ES2977620T3

ES2977620T3 - Alfalfa con composición reducida de lignina

Info

Publication number: ES2977620T3
Application number: ES18728734T
Authority: ES
Inventors: Song Luo; Nicholas J Baltes
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2024-08-27
Anticipated expiration: 2038-04-25
Also published as: AU2018260469A1; EP3615668C0; CA3060622A1; HUE067206T2; US20200048648A1; WO2018198049A1; AR111489A1; EP3615668B1; EP4403637A3; AU2018260469B2; EP4403637A2; US11479782B2; EP3615668A1

Abstract

En el presente documento se proporcionan materiales y métodos para crear plantas (por ejemplo, líneas de alfalfa) con contenido y composición de lignina reducidos, al igual que plantas, partes de plantas y células vegetales generadas mediante los métodos proporcionados en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Alfalfa con composición reducida de lignina

Campo técnico

Este documento se refiere a materiales y métodos para alterar el contenido y/o la composición de lignina en la alfalfa. Por ejemplo, este documento se refiere a materiales y métodos para inactivar o atenuar genes asociados a la lignina en Medicago sativa, lo que resulta en plantas de alfalfa que tienen un contenido reducido de unidades de siringilo (S) y/o un contenido reducido de lignina

Antecedentes de la invención

La alfalfa, Medicago sativa, es un cultivo forrajero importante en muchos países, y es una excelente fuente de proteínas, vitaminas, minerales y fibra digerible. Un rasgo de calidad en la alfalfa es el contenido de lignina. La lignina es un componente en las paredes celulares que es fundamental para el crecimiento de las plantas, la conductividad del agua, el desarrollo y la estructura de las plantas y la resistencia a los patógenos. La lignina está compuesta por tres monómeros: alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico y alcohol sinapílico, y cada monómero tiene un anillo de carbono con una configuración de grupo metoxi diferente y una cola de 3 carbonos. Para formar lignina, los monómeros se polimerizan en forma de unidades de fenilpropanoides p-hidroxifenilo (H lignina), guayacilo (G lignina) y siringilo (S lignina). Las plantas dicotiledóneas, incluida la alfalfa, se componen principalmente de mezclas de lignina G y S, mientras que las plantas monocotiledóneas se componen principalmente de mezclas de lignina G, S y H.

El alto contenido de lignina en la alfalfa se asocia con una menor calidad del forraje y una menor digestibilidad. A medida que aumenta la madurez de la planta de alfalfa, aumenta la cantidad de fibra, incluida la lignina, y disminuye la digestibilidad. El contenido de lignina, hemicelulosa y celulosa dentro de las plantas de alfalfa se puede medir como digestibilidad neutra de la fibra detergente (NDFD). La NDFD es una indicación de la cantidad de energía que los animales pueden extraer de la alfalfa. Debido a que la lignina es principalmente indigerible y reduce la digestión de otras fibras en los animales, el contenido energético previsto de la alfalfa disminuye con la disminución de NDFD. Una variedad de alfalfa con lignina reducida puede tener un nivel más alto de NDFD, lo que resulta en una mayor digestibilidad y un mejor valor alimenticio en comparación con las variedades convencionales. La alfalfa con lignina reducida también puede proporcionar a los productores la capacidad de retrasar la cosecha hasta una etapa posterior de madurez, sin pérdida de digestibilidad.

Breve descripción de la invención

Este documento se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la edición del genoma se puede utilizar para generar plantas de alfalfa modificadas que tienen componentes de valor alimenticio mejorados, tales como contenido reducido de lignina, contenido reducido de unidades de siringilo (S) y/o NDFD aumentado. Como se describe en la presente, las plantas de alfalfa con componentes de valor alimenticio mejorados se pueden generar usando nucleasas específicas de secuencia para inactivar o atenuar el gen de la O-metiltransferasa del ácido cafeico (COMT). Por lo tanto, este documento describe materiales y métodos para utilizar la edición del genoma para generar mutaciones dentro de los alelos del gen de la COMT en plantas, partes de plantas y células vegetales de alfalfa y otros miembros del género Medicago. Las plantas, partes de plantas y células vegetales que contienen mutaciones de COMT generadas de acuerdo con los métodos descritos también se describen en la presente.

El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, la presente invención proporciona una planta de alfalfa, una parte de planta de la planta de alfalfa o una célula de planta de la planta de alfalfa, en donde el genoma de dicha planta de alfalfa, dicha parte de planta o dicha célula de planta comprende una mutación inducida en cada alelo de la COMT de dicho genoma; en donde dicha planta de alfalfa comprende una reducción en unidades de siringilo (S) en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente, y/o en donde dicha planta de alfalfa comprende un contenido de lignina disminuido en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente. La parte de la planta que comprende dicha mutación inducida se puede seleccionar del grupo que consiste en un tallo, una hoja, una flor y una semilla. Cada mutación inducida puede comprender una deleción de uno o más pares de bases de ácido nucleico. Al menos una mutación inducida puede comprender una eliminación dentro del marco de dos o más codones de ácido nucleico consecutivos. Cada mutación inducida se puede seleccionar del grupo que consiste en: una mutación inducida dentro de una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:9-15, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 9-15; una deleción de la citosina en la posición 29 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 9-15; una deleción de la timina en la posición 144 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:9-15; una deleción de la adenina en la posición 208 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:9-15; y una mutación inducida dentro de una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:6-8, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:6-8. Cada mutación inducida puede producir un alelo de la COMT que contiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:32526 a 32537. La planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal puede producir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO:32538 o SEQ ID No :32539.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta de alfalfa, el método comprende: proporcionar una población de células de alfalfa que comprende cada una cuatro alelos COMT, poner en contacto la población de células de alfalfa con una o más endonucleasas de corte raro dirigidas a uno o más de los cuatro alelos COMT, regenerar plantas de alfalfa a partir de la población de células de alfalfa y seleccionar una planta de alfalfa con una mutación inducida en cada uno de dichos cuatro alelos COMT, en donde dicha planta de alfalfa seleccionada comprende una reducción en unidades de siringilo (S) en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente, y en donde dicha planta de alfalfa seleccionada exhibe un contenido de lignina reducido en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente. Cada mutación inducida puede comprender una deleción de uno o más pares de bases de ácido nucleico, o al menos una mutación inducida puede comprender una deleción dentro del marco de dos o más codones de ácido nucleico consecutivos. Cada mutación inducida se puede seleccionar del grupo que consiste en: una mutación inducida dentro de una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:9-15, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 9-15; una deleción de la citosina en la posición 29 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO: 9-15; una deleción de la timina en la posición 144 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:9-15; una deleción de la adenina en la posición 208 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:9-15; y una mutación inducida puede estar dentro de una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:6-8, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90% de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:6-8. Cada mutación inducida puede producir un alelo de la COMT comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:32526 a 32537. La una o más endonucleasas de corte raro pueden ser nucleasas TALE. La nucleasa TALE se puede unir a una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:6-8.

También se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO:32526 a 32537.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica de la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en los dibujos adjuntos y en la siguiente descripción. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de las figuras, y de las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra la secuencia codificante de una secuencia de ARNm de COMT representativa, desde el codón de inicio hasta el de terminación (SEQ ID NO:1); Medicago sativa, secuencia codificante de COMT; número de acceso de GenBank GU066087.1.

La FIG. 2 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO:9).

La FIG. 3 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO: 10).

La FIG. 4 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO: 11).

La FIG. 5 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO: 12).

La FIG. 6 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO: 13).

La FIG. 7 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO: 14).

La FIG. 8 muestra una secuencia parcial del gen de la COMT identificado dentro de una planta de la variedad Medicago sativa SW 8421-S (SEQ ID NO: 15).

La FIG. 9 muestra el genotipo de una planta SW8421-S T0 de Medicago sativa (designada como Ms491-1) que contiene tres alelos COMT mutantes (SEQ ID NO: 32526-32528) y un alelo de la WT COMT (no abarcado por la presente invención). Ms491-1 se generó utilizando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T01.1 que se une a la SeQ ID nO:6. La FIG. 10 muestra el genotipo de una planta SW8421-S T0 de Medicago sativa (designada como Ms492-2) que contiene cuatro alelos COMT mutantes (SEQ Id NO:32529-32532). Ms492-2 se generó utilizando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1 que se une a la SEQ ID NO:7.

La FIG. 11 muestra el genotipo de una planta SW8421-S T0 de Medicago sativa (designada como Ms589-1) que contiene cuatro alelos COMT mutantes (SEQ ID NO:32533-32536). Ms589-1 se generó utilizando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T03.1 que se une a la SEQ ID NO:7.

La FIG. 12 muestra el genotipo de una planta SW8421-S T0 Medicago sativa (designada como Ms553-1) que contiene un alelo COMT mutante (SEQ ID NO:32537) y tres alelos de la WT COMT (no abarcado por la presente invención). Ms553-1 se generó utilizando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1 que se une a la S<e>Q ID NO:7.

La FIG. 13 muestra los resultados de la tinción de Maule de la línea mutante Ms589-1.

La FIG. 14 muestra los resultados de la tinción de Maule de la línea mutante Ms492-2.

Descripción detallada

Este documento describe materiales y métodos para generar plantas de alfalfa con valor alimenticio mejorado. Por ejemplo, este documento describe materiales y métodos para crear plantas de alfalfa con valor alimenticio mejorado usando nucleasas específicas de secuencia para inactivar y/o atenuar alelos del gen de la COMT.

La lignina desempeña un papel importante en el desarrollo y la función de las plantas. Por ejemplo, la lignina puede actuar como una barrera física para ayudar a reducir los ataques microbianos, proporcionar apoyo estructural a las plantas y facilitar el transporte de agua. La lignina en las plantas dicotiledóneas, incluida la alfalfa, se compone de unidades de guayacilo (G) y siringilo (S) monolignol. Las unidades G se derivan del ácido cafeico, mientras que las unidades S se derivan del ácido sinápico.

