ES2980444T3 - Inhibidores de ADN-PK - Google Patents

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ES2980444T3
ES2980444T3 ES19703858T ES19703858T ES2980444T3 ES 2980444 T3 ES2980444 T3 ES 2980444T3 ES 19703858 T ES19703858 T ES 19703858T ES 19703858 T ES19703858 T ES 19703858T ES 2980444 T3 ES2980444 T3 ES 2980444T3
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John Maxwell
Katrina Jackson
Qing Tang
Mark Morris
Steven Ronkin
Jinwang Xu
Kevin Cottrell
Paul Charifson
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Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos útiles como inhibidores de la DNA-PK. La invención también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden dichos compuestos y métodos de uso de las composiciones en el tratamiento de diversas enfermedades, afecciones o trastornos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de ADN-PK
APLICACIONES RELACIONADAS
[0001]Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N.° 62/618,339, presentada el 17 de enero de 2018.
LISTADO DE SECUENCIA
[0002]La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. La copia ASCII, creada el 16 de enero de 2019, se denomina 14390-688 Listado de secuencias_ST25.txt y tiene un tamaño de 5 KB.
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
[0003]La presente invención se refiere a compuestos útiles como inhibidores de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-Pk ). La invención también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden los compuestos de la invención y compuestos y composiciones farmacéuticas para usar en métodos de tratamiento del cáncer, y métodos para aumentar la eficiencia de la edición del genoma mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una(s) célula(s).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0004]La radiación ionizante (RI) induce una variedad de daños en el ADN, de los cuales las roturas de doble cadena (DSB) son las más citotóxicas. Estos DSB pueden provocar la muerte celular por apoptosis y/o catástrofe mitótica si no se reparan rápida y completamente. Además de la RI, ciertos agentes quimioterapéuticos, incluidos los inhibidores de la topoisomerasa II, la bleomicina y la doxorrubicina, también causan DSB. Estas lesiones del ADN desencadenan un conjunto complejo de señales a través de la red de respuesta al daño del ADN que funcionan para reparar el ADN dañado y mantener la viabilidad celular y la estabilidad genómica. En las células de mamíferos, la vía de reparación predominante de las DSB es la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Esta vía funciona independientemente de la fase del ciclo celular y no requiere una plantilla para volver a ligar los extremos rotos del ADN. NHEJ requiere la coordinación de muchas proteínas y vías de señalización. La maquinaria central de NHEJ consta del heterodímero Ku70/80 y la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs o ADN-PK), que juntos comprenden el complejo enzimático activo ADN-PK. ADN-PKcs es miembro de la familia de serina/treonina proteínas quinasas relacionadas con fosfatidilinositol 3-quinasa (PIKK) que también incluye ataxia telangiectasia mutada (ATM), ataxia telangiectasia relacionada con Rad3 (ATR), mTOR y cuatro PI3K. isoformas. Sin embargo, si bien ADN-PKcs pertenece a la misma familia de proteínas quinasas que ATM y ATR, estas últimas quinasas funcionan para reparar el daño del ADN a través de la vía de recombinación homóloga (Rh ) y están restringidas a las fases S y G<2>del ciclo celular. Mientras que ATM también se recluta en sitios de DSB, ATR se recluta en sitios de roturas de ADN monocatenario.
[0005]Se cree que NHEJ procede a través de tres pasos clave: reconocimiento de los DSB, procesamiento del ADN para eliminar extremos no ligables u otras formas de daño en los extremos y, finalmente, ligadura de los extremos del ADN. El reconocimiento del DSB se lleva a cabo mediante la unión del heterodímero Ku a los extremos irregulares del ADN seguido del reclutamiento de dos moléculas de ADN-PK cs en los lados adyacentes del DSB; esto sirve para proteger los extremos rotos hasta que se recluten enzimas de procesamiento adicionales. Datos recientes respaldan la hipótesis de que ADN-PKcs fosforila la enzima procesadora Artemisa, así como a sí mismo, para preparar los extremos del ADN para un procesamiento adicional. En algunos casos, es posible que se requiera ADN polimerasa para sintetizar nuevos extremos antes del paso de ligación. Se cree que la autofosforilación de ADN-PKcs induce un cambio conformacional que abre la cavidad central de unión del ADN, libera ADN-PKcs del ADN y facilita la religación final de los extremos del ADN.
[0006]Se sabe desde hace algún tiempo que los ratones ADN-PK-/- son hipersensibles a los efectos de la RI y que algunos inhibidores no selectivos de moléculas pequeñas de ADN-PKcs pueden radiosensibilizar una variedad de tipos de células tumorales en un amplio conjunto de orígenes genéticos. Si bien se espera que la inhibición de ADN-PK radiosensibilice las células normales hasta cierto punto, esto se ha observado en menor grado que con las células tumorales, probablemente debido al hecho de que las células tumorales poseen niveles basales más altos de estrés de replicación endógeno y daño al ADN. estrés de replicación inducido por oncogenes) y los mecanismos de reparación del ADN son menos eficientes en las células tumorales. Lo más importante es que la combinación de un inhibidor de ADN-PK con avances recientes en la administración precisa de RI enfocada, incluida la RT con guía de imágenes (IGRT) y la RT de intensidad modulada (IMRT), brindará una ventana terapéutica mejorada con mayor preservación del tejido normal).
[0007]La inhibición de la actividad ADN-PK induce efectos tanto en células cíclicas como en células no cíclicas. Esto es muy significativo ya que la mayoría de las células de un tumor sólido no se replican activamente en un momento dado, lo que limita la eficacia de muchos agentes que se dirigen al ciclo celular. Igualmente, intrigantes son informes recientes que sugieren una fuerte conexión entre la inhibición de la vía NHEJ y la capacidad de matar células madre cancerosas (CSC) tradicionalmente radiorresistentes. Se ha demostrado en algunas células tumorales que los DSB en las CSC latentes activan predominantemente la reparación del ADN a través de la vía NHEJ; Se cree que las CSC suelen estar en la fase de reposo del ciclo celular. Esto puede explicar por qué la mitad de los pacientes con cáncer pueden experimentar recaída tumoral local o distante a pesar del tratamiento, ya que las estrategias actuales no pueden atacar eficazmente las CSC. Un inhibidor de ADN-PK puede tener la capacidad de sensibilizar estas posibles células progenitoras metastásicas a los efectos de la RI y seleccionar agentes quimioterapéuticos inductores de DSB.
[0008]Dada la participación de ADN-PK en los procesos de reparación del ADN, una aplicación de fármacos inhibidores de ADN-PK específicos sería actuar como agentes que mejorarán la eficacia tanto de la quimioterapia como de la radioterapia contra el cáncer. Por consiguiente, sería deseable desarrollar compuestos útiles como inhibidores de ADN-PK.
[0009]Además, se necesitan tecnologías precisas de localización del genoma para permitir la ingeniería sistemática de variaciones genéticas. El uso de sistemas de edición del genoma, específicamente la tecnología de edición del genoma basada en endonucleasas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), ha crecido exponencialmente en los últimos años. El sistema inmunológico innato bacteriano CRISPR-Cas9 tipo II se ha convertido en una herramienta eficaz de edición del genoma para la modificación dirigida del genoma humano (Wiedenheft, B. 2012; Hsu, PD et. 2014). Recientemente se han descrito sistemas de edición del genoma CRISPR-Cpf. La edición del genoma basada en CRISPR-endonucleasa depende, en parte, de las vías de unión de extremos no homólogos (NHEJ) y de reparación dirigida por homología (HDR) para reparar las roturas de la doble cadena del ADN. El mecanismo de reparación celular favorece a NHEJ sobre HDR.
[0010]Si bien el logro de inserciones o eliminaciones (indeles) de NHEJ tiene una efectividad de hasta el 70 % en algunos informes, la eficiencia del HDR sigue siendo un desafío, con tasas inferiores al 1 %.
[0011]En consecuencia, existe la necesidad de aumentar la eficiencia de la edición del genoma, en particular, la eficiencia de HDR. Otra aplicación de fármacos inhibidores de ADN-PK específicos sería actuar como agentes que mejorarán la eficacia de los sistemas de edición del genoma. El documento W o 2014/159690 A1 describe compuestos útiles como inhibidores de ADN-PK. La invención también proporciona composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden dichos compuestos y métodos para usar las composiciones en el tratamiento de diversas enfermedades, afecciones o trastornos. El documento WO 2013/072015 A1 describe compuestos para inhibir serina/treonina proteína quinasas y para sensibilizar células cancerosas a fármacos anticancerígenos y/o radiación ionizante y el uso de los compuestos en la profilaxis, terapia o seguimiento del progreso de cánceres, tumores, metástasis o angiogénicos. trastornos, en combinación con radioterapia y/o un fármaco anticancerígeno. El documento WO 2014/183850 describe compuestos que se pueden usar para inhibir las serina/treonina proteínas quinasas y para sensibilizar las células cancerosas con respecto a agentes anticancerígenos y/o radiación ionizante. El documento US 8404 681 B2 describe compuestos que inhiben la proteína quinasa dependiente de ADN, composiciones que comprenden los compuestos, métodos para inhibir la actividad biológica de ADN-PK, métodos para sensibilizar células, agentes que causan lesiones en el ADN y métodos para potenciar el tratamiento del cáncer.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0012]La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Se ha descubierto que los compuestos de esta invención, y sus composiciones farmacéuticamente aceptables, son eficaces como inhibidores de<a>DN-PK. Referencias en el presente documento a métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo, métodos para reparar una rotura del ADN en una o más regiones genómicas objetivo, métodos para inhibir o suprimir una rotura del ADN en una o más regiones genómicas objetivo o métodos para modificar la expresión de una o más genes o proteínas se refieren a métodos que utilizan una o más células cultivadas o célulasex vivode un organismo. La invención también se refiere a compuestos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y composiciones farmacéuticas para usar en métodos para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección que necesita editar una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) del sujeto, comprendiendo los métodos editar una o más regiones genómicas objetivo, métodos para reparar una rotura del ADN en una o más regiones genómicas objetivo, métodos para inhibir o suprimir una rotura del ADN en una o más regiones genómicas objetivo o métodos para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, en el que las células utilizadas en los métodos son célulasin vivodentro de un organismo. Por consiguiente, en un aspecto, la invención presenta compuestos representados por la Fórmula(I):
o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde cada uno de R1, R2, X, Anillo A, Anillo B y Anillo C independientemente es como se define en otra parte del presente documento.
