ES2978017T3 - Método para detectar una mutación en una secuencia de microsatélites - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para detectar una mutación en un locus de secuencia de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN, que comprende una etapa de someter dicha muestra de ADN a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) digital en presencia de una solución de PCR que comprende: - un par de cebadores adecuados para amplificar dicho fragmento diana de la muestra de ADN que incluye dicha secuencia de microsatélites; - una primera sonda de hidrólisis de oligonucleótidos MS (MS), marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda de oligonucleótidos MS es complementaria a una secuencia de tipo salvaje que incluye la secuencia de microsatélites; - una segunda sonda de hidrólisis de referencia de oligonucleótidos (REF), marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda de oligonucleótidos REF es complementaria a una secuencia de tipo salvaje de dicho fragmento de ADN diana que no incluye dicha secuencia de microsatélites. La presente invención también abarca métodos para el diagnóstico y pronóstico del cáncer y un método para determinar la eficacia de un tratamiento contra el cáncer. La invención también incluye un kit para detectar una mutación en una secuencia de microsatélites. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para detectar una mutación en una secuencia de microsatélites
Estado de la técnica
Los microsatélites (MS) son repeticiones en tándem de secuencias cortas de ADN que abundan en todo el genoma humano. Debido a sus elevadas tasas de mutación, las secuencias de microsatélites se han utilizado ampliamente como marcadores polimórficos en genética de poblaciones y ciencia forense. La inestabilidad de microsatélites (MSI, del inglésMicrosatellite instability)es un fenotipo hipermutador que se produce en tumores con alteraciones en la reparación de emparejamientos incorrectos del a Dn (MMR, del inglésmismatch repair)y se caracteriza por polimorfismos generalizados en la longitud de repeticiones de microsatélites debidos al deslizamiento de la ADN polimerasa, así como por una frecuencia elevada de variantes de un solo nucleótido (SNV, del ingléssingle-nucleotide variants).La MSI está provocada por la inactivación de los genes MMR (por ejemplo, MLH1, MSH2, MSH3, MSH6 y PMS2) a través de mutaciones somáticas, con mayor riesgo de cáncer para aquellos con mutaciones hereditarias de la línea germinal (es decir, síndrome de Lynch). La MSI también se produce por inactivación epigenética de genes MMR (por ejemplo, hipermetilación de los promotores MLH1 y MSH2 asociados con la mutación somática BRAF V600E o eliminación en el extremo 3' de Ep-CAM), o disminución de genes MMR mediante microARN. Los acontecimientos de MSI dentro de las regiones codificantes pueden alterar el marco de lectura, lo que lleva a proteínas truncadas funcionalmente deterioradas (véase también Cortes-Cirianoet al.,Nat Commun. 6 de junio de 2017;8:15180 y Copijaet al.,Int J Mol Sci. 6 de enero de 2017;18(1). pii: E107).
El fenotipo de MSI se ha utilizado ampliamente como herramienta de diagnóstico molecular para tumores gastrointestinales, endometriales y colorrectales, donde tiene implicaciones importantes para el pronóstico de la enfermedad y la planificación racional del tratamiento (Boland y Goel, Gastroenterology, junio de 2010; 138(6):2073-2087.e3, Copijaet al.,Int J Mol Sci. 6 de enero de 2017;18(1). pii: E107). Se sabe que los tumores positivos para MSI muestran características histopatológicas y clínicas únicas que incluyen ubicación específica, mala diferenciación, elevada infiltración linfocítica y mejor pronóstico asociado con baja frecuencia de metástasis a distancia (Boland y Goel, Gastroenterology 2010; 138(6):2073-2087.e3).
Análisis recientes también han identificado MSI en varios tipos de cáncer adicionales, tales como del tracto urinario, de ovario, próstata, pulmón, cabeza y cuello, hígado y glioblastomas, lo que sugiere una posible aplicación más amplia de la detección de MSI en la práctica clínica (Hauseet al.,Nat Med. Noviembre de 2016; 22(11): 1342-1350, Cortes-Cirianoet al.,Nat Commun. 6 de junio de 2017;8:15180).
De hecho, la MSI ha surgido recientemente como el primer biomarcador pantumoral que probablemente predice el beneficio clínico del tratamiento de bloqueo de puntos de control inmunitario (Leet al.,N Engl J Med. 25 de junio de 2015;372(26):2509-20; Leet al.,Science, 8 de junio de 2017. pii: eaan6733). Cabe destacar que, a través de un proceso de aprobación acelerada, la FDA ha autorizado recientemente el uso del tratamiento de bloqueo anti-PD-1 para el tratamiento de pacientes adultos y pediátricos con tumores sólidos irresecables o metastásicos positivos para MSI o con deficiencia de MMR.
El diagnóstico molecular de la MSI se realiza actualmente mediante el examen de productos de PCR de unos pocoslocide microsatélites informativos de ADN extraído de muestras tumorales (Bacheret al.,Disease Markers 2004, 237 250). Las desventajas de este método incluyen la necesidad de electroforesis capilar para detectar cambios en el tamaño de los alelos y la sensibilidad limitada de la técnica, lo que requiere una celularidad tumoral mínima del 20 % para lograr resultados fiables y sólidos (Shi y Washington, Am J Clin Pathol 2012 137:847-859). Recientemente, se han utilizado métodos de secuenciación de nueva generación (NGS, del inglésnext generation sequencing)para lograr una mayor sensibilidad y una mejor precisión en la detección de MSI (Salipanteet al.,Clin Chem, 30 de junio de 2014, 60 (9), 1192-1199; Hauseet al.,Nat Med. Noviembre de 2016; 22(11):1342-1350, Cortes-Cirianoet al.,Nat Commun.
6 de junio de 2017;8:15180). Aunque es claramente una mejora con respecto al método utilizado actualmente en la clínica, la sensibilidad del 1 % obtenida por NGS sigue estando por encima de la sensibilidad de los ensayos basados en PCR.
Por lo tanto, el desarrollo de un método de diagnóstico de MSI sensible que se pueda utilizar en ADN tumoral circulante obtenido de biopsias líquidas sigue siendo de gran importancia clínica y terapéutica.
Objeto de la invención
La invención se define en las reivindicaciones.
Los autores han diseñado un método de diagnóstico por PCR digital para detectar la inestabilidad de microsatélites, que se puede realizar en una muestra de ADN que contiene una concentración muy baja de ADN diana.
De hecho, los autores han demostrado que el límite de detección alcanzado (es decir, la concentración más baja que probablemente se distinga de manera fiable del límite del blanco y en la cual la detección es factible), es 250 veces inferior que el umbral mínimo de celularidad (es decir, al menos un 20 % de celularidad) necesario para determinar el estado de MSI mediante el ensayo quíntuple que se aplica actualmente en la práctica clínica (véase Bacheret al.,2004, Disease Markers 20:237-250, véase también Shi y Washington, Am J Clin Pathol 2012 137:847-859). De acuerdo con los resultados que se muestran en el presente documento, el nuevo ensayo de detección de MSI es altamente específico y sensible, ya que la sensibilidad podría alcanzar valores, al menos en teoría, cercanos al 0,1 %. Este enfoque innovador también ofrece otras ventajas, incluida la simplicidad de los análisis de sangre y la reducción del tiempo de análisis. En conjunto, el método de diagnóstico de la m S i de la divulgación promete una mejor precisión diagnóstica y el uso sin precedentes de un biomarcador de la MSI en biopsias líquidas para el diagnóstico y seguimiento del tratamiento y la progresión de la enfermedad.
Anteriormente se ha utilizado una técnica similar para la detección del estado BRAF en el cáncer colorrectal (véase Bidshahriet al.,The Journal of Molecular Diagnostic 2016, 18(2): 190-204). Sin embargo, nunca se ha previsto el uso de dicha técnica para la detección de una secuencia de microsatélites mutada. De hecho, debido al tamaño y más particularmente a la naturaleza extremadamente repetitiva de la secuencia de microsatélites, se esperaría que la sonda que cubre el microsatélite (sonda MS, véase más abajo) se deslizara sobre la secuencia repetida de tal manera que no se pudiera obtener una hibridación eficaz o fiable de la sonda. Dietmaieret al.(Laboratory Investigation, 2001) describen una técnica para la detección de una secuencia de microsatélites mediante RT-PCR y mediante el análisis del punto de fusión, utilizando sondas de hibridación de secuencias específicas de los marcadores diana. Las sondas de hibridación Light Cycler HybProbes utilizadas en este documento no son capaces de discriminar secuencias de microsatélites TS y mutantes. Por lo tanto, se necesitan análisis adicionales del punto de fusión después de la amplificación por PCR en tiempo real para la identificación de microsatélites mutados. Además, las sondas de Dietmaieret al.no se consideran sondas de hidrólisis y no son importantes en el contexto de una reacción de PCR digital.
El método de la divulgación se basa en una única reacción con dos sondas de hidrólisis ubicadas en el mismo amplicón. La primera cubre la secuencia completa del microsatélite TS (sonda MS). La segunda es una sonda de referencia (REf ) ubicada en una región no variable, que no incluye el locus de la secuencia de microsatélites (MS) y se utiliza para cuantificar nanogotas con ADN amplificable. Por tanto, las secuencias de tipo silvestre (TS) mostrarán una señal de fluorescencia doble positiva procedente de la hibridación de las sondas REF y MS, mientras que las nanogotas que contienen alelos de microsatélites mutados presentarán una señal cambiada que resulta de la hibridación de la sonda REF únicamente.
Por lo tanto, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana a partir de una muestra de ADN, que comprende una etapa de someter dicha muestra de ADN a una reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR, del inglésdigitalpolymerase chain reaction)en presencia de una solución de PCR que comprende:
- un par de cebadores adecuados para amplificar dicho fragmento diana de la muestra de ADN que incluye dicha secuencia de microsatélites;
- una primera sonda oligonucleotídica de hidrólisis de microsatélites (MS), marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda oligonucleotídica MS es complementaria a una secuencia de tipo silvestre que incluye la secuencia de microsatélites;
- una segunda sonda oligonucleotídica de hidrólisis de referencia (REF), marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda oligonucleotídica REF es complementaria a una secuencia de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN diana, que no incluye dicha secuencia de microsatélites, en donde dichas sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador.
Preferentemente, la PCR digital (dPCR) es una PCR digital en nanogotas (ddPCR, del inglésdigital droplet PCR).
El fragmento diana de la muestra de ADN puede ser ADN genómico constitucional o ADN tumoral genómico o ADN circulante.
El locus de secuencias de microsatélites se puede seleccionar del grupo que comprende BAT-25, BAT-26, BAT-34c4, BAT-40, NR21, NR24, MONO-27, D2S123, D5S346, D17S250, ACVR2A, DEFB105A, DEFB105B, RNF43, DOCK3, GTF2IP1, LOC100093631, PIP5K1A, MSH3, TRIM43B, PPFIA1 y TDRD1. Además, se pueden seleccionar secuencias de microsatélites ubicadas en regiones del genoma frecuentemente amplificadas en el cáncer (por ejemplo, la región chr8q del genoma humano) para aumentar la sensibilidad.
