ES2979391T3

ES2979391T3 - Ensamblaje del ADN

Info

Publication number: ES2979391T3
Application number: ES18728221T
Authority: ES
Inventors: Da Lin; Chris O'callaghan
Original assignee: Triple Helix Biotechnology Ltd
Current assignee: Triple Helix Biotechnology Ltd
Priority date: 2017-05-03
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2024-09-25
Anticipated expiration: 2038-05-02
Also published as: JP7305553B2; WO2018203056A1; US20250388913A1; CN111094575A; JP2020518247A; CN111094575B; EP3619311B1; EP3619311C0; EP3619311A1

Abstract

La invención se refiere a un ácido nucleico para su uso en el ensamblaje de ADN, en el que el ácido nucleico comprende al menos un elemento de restricción protegible por metilación, comprendiendo el elemento de restricción protegible por metilación: una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción que es reconocida por una enzima de restricción que corta fuera de la secuencia de reconocimiento; y una secuencia de reconocimiento de ADN metilasa, en la que la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción y la secuencia de reconocimiento de ADN metilasa se superponen de manera que la base modificada por la ADN metilasa se encuentra dentro de la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción, en la que la secuencia de reconocimiento de ADN metilasa no es idéntica a la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción ni está encerrada por ella, y en la que la secuencia de reconocimiento de ADN metilasa no se superpone con la secuencia que formaría la secuencia de extremo saliente generada por la enzima de restricción. La invención se refiere además a métodos y kits asociados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ensamblaje del ADN

Esta invención se refiere a métodos de ensamblaje de ADN y a material de ácido nucleico relacionado.

Los avances en biología y biotecnología han llevado al desarrollo de una variedad de métodos para ensamblar grandes construcciones de ADN. Los métodos existentes pueden dividirse en dos grandes grupos: métodos basados en la homología, que utilizan secuencias largas y solapadas entre fragmentos para especificar el orden de ensamblaje, como el ensamblaje Gibson y los enfoques de recombinación homólogain vivobasados en levaduras oB. subtilis, y los métodos basados en enzimas de restricción/recombinasas que utilizan una secuencia específica de enzimas definida para especificar el orden de ensamblaje, como Moclo (revisado en Nat Rev Mol Cell Biol. septiembre de 2015;16(9):568-76. doi: 10.1038/nrm4014 (PMID 2608161)2 y Crit Rev Biotecnología. mayo de 2017; 37(3):277-286. doi: 10.3109/07388551.2016.1141394 (PMID 26863154). Una lucha constante es lograr un equilibrio entre la reducción de las limitaciones del diseño de secuencias, como la secuencia prohibida en el ADN ensamblado y la secuencia de cicatrices no deseadas introducidas durante el proceso de ensamblaje, y la mejora de la modularidad del ensamblaje y la reutilización de las piezas.

El sistema inicial de ensamblaje de ADN basado en enzimas de restricción tipo IIS se denominó ensamblaje Golden Gate. En el sistema de ensamblaje Golden Gate, los fragmentos de ADN insertados que se ensamblarán dentro de los plásmidos insertados están flanqueados por sitios de reconocimiento para una enzima de restricción de tipo IIS que corta fuera de la secuencia de reconocimiento y genera extremos adhesivos arbitrarios con secuencias independientes de la secuencia de reconocimiento de la enzima. Los plásmidos de inserción para el ensamblaje de Golden Gate contienen inserciones flanqueadas por un sitio de restricción de tipo IIS dentro del esqueleto del vector de inserción frente a los insertos, de modo que una vez que los insertos son liberados del plásmido por la enzima de restricción de tipo IIS, no contienen el sitio de restricción. El vector de ensamblaje para el ensamblaje Golden Gate contiene un marcador de selección negativo flanqueado por sitios de tipo IIS ubicados en el marcador de selección frente al vector, de modo que una vez que el marcador de selección se libera del vector, la columna vertebral del vector no contiene el sitio de restricción de tipo IIS. Estos plásmidos especialmente diseñados permiten el ensamblaje simple en un solo recipiente de múltiples fragmentos de ADN mezclando plásmidos insertados y vectores junto con una enzima de restricción de tipo IIS y ADN ligasa. En la reacción de ensamblaje Golden Gate, la digestión de restricción de los insertos y el vector y la ligación entre los insertos y el vector se producen en el mismo tubo. Se generará una mezcla de productos de ligadura durante la reacción en un solo recipiente cuando los insertos y la columna vertebral del vector de ensamblaje tengan extremos adhesivos compatibles. Esto incluye productos de ligamiento favorables entre los insertos y el esqueleto del vector de ensamblaje, así como productos de ligamiento desfavorables tales como entre el marcador de selección negativo y el esqueleto del vector de ensamblaje, entre el marcador de selección negativo y el esqueleto del vector de inserto, y entre el inserto y el esqueleto del vector de inserto. Debido a que los sitios de restricción de tipo IIS están ubicados dentro del marcador de selección negativa y la cadena principal del vector de inserción, todos los productos de ligación desfavorables son susceptibles a la digestión por la enzima de restricción de tipo IIS, mientras que los productos de ligación favorables son refractarios a la digestión. Como resultado, la reacción favorece la generación de productos de ligación ensamblados correctamente entre los insertos y la columna vertebral del vector de ensamblaje a largo plazo. Seguido de la selección usando marcadores de selección de antibióticos positivos dentro de la estructura principal del vector de ensamblaje y un marcador de selección negativo dentro del inserto del vector de ensamblaje, se pudieron seleccionar con alta eficiencia plásmidos que contenían insertos correctamente ensamblados.

Los sistemas basados en Moclo se desarrollaron a partir del sistema de ensamblaje Golden Gate agregando un segundo par de sitios de restricción tipo IIS diferentes de la enzima utilizada para el ensamblaje al vector de ensamblaje para liberar el ADN ensamblado para el ensamblaje de la siguiente etapa. En el ensamblaje Golden Gate, el ADN ensamblado no pudo ser liberado por la misma enzima de restricción utilizada para el ensamblaje, porque los insertos y el esqueleto del vector plasmídico de ensamblaje carecen de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS utilizada. Al agregar un par diferente de sitios de restricción de tipo IIS para liberar el fragmento ensamblado, el proceso de ensamblaje de Golden Gate podría repetirse usando esta segunda enzima de restricción y un vector diferente que porta un marcador de selección de antibiótico diferente. Los usos secuenciales alternativos de dos enzimas de restricción de tipo IIS diferentes y marcadores de selección de antibióticos permiten el ensamblaje jerárquico de grandes fragmentos de ADN mediante una reacción de restricción/ligadura en un solo recipiente.

Un inconveniente importante del ensamblaje de ADN basado en enzimas de tipo IIS es la necesidad de eliminar los sitios de restricción internos de tipo IIS dentro de las partes de ADN que se utilizarán para el ensamblaje. Se requieren un mínimo de dos enzimas para el ensamblaje jerárquico básico y tres enzimas para otros esquemas, como la adición lineal de múltiples pasos de partes de ADN. Debido a que la mayoría de las enzimas de restricción de tipo IIS conocidas reconocen una secuencia <=6 pb, la mayoría de los sistemas basados en Moclo utilizan cortadores de 6 pb. Esto requiere que la parte de ADN esté libre de dos secuencias asimétricas de 6 pb, que ocurren con una frecuencia de ~ 1 en 1 kb para una secuencia de ADN aleatoria con un contenido de GC del 50 %. Una mejora potencial del sistema Moclo actual sería utilizar enzimas de restricción de tipo IIS con 7 pb o más de especificidad. Sin embargo, esta opción está limitada por la disponibilidad de enzimas de restricción comerciales de tipo IIS. Actualmente sólo están disponibles comercialmente dos tipos de enzimas de restricción de tipo IIS de 7 pb: LguI/SapI que reconoce GCTCTTC y deja un extremo pegajoso de 3 pb, y AarI que reconoce CACCTGC y deja un extremo pegajoso de 4 pb. AarI también requiere la adición de oligonucleótidos para una digestión completa, lo cual no es deseable para el ensamblaje del ADN. Los sistemas de ensamblaje de ADN basados en enzimas de restricción de tipo IIS existentes también están diseñados para el ensamblaje modular de ADN que deja secuencias cicatriciales no deseadas en el ADN ensamblado final y no se pueden usar para ensamblar secuencias de ADN arbitrarias sin crear vectores de ensamblaje personalizados. El documento US20160002644 describe un sistema de ensamblaje de ADN. Utiliza dos enzimas de restricción LguI y Earl, y una cepa con expresión inducible de M.TaqI para bloquear sitios de restricción solapados en el vector de ensamblaje. El sitio M.TaqI se solapa con la secuencia del extremo adhesivo de 3 pb generada por LguI/EarI, lo que deja graves limitaciones en el diseño de la secuencia del adaptador.

Lo que se requiere es un método de ensamblaje de ADN mejorado que proporcione a uno o más una mayor libertad para elegir y diseñar secuencias adaptadoras, ensamblaje con cicatrices mínimas, menos pasos de reacción o complejidad y la capacidad de ensamblar secuencias de ADN más grandes. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método de ensamblaje de ADN mejorado y material asociado.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico para su uso en el ensamblaje de ADN según la reivindicación 1 del presente documento.

En el presente documento se describe un ácido nucleico para su uso en el ensamblaje de ADN, en donde el ácido nucleico comprende al menos un elemento de restricción protegible por metilación, comprendiendo el elemento de restricción protegible por metilación:

- una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción que es reconocida por una enzima de restricción que escinde fuera de la secuencia de reconocimiento; y

- una secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN,

en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción y la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN se solapan de manera que la base modificada por la metilasa del ADN se encuentra dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción,

en donde la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN no es idéntica a, o está incluida por, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, y

en donde la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN no se solapa con la secuencia que formaría la secuencia del extremo sobresaliente generada por la enzima de restricción.

La presente invención puede permitir ventajosamente el uso de una única enzima de restricción en diferentes etapas del ensamblaje del ADN. Esto reduce el coste y la complejidad de preparar una parte inicial del fragmento de ADN para que esté libre de la enzima de restricción utilizada. Como la secuencia de reconocimiento de la metilasa no se solapa con la secuencia que formaría la secuencia del extremo saliente generada por la enzima de restricción, la invención proporciona además más libertad para diseñar adaptadores (es decir, salientes) para el ensamblaje de fragmentos de ADN. La invención también proporciona el primer sistema de ensamblaje de ADN jerárquico sin cicatrices que utiliza un método de ensamblaje basado en enzimas de restricción. A diferencia de los métodos de ensamblaje de ADN modulares existentes, que dejan secuencias cicatriciales no deseadas en el ADN ensamblado final, la presente invención se puede utilizar para ensamblar secuencias de ADN grandes y arbitrarias sin dejar cicatrices. Los sistemas de ensamblaje sin cicatrices existentes, todos los cuales se basan en métodos de ensamblaje basados en homología, tales como el ensamblaje de Gibson y la recombinación homóloga de levadura, no pueden ensamblar construcciones de ADN grandes con secuencias de ADN repetitivas, en contraste con la presente invención. El método de la invención también permite un diseño simple para el ensamblaje jerárquico y sin cicatrices de ADN utilizando un conjunto universal de 6 plásmidos.

La metilación del elemento de control de corte puede bloquear/deteriorar el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción solapada.

En una descripción, la enzima de restricción que escinde fuera de su secuencia de reconocimiento es una enzima de restricción de tipo IIS.

En una descripción, el ácido nucleico comprende al menos dos elementos de restricción protegibles por metilación. En otra descripción, el ácido nucleico presenta dos elementos de restricción protegibles por metilación. En una descripción que comprende dos elementos de restricción protegibles por metilación, la secuencia de ácido nucleico entre los sitios de corte de los dos elementos de restricción protegibles por metilación puede ser una secuencia de descarte (es decir, un fragmento no deseado que se eliminará del ácido nucleico durante una reacción de restricción). En una descripción alternativa, la secuencia de descarte puede eliminarse previamente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser un vector linealizado previamente cortado que tiene un elemento de restricción protegible por metilación en cada extremo.

La secuencia de descarte puede comprender un marcador seleccionable, un gen informador o una etiqueta. El experto estará familiarizado con los marcadores y genes indicadores típicos utilizados en el ensamblaje y la clonación de ADN. Por ejemplo, un marcador seleccionable puede comprender un gen que codifica una resistencia a antibióticos, una actividad enzimática, una luciferasa o similares. El marcador podría ser una etiqueta, tal como una radiomarca. En una descripción, la secuencia de descarte codificalacZcomo reportero. El experto reconocerá que la secuencia descartada, que puede ser reemplazada por la secuencia ensamblada en un vector, puede no contener ningún elemento funcional en absoluto, ya que el proceso favorece la generación de ADN ensamblado.

Proporcionar un marcador seleccionable, gen indicador o etiqueta en la secuencia de descarte permite ventajosamente seleccionar clones a los que se les ha eliminado o reemplazado con éxito la secuencia de descarte por un fragmento/secuencia de interés.

En una descripción, se proporciona una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción no protegible opuesta en el lado opuesto del sitio de corte del elemento de restricción protegible por metilación. Por ejemplo, en una descripción que comprende una secuencia de descarte, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta se ubicaría en la secuencia de descarte. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta también puede ser reconocida por una enzima de restricción que escinde fuera de su secuencia de reconocimiento, tal como una enzima de restricción de tipo IIS. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta puede no estar protegida por (o dispuesta para ser protegida por) metilación, o al menos puede no estar protegida por metilación de una metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de metilasa del elemento de restricción protegible por metilación. Tal secuencia de reconocimiento de enzima de restricción no protegible opuesta en la secuencia de descarte puede denominarse de otro modo una“secuencia de reconocimiento de enzima de restricción interna”, mientras que la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede denominarse“secuencia externa de reconocimiento de enzima de restricción”. secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción”.

La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede ser reconocida por la misma especie de enzima de restricción que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede comprender la misma secuencia que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta.

En una realización, el ácido nucleico puede comprender un“elemento compuesto de mantenimiento”, en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta puede estar dispuesta para dirigir la enzima de restricción para cortar el ácido nucleico en el mismo sitio que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, de modo que se produciría el mismo saliente/extremo pegajoso en la misma posición. Esto se puede lograr proporcionando la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta no protegible a una distancia específica, dependiendo del sitio de corte proporcionado por la(s) enzima(s) de restricción seleccionada. En esta realización, la secuencia del saliente producido por la enzima de restricción que corta el ácido nucleico según la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación se mantiene después de cortar el ácido nucleico con la enzima de restricción que reconoce el elemento opuesto no protegible. secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de la secuencia de descarte y una ligadura posterior con un inserto de fragmento de ADN. Como tal, esta realización puede denominarse“elemento compuesto de mantenimiento”, es decir, el elemento compuesto de mantenimiento puede comprender dos secuencias de restricción dispuestas en dirección cabeza a cabeza (una de las cuales es parte del elemento protegible contra la metilación, y la otra la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta). El saliente producido a partir de un elemento compuesto de mantenimiento puede estar predeterminado por la secuencia entre las secuencias de reconocimiento de restricción opuestas.

En una realización alternativa al elemento compuesto de mantenimiento, se proporciona un“elemento compuesto truncado”, en donde la distancia entre el elemento de restricción protegible por metilación y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta se puede reducir de manera que la no protegible opuesta La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción puede disponerse para dirigir la enzima de restricción para que corte el ácido nucleico en un sitio que no se solape al sitio de corte de la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación (es decir, de manera que la la posición de los salientes posteriores creados por los sitios de corte opuestos no se solapan y los salientes posteriores pueden ser diferentes en secuencia). El sitio de corte de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta en un elemento compuesto truncado puede estar dentro de la secuencia de reconocimiento de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o dentro de los nucleótidos entre el sitio de corte y el secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción secuencia de reconocimiento del elemento de restricción protegible por metilación. En una realización, el punto de escisión entre pares de bases al final de un sitio de corte y el punto de escisión entre pares de bases al inicio del sitio de corte opuesto puede estar en pares de bases adyacentes/vecinos (es decir, los sitios de corte pueden estar inmediatamente adyacentes a entre sí, pero sin solaparse). Esto se puede lograr proporcionando la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta a una distancia específica, dependiendo del sitio de corte proporcionado por la enzima(s) de restricción seleccionada. La distancia será lo suficientemente cercana como para causar el corte en la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción opuestas no protegibles y/o nucleótidos entre la secuencia de reconocimiento y el sitio de corte, o viceversa (es decir, más cerca que las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción opuestas en el“elemento compuesto de mantenimiento”).“para un equivalente/la misma enzima de restricción seleccionada). En esta realización de elemento compuesto truncado, la secuencia del saliente producido por la enzima de restricción que corta el ácido nucleico según la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede mantenerse o no después de cortar el ácido nucleico con la enzima de restricción. que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta de la secuencia de descarte y una ligadura posterior con un inserto de fragmento de ADN, mediante el cual la secuencia del inserto de fragmento de ADN dictaría la secuencia del saliente (por ejemplo, el saliente producido a partir de un elemento compuesto truncado puede no estar predeterminado por la secuencia entre los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción opuestos).

En una realización alternativa al elemento compuesto de mantenimiento y al elemento compuesto truncado, se proporciona un“elemento compuesto de inserción”, en donde se proporciona un inserto de secuencia entre el elemento de restricción protegible por metilación y la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción no protegible opuesta. El inserto de secuencia puede comprender una secuencia funcional de manera que proporcione una función. Por ejemplo, el inserto de secuencia puede comprender una secuencia promotora o una secuencia terminadora. En una realización que comprende un elemento compuesto de inserción, el elemento de restricción protegible por metilación y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta pueden no solaparse y pueden estar separados por el inserto de secuencia. El inserto de secuencia puede tener cualquier longitud adecuada. Por ejemplo, la distancia entre el elemento de restricción protegible por metilación y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta puede ser cualquier número de nucleótidos según sea necesario para el inserto de secuencia, tal como un inserto de secuencia funcional. La distancia entre la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción dentro del elemento de restricción protegible por metilación y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta puede oscilar entre 6 pb y 300 kb.

Ventajosamente, después del ensamblaje del ADN, la secuencia funcional se agregará al extremo 5’ o 3’ del ADN ensamblado. Este diseño es conveniente para agregar elementos comunes a un plásmido ensamblado mediante el uso de vectores especializados (por ejemplo, agregar promotor y terminadores en una reacción de ensamblaje de genes de región codificante de múltiples partes).