[0013]En una forma de realización, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que:
El Anillo A es un sistema de anillos aromático seleccionado de
El Anillo B es un sistema de anillos seleccionado de
donde el Anillo B está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>; el Anillo C es un grupo cicloalquilo C<4-6>, heteroarilo de 5-6 miembros o fenilo, en el que el Anillo C está opcionalmente además sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, alquilo C<1-2>, -OH y -Oalquilo C<1-2>; X es -NH-, -O-, -Oalquilo C<1-4>-, -S- o -CH<2>-; cada uno de R1 y R2 es, independientemente, hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7 en los que R1 y R2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno; cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -C(O)OH, -C(O)Oalquilo C<1-2>, -CN, -C(O)NHalquilo C<1-2>, -C(O)NH<2>, cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>; cada R4 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-10>, arilo de 6-10 miembros, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 4-10 miembros, en donde cada uno de dichos grupos R4 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<1-4>, CN, NO<2>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-6>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C<0>-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-C(O)NH2, C(O)NHalquilo C1-4, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C3-5), CH<2>OR5, alquilo C0-4-C(O)R5, alquilo C0-4-C(O)N(R5)<2>, alquilo C0-4-C(O)OR5, alquilo C0-4-NHC(O)R5, alquilo C0-4-N(R5)2, heterociclilo de 5-6 miembros, -O(alquilo C<1>-4)OR5, -OR5 y oxo, y en el que cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales es opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C1-4, -OH, -Oalquilo C1-4, -Salquilo C<1-4>, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>y -C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>; y cada R5 independientemente es hidrógeno, alquilo C<1-4>, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde cada R5 independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN, -OH, -Oalquilo C<1-2>, heteroarilo de 5-6 miembros y heterociclilo de 4-7 miembros, o dos grupos R5 junto con el átomo de nitrógeno intermedio opcionalmente forman un anillo de morfolina. anillo de azetidina, anillo de pirrolidina, anillo de piperidina o anillo de piperazina; y R6 es hidrógeno o alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -CH<2>OH, -CN, -OH y -Oalquilo C<1-2>; R7 es arilo de 6 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN y -OR; y cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<1-4>, o R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman opcionalmente un anillo de morfolina, un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de piperazina.
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada uno de R1, R2, X, Anillo A, Anillo B y Anillo C es como se define en otra parte del presente documento.
[0014]La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen un compuesto de Fórmula(I)y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Estos compuestos y composiciones farmacéuticas son útiles para tratar o disminuir la gravedad del cáncer.
[0015]Los compuestos y composiciones proporcionados por esta invención también son útiles para el estudio de ADN-PK en fenómenos biológicos y patológicos; el estudio de vías de transducción de señales intracelulares mediadas por dichas quinasas; y la evaluación comparativa de nuevos inhibidores de quinasas.
[0016]La presente invención también puede mejorar la eficiencia de HDR suprimiendo enzimas NHEJ tales como ADN-PK usando inhibidores de ADN-PK.
[0017]En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(I):
o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde cada uno de R, R2, X, Anillo A, Anillo B y Anillo C independientemente es como se define en otra parte del presente documento.
El Anillo A es un sistema de anillos aromático seleccionado de
El Anillo B es un sistema de anillos seleccionado de
donde el Anillo B está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>;
el Anillo C es un grupo cicloalquilo C<4-6>, heteroarilo de 5-6 miembros o fenilo, en el que el Anillo C está opcionalmente además sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, alquilo C<1-2>, -OH y -Oalquilo C<1-2>; X es -NH-, -O-, -Oalquilo C<1-4>-, -S- o -CH<2>-;
cada uno de R1 y R2 es, independientemente, hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -Nh S(O)<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7 en los que R1 y R2 hidrógeno; cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>,
halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -C(O)OH, -C(O)Oalquilo C<1-2>, -<c>N, -C(O)NHalquilo C<1-2>, -C(O)NH<2>, cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>;
cada R4 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-10>, arilo de 6-10 miembros, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 4-10 miembros, en donde cada uno de dichos grupos R4 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<1-4>, CN, NO<2>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-6>, alquilo Cü<-4>-cicloalquilo C<3-5>, alquilo Cü<-4>-O-alquilo C<1-4>, alquilo C<0>-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-C(O)NH2, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C<1-4>)<2>, C(O)NH(alquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>), CH<2>OR5, alquilo C<0-4>-C(O)R5, alquilo C<0-4>-C(O)N(R5)<2>, alquilo C0-4-C(O)OR5, alquilo C0-4-NHC(O)R5, alquilo C0-4-N(R5)2, heterociclilo de 5-6 miembros, -O(alquilo C<1>-4)OR5, -OR5 y oxo, y en el que cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales es opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-4>, -OH, -Oalquilo C<1-4>, -Salquilo C<1-4>, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>y -C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>; y
cada R5 independientemente es hidrógeno, alquilo C<1-4>, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde cada R5 independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN, -OH, -Oalquilo C<1-2>, heteroarilo de 5-6 miembros y heterociclilo de 4-7 miembros, o dos grupos R5 junto con el átomo de nitrógeno intermedio opcionalmente forman un anillo de morfolina. anillo de azetidina, anillo de pirrolidina, anillo de piperidina o anillo de piperazina; y R6 es hidrógeno o alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -CH<2>OH, -CN, -OH y -Oalquilo C<1-2>;
R7 es arilo de 6 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>., -CH<2>OH, -CN y -OR; y
cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<1-4>, o R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman opcionalmente un anillo de morfolina, un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de piperazina.
[0018]En algunas formas de realización, la divulgación también proporciona un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo mediante una vía de reparación dirigida por homología (HDR), el método incluye la administración a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0019]El sistema de edición del genoma interactúa con uno o varios ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en el que la rotura del ADN se repara al menos en parte mediante una vía HDR.
[0020]En algunas formas de realización, la divulgación también proporciona un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía NHEJ, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(I)o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
[0021]El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en el que se inhibe o suprime la reparación de la rotura del ADN a través de una vía NHEJ.
[0022]En algunas formas de realización, la divulgación también proporciona un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, el método incluye administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0023]El sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico de una o más regiones genómicas objetivo de un gen objetivo, dando como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en el que la edición modifica la expresión de un gen(es) y/o proteína(s) aguas abajo asociada(s) con el (los) gen(es) objetivo.
[0024]En algunas formas de realización, se proporciona un kit o composición para editar una o más regiones genómicas objetivo. En algunas formas de realización, el kit o composición incluye un sistema de edición del genoma; y un compuesto representado por la Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0025]Otras características, objetos y ventajas de la invención son evidentes en la descripción detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, si bien indica formas de realización y aspectos de la invención, se proporciona únicamente a modo de ilustración, no de limitación. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0026]
FIGS. 1A -1C son una serie de esquemas y secuencias relacionadas con el uso de un ensayo de indicador de semáforo usado para monitorear la eficiencia de HDR.
FIG. 1A representa el diseño de una construcción bicistrónica dirigida al locus AAVS1 humano (SBI).
FIG. 1B representa la línea celular y la región polinucleotídica objetivo, utilizada en el ensayo del indicador de semáforo para monitorear la eficiencia de HDR.
FIG. 1C es un esquema del flujo de trabajo experimental utilizado en el ensayo del reportero del semáforo para monitorear eficiencia HDR.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0027]A menos que se defina lo contrario, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con esta divulgación tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligonucleótidos o polinucleótidos descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (p. ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente según métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de esta divulgación. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de la química analítica, la química orgánica sintética y la química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéuticas, y tratamiento de pacientes. Generalmente, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Periodic Table of the Elements, versión CAS, y el Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. 1994. Además, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March's Advanced Organic Chemistry", 5a edición, Smith, M.B. y March, J., eds. John Wiley & Sons, Nueva York: 2001. Tal como se utilizan de acuerdo con esta divulgación, se entenderá que los términos definidos en esta divulgación, a menos que se indique lo contrario, tienen los significados definidos en este documento.
Compuestos de la invención
[0028]En una forma de realización, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(I):
o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que las variables de la Fórmula(I)son cada una independientemente como se describe a continuación. El primer conjunto de variables de Fórmula(I)es el siguiente:
El anillo A es un sistema de anillos aromáticos seleccionado de
o
El Anillo B es un sistema de anillos opcionalmente sustituido y seleccionado de
donde el Anillo B está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consta de -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>. En una forma de realización específica, el Anillo B está opcionalmente sustituido y se selecciona de
En otra forma de realización específica, el Anillo B está opcionalmente sustituido.
El Anillo C es un cicloalquilo C<4-6>, heteroarilo de 5-6 miembros o fenilo, en el que el Anillo C está opcionalmente además sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, alquilo C<1-2>, -OH y -Oalquilo C<1-2>. En una forma de realización específica, el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido o heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido. En una forma de realización específica, el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido. En una forma de realización específica, el Anillo C es heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido.
[0029]X es -NH-, -O-, -Oalquilo C<1-4>-, -S- o -CH<2>-. En una forma de realización específica, X es -NH-, -O- o -CH<2>-. En otra forma de realización específica, X es -NH- u -O-. En otra forma de realización específica, X es -O-. En otra forma de realización específica, X es -NH-. En otra forma de realización específica, X es -Oalquilo C<1-4>-. En otra forma de realización específica, X es -CH<2>-.
[0030]Cada uno de R1 y R2 es independientemente hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4,
-NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7 en los que R1 y R2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno. En una forma de realización específica, al menos uno de R1 y R2 es -NHR4 o -OR4. En otra forma de realización específica, cada uno de R1 y R2 independientemente es hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -NHR4, -OR4 o R7 En otra forma de realización específica, R2 es hidrógeno y R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O))<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y R. En otra forma de realización específica, R2 es hidrógeno y R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4,
-NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -NHR4, -OR4 o R7 En otra forma de realización específica, R2 es hidrógeno y R1 es -NHR4, -OR4 o R7. En otra forma de realización específica, R2 es hidrógeno y R1 es -NHR4 o -OR4.
[0031]Cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -C(O)OH, -C(O)Oalquilo C<1-2>, -CN, -C(O)NHalquilo C<1-2>, -C(O)NH<2>, cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>. En una forma de realización específica, cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -CN, -cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en donde cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido. En otra forma de realización específica, cada R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2.
[0032]Cada R4 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-10>, arilo de 6-10 miembros, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 4-10 miembros. Cada uno de los grupos R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<1-4>, CN, NO<2>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-6>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-C(O)NH2, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH (alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>), CH<2>OR<5>, alquilo C0-4-C(O)R5, alquilo C<0>-4-C(O)N(R5)2, alquilo C0-4-C(O)OR5, alquilo C0-4NHC(O)R5, alquilo C0-4-N(R5)2, heterociclilo de 5-6 miembros, -O(alquilo C1-4)OR5, -OR5 y oxo. Cada uno de los sustituyentes R4 opcionales está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-4>, -OH, -Oalquilo C<1-4>, -Salquilo C<1-4>, -C(O) alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>y -C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>. Ejemplos específicos del grupo heteroarilo para R4 incluyen un pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina (p. ej.,
pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina (p. ej.,
pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, y benzoxazol, cada uno de los alquilo C<1-4>, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>y alquinilo C<2-4>para R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F y -O(alquilo C<1-4>), y cada uno de los grupos cicloalquilo C<3-10>, arilo de 6-10 miembros, heteroarilo de 5 10 miembros y heterociclilo de 4-10 miembros para R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más grupos alquilo C<1-4>, -O(alquilo C<1-4>), alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C(O)<n>HC1-4, C(O)N(alquilo C1-4)2 o piperazina, en donde cada uno de los sustituyentes R4 opcionales está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C<1-4>.