La vía de biosíntesis de la lignina comienza con la conversión de la fenilalanina en ácido cinámico, que es catalizada por<la enzima PAL. A continuación, el ácido cinámico se convierte en ácido>p<-cumárico mediante la enzima C4H. El ácido>p<-cumárico se convierte en ácido>p<-cumárico CoA mediante la enzima 4CL. El ácido>p<-cumárico CoA se convierte después en>p<-cumaraldehído mediante la enzima CCR o se convierte en cafeil CoA mediante la enzima HCT/C3H. El>p<-cumaraldehído se convierte en alcohol>p<-cumarílico mediante la enzima CAD, que se utiliza para formar H-lignina. El>cafeoil CoA se convierte en feruloil CoA por la enzima CCoAOMT. La feruloil CoA es después convertida en coniferaldehído por la enzima CCR. El coniferaldehído se convierte después en alcohol coniferílico para la síntesis de G-lignina o se convierte en 5-hidroxiconiferaldehído mediante la enzima CAld5H. El 5-hidroxiconiferaldehído se convierte después en sinapaldehído mediante la enzima COMT. El sinapaldehído se convierte después en alcohol sinapílico mediante la enzima CAD, donde el alcohol sinapílico se usa para producir S-lignina.

En la presente invención, la planta utilizada para la inactivación o atenuación de COMT es una planta de alfalfa (Medicago sativa). La planta de alfalfa puede ser una planta de alfalfa que se conoce comúnmente como una planta de alfalfa cultivada, una planta de alfalfa glandular, una planta de alfalfa de flor púrpura, una planta de alfalfa falciforme, una planta de alfalfa abigarrada, una planta de alfalfa silvestre o una planta de alfalfa de flor amarilla.

La COMT es una O-metiltransferasa (OMT) dependiente de S-adenosil-L-Met de molécula pequeña, que cataliza la conversión de 5-hidroxiconiferaldehído en sinapaldehído. La secuencia codificante, sin incluir intrones genómicos, para un gen de la COMT de Medicago sativa se expone en la SEQ ID NO:1 como se muestra en la FIG. 1. Como se describe en la presente, la secuencia genómica, que incluye intrones genómicos, para otro gen de la COMT representativo de la especie Medicago (Medicago truncatula) se muestra a continuación y en la SEQ ID NO:32524. Las letras mayúsculas indican exones. Las letras minúsculas indican intrones.

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(SEQ ID NO:32524)

Las secuencias parciales representativas para los alelos de la COMT de la variedad Medicago sativa SW 8421-S se muestran en las FIGS. 2-8 (S<e>Q ID NO:9-15, respectivamente).

La proteína COMT tiene actividad metiltransferasa y puede funcionar en varios sustratos, que incluyen cafeato, 5-hidroxiferulado, cafeil aldehído, alcohol cafeílico, 5-hidroxiconiferaldehído y alcohol 5-hidroxiconiferílico. Los aminoácidos que son importantes para la función COMT incluyen los aminoácidos que forman los bolsillos de unión para los sustratos SAM/SAH y COMT, y los aminoácidos que forman el sitio activo. La información con respecto a la estructura cristalina de COMT y los aminoácidos específicos que forman bolsas de unión y sitios activos se puede encontrar en otra parte (véase, por ejemplo, Zubieta et al., Plant Cell, 14:1265-1277, 2002).

La alfalfa y otras plantas Medicago son tetraploides, y se pueden inducir mutaciones en uno, dos, tres o los cuatro alelos de la COMT de una planta, parte de planta o célula vegetal. En la presente invención, el genoma de la planta de alfalfa, una parte de la planta de dicha planta de alfalfa o una célula vegetal de dicha planta de alfalfa comprende una mutación inducida en cada alelo de la COMT de dicha planta de alfalfa mediante el uso de los métodos descritos en la presente. Las mutaciones dentro de la COMT que pueden dar como resultado la inactivación o atenuación de la función génica pueden incluir deleciones, inserciones y/o sustituciones.

Las deleciones e inserciones pueden variar en tamaño de un nucleótido (nt) a 200 o más nt (por ejemplo, de uno a cinco nt, de cinco a 10 nt, de 10 a 15 nt, de 15 a 20 nt, de 20 a 30 nt, de 30 a 40 nt, de 40 a 50 nt, de 50 a 75 nt, de 75 a 100 nt, de 100 a 150 nt, de 150 a 200 nt o más de 200 nt). Una eliminación puede dar como resultado la eliminación de 0,1% a 100% de la secuencia codificante de un gen (por ejemplo, 0,1 a 0,5%, 0,5 a 1%, 1 a 5%, 5 a 10%, 10 a 15%, 15 a 20%, 20 a 30%, 30 a 40%, 40 a 50%, 50 a 60%, 60 a 70%, 70 a 80%, 80 a 90% o 90 a 100% de la secuencia codificante).

En algunas realizaciones, las eliminaciones que resultan en inactivación o atenuación son mutaciones de desplazamiento de marco (es decir, -3N 1 y -3N 2; donde N es un número entero que es mayor o igual a 1), y en algunas realizaciones, las inserciones que resultan en inactivación o atenuación son mutaciones de desplazamiento de marco (es decir, 3N-1 y 3N-2; donde N es un número entero que es mayor o igual a 1). Un desplazamiento del marco de inactivación/atenuación puede ocurrir dentro de un exón, después del codón de inicio y antes del codón que codifica el último aminoácido que es importante para la función de la proteína. Para COMT, se puede producir un desplazamiento del marco de inactivación/atenuación antes del codón que codifica el ácido glutámico en la posición de aminoácido 329 de la SEQ ID NO:32525. En otras palabras, el desplazamiento del marco puede ocurrir antes de los nucleótidos en las posiciones 1000 y 1002 en la SEQ ID NO:1. Las deleciones que pueden dar como resultado la inactivación o atenuación del gen también pueden incluir deleciones dentro del marco que eliminan codones que codifican aminoácidos que son importantes para la función de la proteína. Estos aminoácidos incluyen, pero no se limita a L136, H166, A162, H323, N324,<m>252, D251, L232, D206, V207, G208, G209, G210, T211, G212, K265, M180, N131, F176, H296, H166, H183, E329, E297, I319, M180, H269, D270, D231 y F176 de la SEQ ID NO:32525. En algunos casos, una planta generada por los métodos proporcionados en la presente puede tener al menos un alelo de la COMT con una eliminación dentro del marco de uno o más (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, dos o más, cinco o más, diez o más, dos a diez, tres a 15, cinco a 20 o diez a 50) codones consecutivos.

Las sustituciones que pueden resultar en inactivación o atenuación pueden incluir mutaciones que resultan en un codón de terminación temprana. Típicamente, el codón de terminación temprana puede ocurrir dentro de un exón, después del codón de inicio y antes del codón que codifica el último aminoácido que es importante para la función de la proteína. Para COMT, tal sustitución puede tener lugar antes del codón que codifica el ácido glutámico en la posición de aminoácido 329 de la SEQ ID NO:32525. En otras palabras, la sustitución puede ocurrir antes de los nucleótidos en las posiciones 1000 y 1002 en la SEQ ID NO: 1. Las sustituciones que pueden dar como resultado la inactivación o atenuación también incluyen mutaciones que dan como resultado un corte y empalme de intrones aberrante, y también sustituciones que dan como resultado una o más sustituciones de aminoácidos dentro de la proteína COMT. Tales sustituciones pueden ser en sitios activos o conservados dentro de la proteína COMT. Estos aminoácidos incluyen, pero no se limita a L136, H166, A162, H323, N324, M252, D251, L232, D206, V207, G208, G209, G210, T211, G212, K265, M180, N131, F176, H296, H166, H183, E329, E297, I319, M180, H269, D270, D231 y F176 de la SEQ ID NO:32525.

Para generar plantas mutantes de COMT, las plantas (es decir, alfalfa) se pueden regenerar a partir de una célula, o una población de células, que se han transformado con una o más nucleasas específicas de secuencia. Normalmente se generan numerosos mutantes independientes utilizando cada una de una o más nucleasas específicas de secuencia. Las plantas con mutaciones de COMT específicas también se pueden generar cruzando una primera planta que contiene una o más mutaciones de COMT inducidas por nucleasa específicas de secuencia con una segunda planta que puede tener o no una o más mutaciones de COMT inducidas por nucleasa específicas de secuencia. Las plantas mutantes de COMT resultantes se pueden evaluar de numerosas maneras, que incluyen (1) fenotipar el rasgo deseado (por ejemplo, contenido y composición de lignina), (2) caracterización molecular de la planta resultante para garantizar que no haya mutaciones fuera del objetivo o integración aleatoria de ADN extraño, (3) segregación de las mutaciones y el fenotipo, y (4) rendimiento agronómico de la planta mutante de COMT.

En algunas realizaciones, las plantas de acuerdo con la presente invención también pueden contener un transgén. El transgén se puede integrar en el genoma de la alfalfa utilizando protocolos de transformación estándar. El transgén puede dar como resultado la expresión de una proteína que confiere tolerancia o resistencia a uno o más herbicidas (por ejemplo, glufonsinato, mesotriona, imidazolinona, isoxaflutol, glifosato, 2,4-D, herbicidas inhibidores de hidroxifenilpiruvato dioxigenasa o dicamba). El transgén puede codificar una proteína 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) vegetal o una proteína EPSPS vegetal modificada, una proteína EPSPS bacteriana, en donde la EPSPS vegetal modificada contiene una sustitución de aminoácidos dentro de la secuencia TAMRP conservada (SEQ ID NO:32522). Las sustituciones pueden incluir una sustitución de treonina por isoleucina, una sustitución de prolina por serina o una sustitución de prolina por adenina. El transgén puede codificar una proteína EPSPS bacteriana, una proteína EPSPS CP4 de agrobacterium, una proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD), una proteína fosfinotricina N-acetiltransferasa (PAT), una proteína de subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa, una proteína p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (hppd) o una proteína dicamba monooxigenasa (DMO).