Normalmente, la muestra de ADN se selecciona del grupo que consiste en tejido tumoral, células diseminadas, deposiciones, células sanguíneas, plasma sanguíneo, suero, ganglios linfáticos, orina, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad, jugo pancreático, jugo gástrico, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo y líquidos serosos.
La presente divulgación también se refiere a un método como se describió anteriormente que comprende además una etapa de medir las señales de fluorescencia asociadas con las sondas REF y MS, en donde: la señal de intensidad de fluorescencia máxima asociada con las sondas REF y MS indica la presencia de una secuencia de microsatélites de tipo silvestre en el fragmento de ADN diana, mientras que un cambio en la señal de intensidad de fluorescencia asociada con la sonda MS indica la presencia de una mutación en la secuencia de microsatélites del fragmento de ADN diana.
La presente divulgación también se refiere a un método para el diagnóstico de cánceres, enfermedades asociadas con mutaciones en genes de reparación de emparejamientos incorrectos (MMR) o predisposición familiar a tumores en un sujeto, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un ADN diana a partir de una muestra de ADN como se describió anteriormente, en donde el fragmento diana procede de un tumor.
La presente divulgación también se refiere a un método para el pronóstico de cánceres que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN como se describió anteriormente, en donde el fragmento diana procede de un tumor.
La presente divulgación también se refiere a un método para predecir la eficacia de un tratamiento en un sujeto que padece un cáncer, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana a partir de una muestra de ADN como se describió anteriormente, en donde el fragmento diana se origina a partir de un tumor y en donde el tratamiento es preferentemente inmunoterapia, tal como terapia de puntos de control inmunitario.
La presente divulgación también se refiere a un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita que comprende:
- la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN como se describió anteriormente, y
- la administración al sujeto de una inmunoterapia si se identifica una mutación en un locus de secuencias de microsatélites del fragmento diana,
en donde el fragmento diana de la muestra de ADN procede de un tumor.
La presente divulgación también se refiere a un método para el seguimiento de un paciente diagnosticado con un tumor asociado con una reparación de emparejamientos incorrectos de ADN (MMR) alterada, o que ha padecido dicho tumor, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana a partir de una muestra de ADN como se describió anteriormente,
- en donde el fragmento diana de la muestra de ADN procede de un tumor.
Por último, la presente divulgación también abarca un kit para identificar una mutación en una región de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN que comprende:
- un par de cebadores adecuados para amplificar dicho fragmento diana a partir de la muestra de ADN que incluye dicha secuencia de microsatélites;
- una primera sonda oligonucleotídica de hidrólisis (MS), marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda oligonucleotídica de hidrólisis es complementaria a una secuencia de tipo silvestre que incluye la secuencia de microsatélites;
- una segunda sonda oligonucleotídica de hidrólisis (REF), marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda oligonucleotídica de hidrólisis es complementaria a una secuencia de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN amplificado, que no incluye dicha secuencia de microsatélites;
- una polimerasa termoestable,
en donde dichas sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador.
Descripción detallada de la invención
A- Definiciones
Las siguientes definiciones tienen como objetivo ayudar a proporcionar una comprensión clara y coherente del alcance y detalle de los siguientes términos, como se utiliza para describir y definir la presente divulgación:
Como se utiliza en el presente documento, el verbo "comprender" como se usa en esta descripción y en las reivindicaciones y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitante para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero no se excluyen los puntos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un componente mediante el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los componentes, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los componentes. Por tanto, el artículo indefinido "un" o "una" normalmente significa "al menos un o una".
Como se utiliza en el presente documento, un "tumor" o una "neoplasia" (ambos términos se pueden utilizar de forma indistinta) es un nuevo crecimiento anormal de células. Las células de una neoplasia suelen crecer más rápidamente que las células normales y seguirán creciendo si no se tratan. Mientras crecen, las neoplasias pueden incidir y dañar estructuras adyacentes. El término neoplasia puede referirse a crecimientos benignos (generalmente curables) o malignos (cancerosos).
Un tumor o neoplasia benigna generalmente está localizado y no se propaga a otras partes del cuerpo. La mayoría de los tumores benignos responden bien al tratamiento. Sin embargo, si se dejan sin tratar, algunos tumores benignos pueden crecer y provocar enfermedades graves debido a su tamaño. Los tumores benignos también pueden parecerse a los tumores malignos, por lo que a veces se tratan. Los tumores malignos son crecimientos cancerosos. A menudo son resistentes al tratamiento, pueden propagarse a otras partes del cuerpo (es decir, metástasis) y, a veces, reaparecen después de su eliminación.
El término "cáncer" se utiliza en el presente documento para un tumor maligno.
"Alelo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una de varias formas alternativas de un gen o secuencia de ADN en una ubicación cromosómica (locus) específica. En cada locus autosómico un individuo posee dos alelos, uno heredado del padre y otro de la madre.
"Polimorfismo del ADN", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la existencia de dos o más alelos para un locus determinado en la población. "Locus" o "locus genético", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una ubicación cromosómica única que define la posición de un gen o secuencia de ADN individual. "Cebador específico de locus", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un cebador que se hibrida específicamente con una parte del locus indicado o su cadena complementaria, al menos para un alelo del locus, y no se hibrida de manera eficaz con otras secuencias de ADN en las condiciones utilizadas en el método de amplificación.
"Locus de secuencias de microsatélites" o "secuencia de microsatélites" se utilizan indistintamente y se refieren a una región de ADN genómico que contiene elementos de secuencia cortos y repetitivos de uno (1) a siete (7), normalmente de uno (1) a cinco (5), en particular de uno (1) a cuatro (4), pares de bases de longitud. Cada secuencia repetida al menos una vez dentro de un locus de microsatélite se denomina en el presente documento "unidad de repetición". Cada locus de microsatélites suele incluir al menos siete unidades de repetición, en particular al menos diez unidades repetitivas, y preferentemente al menos veinte unidades de repetición.
"Inestabilidad de microsatélites" (en adelante, "MSI"), como se utiliza en el presente documento, se refiere a una forma de inestabilidad genética en la que los alelos del ADN genómico obtenidos de determinado tejido, células o líquidos corporales de un sujeto determinado se mutan en un locus de microsatélites. Las mutaciones en el locus de microsatélites suelen incluir eliminación(es), adición(es) o sustitución de al menos una unidad de repetición en un locus de microsatélites. Normalmente, la MSI da como resultado un cambio de longitud en un lugar microsatélite, debido a adiciones o, con más frecuencia, a eliminaciones.
Como se utiliza en el presente documento, un "conjunto de cebadores/sonda" se refiere a una agrupación de un par de cebadores oligonucleotídicos y dos sondas oligonucleotídicas, cada una de las cuales se hibrida con una secuencia de nucleótidos diana específica. Dicho conjunto de oligonucleótidos consiste en: (a) un cebador discriminatorio directo que se hibrida en una primera ubicación de una secuencia de ácido nucleico; (b) un cebador discriminatorio inverso que se hibrida en una segunda ubicación de la secuencia de ácido nucleico cadena abajo de la primera ubicación y (c) dos sondas, que se hibridan con una secuencia diana entre los cebadores. Dicho de otra manera, un conjunto de cebador/sonda consiste en un par de oligonucleótidos específicos que se hibridan con cadenas opuestas de una secuencia de ácido nucleico (que normalmente incluye un locus de secuencias de microsatélites) para formar un amplicón específico de la secuencia de ácido nucleico durante la reacción de PCR, y dos sondas, preferentemente fluorescentes, que se hibridan con(es decir,que son complementarias a) una secuencia diana específica del amplicón.
Un "amplicón" se refiere a un fragmento de ácido nucleico formado como producto de acontecimientos o técnicas de amplificación naturales o artificiales. Normalmente, el amplicón se produce mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). "Amplificar", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso mediante el cual se realizan múltiples copias de un locus particular de un ácido nucleico (es decir, una secuencia diana como se mencionó anteriormente), tal como ADN genómico. La amplificación se logra mediante PCR (Saikiet al.,1985 Science 230: 1350- 1354).
Un "fragmento (ADN) diana" o una "región (ADN) diana", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren al fragmento de la muestra de ADN que se amplifica mediante un par de cebadores de un conjunto de cebador/sonda. De acuerdo con la divulgación, dicho fragmento diana incluye un locus MS. Una "secuencia diana" o "secuencia de ADN diana", utilizadas indistintamente, se refieren a una secuencia de ADN que es complementaria a la primera o segunda sonda oligonucleotídica.
Como se utiliza en el presente documento, "PCR digital" se refiere a un ensayo que proporciona una medición de puntos finales que proporciona la capacidad de cuantificar ácidos nucleicos sin el uso de curvas convencionales, como se utiliza en la PCR en tiempo real (véanse Sykeset al.,1992 Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. BioTechniques 13, 444-449, Vogelstein y Kinzler 1999 Digital PCR. Proc Natl Acad Sci USA, 96:9236-9241 y Pohl y Shihle 2004 Principle and applications of digital PCR. Expert Rev Mol Diagn, 4:41-47, véase también Monya Baker 2012 Nature Methods 9, 541-544).
En un experimento típico de PCR digital, se prepara una solución de PCR de manera similar a un ensayo de sonda TaqMan clásico, que normalmente comprende la muestra de ADN, sondas desactivadoras de fluorescencia (es decir, sondas de hidrólisis), cebadores y una mezcla maestra de PCR, que generalmente contiene ADN polimerasa, dNTPs, MgCl<2>y tampones de reacción en concentraciones óptimas. A continuación, la solución de PCR se distribuye aleatoriamente en particiones o compartimentos separados (es decir, individuales), de modo que algunos no contienen ADN diana y otros contienen una o más copias de ADN diana, lo más preferentemente una copia de ADN diana. Por lo tanto, en estas condiciones, la señal de referencia asociada con la presencia del ADN diana en la muestra de ADN en una partición o compartimento determinado debería ser teóricamente 0 o 1. Obviamente debido a la variabilidad biológica de una población de partición o compartimento, se observan nubes que corresponden respectivamente a los valores teóricos 0 o 1.
Las particiones se amplifican individualmente hasta la fase de meseta terminal de la PCR (o punto final) y después se leen para detectar fluorescencia, para determinar la fracción de particiones positivas.
Si las particiones son de volumen uniforme, el número de moléculas de ADN diana presentes se puede calcular a partir de la fracción de reacciones finales positivas utilizando la estadística de Poisson, según la siguiente ecuación:
en dondeAes el número promedio de moléculas de ADN diana por reacción replicada ypes la fracción de reacciones finales positivas. A partir deA, junto con el volumen de cada p Cr replicada y el número total de réplicas analizadas, se calcula una estimación de la concentración absoluta de ADN diana.
