ES2978498T3

ES2978498T3 - Utilización de una composición que comprende un exosoma derivado de células madre adiposas como ingrediente eficaz en el alivio de la dermatitis

Info

Publication number: ES2978498T3
Application number: ES18824926T
Authority: ES
Inventors: Yong Weon Yi; Byong Seung Cho
Original assignee: Exocobio Inc
Current assignee: Exocobio Inc
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2024-09-13
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: EP3639832B1; KR20190128146A; JP2020534247A; US20200121723A1; EP3639832A4; US11612621B2; JP6970459B2; CN111148520A; EP3639832A2; EP3639832C0; KR20190003316A; CN111148520B; KR20190003336A

Abstract

La presente invención proporciona una composición que comprende exosomas derivados de células madre adiposas como un ingrediente eficaz para prevenir, aliviar, reducir o tratar la dermatitis. Al actuar sobre múltiples dianas de citocinas causantes de la dermatitis, una composición según la presente invención se puede aplicar a un amplio espectro de dermatitis atribuidas a diversas causas y puede suprimir o reducir eficazmente la dermatitis. Además, la composición de la presente invención puede reducir la evaporación de humedad del estrato córneo y mejorar la humectación de la piel para proteger y reforzar las barreras cutáneas, con lo que se puede prevenir, aliviar, reducir o tratar la dermatitis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización de una composición que comprende un exosoma derivado de células madre adiposas como ingrediente eficaz en el alivio de la dermatitis

CAMPO TÉCNICO

[0001] La presente invención se refiere a una composición para su utilización en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica, incluyendo la composición exosomas derivados de células madre derivadas del tejido adiposo como principio activo, en la que los exosomas se aíslan de un medio acondicionado obtenido mediante el cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo.

[0002] Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica, una preparación externa para la piel y una composición cosmética que incluye la composición anterior para su utilización en prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis.

[0003] En el presente documento se describe, pero no se reivindica, una tecnología clínica y comercialmente relevante capaz de obtener una gran cantidad de exosomas derivados de células madre derivadas del tejido adiposo que son clínicamente aplicables para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis y tienen alta pureza y una distribución uniforme del tamaño de partícula, en la que la tecnología puede proporcionar una composición que incluye, como principio activo, los exosomas obtenidos que tienen una excelente actividad funcional, en grandes cantidades a bajo coste.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

[0004] La piel del cuerpo humano es un órgano que protege física y químicamente protege el cuerpo del exterior y realiza las funciones bioquímicas necesarias para el metabolismo de todo el cuerpo. En general, las enfermedades inflamatorias de la piel que aparecen en la piel humana se denominan dermatitis. La dermatitis relativamente común incluye dermatitis atópica, dermatitis de contacto, dermatitis seborreica y similares.

[0005] La dermatitis de contacto es una dermatitis causada por el contacto con sustancias extrañas. La dermatitis de contacto se clasifica, según el mecanismo de desarrollo, en dermatitis de contacto irritante y dermatitis de contacto alérgica, y un tipo de sustancia puede provocar estas dos respuestas de manera simultánea. La mayoría de las sustancias que causan la dermatitis de contacto son compuestos orgánicos. Se sabe que cuando las sustancias que causan dermatitis entran nuevamente en contacto con la piel sensibilizada por dichas sustancias, las células de memoria las reconocen para secretar diversas sustancias químicas que causan inflamación.

[0006] La dermatitis atópica es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel caracterizada por picazón y lesiones de eczema. Estudios anteriores han demostrado que varios factores intervienen en el desarrollo de la dermatitis atópica. Cuando se produce la dermatitis atópica, se observan células relacionadas con la inflamación, tales como eosinófilos, neutrófilos y mastocitos, en el sitio de la lesión, y aumenta la inmunoglobulina IgE producida a partir de mastocitos. Además, aparece una proliferación anormal de células T, y en este proceso aumentan las citocinas inflamatorias IL-4, IL-5, IL-13, etc., amplificando así las respuestas inmunitarias. Recientemente, se ha sabido que la linfopoyetina del estroma tímico (TSLP,thymic stromal lymphopoietin)se asocia con la gravedad de la dermatitis y causa síntomas de picazón en la dermatitis atópica. Además, la dermatitis seborreica es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel que se presenta en el cuero cabelludo; cara, especialmente cejas, nariz, piel alrededor de los labios y orejas; axilas; pecho; y zona inguinal; donde la secreción de sebo aumenta debido al aumento de la actividad de las glándulas sebáceas.

[0007] Basándose en los resultados de la investigación antes mencionados, se han realizado esfuerzos para desarrollar agentes terapéuticos para la dermatitis que traten la dermatitis mediante inflamación y supresión inmunitaria. Los agentes terapéuticos para la dermatitis desarrollados hasta la fecha incluyen esteroides, antihistamínicos e inmunosupresores, tales como la ciclosporina A. Sin embargo, estos agentes tienen problemas porque causan efectos secundarios graves, tales como atrofia de la piel, vasodilatación, despigmentación, hipersensibilidad en el lugar de la inyección, resistencia, neutropenia y similares. Además, estos agentes tienen limitaciones porque simplemente ayudan a controlar los síntomas hasta un nivel apropiado en lugar de un tratamiento radical.

[0008] En vista de estos problemas, se han llevado a cabo activamente estudios sobre agentes terapéuticos para la dermatitis basados en sustancias naturales. En el caso de agentes terapéuticos para la dermatitis basados en estas sustancias naturales, la cantidad de un principio activo en el extracto natural es baja y, por tanto, es necesario utilizar una gran cantidad del extracto natural para obtener el efecto de tratar la dermatitis. En la mayoría de los casos, en la comercialización se ha enfatizado el hecho de que estas composiciones están basadas en sustancias naturales, pero es necesaria una mayor investigación científica sobre las eficacias prácticas de las sustancias naturales en el tratamiento de la dermatitis.

[0009] Paralelamente, se han propuesto procedimientos para regenerar y tratar la piel utilizando células madre. Las células madre embrionarias o las células madre derivadas de tejido fetal tienen una excelente capacidad de diferenciación y excelentes capacidades de regeneración y tratamiento, y causan menos rechazo, pero estas células madre no son clínicamente aplicables debido a cuestiones éticas y al riesgo potencial de formación de tumores. Como alternativa a esto, se han propuesto procedimientos para regenerar y tratar la piel utilizando células madre adultas. Sin embargo, el uso de células madre adultas alogénicas, no de células madre adultas autólogas del paciente, puede suponer un riesgo de causar enfermedad de injerto contra huésped. Cuando se utilizan células madre adultas autólogas para el tratamiento, surge el problema de que es necesario un proceso de cultivo de células madre adultas aisladas de un paciente, lo cual es complicado y costoso.

[0010] En los últimos años, en vista de los problemas de las células madre descritos anteriormente, se han realizado intentos de regenerar o tratar la piel usando medios acondicionados obtenidos mediante el cultivo de células madre adultas. Sin embargo, los medios acondicionados de las células madre adultas contienen no sólo diversas proteínas, citocinas y factores de crecimiento secretados por las células madre adultas, sino también componentes, tales como productos de desecho secretados durante el crecimiento de las células, antibióticos añadidos para evitar la contaminación, suero de origen animal y similares. Por tanto, cuando los medios acondicionados se utilizan sobre la piel, es muy probable que la piel quede expuesta a diversos riesgos.

[0011] Recientemente, ha habido informes de que los secretomas celulares contienen diversas moléculas bioactivas que regulan los comportamientos celulares. En particular, los secretomas celulares contienen un "exosoma" que tiene funciones de señalización intercelular y, por tanto, se han llevado a cabo de manera activa estudios sobre sus componentes y funciones.

[0012] Las células excretan varias vesículas membranosas a su entorno extracelular, y estas vesículas liberadas se denominan habitualmente vesículas extracelulares (EV). La vesícula extracelular también se denomina vesícula derivada de la membrana celular, ectosoma, vesícula de excreción, micropartícula, exosoma, etc., y también se usa de forma discriminatoria del exosoma en algunos casos.

[0013] El exosoma es una vesícula de decenas a cientos de nanómetros de tamaño, que consiste en una membrana de bicapa de fosfolípidos que tiene la misma estructura que la membrana celular. Este exosoma contiene proteínas, ácidos nucleicos (ARNm, miARN, etc.) y similares que se denominan carga de exosoma. Se sabe que la carga del exosoma incluye una amplia gama de factores de señalización, y estos factores de señalización son específicos de los tipos de células y se regulan de manera diferente según el entorno de las células secretoras. Se sabe que el exosoma es un mediador de señalización intercelular secretado por las células, y varias señales celulares transmitidas a través del mismo regulan los comportamientos celulares, incluida la activación, el crecimiento, la migración, la diferenciación, la desdiferenciación, la apoptosis y la necrosis de las células diana. El exosoma contiene materiales genéticos específicos y factores bioactivos según la naturaleza y el estado de las células de las que se derivó el exosoma. El exosoma derivado de células madre proliferantes regula comportamientos celulares, tales como la migración, proliferación y diferenciación celular, y recapitula las características de las células madre involucradas en la regeneración de tejidos (Nature Review Imunology 2002 (2) 569-579).

[0014] Sin embargo, aunque se han realizado varios estudios que sugieren una posibilidad para el tratamiento de algunas enfermedades utilizando exosomas, se requieren estudios clínicos y no clínicos más detallados y, en particular, existe la necesidad de desarrollar una tecnología que utilice exosomas. que se pueda aplicar para el tratamiento de una variedad de enfermedades, identificando científicamente una variedad de dianas sobre las cuales actúan los exosomas.

[0015] Los inventores de la presente invención se han esforzado por desarrollar un agente terapéutico que sea superior y más seguro que los agentes terapéuticos convencionales conocidos con respecto a la dermatitis acompañada de picazón e inflamación. En consecuencia, los inventores de la presente invención han realizado estudios extensos sobre el nuevo uso de exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo y, como resultado, han descubierto que los exosomas aislados del medio acondicionado de células madre derivadas de tejido adiposo pueden resolver los problemas de seguridad de las propias células madre derivadas de tejido adiposo o de los medios acondicionados como se describió anteriormente, y son eficaces para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis, completando así la presente invención.