[0033]Ejemplos específicos del grupo heterociclilo para R4 incluyen tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina (p. ej.,
dihidropiranopirimidina (p. ej.
dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina (p. ej.,
dihidrofuropiridina (p. ej.,
dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina e isoindolina-1,3-diona. Ejemplos específicos del grupo heterocíclico para los sustituyentes R4 incluyen oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina, pirrolidina, piperazina, furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol, oxadiazol y tetrazol.
[0034]En una forma de realización específica, cada R4 es independientemente hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-5>o un fenilo. En otra forma de realización específica, cada R4 independientemente es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina o isoindolina-1,3-diona. En otra forma de realización específica, cada R4 independientemente es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre imidazol, pirazol, pirimidina, furopirimidina, oxetano o dihidrofuropirimidina.
[0035]En otra forma de realización específica, cada R4 independientemente es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<1-4>,
o un grupo anillo seleccionado entre un grupo cicloalquilo C<3-5>, pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol o fenilo, en los que X1 es N o CR4d; X2 es N o CR4c, donde X1 y X2 no pueden ser N simultáneamente; cada uno de R4a, R4b y R4c independientemente es hidrógeno, F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C<1>-<4>)<2>, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>), un grupo heterocíclico seleccionado entre un oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina o piperazina, o un grupo heteroarilo seleccionado entre furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol o tetrazol; o R4c y R4a, o R4c y R4b, junto con los átomos intermedios, forman opcionalmente un grupo heterocíclico dihidrofurano, dihidropirano o tetrahidropiperidina; y R4d independientemente es hidrógeno, F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C<0-4>-O-alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, o C(O)N(alquilo C<1-4>)<2>. Cada uno de dichos grupos heterocíclico y heteroarilo para R4a, R4b y R4c, y para los sustituyentes de R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, alquilo C<1-4>, -OH, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>o -C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>; y cada uno de los grupos alquilo y cicloalquilo para R4a, R4b y R4c, y para los sustituyentes de R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F y -OH. En una forma de realización específica, R4d es hidrógeno, CF, CCl o alquilo CC<1-2>opcionalmente sustituido con uno o más -F.
[0036]En otra forma de realización específica, cada R4 independientemente es alquilo C<1-4>o un grupo anular seleccionado entre cicloalquilo C<3-5>, pirazol, imidazol, oxetano,
en el que el alquilo R4 C<1-4>está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F y -O(alquilo C<1-4>), y en el que cada uno de los grupos del anillo R4 es opcionalmente y sustituido independientemente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<1-4>, -CN, -O(alquilo C<1-4>), cicloalquilo C<3-6>, alquilo C<0-4>-O -alquilo C<1-4>, alquilo C(O)NHC1-4, C(O)N(alquilo C1-4)2 y una piperazina, en donde cada uno de los sustituyentes R4 opcionales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre los grupo que consiste en -F, alquilo C<1-4>, -OH y -Oalquilo C<1-4>. En una forma de realización específica, el alquilo C<1-4>R4 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F y -O(alquilo C<1-4>), y cada uno de los grupos del anillo R4 está sustituido opcional e independientemente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo C<1-4>, -O(alquilo C<1-4>), alquilo C0-4-Oalquilo C<1-4>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2, y una piperazina, en la que cada uno de los sustituyentes R4 opcionales está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C1-4.
[0037]Cada R5 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1-4>, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros o heterociclilo de 4 7 miembros, en donde cada R5 independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH,
-CN, -OH, -Oalquilo C<1-2>, heteroarilo de 5-6 miembros y heterociclilo de 4-7 miembros, o dos grupos R5 junto con el átomo de nitrógeno intermedio opcionalmente forman una morfolina, azetidina, pirrolidina, piperidina o piperazina. Ejemplos específicos del grupo heteroarilo opcionalmente sustituido para R5 incluyen un imidazol, triazol, tiazol, piridina y pirimidina. Ejemplos específicos del grupo heterociclilo opcionalmente sustituido para R5 incluyen un oxetano, tetrahidrofurano y tetrahidropirano.
[0038]R6 es hidrógeno o alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -CH<2>OH, -CN, -Oh y -Oalquilo C<1-2>. En una forma de realización específica, R6 es hidrógeno o metilo.
[0039]R7 es arilo de 6 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN y -OR. Los ejemplos específicos de R7 incluyen pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina e isoindolina-1,3-diona. En una forma de realización específica, R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, oxetano, dihidrofuropirimidina o isoindolina-1,3-diona. En otra forma de realización específica, R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, oxetano, dihidrofuropirimidina o isoindolin-1,3-diona. En otra forma de realización específica más, R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirimidina, pirazol, furopirimidina, tiazol o isoindolin-1,3-diona.
[0040]Cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<1-4>, o R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman opcionalmente un anillo de morfolina, un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de piperazina. En una forma de realización específica, cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<1-4>. En otra forma de realización específica, cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<1-2>.
[0041]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(I), cada R4 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-10>, un fenilo, un naftaleno, un grupo heteroarilo de 5-10 miembros. seleccionado del grupo que consiste en pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol y benzoxazol, o un grupo heterociclilo de 4-10 miembros seleccionado del grupo que consiste en tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina y isoindolina-1,3-diona. Cada uno de R4 está opcional e independientemente sustituido en una forma de realización especifica, el grupo heterocíclico para los sustituyentes R4 está opcionalmente sustituido y seleccionado de oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina, pirrolidina, piperazina, furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol, oxadiazol o tetrazol. Las variables restantes de la Fórmula(l)son cada una e independientemente como se describe en el primer conjunto de variables de la Fórmula(I).
[0042]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(I), cada R5 independientemente es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<1-4>, fenilo, un grupo heteroarilo de 5-6 miembros seleccionado entre imidazol, triazol, tiazol, piridina, o pirimidina, o un grupo heterociclilo de 4 a 6 miembros seleccionado entre oxetano, tetrahidrofurano o tetrahidropirano. Cada R4 de forma independiente es como se describe en el segundo conjunto de variables de Fórmula(I). Las variables restantes de la Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en el primer o segundo conjunto de variables de la Fórmula(I).
[0043]En el cuarto conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido o heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido; cada uno de R4 y R5 independientemente son como se describe en el tercer conjunto de variables de Fórmula(I); y las variables restantes de Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a tercero de Fórmula(I).
[0044]En el quinto conjunto de variables de Fórmula(I), X es -O- o -NH-; Anillo C el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido o heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido; y las variables restantes de la Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al cuarto de la Fórmula(I).
[0045]En el sexto conjunto de variables de Fórmula(I), X es -O- o -NH-; Anillo C el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido o heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido; cada uno de R4 y R5 independientemente son como se describe en el tercer conjunto de variables de Fórmula(I); y las variables restantes de la Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al quinto de la Fórmula(I).
[0046]En el séptimo conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo B
está opcionalmente sustituido y seleccionado entre
X es -O- o -NH-; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al sexto de Fórmula(I).
[0047]En el octavo conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo B
está opcionalmente sustituido y seleccionado entre
X es -O- o -NH-; Anillo C el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido o heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido; cada uno de R4 y R5 independientemente son como se describe en el tercer conjunto de variables de Fórmula(I); y las variables restantes de la Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al séptimo de la Fórmula(I).
[0048]En el noveno conjunto de variables de Fórmula(I), cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -alquilo C<1-2>, -CN, -cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al octavo de Fórmula(I).
[0049]En el décimo conjunto de variables de Fórmula(I), cada R4 independientemente es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-5>o fenilo; y las variables restantes de Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al noveno de Fórmula(I).
[0050]En el undécimo conjunto de variables de Fórmula(I), cada R4 independientemente es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado de pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona., furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, hidropiridopiridina, tetrahidropteridina o isoindolina-1,3-diona; y las variables restantes de Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al décimo de Fórmula(I).
[0051] En el duodécimo conjunto de variables de Fórmula (I), cada R4 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre imidazol, pirazol, pirimidina, furopirimidina, oxetano o dihidrofuropirimidina; y las variables restantes de Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al undécimo de Fórmula (I).
[0052] En el decimotercer conjunto de variables de Fórmula (I), cada R4 independientemente es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<1-4>,
o un grupo anular seleccionado entre cicloalquilo C<3-5>, pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol o fenilo, en los que X1 es N o CR4d;
X2 es N o CR40, donde X1 y X2 no pueden ser N simultáneamente; cada uno de R4a, R4b y R4c independientemente es hidrógeno, F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo Cü<-4>-cicloalquilo C<3-5>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C<1-4>)<2>, C(O)NH(alquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>), un grupo heterocíclico seleccionado de oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina o piperazina, o un grupo heteroarilo seleccionado entre furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol o tetrazol; o R4c y R4a, o R4c y R4b, junto con los átomos intermedios, forman opcionalmente un grupo anular heterocíclico dihidrofurano, dihidropirano o tetrahidropiperidina; R4d es independientemente hidrógeno, F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquenilo C2-4, alquinilo C2-4, C(O)Oalquilo C1-4, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C1-4, o C(O)N(alquilo C1-4)2; cada uno de los grupos del anillo R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C<0-4>-O-alquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>), un grupo heterocíclico seleccionado entre oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina o piperazina, y un grupo heteroarilo seleccionado entre furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol o tetrazol; cada uno de dichos grupos heterocíclico y heteroarilo para R4a, R4b y R4c, y para los sustituyentes de R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, alquilo C<1-4>, -OH, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>o -C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>; y cada uno de dichos grupos alquilo y cicloalquilo para R4a, R4b y R4c, y para los sustituyentes de R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F y -OH. Las variables restantes de la Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimotercero de la Fórmula (I).
[0053] En el decimocuarto conjunto de variables de Fórmula (I), cada R4 independientemente es alquilo C<1-4>o un grupo anular seleccionado entre cicloalquilo C<3-5>, pirazol, imidazol, oxetano,
en el que dicho R4 alquilo C<1-4>está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F y -O(alquilo C<1-4>), y en el que cada uno de dichos grupos anulares R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<1-4>, -CN, -O(alquilo C<1-4>), cicloalquilo C<3-6>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo piperazina, en la que cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, alquilo C<1-4>, -OH y -Oalquilo C<1-4>. Las variables restantes de la Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimotercero de la Fórmula (I).
