ES2979314T3 - L-asparaginasa modificada - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína modificada que es una combinación de (i) una L-asparaginasa y (ii) uno o más (poli)péptidos, en donde el (poli)péptido consiste únicamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina. La proteína modificada se puede formar de varias maneras, incluyendo la conjugación química entre la L-asparaginasa y los (poli)péptidos o expresando la proteína modificada como una proteína de fusión. También se proporcionan en este documento ácidos nucleicos que codifican la proteína modificada, vectores y/o células huésped que los comprenden, así como procesos para su producción. Se describen composiciones que comprenden la proteína modificada y su uso en medicina, particularmente en el tratamiento del cáncer. En otro aspecto de la invención, la L-asparaginasa se puede derivar de Erwinia y/o tiene al menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

L-asparaginasa modificada

La presente invención se refiere a una proteína modificada que es una proteína de fusión de una L-asparaginasa y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente de residuos de aminoácidos prolina y alanina, y en donde dicho polipéptido consiste en de 100 a 600 residuos de aminoácidos prolina y alanina. La proteína modificada puede formarse de varias maneras, incluyendo la conjugación química entre la L-asparaginasa y los polipéptidos o expresando la proteína modificada como una proteína de fusión. También se proporcionan en la presente ácidos nucleicos que codifican la proteína modificada, vectores y/o células huésped que los contienen, así como procesos para su producción. Se divulgan composiciones que comprenden la proteína modificada y su uso en medicina, particularmente en el tratamiento del cáncer. En otro aspecto de la invención, la L-asparaginasa puede derivarse deErwiniay/o tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Las proteínas con actividad de L-asparagina aminohidrolasa, conocidas comúnmente como L-asparaginasas, se han usado con éxito para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) en niños durante muchos años. La ALL es el cáncer maligno infantil más común (Avramis (2005) Clin. Pharmacokinet. 44, 367-393).

La L-asparaginasa también se ha usado para tratar la enfermedad de Hodgkin, la leucemia mielocítica aguda, la leucemia mielomonocítica aguda, la leucemia linfocítica crónica, el linfosarcoma, el reticulosarcoma y el melanosarcoma (Kotzia (2007) J. Biotechnol. 127, 657-669). Se cree que la actividad antitumoral de la L-asparaginasa se debe a la incapacidad o capacidad reducida de ciertas células malignas para sintetizar la L-asparagina(Id).Estas células malignas dependen de un suministro extracelular de L-asparagina. Sin embargo, la enzima L-asparaginasa cataliza la hidrólisis de L-asparagina en ácido aspártico y amoníaco, agotando de este modo las reservas circulantes de L-asparagina y matando a las células tumorales que no pueden realizar la síntesis de proteínas sin L-asparagina (Id).

La L-asparaginasa deE. colifue el primer fármaco enzimático usado en la terapia para la ALL y se ha comercializado como Elspar® en Estados Unidos o como Kidrolase® y L-asparaginasa Medac® en Europa. También se han aislado L-asparaginasas de otros microorganismos, por ejemplo, una proteína L-asparaginasa deErwinia chrysanthemi,denominada crisantaspasa, que se ha comercializado como Erwinase® (Wriston (1985) Meth. Enzymol.

113, 608-618; Goward (1992)). También se han identificado L-asparaginasas de otras especies deErwinia,incluyendo, por ejemplo,Erwinia chrysanthemi3937 (N° de Registro del Genbank AAS67028),Erwinia chrysanthemiNCPPB 1125 (N° de Registro del Genbank CAA31239),Erwinia carotovora(N° de Registro del Genbank AAP92666), yErwinia carotovorasubsp. artroseptica (N° de Registro del Genbank AAS67027). Estas L-asparaginasas deErwinia chrysanthemitienen aproximadamente un 91-98% de identidad de secuencia de aminoácidos entre sí, mientras que las L-asparaginasas deErwinia carotovoratienen aproximadamente un 75-77% de identidad de secuencia de aminoácidos con las L-asparaginasas deErwinia chrysanthemi(Kotzia (2007) J. Biotechnol. 127, 657-669).

Las L-asparaginasas de origen bacteriano tienen un alto potencial inmunogénico y antigénico y con frecuencia provocan reacciones adversas que van desde una reacción alérgica leve hasta un choque anafiláctico en pacientes sensibilizados (Wang (2003) Leukemia 17, 1583-1588). La L-asparaginasa deE. colies particularmente inmunogénica, y los informes sobre la presencia de anticuerpos antiasparaginasa contra la L-asparaginasa deE. colidespués de su administración intravenosa o intramuscular alcanzan hasta el 78% en adultos y el 70% en niños(Id).

Las L-asparaginasas deEscherichia ColiyErwinia chrysanthemidifieren en sus propiedades farmacocinéticas y tienen perfiles inmunogénicos distintos, respectivamente (Klug Albertsen (2001) Brit. J. Haematol.

115, 983-990). Además, se ha demostrado que los anticuerpos que se desarrollan después de un tratamiento con L-asparaginasa deE. colino reaccionan de manera cruzada con la L-asparaginasa deErwinia(Wang (2003) Leukemia 17, 1583-1588). Por tanto, la L-asparaginasa deErwinia(crisantaspasa) se ha usado como tratamiento de segunda línea de la ALL en pacientes que reaccionan a la L-asparaginasa deE. coli(Duval (2002); Avramis (2005) Clin. Pharmacokinet. 44, 367-393).

En otro intento de reducir la inmunogenicidad asociada a la administración de L-asparaginasas microbianas, se ha desarrollado una L-asparaginasa deE. colimodificada con metoxi-polietilenglicol (mPEG). Esta denominada mPEG-L-asparaginasa, o pegaspargasa, comercializada como Oncaspar® (Enzon Inc.), fue aprobada por primera vez en los Estados Unidos para el tratamiento de segunda línea de la ALL en 1994, y ha sido aprobada para terapia de primera línea de la ALL en niños y adultos desde 2006. La WO 2011/003633 A1 divulga un conjugado de una L-asparaginasa de Erwinia y polietilenglicol con un peso molecular menor o igual a aproximadamente 5000 Da.

Oncaspar® es una L-asparaginasade E. colique ha sido modificada en múltiples residuos de lisina usando mPEG-succinimidil succinato (SS-PEG) de 5 kDa (Patente de Estados Unidos N° 4.179.337). El SS-PEG es un reactivo de PEG de primera generación que contiene un enlace éster inestable que es sensible a la hidrólisis por enzimas o a valores de pH ligeramente alcalinos (Patente de Estados Unidos N° 4.670.417). Estas propiedades disminuyen la estabilidad tantoin vitrocomoin vivoy pueden afectar a la seguridad del fármaco.

Además, se ha demostrado que los anticuerpos desarrollados contra la L-asparaginasa deE. colireaccionan de manera cruzada con Oncaspar® (Wang (2003) Leukemia 17, 1583-1588). Aunque estos anticuerpos no eran neutralizantes, este descubrimiento demostró claramente el alto potencial de hipersensibilidad cruzada o inactivación cruzadain vivo.De hecho, en un informe, el 30-41% de los niños que recibieron pegaspargasa presentaron una reacción alérgica(Id).

Además de las reacciones alérgicas externas, recientemente se ha informado del problema de la "hipersensibilidad silenciosa", por la que los pacientes desarrollan anticuerpos antiasparaginasa sin mostrar ninguna evidencia clínica de una reacción de hipersensibilidad (Wang (2003) Leukemia 17, 1583-1588). Esta reacción puede dar como resultado la formación de anticuerpos neutralizantes contra la L-asparaginasa deE. coliy la pegaspargasa; sin embargo, a estos pacientes no se les cambia a la L-asparaginasa deErwiniaporque no hay signos externos de hipersensibilidad, y por lo tanto reciben una duración más corta de tratamiento eficaz (Holcenberg (2004) J. Pediatr. Hematol. Oncol. 26, 273-274).

El tratamiento con L-asparaginasa deErwinia chrysanthemise usa a menudo en caso de hipersensibilidad a las L-asparaginasasderivadas de E. coli.Sin embargo, se ha observado que tantos como un 30-50% de los pacientes que reciben L-asparaginasa deErwiniason positivos para anticuerpos (Avramis (2005), Clin. Pharmacokinet. 44, 367 393). Además, como la L-asparaginasa deErwinia chrysanthemitiene una semivida de eliminación más corta que las L-asparaginasas deE. coli,debe administrarse con más frecuencia(Id).En un estudio de Avramiset. al,la asparaginasa deErwinia seasoció a perfiles farmacocinéticos inferiores (Avramis (2007), J. Pediatr. Hematol. Oncol.

29, 239-247). Por lo tanto, la L-asparaginasa deE. coliy la pegaspargasa han sido las terapias de primera línea preferidas para la ALL frente a la L-asparaginasa de Erwinia.

Se han PEGilado y comercializado con éxito durante muchos años numerosos biofármacos. Sin embargo, en muchos casos, los biofármacos PEGilados muestran una actividad significativamente reducida en comparación con el biofármaco no modificado. En el caso de la L-asparaginasa deErwinia carotovora,se ha observado que la PEGilación redujo su actividad in vitro a aproximadamente un 57% (Kuchumova (2007) Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 1,230-232). La L-asparaginasa deErwinia carotovorasólo tiene aproximadamente un 75% de homología con la L-asparaginasa deErwinia chrysanthemi(crisantaspace). En el caso de Oncaspar® también se sabe que su actividadin vitroes de aproximadamente el 50% en comparación con la L-asparaginasa deE. colino modificada.

Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es la provisión de medios y métodos para tratar el cáncer, como la leucemia o el linfoma no Hodgkin, que evite las limitaciones y desventajas de las terapias del estado de la técnica, particularmente de algunas asparaginasas PEGiladas.

El problema técnico se resuelve mediante la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a una proteína modificada que comprende una L-asparaginasa y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la proteína modificada es una proteína de fusión de la L-asparaginasa y el polipéptido, y en donde dicho polipéptido consiste en de 100 a 600 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. En un aspecto preferido, la invención se refiere a una proteína modificada que comprende una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una proteína modificada que comprende una L-asparaginasa recombinante que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina. Las explicaciones y definiciones proporcionadas en la presente en relación con los términos "proteína modificada", "L-asparaginasa", "(poli)péptido(s)" y similares proporcionados en la presente se aplican mutatis mutandis. El término "L-asparaginasa recombinante" como se usa en la presente se refiere a una forma recombinante de L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de una L-asparaginasa de Erwinia nativa. El término "recombinante" puede referirse a una L-asparaginasa producida recombinantemente, por ejemplo, una L-asparaginasa producida en una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica la L-asparaginasa.

Además, las proteínas modificadas presentan una mayor semivida plasmática y, por tanto, una duración de acción prolongada en comparación con la L-asparaginasa no conjugada respectiva. Esto permite reducir la frecuencia de dosificación y, por tanto, la carga de efectos secundarios. La invención también proporciona procesos de preparación de las proteínas modificadas descritas en la presente.

En ciertos aspectos, la invención se refiere a una proteína modificada que comprende (i) una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 y (ii) un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina. Se entiende que el término "consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina" significa que hay por lo menos un residuo de prolina y por lo menos un residuo de alanina, es decir, debe haber tanto por lo menos un residuo de prolina como por lo menos un residuo de alanina. En un aspecto preferido, la invención se refiere a una proteína modificada que comprende (i) una L-asparaginasa recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 y (ii) un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina. En un aspecto, la L-asparaginasa es un tetrámero (es decir, la L-asparaginasa está compuesta por cuatro subunidades o monómeros). Una subunidad o monómero ejemplar tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

En un aspecto, el polipéptido media una inmunogenicidad disminuida de la proteína modificada descrita en la presente, por ejemplo, una inmunogenicidad disminuida de la proteína modificada en comparación con la L-asparaginasa no conjugada.

Como se muestra en los ejemplos adjuntos, la proteína P A# 1 (200)-Crisantaspasa tenía un 109% y la proteína PA#1 (400)-Crisantaspasa tenía un 118% de actividad enzimática en comparación con la Crisantaspasa no modificada; ver el Ejemplo 5. Esto demuestra que la fusión de asparaginasas como se describe en la presente con polipéptidos no afecta a la actividad enzimática. Sorprendentemente, la actividad incluso aumentó con la longitud del polipéptido PA.

De manera más general, las proteínas modificadas proporcionadas en la presente tienen la misma o sustancialmente la misma actividad (enzimática) en comparación con la asparaginasa no modificada. La actividad (enzimática) puede evaluarse mediante el ensayo de Nessler. Los detalles del ensayo de Nessler se proporcionan en los ejemplos adjuntos y/o se divulgan en el estado de la técnica, por ejemplo, Mashburn (1963) Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 50. Por consiguiente, en un aspecto, las proteínas modificadas proporcionadas en la presente tienen la misma o sustancialmente la misma actividad (enzimática) en comparación con la asparaginasa no modificada según se evalua mediante un ensayo de Nessler. El término "asparaginasa no modificada", como se usa en la presente, se refiere a una asparaginasa nativa, es decir, una asparaginasa que no está modificada por fusión/conjugación con (poli)péptidos, como se define en la presente.

Por ejemplo, una "asparaginasa no modificada" es una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. En un aspecto preferido, una "asparaginasa no modificada" es una L-asparaginasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1.

En algunos aspectos, las proteínas modificadas proporcionadas en la presente tienen una actividad (enzimática) mayor que la de la L-asparaginasa no modificada. La actividad (enzimática) puede evaluarse, por ejemplo, mediante el ensayo de Nessler. Los detalles del ensayo de Nessler se proporcionan en los ejemplos adjuntos y/o se divulgan en el estado de la técnica, por ejemplo, Mashburn (1963) Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 50. Por consiguiente, en un aspecto, las proteínas modificadas proporcionadas en la presente tienen una actividad (enzimática) mayor que la de la L-asparaginasa no modificada evaluada mediante un ensayo de Nessler. El término "asparaginasa no modificada" como se usa en la presente se refiere a una asparaginasa nativa, es decir, una asparaginasa que no está modificada por fusión/conjugación con (poli)péptidos como se define en la presente. Por ejemplo, una "asparaginasa no modificada" es una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. En un aspecto preferido, una "asparaginasa no modificada" es una L-asparaginasa que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1. Por ejemplo, las proteínas modificadas tienen una actividad (enzimática) que puede ser por lo menos un 5% y/o hasta un 30% (por ejemplo, por lo menos un 10%, 15%, 20%, 25,%, (o más) mayor que la de la L-asparaginasa, particularmente mayor que la de la L-asparaginasa no modificada, particularmente según se evalúa mediante el ensayo de Nessler. Las explicaciones anteriores se aplican en particular a las proteínas de fusión proporcionadas en la presente (por ejemplo, proteína modificada de L-asparaginasa y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina), pero no se limitan a las mismas.

En algunos aspectos, las proteínas modificadas tienen una actividad de asparaginasa o actividad de glutaminasa mayor que la de la L-asparaginasa no modificada. Por ejemplo, las proteínas modificadas pueden tener una actividad de asparaginasa o actividad de glutaminasa de por lo menos un 5% y/o hasta un 30% (por ejemplo, por lo menos un 10%, 15%, 20%, 25%, (o más) mayor que la de la L-asparaginasa, en particular mayor que la de la L-asparaginasa no modificada, en particular evaluada mediante el ensayo de Nessler. En algunas realizaciones, la actividad de asparaginasa o actividad de glutaminasa puede medirse mediante un ensayo de Nessler. La tasa de hidrólisis de la asparagina puede determinarse midiendo el amoníaco liberado, y la cantidad de amoníaco liberado al usar las proteínas modificadas divulgadas en la presente puede compararse con la cantidad liberada al usar la L-asparaginasa o la L-asparaginasa no modificada. En aspectos adicionales, dichas proteínas modificadas tienen una actividad de agotamiento de L-asparagina más alta que la de la L-asparaginasa no modificada. Por ejemplo, las proteínas modificadas tienen una actividad de agotamiento de L-asparagina de por lo menos un 5% y/o hasta un 30% (por ejemplo, por lo menos un 10%, 15%, 20%, 25%, (o más)) mayor que la de la L-asparaginasa, particularmente mayor que la de la L-asparaginasa no modificada, particularmente según se evalúa mediante el ensayo de Nessler. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada, y la proteína modificada o la composición farmacéutica para su uso en terapia, o para su uso como medicamento, o para su uso en medicina.

Generalmente, una proteína modificada puede obtenerse por acoplamiento químico o por fusión genética (en el caso de la conjugación con otra proteína o péptido). El término "proteína de fusión", como se usa en la presente, se refiere principalmente a una proteína modificada que comprende (i) una L-asparaginasa y (ii) uno o más polipéptidos, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina. En este contexto, el polipéptido puede consistir en de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. La secuencia de aminoácidos ejemplar de tales polipéptidos se muestra en la SEQ ID NO: 7 o 9.

Si la proteína modificada se obtiene por acoplamiento químico, comprende (i) una L-asparaginasa y (ii) uno o más péptidos, en donde el péptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina. En este contexto, el péptido puede consistir en un total de entre 10 y 100 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de aproximadamente 15 a 45 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, por ejemplo, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, por ejemplo, 20 residuos de aminoácidos de prolina y alanina o 40 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. Las secuencias de aminoácidos ejemplares de tales péptidos son AAPAAPAPAAPAAPAPA (SEQ ID NO:5) o AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAAPAAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 15).

El término "proteína modificada", como se usa en la presente, puede usarse indistintamente con el término "conjugado", en particular si el término "proteína modificada" se refiere a una proteína modificada obtenida por acoplamiento químico o como una proteína de fusión, es decir, principalmente si comprende (i) una L-asparaginasa y (ii) uno o más (poli)péptidos, en donde el (poli)péptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina. De igual manera, en la presente los términos "no modificado" y "no conjugado" pueden usarse indistintamente.

La invención también se refiere a un proceso de preparación de la proteína modificada, que comprende (a) acoplar un péptido activado de la fórmula RN - (P/A)- RC-act, en donde RC-act es una forma activada con carboxi de RC, en donde RC y (P/A) son como se definen en la proteína modificada que se va a preparar, y en donde RN es un grupo protector que se une al grupo amino N-terminal de (P/A), con L-asparaginasa para obtener una proteína modificada de la L-asparaginasa y péptidos en los que RN es un grupo protector.

En los ejemplos adjuntos (ver el Ejemplo 1, Tabla 1) se ha demostrado que la proteína modificada puede prepararse usando una variedad de relaciones de masa del péptido activado y la asparaginasa. Por ejemplo, pueden usarse relaciones de masa de 10:1 (péptido activado: asparaginasa), 7,5:1, 5:1 o 3,5:1. Se observó que la actividad (enzimática) del modificado era mayor si se utilizaba una relación de 5:1 o menor (ver el Ejemplo 1, Tabla 2). Por tanto, en el proceso descrito anteriormente puede ser ventajoso usar una relación de masa de péptido activado: asparaginasa de 5:1 o menor, por ejemplo, 5:1,4:1,3,5:1 o 3:1. El término "relación de masa" como se usa en la presente se refiere a la relación del peso molecular del péptido activado como se define en la presente y de la asparaginasa como se define en la presente (por ejemplo, asparaginasa como se muestra en la SEQ ID NO: 1 y proteínas con por lo menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 1). El "peso molecular" se indica típicamente en la presente usando la unidad científica Dalton (Da). Es bien sabido que la unidad de peso molecular de la asparaginasa o del péptido, como se indica en la presente en dalton (Da), es un nombre alternativo para la unidad de masa atómica unificada (u). Así, un peso molecular de, por ejemplo, 500 Da equivale a 500 g/mol. El término "kDa" (kilodalton) se refiere a 1000 Da.