[0016] Paralelamente, debe entenderse que la materia descrita como antecedentes de la técnica pretende simplemente ayudar a comprender los antecedentes de la presente invención y no se admiten como técnica anterior frente a la presente invención.

[0017] El documento KR-A-20160109019 describe una inyección intravenosa de células madre derivadas de tejido adiposo humanas o su medio de cultivo para tartar la dermatitis atópica.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

[0018] Un objetivo de la presente invención es dar a conocer una composición para su utilización según la reivindicación 1. En particular, con respecto a la composición para su utilización según la presente invención, la composición es capaz de actuar contra múltiples dianas de citocinas que inducen dermatitis y, por tanto, se puede aplicar ampliamente contra la dermatitis causada por diversos factores, suprimir y aliviar de manera eficaz la dermatitis.

[0019] En la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica, una composición externa para la piel o una composición cosmética.

[0020] Se describe y no se reivindica la obtención de una gran cantidad de exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo que tienen alta pureza y una distribución uniforme del tamaño de partícula.

[0021] Se describe y no se reivindica un procedimiento para prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis utilizando la composición.

[0022] Se describe y no se reivindica un procedimiento cosmético para regular las afecciones de la piel de los mamíferos, excepto con fines de tratamiento, mediante el uso de la composición.

[0023] Sin embargo, los objetivos de la presente invención descritos anteriormente son ilustrativos y el alcance de la presente invención no se limita a los mismos. Además, otros objetivos y ventajas de la presente invención resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y los dibujos adjuntos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0024] Para lograr los objetivos anteriores, la presente invención da a conocer una composición para su utilización en prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis atópica según la reivindicación 1.

[0025] Se describe y no se reivindica una nueva tecnología clínica y comercialmente relevante capaz de obtener una gran cantidad de exosomas derivados de células madre derivadas del tejido adiposo que son clínicamente aplicables para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis y tienen una alta pureza y una distribución uniforme del tamaño de partículas, en la que la tecnología puede proporcionar una composición que incluye, como principio activo, los exosomas obtenidos que tienen una excelente actividad funcional, en grandes cantidades a bajo coste.

[0026] Tal como se usa en el presente documento, el término "exosomas" se refiere a vesículas de decenas a cientos de nanómetros de tamaño (preferiblemente, de 30 a 200 nm), que consisten en una membrana bicapa de fosfolípidos que tiene la misma estructura que la de la membrana celular (sin embargo, el tamaño de partícula de los exosomas varía según el tipo de célula de la que se aíslan los exosomas, un procedimiento de aislamiento y un procedimiento de medición) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes”, Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). Estos exosomas contienen proteínas, ácidos nucleicos (ARNm, miARN, etc.) y similares que se denominan carga de exosomas. Se sabe que la carga de los exosomas incluye una amplia gama de factores de señalización, y estos factores de señalización son específicos de los tipos de células y se regulan de manera diferente según el entorno de las células secretoras. Se sabe que los exosomas son mediadores de señalización intercelular secretados por las células, y diversas señales celulares transmitidas a través de ellos regulan los comportamientos celulares, incluida la activación, el crecimiento, la migración, la diferenciación, la desdiferenciación, la apoptosis y la necrosis de las células diana.

[0027] Tal como se usa en el presente documento, el término "iontoforesis" se refiere a un procedimiento para hacer fluir una microcorriente a través de la piel a la que se ha aplicado un principio activo, generando de ese modo una diferencia de potencial y cambiando el entorno eléctrico de la piel, y permitiendo así que un principio activo ionizado penetre la piel mediante repulsión eléctrica. Entre los ejemplos de iontoforesis que se describen, pero no se reivindican, se incluyen: un procedimiento para introducir una microcorriente en la piel permitiendo que la microcorriente fluya desde una fuente de energía externa hacia un parche de electrodo en la piel, la microcorriente generada por la fuente de energía externa; un procedimiento para introducir una microcorriente en la piel, la microcorriente generada por una batería proporcionada en un parche de electrodo sobre la piel; y un procedimiento para introducir una microcorriente en la piel a través de un parche sobre la piel provisto de un dispositivo de electrodiálisis inversa, la microcorriente generada por la diferencia de concentración entre la solución de electrolitos de alta concentración y la solución de electrolitos de baja concentración en el dispositivo de electrodiálisis inversa.

[0028] Se describieron los efectos limitados de los exosomas derivados de células madre derivadas del tejido adiposo sobre la mejora de las arrugas y la regeneración de la piel. Además, se ha descrito que los exosomas derivados de células madre neurales en lugar de células madre derivadas del tejido adiposo son eficaces para el tratamiento de lesiones cerebrales y el tratamiento de una enfermedad inflamatoria causada por el rechazo de un trasplante de células madre. Sin embargo, nunca se supo que el uso de exosomas aislados y purificados a partir de medios acondicionados de células madre derivadas del tejido adiposo fuera eficaz para "el tratamiento de la dermatitis atópica" y similares.

[0029] Se ha desarrollado un agente terapéutico que permite aplicar clínicamente los exosomas para el tratamiento de la dermatitis atópica, en el que los exosomas se aíslan económicamente y se purifican en gran cantidad a partir del medio acondicionado de células madre derivadas del tejido adiposo obtenidas después de cultivar células madre derivadas de tejido adiposo que pueden cultivarse en masa. Las células madre derivadas del tejido adiposo se pueden obtener en grandes cantidades mediante un procedimiento sencillo, tal como la liposucción. El tejido adiposo tiene 40 veces más células madre que la médula ósea, el cordón umbilical o la sangre del cordón umbilical. Así, estas células madre derivadas del tejido adiposo tienen el coste comercial más bajo y se obtienen en gran cantidad. Sin embargo, dado que el tejido adiposo contiene una gran cantidad de impurezas, tales como restos celulares, desechos, proteínas y macropartículas, es difícil aislar económicamente una gran cantidad de exosomas, que tengan una alta pureza y una distribución uniforme del tamaño de las partículas, del medio acondicionado de células madre derivadas del tejido adiposo. Por lo tanto, parece que existen barreras técnicas para aislar una gran cantidad de exosomas, que tienen una alta pureza y una distribución uniforme del tamaño de partículas, de los medios acondicionados de células madre derivadas de tejido adiposo en términos de economía.

[0030] Cuando la composición para su utilización de la presente invención se aplica como una composición farmacéutica, tal como una preparación inyectable o una preparación externa para la piel, los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo contenidos en la composición como principio activo exhiben efectos notables sobre la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica, y pueden superar el problema de seguridad de las propias células madre o del medio acondicionado de las células madre. Por tanto, los exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo contenidos en la composición para su utilización en prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis atópica según la presente invención previenen, alivian o tratan la dermatitis atópica mediante un mecanismo que es completamente diferente del mecanismo de mejora limitada de las arrugas y regeneración de la piel conocido en la técnica convencional, y debe entenderse que estos efectos no son en absoluto predecibles a partir de la técnica convencional.

[0031] La presente invención da a conocer una composición para su utilización en prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis atópica, que incluye exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo como principio activo, en la que los exosomas se aíslan de un medio acondicionado obtenido mediante el cultivo de células madre derivadas del tejido adiposo, según la reivindicación 1.

[0032] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, los exosomas se pueden obtener realizando las siguientes etapas: (a) añadir trehalosa a un medio acondicionado de células madre derivadas de tejido adiposo; (b) filtrar el medio acondicionado al que se le ha añadido trehalosa; (c) aislar exosomas del medio acondicionado filtrado mediante filtración de flujo tangencial (TFF); y (d) añadir trehalosa a un tampón para diafiltración y realizar diafiltración en los exosomas aislados mediante TFF usando el tampón al que se le ha añadido trehalosa.

[0033] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, cuando se añade trehalosa al tampón para diafiltración en la etapa (d), se pueden obtener de manera eficaz exosomas que tienen una distribución uniforme del tamaño de partícula y alta pureza (véanse las figuras 6A a 6E).

[0034] Paralelamente, en la presente invención, la trehalosa sirve para discriminar de manera eficaz los exosomas de impurezas, tales como restos celulares, desechos, proteínas y macropartículas.

[0035] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, la diafiltración se puede realizar de forma continua o discontinua. La diafiltración se puede realizar usando un tampón que tenga al menos 4 veces, preferiblemente al menos 6 a 10 veces, más preferiblemente, al menos 12 veces, el volumen de los exosomas aislados.

[0036] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, la TFF se puede realizar usando un filtro de TFF que tiene un límite de peso molecular (MWCO) de 100.000 Da (Dalton), 300.000 Da, 500.000 Da o 750.000 Da, o un filtro de 0,05 |jm.

[0037] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, la etapa (c) puede comprender además concentrar los exosomas aislados hasta un volumen de 1/100 a 1/25 por TFF.

[0038] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, los exosomas pueden disminuir los niveles de expresión de IL-4 e IL-31 en tejido o células de la piel. Además, los exosomas pueden disminuir el nivel de expresión de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en IL-23 y TNF-a en tejido o células de la piel.

[0039] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, los exosomas pueden disminuir el nivel de IgE en sangre y el número de leucocitos y eosinófilos en sangre.

[0040] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, los exosomas pueden disminuir el número de mastocitos, células CD86+ y células CD206+ en el tejido de la piel.

[0041] En la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, el tipo de células madre derivadas de tejido adiposo no está particularmente limitado, siempre y cuando no representen un riesgo de infección con un patógeno y no provoquen rechazo inmunológico, pero preferiblemente pueden ser células madre derivadas de tejido adiposo humano.

[0042] Se describe y no se reivindica que la composición se puede usar eficazmente para la dermatitis de contacto, dermatitis de contacto irritante, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis de contacto fototóxica y fotoalérgica, síndrome de urticaria por contacto, dermatitis seborreica, dermatitis de autosensibilización, dermatitis autoinmune por progesterona, dermatitis por estasis, acné o eczema. Se describe y no se reivindica que la composición puede usarse para acné o eczema.