En una descripción, para el“elemento compuesto de mantenimiento”, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta (tal como una secuencia BsaI) puede distanciarse de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción (tal como una secuencia BsaI) de la secuencia protegible por metilación. elemento de restricción por 6 pares de bases (es decir, 6 pb en el espacio entre el final de una secuencia de reconocimiento y el inicio de la secuencia de reconocimiento opuesta). El experto reconocerá que dicha distancia depende de la propiedad de la(s) enzima(s) de restricción seleccionada(s). Por ejemplo, suponiendo que la enzima corta x bases de la secuencia de reconocimiento y genera y bases del extremo/protuberancia adhesiva (por ejemplo, para BsaI x = 1 e y = 4), entonces la distancia (d) para el número de bases entre enzimas de restricción opuestas Las secuencias de reconocimiento del elemento compuesto de mantenimiento pueden proporcionarse mediante la siguiente ecuación: d = (2 * x) y (por ejemplo, d = 6 pb para BsaI). La distancia (d) para el elemento compuesto de mantenimiento puede variar desde 5 pb (por ejemplo, cuando se usa EarI) hasta 24 pb (por ejemplo, cuando se usa BtgZI). En una descripción, la diferencia entre las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción opuestas del elemento compuesto de mantenimiento es d, en donde d = (2 * x) y, y en donde x es el número de pares de bases que tiene el sitio de corte de una enzima de restricción determinada. de su secuencia de reconocimiento, y y es la longitud del saliente que produciría la enzima de restricción.

En la descripción alternativa del elemento compuesto truncado, por ejemplo cuando el saliente producido por la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede mantenerse o no, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta (tal como para BsaI) puede estar distanciados de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción (tal como para BsaI) del elemento de restricción protegible por metilación en 2 pares de bases. Como anteriormente, el experto reconocerá que dicha distancia depende de la propiedad de la(s) enzima(s) de restricción seleccionada(s). Por ejemplo, suponiendo que la enzima corta x bases de la secuencia de reconocimiento y genera y bases con el extremo adhesivo (para BsaI x = 1 e y = 4), la distancia (d) para el número de bases entre secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción opuestas de la secuencia truncada El elemento compuesto puede ser proporcionado por la siguiente ecuación: d = 2 * x (por ejemplo, d=2pb para BsaI). La distancia (d) para el elemento compuesto truncado puede oscilar entre 2 pb (por ejemplo, cuando se usa BsaI) y 20 pb (por ejemplo, cuando se usa BtgZI). En una descripción, la diferencia entre las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción opuestas del elemento compuesto truncado es d, en donde d = 2 * x, y en donde x es el número de pares de bases que el sitio de corte de una enzima de restricción dada es de su secuencia de reconocimiento.

Ventajosamente, la provisión de un elemento compuesto de mantenimiento facilita el ensamblaje de ADN en un solo recipiente, mediante el cual se pueden ensamblar múltiples fragmentos de ADN en una única reacción en un solo recipiente con una única especie de enzima de restricción. Ventajosamente, la provisión de un elemento compuesto truncado facilita el ensamblaje de ADN sin cicatrices, por lo que los extremos sobresalientes de un inserto de fragmento de ADN particular pueden predeterminarse para adaptarse para la ligación en un vector de destino o proporcionarse según la secuencia nativa del fragmento de ADN. de interés para unirse con fragmentos vecinos en la secuencia.

En una descripción, el ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico circular, tal como un vector, que comprende dos elementos compuestos de mantenimiento con una secuencia de descarte entre ellos, o una versión linealizada del mismo con la secuencia de descarte recortada. En otra descripción, el ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico circular, tal como un vector, que comprende un elemento compuesto de mantenimiento y un elemento compuesto truncado con una secuencia de descarte entre ellos, o una versión linealizada del mismo con la secuencia de descarte recortada. En otra descripción, el ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico circular, tal como un vector, que comprende dos elementos compuestos truncados con una secuencia de descarte entre ellos, o una versión linealizada del mismo con la secuencia de descarte recortada. En otra descripción, el ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico circular, tal como un vector, que comprende un elemento compuesto de inserción y un elemento compuesto truncado con una secuencia de descarte entre ellos, o una versión linealizada del mismo con la secuencia de descarte recortada. En otra descripción, el ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico circular, tal como un vector, que comprende un elemento compuesto de inserción y un elemento compuesto de mantenimiento con una secuencia de descarte entre ellos, o una versión linealizada del mismo con la secuencia de descarte recortada. En otra descripción, el ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico circular, tal como un vector, que comprende dos elementos compuestos de inserción con una secuencia de descarte entre ellos, o una versión linealizada del mismo con la secuencia de descarte recortada. En realizaciones de ácido nucleico linealizado, la secuencia de descarte puede haberse cortado mediante restricción con la enzima de restricción que reconoce la secuencia de enzima de restricción opuesta no protegible presente en la secuencia de descarte (es decir, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción interna).

En descripciones que comprenden dos elementos compuestos de mantenimiento, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los dos elementos compuestos de mantenimiento pueden ser las mismas y/o las secuencias de reconocimiento de metilasa de los dos elementos compuestos de mantenimiento pueden ser las mismas. En descripciones que comprenden dos elementos compuestos truncados, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los dos elementos compuestos truncados pueden ser las mismas y/o las secuencias de reconocimiento de metilasa de los dos elementos compuestos truncados pueden ser las mismas. En descripciones que comprenden dos elementos compuestos de inserción, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los dos elementos compuestos de inserción pueden ser las mismas y/o las secuencias de reconocimiento de metilasa de los dos elementos compuestos de inserción pueden ser las mismas. En las descripciones que comprenden un elemento compuesto de mantenimiento y un elemento compuesto de truncamiento, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento pueden ser las mismas y/o las secuencias de reconocimiento de metilasa de los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento pueden ser las mismas. En las descripciones que comprenden un elemento compuesto de mantenimiento y un elemento compuesto de inserción, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos compuestos de mantenimiento y de inserción pueden ser las mismas y/o las secuencias de reconocimiento de metilasa de los elementos compuestos de mantenimiento y de inserción pueden ser las mismas. En las descripciones que comprenden un elemento compuesto truncado y un elemento compuesto de inserción, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos compuestos truncados e de inserción pueden ser las mismas y/o las secuencias de reconocimiento de metilasa de los elementos compuestos truncados e de inserción pueden ser las mismas. Por ejemplo, la digestión del ácido nucleico para eliminar una secuencia de descarte o un fragmento de ADN de interés puede llevarse a cabo mediante la misma enzima de restricción. Además, la metilación del ácido nucleico para proteger todos los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción protegibles por metilasa en el ácido nucleico puede llevarse a cabo mediante la misma metilasa.

En una descripción, la metilasa comprende una metilasa del ADN de tipo II. En otra descripción, la metilasa comprende una metilasa del ADN de tipo I. En una descripción, la metilasa comprende una metilasa de dominio único sin actividad de enzima de restricción, o una metilasa modificada que tiene una actividad de enzima de restricción no funcional. Por ejemplo, la modificación puede comprender modificar la posición N6 de metiladenina. En una descripción, la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN comprende al menos 4 pares de bases. La metilasa del ADN puede estar activa, tal como óptimamente activa, a aproximadamente 37°C.

En una descripción, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta no es capaz de bloquearse mediante metilación con la metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación. En una descripción, la metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación puede no reconocer una secuencia dentro o solapada con la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción no protegible opuesta. Por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta no protegible puede no solaparse con o comprender una secuencia que sea reconocida por la metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede estar metilada, por ejemplo mediante la metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación. La metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación puede disponerse para metilar un nucleótido dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación. La metilación puede ser capaz de bloquear el corte del ADN mediante la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación. En una descripción, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación puede volverse no funcional como resultado de la metilación de al menos uno de los nucleótidos de la secuencia. En una descripción, el nucleótido metilado puede ser una adenina, o el nucleótido dispuesto para ser metilado puede ser una adenina. En otra descripción, el nucleótido metilado puede ser una citosina, o el nucleótido dispuesto para ser metilado puede ser una citosina. La metilación puede ser cualquiera de los tipos de metilación seleccionados entre N4-metilcitosina (m4C), C5-metilcitosina (m5C) o N6-metiladenina (m6A). El experto reconocerá que el tipo de metilación proporcionada debería bloquear/deteriorar la función del sitio de restricción solapado. Además, para metilaciónin vivo, la cepa utilizada para expresar la metilasa puede ser deficiente en enzimas de restricción dependientes de modificación que pueden reconocer las bases metiladas, como las enzimas de restricción de la familia Mcr/Mrr. En una descripción, el tipo de metilación puede comprender N6-metiladenina (m6A).

En una descripción, la metilasa puede metilar o no las bases más externas de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. Por ejemplo, en una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción de 6 pb, las bases 1 ó 6 pueden no estar metiladas. En una descripción, la metilasa puede metilar o no los 2<º>base de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. En una descripción, la metilasa puede metilar la posición 3, 4 o 5 para sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de 6 pb. En una descripción, la metilasa puede metilar la posición 3, 4, 5 o 6 para los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.

En una descripción que comprende dos elementos de restricción protegibles por metilación, las secuencias de reconocimiento de metilasa del ADN de cada elemento de restricción protegible por metilación pueden ser reconocidas por la misma metilasa. La secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN de los elementos de restricción protegibles por metilación puede comprender o consistir en la misma secuencia.

En una descripción que comprende dos elementos de restricción protegibles por metilación, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de cada elemento de restricción protegible por metilación pueden ser reconocidas por la misma especie de enzima de restricción. Cada secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos de restricción protegibles por metilación puede comprender o consistir en la misma secuencia. Los dos elementos de restricción protegibles por metilación pueden comprender o consistir en la misma secuencia.

El uso de la misma secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción proporciona ventajosamente que se puede usar una única especie de enzima de restricción en una reacción de ensamblaje de ADN. El uso de una única especie de enzima de restricción abre la posibilidad de un ensamblaje de ADN menos complejo, porque la presencia de más especies de enzimas de restricción en una reacción aumenta significativamente la probabilidad de que la secuencia contenga aleatoriamente/inadvertidamente un sitio de reconocimiento y corte de restricción, causando un fallo en el procedimiento de clonación.

En una descripción, el elemento de restricción protegible por metilación comprende o consiste en una secuencia según cualquiera de los sitios de metilación/restricción solapados identificados en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción alternativa, el elemento de restricción protegible por metilación comprende o consiste en una secuencia según cualquiera de los sitios de metilación/restricción solapados identificados en la Tabla 3 en el presente documento, excluyendo aquellos que proporcionan metilación de la primera o última base en la secuencia de restricción. En una descripción, el elemento de restricción protegible por metilación comprende o consiste en la secuencia GACNNGGTCTCNNNNN (BsaI/M.Osp807II - SEQ ID NO: 1). En otra descripción, el elemento de restricción protegible por metilación comprende o consiste en la secuencia GAAGACGCNNNNNN (BpiI/M2.NmeMC58II - SEQ ID NO: 2). En otra descripción, el elemento de restricción protegible por metilación comprende o consiste en la secuencia GAAGCTCTTCNNNN (LguI/M.XmnI - SEQ ID NO: 3).

En una descripción, la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción protegible y/o no protegible por metilación comprende o consiste en una secuencia según cualquiera de las secuencias de reconocimiento de enzima de restricción identificadas en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción alternativa, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción protegible y/o no protegible por metilación comprende o consiste en una secuencia según cualquiera de las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción identificadas en la Tabla 3 del presente documento, excluyendo aquellas que proporcionan la metilación de la primera o la última base en la secuencia de restricción. En una descripción, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción protegible y/o no protegible por metilación comprende o consiste en la secuencia GGTCTC (BsaI - SEQ ID NO: 4). En otra descripción, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción protegible y/o no protegible por metilación comprende o consiste en una secuencia GAAGAC (BpiI - SEQ ID NO: 5). En otra descripción, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción protegible y/o no protegible por metilación comprende o consiste en una secuencia GCTCTTC (LguI - SEQ ID NO: 6).

En una descripción, la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN comprende o consiste en una secuencia según cualquiera de las secuencias de reconocimiento de metilasa del ADN de tipo II identificadas en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción alternativa, la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN comprende o consiste en una secuencia según cualquiera de las secuencias de reconocimiento de metilasa del ADN de tipo II identificadas en la Tabla 3 en el presente documento, excluyendo aquellas que proporcionan metilación de la primera o última base en la secuencia de restricción. En una descripción, la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN comprende o consiste en la secuencia GACNNNGTC (M.Osp807II - SEQ ID NO: 7). En otra descripción, la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN comprende o consiste en la secuencia GACGC (M2.NmeMC58II - SEQ ID NO: 8). En otra descripción, la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN comprende o consiste en la secuencia GAANNNNTTC (M.XmnI - SEQ ID NO: 9).

La enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar al menos un saliente/extremo pegajoso de 2 pb. Alternativamente, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar al menos un saliente/extremo pegajoso de 3 pb. En otra descripción, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar un saliente/extremo pegajoso de 3 pb. En otra descripción, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar un saliente/extremo pegajoso de 4 pb. En otra descripción, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar un saliente/extremo pegajoso de 2 a 6 pb. En otra descripción, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar un saliente/extremo pegajoso de 2 a 5 pb. En otra descripción, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar un saliente/extremo pegajoso de 3 a 5 pb. En otra descripción, la enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible por metilación, y/o la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta, puede ser capaz de cortar el ácido nucleico para dejar un saliente/extremo pegajoso de 4 a 5 pb.

En una descripción, la enzima de restricción comprende o consiste en cualquier enzima de restricción de tipo IIS identificada en la Tabla 3 del presente documento. En otra descripción, la enzima de restricción de tipo IIS comprende o consiste en BsaI, BpiI o LguI.

En una descripción, la metilasa del ADN comprende o consiste en cualquier metilasa del ADN de tipo II identificada en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción alternativa, la metilasa del ADN comprende o consiste en cualquier metilasa del ADN de tipo II identificada en la Tabla 3 del presente documento, excluyendo aquellas que proporcionan metilación de la primera o la última base en la secuencia de restricción. En otra descripción, la metilasa del ADN comprende o consiste en M.Osp807II, M2.NmeMC58II o M.XmnI.

En una descripción, la enzima de restricción y la metilasa del ADN comprenden o consisten en cualquier par de enzimas de restricción de tipo IIS y las metilasa del ADNs de tipo II identificadas en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción, la enzima de restricción y la metilasa del ADN comprenden o consisten en los pares BsaI/M.Osp807II, BpiI/M2.NmeMC58II o LguI/M.XmnI.

En una descripción, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción y la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN comprenden o consisten en cualquier par de secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS y las secuencias de reconocimiento de la metilasa del ADN de tipo II identificadas en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción alternativa, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción y la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN comprenden o consisten en cualquier par de secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS y las secuencias de reconocimiento de la metilasa del ADN de tipo II identificadas en la Tabla 3 del presente documento, excluyendo aquellas que proporcionan metilación de la primera o última base en la secuencia de restricción.

En una descripción que comprende dos elementos de restricción protegibles por metilación (por ejemplo, con una secuencia de descarte entre ellos), el saliente/extremo pegajoso producido cortando con la enzima de restricción en el primer elemento de restricción protegible por metilación puede tener una secuencia diferente que el saliente/extremo pegajoso. extremo producido cortando con la enzima de restricción en el segundo elemento de restricción protegible por metilación. El experto estará familiarizado con proporcionar diferentes salientes para el ensamblaje/clonación direccional de ADN o controlar qué extremo del ácido nucleico está ligado a un inserto/fragmento de interés.

En una descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GACNNGGTCTCNNNNNNGAGACC (SEQ ID NO: 10). En otra descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGACGCNNNNNNGTCTTC (SEQ ID NO: 11). En otra descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNNNNGAAGAGC (SEQ ID NO: 12). N puede significar A, C, T o G. Se pueden proporcionar otras secuencias según las secuencias de reconocimiento de metilasa y enzima de restricción combinadas/solapadas proporcionadas en la tabla 3, en donde después de la serie de N bases, la secuencia comprende además las secuencias palindrómicas/inversas. secuencia complementaria de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción.

En una descripción que implica dos elementos compuestos de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GACNNGGTCTCNNNNNNGAGACC(N<X>)GGTCTCNNNNNNGAGACCNNGTC (SEQ ID NO: 13). En otra descripción que implica dos elementos compuestos de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGACGCNNNNNNGTCTTC(N<X>)GAAGACNNNNNNGCGTCTTC (SEQ ID NO: 14). En otra descripción que implica dos elementos compuestos de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNNNNGAAGAGC(N<X>)GCTCTTCNNNNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 15). N puede significar A, C, T o G. (N<X>) puede significar cualquier número de A, C, T o G, o entre 0 pb y 300 kbp de A, C, T o G.

El experto entenderá que para algunas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción, tales como para LguI, el número de nucleótidos (N<X>) entre dos elementos compuestos de mantenimiento podría ser negativo con los dos sitios internos de reconocimiento de enzimas de restricción no protegibles solapados. Por lo tanto, en otra descripción que implica dos elementos compuestos de mantenimiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNNNNGAAGA.GCTCTTCNNNNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 16) (los nucleótidos solapados se muestran en negrita y subrayados).

En una descripción que implica un elemento compuesto truncado, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GACNNGGTCTCNNGAGACC (SEQ ID NO: 17). En una descripción que implica un elemento compuesto truncado, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNGAAGAGGC (SEQ ID NO: 18). N puede significar A, C, T o G. N puede significar A, C, T o G. Se pueden proporcionar otras secuencias según las secuencias de reconocimiento de enzima de restricción y metilasa combinadas/solapadas proporcionadas en la tabla 3, en donde siguiendo la serie de N bases, la secuencia comprende además la secuencia palindrómica/complementaria inversa de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, y en donde el número de N bases entre las secuencias de reconocimiento de restricción se reduce por el número de bases sobresalientes producidas por la enzima de restricción seleccionada.

En una descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento y truncamiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GACNNGGTCTCNNNNNNGAGACC(N<X>)GGTCTCNNGAGACCNNGTC (SEQ ID NO: 19). En una descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento y truncamiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNNNNGAAGAGC(N<X>)GCTCTTCNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 20). N puede significar A, C, T o G. (N<X>) puede significar cualquier número de A, C, T o G, o entre 0 pb y 300 kbp de A, C, T o G.

El experto entenderá que, para algunas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción, tales como para LguI, el número de nucleótidos (N<X>) entre un elemento compuesto de mantenimiento y truncamiento podría ser negativo con los dos sitios internos de reconocimiento de enzimas de restricción no protegibles solapados. Por lo tanto, en otra descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento y truncamiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNNNNGAAGA.GCTCTTCNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 21) (los nucleótidos solapados se muestran en negrita y subrayados).