[0054] En el decimoquinto conjunto de variables de Fórmula (I), cada R4 independientemente es como se describe en el decimocuarto conjunto de variables de Fórmula (I), en donde el R4 alquilo C<1-4>está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de -F y -O(alquilo C<1-4>), y cada uno de los grupos anulares R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo C<1-4>, -O(alquilo C<1-4>), alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2 y una piperazina, y en el que cada uno de los sustituyentes R4 opcionales está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C<1-4>. Las variables restantes de la Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimocuarto de la Fórmula (I).
[0055]En el decimosexto conjunto de variables de Fórmula(I), cada uno de R1 y R2 independientemente es hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7. Las variables restantes de la Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoquinto de la Fórmula(I).
[0056]En el decimoséptimo conjunto de variables de Fórmula(I), R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetra hidropteridina o isoindolina-1,3-diona. Las variables restantes de la Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimosexto de la Fórmula(I).
[0057]En el decimoctavo conjunto de variables de Fórmula(I), R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, oxetano, dihidrofuropirimidina o isoindolina-1,3-diona. Las variables restantes de la Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoséptimo de la Fórmula(I).
[0058]En el decimonoveno conjunto de variables de Fórmula(I), R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirimidina, pirazol, furopirimidina, tiazol o isoindolin-1,3-diona; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoctavo de Fórmula(I).
[0059]En el vigésimo conjunto de variables de Fórmula(I), X es -O-; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoctavo de Fórmula(I).
[0060]En el vigésimo primer conjunto de variables de Fórmula(I), X es -NH-; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoctavo de Fórmula(I).
[0061]En el vigésimo segundo conjunto de variables de Fórmula(I), X es -CH<2>-; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoctavo de Fórmula(I).
[0062]En el vigésimo tercer conjunto de variables de Fórmula(I), X es -Oalquilo C<1-4>-; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al decimoctavo de Fórmula(I).
[0063]En el vigésimo cuarto conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo tercero de Fórmula(I).
[0064]En el vigésimo quinto conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo C es ciclohexano opcionalmente sustituido; y las variables restantes de Fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo cuarto de Fórmula(I).
[0065]En el vigésimo sexto conjunto de variables de Fórmula(I), R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; R2 es hidrógeno; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo quinto de Fórmula(I).
[0066]En el vigésimo séptimo conjunto de variables de Fórmula(I), cada R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; R6 es hidrógeno o metilo; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo sexto de Fórmula(I).
[0067]En el vigésimo octavo conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo C es heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0068]En el vigésimo noveno conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo C es fenilo opcionalmente sustituido; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0069]En el trigésimo conjunto de variables de Fórmula(I), el Anillo C es fenilo opcionalmente sustituido; X es -Oalquilo C<1-4>-; y las variables restantes de la Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describen en cualquiera de los puntos primero al vigésimo séptimo conjuntos de variables de Fórmula(I).
[0070]En otra forma de realización, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(II)o sus sales farmacéuticamente aceptables:
en la que las variables de la Fórmula(II)son cada una independiente como se describe a continuación.
[0071]En el primer conjunto de variables de Fórmula(II), cada una de las variables de Fórmula(II)es independientemente como se describe anteriormente en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0072]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(II), R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y R2 es hidrógeno. Las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0073]En otra forma de realización, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), o sales farmacéuticamente aceptables. del mismo:
(III-B-2),en donde las variables de Fórmula(II)son cada una independiente como se describe a continuación.
[0074]En el primer conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2),cada una de las variables de(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2)es independientemente como se describe anteriormente en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0075]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0076]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -NHR4, o -OR4; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera del primer o segundo conjunto de variables de(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1), o(III-B-2).
[0077]En el cuarto conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -NHR4; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a tercero de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1), o(III-B-2).
[0078]En el quinto conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -OR4; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a cuarto de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),o(III-B-2).
[0079]En el sexto conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; R6 es hidrógeno o metilo; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a quinto de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),o(III-B-2).
[0080]En otra forma de realización más, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(IV)o sus sales farmacéuticamente aceptables:
en la que las variables de la Fórmula(IV)son, cada una e independientemente, como se describen a continuación.
[0081]En el primer conjunto de variables de Fórmula(IV), cada una de las variables de forma independiente es como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0082]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(IV), R1 es hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y las variables restantes de Fórmula(IV)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0083]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(IV), el Anillo B se sustituye
Oo ,
opcionalmente y las variables restantes de Fórmula(IV)son, cada una e independientemente, como se describe en el primer o segundo conjunto de variables de Fórmula(IV).
[0084]En otra forma de realización más, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(V-A)o(V-B), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:
(V-B), en la que cada una de las variables de Fórmula(V-A)o(V-B)es independientemente como se describe abajo.
[0085]En el primer conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B), cada una de las variables de forma independiente es como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0086]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B), R3 es hidrógeno, metilo, ciclopropilo, -F, -Cl, -Oalquilo C<1-2>, -NRR' o -CN, en donde cada uno de dicho R3 alquilo es opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y -O(alquilo C<1-2>); cada R4 independientemente es alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y -O(alquilo C<1-2>); y R y R' son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C<1-2>. Las variables restantes de Fórmula(V-A)o(V-B)son, cada una e independientemente, como se describen en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0087]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B), cada R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; y R6 es hidrógeno o metilo. Las variables restantes de Fórmula(V-A)o(V-B)son cada una e independientemente como se describen en el primer o segundo conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B).
[0088]En otra forma de realización más, los compuestos de la invención están representados por cualquiera de las Fórmulas(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),(III-B-2),(IV),(V-A)y(V-B), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde cada una de las variables de estas Fórmulas de forma independiente como se representa en las fórmulas estructurales de las Tablas 1 y 2.
[0089]En otra forma de realización más, los compuestos de la invención son como se representan en las Tablas 1 y 2, o sus sales farmacéuticamente aceptables. En una forma de realización específica, la invención presenta un compuesto seleccionado del grupo de compuestos enumerados en la Tabla 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra forma de realización específica, la invención presenta un compuesto seleccionado del grupo de compuestos enumerados en la Tabla 2, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0090]Tal como se utilizan en este documento, se aplicarán las siguientes definiciones a menos que se indique lo contrario. Para los fines de esta invención, los elementos químicos se identifican de acuerdo con la Periodic Table of the Elements, versión CAS, y el Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. 1994. Además, los principios generales de la química orgánica se describen en "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y "March's Advanced Organic Chemistry", 5a edición, Smith, M.B. y March, J., eds. John Wiley & Sons, Nueva York: 2001.
[0091]Como se describe en el presente documento, los compuestos de la invención pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, como los que se ilustran en general anteriormente, o como se ejemplifican mediante clases, subclases y especies particulares de la invención. Se apreciará que la frase "opcionalmente sustituido" se usa indistintamente con la frase "sustituido o no sustituido". En general, el término "sustituido", precedido o no por el término "opcionalmente", se refiere a la sustitución de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente específico. A menos que se indique lo contrario, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo. Cuando se puede sustituir más de una posición en una estructura dada con más de un sustituyente seleccionado de un grupo específico, el sustituyente puede ser el mismo o diferente en cada posición.
[0092]Como se describe en el presente documento, cuando el término "opcionalmente sustituido" precede a una lista, dicho término se refiere a todos los grupos sustituibles posteriores en esa lista. Por ejemplo, si X es halógeno; alquilo C<1>-<3>o fenilo opcionalmente sustituido; X puede ser alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido. Asimismo, si el término "opcionalmente sustituido" sigue a una lista, dicho término también se refiere a todos los grupos sustituibles en la lista anterior a menos que se indique lo contrario. Por ejemplo: si X es halógeno, alquilo C<1-3>o fenilo, en el que X está opcionalmente sustituido con JX, entonces tanto el alquilo C<1-3>como el fenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con JX. Como resulta evidente para un experto en la técnica, grupos tales como H, halógeno, NO<2>, CN, NH<2>, OH u OCF<3>no se incluirían porque no son grupos sustituibles. Como también resulta evidente para un experto, un anillo heteroarilo o heterocíclico que contiene un grupo NH puede estar opcionalmente sustituido sustituyendo el átomo de hidrógeno por el sustituyente. Si un radical o estructura sustituyente no se identifica o define como "opcionalmente sustituido", el radical o estructura sustituyente no está sustituido.
[0093]Las combinaciones de sustituyentes previstas por esta invención son preferiblemente aquellas que dan como resultado la formación de compuestos estables o químicamente factibles. El término "estable", como se usa en este documento, se refiere a compuestos que no se alteran sustancialmente cuando se someten a condiciones que permitan su producción, detección y, preferiblemente, su recuperación, purificación y uso para uno o más de los propósitos descritos en este documento. En algunas formas de realización, un compuesto estable o un compuesto químicamente factible es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene a una temperatura de 40 °C o menos, en ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante al menos una semana.
[0094]El término "alquilo" o "grupo alquilo", como se usa en el presente documento, significa una cadena hidrocarbonada de cadena lineal (es decir, no ramificada) o ramificada, sustituida o no sustituida que está completamente saturada. A menos que se especifique lo contrario, los grupos alquilo contienen de 1 a 8 átomos de carbono. En algunas formas de realización, los grupos alquilo contienen de 1 a 6 átomos de carbono, y en otras formas de realización más, los grupos alquilo contienen de 1 a 4 átomos de carbono (representados como "alquilo C<1-4>"). En otras formas de realización, los grupos alquilo se caracterizan como "alquilo C<0-4>" que representa un enlace covalente o una cadena de alquilo C<1-4>. Ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo y tere-butilo. El término "alquileno", como se usa en el presente documento, representa un grupo hidrocarbonado divalente saturado de cadena lineal o ramificada y está ejemplificado por metileno, etileno, isopropileno y similares. El término "alquilideno", como se usa en el presente documento, representa un grupo de enlace alquilo de cadena lineal divalente. El término "alquenilo", como se usa en el presente documento, representa un grupo hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada que contiene uno o más dobles enlaces de carbono-carbono. El término "alquinilo", como se usa en el presente documento, representa un grupo hidrocarbonado monovalente de cadena lineal o ramificada que contiene uno o más triples enlaces carbono-carbono.
[0095]El término "cicloalquilo" (o "carbociclo") se refiere a un hidrocarburo monocíclico C<3>-C<8>o bicíclico C<8>-C<12>que está completamente saturado y tiene un único punto de unión al resto de la molécula, y en el que cualquier anillo individual en dicho El sistema de anillos bicíclico tiene de 3 a 7 miembros. Los grupos cicloalquilo adecuados incluyen, entre otros, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.