Este documento también describe moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de nucleótidos de COMT (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO:1, 6-15 o 32524, o un fragmento de cualquiera de las SEQ ID NO:1, 6-15 o 32524), pero con una o más deleciones, inserciones o sustituciones de nucleótidos inducidas en comparación con una secuencia de nucleótidos de COMT de tipo silvestre correspondiente. Un aspecto de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos tal como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:32526-32537. Como se describe en la presente, una molécula de ácido nucleico aislada puede contener una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido COMT de alfalfa, siempre que la secuencia de ácido nucleico incluya una deleción dentro del marco de al menos tres (por ejemplo, tres, seis, nueve, 12, 15, 18, tres a 30, tres a 60, tres a 99, seis a 30, seis a 60 o seis a 99) nucleótidos en comparación con una secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido COMT de alfalfa de tipo silvestre.

La molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico aislada. El término "aislado", como se usa en la presente con referencia a un ácido nucleico, se refiere a un ácido nucleico de origen natural que no es inmediatamente contiguo con ambas secuencias con las que es inmediatamente contiguo (una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma de origen natural del organismo del que se deriva. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre que una de las secuencias de ácido nucleico que normalmente se encuentra inmediatamente flanqueando esa molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural se elimine o esté ausente. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado incluye, pero no se limita a un ADN recombinante que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido por PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias, así como ADN recombinante que se incorpora en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o virus del herpes) o en el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir una molécula de ADN recombinante que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.

El término "aislado", tal como se usa en la presente con referencia a un ácido nucleico, también incluye cualquier ácido nucleico de origen no natural, ya que las secuencias de ácido nucleico de origen no natural no se encuentran en la naturaleza y no tienen secuencias inmediatamente contiguas en un genoma de origen natural. Por ejemplo, un ácido nucleico de origen no natural, tal como un ácido nucleico modificado genéticamente o un ácido nucleico que contiene una mutación inducida por la edición de genes como se describe en la presente, se considera un ácido nucleico aislado. Los ácidos nucleicos modificados genéticamente se pueden generar utilizando técnicas de clonación molecular o síntesis química de ácidos nucleicos. Un ácido nucleico aislado de origen no natural puede ser independiente de otras secuencias, o incorporarse en un vector, un plásmido de replicación autónoma, un virus (por ejemplo, un retrovirus, adenovirus o virus del herpes) o el ADN genómico de un procariota o eucariota. Además, un ácido nucleico no natural puede incluir una molécula de ácido nucleico que es parte de una secuencia de ácido nucleico híbrida o de fusión.

Como se describe en la presente, un ácido nucleico puede tener una secuencia de nucleótidos con al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos COMT representativa. Por ejemplo, como se describe en la presente, una secuencia de nucleótidos puede tener al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 91, al menos 92, al menos 93, al menos 94, al menos 95, al menos 96, al menos 97, al menos 98 o al menos 99 por ciento de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos COMT de origen natural representativa como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 6-8, 9-15 y 32524. En algunos casos, una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal como se define en la presente de acuerdo con la presente invención puede tener una mutación inducida dentro de una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 6-8 y 9-15, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90% (por ejemplo, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%) de identidad para cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 6-8 y 9-15.

El porcentaje de identidad de secuencia entre una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico particular y una secuencia referenciada por un número de identificación de secuencia particular se determina de la siguiente manera. En primer lugar, se compara una secuencia de ácido nucleico o aminoácidos con la secuencia establecida en un número de identificación de secuencia particular utilizando el programa BLAST 2 Sequences (B12seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene BLASTN versión 2.0.14 y BLASTP versión 2.0.14. Esta versión independiente de BLASTZ se puede obtener en línea en fr.com/blast o en ncbi.nlm.nih.gov. Las instrucciones que explican cómo usar el programa B12seq se pueden encontrar en el archivo Léame que acompaña a BLASTZ. B12seq realiza una comparación entre dos secuencias utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácido nucleico, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. Para comparar dos secuencias de ácido nucleico, las opciones se establecen de la siguiente manera: -i se establece en un archivo que contiene la primera secuencia de ácido nucleico a comparar (por ejemplo, C:\seql.txt); -j se establece en un archivo que contiene la segunda secuencia de ácido nucleico a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece en blastn; -o se establece en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); -q se establece en -1; -r se establece en 2; y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias: C:\B12seq -i c:\seql.txt -j c:\seq2.txt -p blastn -o c:\output.txt -q -1 -r 2. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de B12seq se establecen de la siguiente manera: -i se establece en un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácido a comparar (por ejemplo, C:\seql.txt); -j se establece en un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácido a comparar (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece en blastp; -o se establece en cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las demás opciones se dejan en su configuración predeterminada. Por ejemplo, se puede utilizar el siguiente comando para generar un archivo de salida que contenga una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\B12seq -i c:\seql.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida designado presentará esas regiones de homología como secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas.

Una vez alineados, el número de coincidencias se determina contando el número de posiciones donde se presenta un residuo de nucleótido o aminoácido idéntico en ambas secuencias. El porcentaje de identidad de secuencia se determina dividiendo el número de coincidencias ya sea por la longitud de la secuencia establecida en la secuencia identificada (por ejemplo, SEQ ID NO:1), o por una longitud articulada (por ejemplo, 100 nucleótidos consecutivos o residuos de aminoácidos de una secuencia establecida en una secuencia identificada), seguido de multiplicar el valor resultante por 100. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene 700 coincidencias cuando se alinea con la secuencia establecida en la SEQ ID NO:1 es 63,8 por ciento idéntica a la secuencia establecida en la SEQ ID NO:1 (es decir, 700 / 1098 x 100 = 63,8). Se observa que el valor de porcentaje de identidad de secuencia se redondea a la décima más cercana. Por ejemplo, 75,11, 75,12, 75,13 y 75,14 se redondea a 75,1, mientras que 75,15, 75,16, 7,17, 75,18 y 7,19 se redondea a 7,2. También se observa que el valor de longitud siempre será un número entero.

Los métodos de la presente invención implican la administración de reactivos de modificación genética del genoma a células vegetales de alfalfa. Se puede utilizar cualquier método adecuado para introducir el ácido nucleico en células vegetales. En algunas realizaciones, por ejemplo, un método como se describe en la presente puede incluir poner en contacto una célula vegetal con un organismo que es capaz de transferencia génica horizontal (por ejemplo, una bacteria, tal como una Agrobacterium), donde el organismo contiene un plásmido Ti o Ri, o plásmido de a DN-T que tiene una región de ADN-T que incluye el promotor, UTR, secuencia codificante y una cola poli-A. Los métodos para la transformación mediada por Agrobacterium en la alfalfa se describen en otra parte (véase, por ejemplo, Tohidfar et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 113:227-235, 2013.) Un método para introducir reactivos de edición del genoma como se describe en la presente puede incluir transformación biolística, transformación mediada por electroporación o transformación mediada por polietilenglicol de células vegetales de alfalfa (por ejemplo, protoplastos. Los protoplastos se pueden obtener a partir de tejido de hipocotilo o de hoja. Las plantas que contienen mutaciones o ADN de nucleasa TALE se pueden regenerar utilizando protocolos de regeneración de plantas estándar. Véase, por ejemplo, Atanassov et al., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 3:149-162, 1984.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente pueden incluir determinar el nivel y la composición de lignina en la alfalfa. Se pueden emplear varios métodos para medir los niveles y la composición de lignina, incluidos los métodos de tinción de Maule, fibra de detergente ácido, lignina de detergente ácido, Klason, permanganato y lignina de bromuro de acetilo. Los detalles sobre estos métodos se proporcionan en otra parte (véase, por ejemplo, Hatfield y Fukushima, Crop Science, 45:832-839, 2005). Para el método de tinción de Maule, véase, Guo et al., Plant Cell, 13: 73 88, 2001 and Mitra and Loque Journal of visualized experiments, 87: 51381, 2014. Para el método de Klason, véase, Lin and Dence, Methods in Lignin Chemistry, 217-232, 1992. La tioacidólisis se puede utilizar para estimar la abundancia relativa y el rendimiento total de monolignoles S, G y H unidos por p-O-4. Véase, por ejemplo, Foster et al., J Vis Exp, 37:5-8, 2010; y Wang et al., Proc Natl Acad Sci USA, 107:22338-22343). Por ejemplo, las muestras se pueden hacer reaccionar con eterato de BF3 en una mezcla de dioxano/etanotiol. A continuación, los monómeros de lignina individuales se pueden evaluar mediante espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC/MS) y cuantificar mediante cromatografía de gases. Una reducción en el contenido de S-lignina dentro de una planta mutante COMT puede sugerir que las mutaciones COMT reducen la conversión de 5-hidroxiconiferaldehído en sinapaldehído, lo que posteriormente da como resultado plantas con S-lignina reducida.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente pueden incluir identificar la edición de genes prevista. Se pueden emplear varios medios para identificar la inserción objetivo-deseada. Un medio es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que los cebadores se diseñan para amplificar el ADN que abarca el sitio diana de la nucleasa TALE. El producto de PCR se puede clonar y secuenciar utilizando técnicas estándar de secuenciación de ADN para verificar la mutagénesis dirigida exitosa.