El peso molecular de la asparaginasa o del péptido puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica, como, por ejemplo, espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas por ionización por electrospray, ESI-MS, o espectrometría de masas por desorción/ionización de láser asistida por matriz, MALDI-MS), electroforesis en gel (por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida usando dodecil sulfato de sodio, SDS-PAGE), métodos hidrodinámicos (por ejemplo, filtración en gel / cromatografía de exclusión por tamaño, SEC, o sedimentación en gradiente), o dispersión de luz dinámica (DLS) o estática (por ejemplo, dispersión de luz multiángulo, MALS), o el peso molecular de la asparaginasa o el péptido puede calcularse a partir de la secuencia de aminoácidos conocida (y las modificaciones postraduccionales conocidas, si las hay) de la asparaginasa o el péptido. Preferiblemente, el peso molecular de la asparaginasa o el péptido se determina usando espectrometría de masas.

La invención también se refiere a un proceso para la preparación de la proteína modificada o de un ácido nucleico que codifica la proteína modificada. En algunos aspectos, el proceso comprende producir una L-asparaginasa en un huésped seleccionado del grupo que comprende levaduras, tales comoSaccharomyces cerevisiaeyPichia Pistoris,así como bacterias, actinomicetos, hongos, algas y otros microorganismos, incluyendoEscherichia coli, Bacillussp.,Pseudomonas fluorescens, Corynebacterium glutamicumy huéspedes bacterianos de los siguientes géneros Serratia, Proteus, Acinetobacter y Alcaligenes. Los expertos en la materia conocen otros huéspedes, que incluyenNocardiopsis alba,que expresa una variante de la asparaginasa que carece de actividad de glutaminasa (Meena et al. (2014) Bioprocess Biosyst. Eng. Artículo de Octubre de 2014, y los divulgados en Savitri et al. (2003) Indian Journal of Biotechnology, 2, 184-194.

La proteína modificada puede ser una proteína de fusión que comprende (i) una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 y (ii) uno o más polipéptidos, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina.

Los residuos de prolina en el polipéptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina pueden constituir más de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 70% del polipéptido. Por consiguiente, se prefiere que del 10% al 70% del número total de residuos de aminoácidos del polipéptido sean residuos de prolina; más preferiblemente, del 20% al 50% del número total de residuos de aminoácidos comprendidos en el polipéptido sean residuos de prolina; e incluso más preferiblemente, del 30% al 40% (por ejemplo, el 30%, 35% o 40%) del número total de residuos de aminoácidos comprendidos en el polipéptido sean residuos de prolina.

El polipéptido puede comprender una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde dicha repetición consiste en residuos de prolina y alanina y en donde no más de 6 residuos de aminoácidos consecutivos son idénticos. En particular, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos AAPAAPAPAAPAAPAPA (SEQ ID NO:5) o versiones circulares permutadas o (a) multímeros de las secuencias en su totalidad o partes de la secuencia.

Preferiblemente, el polipéptido comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 7 o 9, o el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la SEQ ID NO:8 o 10. En la presente se prefiere que la proteína modificada (a) comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en la SEQ ID NO: 11 o 13; o (b) comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tenga una secuencia de nucleótidos como la que se muestra en la SEQ ID NO: 12 o 14. En un aspecto, el polipéptido es un polipéptido de espiral aleatoria.

En algunos aspectos, la proteína modificada, por ejemplo la proteína de fusión, tiene una actividad de asparaginasa o glutaminasa mayor que la de la L-asparaginasa no conjugada. Por ejemplo, las proteínas modificadas pueden tener una actividad de asparaginasa o glutaminasa de por lo menos un 5% y/o hasta un 30% (por ejemplo, por lo menos un 10%, 15%, 20%, 25%, (o más) mayor que la de la L-asparaginasa no modificada, en particular según se evalúa mediante el ensayo de Nessler. En aspectos adicionales, la L-asparaginasa en la proteína modificada está enlazada covalentemente a un residuo terminal del polipéptido directamente por un enlace amino, y/o la proteína de fusión se fabrica de manera recombinante. En aspectos preferidos, la proteína modificada, por ejemplo la proteína de fusión, incluye un conector entre la L-asparaginasa y el polipéptido. Un conector ejemplar puede ser un residuo de aminoácido alanina. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada o su uso en terapia, o para su uso como medicamento, o para su uso en medicina.

La invención también se refiere a un ácido nucleico que codifica la proteína modificada, particularmente una proteína de fusión como se define en la presente. Preferiblemente, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12 o 14; (b) la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos como se define en (a); y (c) la molécula de ácido nucleico degenerada como resultado del código genético a la secuencia de nucleótidos como se define en (a).

Un aspecto de la invención se refiere además a un proceso para la preparación de una proteína modificada como se define en la presente o de un ácido nucleico como se define en la presente. El proceso puede comprender cultivar la célula huésped como se define en la presente y aislar dicha proteína modificada del cultivo o de dicha célula. El proceso de preparación de la proteína modificada como se define en la presente, en particular la proteína de fusión, puede comprender cultivar una célula huésped transformada con o que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína modificada, en particular la proteína de fusión, en condiciones que provocan la expresión de la proteína modificada, en particular de la proteína de fusión. En algunos aspectos, la célula huésped se selecciona del grupo mencionado anteriormente.

La invención se refiere además a la proteína modificada de acuerdo con la invención o a una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina en un paciente, dicho método comprendiendo administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de la proteína modificada, en donde la enfermedad que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina es un cáncer. La proteína modificada como se define en la presente puede provocar una respuesta inmunogénica menor en el paciente en comparación con la L-asparaginasa no conjugada, puede tener una semivida circulantein vivomás larga después de una única dosis en comparación con la L-asparaginasa no conjugada, y/o puede tener un valor de AUC mayor después de una única dosis en comparación con la L-asparaginasa (en particular la L-asparaginasa no conjugada).

El problema a resolver por la invención puede considerarse como la provisión de una preparación de L-asparaginasa con: alta bioactividadin vitro; un enlace modificador de proteínas estable; semividain vivoprolongada; inmunogenicidad significativamente reducida, como se evidencia, por ejemplo, por la reducción o eliminación de una respuesta de anticuerpos contra la preparación de L-asparaginasa después de administraciones repetidas; y/o utilidad como terapia de segunda línea para pacientes que han desarrollado sensibilidad a terapias de primera línea usando, por ejemplo, L-asparaginasas no derivadas deE. coli.

Este problema se resuelve de acuerdo con la presente invención mediante las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones, en particular proporcionando una proteína modificada que comprende una L-asparaginasa y un modificador, es decir, un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina, en donde la proteína modificada es una proteína de fusión de la L-asparaginasa y el polipéptido, y en donde dicho polipéptido consiste en de 100 a 600 residuos de aminoácidos prolina y alanina, y proporcionando métodos para preparar y usar la misma.

En un aspecto, en la presente se describe una L-asparaginasa modificada con propiedades farmacológicas mejoradas en comparación con la proteína L-asparaginasa no modificada.

El término "L-asparaginasa modificada", como se usa en la presente, se refiere a "una proteína modificada que comprende (i) L-asparaginasa y (ii) un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la proteína modificada es una proteína de fusión de la L-asparaginasa y el polipéptido, y en donde dicho polipéptido consiste en de 100 a 600 residuos de aminoácidos de prolina y alanina", como se define y describe en la presente. En un aspecto de la invención, la L-asparaginasa se deriva deErwiniaque tiene por lo menos un 85% de identidad con el aminoácido de la SEQ ID NO: 1.

La L-asparaginasa modificada descrita en la presente, por ejemplo, L-asparaginasa conjugada o fusionada con uno o más (poli)péptidos, en donde el (poli)péptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina, sirve como agente terapéutico particularmente para su uso en pacientes que muestran hipersensibilidad (por ejemplo, una reacción alérgica o hipersensibilidad silenciosa) al tratamiento con L-asparaginasa o L-asparaginasa PEGilada deErwiniay/oE. coli.,o L-asparaginasa no modificada deErwinia.La L-asparaginasa modificada descrita en la presente también es útil como agente terapéutico para su uso en pacientes que han experimentado una recaída de la enfermedad, por ejemplo, una recaída de ALL, y que han sido tratados previamente con otra forma de asparaginasa.

LaErwinia chrysanthemi(también conocida comoPectobacterium chrysanthemi)ha pasado a denominarseDickeya chrysanthemi.Por lo tanto, en la presente los términosErwinia chrysanthemi, Pectobacterium chrysanthemiyDickeya chrysanthemise usan indistintamente.

A menos que se defina expresamente lo contrario, los términos usados en la presente se entenderán según su significado ordinario en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "que incluye" significa "que incluye, sin limitación", y los términos usados en singular incluirán el plural, y viceversa, a menos que el contexto indique lo contrario.

Como se usan en la presente, los términos "que comprende", "que incluye", "que tiene" o las variantes gramaticales de los mismos se entenderán en el sentido de que especifican las características, los números enteros, los pasos o los componentes indicados, pero no excluyen la adición de una o más características, números enteros, pasos, componentes o grupos adicionales de los mismos. Los términos "que comprende"/"que incluye"/"que tiene" engloban los términos "que consiste en" y "que consiste esencialmente en". Por tanto, siempre que se usen los términos "que comprende"/"que incluye"/"que tiene", pueden sustituirse por "que consiste esencialmente en" o, preferiblemente, por "que consiste en".

Los términos "que comprende"/"que incluye"/"que tiene" significan que puede haber cualquier componente adicional (o de igual manera características, números enteros, pasos y similares).

El término "que consiste en" significa que no puede haber ningún componente adicional (o de igual manera características, números enteros, pasos y similares).

El término "que consiste esencialmente en" o variantes gramaticales del mismo, cuando se usa en la presente, debe entenderse como una especificación de las características, números enteros, pasos o componentes indicados, pero no excluye la adición de una o más características, números enteros, pasos, componentes o grupos de los mismos adicionales, pero sólo si las características, números enteros, pasos, componentes o grupos de los mismos adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas del producto, composición, dispositivo o método reivindicado y similares.

Por tanto, el término "que consiste esencialmente en" significa que puede haber presentes componentes adicionales específicos (o de igual manera características, enteros, pasos y similares), concretamente aquellos que no afecten materialmente a las características esenciales del producto, composición, dispositivo o método. En otras palabras, el término "que consiste esencialmente en" (que puede usarse indistintamente en la presente con el término "que comprende sustancialmente"), permite la presencia de otros componentes en el producto, composición, dispositivo o método, además de los componentes obligatorios (o de igual manera características, números enteros, etapas y similares), siempre que las características esenciales del producto, composición, dispositivo o método no se vean afectadas materialmente por la presencia de otros componentes.

Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10%, a menos que se indique lo contrario.

Como se usa en la presente, "un" o "uno" puede significar uno o más.

Como se usa en la presente, el término "enfermedad que puede tratarse por agotamiento de asparagina" se refiere a una afección o trastorno en el que las células implicadas o responsables de la afección o trastorno o carecen o tienen una capacidad reducida para sintetizar L-asparagina. El agotamiento o privación de L-asparagina puede ser parcial o sustancialmente completa (por ejemplo, a niveles indetectables usando métodos y aparatos conocidos en la técnica).

Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de una proteína (por ejemplo, asparaginasa o proteína modificada de la misma), requerida para producir un efecto terapéutico deseado.

Como se usa en la presente, el término "L-asparaginasa" es una enzima con actividad de L-asparagina aminohidrolasa. La actividad enzimática de la L-asparaginasa puede incluir no sólo la desamidación de la asparagina a ácido aspártico y amoníaco, sino también la desamidación de la glutamina a ácido glutámico y amoníaco. Las asparaginasas están compuestas típicamente por cuatro monómeros (aunque se ha informado de algunas con cinco o seis). Cada monómero puede tener de aproximadamente 32.000 a aproximadamente 36.000 daltons.

En la técnica se han identificado muchas proteínas L-asparaginasa, aisladas por métodos conocidos a partir de microorganismos. (Ver, por ejemplo, Savitri y Azmi, Indian J. Biotechnol 2 (2003) 184-194). Las L-asparaginasas más ampliamente usadas y disponibles comercialmente se derivan deE. colio deErwinia chrysanthemi,que comparten ambas una homología estructural del 50% o menos.

Lo siguiente se refiere a la "L-asparaginasa" que se usará de acuerdo con la invención. Dentro de la especieErwinia,se ha informado de una identidad de secuencia típica del 75-77% entre las enzimas derivadas deErwinia chrysanthemiyErwinia carotovora,y se ha encontrado una identidad de secuencia de aproximadamente el 90% entre diferentes subespecies deErwinia chrysanthemi(Kotzia (2007), Journal of Biotechnology 127, 657-669). Algunas L-asparaginasas representativas deErwiniaincluyen, por ejemplo, las que se proporcionan en la Tabla 1 a continuación, que divulga el porcentaje de identidad de secuencia con la Erwinia Chrysanthemi NCPPB 1066:

Las L-asparaginasas ejemplares usadas en terapia son la L-asparaginasa aislada deE. coliy deErwinia,específicamente,Erwinia chrysanthemi.

Las L-asparaginasas pueden ser enzimas nativas aisladas de los microorganismos. También pueden producirse mediante tecnologías de enzimas recombinantes en microorganismos productores como E. coli. Como ejemplos, la proteína usada en la proteína modificada de la invención puede ser una proteína recombinante producida en una cepa deE. coli,preferiblemente una proteína de una especie deErwinia,en particularErwinia chrysanthemi,producida en una cepa de E.colirecombinante.

Las enzimas pueden identificarse por sus actividades específicas. Esta definición incluye, por tanto, todos los polipéptidos que tienen la actividad específica definida también presentes en otros organismos, más particularmente en otros microorganismos. A menudo, las enzimas con actividades similares pueden identificarse mediante su agrupación en ciertas familias definidas como PFAM o COG. La PFAM (base de datos de alineamientos de familias de proteínas y modelos ocultos de Markov.; pfam.sanfferac.ukl) representa una gran colección de alineaciones de secuencias de proteínas. Cada PFAM permite visualizar alineaciones múltiples, ver dominios de proteínas, evaluar la distribución entre organismos, acceder a otras bases de datos y visualizar estructuras de proteínas conocidas. Los COG (Clústeres de grupos ortólogos de proteínas; vv-ww.nebi.nlm.nih.gov/COG/) se obtienen comparando secuencias de proteínas de 43 genomas completamente secuenciados que representan 30 líneas filogenéticas principales. Cada COG se define a partir de por lo menos tres líneas, lo que permite identificar dominios conservados anteriores.

Los medios para identificar el porcentaje de identidad de secuencia son bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen en particular los programas BLAST, que pueden usarse desde el sitio web blast.ncbi.olo.nih.govBlast.cgi con los parámetros por defecto indicados en dicho sitio web. A continuación, las secuencias obtenidas pueden explotarse (por ejemplo, alinearse) usando, por ejemplo, el programa CLUSTALW (ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html) con los parámetros por defecto. Usando las referencias dadas en GenBank para genes conocidos, los expertos en la técnica pueden determinar los genes equivalentes en otros organismos, cepas bacterianas, levaduras, hongos, mamíferos, plantas, etc. Este trabajo rutinario se realiza ventajosamente usando secuencias consenso que pueden determinarse llevando a cabo alineamientos de secuencias con genes derivados de otros microorganismos, y diseñando sondas degeneradas para clonar el gen correspondiente en otro organismo.

Los expertos en la técnica comprenderán cómo seleccionar y diseñar proteínas que conserven sustancialmente su actividad de L-asparaginasa. Un enfoque para medir la actividad de la L-asparaginasa es el ensayo de Nessler como se describe en Mashburn (1963) Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 50.

En un aspecto particular de la proteína modificada de la invención, la L-asparaginasa tiene por lo menos aproximadamente un 85% de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, más específicamente por lo menos aproximadamente un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 como se expone en el listado de secuencias adjunto. En la presente los términos "homología" e "identidad de secuencia" se usan indistintamente.

El término "que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1" (por ejemplo, si la L-asparaginasa tiene un 100% de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1) significa que la secuencia de aminoácidos de la asparaginasa puede no limitarse estrictamente a la SEQ ID NO:1, sino que puede contener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos adicionales. En otras palabras, si la L-asparaginasa que se va a usar en la presente tiene un 100% de homología o identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, la L-asparaginasa puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. El término "que comprende" significa en este contexto que la secuencia de aminoácidos de la L-asparaginasa de la SEQ ID NO: 1 puede contener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos adicionales.

En un aspecto particular, la proteína es la L-asparaginasa deErwinia chrysanthernique comprende o consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto, la L-asparaginasa es deErwinia chrysanthemiNCPPB 1066 (N° de Registro del Genbank CAA32884), con o sin péptidos señal y/o secuencias líder.

Dentro de la definición de la L-asparaginasa usada en la proteína modificada de la invención también están comprendidos los fragmentos de la L-asparaginasa, preferiblemente la L-asparaginasa de la SEQ ID NO:1. El término "un fragmento de asparaginasa" (por ejemplo, un fragmento de la asparaginasa de la SEQ ID NO:1) significa que la secuencia de la asparaginasa puede incluir menos aminoácidos que en las asparaginasas ejemplificadas en la presente (por ejemplo, la asparaginasa de la SEQ ID NO:1) pero aun así suficientes aminoácidos para conferir actividad de L-aminohidrolasa. Por ejemplo, el "fragmento de asparaginasa" es un fragmento que es/consiste en por lo menos aproximadamente 150 o 200 aminoácidos contiguos de una de las asparaginasas ejemplificadas en la presente (por ejemplo la asparaginasa de la SEQ ID NO: 1) (por ejemplo aproximadamente 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 321,322, 323, 324, 325, 326 aminoácidos contiguos) y/o en donde dicho fragmento tiene hasta 50 aminoácidos eliminados del extremo N-terminal de dicha asparaginasa ejemplificada en la presente (por ejemplo, la asparaginasa de la SEQ ID NO:1) (por ejemplo hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50) y/o tiene hasta 75 o 100 aminoácidos eliminados del extremo C-terminal de dicha asparaginasa ejemplificada en la presente (por ejemplo, la asparaginasa de la SEQ ID NO:1) (por ejemplo hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100) y/o ha eliminado aminoácidos tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal de dicha asparaginasa ejemplificada en la presente (por ejemplo, la asparaginasa de la SEQ ID NO:1), en donde el número total de aminoácidos eliminados puede ser de hasta 125 o 150 aminoácidos.

Es bien sabido en la técnica que un polipéptido puede modificarse mediante sustitución, inserción, eliminación y/o adición de uno o más aminoácidos a la vez que se conserva su actividad enzimática. El término "uno o más aminoácidos" en este contexto puede referirse a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos. Por ejemplo, es común la sustitución de un aminoácido en una posición dada por un aminoácido químicamente equivalente que no afecte a las propiedades funcionales de una proteína. Las sustituciones pueden definirse como intercambios dentro de uno de los siguientes grupos:

• Residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

• Residuos polares, cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln

• Residuos polares, cargados positivamente: His, Arg, Lys

• Residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, Ile, Val, Cys

• Residuos aromáticos grandes: Phe, Tyr, Trp.

Por tanto, cabe esperar que los cambios que dan como resultado la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro (como el ácido glutámico por el ácido aspártico) o de un residuo cargado positivamente por otro (como la lisina por la arginina) produzcan un producto funcionalmente equivalente.

