de la columna sea el 10 % de la concentración de Fab/Dab en la alimentación.

A<sub>= contribución de absorbancia de proteínas no vinculantes;

A(V) = absorbancia a un volumen aplicado dado;

Vc = volumen de la columna;

V<ap>= volumen aplicado hasta una penetración del 10 %;

V<sis>= volumen muerto del sistema;

C<ü>= concentración de alimentación.

Se calculó la capacidad de unión dinámica (DBC) con una penetración del 10 % y se estudió la apariencia de la curva. También se estudió la curva en cuanto a unión, elución y pico de CIP. La capacidad de unión dinámica (DBC) se calculó para una penetración del 10 y del 80 %.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de unión a la cadena ligera kappa que comprende o consiste en un multímero de un dominio 3 de unión de la proteína L dePeptostreptococcus, en donde la secuencia de aminoácidos del dominio 3 está definida por la SEQ ID NO: 4 o tiene al menos un 95 % de homología de secuencia con SEQ ID NO: 4.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde en uno o más, tal como en todos, de dichos dominios de unión, al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 45 en SEQ ID NO: 4 ha sido mutado a un aminoácido que no es asparagina, prolina ni cisteína, tal como a una alanina.

3. El polipéptido de cualquier reivindicación anterior, en donde en uno o más, tal como en todos, de dichos dominios de unión al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 10 en SEQ ID NO: 4 ha sido mutado a un aminoácido que no es asparagina, prolina ni cisteína, tal como a una glutamina.

4. El polipéptido de cualquier reivindicación anterior, en donde en uno o más, tal como en todos, de dichos dominios de unión al menos el aminoácido en la posición correspondiente a la posición 60 en SEQ ID NO: 4 ha sido mutado a un aminoácido que no es asparagina, prolina ni cisteína, tal como a una glutamina

5. El polipéptido de cualquier reivindicación anterior, en donde uno o más, tal como todos, de dichos dominios de unión tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias definidas por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.

6. El polipéptido de cualquier reivindicación anterior, que comprende además un resto N-terminal y/o un resto C-terminal.

7. El polipéptido de cualquier reivindicación anterior, en donde:

a) los dominios están unidos entre sí mediante elementos que comprenden hasta cinco o quince residuos de aminoácidos;

b) dicho polipéptido comprende o consiste en dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete dominios;

c) dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias definidas por SEQ ID NO: 15-18 o por SEQ ID NO: 16-18;

d) la estabilidad alcalina mejora cuando se mide por la capacidad de unión restante para las proteínas que contienen cadenas ligeras kappa después de 96-100 ciclos de incubación de 10 minutos en NaOH acuoso 0,1 M a 22 /- 2 °C; y/o

e) dicho polipéptido comprende además en el extremo C o en el extremo N uno o más elementos de acoplamiento, seleccionados del grupo que consiste en un residuo de cisteína, una pluralidad de residuos de lisina y una pluralidad de residuos de histidina.

8. Un ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido según cualquier reivindicación anterior.

9. Un sistema de expresión que comprende un ácido nucleico o un vector según la reivindicación 8.

10. Una matriz de separación, en donde una pluralidad de polipéptidos o multímeros según cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 se han acoplado a un soporte sólido.

11. La matriz de separación según la reivindicación 10, en donde los polipéptidos o multímeros se han acoplado al soporte sólido mediante unión multipunto y/o en donde el soporte sólido es un polisacárido.

12. La matriz de separación según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en donde la capacidad de unión de la matriz para las proteínas que contienen cadenas ligeras kappa después de 100 ciclos de incubación de 15 min en NaOH 0,1 M a 22 /- 2 °C es al menos 40, tal como al menos 50, o al menos el 55 % de la capacidad de unión antes de la incubación.

13. Un método para aislar una proteína que contiene una cadena ligera kappa, en donde se utiliza una matriz de separación según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12.

14. El método de la reivindicación 13, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra líquida que comprende una proteína que contiene una cadena ligera kappa con una matriz de separación según una cualquiera de las reivindicaciones 10-12,

b) lavar dicha matriz de separación con un líquido de lavado,

c) eluir la proteína que contiene la cadena ligera kappa de la matriz de separación con un líquido de elución, y d) limpiar la matriz de separación con un líquido limpiador,

15. El método de la reivindicación 14, en donde el líquido limpiador es alcalino, tal como con un pH de 12 - 14 y/o en donde el líquido limpiador comprende NaOH o KOH 0,01 - 1,0 M, tal como NaOH o KOH 0,05 - 1,0 M o 0,05 - 0,1 M.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en donde las etapas a) - d) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces o 50 - 200 veces.