En una descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento y truncamiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GACNNGGTCTCNNGAGACC(N<X>)GGTCTCNNNNNNGAGACCNNGTC (SEQ ID NO: 22). En una descripción que implica un elemento compuesto de mantenimiento y truncamiento, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNGAAGAGC(N<X>)GCTCTTCNNNNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 23). N puede significar A, C, T o G. (N<X>) puede significar cualquier número de A, C, T o G, o entre 0 pb y 300 kpb de A, C, T o G. En otra descripción que implica un elemento compuesto que mantiene y trunca, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNGAAGAGCTCTTCNNNNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 24) (los nucleótidos solapados se muestran en negrita y subrayados).

En una descripción que implica dos elementos compuestos truncados, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GACNNGGTCTCNNGAGACC(N<X>)GGTCTCNNGAGACCNNGTC (SEQ ID NO: 25). En una descripción que implica dos elementos compuestos truncados, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNGAAGAGC(N<X>)GCTCTTCNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 26). N puede significar A, C, T o G. (N<X>) puede significar cualquier número de A, C, T o G, o entre 0 pb y 300 kbp de A, C, T o G.

El experto entenderá que, para algunas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción, tales como para LguI, el número de nucleótidos (N<X>) entre dos elementos compuestos truncados podría ser negativo con los dos sitios internos de reconocimiento de enzimas de restricción no protegibles solapados. Por lo tanto, en otra descripción que involucra dos elementos compuestos truncados, el ácido nucleico puede comprender o consistir en la secuencia de GAAGCTCTTCNNGAAGA.GCTCTTCNNGAAGAGCTTC (SEQ ID NO: 27) (los nucleótidos solapados se muestran en negrita y subrayados).

El ácido nucleico puede ser un ácido nucleico aislado. En una descripción, el ácido nucleico puede ser sintético (es decir, no encontrarse en la naturaleza). En una descripción, el ácido nucleico puede aislarse o derivarse de una cepa bacteriana, tal comoE. coli,que expresa una metilasa del ADN que reconoce (y metila) la secuencia de reconocimiento de metilasa del elemento de restricción protegible por metilación. Por ejemplo, una cepa bacteriana, comoE. coli,que expresa cualquier metilasa del ADN de tipo II identificada en la Tabla 3 del presente documento. En una descripción, el ácido nucleico puede aislarse o derivarse de una cepa bacteriana, tal comoE. coli,que expresa M.Osp807II, M2.NmeMC58II o M.XmnI. La metilasa del ADN expresada puede ser funcional. La cepa bacteriana puede modificarse/diseñarse genéticamente para expresar dicha metilasa del ADN.

El ácido nucleico puede ser un vector, tal como un vector de clonación. El experto estará familiarizado con diversos vectores de clonación, que pueden incluir, por ejemplo, un origen de replicación, un marcador seleccionable, un gen indicador, elementos de expresión o combinaciones de los mismos. El vector puede comprender ácido nucleico que comprende un elemento de ADN que soporta la replicación del ADN que lo contiene (por ejemplo, un origen de replicación) y un marcador de selección (por ejemplo, un marcador de selección de antibiótico). El vector puede ser un vector con un número de copias alto o bajo. En una descripción, el vector es un vector con un número elevado de copias. El experto estará familiarizado con los métodos de clonación y los materiales/vectores, por ejemplo como se proporciona en Green, M.R., Sambrook, J. Clonación molecular: manual de laboratorio.4to. Prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York; 2012.

En versiones linealizadas del ácido nucleico, el ácido nucleico no puede comprender más de dos copias/sitios de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción.

También se describe un método de ensamblaje de ADN que comprende:

proporcionar un ácido nucleico metilado linealizado como se describe en el presente documento, en donde el elemento de restricción protegible por metilación está metilado con la metilasa del ADN;

proporcionar dos o más fragmentos de ADN de interés para el ensamblaje con el ácido nucleico metilado linealizado, en donde un primer fragmento de ADN comprende un saliente complementario para la ligación con un primer extremo del ácido nucleico metilado linealizado, y un segundo fragmento de ADN comprende salientes complementarios para la ligación con el otro/segundo extremo del ácido nucleico metilado linealizado; y (i) el primer y segundo fragmentos de ADN comprenden además salientes complementarios para ligarse entre sí; o

(ii) el primer y segundo fragmentos de ADN comprenden además salientes complementarias para la ligación con uno o más fragmentos de ADN adicionales que tienen salientes complementarias, de modo que ligar los fragmentos de ADN y el ácido nucleico metilado linealizado con una ADN ligasa daría como resultado una única molécula de ADN ensamblada;

ligar los fragmentos de ADN y el ácido nucleico metilado linealizado con una ligasa para formar una única molécula de ADN ensamblada que comprende la secuencia de los fragmentos de ADN ensamblados flanqueados por las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos de restricción protegibles por metilación. La única molécula de ADN ensamblada puede ser circular, tal como un vector de ADN circular.

Ventajosamente, el corte adicional de la única molécula de ADN ensamblada mediante la enzima de restricción que reconoce las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción de los elementos de restricción protegibles por metilación se bloquea mediante la metilación de las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción. El ácido nucleico linealizado puede proporcionarse proporcionando un ácido nucleico como se describe en el presente documento en forma de un vector de destino circular que comprende dos elementos de restricción metilados protegibles por metilación y una secuencia de descarte entre ellos, en donde el método comprende el paso de cortar el vector de destino circular con enzimas de restricción que reconocen las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción no protegibles opuestas en la secuencia de descarte, dejando así un ácido nucleico linealizado que tiene salientes definidos por las enzimas de restricción. Las enzimas de restricción pueden ser de la misma especie. Las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos de restricción metilados protegibles por metilación pueden comprender la misma secuencia. En una descripción, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos de restricción metilados protegibles por metilación y las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción no protegibles opuestas pueden comprender la misma secuencia.

La enzima de restricción y la metilasa (o secuencias de reconocimiento de las mismas) utilizadas en el método se pueden seleccionar según la enzima de restricción y las metilasas (o secuencias de reconocimiento de las mismas) proporcionadas para la descripción del ácido nucleico en el presente documento.

El vector de destino circular puede purificarse/aislarse a partir de una cepa bacteriana que exprese la metilasa de ADN que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa de ADN del elemento de restricción protegible contra la metilación. En otra descripción, el vector de destino circular o linealizado puede ser metilado por la metilasa de ADNin vitro.

Los dos o más fragmentos de ADN de interés para ensamblar con el ácido nucleico pueden proporcionarse en vectores de donación circulares, en donde el método comprende el paso de cortar los vectores de donación circulares para liberar los fragmentos de ADN de interés. El corte de los vectores donantes puede realizarse con una enzima de restricción que deja salientes complementarios para la ligación con el ácido nucleico metilado linealizado. El corte de los vectores donantes puede realizarse con una enzima de restricción que deja salientes complementarios para la ligación con el ácido nucleico metilado linealizado y con otro fragmento de ADN de interés para la inserción. El corte de los vectores donantes puede realizarse con una enzima de restricción que deja salientes complementarios para la ligación con otros dos fragmentos de ADN de interés para la inserción.

La enzima de restricción para cortar los vectores de donación circulares puede comprender una enzima de restricción de tipo IIS. La enzima de restricción para cortar los vectores de donación circulares puede comprender la misma enzima de restricción, o una enzima de restricción que reconoce la misma secuencia, que la enzima de restricción utilizada para cortar el vector de destino circular. Los salientes complementarios de los fragmentos de ADN de interés para la ligación con el ácido nucleico linealizado pueden definirse mediante la enzima de restricción.

Ventajosamente, la provisión de la misma secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción para los elementos de restricción protegibles por metilación, la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta en la secuencia de descarte y las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción en los vectores donantes proporciona que se pueda utilizar un único tipo de enzima de restricción. usado. Esto permite reducir el coste y la complejidad a la hora de eliminar el sitio de restricción interno de tipo IIS de las partes de ADN, porque hay menos sitios de restricción que eliminar. Esto hace que el ensamblaje de secuencias más largas sea más fácil y menos costoso. Además, la invención permite la denominada reacción“en un solo recipiente”, mediante la cual la restricción y la ligación se pueden llevar a cabo en un recipiente en un solo paso.

Por lo tanto, el método puede combinar los pasos de restringir y ligar. En particular, el vector de destino circular, los vectores donantes, la enzima de restricción y la ligasa pueden proporcionarse en la misma composición.

Después del ensamblaje de la única molécula de ADN ensamblada, el método puede comprender además el paso de transformar la única molécula de ADN ensamblada en una cepa bacteriana que no expresa la metilasa del ADN que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación. Ventajosamente, transformar la única molécula de ADN ensamblada en una cepa bacteriana que no expresa la metilasa del ADN que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN del elemento de restricción protegible por metilación da como resultado la clonación y producción de una secuencia de ácido nucleico, tal como un vector. que comprende una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción no metilada (es decir, no bloqueada) para permitir reacciones de restricción posteriores.

El método puede comprender además un proceso de ensamblaje de múltiples etapas para formar fragmentos de ADN ensamblados o vectores de mayor longitud de secuencia. Por ejemplo, el ADN ensamblado, que es el producto del método, puede usarse posteriormente para un ensamblaje de orden superior. Por ejemplo, el método puede comprender una segunda ronda de ensamblaje de ADN según la descripción en el presente documento en donde los fragmentos de ADN de interés para el ensamblaje con el ácido nucleico metilado linealizado pueden comprender ADN ensamblado de una primera/anterior ronda de ensamblaje de ADN según la descripción en el presente documento. Proporcionar múltiples rondas de ensamblaje de ADN para formar fragmentos de ADN más grandes reduce ventajosamente el número de secuencias adaptadoras/protuberantes que son necesarias. La tasa de éxito del ensamblaje del ADN también aumenta al ensamblar menos fragmentos de ADN. Además, puede ser más fácil detectar el ADN ensamblado exitosamente con menos fragmentos ensamblados en una sola reacción.

Método de ensamblaje de ADN sin cicatrices

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método de ensamblaje de fragmentos de ADN sin cicatriz según la reivindicación 7 del presente documento.

Descrito en el presente documento, se proporciona un método de ensamblaje de fragmentos de ADN sin cicatriz comprende los pasos de:

(A) proporcionar un primer ácido nucleico metilado linealizado como se describe en el presente documento, que tiene un elemento compuesto de mantenimiento en un extremo y un elemento compuesto de truncamiento en el otro extremo, en donde los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento están metilados con la metilasa del ADN;

proporcionar un primer fragmento de ADN para ensamblaje que tiene extremos salientes que están adaptados para ligarse a los extremos salientes del primer ácido nucleico metilado linealizado;

ligar el primer fragmento de ADN para el ensamblaje y el primer ácido nucleico metilado linealizado con una ligasa para formar un primer vector intermedio metilado;

transformar el primer vector intermedio metilado en una cepa bacteriana que no expresa la(s) metilasa del ADN(s) que reconoce cualquiera de las secuencias de reconocimiento de metilasa del ADN de los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento, formando de este modo un primer vector intermedio que no está metilado;

aislar el primer vector intermedio;

(B) proporcionar un segundo ácido nucleico metilado linealizado como se describe en el presente documento, que tiene un elemento compuesto de mantenimiento en un extremo y un elemento compuesto truncado en el otro extremo, en donde los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento están metilados con la metilasa del ADN, y en donde el saliente proporcionado por el elemento compuesto de mantenimiento del primer ácido nucleico metilado linealizado es diferente en secuencia al saliente proporcionado por el elemento de restricción protegible por metilación del segundo ácido nucleico metilado linealizado;

proporcionar un segundo fragmento de ADN para ensamblaje que tiene extremos salientes que están adaptados para ligarse a los extremos salientes del segundo ácido nucleico metilado linealizado;

ligar el segundo fragmento de ADN para el ensamblaje y el segundo ácido nucleico metilado linealizado con una ligasa para formar un segundo vector intermedio metilado;

transformar el segundo vector intermedio metilado en una cepa bacteriana que no expresa la(s) metilasa del ADN(s) que reconoce(n) cualquiera de las secuencia(s) de reconocimiento de metilasa del ADN de los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento, formando de ese modo un segundo vector intermedio que no está metilado;

aislar el segundo vector intermedio;

(C) cortar el primer vector intermedio con una enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento compuesto de mantenimiento y una enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento compuesto truncado, formando de este modo un primer inserto de fragmento de ADN adaptado que comprende una secuencia saliente mantenida que está determinada por el elemento compuesto de mantenimiento y una secuencia saliente nativa opuesta que está determinada por la secuencia nativa del primer fragmento de ADN para ensamblaje;

(D) cortar el segundo vector intermedio con una enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento compuesto de mantenimiento y una enzima de restricción que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento compuesto truncado, formando de este modo un segundo inserto de fragmento de ADN adaptado que comprende una secuencia saliente mantenida que está determinada por el elemento compuesto de mantenimiento y una secuencia saliente nativa opuesta que está determinada por la secuencia nativa del segundo fragmento de ADN para ensamblaje; en donde

(i) el primer y segundo fragmentos de ADN adaptados son fragmentos terminales en donde sus secuencias salientes nativas son complementarias, de modo que están dispuestas para ligarse entre sí; o

(ii) se proporcionan uno o más fragmentos de ADN medios para ensamblaje en donde el primer y segundo fragmentos de ADN adaptados son fragmentos terminales respectivos en el ensamblaje, y el uno o más fragmentos de ADN medios están dispuestos para ligarse entre el primer y segundo fragmentos de ADN adaptados a través de secuencias nativas salientes complementarias;

que comprende además el paso de ligar juntos, con una ligasa, el primer y segundo fragmentos de ADN adaptados, o el primer y segundo fragmentos de ADN adaptados y uno o más fragmentos de ADN intermedios, para formar un fragmento de ADN ensamblado que tiene salientes mantenidos en cada extremo.

El uno o más fragmentos de ADN intermedios pueden comprender secuencias salientes nativas en ambos extremos que están determinadas por su secuencia nativa. En una descripción que comprende un único fragmento de ADN medio para ensamblaje, el fragmento de ADN medio puede comprender una primera secuencia saliente nativa que es complementaria a la saliente nativa del primer fragmento de ADN adaptado y una segunda secuencia saliente nativa que es complementaria a la saliente nativo del segundo fragmento de ADN adaptado.

En una descripción que comprende dos o más fragmentos de ADN medios para ensamblaje, los fragmentos de ADN medios pueden comprender cada uno de ellos secuencias salientes nativas que son complementarias al saliente nativo de un fragmento de ADN medio vecino, de modo que se pueden ligar entre sí en una secuencia previa. -orden determinado. El primer y último fragmento de ADN intermedio en una secuencia se dispondrán para ligarse al primer fragmento de ADN adaptado y al segundo fragmento de ADN adaptado respectivos mediante secuencias sobresalientes nativas complementarias.

En una descripción, un fragmento de ADN medio para ensamblaje puede ser proporcionado por

proporcionar un ácido nucleico metilado linealizado adicional como se describe en el presente documento, en donde el ácido nucleico metilado linealizado comprende un elemento compuesto truncado en cada extremo, en donde los elementos compuestos truncados están metilados con la metilasa del ADN;

proporcionar un fragmento de ADN medio adaptado para ensamblaje que tiene extremos salientes que están adaptados para ligarse a los extremos salientes del ácido nucleico metilado linealizado;

ligar el fragmento de ADN medio adaptado para el ensamblaje y el ácido nucleico metilado linealizado con una ligasa para formar un vector intermedio metilado;

transformar el vector intermedio metilado en una cepa bacteriana que no expresa la(s) metilasa del ADN(s) que reconoce(n) cualquiera de las secuencias de reconocimiento de metilasa del ADN de los elementos compuestos truncados, formando de ese modo un vector intermedio que no está metilado;

aislar el vector intermedio;

cortar el vector intermedio con enzimas de restricción que reconocen la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de los elementos compuestos truncados, formando así un inserto de fragmento de ADN medio que comprende secuencias salientes nativas en cada extremo que están determinadas por la secuencia nativa del fragmento de ADN medio para el ensamblaje.

Los fragmentos de ADN para el ensamblaje pueden comprender ADN bicatenario que comprende los salientes/extremos pegajosos en cada extremo. Se puede preparar un fragmento de ADN para ensamblaje mediante PCR a partir de una plantilla, mediante síntesis génica o mediante hibridación de dos oligonucleótidos. Tales procesos, p.ej. La PCR o la síntesis de genes pueden generar ADN bicatenario con extremos romos. Para el ensamblaje que comienza con el producto de la PCR, se puede incluir una secuencia adaptadora adecuada que contenga el sitio de restricción en el cebador de la PCR para recortar el ADN y generar los salientes para la clonación en los vectores intermedios. Para descripciones que comprenden el uso de oligonucleótidos hibridados hay más opciones. El diseño de la secuencia podría ser el mismo que para la PCR/síntesis de genes con sitios de restricción en ambos extremos para recortar con una enzima de restricción para generar los salientes. Alternativamente, dos oligos recocidos pueden formar los propios salientes.

En una descripción, los fragmentos de ADN para ensamblaje, tales como el primer fragmento de ADN para ensamblaje, el segundo fragmento de ADN para ensamblaje y uno o más fragmentos de ADN medios adaptados para ensamblaje, pueden proporcionarse mediante PCR a partir de una secuencia plantilla (es decir, los fragmentos de ADN para ensamblaje pueden ser productos de PCR). La secuencia plantilla puede proporcionar la secuencia completa que se desea clonar como fragmento de ADN ensamblado. Los fragmentos de ADN para el ensamblaje pueden replicarse, por ejemplo mediante PCR, a partir de diferentes secciones de la plantilla, y los productos de PCR vecinos generados pueden solaparse parcialmente en secuencia (es decir, la secuencia cerca del final de un producto de PCR puede comprender la misma secuencia cerca del inicio). del siguiente producto de PCR para su ensamblaje). El solapamiento puede ser parcial, pero de longitud suficiente para proporcionar un extremo adhesivo complementario. En una descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener al menos 2 pares de bases de longitud. En otra descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener al menos 3 pares de bases de longitud. En otra descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener una longitud de 3 a 6 pares de bases. En otra descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener una longitud de 3 a 5 pares de bases. En otra descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener una longitud de 4-5 pares de bases. En otra descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener una longitud de 3-4 pares de bases. En otra descripción, la secuencia de solapamiento dentro de un producto de PCR (fragmento de ADN para ensamblaje) y la solapamiento en el siguiente producto de PCR vecino (fragmento de ADN para ensamblaje) pueden tener 4 pares de bases de longitud.

