ES2979210T3 - Anticuerpos monoclonales anti-CTLA4 humano quiméricos y humanizados y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a composiciones de anticuerpos quiméricos y humanizados que se unen a la molécula humana CTLA4 y su uso en inmunoterapia contra el cáncer y para la reducción de efectos secundarios autoinmunes en comparación con otros agentes inmunoterapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales anti-CTLA4 humano quiméricos y humanizados y usos de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos quiméricos y humanizados que se unen a la molécula de CTLA4 humano y a métodos para su uso.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario de los seres humanos y otros mamíferos es responsable de proporcionar protección contra infecciones y enfermedades. Dicha protección la proporciona tanto una respuesta inmunitaria humoral como una respuesta inmunitaria mediada por células. La respuesta humoral da como resultado la producción de anticuerpos y otras biomoléculas que son capaces de reconocer y neutralizar dianas extrañas (antígenos). Por el contrario, la respuesta inmunitaria mediada por células implica la activación de macrófagos, neutrófilos, linfocitos citolíticos naturales (NK, por sus siglas en inglés) y linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno por parte de los linfocitos T, y la liberación de diversas citocinas en respuesta al reconocimiento de un antígeno.

La capacidad de los linfocitos T para mediar de manera óptima una respuesta inmunitaria contra un antígeno requiere dos interacciones de señalización distintas. En primer lugar, el antígeno que se ha dispuesto en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) debe presentarse a linfocitos T sin activación previa específicos de antígeno en forma de MHC: complejo peptídico (1, 2). Dicha presentación suministra una señal a través del receptor de linfocitos T (TCR) que dirige a los linfocitos T para que inicien una respuesta inmunitaria que será específica del antígeno presentado. En segundo lugar, una serie de señales coestimuladoras, mediada a través de interacciones entre las APC y distintas moléculas de superficie de linfocitos T, desencadena en primer lugar la activación y proliferación de los linfocitos T y en última instancia su inhibición (3-5). Por lo tanto, la primera señal confiere especificidad a la respuesta inmunitaria mientras que la segunda señal sirve para determinar la naturaleza, la magnitud y la duración de la respuesta limitando al mismo tiempo la autoinmunidad. De particular importancia entre estas segundas moléculas señal es la unión entre los ligandos B7.1 (CD80) (6) y B7.2 (CD86) (7-9) de la Célula presentadora de antígenos y los receptores CD28 y CTLA4 (10-12) del linfocito T.

Se reconoce al antígeno 4 de los linfocitos T citotóxicos (CTLA4, por sus siglas en inglés) como un regulador clave de las respuestas inmunitarias adaptativas, que tiene un papel fundamental en el mantenimiento de la tolerancia periférica y en la conformación del repertorio de respuestas emergentes de los linfocitos T y, por lo tanto, es una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer y la inflamación. Se ha demostrado que el tratamiento con anticuerpos anti-CTLA4 es una herramienta potente para potenciar la inmunidad antitumoral en modelos preclínicos (10). La monoterapia con un anticuerpo contra CTLA4 promovió el rechazo de tumores trasplantables de diversos orígenes.

Basándose en estudios prometedores de modelos tumorales preclínicos, se ha explorado el potencial clínico de los anticuerpos contra CTLA4 en neoplasias malignas humanas diferentes. Aunque el anticuerpo anti-CTLA4 (ipilimumab, comercializado como Yervoy) ha demostrado eficacia en el tratamiento del melanoma, el tratamiento y el direccionamiento de CTLA4 se asocian a toxicidades de tipo autoinmunitarias. Los efectos secundarios característicos de la inhibición de CTLA4 generalmente se denominan eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE, por sus siglas en inglés) y los irAE más comunes son erupción cutánea, hepatitis, colitis y endocrinopatías, particularmente hipopituitarismo. Por lo tanto, existe el deseo de mejorar el potencial terapéutico de los anticuerpos anti-CTLA4 aumentando la eficacia y reduciendo al mismo tiempo los irAE asociados.

El documento WO 2014/089113 A1 describe un método para potenciar la eficacia antitumoral de una proteína de fusión de Fc que se une específicamente a una diana, por ejemplo, un receptor coinhibidor o coestimulador de ligando, sobre un linfocito T en un sujeto que padece un cáncer o una enfermedad provocada por un agente infeccioso y altera la actividad de la diana inmunomoduladora, potenciando de este modo una respuesta inmunitaria endógena contra las células del cáncer o del agente infeccioso, en donde el método comprende seleccionar, diseñar o modificar la región Fc de la proteína de fusión de Fc de manera de potenciar la unión de dicha región Fc a un receptor de Fc activador (FcR, por sus siglas en inglés).

El documento WO 2012/120125 A1 describe un anticuerpo anti-CTLA4 que inhibe la unión de CTLA4 a B7 humano, en particular, inhibe la unión de CTLA4 a B7.1 humano y/o B7.2 humano.

El documento CN 101 628940 A describe anticuerpos anti-CTLA-4 y anticuerpos anti-4-1BB.

El documento US 2013/136749 A1 describe anticuerpos de secuencia humana contra CTLA-4 humano y métodos de tratamiento de enfermedades, infecciones y otras afecciones humanas usando estos anticuerpos.

May et al. describen que un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 humano promueve la expansión de los linfocitos T y la inmunidad en un modelo hu-PBL-SCID (May KF Jr, Roychowdhury S, Bhatt D, Kocak E, Bai XF, Liu JQ, Ferketich AK, Martin EW Jr, Caligiuri MA, Zheng P, Liu Y. Anti-human CTLA-4 monoclonal antibody promotes T-cell expansión and immunity in a hu-PBL-SCID model: a new method for preclinical screening o f costimulatory monoclonal antibodies. Blood. 1 de febrero de 2005; 105(3):1114-20. doi: 10.1182/blood-2004-07-2561. Epub de 14 de octubre de 2004. PMID: 15486062).

Otro foco para el campo de la inmunoterapia y el tratamiento de tumores, es la combinación de diferentes inhibidores del control inmunitario con el fin de potenciar la actividad antitumoral, en particular contra tumores poco inmunogénicos. Sin embargo, este enfoque se asocia al riesgo de aumentar adicionalmente los efectos secundarios autoinmunitarios, lo que destaca adicionalmente la necesidad de modular selectivamente la inmunidad frente al cáncer sin potenciar la autoinmunidad.

Investigaciones adicionales sobre los ligandos del receptor CD28 han conducido a la identificación y caracterización de un conjunto de moléculas B7 relacionadas (la "Superfamilia B7") (32-33). Actualmente existen varios miembros conocidos de la familia: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), el ligando coestimulador inducible (ICOS-L), el ligando de muerte programada-1 (PD-L1; B7-H1), el ligando de muerte programada-2 (PD-L2; B7-DC), b 7-H3, B7-H4 y B7-H6 (35-36).

B7-H1 se expresa ampliamente en diferentes tejidos humanos y de ratón, tales como corazón, placenta, músculo, hígado fetal, bazo, ganglios linfáticos y timo para ambas especies, así como hígado, pulmón y riñón sólo en ratones (37). B7-H1 (PD-L1, CD274) es un miembro particularmente significativo de la Superfamilia B7, ya que está implicado de manera fundamental en la conformación de la respuesta inmunitaria a los tumores (38; las Patentes de los E<e>.UU. N. ° 6.803.192, 7.794.710; las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2005/0059051; 2009/0055944; 2009/0274666; 2009/0313687; la Publicación PCT N.° WO 01/39722; WO 02/086083).

Muerte Programada-1 ("PD-1") es un receptor de B7-H1 así como de B7-DC. PD-1 es una proteína de membrana de tipo I miembro de la familia extendida CD28/CTLA4 de reguladores de linfocitos T (39; Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667; la Pat. de los EE.UU. N.° 6.808.710; 7.101.550; 7.488.802; 7.635.757; 7.722.868; la Publicación PCT N.°WO 01/14557). En comparación con CTLA4, PD-1 regula negativamente de manera más amplia las respuestas inmunitarias. PD-1 se expresa en linfocitos T activados, linfocitos B y monocitos (40-41) y a niveles bajos en linfocitos T citolíticos naturales (NK) (42-43).

Se ha descubierto que la interacción de B7-H1 y PD-1 proporciona una señal coestimuladora negativa crucial para los linfocitos T y B (43) y actúa como un inductor de muerte celular (39). La función de B7-H1 y PD-1 en la inhibición de la activación y proliferación de linfocitos T ha sugerido que estas biomoléculas podrían servir como dianas terapéuticas para tratamientos de inflamación y cáncer. Por consiguiente, se ha propuesto y demostrado que el uso de anticuerpos anti-PD1 y anti-B7-H1 para tratar infecciones y tumores y modular una respuesta inmunitaria adaptativa es eficaz para el tratamiento de varios tumores humanos. Sin embargo, no todos los sujetos responden o tienen respuestas completas al tratamiento anti-PD-1 o anti-B7-H1, por lo que existe un gran interés en combinar anticuerpos anti-PD-1 o anti-B7-H1 con otros inhibidores de control inmunitario con el fin de potenciar la actividad antitumoral.

4-1BB (también conocida como CD137 y TNFRSF9) es otra molécula de punto de control inmunitario. La actividad mejor caracterizada de CD137 es su actividad coestimuladora de linfocitos T activados. El entrecruzamiento de CD137 potencia la proliferación de linfocitos T, la secreción de IL-2, la supervivencia y la actividad citolítica. Además, como los anticuerpos anti-CTLA4, los anticuerpos anti-4-1BB pueden potenciar la actividad inmunitaria para eliminar tumores en ratones (27-29). Sin embargo, a diferencia de la tendencia de los anticuerpos anti-CTLA4 a exacerbar enfermedades autoinmunitarias, se ha demostrado que los mAb anti-4-1BB terapéuticos contra el cáncer anulan el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias en ratones propensos al lupus, en los que inhibieron la producción de anticuerpos anti-ADNbc y redujeron la patología renal (25, 26). Datos anteriores han demostrado que es posible reducir los efectos secundarios autoinmunitarios del tratamiento anti-CTLA4 en un modelo de tumor de cáncer de colon en ratón combinando el tratamiento del anticuerpo anti-CTLA4 con el anticuerpo anti-4-1BB, potenciando al mismo tiempo la actividad antitumoral (19). Esto demuestra que es posible compensar los efectos secundarios autoinmunitarios de la terapia tumoral anti-CTLA4.

El cribado preclínico de anticuerpos anti-CTLA4 humano está plagado de dificultades porque los correlatos inmunológicos in vitro en ocasiones tienen poco valor, como lo demuestra la experiencia con anticuerpos anti-CTLA4 de ratón. Los mismos anticuerpos anti-CTLA4 de ratón que inducen una inmunidad antitumoral potente in vivo pueden tener efectos variables sobre los linfocitos T in vitro. Los anticuerpos anti-CTLA4 potenciaron la proliferación de linfocitos T en respuesta al aloantígeno, pero suprimieron la proliferación de linfocitos T en respuesta a la coestimulación por anti-CD 28 (30, 31). Además, la interacción de CTLA4 con el anticuerpo podría promover o inhibir la proliferación de diferentes subconjuntos de linfocitos T en el mismo cultivo (32). Esta complicación puede superarse si se pueden estudiar las respuestas de los linfocitos T humanos en un modelo de roedor.

En el presente documento se describen anticuerpos anti-CTLA4 con efectos secundarios autoinmunitarios reducidos cuando se usan para potenciar respuestas inmunitarias y para su uso en terapia antitumoral. Además, estos anticuerpos pueden usarse en combinación con otros inhibidores de punto de control, tales como anti-PD-1 y anti-4-1BB, para potenciar el tratamiento antitumoral y al mismo tiempo anular los efectos secundarios autoinmunitarios.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-CTLA4 capaz de unirse a CTLA4 humano que comprende: una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 64, una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 71 y una región Fc de IgG1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4. La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento o el diagnóstico del cuerpo humano o animal mediante terapia.

Específicamente, la invención se refiere a anticuerpos con actividad bloqueante de CTLA4 potenciada para los ligandos de CTLA4 B7.1 y B7.2, función efectora potenciada o unión reducida a CTLA4 soluble con respecto a CTLA4 unido a membrana o inmovilizado.

El anticuerpo como se describe en el presente documento puede comprender una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, y una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo también puede comprender una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 27, 28 o 29, y una secuencia de aminoácidos variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 30, 31 o 32. El anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que tiene secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, y una región variable de cadena pesada que tiene secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 24, 25 y 26. Más específicamente, el anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de<c>DR2 expuesta en la SEQ ID NO: 33, 34 o 35, y una región variable de cadena ligera que tiene secuencias de CDR expuestas en la SEQ ID NO: 36, 37 o 38.

Las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo pueden comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o 4. De acuerdo con la invención, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. La región constante de cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo también comprende una mutación. Con respecto a la secuencia de la cadena principal de hlgG1 en la SEQ ID NO: 3, la mutación puede ser M135Y, S137T, T139E, S181A, E216A o K217A, o una combinación de las mismas. De acuerdo con la invención, la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina del anticuerpo comprende las seis mutaciones. El anticuerpo descrito en el presente documento puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. El anticuerpo también puede comprender una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 9, 11 o 13, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15, 17 o 19. El anticuerpo es capaz de unirse a CTLA4 humano. El anticuerpo también puede inhibir la unión de CTLA4 humano a B7-1 o b 7-2.

En el presente documento se describe además un fragmento de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en el presente documento.

En el presente documento también se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos descritos en el presente documento. La composición farmacéutica comprende un portador o excipiente fisiológicamente aceptable.

En otro aspecto, en el presente documento se presentan métodos para potenciar una o más funciones o respuestas inmunitarias en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En una realización específica, en el presente documento se presentan métodos para prevenir, tratar y/o gestionar una enfermedad en la que es deseable activar o potenciar una o más funciones o respuestas inmunitarias. La enfermedad puede ser un cáncer, que puede ser una neoplasia maligna humana. En particular, la malignidad humana puede ser melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovario, carcinoma de próstata, linfoma de Hodgkin o no Hodgkin, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica o carcinoma de células renales. En otra realización, la enfermedad que ha de tratarse es una enfermedad infecciosa. El método descrito en el presente documento puede minimizar los efectos adversos autoinmunitarios asociados a la inmunoterapia.

En otras realizaciones específicas divulgadas en el presente documento, el método comprende una terapia de combinación, en donde las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento se administran a un sujeto en combinación con otra terapia, que puede activar o potenciar una o más funciones o respuestas inmunitarias. En otra realización, las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento se administran como adyuvante en combinación con una composición antigénica. En una realización particular, las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento se administran en combinación con una composición de vacuna para inducir, activar o potenciar la respuesta inmunitaria desencadenada por la composición de vacuna.

En una realización específica divulgada en el presente documento, las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento se administran a un sujeto en combinación con una o más terapias diferentes que se dirigen a vías inmunomoduladoras diferentes. En una realización preferida divulgada en el presente documento, la actividad de la terapia dirigida a una vía inmunomoduladora diferente es complementaria o sinérgica con las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento. En un caso, las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento se administran en combinación con otros inhibidores de punto de control o pequeños moduladores oncoinmunológicos tales como inhibidores de la indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO).

En otro caso, las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento se administran en combinación con moléculas inmunoestimuladoras. Las realizaciones específicas incluyen combinar las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento con anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda) o Nivolumab (Opdivo)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentriq) o durvalumab), anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LAG3, anti-Tim3, anti-<c>D40, anti-OX40, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS o anti-41BB. En otra realización, las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento y la segunda molécula inmunoestimuladora se combinan en un único anticuerpo biespecífico.

En otra realización, un anticuerpo anti-CTLA4 humano descrito en el presente documento puede unirse preferentemente a CTLA-4 humano expresado en la superficie celular con respecto a moléculas de CTLA4 soluble. El anticuerpo anti-CTLA4 humano puede unirse a CTLA4 humano y preferentemente regular positivamente la expresión de B7.1 o B7.2 in vivo. El anticuerpo puede estar contenido en una composición para su uso en la modulación de respuestas inmunitarias (inmunoterapia) y el tratamiento del cáncer.

La divulgación se refiere además al método de cribado para mAb anti-CTLA4 humano con actividad preferida. El cribado preclínico de mAb anti-CTLA4 humano está plagado de dificultades porque los correlatos inmunológicos in vitro para la inmunidad frente al cáncer y los efectos adversos autoinmunitarios no están definidos. Se han observado efectos secundarios autoinmunitarios importantes en ensayos clínicos con anti-CTLA4 humano (ipilimumab), especialmente cuando se combina con anti-PD-1. Con el fin de identificar anticuerpos anti-CTLA4 con toxicidades relacionadas con la inmunidad reducidas, pueden cribarse anticuerpos que demuestren actividad antitumoral en ratones humanizados para determinar su capacidad para reducir los efectos adversos autoinmunitarios in vivo usando ratones con el gen de CTLA4 humano inactivado.

La divulgación se refiere además a un método de cribado de mAb anti-CTLA4 humano con efecto antitumoral potenciado en donde los anticuerpos demuestran un agotamiento local potenciado de linfocitos Treg en el ambiente tumoral.

La divulgación se refiere además a métodos de control de los efectos bloqueantes de los anticuerpos anti-CTLA4 in vivo controlando los niveles de expresión de B7.1 y B7.2 en células inmunitarias tales como células presentadoras de antígenos (APC). La divulgación contempla además biomarcadores para medir la actividad biológica de los anticuerpos anti-CTLA4 in vivo y controlar las respuestas de los pacientes al tratamiento anti-CTLA4 midiendo el nivel de expresión de B7.1 y B7.2 en células inmunitarias ex vivo.

Con el fin de cartografiar el epítopo de unión a CTLA4 del anticuerpo parental L3D10 y las variantes humanizadas, PP4631 y PP4637, se aprovechó el hecho de que las proteínas CTLA4 de ratón y humana tienen reactividad cruzada con B7-1, pero no con los anticuerpos anti-CTLA-4. En consecuencia, se diseñaron varios mutantes de la proteína CTLA-4Fc humana en los que grupos de aminoácidos de la proteína CTLA-4 humana se reemplazaron con aminoácidos de la proteína Ctla-4 murina. Como los anticuerpos anti-CTLA-4 utilizados en este estudio no se unen a Ctla-4 murino, la unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 humano puede suprimirse cuando los restos clave del epítopo de unión del anticuerpo se reemplazan por aminoácidos murinos.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. Diagrama esquemático de los anticuerpos L3D10 quimérico (izquierda) y humanizado (derecha) con una combinación novedosa de mutaciones en la región Fc de IgG1. Las posiciones de las mutaciones en la región Fc se identifican por su número de posición de aminoácido y los aminoácidos se identifican por su código de una sola letra, representando la letra antes del número el aminoácido reemplazado y representando la letra después del número el aminoácido introducido. La región variable de los anticuerpos se representa con óvalos abiertos y la secuencia humana se representa con rectángulos de color gris. V = región variable; C = región constante; L = cadena ligera; H = cadena pesada.

FIG. 2. CTLA4 Unión de L3D10 y 10D1 quiméricos a CTLA4 inmovilizado en placa, como se determina por ELISA.

Las placas de ELISA se recubrieron con 1 |jg/ml de proteína CTLA4-His (Sino Biological, China). Se añadió la concentración dada de proteínas de unión biotiniladas y se midió la unión usando estreptavidina conjugada con HRP. 10D1-1 y -2 son dos lotes de material independientes del mismo anticuerpo. B7.1-Fc es un control positivo y Fc es un control negativo.

FIG. 3. Ensayo de competencia de L3D10. 10D1 es menos eficiente para bloquear la unión de L3D10 quimérico a CTLA4 que el L3D10 quimérico. El experimento se realizó como en la FIG. 2, excepto por que el L3D10 quimérico biotinilado se mezcló con la concentración dada de proteínas de unión a CTLA4 sin marcar o CTLA4-Fc antes de agregarlo a las placas de ELISA. Nótese que el bloqueo con L3D10 sin marcar es mucho mejor que con 10D1, lo que sugiere que estos sitios de unión de anticuerpos no son idénticos.