Las posiciones en las que se modifican los aminoácidos y el número de aminoácidos sujetos a modificación en la secuencia de aminoácidos no están particularmente limitados. El experto en la técnica es capaz de reconocer las modificaciones que pueden introducirse sin afectar a la actividad de la proteína. Por ejemplo, puede esperarse que en ciertas circunstancias las modificaciones en la porción N- o C-terminal de una proteína no alteren la actividad de una proteína. Con respecto a las asparaginasas, en particular, se ha realizado una gran caracterización, particularmente con respecto a las secuencias, las estructuras y los residuos que forman el sitio catalítico activo. Esto proporciona orientación con respecto a los residuos que pueden modificarse sin afectar a la actividad de la enzima. Todas las L-asparaginasas conocidas de origen bacteriano tienen características estructurales comunes. Todas son homotetrámeros con cuatro sitios activos entre los dominios N- y C-terminales de dos monómeros adyacentes (Aghaipour (2001)). Todas tienen un alto grado de similitud en sus estructuras terciarias y cuaternarias (Papageorgiou (2008) FEBS J. 275, 4306-4316). Las secuencias de los sitios catalíticos de las L-asparaginasas están muy conservadas entre L-asparaginasa II deErwinia chrysanthemi, Erwinia carotovorayE. coli (Id).El giro flexible del sitio activo contiene los residuos de aminoácidos 14-33, y los análisis estructurales muestran que Thr15, Thr95, Ser62, Glu63, Asp96 y A1 a120 contactan con el ligando(Id).Aghaipour et al. han realizado un análisis detallado de los cuatro sitios activos de la L-asparaginasa deErwinia chrysanthemiexaminando estructuras cristalinas de alta resolución de la enzima formando complejo con sus sustratos (Aghaipour (2001)). Kotzia et al. proporcionan secuencias de L-asparaginasas de varias especies y subespecies deErwiniay, a pesar de que las proteínas solo tienen aproximadamente un 75-77% de identidad entreErwinia chrysanthemiyErwinia carotovora,cada una de ellas tienen todavía actividad L-asparaginasa (Kotzia (2007) J. Biotechnol. 127, 657-669). Moola et al realizaron estudios de mapeo de epítopos de la L-asparaginasa de Erwinia chrysanthemi 3937 y pudieron conservar la actividad enzimática incluso después de mutar varias secuencias antigénicas en un intento de reducir la inmunogenicidad de la asparaginasa (Moola (1994) Biochem. J. 302, 921-927). En vista de la extensiva caracterización que se ha realizado de las L-asparaginasas, un experto en la técnica podría determinar cómo realizar fragmentos y/o sustituciones de secuencias conservando la actividad enzimática.

Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" que modifica, por ejemplo, las dimensiones, volúmenes, cantidad de un ingrediente en una composición, concentraciones, temperatura de proceso, tiempo de proceso, rendimientos, caudales, presiones y valores similares, e intervalos de los mismos, se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede producirse, por ejemplo, a través de procedimientos típicos de medición y manipulación usados para elaborar compuestos, composiciones, concentrados o formulaciones de uso; a través de errores involuntarios en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los materiales de partida o ingredientes usados para llevar a cabo los métodos; y consideraciones similares. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren debido al envejecimiento de, por ejemplo, una composición, formulación o cultivo celular con una concentración o mezcla inicial particular, y cantidades que difieren debido al mezclado o procesamiento de una composición o formulación con una concentración o mezcla inicial particular. Ya estén modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones adjuntas a la presente incluyen equivalentes a estas cantidades. El término "aproximadamente" puede referirse además a un intervalo de valores que son similares al valor de referencia indicado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 por ciento o menos del valor de referencia indicado.

En el contexto de la presente invención, se ha descubierto sorprendentemente que la conjugación química de uno o más péptidos que consisten exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina a través de un residuo de aminoácido C-terminal específico (RC) con L-asparaginasa permite proporcionar una proteína modificada con L-asparaginasa que tiene una relación de acoplamiento particularmente alta de dichos péptidos por molécula de asparaginasa y, por tanto, una inmunogenicidad considerablemente reducida y una semivida en plasma mejorada. Además, se ha descubierto que esta novedosa técnica también puede aplicarse a la L-asparaginasa sin afectar a su actividad catalítica, lo que aumenta enormemente el valor terapéutico de las proteínas modificadas correspondientes descritas en la presente.

En un aspecto, se describe en la presente una proteína modificada que comprende (i) una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 y (ii) uno o más péptidos, en donde el péptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina.

En un aspecto preferido, la proteína modificada es una proteína modificada de L-asparaginasa y uno o más péptidos, en donde cada uno es independientemente un péptido RN-(P/A)-RC, en donde (P/A) es una secuencia de aminoácidos que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina, en donde RN es un grupo protector unido al grupo amino N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y en donde RC es un residuo de aminoácido unido mediante su grupo amino al grupo carboxi C-terminal de la secuencia de aminoácidos, en donde cada péptido se conjuga con la L-asparaginasa mediante un enlace amida formado a partir del grupo carboxi del residuo de aminoácido C-terminal RC del péptido y un grupo amino libre de la L-asparaginasa, y en donde por lo menos uno de los grupos amino libres a los que se conjugan los péptidos no es un grupo a-amino N-terminal de la L-asparaginasa.

En algún aspecto, el monómero de la proteína modificada tiene de aproximadamente 350, 400, 450, 500, aminoácidos a aproximadamente 550, 600, 650, 700, o 750 aminoácidos después de la modificación. En aspectos adicionales, la proteína modificada tiene de aproximadamente 350 a aproximadamente 750 aminoácidos, o de aproximadamente 500 a aproximadamente 750 aminoácidos.

Cada péptido comprendido en la proteína modificada como se describe en la presente es independientemente un péptido RN-(P/A)-RC. Por consiguiente, para cada uno de los péptidos comprendidos en una proteína modificada descrita en la presente, el grupo protector N-terminal RN, la secuencia de aminoácidos (P/A), y el residuo de aminoácido C-terminal RC se seleccionan cada uno independientemente de sus significados respectivos. Por tanto, los dos o más péptidos comprendidos en la proteína modificada pueden ser iguales, o pueden ser diferentes entre sí. En un aspecto, todos los péptidos comprendidos en la proteína modificada son iguales.

Además, los péptidos comprendidos en la proteína modificada adoptan preferiblemente una conformación en espiral aleatoria, particularmente cuando la proteína modificada está presente en un entorno acuoso (por ejemplo, una solución acuosa o un tampón acuoso). La presencia de una conformación en espiral aleatoria puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica, en particular por medio de técnicas espectroscópicas, como la espectroscopia de dicroísmo circular (CD).

La fracción (P/A) en la proteína modificada químicamente conjugada, que está comprendida en el péptido RN-(P/A)-RC, es una secuencia de aminoácidos que puede consistir en un total de entre 10 y 100 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, un total de entre 15 y 60 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, un total de entre 15 y 45 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, por ejemplo, un total de 20 a aproximadamente 40 residuos de aminoácidos prolina y alanina, por ejemplo 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, o 45 residuos de aminoácidos prolina y alanina. En un aspecto preferido, dicha secuencia de aminoácidos consiste en 20 residuos de aminoácidos prolina y alanina. En otro aspecto preferido, dicha secuencia de aminoácidos consiste en 40 residuos de aminoácidos prolina y alanina. En el péptido RN-(P/A)-RC, la relación entre el número de residuos de prolina comprendidos en la fracción (P/A) y el número total de residuos de aminoácidos comprendidos en (P/A) es preferiblemente >10% y <70%, más preferiblemente >20% y <50%, y aún más preferiblemente >25% y <40%. Por consiguiente, se prefiere que del 10% al 70% del número total de residuos de aminoácidos en (P/A) sean residuos de prolina; más preferiblemente, del 20% al 50% del número total de residuos de aminoácidos comprendidos en (P/A) sean residuos de prolina; y aún más preferiblemente, del 25% al 40% (por ejemplo, el 25%, 30%, 35% o 40%) del número total de residuos de aminoácidos comprendidos en (P/A) sean residuos de prolina. Además, se prefiere que (P/A) no contenga ningún residuo de prolina consecutivo (es decir, que no contenga ninguna secuencia parcial PP). En un aspecto preferido, (P/A) es la secuencia de aminoácidos AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID n O:5). En otro aspecto preferido, (P/A) es la secuencia de aminoácidos AAPAAPAPAAPAAPAAPAAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPA (SEQ ID NO:15).

El grupo RN en el péptido RN-(P/A)-RC puede ser un grupo protector que se une al grupo amino N-terminal, en particular al grupo a-amino N-terminal, de la secuencia de aminoácidos (P/A). Se prefiere que RN sea piroglutamoilo o acetilo.

El grupo RC en el péptido RN-(P/A)-RC es un residuo de aminoácido que está unido a través de su grupo amino al grupo carboxi C-terminal de (P/A), y que comprende por lo menos dos átomos de carbono entre su grupo amino y su grupo carboxi. Se entenderá que los por lo menos dos átomos de carbono entre el grupo amino y el grupo carboxilo de RC pueden proporcionar una distancia de por lo menos dos átomos de carbono entre el grupo amino y el grupo carboxi de RC (que es el caso si, por ejemplo, RC es un ácido w-amino-C3-15 alcanoico, como el ácido £-aminohexanoico). Se prefiere que RC sea ácido £-aminohexanoico.

En una realización, el péptido es Pga-AAPAAPAPAAPAPAAPA-Ahx-COOH (SEQ ID NO: 16) o Pga-AAPAAPAPAAPAAPAAAPAPAAPAPAAPAAPA-Ahx-COOH (SEQ ID NO: 17). El término "Pga" es una abreviatura de "piroglutamoil" o "ácido piroglutámico". El término "Ahx" es una abreviatura de "ácido £-aminohexanoico".

Como también se demuestra en los ejemplos adjuntos, sorprendentemente se ha descubierto que el uso de un residuo de aminoácido C-terminal RC como se define en la presente, incluyendo en particular el ácido £-aminohexanoico, permite proporcionar proteínas modificadas con una relación de acoplamiento ventajosamente alta de péptidos que consisten exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina por molécula de asparaginasa y, por tanto, una inmunogenicidad ventajosamente reducida y una semivida en plasma ventajosamente mejorada.

En las proteínas modificadas descritas en la presente, cada péptido RN-(P/A)-RC, puede conjugarse con la L-asparaginasa mediante un enlace amida formado a partir del grupo carboxi del residuo de aminoácido C-terminal RC del péptido y un grupo amino libre de la L-asparaginasa. Un grupo amino libre de la L-asparaginasa puede ser, por ejemplo, un grupo a-amino N-terminal o un grupo amino de cadena lateral de la L-asparaginasa (por ejemplo, un grupo £-amino de un residuo de lisina comprendido en la L-asparaginasa). Si la L-asparaginasa está compuesta de múltiples subunidades, por ejemplo, si la L-asparaginasa es un tetrámero, puede haber múltiples grupos a-amino N-terminales (es decir, uno en cada subunidad). En un aspecto, pueden conjugarse químicamente a la L-asparaginasa (por ejemplo, a cada subunidad/monómero de la L-asparaginasa) de 9 a 13 péptidos como se define en la presente (por ejemplo, 9, 11, 12 o 13 péptidos).

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, por lo menos uno de los grupos amino libres, a los que se conjugan químicamente los péptidos, no es (es decir, es diferente de) un grupo a-amino N-terminal de la L-asparaginasa. Por consiguiente, se prefiere que por lo menos uno de los grupos amino libres con los que se conjugan los péptidos sea un grupo amino de cadena lateral de la L-asparaginasa, y se prefiere particularmente que por lo menos uno de los grupos amino libres con los que se conjugan los péptidos sea un grupo £-amino de un residuo de lisina de la L-asparaginasa.

Además, se prefiere que los grupos amino libres, con los que se conjugan los péptidos, se seleccionen entre el grupo o grupos £-amino de cualquier residuo o residuos de lisina de la L-asparaginasa, el grupo o grupos a-amino N-terminal de la L-asparaginasa o de cualquier subunidad o subunidades de la L-asparaginasa, y cualquier combinación de los mismos. Se prefiere particularmente que uno de los grupos amino libres, al que se conjugan los péptidos, sea un grupo a-amino N-terminal, mientras que el otro o los otros de los grupos amino libres, al que se conjugan los péptidos, sea o sean cada uno un grupo £-amino de un residuo de lisina de la L-asparaginasa. Alternativamente, se prefiere que cada uno de los grupos amino libres, a los que se conjugan los péptidos, sea un grupo £-amino de un residuo de lisina de la L-asparaginasa.

Las proteínas modificadas como se describen en la presente pueden estar compuestas de L-asparaginasa y uno o más péptidos como se define en la presente. Una proteína modificada correspondiente puede, por ejemplo, consistir en una L-asparaginasa y uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 (o más) péptidos que están cada uno conjugado con la L-asparaginasa. La L-asparaginasa puede ser, por ejemplo, una proteína monomérica o una proteína compuesta de múltiples subunidades, por ejemplo, un tetrámero. Si la L-asparaginasa es una proteína monomérica, una proteína modificada correspondiente puede, por ejemplo, consistir en una L-asparaginasa monomérica y de nueve a trece (o más) (por ejemplo, 9, 10, 11, 12 o 13), péptidos que están conjugados cada uno con la L-asparaginasa monomérica. En la SEQ ID NO.1 se muestra una secuencia de aminoácidos ejemplar de una L-asparaginasa monomérica. Si la L-asparaginasa es una proteína compuesta de múltiples subunidades, por ejemplo, de cuatro subunidades (es decir, si dicha L-asparaginasa es un tetrámero), una proteína modificada correspondiente puede, por ejemplo, consistir en cuatro subunidades de L-asparaginasa y de nueve a trece (o más) (por ejemplo, 9, 10, 11, 12 o 13), péptidos como se define en la presente que se conjugan cada uno con cada subunidad de la L-asparaginasa. En la SEQ ID NO.1 se muestra una secuencia de aminoácidos ejemplar de una subunidad de L-asparaginasa. De igual manera, si la L-asparaginasa es una proteína compuesta de múltiples subunidades, por ejemplo, de cuatro subunidades (es decir, si dicha L-asparaginasa es un tetrámero), una proteína modificada correspondiente puede, por ejemplo, consistir en cuatro subunidades de L-asparaginasa y 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36. 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 (o más) péptidos que están cada uno conjugados con el tetrámero de L-asparaginasa. En un aspecto, la invención se refiere a una proteína modificada que tiene una L-asparaginasa y múltiples secuencias peptídicas químicamente unidas. En un aspecto adicional, la longitud de las secuencias peptídicas es de aproximadamente 10 a aproximadamente 100, de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40.

El péptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina puede estar enlazado covalentemente a uno o más aminoácidos de dicha L-asparaginasa, como residuos de lisina y/o residuo N-terminal, y/o el péptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina puede estar enlazado covalentemente a por lo menos de aproximadamente un 40, 50, 60, 70, 80 o 90% a aproximadamente un 60, 70, 80, 90 o 100% de los grupos amino accesibles incluyendo grupos amino de residuos de lisina y/o residuo N-terminal en la superficie de la L-asparaginasa. Por ejemplo, puede haber aproximadamente de 11 a 12 residuos de lisina a los que puede acceder la L-asparaginasa, y aproximadamente de 9 a 12 lisinas se conjugarían con el péptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina. En aspectos adicionales, el péptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina está enlazado covalentemente a de aproximadamente un 20, 30, 40, 50 o 60% a aproximadamente un 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% del total de residuos de lisina de dicha L-asparaginasa. En realizaciones adicionales, el péptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina está enlazado covalentemente a la L-asparaginasa mediante un conector. Los conectores ejemplares incluyen conectores divulgados en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2015/0037359.

Además, dicha proteína modificada puede tener una semivida de por lo menos aproximadamente 5, 10, 12, 15, 24, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas a una dosis de aproximadamente 25 pg de proteína/kg, y/o una semivida circulante in vivo más larga en comparación con la L-asparaginasa no modificada. Además, dicha proteína modificada puede tener una mayor área bajo la curva de concentración-tiempo en plasma del fármaco (AUC) en comparación con la L-asparaginasa.

La proteína modificada de acuerdo con la presente invención puede prepararse usando métodos conocidos en la técnica. En particular, puede prepararse usando el proceso descrito a continuación, y/o de acuerdo con o en analogía con los procedimientos descritos en los ejemplos.

La invención se refiere además a un proceso de preparación de una proteína modificada como se define en la presente, el proceso comprende: (a) acoplar un péptido activado de la fórmula RN-(P/A)-RC-act, en donde RC-act es una forma activada por carboxi de RC, en donde RC y (P/A) son como se definen en la proteína modificada que se va a preparar, y en donde RN es un grupo protector que se une al grupo amino N-terminal de (P/A), con L-asparaginasa para obtener una proteína modificada de la L-asparaginasa y péptidos en la que RN es un grupo protector.

El residuo de aminoácido C-terminal activado por carboxi RC-act, que está comprendido en el péptido activado, puede ser cualquier residuo de aminoácido RC, como se describe y define en la presente con respecto al péptido, en donde el grupo carboxi de RC está en forma de un grupo carboxi activado. Preferiblemente, el grupo carboxi activado del residuo de aminoácido RC-act en el péptido activado es un grupo éster activo.

Si el grupo carboxi activado de RC-act es un grupo éster activo, preferiblemente se selecciona entre cualquiera de los siguientes grupos éster activos:

Un grupo éster activo particularmente preferido es un grupo éster activo de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt). Por consiguiente, se prefiere especialmente que el grupo carboxi activado de RC-act sea un grupo de la siguiente fórmula:

El proceso puede comprender además, antes del paso a), un paso adicional de conversión de un péptido de la fórmula RN-(P/A)-RC, en donde RC y (P/A) son como se definen en la proteína modificada que se va a preparar, y en donde RN es un grupo protector que está unido al grupo amino N-terminal de (P/A), en el péptido P/A activado.

Por ejemplo, para obtener un péptido activado que tenga un grupo éster activo de 1 -hidroxibenzotriazol como grupo carboxi activado de RC-act, el paso de convertir el péptido en el péptido activado puede realizarse haciendo reaccionar el péptido con una sal de un éster de fosfonio, uronio o imonio de 1 -hidroxibenzotriazol (HOBt) en presencia de una base. La sal del derivado de fosfonio, uronio o imonio del HOBt es preferiblemente tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU).

El paso de acoplamiento (a) y el paso opcional anterior de convertir un péptido en un péptido activado pueden realizarse, por ejemplo, usando cualquiera de los procedimientos de acoplamiento de péptidos o de formación de enlaces amida descritos en la bibliografía, por ejemplo, en cualquiera de: El-Faham et al., 2011 Chem Rev. 111(11), 6557-6602; Montalbetti et al., 2005 Tetrahedron, 61(46), 10827-10852; Klose et al., 1999 Chem. Commun. 18, 1847 1848; Valeur et al., 2007; Carpino et al., 1995 J. Am. Chem. Soc. 117(19), 5401-5402);; Valeur et al., 2009 Chem. Soc.

Rev., 38(2), 606-631; o Hermanson, 2013 Bioconjugate techniques. Tercera edición. Academic press. Los reactivos y las condiciones de reacción adecuados para tales procedimientos se describen con más detalle en la bibliografía mencionada anteriormente y en las referencias adicionales citadas en la misma. Descripciones adicionales se encuentran en las Patentes de Estados Unidos N° 8.563.521; 9.260.494; y 9.221.882.

Los procedimientos para eliminar los grupos protectores RN, como se requiere en el paso opcional (b), son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Wuts et al., 2012 Greene's Protective Groups in Organic Synthesis. Cuarta Edición. John Wiley & Sons y/o en Isidro-Llobet et al., 2009 Chem. Rev. 109(6), 2455-2504. El paso opcional (b) puede por tanto realizarse, por ejemplo, como se describe para el grupo protector RN correspondiente en cualquiera de las referencias mencionadas con anterioridad.