Se pueden utilizar placas de micropocillos, capilares, emulsión de aceite y conjuntos de cámaras miniaturizadas con superficies de unión a ácidos nucleicos para dividir las muestras en distintos compartimentos o nanogotas. Por lo tanto, la PCR digital, como se utiliza en el presente documento, incluye una variedad de formatos, incluida la PCR digital en nanogotas (ddPCR), BEAMing(beads, emulsión, amplification, and magnetic,perlas, emulsión, amplificación y magnéticos) y chips de microfluidos.
"PCR digital en nanogotas" (ddPCR) se refiere a un ensayo de PCR digital que mide cantidades absolutas mediante el recuento de moléculas de ácido nucleico encapsuladas en particiones separadas de nanogotas de agua en aceite, volumétricamente definidas, que admiten la amplificación por PCR (Hinsonet al.,2011, Anal. Chem. 83:8604-8610; Pinheiroet al.,2012, Anal. Chem. 84: 1003-1011). Una sola reacción de ddPCR puede comprender al menos 20.000 nanogotas divididas por pocillo.
Una "nanogota" se refiere a una partición individual de la solución de PCR en un ensayo de PCR digital en nanogotas. A continuación de la presente solicitud, la PCR digital se describirá en referencia a la PCR digital en nanogotas (o PCR en nanogotas digital, utilizadas indistintamente), sin embargo, como se mencionó anteriormente, la partición individual de la solución de PCR de acuerdo con el principio de la PCR digital se puede obtener de acuerdo con una variedad de técnicas. Por tanto, el método de la divulgación, como se describe a continuación en referencia a la PCR digital en nanogotas, no se limita a esta técnica de PCR digital y puede aplicarse de manera similar a otras técnicas de PCR digital.
Las técnicas disponibles para la PCR digital incluyen la amplificación por PCR en un chip de microfluidos (Warrenet al.,2006 Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital Rt -PCR. Proc Natl Acad Sci USA 103, 17807-17812; Ottesenet al.,2006 Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science 314, 1464-1467; Fan y Quake 2007, Detection of aneuploidy with digital polymerase chain reaction. Anal Chem 79, 7576-7579). Otros sistemas implican la separación en micromatrices (Morrisonet al.,2006 Nanoliter high-throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res 34, e123) o discos de microfluidos giratorios (Sundberget al.,2010 Spinning disk platform for microfluidic digital polymerase chain reaction. Anal Chem 82, 1546 1550) y técnicas de nanogotas basadas en emulsiones aceite-agua (Hindson, Benjaminet al.,2011 High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Analytical Chemistry 83 (22): 8604-8610). Normalmente, la PCR digital se selecciona de la PCR digital en nanogotas (ddPCR), BEAMing (perlas, emulsión, amplificación y magnéticos) y chips de microfluidos. Preferentemente, la PCR digital es una PCR digital en nanogotas.
Una nanogota admite la amplificación por PCR de molécula(s) plantilla utilizando químicas de ensayo homogéneas y flujos de trabajo similares a los ampliamente utilizados para aplicaciones de PCR en tiempo real (Hinsonet al.,2011, Anal. Chem. 83:8604-8610; Pinheiroet al.,2012, Anal. Chem. 84: 1003-1011). Una vez que se generan las nanogotas, se pueden transferir a una placa de PCR y las reacciones de PCR emulsionadas se pueden ejecutar en un termociclador en un programa clásico, tal como se describe, por ejemplo, en la Guía de Biorad para ddPCR (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf).
La PCR digital en nanogotas se puede realizar mediante cualquier plataforma que realice un ensayo de PCR digital que mida cantidades absolutas mediante el recuento de moléculas de ácido nucleico encapsuladas en particiones separadas de nanogotas de agua en aceite, volumétricamente definidas, que admiten la amplificación por PCR. La estrategia para la PCR digital en nanogotas se puede resumir de la siguiente manera: La solución de PCR que contiene la muestra de ADN se diluye y se divide en miles o millones de cámaras de reacción separadas (nanogotas de agua en aceite) para que cada una contenga una o ninguna copia de la molécula de ácido nucleico de interés.
El número de nanogotas "positivas" detectadas, que contienen el amplicón diana (es decir, fragmento de ADN diana) (es decir, de acuerdo con la presente divulgación, nanogotas REF positivas), en comparación con el número de nanogotas "negativas", que no contienen el amplicón diana (es decir, nanogotas REF negativas), puede utilizarse para determinar el número de copias de la molécula de ácido nucleico de interés que estaban en la muestra original.
Los ejemplos de sistemas de PCR digital en nanogotas incluyen el sistema de PCR digital en nanogotas QX100 ™ de Bio-Rad, que divide muestras que contienen la plantilla de ácido nucleico en 20.000 nanogotas de tamaño nanolitro; y el sistema de PCR digital RainDrop™ de RainDance, que divide muestras que contienen la plantilla de ácido nucleico en 1.000.000 a 10.000.000 de nanogotas de tamaño picolitro.
Los beneficios de la dPCR y, de manera más particular, de la tecnología ddPCR incluyen:
- Cuantificación absoluta, ya que la tecnología ddPCR proporciona un recuento absoluto de copias de ADN diana por muestra de entrada sin la necesidad de ejecutar curvas convencionales.
- Precisión sin precedentes, ya que la partición masiva de muestras que ofrece ddPCR permite la medición fiable de pequeñas diferencias en el número de copias de la secuencia de ADN diana entre muestras.
- Mayor relación señal/ruido: las plantillas y el fondo de elevado contenido se diluyen, lo que enriquece de manera eficaz la concentración de la plantilla en particiones positivas para la diana, permitiendo la detección sensible de dianas raras.
- Eliminación del sesgo de PCR, ya que las tasas de error se reducen mediante la eliminación de la dependencia de la eficacia de amplificación de qPCR, lo que permite la detección de pequeñas diferencias (1,2 veces).
- Cuantificación simplificada, ya que no se necesitan patrones de calibración ni una referencia para la cuantificación absoluta.
- Costes de consumibles reducidos, ya que los volúmenes de reacción están en el intervalo de pico a nanolitros, lo que reduce el uso de reactivos y la cantidad de muestra necesaria para cada punto de datos.
- Costes de equipo menores, ya que el sistema de reacción basado en emulsión significa que las reacciones de PCR se pueden realizar en un termociclador convencional sin chips ni microfluidos complejos.
- Partición superior, dado que la tecnología ddPCR produce 20.000 nanogotas por 20 pl de muestra, casi dos millones de reacciones de PCR divididas en una placa de 96 pocillos, mientras que los sistemas de PCR digitales basados en chips producen sólo cientos o miles de particiones. El mayor número de particiones también produce una mayor precisión.
La expresión "temperatura de fusión" o "Tm" se refiere a la temperatura a la que un polinucleótido se disocia de su secuencia complementaria. En general, laTmpuede definirse como la temperatura a la que la mitad de los pares de bases de Watson-Crick en una molécula de ácido nucleico doble se rompen o disocian (es decir, se "funden") mientras que la otra mitad los pares de bases de Watson-Crick permanece inalterado en una conformación de doble cadena. Dicho de otra manera, laTmse define como la temperatura a la que el 50 % de los nucleótidos de dos secuencias complementarias se hidridan (cadenas dobles) y el 50 % de los nucleótidos se desnaturalizan (cadenas simples). LaTmse puede calcular mediante varios métodos, tal como, por ejemplo, mediante un cálculo del vecino más cercano según Wetmur 1991 (Wetmur 1991 DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol 26: 227-259) o mediante programas comerciales que incluyen Oligo™ Primer Desing y programas disponibles en Internet. Como alternativa, laTmse puede determinar mediante experimentación real. Por ejemplo, se pueden utilizar colorantes de unión o intercalación de ADN bicatenario, tal como bromuro de etidio o SYBR-verde (Molecular Probes), en un ensayo de curva de fusión para determinar la Tm real del ácido nucleico.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "temperatura clave de desnaturalización" o "Tc" se refiere a una temperatura por debajo de la Tm de la secuencia de tipo silvestre, a la que se fundirá un dúplex de la secuencia de tipo silvestre y la secuencia mutante. (En algunos casos, esta temperatura puede ser aquella a la que también se funde un homodúplex de las secuencias mutantes). La temperatura clave desnaturalizante (Tc) es la temperatura por debajo de la cual la eficacia de la PCR cae repentinamente para una secuencia de ácido nucleico determinada.
B- Método para identificar una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de una muestra de ADN
La presente divulgación se refiere a un método para la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites (MS) diana de un fragmento diana de una muestra de ADN, que comprende una etapa de someter dicha muestra de ADN a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en presencia de:
- un par de cebadores adecuados para amplificar dicho fragmento diana de la muestra de ADN que incluye dicho locus MS;
- una primera sonda oligonucleotídica MS, marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda oligonucleotídica MS es complementaria a una primera secuencia diana de tipo silvestre que incluye la secuencia de microsatélites;
- una segunda sonda oligonucleotídica de referencia (REF), marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda oligonucleotídica REF es complementaria a una segunda secuencia diana de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN amplificado que no incluye dicha secuencia de microsatélites, en donde dichas sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador.
El ADN de la muestra de ADN y, en particular, el ADN diana (o fragmento de ADN diana), puede ser ADN genómico o ADN emitido a partir de transcripción inversa de ARN. El ADN genómico puede ser ADN constitucional, ADN procedente de un tumor (es decir, ADN genómico del tumor), en particular, un tumor maligno. Normalmente también, el fragmento de ADN diana es ADN extracelular, tal como ADN circulante. En particular, el fragmento de ADN diana puede ser ADN tumoral extracelular, en particular, ADN tumoral circulante o ADN fetal extracelular (es decir, ADN fetal que circula en el torrente sanguíneo materno).
El método utiliza un conjunto de cebador/sonda como se definió previamente.
Preferentemente, el par de cebadores normalmente está diseñado para tener unaTmmás baja que laTcde la reacción. El par de cebadores se puede diseñar mediante programas informáticos disponibles.
Normalmente, las sondas de acuerdo con la divulgación son sondas de hidrólisis (también denominadas sondas TaqMan). Las sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador. Las sondas de oligonucleótidos están marcadas de forma detectable con un marcador fluorescente que se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en FAM (5- o 6-carboxifluoresceína), VIC, NED, fluoresceína, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, HEX, TET (5-tetraclorofluoresceína), TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, Oregon verde, Rodamina verde, Rodamina roja, rojo Texas, amarillo yakima, Alexa Fluor PET, Biosearch Blue™, Marina Blue®, Bothell Blue®, Alexa Fluor®, 350 fAm™, SYBR® Verde 1, fluoresceína, EvaGreen™, Alexa Fluor® 488 JOE™, 25 VIC™, HEX™, TET™, CAL Fluor®Gold 540, Yakima Yellow®, ROX™, CAL Fluor® Red 610, Cy3.5™, Texas Red®, Alexa Fluor® 568 Cry5™, Quasar™ 670, LightCycler Red640®, Alexa Fluor 633 Quasar™ 705, LightCycler Red705®, Alexa Fluor® 680, SYT0®9, LC Green®, LC Green® Plus+ y EvaGreen™. Preferentemente, el marcador detectable se selecciona de 6-carboxifluoresceína, FAM o tetraclorofluoresceína, (acrónimo: TET), rojo Texas, cianina 5, cianina 3 o VIC™.