[0096]El término "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterocíclico" como se usa en el presente documento se refiere a un sistema de anillos monocíclico, bicíclico o tricíclico en el que al menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos, que es el igual o diferente, y que esté completamente saturado o que contenga una o más unidades de insaturación, pero que no sea aromático, y que tenga un único punto de unión con el resto de la molécula. En algunas formas de realización, el grupo "heterociclo", "heterociclilo", "heterocicloalquilo" o "heterocíclico" tiene de tres a catorce miembros del anillo en los que uno o más miembros del anillo es un heteroátomo seleccionado independientemente de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo y cada anillo del sistema contiene de 3 a 8 miembros de anillo.
[0097]Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen, entre otros, los siguientes monociclos: 2-tetrahidrofuranilo, 3-tetrahidrofuranilo, 2-tetrahidrotiofenilo, 3-tetrahidrotiofenilo, 2-morfolino, 3-morfolino, 4-morfolino, 2-tiomorfolino, 3-tiomorfolino, 4-tiomorfolino, 1 -pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo, 3-pirrolidinilo, 1 -tetrahidropiperazinilo, 2-tetrahidropiperazinilo, 3-tetrahidropiperazinilo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 1 -pirazolinilo, 3-pirazolinilo, 4-pirazolinilo, 5-pirazolinilo, 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-piperidinilo, 2-tiazolidinilo, 3-tiazolidinilo, 4-tiazolidinilo, 1 -imidazolidinilo, 2-imidazolidinilo, 4-imidazolidinilo, 5- imidazolidinilo; y los siguientes biciclos: 3-1H-bencimidazol-2-ona, 3-(1-alquil)-bencimidazol-2-ona, indolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, benzotiolano, benzoditiano y 1,3-dihidroimidazol-2-ona.
[0098]El término "heteroátomo" significa uno o más de oxígeno, azufre, nitrógeno o fósforo, incluyendo cualquier forma oxidada de nitrógeno, azufre o fósforo; la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico; o un nitrógeno sustituible de un anillo heterocíclico, por ejemplo N (como en 3,4-dihidro-2H-pirrolilo), NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en pirrolidinilo N-sustituido).
[0099]El término "insaturado", como se usa en el presente documento, significa que un resto tiene una o más unidades de insaturación.
[0100]El término "alcoxi" o "tioalquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo, como se definió anteriormente, unido a la cadena de carbono principal a través de un átomo de oxígeno ("alcoxi") o azufre ("tioalquilo").
[0101]Los términos "haloalquilo", "haloalquenilo" y "haloalcoxi" significan alquilo, alquenilo o alcoxi, según sea el caso, sustituido con uno o más átomos de halógeno. El término "halógeno" significa F, Cl, Br o I.
[0102]El término "arilo", usado solo o como parte de un resto mayor como en "aralquilo", "aralcoxi" o "ariloxialquilo", se refiere a un sistema de anillos carbocíclicos monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene un total de seis a catorce miembros del anillo, en el que dicho sistema de anillos tiene un único punto de unión al resto de la molécula, al menos un anillo en el sistema es aromático y en el que cada anillo en el sistema contiene de 4 a 7 miembros del anillo. El término "arilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo de arilo". Ejemplos de anillos de arilo incluyen fenilo, naftilo y antraceno.
[0103]El término "heteroarilo", usado solo o como parte de un resto más grande como en "heteroaralquilo" o "heteroarilalcoxi", se refiere a un sistema de anillos monocíclico, bicíclico y tricíclico que tiene un total de cinco a catorce miembros del anillo, en el que dicho sistema de anillos tiene un único punto de unión al resto de la molécula, al menos un anillo en el sistema es aromático, al menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente entre nitrógeno, oxígeno, azufre o fósforo, y en donde cada anillo del sistema contiene de 4 a 7 miembros de anillo. El término "heteroarilo" puede usarse indistintamente con el término "anillo heteroarilo" o el término "heteroaromático".
[0104]Otros ejemplos de anillos de heteroarilo incluyen los siguientes monociclos: 2-furanilo, 3-furanilo, N-imidazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 5-imidazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo, N-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, piridazinilo (p. ej., 3-piridazinilo), 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, tetrazolilo (p. ej., 5-tetrazolilo), triazolilo (p. ej., 2-triazolilo y 5-triazolilo), 2-tienilo, 3-tienilo, pirazolilo (p. ej., 2-pirazolilo), isotiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, pirazinilo, 1,3,5-triazinilo y los siguientes biciclos: bencimidazolilo, benzofurilo, benzotiofenilo, indolilo (p. ej., 2-indolilo), purinilo, quinolinilo (p. ej., 2-quinolinilo, 3-quinolinilo, 4-quinolinilo) e isoquinolinilo (p. ej., 1-isoquinolinilo, 3-isoquinolinilo o 4-isoquinolinilo).
[0105]Como se describe en el presente documento, un enlace trazado desde un sustituyente hasta el centro de un anillo dentro de un sistema de anillos múltiples (como se muestra a continuación) representa la sustitución del sustituyente en cualquier posición sustituible en cualquiera de los anillos dentro del sistema de anillos múltiples. Por ejemplo, la Estructura a representa una posible sustitución en cualquiera de las posiciones mostradas en la Estructura b.
Estructura a Estructura b
[0106]Esto también se aplica a sistemas de anillos múltiples fusionados a sistemas de anillos opcionales (que estarían representados por líneas de puntos). Por ejemplo, en la Estructura c, X es un sustituyente opcional tanto para el anillo A como para el anillo B.
Estructura c
[0107]Sin embargo, si dos anillos en un sistema de anillos múltiples tienen cada uno diferentes sustituyentes extraídos del centro de cada anillo, entonces, a menos que se especifique lo contrario, cada sustituyente solo representa una sustitución en el anillo al que está unido. Por ejemplo, en la Estructura d, Y es un sustituyente opcional del anillo A únicamente y X es un sustituyente opcional del anillo B únicamente.
Estructura d
[0108]El término "grupo protector', como se usa en el presente documento, representa aquellos grupos destinados a proteger un grupo funcional, tal como, por ejemplo, un alcohol, amina, carboxilo, carbonilo, etc., contra reacciones indeseables durante procedimientos sintéticos. Los grupos protectores utilizados habitualmente se describen en Greene y Wuts, Protective Groups In Organic Synthesis, 3a edición (John Wiley & Sons, Nueva York, 1999). Ejemplos de grupos protectores de nitrógeno incluyen grupos acilo, aroilo o carbamilo tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, tbutMacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutirilo, benzoilo, 4-clorobenzoílo, 4-bromobenzoílo, 4-nitrobenzoílo y auxiliares quirales tales como D, L o D,L-aminoácidos protegidos o no protegidos tales como alanina, leucina, fenilalanina y similares; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y similares; grupos carbamato tales como benciloxicarbonilo, pclorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, pbromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, -nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, a,a-dimetil-3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares, grupos arilalquilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y los similares y grupos sililo tales como trimetilsililo y similares. Los grupos protectores de N preferidos son formilo, acetilo, benzoílo, pivaloílo, t-butilacetilo, alanilo, fenilsulfonilo, bencilo, t-butiloxicarbonilo (Boc) y benciloxicarbonilo (Cbz). Ejemplos de grupos protectores de hidroxilo incluyen éteres, tales como tetrahidropiranilo, tercbutilo, bencilo, alilo y similares; éteres sililo tales como trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo, terc-butildifenilsililo y similares; ésteres tales como acetilo, trifluoroacetilo y similares; y carbonatos. Los grupos protectores de hidroxilo también incluyen aquellos apropiados para la protección de fenoles.
[0109]A menos que se represente o indique lo contrario, las estructuras citadas en el presente documento pretenden incluir todas las formas isoméricas (p. ej., enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, isómeros de doble enlace (Z) y (E), e isómeros conformacionales (Z) y (E). Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos individuales, así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de la invención. Los compuestos que se han dibujado con centros estereoquímicos definidos, generalmente mediante el uso de un enlace sombreado (« lili) o en negrita ( -^« ), son estereoquímicamente puros, pero su estereoquímica absoluta aún no está definida. Dichos compuestos pueden tener la configuraciónRo S. En aquellos casos en los que se ha determinado la configuración absoluta, los centros quirales están etiquetados(R)o(S)en el dibujo.
[0110]A menos que se indique lo contrario, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la invención están dentro del alcance de la invención. Además, a menos que se indique lo contrario, las estructuras representadas en el presente documento también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos enriquecidos isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto la sustitución de hidrógeno por deuterio o tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C, están dentro del alcance de esta invención. Dichos compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas analíticas, sondas en ensayos biológicos o como inhibidores de ADN-PK con un perfil terapéutico mejorado.
Composiciones, formulaciones y administración de compuestos de la invención.
[0111]En otra forma de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las fórmulas descritas en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Tabla 1. En una forma de realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Tabla 2. En una forma de realización adicional, las composiciones comprenden adicionalmente un agente terapéutico adicional.
[0112]Según otra forma de realización, la invención proporciona una composición que comprende un compuesto de esta invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una forma de realización, la cantidad de compuesto en una composición de esta invención es tal que es eficaz para inhibir de forma mensurable una PK de ADN en una muestra biológica o en un paciente. En otra forma de realización, la cantidad de compuesto en las composiciones de esta invención es tal que sea eficaz para inhibir de forma mensurable la ADN-PK. En una forma de realización, la composición de esta invención se formula para administración a un paciente que necesita dicha composición. En una forma de realización adicional, la composición de esta invención se formula para administración oral a un paciente.
[0113]El término "paciente", tal como se utiliza en el presente documento, significa un animal, preferiblemente un mamífero y más preferiblemente un ser humano.
[0114]El término "agente" se utiliza en el presente documento para indicar un compuesto químico, una molécula pequeña, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos.
[0115]Como se usa en el presente documento, "tratamiento" o "tratar", o "paliar" o "mejorar" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen, entre otros, un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende cualquier mejora o efecto terapéuticamente relevante sobre una o más enfermedades, afecciones o síntomas bajo tratamiento. Para beneficio profiláctico, las composiciones pueden administrarse a un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad, afección o síntoma particular, o a un sujeto que informa uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, incluso aunque es posible que aún no se haya manifestado la enfermedad, afección o síntoma. Estos términos también significan el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano, incluyendo (a) inhibir la enfermedad, es decir, detener o prevenir su desarrollo; (b) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión del estado patológico; o (c) curar la enfermedad.
[0116]El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo de uno o más de: el sujeto y la enfermedad que se está tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la forma de administración y similares, que pueden determinarse fácilmente mediante alguien con experiencia ordinaria en la técnica. El término también se aplica a una dosis que proporcionará una imagen para la detección mediante cualquiera de los métodos de obtención de imágenes descritos en el presente documento. La dosis específica puede variar dependiendo de uno o más de: el agente particular elegido, el régimen de dosificación a seguir, si se administra en combinación con otros compuestos, el momento de la administración, el tejido del que se van a tomar imágenes y el sistema de administración física en que se lleva.