Tal como se usa en la presente, las secuencias de aminoácidos siguen la nomenclatura estándar de una sola letra o tres letras. Todas las secuencias de proteínas o péptidos se muestran en formato convencional donde el extremo N aparece a la izquierda y el grupo carboxilo en el extremo C a la derecha. La nomenclatura de aminoácidos, tanto de una sola letra como de tres letras, para los aminoácidos naturales es la siguiente: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C), ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G), histidina (His; H), leucina (Leu; L), isoleucina (Ile; I), lisina (Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V).

Tal como se usa en la presente, "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula vegetal y/o una parte de planta regenerada que comprende una mutación de origen no natural en el gen de la COMT derivado de una planta ancestral. La progenie puede contener mutaciones de origen no natural en uno, dos, tres o cuatro de los alelos de la COMT.

El término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un gen en un locus particular. En una célula diploide (o anfidiploide) de un organismo, los alelos de un gen dado se encuentran en una ubicación o locus específico en un cromosoma. Un alelo está presente en cada cromosoma del par de cromosomas homólogos. Los alelos "heterocigotos" son dos alelos diferentes que residen en un locus específico, posicionados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos. Los alelos "homocigotos" son dos alelos idénticos que residen en un locus específico, posicionados individualmente en pares correspondientes de cromosomas homólogos en la célula. Tal como se usa en la presente, "retrocruzamiento" se refiere a un cruzamiento repetitivo de plantas híbridas, donde, por ejemplo, un híbrido de primera generación se cruza de nuevo con uno de los progenitores de la progenie híbrida. El retrocruzamiento se puede utilizar para transferir uno o más loci de un fondo genético a un fondo genético diferente.

Tal como se usa en la presente, "cruce" se refiere al apareamiento de dos plantas progenitoras, en donde el polen de uno de los progenitores se transfiere al estigma del segundo progenitor. El cruce se puede utilizar para transferir uno o más alelos específicos a una planta diferente con un fondo genético diferente. El cruce se puede utilizar para crear una población de plantas de alfalfa con un rasgo deseado, en donde la población comprende plantas de alfalfa con diferentes antecedentes genéticos. Aquí, las plantas de alfalfa que comprenden diferentes antecedentes genéticos se cruzan con plantas que comprenden un alelo que produce un rasgo deseado. El cruce, el retrocruzamiento y la cría se pueden llevar a cabo mediante procedimientos conocidos. Se pueden utilizar huellas dactilares de ADN, SNP o tecnologías similares en un programa de reproducción de selección asistida por marcadores (MAS) para transferir o reproducir alelos de la COMT mutantes en otras plantas de alfalfa. Por ejemplo, un fitomejorador puede crear poblaciones segregantes a partir de hibridaciones de un genotipo que contiene un alelo mutante con un genotipo agronómicamente deseable. Las plantas en las generaciones F2 o retrocruzadas se pueden analizar utilizando marcadores desarrollados a partir de secuencias COMT o fragmentos de estas. Las plantas identificadas como poseedoras del alelo mutante se pueden retrocruzar o autopolinizar para crear una segunda población a analizar. Dependiendo del patrón de herencia esperado o de la tecnología MAS utilizada, puede ser necesario autopolinizar las plantas seleccionadas antes de cada ciclo de retrocruzamiento para ayudar a la identificación de las plantas individuales deseadas. El retrocruzamiento u otro procedimiento de reproducción se puede repetir hasta que se recupere el fenotipo deseado del progenitor recurrente. El resultado de un programa de fitomejoramiento que utiliza las plantas de alfalfa mutantes descritas en la presente puede ser líneas y variedades nuevas y útiles. Tal como se usa en la presente, el término "variedad" se refiere a una población de plantas que comparten características constantes que las separan de otras plantas de la misma especie. Con respecto a la alfalfa, una variedad puede referirse a una población de alfalfa con diferentes antecedentes genéticos. Una variedad a menudo, aunque no siempre, se vende comercialmente. Si bien posee uno o más rasgos distintivos, una variedad puede caracterizarse además por una variación general muy pequeña entre los individuos dentro de esa variedad. Se puede crear una variedad de "línea pura" mediante varias generaciones de autopolinización y selección, o propagación vegetativa a partir de un solo progenitor utilizando técnicas de cultivo tisular o celular. Una variedad puede derivarse esencialmente de otra línea o variedad. Según lo definido por la Convención Internacional para la Protección de Nuevas Variedades de Plantas (2 de diciembre de 1961, revisada en Ginebra el 10 de noviembre de 1972, el 23 de octubre de 1978 y el 19 de marzo de 1991), una variedad es "esencialmente derivada" de una variedad inicial si: a) se deriva predominantemente de la variedad inicial, o de una variedad que se deriva predominantemente de la variedad inicial, conservando la expresión de las características esenciales que resultan del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial; b) es claramente distinguible de la variedad inicial; y c) excepto por las diferencias que resultan del acto de derivación, se ajusta a la variedad inicial en la expresión de las características esenciales que resultan del genotipo o combinación de genotipos de la variedad inicial. Las variedades esencialmente derivadas se pueden obtener, por ejemplo, mediante la selección de un mutante natural o inducido, una variante somaclonal, un individuo variante de plantas de la variedad inicial, retrocruzamiento o transformación. Una "línea", a diferencia de una variedad, a menudo denota un grupo de plantas utilizadas de forma no comercial, por ejemplo, en la investigación de plantas. Una línea generalmente muestra poca variación general entre individuos para uno o más rasgos de interés, aunque puede haber alguna variación entre individuos para otros rasgos.

Tal como se usa en la presente, el término "explante" se refiere a una sección de células vegetales o partes de plantas que se toman de una planta donante y se usan para el cultivo.

Tal como se usa en la presente, el término "Digestibilidad de Fibra Detergente Neutra" o "NDFD" se refiere a la digestibilidad de una fibra de forraje. La NDFD se puede medir in vitro y predecir utilizando técnicas como la espectroscopia de reflectancia del infrarrojo cercano. La NDFD también se puede medir incubando forrajes con líquido ruminal durante un período de tiempo específico. Un valor alto de NDFD indica un forraje más digerible, mientras que un valor bajo de NDFD indica un forraje menos digerible.

El término "contenido reducido de lignina" se refiere a cualquier reducción en la cantidad de lignina en una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal generada por un método descrito en la presente, en comparación con la cantidad de lignina en una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el contenido de lignina se puede reducir en al menos 3% (por ejemplo, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90%), en comparación con el contenido de lignina en una planta, parte de planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente.

El término "unidades de siringilo (S) reducido" se refiere a cualquier reducción en las unidades de siringilo (S) en una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal generada por un método descrito en la presente, en comparación con las unidades de siringilo (S) en una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el contenido de unidades de siringilo (S) se puede reducir en al menos 3% (por ejemplo, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90%), en comparación con el contenido de unidades de siringilo (S) en una planta, parte de planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente.

El término "NDFD aumentada" se refiere a cualquier aumento en el nivel de NDFD en una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal generada por un método descrito en la presente, en comparación con la cantidad de NDFD en una planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente. En algunas realizaciones, el contenido de NDFD se puede aumentar en al menos 3% (por ejemplo, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90%), en comparación con el nivel de NDFD en una planta, parte de planta o célula vegetal de tipo silvestre correspondiente.

El término "mutación inducida", tal como se usa en la presente, se refiere a una mutación introducida por intervención humana. Una "mutación inducida" puede ser una mutación que se introdujo usando una nucleasa específica de secuencia, por ejemplo. En algunos casos, la nucleasa específica de secuencia utilizada para inducir una mutación puede ser una meganucleasa, una nucleasa TALE, una nucleasa con dedos de zinc o una repetición palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada/nucleasa del sistema CRISPR/Cas asociada a CRISPR. En algunos casos, una "mutación inducida" puede ser una mutación que se introdujo usando una sustancia química, tal como etilmetilsulfonato (EMS) o etilnitrosourea (ENU). Además, una "mutación inducida" puede ser una mutación que se introdujo usando radiación ionizante, tal como radiación de neutrones (por ejemplo, mutagénesis de neutrones rápida), rayos gamma o rayos X.

"Tipo silvestre", como se usa en la presente, se refiere a una forma típica de una planta o un gen como ocurre más comúnmente en la naturaleza. Por ejemplo, un "alelo de la COMT de tipo silvestre" es un alelo de la COMT de origen natural (por ejemplo, como se encuentra dentro de las plantas de alfalfa de origen natural) que codifica una proteína COMT funcional, mientras que un "alelo de la COMT mutante" es un alelo de la COMT que no codifica una proteína COMT funcional o codifica una proteína COMT atenuada. Tal "alelo de COMT mutante" puede incluir una o más mutaciones en su secuencia de ácido nucleico, donde la mutación o mutaciones dan como resultado una cantidad no detectable de proteína COMT funcional en la planta o célula vegetal in vivo.

Tal como se usa en la presente, el término "variante funcional" pretende hacer referencia a un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína. Tal mutante puede tener el mismo nivel de actividad, o un nivel de actividad más alto o más bajo en comparación con la proteína original o el dominio de proteína.

Tal como se usa en la presente, "secuencia de localización nuclear'' y "NLS" y "etiqueta NLS" se refieren a una secuencia de aminoácidos que facilita el tránsito hacia el núcleo de la célula vegetal. La secuencia de localización nuclear y la NLS y la etiqueta NLS también pueden referirse a la secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que facilita el tráfico al núcleo de la célula vegetal. Las proteínas Argonauta y Ago pueden contener etiquetas NLS. La etiqueta NLS se puede ubicar dentro de la secuencia de proteínas Argonauta y Ago. La etiqueta NLS se puede agregar al extremo C, al extremo N o a la porción central de la proteína Argonauta y Ago. Preferentemente, la etiqueta NLS está cerca del extremo N de la proteína Argonauta y Ago.