FIG. 4. Bloqueo de la unión de CTLA4 a B7.1 inmovilizado en placa. Se recubrieron placas de ELISA con proteína B7.1Fc a 0,5 jg/ml. Después de lavar y bloquear, se añadió proteína CTLA4-Fc biotinilada a 0,25 jg/m l en presencia de concentraciones dadas de las proteínas competidoras. Los datos mostrados son medias de la densidad óptica por duplicado a 405 nM. Mientras que B7.1, L3D10 quimérico y CTLA4-Fc bloquean la interacción CTLA4:B7.1 de una manera dependiente de la dosis, dos lotes separados de anticuerpo 10D1 no lograron bloquear ninguna de las dosis sometidas a ensayo. La biotinilación de CTLA4 no destruye los epítopos de 10D1 en CTLA4 ya que ambos lotes de 10D1 muestran una fuerte unión a CTLA4 biotinilado (datos no mostrados).

FIG. 5. Bloqueo de la unión de CTLA4 a B7.2 inmovilizado en placa. Se recubrieron placas de ELISA con proteína B7.2Fc a 0,5 jg/ml. Después de lavar y bloquear, se añadió proteína CTLA4-Fc biotinilada a 0,25 jg/m l en presencia de concentraciones dadas de las proteínas competidoras. Mientras que el L3D10 quimérico bloquea la interacción CTLA4:B7.2 de manera dependiente de la dosis, dos lotes separados de anticuerpo 10D1 no lograron bloquear completamente la interacción CTLA4:B7.2 incluso a la concentración más alta.

FIG. 6. Tanto 10D1 como L3D10 bloquean potentemente la interacción B7-CTLA4 usando B7-1 y B7-2 solubles y CTLA4-Fc inmovilizado. Se añadieron dosis variables de mAb anti-CTLA4 humano junto con 0,25 jg/m l de CTLA4-Fc humano biotinilado a placas recubiertas con B7-1Fc humano. Las cantidades de CTLA4 unidas a las placas se midieron usando estreptavidina conjugada con HRP. Los datos mostrados son medias de duplicados y son representativos de dos experimentos independientes.

FIG. 7. Bloqueo de la unión de CTLA4 a B7.1 expresado en la superficie celular. Se añadió proteína CTLA4-Fc biotinilada a células CHO que expresaban B7.1 a 0,5 jg/m l en presencia de la concentración dada de las proteínas competidoras. La unión de la proteína de fusión biotinilada a células CHO transfectadas con B7-1 y B7-2 de ratón o humanos se detectó mediante citometría de flujo. Las cantidades de receptores unidos se midieron usando estreptavidina conjugada con ficoeritrina. Los datos mostrados son intensidades de fluorescencia medias de muestras por triplicado. Mientras que el L3D10 quimérico bloquea la interacción CTLA4:B7.1 de manera dependiente de la dosis, dos lotes separados de anticuerpo 10D1 no lograron bloquear ninguna de las dosis sometidas a ensayo.

FIG. 8. Bloqueo de la unión de CTLA4 a B7.1 murino expresado en la superficie celular. Bloqueo modesto pero detectable de la interacción B7-1 de ratón-CTLA4 humano por 10D1 cuando se expresa mB7-1 en células CHO. Se añadieron dosis variables de mAb anti-CTLA4 humano junto con 0,25 jg/m l de CTLA4-Fc humano a células CHO que expresaban B7-1 de ratón. Los datos mostrados son medias y ETM o datos por triplicado y son representativos de dos experimentos independientes.

FIG. 9. Bloqueo de la unión de CTLA4 a B7.2 expresado en la superficie celular. Se añadió proteína CTLA4-Fc biotinilada a células CHO que expresaban B7.2 a 0,5 jg/m l en presencia de la concentración dada de las proteínas competidoras. Mientras que el L3D10 quimérico bloquea la interacción CTLA4:B7.2 de manera dependiente de la dosis, dos lotes separados de anticuerpo 10D1 no lograron bloquear completamente la interacción CTLA4:B7.2 incluso a la concentración más alta. Los datos mostrados en esta figura se han repetido al menos 5 veces.

FIG. 10. 10D1 se une a CTLA4-Fc humano biotinilado mejor que L3D10. Se aplicaron como recubrimiento sobre la placa dosis variables de mAb anti-CTLA4 humano o IgG de control. Se añadió CTLA4-Fc biotinilado a 0,25 jg/ml. Las cantidades de CTLA4 unidas a las placas se midieron usando estreptavidina conjugada con HRP. Los datos mostrados son medias de duplicados y son representativos de dos experimentos independientes.

FIG. 11. L3D10, pero no 10D1, bloquea la interacción entre CTLA4 marcado con polihistidina y células CHO que expresan B7-1 humano. Se incubaron células CHO que expresaban B7-1 humano con CTLA4 marcado con polihistidina junto con dosis dadas de anticuerpos, las cantidades de CTLA4-Fc se detectaron con PE-estreptavidina y se midieron mediante FACSCanto II. Los datos mostrados son intensidades de fluorescencia medias de muestras por triplicado y son representativos de dos experimentos independientes.

FIG. 12. El L3D10 quimérico induce la remisión completa de tumores establecidos en el modelo singénico MC38. El panel superior representa el diseño experimental y los paneles inferiores muestran la cinética de crecimiento de tumores MC38 en ratones que recibieron IgG de control (panel inferior izquierdo, n = 6) o L3D10 quimérico (panel inferior derecho, n = 5).

FIG. 13. Efecto terapéutico de L3D10 y 10D1 quiméricos en el modelo de tumor MC38. Para el estudio se usaron ratones con activación de CTLA4 humano con un peso corporal de aproximadamente 20 gramos. Se inyectaron 1^10® células tumorales MC38 por vía subcutánea en ratones Ctla4h/h y cuando el tumor alcanzó un tamaño de 0,5 cm de diámetro, los ratones portadores de tumores se distribuyeron aleatoriamente en tres grupos de 5 o 6 ratones cada uno. Después, los ratones se trataron (i.p.) con 100 pg/inyección de 10D1, L3D10 quimérico o hlgGFc de control los días 7, 10, 13 y 16 como lo indican las flechas. Se muestran los resultados de los experimentos duplicados (paneles izquierdo y derecho) y los datos mostrados son medias y D.T. del tamaño tumoral (n = 6 por grupo en el panel izquierdo, n = 5 por grupo en el panel derecho). L3D10 y 10D1 tienen un efecto terapéutico similar en este modelo y ambos son capaces de inducir la remisión completa de los tumores establecidos. Los diámetros (d) del tumor se calcularon usando la siguiente fórmula: D= V (ab), V=ab2/2, donde a es el diámetro largo, mientras que b es el diámetro corto. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías (tratamiento X tiempo). Para el panel izquierdo: P = 10D1 frente a hlgGFc: 5,71e-07; L3D10 frente a hlgGFc: P = 5,53e-07; 10D1 frente a L3D10: P = 0,869.

FIG. 14. Rechazo eficaz de MC38 por mAb anti-CTLA-4 en ratones CTLA4h/m Como en la FIG. 13, excepto por que se usan ratones CTLA4h/m heterocigotos. Los datos mostrados son medias y ETM de diámetros tumorales (6 ratones por grupo); 10D1 frente a hlgGFc: P = 0,0011; L3D10 frente a hlgGFc: P = 5,55e-05; 10D1 frente a L3D10: P = 0,0346.

FIG. 15. Efecto terapéutico de L3D10 y 10D1 quiméricos en el modelo de tumor de melanoma B16-F1. Para el estudio se usaron ratones con activación de CTLA4 humano con un peso corporal de aproximadamente 20 gramos. Las flechas indican el tiempo de tratamiento (50 pg/ratones/tratamiento). Los datos mostrados son medias y D.T. del tamaño tumoral (n = 4 por grupo). L3D10 tiene un efecto terapéutico similar en este modelo y ambos son capaces de retrasar el crecimiento tumoral en este modelo de tumor agresivo y poco inmunogénico.

FIG. 16. Ensayo para medir el bloqueo de CTLA4 in vivo. B7.1 o B7.2 se unen en las células dendríticas, y son regulados negativamente por, CTLA4 en la superficie de los linfocitos T. Sin embargo, la unión de los anticuerpos bloqueantes anti-CTLA4 impide la unión de B7.1/B7.2 a CTLA4 y, por lo tanto, evita la regulación negativa de B7.1 y B7.2, dando como resultado un aumento neto en la expresión de B7.1/B7.2. Sin embargo, con linfocitos T quiméricos que expresan CTLA4 tanto humano como de ratón, los anticuerpos que se unen al CTLA4 humano no evitan la unión de B7.1/B7.2 al CTLA4 murino, que restablece la inhibición de B7.1/B7.2.

FIG. 17A-F. 10D1 no bloquea la interacción B7-CTLA4 in vivo. Usando el ensayo descrito en la FIG. 11, se usaron células de ratones tratados con anticuerpos anti-CTLA4 para someter a ensayo la expresión de B7.1 y B7.2. La FIG. 17A muestra un diagrama de diseño experimental. Resumiendo, ratones de la misma edad y sexo recibieron 500 pg de anticuerpos o sus controles por vía intraperitoneal. 24 horas después de la inyección, los ratones se sacrificaron y sus células del bazo se tiñeron con mAb anti-CD11c, CD11b, anti-B7-1 y anti-B7-2. La FIG. 17B muestra datos representativos que muestran el fenotipo de DC CD11chi analizadas para determinar la expresión de B7. La FIG. 17c muestra histogramas representativos que representan los niveles de B7-1 en DC de ratones que recibieron IgG1-Fc de control, L3D10 o 10D1. Los datos del panel superior muestran el efecto de los anticuerpos en ratones inactivados homocigotos, mientras que el del panel inferior muestra el efecto de los anticuerpos en los ratones heterocigotos. La FIG. 17D muestra como en la FIG. 17C, excepto por que se muestra la expresión de B7-2. Los datos mostrados en las FIG. 17C y D son representativos de los de 3 ratones por grupo y se han repetido una vez con tres ratones por grupo. La FIG. 17E muestra que en ratones homocigotos para CTLA4 humano, L3D10 pero no 10D1 indujo la expresión de B7-1 (panel izquierdo) y B7-2 (panel derecho). Los datos mostrados se resumen a partir de dos experimentos que implican un total de 6 ratones por grupo. En cada experimento, los datos medios en los ratones de control se definen artificialmente como 100 % y los de los grupos experimentales se normalizan con respecto al control. La FIG. 17F es como la FIG. 17E, excepto por que se usan ratones heterocigotos. Ni L3D10 ni 10D1 bloquean la interacción B7-CTLA4 en ratones que expresan de forma codominante genes Ctla4 tanto de ratón como humanos.

FIG. 18. L3D10 se une a CTLA4 humano pero no de ratón. Los datos que se muestran son gráficos de puntos de tinción intracelular de CTLA4 entre células Cd3+Cd4+ seleccionadas, usando células de bazo de ratones Ctla4h/h (parte superior) o Ctla4m/m (parte inferior). Se usó mAb anti-CTLA4 de ratón 4F10 como control.

FIG. 19. Efecto terapéutico de L3D10 y 10D1 quiméricos en ratones CTLA4h/m. El panel superior muestra el diseño experimental. Los ratones Ctla4h/h se expusieron a la estirpe celular de cáncer de colon MC38 y cuando el tumor alcanzó un tamaño de aproximadamente 5 mm de diámetro, los ratones se trataron 4 veces con IgG-Fc humano de control, L3D10 o 10D1 y se observó el tamaño tumoral durante un período de 6 semanas. Los paneles inferiores muestran la cinética de crecimiento de los tumores MC38 en ratones que recibieron IgG de control, L3D10 o 10D1 quimérico (n = 6 por grupo). A pesar de las diferencias aparentes en la actividad bloqueante de CTLA4 in vivo como se muestra en la FIG. 16, tanto L3D10 como 10D1 muestran una fuerte actividad antitumoral contra el modelo MC38 en ratones CTLA4m/h quiméricos.

FIG. 20A-B. 10D1 y L3D10 tienen un efecto terapéutico similar sobre el crecimiento del melanoma B16. Se inyectaron 1*105 células tumorales B16 (s.c.) en ratones Ctla4h/h (n = 4-5) y se trataron (i.p.) con 100 |jg (FIG. 20A) o 250 jg (FIG. 20B) de 10D1, L3D10 o IgGFc de control los días 11, 14, 17 (FIG. 20A) o los días 2, 5 y 8 (FIG.

20B), como lo indican las flechas. Para la FIG. 20A, 10D1 frente a hlgGFc: P = 0,0265; L3D10 frente a hlgGFc: 10D1 frente a L3D10: P = 0,0487; P = 0,302. Para la FIG. 20B, 10D1 frente a hlgGFc: P = 0,00616; L3D10 frente a hlgGFc: P = 0,0269: 10D1 frente a L3D10: P = 0,370. Los datos representan la media ± ETM de 4-5 ratones por grupo. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías.

FIG. 21A-B. Efectos inmunoterápicos entre L3D10 y 10D1 en ratones Ctla4h/h (FIG. 21A) y Ctla4m/h (FIG. 21B) en ratones a los que se les puso fin antes del rechazo completo con el fin de evaluar el agotamiento de Treg dentro del microambiente tumoral. Los datos mostrados son medias y ETM de diámetros tumorales de dos experimentos independientes, que implican 5 ratones por grupo.

FIG. 22A-F. El bloqueo de la interacción B7-CTLA4 no contribuye a la actividad inmunoterápica contra el cáncer del mAb anti-CTLA4. La FIG. 22A muestra un efecto inmunoterápico comparable a pesar de una actividad bloqueante muy diferente de dos mAb anti-CTLA4. Se inyectaron 5 * Í05 células tumorales MC38 (s.c.) en ratones Ctla4h/h (n = 6) y tratados (i.p.) con 100 jg de 10D1, L3D10 o hlgG-Fc de control los días 7, 10, 13 y 16, como lo indican las flechas. Los datos representan la media ± ETM de seis ratones por grupo. Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías (tratamiento x tiempo). 10D1 frente a hlgG-Fc: P = 5,71e-07; L3D10 frente a hlgG-Fc: P = 5,53e'07; 10D1 frente a L3D10: P = 0,869. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. FIG. 22B. En ratones en los que ninguno de los anticuerpos bloquea la interacción B7-CTLA4, ambos inducen un fuerte rechazo tumoral. Como en la FIG. 22A, excepto por que se usaron ratones heterocigotos que expresan CTLA4 tanto de ratón como humano. 10D1 frente a hlgG-Fc: P = 0,0011; L3D10 frente a hlgG-Fc: P = 5,55e'0S; 10D1 frente a L3D10: P = 0,0346. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. FIG. 22C-F, El bloqueo de la interacción B7-CTLA4 no contribuye al agotamiento selectivo de Treg en el microambiente tumoral. FIG. 22C y D. Independientemente de su capacidad para bloquear la interacción B7-CTLA4, L3D10 y 10D1 no suprimen Treg en el bazo. Los datos mostrados son el % de células Foxp3+ entre los linfocitos T CD4 del bazo en ratones Ctla4h/h (FIG. 22C) y Ctla4m/h (FIG. 22D). n = 6. e y f, tanto L3D10 como 10D1 suprimen Treg entre los linfocitos T CD4 infiltrantes de tumores en ratones Ctla4h/h (FIG. 22E) y Ctla4m/h (FIG. 22F). Los datos mostrados en c-f son % de Treg a los 17 (experimento 1) o 19 días (experimento 2) después de la exposición con células tumorales y 10 o 12 días después del inicio de 4 tratamientos con mAb anti-CTLA4 como se indica en las flechas.

FIG. 23A-F. Evaluación de las actividades de bloqueo de los mAb anti-CTLA4 de ratón 9H10 y 9D9 de uso común. Las FIG. 23A y B muestran que 9H10 no bloquea la interacción B7-CTLA4 si B7-1 (FIG. 23A) y B7-2 (FIG. 23B) se aplican como recubrimiento sobre placas. Se incubó proteína de fusión CTLA4-Fc de ratón biotinilada con placas recubiertas con B7 en presencia de una concentración dada de IgG de control o mAb anti-CTLA4 de ratón 9D9 y 9H10. La unión de CTLA4 se detecta con estreptavidina conjugada con HRP. Los datos mostrados son medias de duplicados, y son representativos de dos experimentos independientes. Las FIG. 23C y D muestran que 9D9 y 9H10 presentan unión diferencial a CTLA4-Fc soluble (FIG. 23c ) y unido a placa (FIG. 23d ). Los datos mostrados son medias duplicadas y son representativos de al menos dos experimentos independientes. Las FIG. 23E y F muestran los efectos de mAb anti-CTLA4 de ratón 9D9 y 9H10 sobre los niveles de B7-1 (FIG. 23E) y B7-2 (FIG.

23F) en DC CD11chi de células del bazo WT (tipo silvestre, por sus siglas en inglés) (Ctla4m/m) 24 horas después del tratamiento con 500 jg de anticuerpos i.p. Los datos se resumen a partir de 6 ratones independientes por grupo en dos experimentos independientes que implican 3 ratones por grupo cada uno.

FIG. 24A-D. Actividades bloqueantes in vivo e in vivo distintas del mAb anti-CTLA4 de ratón 4F10. Las FIG. 24A y B muestran el efecto de 4F10 sobre la interacción de CTLA4-Fc con B7-1 (FIG. 24A) o B7-2 (FIG. 24B) aplicados como recubrimiento sobre placas. Se incubó proteína de fusión CTLA4-Fc de ratón biotinilada con placas recubiertas con B7 en presencia de una concentración dada de IgG de control o mAb anti-CTLA4 de ratón 4F10. La unión de CTLA4 se detecta con estreptavidina conjugada con HRP. Los datos mostrados son medias de duplicados, y son representativos de dos experimentos independientes. Las FIG. 24C y D muestran el impacto de 4F10 en la expresión de B7-1 y B7-2. Datos resumidos sobre los niveles de B7-1 (FIG. 24C) y B7-2 (FIG. 24D) de 6 ratones por grupo. Los niveles de B7 en el grupo de control tratado con IgG se definen artificialmente como 100 %.

FIG. 25. Efectos adversos de L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. El panel superior muestra el diseño experimental. Para el estudio se usaron ratones con activación de CTLA4 humano exclusivamente hembras de 10 días de edad con un peso corporal de más de 4 gramos. Recibieron las proteínas indicadas o sus combinaciones. Las flechas indican el tiempo de tratamiento (100 jg/ratones/tratamiento). Los datos mostrados son medias y D.T. del % de ganancias de peso. L3D10 y 10D1 quiméricos tienen un efecto terapéutico contra el cáncer comparable en ratones adultos (FIG. 13), pero se observan efectos adversos distintos cuando 10D1 se combina con el mAb anti-PD-1.

FIG. 26. Efectos adversos de L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. El gráfico muestra el peso corporal terminal el Día 42 en los ratones del experimento esbozado en la FIG. 25 que recibieron IgG de control, 10D1 anti-PD-1 o L3D10 quimérico anti-PD-1 (n = 5 por grupo). Se observa una reducción significativa de peso con la combinación anti-PD1 10D1, lo que no se observó con la combinación anti-PD-1+L3D10 Quimérico.

FIG. 27. Efectos patológicos de L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. Para examinar adicionalmente la toxicidad relativa de L3D10 en comparación con 10D1 cuando se administraron en combinación con anti-PD-1, se observó la anatomía macroscópica de los ratones descritos en la FIG. 26 anterior. El Útero/Ovario/Vejiga y el timo eran notablemente más pequeños en ratones tratados con 10D1 PD-1, mientras que los órganos de los ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 eran comparables a los del control de hlgG. Por el contrario, los corazones disecados de ratones tratados con 10D1 parecían más grandes y con un aspecto notablemente más blanco.