[0117]Como se usa en el presente documento, "administrar" se refiere a poner en contacto, inyectar, dispensar, administrar o aplicar un inhibidor de ADN-PK a un sujeto, un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una célula o un sujeto. En algunas formas de realización, la administración consiste en poner en contacto un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK con una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la administración consiste en administrar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la administración consiste en aplicar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la administración es inyectar un sistema de edición genómica y/o un inhibidor de ADN-PK a una(s) célula(s). La administración puede ocurririn vivo, ex vivooin vitro.La administración de un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADN-PK a una célula se puede realizar de forma simultánea o secuencial.
[0118]El término "adquirido" en referencia a una afección o enfermedad tal como se utiliza en el presente documento significa un trastorno o afección médica que se desarrolla después del feto; en contraste con un trastorno congénito, que está presente al nacer. Un trastorno congénito puede ser antecedente de un trastorno adquirido.
[0119]Los términos condición o enfermedad "congénita" o "heredada" son un trastorno genético que se encuentra en el genoma de un sujeto y que está presente en un sujeto al nacer. El "genoma" como se utiliza en el presente documento incluye todo el material genético en el núcleo y el citoplasma, e incluye además el genoma mitocondrial y el genoma ribosómico. La congénita o heredada puede expresarse en cualquier momento de la vida del sujeto, por ejemplo, al nacer o en la edad adulta.
[0120]El término "trastorno genético" o "enfermedad genética" incluye mutaciones heredadas o adquiridas en el genoma de un sujeto que causa o puede causar una enfermedad.
[0121]Los términos "polimorfismos" o "variaciones genéticas" significan diferentes formas de un gen en un locus genético.
[0122]Los compuestos descritos en el presente documento pueden existir en forma libre para tratamiento o, cuando sea apropiado, como un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Un derivado farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, profármacos, sales, ésteres, sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables o cualquier otro aducto o derivado que, tras su administración a un paciente que lo necesite, sea capaz de proporcionar, directa o indirectamente, un compuesto como se describe de otro modo en el presente documento, o un metabolito o residuo del mismo. Como se usa en el presente documento, el término "metabolito activo inhibidor o residuo del mismo" significa que un metabolito o residuo del mismo es también un inhibidor de ADN-PK.
[0123]Tal como se utiliza en el presente documento, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares.
[0124]Las sales farmacéuticamente aceptables son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S.M. Berge et al., describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 66:1-19, 1977. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen aquellas derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Ejemplos de sales de adición de ácidos no tóxicas y farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico o usando otros métodos usados en la técnica tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato., hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, sales de 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato y similares. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo Cm )4. Esta invención también prevé la cuaternización de cualquier grupo básico que contenga nitrógeno de los compuestos descritos en este documento. Mediante dicha cuaternización se pueden obtener productos solubles o dispersables en agua o aceite. Las sales representativas de metales alcalinos o alcalinotérreos incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes no tóxicos de amonio, amonio cuaternario y amina formados usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato C<1-8>y sulfonato de arilo.
[0125]Como se describió anteriormente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención comprenden adicionalmente un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable, que, como se usa en el presente documento, incluye todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. En Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, 2005, ed. D.B. Troy, Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J.C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York, describen diversos vehículos utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticamente aceptables y técnicas conocidas para su preparación. Excepto en la medida en que cualquier medio portador convencional sea incompatible con los compuestos de la invención, como por ejemplo produciendo cualquier efecto biológico indeseable o interactuando de otra manera de manera perjudicial con cualquier otro componente(s) de la composición farmacéuticamente aceptable, se contempla que su uso sea dentro del alcance de esta invención.
[0126]Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico o sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, grasa de lana, azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles; tal propilenglicol o polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tampón tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes liberadores, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes. estar presente en la composición, según el criterio del formulador.
[0127]Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por vía oral, parenteral, mediante pulverización para inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado. El término "parenteral", tal como se utiliza en el presente documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intraocular, intrahepática, intralesional, epidural, intraespinal e intracraneal. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa. Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular según técnicas conocidas en la técnica usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión.
[0128]Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, como el ácido oleico y sus derivados glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. También se pueden usar para los fines de formulación otros tensioactivos comúnmente usados, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas farmacéuticas sólidas, líquidas u otras formas de dosificación farmacéuticamente aceptables.
[0129]Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se pueden administrar por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable que incluye, entre otras, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de los comprimidos para uso oral, los vehículos comúnmente utilizados incluyen lactosa y almidón de maíz. Normalmente también se añaden agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsulas, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.
[0130]Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se pueden administrar en forma de supositorios para administración rectal. Estos se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperatura ambiente pero líquido a temperatura rectal y, por lo tanto, se derrita en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
[0131]Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también se pueden administrar tópicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles mediante aplicación tópica, incluidas enfermedades de los ojos, la piel o el tracto intestinal inferior. Se preparan fácilmente formulaciones tópicas adecuadas para cada una de estas áreas u órganos.
[0132]La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior se puede realizar en una formulación de supositorio rectal (ver arriba) o en una formulación de enema adecuada. También se pueden utilizar parches tópicos transdérmicos.
[0133]Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden formular en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Los vehículos para la administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, entre otros, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden formular en una loción o crema adecuada que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos adecuados incluyen, entre otros, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
[0134]Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse, por ejemplo, como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica, estéril con pH ajustado u otra solución acuosa, o, preferiblemente, como soluciones en solución salina isotónica, estéril con pH ajustado u otra solución acuosa, ya sea con o sin conservantes como el cloruro de bencilalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una pomada tal como vaselina. Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se preparan según técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.
[0135]Lo más preferiblemente, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se formulan para administración oral.
[0136]Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen, entre otras, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol de bencilo, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, maní, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos. de sorbitán y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes.
[0137]Se pueden formular preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran agua, solución de Ringer, USP y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se utilizan ácidos grasos como el ácido oleico.
[0138]Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
[0139]Para prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, a menudo es deseable retardar la absorción del compuesto mediante inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del compuesto depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, disolver o suspender el compuesto en un vehículo oleoso logra la absorción retardada de una forma de compuesto administrada por vía parenteral. Las formas de depósito inyectables se elaboran formando matrices de microencápsulas del compuesto en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la proporción de compuesto a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del compuesto. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones que sean compatibles con los tejidos corporales.
[0140]Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar mezclando los compuestos de esta invención con excipientes o vehículos no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal. y por tanto se funden en el recto o cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
[0141]Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólida, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o portador inerte y farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) cargas o extensores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la solución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como arcilla de caolín y bentonita, y i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma de dosificación también puede comprender agentes tampón.
[0142]También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libere el o los ingredientes activos únicamente, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras. También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
[0143]Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes como se indicó anteriormente. Las formas de dosificación sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos que controlan la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas de dosificación también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes para tabletas y otros coadyuvantes para tabletas tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden contener agentes tamponadores. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden tener una composición que libere el o los ingredientes activos únicamente, o preferentemente, en una determinada parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de inclusión que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
[0144]Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, aerosoles, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario según sea necesario. También se contemplan dentro del alcance de esta invención formulaciones oftálmicas, gotas para los oídos y gotas para los ojos. Además, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que tienen la ventaja adicional de proporcionar una administración controlada de un compuesto al cuerpo. Dichas formas de dosificación se pueden preparar disolviendo o dispensando el compuesto en el medio adecuado. También se pueden utilizar potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad se puede controlar proporcionando una membrana controladora de velocidad o dispersando el compuesto en una matriz o gel polimérico.
[0145]Los compuestos de la invención se formulan preferiblemente en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La expresión "forma unitaria de dosificación", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente discreta de agente apropiada para el paciente que se va a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención lo decidirá el médico tratante dentro del alcance de su sólido criterio médico. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier paciente u organismo particular dependerá de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de administración, vía de administración y velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
[0146]La cantidad de compuestos de la presente invención que se pueden combinar con los materiales portadores para producir una composición en una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Preferiblemente, las composiciones deben formularse de manera que se pueda administrar una dosis de entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/día del inhibidor a un paciente que recibe estas composiciones.
[0147]Dependiendo de la afección proliferativa particular o del cáncer a tratar, en las composiciones de esta invención también pueden estar presentes agentes terapéuticos adicionales, que normalmente se administran para tratar o prevenir esa afección. Tal como se utilizan en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que normalmente se administran para tratar o prevenir una afección proliferativa o cáncer particular se conocen como "apropiados para la enfermedad o afección que se está tratando". A continuación se proporcionan ejemplos de agentes terapéuticos adicionales.
[0148]La cantidad de agente terapéutico adicional presente en las composiciones de esta invención no será mayor que la cantidad que normalmente se administraría en una composición que comprende ese agente terapéutico como único agente activo. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones actualmente descritas oscilará entre aproximadamente el 50 % y el 100 % de la cantidad normalmente presente en una composición que comprende ese agente como el único agente terapéuticamente activo.
Usos de los compuestos y composiciones de la invención
[0149]En una forma de realización, la invención proporciona un método para sensibilizar una célula a un agente terapéutico o un estado patológico que induce una lesión del ADN que comprende el paso de poner en contacto la célula con uno o más inhibidores de ADN-PK de Fórmulas(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),(III-B-2),(IV),(V-A)y(V-B), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una forma de realización específica, los métodos de la invención emplean uno o más inhibidores de A<d>N-PK de Fórmulas(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1), y(III-B-2),o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0150]La invención proporciona además inhibidores de ADN-PK para su uso en métodos para potenciar un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer que comprende el paso de administrar a un individuo que lo necesita una cantidad eficaz del inhibidor de ADN-PK de(I),(II), (III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),(III-B-2),(IV),(V-A)y(V-B), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En una forma de realización específica, los métodos de la invención emplean uno o más inhibidores de ADN-PK de Fórmulas(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),y(III-B-2), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En un aspecto, el régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer incluye radioterapia.
[0151]Los compuestos de la invención son útiles en casos en los que la radioterapia está indicada para mejorar el beneficio terapéutico de dicho tratamiento. Además, la radioterapia frecuentemente está indicada como complemento de la cirugía en el tratamiento del cáncer. El objetivo de la radioterapia en el contexto adyuvante es reducir el riesgo de recurrencia y mejorar la supervivencia libre de enfermedad cuando el tumor primario ha sido controlado. La radioterapia adyuvante está indicada en varias enfermedades, incluidos los cánceres de colon, recto, pulmón, gastroesofágico y de mama, como se describe a continuación.