Los cebadores de PCR pueden disponerse para amplificar las secciones parcialmente solapadas del ADN molde con el fin de formar los fragmentos de ADN para el ensamblaje que comprenderían salientes complementarias. La reacción de PCR puede agregar secuencias adaptadoras que contienen la secuencia de reconocimiento de restricción (es decir, la secuencia adaptadora universal, por ejemplo la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción puede comprender la misma secuencia que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento compuesto de mantenimiento y/o del elemento compuesto truncado) más la secuencia del saliente que sería complementario al saliente del fragmento vecino/consecutivo para su ensamblaje. El saliente que comprende la secuencia que se solapa, por ejemplo en 4 pb, entre fragmentos consecutivos/vecinos puede formarse después de la digestión con la enzima de restricción (es decir, el solapamiento entre el producto de PCR se refiere a la secuencia, por ejemplo de 4 pb, que está dentro del adaptador completo). secuencia que comprende la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción).

Los cebadores de PCR pueden proporcionar además las secuencias adaptadoras para los fragmentos de ADN, que forman el saliente complementario para la ligación con los ácidos nucleicos metilados linealizados (tales como el primer ácido nucleico metilado linealizado, el segundo ácido nucleico metilado linealizado o ácido nucleico metilado linealizado adicional) y formación de los vectores intermedios. Los cebadores de PCR pueden proporcionar además una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción que está dispuesta para dirigir la enzima de restricción para que corte el producto de PCR para formar las secuencias adaptadoras. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción proporcionada por los cebadores de PCR puede ser una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. La secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción puede comprender la misma secuencia que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento compuesto de mantenimiento y/o del elemento compuesto truncado.

En una descripción, el fragmento de ADN medio adaptado comprende una región de secuencia nativa solapada que es la misma secuencia que una secuencia saliente nativa proporcionada en un fragmento de ADN consecutivo/vecino destinado a la ligación. Por ejemplo, cuando fragmentos de ADN vecinos/consecutivos para ensamblarse entre sí están codificados a partir de una plantilla, cada uno de ellos puede comprender una región de secuencia solapada/misma de la plantilla, que formaría los salientes nativos complementarios entre las dos secuencias vecinas/consecutivas en un ligadura posterior. En una descripción, el fragmento de ADN medio adaptado comprende dos regiones de secuencia nativa solapada, que están dispuestas para formar los salientes nativos del fragmento de ADN medio una vez cortado por la enzima de restricción de reconocimiento.

El método puede comprender además el paso de proporcionar un vector de destino linealizado para la inserción de los fragmentos de ADN ensamblados. El vector de destino linealizado puede comprender secuencias sobresalientes respectivas que son complementarias a las proyecciones mantenidas del fragmento de ADN ensamblado. Las secuencias salientes del vector de destino linealizado pueden comprender un primer saliente que es complementario a la secuencia saliente mantenida del primer fragmento de ADN adaptado y un segundo saliente que es complementario a la segunda secuencia saliente mantenida del segundo fragmento de ADN adaptado.

El vector de destino linealizado se puede proporcionar cortando un vector de destino circular con la(s) enzima(s) de restricción que están dispuestas para proporcionar los mismos salientes complementarios que los fragmentos de ADN ensamblados. Por ejemplo, el vector de destino linealizado puede proporcionarse cortando un vector de destino circular con la(s) enzima(s) de restricción que reconocen las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción del elemento compuesto de mantenimiento y/o truncamiento. El vector de destino linealizado puede ser un vector de clonación.

En una descripción, el elemento compuesto de mantenimiento comprende la misma secuencia en todos los vectores intermedios que comprenden el elemento compuesto de mantenimiento. En una descripción, el elemento compuesto truncado comprende la misma secuencia en todos los vectores intermedios. En una descripción, el elemento compuesto de mantenimiento comprende la misma secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción que el elemento compuesto truncado. En una descripción, las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de los elementos compuestos de mantenimiento y/o los elementos compuestos truncados de los vectores intermedios son las mismas. En particular, se pueden usar las mismas especies de enzimas de restricción para la restricción de los vectores intermedios y, opcionalmente, el vector de destino.

Los vectores utilizados en el método de ensamblaje sin cicatrices como se describe en el presente documento pueden ser vectores con un número de copias alto. Por ejemplo, el primer y/o segundo ácido nucleico metilado linealizado pueden comprender un vector metilado linealizado de alto número de copias.

En una descripción, el método de ensamblaje de ADN descrito en el presente documento se lleva a cabo en una única composición (es decir, el llamado proceso“de un solo recipiente”). Por ejemplo, el proceso de ensamblaje de ADN (incluyendo digestión con enzima de restricción y ligación) se puede llevar a cabo en una única composición que contiene la enzima de restricción y ADN ligasa usando plásmidos de inserción circular o fragmentos de inserción linealizados y vectores circulares intermedios y/o de destino, o linealizados. versiones de los mismos.

En una descripción, la metilación del ácido nucleico se lleva a cabo en una cepa bacteriana modificada para expresar la metilasa que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa.En una descripción, la metilación del ácido nucleico se lleva a caboin vitro.

También se describe una cepa bacteriana modificada que se modifica para expresar una metilasa del ADN descrita en el presente documento.

La cepa bacteriana modificada que se modifica para expresar una metilasa del ADN puede ser una cepa deE. coli. La modificación puede comprender la inserción del gen de la metilasa en el lugararsbdel genomaE. coli. La cepa bacteriana modificada que se modifica para expresar una metilasa del ADN puede formarse mediante ensamblaje de un vector con un casete de expresión de metilasa seguido de un casete de selección de antibióticos, tal como un casete de selección de antibióticos de zeocina, y flanqueado por una secuencia homóloga del genarsbdeE. coli,seguido de PCR usando esto como plantilla para generar ADN lineal que contiene el elemento anterior, y recombinación con este fragmento seguido de selección con el antibiótico, tal como zeocina, para generar cepas de bacterias con el casete de expresión de metilasa y el marcador de selección insertados de manera estable en elarsblugar del genomaE. coli.

También se describe el uso de una cepa bacteriana modificada que se modifica para expresar una metilasa del ADN descrita en el presente documento, para fabricar una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento.

La cepa bacteriana modificada puede serE. coli.

También se describe una composición que comprende el ácido nucleico según la descripción en el presente documento. La composición puede comprender tampón.

También se describe un kit que comprende uno o más ácidos nucleicos según la descripción en el presente documento.

El kit puede comprender además una enzima de restricción y/o una ligasa, tal como ADN ligasa T4. Adicional o alternativamente, el kit puede comprender una cepa bacteriana modificada que se modifica para expresar una metilasa del ADN según la descripción en el presente documento y/o una metilasa del ADN.

Adicional o alternativamente, el kit puede comprender una o más soluciones tampón. Adicional o alternativamente, el kit puede comprender antibióticos para la selección de clones.

Uno o más, o todos, el ácido nucleico, el tampón, la cepa bacteriana, la enzima de restricción, la ligasa y la metilasa pueden proporcionarse en un recipiente, tal como un tubo Eppendorf.

También se describe una célula huésped que comprende ácido nucleico según la descripción en el presente documento.

También se describe el uso del ácido nucleico según la descripción en el presente documento para ensamblar fragmentos de ADN de interés, opcionalmente en donde el uso esin vitro.

La referencia al término“sin cicatrices”o“ensamblaje sin cicatrices”en el presente documento pretende referirse a una secuencia de ADN que se ha ensamblado a partir de múltiples secuencias, en donde la unión entre las secuencias no comprende artefactos, tales como pares de bases no deseados, de la restricción. y ligadura del proceso de ensamblaje del ADN. Por ejemplo, el ensamblaje de ADN sin cicatrices no introduce secuencias adicionales en el fragmento de ADN ensamblado. En algunas publicaciones también se le llama ensamblaje de ADN sin fisuras. En un ejemplo, una secuencia adaptadora diseñada para proporcionar extremos adhesivos complementarios para facilitar la unión de fragmentos de ADN puede considerarse una“cicatriz”entre las secuencias unidas.

La referencia al término“adaptador”en el presente documento pretende referirse a una secuencia diseñada para proporcionar extremos adhesivos complementarios para facilitar la unión de fragmentos de ADN.

La referencia al término“solapar”o“solaparse”en el contexto de secuencias de reconocimiento solapadas pretende referirse a que al menos parte de la secuencia de reconocimiento de una enzima (por ejemplo cualquier nucleótido distinto de N en una secuencia de reconocimiento) está en una posición de la secuencia de nucleótidos que especifica la secuencia de reconocimiento de otra enzima. (es decir, secuencias solapadas comparten al menos algunos nucleótidos comunes).

La referencia al término“nativo”en el contexto de una secuencia de extremo sobresaliente/pegajoso pretende referirse a la secuencia natural, no adaptada, del fragmento de ADN de interés que se insertará o unirá al ácido nucleico. Por ejemplo, la secuencia no se diseñará ni modificará con respecto a la secuencia del ADN molde de interés. Esto contrasta con los salientes determinados por la secuencia del vector para facilitar el ensamblaje del ADN, que podrían introducirse como una cicatriz en la secuencia ensamblada.

La referencia a una“molécula de ADN ensamblada única”pretende referirse a un único tipo de molécula, y no pretende referirse al número de copias de la misma molécula. En particular, en cualquier reacción o composición dada, puede haber una pluralidad de copias de una única molécula de ADN ensamblada.

La referencia a plásmidos/vectores de“alto número de copias”puede referirse a aquellos con un número de copias de 100 o más copias por célula, incluidos, entre otros, plásmidos con orígenes de replicación tales como 1. origen de replicación pMB1 mutado a partir de plásmidos pUC (Vieira y Messing 1982. Gen 19:259-268; Vieira y Messing 1987. Métodos Enzymol. 153:3-11; Messing 1983. Métodos Enzymol. 101:20-78; Lin-Chao et al. 1992. Mol. Microbiol.

6:3385-3393); y 2. Origen de replicación derivado de Co1E1 a partir de plásmidos pbluescript (https://www.chemagilent.com/pdf/strata/212205.pdf - Vectores fagémidos pbluescript II, manual de instrucciones, catálogo n.º 212205, n.º 212206. #212207 y #212208, Revisión A.01). El origen de replicación que porta pbluescript es de pUC con una mutación de un solo nucleótido. Se pueden encontrar guías particulares sobre la regulación de plásmidos/vectores de copias bajas y altas en Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3ra (2001), Joseph Sambrook y David W Russell, volumen 1 página 1.4 Tabla 1-1 y volumen 1 página 4.2 Tabla 4-1.

La referencia a plásmidos/vectores de“bajo número de copias”puede referirse a aquellos con un número de copias inferior a 100 copias por célula, incluidos, entre otros, plásmidos con origen de replicación tal como 1. origen de replicación p15A a partir de plásmidos pACYC (Chang y Cohen 1978. J. Bacteriol. 134:1141-1156); 2. Origen de replicación de pSC101 a partir de plásmidos pSC101 (Stoker et al.1982. Gen 18:335-341); 3. Origen de la replicación F a partir de plásmidos F (Kim y cols.1996. Genómica 34:213-218; Asakawa et al.1997. Gen 191: 69-79); 4. Origen de replicación de pMB1 a partir de plásmidos pbR322 (Bolívar et al. 1977. Gen 2:95-113); y 5. Origen de replicación de Co1E1 a partir del plásmido Co1E1 (Kahn et al.1979. Métodos Enzymol.68:268-280)

El experto entenderá que las características opcionales de una descripción pueden ser aplicables, cuando sea apropiado, a otras descripciones.

Figura 1. Identificación de metilasas que bloquean la solapamiento de sitios de metilación/restricción.A. Diagrama de sitios de metilación/restricción solapados para el cribado inicial. Los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción están encuadrados en líneas continuas. El extremo adhesivo generado por la enzima de restricción se muestra con una línea continua. Los sitios de reconocimiento de las enzimas de metilación están encuadrados con líneas discontinuas y las bases metiladas están en negrita. Todas las metilasas enumeradas modifican la N6-adenina, excepto M.SacI y M.AspJHL3I, que modifican la C5-citosina y la N4-citosina respectivamente.

B. Diseños experimentales para probar el bloqueo de sitios de metilación/restricción solapados mediante metilaciónin vivo. Para cada combinación de metilasa/enzima de restricción analizada, el plásmido de prueba contiene un sitio de metilación/restricción solapado y un sitio de restricción no metilable. La digestión de restricción del plásmido de prueba preparado a partir de una cepa normal daría como resultado una restricción en ambos sitios y liberaría un fragmento de ~600 pb de la estructura principal del vector de ~4,3 kb. La digestión de restricción del plásmido de prueba preparado a partir de una cepa que expresa metilasa daría como resultado una única banda de ~4,9 kb, debido al bloqueo de los sitios de metilación/restricción solapados por metilaciónin vivo. Se muestran los sitios de restricción del plásmido de prueba para cada enzima de restricción, con el sitio de restricción encuadrado en línea continua, la secuencia de metilación encuadrada en línea discontinua y las bases metiladas en negrita. La disposición directa del sitio de metilación/restricción solapado permite analizar la actividad de la nickasa en el mismo ensayo. C. Análisis de electroforesis en gel de agarosa del plásmido de prueba para cada combinación solapada de metilasa/enzima de restricción preparada en una cepa normal o en una cepa que expresa metilasa del ADN y digerida con las enzimas de restricción de tipo IIS correspondientes. Las combinaciones ensayadas son BsaI con M.Osp807II (M.Osp) utilizando el plásmido de prueba pMOP_BsaINC, BpiI con M2.NmeMC58II (M2.Nme) utilizando el plásmido de prueba pMOP_BpiINC y LguI con M.XmnI utilizando el plásmido de prueba pMOP_LguINC. Las condiciones de la prueba son 60 fmol de plásmido de prueba digeridos usando 5 U de BsaI o BpiI, o 2,5 U de LguI en 10 µl de reacción a 37 °C durante 1 h. El resultado muestra que cada una de las metilasas probadas produce un bloqueo exitoso a través de la metilaciónin vivode un sitio de restricción para la enzima de restricción de tipo IIS correspondiente cuando el sitio de reconocimiento de metilasa se solapa al sitio de la enzima de restricción. Los datos mostrados representan resultados de tres experimentos independientes.

Figura 2. Sistema Metclo basado en BsaI-M.Osp807II

Los plásmidos donantes contienen fragmentos de ADN para ensamblar (Frag A-D) flanqueados por sitios BsaI que generan extremos adhesivos compatibles (etiquetados aaaa-eeee). Los sitios BsaI se solapan con la secuencia de reconocimiento de metilasa M.Osp807II. Los plásmidos donantes se prepararon a partir de una cepa normal que carece de actividad metilasa M.Osp807II. Como resultado, los sitios BsaI no están metilados y, por lo tanto, los fragmentos de ADN insertados pueden liberarse mediante digestión con BsaI. El vector de ensamblaje contiene un marcador de selección LacZ flanqueado por sitios BsaI enfrentados. El par exterior de sitios BsaI más cercanos al esqueleto del vector se solapa con la secuencia de metilación de M.Osp807II, mientras que el par interior no. La preparación del vector de ensamblaje en la cepa DH10B que expresa M.Osp807II da como resultado el bloqueo específico del par externo de sitios BsaI. BsaI aún podría liberar el fragmento LacZ a través de la acción en el par interior de sitios BsaI. Después de una reacción en un solo recipiente utilizando ADN ligasa BsaI y T4, la ligación entre extremos adhesivos compatibles da como resultado un ensamblaje ordenado de fragmentos de ADN en la columna vertebral del vector de ensamblaje. El fragmento ensamblado en el plásmido ensamblado está flanqueado por sitios BsaI bloqueados refractarios a la digestión con BsaI. Después de la transformación en una cepa normal que carece de actividad M.Osp807II, la metilación de los sitios de restricción flanqueantes se pierde y BsaI podría liberar el fragmento ensamblado para el ensamblaje de la siguiente etapa.

Figura 3. Ensamblaje de ADN utilizando el vector Metclo que contiene elementos de ADN funcionales entre el sitio de restricción protegible por metilación y el sitio de restricción no protegible.

A. Diagrama que muestra el ensamblaje de una unidad de transcripción para la expresión de una proteína con tres dominios diferentes (D1, D2, D3) utilizando el vector Metclo con el elemento promotor (Prom) y la señal poliA (poliA) preincrustados en el vector. Los sitios BsaI protegidos por metilación están encuadrados en línea continua, los sitios BsaI funcionales en línea de puntos y las bases metiladas en negrita. XXXX y YYYY representan la secuencia adaptadora en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de ADN ensamblado (unidad de transcripción) que podría liberarse para la siguiente ronda de ensamblaje de ADN. Pueden o no ser diferentes de las secuencias del adaptador interno (AATG, ACTA, ATCT y GCTT), porque no participan en la reacción de ensamblaje.

B. Diagrama que muestra el ensamblaje de la misma unidad de transcripción usando Metclo con el elemento promotor y la señal poliA proporcionada en plásmidos de inserción separados. XXXX y YYYY representan la secuencia adaptadora en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de ADN ensamblado (unidad de transcripción) que podría liberarse para la siguiente ronda de ensamblaje de ADN. Son diferentes de las secuencias del adaptador interno.

Figura 4. Principio de conmutación de extremos adhesivos utilizando vectores de clonación universales.

A. Diagrama de tres tipos de vectores de ensamblaje universal.

B. Detalles del proceso de cambio de extremo adhesivo de vectores de clonación universal a través de Metclo, utilizando el vector VL como ejemplo. Los sitios de restricción de tipo funcional IIS están encuadrados en línea continua, los sitios de restricción bloqueados en línea discontinua y las bases metiladas en negrita.

C. Sistema simbólico de representación del proceso de cambio de extremo del adhesivo. u y v representan los extremos adhesivos universales CTCC y CGAG respectivamente. x e y representan la secuencia de 4 pb dentro de los extremos adhesivos universales definidos por la secuencia. El ensamblaje utilizando diferentes tipos de vectores da como resultado el cambio de diferentes extremos adhesivos.

D. Proceso de cambio de extremo adhesivo aplicado al ensamblaje de múltiples fragmentos.

Figura 5. Ensamblaje de ADN sin cicatrices utilizando vectores de clonación universales

A. El fragmento de ADN que se va a ensamblar no lleva sitios de restricción BsaI internos. El objetivo del proceso de ensamblaje es generar un único fragmento ensamblado que lleva extremos adhesivos x e y definidos por los extremos del fragmento.

B. La secuencia primero se divide digitalmente en 9 fragmentos diferentes (fragmentos A-I) con solapamientos de 4 pb (a-h).

C. Luego se agregaron secuencias adaptadoras a los fragmentos digitalmente, lo que dio como resultado fragmentos de ADN que podrían recortarse con BsaI para generar fragmentos flanqueados por los extremos adhesivos universales u y v.

D. Los fragmentos de ADN bicatenario sintetizados se clonaron primero en vectores de ensamblaje universales específicos para cambiar los extremos adhesivos dependiendo de la posición del fragmento en la siguiente etapa de ensamblaje.