FIG. 28A-D. El tratamiento con 10D1 en combinación con anti-PD-1 da como resultado una eritropoyesis anormal. Dadas las diferencias en los corazones observadas en la FIG. 27, se observó la eritropoyesis dentro de los ratones y se observaron diferencias claras en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a los grupos tratados con L3D10 anti-PD-1 o anticuerpo de control (hIgG), que eran bastante similares. La médula ósea de ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 tenía un color notablemente más blanco (FIG. 28A) y la sangre aislada era de color casi completamente blanco (FIG. 28B). De acuerdo con esto, cuando se analizó la diferenciación de los glóbulos rojos usando la distribución de los marcadores CD119 y CD71, se observó una reducción estadísticamente significativa en el número de células en desarrollo en Fase IV en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1. En la FIG. 28C se muestran perfiles de FACS representativos, mientras que los datos resumidos se presentan en la FIG.

28D.

FIG. 29. Análisis por citometría de flujo de anticuerpos anti-glóbulos rojos. Se tiñeron muestras de sangre de ratones NOD.SCID.II2rg-/- (NSG) con muestras de plasma de los ratones que recibieron tratamiento con anticuerpos durante el período perinatal. Se usaron sueros de ratones NSG y aquellos sin suero se usaron como control negativo. Todos los sueros se usaron a una dilución 1:50. Estos datos muestran que ningún ratón produjo anticuerpos anti-glóbulos rojos.

FIG. 30. Patología del corazón en ratones tratados con L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. Para determinar adicionalmente la toxicología de L3D10 frente a 10D1 en combinación con anti-PD-1, se realizó un análisis histológico del corazón en ratones descritos en la FIG. 26. Los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 mostraron un alto nivel de infiltración de linfocitos T que no se observó en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 o ratones tratados con control de IgG humana.

FIG. 31. Patología del pulmón en ratones tratados con L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. Para determinar adicionalmente la toxicología de L3D10 frente a 10D1 en combinación con anti-PD-1, se realizó un análisis histológico del pulmón en ratones descritos en la FIG. 26. Los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 mostraron un alto nivel de infiltración de linfocitos T que no se observó en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 o ratones tratados con control de IgG humana.

FIG. 32. Patología de la glándula salival en ratones tratados con L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. Para determinar adicionalmente la toxicología de L3D10 frente a 10D1 en combinación con anti-PD-1, se realizó un análisis histológico de la glándula salival en ratones descritos en la FIG. 26. Los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 mostraron un nivel mucho mayor de infiltración de linfocitos T en comparación con el observado en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 o ratones tratados con control de IgG humana.

FIG. 33A-F. Patología del riñón y del hígado en ratones tratados con L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. Para determinar adicionalmente la toxicología de L3D10 frente a 10D1 en combinación con anti-PD-1, se realizó un análisis histológico del riñón y del hígado en ratones descritos en la FIG. 26. Las FIG. 33A-C son secciones del riñón y

las FIG. 33D-E son secciones tomadas del hígado. Los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 mostraron un nivel alto de infiltración de linfocitos T en comparación con el observado en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 o ratones tratados con control de IgG humana.

FIG. 34. Puntuaciones de toxicidad de ratones tratados con L3D10 y 10D1 quiméricos en combinación con anti-PD-1. Estos datos de tejido mostrados en las FIG. 30-33 se resumen y muestran las altas puntuaciones de toxicidad de los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a L3D10 anti-PD-1 que tiene puntuaciones sólo marginalmente superiores que el grupo de ratones de control de hlgG.

FIG. 35. 10D1+anti-PD-1 no tienen toxicidad significativa en los ratones Ctla4h/m como se evidencia por las ganancias de peso corporal normales en ratones que recibieron tratamiento con anticuerpos durante el período perinatal. Los ratones recibieron tratamientos con el anticuerpo dado o combinaciones los días 10, 13, 16, 19 y 22 por vía intraperitoneal (100 pg/ratones/inyección/anticuerpo). Los ratones se pesaron al menos una vez cada 3 días.

FIG. 36. L3D10 y 10D1 muestran patrones de unión similares para CTLA4 inmovilizado en placa. Las placas de ELISA se recubrieron con 1 pg/ml de proteína CTLA4-His (Sino Biological, China). Se añadió la concentración dada de proteínas de unión biotiniladas, y se midió la unión usando estreptavidina conjugada con HRP. 10D1-1 y -2 son dos lotes de material independientes del mismo anticuerpo. hlgG-Fc es un control negativo de Ig humana.

FIG. 37. L3D10 muestra CTLA4 soluble de unión reducida. Se aplicaron concentraciones dadas de mAb anti-CTLA4 humano como recubrimiento sobre la placa durante la noche, después de lavar y bloquear con albúmina sérica bovina, se añadió CTLA4-Fc biotinilado a 0,25 pg/ml. Después de la incubación y el lavado, las cantidades de CTLA4-Fc capturado se midieron usando estreptavidina marcada con HRP.

FIG. 38. Alineación de las regiones variables del anticuerpo humanizado con la secuencia del anticuerpo L3D10 parental. La región variable de cadena pesada (parte superior) (SEQ ID NO: 62-64) y la región variable de cadena ligera (parte inferior) (SEQ ID NO: 70-72) de las secuencias del anticuerpo humanizado están alineadas con el anticuerpo L3D10 parental (cadena pesada: SEQ ID NO: 57; cadena ligera: SEQ ID NO: 65) y los respectivos armazones de anticuerpos humanos (cadena pesada: SEQ ID NO: 58-61; cadena ligera: SEQ ID NO: 66-69). Las retromutaciones en la secuencia parental del ratón están resaltadas en color amarillo. Los aminoácidos novedosos, es decir, los restos de aminoácidos que no están presentes en la secuencia del anticuerpo parental o en el armazón del anticuerpo humano respectivo están resaltados en color verde. Las mutaciones introducidas en las secuencias de CDR2 se muestran en color morado. Las secuencias de CDR se muestran en color rojo basándose en www.bioinf.org.uk/abs/.

FIG. 39A-B. Actividad antitumoral de anticuerpos L3D10 humanizados en comparación con 10D1. Usando el modelo de tumor de ratón MC38 en ratones con activación de CTLA4 humano, se observó la actividad antitumoral de los anticuerpos L3D10 humanizados en comparación con el anticuerpo L3D10 quimérico y 10D1. El panel superior muestra el programa de tratamiento del experimento in vivo; a los ratones se les administraron un total de 4 dosis de anticuerpo cada 3 días a partir del día 7 después de la inoculación. Todos los anticuerpos humanizados (n = 6 por grupo) erradicaron completamente los tumores y fueron comparables a 10D1 (panel inferior).

FIG. 40. Actividad antitumoral de anticuerpos L3D10 humanizados en ratones CTLA4h/m. El panel superior muestra el programa de tratamiento del experimento in vivo; los ratones Ctla4h/m recibieron hlg de control o uno de tres mab anti-CTLA4 humano diferentes en dosis de 30 (-30, líneas continuas) o 10 (-10, líneas de puntos) mg por inyección en las fechas indicadas después de la inyección del tumor MC38. Los tamaños de los tumores se midieron una vez cada tres días.

FIG. 41. Efecto terapéutico del mAb anti-CTLA-4 en el modelo de tumor B16-F1 de enfermedad mínima. Usando el modelo de tumor de ratón B16-F1 en ratones con activación de CTLA4 humano, los presentes inventores observaron la actividad antitumoral de los anticuerpos L3D10 humanizados. Se inyectaron 1*105 células tumorales B16 (s.c.) en ratones Ctla4h/h (n = 5-6). Los días 2, 5 y 8, los ratones se trataron con Ig de control, 10D1, L3D10 quimérico o PP4637 y PP4638 (250 pg/ratón, i.p.). La incidencia y los tamaños de los tumores se midieron cada dos días. 10D1 frente a hlgGFc: P = 0,00616; L3D10 frente a hlgGFc: P = 0,0269; 10D1 frente a L3D10: P = 0,370; PP4637 frente a hlgGFc: P = 0,0005; PP4637 frente a 10D1: P = 0,805; PP4638 frente a hlgGFc: P = 0,0016; PP4638 frente a 10D1: P = 0,856. Los datos representan la media ± ETM de 5-6 ratones por grupo. Los tamaños de los tumores se consideraron 0 para los ratones que nunca desarrollaron un tumor.

FIG. 42. Comparación entre hembras 10D1, PP4631 y PP4637 para determinar su toxicidad combinada con mAb anti-PD-1. Se trataron ratones CTLA4h/h hembra los días 10 u 11 después del nacimiento con 4 inyecciones de anticuerpos (100 pg/ratones/inyección, una vez cada tres días) o Fc de control como se especifica en las leyendas. Los ratones se pesaron una vez cada 3 días. Los datos mostrados son medias y ETM del % de ganancia de peso durante un período de 30 días. Todos los ratones se sacrificaron el día 43 para el análisis histológico. El número de ratones utilizados por grupo se muestra en los paréntesis de los rótulos.

FIG. 43. La terapia de combinación con 10D1 y anti-PD-1 provoca anemia, mientras que aquellos con PP4631+anti-PD-1 o PP4637+anti-PD-1 no lo hacen. Los datos mostrados son hematocrito de ratones de 43 días de edad que han recibido cuatro tratamientos de anticuerpos los días 11, 14, 17 y 20 a dosis de 100 pg/ratón/anticuerpos.

FIG. 44A-B. La terapia de combinación con 1001+anti-PD-1 provoca la activación sistémica de los linfocitos T, mientras que aquellos con PP4631+anti-PD-1 o PP4637+anti-PD-1 no lo hacen. Los datos mostrados son el % de linfocitos T CD4 (paneles superiores) y CD8 (paneles inferiores) con fenotipos de linfocitos T sin activación previa (CD44loCD62Lhi), de memoria central (CD44hiCD62Lhi) y de memoria efectora (CD44hiCD62Llo) ya sea en sangre periférica (FIG. 44A) o en el bazo (FIG. 44B). Las células se recogieron de ratones de 43 días de edad que recibieron cuatro tratamientos de anticuerpos los días 11, 14, 17 y 20 a dosis de 100 pg/ratón/anticuerpos.

FIG. 45. La humanización de L3D10 no afecta la unión a CTLA4 inmovilizado. La capacidad de los anticuerpos L3D10 humanizados para unirse a CTLA4 inmovilizado se determinó como se describe en la FIG. 36. El eje X indica la concentración de mAb anti-CTLA-4 añadidos a la solución. La humanización no afecta la unión a CTLA4 inmovilizado y los 3 anticuerpos humanizados demostraron una unión similar al anticuerpo L3D10 quimérico parental y 10D1. Se observaron patrones similares cuando se usó CTLA4-lg en lugar de CTLA-4-his.

FIG. 46. La humanización reduce adicionalmente la unión de L3D10 a CTLA4 soluble. La capacidad de los anticuerpos L3D10 humanizados para unirse a CTLA4 soluble se determinó como se describe en la FIG. 37. El eje X indica la concentración de mAb anti-CTLA-4 aplicados como recubrimiento sobre placas de ELISA. La humanización reduce adicionalmente la unión a CTLA4 soluble con respecto al anticuerpo L3D10 quimérico parental. Se observaron patrones similares cuando se usó CTLA4-lg en lugar de CTLA-4-his.

FIG. 47A-B. PP4631, PP4638 y PP4637 no bloquean las interacciones B7-CTLA-4 in vitro. La FIG. 47A muestra el bloqueo de la interacción B7-1-CTLA-4 por mAb anti-CTLA-4 humano 10D1, PP4631, PP4637 y L3D10. Se inmovilizó B7-1Fc a la concentración de 0,5 pg/ml. Se añadió CTLA4-Fc biotinilado a 0,25 pg/ml junto con las dosis dadas de anticuerpos. Los datos mostrados son medias de la densidad óptica por duplicado a 405 nM. La FIG.

47B muestra el bloqueo de la interacción B7-2-CTLA-4 por los mAb anti-CTLA-4 humano 10D1 y L3D10. Como en la FIG. 47A, excepto por que B7-2-Fc estaba inmovilizado.

FIG. 48. PP4631 y PP4637 no bloquean las interacciones B7-CTLA-4 in vivo como lo demuestra su falta de efecto sobre la expresión de B7-1 y B7-2 en células dendríticas. Datos resumidos sobre los niveles de B7-1 (a) y B7-2 (b) de 3 ratones por grupo. Los niveles de B7 en el grupo de control tratado con IgG se definen artificialmente como 100 %.

FIG. 49. PP4637, que presenta el mejor perfil de seguridad en combinación con mAb anti-PD-1 (véase la FIG. 42), es el más potente para provocar rechazo tumoral basándose en el rechazo tumoral a las dosis terapéuticas más bajas. Los ratones Ctla4h/m recibieron IgFc de control o uno de tres mab anti-CTLA4 humano diferentes en dosis de 30 (-30, líneas continuas) o 10 (-10, líneas de puntos) pg por inyección en las fechas indicadas. Los tamaños de los tumores se midieron una vez cada tres días. A 10 pg/inyección, PP4637 (HL32) es el más eficiente para inducir el rechazo tumoral.

FIG. 50. Evaluación de la pureza de los anticuerpos humanizados. Se purificaron anticuerpos L3D10 humanizados expresados transitoriamente mediante cromatografía de proteína A y las muestras de los 3 anticuerpos se evaluaron mediante SDS-PAGE reductora y no reductora. Las proteínas purificadas produjeron bandas de gel de tamaño indicativo de una molécula de anticuerpo tanto en condiciones reductoras como no reductoras. Las calles de "Flujo de salida" muestran el flujo de la columna de proteína A, lo que indica que la mayor parte de la proteína de anticuerpo se adhirió a la columna de proteína A.

FIG. 51. Cromatografía de exclusión por tamaño (SE-HPLC, por sus siglas en inglés) de proteína expresada transitoriamente. Se analizaron muestras de proteínas para cada uno de los anticuerpos humanizados mediante SE-HPLC después de una cromatografía de proteína A de una única etapa. Panel superior: anticuerpo PP4631. Panel central: anticuerpo PP4637. Panel inferior: anticuerpo PP4638.

FIG. 52. Análisis por CE-SDS de proteína expresada transitoriamente. Se analizaron muestras de proteínas para cada uno de los anticuerpos humanizados mediante CE-SDS después de una cromatografía de proteína A de una única etapa. Los paneles de la izquierda muestran los resultados en condiciones no reducidas y los paneles de la derecha muestran los resultados en condiciones reducidas. Panel superior: anticuerpo PP4631. Panel central: anticuerpo PP4637. Panel inferior: anticuerpo PP4638.

FIG. 53A-C. Perfil de isoformas de carga y desamidación de los anticuerpos L3D10 humanizados como se determina mediante enfoque isoeléctrico capilar (clEF, por sus siglas en inglés). El nivel de desamidación de proteínas bajo estrés de pH alto se determinó comparando los anticuerpos L3D10 humanizados antes y después del tratamiento de estrés de pH alto durante dos períodos de tiempo diferentes (5 horas y 12,5 horas) que se analizaron mediante análisis clEF. Las FIG. 53A-C muestran los perfiles para los anticuerpos PP4631, PP4637 y PP4638, respectivamente.

FIG. 54A-C. Análisis térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en inglés) de los anticuerpos L3D10 humanizados. Con el fin de determinar la estabilidad térmica y las temperaturas de fusión de los diferentes anticuerpos, se sometieron a análisis térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las FIG.

54A-C muestran las curvas de DSC normalizadas para los anticuerpos PP4631, PP4637 y PP4638, respectivamente.

FIG. 55. Alineación de los dominios extracelulares CTLA-4 humano, de macaco y de ratón. Las secuencias de aminoácidos de los dominios extracelulares de la proteína CTLA-4 humana (Hm, mostrada en color rojo) (SEQ ID NO: 73), de macaco (Mk, mostrada en color negro) y ratón (Ms, mostrada en color verde) están alineadas y los aminoácidos conservados (con respecto a la secuencia humana) se muestran con guiones (-). Con el fin de ayudar a la alineación, la secuencia de ratón tiene una supresión y una inserción (con respecto a las secuencias humana y de mono) en las posiciones resaltadas en color amarillo. El sitio de unión de B7-1lg conocido se muestra en negrita y subrayado. Las secuencias demuestran que las secuencias humanas y de mono están altamente conservadas, mientras que la secuencia de ratón tiene varias diferencias de aminoácidos. Basándose en esta alineación de secuencia, se diseñaron 11 proteínas CTLA-4Fc humanas mutantes (M1 - M11) (SEQ ID NO: 40-50) que incorporan aminoácidos específicos murinos; los aminoácidos incorporados en cada proteína mutante se muestran en color azul.

FIG. 56A-B. Composición de la secuencia de aminoácidos de las proteínas CTLA-4Fc WT y mutantes. Se diseñaron como se muestra construcciones de ADN que codificaban la proteína CTLA-4Fc WT (SEQ ID NO: 39) y 11 proteínas mutantes (SEQ ID NO: 40-50) que incorporan aminoácidos de Ctla-4 murina. Las secuencias de aminoácidos son para proteínas maduras, incluyendo la porción Fc de IgG1, pero no el péptido señal. El sitio de unión de B7-1lg conocido se muestra en letras de color azul grandes y subrayado doble. Los restos de aminoácidos murinos reemplazados en el mutante se muestran en minúsculas en color rojo. La porción Fc de IgG1 de las proteínas está subrayada.

FIG. 57. La mutación en M11 (AA103-106, YLGI>fcGm) suprimen selectivamente la unión del anticuerpo a CTLA-4 humano. Los datos mostrados son medias de duplicados, que representan la unión de B7-1Fc (a), L3D10 (b), PP4631 (c) y PP4637 (d) la unión a hCTLA4-Fc aplicado como recubrimiento sobre placas (círculos abiertos), mCTLA4-Fc (triángulos rellenos), M11 (círculos rellenos) e IgG1-Fc (triángulos abiertos).

FIG. 58. Cartografiado de L3D10, PP4631 y PP4637 a un epítopo adyacente al sitio de unión B7-1 en una estructura 3D del complejo B7-1-CTLA4. El motivo de unión de B7-1 está coloreado en rojo, mientras que el epítopo del anticuerpo está coloreado en morado. B7-1 se representa encima de CTLA4 con una cinta llena de espacios, mientras que el de CTLA-4 se representa como una cinta sin rellenar.

FIG. 59. Composición de la secuencia de aminoácidos de las proteínas CTLA-4Fc WT (SEQ ID NO: 39) y mutantes, M12-M17 (s Eq ID NO: 51-56). Se diseñaron como se muestra construcciones de ADN que codificaban las 6 proteínas CTLA-4Fc mutantes, M12-M17, que incorporaban aminoácidos de Ctla-4 murino. Las secuencias de aminoácidos son para proteínas maduras, incluyendo la porción Fc de IgG1, pero no el péptido señal. El sitio de unión de B7-1lg conocido se muestra en letras de color azul grandes y subrayado doble. Los restos de aminoácidos murinos reemplazados en el mutante se muestran en minúsculas en color rojo. La porción Fc de IgG1 de las proteínas está subrayada.

FIG. 60A-C. El análisis mutacional revela requisitos de unión distintos para 10D1 (FIG. 60A), PP4631 (FIG. 60B) y PP4637 (FIG. 60C) a CTLA-4. Se recubrieron mutantes CTLA-4Fc durante la noche a 4 oC a 1 pm/ml. Después de bloquear con BSA, se añadió una concentración dada de mAb anti-CTLA-4 biotinilados y se incubó durante 2 horas. Después de eliminar los anticuerpos no unidos, los anticuerpos unidos se detectaron con estreptavidina marcada con HRP.