El desactivador puede ser un desactivador interno o un desactivador ubicado en el extremo 3' de la sonda. Los desactivadores típicos son la tetrametilrodamina, TAMARA, desactivador Black Hole o desactivador no fluorescente. Las sondas de hidrólisis utilizables de acuerdo con la divulgación son bien conocidas en el campo (véase, en particular, http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detectionmethods.html ). La molécula desactivadora apaga la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando la fuente de luz del ciclador lo excita normalmente a través de FRET (Transferencia de energía por resonancia de Forster). Mientras el fluoróforo y el desactivador estén cerca, la desactivación inhibe cualquier señal de fluorescencia. Dichas sondas están diseñadas de manera que se hibridan dentro de la región diana amplificada por un conjunto específico de cebadores. A medida que la Taq polimerasa extiende el cebador y sintetiza la cadena naciente, la actividad exonucleasa 5'-3' inherente a la ADN polimerasa Taq separa el indicador en 5' del desactivador en 3', que proporciona una señal fluorescente que es proporcional al rendimiento del amplicón.
La primera y segunda sondas de acuerdo con la divulgación están ubicadas dentro del mismo amplicón. Las sondas se diseñan de acuerdo con la práctica bien establecida en la materia para minimizar preferentemente los artefactos de la PCR y para hibridarse de manera específica con las secuencias como se define a continuación. La primera y segunda sondas están marcadas con fluoróforos distintos para permitir la detección por separado de su señal respectiva.
En algunas realizaciones, las sondas de hidrólisis de acuerdo con la divulgación incluyen una fracción de unión al surco menor (MGB, del inglésminorgroove binder)en su extremo 3'. Dicha MGB normalmente aumenta la temperatura de fusión (Tm) de la sonda y estabiliza los híbridos sonda-diana.
Las sondas oligonucleotídicas tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 10 a aproximadamente 50. Preferentemente, las sondas oligonucleotídicas (y, en particular, la sonda MS) tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 15 a 40, o de 25 a 50 o, en particular, de 15 a 35.
Preferentemente, las sondas oligonucleotídicas (y, en particular, la sonda MS) tienen una longitud de secuencia de nucleótidos de aproximadamente 20 a 40, o de 30 a 50 o, en particular, de 30 a 40.
La primera sonda de acuerdo con la divulgación (también denominada sonda MS) se hibrida con una primera secuencia diana de tipo silvestre del fragmento de ADN diana amplificado, que incluye un locus de secuencias de microsatélites. Preferentemente, la sonda cubre la secuencia de microsatélites de tipo silvestre completa y se extiende además unos pocos nucleótidos en cada extremo (normalmente de 1 a 10 nucleótidos, en particular, de 2 a 8, preferentemente de 2 a 6, lo más preferentemente de 2 a 5 o de 2 a 4) para conferir tanto su capacidad para unirse adecuadamente como la desestabilización resultante en caso de inestabilidad del microsatélite. Dicho de otra manera, el tamaño de la sonda está diseñado para conferir su capacidad de unirse adecuadamente a la secuencia de microsatélites de tipo silvestre, al tiempo que previene la hibridación de las sondas MS en presencia de una mutación en la secuencia de microsatélites.
La segunda sonda de la divulgación (también denominada sonda REF) se hibrida con una segunda secuencia diana de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN amplificado, que no incluye dicha secuencia de microsatélites. En particular, dicha segunda sonda puede superponerse parcialmente con dicha secuencia de microsatélites o estar situada fuera de dicha secuencia de microsatélites. Preferentemente, la segunda sonda de acuerdo con la divulgación está situada fuera de dicha secuencia de microsatélites.
Se pueden seleccionar como diana diversos loci de secuencias de microsatélites en la primera secuencia diana de tipo silvestre de acuerdo con la divulgación. Los loci o marcadores de secuencias de microsatélites a los que se puede dirigir de acuerdo con la divulgación se describen en particular en Bacheret al.,2004 Disease Markers 20, 237-250, así como en Hauseet al.,2016 Nat Medicine, Nov. 22(11):1342-1350). Preferentemente, los loci de secuencias de microsatélites específicos (o marcadores de microsatélites) se seleccionan de microsatélites que se encuentran altamente asociados con tumores positivos para MSI, en función de su frecuencia de inestabilidad en adenocarcinomas de colon, endometrio, recto y estómago. Preferentemente, los loci de secuencias de microsatélites dirigidos se encuentran en regiones frecuentemente amplificadas en tumores.
Por ejemplo, se puede seleccionar un locus de secuencias de microsatélites diana de BAT-25, BAT-26, BAT-34c4, BAT-40, NR21, NR24, MONO-27, D2S123, D5S346, D17S250, ACVR2A, DEFB105A, DEFB105B, RNF43, DOCK3, GTF2IP1, LOC100093631, PIP5K1A, MSH3, TRIM43B, PPFIA1 y TDRD1.
En una realización, el locus de secuencias de microsatélites diana también puede seleccionarse entre el grupo de Bethesda, que comprende BAT-25, BAT-26, D2S123, D5S346 y D17S250.
Se ha demostrado que los loci de repetición de mononucleótidos son muy susceptibles a la alteración en tumores con sistemas de reparación de emparejamientos incorrectos de ADN disfuncionales (Parsons, 1995, anteriormente citado), lo que hace que dichos loci sean particularmente útiles para la detección de cáncer y otras enfermedades asociadas con sistemas de reparación de emparejamientos incorrectos de ADN disfuncionales, de modo que pueden preferirse los marcadores mononucleótidos de<m>S<i>.
En una realización de la divulgación, un locus de secuencias de microsatélites diana es BAT-26 y/o ACVR2A y/o DEFB105A y DEFB105B.
De forma más general, los loci de secuencia de microsatélite adecuados a los que se puede dirigir de acuerdo con la divulgación son secuencias de microsatélites cortas (que normalmente comprenden de 8 a 30, en particular, de 8 a 25, preferentemente, de 8 a 20, lo más preferentemente de 8 a 15 o de 8 a 12 nucleótidos) tal como el locus de secuencias de microsatélites diana ejemplificado en el grupo que consiste en D2S123, D5S346, D17S250, ACVR2A, DEFB105A, DEFB105B, RNF43, DOCK3, GTF2IP1, LOC100093631, PIP5K1A, MSH3, TRIM43B, PPFIA1 y TDRD1.
Dependiendo del locus del microsatélite, también se pueden utilizar sondas de diversos tamaños y contenidos de G/C. Por ejemplo, pueden utilizarse sondas de más de 30 nucleótidos y/o con un contenido de G/C inferior al 30 %. Este es, en particular, el caso de BAT-26. A modo de ejemplo, se puede utilizar una sonda MS de SEQ ID NO: 4, que se hibrida con una secuencia que incluye la secuencia de microsatélites BAT-26. Los cebadores de secuencias SEQ ID NO: 1 y 2 así como la sonda REF y la sonda MS de SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, representan un conjunto ilustrativo de cebador/sonda que se puede utilizar de acuerdo con la divulgación.
De acuerdo con la presente divulgación, la amplificación del fragmento de ADN diana se produce con una técnica de PCR digital. Normalmente, en dicha técnica, la solución de PCR se divide en múltiples compartimentos o nanogotas, que están hechos para ejecutar la PCR individualmente. Normalmente, también la mayoría de los compartimentos o nanogotas contienen 0 o 1 copia del fragmento de ADN diana que se va a amplificar.
Para sortear los problemas técnicos asociados con la amplificación de secuencias de baja complejidad, tales como la secuencia de microsatélites, se pueden proporcionar una serie de modificaciones a la guía de Biorad para ddPCR como se mencionó anteriormente, para lograr una hibridación adecuada de la sonda MS con los alelos TS. Se puede aumentar la temperatura de hibridación de la reacción y/o el tiempo de extensión. La temperatura de hibridación normal de acuerdo con las directrices de Biorad es de 55 °C. Dicha temperatura de hibridación puede aumentarse de manera ventajosa de 3 a 15 °C. El ciclo térmico se realiza hasta el final. Por lo tanto, después de múltiples ciclos de amplificación por PCR (es decir, después de completar los ciclos de PCR), los datos de PCR sin procesar se recopilan después mediante la medición de la señal de fluorescencia asociada con las sondas REF y MS para cada nanogota.
Las nanogotas que contienen fragmentos diana TS muestran una señal de fluorescencia positiva doble procedente de la hibridación de las sondas REF y MS (nanogotas REF+/MS+).
La no hibridación (o hibridación ineficaz) de la sonda MS en nanogotas que contienen alelos de microsatélites mutados conduce a un cambio de la nube de nanogotas en el gráfico 2D, hacia una única población REF positiva (REF+), que es proporcional a la fracción de nanogotas que contienen alelos de microsatélites mutantes.
Normalmente, los datos brutos de dPCR (o ddPCR) se recopilan después del ciclo de PCR mediante la lectura o medición de la señal de fluorescencia asociada con las sondas REF y M<s>para cada nanogota.
La etapa de recogida de datos de la PCR generalmente se realiza en un detector óptico (por ejemplo, en ddPCR se puede utilizar el lector de nanogotas Bio-Rad QX-100). Preferentemente, se utiliza al menos un sistema de detección de dos colores (por ejemplo, para detectar marcadores fluorescentes FAM y HEX o VIC). Las nubes de nanogotas normalmente se pueden establecer en gráficos 2D mediante el trazado del nivel de fluorescencia de cada sonda por nanogota. En algunas realizaciones, el análisis se puede lograr con el programa informático adecuado (tal como el programa informático QuantaSoft v1.7.4 para ddPCR o el paquete de ddPCR en R [https://cran.rproject.org/web/packages/ddpcr/index.html]. Quantasoft permite la asignación manual de las nanogotas a la población (es decir, nubes) positiva de REF única o doble positiva para REF/MS. El paquete R define umbrales de forma automática para evitar sesgos que podrían introducirse mediante la asignación manual.
El número de nanogotas positivas para la sonda de referencia (sonda REF) se puede utilizar para cuantificar el número total de fragmentos de ADN diana en la muestra. A continuación, la fracción de nanogotas positivas se puede ajustar a una distribución de Poisson para determinar el número de copias inicial absoluto del fragmento de ADN diana en la mezcla de reacción de entrada en unidades de copias/pl.
En las nanogotas que contienen un ADN diana de tipo silvestre (sin mutación en la secuencia MS diana), se observa una señal de fluorescencia máxima para las sondas REF y MS. Por el contrario, en las nanogotas que contienen una secuencia mutada en el fragmento de ADN diana amplificado (es decir, una mutación en la secuencia de microsatélites), se observa un cambio en la intensidad de la fluorescencia para la señal asociada con la sonda MS.