En algunos aspectos, la invención se refiere a una proteína modificada que comprende (i) una L-asparaginasa que tiene por lo menos un 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:1 y (ii) y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos de prolina y alanina. La proteína modificada es una proteína de fusión. El polipéptido que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina puede tener una longitud de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 residuos de aminoácidos prolina y alanina. En otras palabras, el polipéptido puede consistir en de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 residuos de aminoácidos prolina y alanina. En un aspecto preferido, el polipéptido consiste en un total de aproximadamente 200 (por ejemplo 201) residuos de aminoácido prolina y alanina (es decir, tiene una longitud de aproximadamente 200 (por ejemplo 201) residuos de aminoácido prolina y alanina) o el polipéptido consiste en un total de aproximadamente 400 (por ejemplo 401) residuos de aminoácido prolina y alanina (es decir, tiene una longitud de aproximadamente 400 (por ejemplo 401) residuos de aminoácido prolina y alanina). En algunas realizaciones preferidas, el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:7 o 9; o el polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO:8 o 10. En algunos aspectos, la proteína modificada, preferiblemente en donde la proteína modificada es una proteína de fusión, y cada monómero tiene de aproximadamente 350, 400, 450, 500, aminoácidos a aproximadamente 550, 600, 650, 700, 750 o 1.000 aminoácidos incluyendo el monómero y la secuencia de aminoácidos P/A. En aspectos adicionales, la proteína modificada tiene de aproximadamente 350 a aproximadamente 800 aminoácidos o de aproximadamente 500 a aproximadamente 750 aminoácidos.

Por ejemplo, el polipéptido incluye los péptidos preparados en la Patente de Estados Unidos N° 9.221.882.

En un aspecto preferido, la proteína modificada (a) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 11 o 13; o (b) comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12 o 14. Se contempla en la presente que la proteína modificada comprende (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 11 o 13; (b) una proteína como se define en (a) en donde se eliminan, insertan, añaden o sustituyen de uno a 65 aminoácidos en la asparaginasa; (c) una proteína codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12 o 14; (d) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con la cadena complementaria de moléculas de ácido nucleico como se define en (c); (e) una proteína que tiene por lo menos un 85% de identidad con la proteína de cualquiera de (a) a (d); y (f) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico como se define en (c) o (d).

La proteína modificada como se define en la presente puede estar compuesta de cuatro subunidades, en donde las subunidades se seleccionan del grupo que consiste en (a) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:1; (b) una proteína como se define en (a) en donde se eliminan, insertan, añaden o sustituyen en la asparaginasa de uno a 65 aminoácidos; (c) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2; (d) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con la cadena complementaria de moléculas de ácido nucleico como se define en (c); (e) una proteína que tiene por lo menos un 85% de identidad con la proteína de cualquiera de (a) a (d); y (f) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico como se define en (c) o (d).

La invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la proteína modificada de acuerdo con la invención. La proteína modificada es una proteína de fusión. En un aspecto preferido, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: a) el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12 o 14; b) el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos como se define en a); y c) el ácido nucleico degenerado como resultado del código genético a la secuencia de nucleótidos como se define en a).

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión, incluyendo una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 85, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con la secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12 o 14. Mientras que el polipéptido codificado comprende una secuencia de aminoácidos repetitiva que puede formar una espiral aleatoria, el ácido nucleico codificante comprende preferiblemente secuencias de nucleótidos poco repetitivas. En otras palabras, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido rico en PA, en donde dicha secuencia de nucleótidos codificante comprende repeticiones de nucleótidos que tienen una longitud máxima de 14, 15, 16, 17, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50 o aproximadamente 55 nucleótidos. El ácido nucleico poco repetitivo como se divulga en la presente puede ser ventajoso en comparación con las moléculas de ácido nucleico altamente repetitivas. En particular, puede mejorarse la estabilidad genética de las moléculas de ácido nucleico poco repetitivas que se usen en la presente.

En algunos aspectos, la secuencia de nucleótidos es una secuencia que codifica cualquiera de las proteínas modificadas de acuerdo con la invención, excepto que se añade, elimina, inserta o sustituye uno o más aminoácidos, con la condición de que la proteína de fusión que tenga esta secuencia de aminoácidos tenga actividad de L-asparaginasa.

En aspectos adicionales, la invención se refiere a un vector (recombinante) que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína modificada de acuerdo con la invención. En aspectos adicionales, la invención también se refiere a un huésped que comprende el vector (recombinante) descrito en la presente. El huésped puede ser levaduras, comoSaccharomyces cerevisiaeyPichia Pistoris,así como bacterias, actinomicetos, hongos, algas y otros microorganismos, incluyendoEscherichia coli, Bacillussp.,Pseudomonas fluorescens, Corynebacteríum glutamicumy huéspedes bacterianos de los siguientes géneros Serratia, Proteus, Acinetobacter y Alcaligenes. Los expertos en la técnica conocen otros huéspedes, comoNocardiopsis alba,que expresa una variante de la asparaginasa que carece de actividad de glutaminasa (Meena et al. (2014) Bioprocess Biosyst. Eng. Artículo de Octubre de 2014), y los divulgados en Savitri et al. (2003) Indian Journal of Biotechnology, 2, 184-194.

La presente invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico como se ha descrito en la presente anteriormente, es decir, un ácido nucleico que codifica la proteína modificada de acuerdo con la invención. En un aspecto preferido, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: (a) el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12 o 14; (b) el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos como se define en (a); y (c) el ácido nucleico degenerado como resultado del código genético a la secuencia de nucleótidos como se define en (a).

La invención se refiere a una célula huésped que comprende el ácido nucleico como se define en la presente o que comprende el vector como se define en la presente. Los ejemplos de huéspedes se enumeran más arriba.

La invención se refiere además a un proceso de preparación de la proteína modificada como se describe en la presente, preferiblemente la proteína de fusión, o del ácido nucleico que codifica la misma. El proceso puede comprender cultivar una célula huésped como se define en la presente y aislar dicha proteína modificada del cultivo o de dicha célula. El proceso puede comprender el cultivo de una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped transformada con o una célula huésped que comprende el ácido nucleico y/o un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína modificada (preferiblemente la proteína de fusión) en una condición que provoca la expresión de la proteína modificada (preferiblemente la proteína de fusión). Los ejemplos de huéspedes se enumeran más arriba.

Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados. La elección de un vector adecuado depende de la función deseada, incluyendo plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados convencionalmente en ingeniería genética.

Para construir varios plásmidos pueden usarse métodos bien conocidos por los expertos en la técnica; ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los vectores plasmídicos típicos incluyen, por ejemplo, pQE-12, la serie pUC de plásmidos, pBluescript (Stratagene), la serie pET de vectores de expresión (Novagen) o pCRTOPO (Invitrogen), lambda gt11, pJOE, la serie pBBR1-MCS, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1. Los vectores típicos compatibles con la expresión en células de mamífero incluyen el sistema de vectores E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a), pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, Okayama-Berg vector de expresión de ADNc pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pcDNA3.1, pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), pEAK-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) y pCINeo (Promega). Ejemplos no limitativos de vectores plasmídicos adecuados paraPichia pastoriscomprenden, por ejemplo, los plásmidos pAO815, pPIC9K y pPIC3.5K (todos ellos de Invitrogen).

Generalmente, los vectores pueden contener uno o más orígenes de replicación (ori) y sistemas de herencia para clonación o expresión, uno o más marcadores para selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión. Ejemplos de orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, el ColE1 de longitud completa, sus versiones truncadas como las presentes en los plásmidos pUC, los orígenes de replicación viral SV40 y del fago M13. Ejemplos no limitativos de marcadores seleccionables incluyen ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina, dhfr, gpt, neomicina, higromicina, blasticidina o geneticina. Además, dicho vector comprende una secuencia reguladora que está enlazada operativamente a dicha secuencia de nucleótidos o a la molécula de ácido nucleico definida en la presente.

La secuencia o secuencias codificantes, por ejemplo, dicha secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, comprendida en el vector puede estar enlazada a (a) un elemento o elementos reguladores transcripcionales y/o a otras secuencias codificantes de aminoácidos usando métodos establecidos. Tales secuencias reguladoras son bien conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, sin carácter limitativo, secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción, sitios de entrada ribosómica interna (IRES) y, opcionalmente, elementos reguladores que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Ejemplos no limitativos de tales secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción comprenden promotores, un codón de inicio de la traducción, potenciadores, aislantes y/o elementos reguladores que aseguran la terminación de la transcripción. Ejemplos adicionales incluyen secuencias de Kozak y secuencias intermedias flanqueadas por sitios donantes y aceptores para el corte y empalme de ARN, secuencias de ácido nucleico que codifican señales de secreción o, dependiendo del sistema de expresión usado, secuencias de señalización capaces de dirigir la proteína expresada a un compartimento celular o al medio de cultivo.

Ejemplos de promotores adecuados incluyen, sin ser limitativos, el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor del SV40, el promotor del RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor de lacZ, el promotor de la p-actina del pollo, el promotor de CAG (una combinación del promotor de la p-actina del pollo y el potenciador inmediatotemprano del citomegalovirus), el promotor del factor de elongación 1a humano, el promotor de AOX1, el promotor de GAL1, el promotor de CaM-quinasa, el promotor de lac, trp o tac, el promotor de lacUV5, el promotor de T7 o T5, el promotor poliédrico del virus de la poliedrosis nuclear múltiple deAutographa californica(AcMNPV) o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales. Un ejemplo de potenciador es, por ejemplo, el potenciador SV40. Ejemplos no limitativos adicionales de elementos/secuencias reguladoras que aseguran la terminación de la transcripción incluyen el sitio poli-A del SV40, el sitio poli-A de tk o las señales de poliadenilación poliédricas del AcMNPV.

Además, dependiendo del sistema de expresión, pueden añadirse a la secuencia codificante del ácido nucleico proporcionado en la presente secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o de secretarlo al medio. La secuencia o secuencias líder se ensamblan en el marco con las secuencias de traducción, inicio y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder es capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de la misma, al espacio periplásmico o al medio extracelular. Las secuencias líder adecuadas son, por ejemplo, las secuencias señal de BAP (fosfatasa alcalina bacteriana), CTB (subunidad B de la toxina del cólera), DsbA, ENX, OmpA, PhoA, stII, OmpT, PelB, Tat (translocación de arginina gemela) enE. coli,y las secuencias señal de la hormona de crecimiento bovina, quimotripsinógeno humano, factor VIII humano, ig-kappa humana, insulina humana, interleucina-2 humana, luciferasa deMetridaoVargula,tripsinógeno-2 humano, inulinasa deKluyveromyces marxianus,factor de apareamiento alfa-1 deSaccharomyces cerevisiae,mellitina, azurocidina humana y similares en células eucariotas.

Los vectores también pueden contener una secuencia de ácido nucleico expresable adicional que codifique una o más chaperonas para facilitar el plegamiento correcto de las proteínas.

En algunos aspectos, el vector de la presente invención es un vector de expresión. Un vector de expresión es capaz de dirigir la replicación y la expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y la secuencia de nucleótidos que codifica la asparaginasa.

Las moléculas de ácido nucleico y/o los vectores descritos en la presente pueden diseñarse para su introducción en células mediante, por ejemplo métodos no químicos (electroporación, sonoporación, transfección óptica, electrotransferencia génica, suministro hidrodinámico o transformación de origen natural tras entrar en contacto las células con la molécula de ácido nucleico de la invención), métodos basados en productos químicos (fosfato de calcio, DMSO, PEG, liposomas, DEAE-dextrano, polietilenimina, nucleofección, etc.), métodos basados en partículas (pistola génica, magnetofección, impalefección), métodos basados en vectores de fagos o fagémidos y métodos virales. Por ejemplo, pueden usarse vectores de expresión derivados de virus como los retrovirus, el virus vaccinia, el virus adenoasociado, los virus del herpes, el virus del bosque de Semliki o el virus del papiloma bovino para administrar las moléculas de ácido nucleico a una población celular diana.

La presente invención también se refiere a una célula huésped o un huésped no humano transformado con un vector o el ácido nucleico descrito en la presente. Se apreciará que el término "célula huésped o huésped no humano transformado con el vector" se refiere a una célula huésped o huésped no humano que comprende el vector o el ácido nucleico como se describe en la presente. Las células huésped para la expresión de polipéptidos son bien conocidas en la técnica y comprenden tanto células procariotas como eucariotas. En la técnica se conocen los medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huésped descritas anteriormente.

"Cultivar el huésped o célula huésped" incluye la expresión de la proteína modificada, incluso como proteína de fusión, como se define en la presente y/o del polipéptido como se define en la presente y/o de la asparaginasa en el huésped o célula huésped.

Los métodos para el aislamiento de la proteína modificada y/o del polipéptido como se define en la presente y/o de la asparaginasa comprenden, sin limitación, pasos de purificación como cromatografía de afinidad (preferiblemente usando una etiqueta de fusión como la etiquetaStrepII o la etiqueta His6), filtración en gel (cromatografía de exclusión por tamaño), cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), HPLC de fase inversa, precipitación con sulfato de amonio o inmunoprecipitación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y generalmente se han descrito, por ejemplo, en Scopes (1994) Protein Purification - Principles and Practice, Springer. Tales métodos proporcionan polipéptidos sustancialmente puros. Dichos polipéptidos puros tienen una homogeneidad, preferiblemente, de por lo menos aproximadamente del 90 al 95% (a nivel proteico), más preferiblemente, por lo menos aproximadamente del 98 al 99%. Más preferiblemente, estos polipéptidos puros son adecuados para uso/aplicaciones farmacéuticas.

Se prevé en la presente que, una proteína modificada que comprende L-asparaginasa y el polipéptido puede prepararse expresando la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y la secuencia de ácido nucleico que codifica la asparaginasa. La proteína modificada expresada puede aislarse. Alternativamente, la proteína modificada puede prepararse cultivando/criando el huésped que comprende la secuencia de nucleótidos o la molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido que consiste exclusivamente de prolina y alanina. Por tanto, el ácido nucleico se expresa en el huésped. El polipéptido producido puede aislarse. El polipéptido producido puede conjugarse con la asparaginasa, por ejemplo, mediante un enlace peptídico o un enlace no peptídico.

Las proteínas modificadas descritas en la presente pueden usarse en el tratamiento de una enfermedad que puede tratarse por agotamiento de asparagina. La enfermedad que puede tratarse por agotamiento de asparaginas es preferiblemente cáncer, como cáncer no sólido. Preferiblemente, el cáncer no sólido es leucemia o linfoma no Hodgkin. Preferiblemente, la leucemia es una leucemia linfoblástica aguda (ALL) o una leucemia mieloide aguda (AML). Por ejemplo, las proteínas modificadas son útiles en el tratamiento o la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) tanto en adultos como en niños o la leucemia mieloide aguda (AML) tanto en adultos como en niños. Se contempla el uso de las proteínas modificadas descritas en la presente en el tratamiento de otras afecciones en las que se espera que la agotamiento de asparagina tenga un efecto útil. Tales afecciones incluyen, pero no se limitan a: enfermedades malignas o cánceres, incluyendo pero no limitadas a enfermedades malignas hematológicas, linfoma NK, cáncer de páncreas, enfermedad de Hodgkin, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfosarcoma, reticulosarcoma, melanosarcoma y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). El cáncer puede ser un cáncer sólido, por ejemplo, cáncer de pulmón o cáncer de mama. Las enfermedades hematológicas no malignas representativas que responden al agotamiento de asparagina incluyen enfermedades hematológicas mediadas por el sistema inmunitario, por ejemplo, enfermedades infecciosas como las provocadas por la infección por VIH (es decir, SIDA). Las enfermedades no hematológicas asociadas con la dependencia de la asparagina incluyen enfermedades autoinmunes, por ejemplo artritis reumatoide, SLE, enfermedades autoinmunes, vasculares del colágeno, etc. Otras enfermedades autoinmunes incluyen la osteoartritis, el síndrome de Issac, la psoriasis, la diabetes mellitus insulinodependiente, la esclerosis múltiple, la panencefalitis esclerosante, el lupus eritematoso sistémico, la fiebre reumática, la enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn), la cirrosis biliar primaria, la hepatitis crónica activa, la glomerulonefritis, la miastenia gravis, el pénfigo vulgar y la enfermedad de Graves. Las células sospechosas de provocar la enfermedad pueden probarse para determinar la dependencia de asparagina en cualquier ensayoin vitrooin vivoadecuado, por ejemplo, un ensayoin vitroen el que el medio de crecimiento carece de asparagina.

La invención se refiere además a una proteína modificada de acuerdo con la invención o a una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina en un paciente, dicho método comprendiendo administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de la proteína modificada, en donde la enfermedad que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina es un cáncer. En algunos aspectos preferidos, dicha enfermedad que puede tratarse mediante agotamiento de L-asparagina es leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML) o linfoma no Hodgkin. En algunos aspectos, dicha enfermedad que puede tratarse mediante agotamiento de L-asparagina es un cáncer que incluye, pero no se limita a, linfoma NK y cáncer de páncreas. En realizaciones adicionales, la proteína modificada descrita en la presente provoca una respuesta inmunogénica menor en dicho paciente en comparación con la L-asparaginasa de dicha proteína modificada.

En algunos aspectos, la proteína modificada descrita anteriormente tiene una semivida circulatoriain vivomás larga después de una única dosis en comparación con la L-asparaginasa no modificada de dicha proteína modificada. La proteína modificada descrita en la presente puede reducir los niveles en plasma de L-asparagina durante un periodo de tiempo de por lo menos aproximadamente 12, 24, 48, 72, 96 o 120 horas cuando se administra a una dosis de 5 U/kg de peso corporal (pc) o 10 pg/kg (en base al contenido proteico). La proteína modificada descrita en la presente puede reducir los niveles em plasma de L-asparagina a niveles indetectables durante un periodo de tiempo de por lo menos aproximadamente 12, 24, 48, 72, 96, 120 o 144 horas cuando se administra a una dosis de 25 U/kg de peso corporal o 50 pg/kg (sobre la base del contenido de proteína). La proteína modificada descrita en la presente puede reducir los niveles en plasma de L-asparagina durante un periodo de tiempo de por lo menos aproximadamente 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 o 240 horas cuando se administra a una dosis de 50 U/kg de peso corporal o 100 pg/kg (sobre la base del contenido de proteína). La proteína modificada descrita en la presente puede reducir los niveles en plasma de L-asparagina a niveles indetectables durante un periodo de tiempo de por lo menos aproximadamente 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 o 240 horas cuando se administra a una dosis que varía de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 15.000 IU/m2 (aproximadamente 20-30 mg de proteína/m2).

La proteína modificada descrita en la presente puede dar como resultado un nivel similar de agotamiento de L-asparagina durante un período de tiempo (por ejemplo, 24, 48 o 72 horas) después de una única dosis.

La proteína modificada descrita puede tener una t<1/2>más larga que la L-asparaginasa no modificada administrada a una dosis equivalente de proteína. La proteína modificada descrita anteriormente puede tener un valor de AUC mayor (por ejemplo, por lo menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces) después de una única dosis en comparación con la L-asparaginasa de dicha proteína no modificada.

En algunos aspectos, la proteína modificada descrita en la presente no provoca ninguna respuesta significativa de anticuerpos durante un periodo de tiempo determinado después de la administración de una única dosis, por ejemplo, de más de aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, etc. Por ejemplo, la proteína modificada no provoca ninguna respuesta significativa de anticuerpos durante por lo menos 8 semanas. En un ejemplo, "no provoca ninguna respuesta significativa de anticuerpos" significa que el sujeto que recibe la proteína modificada se identifica dentro de los parámetros reconocidos por la técnica como negativo para anticuerpos. Los niveles de anticuerpos pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo ELISA o ensayos de resonancia de plasmón de superficie (Zalewska-Szewczyk (2009) Clin. Exp. Med. 9, 113-116; Avramis (2009) Anticancer Research 29, 299-302). La proteína modificada puede tener cualquier combinación de estas propiedades.