FIG. 61A-B. Efecto terapéutico de los anticuerpos anti-4-1BB y anti-CTLA-4 tanto en modelos de enfermedad mínima (FIG. 61A) como de tumor establecido (FIG. 61B). La FIG. 61A muestra la terapia de enfermedad mínima. Se inocularon ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 5x105 células MC38. Los días 2, 9 y 16 después de la inyección de células tumorales, se inyectaron IgG de hámster y de rata de control, anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-4-1BB. Los tamaños de los tumores se midieron mediante examen físico. Los datos mostrados son la cinética de crecimiento de los tumores, y cada línea representa el crecimiento tumoral en un ratón. Los tamaños presentados son productos de diámetros largos y cortos del tumor. La FIG. 61B muestra la terapia de tumores establecidos. Como en la FIG. 61A, excepto por que la terapia comenzó el día 14 después de la exposición al tumor; todos los ratones tenían tumores establecidos que variaban entre 9 y 60 mm2 de tamaño antes de que se iniciase el tratamiento con mAb. El efecto combinado de los dos anticuerpos sobre los tumores establecidos se repitió 3 veces.

FIG. 62. Los linfocitos T CD8, pero no los linfocitos CD4 o NK, son esenciales para el rechazo tumoral inducido por anticuerpos. Los ratones portadores de tumores carecían de linfocitos CD4, CD8 o NK mediante tres inyecciones de anticuerpos específicos para CD4, CD8 o NK1.1 los días 9, 12 y 16 después de la inoculación de células tumorales (*). Se inyectaron anticuerpos terapéuticos (anti-CTLA-4 más anti-4-1BB) los días 9, 16 y 23 (flechas verticales). Los datos mostrados son medias y ETM de los tamaños de tumorales (n = 3). P < 0,05 para el grupo con agotamiento de CD8 en comparación con cada uno de los otros grupos (f).

FIG. 63A-B. La terapia de combinación redujo la respuesta del hospedador a los anticuerpos anti-CTLA-4. Se recubrieron placas de ELISA con anticuerpos de hámster anti-CTLA-4 de ratón (FIG. 63A) o anticuerpos de rata de anti-4-1BB de ratón (FIG. 63B). Se añadieron a las placas diferentes diluciones de sueros de grupos de 5 ratones cada uno. Las cantidades relativas de anticuerpo unido se determinaron usando un reactivo de etapa secundaria (anticuerpos anti-ratón de cabra biotinilados que perdieron su reactividad frente a IgG de rata y de hámster por absorción). Los datos mostrados son la media y el ETM de la densidad óptica a 490 nm. Se observó una reducción similar de la respuesta a anticuerpos del hospedador a anti-CTLA-4 y 4-1BB cuando se trataron ratones sin tumores con los mismos anticuerpos (datos no mostrados).

FIG. 64A-B. Terapia de combinación con anticuerpos anti-4-1BB y L3D10 (anti-CTLA4 humano) en ratones con activación del gen de CTLA-4 humano. La FIG. 64A muestra un efecto terapéutico. Se inocularon ratones con activación de CTLA4 humano con 5x105 células tumorales MC38 por vía subcutánea. Dos días después, se trataron grupos de 7 ratones con IgG de rata y ratón, anti-4-1BB e IgG de ratón, L3D10 e IgG de rata, o L3D10 y anti-4-1BB, como indican las flechas. Los datos mostrados son el volumen tumoral medio y el ETM (n = 7). Todos los tratamientos redujeron significativamente el crecimiento tumoral (P < 0,001) y el grupo de tratamiento con anticuerpo doble mostró una reducción significativa del tamaño tumoral en comparación con el control (P < 0,0001) o el anticuerpo L3D10 (P = 0,0007) o el tratamiento con anticuerpo anti-4-1BB (P = 0,03). Todos los ratones portadores de tumores se sacrificaron cuando el grupo de control tratado con IgG alcanzó los criterios de eliminación temprana. La FIG. 64B muestra inmunidad duradera en ratones que recibieron terapia de combinación. Los ratones sin tumores del grupo tratado con anticuerpo doble desarrollaron inmunidad duradera contra los tumores MC38. 110 días después de la primera exposición con células tumorales, los ratones sin tumores tratados con anticuerpos dobles o los ratones sin tratamiento previo de control se expusieron a 5*105 células tumorales por vía subcutánea. El crecimiento tumoral se controló mediante examen físico. Nótese que todos los ratones que rechazaron los tumores en la primera ronda fueron totalmente resistentes a una nueva exposición, mientras que todos los ratones sin tratamiento previo tuvieron un crecimiento tumoral progresivo.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" pretende indicar una molécula de inmunoglobulina que posee un sitio de reconocimiento de antígeno de "región variable". La expresión "región variable" pretende distinguir dicho dominio de la inmunoglobulina de dominios que son ampliamente compartidos por anticuerpos (tales como un dominio Fc de anticuerpo). La región variable comprende una "región hipervariable" cuyos restos son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "Región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, normalmente a aproximadamente los restos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y a aproximadamente los restos 27-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; ref. 44) y/o los restos de un "bucle hipervariable" (es decir, los restos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Ref. 45). Los restos de "región marco conservada" o "FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable como se define en el presente documento. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id contra los anticuerpos de la invención). En particular, dichos anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG-i, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgA<1>e IgA<2>) o subclase.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que contienen las Regiones Determinantes de la Complementariedad ("CDR") del anticuerpo y opcionalmente los restos estructurales que comprenden el sitio de reconocimiento de antígeno de la "región variable" del anticuerpo, y presentan la capacidad de unirse inmunoespecíficamente al antígeno. Estos fragmentos incluyen Fab', F(ab').sub.2, Fv, monocatenario (ScFv) y mutantes de los mismos, variantes naturales y proteínas de fusión que comprenden el sitio de reconocimiento del antígeno de la "región variable" del anticuerpo y una proteína heteróloga (por ejemplo, una toxina, un sitio de reconocimiento de antígeno para un antígeno diferente, una enzima, un receptor o ligando de receptor, etc.). Como se usa en el presente documento, el término "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 restos de aminoácidos contiguos, al menos 10 restos de aminoácidos contiguos, al menos 15 restos de aminoácidos contiguos, al menos 20 restos de aminoácidos contiguos, al menos 25 restos de aminoácidos contiguos, al menos 40 restos de aminoácidos contiguos, al menos 50 restos de aminoácidos contiguos, al menos 60 restos de aminoácidos contiguos, al menos 70 restos de aminoácidos contiguos, al menos 80 restos de aminoácidos contiguos, al menos 90 restos de aminoácidos contiguos, al menos 100 restos de aminoácidos contiguos, al menos 125 restos de aminoácidos contiguos, al menos 150 restos de aminoácidos contiguos, al menos 175 restos de aminoácidos contiguos, al menos 200 restos de aminoácidos contiguos o al menos 250 restos de aminoácidos contiguos.

Se prefieren particularmente anticuerpos humanos, quiméricos o humanizados para su uso in vivo en seres humanos, sin embargo, pueden emplearse ventajosamente anticuerpos murinos o anticuerpos de otras especies para muchos usos (por ejemplo, ensayos de detección in vitro o in situ, uso in vivo agudo, etc.).

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo derivan de moléculas de inmunoglobulina diferentes, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una o más CDR de una especie no humana y regiones marco conservadas de una molécula de inmunoglobulina humana pueden producirse usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, el injerto de CDR (documento EP 239.400; la Publicación Internacional N.° WO 91/09967; y las Patentes de los E<e>.UU. N.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), modificación superficial o revestimiento (documento EP 592,106; documento EP 519.596: 46 48) y transposición de cadenas (Patente de los EE.UU. N.° 5.565.332).

La invención se refiere particularmente a "anticuerpos humanizados". Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina que comprende una región marco conservada humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (habitualmente una de ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina humana que proporciona el armazón se denomina "aceptadora". No es necesario que haya regiones constantes presentes, pero si las hubiese, pueden ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente el 85-90 %, preferentemente aproximadamente el 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de secuencias de inmunoglobulinas humanas naturales. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina de cadena ligera humanizada y cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado no abarcaría un anticuerpo quimérico típico, porque, por ejemplo, toda la región variable de un anticuerpo quimérico no es humana. Se dice que el anticuerpo del donante se ha "humanizado", mediante el proceso de "humanización", porque se espera que el anticuerpo humanizado resultante se una al mismo antígeno que el anticuerpo donante que proporciona las CDR. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de región hipervariable del receptor se reemplazan por restos de región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o un primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas ocasiones, los restos de la región marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se efectúan para perfeccionar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido Fc.gamma.RIIB, que se ha alterado mediante la introducción de sustituciones, supresiones o adiciones de restos de aminoácidos (es decir, mutaciones).

Descripción detallada

Se ha demostrado que un anticuerpo contra la proteína CTLA4 humana, Ipilimumab, aumenta la supervivencia de los pacientes con cáncer, ya sea como agente inmunoterápico único o en combinación con otros agentes terapéuticos tales como, por ejemplo, sin limitación, un anticuerpo anti-PD-1 (13-15). Sin embargo, el efecto terapéutico se asocia a efectos adversos importantes (13-18). Existe una gran necesidad de desarrollar nuevos anticuerpos anti-CTLA4 para conseguir un mejor efecto terapéutico y/o menos efectos adversos autoinmunitarios. Los inventores han descubierto un anticuerpo anti-CTLA4 que, sorprendentemente, se puede utilizar para inducir el rechazo del cáncer y al mismo tiempo reducir los efectos adversos autoinmunitarios asociados a la inmunoterapia.

En el presente documento se proporcionan composiciones de anticuerpos de materia y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. La invención se refiere además a la realización de dichas moléculas en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

De manera detallada, la invención proporciona una molécula, que comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CTLA4 humano, preferentemente expresado en la superficie de una célula viva a una concentración endógena o transfectada. La invención se refiere en particular a la realización de una molécula de este tipo en donde el fragmento de unión a antígeno se une a CTLA4 y en donde la célula viva es un linfocito T.

La presente invención se refiere a anticuerpos que son capaces de unirse inmunoespecíficamente a CTLA4. En algunas realizaciones, dichas moléculas son adicionalmente capaces de bloquear la unión de B7.1 y B7.2 a CTLA4.

La invención se refiere además a la realización de dichas moléculas en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. La divulgación incluye las realizaciones en donde dichos anticuerpos son monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o multiespecíficos.

La divulgación se refiere además a la realización de dichas moléculas o anticuerpos que se unen a CTLA4, y en donde el fragmento de unión a antígeno del mismo comprende seis CDR, en donde las CDR comprenden las CDR del anticuerpo anti-CTLA4 L3D10. Específicamente, el anticuerpo comprende las tres CDR de cadena ligera y las tres de cadena pesada del anticuerpo anti-CTLA4 L3D10.

La divulgación se refiere además a la realización de los anticuerpos descritos anteriormente, en donde el anticuerpo está marcado de forma detectable o comprende una toxina conjugada, fármaco, receptor, enzima, ligando de receptor.

La invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones de anticuerpos reivindicadas y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable

En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que ha sido aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que figura en la farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y más particularmente, en seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, en particular, para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también pueden contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención pueden suministrarse bien por separado o mezclados conjuntamente en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se ha de administrar por infusión, ésta puede dispensarse con un frasco de infusión que contenga agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de manera que los principios pueden mezclarse antes de la administración.

Las composiciones de la invención pueden formularse en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. y aquellas formadas con cationes tales como aquellos derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

La divulgación se refiere además al uso de las composiciones de anticuerpos descritas en el presente documento y composiciones farmacéuticas de los mismos para la regulación positiva de las respuestas inmunitarias. La modulación positiva del sistema inmunitario es particularmente deseable en el tratamiento de cánceres e infecciones crónicas y, por lo tanto, la presente invención tiene utilidad en el tratamiento de dichos trastornos. Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a una neoplasia o a un tumor resultante del crecimiento no controlado, anómalo, de las células. Como se usa en el presente documento, el cáncer incluye explícitamente leucemias y linfomas. El término se refiere a una enfermedad que implica células que tienen el potencial de metastatizarse en sitios distales.

En consecuencia, las composiciones de la invención también pueden ser útiles en el tratamiento o la prevención de una diversidad de cánceres u otras enfermedades proliferativas anómalas, incluyendo (pero sin limitación) los siguientes: carcinoma, incluyendo el de vejiga, mama, colon, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, estómago, cuello del útero, tiroides y piel; incluyendo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoyéticos de linaje linfoide, incluyendo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de linfocitos B, linfoma de linfocitos T, linfoma de Berkett; tumores hematopoyéticos del linaje mieloide, incluyendo leucemias mielógenas agudas y crónicas y leucemia promielocítica; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma y rabdomioscarcoma; otros tumores, incluyendo melanoma, seminoma, tetratocarcinoma, neuroblastoma y glioma; tumores del sistema nervioso central y periférico, incluyendo astrocitoma, neuroblastoma, glioma y schwannomas; tumores de origen mesenquimatoso, incluyendo fibrosarcoma, rhabdomiosarcoma y osteosarcoma; y otros tumores, incluyendo melanoma, xenoderma pigmentoso, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides y teratocarcinoma. También se contempla que los cánceres ocasionados por aberraciones de la apóptosis también se tratarían mediante los métodos y las composiciones de la invención. Dichos cánceres pueden incluir, pero sin limitación, linfomas foliculares, carcinomas con mutaciones de p53, tumores dependientes de hormonas de mama, próstata y ovario, y lesiones precancerosas tales como poliposis adenomatosa familiar y síndromes mielodisplásicos. En realizaciones específicas, el tumor maligno o los cambios disproliferativos (tales como metaplasias y displasias) o trastornos hiperproliferativos, se tratan y previenen mediante los métodos y las composiciones de la invención en el ovario, vejiga, mama, colon, pulmón, piel, páncreas o útero. En otras realizaciones específicas, el sarcoma, el melanoma o la leucemia se tratan o previenen mediante los métodos y composiciones de la invención.

En otra realización de la invención, las composiciones de anticuerpos de los mismos pueden usarse con otras terapias antitumorales, incluyendo, pero sin limitación, quimioterapias experimentales y convencionales actuales, terapias hormonales, terapias biológicas, inmunoterapias, radioterapias o cirugía. En algunas realizaciones, las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más agentes, anticuerpos terapéuticos u otros agentes conocidos por los expertos en la materia para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad infecciosa o intoxicación. Dichos agentes incluyen, por ejemplo, cualquiera de los modificadores de la respuesta biológica analizados anteriormente, citotoxinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, antibióticos y agentes antimitóticos, así como inmunoterápicos.

En realizaciones preferidas de la invención, las composiciones de anticuerpos de los mismos pueden usarse con otras inmunoterapias antitumorales. En una realización de este tipo, las moléculas de la invención se administran en combinación con moléculas que interrumpen o potencian vías inmunomoduladoras alternativas (tales como TIM3, TIM4, OX40, CD40, GITR, 4-1-BB, B7-H1, PD-1, B7-H3, B7-H4, LIGHT, BTLA, ICOS, CD27 o LAG3) o modular la actividad de moléculas efectoras tales como citocinas (por ejemplo, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17, GF beta, IFNg, Flt3, Blys) y quimiocinas (por ejemplo, CCL21) con el fin de potenciar los efectos inmunomoduladores. Los ejemplos específicos incluyen un anticuerpo biespecífico que comprende las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento y anti-PD-1 (pembrolizumab (Keytruda) o Nivolumab (Opdivo)), anti-B7-H1 (atezolizumab (Tecentriq) o durvalumab), anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4, anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS o anti-4-1BB. Las moléculas de la invención pueden administrarse en combinación con moléculas que activan diferentes fases o aspectos de la respuesta inmunitaria con el fin de conseguir una respuesta inmunitaria más amplia. En una realización más preferida, las composiciones de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos se combinan con anticuerpos anti-PD-1 o anti-4-1BB, sin exacerbar los efectos secundarios autoinmunitarios.

La divulgación incluye además un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo que se une a CTLA4 unido a un anticuerpo que se une a otras moléculas inmunoestimuladoras. Los ejemplos específicos incluyen un anticuerpo biespecífico que comprende las composiciones de anticuerpos anti-CTLA4 descritas en el presente documento y anti-PD-1, anti-B7-H1, anti-B7-H3, anti-B7-H4, anti-LIGHT, anti-LAG3, anti-TIM3, anti-TIM4, anti-CD40, anti-OX40, anti-GITR, anti-BTLA, anti-CD27, anti-ICOS o anti-4-1BB. La divulgación se refiere además al uso de dichos anticuerpos para el tratamiento del cáncer.

Los métodos de administración de las composiciones de anticuerpos de la invención incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). En una realización específica, los anticuerpos de la invención se administran por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía subcutánea. Las composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Otra realización más de la invención se refiere al control de los efectos bloqueantes de los anticuerpos anti-CTLA4 in vivo controlando los niveles de expresión de B7.1 y B7.2 en células inmunitarias tales como células presentadoras de antígenos (APC). CTLA4 se expresa predominantemente entre las Treg, donde suprime las enfermedades autoinmunitarias regulando negativamente la expresión de B7-1 y B7-2 en APC, tales como células dendríticas. Por lo tanto, la regulación positiva de las moléculas B7, B7.1 y B7.2, puede ser como lecturas para el bloqueo in vivo de las interacciones B7-CTLA4. En una realización específica, las células inmunitarias periféricas o intratumorales se eliminan del sujeto antes y después del tratamiento anti-CTLA4 y se someten a ensayo ex vivo para reducir el nivel de B7.1 y/o B7.2 en la superficie de la célula inmunitaria, en donde la presencia de anticuerpos bloqueantes anti-CTLA4 evita la unión de B7.1/B7.2 por CTLA4 endógeno, lo que a su vez evita la regulación negativa de B7.1 y B7.2, dando como resultado un aumento neto en la expresión de B7.1/B7.2. En una realización preferida, el nivel de B7.1 y B7.1 se mide en células presentadoras de antígeno. En una realización mucho más preferida, el nivel de B7.1 y B7.1 se mide en células dendríticas.

En una realización adicional, el cambio (reducción) en B7.1 y B7.2 en las células inmunitarias después del tratamiento anti-CTLA4 se usa como biomarcador para medir la actividad biológica de los anticuerpos anti-CTLA4 in vivo y controlar las respuestas de los pacientes al tratamiento anti-CTLA4 midiendo el nivel de expresión de B7.1 y/o B7.2 en células inmunitarias, y comparando el nivel de expresión antes y después del tratamiento. En una realización preferida, el nivel de expresión de B7.1 y/o B7.2 se controla a lo largo del tiempo durante un curso de terapia anti-CTLA4.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación de anticuerpo anti-CTLA4 quimérico

Usando ratones con activación del gen de CTLA4 humano y ratones hu-PBL-Scid, anteriormente se demostró que los anticuerpos anti-CTLA4 humanos de ratón reducían el crecimiento tumoral e identifican a L3D10 como el más eficaz entre el panel de mAb sometidos a ensayo. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos obtenidos fue capaz de conseguir el rechazo completo del tumor, incluso cuando se usan a dosis relativamente altas de (>10mg/kg) y antes de la formación de tumores palpables (desde el día 2) después de la exposición a células tumorales (19-21).

Puesto que los anticuerpos de ratón eran de la subclase IgG1 que no tiene una fuerte citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), y puesto que la ADCC puede estar implicada en el rechazo de tumores, el Fc del mAb se modificó de varias maneras, para conseguir un mejor efecto inmunoterápico. En primer lugar, la IgG1 de ratón, que es débil en ADCC, se reemplazó para producir un anticuerpo quimérico con IgG1 humana, que tiene una fuerte actividad ADCC. En segundo lugar, basándose en la técnica conocida en la bibliografía (22), se introdujeron tres mutaciones (S298A, E333A y K334A) en el CH para aumentar la actividad de ADCC. En tercer lugar, se introdujeron tres mutaciones (M252Y, S254T y T256E) para aumentar la semivida del anticuerpo in vivo (23). El diseño del nuevo anticuerpo quimérico se representa en la FIG. 1, panel izquierdo.