Lo más preferentemente, la reacción de PCR digital está diseñada para garantizar que la mayoría de las nanogotas contengan 0 o 1 copia del fragmento de ADN diana (en particular, dependiendo de la cantidad de ADN cargado en la reacción). En estas condiciones, se puede observar una separación óptima entre las nubes de microsatélites TS (señales REF+/MS+) y mutados (o MSl) (señal REF+ única). Cabe señalar que, debido a la variabilidad biológica, las nanogotas clasificadas en la señal REF+ única pueden estar incluida una señal MS residual(es decir,no significativa). Un experto en la materia puede determinar un umbral por debajo del cual una señal MS se considera como "una señal MS residual" de acuerdo con técnicas clásicas de análisis de señales. Dicho umbral normalmente se puede establecer utilizando el paquete R como se mencionó anteriormente. Normalmente, la frecuencia de alelos mutantes se puede determinar a partir del recuento de nanogotas mediante la asignación manual de nubes de nanogotas de microsatélites TS y mutados. Como se ha mencionado anteriormente, la identificación de una población de nanogotas con una única señal a partir de la sonda REF indica la presencia de una secuencia de microsatélites mutada en la muestra de ADN.
La frecuencia de alelos mutantes que se puede determinar como se mencionó anteriormente se puede comparar con una frecuencia de alelos mutados de control obtenida a partir de una muestra de ADN de control. La muestra de ADN de control puede ser una muestra de tipo silvestre o una muestra o estirpe celular recogida en un sujeto, diagnosticado con un tumor positivo para MSI o con una enfermedad asociada con una mutación en la reparación de emparejamientos incorrectos del ADN, en un momento anterior, durante el curso temporal de la enfermedad y/o durante el curso temporal del tratamiento.
Como se utiliza en el presente documento, el término "muestra" se refiere a cualquier cosa que pueda contener ADN y, en particular, el fragmento de ADN que se va a amplificar. En alguna realización, la "muestra" contiene ARN y, por lo tanto, se somete a una etapa de transcripción inversa. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un líquido biológico o un tejido biológico. Ejemplos de líquidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad, jugo pancreático, jugo gástrico, líquido amniótico, líquidos serosos, tal como líquido pericárdico, líquido pleural o líquido peritoneal.
Los tejidos biológicos son agregados de células, generalmente de un tipo particular junto con su sustancia intercelular que forman uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, vegetal, bacteriana, fúngica o vírica, incluidos los tejidos conectivo, epitelial, muscular y nervioso. Ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tejido tumoral, ganglios linfáticos, arterias y célula(s) diseminada(s). El tejido puede estar fresco, recién congelado o fijado, tal como los tejidos fijados con formol e incluidos en parafina (FFIP). La muestra se puede obtener por cualquier medio, por ejemplo, mediante un procedimiento quirúrgico, tal como una biopsia, o mediante un método menos invasivo, que incluye, pero sin limitación, abrasión o aspiración con aguja fina. Preferentemente, la muestra de ADN se selecciona del grupo que consiste en: tejido tumoral, células diseminadas, deposiciones, células sanguíneas, plasma sanguíneo, suero, ganglios linfáticos, orina, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad, jugo pancreático, jugo gástrico, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, líquidos serosos, tal como líquido pericárdico, líquido pleural o líquido peritoneal.
El ADN y, en particular, el fragmento de ADN diana pueden ser ADN genómico o ADN emitido a partir de transcriptasa inversa. El ADN genómico puede ser ADN constitucional, ADN tumoral o ADN fetal. En algunas realizaciones, en especial cuando la muestra es un líquido biológico, la muestra de ADN puede contener ADN extracelular (ADNec) o<a>D<n>circulante. Los primeros estudios han demostrado que el ADN tumoral se libera a la circulación y está presente en concentraciones particularmente elevadas en plasma y suero en varios tipos diferentes de cáncer (Leonet al.,1977 Cancer Res 37:646-650; Strounet al.,1989 Oncology 46:318-322). Por lo tanto, la muestra de ADN de acuerdo con la divulgación puede contener ADN tumoral extracelular o ADN tumoral circulante. En otra realización, la muestra de ADN contiene ADN fetal extracelular. Debido a su elevada sensibilidad, el método de la divulgación se puede utilizar en una muestra de plasma que contiene una baja concentración de ADN diana circulante o extracelular, tal como ADN tumoral o ADN fetal extracelulares o circulantes. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el ADN se puede obtener a partir de la transcripción inversa de una muestra de ARN.
Normalmente, una muestra de ADN de acuerdo con la divulgación se obtiene de un sujeto. El sujeto, o el paciente, (ambos términos se pueden utilizar indistintamente) de la divulgación es un mamífero, normalmente un primate, tal como un ser humano. En algunas realizaciones, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y puede tener cualquier edad adecuada, incluyendo bebés, juveniles, adolescentes, adultos y sujetos geriátricos. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no primate, tal como un roedor.
En algunas realizaciones de la divulgación, el sujeto tiene un cáncer, está en remisión de un cáncer o está en riesgo de padecer un cáncer, en particular, debido a sus antecedentes familiares. En algunas realizaciones, por ejemplo, el sujeto tiene predisposición familiar a tumores.
En alguna realización, el sujeto padece, está en remisión o tiene predisposición familiar al cáncer, en particular, el sujeto padece o corre el riesgo de padecer una enfermedad provocada por mutaciones en genes reparadores de emparejamientos incorrectos (MMR), tal como el síndrome de deficiencia de reparación de emparejamientos incorrectos constitucionales (síndrome CMMRD) o el síndrome de Lynch.
El cáncer puede ser un cáncer sólido o un "tumor líquido", como los cánceres que afectan a la sangre, la médula ósea y el sistema linfoide, también conocidos como tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, que incluyen principalmente leucemia y linfoma. Los tumores líquidos incluyen, por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y leucemia linfoblástica crónica (LLC), (incluidos varios linfomas, como el linfoma de células del manto o el linfoma no de Hodgkins (LNH).
Los cánceres sólidos incluyen en particular los cánceres que afectan a uno de los órganos seleccionados del grupo que consiste en colon, recto, piel, endometrio, pulmón (que incluye el carcinoma broncopulmonar no microcítico), útero, huesos (tales como osteosarcoma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, fibrosarcoma, tumores de células gigantes, adamantinomas y cordomas), hígado, riñón, esófago, estómago, vejiga, páncreas, cuello uterino, cerebro (tales como meningiomas, glioblastomas, astrocitomas de grado inferior, oligodendrocitomas, tumores hipofisarios, schwannomas y cánceres cerebrales metastásicos), ovario, mama, región de cabeza y cuello, testículos, próstata y la glándula tiroides.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, el cáncer es el síndrome de deficiencia de reparación de emparejamientos incorrectos constitucional (síndrome CMMRD) o el síndrome de Lynch.
En el contexto de la presente divulgación, un cáncer (o un tumor) asociado con la MSI también se denomina cáncer positivo para MSI (o tumor positivo para MSI) y se relaciona con un cáncer (o tumor) en donde el ADN genómico del tumor presenta al menos una mutación en una secuencia de microsatélites. Por tanto, un cáncer positivo para MSI puede ser cualquiera de los cánceres enumerados anteriormente en donde el ADN genómico del tumor presenta al menos una mutación en una secuencia de microsatélites.
Aplicaciones clínicas: métodos de diagnóstico y pronóstico, tratamiento terapéutico y seguimiento del paciente.
El método para identificar una secuencia de microsatélites mutada en un fragmento de ADN diana como se describe anteriormente tiene varias aplicaciones clínicas principales y directas.
En primer lugar, como se ha mencionado anteriormente, la inestabilidad de microsatélites es un fenotipo hipermutador que se produce en tumores asociados con alteraciones de la reparación de emparejamientos incorrectos (MMR) del ADN. Por lo tanto, la MSI se ha asociado con una gran variedad de cánceres, tales como, pero sin limitación, cánceres colorrectales, cáncer gástrico, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer del tracto urinario, cáncer de cerebro y cáncer de mama. La MSI es más frecuente como consecuencia del cáncer de colon. Normalmente, la MSI se encuentra en el síndrome de deficiencia de reparación de emparejamientos incorrectos constitucionales (síndrome CMMRD) o el síndrome de Lynch.
Por tanto, la detección de una secuencia de microsatélites mutada de acuerdo con el método descrito anteriormente se puede utilizar en el diagnóstico de cánceres como se definió anteriormente, en particular de los cánceres (como se definió anteriormente) que están asociados con una reparación deficiente emparejamientos incorrectos del ADN y, en particular, con cánceres (o tumores) positivos para MSI.
En una realización de la divulgación, la detección de una secuencia de microsatélites mutada de acuerdo con el método también se puede utilizar en el diagnóstico de enfermedades provocadas por mutaciones en genes de reparación de emparejamientos incorrectos (MMR), tales como tumores positivos para MSI, en particular tales como el síndrome de deficiencia de reparación de emparejamientos incorrectos constitucionales (síndrome CMMRD) o el síndrome de Lynch, o en el diagnóstico de la predisposición familiar a tumores en un sujeto.
Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para el diagnóstico de cánceres, en particular de enfermedades asociadas con mutaciones en genes de reparación de emparejamientos incorrectos (MMR), tales como tumores positivos para MSI, y/o de predisposición tumoral familiar al cáncer en un sujeto, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un ADN diana a partir de una muestra de ADN de acuerdo con la presente divulgación. Normalmente, el ADN diana es ADN genómico procedente de un tumor. La muestra se puede obtener de un sujeto como se describió anteriormente. En una realización, la detección de una secuencia de microsatélites mutada en una muestra de ADN de un sujeto indica que el sujeto padece una enfermedad provocada por mutaciones en los genes de MMR, tales como tumores positivos para MSI, en particular, CMMRD o síndrome de Lynch. La detección de una secuencia de microsatélites mutada en una muestra de ADN de un sujeto también puede indicar que el sujeto tiene predisposición familiar a tumores, tal como en el CMMRD o el síndrome de Lynch.
Las mutaciones en los genes de MMR incluyen la adición, eliminación o sustitución, en particular variaciones de un solo nucleótido (SNV), así como epimutaciones (tales como la hipermetilación del ADN).
La prevalencia de tumores positivos para MSI es mayor en cánceres colorrectales, cánceres gástricos y cánceres de endometrio. Sin embargo, se ha encontrado que la MSI tiene una prevalencia más baja en prácticamente todos los tipos de cáncer (véase Hauseet al.,2016 Nature Medicine), aunque con baja prevalencia. Como se ha mencionado anteriormente, el fenotipo de MSI del cáncer (es decir, positivo o negativo) tiene implicaciones importantes en el pronóstico del cáncer y la planificación racional del tratamiento (Boland y Goel, Gastroenterology 2010). Por tanto, incluso en el caso de cánceres con baja prevalencia positiva de MSI, sigue siendo de gran importancia identificar si el paciente padece un tumor positivo para MSI o un tumor negativo para MSI. Por tanto, el método de la presente divulgación se puede utilizar en el pronóstico de diversos cánceres. La identificación de un cáncer positivo para MSI generalmente se asocia con un mejor pronóstico.
Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un método para el pronóstico de cánceres (como se definió anteriormente) que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de una muestra de ADN de acuerdo con la presente divulgación. En alguna realización, la identificación de una secuencia de microsatélites mutada en la muestra, preferentemente una muestra de ADN procedente de un tumor, indica que dicho tumor es positivo para MSI.
En los contextos terapéuticos mencionados anteriormente, los métodos de la divulgación son particularmente útiles ya que su gran sensibilidad permite la detección de inestabilidad de microsatélites en muestras de ADN que contienen concentraciones muy bajas de ADN diana. Por lo tanto, el método de la divulgación se puede realizar de forma rutinaria en muestras biológicas, tales como muestras de sangre, muestras de plasma, orina o incluso heces. Normalmente, los métodos de la divulgación se realizan en una muestra de sangre o una muestra de plasma y el ADN diana es ADN extracelular, tal como ADN tumoral circulante. Este punto es particularmente importante para enfermedades tales como CMMRD, que implican un tumor cerebral sin acceso a biopsia.
La presente divulgación también se refiere a un método para predecir la eficacia de un tratamiento, ya que los informes han demostrado, por ejemplo, que los pacientes con cáncer colorrectal con deficiencia de m Mr tienen mejores respuestas a la inmunoterapia mediante el bloqueo del punto de control inmunitario PD-1 y muestran una mejor supervivencia sin progresión. Por tanto, la identificación de pacientes que padecen cáncer asociado con MSI (es decir, cáncer o tumor positivo para MSI) es de gran importancia clínica para la selección de una estrategia terapéutica adecuada.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para predecir la eficacia de un tratamiento en un sujeto que padece cáncer, en donde dicho método comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento de ADN diana de una muestra de ADN diana como se describió anteriormente. Preferentemente, el fragmento de ADN diana procede de un tumor. Normalmente, la muestra de ADN se obtiene de un sujeto que padece un tumor y/o que tiene predisposición familiar al cáncer.
La presente divulgación también proporciona un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesita, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento de ADN diana de una muestra de ADN de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. Normalmente, el fragmento de ADN diana procede de un tumor. Normalmente, también la muestra de ADN se obtiene de un sujeto que padece un tumor y/o que tiene predisposición familiar al cáncer.
Preferentemente, el tratamiento es la inmunoterapia. La inmunoterapia incluye, entre otros, moduladores de puntos de control inmunitarios (es decir, inhibidores y/o agonistas), anticuerpos monoclonales, vacunas contra el cáncer.
Lo más preferentemente, el tratamiento comprende la administración de moduladores de puntos de control inmunitario, tales como inhibidores anti-PD-1 y/o anti-PDL-1.
Preferentemente, se administra inmunoterapia al sujeto si se detecta una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un ADN diana (en particular, un ADN tumoral diana) de una muestra de ADN.
Asimismo, el método de la divulgación para detectar la inestabilidad de microsatélites también se puede utilizar para el seguimiento de un sujeto diagnosticado con un tumor asociado con una reparación de emparejamientos incorrectos de ADN deteriorada. Preferentemente, dicho seguimiento se realiza durante el transcurso del tratamiento. El método también puede utilizarse para el seguimiento de la recaída del cáncer en un sujeto que ha padecido un tumor asociado con una reparación deficiente de emparejamientos incorrectos del ADN.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente divulgación también proporciona un método para el seguimiento de un paciente diagnosticado con un tumor asociado con una reparación deficiente de emparejamientos incorrectos del ADN, o que ha padecido dicho tumor, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un ADN tumoral diana a partir de una muestra de ADN seleccionada de una muestra de plasma o de suero obtenida de un sujeto diagnosticado con un tumor asociado con una reparación deficiente de emparejamientos incorrectos del ADN o que ha padecido un tumor asociado con una reparación deficiente de emparejamientos incorrectos del ADN. En pacientes que han padecido un tumor asociado con una reparación deficiente de emparejamientos incorrectos del ADN, la detección de inestabilidad de microsatélites en el ADN tumoral circulante puede ser indicativa de una recaída.
Ensayos múltiples para la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un ADN diana a partir de una muestra de ADN
El poder de detectar la presencia de MSI en tejidos asociados con una enfermedad particular, tales como tumores cancerosos, se puede aumentar enormemente mediante la multiplexación de múltiples marcadores. Por lo tanto, en el contexto de la divulgación, se puede utilizar más de un conjunto de cebador/sonda, como se definió previamente, en un ensayo múltiple de modo que pueda dirigirse a más de un locus de secuencias de microsatélites (es decir; un grupo de loci de secuencias de microsatélites) como se definió previamente.
A modo de ejemplo, los loci de secuencias de microsatélites del grupo para ensayos múltiples de acuerdo con la divulgación se pueden seleccionar del grupo que consiste en BAT-25, B<a>T-26,<b>A<t>-34<c>4, BAT-40, NR21, NR24, MONO-27, D2S123, D5S346, D17S250, ACVR2A, DEFB105A, DEFB105B, RNF43, DOCK3, GTF2IP1, LOC100093631, PIP5K1A, MSH3, TRIM43B, PPFIA1 y TDRD1 y en cualquiera de los grupos definidos previamente.
Dicho ensayo múltiple es particularmente útil en las aplicaciones clínicas descritas anteriormente.
Preferentemente, en los ensayos múltiples, los pares de cebadores se diseñan mediante programas informáticos disponibles de modo que, tras la amplificación, se predice que los amplicones resultantes tendrán la misma temperatura de fusión.
Cuando se encuentra en el intervalo digital (donde todos los compartimentos contienen 0 o 1 molécula diana), es posible realizar ensayos múltiples de qPCR sin preocuparse por la competencia o la reactividad cruzada, ya que cada reacción que contiene la diana procederá con la unión de la diana a sus cebadores/sonda específicamente, mientras que en compartimentos sin dianas no se producirá ninguna reacción. Tener cada molécula en un compartimento de reacción separado permite contar dianas de alta y baja abundancia en el mismo experimento sin preocuparse por "inundar" la diana de baja abundancia (ya que cada compartimento tiene como máximo 1 diana, independiente de su concentración en el volumen medio de muestra). Cuando se cuenta más de una diana (por ejemplo, en un formato de ensayo doble), las proporciones de los recuentos de una diana con respecto a otra (por ejemplo, alelo mutante frente a alelo de tipo silvestre) permiten cuantificar las "proporciones absolutas", utilizando una de las dianas como referencia de normalización interna (por ejemplo, cuántos equivalentes de genoma amplificables se cargaron) que ha pasado por el experimento idéntico al de las otras dianas analizadas.
Además, dado que la dPCR se realiza como una reacción de punto final (la PCR se ejecuta hasta su finalización antes de medir la fluorescencia), tener verdaderas moléculas diana únicas aisladas permite la multiplexación basada en la intensidad de la sonda (Zhong, Bhattacharya,et al.,2011 Multiplex digital PCR: breaking the one target per color barrier of quantitative PCR. Lab Chip, 11:2167-2174). Mediante la adición en el ensayo de fluorescencia específico de la diana a una concentración limitante, un compartimento con esa molécula diana será positivo para la PCR, pero con un brillo limitado en el punto final de la PCR. Para contar un segundo tipo de diana, se añade una sonda específica de diana diferente con el mismo "color" (es decir, con el mismo fluoróforo) a una concentración diferente. Un compartimento con la segunda diana tendrá una señal más brillante en el punto final de la PCR que un compartimento con la primera diana, lo que proporciona nubes separadas y permite así recuentos separados para cada diana. Por lo tanto, se pueden utilizar combinaciones de sondas de diferentes colores y de diferentes concentraciones para multiplexar a niveles más elevados.
Kits:
La presente divulgación también abarca un kit para identificar una mutación en una región de secuencias de microsatélites de una muestra de ADN que comprende un conjunto de cebador/sonda que comprende:
- un par de cebadores adecuados para amplificar un fragmento de ADN diana de dicha muestra de ADN que incluye dicha secuencia de microsatélites;
- una primera sonda oligonucleotídica, marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda oligonucleotídica es complementaria a una secuencia de tipo silvestre que incluye la secuencia de microsatélites; - una segunda sonda oligonucleotídica, marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda oligonucleotídica es complementaria a una secuencia de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN amplificado situado fuera de dicha secuencia de microsatélites;
- una ADN polimerasa termoestable,
en donde dichas sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador.
Las ADN polimerasas termoestables se describen normalmente en Newton y Graham 1994 en: PCR, BIOS Scientific Publishers, Ltd., Oxford, Reino Unido. 13. De manera ventajosa, la polimerasa termoestable es la polimerasa Taq. En un aspecto, el kit comprende más de un conjunto de cebador/sonda, en donde los conjuntos de cebador/sonda permiten la amplificación y detección de fragmentos de ADN diana que comprenden distintas secuencias de microsatélites.
El kit mencionado anteriormente se puede utilizar en las aplicaciones clínicas descritas anteriormente.
Descripción de las figuras
Figura 1: A a C.Gráficos 2-D de dispersión de amplitud de fluorescencia del ensayo BAT-26 ddPCR MSI utilizando ADN de la estirpe celular HCT-116 (MSI-H), PBMC (TS) o una dilución del 10 % de HCT-116 en ADN TS.D a F.
Gráficos 2-D de dispersión de amplitud de fluorescencia del ensayo DEFB105A/B ddPCR MSI utilizando ADN de la estirpe celular<h>C<t>-116 (MSI-H), PBMC (TS) o una dilución del 10 % de HCT-116 en ADN TS.G a I. Gráficos 2-D de dispersión de amplitud de fluorescencia del ensayo ACVR2A ddPCR MSI utilizando ADN de la estirpe celular HCT-116 (MSI-H), PBMC (TS) o una dilución del 10 % de HCT-116 en ADN TS.
Las nanogotas que contienen alelos TS son positivas para las señales FAM y VIC, mientras que las nanogotas que contienen alelos MSI son positivas únicamente para la señal VIC.
Figura 2:Curvas de correlación obtenidas para ensayos BAT-26(A),DEFB105A/B (B) y ACVR2A(C)para MAF observadas frente a esperadas en diluciones en serie de mutantes reconstituidos (10 %, 5 %, 2,5 %, 1,25, 0,63 %, 0,31 %, 0,16 %, 0,08 %, 0,04 %, 0,02 % y 0,01 %). Línea de puntos: LDB, estimado como la CI superior del 95 % de identificaciones falsas positivas en al menos 53 reacciones de ddPCR independientes con ADN TS.
Figura 3:Correlación entre fracciones de ADNtc estimadas por ensayo de ddPCR BAT-26(A),ACVR2A(B)o DEFB105A/B(C)y un ensayo de ddPCR dirigido específicamente a la mutación BRAFV600E.
Figura 4: diagrama 2-D de dispersión de amplitud de fluorescencia que ilustra las señales de fluorescencia obtenidas con un ensayo triple dirigido simultáneamente a los marcadores microsatélite BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B utilizando una dilución del 10 % de la estirpe celular HCT-116 en ADN TS. Resultados obtenidos con temperatura de hibridación y tiempo de extensión a 63 °C durante 3 min. Las concentraciones de cebadores y sondas fueron: BAT-26: 0,2*; ACVR2A: 0,6*; DEFB105A/B: 1*.