E. Los fragmentos clonados se ensamblaron 3 por grupo en vectores de ensamblaje universales específicos, dependiendo el tipo de vector de la posición del fragmento ensamblado en la siguiente etapa de ensamblaje. F. La etapa final del ensamblaje genera el fragmento completamente ensamblado con extremos adhesivos x e y de secuencia especificada.

Figura 6. Ventaja del ensamblaje universal sin cicatrices basado en Metclo en comparación con el ensamblaje universal basado en Moclo

Para el ensamblaje de múltiples etapas utilizando vectores de ensamblaje universales, el sistema basado en Moclo utiliza dos enzimas de restricción diferentes (BsaI y Bpil) para etapas consecutivas, lo que requiere diferentes adaptadores universales para un bloque determinado (CTCC para BsaI y AGAA para BpiI). Para clonar los fragmentos de diferentes etapas en vectores de ensamblaje universal, el extremo 5’ del primer bloque y el extremo 3’ del último bloque en cada subconjunto deben cambiar entre diferentes secuencias adaptadoras dependiendo de la enzima utilizada para el ensamblaje. La ilustración muestra el cambio del adaptador 5’ para el primer bloque (bloque A) durante 3 etapas consecutivas de la reacción de ensamblaje, con los sitios BsaI encuadrados en línea continua y los sitios BpiI encuadrados en líneas discontinuas. Es necesario agregar un adaptador muy largo al extremo de 5’ del bloque A para hacer frente al cambio de adaptadores durante las diferentes etapas del ensamblaje. El adaptador se“mastica”4 pb después de cada etapa de ensamblaje, por lo que la longitud de la secuencia del adaptador depende del número de etapas. El diseño basado en Metclo es mucho más sencillo, porque utiliza una única enzima BsaI para las diferentes etapas de ensamblaje. Aquí los sitios BsaI no metilables están recuadrados en línea continua y los sitios BsaI bloqueados por metilación están recuadrados en línea discontinua. La secuencia de adaptador universal CTCC en el extremo 5’ del primer bloque (bloque A) se puede utilizar para diferentes etapas de ensamblaje. No es necesario cambiar la secuencia del adaptador para los bloques exteriores. Como resultado, el diseño del adaptador para la secuencia inicial es mucho más sencillo.

Figura 7. Ensamblaje de ADN usando Metclo.La figura ilustra el ensamblaje de cuatro fragmentos de ADN (Fragmentos A, B, C y D) en un único fragmento de ADN (Fragmento ABCD) a través de dos ciclos de Metclo utilizando una única enzima de restricción de tipo IIS. La etapa 1 y la etapa 2 son efectivamente el mismo proceso con inserciones progresivamente más grandes. En la Etapa 1, los plásmidos donantes del inserto contienen fragmentos del inserto (Fragmentos A, B, C o D) flanqueados por sitios de restricción metilables de tipo IIS que generan extremos adhesivos compatibles La preparación de plásmidos insertados en cepas normales de E. coli, que carecen de la metilasa específica del sitio adecuada, da como resultado fragmentos insertados liberables por la enzima de restricción tipo IIS. El vector de ensamblaje contiene el marcador de selección negativa LacZα flanqueado por una configuración de cabeza a cabeza diseñada expresamente de sitios de restricción de tipo IIS. El par interior de los sitios de restricción está diseñado para que no sean metilables, pero el par exterior sí lo es mediante una metilasa específica del sitio porque la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción se solapa con la secuencia de reconocimiento de la metilasa. La preparación del vector de ensamblaje en cepas deE. colique expresan la metilasa correspondiente conduce a la metilación selectiva del par externo de sitios de restricción metilables, y la digestión con la enzima de restricción de tipo IIS genera una columna vertebral del vector que retiene el par externo de sitios de restricción de tipo IIS metilados. La ligación de los fragmentos del inserto con la estructura principal del vector genera un plásmido correctamente ensamblado refractario a la restricción mediante la enzima de restricción tipo IIS. Todos los demás fragmentos no deseados, incluida la cadena principal del vector del plásmido insertado y el fragmento LacZα del vector de ensamblaje, contienen sitios de restricción activos de tipo IIS, que son sensibles a la restricción por parte de la enzima. Este esquema permite una reacción de ensamblaje en un solo recipiente que combina el paso de restricción y ligación porque la reacción favorece la generación del plásmido ensamblado correctamente. La transformación de la reacción de ensamblaje en una cepa deE. colinormal, que carece de la metilasa específica del sitio apropiada, da como resultado efectivamente la desmetilación de los sitios de restricción metilados de tipo IIS que flanquean el fragmento ensamblado en el plásmido ensamblado. En la Etapa 2, los insertos ensamblados (Fragmentos AB y CD) se pueden usar para una ronda posterior de ensamblaje de Metclo en un fragmento más grande (Fragmento ABCD).

Figura 8. Salto de nivel: esquema de modificación de ADN utilizando componentes de diferentes niveles de ensamblaje. El diagrama muestra el esquema para el ensamblaje de dos fragmentos de ADN (Fragmentos A y B) mediante el esquema estándar de Metclo y la posterior modificación del fragmento ensamblado (Fragmento AB) utilizando un tercer fragmento (Fragmento C). Los fragmentos iniciales utilizados (Fragmentos A, B y C) son del mismo nivel en la jerarquía de ensamblaje, en el sentido de que llevan el mismo marcador de selección de antibióticos. El paso de modificación modifica un fragmento existente (Fragmento AB) utilizando un fragmento (Fragmento C) de un nivel diferente de ensamblaje, por lo tanto,“salto de nivel”. El fragmento modificado (Fragmento ABC) lleva los mismos extremos adhesivos que el fragmento inicial (Fragmento AB) y un marcador de selección de antibiótico (M3) diferente de los bloques de nivel 1 y 2 (M1 y M2). Por lo tanto, el nuevo fragmento ABC puede usarse para el siguiente nivel de ensamblaje de ADN usando el marcador de selección M1 en lugar del fragmento AB. El mantenimiento de los extremos adhesivos durante el paso de modificación se logra mediante el uso de una disposición especial de sitios de restricción de tipo IIS cabeza a cabeza (a la derecha del fragmento LacZα durante el paso de modificación), en el que el interior de tipo IIS no metilable El sitio de restricción genera un extremo adhesivo que es compatible con el fragmento de modificación a insertar (Fragmento C), y el sitio de restricción exterior metilable tipo IIS genera un extremo adhesivo idéntico al extremo del fragmento de ADN a modificar (el extremo derecho del Fragmento AB en el diagrama). El paso de modificación no es posible con el método Moclo estándar que utiliza dos enzimas de restricción de tipo IIS, porque los fragmentos de ADN de niveles consecutivos de ensamblaje tendrían que ser liberados por dos enzimas de restricción diferentes, cada una de las cuales tiene que ser diferente de la enzima utilizada para el siguiente nivel de ensamblaje de ADN después del paso de modificación. El esquema de modificación de salto de nivel es útil para la inserción de elementos genéticos funcionales, como unidades de transcripción, en un proceso de ensamblaje existente sin cambiar el diseño de ensamblaje de nivel superior, para maximizar la reutilización de las partes de ADN existentes con secuencia verificada.

Figura 9. Inserción de nivel: esquema para el ensamblaje del ADN a través de una etapa intermedia de ensamblaje.El diagrama muestra el esquema de ensamblaje de cuatro fragmentos de ADN (Fragmentos A, B, C y D) en un solo fragmento (Fragmento ABCD) a través de una etapa intermedia de ensamblaje de ADN (Nivel de inserción). A diferencia del esquema de ensamblaje estándar de Metclo (Figura 3) que ensambla los cuatro fragmentos en una sola reacción, este esquema implica una etapa de ensamblaje intermedia mediante el subensamblaje de los fragmentos B y C en un vector de ensamblaje intermedio que lleva un marcador de selección (M3) diferente del de los insertos de ADN de nivel 1 (M1 transportado por los fragmentos A, B, C y D) y del fragmento de ADN ensamblado de nivel 2 (M2 transportado por los fragmentos ABCD). El esquema de subensamblaje de inserción de nivel ofrece más opciones en las rutas de ensamblaje del ADN y aumenta la reutilización de los fragmentos de ADN ensamblados intermedios.

Figura 10. Suma lineal: esquema para la construcción de vectores de ensamblaje usando Metclo basado en Bsal. El diagrama muestra el esquema para la adición lineal de partes de ADN para la construcción de vectores de ensamblaje que transportan elementos genéticos funcionales existentes (Fragmentos A y D). Comenzando con un vector de ensamblaje que lleva un fragmento de ADN de relleno no seleccionable flanqueado por sitios de restricción de tipo IIS no metilables, primero se ensamblan dos fragmentos de ADN (Fragmentos A y D) con un marcador de selección LacZα en este vector. El marcador de selección LacZα está flanqueado por una disposición cabeza a cabeza especialmente diseñada de sitios de restricción tipo IIS, de modo que los sitios internos son metilables y los sitios externos no. La preparación del plásmido de inserción LacZα en una cepa deE. colique expresa la metilasa correspondiente da como resultado el bloqueo selectivo de los pares internos de sitios de restricción metilables de tipo IIS. El ensamblaje en un solo recipiente del inserto LacZα con otros insertos preparados a partir de la cepa E.coli normal (Fragmentos A y D) da lugar a un fragmento de ADN ensamblado refractario a la restricción por la enzima de restricción de tipo IIS utilizada para el ensamblaje del ADN. La transformación del ADN ensamblado en una cepa normal deE. colique carece de la correspondiente actividad metilasa da como resultado la desmetilación de los sitios de restricción metilables de tipo IIS que flanquean el fragmento LacZα. Como resultado, el ADN ensamblado se puede utilizar como vector de ensamblaje para la adición de nuevos fragmentos de ADN (Fragmentos B y C) en lugar del marcador de selección LacZα en la siguiente ronda de ensamblaje de ADN. El resultado neto es la adición lineal de fragmentos de ADN en el vector de ensamblaje (fragmentos A y D, luego fragmentos B y C). El esquema es útil para la construcción de vectores de ensamblaje de etapa final que portan elementos genéticos funcionales comunes, como marcadores de selección de mamíferos.

Ejemplo 1: ensamblaje modular asistido por metilación utilizando una única enzima de restricción (MetClo) Introducción

Descripción general de Metclo

Aquí desarrollamos un método de ensamblaje jerárquico basado en enzimas de restricción tipo IIS mejorado llamado Metclo, que reduce la cantidad de enzimas de restricción utilizadas a una. LoGs esto agregando un par de sitios de restricción de tipo IIS específicos para la misma enzima utilizada para el ensamblaje en el vector de ensamblaje, que se bloquean selectivamente mediante la metilación del ADN. La transformación del ADN ensamblado en cepas normales que carecen de la metilasa específica desbloquea los sitios de restricción flanqueantes, lo que da como resultado plásmidos que transportan el fragmento ensamblado que puede liberarse usando la misma enzima de restricción tipo IIS y luego usarse para una ronda posterior de ensamblaje de ADN. Probamos varias metilasas para determinar su capacidad para bloquear sitios de metilación/restricción solapados para tres enzimas de tipo IIS BsaI, BpiI y LguI comúnmente utilizadas y disponibles comercialmente, e identificamos metilasas adecuadas para cada una de ellas, a saber, M.Osp807II (para BsaI con secuencia solapadaGACNNGGtCTCN^NNNN), M2.NmeMC58II (para BpiI con secuencia solapadaGAAGACGC^NNNN),y M.XmnI (para LguI con secuencia solapadaGAACGCTCTtCN^NNN, la base metilada o la base opuesta está subrayada, se requieren bases adicionales para especificar la actividad metilasa en negrita, secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción en cursiva; las tres modificaciones son m6A N6-metiladenina). Desarrollamos cepas deE. colique portan copias cromosómicas de casetes de expresión para la expresión constitutiva de estas metilasas y demostramos que el ADN propagado en estas cepas es refractario a la digestión por la enzima de restricción cuando el sitio de restricción se solapa con la secuencia de reconocimiento de metilasa correspondiente. Luego construimos sistemas Metclo de prueba de principio para cada par de metilasa/enzima de restricción para ensamblar cuatro fragmentos en un solo fragmento, que podría ser liberado por la misma enzima de restricción. Finalmente, demostramos la utilidad del sistema Metclo basado en M.Osp807II/BsaI para el ensamblaje jerárquico de un ADN de 218 kb a partir de ADN de 28 x 7,7 kb en 2 etapas utilizando BsaI.

Materiales y métodos

Construcción de plásmido

Los plásmidos se construyeron mediante técnicas de clonación basadas en ligación y enzimas de restricción estándar. Los fragmentos de ADN para la clonación se generaron mediante PCR o mediante síntesis de genes (IDT o Invitrogen). Para probar el ensamblaje modular principal de ADN de aproximadamente 1 kb a partir de 4 fragmentos, la columna vertebral del vector aceptor del ensamblaje modular se basa en el vector Moclo resistente a ampicilina pICH47732 (disponible en Addgene y descrito en A modular cloning system for standardized junction of multigene constructs). Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S. PLoS One. 18 de febrero de 2011;6(2):e16765. doi: 10.1371/journal.pone.0016765) y la estructura principal del plásmido donante basada en un vector resistente a kanamicina construido reemplazando el gen resistente a ampicilina en pICH47732 con un gen resistente a kanamicina. Para el ensamblaje jerárquico de ADN de ~200 kb a partir de 28 fragmentos, los vectores aceptores de ensamblaje modular se basan en la columna vertebral del vector BAC de baja copia resistente a gentamicina o kanamicina con origen de replicación F, y la columna vertebral del plásmido donante se basa en cadenas principales de vector de baja copia resistente a la kanamicina con Origen de replicación de p15A o F. Los plásmidos para la sobreexpresión de metilasa se construyeron basándose en un esqueleto de vector BAC de baja copia resistente a kanamicina con origen de replicación F. Los genes de metilasa estaban bajo el control del promotor sintético J23100 y flanqueados por un casete de selección de zeocina, así como secuencias homólogas del locus arsB para facilitar la integración estable en el genoma de E coli mediante recombinación. Los plásmidos plantilla para el ensayo de metilasa se basan en pICH47732 resistente a ampicilina.

Generación de cepas que expresan metilasa.

Se generaron cepas deE. colicon expresión estable de metilasas específicas mediante recombinación. Brevemente, se generaron fragmentos de ADN que contienen el gen de la metilasa, el marcador de selección de zeocina y las secuencias homólogas flanqueantes de arsB mediante PCR utilizando el plásmido BAC que expresa la metilasa correspondiente como plantilla. Los fragmentos se usaron para la recombinación de rojo lambda en células DH10B seguido de selección con zeocina para insertar el casete de expresión de metilasa en el locus arsB. Los clones con inserciones cromosómicas correctas se verificaron mediante PCR y secuenciación. Las cepas que expresan metilasa pueden mantenerse estables sin selección de antibióticos.

Ensamblaje modular

Para probar el ensamblaje modular principal de ADN de ~ 1 kb a partir de 4 fragmentos, las reacciones de ensamblaje se configuraron utilizando 60 fmol de cada uno de los plásmidos donantes preparados a partir de células DH5alfa, 60 fmol de vector de ensamblaje preparado a partir de cepas DH10B que expresan metilasa compatible, 1000 U de ADN ligasa T4 (NEB), y 5U de BsaI (NEB) o BpiI (Fermentas) o 2,5U de LguI (Fermentas) en 20 µl de tampón de ligasa T4 1x (NEB). La condición de reacción fue: 37°C 15 min, seguido de 45 ciclos de 37°C 2 min más 16°C 5 min, luego 37°C 20 min y 80°C 5 min. Las muestras ensambladas se transformaron en células químicamente competentes DH5alfa y se sembraron en placas LB con selección de AIX (ampicilina 100 µg/ml, IPTG 100 µM, X-Gal 50 µg/ml) a 37 °C durante la noche. Las colonias blancas se ampliaron y examinaron mediante secuenciación de ADN.

Para el ensamblaje jerárquico de ADN de aproximadamente 200 kb a partir de 28 fragmentos, el ensamblaje se llevó a cabo en dos etapas. En la etapa 1, los fragmentos se ensamblaron 7 por grupo usando 15 fmol de cada plásmido donante preparado a partir de células DH10B, 15 fmol de vector de ensamblaje preparado a partir de células DH10B-M.Osp807II, 1000 U de ligasa T4 (NEB) y 5 U de BsaI (NEB) en 20 µl. 1x tampón ligasa T4 (NEB). La condición de reacción fue la misma que la descrita anteriormente. Luego, las muestras ensambladas se dializaron gota a gota frente a 50 ml de dH2O utilizando un filtro de celulosa de 0,05 µm (Millipore) a temperatura ambiente durante 1 h. Se transformaron 5 µl de muestra dializada en 25 µl de células electrocompetentes NEB-10beta mediante electroporación a 0,9 kV, 100 Ω, 25 µF, utilizando Gene Pulser y cubetas de electroporación de 1 mm (Biorad). Después de la electroporación, las células se recuperaron añadiendo 1 ml de medio LB y se incubaron a 37 °C 23,03 rad/s (220 rpm) durante 1 h. Las células se sembraron en placas LB con selección GIX (gentamicina 2,5 µg/ml, IPTG 100 µM, X-gal 50 µg/ml) a 37°C durante la noche. Las colonias blancas se expandieron y seleccionaron mediante digestión de restricción usando XhoI.

En la etapa 2, el ADN de aproximadamente 200 kb se ensambló usando protocolos similares a los de la etapa 1 con las siguientes modificaciones: se usaron 30 fmol de cada plásmido donante y 15 fmol de vector de ensamblaje en la reacción de ensamblaje; Después del ensamblaje modular y antes del paso de diálisis por gota, se agregaron 10 U de BsaI a la reacción de ensamblaje para la incubación a 37 °C durante 45 min, seguido de inactivación por calor a 80 °C durante 5 min. Las células transformadas se sembraron en placas LB con selección KIX (kanamicina 30 µg/ml, IPTG 100 µM, X-gal 50 µg/ml). Las colonias blancas se examinaron mediante PCR utilizando cebadores que detectan la unión entre el segundo y el tercer fragmento de 54 kb (TACCCACGTGATTCACGCTG y ATCCTACAGACTCGCTGTGG). Los clones positivos para PCR seleccionados se examinaron mediante digestión de restricción usando XhoI o BsaI con electroforesis de campo pulsado.