En algunos aspectos, la proteína modificada descrita en la presente es para su uso en un método de tratamiento, en donde se administra como terapia de primera línea. En otro aspecto, la proteína modificada es para su uso en un método de tratamiento, en donde se administra como terapia de segunda línea en pacientes, en particular pacientes con ALL, donde se han desarrollado signos objetivos de alergia o hipersensibilidad, incluyendo la "hipersensibilidad silenciosa", a otras preparaciones de asparaginasa, en particular, la L-asparaginasa nativa derivada de Escherichia coli o su variante PEGilada (pegaspargasa). Los ejemplos no limitativos de signos objetivos de alergia o hipersensibilidad incluyen pruebas de "positivo para anticuerpos " para una enzima asparaginasa. En un aspecto específico, la proteína modificada es para su uso en terapia de segunda línea después del tratamiento con pegaspargasa. El paciente puede haber tenido una hipersensibilidad previa a una L-asparaginasade E. coli,y/o puede haber tenido una hipersensibilidad previa a una L-asparaginasa de Erwinia. La hipersensibilidad puede seleccionarse del grupo que consiste en reacción alérgica, choque anafiláctico e hipersensibilidad silenciosa.

La incidencia de recaída en pacientes con ALL después del tratamiento con L-asparaginasa sigue siendo alta, con aproximadamente un 10-25% de pacientes pediátricos con ALL que tienen recaídas tempranas (por ejemplo, algunas durante la fase de mantenimiento a los 30-36 meses después de la inducción) (Avramis (2005) Clin. Pharmacokinet. 44, 367-393). Si un paciente tratado con L-asparaginasa derivada de E.colitiene una recaída, el tratamiento posterior con preparaciones deE. colipodría producir un efecto de "vacunación", por el que la preparación deE. colitiene una mayor inmunogenicidad durante las administraciones posteriores. La proteína modificada descrita en la presente puede usarse en un método de tratamiento de pacientes con ALL recidivante que fueron tratados con anterioridad con otros preparados de asparaginasa, en particular los que fueron tratados con anterioridad con asparaginasas derivadasde E. coli.La recaída de la enfermedad puede producirse tras el tratamiento con una L-asparaginasa deE. colio una forma PEGilada de la misma.

En otro aspecto, la invención se dirige a una proteína modificada de acuerdo con la invención o a una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención para su uso en un método de tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda, en donde el método comprende administrar a un paciente que necesita el tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína modificada. En un aspecto específico, el método de tratamiento comprende además administrar la proteína modificada a una dosis que varía de aproximadamente 1500 IU/m2 a aproximadamente 15.000 IU/m2, típicamente de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 15.000 IU/m2 (aproximadamente 20-30 mg de proteína/m2), a un programa que varía de aproximadamente dos veces a la semana a aproximadamente una vez al mes, típicamente una vez por semana o una vez cada dos semanas. La proteína modificada descrita anteriormente puede administrarse como un único agente (por ejemplo, monoterapia) o como parte de una combinación de fármacos de quimioterapia, incluyendo, entre otros, glucocorticoides, corticosteroides, compuestos anticancerígenos u otros agentes, incluyendo, entre otros, metotrexato, dexametasona, prednisona, prednisolona, vincristina, ciclofosfamida y antraciclina. A modo de ejemplo, a los pacientes con ALL se les administrará la proteína modificada descrita anteriormente como componente de la quimioterapia multiagente durante 3 fases de quimioterapia que incluyen inducción, consolidación o intensificación, y mantenimiento. En un ejemplo específico, la proteína modificada descrita anteriormente no se administra con un inhibidor de la asparagina sintetasa (por ejemplo, como se expone en WO 2007/103290). En otro ejemplo específico, la proteína modificada descrita anteriormente no se administra con un inhibidor de la asparagina sintetasa, sino que se administra con otros fármacos quimioterapéuticos. La proteína modificada descrita anteriormente puede administrarse antes, después o simultáneamente con otros compuestos como parte de un régimen de quimioterapia multiagente.

En una realización específica, una proteína modificada de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención es para su uso en un método de tratamiento, en donde el método comprende administrar la proteína modificada en una cantidad de aproximadamente 1 U/kg a aproximadamente 25 U/kg (por ejemplo, aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, o 25 U/kg) o una cantidad equivalente de la misma 20 (por ejemplo, sobre una base de contenido de proteína). Las cantidades de proteína modificada a administrar dependerán de muchos factores, por ejemplo, la IC<50>, la EC<50>, la semivida biológica del compuesto, la edad, el tamaño, el peso y la condición física del paciente, y la enfermedad o trastorno a tratar. La importancia de estos y otros factores a considerar es bien conocida por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, la cantidad de proteína modificada que debe administrarse puede variar de aproximadamente 10 unidades internacionales por metro cuadrado del área de superficie del cuerpo del paciente (IU/m2) y 50.000 IU/m2. En aspectos adicionales, una proteína modificada de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención es para su uso en un método de tratamiento, en donde la proteína modificada se administra en una cantidad seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 5, aproximadamente 10 y aproximadamente 25 U/kg. En otro aspecto específico, una proteína modificada de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención es para su uso en un método de tratamiento, en donde la proteína modificada es para su administración a una dosis que varía de aproximadamente 1.000 IU/m2 a aproximadamente 20.000 IU/m 2 (por ejemplo, 1.000 IU/m2, 2.000 IU/m2, 3.000 IU/m2, 4.000 IU/m2, 5.000 IU/m2, 6.000 IU/m2, 7.000 IU/m2, 8.000 IU/m2, 9.000 IU/m2, 10.000 IU/m2, 11.000 IU/m2, 25 12.000 IU/m, 13.000 IU/m22, 14.000 IU/m2, 15.000 IU/m2, 16.000 IU/m2, 17.000 IU/m2, 18.000 IU/m2, 19.000 IU/m2, o 20.000 IU/m2). En otro aspecto específico, una proteína modificada de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con la invención es para su uso en un método de tratamiento, en donde la proteína modificada es para su administración a una dosis que agota la L-asparagina a niveles indetectables usando métodos y aparatos conocidos en la técnica durante un periodo de aproximadamente 3 días a aproximadamente 10 días (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días) para una única dosis.

La proteína modificada puede ser para su administración a una dosis que agota la L-asparagina a niveles indetectables durante un período de aproximadamente 3 a 1 aproximadamente 0 días, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 días, de aproximadamente 1 a 15 días, o de aproximadamente 2 a 30 días. La proteína modificada puede administrarse a una dosis que agota la L-asparagina a niveles indetectables durante un período de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 días a aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 días. La proteína modificada puede ser para administración intravenosa o intramuscular. En realizaciones adicionales, dicha proteína modificada puede ser para su administración una o dos veces por semana, menos de una vez por semana o como monoterapia.

La presente invención se refiere a una composición que comprende la proteína modificada como se define en la presente o la proteína modificada preparada mediante el proceso descrito en la presente. La composición puede ser una composición farmacéutica, que opcionalmente comprende además (a) portador portadores o excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada descrita anteriormente. En un aspecto específico, la composición farmacéutica está contenida en un vial como un polvo liofilizado para ser reconstituido con un solvente, como las L-asparaginasas nativas actualmente disponibles, cualquiera que sea la fuente bacteriana usada para su producción (por ejemplo, Kidrolase®, Elspar®, Erwinase®). En otro aspecto, la composición farmacéutica es una solución "lista para su uso", como la pegaspargasa (Oncaspar®) que permite, además de una manipulación adecuada, una administración a través de, por ejemplo, vías intramuscular, intravenosa (infusión y/o bolo), intracerebroventricular (icv), subcutánea.

La proteína modificada, incluyendo las composiciones que la comprende (por ejemplo, una composición farmacéutica), puede administrarse a un paciente usando técnicas estándar. Las técnicas y formulaciones en general pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a ed., Pharmaceutical Press, (2012). Las formas de dosificación adecuadas, en parte, dependen del uso o la vía de entrada, por ejemplo, oral, transdérmica, transmucosa o por inyección (parenteral). Dichas formas de dosificación deben permitir que el agente terapéutico alcance una célula diana o tenga de otro modo el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas inyectadas en el torrente sanguíneo son preferiblemente solubles. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden formularse como sales farmacéuticamente aceptables y complejos de las mismas. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales no tóxicas presentes en las cantidades y concentraciones a las que se administran. La preparación de tales sales puede facilitar el uso farmacéutico alterando las características físicas del compuesto sin impedir que ejerza su efecto fisiológico. Las alteraciones útiles en las propiedades físicas incluyen la disminución del punto de fusión para facilitar la administración transmucosal y aumentar la solubilidad para facilitar la administración de concentraciones más altas del fármaco. La sal farmacéuticamente aceptable de una proteína modificada como se describe en la presente puede estar presente en forma de complejo, como apreciarán los expertos en la técnica. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de ácido como las que contienen sulfato, clorhidrato, fumarato, maleato, fosfato, sulfamato, acetato, citrato, lactato, tartrato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenesulfonato, ciclohexilsulfamato y quinato. Las sales farmacéuticamente aceptables pueden obtenerse a partir de ácidos, incluyendo ácido clorhídrico, ácido maleico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido sulfámico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido malónico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido ciclohexilsulfámico, ácido fumárico y ácido quínico. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales de adición básicas, como las que contienen benzatina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina, procaína, aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio, amonio, alquilamina y zinc, cuando hay grupos funcionales ácidos, como ácido carboxílico o fenol. Consultar, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Tales sales pueden prepararse usando las bases correspondientes apropiadas. A una composición farmacéutica de acuerdo con la invención también pueden incorporarse portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables para facilitar la administración de la asparaginasa particular. Los ejemplos de portadores adecuados para su uso en la puesta en práctica de la invención incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares como lactosa, glucosa o sacarosa, o tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, polietilenglicoles y solventes fisiológicamente compatibles. Ejemplos de solventes fisiológicamente compatibles incluyen soluciones estériles de agua para inyección (WFI), solución salina y dextrosa. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden administrarse por diferentes vías, incluyendo la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, oral, tópica (transdérmica) o transmucosal. Para la administración sistémica, se prefiere la administración oral. Para la administración oral, por ejemplo, los compuestos pueden formularse en formas de dosificación oral convencionales como cápsulas, comprimidos y preparaciones líquidas como jarabes, elixires y gotas concentradas. Alternativamente, puede usarse la inyección (administración parenteral), por ejemplo, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Para la inyección, las composiciones farmacéuticas se formulan en soluciones líquidas, preferiblemente en tampones o soluciones fisiológicamente compatibles, como solución salina, solución de Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden formularse en forma sólida y volver a disolverse o suspenderse inmediatamente antes de su uso. Por ejemplo, pueden producirse formas liofilizadas de la proteína modificada. En un aspecto específico, la proteína modificada es para administración intramuscular. En un aspecto específico preferido, la proteína modificada es para administración intravenosa.

La administración sistémica también puede realizarse por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se desea penetrar. Tales penetrantes son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosal, sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además, pueden usarse detergentes para facilitar la penetración. La administración transmucosal, por ejemplo, puede realizarse a través de aerosoles nasales, inhaladores (para administración pulmonar), supositorios rectales o supositorios vaginales. Para la administración tópica, los compuestos pueden formularse en pomadas, ungüentos, geles o cremas, como es bien conocido en la técnica.

En un aspecto, la invención también se refiere a la proteína modificada como se describe en la presente para su uso en terapia. El uso puede ser para tratar un cáncer que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina. En un aspecto, la invención se refiere a la proteína modificada como se describe en la presente o la proteína modificada preparada por el proceso como se describe en la presente, o la composición que comprende la proteína modificada como se describe en la presente, para el uso como medicamento / para el uso en terapia / para el uso en medicina.

En un aspecto, la invención se refiere a la proteína modificada como se describe en la presente o la proteína modificada preparada mediante el proceso como se describe en la presente, o la composición que comprende la proteína modificada como se describe en la presente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina en un paciente, en donde la enfermedad que puede tratarse por agotamiento de L-asparagina es un cáncer.

En un aspecto preferido, la invención se refiere a la proteína modificada como se describe en la presente o la proteína modificada preparada mediante el proceso como se describe en la presente, o la composición que comprende la proteína modificada como se describe en la presente para su uso en el tratamiento del cáncer.

Se prefiere que el sujeto a tratar sea un mamífero, en particular un humano.

El cáncer puede ser un cáncer no sólido, por ejemplo, una leucemia o un linfoma no Hodgkin. Preferiblemente, dicha leucemia es una leucemia linfoblástica aguda (ALL) o una leucemia mieloide aguda (AML).

La proteína modificada puede provocar una respuesta inmunogénica menor en el paciente en comparación con la L-asparaginasa no conjugada. La proteína modificada puede tener una semivida de circulaciónin vivomás larga después de una única dosis en comparación con la L-asparaginasa no conjugada. La proteína modificada puede tener un valor de AUC mayor después de una única dosis en comparación con la L-asparaginasa no conjugada. El paciente puede haber tenido una hipersensibilidad previa a la L-asparaginasade E. colio a su forma PEGilada.

La presente invención se ilustra adicionalmente por referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Las Figuras muestran:

Figura 1: Química de la conjugación de Crisantaspasa con péptidos P/A protegidos N-terminalmente mediante grupos amino

(A) y (B) representan las estructuras químicas de péptidos P/A (SEQ ID NO: 16 y 17, secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 5 y 15) que contienen 20 o 40 residuos Pro/Ala (respectivamente), que se obtuvieron mediante síntesis peptídica en fase sólida. Para evitar la polimerización de los péptidos tras la activación química del extremo C-terminal, el extremo N-terminal se protegió con residuos de piroglutamilo (Pga). Se incorporó ácido aminohexanoico (Ahx) en el extremo C-terminal de los péptidos para que sirva como conector. (C) En presencia de la base no nucleófilaN,N-diisopropiletilamina(DIPEA, base de Hünig), y con DMSO como solvente, el péptido P/A protegido N-terminalmente se activa en su extremo C-terminal con el derivado de tetrafluoroborato deO-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU). El éster activo hidroxibenzotriazol (HOBt) del péptido se usa posteriormente para derivatizar los grupos amino (grupos £-amino de los residuos de lisina o grupo a-amino del extremo N-terminal) de Crisantaspasa con el péptido P/A mediante la formación de enlaces peptídicos o isopeptídicos, mientras que el HOBt libre se libera. Este paso de acoplamiento se realiza en solución acuosa (por ejemplo, tampón PBS) con un contenido de solvente orgánico <30%. La proteína modificada con P/A-Crisantaspasa puede purificarse del péptido P/A/reactivo de acoplamiento residual mediante diálisis y/o cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico).

Figura 2: Optimización de la relación de acoplamiento de Crisantaspasa/Pga-P/A(20)-Ahx

La Crisantaspasa recombinante producida enE. colise conjugó con el péptido Pga-P/A#1 (20)-Ahx(Fig. 1A)(SEQID NO: 16, secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5) como se describe en el Ejemplo 1. La relación péptido a proteína varió entre 3,5 mg y 10 mg de péptido P/A por 1 mg de Crisantaspasa. El gel se cargó con 7 gg de Crisantaspasa de cada reacción de acoplamiento. Además, como estándar de tamaño ("Std") se aplicó una mezcla de reacciones de acoplamiento con proporciones de 0,3 a 10 mg de péptido por mg de proteína. El número de péptidos P/A acoplados puede determinarse contando las bandas en esa escalera a partir de la Crisantaspasa no conjugada como está marcada a la derecha. Carril "kDa": Pierce™ Unstained Protein MW Marker (Thermo Fisher Scientific).

Figura 3: Purificación del producto de acoplamiento del péptido Crisantaspasa/Pga-P/A(40)-Ahx mediante cromatografía de intercambio aniónico

La Crisantaspasa recombinante producida enE. colise conjugó con el péptido Pga-P/A(40)-Ahx(Fig. 1B)(SEQ ID NO: 17, secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 15) como se describe en el Ejemplo 2. Después de la diálisis contra tampón de funcionamiento AIX (25 mM de ácido bórico/NaOH pH 9,0, 1 mM de EDTA) se realizó cromatografía de intercambio aniónico en una columna Source™ 15Q de 85 ml (A). Aplicando un gradiente de concentración de NaCl, la proteína modificada con enzimas eluyó en un único pico agudo, como revela el trazado UV a 280 nm. La separación del péptido no acoplado restante y de otros subproductos no proteicos de la conjugación química desprovistos de absorción UV a 280 nm se monitorizó mediante la traza UV a 225 nm. (B) Análisis SDS-PAGE de la proteína modificada con Crisantaspasa/Pga-P/A(40)-Ahx después de su purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico (carril 1). En el carril 2 se aplicó una mezcla de reacciones de acoplamiento con proporciones de 0,3 a 10 mg de péptido por mg de proteína para permitir la determinación del número de péptidos P/A acoplados por monómero Crisantaspasa. Al carril "M" se aplicó el marcador PageRuler™ Plus Prestained (Thermo Fisher Scientific).

Figura 4: Purificación del producto de acoplamiento del péptido Crisantaspasa/Pga-P/A(20)-Ahx mediante cromatografía de intercambio aniónico

La Crisantaspasa recombinante producida enE. colise conjugó con el péptido Pga-P/A(20)-Ahx(Fig. 1A)(SEQ ID NO: 16, secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5) como se describe en el Ejemplo 3. Después de la diálisis contra tampón de funcionamiento AIX (25 mM de ácido bórico/NaOH pH 9,0, 1 mM de EDTA), se realizó una cromatografía de intercambio aniónico en una columna Source™ 15Q de 85 ml (A). Aplicando un gradiente de concentración de NaCl, la proteína modificada enzimáticamente eluyó en un único pico agudo, como revela la traza UV a 280 nm. La separación del péptido no acoplado restante y de otros subproductos no proteicos de la conjugación química desprovistos de absorción UV a 280 nm fue revelada por la traza UV a 225 nm. (B) Análisis SDS-PAGE de la proteína modificada Crisantaspasa/Pga-P/A(20)-Ahx después de su purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico (carril 1). En el carril 2 se aplicó una mezcla de reacciones de acoplamiento con proporciones de 0,3 a 10 mg de péptido por mg de proteína para permitir la determinación del número de péptidos P/A acoplados por monómero de Crisantaspasa. Se aplicó el marcador PageRuler™ Plus Prestained (Thermo Fisher Scientific) al carril "M".

Figura 5: Clonación de los vectores de expresión para la producción de Crisantaspasa PASilada en E.coIí(A) Mapa plasmídico de pASK75-SapI-Crisantaspasa (SEQ ID NO: 4) y (B) de su derivado pASK75-PA400-Crisantaspasa (SEQ ID NO:14) después de la inserción sin fisuras de un casete génico PA#1c/1b(400) (SEQ ID NO: 10) a través de los dos sitios de restricción SapI orientados inversamente. El gen estructural para la (pre)proteína biológica/farmacológicamente activa PA#1(400)-Crisantaspasa (SEQ ID NO:13) que comprende la secuencia de nucleótidos poco repetitiva que codifica un polipéptido PA#1 con 401 residuos de aminoácidos y el gen estructural para Crisantaspasa así como la región codificante para la secuencia señal Enx bacteriana (SPEnx) se clona bajo el control transcripcional del promotor/operador tet (tetp/o). La estructura principal del plásmido fuera del casete de expresión flanqueado por los sitios de restricción XbaI e HindIII es idéntico al del vector de expresión genérico pASK75 (Skerra (1994) Gene 151:131 -135). Se clonó de la misma manera un plásmido para la expresión de Crisantaspasa fusionado a Pa #1(200) (SEQ ID NO: 11) usando el casete del gen PA#1b(200) (SEQ ID NO: 12).