RESULTADOS MATERIALES Y MÉTODOS
Diseño de cebadores y sondas
Los cebadores y sondas se diseñaron con el apoyo del programa informático Primer3Plus (Instituto Whitehead de Investigación Biomédica). Se comprobó la unión no específica de todos los cebadores utilizando Primer BLAST y la ausencia de estructuras secundarias. Los cebadores se diseñaron para generar amplicones de menos de 140 pb para una amplificación óptima del ADN extracelular (ADNec) y del ADN fragmentado extraído de muestras de tumores fijados con formol e incluidos en parafina (FFIP). Las secuencias oligonucleotídicas utilizadas en este estudio se proporcionan en la tabla 1. BAT-26 simple: SEQ ID NO: 1 a 4; ACVR2A simple: SEQ ID NO: 5 a 8; DEFB105A/B simple: SEQ ID NO: 9 a 12; BRAF V600E simple: SEQ ID NO: 13 a 16; BAT-26-ACVR2A-DEFB105A/B triple: SEQ ID NO: 1 a 5, 7, 9, 11, 17 a 20. Invitrogen y Applied Biosystems UK fabricaron cebadores desalados y sondas purificadas por HPLC.
Condiciones de la ddPCR
La PCR digital en nanogotas (ddPCR) se realizó mediante el sistema Bio-Rad QX100 según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR se prepararon en un volumen de 20 pl que contenía 10 pl de Supermix 2x para sondas sin dUTP (Ref. de Bio-Rad 1863024). 900 nM de cada cebador, 250 nM de cada sonda TaqMan® y hasta 16,5 ng de plantilla de ADN, lo que equivale a 5.000 copias. A continuación, la reacción de PCR se transfirió a un casete generador de nanogotas desechable (Ref. Bio-Rad 864008). Se añadieron 70 pl de aceite de generación de nanogotas (Ref. Bio-Rad 1863005) y se cargó el casete en el generador de nanogotas. Las nanogotas generadas (40 pl) se transfirieron a una placa de PCR de 96 pocillos (Ref. Eppendorf 0030 128.575). Después se realizaron reacciones de PCR emulsionadas en un termociclador C1000 (Bio-Rad) en las siguientes condiciones de ciclado: desnaturalización a 95 °C durante 10 min seguido de 40 ciclos de amplificación de 94 °C durante 30 s, 61 °C durante 3 min (BAT-26) o 59 °C durante 3 min (DEFB105A/B) o 55 °C durante 3 min (ACVR2A) o 60 °C durante 1 min (BRAFV600E); retención final a 98 °C durante 10 min. La tasa de aumento de la temperatura se fijó en 2,5 °C/s. En cada ejecución, se incluyeron controles sin ADN y controles que contenían ADN 100 % TS o 100 % mutante. El umbral y la cuantificación de los grupos se realizaron con el programa informático QuantaSoft v1.7.4 (Bio-RAD). Para los ensayos ddPCR MSI, las nanogotas se asignaron manualmente como positivas para TS o MSI en función de su amplitud de fluorescencia: TS, VIC+/FAM+; MSI positivo (mutante), VIC+/FAM'/baj°. A las nanogotas sin plantilla se les asignó VIC'/FAMv La optimización del ensayo se realizó con ADN genómico (ADNg) de la estirpe celular HCT-116 (una estirpe celular de cáncer de colon positiva para MSI) diluido o no en ADN TS obtenido de células mononucleares de sangre periférica (PBMC, del inglésperipheral blood mononuclear cells).A partir del recuento de las nanogotas mediante asignación manual, se determinaron las frecuencias de alelos mutantes (MAF, del inglésmutant allele frequencies).
Cálculos de LDB y LDD
La señal de fondo o la proporción de falsos positivos de cada ensayo se estimó mediante al menos 53 réplicas de ADN TS. El límite del blanco (LDB) se definió como el límite de confianza superior del 95 % de las mediciones medias de falsos positivos. La sensibilidad analítica se estimó mediante diluciones en serie de la estirpe celular HCT-116 en ADN TS, en frecuencias de alelos mutantes (MAF) que van del 10 % al 0,01 % (diluciones en serie 1:2). El número total de réplicas por punto de dilución varió de 3 a 8 (10 % y 5 %, 3*; 2,5 % y 1,25 %, 4*, 0,63 % a 0,16 %, 6*; 0,08 % a 0,01 %, 8*) para maximizar la detección de acontecimientos raros. El límite de detección (LDD) se estimó como la concentración mutante más baja que probablemente se distinga de manera fiable del LDB.
Validación de los ensayos ddPCR MSI en muestras de pacientes
Se utilizaron muestras de tejido tumoral fijado con formol e incluido en parafina (FFIP), plasma o suero de pacientes con cáncer predominantemente colorrectal (CCR) o carcinomas de endometrio (CE) para validar los ensayos ddPCR MSI. T odas las muestras se obtuvieron de pacientes tratados e inscritos en estudios clínicos en el Institut Curie (París, Francia), con aprobación del Consejo de ética de investigación clínica de la institución. Las muestras se seleccionaron de un conjunto de tumores con estabilidad de microsatélites (MSS) o inestabilidad de microsatélites (MSI-H), identificados mediante el método de PCR quíntuple (Bacheret al.,2004) en asociación o no con tinción inmunohistoquímica (IHC) de proteínas reparadoras de emparejamientos incorrectos (MMR) (MLH1, MSH2, MHS6 y PMS2). El ADNg de los tejidos tumorales se extrajo mediante el kit Qiagen DNA FFPE Tissue (Ref. Qiagen 56404) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se almacenó a -20 °C. El ADNec se extrajo de 0,5 a 1,8 ml de plasma o suero con el kit QIAamp® Circulating Nucleic Acid (Ref. Qiagen 55114), siguiendo las recomendaciones del fabricante y se almacenó a -20 °C. El ADN se cuantificó mediante el ensayo Qubit dsDNA HS y la amplificación LINE-1 (Ragoet al.,2007). Las reacciones de ddPCR se realizaron como se describe anteriormente. La cantidad total de ADN por reacción varió de 2,5 ng a 10 ng para muestras FFIP y de 1 ng a 10 ng para muestras de plasma o suero.
RESULTADOS
Los ensayos de ddPCR MSI BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B detectan de manera fiable variaciones en el tamaño de los alelos en los microsatélites ubicados en el interior de genes MSH2, ACVR2A y DEFB105A y B, respectivamente
Se desarrollaron ensayos de ddPCR capaces de detectar variaciones en el tamaño de los alelos para 3 marcadores de microsatélites (MS) poli(A) mononucleotídicos: BAT-26, una repetición cuasimonomórfica larga A<27>localizada en el quinto intrón del genMSH2,y dos repeticiones más cortas As y A<9>localizadas en el décimo exón deACVR2Ay en el segundo intrón de los genes parálogosDEFB105A/B,respectivamente (Tabla 1). BAT-26 es uno de los cinco marcadores de microsatélites ampliamente utilizados para determinar el estado de la MSI de los tumores colorrectales y endometriales en la práctica clínica (Suraweeraet al.,2002). Los microsatélites localizados en los genesACVR2AyDEFB105A/Bson nuevos marcadores discriminatorios identificados recientemente a partir del análisis de los datos de secuenciación del exoma TCGA como recurrentemente inestables en tumores MSI-H, en comparación con los tumores MSS (Hauseet al.,2016; Maruvkaet al.,2017). Los tres ensayos se basan en la estrategia de ddPCR de pérdida, que identifica alelos mutados en función de la ausencia de una señal TS (Decraeneet al.,2018). Para cada marcador de microsatélite se diseñaron dos sondas de hidrólisis Taqman en el mismo amplicón. Una sonda de referencia (REF) marcada con VIC, que se hibrida con una secuencia no variable cadena arriba o cadena abajo de la región de microsatélites y una sonda (MS) de pérdida marcada con FAM, que cubre todo el homopolímero poli-A más de 2 a 4 bases en cada lado para conferir su capacidad de unirse adecuadamente y la desestabilización resultante en caso de alelos mutados asociados con la inestabilidad de microsatélites. Mientras que la sonda REF cuantifica el número total de copias del amplicón (es decir, fragmentos de ADN BAT-26, ACVR2A o DEFB105A/B), la sonda MS discrimina los alelos TS y MSI debido a una hibridación ineficaz con secuencias mutantes. Por tanto, con este tipo de ensayo, los diagramas de dispersión 2-D de la amplitud de fluorescencia de VIC y FAM pueden mostrar tres posibles grupos de nanogotas: nanogotas sin plantilla (VIC'/FAM'), nanogotas que contienen alelos TS (VIC+/FAM+) y nanogotas que<contienen alelos positivos para MSI (VIC+/FAM'/baj°) (Figuras>1<a a 1I).>
Dada la baja complejidad de la sonda MS, se tuvieron que realizar ajustes a las condiciones convencionales de ddPCR (directrices BioRAD) para lograr una hibridación específica con los alelos TS. Se observó que un protocolo de termociclado con mayor temperatura de hibridación y tiempo de hibridación/extensión mejoró significativamente la especificidad de la sonda MS para los alelos TS y, en consecuencia, mejoró la separación de las nubes positivas para TS y MSI. Los ensayos optimizados pudieron detectar de manera específica alelos MSI en el ADN extraído de la estirpe celular HCT-116 MSI-H, mientras que no se pudo observar inestabilidad en el ADN TS procedente de células<mononucleares de sangre periférica>(PB<m>C)<(Figuras 1A y 1B para BAT-26; 1D y 1E para DEFB105A/B; 1G y 1H para>ACVR2A). Así mismo, los tres ensayos pudieron cuantificar con precisión los alelos de MSI en diluciones 1/10 de la estirpe celular HCT-116 en un fondo TS (Figuras 1C, 1F, 1I).