Para modificar el anticuerpo, las regiones variables del hibridoma L3D10 se identificaron primero mediante secuenciación de ADN usando métodos convencionales conocidos en la técnica. Las secuencias de nucleótidos se tradujeron en aminoácidos enumerados en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. La secuencia de Fc de IgG1 humano normal y la secuencia de Fc mutante se describen en la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos optimizada por codones de las secuencias de cadena pesada y ligera se describen en las SEQ ID NO: 5-8.

El ADN correspondiente a SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 se sintetizó y se insertó en vectores de expresión, y los vectores se transfectaron con la secuencia diseñada en células HEK293. Resumiendo, se sembraron células HEK293 en un matraz agitado un día antes de la transfección y se cultivaron usando medios químicamente definidos sin suero. Las construcciones de expresión de ADN se transfectaron transitoriamente en 0,5 litros de suspensión de células HEK293 usando un procedimiento operativo convencional para la transfección transitoria. Después de 20 horas, se tomaron muestras de células para obtener la viabilidad y el recuento de células viables, y se midió el título (Octet QKe, ForteBio). Se tomaron lecturas adicionales a lo largo de las ejecuciones de producción de transfección transitoria. El cultivo se recogió el día 5. El medio acondicionado para L3D10 se recogió y se aclaró a partir de la producción de transfección transitoria mediante centrifugación y filtración. El sobrenadante se hizo pasar por una columna de Proteína A y se eluyó con un tampón de pH bajo. Antes de la distribución en alícuotas se realizó una filtración usando un filtro de membrana de 0,2 pm. Después de la purificación y la filtración, la concentración de proteína se calculó a partir de la DO280 y el coeficiente de extinción. Se obtuvo un total de 43,2 mg de proteínas Ig de una ronda de transfección.

Ejemplo 2. Los sitios de unión del anticuerpo L3D10 quimérico se superponen sólo parcialmente con 10D1

En el entorno clínico, se ha demostrado que el anticuerpo anti-CTLA4, Ipilimumab, mejora la supervivencia de los pacientes con cáncer, pero induce efectos adversos autoinmunitarios significativos. Con el fin de evaluar los sitios de unión comparativos del anticuerpo L3D10 quimérico y 10D1, se compararon la unión a CTLA4 y la capacidad de los anticuerpos para competir por la unión a CTLA4. Aunque ambos anticuerpos se unen a proteínas CTLA4 inmovilizadas con una eficacia comparable (FIG. 2), 10D1 no bloquea completamente la unión de L3D10 quimérico a CTLA4 (FIG.

3). Como se esperaba, L3D10 sin marcar bloquea completamente la unión de L3D10 marcado, lo que indica que los sitios de unión de anticuerpos de L3D10 y 10D1 sólo se superponen parcialmente.

Ejemplo 3. Bloqueo más eficiente de las interacciones CTLA4:B7.1 y CTLA4:B7.2 mediante el anticuerpo L3D10 quimérico que mediante 10D1

Se ha publicado que el mAb anti-CTLA4 humano, 10D1, puede bloquear la interacción B7-CTLA4 si se usaron B7-1 y B7-2 solubles para interactuar con CTLA4 inmovilizado (49). Puesto que B7-1 y B7-2 actúan como moléculas coestimuladoras de la superficie celular, los presentes inventores evaluaron la capacidad de los anticuerpos anti-CTLA4 para bloquear la interacción B7-CTLA4 usando B7-1 y B7-2 inmovilizados. Usando un formato de ensayo ELISA competitivo, las capacidades de L3D10 y 10D1 para bloquear la unión de la proteína de fusión CTLA4, CTLA4-lg, tanto a B7.1 como a B7.2 inmovilizados en placa y expresados en membrana celular. Para estos experimentos se usó un mAb anti-CTLA4 humano quimérico con una afinidad (2,3 nM) que es similar a 10D1 (4 nM) (49). Para los ensayos de placa inmovilizada, la placa ELISA se recubrió con B7.1Fc o B7.2Fc a 1 pg/ml durante la noche a 4 °C o 2 horas a 37 °C. Se mezclaron CTLA4-Fc biotinilados con concentraciones dadas de B7.1-Fc, 10D1 o L3D10 quimérico. Las cantidades del CTLA4-Fc unido a B7.1 en la placa se determinan usando estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Como se muestra en la FIG. 4, mientras que el L3D10 quimérico, B7.1Fc y CTLA4-Fc bloquearon eficientemente la interacción CTLA4-Fc:B7.1, dos lotes de material separados de 10D1 no lograron bloquear la interacción. L3D10 muestra un bloqueo significativo de la unión de B7.1 inmovilizado en placa a concentraciones tan bajas como 0,2 pg/ml, consiguiendo un 50 % de inhibición (CI<50>) a aproximadamente 3 pg/ml. De forma similar, L3D10 bloqueó la unión de CTLA4-Fc a la placa B7.2 inmovilizada con una CI<50>de 0,03 pg/ml, mientras que 10D1 de dos lotes de materiales diferentes mostró un bloqueo mínimo con una CI<50>de aproximadamente 200 pg/ml (FIG. 5). Sin embargo, coherente con el informe anterior (49), el anticuerpo 10D1 inhibió potentemente la interacción B7-1-CTLA4 en el experimento inverso cuando se usó CTLA4 inmovilizado en placa para interactuar con B7-1 soluble (FIG. 6).

Para los experimentos de unión a proteína de membrana celular, cuando B7.1 se expresa en la superficie de las células CHO, L3D10 bloquea la unión de CTLA4-Fc, pero 10D1 de dos lotes de materiales diferentes no lo hizo, incluso cuando se usó a 512 pg/ml (FIG. 7). Aunque es mucho menos potente que el L3D10, dosis altas de 10D1 consiguieron aproximadamente un 25 % de bloqueo entre CTLA4 humano y B7-1 de ratón (FIG. 8). Para B7.2 expresado en la superficie de las células CHO, L3D10 estaba nuevamente bloqueando mientras que 10D1 sólo estaba parcialmente bloqueando, observándose menos del 50 % de inhibición incluso cuando se usó 10D1 a 512 pg/ml (FIG. 9).

Una posible advertencia es que la biotinilación puede haber afectado a la unión de 10D1 a CTLA4-Fc. Para abordar este problema, los presentes inventores compararon la unión de L3D10 y 10D1 a CTLA4-Fc biotinilado utilizado en los estudios de bloqueo. Como se muestra en la FIG. 10, 10D1 es más eficaz que L3D10 para unirse al CTLA4-Fc biotinilado. Por lo tanto, el fracaso en el bloqueo por 10D1 no se debió a una unión insuficiente a CTLA4-Fc biotinilado. Se observa un patrón similar cuando se usó CTLA4 marcado con polihistidina para interactuar con células CHO humanas transfectadas con B7-1 (FIG. 11). Considerados en conjunto, los datos de los presentes inventores sugieren que la capacidad del anticuerpo 10D1 para bloquear la interacción B7-CTLA4 depende en gran medida del ensayo empleado, con una actividad de bloqueo mínima a no detectable si B7-1 y B7-2 están inmovilizados, mientras que el anticuerpo L3D10 es un bloqueante potente de la interacción B7-CTLA4 independientemente de si la proteína B7 está inmovilizada.

Ejemplo 4. El anticuerpo L3D10 quimérico es más eficiente que el L3D10 sin modificar para provocar el rechazo tumoral

Anteriormente se publicó que el L3D10 de ratón no logró provocar la remisión completa de los tumores MC38, aunque se observaron retardos importantes (19, 20). Para determinar si el L3D10 quimérico puede provocar una remisión completa en ratones singénicos, se trasplantaron 1*10® células tumorales MC38 en ratones C57BL/6 singénicos. Una semana después, cuando el tumor alcanza aproximadamente 5 mm de diámetro, los ratones fueron tratados con IgG de control o con mAb L3D10 quimérico a una dosis que es sólo la mitad de la utilizada en los estudios anteriores con el L3D10 de ratón. Como se muestra en la FIG. 12, a pesar de la posible inmunogenicidad de la secuencia de Ig humana, se descubrió que el L3D10 quimérico provocó una remisión completa en todos los ratones sometidos a ensayo. Puesto que el tratamiento se inició cuando se habían establecido grandes cargas tumorales, lo que es mucho más difícil que cuando los tumores no eran palpables (19), estos experimentos muestran que el L3D10 quimérico es más eficiente que el L3D10 sin modificar.

Ejemplo 5. El anticuerpo L3D10 quimérico tiene una actividad equivalente a la de 10D1 para provocar el rechazo tumoral

La disponibilidad de ratones con activación del gen de CTLA4 humano (20) proporcionó una oportunidad sin precedentes para someter a ensayo la actividad biológica del anticuerpo quimérico anti-CTLA-4 humano con mAb anti-CTLA-4 utilizado clínicamente, 10D1. En este modelo de ratón humanizado, un gen de CTLA4 que codifica un producto con un 100 % de identidad con la proteína CTLA-4 humana se expresa bajo el control del locus de Ctla4 de ratón endógeno. Cuando la actividad antitumoral del L3D10 quimérico y 10D1 se compararon directamente en el modelo de tumor MC38 en ratones con activación de CTLA4-humano, está claro que ambos anticuerpos fueron comparables en provocar rechazo tumoral, mientras que los tumores crecieron progresivamente en el grupo control de IgG. La FIG. 13 muestra los resultados del tratamiento con anticuerpos sobre el tamaño tumoral a partir de experimentos duplicados.

Una pregunta interesante es si los mAb anti-CTLA-4 necesitan interactuar con todos los CTLA-4 (es decir, conseguir la saturación diana) para ejercer un efecto inmunoterápico. Los ratones F1 de entre ratones CTLA4h/h y CTLA4m/m expresan la proteína CTLA-4 tanto de ratón como humana de forma codominante. De manera interesante, como se muestra en la FIG. 14, tanto L3D10 quimérico como 10D1 indujeron eficazmente el rechazo tumoral, aunque aproximadamente el 50 % de la proteína CTLA-4 (es decir, la versión murina de la proteína) no puede unirse a los mAb anti-CTLA-4 humanos. De forma importante, L3D10 es más eficaz terapéuticamente que 10D1 en este contexto, es decir, cuando las dosis de genes son limitadas (P < 0,05).

Estudios anteriores han demostrado que los mAb anti-Ctla-4 de ratón no pueden inducir el rechazo de la estirpe celular de melanoma B16-F1 sin combinación con otras modalidades terapéuticas. Por lo tanto, el efecto antitumoral de los anticuerpos L3D10 quimérico y 10D1 también se sometió a ensayo usando este modelo de tumor B16 de mayor exposición en ratones con activación de CTLA4 humanos. Como se muestra en la FIG. 15, considerando que ni L3D10 ni Ipilimumab fueron capaces de provocar el rechazo de tumores establecidos, ambos provocan un retraso estadísticamente significativo en el crecimiento tumoral, mientras que las diferencias entre diferentes anticuerpos no son estadísticamente significativas.

Ejemplo 6: Bloqueo de CTLA4in vivo

CTLA4 se expresa predominantemente entre las Treg, donde suprime las enfermedades autoinmunitarias al regular negativamente la expresión de B7-1 y B7-2 en las células dendríticas (50). Puesto que la mutación dirigida de Ctla4 (50) y el tratamiento con mAb bloqueante anti-CTLA4 (51) aumentó la expresión de b 7-1 y B7-2 en células dendríticas, se ha sugerido que la función fisiológica de CTLA4 en Treg es regular negativamente B7 en DC. Por lo tanto, la regulación positiva de B7 se usó como lectura para el bloqueo in vivo de las interacciones B7-CTLA4 y desarrolló un ensayo usando linfocitos T de los ratones Ctla4h/h que tenían activación homocigota del gen CTLA4 humano.

Como se describe en la FIG. 16, B7.1 o B7.2 expresados en superficie se unen a CTLA4 en la superficie de los linfocitos T, lo que conduce a una regulación negativa en la expresión de B7.1 y B7.2. Sin embargo, la unión de anticuerpos anti-CTLA4 bloqueantes evita la unión de B7.1/B7.2, lo que evita la regulación negativa de B7.1 y B7.2, dando como resultado un aumento neto en la expresión de B7.1/B7.2. Sin embargo, con linfocitos T quiméricos que expresan CTLA4 tanto humano como de ratón, los anticuerpos que se unen al CTLA4 humano no evitan la unión de B7.1/B7.2 al CTLA4 murino, que restablece la inhibición de B7.1/B7.2.

Se han descrito ratones humanizados CTLA4 que expresan el gen de CTLA4 con un 100 % de identificación con la proteína CTLA4 humana bajo el control de un locus de Ctla4 de ratón endógeno (20). Se retrocruzaron ratones con activación homocigota (CTLA4h/h) con el antecedente C57BL/6 durante al menos 10 generaciones. Se produjeron ratones (CTLA4h/m) heterocigotos cruzando ratones CTLA4h/h con ratones BALB/c WT.

Para someter a ensayo el mAb terapéutico anti-CTLA4 clínicamente probado, 10D1, los presentes inventores inyectaron dosis muy altas de mAb anti-CTLA4 (500 pg/ratón, que es aproximadamente 25 mg/kg u 8 veces la dosis más alta utilizada en la clínica) en ratones Ctla4h/h o Ctla4m/h y células del bazo recogidas para medir los niveles de B7-1 y B7-2 en DC Cd11chi 24 horas después de la inyección (FIG. 17A-B). Como se muestra en las FIG. 17C-E, en comparación con ratones Ctla4h/h que recibieron IgG1-Fc humana, las DC de ratones quiméricos tratados con L3D10 tuvieron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de B7.1 en linfocitos T que expresan CTLA4 humano, pero no en linfocitos T que expresan CTLA4 tanto humano como de ratón. Se observaron resultados similares para B7.2 como se muestra en las FIG. 17C-E.

La magnitud de la regulación positiva en B7-2 es comparable a la que se consiguió usando un mAb anti-CTLA4 bloqueante en un cocultivo de Treg-DC humano (66).

Para confirmar adicionalmente la especificidad del ensayo in vivo, los presentes inventores sometieron a ensayo si L3D10 puede regular positivamente B7 en ratones Ctla4m/h en los que CTLA4 de ratón y humano se expresan de forma codominante. Puesto que al menos el 50 % del CTLA4 no se une a los anticuerpos anti-CTLA4 humano, se espera que sean menos potentes para bloquear la interacción B7-CTLA4. De hecho, ninguno de los anticuerpos provocó una regulación positiva de B7-1 y B7-2 en DC de ratones Ctla4m/h (FIG. 17C, D, F). La falta total de bloqueo por parte de L3D10 en los ratones Ctla4m/h sugiere que el CTLA4 codificado por el alelo del ratón, que no se une a L3D10 (FIG.

18), es suficiente para regular negativamente la expresión de B7. Por lo tanto, los datos de los presentes inventores demostraron que a dosis que son al menos 8 veces mayores que la dosis más alta utilizada en la clínica, 10D1 no bloquea la interacción B7-CTLA4 cuando B7 está inmovilizado en una placa o anclado en una membrana celular, tanto in vivo como in vitro.

La falta total de bloqueo por parte de L3D10 en los ratones Ctla4m/h sugiere que el CTLA4 codificado por el alelo del ratón, que no se une a L3D10 (FIG. 18), es suficiente para regular negativamente la expresión de B7. Por el contrario, 10D1 no aumentó la expresión de B7.1 o B7.2. De acuerdo con el modelo, esto sugiere que L3D10 bloquea la actividad de CTLA4 in vivo mientras que 10D1, no.

Sin embargo, a pesar de estas aparentes diferencias en la actividad de bloqueo, tanto L3D10 como 10D1 muestran una fuerte actividad antitumoral contra el modelo MC38 en ratones CTLA4m/h, como se muestra en la FIG. 19. Aunque el tumor creció progresivamente en los ratones de control tratados con Ig, se consiguió el rechazo completo mediante cualquiera de los mAb anti-CTLA4. En múltiples experimentos, los dos anticuerpos son comparables a la hora de provocar el rechazo tumoral. En otro modelo de tumor, melanoma B16, ambos anticuerpos indujeron un retraso similar en el crecimiento tumoral, aunque ninguno de los anticuerpos consiguió el rechazo completo (FIG. 20).

Ejemplo 7: Los efectos antitumorales se asocian al agotamiento de Treg intratumorales

La regulación inmunitaria in vivo es resultado de un equilibrio entre la activación de las células inmunitarias y los puntos de control inmunitarios. En particular, los linfocitos T reguladores (Treg) son una subpoblación de linfocitos T que regulan el sistema inmunitario, mantienen la tolerancia a los autoantígenos y anulan las enfermedades autoinmunitarias. Estudios recientes han demostrado que la eficacia terapéutica del mAb anti-CTLA4 de ratón se ve afectada por la subclase de Fc y el receptor Fc del hospedador, lo que a su vez afecta a la citotoxicidad dependiente de anticuerpos de Treg selectivamente dentro del microambiente tumoral (52, 53). Como la actividad bloqueante diferencial de CTLA4 in vivo no parece traducirse en diferencias en la actividad antitumoral, los presentes inventores intentaron establecer el mecanismo de acción mediante el cual se produce la actividad antitumoral y se observaron Treg dentro del microambiente tumoral. Para ello, los presentes inventores sacrificaron ratones portadores de tumores MC38 antes de que se completasen los rechazos (FIG. 21) y se analizase la frecuencia de Treg en ratones con activación de Ctla4h/h que recibieron Ig de control, 10D1 o L3D10. Aunque ninguno de los anticuerpos reduce los Treg en el bazo (FIG. 22C), ambos reducen los Treg en el microambiente tumoral (FIG. 22E). De manera interesante, 10D1, pero no L3D10, expandieron Treg en el bazo. La expansión de Treg en el bazo por 10D1 recapitula un hallazgo clínico de que ipilimumab aumentó la expresión de FOXP3 por los leucocitos de sangre periférica (54). Puesto que los anticuerpos bloqueantes y no bloqueantes son comparables en cuanto al agotamiento de Treg en el microambiente tumoral, el bloqueo de la interacción B7-CTLA4 no contribuye al agotamiento de Treg. Puesto que 10D1 no bloquea la interacción B7-CTLA4 in vivo y aun así confiere efecto terapéutico en los ratones Ctla4h/h y en pacientes con melanoma, no se requiere el bloqueo de esta interacción para su efecto terapéutico. Además, puesto que dos mAb con un efecto de bloqueo drásticamente diferente tienen un efecto terapéutico comparable y un agotamiento selectivo de Treg en el microambiente tumoral, el bloqueo de la interacción CTLA4-B7 no potencia el efecto terapéutico de un anticuerpo.

Para fundamentar esta observación, los presentes inventores sometieron a ensayo el efecto terapéutico de los dos mAb anti-CTLA4 en los ratones Ctla4m/h en los que los mAb anti-CTLA4 humano pueden unirse como máximo al 50 % de las moléculas de CTLA4 y en los que ninguno de los anticuerpos puede bloquear la interacción B7-CTLA4 para conseguir la regulación positiva de B7 en las células dendríticas (FIG. 16). De nuevo, ambos anticuerpos provocan un rápido rechazo de los tumores MC38, aunque L3D10 es algo más eficaz que 10D1 (FIG. 22B). De forma correspondiente, ambos anticuerpos agotaron selectivamente los Treg en el microambiente tumoral (FIG. 22D y 21F). Estos datos genéticos demostraron además la irrelevancia del bloqueo de CTLA4 en el rechazo tumoral y el agotamiento local de Treg y, por lo tanto, refutan la hipótesis predominante de que el mAb anti-CTLA4 induce inmunidad frente al cáncer mediante el bloqueo de la interacción B7-CTLA4 (10).