Figura 6: Análisis SDS-PGE de Crisantaspasa recombinante fusionada genéticamente con PA200 o PA400

(A) Análisis de la proteína de fusión madura PA#1(400)-Crisantaspasa (SEQ ID 13) después de la extracción periplásmica (PPE), precipitación con sulfato de amonio (ASP) y cromatografía de intercambio aniónico (AEX) mediante SDS-PAGE al 10%. (B) El gel muestra muestras de 5 gg de PA#1 (200)-Crisantaspasa madura purificada (carril 1) (SEQ ID NO:11) o PA#1(400)-Crisantaspasa (carril 2) (SEQ ID NO: 13). Los tamaños de las proteínas marcadoras (M) se indican a la izquierda. La PA#1(200)-Crisantaspasa y la proteína de fusión PA#1(400)-Crisantaspasa aparecen como bandas únicas homogéneas con un tamaño molecular aparente de aproximadamente 105 kDa (carril 1) o 200 kDa (carril 2), respectivamente. Debido a la escasa unión al SDS, las proteínas de fusión PA generalmente muestran tamaños significativamente mayores (Schlapschy (2013) Protein Eng Des Sel. 26:489-501) que, por ejemplo, la masa calculada de 51 kDa para el monómero PA#1(200)-Crisantaspasa o de 67 kDa para el monómero PA#1 (400)-Crisantaspasa.

Figura 7: Cromatografía de exclusión por tamaño de variantes de Crisantaspasa PASilada

(A) Superposición de perfiles de elución para Crisantaspasa no modificada, así como para Crisantaspasa conjugada químicamente con péptidos Pga-P/A(20)-Ahx o Pga-P/A(40)-Ahx (descritos en los Ejemplos 3 y 2, respectivamente) y la Crisantaspasa recombinante fusionada genéticamente con polipéptidos PA#1 (200) (SEQ ID NO:7) o PA#1 (400) (SEQ ID NO:9) (descritos en el Ejemplo 5). Se aplicaron 150 gl de la proteína purificada a una concentración de 1 mg/ml a una columna Superdex™ S200 10/300 GL equilibrada con tampón PBS. Se monitorizó la absorción a 280 nm y el pico de cada serie cromatográfica se normalizó al 100%.

(B) Curva de calibración para los cromatogramas de (A) usando una columna Superdex S200 10/300 GL. El logaritmo del peso molecular de las proteínas marcadoras (ovoalbúmina, 43,0 kDa; albúmina de suero bovino, 66,3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa, p-amilasa, 200 kDa, apo-ferritina, 440 kDa) se trazó frente a sus volúmenes de elución (círculos negros) y se ajustó mediante una línea recta. A partir de los volúmenes de elución observados de la Crisantaspasa tetramérica, sus proteínas modificadas con el péptido PA#1 y sus proteínas de fusión PA#1 recombinantes (cuadrados negros), se determinaron sus tamaños moleculares aparentes de la siguiente manera. Crisantaspasa, 105 kDa (masa real 140 kDa); proteína modificada Crisantaspasa/Pga-P/A(20)-Ahx, 531 kDa (masa real 228 kDa); proteína modificada Crisantaspasa/Pga-P/A(40)-Ahx, 820 kDa (masa real 284 kDa); PA200-Crisantaspasa, 595 kDa (masa real 205 kDa); PA400-Crisantaspasa, 1087 kDa (masa real 269 kDa). Estos datos muestran que tanto los péptidos P/A conjugados químicamente como la fusión genética con el polipéptido PA#1 confieren un volumen hidrodinámico mucho mayor.

Figura 8: Análisis ESI-MS de variantes de Crisantaspasa PASilada

(A) El espectro m/z en bruto obtenido por Espectrometría de Masas por Ionización por electrospray (ESI-MS) de la proteína modificada Crisantaspasa/Pga-P/A(20)-Ahx purificada, preparada como se describe en el Ejemplo 3, se deconvolucionó proporcionando el espectro de masas (B). Las especies de masa observadas pudieron asignarse inequívocamente a la Crisantaspasa conjugada con 9 a 14 péptidos (verTabla 3). Sin embargo, sólo se observaron picos importantes para las especies proteicas con de 10 a 13 péptidos, lo que corresponde a la determinación de la relación de acoplamiento peptídico por SDS-PAGE (ver laFig. 4B). (C) y (E) muestran los espectros m/z brutos de las proteínas de fusión PA200-Crisantaspasa y PA400-Crisantaspasa preparadas en el Ejemplo 5. Los espectros de masas deconvulocionados (D) y (F) revelaron masas de 51164,75 Da y 67199,17 Da, respectivamente, que corresponden casi perfectamente a las masas calculadas de 51163,58 Da.

Figura 9: Concentración plasmática media (± SD) frente a perfiles temporales después de una única dosis en bolo IV a ratones machos CD-1

Las figuras muestran la actividad de asparaginasa en plasma de los conjugados de PA-crisantaspasa después de una única dosis en bolo IV a ratones macho.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención:

Ejemplo 1: Optimización de la relación de acoplamiento para la preparación de Piroglutamoil-P/A(20)-aminohexanoil-Crisantaspasa

Se disolvieron 4,38 mg de péptido Pga-P/A#1(20)-Ahx(Fig. 1A;sal de TFA, pureza 98%; PSL Peptide Specialty Laboratories, Heidelberg, Alemania) (SEQ ID NO: 16, secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 5) en 66,3 pl de DMSO. La activación química del péptido P/A a través de su grupo carboxilato terminal se inició mediante la adición de 23,7 pl de una solución de 500 mM de TBTU (CAS# 125700-67-6; Iris Biotech, Marktredwitz, Alemania) en DMSO y 2,7 pl de DIPEA a la solución de péptido y agitando en vórtice (ver laFig. 1C). En esta configuración, la concentración del péptido era de 25,8 mM y la relación molar entre DIPEA, TBTU y Pga-P/A#1 (20)-Ahx era de 5:5:1. Después de 10 min de incubación a 25°C, la solución del péptido se mezcló con DIPEA y TBTU. Después de 10 min de incubación a 25°C, la mezcla se diluyó en tubos Eppendorf de acuerdo con laTabla 1.

Se preparó una solución de L-asparaginasa deDickeya chrysanthemi(Crisantaspasa, SEQ ID NO: 1, recombinante, producida enE. coli(lote RE-LAP-P57D) con una concentración de 2 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS: 115 mM NaCl, 4 mM KH<2>PO<4>y 16 mM Na2HPO4, pH 7,4) y se pipeteó en cada tubo Eppendorf según los volúmenes indicados en la tabla 1. Después de mezclar mediante pipeteo repetido y agitación en vórtice, se dejó que la reacción de acoplamiento tuviera lugar a 25°C durante 30 minutos. La reacción se inactivó mediante la adición de glicina (pH 8,0 ajustado con Tris base) hasta una concentración final de 250 mM.

En laFig. 2se muestra el análisis SDS-PAGE de las proteínas modificadas. Las bandas individuales corresponden a proteínas modificadas que varían por un péptido P/A acoplado cada una. La aplicación adicional de una mezcla de reacciones de acoplamiento con relaciones de 0,3 a 10 mg de péptido por mg de proteína permitió contar las bandas en una escala sucesiva partiendo de la proteína no conjugada y, de este modo, pudo determinarse con precisión el número de péptidos P/A acoplados. Las intensidades de las bandas se cuantificaron densitométricamente usando el software Quant v12.2 (TotalLab, Newcastle upon Tyne, Reino Unido) y se calcularon los valores medios aritméticos del número de péptidos acoplados por monómero de Crisantaspasa ponderados por sus intensidades de banda (ver laTabla 2). 3,5 mg de péptido P/A por mg de Crisantaspasa dieron como resultado una relación de acoplamiento en el intervalo de 9 a 12 péptidos P/A por monómero de Crisantaspasa (valor medio: 10,4). El aumento de la relación de masa aplicada a 10 mg de péptido P/A por mg de Crisantaspasa llevó solamente a un ligero aumento de la relación de acoplamiento resultante de 10 a 13 péptidos P/A por Crisantaspasa (valor medio: 12,0), lo que indica una saturación de los grupos amino accesibles.

Las proteínas modificadas se purificaron mediante cromatografía de intercambio aniónico (AEX) en una columna MonoQ HR5/5 (GE Healthcare) usando 25 mM de Na-borato pH 9,0, 1 mM de EDTA como tampón de funcionamiento y un gradiente de concentración de NaCl de 0 a 1 M para eluir las proteínas. La actividad de la L-asparaginasa aminohidrolasa de cada proteína modificada con Crisantaspasa se determinó mediante la reacción del amoníaco liberado por la actividad enzimática de la L-asparaginasa con el reactivo de Nessler. Brevemente, se mezclaron 50 pl de solución enzimática con 20 mM de L-asparagina en un tampón de borato sódico 100 mM pH 8,6 que contenía un 0,015% (p/v) de albúmina de suero bovino y se incubó durante 15 min a 37°C. La reacción se detuvo mediante la adición de 200 pl de reactivo de Nessler (Sigma-Aldrich). La absorbancia de esta solución se midió a 450 nm. La actividad se calculó a partir de una curva de calibración que se obtuvo a partir de sulfato amónico como referencia. Los resultados se resumen en laTabla 2.

Tabla 2: Actividades enzimáticas de la Crisantaspasa conjugada con el péptido Pga-P/A(20)-Ahx en diferentes cantidades

continuación

Ejemplo 2: Preparación de piroglutamoil-P/A(40)-aminohexanoil-Crisantaspasa

Se disolvieron 28 mg del péptido Piroglutamoil-P/A#1(40)-Ahx (SEQ ID NO. 17, secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 15),Fig. 1B,sal de TFA, pureza 98%; Almac Group, Craigavon, Reino Unido) en 1324 pl de DMSO anhidro (99,9%; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Para lograr la activación química del péptido P/A a través de su grupo carboxilato terminal, se añadieron 162 pl de una solución de 500 mM de TBTU (N° CAS 125700 67-6; Iris Biotech, Marktredwitz, Alemania) en DMSO y, después de mezclar, 14 pl de DIPeA (99,5%, grado biotecnológico, Sigma-Aldrich). Se agitó brevemente en vórtice toda la mezcla y se incubó durante 20 min a 25°C (ver laFig. 1C).En esta configuración, la concentración de péptido fue de 5,41 mM y la relación molar entre DIPEA, TBTU y Pga-P/A#1 (40)-Ahx fue de 10:10:1.

Se mezclaron 3,5 ml de una solución enfriada con hielo de Crisantaspasa (SEQ ID NO: 1) (2 mg/ml en PBS) con la solución de péptido activado (1,5 ml), dando como resultado una relación de masa entre Pga-P/A#1 (40)-Ahx y Crisantaspasa de 5:1, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min para permitir el acoplamiento. Usando un tubo de diálisis de membrana de celulosa regenerada (MWCO 50 kDa, Spectrum Laboratories, Los Angeles, CA), la solución se dializó contra 5 l de tampón de funcionamiento AEX (25 mM Na-borato pH 9,0, 1 mM EDTA) y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico en una columna HiScale™ 16/40 empaquetada con resina Source™ 15Q (GE Healthcare). La columna se equilibró con tampón de funcionamiento AEX y la proteína modificada se eluyó usando un gradiente de concentración de NaCl segmentado de 0 a 150 mM en 1 volumen de columna y de 150 a 1000 mM en 0,25 volúmenes de columna(Fig. 3A).

La aplicación del eluido a SDS-PAGE junto con una escalera obtenida a partir de una mezcla de reacciones de acoplamiento con relaciones de 0,3 a 10 mg de péptido por mg de proteína permitió determinar la relación de acoplamiento de 9-11 péptidos PA por monómero de Crisantaspasa (valor medio: 10,0)(Fig. 3B). La actividad enzimática de la proteína Crisantaspasa/PA(40) modificada, determinada mediante el ensayo de Nessler descrito en el ejemplo 1, fue del 78,2% de la actividad de la Crisantaspasa no modificada sometida al mismo ensayo.

Ejemplo 3: Preparación de piroglutamoil-P/A(20)-aminohexanoil-Crisantaspasa

Se disolvieron 21 mg del péptido Piroglutamoil-P/A#1 (20)-Ahx (SEQ ID NO. 5,Fig. 1A;sal TFA, pureza 98%; PSL Peptide Specialty Laboratories, Heidelberg, Alemania) en 1376 pl de DMSO anhidro (99,9%; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). Para lograr la activación química del péptido P/A a través de su grupo carboxilato terminal, se añadieron 114 pl de una solución de 500 mM de TBTU (N° CAS 125700-67-6; adquirido a Iris Biotech, Marktredwitz, Alemania) en DMSO y, después de mezclar, 10 pl de DIPEA (99,5%, grado biotecnológico, Sigma-Aldrich). Toda la mezcla se agitó brevemente en vórtice y se incubó durante 20 min a 25°C(Fig. 1C).En esta configuración, la concentración de péptido fue de 7,58 mM y la relación molar entre DIPEA, TBTU y Pga-P/A#1 (20)-Ahx fue de 5:5:1.

Se mezclaron 3,5 ml de una solución enfriada con hielo de Crisantaspasa (SEQ ID NO: 1) (2 mg/ml en PBS) con la solución de péptido activado (1,5 ml), dando como resultado una relación de masa entre Pga-P/A#1 (40)-Ahx y Crisantaspasa de 5:1, y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min para permitir el acoplamiento. Usando un tubo de diálisis de membrana de celulosa regenerada (MWCO 50 kDa, Spectrum Laboratories, Los Angeles, CA), la solución se dializó contra 5 l de tampón de funcionamiento AEX (25 mM Na-borato pH 9,0, 1 mM EDTA) y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico en una columna HiScale™ 16/40 empaquetada con resina Source™ 15Q (GE Healthcare). La columna se equilibró con tampón de funcionamiento AEX y la proteína modificada se eluyó usando un gradiente de concentración de NaCl segmentado de 0 a 150 mM en 1 volumen de columna y de 150 a 1000 mM en 0,25 volúmenes de columna(Fig. 4A).

La aplicación del eluido a SDS-PAGE junto con una escalera obtenida a partir de una mezcla de reacciones de acoplamiento con relaciones de 0,3 a 10 mg de péptido por mg de proteína, permitió determinar la proporción de acoplamiento de 10-13 péptidos PA por monómero de Crisantaspasa (valor medio 11,9)(Fig. 4B). La actividad enzimática de la proteína Crisantaspasa/PA(20) modificada, determinada usando el ensayo de Nessler descrito en el Ejemplo 1, fue del 91,2% de la actividad de la Crisantaspasa no modificada analizada de la misma manera.

Ejemplo 4: Clonación de plásmidos de expresión para la producción periplásmica de Crisantaspasa fusionada N-terminalmente a secuencias P/A de longitud variable.

Se obtuvo un fragmento sintético de ADN que codifica la secuencia madura de aminoácidos de la L-asparaginasa deDickeya chrysanthemi(UniProt ID P06608) de un proveedor de síntesis genética (Thermo Fisher Scientific, Regensburg, Alemania). Este fragmento de gen (SEQ ID NO: 4) comprendía un sitio de restricción XbaI, seguido de un sitio de unión ribosómica, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal Enx, seguido de un codón de alanina GCC, una primera secuencia de reconocimientoSapIGCTCTTC en la cadena no codificante, un espaciador de 11 nucleótidos, y una segunda secuencia de restricciónSapIen orientación complementaria inversa, con su secuencia de reconocimiento GCTCTTC en la cadena codificante, seguida de un codón de alanina GCC directamente enlazado a la secuencia codificante de la L-asparaginasa madura, a la que seguía finalmente un sitio de restricción HindIII.

Este fragmento del gen se clonó en pASk75 a través de los sitios de restricción flanqueantesXbaIyHindIIIde acuerdo con los procedimientos estándar (Sambrook (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). El plásmido resultante(Fig. 5A)se digirió conSapI,lo que llevó a la liberación de un pequeño inserto de ADN (30 pb) que contenía tanto sitios de reconocimientoSapIcomo una estructura principal de vector escindida con extremos pegajosos compatibles 5'-GCC/5'-GGC en la posición directamente delante del extremo N-terminal maduro codificado de la L-asparaginasa, que es ideal para la inserción de la molécula de ácido nucleico poco repetitiva que codifica la secuencia de repetición de aminoácidos rica en prolina/alanina. Después del aislamiento del fragmento del vector usando el kit de extracción en gel Promega Wizard (Promega, Mannheim, Alemania) y la desfosforilación con la fosfatasa alcalina termosensible FastAP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), siguiendo en ambos casos las instrucciones del fabricante, se ligó con el casete del gen PA#1 b(200) escindido de pXL2-PA#1 b(200) (SEQ ID NO: 8) o el casete del gen PA#1c/1b(400) escindido de pXL2-PA#1c/1b(400) (SEQ ID n O: 10) mediante la digestión de restricciónEarI.Los plásmidos resultantes (SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14)(Fig. 5b)permiten la expresión bacteriana de proteínas de fusión (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13) consistentes en una secuencia repetida de aminoácidos rica en prolina/alanina fusionada con la proteína biológicamente activa Crisantaspasa (después del procesamientoin vivodel péptido señal Enx tras la secreción periplásmica enE. coli).

Ejemplo 5: Producción bacteriana y purificación de proteínas de fusión entre la secuencia PA#1(200) o PA#1(400) y Crisantaspasa

Tanto la proteína de fusión PA#1(200)-Crisantaspasa como la PA#1(400)-Crisantaspasa (masa calculada: 51 kDa y 67 kDa, respectivamente) se produjeron a 25°C enE. coliW3110 que albergaba el plásmido de expresión pASK75-PA200-Crisantaspasa o pASK75-PA400-Crisantaspasa(Fig. 5B)del Ejemplo 4 usando un fermentador superior de sobremesa de 8 l con un medio mineral de glucosa sintética suplementado con 100 mg/l de ampicilina de acuerdo con un procedimiento publicado (Schiweck (1995) Proteins 23: 561-565). La expresión del gen recombinante se indujo mediante la adición de 500 pg/l de anhidrotetraciclina (Skerra (1994) loc. cit.) tan pronto como el cultivo alcanzó una OD<550>= 40. Después de un periodo de inducción de 2,5 h, las células se recogieron por centrifugación y se volvieron a suspender durante 10 min en tampón de fraccionamiento periplásmico helado (500 mM de sacarosa, 1 mM de EDTA, 200 mM de ácido bórico/NaOH pH 8,0; 2 ml por L yDDO55ü). Después de añadir 15 mM de EDTA y 250 pg/ml de lisozima, la suspensión celular se incubó durante 20 min en hielo, se centrifugó varias veces y se recuperó el sobrenadante aclarado que contenía la proteína recombinante.

Los extractos periplásmicos se dializaron dos veces a 4°C frente a 15 l de PBS que contenía 1 mM de EDTA durante por lo menos 6 h, respectivamente, se filtraron usando una membrana de nitrato de celulosa de 0,2 pm (GE Healthcare) y se precipitaron mediante la adición de sulfato de amonio (grado Ph.Eur.; Applichem, Darmstadt, Alemania) hasta una saturación del 25% a 25°C. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se volvió a suspender en tampón de funcionamiento AEX (25 mM Na-borato pH 9,0, 1 mM EDTA) y se dializó a 4°C frente a 5 l de tampón de funcionamiento AEX durante por lo menos 6 h. La solución dializada de proteínas se limpió de materia insoluble restante mediante centrifugación y se sometió a cromatografía de intercambio aniónico sustractivo usando una columna HiScale™ de 85 ml (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) empaquetada con resina Source15Q, conectada a un sistema purificador Ákta™ (GE Healthcare, Friburgo, Alemania), equilibrada en tampón de funcionamiento AEX. El flujo de la columna que contenía la proteína pura (ver laFig. 6Ay6B)se dializó dos veces frente a 5 l de PBS.