Tal como se usa en la presente, el término aminoácidos "polares no cargados" incluye glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. El término aminoácidos "no polares" incluye alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. El término aminoácidos "polares cargados" incluye ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina e histidina.

Tal como se usa en la presente, "ácido desoxirribonucleico" y "ADN" se refieren a un biopolímero que comprende cuatro nucleótidos unidos entre sí por puentes fosfodiéster. Los cuatro nucleótidos incluyen dAMP (2'-desoxiadenosina-5-monofosfato), dGMP (2'-desoxiguanosina-5-monofosfato), dCMP (2'-desoxicitosina-5-monofosfato) y dTMP (2'-desoxitimosina-5-monofosfato).

Tal como se usa en la presente, el término "codón" se refiere a tripletes de nucleótidos que codifican aminoácidos. Debido a la redundancia del código genético, el mismo aminoácido puede ser codificado por diferentes codones. La siguiente es una lista de aminoácidos y sus respectivos codones: Met (ATG); Glu (GAA, GAG); Val (GTA, GTC, GTG, GTT); Arg (CGA, CGC, CGG, CGT, AGA, AGG); Leu (CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG); Ser (TCA, TCC, TCG, TCT, AGC, AGT); Thr (ACA, ACC, ACG, ACT); Pro (CCA, CCC, CCG, CCT); Ala (GCT, GCA, GCC, GCG); Gly (GGA, GGC, GGG, GGT); Ile (ATA, ATC, ATT); Lys (AAA, AAG); Asn (AAC, AAT); Gln (CAG, CAA); His (CAC, CAT); Asp (GAC, GAT); Tyr (TAC, TAT); Cys (TGC, TGT); Phe (TTC, TTT); y Trp (UGG).

Tal como se usa en la presente, los términos "planta" y "parte de planta" se refieren a células, tejidos, órganos, semillas y partes cortadas (por ejemplo, raíces, tallos, hojas y flores) que conservan las características distintivas de la planta original. "Semilla" se refiere a cualquier estructura vegetal que se forma por la diferenciación continua del óvulo de la planta, siguiendo su punto de maduración normal en la apertura de la flor, independientemente de si se forma en presencia o ausencia de fertilización e independientemente de si la estructura de la semilla es fértil o infértil.

Como se menciona en la presente, "secuencia codificante" o "CDS" se refiere a ADN que alberga la información necesaria que se requiere para producir un ARN o proteína funcional. La secuencia codificante o CDS puede incluir una secuencia de ADN que comienza con ATG y termina con un codón de terminación. La secuencia codificante o CDS generalmente no contiene intrones, si no se requieren intrones para producir el ARN o proteína funcional.

El término "endonucleasas de corte raro" en la presente se refiere a proteínas naturales o modificadas genéticamente que tienen actividad endonucleasa dirigida a secuencias de ácido nucleico que tienen una secuencia de reconocimiento (secuencia diana) de aproximadamente 12-40 pb de longitud (por ejemplo, 14-40 pb de longitud). Las endonucleasas de corte raro típicas causan escisión dentro de su sitio de reconocimiento, dejando un corte escalonado de 4 nt con salientes de 3 OH o 5'OH. Estas endonucleasas de corte raro pueden ser meganucleasas, tales como proteínas de tipo silvestre o variantes de endonucleasas de asentamiento, más particularmente pertenecientes a la familia de dodecapéptidos (LAGLIDADG (SEQ ID NO:32523; véase, WO 2004/067736) o pueden resultar de proteínas de fusión que asocian un dominio de unión a ADN y un dominio catalítico con actividad de escisión. Las endonucleasas efectoras TAL y las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son ejemplos de fusiones de dominios de unión a ADN con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI. Las endonucleasas efectoras TAL personalizadas están disponibles comercialmente con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, París, Francia). Para una revisión de endonucleasas de corte raro, véase Baker, Nature Methods 9:23-26, 2012.

Como se menciona en la presente, "planta" puede referirse a plantas de cultivo, o monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de plantas de cultivo incluyen semillas de soja, trigo, alfalfa, papa, arroz, maíz, mijo, cebada, tomate, manzana, pera, fresa, naranja, sandía, pimiento, zanahoria, remolacha azucarera, ñame, lechuga, espinaca, girasol y colza, una planta con flores, como petunia, rosa y crisantemo, coníferas y pinos, una planta utilizada en fitorremediación (por ejemplo, plantas que acumulan metales pesados) y una planta utilizada con fines experimentales (por ejemplo, Arabidopsis). La planta puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. Los ejemplos de monocotiledóneas incluyen, pero no se limita a trigo, maíz, arroz, orquídeas, cebolla, áloe, lirios verdaderos, hierbas (por ejemplo, setaria), arbustos y árboles leñosos (por ejemplo, palmeras y bambú) y plantas alimenticias tales como piña y caña de azúcar. Los ejemplos de dicotiledóneas incluyen, pero no se limita a tomate, yuca, soja, tabaco, papa, Arabidopsis, rosa, pensamiento, girasol, uva, fresa, calabaza, frijol, guisante y maní. Las ordenes de dicotiledóneas incluyen Magniolales, Illiciales, Laurales, Piperales, Aristochiales, Nymphaeales, Ranunculales, Papeverales, Sarraceniaceae, Trochodendrales, Hamamelidales, Eucomiales, Leitneriales, Myricales, Fagales, Casuarinales, Caryophyllales, Batales, Polygonales, Plumbaginales, Dilleniales, Theales, Malvales, Urticales, Lecythidales, Violates, Salcicales, Capparales, Ericales, Diapensales, Ebenales, Primulales, Rosales, Fabales, Podostemales, Haloragales, Myrtales, Cornales, Proteales, Santalales, Rafflesiales, Celastrales, Euphorbiales, Rhamnales, Sapindales, Juglandales, Geraniales, Polygalales, Umbellales, Gentianales, Polemoniales, Lamiales, Plantaginales, Scrophulariales, Camapnulales, Rubiales, Dipsacales y Asterales. Los géneros de dicotiledóneas incluyen Atropa, Alseodaphne, Anacardium, Arachis, Beilschmiedia, Brassica, Carthamus, Cocculus, Croton, Cucumis, Citrus, Citrullus, Capsicum, Catharanthus, Cocos, Coffea, Cucurbita, Daucus, Duguetia, Eschscholzia, Ficus, Fragaria, Galucium, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hyoscyamus, Lactuca, Landolphia, Linum, Litsea, Lycopersicon, Lupinus, Manihot, Majorana, Malus, Medicago, Nicotiana, Olea, Parthenium, Papaver, Persea, Phaseolus, Pistacia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Senecio, Sinomenium, Stephania, Sinapsis, Solanum, Theobroma, Trifolium, Trigonella, Vicia, Vinca, Vilis y Vigna. Las ordenes de monocotiledóneas incluyen Alismatales, Hydrocharitales, Najadales, Triuridales, Commelinales, Eriocaulales, Restionales, Poales, Juncales, Cyperales, Typhales, Bromeliales, Zingiberales, Arecales, Cyclanthales, Pandanales, Arales, Lilliales y Orchid ale. Los géneros de monocotiledóneas incluyen Allium, Andropogon, Aragrostis, Asparagus, Avena, Cynodon, Elaeis, Festuca, Festulolium, Heterocallis, Hordeum, Lemna, Lolium, Musa, Oryza, Panicum, Pannesetum, Phleum, Poa, Secale, Sorghum, Triticum y Zea. Otras plantas incluyen Gymnospermae, tal como las ordenes Pinales, Ginkgoales, Cycadales y Cmetales, como los géneros Abies, Cunninghamia, Picea, Pinus y Pseudotsuga, tal como el abeto y el pino.

"Mutagénesis", como se usa en la presente, se refiere a procesos en los que se introducen mutaciones en una secuencia de ADN seleccionada. Las mutaciones inducidas por endonucleasas generalmente se obtienen mediante una ruptura bicatenaria, que da como resultado mutaciones de inserción/deleción ("indeles") que pueden detectarse mediante análisis de secuenciación profunda. Tales mutaciones típicamente son deleciones de varios pares de bases y tienen el efecto de inactivar el alelo mutado. En los métodos descritos en la presente, por ejemplo, la mutagénesis se produce a través de roturas de ADN bicatenario realizadas por nucleasas dirigidas a secuencias de ADN seleccionadas en una célula vegetal. Tal mutagénesis da como resultado "mutaciones inducidas por nucleasas" (por ejemplo, inactivaciones inducidas por nucleasas, tales como inactivaciones inducidas por nucleasas TALE) y expresión reducida del gen diana. Después de la mutagénesis, las plantas se pueden regenerar a partir de las células tratadas usando técnicas conocidas (por ejemplo, plantando semillas de acuerdo con procedimientos de cultivo convencionales, seguido de autopolinización).

Los métodos para seleccionar secuencias diana endógenas y generar pares de nucleasas TALE dirigidas a tales secuencias se pueden realizar como se describe en otra parte. Véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 2011/072246. En algunas realizaciones, se puede utilizar el software que identifica específicamente los sitios de reconocimiento de nucleasas TALE, tal como TALE-NT 2.0 (Doyle et al., Nucl Acids Res 40:W117-122, 2012).