[0043] La composición para su utilización, según una realización de la presente invención, se puede preparar como una composición farmacéutica. Cuando la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, se prepara como una composición farmacéutica, la composición, según una realización de la presente invención, puede ser cualquier formulación para administración oral o parenteral.

[0044] La composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, puede incluir portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables según un procedimiento convencional. Los portadores, excipientes y diluyentes incluyen, pero sin limitarse a los mismos, lactosa, dextrosa, trehalosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma de acacia, alginato, gelatina, fosfato cálcico, carbonato cálcico, silicato cálcico, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. Para su utilización, la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, se puede formular como formas de dosificación oral, tales como polvos, píldoras, comprimidos, cápsulas, suspensiones, emulsiones, jarabes, gránulos, elixires, aerosoles o similares, preparaciones externas para la piel, supositorios o soluciones inyectables estériles.

[0045] La administración de la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, significa introducir una sustancia deseada en un paciente mediante cualquier procedimiento apropiado, y la composición farmacéutica puede administrarse mediante cualquier ruta general, siempre que la sustancia pueda alcanzar un tejido diana. Por ejemplo, la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, se puede administrar por vía oral o parenteral. Las rutas para la administración parenteral pueden incluir administración transdérmica, administración intraperitoneal, administración intravenosa, administración intraarterial, administración intramuscular, administración subcutánea, administración intradérmica, administración tópica, administración intrarrectal y similares. Sin embargo, el alcance de la presente invención no se limita a las mismas y no se excluyen diversos procedimientos de administración conocidos en la técnica. Además, la composición farmacéutica para su utilización, según una realización, puede administrarse mediante cualquier dispositivo a través del cual se pueda administrar un principio activo en un tejido o célula diana. Además, la cantidad eficaz de la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, significa la cantidad necesaria para la administración con el fin de lograr el efecto de tratamiento de la dermatitis atópica.

[0046] Las formulaciones para la administración parenteral de la composición farmacéutica para su utilización, según la presente invención, pueden ser soluciones acuosas esterilizadas, soluciones no acuosas, suspensiones, emulsiones, formulaciones liofilizadas o supositorios. Las formulaciones para la administración parenteral de la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, también se pueden preparar como formulaciones inyectables. Las formulaciones inyectables, según una realización de la presente invención, pueden ser formulaciones inyectables acuosas, formulaciones inyectables no acuosas, inyecciones en suspensión acuosa, inyecciones en suspensión no acuosa, formulaciones inyectables sólidas que se usan después de la disolución o suspensión, etc., pero no se limitan a las mismas. Una formulación inyectable, según una realización de la presente invención, puede comprender además al menos uno de agua destilada para inyección, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de maní, aceite de sésamo, aceite de camelia, etc.), monoglicérido, diglicérido, propilenglicol, alcanfor, benzoato de estradiol, subsalicilato de bismuto, arsenobenzol sódico, sulfato de estreptomicina, dependiendo del tipo de las mismas, y opcionalmente puede comprender además un estabilizador o un conservante.

[0047] El contenido de la composición farmacéutica para su utilización, según una realización, en una formulación se puede seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo, cantidad, forma y similares de los componentes adicionales descritos anteriormente. Por ejemplo, la composición farmacéutica para su utilización de la presente invención puede estar contenida en una cantidad de 0,1 a 99 % en peso, preferiblemente, de 10 a 90 % en peso, basado en el peso total de una formulación inyectable. Además, la dosis adecuada de la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, se puede ajustar dependiendo del tipo de enfermedad del paciente, la gravedad de la enfermedad, el tipo de formulación, el procedimiento de formulación, la edad, el sexo y el peso corporal, estado de salud del paciente, dieta, tasa de excreción, el período de administración y el régimen de administración. Por ejemplo, cuando la composición farmacéutica para su utilización, según una realización de la presente invención, se administra a un adulto, se puede administrar de una a varias veces a una dosis de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg por día.

[0048] Paralelamente, cuando la composición para su utilización, según una realización de la presente invención, se prepara como una preparación externa para la piel y/o una composición cosmética, puede contener adecuadamente componentes que se usan generalmente en productos cosméticos o preparaciones externas para la piel, para por ejemplo, humectantes, antioxidantes, componentes oleosos, absorbentes de rayos UV, emulsionantes, tensioactivos, espesantes, alcoholes, componentes en polvo, colorantes, componentes acuosos, agua y diversos nutrientes para la piel, etc., según sea necesario, dentro del intervalo que no perjudique el efecto de la presente invención.

[0049] Además, la preparación externa de la piel para su utilización, según una realización de la presente invención, puede incluir, además de exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo, un agente para el tratamiento de la dermatitis y/o un humectante, que se usa en la técnica, dentro del intervalo que no perjudica el efecto de los exosomas derivados de células madre derivadas del tejido adiposo, es decir, el efecto de supresión de la dermatitis y el prurito, etc. Por ejemplo, los exosomas de la presente invención pueden estar contenidos o mezclados con al menos uno de hidrogel, ácido hialurónico, sal de ácido hialurónico (por ejemplo, hialuronato de sodio, etc.) o gel de hialuronato. En la preparación externa para la piel para su utilización, según una realización de la presente invención, el tipo de hidrogel no está particularmente limitado, pero el hidrogel se puede obtener preferiblemente dispersando un polímero gelificado en un alcohol polihídrico. El polímero gelificado puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en plurónico, agar purificado, agarosa, goma gellan, ácido algínico, carragenano, goma casia, goma xantana, galactomanano, glucomanano, pectina, celulosa, goma guar y goma de algarroba y el alcohol polihídrico puede ser al menos uno seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, isobutilenglicol, dipropilenglicol, sorbitol, xilitol y glicerina.

[0050] La preparación externa para la piel para su utilización y/o composición cosmética para su utilización, según una realización de la presente invención, se pueden usar en diversas formas, por ejemplo, parches, paquetes de mascarillas, láminas de mascarillas, cremas, tónicos, pomadas, suspensiones, emulsiones, pastas, lociones, geles, aceites, paquetes, aerosoles, pulverizadores de niebla, bases, polvos y toallitas oleosas. Por ejemplo, la preparación externa para la piel y/o la composición cosmética se pueden aplicar o empapar en al menos una superficie de un parche, un paquete de mascarilla o una lámina de mascarilla.

[0051] Cuando la preparación externa para la piel para su utilización, según una realización de la presente invención, se prepara como una composición cosmética, se usa con el fin de prevenir, mejorar o aliviar la dermatitis atópica, y la composición cosmética se puede preparar como cualquier formulación que generalmente se prepara en la técnica. Por ejemplo, puede formularse como parche, paquete de mascarilla, lámina de mascarilla, suavizante de la piel, nutrición, loción astringente, crema nutritiva, crema de masaje, crema para los ojos, crema limpiadora, esencia, esencia para los ojos, loción limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, protector solar, lápiz labial, jabón, champú, limpiador que contiene surfactante, preparación para el baño, loción corporal, crema corporal, aceite corporal, esencia corporal, limpiador corporal, tinte para el cabello, tónico para el cabello, etc., pero no se limita a los mismos.

[0052] La preparación externa para la piel para su utilización y/o la composición cosmética para su utilización, según una realización de la presente invención, contiene componentes que se usan habitualmente en preparaciones externas para la piel y/o productos cosméticos. Por ejemplo, la preparación externa para la piel para su utilización y/o la composición cosmética para su utilización pueden contener adyuvantes y portadores convencionales, tales como antioxidantes, estabilizadores, solubilizantes, vitaminas, pigmentos y fragancias. Además, los expertos en la técnica pueden seleccionar adecuadamente sin dificultad otros componentes en cada formulación para la preparación externa para la piel para su utilización y/o la composición cosmética para su utilización dependiendo del tipo o uso previsto de la preparación externa para la piel y/o la composición cosmética.

[0053] Se describe y no se reivindica un procedimiento cosmético para regular las afecciones de la piel de los mamíferos, excepto con fines de tratamiento, mediante el uso de la composición cosmética. En el procedimiento cosmético, regular las condiciones de la piel significa mejorar las condiciones de la piel y/o regular profilácticamente las condiciones de la piel, y mejorar las condiciones de la piel significa un cambio positivo perceptible de forma visual y/o táctil en la apariencia y sensación del tejido de la piel.

[0054] El procedimiento cosmético incluye: (a) aplicar la composición cosmética directamente a la piel de un mamífero; o (b) poner en contacto o unir un parche, un paquete de mascarilla o una lámina de mascarilla, que tiene la composición cosmética aplicada a los mismos o empapada en los mismos, a la piel del mamífero; o realizando secuencialmente (a) y (b).

[0055] El procedimiento cosmético puede comprender además realizar la iontoforesis permitiendo que una microcorriente fluya a través de la piel del mamífero a la que se le ha aplicado la composición cosmética. Además, el procedimiento cosmético puede comprender además poner en contacto o unir un dispositivo de iontoforesis a la piel del mamífero.

[0056] En el procedimiento cosmético, el dispositivo de iontoforesis puede incluir al menos una batería seleccionada del grupo que consiste en pilas flexibles, pilas secundarias de iones de litio, pilas alcalinas, pilas secas, pilas de mercurio, pilas de litio, pilas de níquel-cadmio y pilas de electrodiálisis inversa, o puede incluir un parche, un paquete de mascarilla o una hoja de mascarilla proporcionada con al menos una batería.

[0057] Se describe y no se reivindica un procedimiento para prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis que comprende administrar a un mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica.

[0058] En el procedimiento para prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis, el mamífero puede ser seres humanos, perros, gatos, roedores, caballos, ganado vacuno, monos o cerdos.