Resultado

El sistema Metclo se basa en el sistema de ensamblaje de ADN de un solo recipiente basado en enzimas de restricción tipo IIS estándar y agregó un par adicional de sitios de restricción tipo IIS en la columna vertebral del vector de ensamblaje para la liberación del ADN ensamblado para el ensamblaje de la siguiente etapa. A diferencia del sistema Moclo, que utiliza sitios de restricción diferentes de la enzima tipo IIS utilizada en el proceso de ensamblaje, Metclo utiliza sitios de restricción para la misma enzima. Para evitar que esta enzima corte el plásmido ensamblado en la reacción de ensamblaje en un solo recipiente, Metclo utiliza metilasa específica para metilar los sitios de restricción de tipo IIS que se solapan con las secuencias de reconocimiento de la metilasa, para bloquear estos sitios de restricción de tipo IIS en la columna vertebral del vector La metilación se pierde cuando el plásmido ensamblado se transforma en cepas deE. colique carecen de la metilasa específica, lo que permite la liberación del fragmento ensamblado del plásmido ensamblado mediante la misma enzima de restricción de tipo IIS utilizada en la reacción de ensamblaje. Por lo tanto, el sistema Metclo resultante permite el ensamblaje jerárquico de fragmentos de ADN mediante una reacción en un solo recipiente con una única enzima de restricción de tipo IIS, entre varias aplicaciones.

La clave del sistema Metclo es la identificación de la metilasa adecuada para bloquear los sitios de restricción de tipo IIS que se solapan con la secuencia de reconocimiento de la metilasa en la columna vertebral del vector. Existen varios criterios para la selección de la metilasa adecuada. En primer lugar, la metilación del sitio de metilación/restricción solapado debe dar como resultado el bloqueo de la acción de la enzima de restricción de tipo IIS. El proceso de metilación podría ocurrir por metilaciónin vitrodel plásmido vector purificado, o mediante la propagación del plásmido vector en cepas que expresan la metilasain vivo.Se prefiere la metilaciónin vivodebido al costo y tiempo reducidos en el proceso de preparación del vector. En segundo lugar, la secuencia de reconocimiento de la metilasa no debe ser idéntica ni estar completamente rodeada por el sitio de restricción de tipo IIS; Se deben requerir pares de bases adicionales para especificar la acción de la metilasa en el sitio de metilación/restricción solapado. La razón de este requisito es que hay dos pares de sitios de restricción de tipo IIS para la misma enzima en el vector de ensamblaje. La metilasa debe bloquear un par dentro de la cadena principal del vector, mientras que el otro par dentro del inserto del marcador de selección negativa no debe bloquearse. Si la secuencia de reconocimiento de metilasa es idéntica al sitio de restricción de tipo IIS o está incluida en él, todos los sitios de restricción en el vector de ensamblaje para esta enzima de restricción de tipo II en particular se bloquearán mediante metilación, incluido el par dentro del inserto del marcador de selección negativa; el vector de ensamblaje metilado resultante no será cortado en absoluto por la enzima tipo IIS, por lo tanto, no se puede utilizar para el ensamblaje de ADN. En tercer lugar, los pares de bases adicionales para especificar la actividad metilasa no deben solaparse con la secuencia del extremo adhesivo generada por la enzima de restricción tipo IIS. Esto mantendrá la máxima flexibilidad en el diseño de la secuencia adaptadora para el ensamblaje del ADN.

Buscamos metilasas con capacidad predicha para bloquear los sitios de restricción de las enzimas de restricción de tipo IIS BsaI, BpiI y LguI. Se trata de enzimas de restricción de tipo IIS habituales en los sistemas de ensamblaje basados en IIS. Para elegir las metilasas candidatas utilizamos algunos criterios adicionales a los mencionados anteriormente. Nuestro objetivo era generar plásmidos metilados mediante metilación in vivo, por lo que lo ideal era que la metilasa fuera activa a la temperatura de crecimiento de E coli. También preferimos metilasas que reconocieran secuencias más largas (5-6 pb), porque con secuencias de reconocimiento más largas, menos bases en el genoma huésped de E coli y en el esqueleto del vector de ensamblaje servirían como sustrato de metilación por casualidad. Esto aumenta potencialmente la eficacia de la metilación y reduce la posibilidad de que la metilación heteróloga del ADN tenga efectos adversos sobre la función del gen huésped. Además, preferimos las metilasas de subunidad única de los sistemas de restricción/modificación de tipo II que carecen de actividad de restricción hacia la secuencia no metilada para evitar posibles problemas de restricción durante la etapa de construcción del vector. Por último, para aumentar la probabilidad de que la metilación bloquee los sitios de metilación/restricción solapados, preferimos metilasas que modifican bases cercanas al centro del sitio de restricción.

Con base en estos criterios, seleccionamos las siguientes metilasas para las pruebas: M.Osp807II (GACNNGGTCTC m6A) para BsaI, M.Rsp7740I (TTCGAAGAC m6A) y M2.NmeMC58II (GAAGACGC m6A) para BpiI, y M.SacI (GAGCTCTTC m5C). M.AspJHL3I (GAGCTCTTC m4C) y M.XmnI (GAAGCTCTTC m6A) para LguI (base metilada o base complementaria subrayada). Examinamos la actividad de la metilasa preparando un plásmido plantilla de alto número de copias basado en ColE (es decir, derivado de ColE) que lleva sitios de metilación/restricción solapados en células DH10B que expresan la metilasa correspondiente bajo el promotor sintético constitutivo J23100 de un vector BAC de baja copia (estructura del vector BAC de baja copia). con origen de replicación F). Esto identificó a M.Osp807II (para BsaI), M2.NmeMC58II (para BpiI) y M.XmnI (para LguI) como candidatos adecuados para análisis adicionales (Figura 1A). Luego inteGs el casete de expresión de metilasa con un marcador de selección de zeocina en el locus arsB usando recombinación de rojo lambda para generar cepas estables que sobreexpresan la metilasa a partir de una copia cromosómica (Hecho de células microbianas. 24 de junio de 2013; 12:60. doi: 10.1186/1475-2859-12-60 (PMID 23799955)), y probó la capacidad de estas metilasas para bloquear sitios de metilación/restricción solapadosin vivo.El vector de prueba lleva un sitio de restricción que no se solapa con la secuencia de metilación, por lo que es permisible para la restricción tanto en la cepa de tipo salvaje como en la cepa que expresa metilasa, y un sitio con dos sitios de restricción de tipo IIS cabeza a cabeza, ambos de los cuales se solapan con la secuencia de metilación correspondiente y, por lo tanto, estarían bloqueados en la cepa que expresa la metilasa. La disposición de cabeza a cabeza permite la evaluación de la actividad de la nickasa, así como la actividad de restricción de doble hebra en el mismo ensayo (Figura 1B). Después de 1 hora de digestión de 60 fmol de plásmido de prueba (pMOP _BsaINC, pMOP_BpiINC y pMOP _LguINC) en 10 µl de reacción usando 5 U (BsaI, BpiI) o 2,5 U (LguI) de enzima a 37 °C, se analizó el ADN mediante electroforesis en gel de agarosa con tinción con EtBr. El resultado muestra que, en condiciones de prueba, las tres metilasas bloquean la restricción de los sitios solapados, como lo demuestra la falta de generación del fragmento de -600 pb (Figura 1C).

Luego desarrollamos sistemas de ensamblaje de ADN Metclo de prueba de principio utilizando estas metilasas para el ensamblaje de ADN en un solo recipiente (la Figura 2 muestra BsaI-MOsp807II como ejemplo). En estos sistemas, los insertos de ADN del donante que se van a ensamblar están flanqueados por un sitio de metilación/restricción solapado. Debido a que los plásmidos donantes que contienen los insertos de ADN que se van a ensamblar se preparan en una cepa deE colinormal que carece de la metilasa correspondiente, el sitio de restricción no está bloqueado y la enzima podría liberar el inserto donante en la reacción de ensamblaje. El vector de ensamblaje lleva un marcador de selección diferente del plásmido donante y un marcador de selección LacZ flanqueado por sitios de restricción tipo IIS cabeza a cabeza. Para cada sitio de cabeza a cabeza, los dos sitios de restricción de tipo IIS generan el mismo extremo adhesivo. El sitio exterior cercano al esqueleto del vector se solapa con la secuencia de metilación, y el sitio interior cercano al inserto LacZ no. Los vectores de destino se preparan a partir de una cepa deE colique expresa la metilasa correspondiente. Como resultado, sólo los sitios internos de tipo IIS son funcionales en la reacción de ensamblaje. Durante la reacción, el inserto LacZ se libera de la columna vertebral del vector debido a la acción de la enzima en el sitio interior tipo IIS; la ligadura del inserto donante con el vector de destino da como resultado sitios de restricción de tipo IIS dentro de la estructura principal del vector de destino, que se bloquea mediante metilación; La religación del inserto LacZ liberado con la columna vertebral del vector de destino da como resultado la regeneración del sitio tipo IIS cabeza a cabeza, que es sensible a la restricción debido a que el sitio interior no está bloqueado. Como resultado, la reacción favorece la ligación de los fragmentos del donante al esqueleto del vector de destino. Luego, la reacción moclo se transforma en una cepa deE colinormal que carece de actividad metilasa específica para detectar la expresión de LacZ utilizando placas LB que contienen IPTG y X-Gal. Las colonias blancas que carecen de actividad LacZ deben contener plásmidos ensamblados con éxito. El fragmento de ADN ensamblado tiene sitios de restricción de tipo IIS flanqueantes que se solapan con secuencias de reconocimiento de metilasa, que son idénticas al vector donante. Como resultado, esto permite una ronda adicional de ensamblaje modular en el siguiente nivel usando la misma enzima de restricción y así sucesivamente durante múltiples rondas según sea necesario.

Probamos los sistemas para las tres enzimas para el ensamblaje a partir de cuatro fragmentos (Tabla 1). Los vectores donantes son resistentes a la kanamicina y los vectores de destino, resistentes a la ampicilina. Los vectores de destino se prepararon a partir de las correspondientes cepas que expresan metilasa. Después de la selección, se seleccionaron 8 colonias blancas para la minipreparación y se analizaron mediante secuenciación Sanger. El resultado de la secuenciación muestra que el 100% (8/8) de los clones son correctos para cada uno de los tres sistemas Metclo (Tabla 1). Esto confirma la utilidad de Metclo para el ensamblaje modular utilizando una única enzima de restricción como BsaI, BpiI o LguI.

Para explorar más a fondo la utilidad de Metclo para el ensamblaje jerárquico de construcciones de ADN grandes, ensamblamos un fragmento de ADN de 218 kb a partir de fragmentos de 28 x 7,7 kb utilizando la enzima de restricción BsaI en dos etapas. En la etapa uno, se ensamblaron 28 fragmentos de ADN de 7,7 kb que estaban libres de sitios BsaI, 7 por grupo en 4 fragmentos de 54 kb utilizando el sistema Metclo basado en BsaI. En la segunda etapa, las 4 piezas de fragmentos de 54 kb se ensamblaron en un único fragmento de 218 kb. El fragmento final de 218 kb está compuesto por una secuencia no repetitiva con -48 % de contenido de GC. El resumen de restricción muestra una tasa de éxito del -50% para el ensamblaje de la etapa 1 (2/4 a 3/4 clones correctos) y del -20% para el ensamblaje de la etapa 2 (14 de 27 verificados por PCR, de los cuales 3 de 8 verificados mediante restricción) digerir) (Tabla 2). Esto confirma que el sistema Metclo se puede utilizar para el ensamblaje jerárquico de construcciones de ADN grandes utilizando una única enzima de restricción de tipo IIS.

Discusión

Aquí presentamos Metclo, un sistema de ensamblaje de ADN basado en enzimas de restricción de tipo IIS modificado para el ensamblaje de ADN en un solo recipiente utilizando enzimas de restricción de tipo IIS comunes como BsaI, BpiI o LguI, que genera ADN ensamblado que se puede liberar mediante la misma enzima de restricción. Esto permite el ensamblaje jerárquico de construcciones de ADN grandes utilizando una única enzima de restricción de tipo IIS. El sistema utiliza cepas que sobreexpresan metilasa durante el paso de preparación del vector parain vivometilación de sitios de metilación/restricción solapados para bloquear sitios de restricción selectiva en el vector. El proceso de ensamblaje es el mismo que el de los sistemas de ensamblaje de ADN tipo IIS mediante el uso de reacción en un solo recipiente, por lo que se preserva la simplicidad de los sistemas existentes. Los pasos de preparación y transformación de piezas utilizan cepas normales similares al sistema Moclo estándar, lo que permite el uso de cepas de clonación de rutina para el ensamblaje de ADN, similar a los sistemas de ensamblaje de tipo IIS actuales.

El sistema Metclo tiene una serie de ventajas sobre los sistemas de ensamblaje de ADN jerárquicos basados en enzimas de restricción tipo IIS existentes. En primer lugar, el enfoque de Metclo reduce la carga de eliminar los sitios de restricción internos durante la construcción de los componentes. En comparación con el sistema Moclo estándar que utiliza dos o más enzimas, el sistema Metclo de enzima única basado en BsaI y BpiI utiliza un cortador de 6 pb que reduce la frecuencia de los sitios de restricción prohibidos de 1 por ~1kb a 1 por ~2kb para ADN aleatorio con 50% de contenido de GC, y el sistema Metclo basado en LguI utiliza un cortador de 7 pb que reduce aún más la frecuencia a 1 por ~8 kb.

Metclo mejora la flexibilidad del sistema de ensamblaje jerárquico de tipo IIS. Dado que los fragmentos de ADN ensamblados procedentes de diferentes etapas de ensamblaje pueden ser liberados por la misma enzima de restricción, con un diseño adecuado de los adaptadores y la elección de un vector resistente a los antibióticos, el sistema permite potencialmente el diseño de varios esquemas de ensamblaje que no pueden conseguirse utilizando el sistema existente. Entre ellos se incluyen el salto de nivel (el ensamblaje de ADN utilizando partes de diferentes etapas de ensamblaje) y la inserción de nivel (el ensamblaje de fragmentos de ADN a través de una etapa de ensamblaje intermedia). Estos esquemas son útiles para la modificación de grandes construcciones de ADN utilizando las piezas existentes, y para el subensamblaje de piezas complejas, como los marcos de lectura abiertos de varias partes, para una mayor reutilización.

También podrían idearse esquemas adicionales para la adición lineal de partes de ADN durante el proceso de ensamblaje. Por ejemplo, durante el ensamblaje del ADN podrían usarse partes de ADN que contengan marcadores de selección flanqueados por sitios de restricción de tipo IIS bloqueados por metilación interna. El plásmido ensamblado podría usarse entonces como vector de ensamblaje para la inserción de partes de ADN adicionales en lugar del marcador de selección en la siguiente etapa de ensamblaje. Esto es particularmente útil para la construcción de vectores de ensamblaje comunes que contienen módulos funcionales.

Metclo también aumenta la intercambiabilidad de piezas de diferentes estándares de ensamblaje. El desarrollo independiente de bibliotecas de piezas y estándares de ensamblaje conduce a sistemas de ensamblaje que utilizan diferentes enzimas de restricción de tipo IIS. Por ejemplo, para biología vegetal, Moclo usa BsaI/BpiI (y Esp3I), Goldenbraid usa BsaI y BsmBI (y BtgZI); para E.coli, Ecoflex utiliza Bsal/BsmBI, CIDAR utiliza BsaI/BpiI. Esto impone limitaciones a la intercambiabilidad de piezas entre diferentes colecciones. El sistema Metclo que utiliza una única enzima de restricción tipo IIS es compatible con cualquier sistema que utilice esa enzima de restricción. En particular, el sistema basado en BsaI es compatible con todos los sistemas existentes que utilizan BsaI. Dado que BsaI se ha utilizado en la mayoría de los sistemas de ensamblaje modular jerárquico basados en enzimas de restricción tipo IIS hasta la fecha (ACS Sintetizador Biol. 21 de octubre de 2016;5(10):1059-1069 (PMID 27096716); ACS Sintetizador Biol. 15 de enero de 2016;5(1):99-103. doi: 10.1021/acssynbio.5b00124 (PMID 26479688; ACS Sintetizador Biol. 18 de septiembre de 2015;4(9):975-86. doi: 10.1021/sb500366v (PMID25871405)); y Más uno. 18 de febrero de 2011;6(2):e16765. doi: 10.1371/journal.pone.0016765 (PMID 21364738), el sistema Metclo basado en BsaI tiene potencial para usarse como estándar para ensamblaje modular que es compatible con la mayoría de las bibliotecas de piezas existentes.

Existen sistemas de ensamblaje de ADN que utilizan la metilación del ADN para bloquear los sitios de restricción internos de tipo IIS durante el proceso de ensamblaje. Por ejemplo, el sistema de ensamblaje TNT (Sci Rep. 13 de enero de 2016; 6: 19278. doi: 10.1038/srep19278 (PMID 26758940)) utiliza M.TaqI para metilar el sitio de reconocimiento de EarI solapado, lo que da como resultado un sistema de ensamblaje que utiliza un cortador LguI de 7 pb (GCTCTTCN^NNN) y un cortador EarI de 6 pb (CTCTTCN^NNN), ambos con extremos adhesivos de 3 pb, por lo que requieren la eliminación de un solo 6 pb. secuencia de partes de ADN (CTCTTC). Sin embargo, debido a que la secuencia de reconocimiento M.TaqI (TCGA) que se solapa con el sitio de restricción EarI interfiere con la secuencia del extremo adhesivo (CTCTTCG^ANN), el sistema impone limitaciones en el diseño de los adaptadores, por lo que solo puede ensamblar fragmentos de tres a la vez. y no se pudo ampliar a un sistema de ensamblaje exclusivo de LguI. Como otro ejemplo, Greengate utilizó ADN conector metilado como partes durante el proceso de ensamblaje del ADN para introducir nuevos sitios BsaI para rondas de ensamblaje posteriores. Sin embargo, el sistema resultante sólo podría usarse para la adición lineal de partes de ADN, limitando así el uso del sistema a la construcción de construcciones de ADN con un pequeño número de unidades de transcripción. En comparación con estos sistemas, el sistema Metclo, con el uso dein vivoLa metilación del sitio de metilación/restricción solapado fuera de la secuencia adaptadora preserva la ventaja del esquema de ensamblaje multiplicativo jerárquico del sistema Moclo y mantiene la libertad de elección de secuencias adaptadoras para el ensamblaje de ADN. En la práctica, se podrían lograr resultados similares agregando ADN conector metilado como primera y última parte durante el proceso de ensamblaje. Sin embargo, esto aumentaría el número de piezas en el ensamblaje en dos, lo que reduce la tasa de éxito del ensamblaje en comparación con el enfoque de metilación de vectoresin vivoen el sistema Metclo.

En resumen, el sistema Metclo, mediante el uso de metilaciónin vivopara bloquear sitios específicos de restricción de tipo IIS dentro del vector de ensamblaje, permite el ensamblaje jerárquico de grandes fragmentos de ADN utilizando una única enzima de restricción de tipo IIS. El sistema simplifica el método de ensamblaje basado en enzimas de restricción tipo IIS existente y aumenta la flexibilidad del diseño de esquemas de ensamblaje. El sistema Metclo basado en BsaI en particular es compatible con todas las bibliotecas de piezas existentes que utilizan BsaI y podría usarse como un sistema de ensamblaje estándar tipo IIS.