Ejemplo 8. Evaluación de las actividades de bloqueo de los mAb anti-CTLA4 de ratón 9H10 y 9D9 de uso común

El concepto de que CTLA4 es un regulador negativo intrínseco de las células para la regulación de los linfocitos T se propuso basándose en el efecto estimulante tanto de Fab intacto como de dos mAb anti-CTLA4 de ratón (30, 31), 4F10 y 9H10, aunque no se presentaron datos que demuestren que estos anticuerpos bloqueen la interacción B7-CTLA4. Más recientemente, se publicó que un tercer mAb anti-CTLA4 de ratón, 9D9, tiene efecto terapéutico en ratones con tumores y provoca un agotamiento local de Treg en el microambiente tumoral (52). Por lo tanto, los presentes inventores se propusieron someter a ensayo los tres mAb anti-CTLA4 de ratón disponibles en el mercado que habían demostrado inducir el rechazo tumoral por su capacidad para bloquear la interacción B7-CTLA4 en configuraciones fisiológicamente relevantes. Como primer ensayo, los presentes inventores usaron cantidades crecientes de mAb anti-CTLA4 (hasta un exceso molar de hasta 2000 veces sobre CTLA4-Fc) para bloquear la unión de CTLA4-Fc biotinilado a B7-1 y B7-2 inmovilizados en placa. Como se muestra en la FIG. 23A, el mAb anti-CTLA4 de ratón 9H10 no bloqueó la interacción B7-1-CTLA4 incluso en la concentración más alta sometida a ensayo, aunque se observó un bloqueo modesto cuando se usó 9D9 a concentraciones muy altas. Mientras que el mAb 9D9 bloqueó eficazmente la interacción con B7-2-CTLA4, 9H10 no lo hizo (FIG. 23B). De manera interesante, mientras que 9D9 muestra una fuerte unión a CTLA4-Fc soluble, 9H10 mostró una unión escasa (FIG. 23c), aunque es más potente que 9D9 en la unión de CTLA4-Fc de ratón inmovilizado (FIG. 23D). Puesto que la falta de actividad bloqueante por parte de 9H10 en este ensayo puede reflejar simplemente su escasa unión a CTLA4-Fc soluble, los presentes inventores usaron de nuevo la regulación positiva de<b>7-1 y B7-2 en células dendríticas en ratones WT (CTLA4m/m) para medir el bloqueo in vivo de la interacción B7-CTLA4. Como se muestra en las FIG. 23E y F, 9H10 no reguló positivamente la expresión de B7-1 en DC, mientras que 9D9 aumentó el nivel de B7-1 en un 15 % (P<0,05). De manera interesante, mientras que 9D9 claramente reguló positivamente B7-2 en DC, 9H10 no lo logró. Por lo tanto, 9H10, el primer mAb anti-CTLA4 inmunoterápico tumoral y el más estudiado no bloquea la interacción B7-CTLA4. Por lo tanto, el bloqueo de la interacción B7-CTLA4 no contribuye a la inducción de inmunidad antitumoral por mAb anti-CTLA4 de ratón. Puesto que ambos mAb muestran un efecto inmunoterápico comparable y una supresión comparable de Treg en el microambiente tumoral (52), la supresión local de Treg, en lugar de bloquear la interacción B7-CTLA4, proporciona una explicación unificadora para el efecto terapéutico de los mAb anti-CTLA4 de ratón. De manera interesante, mientras que 4F10 bloqueó la interacción B7-CTLA4 in vitro, no logró inducir la regulación positiva de B7 en DC in vivo (FIG. 24).

Considerados en conjunto, los presentes inventores han demostrado que el mAb anti-CTLA4 humano (10D1) terapéutico clínicamente probado y dos mAb anti-CTLA4 de ratón (9H10 y 4F10) confieren un efecto inmunoterápico sin bloquear la interacción B7-CTLA4 en condiciones fisiológicamente relevantes. Además, dicho bloqueo no fue necesario para el rechazo tumoral, incluso para el mAb (L3D10) que puede bloquear potentemente la interacción B7-CTLA4. Puesto que el efecto terapéutico es sustancialmente el mismo para los anticuerpos con diferencias de 1000 veces en el bloqueo de la interacción B7-CTLA4, dicho bloqueo no contribuye al efecto terapéutico contra el cáncer de los mAb anti-CTLA4. Estos datos refutan la hipótesis de que el mAb anti-CTLA4 confiere un efecto inmunoterápico a través del bloqueo de los puntos de control (55). Al refutar la hipótesis predominante, los datos de los presentes inventores sugieren que el efecto terapéutico del mAb anti-CTLA4 no puede optimizarse mejorando las actividades de bloqueo de los mAb anti-CTLA4. En este contexto, es de particular interés observar que el Tremelimumab, que es superior en el bloqueo de la interacción B7-CTLA4 (56), no alcanzó el criterio de valoración clínico en un ensayo clínico de fase III (57). Al mismo tiempo, al demostrar una fuerte correlación entre el rechazo tumoral del agotamiento local de Treg y al refutar la participación del bloqueo de la interacción B7-CTLA4 en la inmunidad tumoral, el trabajo de los presentes inventores favorece la hipótesis de que la supresión local de Treg dentro del ambiente tumoral es el principal mecanismo para el mAb anti-CTLA4 terapéutico y, por lo tanto, sugiere nuevos enfoques para desarrollar la próxima generación de mAb anti-CTLA4 para la inmunoterapia contra el cáncer.

Por último, la acumulación de datos genéticos en los ratones sugiere que puede ser necesario revisar el concepto original (30, 31) de que CTLA4 regula negativamente la activación de los linfocitos T y que dicha regulación se consiguió a través de SHP-2 (58, 59) (60). Por lo tanto, aunque las enfermedades autoinmunitarias graves en los ratones Ctla4'/_ se han usado para respaldar la noción de CTLA4 como un regulador negativo intrínseco de la activación de los linfocitos T (61, 62), desde entonces han surgido al menos tres líneas de datos genéticos que no son coherentes con este punto de vista. En primer lugar, la supresión específica del linaje del gen Ctla4 en Treg, pero no en los linfocitos T efectores, es suficiente para recapitular el fenotipo autoinmunitario observado en ratones con supresión de la estirpe germinal del gen Ctla4 (50). Estos datos sugieren que la autoinmunidad en los ratones Ctla4'/_ no se debió a la falta del regulador negativo intrínseco celular CTLA4 en linfocitos T efectores. En segundo lugar, en ratones quimera que consistían en linfocitos T tanto WT como Ctla4-/-, el fenotipo autoinmunitario se evitó mediante la coexistencia de linfocitos T WT (63). Estos datos nuevamente sostienen firmemente que las enfermedades autoinmunitarias no fueron provocadas por la falta de un regulador negativo intrínseco a las células. La falta de efecto regulador negativo intrínseco a las células también se demuestra por el hecho de que en los ratones quimera, no se observó expansión preferencial de linfocitos T Ctla4-/- durante la infección vírica (64). En tercer lugar, la supresión específica de linfocitos T de Shp2, que se propuso que media en la regulación negativa de CTLA4 (58, 59), resultó reducir en lugar de potenciar la activación de los linfocitos T (65). En el contexto de estos datos genéticos publicados desde la propuesta de CTLA4 como regulador negativo para la activación de los linfocitos T, los datos de los presentes inventores presentados en el presente documento exigen una reevaluación del bloqueo de puntos de control de CTLA4 en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ejemplo 9. El L3D10 quimérico demuestra una reducción de los eventos adversos inmunitarios cuando se usa en combinación con otros anticuerpos inmunoterápicos

Estudios clínicos recientes han revelado que la terapia de combinación entre mAb anti-PD-1 y anti-CTLA4 aumenta adicionalmente la supervivencia de los pacientes con melanoma en estadio terminal. Sin embargo, el 55 % de los pacientes que recibieron la terapia de combinación desarrollaron eventos adversos relacionados con el sistema inmunitario (irAE) de grados 3 y 4. Por lo tanto, es fundamental desarrollar anticuerpos con menos toxicidad. Los presentes inventores han desarrollado un modelo in vivo que recapitula los irAE asociados a la terapia de combinación de mAb anti-CTLA-4 y anti-PD-1 observados en la clínica. En este modelo los presentes inventores trataron ratones con activación del gen de CTLA4 humano (CTLA4h/h) durante el período perinatal con dosis altas de mAb anti-PD-1 y anti-CTLA-4. Descubrieron que, aunque los ratones jóvenes toleran el tratamiento con mAb individuales, la terapia de combinación con anti-PD-1 y 10D1 provoca irAE grave con inflamación de múltiples órganos, anemia y, como se muestra en la FIG. 25, crecimiento gravemente atrofiado. Por el contrario, cuando se combina con anti-PD-1, L3D10 quimérico presenta sólo irAE leve como lo demuestra la ganancia de peso normal.

Para examinar adicionalmente la toxicidad relativa de L3D10 quimérico en comparación con 10D1 cuando se administra en combinación con anti-PD-1, los presentes inventores observaron los efectos patológicos en los ratones con activación CTLA4h/h 42 días después de la administración. Como se muestra en la FIG. 26, el peso corporal terminal (día 42) en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 fue similar al de los ratones tratados con anticuerpo de control negativo hlgG. Sin embargo, en comparación, el peso de los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 fue mucho menor. En consecuencia, cuando los presentes inventores observaron la anatomía general de estos ratones, el Útero/Ovario/Vejiga y el timo eran notablemente más pequeños en ratones tratados con 10D1 PD-1 (FIG. 27). De nuevo, los órganos en ratones tratados con L3D10 anti-PD-1 fueron comparables a los del control de hlgG. Por el contrario, los corazones disecados de ratones tratados con 10D1 parecían de un tamaño ligeramente más grande con un aspecto notablemente más blanco. Como resultado, los presentes inventores decidieron observar la eritropoyesis dentro de los ratones y observaron diferencias claras en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a los grupos tratados con L3D10 anti-PD-1 o anticuerpo de control, que eran bastante similares. Como se muestra en la FIG 27A, la médula ósea de ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 tenía un color notablemente más blanco y la sangre aislada era de color casi completamente blanco (FIG. 28b). De acuerdo con esto, cuando los presentes inventores observaron más de cerca las células que atravesaban las diferentes fases de desarrollo sanguíneo usando los marcadores CD71 y CD119. En la FIG. 28C se muestran perfiles de FACS representativos, mientras que los datos resumidos se presentan en la FIG. 28D. Estos datos revelaron una reducción estadísticamente significativa en el número de células que experimentaban desarrollo de Fase IV en los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 (FIG.

28D).

Para explorar el mecanismo potencial de la anemia en los ratones tratados con 10D1, los presentes inventores sometieron a ensayo si el tratamiento con 10D1+PD-1 induce anticuerpos anti-glóbulos rojos. Como se muestra en la FIG. 29, no se detectan anticuerpos anti-glóbulos rojos. Por lo tanto, el desarrollo de autoanticuerpos específicos de glóbulos rojos no es responsable de la anemia en los ratones tratados con anti-PD-1 10D1.

Para determinar adicionalmente la toxicología de L3D10 frente a 10D1 en combinación con anti-PD-1, los presentes inventores realizaron análisis histológicos del corazón (FIG. 30), pulmón (FIG. 31), glándula salival (FIG. 32) y riñón e hígado (FIG. 33) después de la fijación en formol al 10 % durante al menos 24 horas. En cada uno de los tejidos estudiados, los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 mostraron un nivel alto de infiltración de linfocitos T. La puntuación de toxicidad, basándose en la gravedad de la inflamación, se resume en la FIG. 34, que muestra las altas puntuaciones de toxicidad de los ratones tratados con 10D1 anti-PD-1 con respecto a L3D10 anti-PD-1 que tiene puntuaciones sólo marginalmente superiores que el grupo de ratones de control de hlgG.

Ejemplo 10: L3D10 tiene unión reducida para CTLA4 soluble.

L3D10 y 10D1 muestran patrones de unión similares para CTLA4 inmovilizado en placa (FIG. 36). Como posible explicación de la toxicidad reducida de L3D10 con respecto a 10D1, particularmente el aumento de la infiltración/actividad de linfocitos T asociada a 10D1, los presentes inventores decidieron observar la unión a CTLA4 soluble. Los presentes inventores eligieron analizar esto porque la asociación entre el polimorfismo de CTLA4 y múltiples enfermedades autoinmunitarias se relaciona con la producción defectuosa de CTLA4 soluble (Nature 2003, 423: 506-511) y el silenciamiento genético de la isoterma sCTLA4 aumentó la aparición de diabetes de tipo I en ratones. (Diabetes 2011,60:1955-1963). Además, CTLA4 soluble (abatacept y belatacept) es un fármaco ampliamente utilizado para la supresión inmunitaria. De acuerdo con esta idea, cuando los presentes inventores observaron la unión relativa a CTLA4 soluble, observaron una marcada disminución en la unión de L3D10 (FIG. 37).

Los presentes inventores han demostrado que el mAb anti-CTLA-4 induce una inyección tumoral robusta en ratones Ctla4h/m heterocigotos en los que sólo el 50 % de las moléculas de CTLA-4 pueden unirse a mAb anti-CTLA-4 humano. Para determinar si la participación del 50 % de CTLA-4 es suficiente para inducir irAE, los presentes inventores trataron ratones Ctla4h/m con anti-PD-1 10D1. Como se muestra en la FIG. 35, anti-PD-1 10D1 no lograron inducir la pérdida de peso en los ratones Ctla4h/m Por lo tanto, los irAE y la inmunidad frente al cáncer pueden desacoplarse genéticamente.

La actividad in vivo demuestra que el anticuerpo L3D10 conserva su actividad antitumoral, pero muestra un efecto adverso autoinmunitario reducido observado con otros anticuerpos inmunoterápicos tales como 10D1, lo que indica que es posible potenciar la actividad antitumoral sin exacerbar los eventos adversos autoinmunitarios. En consecuencia, los efectos secundarios autoinmunitarios no son un precio necesario para la inmunidad frente al cáncer y es posible desacoplar estas dos actividades. La caracterización de L3D10 demostró que su capacidad para bloquear la interacción de CTLA4 con B7.1 y B7.2 es más efectiva que la de 10D1 y que esto se relaciona con una diferencia en el sitio de unión de CTLA4 entre los anticuerpos. Además, L3D10 se fusionó con un dominio Fc de IgG1 humana modificado que tiene mutaciones que confieren una fuerte actividad ADCC que potencia el efecto terapéutico del anticuerpo. Una caracterización adicional demuestra que L3D10 y 10D1 se unen a CTLA4 inmovilizado con un perfil de unión similar. Sin embargo, L3D10 demuestra una afinidad de unión mucho menor a CTLA4 soluble que 10D1. Considerados en conjunto, los datos de los presentes inventores demuestran que el anticuerpo L3D10 tiene un gran potencial para su uso clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer con eventos adversos menos graves.

Ejemplo 11. Humanización de L3D10

El proceso de humanización comienza generando una estructura 3D de anticuerpo modelada por homología y creando un perfil del anticuerpo parental basado en el modelado de estructura. Los armazones aceptores que han de utilizarse se identificaron basándose en la identidad de secuencia global en todo el armazón, la posición de interfaz coincidente, las posiciones canónicas de CDR clasificadas de manera similar y la presencia de sitios de N-glicosilación que tendrían que eliminarse. Se seleccionó un armazón de cadena ligera (LC) y uno de cadena pesada (HC) para el diseño de humanización.

Los anticuerpos humanizados se diseñaron mediante la creación de múltiples secuencias híbridas que fusionan partes seleccionadas de la secuencia del anticuerpo parental con las secuencias estructurales humanas, incluyendo el injerto de las secuencias de CDR en los armazones aceptores. Las secuencias de CDR predichas del anticuerpo original de referencia L3D10 se proporcionan como las SEQ ID NO: 21-26 como se indica en la Tabla 1A a continuación:

T l 1A L n i DR r i h l n i r r n l ^ r f r n i L D1

Usando el modelo 3D, estas secuencias humanizadas se analizaron metódicamente mediante modelos oculares e informáticos para aislar las secuencias que probablemente retendrían la unión a antígeno. El objetivo era maximizar la cantidad de secuencia humana en los anticuerpos humanizados finales conservando al mismo tiempo la especificidad del anticuerpo original.

Se diseñaron tres cadenas ligeras humanizadas (LC1, LC2 y LC3) y tres cadenas pesadas humanizadas (HC1, HC2 y HC3) basándose en los marcos aceptores seleccionados.

De acuerdo con la invención, la cadena ligera humanizada es LC2 y la cadena pesada humanizada es HC3. Cada una de las tres secuencias HC o tres secuencias LC eran de la misma estirpe germinal, con diferentes retromutaciones a la secuencia parental murina como se muestra en la FIG. 38. Las secuencias de aminoácidos de la región variable humanizada y su secuencia de nucleótidos codificante optimizada se enumeran en las SEQ ID NO: 9-20. Las secuencias de CDR2 de las cadenas pesada y ligera humanizadas contienen cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia del anticuerpo L3D10 parental de referencia y se enumeran en las SEQ ID NO 33-38 como se indica en la Tabla 1B a continuación.

T l 1B n i DR2 l r i n ri l l n i r h m niz

Las cadenas humanizadas ligeras y pesadas ahora pueden combinarse para crear variantes de anticuerpos totalmente humanizados. Se sometieron a ensayo todas las combinaciones posibles de cadenas ligeras y pesadas humanizadas para determinar su nivel de expresión y afinidad de unión a antígeno para identificar anticuerpos que se comportan de manera similar al anticuerpo parental.

Se usó una nueva herramienta para calcular las puntuaciones de humanidad de los anticuerpos monoclonales (24). Esta puntuación representa el aspecto humano de la secuencia de la región variable de un anticuerpo, lo que es un factor importante a la hora de humanizar los anticuerpos. Las puntuaciones de humanidad para los anticuerpos parentales y humanizados se muestran en las Tablas 2 y 3 a continuación. Basándose en el método de los presentes inventores, para las cadenas pesadas, una puntuación de 79 o más es indicativa de apariencia humana; para las cadenas ligeras, una puntuación de 86 o más es indicativa de apariencia humana.

T l 2 Inf rm i n n li r h m niz n i n h m ni

T l Inf rm i n n h m niz n i n h m ni

Se construyeron genes de anticuerpos de longitud completa sintetizando en primer lugar las secuencias de la región variable. Las secuencias se optimizaron para su expresión en células de mamíferos. Estas secuencias de regiones variables después se clonaron en vectores de expresión que ya contenían dominios Fc humanos; para la cadena pesada, se utilizó la cadena principal hlgG1 (M252y , S254T, T256E, S298A, E333A, K334A). Adicionalmente, para comparación, la región variable de las cadenas pesada y ligera quiméricas parentales se construyó como cadenas quiméricas de longitud completa usando las mismas secuencias Fc de la cadena principal.

Los 9 anticuerpos humanizados se sometieron a una producción a pequeña escala de 0,01 litros. El anticuerpo parental quimérico también se amplió para la comparación directa. Los plásmidos para las cadenas pesada y ligera indicadas se transfectaron en células HEK293 en suspensión usando medios químicamente definidos en ausencia de suero para preparar los anticuerpos. Los anticuerpos completos en los medios condicionados se purificaron usando el medio MabSelect SuRe Protein A (GE Healthcare). Los 10 anticuerpos analizados se muestran en la Tabla 4 a continuación, en donde PP N.° 4639-4636 y 4638 son anticuerpos de referencia y PP N.° 4637 es el anticuerpo de acuerdo con la invención.