EFECTOS VENTAJOSOS

[0059] La composición para su utilización de la presente invención es capaz de reducir la producción de diversas citoquinas inflamatorias y factores relacionados con la inflamación, que causan dermatitis, y previene, mejora, alivia o trata la dermatitis atópica inhibiendo la actividad o la participación de células inmunitarias relacionadas con la inflamación.

[0060] En particular, la composición para su utilización de la presente invención es capaz de actuar contra múltiples dianas de citoquinas que inducen dermatitis y, por tanto, puede aplicarse ampliamente contra la dermatitis atópica causada por diversos factores y suprimir y aliviar de manera eficaz la dermatitis atópica. Además, la composición para su utilización de la presente invención es capaz de regular las dianas de citoquinas cuyos patrones de expresión difieren dependiendo de la etapa leve, moderada o grave de la dermatitis y, por lo tanto, es aplicable para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica. Además, la composición para su utilización de la presente invención es capaz de regular las dianas de citoquinas cuyos patrones de expresión difieren dependiendo del estado agudo o crónico de la dermatitis y, por tanto, puede aplicarse para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica.

[0061] Por consiguiente, la composición para su utilización de la presente invención se usa como una composición farmacéutica, una preparación externa para la piel y una composición cosmética para su utilización en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica.

[0062] Además, se describe, pero no se reivindica, que se pueden obtener exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo que tienen una distribución uniforme del tamaño de partícula y alta pureza en grandes cantidades a bajo coste. Por lo tanto, la presente invención puede proporcionar una composición para su utilización que contiene como principio activo exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo que tienen una excelente actividad funcional, en grandes cantidades a bajo coste. Además, la presente divulgación hace posible escalar los procesos y también es adecuada para las buenas prácticas de fabricación (GMP,Good Manufacturing Practice).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0063]

La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra un procedimiento de aislamiento y purificación de exosomas en un procedimiento de preparación de exosomas a partir de medios de cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo. La Figura 2 muestra los resultados de medir la cantidad relativa de proteínas contenidas en una solución en cada etapa de la preparación de exosomas a partir de medios de cultivo de células madre derivadas del tejido adiposo. La cantidad relativa de proteínas en cada etapa se expresó como la relación relativa entre la cantidad total de proteínas en solución de cada etapa y la cantidad total de proteínas en medios acondicionados de células madre. Los resultados experimentales que se muestran son los resultados obtenidos de dos lotes diferentes, respectivamente.

La figura 3 muestra los resultados de medir la productividad y pureza de los exosomas obtenidos. La productividad de los exosomas se calculó como el número de partículas de exosomas obtenidas por ml de medio acondicionado de células madre (CM), y la pureza de los exosomas se calculó como el número de partículas de exosomas por |jg de proteínas contenidas en una fracción final. Los resultados experimentales que se muestran son los resultados obtenidos de cinco lotes diferentes, respectivamente.

Las Figuras 4A a 4E muestran los resultados del análisis de las propiedades físicas de los exosomas obtenidos. La “figura 4A" muestra la distribución del tamaño de las partículas y el número de partículas obtenidas mediante el análisis de detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS,tunable resistive pulse sensing).La "Figura 4B" muestra la distribución del tamaño de las partículas y el número de partículas obtenidas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA,nanoparticle tracking analysis).La "figura 4C" muestra diferentes aumentos de imágenes de partículas obtenidas mediante análisis de microscopía electrónica transmitida (TEM,transmitted electrón microscopy).La "figura 4D" muestra los resultados del análisis de transferencia Western de exosomas obtenidos según una realización de la presente invención. La “figura 4E" muestra los resultados de la citometría de flujo para CD63 y CD81 en el análisis de los marcadores de exosomas obtenidos.

Las figuras 5A a 5C muestran los resultados del análisis NTA de distribuciones de tamaño de partículas, que indican que mediante la adición de trehalosa se obtienen exosomas que tienen una distribución uniforme del tamaño de partículas y alta pureza. A medida que aumenta la cantidad de trehalosa añadida, se puede obtener una distribución del tamaño de partículas con un único pico.

Las figuras 6A a 6C muestran los resultados del análisis NTA que indican las distribuciones de tamaño de partículas obtenidas dependiendo de si se añadió o no trehalosa en un proceso de preparación de exosomas. La "figura 6A" muestra los resultados obtenidos cuando se añadió trehalosa durante todo el proceso de preparación; la "figura 6B" muestra los resultados obtenidos en el caso de que los medios acondicionados se almacenen por congelación y se descongelen, y a continuación se añadió trehalosa a los medios descongelados; y la "figura 6C" muestra los resultados obtenidos cuando no se añadió trehalosa. La "figura 6D" muestra los resultados de comparar la productividad relativa y la concentración relativa de exosomas aislados mediante los procedimientos de las figuras 6A a 6C. La "figura 6E" muestra el tamaño medio de los exosomas aislados mediante los procedimientos de las figuras 6A a 6C.

La figura 7 muestra resultados experimentales que indican que los exosomas tienen el efecto de reducir la formación de NO, un tipo de reacción inflamatoria. En la figura 7, PBS indica solución salina tamponada con fosfato; DEX indica dexametasona; EXO indica exosomas; CM indica medios acondicionados de células madre derivadas de tejido adiposo; y CM-EXO indica medios acondicionados empobrecidos en exosomas de células madre derivadas de tejido adiposo.

Las figuras 8A a 8C muestran resultados experimentales que comparan el efecto reductor de la formación de NO de los exosomas aislados, con el efecto reductor de la formación de NO de los exosomas aislados mediante un procedimiento de precipitación convencional (PPT). La figura 8A muestra los resultados del análisis NTA de exosomas aislados mediante un procedimiento de precipitación convencional; la figura 8B muestra los resultados del análisis NTA de exosomas aislados; y la figura 8C es un gráfico que compara los efectos reductores de la formación de NO. El grado de reducción en la formación de NO se expresó como una relación relativa (%) con respecto al grado de reducción en la formación de NO por dexametasona (Dex) como control positivo.

La figura 9 muestra resultados que indican que cuando se trataron ratones con atopia inducida (modelo animal 1 con dermatitis inducida) con exosomas, según una realización de la presente invención, se aliviaron los síntomas atópicos. La figura 10 representa gráficos que muestran los resultados de la PCR en tiempo real realizada para examinar cambios en los niveles de expresión de ARNm de las citoquinas inflamatorias IL-4 e IL-31 en muestras obtenidas de la lesión cutánea del modelo animal 1 inducida por dermatitis, después de tratar a los ratones en los que se indujo atopia, con exosomas según una realización de la presente invención.

La figura 11 muestra resultados que indican que cuando se trataron ratones con atopia inducida (modelo animal 2 con dermatitis inducida) con exosomas, según una realización de la presente invención, los síntomas atópicos se aliviaron de una manera dependiendo de la dosis de los exosomas.

La figura 12 representa gráficos que cuantifican y comparan los resultados mostrados en la figura 11.

La figura 13 muestra gráficos que muestran los resultados de la PCR en tiempo real realizada para examinar los cambios en los niveles de expresión del ARNm de las citoquinas inflamatorias IL-4, IL-31, TNF-a e IL-23 en muestras obtenidas de la lesión cutánea de un modelo animal 2 con dermatitis inducida, después de tratar los ratones en los que se indujo atopia, con exosomas según una realización de la presente invención.

La figura 14 representa gráficos que muestran los resultados de medir IgE (A), glóbulos blancos (B) y eosinófilos (C) presentes en la sangre, después de tratar el modelo animal 2 con dermatitis inducida con exosomas según una realización de la presente invención.

La figura 15 muestra los resultados de medir la intensidad de la fluorescencia para identificar exosomas teñidos con PKH67.

La figura 16 representa imágenes microscópicas de fluorescencia que muestran hasta qué punto los exosomas teñidos con fluorescencia se introdujeron en el tejido de la piel porcina. Las imágenes microscópicas de fluorescencia se obtuvieron en un momento determinado después de diluir los exosomas teñidos con fluorescencia de la presente invención con tampón y aplicar la dilución a la superficie de la piel porcina.

La figura 17 muestra imágenes microscópicas de fluorescencia confocal que muestran hasta qué punto los exosomas teñidos con fluorescencia se administraron al tejido de la piel del ratón y gráficos que comparan la intensidad de fluorescencia total obtenida midiendo la intensidad de fluorescencia en cada una de las imágenes. La parte superior de la figura 17 representa imágenes microscópicas de fluorescencia confocal obtenidas después de un cierto tiempo después de diluir los exosomas teñidos con fluorescencia con tampón y aplicar la dilución a la superficie de la piel del ratón.

La figura 18 muestra resultados que indican que los exosomas no eran citotóxicos después de que las células HS68 de fibroblastos humanos fueran tratadas con los exosomas.

La figura 19 muestra fotografías que muestran que el eritema y similares en la piel humana (parte afectada) con dermatitis grave mejoraron notablemente como resultado de aplicar una composición que incluye exosomas a la piel humana (parte afectada) y, a continuación, realizar iontoforesis para permitir que una microcorriente fluya a través de la piel humana (parte afectada) a la que se aplicó la composición.

La figura 20 representa fotografías que muestran que los síntomas atópicos mejoraron notablemente como resultado de la inyección subcutánea de una composición que incluye exosomas, según una realización de la presente invención, en perros pastor de Shetland que padecen dermatitis atópica grave de origen natural.

EJEMPLOS

[0064] En lo sucesivo, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos son sólo para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar o restringir el alcance de la presente invención. Aquello que los expertos en la técnica pueden inferir fácilmente a partir de la descripción detallada y los ejemplos de la presente invención se interpretan como dentro del alcance de la presente invención.

[0065] A lo largo de la presente memoria descriptiva, debe entenderse que, cuando se hace referencia a cualquier pieza como "que comprende" cualquier componente, no excluye otros componentes, pero puede incluir además otros componentes, a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplo 1: Cultivo celular

[0066] Se adquirieron células RAW 264.7 (línea celular de macrófagos de ratón) del Korean Cell Line Bank y se cultivaron. Para el cultivo celular, las células se subcultivaron en medio DMEM (adquirido de ThermoFisher Scientific) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS; adquirido de ThermoFisher Scientific) y antibióticos-antimicóticos al 1 % (adquiridos en ThermoFisher Scientific) a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 %.