Los efectores de tipo activador de la transcripción (TAL) se encuentran en bacterias patógenas de plantas del género Xanthomonas. Estas proteínas desempeñan funciones importantes en la enfermedad, o desencadenan la defensa, al unirse al ADN del huésped y activar los genes del huésped específicos del efector (véase, por ejemplo, Gu et al., Nature 435:1122-1125, 2005; Yang et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:10503-10508, 2006; Kay et al., Science 318:648-651,2007; Sugio et al., Proc Natl Acad Sci USA 104:10720-10725, 2007; and Romer et al., Science 318:645-648, 2007). La especificidad depende de una cantidad variable efectora de repeticiones imperfectas, típicamente de 34 aminoácidos (Schornack et al., J Plant Physiol 163:256-272, 2006; y WO 2011/072246). Los polimorfismos están presentes principalmente en las posiciones de repetición 12 y 13, que se denominan residuos variables de repetición (RVD).

Los RVD de los efectores TAL corresponden a los nucleótidos en sus sitios diana de forma directa y lineal, un RVD a un nucleótido, con cierta degeneración y sin dependencia aparente del contexto. Este mecanismo para el reconocimiento de proteína-ADN permite la predicción del sitio objetivo para nuevos efectores TAL específicos del objetivo, así como la selección del sitio objetivo y la ingeniería de nuevos efectores TAL con especificidad de unión para los sitios seleccionados.

Los dominios de unión al ADN efector TAL se pueden fusionar a otras secuencias, tales como secuencias de endonucleasas, dando como resultado endonucleasas quiméricas dirigidas a secuencias de ADN específicas y seleccionadas, y que conducen al corte posterior del ADN en o cerca de las secuencias dirigidas. Tales cortes (es decir, rupturas bicatenarias) en el ADN pueden inducir mutaciones en la secuencia de ADN de tipo silvestre mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o recombinación homóloga, por ejemplo. En algunos casos, las nucleasas TALE se pueden utilizar para facilitar la mutagénesis dirigida al sitio en genomas complejos, eliminando o alterando de otro modo la función génica con gran precisión y alta eficiencia. Como se describe en los siguientes Ejemplos, las nucleasas TALE dirigidas a los alelos de la COMT de alfalfa se pueden utilizar para mutagenizar los alelos endógenos, dando como resultado plantas sin expresión detectable (o expresión reducida) de COMT. El hecho de que algunas endonucleasas (por ejemplo, FokI) funcionen como dímeros se puede utilizar para mejorar la especificidad objetivo de la nucleasa TALE. Por ejemplo, en algunos casos se puede utilizar un par de monómeros de nucleasa TALE dirigidos a diferentes secuencias de ADN. Cuando los dos sitios de reconocimiento de nucleasas TALE están muy cerca, los monómeros inactivos pueden unirse para crear una enzima funcional que escinde el ADN. Al requerir la unión al ADN para activar la nucleasa, se puede crear una enzima de restricción altamente específica del sitio.

Los métodos para usar nucleasas TALE para generar plantas de alfalfa, células vegetales o partes de plantas que tienen mutaciones en genes endógenos incluyen, por ejemplo, los descritos en los Ejemplos de la presente. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos que codifican nucleasas TALE dirigidas a secuencias de nucleótidos conservadas presentes en uno o más alelos de la COMT pueden transformarse en células vegetales o partes de plantas, donde pueden expresarse. En algunos casos, se pueden introducir una o más proteínas nucleasa TALE en células vegetales o partes de plantas. Las células o partes de la planta, o una línea celular vegetal o parte de la planta generada a partir de las células, se pueden analizar posteriormente para determinar si se han introducido mutaciones en el sitio o sitios diana, a través de técnicas de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, 454 pirosecuenciación o secuenciación Illumina) o métodos de secuenciación convencionales (por ejemplo, secuenciación Sanger). El molde para la secuenciación puede ser, por ejemplo, el sitio diana de nucleasa TALE dentro de una secuencia génica de COMT que se amplifica mediante PCR usando cebadores que son homólogos a secuencias de nucleótidos conservadas en todos los alelos de COMT.

Los sistemas guiados por ARN también se pueden utilizar en los métodos proporcionados en la presente. Por ejemplo, los sistemas CRISPR/Cas utilizan ARN para dirigir la escisión del ADN (véase, por ejemplo, Belahj et al., Plant Methods 9:39, 2013). Este sistema consiste en una endonucleasa Cas9 y un ARN guía (ya sea un complejo entre un ARN CRISPR [ARNcr] y un ARNcr transactivador [ARNtracr], o una fusión sintética entre el extremo 3' del ARNcr y el extremo 5' del ARNtracr). El ARN guía dirige la unión a Cas9 y la escisión del ADN a secuencias que son adyacentes a un motivo adyacente protoespaciador (PAM; por ejemplo, NGG para Cas9 de Streptococcus pyogenes). Una vez en la secuencia de ADN diana, Cas9 genera una ruptura de doble cadena de ADN en una posición a tres nucleótidos del extremo 3' de la secuencia de ARNcr que es complementaria a la secuencia diana. Como hay varios motivos PAM presentes en la secuencia de nucleótidos de los alelos de la COMT, el sistema CRISPR/Cas puede emplearse para introducir mutaciones dentro de los alelos de la COMT dentro de las células vegetales de alfalfa en las que se transfectan y expresan la endonucleasa Cas9 y el ARN guía. Este enfoque se puede utilizar como una alternativa a las nucleasas TALE en algunos casos, para obtener plantas y partes de plantas como se describe en la presente.

El término "expresión", tal como se usa en la presente, se refiere a la transcripción de una secuencia de ácido nucleico particular para producir ARN o ARNm sentido o antisentido, y/o la traducción de una molécula de ARNm para producir un polipéptido, con o sin eventos postraduccionales posteriores.

El término "modular", tal como se usa en la presente, se refiere a aumentar o disminuir la eficiencia de traducción de un ARNm. Esto se puede lograr insertando, eliminando o alterando una secuencia 5' UTR, una secuencia 3' UTR o secuencias 5' y 3' UTR.

Tal como se usa en la presente, el término "ácido nucleico" se refiere a un polímero compuesto por monómeros de nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, y puede ser lineal o circular. Cuando es monocatenario, un ácido nucleico puede ser una cadena sentido o una cadena antisentido. Un ácido nucleico puede estar compuesto de ADN (por ejemplo, ADNc, ADN genómico, ADN sintético o una combinación de estos), ARN o ADN y ARN. Además, los ácidos nucleicos pueden contener información para la expresión génica, que incluye, pero no se limita a promotores, UTR 5', UTR 3', secuencias codificantes y terminadores.

Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ADN para provocar la replicación del segmento insertado. En general, un vector es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados. Los esqueletos de vectores adecuados incluyen, por ejemplo, los utilizados rutinariamente en la técnica, tales como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BAC, YAC o<p>A<c>. El término "vector" incluye vectores de clonación y expresión, así como vectores virales y vectores de integración. Un "vector de expresión" es un vector que incluye una o más secuencias de control de expresión, y una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y/o traducción de otra secuencia de ADN. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limita a plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófagos, baculovirus, virus del mosaico del tabaco, virus del herpes, citomegalovirus, retrovirus, virus vaccinia, adenovirus y virus adenoasociados. Numerosos vectores y sistemas de expresión están disponibles comercialmente de corporaciones como Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

Los términos "región reguladora", "elemento de control" y "secuencia de control de expresión" se refieren a secuencias de nucleótidos que influyen en el inicio y la velocidad de transcripción o traducción, y la estabilidad y/o movilidad del transcrito o producto polipeptídico. Las regiones reguladoras incluyen, pero no se limita a secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteínas, elementos inducibles, elementos de control del promotor, secuencias de unión a proteínas, UTR 5' y 3', sitios de inicio de la transcripción, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, intrones y otras regiones reguladoras que pueden residir dentro de secuencias codificantes, tales como señales secretoras, secuencias de localización nuclear (NLS) y sitios de escisión de proteasas.

Tal como se usa en la presente, "unido operativamente" significa incorporado en una construcción genética de modo que las secuencias de control de la expresión controlan eficazmente la expresión de una secuencia codificante de interés. Una secuencia codificante está "unida operativamente" y "bajo el control" de secuencias de control de expresión en una célula cuando la ARN polimerasa es capaz de transcribir la secuencia codificante en ARN, que si es un ARNm, entonces puede traducirse en la proteína codificada por la secuencia codificante. Por lo tanto, una región reguladora puede modular, por ejemplo, regular, facilitar o impulsar, la transcripción en la célula vegetal, planta o tejido vegetal en el que se desea expresar un ácido nucleico diana modificado.

Los métodos proporcionados en la presente incluyen regenerar plantas de alfalfa a partir de la población de células vegetales. Los métodos también pueden incluir la reproducción de la planta (por ejemplo, la planta en la que se introdujeron los ácidos nucleicos, o la planta obtenida después de la regeneración de la parte de la planta o la célula vegetal utilizada como material de partida) para obtener un linaje vegetal genéticamente deseado. Los métodos para regenerar y reproducir plantas están bien establecidos en la técnica.

La invención se describirán adicionalmente en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Diseño de nucleasas TALE dirigidas a COMT en Medicago sativa

Para identificar secuencias diana potenciales para nucleasas TALE, se secuenciaron regiones dentro del gen de la COMT. Se diseñó un primer par de cebadores de PCR para reconocer y amplificar una región que abarca el primer exón de COMT (TABLA 1). Se diseñó un segundo par de cebadores de PCR para reconocer y amplificar una región que abarca los exones segundo a cuarto de COMT.