Se obtuvieron preparaciones de proteínas homogéneas sin signos de agregación con un rendimiento final de 128 mg para la PA#1(200)-Crisantaspasa y 48 mg para la PA#1(400)-Crisantaspasa de un fermentador de 8 l, respectivamente. Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la absorción a 280 nm usando un coeficiente de extinción calculado (Gill (1989) Anal. Biochem. 182: 319-326) de 19370 M-1 cm-1. Las actividades enzimáticas de las proteínas de fusión se determinaron usando el ensayo de Nessler descrito en el ejemplo 1. En esta configuración, la proteína de fusión PA#1 (200)-Crisantaspasa tenía un 109% y la PA#1 (400)-Crisantaspasa tenía un 118% de actividad enzimática en comparación con la Crisantaspasa no modificada ensayada de igual manera. Esto demuestra que la fusión N-terminal de la Crisantaspasa con polipéptidos P/A hasta una longitud de por lo menos 401 aminoácidos no afecta a la actividad enzimática.

Ejemplo 6: Medición del volumen hidrodinámico de la Crisantaspasa genéticamente y químicamente PASilada mediante filtración analítica en gel

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo en una columna Superdex™ S200 aumento 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Friburgo, Alemania) a un caudal de 0,5 ml/min usando un sistema Ákta™ Purifier 10 (GE Healthcare) con PBS (115 mM NaCl, 4 mM KH<2>PO<4>, 16 mM Na2HPÜ4; pH 7,4) como tampón de funcionamiento. Usando dispositivos de ultrafiltración desechables de celulosa regenerada (MWCO 10 kDa; Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania) la Crisantaspasa recombinante fusionada genéticamente con los polipéptidos PA#1(200) o PA#1(400) (descritos en el Ejemplo 5) y la Crisantaspasa conjugada químicamente con el péptido Pga-P/A(40)-Ahx (descrito en el Ejemplo 2) o con el péptido Pga-P/A(20)-Ahx (descrito en el Ejemplo 3) se ajustaron a una concentración de 1 mg/ml en PBS. Se aplicaron individualmente a la columna muestras de 150gl de las enzimas concentradas PASiladas y de Crisantaspasa no PASilada y se superpusieron las trazas de cromatografía(Fig. 7A).

Las cinco proteínas eluyeron en picos homogéneos individuales.

Para la calibración de la columna(Fig. 7B)se aplicaron 150gl de una mezcla apropiada de las siguientes proteínas globulares (Sigma, Deisenhofen, Alemania) en PBS a concentraciones de proteína entre 0,5 mg/ml y 1,0 mg/ml: citocromo c, 12,4 kDa; ovoalbúmina, 43,0 kDa; albúmina sérica bovina, 66,3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa; p-amilasa, 200 kDa; apo-ferritina, 440 kDa; tiroglobulina, 660 kDa.

Como resultado, tanto las proteínas de fusión PA recombinantes como las preparaciones enzimáticas conjugadas químicamente mostraron un tamaño significativamente mayor que las proteínas globulares correspondientes con el mismo peso molecular. Al aumentar el tamaño de la fracción de (poli)péptido P/A, esta desproporción peso molecular/volumen hidrodinámico aumentó aún más. El aumento de tamaño aparente de la PA(200)-Crisantaspasa fue de 5,1 veces en comparación con la Crisantaspasa no fusionada, mientras que la masa real sólo fue 1,5 veces mayor. El aumento de tamaño aparente de la PA(400)-Crisantaspasa en comparación con la Crisantaspasa no fusionada fue de 10,4 veces, mientras que la masa real sólo fue 1,9 veces mayor. Esta observación indica claramente un volumen hidrodinámico muy aumentado conferido a la enzima Crisantaspasa biológicamente activa por el segmento polipeptídico Pro/Ala de acuerdo con esta invención.

Ejemplo 7: Análisis ESI-MS de Crisantaspasa química o genéticamente PASilada

Se aplicaron 250 gl de la proteína modificada químicamente purificada de Crisantaspasa con Pga-P/A(20)-Ahx del Ejemplo 3 y de las proteínas recombinantes de fusión PA200- y PA400 del Ejemplo 5, todas a una concentración de 1 mg/ml, a una columna Resource™ RPC de 1 ml (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) conectada a un sistema purificador Ákta™ usando acetonitrilo al 2% v/v, ácido fórmico al 1 % v/v como tampón de funcionamiento. Las proteínas se eluyeron usando un gradiente de acetonitrilo del 2% v/v de acetonitrilo, 1% v/v de ácido fórmico al 80% v/v de acetonitrilo, 0,1% v/v de ácido fórmico en 20 volúmenes de columna. Las proteínas eluidas se analizaron directamente mediante espectrometría de masas ESI en un instrumento micrOTOF maXis™ (Bruker Daltonik, Bremen, Alemania) usando el modo de iones positivos. El espectro m/z bruto de la proteína Crisantaspasa/Pga-P/A(20)-Ahx modificada químicamente se muestra en laFig.8A.Las masas reveladas por el espectro de masas deconvolucionado(Fig. 8B)se indican en laTabla 3. La distribución de masas coincide con las relaciones de acoplamiento determinadas por el análisis SDS-PAGE descrito en el Ejemplo 2.

En laFig. 8Cse muestra el espectro m/z bruto de la proteína de fusión recombinante PA#1(200)-Crisantaspasa (SEQ ID NO: 11). El espectro de masas deconvolucionado reveló una masa de 51164,75 Da(Fig. 8D), que coincide esencialmente con la masa calculada de esta proteína (51163,58 Da). En laFig. 8Ese muestra el espectro m/z bruto de la proteína de fusión recombinante PA#1(400)-Crisantaspasa (SEQ ID NO: 13).El espectro deconvolucionado(Fig. 8F)reveló una masa de 67199,17 Da, que coincide esencialmente con la masa calculada de esta proteína (67201,99 Da). Esto demuestra claramente que la enzima Crisantaspasa intacta fusionada genéticamente a PA200 o PA400 puede producirse en E. coli de manera altamente homogénea.

Tabla 3:Comparación de las masas calculadas y medidas detectadas en la preparación de la proteína Crisantas asa/P a-P/A 20 -Ahx modificada uímicamente

Ejemplo 8: Actividad de la asparaginasa

La actividad de la enzima L-asparaginasa PASilada se determinó mediante la catálisis de la conversión de L-asparagina en ácido L-aspártico. Esta reacción libera un mol de amoníaco por mol de L-asparagina convertida. El amoníaco liberado se detecta usando el reactivo de Nessler. En presencia del reactivo de Nessler, el amoníaco formará un complejo amarillo soluble en agua que puede cuantificarse midiendo la absorbancia a 450 nm (Mashburn et al. (1963) Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 50). Una unidad de actividad enzimática de L-asparaginasa (Unidad Internacional o IU) se define como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de un gmol de L-asparagina por minuto. La actividad específica de las muestras (lU/mg) se determina dividiendo el valor de la actividad de la L-asparaginasa expresado en lU/ml por la concentración de proteína expresada en mg/ml. Se midió la masa del monómero de proteína con la secuencia PASilada.

La medición de la actividad de la L-asparaginasa se basa en un ensayo de criterios de valoración en el que la muestra se diluye hasta una serie de concentraciones finales de enzima que se incuban a continuación a 37°C bajo una concentración saturante de L-asparagina durante 15 minutos. La reacción se detiene mediante la adición del reactivo de Nessler y la cantidad de amoníaco producida por la reacción se extrapola a partir de una curva de calibración construida a partir de cantidades conocidas de sulfato de amonio usadas como estándar. A continuación, se crea un gráfico de la concentración de enzima frente al amoníaco para cada muestra y se divide la pendiente de la curva por el tiempo de reacción para obtener la actividad específica en lU/mg. La actividad específica se expresa en lU/mg y se expresa al número entero más próximo.

En la tabla siguiente se muestran los resultados iniciales de las pruebas para cada una de las proteínas modificadas o proteínas de fusión.

Ejemplo 9: Farmacocinética

Se caracterizó el perfil farmacocinético de la crisantaspasa recombinante expresada porE. colicomo proteína de fusión PASilada (PA-200) o conjugada químicamente con péptidos PA (PA-20) después de la administración de una única dosis en bolo intravenoso a ratones CD-1. El ratón CD-1 es un modelo de ratón sano.

Todos los animales recibieron un único bolo intravenoso (IV) a través de la vena lateral de la cola (10 ml/kg) sobre la base del peso corporal tomado antes de la dosificación. Las dosis individuales se calcularon basándose en los pesos corporales individuales más recientes para proporcionar la dosis adecuada. El primer día de dosificación se basó en los pesos corporales del día 0 del estudio. Se observó a todos los animales dos veces al día, una por la mañana y otra por la tarde, para detectar mortalidad, anomalías y signos de dolor y angustia.

Se administró asparaginasa PASilada a ratones en una dosis IV única de 25 lU/kg de peso corporal. Se dosificaron a grupos de ratones a 25 lU/kg de peso corporal y se recogieron muestras de plasma en momentos programados durante un máximo de 10 días (240 h) después de la dosificación. La actividad de la asparaginasa en el plasma de los ratones se midió usando un ensayo bioquímico cualificado, como se describe en los ejemplos anteriores. Se trazaron los datos de la actividad plasmática media de la asparaginasa (n=4) frente al tiempo (Figuras 1) y se llevaron a cabo análisis farmacocinéticos.

Se tomaron muestras de sangre antes de la dosificación y aproximadamente a las 6, 24 (Día 1), 48 (Día 2), 51 (Día 2), 54 (Día 2), 60 (Día 2), 96 (Día 4), 168 (Día 7) y 240 (Día 10) horas después de la dosis. Se empleó un procedimiento de extracción de sangre con un recorte de la cola (corte en el extremo de la cola). Se cortó aproximadamente de 1 a 2 mm del extremo distal de la cola para la primera extracción de sangre, todas las extracciones de sangre secuenciales se recogieron del mismo sitio quitando la costra y facilitando el flujo sanguíneo acariciando la cola. Se recogieron aproximadamente 100 gl de sangre por punto temporal en tubos de muestreo K<3>EDTA (Minivette) refrigerados. La sangre se transfirió a tubos apropiados para la centrifugación. Para el aislamiento del plasma, todas las muestras se centrifugaron aproximadamente 20 minutos después de la toma de muestras a 3.000 x g en una centrifugadora refrigerada ajustada para mantener aproximadamente 4°C durante aproximadamente 10 minutos. Después de la centrifugación, se recuperó la máxima cantidad de plasma (30 gl como objetivo) y se colocó en viales de plástico. Los viales de plástico se almacenaron entre -65°C y -85°C hasta la realización de las pruebas.

La actividad de la asparaginasa se midió como la concentración de asparaginasa en las muestras de plasma como se ha descrito con anterioridad (Allas et al. (2009) Blood, 114, 2033). Los parámetros dependientes de una caracterización suficiente de la fase terminal del perfil de concentración frente al tiempo (t1/<2>, CL y Vss) sólo se comunicaron si R2 (el cuadrado del coeficiente de correlación para la regresión lineal usada para estimar la constante de tasa de eliminación terminal, Az) era mayor de 0,8. Los datos farmacocinéticos se importaron a Phoenix WinNonlin v6.4 (Certara/Pharsight) para su análisis. Los datos de actividad de asparaginasa en plasma frente al tiempo se analizaron usando métodos no compartimentales con muestreo disperso en un modelo de administración IV en bolo. Los valores de actividad por debajo del límite de cuantificación del ensayo (10 U/l) se fijaron en cero en el cálculo de las medias de grupo. Para los cálculos se usaron niveles de dosis nominales y tiempos de recogida de muestras. Los valores t<1/2>estimados fueron de 50,2 h para la PA-20 crisantaspasa y de 17,9 h para la PA-200 crisantaspasa.

La presente invención se refiere a las siguientes secuencias de nucleótidos y aminoácidos:

Algunas secuencias proporcionadas en la presente están disponibles en la base de datos del NCBI y pueden recuperarse de www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene; Estas secuencias también se refieren a secuencias anotadas y modificadas. La presente invención también proporciona técnicas y métodos en los que se usan secuencias homólogas y variantes de las secuencias concisas proporcionadas en la presente. Preferiblemente, tales "variantes" son variantes genéticas.

SEQ ID No. 1:

Secuencia de aminoácidos de la L-asparaginasa de Dickeya chrysanthemi.

A D K LPN JV ILA TG G TJA G SA A TÍ iTQ TTG Y K A G A LG V D TLJN A V PEV K K LA N V K G EQ FS N M ¿V SENM T GD W T ,KT, SQR VNFT J , A RD D V D G W T T H G T D T VEJ- S A YFT ,HT. T VK SDKP YYFVA AM R?ATATS ADGPMNT T FA V RV A G D K Q S R G R G W V V l N D PTG SA RY ITK TN A STT-DTFK ANFFGYT =:GVTTGNRTYYfQNRTEEKT H’T T R S W T )\T U iI,TST PKVDTT A T<t>Y O D D PF, YT. Y D A A TQHGYK GT V Y A G M G A GS V S Vjfc GT A GMRT< A \ÍF K GV V VER S TRT GNGTYPP DLiLiLPGJL V SD SÉ NP Al 1ARLLLML AL ERTSDPK V1QE Y1111’Y

SEQ ID No. 2:

Secuencia de nucleótidos que codifica la L-asparaginasa de Dickeya chrysanthemi

GCAGATAAACTGCCGAATATTGTTATTCTGGCAACCGGTGGCACCATTGCAGGTAG C G C AC¡ CAA C CGGC ACC C AAAC C AC A G G i i A l AAAG C C G G 1G C A C IG G G i G i l G A l ACCCTGATI AA l’GCAG T TCCGGA AG T TA A AAAAC IGGCC A A i G'l GA A AGG EGA AC AG L E l’AGC AA 1AJ GGCCAGCG A A A A JA l’G ACCG G 1GAJ1G E1G E1 C'l GAAAC i GAG CCACíCGEG'JJ AAT GAAC TGC J G GCACGl GA'J GA 1 G'l EG A.'J G G l G EGG E i A i 1ACCC ATGGCACCGATACCGTTGAAGAAAGCGCCTATTTTCTGCATCTGACCGTGAAAAGC GATA A ACCGGTTGTTTTTGTTGCAGCA ATGCGTCCGGC AACCGCA ATTAGCGC AGA EG G i C C G A l G AA'l C 1 G C EG G A A G C A G E i C G'l Ci E1 G C C G G'l G A l A AAC AG AG C C G T GGTCGTGGTGTTATGGTTGTTCTGAATGATCGTATTGGTAGCGCACGCTATATTAC C AAAACC AA i GC AAGCACCC i GG A EACC: i 11 AAAGCC A A i G AAG AAGG i 1 A 1C EG GGCG í l A l l A l l GGCAA ECGCAl l l A'l'l A ECAGAA EC G CA J’ EGAEAAAC lG C A lA C

t ■ A C CC GT AGC G TTTTTG A TGTT C GTG G TC TG A CC A GCCT GCCG A A A GTTG AT ATT C J G EA i GGC i A l CAGGA EGA EECGG A A i A l C J G EA EGA 1GCAGCCLA E EC AGC A i GG i G El A A 4 G G i A i 1 G'l G 1A EG C AG G i’A 1 GGG'l G C AGG'l A G C G 11 AGC G1 ’ EC G 1G G i AA TÜCAGCTATGCGTAAAGCAATÜG.AAAAAÜÜCGTTGTTGTTATTCGTAGCACrCGT AC C G G EA A i GG l A l 1 G E EC C GCC G G A 1G AAG A AC'l G C C GGG'l C 1 Ci G 1 E AG C G A E A GCCTGAATCCGÜCAOVTGCACGTATTCTGCTGATGCTGGCACTGACCCGTACCAGC

C5ATCCC5AAACiTGATTCA£3CJAATATTTT('AT ACCTAT

SEQ ID No. 3:

Secuencia de aminoácidos del Péptido señal de L-asparaginasa de Dickeya chrysanthemi: 1 -28; eliminado durante la clonación: 29-39; 40-366 asparaginasa

M F’KE K K N E L V G L S A A L M S IS L T ’S A T ASAAKRAIl 'ÜRSSAADKLP^IV1L. A'J' G G T1AGS A A T G T Q T T G Y K A G A L G V D T L IK A V P E V K K L A N Y K G E Q F S N M A S E N M T G D V V L K L S Q R V N E L L A R D D V D G V V JT H Í iT D T V E E S A Y F L H L T V K S D K P Y Y F V A A M R P A T A lS A D G P M N L L E A V R V A G D K Q SR G R G V M \~ T1NDRI G S A R Y IT K T K.A S T LD TFK A N E E G Y L GVTIGM RIY Y Q N R [ D K LH TT R. S V F D V R G L T1 SL.P K V D ] L YG Y Q D D P E Y L Y D A A IQ H G VK G [ V Y A i i M G A GS V S V R GÍA GRÍR K A M E K GYYVTR S TR T G N G 1V P PD F E Í P G r Y S m i NPAHARTT T, MT A L T R T SD PK V T Q E Y FH T Y

SEQ ID No. 4

Secuencia de nucleótidos (sintética) que codifica asparagina madura de L-asparaginasa de Dickeya chrysanthemi codificada a partir de la base 160-1140 (letras en negrita). Por tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica la L-asparaginasa abarca desde los nucleótidos en la posición 160 a 1140.