[0067] Se subcultivaron células HS68 de fibroblastos dérmicos humanos adquiridas de ATCC en medio DMEM (adquirido de ThermoFisher Scientific) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS; adquirido de ThermoFisher Scientific) y antibióticos-antimicóticos al 1 % (adquiridos de ThermoFisher Scientific) a 37°C bajo CO<2>al 5 %.

[0068] Según un procedimiento de cultivo celular conocido en el campo técnico al que pertenece la presente invención, se cultivaron células madre derivadas de tejido adiposo a 37 °C en una atmósfera de CO<2>al 5 %. A continuación, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (adquirida en ThermoFisher Scientific) y, a continuación, el medio se reemplazó con medio sin suero ni rojo de fenol, y las células se cultivaron durante 1 a 10 días. Se recuperó el sobrenadante (en lo sucesivo denominado "medio acondicionado").

[0069] A efectos de obtener exosomas que tengan una distribución uniforme del tamaño de partícula y alta pureza en un proceso de aislamiento de exosomas, se añadió 2 % en peso de trehalosa al medio acondicionado. Después de la adición de trehalosa, el medio acondicionado se filtró a través de un filtro de 0,22 pm para eliminar impurezas, tales como restos celulares, desechos, macropartículas y similares. Del medio acondicionado filtrado, se aislaron inmediatamente los exosomas. Además, el medio acondicionado filtrado se almacenó en un refrigerador (10 °C o menos) y a continuación se usó para el aislamiento de exosomas. Además, el medio acondicionado filtrado se congeló en un congelador de temperatura ultrabaja a -60 °C o menos, se descongeló y a continuación se sometió a aislamiento de exosomas. Posteriormente, se aislaron los exosomas del medio condicionado mediante TFF.

Ejemplo 2: Aislamiento y purificación de exosomas mediante el procedimiento TFF

[0070] Para aislar, concentrar y diafiltrar exosomas del medio condicionado filtrado a través de un filtro de 0,22 pm en el Ejemplo 1, se utilizó el procedimiento TFF. El medio acondicionado filtrado se sonicó para perder la agregación potencial de exosomas antes de aislar y concentrar los exosomas usando TFF. Como filtro para el procedimiento de TFF, se usó un filtro de cartucho (conocido como filtro de fibra hueca; adquirido en GE Healthcare) o un filtro de casete (adquirido en Pall, Sartorius o Merck Millipore). El filtro de TFF se puede seleccionar con varios límites de peso molecular (MWCO). Usando el filtro que tenía MWCO seleccionado, se aislaron y concentraron exosomas y se eliminaron partículas, proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, compuestos de bajo peso molecular, etc., que son más pequeños que el MWCO.

[0071] Para aislar y concentrar exosomas, se usó un filtro TFF que tenía un MWCO de 100.000 Da (Dalton), 300.000 Da o 500.000 Da. Se aislaron exosomas del medio acondicionado eliminando sustancias más pequeñas que el MWCO y concentrando el medio acondicionado hasta un volumen de 1/100 a 1/25 mediante el procedimiento TFF.

[0072] La solución aislada y concentrada de exosomas se sometió adicionalmente a diafiltración. La diafiltración se realizó de forma continua (diafiltración continua) o de forma discontinua (diafiltración discontinua), usando un tampón que tenía al menos 4 veces, preferiblemente, al menos 6 a 10 veces, más preferiblemente, al menos 12 veces el volumen de los exosomas aislados. Para obtener exosomas que tuvieran una distribución uniforme del tamaño de partículas y alta pureza, se añadió al tampón un 2 % en peso de trehalosa en PBS. Las figuras 6A a 6E muestran los resultados de que mediante la adición de trehalosa, se pueden obtener exosomas que tienen una distribución uniforme de tamaño de partícula y alta pureza con un alto rendimiento.

Ejemplo 3: Análisis de características de exosomas aislados

[0073] Las cantidades de proteínas de los exosomas aislados, el medio acondicionado y las fracciones del proceso de aislamiento de TFF se midieron usando el ensayo colorimétrico BCA (adquirido de ThermoFisher Scientific) o el ensayo de fluorescencia FluoroProfile (adquirido de Sigma). Con respecto a los exosomas aislados y concentrados mediante el procedimiento de TFF, según una realización, se controló mediante los ensayos de proteínas el grado en que se eliminaron proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, compuestos de bajo peso molecular, etc., y los resultados del seguimiento se muestran en la figura 2. Como resultado, se pudo observar que las proteínas presentes en el medio acondicionado se eliminaban de manera muy eficaz mediante el procedimiento de TFF según una realización.

[0074] La figura 3 muestra los resultados de comparar la productividad y pureza de los exosomas en cada uno de cinco lotes independientes cuando los exosomas se aislaron mediante el procedimiento de TFF según una realización. Se analizaron los resultados obtenidos de los cinco lotes independientes y, como resultado, se confirmó que los exosomas se aislaron de manera muy estable mediante el procedimiento de TFF.

[0075] El tamaño de partícula y la concentración de los exosomas aislados se midieron mediante un instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (adquirido de Malvern) o un instrumento de detección de pulso resistivo sintonizable (TRPS) (adquirido de Izon Science). La uniformidad y el tamaño de los exosomas aislados se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las figuras 4A a 4C muestran los resultados de TRPS, NTA y TEM de los exosomas aislados mediante el procedimiento de aislamiento.

[0076] Después de aislar los exosomas mediante el procedimiento TFF, la distribución de tamaño de los exosomas se analizó mediante NTA dependiendo de si se añadió trehalosa. Los resultados del análisis se muestran en las figuras 5A a 5C. La concentración de trehalosa se aumentó del 0 % en peso al 1 % en peso y el 2 % en peso (de arriba a abajo en las figuras 5A a 5C), y el experimento se repitió tres veces. Se confirmó que cuando no se usaba trehalosa, se observaban partículas que tenían un tamaño de 300 nm o más, mientras que a medida que aumentaba la cantidad de trehalosa añadida, el número de partículas que tenían un tamaño de 300 nm o más disminuía y la distribución de tamaño de los exosomas se volvieron uniformes.

[0077] Se examinó adicionalmente el efecto debido a la adición de trehalosa en el proceso de aislamiento de exosomas mediante el procedimiento TFF. Tal como se muestra en las figuras 6A a 6C, cuando se añadió un 2 % en peso de trehalosa en PBS durante todo el proceso de preparación de exosomas, se pudieron obtener exosomas que tenían una distribución de tamaño uniforme (figura 6A). Sin embargo, cuando se usó el medio acondicionado, que había sido almacenado por congelación sin agregar trehalosa, pero el proceso TFF se realizó añadiendo trehalosa solo en el proceso de diafiltración, o el proceso TFF se realizó sin añadir trehalosa, se obtuvieron exosomas desiguales que incluían una gran cantidad de partículas grandes (figuras 6B y 6C).

[0078] Se compararon la productividad relativa y la concentración de los exosomas aislados y, como resultado, se pudieron obtener exosomas con una productividad muy alta cuando se añadió trehalosa durante todo el proceso de producción de exosomas. Los exosomas obtenidos tenían al menos 5 veces la concentración del control (en el que no se añadió trehalosa durante todo el proceso de producción de exosomas) (figura 6D). Tal como se muestra en el resultado del análisis NTA, se confirmó que el tamaño medio de los exosomas aislados era uniforme (200 nm) cuando se añadió trehalosa durante todo el proceso de producción de exosomas (figura 6E).

[0079] La figura 4D muestra los resultados del análisis de transferencia Western de los exosomas aislados mediante el procedimiento de aislamiento. Tal como se muestra en el mismo, se confirmó la presencia de los marcadores CD9,<c>D63, CD81 y TSG101. Como anticuerpos para cada uno de los marcadores se utilizaron anti-CD9 (adquirido de Abcam), anti-CD63 (adquirido de System Biosciences), anti-CD81 (adquirido de System Biosciences) y anti-TSG101 (adquirido de Abcam), respectivamente.

[0080] La figura 4E muestra los resultados de la citometría de flujo de los exosomas aislados mediante el procedimiento de aislamiento. Tal como se muestra en la misma, se confirmó la presencia de los marcadores CD63 y CD81. Para aislar los exosomas CD63 positivos, se utilizó un kit de reactivo de detección/aislamiento de CD63 para exosoma humano (adquirido de ThermoFisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los marcadores se tiñeron con CD63 antihumano de ratón con PE (adquirido de BD) o CD81 antihumano de ratón con PE (adquirido de BD) y a continuación se analizaron utilizando un citómetro de flujo (ACEA Biosciences).

[0081] Tomando los resultados anteriores en conjunto, se podía confirmar que el procedimiento de aislamiento podía aislar y purificar de manera económica y eficaz exosomas que tienen una distribución uniforme de tamaño de partícula y alta pureza con alto rendimiento mediante la adición de trehalosa en el proceso de aislamiento y/o purificación basado en Filtración de flujo tangencial. Además, se pudo observar que los procesos del procedimiento de aislamiento se pueden escalar y también son adecuados para GMP.

Ejemplo 4: Medición de la citotoxicidad después del tratamiento con exosomas

[0082] Para evaluar la citotoxicidad de los exosomas, los aislados mediante el procedimiento de aislamiento, en células HS68 de fibroblastos de piel humana, las células se trataron con diversas concentraciones de los exosomas y se examinó la tasa de proliferación de las células. De manera específica, las células HS68 se suspendieron en d Me M que contenía FBS al 10 % y a continuación se sembraron y se desarrollaron hasta una confluencia del 80 al 90 % y se cultivaron en una incubadora a 37 °C bajo CO<2>al 5 % durante 24 horas. Después de 24 horas, se extrajo el medio y las células se trataron con diversas concentraciones de los exosomas preparados en el Ejemplo 2. A continuación, se evaluó la viabilidad de las células mientras las células se cultivaban durante 24 a 72 horas. La viabilidad celular se midió usando reactivo WST-1 (adquirido de Takara), reactivo MTT (adquirido de Sigma), reactivo CellTiter-Glo (adquirido de Promega) o reactivo alamarBlue (adquirido de ThermoFisher Scientific) con un lector de microplacas (adquirido de Molecular Dispositivos).