[0152]La invención también se puede practicar incluyendo otro agente quimioterapéutico anticancerígeno con un compuesto de la invención en un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer, con o sin radioterapia. La combinación de un compuesto inhibidor de ADN-PK de la invención con otros agentes similares puede potenciar el protocolo quimioterapéutico. Por ejemplo, el compuesto inhibidor de la invención se puede administrar con etopósido o bleomicina, agentes que se sabe que provocan la rotura de la cadena de ADN.
[0153]La invención se refiere además a radiosensibilizar células tumorales utilizando los compuestos de la invención, tales como inhibidores de ADN-PK de Fórmulas(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III- B-1)y(III-B-2), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos preferidos son aquellos descritos para las composiciones farmacéuticas de la invención. Un compuesto que puede "radiosensibilizar" una célula, como se usa en el presente documento, se define como una molécula, preferiblemente una molécula de bajo peso molecular, administrada a animales en una cantidad terapéuticamente eficaz para aumentar la sensibilidad de las células a la radiación electromagnética y/o para promover el tratamiento. de enfermedades que se pueden tratar con radiación electromagnética (p. ej., rayos X). Las enfermedades que se pueden tratar con radiación electromagnética incluyen enfermedades neoplásicas, tumores benignos y malignos y células cancerosas.
[0154]La presente invención también proporciona inhibidores de ADN-PK para uso en métodos de tratamiento del cáncer en un animal que incluye administrar al animal una cantidad eficaz del inhibidor de ADN-PK tal como, por ejemplo, un compuesto de la invención. La invención se dirige además a métodos para inhibir el crecimiento de células cancerosas, incluidos procesos de proliferación celular, invasividad y metástasis en sistemas biológicos. Los métodos incluyen el uso de un compuesto de la invención como inhibidor del crecimiento de células cancerosas. Preferiblemente, los métodos se emplean para inhibir o reducir el crecimiento de células cancerosas, la invasividad, la metástasis o la incidencia de tumores en animales vivos, tales como mamíferos. Los compuestos de la invención se pueden usar, solos o en combinación con el uso de RI o uno o más agentes quimioterapéuticos, para tratar el cáncer o inhibir el crecimiento de células cancerosas. Los métodos de la invención también son fácilmente adaptables para su uso en sistemas de ensayo, por ejemplo, analizando el crecimiento de células cancerosas y sus propiedades, así como para identificar compuestos que afectan el crecimiento de células cancerosas.
[0155]Los tumores o neoplasias incluyen crecimientos de células tisulares en los que la multiplicación de las células es descontrolada y progresiva. Algunos de estos crecimientos son benignos, pero otros se denominan "malignos" y pueden provocar la muerte del organismo. Las neoplasias malignas o "cánceres" se distinguen de los crecimientos benignos en que, además de exhibir una proliferación celular agresiva, pueden invadir los tejidos circundantes y metastatizar. Además, las neoplasias malignas se caracterizan por presentar una mayor pérdida de diferenciación (mayor "desdiferenciación") y de su organización entre sí y con los tejidos circundantes. Esta propiedad también se llama "anaplasia".
[0156]Las neoplasias tratables mediante la presente invención también incluyen tumores sólidos, es decir, carcinomas y sarcomas. Los carcinomas incluyen aquellas neoplasias malignas derivadas de células epiteliales que infiltran (invaden) los tejidos circundantes y dan lugar a metástasis. Los adenocarcinomas son carcinomas derivados del tejido glandular o de tejidos que forman estructuras glandulares reconocibles. Otra categoría amplia de cánceres incluye los sarcomas, que son tumores cuyas células están incrustadas en una sustancia fibrilar u homogénea como el tejido conectivo embrionario. La invención también permite el tratamiento de cánceres de los sistemas mieloide o linfoide, incluidas leucemias, linfomas y otros cánceres que normalmente no se presentan como una masa tumoral, sino que se distribuyen en los sistemas vascular o linforreticular.
[0157]La actividad de ADN-PK puede asociarse con diversas formas de cáncer en, por ejemplo, oncología de adultos y pediátrica, crecimiento de tumores sólidos/malignidades, carcinoma mixoide y de células redondas, tumores localmente avanzados, cáncer metastásico, sarcomas de tejidos blandos humanos, incluido el sarcoma de Ewing., metástasis de cáncer, incluyendo metástasis linfáticas, carcinoma de células escamosas, particularmente de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas de esófago, carcinoma oral, neoplasias malignas de células sanguíneas, incluyendo mieloma múltiple, leucemias, incluyendo leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica y leucemia de células pilosas, linfomas de derrame (linfomas basados en cavidades corporales), cáncer de pulmón con linfoma tímico, incluido el carcinoma de pulmón de células pequeñas, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer de la corteza suprarrenal, tumores productores de ACTH, cánceres de células no pequeñas, cáncer de mama, incluyendo carcinoma de células pequeñas y carcinoma ductal, cánceres gastrointestinales, incluyendo cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, pólipos asociados con neoplasia colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cánceres urológicos, incluyendo cáncer de vejiga, incluyendo tumores primarios superficiales de vejiga, carcinoma invasivo de células transicionales de la vejiga y cáncer de vejiga con invasión muscular, cáncer de próstata, neoplasias malignas del tracto genital femenino, incluido el carcinoma de ovario, neoplasias epiteliales peritoneales primarias, carcinoma cervical, cánceres de endometrio uterino, cáncer vaginal, cáncer de vulva, cáncer de útero y tumores sólidos en el folículo ovárico, neoplasias malignas del tracto genital masculino, incluidos cáncer testicular y cáncer de pene, cáncer de riñón, incluido carcinoma de células renales, cáncer de cerebro, incluidos tumores cerebrales intrínsecos, neuroblastoma, tumores cerebrales astrocíticos, gliomas, invasión de células tumorales metastásicas en el sistema nervioso central, cánceres de huesos, incluidos osteomas y osteosarcomas, cánceres de piel, incluido melanoma maligno, progresión tumoral de queratinocitos de la piel humana, cáncer de células escamosas, cáncer de tiroides, retinoblastoma, neuroblastoma, derrame peritoneal, maligno derrame pleural, mesotelioma, tumores de Wilms, cáncer de vesícula biliar, neoplasias trofoblásticas, hemangiopericitoma y sarcoma de Kaposi. La invención abarca los compuestos y sus sales farmacéuticamente aceptables y las composiciones farmacéuticas para su uso en métodos para potenciar el tratamiento de éstas y otras formas de cáncer.
[0158]La invención proporciona un método para inhibir la actividad de ADN-PK en una muestra biológica que incluye poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o composición de la invención. El término "muestra biológica", como se usa en el presente documento, significa una muestra fuera de un organismo vivo e incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material biopsiado obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos. La inhibición de la actividad quinasa, particularmente la actividad ADN-PK, en una muestra biológica es útil para una variedad de propósitos conocidos por un experto en la técnica. Ejemplos de tales propósitos incluyen, entre otros, almacenamiento de muestras biológicas y ensayos biológicos. En una forma de realización, el método para inhibir la actividad de ADN-PK en una muestra biológica se limita a métodos no terapéuticos.
[0159]En algunas formas de realización, esta divulgación proporciona métodos, composiciones y kits para editar un genoma objetivo, por ejemplo, corrigiendo una mutación. Dichos métodos, composiciones y kits pueden aumentar la eficiencia de la edición del genoma mediante el uso de un inhibidor de ADN-PK.
[0160]Un sistema de edición genómica puede estimular o inducir roturas del ADN, como DSB en el locus deseado en el genoma (o región genómica objetivo). La creación de la escisión del ADN hace que las enzimas celulares reparen el sitio de ruptura a través de la vía NHEJ propensa a errores o mediante la vía HDR libre de errores. En NHEJ, la lesión del ADN se repara fusionando los dos extremos de la rotura del ADN en una serie de procesos enzimáticos que involucran el heterodímero Ku70/80 y las enzimas proteína quinasa dependiente del ADN (ADN-PK). El mecanismo de reparación implica la unión y alineación de dos extremos del ADN, resección, elongación y ligadura (Rouet et al.; Dexheimer T. ADN Repair Paths and Mechanisms. En: Mathews L, Cabarcas S, Hurt E, editors. ADN Repair of Cancer Stem cell. Dordrecht: Springer; 2013. p. 19-32.) dando como resultado la formación de pequeñas mutaciones de inserción o deleción (indeles) en el sitio de ruptura. Los indeles introducidos en la secuencia codificante de un gen pueden causar codón de parada prematuro o mutaciones por cambio de marco que conducen a la producción de proteínas truncadas no funcionales. El mecanismo de la vía HDR se comprende menos e implica un conjunto diferente de proteínas reparadoras, como Rad51, que estimulan la invasión de la cadena mediante una plantilla de reparación del donante para la inserción de bases o el reemplazo de genes. Por lo tanto, HDR permite la introducción de una plantilla de ADN exógeno para obtener el resultado deseado de la edición de ADN dentro de un genoma y puede ser una estrategia poderosa para el modelado traslacional de enfermedades y la edición terapéutica del genoma para restaurar la función genética.
[0161]De las dos vías de reparación del ADN, NHEJ ocurre con una frecuencia mucho más alta y se pueden lograr informes de más del 70 % de eficiencia incluso en neuronas (Swiech et al., "In vivo interrogation of gene function in the mamíferon Brainusing CRISPR-Cas9”, Nat Biotechnol. Enero de 2015; 33(1):102-62014). Sin embargo, la corrección del gen HDR ocurre con una frecuencia muy baja y durante las fases S y G2, cuando se completa la replicación del ADN y las cromátidas hermanas están disponibles para servir como plantillas de reparación (Heyer et al., Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics 44:113-139, 2010). Dado que NHEJ ocurre durante todo el ciclo celular, en competencia y se favorece sobre HDR durante las fases S y G2, la inserción dirigida a través de la vía HDR sigue siendo un desafío y un foco de estudios continuos.
[0162]La ADN proteína quinasa (ADN-PK) desempeña un papel en varios procesos de reparación del ADN. ADN-PK participa en la reparación de roturas de la doble cadena del ADN mediante la activación de la vía de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Se cree que NHEJ procede a través de tres pasos: reconocimiento de los DSB, procesamiento del ADN para eliminar extremos no ligables u otras formas de daño en los extremos y, finalmente, ligadura de los extremos del ADN. El reconocimiento de la DSB se lleva a cabo mediante la unión del heterodímero Ku a los extremos irregulares del ADN, seguido del reclutamiento de dos moléculas de la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs) en los lados adyacentes de la DSB; esto sirve para proteger los extremos rotos hasta que se recluten enzimas de procesamiento adicionales. Datos recientes respaldan la hipótesis de que ADN-PKcs fosforila la enzima procesadora Artemisa, así como a sí mismo, para preparar los extremos del ADN para un procesamiento adicional. En algunos casos, es posible que se requiera ADN polimerasa para sintetizar nuevos extremos antes del paso de ligación. Se cree que la autofosforilación de ADN-PKcs induce un cambio conformacional que abre la cavidad central de unión del ADN, libera ADN-PKcs del ADN y facilita la nueva ligadura final de los extremos del ADN.