Tabla 4: Diez ânticuer os roducidos transitoriamente en células HEK293

La afinidad de 9 combinaciones de anticuerpos humanizados y el anticuerpo parental quimérico con el antígeno (huCTLA4) se evaluó mediante Octet. Se realizaron experimentos cinéticos de concentración múltiple en el sistema Octet Red96 (ForteBio). Los biosensores anti-hlgG Fc (ForteBio, N.° 18-5064) se hidrataron en diluyente de muestra (BSA al 0,1 % en PBS y Tween 20 al 0,02 %) y se preacondicionaron en glicina a pH 1,7. El antígeno se diluyó usando una sonda de 7 puntos, dilución en serie doble comenzando a 600 nM con diluyente de muestra. Todos los anticuerpos se diluyeron a 10 pg/ml con diluyente de muestra y después se inmovilizaron en biosensores de Fc anti-hlgG durante 120 segundos. Después de establecer los valores basales durante 60 segundos en diluyente de muestra, los biosensores se trasladaron a pocillos que contenían el antígeno en una serie de concentraciones para medir la asociación. Se observó asociación durante 120 segundos y disociación durante 180 segundos para cada proteína de interés en el diluyente de muestra. Las afinidades de unión se caracterizaron ajustando los sensogramas cinéticos a un modelo de unión monovalente (unión 1:1). Las mediciones cinéticas completas se resumen en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5: Mediciones cinéticas de los anticuer os humanizados del anticuer o arental

Ejemplo 12. Actividad antitumoral de los anticuerpos anti-CTLA4 humanizados

Basándose en las puntuaciones relativas de afinidad de unión y humanidad, los presentes inventores eligieron 3 anticuerpos para una evaluación adicional:

PP4631 de referencia - alta afinidad y buena expresión

PP4637 - alta afinidad y buena expresión

PP4638 de referencia - afinidad ligeramente inferior pero puntuación de humanización más alta

El material para cada uno de estos anticuerpos se produjo mediante producción transitoria en células HEK293 a una escala de 0,1 litros seguida de purificación de proteína A. La afinidad de unión de los anticuerpos purificados se confirmó mediante análisis de Octet como se muestra en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6. Mediciones cinéticas de los anticuer os humanizados del anticuer o arental

Los presentes inventores evaluaron la actividad antitumoral de estos tres anticuerpos humanizados en comparación con 10D1 y el anticuerpo L3D10 quimérico usando el modelo de tumor de ratón singénico MC38 en ratones con activación de CTLA4 humano descritos en el Ejemplo 5 anterior. La FIG. 39A muestra el programa de tratamiento del experimento in vivo; a los ratones se les administraron un total de 4 dosis de anticuerpo cada 3 días a partir del día 7 después de la inoculación. Como se muestra en la FIG. 39B, todos los anticuerpos humanizados erradicaron completamente el tumor y fueron comparables a 10D1.

En otro experimento, los presentes inventores evaluaron la actividad antitumoral de los anticuerpos humanizados PP4631 y PP4637 en comparación con 10D1 y el anticuerpo L3D10 quimérico usando el modelo de tumor de ratón singénico MC38 en los ratones Ctla4h/m heterocigotos descritos en el Ejemplo 5 (FIG. 14) a dos dosis diferentes. Como se muestra en la FIG. 40, aunque todos los mAb son indistinguibles cuando se usan a dosis de 30 mcg/ratón/inyección (1,5 mg/kg), PP4637 fue más eficaz con 10 mcg/ratón/inyección (0,5 mg/kg), mientras que PP4631 y 10D1 mostraron una actividad comparable.

La actividad antitumoral de los anticuerpos humanizados en comparación con 10D1 y el anticuerpo L3D10 quimérico también se demostró usando el modelo de tumor de ratón con melanoma singénico B16-F1 en ratones con activación de CTLA4 humano como se muestra en la FIG. 41. A los ratones se les administraron un total de 3 dosis de anticuerpo cada 3 días a partir del día 2 después de la inoculación. Como se muestra en la FIG. 41, L3D10 y los anticuerpos humanizados retrasaron el crecimiento tumoral y fueron comparables a 10D1.

Ejemplo 13. Los clones humanizados de L3D10 mantienen perfiles de seguridad superiores a los de 10D1.

Para someter a ensayo si los perfiles de seguridad superiores de L3D10 pueden mantenerse después de la humanización, los presentes inventores compararon PP4631 y PP4637 con 10D1 por sus efectos adversos cuando se usan en combinación con anti-PD-1. Como se muestra en la FIG. 42, tanto PP4631 como PP4637 son menos tóxicos que 10D1 cuando se usan en combinación con anti-PD-1.

De acuerdo con la eritropoyesis defectuosa descrita en la FIG. 28, los ratones tratados con 10D1 más anti-PD-1 están anémicos basándose en el recuento sanguíneo completo (CBC), mientras que aquellos que recibieron anti-PD-1+PP4631 y anti-PD-1+PP4637 tienen perfiles de CBC en gran medida normales como se muestra en la FIG. 43. Por otra parte, el análisis de los perfiles de linfocitos T en el PBL revela una fuerte activación sistémica de los linfocitos T CD4 y CD8 en ratones que recibieron 10D1+anti-PD-1, pero no en aquellos que recibieron anti-PD-1+PP4631 o anti-PD-1+PP4637 (FIG. 44), lo que respalda adicionalmente la idea de que los mAb anti-CTLA-4 basados en L3D10 no provocan activación de linfocitos T sistémicos.

Ejemplo 14. Características de unión de los anticuerpos anti-CTLA4 humanizados

Con el fin de confirmar que los anticuerpos humanizados conservaron sus características de unión a CTLA4, los presentes inventores observaron la unión a CTLA4 inmovilizado y unido a placa. Como se muestra en la FIG. 45, la humanización no afecta la unión a CTLA4 inmovilizado y los 3 anticuerpos humanizados demostraron una unión similar al anticuerpo L3D10 quimérico parental. Sin embargo, la humanización reduce adicionalmente la unión de L3D10 a CTLA4 soluble como se muestra en la FIG. 46. Basándose en una unión reducida a CTLA4 soluble, se anticipa que los 3 anticuerpos humanizados inducirán el mismo rechazo tumoral con incluso menos efectos secundarios autoinmunitarios que L3D10.

Los presentes inventores han demostrado que L3D10 quimérico tiene una actividad de bloqueo 1000 veces mayor que 10D1. Esto planteó una posibilidad interesante de que el bloqueo de las interacciones B7-CTLA-4 pueda explicar su falta de irAE. Como se muestra en las FIG. 47 y 48, ni PP4631 ni PP4637 bloquean las interacciones B7-CTL-A4 in vitro e in vivo. El hecho de que PP4631 y PP4637 muestren irAE disminuidos respalda adicionalmente la idea de que el bloqueo de la interacción B7-CTLA-4 no es responsable de una mayor seguridad de L3D10.

Dada la función propuesta para CTLA-4 en la protección contra enfermedades autoinmunitarias, los presentes inventores propusieron una unión reducida a CTLA-4 soluble como mecanismo subyacente para mejorar los perfiles de seguridad. Para someter a ensayo esta hipótesis, los presentes inventores usaron la ganancia de peso en crecimiento entre los ratones hembra que recibieron mAb anti-PD-1+anti-CTLA-4 durante el período perinatal como indicador básico para irAE. Como se muestra en la FIG. 42, se observó una reducción grave en la ganancia de peso en los ratones que recibieron tanto 10D1 como anti-PD-1, mientras que aquellos que recibieron PP4637 anti-PD-1 tuvieron el irAE más bajo, seguido de PP4631 y después L3D10. La estricta correlación inversa con la unión reducida a sCTLA-4 es coherente con la hipótesis central.

Ejemplo 15. Evaluación de procesabilidad de los anticuerpos anti-CTLA4 humanizados

Con el fin de evaluar el potencial de desarrollo y fabricación de los tres anticuerpos humanizados diferentes, se realizaron varios métodos analíticos para caracterizar los diferentes anticuerpos.

Como evaluación inicial, los pesos moleculares y el punto isoeléctrico previstos de los tres anticuerpos candidatos principales se calcularon basándose en secuencias de aminoácidos. Como se muestra en la Tabla 7, todos los anticuerpos eran bastante similares, aunque el anticuerpo tuvo un PI ligeramente menor.

Tabla 7: Parámetros teóricos de los tres anticuer os humanizados

Evaluación del rendimiento del producto

Para evaluar la productividad de los diferentes anticuerpos, se transfectaron transitoriamente células HEK293 con vectores que expresaban las cadenas pesada y ligera de los diferentes anticuerpos. Después, estas células se cultivaron en matraces agitados durante 6 días usando medio sin suero. Después de 6 días, el sobrenadante se recogió y los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de proteína A de una sola etapa. Como debería verse en la Tabla 8 a continuación, los anticuerpos PP4631 y PP4637 demostraron rendimientos de proteínas similares, mientras que el anticuerpo PP4638 se produjo con un rendimiento relativo mucho menor.

Para evaluar la pureza de los anticuerpos expresados transitoriamente, las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE reductora y no reductora. Como se muestra en la FIG. 50, las muestras de los 3 anticuerpos produjeron bandas de gel indicativas de una molécula de anticuerpo y de que las muestras eran relativamente puras después de la purificación de proteína A.

Cromatografía de exclusión por tamaño

Para examinar adicionalmente la pureza y agregación de los diferentes anticuerpos después de la expresión transitoria, los presentes inventores realizaron una cromatografía de exclusión por tamaño de las proteínas purificadas.

Resumiendo, se usaron 50 |jg de muestra filtrada (usando un filtro de 0,22 |jm) para la separación por SE-HPLC usando una columna TOSOH G3000 SWxl de 5 jm . Se usó PBS pH 7,4 como fase móvil. Como se muestra a continuación en la Tabla 9, todos los anticuerpos humanizados muestran >90 % de pureza después de la purificación de proteína A. Los anticuerpos PP4631 y PP4637 demostraron niveles igualmente bajos de agregados de mayor peso molecular (PM) y degradación presentes en las muestras de anticuerpos con la mayor parte de la proteína dentro del pico principal. Por el contrario, el anticuerpo PP4638 tuvo niveles más altos de agregación y cierta degradación. Los cromatogramas de SE-HPLC se muestran en la FIG. 51.

Electroforesis capilar (CE)

Se usó electroforesis capilar para cuantificar la cantidad de proteína dentro de las bandas de picos tanto en condiciones reducidas como no reducidas, así como la cantidad de proteína de cadena pesada no glicosilada. Resumiendo, se diluyeron 100 jg de muestra en tampón de muestra de CE-SDS junto con Yodoacetamida (condiciones no reducidas) o p-mercaptoetanol (condiciones reducidas), junto con 2 j l de una proteína patrón de 10 kDa. Después las muestras se trataron durante 10 min a 70 °C. Para la separación, se usó PA-800, capilar de sílice fundida desnuda de 50 jm de D.I.; longitud de la ejecución 20,2 cm; tensión de separación 15 kV; DO<220>para la detección. Como se muestra a continuación en la Tabla 10, las tres proteínas demostraron altos niveles de pureza, coherentes con SDS-PAGE, y todos estaban altamente glicosilados. Los cromatogramas de CE-SDS se muestran en la FIG. 52.

Tabla 10: Electroforesis ca ilar

Desamidación: Enfoque isoeléctrico capilar (clEF) y cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS)

El nivel de desamidación de proteínas bajo estrés de pH alto se determinó comparando los anticuerpos con y sin tratamiento de estrés de pH alto durante dos períodos de tiempo diferentes (5 horas y 12,5 horas), seguido de análisis por clEF y LC-MS.

El perfil de isoformas de carga y los puntos isoeléctricos de los diferentes anticuerpos se determinaron mediante enfoque isoeléctrico capilar (clEF). Resumiendo, las muestras se sometieron a intercambio de tampón en Tris 20 mM, pH 8,0 y después se mezclaron 100 jg de proteína de muestra con el electrolito anfótero, metilcelulosa, junto con los marcadores Pl 7.05 y PI 9.77. Se usó iCE3™ para el análisis, con un capilar de 100 jm de D.I.; 1,5 kV más 3 kV; DO<280>para la detección. Para el tratamiento del estrés por desamidación, las muestras se trataron con NaHCO 500 mM durante 5 horas o 12,5 horas, después se examinaron con clEF y LC-MS. Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 11 a continuación y los gráficos de LC-MS se muestran en la FIG. 53. Los tres anticuerpos muestran un aumento previsto en la cantidad de especies desamidadas en condiciones de estrés y una caída correspondiente en el pico principal. Como se predice a partir de la secuencia de aminoácidos, el pl del anticuerpo PP4637 es un poco menor que el de PP4631 y PP4638 (Tabla 7) y el pl mayor observado en comparación con el pl predicho presumiblemente indica glicosilación.

Tabla 11: Enfo ue isoeléctrico desamidación

continuación

Análisis térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Con el fin de determinar la estabilidad térmica y las temperaturas de fusión de los diferentes anticuerpos, se sometieron a análisis térmico por calorimetría diferencial de barrido (DSC). Resumiendo, se sometieron muestras de 2 mg/ml en PBS pH 7,4 a un aumento de temperatura de 15 °C a 105 °C a una velocidad de 1 °C/min. Se controló el cambio de Cp con la temperatura tanto para las muestras como para el tampón (como fondo). Las curvas de Cp frente a temperatura se obtuvieron con resta de fondo y los picos indicaron la Tf de los analitos. Como se muestra a continuación en la Tabla 12, los tres anticuerpos demostraron una temperatura de fusión igualmente alta. Las curvas de DSC para los tres anticuerpos se muestran en la FIG. 54.

Tabla 1 tamaño

Oxidación: Cartografiado de péptidos

La modificación oxidativa de los anticuerpos humanizados se evaluó mediante cartografiado de péptidos usando LC-MS con o sin estrés oxidativo. Las muestras se desnaturalizaron a 65 °C en presencia de GnCl 6 M y p-ME 5 mM, después se acetilaron con yodacetamida. Después, las muestras procesadas se digieren con tripsina (Promega, grado de secuenciación) a 55 °C y la mezcla digerida se separa en una columna de LC de fase reversa C18 (ACQUITY UPLC BEH130 C18, 2,1 * 100 mm, 1,7 |jm) y se analiza mediante espectrometría de masas (Waters XEVO-G2S QTOF) usando herramientas de análisis Masslynx y Biophatmlynx. Para el análisis del estrés de oxidación, las muestras se trataron con H<2>O<2>al 0,05 % o 0,1 % durante 1 hora, después se examinaron con LC-MS. Los resultados se muestran en las Tablas 13-16 a continuación.

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Especificidad de unión

La especificidad de unión de los diferentes anticuerpos se determinó evaluando la capacidad de detectar la unión no específica a dos estirpes celulares diferentes que no expresan CTLA4 (CHO y HEK293) con respecto a 10D1 a dos concentraciones diferentes. Resumiendo, se incubaron muestras de 100 pg/ml o 20 pg/ml (o mAb de referencia) en PBS con 3 x 10 e6 células/ml (CHO o HEK293). Se usó anticuerpo de conejo anti-IgG humana marcado con FITC (Boster, Wuhuan, China) para la detección y la unión del mAb diana a las células se midió mediante FACS. Como se muestra a continuación en la Tabla 17, los anticuerpos PP4631 y PP4637 demuestran una unión muy baja y una buena especificidad, mientras que el anticuerpo PP4638 mostró actividad de unión no específica a las estirpes celulares de control.

Tabla 17: Es ecificidad de unión a estir es celulares CHO HEK293

Ejemplo 16. Cartografiado de epítopos del L3D10 y anticuerpos humanizados

Con el fin de cartografiar el epítopo de unión a CTLA-4 del anticuerpo parental L3D10 y las variantes humanizadas, PP4631 y PP4637, los presentes inventores aprovecharon el hecho de que las proteínas CTLA4 de ratón y humana tienen reactividad cruzada con B7-1, pero no con los anticuerpos anti-CTLA-4. En consecuencia, los presentes inventores diseñaron varios mutantes de la proteína CTLA-4Fc humana en los que grupos de aminoácidos de la proteína CTLA-4 humana se reemplazaron con aminoácidos de la proteína Ctla-4 murina. Como los anticuerpos anti-CTLA-4 utilizados en este estudio no se unen a Ctla-4 murino, la unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 humano debe suprimirse cuando los restos clave del epítopo de unión del anticuerpo se reemplazan por aminoácidos murinos.

Se construyeron vectores de ADN que codificaban 11 proteínas mutantes de CTLA-4Fc (M1-M1 1) (SEQ ID NO: 40 50) basándose en la secuencia de CTLA-4Fc humano de tipo silvestre y las proteínas se produjeron mediante transfección transitoria en HEK293 a una escala de 0,01 ml seguido de purificación por cromatografía de proteína A en una sola etapa.

La unión de los anticuerpos anti-CTLA4 a las proteínas CTLA4Fc se realizó mediante ELISA. Las placas se recubrieron con proteínas CTLA-4Fc a 1 pg/ml y después se usaron anticuerpos biotinilados o proteína de fusión B7-1Fc en fase soluble en el ensayo de unión, con las cantidades de proteína unida medidas usando estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP).

Los anticuerpos anti-CTLA-4 humano no presentan reacción cruzada con Ctla-4 murino, lo que presumiblemente refleja diferencias en la secuencia de aminoácidos entre CTLA-4 humano y de ratón en el dominio extracelular. La FIG. 55 muestra la alineación de los dominios extracelulares de CTLA-4 de ser humano, de macaco y de ratón y destaca la conservación de secuencia entre ser humano y macaco, mostrando al mismo tiempo las numerosas diferencias entre las secuencias murinas y de primates. Debido a la conservación del motivo de unión MYPPPY, las proteínas CTLA4 de ratón y humana tienen reactividad cruzada con B7-1 (72).

Con el fin de cartografiar el epítopo de unión de los anticuerpos anti-CTLA-4 humano, los presentes inventores generaron una serie de proteínas mutantes CTLA-4Fc no superpuestas que incorporan grupos de aminoácidos específicos de murino en la secuencia de CTLA-4 humano. Los aminoácidos incorporados en cada uno de los 11 mutantes se muestran en la FIG. 55, y las secuencias de aminoácidos de las proteínas CTLA-4Fc WT y mutantes se muestran en la FIG. 56. Estas proteínas se produjeron mediante transfección transitoria en células HEK293 y el rendimiento se proporciona en la Tabla 18. Muchas de las mutaciones parecen afectar a la expresión de proteínas como lo indican sus rendimientos con respecto a la proteína CTLA-4Fc humana WT.

Tab - 293.

La capacidad de L3D10 quimérico y los anticuerpos humanizados PP4631 y PP4637 para unirse a las construcciones mutantes de CTLA-4Fc inmovilizadas se determinó después mediante ELISA en la que las placas se recubrieron con las construcciones mutantes de CTLA-4 y se unieron anticuerpos anti-CTLA-4 biotinilados, o proteína de control de Ig B7-1, y la unión se midió usando estreptavidina conjugada con HRP. Los resultados de los ensayos de unión se muestran en las Tablas 19 - 22. Como se esperaba, las 4 proteínas de unión demostraron una buena unión dependiente de la dosis para la proteína CTLA-4Fc WT. Sin embargo, las mutaciones que se introdujeron en las proteínas M9 y M10 parecen alterar la estructura general y estos mutantes no lograron unirse a B7-1Fc. Las mutaciones introducidas en M2 y M4 también alteraron parcialmente la conformación de CTLA-4, como lo indica la unión reducida con respecto a la proteína WT. De manera coherente con esta idea, los 4 mutantes (M2, M4, M9 y M10) se expresaron con un rendimiento mucho menor (Tabla 18). Por el contrario, usando la unión a la proteína CTLA-4Fc WT y la unión de las proteínas B7-1Fc como referencias, M11 destaca claramente por ser una proteína que se expresa bien, se une a B7-1Fc de manera eficiente pero no logró unirse a dos anticuerpos anti-CTLA-4 humanizados. Su unión al L3D10 original también se reduce aproximadamente 100 veces (Tabla 20). Como se esperaba, las mutaciones que afectan a la conformación global también afectaron a la unión a los anticuerpos anti-CTLA-4.

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�� Tabla 23: Datos sin procesar de un estudio repetido que muestra una pérdida específica de epítopo antigénico sólo en M11. Como en la Tabla 2-5, excepto por que se incluyeron controles adicionales para mostrar la especificidad de la unión.