[0083] Como control, se utilizaron las células cultivadas en medio de cultivo celular convencional no tratadas con los exosomas . Se confirmó que los exosomas no mostraron citotoxicidad en el intervalo de concentraciones utilizado en la prueba (Figura 18).

Ejemplo 5: Medición de la respuesta inflamatoria utilizando una línea celular de microfagos

[0084] Se suspendieron células RAW 264.7 en medio DMEM que contenía FBS al 10%y se sembraron en cada pocilio de una placa multipocillo dando como resultado una confluencia del 80 al 90 %. Al día siguiente, las células se trataron y cultivaron con una concentración adecuada de los exosomas (exosomas preparados en el Ejemplo 2) diluidos en medio fresco sin suero que contenía LPS durante 1 a 24 horas. Una vez completado el cultivo, se recogió el sobrenadante del cultivo y se midió el NO presente en el medio de cultivo para examinar la respuesta inflamatoria. La respuesta inflamatoria en el medio de cultivo se midió usando un kit de detección de NO (adquirido de Intronbio o Promega). Como control positivo, las células se trataron con dexametasona (adquirida de Sigma).

[0085] Tal como se muestra en la figura 7, se confirmó que cuando las células RAW 264.7 de macrófagos de ratón se trataron con exosomas en presencia de LPS, la producción de NO, una respuesta inflamatoria inducida por LPS, disminuyó de manera dependiente de la concentración. Este resultado muestra que los exosomas tienen una actividad funcional útil para la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis, es decir, una actividad de reducción de la respuesta inflamatoria inducida por LPS, y que los exosomas son útiles como principio activo en una composición para su utilización en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica.

Ejemplo 6: Comparación del efecto reductor de la formación de NO entre procedimientos de aislamiento

[0086] Para comparar el efecto reductor de la formación de NO de los exosomas entre procedimientos de aislamiento, se prepararon exosomas aislados mediante un procedimiento de precipitación convencional además de los exosomas obtenidos mediante el aislamiento y purificación por TFF. El procedimiento de precipitación se realizó según el protocolo del fabricante (System Biosciences). Se confirmó que los exosomas aislados mediante el procedimiento de precipitación convencional (véase la figura 8A) tenía una menor uniformidad de la distribución del tamaño de partículas y varios tamaños de partículas en comparación con los exosomas aislados y purificados mediante el procedimiento de TFF (véase la figura 8B). Además, tal como se muestra en la figura 8C, se confirmó que los exosomas aislados y purificados mediante el procedimiento de TFF inhibieron la formación de NO a un nivel notablemente más alto que los exosomas obtenidos mediante el procedimiento de precipitación convencional. Estos resultados muestran que los exosomas aislados y purificados, tal como se describe, son superiores a los exosomas aislados según el procedimiento convencional, en términos de uniformidad de la distribución del tamaño de partículas y de inhibición de la formación de NO.

[0087] De este modo, los exosomas obtenidos según el procedimiento de aislamiento tienen un rendimiento o actividades funcionales excelentes (por ejemplo, uniformidad de la distribución del tamaño de partículas, inhibición de la producción de NO, reducción de la respuesta inflamatoria, etc.), y la composición para su uso según la presente invención, que contiene, como principio activo, exosomas derivados de células madre que tienen excelentes actividades funcionales, tal como se ha descrito anteriormente, es superior a la técnica convencional en términos del efecto de prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis atópica.

Ejemplo 7: Modelo animal 1 inducido por dermatitis

[0088] Se adquirieron ratones NC/Nga macho (de 16 a 18 g, 5 semanas de edad; adquiridos de Central Laboratory Animal Inc.), se adaptaron durante 7 días y, a continuación, se usaron en este experimento. Los ratones adaptados se dividieron en cinco grupos de la siguiente manera después de inducirles dermatitis.

(1) Normal: grupo de control normal;

(2) Vehículo (grupo inducido con dermatitis): grupo de control negativo en el que se indujo dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico;

(3) IV: un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 se inyectaron por vía intravenosa (IV) a una dosis de 2,8 pg/cabeza tres veces por semana durante dos semanas, después de que se indujera dermatitis con extractos de ácaros del polvo doméstico;

(4) SC: un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 se inyectaron por vía subcutánea (SC) a una dosis de 2,8 pg/cabeza tres veces por semana durante dos semanas, después de que se indujera dermatitis con extractos de ácaros del polvo doméstico; y

(5) Pred: un grupo de prueba en el que se administró prednisolona por vía oral todos los días, después de que se indujera dermatitis con extractos de ácaros del polvo doméstico.

[0089] Se afeitaron las aurículas de cada uno de los ratones NC/Nga (adquiridos de Central Laboratory Animal Inc.) con una navaja y, a continuación, se depilaron aplicando una cantidad adecuada de una sustancia depilatoria. Después de limpiar la sustancia depilatoria, se aplicó de forma uniforme a las aurículas reactivo de inducción de DA (dermatitis atópica) (extractos de ácaros del polvo doméstico; adquirido de BioStir Inc.) mediante la punta de una micropipeta. Después de afeitarse con una navaja, si era necesario, se aplicaron de forma uniforme 150 pl de una solución acuosa de SDS al 4 % a las aurículas mediante la punta de una micropipeta. Después de que las aurículas se secaran con aire frío de un secador y se secaran adicionalmente de forma natural durante 2 a 3 horas, se aplicó reactivo de inducción de DA de forma uniforme a las aurículas mediante una punta de micropipeta. Todos los tratamientos previos se realizaron dos veces por semana durante 3 semanas, es decir, seis veces en total.

[0090] Antes de comenzar la administración de los exosomas preparados en el Ejemplo 2, se realizó una evaluación de la puntuación clínica de la piel. De acuerdo con las puntuaciones clasificadas, los animales se agruparon de manera aleatoria de modo que la puntuación promedio de cada grupo se distribuyera de la forma más uniforme posible.

[0091] La figura 9A representa una fotografía de un ratón con atopia inducida (sin tratamiento) y fotografías que muestran que los síntomas atópicos se alivian mediante el tratamiento con exosomas (IV y SC) según una realización de la presente invención. La figura 9B es un gráfico que muestra la puntuación clínica atópica de cada uno de los grupos de prueba (2) a (5), y tal como se muestra en el mismo, se confirmó que se mejoró la puntuación clínica atópica de los grupos tratados con los exosomas según una realización de la presente invención. Además, la figura 9C es un gráfico que muestra cambios relativos en el grosor de la oreja medido en cada uno de los grupos de prueba (2) a (5) en comparación con el grosor de la oreja del grupo normal (1), y tal como se muestra en el mismo, se confirmó que disminuyó el grosor de la oreja de los grupos tratados con los exosomas según una realización de la presente invención.

[0092] En conjunto, se confirmó a través del experimento que la puntuación clínica de la piel y el grosor de la oreja disminuyeron en los grupos tratados (tanto por vía IV como SC) con los exosomas.

Ejemplo 8: Modelo animal 2 inducido por dermatitis

[0093] Para evaluar el efecto dependiente de la dosis de los exosomas, los ratones se dividieron en 9 grupos tal como se indica a continuación después de inducir la dermatitis, tal como se describe en el Ejemplo 7 anterior.

(1) Normal: grupo de control normal (indicado por "N" en la figura 11);

(2) Control (grupo inducido con dermatitis): un grupo de control negativo en el que se indujo dermatitis con extractos de ácaros del polvo doméstico (indicado por "C" en la figura 11);

(3) IV, L (exosoma, bajo): un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior se inyectaron por vía intravenosa (IV) a una dosis de 0,14 pg/cabeza tres veces por semana durante 4 semanas, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico;

(4) IV, M (exosoma, medio): un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior se inyectaron por vía intravenosa (IV) a una dosis de 1,4 pg/cabeza tres veces por semana durante 4 semanas, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico;

(5) IV, H (exosoma, alto): un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior se inyectaron por vía intravenosa (IV) a una dosis de 10 pg/cabeza tres veces por semana durante 4 semanas, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico;

(6) S<c>, L (exosoma, bajo): un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior se inyectaron por vía subcutánea (SC) a una dosis de 0,14 pg/cabeza tres veces por semana durante 4 semanas, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico;

(7) SC, M (exosoma, medio): un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior se inyectaron por vía subcutánea (SC) a una dosis de 1,4 pg/cabeza tres veces por semana durante 4 semanas, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico;

(8) SC, H (exosoma, alto): un grupo de prueba en el que los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior se inyectaron por vía subcutánea (SC) a una dosis de 10 pg/cabeza tres veces por semana durante 4 semanas, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico; y

(9) Pred: un grupo de prueba en el que se administró prednisolona por vía oral todos los días, después de que se indujera la dermatitis mediante extractos de ácaros del polvo doméstico (indicado por "P" en la figura 11).

[0094] La inducción de la dermatitis se realizó tal como se describe en el Ejemplo 7, y se aplicó una cantidad excesiva de reactivo de inducción de DA, de modo que la puntuación clínica de la piel media en el momento de la administración de los exosomas fue 9. Antes de comenzar la administración de los exosomas preparados en el Ejemplo 2, se realizó una evaluación de la puntuación clínica de la piel. De acuerdo con las puntuaciones clasificadas, los animales se agruparon de manera aleatoria, de modo que la puntuación promedio de cada grupo se distribuyera de la forma más uniforme posible.