Ejemplo de un elemento compuesto insercional

En otro escenario, se podrían incluir secuencias de ADN más largas entre el sitio de restricción protegible por metilación y el sitio de restricción no protegible opuesto en el vector de ensamblaje, de modo que después del ensamblaje del ADN, estas secuencias se agregarán en el extremo 5’ o 3’ del plásmido de ADN ensamblado. Este diseño es conveniente para agregar elementos comunes al plásmido ensamblado mediante el uso de vectores especializados.

En la figura 3 se muestra un ejemplo para el ensamblaje de una unidad de transcripción para la expresión de una proteína con tres dominios diferentes, a partir de plásmidos insertados que contienen los tres dominios individuales D1, D2 y D3 usando Metclo basado en BsaI. La Figura A muestra el ensamblaje de Metclo utilizando un vector Metclo especial que contiene un promotor entre el sitio de restricción protegible por metilación y el sitio de restricción no protegible en 5’ de LacZ (secuencia de descarte), y un elemento poliA en 3’ (“pre- vector incrustado”. El uso de Metclo con este vector especial preincrustado permite el ensamblaje de los tres dominios en una unidad de transcripción en una reacción en un solo recipiente a partir de tres plásmidos insertados, y la unidad de transcripción ensamblada que consta de un promotor, una región codificante (D1, D2 y D3), y se podría liberar una señal poliA del plásmido ensamblado para la siguiente ronda de ensamblaje de Metclo. Esto contrasta con el Metclo estándar que utiliza“elemento compuesto de mantenimiento”, mientras que la unidad de transcripción debe ensamblarse a partir de 5 plásmidos de inserción diferentes (Figura B). En las figuras XXXX y YYYY representan la secuencia adaptadora en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de ADN ensamblado (unidad de transcripción) que podría liberarse para la siguiente ronda de ensamblaje de ADN. Para el ensamblaje de ADN utilizando“vectores preincrustados” “, estas dos secuencias adaptadoras pueden ser las mismas que las secuencias adaptadoras internas porque no están involucradas en el ensamblaje de tres fragmentos de un recipiente. Sin embargo, para el ensamblaje de ADN utilizando el vector Metclo estándar, las secuencias adaptadoras XXXX y YYYY deben ser diferentes de las secuencias adaptadoras internas (AATG, ACTA, ATCT y GCTT). Además, el método que utiliza vectores preincrustados (Figura A) tiene la ventaja de que es necesario ensamblar una menor cantidad de partes de ADN en una sola reacción, lo que aumenta la tasa de éxito. La desventaja es que el vector especializado es más difícil de preparar.

Ejemplo 2 - Ensamblaje de ADN sin cicatrices (Scarless Metclo)

Una aplicación única de Metclo es un sistema para el ensamblaje jerárquico sin cicatrices de construcciones de ADN grandes utilizando un conjunto limitado de vectores de clonación universales. El ensamblaje de ADN basado en tipo IIS que utiliza vectores universales se basa en una disposición específica de sitios de restricción de tipo IIS cabeza a cabeza en el vector de ensamblaje que cambia el extremo adhesivo del fragmento clonado. El ensamblaje sin cicatrices se logra mediante el uso de estos vectores universales para generar fragmentos de ADN ensamblados con extremos adhesivos (cicatrices) definidos por el fragmento de ADN para la ronda posterior de ensamblaje, que enterró la cicatriz del ensamblaje en la secuencia ensamblada. El uso del sistema Metclo permite el mantenimiento de los mismos extremos adhesivos universales para los fragmentos exteriores durante las diferentes etapas del ensamblaje jerárquico. Una combinación de estas tres características da como resultado un sistema de ensamblaje universal y sin cicatrices.

Aquí describimos los principios del sistema de ensamblaje Metclo sin cicatrices utilizando la enzima de restricción Bsal. El sistema se basa en un conjunto de tres tipos de vectores de clonación universales que cambian los extremos adhesivos de los fragmentos clonados (Figura 4A). Los tres tipos de vectores se denominan VL, VM y VR. Los vectores están diseñados para clonar fragmentos de ADN con el extremo adhesivo CTCC en el extremo 5’ y CGAG en el extremo 3’ que podrían clonarse en los vectores anteriores. El fragmento clonado, una vez liberado por Bsal del vector, tendrá diferentes extremos adhesivos según el vector utilizado. Vector VL está diseñado para mantener el extremo adhesivo 5’ y cambiar el extremo adhesivo 3’ a las cuatro bases dentro de la secuencia CGAG 3’; Vector VR para mantener el extremo adhesivo 3’ y cambiar el extremo adhesivo 5’ a las cuatro bases dentro de la secuencia CTCC 5’; Vector VM para cambiar ambos extremos a las cuatro bases del interior. De esta manera se podría utilizar un conjunto de vectores universales para generar fragmentos de ADN con extremos adhesivos definidos por la secuencia del inserto.

El detalle del proceso de cambio del extremo adhesivo se describe en la Figura 4B utilizando el vector VL como ejemplo. Cuando el vector se prepara en células competentes que expresan metilasa, la metilación de adenina (en negrita) debido a la solapamiento de la secuencia de reconocimiento de metilasa da como resultado el bloqueo de los sitios Bsal externos (encuadrados en línea de puntos), cuando los sitios BsaI internos (encuadrados en línea continua) Están disponibles para retirar el inserto LacZ. Tenga en cuenta que el brazo izquierdo del vector VL es similar al Metclo estándar, y que tanto el sitio BsaI exterior como el interior dan lugar al mismo extremo adhesivo CTCC. Sin embargo, el brazo derecho de VL es diferente en que el extremo adhesivo CGAG generado por el sitio interior de BsaI se solapa con el sitio exterior de BsaI. El ADN del donante lleva un inserto que podría liberarse flanqueando sitios BsaI con extremos adhesivos universales compatibles CTCC y CGAG. El inserto de doble hebra lleva la secuencia XXXX de 4 pb en el extremo 5’ y YYYY en el extremo 3’ dentro del extremo adhesivo universal. Después del ensamblaje Metclo del ADN donante en el vector VL, el plásmido resultante lleva el inserto correspondiente que podría ser liberado por los sitios BsaI flanqueantes (encuadrados en línea continua) en el vector. El fragmento liberado llevaría un extremo adhesivo 5’ CTCC idéntico al usado para la clonación, pero el extremo adhesivo 3’ sería YYYY según lo definido por la secuencia de inserción, que puede ser diferente del extremo adhesivo 3’ universal CGAG. De esta manera, el vector VL cambia el extremo adhesivo derecho del fragmento clonado del extremo adhesivo universal CGAG al extremo adhesivo definido por secuencia YYYY.

El proceso de conversión utilizando los tres tipos de vectores de clonación universal podría describirse utilizando un sistema de representación simbólico simple (Figura 41C). Aquí usamos la letra u para representar el extremo adhesivo universal 5’ CTCC y la letra v para representar el extremo adhesivo universal 3’ CGAG. xey representan la secuencia de 4 pb en los extremos 5’ y 3’ del fragmento de inserción dentro del extremo adhesivo universal. El inserto (u,v) representa un plásmido que porta fragmentos de inserto flanqueados por sitios BsaI que generan extremos adhesivos u y v. La reacción de ensamblaje con diferentes vectores da como resultado la conversión de diferentes extremos adhesivos.

El mismo conjunto de vectores universales podría usarse para ensamblar múltiples fragmentos con extremos adhesivos compatibles, siempre que el extremo 5’ del primer fragmento y el extremo 3’ del último fragmento tengan extremos adhesivos universales u y v (Figura 4D). El fragmento ensamblado lleva diferentes extremos adhesivos según el tipo de vector de ensamblaje utilizado. El ensamblaje de fragmentos en el vector VL mantiene el extremo adhesivo universal 5’ y convierte el extremo 3’ en el 4 pb interno. El ensamblaje en vector VM convierte ambos extremos y el ensamblaje en vector VR convierte el extremo de 5’ y mantiene el extremo adhesivo universal de 3’. Tenga en cuenta que el fragmento ensamblado en el vector VL se parece al fragmento A en que sólo lleva el extremo adhesivo universal 5' u; el fragmento ensamblado en el vector VM se parece al fragmento B; y el fragmento ensamblado en el vector VR se parece al fragmento C. Por lo tanto, el proceso es autosimilar, de modo que los fragmentos ensamblados podrían usarse para la siguiente ronda de ensamblaje de ADN usando el mismo principio dependiendo de la posición del fragmento en el orden de ensamblaje. Esto permite el ensamblaje jerárquico sin cicatrices de grandes construcciones de ADN utilizando vectores de clonación universales.

Todo el proceso de ensamblaje jerárquico y sin cicatrices de ADN se describe en la Figura 2, utilizando como ejemplo el ensamblaje de ADN a partir de 9 fragmentos en 2 etapas. Comenzando con una secuencia de ADN libre de sitios BsaI internos, con los 4 pb en el extremo 5’ denominado x y en el extremo 3’ denominado y, el objetivo es ensamblar el ADN de 9 fragmentos en un único fragmento que, una vez liberado del plásmido ensamblado, porta extremos adhesivos x e y (Figura 5A). La secuencia de ADN se divide primero en 9 fragmentos denominados A-I con secuencias solapadas de 4 pb, y las secuencias solapadas se denominan a-h (Figura 5B). Las posiciones de los solapamientos de 4 pb podrían elegirse libremente, siempre que sean diferentes de los extremos adhesivos universales u y v, y entre sí dentro de cada reacción de subconjunto. Para la configuración actual, los siguientes pares de solapamientoss de 4 pb deben ser diferentes dentro de cada par: (a,b), (d,e), (g,h) y (c,f). Se agregaron secuencias adaptadoras apropiadas a los extremos de las secuencias de los fragmentos A-I, y se sintetizó ADN doble mediante síntesis génica o PCR, de modo que después de la digestión de restricción con BsaI, el ADN bicatenario pudiera recortarse en fragmentos A-I que portaban extremos adhesivos universales u y v (Figura 5C). Estos fragmentos de ADN sintético de doble hebra podrían luego clonarse en tipos apropiados de vectores de clonación universal para cambiar el extremo adhesivo del fragmento dependiendo de la posición del fragmento en el ensamblaje de la siguiente etapa (Figura 5D). Los fragmentos A, D y G, que se ubicarán en la posición final 5’ en la siguiente ronda de ensamblaje, se clonan en un vector de tipo VL; B, E, H en la posición media en la siguiente ronda se clonan en el tipo de vector VM; C, F, I en la posición final 3’ en el tipo vectorial VR. En esta etapa se podrían secuenciar fragmentos clonados para comprobar si hay errores en la síntesis de genes o en la PCR. Estos fragmentos podrían luego usarse para una nueva ronda de ensamblaje y, nuevamente, el tipo de vector de ensamblaje utilizado depende de la posición del fragmento ensamblado en la siguiente ronda de ensamblaje de ADN (Figura 5E). Los fragmentos A, B, C se ensamblaron en el vector VL, porque el fragmento ensamblado ABC se usará como fragmento 5’ en la siguiente ronda de ensamblaje; fragmenta D, E, F en el vector VM y fragmenta G, H, I en el vector VR. El paso final es similar de modo que los tres fragmentos ensamblados del paso 2 se ensamblan aún más en el vector VM, que genera el fragmento completamente ensamblado que lleva los extremos adhesivos x e y definidos por los extremos de la secuencia inicial (Figura 5F).

Se requiere un conjunto de al menos 6 vectores de clonación universales que representen 3 tipos (VL, VM, VR) y 2 marcadores de selección de antibióticos para el ensamblaje jerárquico. Idealmente, 12 vectores que representan 2 números de copias diferentes son óptimos para hacer frente a diferentes tamaños de fragmentos de ADN en diferentes etapas de ensamblaje. Se podría desarrollar un sistema similar para Metclo basado en LguI, pero no para BpiI, porque el sistema sin cicatrices requiere que los adaptadores universales u y v sean diferentes. Para BsaI y SapI, las bases entre la secuencia de reconocimiento de la enzima y el extremo adhesivo generado por la enzima son flexibles, por lo tanto, es posible diseñar diferentes adaptadores u y v. Sin embargo, para Bpil, estas bases son fijas porque ambas bases son necesarias para especifique la secuencia de reconocimiento de metilasa en Metclo basado en BpiI. Además, la base metilada de Metclo basado en BpiI se encuentra en la cadena superior del sitio de restricción. La disposición cabeza a cabeza de los sitios Bpil para el cambio del extremo adhesivo inevitablemente da como resultado que la base metilada sea transportada por el marcador de selección LacZ, no por la columna vertebral del vector de ensamblaje después de la digestión con BpiI, lo que hace imposible el ensamblaje de un recipiente Golden Gate.Las relaciones entre Metclo sin cicatrices y Metclo

Metclo se inventó para resolver el problema del uso de una única enzima de restricción para el ensamblaje jerárquico de construcciones de ADN grandes basadas en enzimas de restricción tipo IIS. Scarless Metclo es un desarrollo posterior de Metclo que utiliza componentes clave del sistema Metclo (cepas que expresan metilasa, sitio de metilación/restricción solapado) para lograr un ensamblaje jerárquico sin cicatrices de grandes construcciones de ADN utilizando un conjunto de vectores de ensamblaje universal.

Scarless Metclo se basa en una combinación de varios conceptos diferentes de sistema de ensamblaje basado en tipo IIS:

1. Un diseño especial de sitio de restricción IIS tipo cabeza a cabeza para cambio de extremo adhesivo, que se ha utilizado en el sistema Moclo para el diseño de vectores de clonación universal“nivel -1”. El diseño vectorial“nivel -1”de Moclo utiliza un sitio de restricción de cabeza a cabeza BpiI-BsaI, que es diferente del diseño de cabeza a cabeza solo BsaI en Metclo, pero el concepto de cambio de extremo adhesivo se basa en el diseño vectorial Moclo“nivel -1”.

2. La eliminación de la cicatriz de ensamblaje mediante el diseño de la secuencia de la cicatriz alrededor de la secuencia de ADN ensamblada. Esto no se ha demostrado antes en un ensamblaje jerárquico basado en IIS. 3. El uso del sistema Metclo para mantener las mismas secuencias de extremos adhesivos para los bloques externos de fragmentos de ADN para cada etapa de ensamblaje.

El uso del sistema Metclo es clave para conseguir un ensamblaje jerárquico multietapa utilizando la misma secuencia de extremo adhesivo universal. Los dos primeros conceptos por sí solos son suficientes para el ensamblaje sin cicatrices de una sola etapa de ADN utilizando un vector de ensamblaje universal. Sin embargo, el sistema de ensamblaje sin cicatrices de una sola etapa no podría adaptarse fácilmente para el ensamblaje jerárquico multietapa utilizando el sistema Moclo tradicional, porque la secuencia adaptadora universal del diseño del vector de cambio del extremo adhesivo para diferentes enzimas son diferentes (BsaI sería CTCN y NGAG, y Bpil ACNN y NNGT). Esto significa que para conseguir un ensamblaje jerárquico sin cicatrices utilizando el Moclo basado en dos enzimas, es necesario añadir secuencias adaptadoras repetitivas muy largas a los extremos de los bloques exteriores en función del número de etapas de ensamblaje, que serán "masticadas" después de cada etapa de ensamblaje (Figura 6). Dado que el sistema Metclo utiliza una única enzima para diferentes etapas de ensamblaje, se podría utilizar la misma secuencia adaptadora universal para los bloques exteriores durante diferentes etapas de ensamblaje, lo que simplifica enormemente el diseño del proceso de ensamblaje.

Ejemplo 3 - Combinaciones identificadas de metilasa y enzima de restricción de tipo IIS

La Tabla 3 contiene una lista de combinaciones de metilasa/enzimas de restricción que pueden dar como resultado el bloqueo del sitio de metilación/restricción solapado para todas las enzimas de restricción de tipo IIS conocidas (78 enzimas que representan 19 especificidades diferentes).

La lista se generó utilizando un script Perl personalizado basado en una lista de enzimas de restricción de tipo IIS conocidas y una lista de metilasa del ADN de tipo II conocidas, ambas de Rebase (PMID 25378308). Ácidos nucleicos res.201543: D298-9).

Las metilasas enumeradas se limitan a metilasas de sistemas de restricción/modificación de tipo II con secuencias de reconocimiento de al menos 4 pb y para las cuales se conoce la posición de la base metilada. Se excluyen las metilasas del sistema de restricción/modificación tipo IIG que contienen actividad tanto de metilasa como de enzima de restricción en la misma proteína. Además de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, se deben requerir bases adicionales para especificar la actividad metilasa hacia el sitio de metilación/restricción solapado. Se elimina cualquier metilasa cuya secuencia de reconocimiento sea idéntica o esté incluida en el sitio de restricción. Además, la secuencia de metilación no debe invadir la secuencia del extremo adhesivo generada por la enzima de restricción de tipo IIS.

Las secuencias de ADN se enumeran utilizando los códigos de ambigüedad de la IUPAC. M representa A o C; R representa A o G; W representa A o T; S representa C o G; Y representa C o T; K representa G o T; V representa A o C o G; H representa A o C o T; D representa A o G o T; B representa C o G o T; N representa A o T o C o G.

La“enzima de restricción”enumera el nombre de la enzima de restricción tipo IIS. Las enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia se agrupan.

El“sitio de restricción”enumera la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción.

La“metilasa”enumeró el nombre de la metilasa que podría bloquear el sitio de metilación/restricción solapado. Se agrupan las metilasas que reconocen la misma secuencia y generan el mismo patrón de metilación.

La“secuencia de metilación”enumera la secuencia de reconocimiento de la metilasa.

La“posición de la base metilada”enumeraba la posición de la base metilada o de la base opuesta en la secuencia de reconocimiento de la metilasa.

El“tipo de metilación”enumera los tipos de metilación de las bases metiladas en el orden de las posiciones de las bases metiladas enumeradas en la columna anterior. m6A representa N6-metiladenina; m5C representa metilcitosina C5; m4C representa N4-metilcitosina;“Desconocido”representa un tipo desconocido de metilación.

El“sitio de metilación/restricción solapado”enumera la secuencia del sitio de metilación/restricción solapado que puede resultar en el bloqueo de la acción de la enzima de restricción enumerada a través de la metilación por la metilasa enumerada. Para algunos pares de combinaciones de enzima de restricción/metilasa, hay varios sitios de metilación/restricción solapados diferentes para elegir. Las bases entre corchetes en“[]”representan los extremos adhesivos generados por la enzima de restricción.

Uso de otros tipos de metiltransferasas.