Puesto que L3D10 mantuvo una unión significativa con M11, los presentes inventores sometieron a ensayo si la unión es específica. Revistieron la placa con CTLA4-Fc humano (hCTLA4Fc), CTLA4-Fc de ratón (mCTLA4-Fc), IgG1-Fc de control o todos los hCTLA4-Fc mutantes y midieron su unión a B7-1Fc junto con L3D10, PP4631 y PP4637. Los datos en bruto se presentan en la Tabla 23. Como se muestra en la FIG. 57, B7-1 biotinilado se une a hCTLA-4, mCTLA-4 y M11, igualmente bien. La especificidad del ensayo se demuestra por la falta de unión a IgG1-Fc. De forma interesante, mientras que la unión de L3D10 a M11 es más fuerte que la de IgG1-Fc y mCTLA4-Fc, la unión significativa a IgG1-Fc sugiere que la unión del anticuerpo quimérico a M11 puede ser no específica. Por el contrario, ninguno de los anticuerpos humanizados se une a M11, mCTLA-4 y control de IgG1-Fc. Estos datos demuestran que las mutaciones introducidas en M11 impidieron selectivamente que L3D10, PP4631 y PP4637 se unan a CTLA-4.

Usando la estructura compleja conocida 133, los presentes inventores cartografiaron el epítopo de CTLA-4 en una estructura 3D. Como se muestra en la FIG. 58, el epítopo es reconocido por estos mAb ubicados dentro del área cubierta por B7-1. De esta manera, la unión de L3D10, PP4631 y PP4637 a CTLA-4 sería mutuamente excluyente de la de B7-1. El bloqueo deficiente de PP4631 y PP4637 se debe a una menor avidez más que a dominios de unión distintivos.

Aprovechando el hecho de que las proteínas CTLA4 de ratón y humana tienen reactividad cruzada con B7-1, pero que los anticuerpos anti-CTLA-4 humano no tienen reacción cruzada con la proteína Ctla-4 murina, los presentes inventores fueron capaces de mapear el epítopo de unión de los anticuerpos derivados de L3D10 mediante ELISA. Usando varios mutantes de la proteína CTLA-4Fc humana en los que grupos de aminoácidos de la proteína CTLA-4 humana se reemplazaron con aminoácidos de la proteína Ctla-4 murina, los presentes inventores demostraron claramente que cuando reemplazan 4 aminoácidos que siguen inmediatamente al dominio de unión B7-1 conocido de CTLA-4, la unión de los anticuerpos dependiente de la dosis se suprime en gran medida. El hecho de que el epítopo de unión se cartografíe directamente adyacente al dominio de unión B7-1 se correlaciona bien con la capacidad demostrada de los anticuerpos L3D10 para bloquear las interacciones B7-CTLA-4 tanto in vitro como in vivo. Puesto que CTLA4 soluble se produce mediante la fusión de aminoácidos C terminales del dominio IgV extracelular con el dominio intracelular, es tentador especular que es más probable que el anticuerpo que se une a restos polimórficos del dominio C terminal (sólo 18 aminoácidos del extremo C terminal) pierda reactividad con el CTLA-4 soluble, en donde un gran dominio intracelular se fusiona con el extremo C del dominio extracelular.

Para investigar adicionalmente el dominio de unión de los anticuerpos anti-CTLA4, se diseñaron 6 proteínas de fusión CTLA4-Fc mutantes adicionales, designadas M12-M17 (SEQ ID NO: 51-56), (FIG. 59) y se usaron para comparar la unión de los anticuerpos anti-CTLA4 10D1 (FIG. 60A), PP4631 (FIG. 60B) y p P4637 (FiG. 60C). Como se muestra en la FIG. 60, las mutaciones en M11, que están en las posiciones y 103L104I106, anularon la unión a 10D1, PP4631 y PP4637, demostrando que los sitios de unión para 10D1, PP4631 y PP4637 incluyen restos y 103L104I106 De forma importante, una mutación adicional en A29>Y restauró la unión de CTLA-4 con mutaciones en y 103L104I106 a PP4631 y PP4637. Estos datos demuestran que la posición A29 en CTLA4 es importante para la unión de los anticuerpos PP4631 y PP4637, pero no para 10D1.

Ejemplo 17. El mAb anti-CTLA-4 tiene sinergia con anti-4-1BB para inducir el rechazo tumoral

Los estudios en modelos animales han indicado que la respuesta antitumoral provocada por el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CTLA-4, al menos en parte, se debe a una respuesta de linfocitos T específica de antígeno contra antígenos de "autodiferenciación" normales (73, 74). La tendencia de los anticuerpos anti-CTLA-4 a exacerbar las enfermedades autoinmunitarias está bien documentada en el ratón (75-78). Esta idea se corroboró adicionalmente y demostró ser una limitación importante en ensayos en seres humanos más recientes en los que los pacientes desarrollaron manifestaciones autoinmunitarias graves que requirieron la interrupción del tratamiento (79). Por otro lado, se ha demostrado que los mAb anti-4-1BB terapéuticos contra el cáncer anulan el desarrollo de enfermedades autoinmunitarias en ratones propensos al lupus (24, 25).

El hecho de que los mAb anti-4-1BB puedan estimular respuestas antitumorales y disminuir las manifestaciones autoinmunitarias plantea la posibilidad intrigante de que la combinación de este anticuerpo con mAb anti-CTLA-4 pueda provocar un rechazo del cáncer sin autoinmunidad. En este estudio se combinaron anti-CTLA-4 y anti-4-1BB para inducir el rechazo de tumores establecidos grandes.

Efecto combinado de los anticuerpos anti-CTLA-4 murino y anti-4-1BB murino en la inducción del rechazo tumoral mediado por linfocitos T CD8.

Se usaron dos modelos, uno de enfermedad mínima y otro de tumores establecidos grandes, para someter a ensayo el efecto antitumoral de combinar tratamientos con mAb anti-4-1BB murino y anti-CTLA-4 murino. Se expusieron ratones C57BL/6 a una inoculación subcutánea de células de cáncer de colon MC38, y en diferentes momentos después de la inoculación de células tumorales, se inyectaron anticuerpos en ratones expuestos a tumores y el tamaño y la incidencia del tumor se controlaron mediante examen físico.

En el modelo de enfermedad mínima, los ratones fueron tratados con IgG de hámster más IgG de rata, anti-4-1BB más IgG de hámster (grupo anti-4-1BB solo), anti-CTLA-4 más IgG de rata (grupo anti-CTLA-4 solo), o anti-4-1BB combinado con anti-CTLA-4 a partir de 48 horas después de la inoculación de células tumorales. Los anticuerpos se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) los días 2, 9 y 16. El tratamiento con mAb anti-4-1BB o anti-CTLA-4 solo dio como resultado un retraso en el crecimiento tumoral y 1 de cada 5 ratones en cada grupo rechazó los tumores, mientras que 4 de 5 ratones tratados con mAb anti-CTLA-4 y anti-4-1BB estaban exentos de tumores al finalizar el experimento. La FIG. 61A muestra las mediciones de crecimiento tumoral para cada ratón. Para comparar las tasas de crecimiento entre grupos, se aplicó a los datos un modelo lineal de efectos aleatorios. La terapia de combinación redujo significativamente el crecimiento diario del tamaño tumoral en 4,6 mm2/día frente a anti-CTLA-4 solo (p = 0,0094). Además, la terapia de combinación redujo significativamente el crecimiento en 8,4 mm2/día frente a anti-4-1BB solo (p = 0,0006). Además de la tasa de crecimiento, los tamaños reales de los tumores se compararon entre los grupos de tratamiento seis semanas después de la exposición inicial al tumor. El tamaño promedio del tumor a las seis semanas fue significativamente menor en los ratones que recibieron la terapia de combinación (27,5 mm2) en comparación con ratones que recibieron anti-CTLA-4 (137,8 mm2, p = 0,0251) o anti-4-1BB por separado (287,6, p = 0,0006). Por lo tanto, en el contexto de una carga tumoral mínima, la combinación de mAb anti-4-1BB y anti-CTLA-4 produce retrasos significativos en el crecimiento tumoral en comparación con los anti-4-1BB o anti-CTLA-4 administrados por separado.

Para determinar si los efectos antitumorales del tratamiento de combinación con mAb contra una carga tumoral pequeña podrían extenderse a aplicaciones terapéuticas contra cargas tumorales más grandes, se trataron ratones con tumores establecidos con anticuerpos. Se expusieron ratones C57BL/6 de tipo silvestre a una inoculación subcutánea de células de cáncer de colon MC38. Se permitió que los tumores crecieran durante 14 días, momento en el cual, se seleccionaron ratones con tumores establecidos (normalmente > 7 mm de diámetro) y se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento: IgG de hámster más IgG de rata, anti-4-1BB más IgG de hámster, anti-CTLA-4 más IgG de rata y mAb anti-4-1BB combinado con mAb anti-CTLA-4. Los anticuerpos se administraron i.p. los días 14, 21 y 28 después de la exposición al tumor. Como se muestra en la FIG. 61B, el tratamiento con mAb anti-CTLA-4 no impidió el crecimiento tumoral en comparación con el tratamiento de control con IgG, aunque se observó rechazo en uno de los ocho ratones del grupo. El tratamiento con mAb anti-4-1BB ralentizó un poco el crecimiento tumoral, pero sólo uno de cada ocho ratones rechazó el tumor. Por el contrario, la terapia de combinación con mAb anti-CTLA-4 y anti-4-1BB condujo a la erradicación de tumores en 7 de 8 ratones y a la prevención de un mayor crecimiento tumoral en el ratón restante. Como anteriormente, las tasas de crecimiento entre grupos se compararon aplicando un modelo lineal de efectos aleatorios a los datos. La terapia de combinación redujo significativamente el crecimiento diario del tamaño tumoral en 10,6 mm2/día frente a anti-CTLA-4 solo (p < 0,0001). Además, la terapia de combinación redujo significativamente el crecimiento en 6,2 mm2/día frente a anti-4-1BB solo (p = 0,0002). Además de la tasa de crecimiento, los tamaños reales de los tumores se compararon entre los grupos de tratamiento ocho semanas después de la exposición inicial al tumor. El tamaño promedio estimado del tumor a las ocho semanas fue significativamente menor para los ratones que recibieron la terapia de combinación (-1,7 mm2, IC del 95 %: -10,8, 7,5 mm2) en comparación con ratones que recibieron anti-CTLA-4 (404,9 mm2, IC del 95 %: 285,4, 524,4 mm2; p < 0,0001) o anti-4-1BB por separado (228,4 mm2, IC del 95 %: 200,4, 689,9 mm2; p = 0,0004). Por lo tanto, la combinación de mAb también parece retrasar significativamente el crecimiento tumoral frente a anti-CTLA-4 o anti-4-1BB por separado también en cargas tumorales más grandes.

Se sabe que MC38 forma metástasis hepática.80 Para evaluar el efecto de los anticuerpos terapéuticos sobre las metástasis hepáticas, todos los ratones reclutados en los experimentos fueron analizados para detectar metástasis hepáticas mediante histología. Como se muestra en la Tabla 24, aproximadamente el 60 % de los ratones de control tratados con Ig presentaban micrometástasis en el hígado. Los tratamientos con anticuerpos anti-CTLA-4 o anti-4-1BB solos redujeron un poco la tasa de metástasis, aunque la reducción no alcanzó significación estadística. Cabe destacar que, sólo 1/22 ratones del grupo tratado con ambos anticuerpos tenían metástasis hepáticas. Usando un modelo de regresión logística, los presentes inventores descubrieron que las probabilidades de metástasis hepática en ratones que recibieron anti-4-1BB solo eran aproximadamente 4,7 veces mayores que las probabilidades de ratones que recibieron tanto anti-4-1BB como anti-CTLA-4 (IC del 95%: 1,6, 13,7; p = 0,0050). De forma similar, las probabilidades de metástasis hepática fueron 3,6 veces mayores en los ratones que recibieron sólo anti-CTLA-4 en comparación con los ratones que recibieron ambos tratamientos (IC del 95%: 1,3, 10,2; p = 0,0174). Por lo tanto, la terapia de combinación reduce significativamente la metástasis hepática por MC38 en comparación con el tratamiento con cualquiera de los anticuerpos solos.

*

Para determinar qué subconjunto de células inmunitarias contribuía al efecto antitumoral provocado por el tratamiento de combinación con mAb, los principales subconjuntos de linfocitos estaban agotados con anticuerpos monoclonales. Se inyectaron células tumorales MC38 por vía subcutánea. Una vez que los tumores eran palpables, los ratones portadores de tumores se separaron en cuatro grupos. Cada grupo recibió una serie de inyecciones de anticuerpos intraperitoneales para agotar diferentes subconjuntos de células inmunitarias, incluyendo la ausencia de agotamiento con IgG de rata normal, agotamiento de linfocitos T CD4 con mAb anti-CD4 (GK 1,5), agotamiento de linfocitos T CD8 con mAb anti-CD8 (2.4.3) y agotamiento de linfocitos NK con mAb anti-NK1.1 (PK136). Adicionalmente, todos los ratones de todos los grupos fueron tratados con mAb anti-CTLA-4 más anti-4-1BB una vez por semana durante tres semanas. Se evaluó el agotamiento adecuado de los subconjuntos de células inmunitarias mediante citometría de flujo de sangre periférica extraída de ratones inmediatamente antes de completar el experimento (datos no mostrados). Como se esperaba, los ratones sin agotamiento de células inmunitarias respondieron al tratamiento con anti-CTLA-4 combinado con mAb anti-4-1BB (FIG. 62). De forma similar, el agotamiento de los linfocitos NK y los linfocitos T CD4 no afectó a la actividad antitumoral de la terapia de combinación con mAb anti-CTLA-4 más anti-4-1BB. El agotamiento de los linfocitos T CD8, sin embargo, anuló la actividad antitumoral de la terapia de combinación con anticuerpos. El día 28, el tamaño tumoral promedio estimado para ratones con agotamiento de linfocitos T CD8 (92,3 mm2, IC del 95 %: 64,5, 120,1 milímetros2) fue significativamente mayor que el tamaño promedio de los tumores para ratones sin agotamiento de las células inmunitarias (28,7 mm2, IC del 95 %: -17,1, 74,4 milímetros2), ratones con linfocitos T CD4 agotados (16,7 mm2, IC del 95 %: 1,0, 32,4 mm2) y ratones con linfocitos NK agotados (9,3 mm2, IC del 95 %: -8,3, 26,9 mm2). Estos datos demuestran que el efecto erradicador de tumores del tratamiento con mAb anti-CTLA-4 y anti-4-1BB depende de los linfocitos T CD8.

El anticuerpo anti-4-1BB redujo la respuesta de anticuerpos a los anticuerpos anti-CTLA-4 xenogénicos.

Uno de los obstáculos para la terapia repetida con anticuerpos es la potenciación de las respuestas de los anticuerpos del hospedador a los anticuerpos terapéuticos.81 Puesto que se sabe que 4-1BB reduce la respuesta de anticuerpos a las proteínas, los presentes inventores evaluaron el efecto de los anticuerpos anti-4-1BB sobre la respuesta del hospedador a los anticuerpos anti-CTLA-4. Como se muestra en la FIG. 63, se detectó muy poca respuesta de anticuerpos en ratones tratados con IgG de control o anti-4-1BB, si es que se detectó alguna. Coherente con la capacidad del mAb anti-CTLA-4 para facilitar las respuestas de los linfocitos T CD482, los ratones tratados con anti-CTLA-4 más IgG de rata desarrollaron fuertes respuestas de anticuerpos del hospedador contra el anticuerpo 4F10 administrado y la IgG de rata (FIG. 63A-B). Esta respuesta se redujo más de 30 veces cuando se coadministró anti-4-1BB con mAb anti-CTLA-4. Estos datos sugieren que los anticuerpos anti-4-1BB pueden aumentar potencialmente la duración de otras proteínas terapéuticas coadministradas al reducir las respuestas del hospedador a las terapias.

En ratones con activación de CTLA-4 humano, una combinación de anticuerpos anti-4-1BB de ratón y anti-CTLA-4 humano indujo el rechazo tumoral y una inmunidad duradera contra el cáncer.

Puesto que anti-4-1BB reduce la producción de anticuerpos contra los anticuerpos anti-CTLA-4, una cuestión interesante es si el aumento del rechazo tumoral por el anti-4-1BB se debe únicamente a su efecto en la supresión de la respuesta de anticuerpos. Este ratón con activación del gen de CTLA4 humano permitió a los presentes inventores someter a ensayo si el efecto antitumoral de los anticuerpos anti-CTLA4 humano puede potenciarse mediante el anticuerpo anti-4-1BB. Como se muestra en la FIG. 64A, aunque tanto el anticuerpo anti-CTLA-4 humano (L3D10) como el anticuerpo anti-4-1BB (2A) por sí solos provocaron un retardo en el crecimiento tumoral, una combinación de los dos anticuerpos dio como resultado el rechazo tumoral más significativo. Respectivamente, en los grupos tratados con anti-CTLA-4, 4-1BB o los dos anticuerpos, 1/7, 2/7, 5/7 ratones nunca desarrollaron tumores, mientras que todos los ratones del grupo no tratado desarrollaron tumores. Puesto que el anticuerpo anti-CTLA-4 humano es de origen murino, el impacto del anticuerpo 4-1BB no puede atribuirse a su supresión de anticuerpos contra anticuerpos terapéuticos anti-CTLA-4. Por otra parte, los datos de los presentes inventores también demostraron que el efecto superior de la terapia de combinación probablemente será aplicable a la inmunoterapia basada en anticuerpos anti-CTLA-4 humano.

Para someter a ensayo si los ratones tratados con doble anticuerpo eran inmunes a una mayor exposición a células tumorales, los presentes inventores los expusieron a células tumorales 110 días después de su primera exposición a células tumorales. Como se muestra en la FIG. 64B, los cinco ratones tratados con anticuerpos dobles que habían rechazado las células tumorales en la primera ronda permanecieron exentos de tumores, mientras que los ratones de control sin tratamiento previo tuvieron un crecimiento tumoral progresivo. Por lo tanto, la terapia de combinación también indujo una inmunidad duradera contra las células cancerosas.

Uno de los obstáculos a la inmunoterapia basada en proteínas es la inmunidad del hospedador a las proteínas terapéuticas. En el caso de los anticuerpos, el hospedador puede producir anticuerpos contra epítopos xenotípicos, alotípicos e idiotípicos.81 La respuesta xenotípica puede eliminarse mediante una humanización completa, aunque otras respuestas de anticuerpos requieren consideraciones especiales. El obstáculo es más obvio para el anticuerpo anti-CTLA-4, ya que es un adyuvante en sí mismo. El trabajo anterior de Mittler et al. demostró una supresión significativa de la respuesta inmunitaria humoral dependiente de linfocitos T.83 Los datos de los presentes inventores demuestran que la coadministración de anticuerpos anti-4-1BB reduce las respuestas del hospedador al anticuerpo anti-CTLA-4, lo que sugiere otra ventaja de la terapia de combinación usando anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-4-1BB.

Considerados en conjunto, los datos de los presentes inventores datos demuestran que la terapia de combinación con anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-4-1BB ofrece tres ventajas principales, concretamente, un mayor efecto en la inmunidad frente al cáncer, supresión mutua de los efectos secundarios autoinmunitarios y mejora de las respuestas de anticuerpos.

Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la presente memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en la misma medida que si se indicara que cada publicación individual o solicitud de patente se incorpora específica e individualmente por referencia en su totalidad. Aunque la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que puede tener modificaciones adicionales y la presente solicitud está destinada abarcar cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo las desviaciones de la presente divulgación que se dan en la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y que pueden aplicarse a las características esenciales expuestas anteriormente en el presente documento.

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Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CTLA4 capaz de unirse a CTLA4 humano que comprende: una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 64, una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 71 y una región Fc de IgG1 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CTLA4 de la reivindicación 1, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable del mismo.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto.

4. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 3, que comprende además usar un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos anti-PD-1 y anti-4-1BB.

5. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 4, en donde los anticuerpos anti-PD-1 o anti-4-1BB y el anticuerpo anti-CTLA4 se combinan en una única molécula en forma de anticuerpos biespecíficos.