T C T A i iA A AT A A T T T T G T T T A A C T T T A AGA A i K i A G A T A T A G A T A T G T T C A A A T T C A A A A A A A A í T T C í T G GT G G G T C T G A G C G C A G C A C T G A TG A G C A TT AG C C T G T T T A G C G C A A C C G C A A G C G C A G a V G A A G A G C G A T T G T A G G A C G C T C T T C T G C C G C A G A T A A A C T G C C G A A T A T T G T T A T T C T G G C A A O X ^ G T G G C A ÍX ^ T T G C A G G T A G C G C A G C A A C ÍX tG C A C C C A G A C C A C C G G T T A T A A A G O X ^ G T G C A C T G G G T G T T G A T A C C C T G A T T A A T C C A G T T C C G G A A G T T A A A A A A C T C C C C A A T C T T A A A C C T G A C C A C T T T A C C A A T A T C G C C A G C G A A A A T A T G A C C G G T G A T C T T G T T C T G A A A

C 1G A G G G A G r G 1G 11A A PG A A Í :<í>G C I X ^ ^ A C G IG A 1G A I G I I G A I I G 1 I ( I T T A T T A C C C A 1 G G C A C C G A 1 A C C G T T G A A G A A A G C G C A 1 A 1 T T T C T G C A T C T G A C C G T G A A A A G C G A T A A A C C G G T T G T T T T T G T T G C A G C A A T G C G T C C G G C A A C C G C C A T T A G C ÍiC A G A T G G T C C G A T G A A T C T G C T G G A A G C A G T T C G T G T T G C C G G T G A T A A A C AG A G C C G T C G T C G T G G T G T T A T G G T T G T G C T G A A T C A T C G T a t t c c t a c c c c a c g t t a t a t t a c c a a a a g c a a t g c a a g c a c c c t c c a t a c c t t T A A A G C A A A T G A A G A A G G T 1 A T C 1 G G G C G T C A T T A T T G G C A A T C G T A T C T A T T A rC A fx A A tX 'G C A lT IG A C A A A C l’G C A l’A f lC A C fX 'G l ’A G C G l I I I’ l ’f iA Í G i l ’C G í’ G G T C T G A C C A G C C T C C C G A A A G T G G A T A T T C T C T A T G G T T A T G A G G A T G A T C C G G A A T A T C T C T A T C ^ T C C A C C A A T T C A C C A T G G T C T G A A A C G T A T T G T T T A T G C A G G 1A 1 G G G i G C G G G 1 A G C G 1 1 A G C G T I C G I G G 1 A T 1 G C C G G 1 A T G C G i A A A G G A A T G G A A A A A G G T G i i G 1 i G i G A 11 C G J A G C A C C C G 1 A C C G G 1 A A 1G G T A T T G T T C C G C C T G A T G A A G A A C T G C C T G G T C l G G T T A G C G A l ’A G C C l ’G A A I ’C C G G C A C A T G C A G G 1 A E T C 1 G C 1 G A 1 G C 1 G G C A G T G A C C C G i A C C A G C G A T C C G A A A G T T A T T C A A G A A T A T T T T C A T A C C T A T T A A G C T T

SEQ ID No. 5:

Secuencia de aminoácidos del péptido PA(20)

AAPAAPAPAAPAAPAAPAAPA

SEQ ID No. 6:

Secuencia de nucleótidos que codifica el péptido PA(20)

G C C G C G C C A G C G G C C C Í G G a X X T G C C G C G C C C G C T G C T ÍX X X iC C C C T G C T G C C C C A G C C SEQ ID No. 7:

Secuencia de aminoácidos del polipéptido PA(200)

A A PA A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A APA A A P A A P A P AA P A A P A P A A PA A A PA A PAR A A PA AP A PA A PA A A PA A P A P A A PA AP A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A R A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P AP A AP A A A P A AP A P A AP A A P A P A A P A A

SEQ ID No. 8:

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PA(200)

G C C G C G C C A G C G G C C X X G G C C C C T G C C G C G C C C G C T G C T C C C G C C C C T G C T G C X X C A G C C G C C G C T C C T G C G G C A C C T G C G C C C G C C G C G C C G G C A G C G C C G G C A C C G G C A G C T C C G G C C C C C G C G C C T G C<a>C C T C C T G O A C C C C<t>C G G C T C C A G C A G C C C C G G C G C C G G C C G C A C C T G C G G C G G C G C C C G C G G C G C C T G C A C C C G C A G C G C C T G C G G C A C C G G C C C C A G C A G C C C C T G C C G C C G C A C C G G C T G C G C C T G C C C C A G C G G C C C C C G C T G C C C C G G C C C C G G C G G C T C C A G C C G C A G C G C C IG C C G C C C C A G C G C C C G C A G C A C C G G C G G C A C C A G C IC C G G C G G C G C C G G C G G C G G C T C C G G C A G C T C C G G C C C C TGC T G C G C C G G C T G C G C C G G C T C C G G C G G C C X X 'T G C G G C G G C T C C G G C C G C A C C T G C A C C T G C C G C G C C G O C T G C T C C G G C C C C G G C L G C C C C A G C A G C G G C A C C A G C A G C G C C T G C T C C T G C G G C G C C T G C A G C T ÍX X X K 'G C C G G C A G C C C C G G ÍX X iC C G C A C C C G C (¡<}<c t í x>:<a g c x x x>:<í x>](<x>:<c íg t c x>'<a í x>:<a><<k x x>:<í x>:<g c c>¡(<x>:<a g c t c>¡( :<a í x>:<t g c t í x x>:

SEQ ID No. 9:

Secuencia de aminoácidos del polipéptido PA(400)

A A P A A P A PA A P A A P A P A APA A A P A A P A P A APA A P A P A A P A A A P A A P A P A APA APA P A A P A A A P A A P A P A A P A A P APA A P A A A P A A P APA A P A A P A P A A P A A A P A A P APA APA A P APA APA A A PA A PA PA APA A PA PA APA A AP A A PA PA A PA A P A P A APA A APA APA P A A P A A P A P A A P A A A P A A PA PA A P A A P ,APA APA A A P A A P A P A A P A A P A P A APA A APA A PA P A APA AP A PA A PA A APA AP A PA A PA A PA PA A PA A A PA A P A P A A PA A PA PA APA A A PA A PA PA APA A PA PA APA A A PA A PA PA APA APARA APA A APA A PA PA APA A PA PA APA A A P A A iA A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A SEQ ID No. 10:

Secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido PA(400)

SEQ ID No. 11:

Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Asparaginasa-PA(200)

A A P A A P APA A PA A P A P A APA A A P A A P A P A APA A P A P A A P A A A P A A P A P A APA APA PA

A ? A A A ? A A ? A ? A AP A A ? A P A A ? A A A P A AP A P A A ? A A P A ? A A P A A A ? A AP A P A A P A A ? APA APA A A PA A PA PA APA A PA PA APA A AP A A PA PA A PA A PA PA APA A APA AP A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A D K L P E 1VIL A T G G Li AG $ A A T G i Q i TG Y K A G A LG VD J LJN AVPLi V K K L A h VKGLiQi SM M A.SEN Ivl'i'GD V V L K L SQ R VN LiLLARD DNTX<j>WTTHGTOTVFT.S AYFLHT ,TVK S D K P W F V A A VfRP A'T ATS A DG PM NT J..E A V R V A G D K Q S R G R G V V m E N D R l& S A R Y T T K T N A STf DTPK A N FEG Y LG V ITG K RTY Y Q N RT DKLJ J T1R SV 1 D V R G L J S L P K V D lL Y G Y Q D D P IiY L Y D A A lQ l IG V K G 1V Y A G M G A G S V S V R G<[>A<<i M>R K A M BK<C i>V V V<]>R ST RTG<K C>i<]>V PPD E ELPC<i>LS D SL<K>P A<H>A R<[>L LMLALTR<T>SDPTÍ V PQ EY FH TY

SEQ ID No. 12:

Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Asparaginasa-PA(200) (XbaI/HindIII) Proteína de fusión madura (SEQ ID NO 11) codificada desde la base 127-1710 (letras en negrita). Por tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión puede abarcar desde nucleótidos en la posición 127 hasta 1710 de la SEQ ID NO: 12. Por consiguiente, el término "proteína modificada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como la que se muestra en la SEQ ID NO: 12", como se usa en la presente, puede definirse de forma más estricta como "proteína modificada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como la que se muestra en las posiciones 127 a 1710 de la SEQ ID NO: 12".

TCT A i TA A AT A ATTTTGTTT A ACTTTA AGA A< Xi AGATAT AC ATATGTTC A A ATTC A A A A A A A A C TTC í T G GT G G G TCTG AGCGC AGC A (X G A TG A GC ATT A( i C C TGTTT A GCG C A ACCGC AAGCGCA G C C G C G C C A C C C C C C C C G C C C C C T C C C C C C C C C C C T C C

<t c c c g c c c c t g><:<t g c c c c a g c c g í x>:<g c t c c t g c g g c a c c t g c g í>:<c c g c c g í>;<g>C C C C C A G C C C C C G C A C C G G C A G C T C C G G C G G C C C C G C C T C C A C C T C C T C C A C C G G C G G C TC C A G C A G C C C C G G C G C C G G C C G C A C C TG C G G C G G C G C C C G C G G C G C C IG C A C C C G C A G C G C C JG C G G C A C C G G C C C C A G C A G C C C C IG C C G C C G C A C C G G C TG C G C G i G CCCCAG C GGCX CX CGC: 1 G C C C C G G t t C C G G C G G C 1f x A G C C G C A íirG C C T G C t G tx xc:A G í:G t:ct:íK :A íx:A (:c:G G t:G G í:A (:c:A (ií:Tc c g g c g g c g c c g g c g g c g g c t c c g g c a í t c t c c g g c c c c t g c t g c g c c g g c t C C C C C G C C T C C C G C G G C C C C T C C G G C G G C T C C C G C C G C A C C T G C A C C T C C C G C G C C G G C TG C TC C G G C C C C C G C TG C C C C A G C A G C G C C A C C A G C A G C G C C T G C T C C IG C G G C G C C rG C A G C TC C G G C G C C G G C A G C C C C G G C X G C C G C A C C C G C G G C IC C A G C C C C C G C C G C JX C A G C A G C C C C X G C G C C A G C IG C A C C T G C 1G CCG CAG A T A A A C T G C C G A A T A l T G l 1A T T tT G G C A A C C G G TG G C A CX A T I G C A GG iA G C G C A G C A A C C G G C A C C C A G A C X ACX G G T I A TA A A G C C G G J G C A C I GG G T G T T G A T A C C C TG A T T A A T G C A G T TC C G G A A G TT A A A AAAC T G G C C A A T G T T AAAG G TG AG CAG T T T A G C A A TA TG G CCAG CG A A A A T A lG A C C G G lG A l G TTG T T C T G A A A C TG A G C C A G C G T G T T A A T G A A C T t iX T ÍX X : A C G T G A T G A T G T T G A T G G TG TT G T T A T T A C C C A T G G C A C C G A T A C C G T T G AAG A A AG C G C A T A T T T T C T G C A T C T ÍT U X X T rG A A A A G C G A T A A A C C G G T T G T T T T T G T T G C A G C A A T G C G T C C G G C A A C C G C C A T T A G C G C A G A T G G T C C G A T G A A T C T G C T G G A A G C A G T T C G T G T T G f X X iG T G A T A A A f ;AG A G Í X X TTG G TÍ X X G G T G T T A T ÍT G T T G T ÍiC T G A AT C A T C G T A T T G G T A G C G C A C G T T A T A T T A rC A A A ACCAA TG C A A G C A C C C TG G A TA C C TTTA A A G C A A A TG A A G A<a c c t t a t c t g c c c c t c a t t a t t c c c a>A TC C TA T C T A T T A IX AG A AG CG C A l C GAGA AACT G C A TA C C A C CX. G 1 AG C G T T T T T G A T G T T C G TG G TC T G A CCAG C C TG C C G GGAG T G G A T A T T C TG J A I G G TT A T C A G G A T (4A T ( X X X fA A T A T C T G T A TG A T€§tTA G C A A T T G A (X .'A K iG TG X G A A A ^ G T A X T G T T T A TG< T4GG T A T G G G T G C G G G T A G C G T T A GC G TTC G T G G T A T T G C C G G T A TG C G T A A A G C A A T G G A A A A A G G T G T T C T T G T G A T T C G T A G C A C C C G T A C C G G TA A T G G T A T T G T T C Í X<t>C C T G A T G M G A A ( :TC ií X T ( X r T f X (X<t>T T A<í t>( G ATA GC C T G A A T C C C C C A C A T G C A C G T A T T C T C C T C<a t g c t c c c a c t g a c c c c t a c c a c>C G A TC C G A A A G T T A TTCAAC A AT A T T T T C A T A C C T A TTA AGCTT

SEQ ID No. 13:

Secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión Asparaginasa-PA(400)

A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A A P A A P AP A AP A A APA AP AP A AP A APA P A AP A A AP A AP APA AP A AP AP A AP A A. AP A APá Pá AP A A P A P A A P A A A P A A PAR A A PA A P AP A A P A A A P A A P A P A A P A A P A P A A P A A A P A A P A P A AP A AP AP A APA A APA APAPA AP A APAPA A ? A A APA APAPA AP A AP AP A AP A A APA A PAPA APA APAPA APA A APA APAPA APA APAPA APA A AP A AP AP A APA APAPA APA A A PAAPAPAAPAAPAPAAPAAAPAAPAPAAPÁAPAPAAPAAAPAAPAPAAPAAPAPAAP A A ADKT ,PNTVTT, ATGGTTAGS A ATGTQTTGYTC A G A P G V D n ,TN A'VPF.VKKT. ANVKGF QFSNM A SF.NMTGDVVT KT SQRYIYFT J , APDDYT^GV VTTPTGTDT YTTS A VFT FTT,T VK SD K P W F V A AM R? AT ATS ADGPMNT J T A VR VA GT)K Q SP GT< GVM V VT NDRTGS ARYTTKT XAS T L D T M A Y liliG V L G Y liG R R i Y Y Q N R ID K L in i RS VT DVRGLT SLPK VD1L YGYQDDPEYLYDA AlQHÍj VKGIV Y AÜM Ü AÜS VS VRGIAÜM RK AMEKU V V VI RSTRTGKü [ VP PDEELPGLV SDSLNPAl 1ARILLJML AL LRJ SDPK VlQE Y liiT Y

SEQ ID No. 14:

Secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Asparaginasa-PA(400)

(Xbal/HindIII)

Proteína de fusión madura (SEQ ID NO 13) codificada a partir de la base 127-2184 (letras en negrita). Por tanto, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión puede abarcar desde nucleótidos en la posición 127 a 2184 de la SEQ ID NO: 14. Por consiguiente, el término "proteína modificada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14" como se usa en la presente puede definirse de manera más estricta como "proteína modificada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en las posiciones 127 a 2184 de la SEQ ID NO: 14".

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SEQ ID NO 15: Secuencia de aminoácidos del péptido PA(40)

AAPAAPAPAAPAAPAAPAAA PAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPA

SEQ ID NO 16: Péptido PA(20) modificado

Pga-AAPAAPAAPAAPA-Ahx-COOH

SEQ ID NO 17: Péptido PA(40) modificado

Pga-AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPA-Ahx-COOH

Lista de referencias

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Carpino, L.A. & El-Faham, A. (1995) Tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate: a rapid-acting peptide coupling reagent for solution and solid phase peptide synthesis. J. Am. Chem. Soc. 117(19), 5401-5402.

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Wuts, 2012

Wuts, P.G. & Greene, T.W. (2012) Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis. Cuarta Edición. John Wiley &

Sons.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína modificada que comprende una L-asparaginasa y un polipéptido, en donde el polipéptido consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina, en donde la proteína modificada es una proteína de fusión de la L-asparaginasa y el polipéptido, y en donde dicho polipéptido consiste en de 100 a 600 residuos de aminoácidos prolina y alanina.

2. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha L-asparaginasa:

(a) tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;

(b) tiene por lo menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;

(c) tiene por lo menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; o

(d) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

3. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido consiste en de 200 a 400 residuos de aminoácidos prolina y alanina.

4. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichos residuos de prolina constituyen más del 10% y menos del 70% del polipéptido.

5. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la L-asparaginasa puede contener uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos adicionales.

6. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la L-asparaginasa está enlazada covalentemente a un residuo terminal del polipéptido directamente mediante un enlace peptídico.

7. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos AAPAAPAPAAPAAPAPA (SEQ ID NO: 5) o versiones circulares permutadas o (a) multímero o multímeros de las secuencias en su totalidad o partes de la secuencia.

8. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho polipéptido consiste en de aproximadamente 100 a aproximadamente 600 residuos de aminoácidos prolina y alanina, preferiblemente en donde dicho polipéptido consiste en un total de aproximadamente 200 residuos de aminoácidos prolina y alanina o un total de aproximadamente 400 residuos de aminoácidos prolina y alanina, preferiblemente en donde dichos residuos de prolina constituyen más de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 70% del polipéptido, y preferiblemente en donde dicho polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO:5) o versiones circulares permutadas o (a) multímero o multímeros de las secuencias como la totalidad o partes de la secuencia.

9. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

(a) en donde dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:7 o 9;

(b) en donde dicho polipéptido comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO:8 o 10.

10. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

(a) en donde dicha proteína modificada comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO:11 o 13;

(b) en donde dicha proteína modificada comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEQ ID NO:12 o 14.

11. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que es una proteína modificada de L-asparaginasa y uno o más péptidos, en donde cada uno es independientemente un péptido RN-(P/A)-RC,

en donde (P/A) es una secuencia de aminoácidos que consiste exclusivamente en residuos de aminoácidos prolina y alanina, en donde RN es un grupo protector unido al grupo amino N-terminal de la secuencia de aminoácidos, y en donde RC es un residuo de aminoácido unido a través de su grupo amino al grupo carboxi C-terminal de la secuencia de aminoácidos,

en donde cada péptido se conjuga con la L-asparaginasa mediante un enlace amida formado a partir del grupo carboxi del residuo de aminoácido C-terminal RC del péptido y un grupo amino libre de la L-asparaginasa, y en donde por lo menos uno de los grupos amino libres, con los que se conjugan los péptidos, no es un grupo aamino N-terminal de la L-asparaginasa, preferiblemente en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en un total de entre 15 y 45 residuos de aminoácidos prolina y alanina, preferiblemente en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en 20 residuos de aminoácidos prolina y alanina, o en donde dicha secuencia de aminoácidos consiste en 40 residuos de aminoácidos prolina y alanina, y preferiblemente en donde dichos residuos de prolina constituyen más de aproximadamente el 10% y menos de aproximadamente el 70% de la secuencia de aminoácidos.

12. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha secuencia de aminoácidos es AAPAAPAPAAPAAPAAPAAPA (SEQ ID NO:5) o AAPAAPAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPA(SEQID NO:15), preferiblemente en donde RN es piroglutamoilo o acetilo, y/o en donde RC es ácido £-aminohexanoico.

13. La proteína modificada de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde por lo menos uno de los grupos amino libres, con los que se conjugan los péptidos, es un grupo £-amino de un residuo de lisina de la L-asparaginasa; o en donde los grupos amino libres, con los que se conjugan los péptidos, se seleccionan del grupo que comprende el grupo o grupos £-amino de cualquier residuo o residuos de lisina de la L-asparaginasa y el grupo o grupos a-amino N-terminales de la L-asparaginasa, preferiblemente en donde la L-asparaginasa se compone de cuatro subunidades, y en donde de 9 a 13 péptidos como se define en la reivindicación 11 o 12 se conjugan con cada subunidad de la L-asparaginasa.

14. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho polipéptido o péptido media una inmunogenicidad disminuida de dicha proteína modificada.

15. Un ácido nucleico que codifica la proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, preferiblemente, en donde dicho ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en:

(a) el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:12 o 14;

(b) el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 85% de identidad con la secuencia de nucleótidos definida en (a); y

(c) el ácido nucleico degenerado como resultado del código genético a la secuencia de nucleótidos definida en (a) o (b).

16. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, opcionalmente en donde dicha secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico está enlazada a otras secuencias codificantes de aminoácidos.

17. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, o el vector de acuerdo con la reivindicación 16.

18. Un proceso para la preparación de una proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 14 o de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el proceso puede comprender cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 17 y aislar dicha proteína modificada del cultivo o de dicha célula.

19. Un proceso de preparación de una proteína modificada como se define en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, el proceso comprendiendo:

(a) acoplar un péptido activado de la fórmula RN-(P/A)-RC-act, en donde RC-act es una forma activada por carboxi de RC, en donde RC y (P/A) son como se definen en la proteína modificada que va a prepararse, y en donde RN es un grupo protector que está unido al grupo amino N-terminal de (P/A), con L-asparaginasa para obtener una proteína modificada de la L-asparaginasa y péptidos en los que RN es un grupo protector, preferiblemente en donde el grupo carboxi activado del residuo de aminoácido RC-act en el péptido activado es un grupo éster activo.

20. Una composición farmacéutica que comprende la proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que opcionalmente comprende además (a) portador o portadores o excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables.

21. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la proteína modificada:

(a) está presente en una cantidad suficiente para provocar una disminución de la inmunogenicidad de la subunidad L-asparaginasa después de su administración a un sujeto humano; o

(b) está presente en una cantidad suficiente para aumentar la semivida en plasma de la subunidad L-asparaginasa después de su administración a un sujeto humano.

22. La proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o la composición de acuerdo con las reivindicaciones 20 o 21, para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

23. La proteína modificada para uso de acuerdo con la reivindicación 22, o la composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 20 o 21, en donde dicha enfermedad puede tratarse por agotamiento de L-asparagina y es un cáncer; o

la proteína modificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o la composición de acuerdo con las reivindicaciones 20 o 21, para su uso en el tratamiento del cáncer;

preferiblemente en donde dicho cáncer es un cáncer no sólido, preferiblemente leucemia o linfoma no Hodgkin, en donde dicha leucemia puede ser leucemia linfoblástica aguda (ALL) o leucemia mieloide aguda (AML), preferiblemente en donde dicha proteína modificada provoca una respuesta inmunogénica menor en el paciente en comparación con la L-asparaginasa no modificada.