A pesar de utilizar enzimas metilasa del ADN de tipo II en los ejemplos, también se pueden considerar enzimas de modificación de restricción de tipo I. Las enzimas de modificación de restricción de tipo I son enzimas de subunidades múltiples que tienen actividad tanto de metiltransferasa como de endonucleasa de restricción. Por lo general, constan de tres tipos de subunidades codificadas por tres genes diferentes: subunidad de metilación, subunidad de restricción y subunidad de reconocimiento de secuencia de ADN (subunidad de especificidad). Tanto la subunidad de metilación como la subunidad de especificidad son necesarias para la actividad de la metiltransferasa.

Por ejemplo, se sabe que M.EcoCI5I reconoce GACNNNNNNRtAAY (base metilada/base opuesta en negrita, RTT complementario inversoAYNNNNNNNGtC). Se podría proporcionar un sitio de restricción protegible por metilación según la descripción en el presente documento usando esta secuencia para proteger un sitio BsaI solapado:RTTATNNNNNGGTCTC (base metilada/base opuesta en negrita, secuencia de reconocimiento de BsaI subrayada, secuencia de reconocimiento de M.EcoCI5I en cursiva). UnE. coliLa cepa que expresa tanto la subunidad de metilación M.EcoCI5I como la subunidad de especificidad S.EcoCI5I puede ser capaz de metilar las bases correspondientes en el elemento de control de corte, lo que bloquearía el sitio BsaI protegido por metilación.

La Tabla 4 proporciona algunos ejemplos adicionales de combinaciones de enzimas de restricción y enzimas de restricción-modificación de tipo I, o secuencias de reconocimiento de las mismas, que pueden proporcionarse según la descripción en el presente documento. El experto entenderá que estos son ejemplos y no una lista exhaustiva de combinaciones potenciales que estarían abarcadas por las reivindicaciones.

Ejemplo de secuencias vectoriales

Las secuencias de plásmidos para Metclo sin cicatrices se enumeran a continuación en formato fasta. El secuencia subrayada es la“secuencia de descarte”que contiene el fragmento de selección LacZ y un origen de replicación para la preparación de ADN del vector con alto número de copias. La secuencia encuadrada es el“elemento compuesto recesivo/truncante”que contiene un“elemento protegible contra la metilación”y un“elemento no protegible”dispuestos cabeza con cabeza a una distancia adecuada para la conmutación del adaptador. El resto de la secuencia es la columna vertebral del vector que contiene un origen de replicación de pocas copias (basado en pl5A) y un marcador de selección (ya sea kanamicina o espectinomicina).

Para Metclo sin cicatrices basado en BsaI/M.Osp807II, los plásmidos son:

pMXLK_VL, pMXLK_VM, pMXLK_VR (kanamicina)

pMXLS_VL, pMXLS_VM, pMXLS_VR (espectinomicina)

Para Metclo sin cicatrices basado en LguI/M.XmnI, los plásmidos son:

pMZLK_VL, pMZLK_VM, pMZLK_VR (kanamicina)

pMZLS_VL, pMZLS_VM, pMZLS_VR (espectinomicina)

Las secuencias de plásmidos para el ensamblaje estándar de 4 fragmentos de ADN de 1 kb y el ensamblaje de 2 etapas de aproximadamente 200 kb de ADN a partir de 28 fragmentos también se enumeran en formato fasta. La secuencia subrayada para vectores de ensamblaje de 1 kb contiene el marcador de selección LacZ. La secuencia subrayada para vectores de ensamblaje de 200 kb contiene el marcador de selección LacZ y un origen de replicación para la preparación de ADN del vector con alto número de copias. El resto de las secuencias son cadenas principales de vectores.

Para un ensamblaje de 1 kb, los plásmidos son:

pMXP_A4E, pMYP_A5E, pMZP_P6T

Para un ensamblaje de 200 kb, los plásmidos son:

pMXBG_A7I, pMXBG_I7G, pMXBG_G7F, pMXBG_F7E, pMXBK_A7E

Dichas secuencias de vectores son aplicables para los vectores de los ejemplos en el presente documento, intercambiándose los elementos compuestos de truncamiento, mantenimiento o inserción específicos según corresponda. Un experto familiarizado con la clonación molecular puede reconstruir los vectores aquí mediante PCR a partir del kit Moclo disponible comercialmente.

>pMXLK_VM (SEQ ID NO: 29)

>pMZLK_VL (SEQ ID NO: 31)

>pMZLK_VR (SEQ ID NO: 33)

>pMXLS_VL (SEQ ID NO: 34)

>pMXLS VM (SEQ ID NO: 35)

>pMXLS VR (SEQ ID NO: 36)

>pMZLS_VL (SEQ ID NO: 37)

>pMZLS_VM (SEQ ID NO: 38)

>pMZLS_VR (SEQ ID NO: 39)

>pMXP A4E (SEQ ID NO: 40)

>pMYP_A5E (SEQ ID NO: 41)

>pMZP_P6T (SEQ ID NO: 42)

>pMXBG_A7I (SEQ ID NO: 43)

>pMXBG_I7G (SEQ ID NO: 44)

>pMXBG_G7F (SEQ ID NO: 45)

>pMXBG_F7E (SEQ ID NO: 46)

>pMXBK A7E (SEQ ID NO: 47)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico para su uso en el ensamblaje de ADN, en donde el ácido nucleico comprende al menos un elemento de restricción metilable, el elemento de restricción metilable comprende:

- una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS; y

- una secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN,

en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS y la secuencia de reconocimiento de la ADN metilasa se solapan de tal forma que la base metilable por la ADN metilasa se encuentra dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS,

en donde la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN no es idéntica ni está rodeada por la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS, y

en donde la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN no se solapa con la secuencia que formaría la secuencia del extremo sobresaliente generada por la enzima de restricción de tipo IIS,

en donde el ácido nucleico comprende además una secuencia opuesta no protegible de reconocimiento de enzima de restricción de tipo IIS proporcionada en el lado opuesto del sitio de corte del elemento de restricción protegible por metilación, formando así un elemento compuesto truncado,

en donde la secuencia opuesta de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS del elemento compuesto truncador está dispuesta para dirigir a la enzima de restricción tipo IIS a cortar el ácido nucleico en un sitio que está dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS del elemento de restricción metilable-protegible, y/o dentro de los nucleótidos entre el sitio de corte y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS del elemento de restricción metilable-protegible.

2. El ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende un primer y un segundo elemento de restricción protegibles por metilación,

y en donde el ácido nucleico comprende además secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS opuestas proporcionadas en el lado opuesto del sitio de corte de cada uno de los elementos de restricción protegibles contra metilación primero y segundo para formar:

A i) un elemento compuesto de mantenimiento o un elemento compuesto de inserción, y ii) un elemento compuesto truncado; o

B) dos elementos compuestos truncados,

en donde el elemento compuesto de mantenimiento es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en el mismo sitio que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento de restricción metilación-protegible opuesto, de tal manera que se produce el mismo voladizo,

en donde el elemento compuesto insercional es un arreglo que comprende un inserto de secuencia funcional provisto entre el elemento de restricción protegible contra metilación y la secuencia opuesta de reconocimiento de enzima de restricción tipo IIS, y

en donde el elemento compuesto truncador es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta del elemento compuesto truncador está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en un sitio que está dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento de restricción metilable-protegible, y/o dentro de los nucleótidos entre el sitio de corte y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento de restricción metilable-protegible.

3. El ácido nucleico según la reivindicación 2, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico entre los sitios de corte de los dos elementos de restricción protegibles por metilación, que es una secuencia de descarte; o

en donde el ácido nucleico es un vector linealizado que tiene un elemento de restricción protegible contra la metilación en cada extremo.

4. El ácido nucleico según la reivindicación 3, en donde la secuencia de descarte comprende un marcador seleccionable, un gen informador o una etiqueta.

5. El ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción del elemento de restricción protegible contra la metilación es reconocida por la misma especie de enzima de restricción que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción opuesta no protegible; y/o

en donde las secuencias de reconocimiento de metilasas de ADN de cada elemento de restricción protegible contra la metilación son reconocidas por la misma metilasa.

6. El ácido nucleico según cualquier reivindicación 1 anterior, en donde el elemento de restricción protegible contra la metilación comprende o consiste en la secuencia GACNNGGTCTCNNNNN (BsaI/M.Osp807II - SEQ ID NO: 1) o GAAGACGCNNNNN (BpiI/M2.NmeMC58II - SEQ ID NO: 2) o GAAGCTTCNNNN (LguI/M.XmnI - SEQ ID NO: 3).

7. Un método de ensamblaje de fragmentos de ADN sin cicatriz que comprende los pasos de:

(A) proporcionar un primer ácido nucleico metilado linealizado mediante corte con enzima de restricción de un primer ácido nucleico, en donde el primer ácido nucleico comprende primero y segundo elementos de restricción protegibles contra metilación con una secuencia de descarte entre ellos, o proporcionar una versión previamente cortada con enzima de restricción del mismo que tiene la secuencia de descarte extirpada,

en donde el primer y segundo elementos de restricción protegibles por metilación del primer ácido nucleico comprenden cada uno:

- una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción de tipo IIS; y

- una secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN,

en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS y la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN se solapan de manera que la base metilable por la metilasa del ADN se encuentra dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS, en donde la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN no es idéntica ni está rodeada por la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS, y

en donde la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN no se solapa con la secuencia que formaría la secuencia del extremo sobresaliente generada por la enzima de restricción de tipo IIS, y en donde el primer y segundo elementos de restricción protegibles por metilación están metilados con la metilasa del ADN que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN; y en donde el primer ácido nucleico comprende además secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS no protegibles opuestas proporcionadas en el lado opuesto del sitio de corte de cada uno de los elementos de restricción protegibles por metilación primero y segundo para proporcionar i) un elemento compuesto de mantenimiento y ii) un elemento compuesto truncado,

en donde el elemento compuesto de mantenimiento es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en el mismo sitio que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento de restricción opuesto protegible por metilación, de modo que se produzca el mismo saliente, y

en donde el elemento compuesto de truncamiento es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta del elemento compuesto de truncamiento está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en un sitio que está dentro de la secuencia de reconocimiento de la restricción de tipo IIS secuencia de reconocimiento enzimático del elemento de restricción protegible por metilación, o dentro de los nucleótidos entre el sitio de corte y la secuencia de reconocimiento del elemento de restricción protegible por metilación secuencia de reconocimiento de enzima del elemento de restricción protegible por metilación;

en donde el primer ácido nucleico es una enzima de restricción cortada por una enzima de restricción de tipo IIS que reconoce las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuestas, formando así el primer ácido nucleico metilado linealizado, y

en donde los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento están metilados con la metilasa del ADN; proporcionar un primer fragmento de ADN para ensamblaje que tiene extremos salientes que están adaptados para ligarse a los extremos salientes del primer ácido nucleico metilado linealizado;

aislar el primer vector intermedio;

(B) proporcionar un segundo ácido nucleico metilado linealizado mediante corte con enzimas de restricción de un segundo ácido nucleico,

en donde el segundo ácido nucleico comprende un primer y un segundo elementos de restricción protegibles por metilación con una secuencia de descarte entre ellos, o proporcionando una versión previamente cortada con enzima de restricción del mismo que tiene la secuencia de descarte escindida,

en donde el primer y segundo elementos de restricción protegibles por metilación del segundo ácido nucleico comprenden cada uno:

- una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción de tipo IIS; y

- una secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN,

en donde la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN no se solapa con la secuencia que formaría la secuencia del extremo sobresaliente generada por la enzima de restricción de tipo IIS, y en donde el primer y segundo elementos de restricción protegibles por metilación están metilados con la metilasa del ADN que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN; y en donde el segundo ácido nucleico comprende además secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS no protegibles opuestas proporcionadas en el lado opuesto del sitio de corte de cada uno de los elementos de restricción protegibles por metilación primero y segundo para proporcionar i) un elemento compuesto de mantenimiento y ii) un elemento compuesto truncado, en donde el elemento compuesto de mantenimiento es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en el mismo sitio que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS de la restricción opuesta protegible por metilación, de manera que se produzca el mismo saliente, y

en donde el elemento compuesto de truncamiento es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta del elemento compuesto de truncamiento está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en un sitio que está dentro de la secuencia de reconocimiento de la restricción de tipo IIS secuencia de reconocimiento enzimático del elemento de restricción protegible por metilación, y/o dentro de los nucleótidos entre el sitio de corte y la secuencia de reconocimiento de la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción tipo IIS del elemento de restricción protegible por metilación; en donde el segundo ácido nucleico es una enzima de restricción cortada por una enzima de restricción de tipo IIS que reconoce las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuestas, formando así el segundo ácido nucleico metilado linealizado; y en donde los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento están metilados con la metilasa del ADN, y en donde el saliente proporcionado por el elemento compuesto de mantenimiento del primer ácido nucleico metilado linealizado es diferente en secuencia al saliente proporcionado por el elemento de restricción protegible por metilación del segundo ácido nucleico metilado linealizado; proporcionar un segundo fragmento de ADN para ensamblaje que tiene extremos salientes que están adaptados para ligarse a los extremos salientes del segundo ácido nucleico metilado linealizado;

transformar el segundo vector intermedio metilado en una cepa bacteriana que no expresa la(s) metilasa del ADN(s) que reconoce(n) cualquiera de las secuencia(s) de reconocimiento de metilasa del ADN de los elementos compuestos de mantenimiento y truncamiento, formando de este modo un segundo vector intermedio que no está metilado;

aislar el segundo vector intermedio;

(C) cortar el primer vector intermedio con una enzima de restricción de tipo IIS que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento compuesto de mantenimiento y una enzima de restricción de tipo IIS que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento compuesto truncado, formando de este modo un primer inserto de fragmento de ADN adaptado que comprende una secuencia saliente mantenida que está determinada por el elemento compuesto de mantenimiento y una secuencia saliente nativa opuesta que está determinada por la secuencia nativa del primer fragmento de ADN para el ensamblaje;

(D) cortar el segundo vector intermedio con una enzima de restricción de tipo IIS que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento compuesto de mantenimiento y una enzima de restricción de tipo IIS que reconoce la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento compuesto truncado, formando así un segundo inserto de fragmento de ADN adaptado que comprende una secuencia saliente mantenida que está determinada por el elemento compuesto de mantenimiento y una secuencia saliente nativa opuesta que está determinada por la secuencia nativa del segundo fragmento de ADN para el ensamblaje;

en donde

8. El método según la reivindicación 7, en donde el fragmento de ADN medio comprende una primera secuencia saliente nativa que es complementaria a la saliente nativa del primer fragmento de ADN adaptado y una segunda secuencia saliente nativa que es complementaria a la saliente nativa del segundo fragmento de ADN adaptado.

9. El método según la reivindicación 7, en donde el método comprende dos o más fragmentos de ADN medios para el ensamblaje, los fragmentos de ADN medios comprenden secuencias salientes nativas que son complementarias al saliente nativo de un fragmento de ADN medio vecino, de modo que puedan ligarse entre sí en un orden predeterminado; y en donde el primer y el último fragmento de ADN intermedio de la secuencia están dispuestos para ligarse al primer fragmento de ADN adaptado y al segundo fragmento de ADN adaptado respectivos mediante secuencias sobresalientes nativas complementarias.

10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde un fragmento de ADN medio para el ensamblaje es proporcionado por

proporcionar otro ácido nucleico metilado linealizado mediante corte con enzima de restricción de un ácido nucleico, en donde el ácido nucleico comprende un primer y un segundo elementos de restricción protegibles contra la metilación con una secuencia de descarte entre ellos, o proporcionar una versión del mismo previamente cortada con enzima de restricción a la que se le ha eliminado la secuencia de descarte,

en donde el primer y segundo elementos de restricción protegibles por metilación del ácido nucleico comprenden cada uno:

- una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción de tipo IIS; y

- una secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN,

en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS y la secuencia de reconocimiento de la metilasa de ADN se solapan de tal manera que la base metilable por la metilasa de ADN se encuentra dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS, en donde la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN no es idéntica ni está rodeada por la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS, y

en donde la secuencia de reconocimiento de metilasa del ADN no se solapa con la secuencia que formaría la secuencia del extremo sobresaliente generada por la enzima de restricción de tipo IIS, y en donde el primer y segundo elementos de restricción protegibles por metilación están metilados con la metilasa del ADN que reconoce la secuencia de reconocimiento de la metilasa del ADN; y en donde el ácido nucleico comprende además secuencias opuestas no protegibles de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS proporcionadas en el lado opuesto del sitio de corte de cada uno de los elementos de restricción protegibles contra metilación primero y segundo para proporcionar dos elementos compuestos truncadores,

en donde el elemento compuesto truncador es una disposición en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS opuesta del elemento compuesto truncador está dispuesta para dirigir la enzima de restricción de tipo IIS para cortar el ácido nucleico en un sitio que está dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento de restricción metilable-protegible, y/o dentro de los nucleótidos entre el sitio de corte y la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento de restricción metilable-protegible; en donde el ácido nucleico es cortado con enzima de restricción por una enzima de restricción tipo IIS que reconoce las secuencias opuestas de reconocimiento de enzimas de restricción tipo IIS, formando así el ácido nucleico metilado linealizado adicional;

proporcionar un fragmento de ADN medio adaptado para ensamblaje que tiene extremos salientes que están adaptados para ligarse a los extremos salientes del ácido nucleico metilado linealizado adicional; ligar el fragmento de ADN medio adaptado para su ensamblaje y ácido nucleico metilado linealizado adicionalmente con una ligasa para formar un vector intermedio metilado;

transformar el vector intermedio metilado en una cepa bacteriana que no expresa la metilasa del ADN que reconoce cualquiera de las secuencias de reconocimiento de la metilasa del ADN de los elementos de restricción protegibles por metilación, formando de ese modo un vector intermedio que no está metilado;

aislar el vector intermedio;

cortar el vector intermedio con enzimas de restricción que reconocen la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción tipo IIS de los elementos de restricción protegibles por metilación, formando así un inserto de fragmento de ADN medio que comprende secuencias salientes nativas en cada extremo que están determinadas por la secuencia nativa del fragmento de ADN medio para el ensamblaje.

11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende además el paso de proporcionar un vector de destino linealizado para la inserción de los fragmentos de ADN ensamblados, opcionalmente en donde el vector de destino linealizado se proporciona cortando un vector de destino circular con la misma(s) enzima(s) de restricción de tipo IIS que reconocen las secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción de tipo IIS del elemento compuesto de mantenimiento y/o truncamiento.

12. Una composición que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

13. Un kit que comprende uno o más ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y una enzima de restricción y/o una ligasa.

14. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

15. Uso del ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para ensamblar fragmentos de ADN de interés, opcionalmente en donde el uso esin vitro.