Tabla 1

Se extrajo ADN de la variedad SW 8421-S de Medicago sativa. Debido a la tendencia a la heterocigosidad dentro de las variedades de alfalfa, se aislaron muestras de tejido de quince plantas individuales de la variedad SW 8421-S. El ADN se preparó utilizando métodos estándar basados en CTAB (Murray and Thompson, Nucl Acids Res, 8:4321- 4325, 1980). Los cebadores que se muestran en la TABLA 1 se utilizaron para amplificar el gen de la COMT. Los amplicones de PCR resultantes se clonaron y secuenciaron. De cada planta, se generaron 16 clones de PCR totales (ocho clones de PCR para cada uno de los dos pares de cebadores). Se utilizó una secuencia de ARNm de COMT disponible públicamente como secuencia de referencia para el alineamiento (SEQ ID NO:1). Las secuencias se alinearon utilizando el algoritmo CLUSTALW y se dilucidó una secuencia de consenso para el locus COMT.

Se identificaron múltiples alelos en el extremo 5' del gen de la COMT utilizando los pares de cebadores CLSSL127 y CLSSL128. Las porciones secuenciadas del gen de la COMT, que comprenden SNP que definen alelos, se muestran en las FIGS. 2-8 y las SEQ ID NO:9-15.

Se diseñaron tres pares de nucleasas TALE para dirigirse a secuencias dentro del extremo 5' del gen de la COMT. Los tres pares de nucleasas TALE se denominaron MsCOMT_T01.1, MsCOMT_T02.1 y MsCOMT_T03.1. Los pares de nucleasas TALE y sus secuencias diana predichas se muestran en la TABLA 2. Los nucleótidos subrayados representan los sitios de unión a nucleasa TALE.

Tabla 2

Ejemplo 2 - Evaluación de la actividad de las nucleasas TALE dirigidas a COMT en Medicago sativa

Para evaluar la actividad de los pares de nucleasas TALE dirigidas a COMT, se realizó un experimento de transformación de protoplastos. Se aislaron protoplastos de alfalfa de hojas de plantas cultivadas in vitro. Las plantas se cultivaron in vitro durante 12 días antes de recolectar las hojas. Las hojas se digirieron en una solución enzimática que contenía celulasa al 2% y macerozima al 0,8%. La solución enzimática se colocó en una incubadora a 25 °C y se agitó a 35 rpm durante aproximadamente 16 horas. Después de la digestión, los protoplastos se aislaron utilizando técnicas convencionales de aislamiento de protoplastos. Específicamente, los protoplastos se filtraron a través de un colador de células de 100 pm en un tubo cónico de 50 mL. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 100 g durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se volvió a suspender en 10 mL de medio CPW-13. Los protoplastos se convirtieron en pellas mediante centrifugación a 100 g durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se volvió a suspender en 5 mL de medio CPW-13. Los protoplastos se transfirieron a un tubo de 15 mL que contenía 8 mL de sacarosa 0,55 M. Las muestras se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos. Los protoplastos en la parte superior del cojín de sacarosa se retiraron y se transfirieron a un nuevo tubo cónico de 50 mL que contenía 5 mL de CPW-13. Las células se centrifugaron a 100 g durante 5 min. El sobrenadante se retiró y las células se volvieron a suspender en 2 mL de CPW-13. Las células se contaron usando un hemocitómetro. Los protoplastos (150.000 por muestra) se transformaron en una solución que comprende polietilenglicol al 20% y 30 pg de ADN plasmídico codificado por nucleasa TALE (es decir, 15 pg de plásmido que codifica cada monómero de nucleasa TALE). Después de la transformación, las células se lavaron tres veces en CPW-13. Después de los tres lavados, las células se volvieron a suspender en solución de K8P y se incubaron a 28 °C. Dos días después de la transformación, se recogieron los protoplastos y se extrajo el ADN. Los sitios diana de nucleasa TALE se amplificaron mediante PCR y los amplicones resultantes se secuenciaron en profundidad utilizando secuenciación illumina.

Los tres pares de nucleasas TALE tuvieron actividad en sus secuencias diana predichas. La frecuencia de mutación (es decir, el número de secuencias mutantes dividido por el número total de secuencias) del par de nucleasas TALE McCOMT_T01.1 fue del 12,58%. La frecuencia de mutación del par de nucleasas TALE McCOMT_T02.1 fue del 15,95%. La frecuencia de mutación del par de nucleasas TALE McCOMT_T03.1 fue del 14,12%.

Las mutaciones de COMT dentro de las células de alfalfa se analizaron más a fondo. Se observaron tanto inserciones como deleciones, siendo la mayoría de las mutaciones deleciones. Con respecto al par de nucleasas TALE MsCOMT_T01.1, se observó que la mayoría de las mutaciones dieron como resultado la deleción del nucleótido en la posición 7 de 15 en el espaciador. Específicamente, con respecto al par de nucleasas TALE MsCOMT _T01.1, se observó una deleción de la citosina en la posición 29 de la SEQ ID NO:1 en la mayoría de las mutaciones. Con respecto al par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1, se observó que la mayoría de las mutaciones dieron como resultado la deleción del nucleótido en la posición 8 de 15 en el espaciador. Específicamente, con respecto al par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1, se observó una deleción de la timina en la posición 144 de la SEQ ID nO:1 en la mayoría de las mutaciones. Con respecto al par de nucleasas TALE MsCOMT_T03.1, se observó que la mayoría de las mutaciones dieron como resultado la deleción del nucleótido en la posición 7 de 15 en el espaciador. Específicamente, con respecto al par de nucleasas TALE MsCOMT_T03.1, una eliminación de la adenina en la posición 208 de la SEQ ID NO: 1 se observó en la mayoría de las mutaciones.

Se proporciona una lista de secuencias COMT que contienen mutaciones inducidas por nucleasa TALE, tanto inserciones como deleciones, que se identificaron dentro de las células de alfalfa mediante las SEQ ID NO: 16-32521. Específicamente, las secuencias COMT que contienen mutaciones inducidas por nucleasa TALE del par de nucleasas Tale MsCOMT _T01.1 son proporcionadas por las SEQ ID NO: 16-10038. Las secuencias de COMT que contienen mutaciones inducidas por nucleasa TALE del par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1 se establecen en las SEQ ID NO: 10039-22042. Las secuencias COMT que contienen mutaciones inducidas por nucleasa TALE del par de nucleasas Tale MsCOMT_T03.1 se establecen en las SEQ ID NO:22043-32521. Cualquiera de las mutaciones dentro de las SEQ ID NO:16-32521 se puede utilizar para crear una planta de alfalfa con menor contenido de lignina. Cualquiera de las mutaciones dentro de las SEQ ID NO: 16-32521, incluidas las mutaciones que dan como resultado cambios de marco, se pueden utilizar (introducidas en todos los alelos de la COMT) para crear una planta de alfalfa con menor contenido de lignina. Las mutaciones dentro de las SEQ ID NO: 16-32521 se pueden combinar en todos los alelos de la COMT para crear una planta de alfalfa con menor contenido de lignina.

Además de SW8421-S, las nucleasas TALE se transformaron en protoplastos de la variedad SW9337. Los protoplastos de ambas variedades se regeneraron durante aproximadamente 1 mes hasta que aparecieron callos visibles. Los callos se regeneraron a partir de protoplastos utilizando técnicas convencionales de regeneración de alfalfa; véase, por ejemplo, Monteiro et al., Scientia Agricola, 60:683-689, 2003; Kao et al., Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie, 96:135-141, 1980; Song et al., Plant Protoplasts and Genetic Engineering IV, 60-70, 1993; Johnson et al., Plant Sciences Letters, 1981. Se aislaron de tres a cinco callos diferentes de ambas variedades y se extrajo el ADN. El ADN se utilizó como plantilla en una PCR con cebadores diseñados para amplificar los sitios diana de nucleasa MsCOMT TALE correspondientes. Los amplicones resultantes se secuenciaron profundamente y se calculó la frecuencia de mutación (Tabla 3). Se observaron mutaciones en los sitios diana de la nucleasa MsCOMT TALE en callos de ambas variedades de alfalfa.

Tabla 3

Ejemplo 3 - Regeneración de plantas de alfalfa con mutaciones en COMT

Para regenerar plantas de alfalfa que comprenden mutaciones dentro del gen de la COMT, se transformaron protoplastos de las líneas SW8421-S y 9337 con ADN que codifica pares de nucleasas TALE funcionales y se regeneraron en plantas completas. Se aislaron protoplastos de alfalfa de tejidos de plantas cultivadas in vitro. Las plantas se cultivaron in vitro durante aproximadamente 1-2 semanas antes de recolectar el tejido. Las hojas se digirieron en una solución enzimática que contenía celulasa al 2% y macerozima al 0,8%. La solución enzimática se colocó en una incubadora a 25 °C y se agitó a 35 rpm durante aproximadamente 16 horas. Después de la digestión, los protoplastos se aislaron utilizando técnicas convencionales de aislamiento de protoplastos. Específicamente, los protoplastos se filtraron a través de un colador de células de 100 pm en un tubo cónico de 50 mL. Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 100 g durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y las pellas se volvieron a suspender en 10 mL de medio CPW-13. Los protoplastos se convirtieron en pellas mediante centrifugación a 100 g durante 5 minutos. El sobrenadante se retiró y el sedimento se volvió a suspender en 5 mL de medio CPW-13. Los protoplastos se transfirieron a un tubo de 15 mL que contenía 8 mL de sacarosa 0,55 M. Las muestras se centrifugaron a 1000 g durante 5 minutos. Los protoplastos en la parte superior del cojín de sacarosa se retiraron y se transfirieron a un nuevo tubo cónico de 50 mL que contenía 5 mL de CPW-13. Las células se centrifugaron a 100 g durante 5 min. El sobrenadante se retiró y las células se volvieron a suspender en 2 mL de CPW-13. Las células se contaron usando un hemocitómetro. Los protoplastos (150.000 por muestra) se transformaron en una solución que comprende polietilenglicol al 20% y 30 pg de ADN plasmídico codificado por nucleasa TALE (es decir, 15 pg de plásmido que codifica cada monómero de nucleasa TALE). Después de la transformación, las células se lavaron tres veces en CPW-13. Después de los tres lavados, las células se volvieron a suspender en solución de K8P y se incubaron a 28 °C.