Los ensayos de ddPCR BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B son altamente específicos y alcanzan un límite de detección inferior al 0,1 %
La especificidad analítica de los ensayos ddPCR MSI de BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B se evaluaron mediante la medición de identificaciones de MSI falsas positivas en al menos 53 reacciones de ddPCR individuales de ADN TS procedente de PBMC (número promedio de copias por reacción: 4520 para BAT-26; 3380 para ACVR2A y 3740 para DEFB105A/B). Las proporciones medias de falsos positivos fueron: 0,006908 ± 0,01366 % para BAT-26<(identificaciones de m>S<i en 11/53 reacciones), 0,006136 ± 0,01623 % para ACVR2A (identificaciones de MSI en 7/55>reacciones) y 0,005604 ± 0,01911 % para DEFB105A/B (identificaciones de MSI en 5/55 reacciones). El límite de blanco (LDB) de cada ensayo se estimó en 0,01067 % para BAT-26 (Figura 2A), 0,01077 % para DEFB105A/B (Figura 2B) y 0,01052 % para ACVR2A (Figura 2C). La sensibilidad analítica se estimó mediante diluciones en serie de la<estirpe celular HCT-116 en ADN de PBMC>T<s>,<en frecuencias de alelos mutantes (MAF) que van del 10 % al 0,01 %>(diluciones en serie 1:2). El número total de réplicas por punto de dilución varió de 3 a 8 (10 % y 5 %, 3*; 2,5 % y 1,25 %, 4*, 0,63 % a 0,16 %, 6*; 0,08 % a 0,01 %, 8*) para maximizar la detección de acontecimientos raros. Para los tres ensayos, se observaron excelentes correlaciones lineales entre la MAF esperada y observada, lo que indica que los tres ensayos pueden cuantificar con precisión la MSI en una amplia gama de frecuencias, R2 = 0,9984 p <0,0001 para BAT-26 (Figura 2A), R2 = 0,9964 p <0,0001 para DEFB105A/B (Figura 2B) y R2 = 0,9955 p <0,0001 para ACVR2A (Figura 2C). El límite de detección (LDD), estimada como la concentración de mutante más baja que probablemente se pueda distinguir con precisión del LDB se estimó en 0,04 % para BAT-26 (Figura 2A) y 0,08 % para<los marcadores DEFB105A/B (Figura 2B) y ACVR2A (Figura 2C). Se concluyó que los tres ensayos m>S<i ddPCR son>altamente sensibles y específicos, lo que promete una mayor precisión diagnóstica y el uso sin precedentes de un biomarcador de MSI en biopsias líquidas para el diagnóstico y seguimiento del tratamiento y la progresión de la enfermedad.
Pruebas ddPCR MSI en muestras clínicas
A continuación, se evaluó el rendimiento de los ensayos ddPCR MSI BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B en 177 muestras de tumores FFIP obtenidas predominantemente de pacientes con cánceres colorrectales o de endometrio (Tabla 2). Estas muestras habían sido previamente caracterizadas como MSI positivas (MSI-H, n = 94) o MSI negativo (MSS, n = 83) mediante el método convencional de electroforesis capilar por PCR múltiple que evalúa la inestabilidad<de los microsatélites en 5 marcadores de microsatélites: BAT-26, n>R-21,<BAT-25,>M<o>N<o>-27<y NR-24. Las muestras>que mostraron inestabilidad para al menos 2 de los 5 marcadores se consideraron positivas para MSI (MSI-H), mientras que las muestras que no mostraron inestabilidad se clasificaron como MSI negativas (MSS). De manera destacada, la ddPCR y los siguientes análisis se realizaron a con enmascaramiento, sin conocimiento del estado MSI de las muestras. Como se muestra en la tabla 2, MSI ddPCR identificó alelos inestables para marcadores BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B en 92, 87 y 81 muestras, respectivamente. Cabe destacar que en BAT-26 se obtuvieron resultados concordantes entre electroforesis capilar y ddPCR para 172 de las 177 muestras analizadas. Para 3 de las 5 muestras discordantes, el estado de BAT-26 no se pudo determinar mediante electroforesis capilar, pero fue definido como inestable por ddPCR. Para las otras 2 muestras discordantes, BAT-26 se clasificó como inestable mediante electroforesis capilar, pero se informó como estable e indeterminado por ddPCR. Considerando una muestra como MSI-H si se encontró inestabilidad para al menos 2 de los 3 marcadores ddPCR analizados, MSI ddPCR pudo clasificar correctamente el 100 % (83/83) de las muestras de MSS como MSS y el 94 % (88/94) de las muestras de MSI-H como MSI-H. Cabe destacar que, la mayoría de los casos discordantes correspondieron a muestras de tumores de endometrio (4/6), que son más difíciles de clasificar que los cánceres colorrectales y más propensos a resultados falsos negativos (Suraweeraet al.,2002; Wanget al.,2017).
Dada la elevada sensibilidad y especificidad de los ensayos MSI ddPCR, a continuación, se evaluó su desempeño en 22 muestras de plasma o suero recogidas de 12 pacientes con tumores colorrectales o endometriales en estadio IV MSI-H. Los ensayos destacables de MSI ddPCR fueron capaces de detectar la inestabilidad de microsatélites en todas las muestras analizadas, incluidas muestras con bajas frecuencias de alelos mutantes, cercanas al 0,2 % (Tabla 3). Así mismo, cinco de estos 12 pacientes tenían tumoresBRAFmutados(BRAFV600E). Por tanto, las frecuencias de alelos mutantes informadas por los ensayos MSI ddPCR podrían compararse directamente con las obtenidas con un ensayo ddPCR que se dirige específicamente la mutación deBRAFV600E. Se obtuvieron excelentes correlaciones (R2 = 0,9852 p <0,0001 para BAT-26, R2 = 0,9603 p <0,0001 para ACVR2A y R2 = 0,9275 p <0,0001 para DEFB105A/B), lo que respalda aún más la fiabilidad de los ensayos ddPCR MSI para la detección y cuantificación del ADN tumoral circulante (Figuras 3A a 3C). En conjunto, estos resultados demuestran que los ensayos MSI ddPCR pueden detectar con precisión MSI en muestras de pacientes y, por lo tanto, se pueden utilizar como método alternativo para pruebas de MSI en tejido tumoral y biopsias líquidas en la práctica clínica.
Desarrollo de un ensayo múltiple
A continuación, el objetivo fue desarrollar un ensayo MSI ddPCR múltiple que pueda detectar de manera simultánea el estado de MSI para los marcadores BAT-26, ACVR2A y DEFB105A/B en una única reacción. La estrategia múltiple consistió en variar las concentraciones de cebadores y sondas para cambiar la fluorescencia del punto final de modo que los grupos de nanogotas positivas para TS y MSI para los 3 marcadores pudieran distinguirse entre sí (véase la guía de multiplexación de PCR digital en nanogotas de Bio-Rad). Se probaron diferentes cebadores y sondas, así como diversas combinaciones de concentración de cebadores y sondas, temperatura de hibridación y tiempo de extensión, algunas de las cuales generaron resultados satisfactorios. En la figura 4 se presenta un ejemplo obtenido con temperatura/tiempo de hibridación/extensión a 63 °C durante 3 minutos y las siguientes combinaciones de cebador/sonda: BAT-26, SEQ ID NO: 1-4, 0.2*; ACVR2A, SEQ ID NO: 5, 7, 17 y 18, 0,6* y DEFB105A/B, SEQ ID NO: 9, 11, 19 y 20, 1*. Estos resultados, aunque preliminares, demuestran la viabilidad de multiplexar ensayos ddPCR dirigidos a diversas secuencias de microsatélites en una sola reacción.
Tabla 1.Lista de cebadores sondas
continuación
Tabla 2. (parte 1/4)Patrones de inestabilidad obtenidos por pentaplex-PCR (*BAT-26, NR-21, BAT-25, Mono-27 y NR-24) y ensayos de MSI ddPCR en muestras de tumores FFPE. ND: no determinado
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Tabla 3.Frecuencias de alelos mutantes obtenidas mediante ensayos ddPCR MSI en muestras de líquidos corporales recogidas de pacientes con tumores colorrectales o endometriales en estadio IV MSI-H. Los pacientes con tumores BRAFV600E mutados están marcados con un asterisco
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Claims (11)
1. Un método para detectar una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN, que comprende una etapa de someter dicha muestra de ADN a una reacción en cadena de la polimerasa digital (dPCR) en presencia de una solución de PCR que comprende:
- un par de cebadores adecuados para amplificar dicho fragmento diana de la muestra de ADN que incluye dicha secuencia de microsatélites;
- una primera sonda oligonucleotídica de hidrólisis de MS (MS), marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda oligonucleotídica MS es complementaria a una secuencia de tipo silvestre que incluye la secuencia de microsatélites;
- una segunda sonda oligonucleotídica de hidrólisis de referencia (REF), marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda oligonucleotídica REF es complementaria a una secuencia de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN diana ubicado fuera de dicha secuencia de microsatélites, en donde dichas sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento diana de la muestra de ADN es ADN genómico constitucional.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el fragmento diana de la muestra de ADN es ADN tumoral genómico.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el locus de secuencias de microsatélites se selecciona del grupo que comprende BAT-25, BAT-26, BAT-34c4, BAT-40, NR21, NR24, MONO-27, D2S123, D5S346, D17S250, ACVR2A, DEFB105A, DEFB105B, RNF43, DOCK3, GTF2IP1, LOC100093631, PIP5K1A, MSH3, TRIM43B, PPFIA1 y TDRD1.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de ADN se selecciona del grupo que consiste en tejido tumoral, células diseminadas, deposiciones, células sanguíneas, plasma sanguíneo, suero, ganglios linfáticos, orina, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, mucosidad, jugo pancreático, jugo gástrico, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo y líquidos serosos.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de medir las señales de fluorescencia asociadas con las sondas REF y MS, en donde la señal de intensidad de fluorescencia máxima asociada con las sondas REF y MS indica la presencia de una secuencia de microsatélites de tipo silvestre en el fragmento de ADN diana, mientras que un cambio en la señal de intensidad de fluorescencia asociada con la sonda MS indica la presencia de una mutación en la secuencia de microsatélites del fragmento de ADN diana.
7. Un método para el diagnóstico de cánceres, enfermedades asociadas con mutaciones en genes de reparación de emparejamientos incorrectos (MMR) o predisposición familiar a tumores en un sujeto, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un ADN diana a partir de una muestra de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento diana procede de un tumor.
8. Un método para el pronóstico de cánceres que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento diana procede de un tumor.
9. Un método para predecir la eficacia de un tratamiento en un sujeto que padece un cáncer, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento diana procede de un tumor y en donde el tratamiento es preferentemente terapia inmunitaria, tal como terapia de puntos de control inmunitario.
10. Un método para el seguimiento de un paciente diagnosticado con un tumor asociado con una reparación defectuosa de emparejamientos incorrectos del ADN (MMR), o que ha padecido dicho tumor, que comprende la detección de una mutación en un locus de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento diana de la muestra de ADN procede de un tumor.
11. Un kit para identificar una mutación en una región de secuencias de microsatélites de un fragmento diana de una muestra de ADN que comprende:
- un par de cebadores adecuados para amplificar dicho fragmento diana a partir de la muestra de ADN que incluye dicha secuencia de microsatélites;
- una primera sonda oligonucleotídica de hidrólisis (MS), marcada con un primer fluoróforo, en donde dicha primera sonda oligonucleotídica es complementaria a una secuencia de tipo silvestre que incluye la secuencia de microsatélites;
- una segunda sonda oligonucleotídica de hidrólisis (REF), marcada con un segundo fluoróforo, en donde dicha segunda sonda oligonucleotídica es complementaria a una secuencia de tipo silvestre de dicho fragmento de ADN amplificado ubicado fuera de dicha secuencia de microsatélite;
- una polimerasa termoestable,
en donde dichas sondas de hidrólisis tienen un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda oligonucleotídica y un desactivador.
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