[0095] La primera y segunda filas desde la parte superior de la figura 11 son fotografías de ratones inducidos con atopia (Día 0) y fotografías que muestran que los síntomas atópicos se alivian de una manera dependiente de la dosis mediante el tratamiento con los exosomas según una realización de la presente invención (Día 28). La figura 12A es un gráfico que muestra una mejora relativa en la puntuación clínica atópica de cada uno de los grupos de prueba (2) a (9), y tal como se muestra en el mismo, se confirmó que la puntuación clínica atópica de los grupos tratados (IV y SC) con los exosomas de acuerdo a una realización de la presente invención mejoró de una manera dependiente de la dosis.

[0096] La tercera y cuarta filas de la parte superior de la figura 11 muestran los resultados de la tinción de secciones de tejido de la piel de la oreja con H&E y azul de toluidina. El tejido de la piel de la oreja de cada ratón sacrificado se tiñó con H&E y, a continuación, se midió el grosor del tejido de la piel de la oreja. La figura 12B es un gráfico que muestra el grosor del tejido de la piel de la oreja medido en cada uno de los grupos de prueba (2) a (9) en comparación con el del grupo normal (1), y tal como se muestra en el mismo, se confirmó que en los grupos tratados (IV y SC) con los exosomas según una realización de la presente invención, el grosor del tejido de la piel de la oreja disminuyó de una manera dependiente de la dosis. Además, el tejido de la piel de la oreja de cada ratón sacrificado se tiñó con azul de toluidina y, a continuación, se midió la infiltración de mastocitos, un tipo de células inflamatorias. La figura 12C es un gráfico que muestra el número de mastocitos medidos en cada uno de los grupos de prueba (2) a (9) en comparación con el del grupo normal (1), y tal como se muestra en el mismo, se confirmó que en los grupos tratados (IV y SC) con los exosomas según una realización de la presente invención, la infiltración de mastocitos disminuyó de una manera dependiente de la dosis.

[0097] Las filas quinta y sexta desde la parte superior de la figura 11 muestran los resultados de someter el tejido de la piel de la oreja de cada ratón sacrificado a tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti-CD86 y anticuerpo anti-CD206. Se sabe que las células epidérmicas dendríticas inflamatorias (IDEC,inflammatory dendritic epidermal cells),que están presentes de forma abundante en las lesiones de dermatitis sin encontrarse en la piel normal, muestran el antígeno CD86 y el antígeno CD206 en su superficie (J Invest Dermatol. 2002; 118:327-334; Arch Dermatol Res. 2001; 293:448-454). De este modo, midiendo el número de células CD86+ y células CD206+ en una lesión de dermatitis atópica, se puede determinar el grado de mejora de los síntomas de la dermatitis.

[0098] La sección de tejido de la piel de la oreja de cada ratón sacrificado se sometió a tinción inmunohistoquímica con anticuerpo anti-CD86 y anticuerpo anti-CD206 (Abcam, Cambridge, MA), y a continuación se contaron el número de células CD86+ y el número de células CD206+. Las figuras 12D y 12E son gráficos que muestran el número de células CD86+ y células CD206+ medidas en cada uno de los grupos de prueba (2) a (9) en comparación con el del grupo normal (1), y tal como se muestra en los mismos, se confirmó que en los grupos tratados (IV y SC) con los exosomas según una realización de la presente invención, el número de células CD86+ y el número de CD206+ disminuyeron de una manera dependiente de la dosis. Estos resultados muestran que la infiltración de células epidérmicas dendríticas inflamatorias en la lesión de dermatitis atópica disminuyó y los síntomas de la dermatitis se aliviaron o mejoraron.

[0099] En conjunto, se confirmó a través de los experimentos que en los grupos tratados (tanto IV como SC) con los exosomas de la presente invención, la puntuación clínica de la piel, el grosor del tejido de la piel de la oreja, la infiltración de mastocitos, y la infiltración de células epidérmicas dendríticas inflamatorias disminuyó de manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 9: Medición de niveles de expresión de ARNm de citoquinas

[0100] Se preparó ADNc a partir del ARN total obtenido triturando tejidos de lesiones cutáneas de cada ratón sacrificado y se midieron los cambios en los niveles de expresión de ARNm de diversas citoquinas inflamatorias que son una de las principales causas de dermatitis utilizando un procedimiento de PCR en tiempo real. Como gen de referencia para normalizar los genes de IL-4, IL-31, IL-23 y TNF-a, se utilizó el gen de GAPDH. Las secuencias de cebadores utilizados en la PCR en tiempo real se muestran en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1: Secuencias de nucleótidos de cebadores utilizados en PCR de tiempo real

[0101] A través del experimento en el modelo animal 1 anterior, se confirmó que en los grupos tratados (tanto IV como SC) con los exosomas, disminuyeron los niveles de expresión de ARNm de las citoquinas IL-4 e IL-31 relacionadas con la inflamación, que causan dermatitis (Figuras 10A y 10B). Además, a través del experimento en el modelo animal 2 anterior, se confirmó que en los grupos tratados (tanto IV como SC) con los exosomas, los niveles de expresión de ARNm de varias citoquinas relacionadas con la inflamación (es decir, IL-4, IL-31, TNF-a e IL-23), que causan dermatitis, disminuyeron de una manera dependiente de la dosis (figuras 13A a 13D).

[0102] El grupo tratado con los exosomas disminuyó los niveles de expresión de ARNm de IL-4, IL-31, TNF-a e IL-23 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control y el grupo tratado con prednisolona, y estas citoquinas relacionadas con la inflamación son dianas importantes para el desarrollo de agentes terapéuticos relacionados con la dermatitis. Las disminuciones en los niveles de expresión de estas múltiples dianas están relacionadas con la supresión y el alivio de la dermatitis. La IL-4 inicia el cambio de clase de isotipo a IgE y activa los eosinófilos. Además, se sabe que la IL-31 afecta el cambio de clase de isotipo a IgE y recluta células inflamatorias en la piel, y el aumento de IL-31 se correlaciona con la gravedad de la dermatitis. Se sabe que la IL-23 induce la diferenciación de células T de tipo ThO en células T auxiliares patógenas que producen TNF-a, y la alta concentración plasmática de TNF-a se correlaciona con la gravedad de la dermatitis. Considerando estos aspectos en conjunto, se cree que los exosomas regulan la respuesta inflamatoria al inhibir la expresión de múltiples citoquinas que son las principales causas de la dermatitis.

[0103] Por lo tanto, los exosomas son capaces de actuar contra diversas citoquinas inflamatorias (es decir, IL-4, IL-31, IL-23 y TNF-a) que causan dermatitis y, por lo tanto, pueden aplicarse ampliamente contra la dermatitis causada por diversos factores y suprime y alivia de manera eficaz la dermatitis.

Ejemplo 10: Ensayo de sangre

[0104] Se aisló plasma de la sangre de cada ratón sacrificado y se midió la concentración de inmunoglobulina E (IgE) en la sangre usando un kit ELISA. A través del experimento, se confirmó que en el grupo tratado con los exosomas preparados en el Ejemplo 2, el nivel de IgE en sangre disminuyó de manera dependiente de la dosis de los exosomas (Figura 14A).

[0105] Además, utilizando la sangre completa de cada ratón sacrificado, se contó el número de células sanguíneas. Se centrifugó una cantidad predeterminada de células de sangre completa usando un Cytospin (adquirido de ThermoFisher Scientific) a 1000 rpm durante 10 minutos y, a continuación, se sometieron a secado en portaobjetos, seguido de tinción con Diff-Quik. Se midieron el número de glóbulos blancos y el número de eosinófilos. A través del experimento, se confirmó que en el grupo tratado con los exosomas preparados en el Ejemplo 2, el número de glóbulos blancos y el número de eosinófilos disminuyeron de manera dependiente de la dosis de los exosomas (figuras 14B y

[0106] A partir de los resultados descritos anteriormente, se puede observar que la composición de la presente invención reduce el nivel del factor de respuesta inflamatoria IgE en sangre que causa la dermatitis, y también reduce la cantidad de glóbulos blancos y la cantidad de eosinófilos en sangre. Además, la composición de la presente invención reduce la producción de diversas citoquinas inflamatorias y factores relacionados con la inflamación, e inhibe la actividad o participación de las células inmunitarias relacionadas con la inflamación. Por lo tanto, la composición para su utilización según la presente invención es útil como composición farmacéutica, preparación externa para la piel y composición cosmética para su utilización en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica.

Ejemplo 11: Prueba de capacidad de penetración en la piel de los exosomas

[0107] Para preparar exosomas teñidos de manera fluorescente, se usó colorante PKH67 (adquirido de Sigma). Se diluyó PKH67 1 mM en Diluyente C (adquirido de Sigma) para preparar una solución de PKH67 10 pM. La solución se mezcló con una concentración adecuada de solución de exosoma y se dejó reaccionar a temperatura ambiente en condiciones de protección contra la luz durante 10 minutos. Después de completar la reacción, se usó una columna de centrifugación MW3000 (adquirida de ThermoFisher Scientific) para eliminar el colorante PKH67 libre restante de los exosomas teñidos con PKH67 (en lo sucesivo, abreviado como "exosomas con PKH"). Después de eliminar el PKH67 que no reaccionaba con los exosomas, se realizó un análisis utilizando un fluorómetro (adquirido de Molecular Devices) y, como resultado, se confirmó que se detectó fluorescencia con suficiente intensidad en los exosomas con PKH (Figura 15).