Las plantas se regeneraron a partir de protoplastos utilizando técnicas convencionales de regeneración de alfalfa; véase, por ejemplo, Monteiro et al., Scientia Agricola, 60:683-689, 2003; Kao et al., Zeitschrift für Pflanzenphysiologie, 96:135-141, 1980; Song et al., Plant Protoplasts and Genetic Engineering IV, 60-70, 1993; Johnson et al., Plant Sciences Letters, Las plantas de alfalfa individuales que se regeneraron a partir de protoplastos se avanzaron después al cribado molecular.

Ejemplo 4 - Cribado de plantas de alfalfa con mutaciones en COMT

El ADN se extrajo de plantas de alfalfa utilizando métodos estándar basados en CTAB (Murray and Thompson, Nucl Acids Res, 8:4321- 4325, 1980). Cebador hacia adelante

TCTCACAAAAACCTCATCAATCAC (SEQ ID NO:32540) y el cebador inverso TTAGCAACAGTAGCCAAACC (SEQ ID NO:32541) se utilizaron en una PCR para amplificar el sitio diana de la nucleasa TALE correspondiente dentro del gen de la COMT. Los amplicones de DNA resultantes se clonaron y secuenciaron.

Se identificó una primera planta (designada como Ms491-1; no abarcada por la presente invención) para albergar deleciones en tres de los cuatro alelos de la COMT (FIG. 9). La planta Ms491-1, derivada de la línea 8421-S, se generó utilizando el par de nucleasas TALE MsCOMT _T01.1, que se une a la SEQ ID NO: 6. Los tres alelos mutantes albergaban deleciones de 5 pb (SEQ ID NO:32526), 10 pb (SEQ ID NO: 32527) y 13 pb (SEQ ID NO:32528).

Se identificó una segunda planta (designada como Ms492-2) para albergar deleciones en cuatro de los cuatro alelos de la COMT (FIG. 10). La planta Ms492-2, derivada de la línea 8421-S, se generó utilizando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1, que se une a la SEQ ID NO: 7. Los cuatro alelos mutantes albergaban deleciones de 16 pb (SEQ ID NO:32530), 11 pb (SEQ ID NO:32529), 10 pb (SEQ ID NO:32532) y 6 pb (SEQ ID NO:32531).

Se identificó una tercera planta (designada como Ms589-1) para albergar deleciones en cuatro de los cuatro alelos de la COMT (FIG. 11). La planta Ms589-1, derivada de la línea 9337, se generó usando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T03.1, que se une a la SEQ ID NO: 8. Los cuatro alelos mutantes albergaban deleciones de 12 pb (SEQ ID NO:32533), 30 pb (SEQ ID NO:32534), 20 pb (SEQ ID NO:32535) y 57 pb (SEQ ID NO:32536).

Se identificó una cuarta planta (designada como Ms553-1; no abarcada por la presente invención) para albergar deleciones en uno de los cuatro alelos de la COMT (FIG. 12). La planta Ms553-1, derivada de la línea 9337, se generó usando el par de nucleasas TALE MsCOMT_T02.1, que se une a la SEQ ID NO: 7. El alelo mutante albergaba una deleción de 10 pb (SEQ ID NO:32537).

Las plantas de alfalfa que contenían mutaciones en los alelos de la COMT avanzaron al análisis fenotípico. Las mutaciones pueden consistir en deleciones, sustituciones y/o inserciones.

Ejemplo 5 - Fenotipado de plantas de alfalfa mutantes de COMT para determinar el contenido de lignina

Las plantas de alfalfa que tienen mutaciones en los alelos de la COMT se evalúan para determinar el contenido de lignina y la composición de lignina. El contenido de lignina se evalúa utilizando el método de lignina de detergente ácido de AOAC (AOAC Official Method 973.18), o utilizando el método de bromuro de acetilo descrito en otra parte (Fukushima y Hatfield, J Agri Food Chem, 52: 3713-3720, 2004). Una disminución en el contenido total de lignina sugiere que las mutaciones en COMT pueden dar como resultado plantas de alfalfa con lignina reducida.

Se utilizó el método de tinción de Maule adaptado de Mitra y Loque (J Visualized Experiments, 87: 51381, 2014) para evaluar la composición de lignina. En resumen, los tallos de plantas de alfalfa de cinco semanas de edad se cortaron a mano y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Después de agregar 1 ml de la solución de permanganato de potasio al 0,5% (almacenada en una botella oscura a temperatura ambiente) al tubo que contenía las secciones, la solución se mezcló pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo sin alterar las secciones. Una vez que todas las secciones se asentaron, se extrajeron 700 pl de solución de permanganato de potasio al 0,5% usando una pipeta de 1 ml, después se lavaron 3-4 veces con 700 pl de agua destilada hasta que la solución acuosa permaneció clara. Se desechó el agua y se añadió 1 ml de HCl al 3% (preparado fresco el día del experimento) hasta que se descargó el color marrón intenso de las secciones. Se pipeteó una solución de HCl al 3% y se añadió 1 ml de solución concentrada de hidróxido de amonio (14,8 M, almacenada a 4 °C). Las secciones se extrajeron usando una pipeta con una punta de pipeta cortada. Las secciones se dispensaron en un portaobjetos de microscopio y se cubrieron con un cubreobjetos para la observación bajo iluminación de campo brillante. La tinción de Maule es específica para detectar las unidades S en el xilema y las fibras interfasciculares. La coloración roja indica la presencia de unidades S en los elementos de lignina. Las plantas con mutaciones en COMT mostraron una coloración roja reducida y un nivel más bajo de S lignina.

Fenotipificación de la planta Ms589-1 (FIG. 13) y Ms492-2 (FIG. 14) por tinción de Maule mostró una reducción en la coloración roja en ambas plantas, lo que indica una reducción en las unidades S.

Ejemplo 6 - Mejoramiento de plantas de alfalfa que comprenden mutaciones dentro de la COMT

Las plantas de alfalfa que tienen mutaciones inducidas en los alelos de la COMT se cruzan para generar una serie de plantas que contienen combinaciones de mutaciones dentro de los cuatro alelos de la COMT. La TABLA 4 enumera las plantas generadas en un programa de reproducción representativo.

Tabla 4

Otras realizaciones

Debe entenderse que aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, el cual se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una planta de alfalfa, el método comprende:

proporcionar una población de células de alfalfa que comprenden cada una cuatro alelos de la COMT,

poner en contacto la población de células de alfalfa con una o más endonucleasas de corte raro dirigidas a uno o más de los cuatro alelos de la COMT,

regenerar plantas de alfalfa a partir de la población de células de alfalfa, y

seleccionar una planta de alfalfa con una mutación inducida en cada uno de dichos cuatro alelos de la COMT, en donde dicha planta de alfalfa seleccionada comprende una reducción en unidades de siringilo (S) en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente, y/o en donde dicha planta de alfalfa seleccionada exhibe un contenido de lignina reducido en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente.

2. El método de la reivindicación 1, en donde cada mutación inducida comprende una deleción de uno o más pares de bases de ácido nucleico, o donde al menos una mutación inducida comprende una deleción dentro del marco de dos o más codones de ácido nucleico consecutivos.

3. El método de la reivindicación 1, en donde cada mutación inducida se selecciona del grupo que consiste en:

una mutación inducida dentro de una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:9-15, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:9-15;

una deleción de la citosina en la posición 29 de cualquiera de las SEQ ID NO: 9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID n O:9-15;

una deleción de la timina en la posición 144 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOS:9-15;

una deleción de la adenina en la posición 208 de cualquiera de las SEQ ID NO:9-15 o en la posición correspondiente dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOS:9-15; y

una mutación inducida dentro de una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:6-8, o dentro de una secuencia que tiene al menos 90 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:6-8.

4. El método de la reivindicación 1, en donde cada mutación inducida produce un alelo de la COMT que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:32526 a 32537.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la una o más endonucleasas de corte raro son nucleasas TALE, opcionalmente en donde cada una de la una o más nucleasas TALE se une a una secuencia de ácido nucleico como se establece en cualquiera de las SEQ ID NO:6-8.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO:32526 a 32537.

7. Una planta de alfalfa, una parte de planta de dicha planta de alfalfa o una célula de planta de dicha planta de alfalfa, en donde el genoma de dicha planta de alfalfa, dicha parte de planta o dicha célula de planta comprende una mutación inducida en cada alelo de la COMT de dicho genoma; en donde dicha planta de alfalfa comprende una reducción en unidades S en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente, y en donde dicha planta de alfalfa comprende un contenido de lignina disminuido en comparación con una planta de alfalfa de tipo silvestre correspondiente.

8. La planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal de la reivindicación 7, en donde dicha parte de planta que comprende dicha mutación inducida se selecciona del grupo que consiste en un tallo, una hoja, una flor y una semilla.

9. La planta, parte de planta o célula vegetal de alfalfa de la reivindicación 7, en donde cada mutación inducida comprende una deleción de uno o más pares de bases de ácido nucleico, o en donde al menos una mutación inducida comprende una deleción en el marco de dos o más codones de ácido nucleico consecutivos.

10. La planta, parte de planta o célula vegetal de alfalfa de la reivindicación 7, en donde dicha mutación inducida se selecciona del grupo que consiste en:

11. La planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal de la reivindicación 7, en donde cada mutación inducida produce un alelo de la COMT que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:32526 a 32537.

12. La planta de alfalfa, parte de planta o célula vegetal de la reivindicación 7, en donde dicha planta produce un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:32538 o la SEQ ID NO:32539.