[0108] Los exosomas con PKH se dispersaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración adecuada, por ejemplo, una concentración de 1 x 105 partículas/ml a 1 x109 partículas/ml, y se aplicaron a la superficie exterior de piel porcina. La piel porcina se cubrió con tela no tejida para evitar el secado de la solución de exosomas con PKH, y, a continuación, se dejaron reaccionar los exosomas con PKH y el tejido de la piel durante un tiempo adecuado, por ejemplo de 30 minutos a 1 hora, de modo que los exosomas con PKH alcanzaron el tejido subcutáneo de la piel porcina. Una vez completada la reacción, el tejido de piel porcina se fijó durante la noche en una solución de formaldehído al 3,7 % y se lavó tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez. El tejido de piel porcina lavado se empapó en una solución de sacarosa al 30 % y, a continuación, se trató con compuesto OCT. A continuación, el tejido se lavó tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez y, a continuación, se seccionó con un micrótomo. La sección de tejido se colocó sobre un portaobjetos de vidrio. Paralelamente, la preparación de la sección de tejido se puede realizar antes de fijar el tejido con solución de formaldehído. La fluorescencia detectada en los exosomas con PKH en la sección de tejido se observó utilizando un microscopio de fluorescencia. Como resultado, se confirmó que los exosomas con PKH se suministraban a través de la epidermis del tejido de la piel porcina al tejido subcutáneo (Figura 16). Tal como se muestra en la figura 16, los exosomas de la presente invención podían penetrar de manera eficaz a través de la barrera cutánea, de modo que podían suministrarse profundamente en el tejido cutáneo y absorberse de manera eficaz en la piel. Por lo tanto, una preparación externa para la piel o una composición cosmética que contenga los exosomas como principio activo actuará de manera eficaz en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis.

[0109] A continuación, se diseccionó el tejido de la piel de ratones sin pelo y se colocó en la cámara superior de una celda de difusión de Franz. El interior de la celda de difusión se llenó con PBS. Los exosomas con PKH se dispersaron en PBS a una concentración adecuada, por ejemplo, una concentración de 1 x 105 partículas/ml a 1 x 109 partículas/ml, y, a continuación, se aplicaron a la superficie exterior del tejido de la piel del ratón. En este momento, se colocó previamente una tela no tejida en la superficie exterior del tejido de la piel del ratón para evitar el secado de la solución de exosoma con PKH, y se inyectó la solución de exosoma con PKH entre la tela no tejida y el tejido de la piel. A continuación, se dejaron reaccionar los exosomas con PKH y el tejido de la piel durante 30 minutos a 1 hora. Una vez completada la reacción, los exosomas con PKH suministrados al tejido de la piel se observaron inmediatamente con un microscopio de fluorescencia confocal (Leica, SP8X), o se dejaron reaccionar adicionalmente el tejido de la piel y la solución de exosomas con PKH durante 1 a 6 horas y, a continuación, se observaron los exosomas con PKH con un microscopio de fluorescencia confocal. Como resultado, se confirmó que los exosomas de la presente invención pueden penetrar de manera eficaz a través de la barrera cutánea, de modo que los exosomas de la presente invención pueden suministrarse profundamente en el tejido de la piel y absorberse de manera eficaz en la piel (Figura 17).

[0110] Por lo tanto, una preparación externa para la piel o una composición cosmética que contenga los exosomas como principio activo actuará de manera eficaz en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis.

Ejemplo 12: Tratamiento de piel humana con una composición que contiene exosomas como principio activo

[0111] La composición que contenía los exosomas obtenida según el procedimiento de aislamiento, es decir, una suspensión que contiene los exosomas, se aplicó a las partes afectadas (mano, cuello, brazo, etc.) de tres pacientes atópicos graves tres veces por semana durante 1 a 2 semanas, y, a continuación, se realizó iontoforesis permitiendo que una microcorriente fluyera a través de la parte afectada a la que se aplicó la composición usando un dispositivo de iontoforesis. Como resultado, el prurito severo en los pacientes se alivió notablemente y los síntomas de eritema relacionados con la dermatitis en los pacientes también mejoraron notablemente (figura 19). En los pacientes a los que se aplicó la composición que contenía los exosomas de la presente invención, se aliviaron y mejoraron los síntomas de prurito severo y eritema relacionado con la dermatitis, de modo que se suspendió la prescripción de esteroides o antihistamínicos para estos pacientes.

[0112] De este modo, se puede observar que una preparación externa para la piel o una composición cosmética que contiene, como principio activo, los exosomas obtenidos mediante el aislamiento, exhibe el efecto de prevenir, mejorar, aliviar o tratar la dermatitis, tal como se confirma a través de las pruebas clínicas descritas anteriormente.

Ejemplo 13: Tratamiento de animales caninos con una composición que contiene exosomas como principio activo

[0113] Se realizó un experimento en un perro pastor de Shetland (peso corporal: 13 kg; 9 años) que padecía dermatitis atópica grave de origen natural. La composición que contenía los exosomas obtenidos según el procedimiento de aislamiento (los exosomas preparados en el Ejemplo 2) se inyectó por vía subcutánea en el perro pastor de Shetland que padecía dermatitis atópica grave de origen natural, 12 veces en total durante 5 semanas. En una inyección, los exosomas preparados en el Ejemplo 2 se inyectaron a una dosis de 117 pg/cabeza. En las semanas 1 y 2, la composición se inyectó por vía subcutánea tres veces por semana, y en las semanas 3, 4 y 5, la composición se inyectó por vía subcutánea dos veces por semana. Además, después de la administración de los exosomas, se suspendió la administración de otros fármacos.

[0114] La figura 20A muestra fotografías de las partes afectadas antes de la administración de los exosomas y, tal como se puede observar en las mismas, el eritema y la inflamación en el abdomen eran graves. Se pudo observar que los síntomas de la dermatitis mejoraron notablemente a partir de 3 días después de la administración de los exosomas de la presente invención (figura 20B), y la dermatitis casi desapareció a los 10 días después de la administración (figura 20C) y 2 semanas después de la administración (figura 20D). Además, después de la administración de los exosomas, la vitalidad del perro pastor de Shetland examinado aumentó claramente y su peso corporal aumentó hasta los 16 kg. Se cree que el aumento de la vitalidad y el aumento de peso se debe a la mejora de los síntomas de la dermatitis.

[0115] Para confirmar si el efecto del exosoma en el tratamiento de la dermatitis se mantendría, se observó de manera continua la parte afectada del perro pastor de Shetland examinado después del final de la administración de los exosomas. Como resultado, se pudo confirmar que el efecto de mejora de la dermatitis se mantuvo incluso a los 50 días (figura 20E) y 93 días (figura 20F) después del final de la administración.

[0116] Por lo tanto, tal como se confirma a través de la prueba en animales caninos descrita anteriormente, la composición que contiene, como principio activo, los exosomas obtenidos según el procedimiento de aislamiento, puede aliviar o mejorar de manera eficaz la dermatitis, y el efecto de tratamiento de la dermatitis de la misma puede mantenerse.

Ejemplo 14: Preparación de una composición cosmética que contiene exosomas de la presente invención

[0117] Se mezclaron 1704 pg/ml de los exosomas preparados en el Ejemplo 2 anterior y se suspendieron en los componentes mostrados en la Tabla 2 a continuación, preparando así una composición cosmética (loción). El contenido de cada componente se muestra en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2: Componentes y su contenido de loción que contiene exosomas de la presente invención

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición para su utilización en la prevención, mejora, alivio o tratamiento de la dermatitis atópica, comprendiendo la composición exosomas derivados de células madre derivadas de tejido adiposo como principio activo, en la que los exosomas se aíslan de un medio acondicionado obtenido cultivando las células madre derivadas de tejido adiposo.

2. Composición para su utilización, según la reivindicación 1, en la que los exosomas se obtienen realizando las etapas de: (a) añadir trehalosa al medio acondicionado; (b) filtrar el medio acondicionado al que se le ha añadido trehalosa; (c) aislar exosomas del medio acondicionado filtrado mediante filtración de flujo tangencial (TFF); y (d) añadir trehalosa a un tampón para diafiltración, y realizar la diafiltración en los exosomas aislados mediante la t Ff usando el tampón al que se le ha añadido trehalosa.

3. Composición para su utilización, según la reivindicación 2, en la que la diafiltración se realiza de forma continua o discontinua.

4. Composición para su utilización, según la reivindicación 2, en la que la diafiltración se realiza utilizando un tampón que tiene al menos 4 veces el volumen de los exosomas aislados.

5. Composición de la reivindicación 2, en la que se usa para la TFF un filtro de TFF que tiene un límite de peso molecular (MWCO) de 100.000 Da, 300.000 Da, 500.000 Da o 750.000 Da, o un filtro de 0,05 |jm.

6. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los exosomas disminuyen los niveles de expresión de IL-4 e IL-31 en tejido de la piel o células de la piel.

7. Composición para su utilización, según la reivindicación 6, en la que los exosomas disminuyen adicionalmente el nivel de expresión de al menos uno seleccionado del grupo que consiste en IL-23 y TNF-a en tejido de la piel o células de la piel.

8. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los exosomas disminuyen el nivel de IgE en sangre y el número de glóbulos blancos y eosinófilos en sangre.

9. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los exosomas disminuyen el número de mastocitos, células CD86+ y células CD206+ en el tejido de la piel.

10. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es una preparación externa para la piel.

11. Composición para su utilización, según la reivindicación 10, en la que los exosomas están contenidos o mezclados con al menos uno de hidrogel, ácido hialurónico, sal de ácido hialurónico y gel de hialuronato.

12. Composición para su utilización, según la reivindicación 11, en la que el hidrogel se obtiene dispersando un polímero gelificado en un alcohol polihídrico, preferiblemente el polímero gelificado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en plurónico, agar purificado, agarosa, agarosa, goma gellan, ácido algínico, carragenano, goma casia, goma xantana, galactomanano, glucomanano, pectina, celulosa, goma guar y goma de algarroba y el alcohol polihídrico es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en etilenglicol, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, isobutilenglicol, dipropilenglicol, sorbitol, xilitol y glicerina.

13. Composición para su utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es una composición cosmética.

14. Composición para su utilización, según la reivindicación 13, en la que la composición cosmética se usa en al menos una forma seleccionada del grupo que consiste en parches, paquetes de mascarillas, láminas de mascarillas, cremas, tónicos, pomadas, suspensiones, emulsiones, pastas, lociones, geles, aceites, paquetes, pulverizaciones, aerosoles, pulverizadores de niebla, bases, polvos y toallitas oleosas, preferiblemente la composición cosmética se aplica o se empapa en al menos una superficie del parche, paquete de mascarilla o lámina de mascarilla.