[0163]En algunas formas de realización, esta divulgación proporciona métodos, composiciones y kits para mejorar la edición de genes, en particular aumentando la eficiencia de la reparación de roturas de ADN a través de una vía HDR, o la eficiencia de inhibir o suprimir la reparación de roturas de ADN a través de una vía NHEJ, en sistemas de edición del genoma, incluida la reparación de HDR en células basada en CRISPR. Si bien no está sujeto a una teoría particular, se cree que un sistema de edición del genoma administrado a una(s) célula(s) interactúa(n) con uno(s) ácido(s) nucleico(s) del gen objetivo, dando como resultado o provocando una rotura del ADN; dicha rotura del ADN se repara mediante varias vías de reparación, por ejemplo, HDR, y un inhibidor de ADN-PK administrado a una(s) célula(s) inhibe, bloquea o suprime una vía de reparación de NHEJ, y la frecuencia o eficiencia de la vía de reparación del ADN de HDR puede ser aumentado o promovido.
[0164]La interacción entre un sistema de edición del genoma con uno o más ácidos nucleicos del gen objetivo puede ser la hibridación de al menos parte del sistema de edición del genoma con el o los ácidos nucleicos del gen objetivo, o cualquier otro reconocimiento de ácido(s) nucleico(s) del gen objetivo mediante el sistema de edición genone. En algunas formas de realización, dicha interacción es una interacción entre una proteína y un ADN o una hibridación entre pares de bases.
[0165]En algunas formas de realización, esta divulgación proporciona métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) mediante la administración a la(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK. La edición puede ocurrir simultánea o secuencialmente. La edición de una o más regiones genómicas objetivo incluye cualquier tipo de manipulación genética o ingeniería del genoma de una célula. En algunas formas de realización, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede incluir inserciones, eliminaciones o reemplazos de regiones genómicas en una(s) célula(s). Las regiones genómicas comprenden el material genético de una célula, como ADN, ARN, polinucleótidos y oligonucleótidos. Las regiones genómicas en una(s) célula(s) también comprenden los genomas de las mitocondrias o cloroplastos contenidos en una(s) célula(s).
[0166]En algunas formas de realización, las inserciones, eliminaciones o reemplazos pueden ser en una región genómica codificante o no codificante, en regiones intrónicas o exónicas, o cualquier combinación de las mismas, incluidos segmentos superpuestos o no superpuestos de los mismos. Como se usa en el presente documento, una "región no codificante" se refiere a regiones genómicas que no codifican una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las regiones no codificantes incluyen intrones. Las regiones codificantes se refieren a regiones genómicas que codifican una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, las regiones codificantes incluyen exones.
[0167]En algunas formas de realización, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede ocurrir en una o más regiones objetivo cualesquiera en un genoma de una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la edición de una o más regiones genómicas objetivo puede ocurrir, por ejemplo, en un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, en una región promotora, una región potenciadora, una región silenciadora, una región aislante, un antirepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (p. ej., poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción o cualquier combinación de los mismos.
[0168]En algunas formas de realización, la administración a una célula con un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica da como resultado una mayor eficiencia de edición del genoma dirigida en comparación con condiciones en las que un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica no se administran a una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la eficiencia de edición aumentada es de aproximadamente 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una(s) célula(s), o en comparación con una condición en la que solo se administra un genoma. Se administra a una célula un sistema de edición y no un inhibidor de ADN-PK. La eficacia de la edición genómica se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante cualquier método que determine la frecuencia de la integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de la mutagénesis dirigida. Las integraciones de polinucleótidos dirigidas también pueden dar como resultado la alteración o sustitución de una secuencia en un genoma, cromosoma o una región de interés en la cromatina celular. Las integraciones de polinucleótidos dirigidas pueden dar como resultado mutaciones dirigidas que incluyen, entre otras, mutaciones puntuales (es decir, conversión de un único par de bases en un par de bases diferente), sustituciones (es decir, conversión de una pluralidad de pares de bases en una secuencia diferente de longitud idéntica), inserciones de uno o más pares de bases, deleciones de uno o más pares de bases y cualquier combinación de las alteraciones de secuencia antes mencionadas.
[0169]En algunas formas de realización, los métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) implican administrar a la(s) célula(s) un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK. En algunas formas de realización, la(s) célula(s) están sincronizadas en la fase S o G2 del ciclo celular. La sincronización de la(s) célula(s) en la fase del ciclo celular S o G2 se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo no limitante, los agentes que pueden usarse para sincronizar una(s) célula(s) en la fase del ciclo celular S o G2 incluyen afidicolina, diroxiurea, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina o cualquier combinación de los mismos.(VerLin et al. "Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery," Elife.
15 de diciembre de 2014; 3). En algunas formas de realización, los agentes para la sincronización celular se pueden administrar en cualquier momento durante el proceso de edición de genes. En algunas formas de realización, una célula puede sincronizarse en la fase S o G2 del ciclo celular antes, durante o después de administrar a una célula un sistema de edición del genoma y/o un inhibidor de ADN-PK.
[0170]En algunas formas de realización, los métodos de edición de una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) mediante la administración a la(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una mayor supervivencia celular en comparación con las condiciones en las que un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK no se administraron a una(s) célula(s), o en comparación con condiciones en las que solo se contacta o se administra a una(s) célula(s) un sistema de edición de genes y no un inhibidor de ADN-PK.
[0171]En algunas formas de realización, en el presente documento se proporcionan métodos para reparar una rotura del<a>D<n>en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR. La administración a una(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK da como resultado una rotura del ADN de una región objetivo del genoma, y la rotura del ADN se repara posteriormente, al menos en parte, mediante una vía HDR. Estos métodos dan como resultado mayores cantidades de reparación mediada por HDR (p. ej., vía HDR) en una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una mayor eficiencia de reparación mediada por HDR en comparación con condiciones en las que se utilizan un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica. no administrado a una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la eficacia de la reparación de la rotura del ADN mediada por la vía HDR es aproximadamente 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una(s) célula(s), o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK. La eficacia de la reparación mediada por la vía HDR se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, determinando la frecuencia de la integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de la mutagénesis dirigida.
[0172]En algunas formas de realización, los métodos del presente documento proporcionan la reparación de la rotura del<a>D<n>aumentando la eficiencia de la vía HDR.
[0173]La vía HDR puede ser "canónica" o "alternativa". "HDR" (reparación dirigida por homología) se refiere a una forma especializada de reparación del ADN que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble hebra o de una muesca del ADN en una célula. La HDR de roturas de doble hebra se basa generalmente en la homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" como plantilla para la reparación de una molécula "objetivo" (p. ej., la que experimentó la rotura de doble hebra) y puede conducir a la transferencia de información genética. información del donante al objetivo. El HDR canónico de roturas de doble cadena se basa generalmente en BRCA2 y RAD51 y normalmente emplea una molécula donante de ADNbc. El HDR no canónico o "alternativo" es un mecanismo de HDR suprimido por genes BRCA2, RAD51 y/o relacionados funcionalmente. El HDR alternativo puede utilizar una molécula donante de ADN monocatenario o de ADN doble mellado. Véase, por ejemplo, WO 2014172458.
[0174]En algunas formas de realización, los métodos para reparar una rotura del ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR mediante la administración a la(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una mayor supervivencia celular en comparación con las condiciones en en las que un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK no se administran a una(s) célula(s), o en comparación con condiciones en las que sólo se administra un sistema de edición de genes a una(s) célula(s) y no un inhibidor de ADN-PK.
[0175]En algunas formas de realización, en el presente documento se proporcionan métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura del ADN en una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la inhibición o supresión de la reparación de una rotura del ADN mediada por NHEJ se realiza inhibiendo o suprimiendo la vía NHEJ. La vía NHEJ puede ser clásica ("canónica") o una vía NHEJ alternativa (alt-NHEJ, o unión de extremos mediada por microhomología (Mm EJ)). La vía NHEJ o vía alt-NHEJ se suprime en una célula administrando a una célula un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK.
[0176]La vía de reparación clásica de NHEJ es una vía de reparación de roturas de doble hebra del ADN en la que los extremos de la rotura de doble hebra se ligan sin una homología extensa. La reparación clásica de NHEJ utiliza varios factores, incluido el heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, Ligasa IV y la subunidad catalítica de las proteínas quinasas de ADN (ADN-PKcs). Alt-NHEJ es otra vía para reparar roturas de doble cadena. Alt-NHEJ utiliza una secuencia microhomóloga de 5 a 25 pares de bases durante la alineación de los extremos rotos antes de unirlos. Alt-NHEJ es en gran medida independiente del heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, Ligasa IV, subunidad catalítica de ADN proteína quinasas (ADN-PKcs), RAD52 y ERCC1.VéaseBennardo et al., "Alternative-NHEJ is a Mechanistically Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair", PLOS Genetics, 27 de junio de 2008.
[0177]En algunas formas de realización, los métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN a través de la ruta NHEJ en una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) al inhibir o suprimir la ruta NHEJ mediante la administración a una(s) célula(s) de un sistema de edición genómica y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una mayor eficiencia para inhibir o suprimir la reparación de la rotura del a Dn mediada por NHEJ en comparación con una célula que no ha recibido un sistema de edición genómica y un inhibidor de<a>D<n>-PK, o en comparación con una condición en la que una célula recibe un sistema de edición genómica y no un inhibidor de ADN-PK. En algunas formas de realización, la eficacia aumentada de inhibir o suprimir la reparación de una rotura del ADN a través de la vía NHEJ al poner en contacto una(s) célula(s) con un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma es aproximadamente 1 veces, 2 veces, 3- veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una(s) célula(s), o se compara con una condición en la que solo se administra a una(s) célula(s) un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK. La eficacia de inhibir o suprimir la reparación de una rotura del ADN a través de la vía NHEJ se puede medir mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, determinando la frecuencia de la integración de polinucleótidos dirigida o midiendo la frecuencia de la mutagénesis dirigida.
[0178]En algunas formas de realización, los métodos para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) mediante la inhibición o supresión de la vía NHEJ mediante la administración a una(s) célula(s) de una edición genómica. El sistema y un inhibidor de ADN-PK dan como resultado una mayor supervivencia celular en comparación con condiciones en las que un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK no se pusieron en contacto ni se administraron a una célula(s), o en comparación con condiciones en las que solo un sistema de edición de genes se contacta o se administra en una célula y no un inhibidor de ADN-PK.
[0179]La rotura del ADN puede ser una rotura bicatenaria (DSB) o dos roturas monocatenarias (p. ej., dos mellas en el ADN). El DSB puede tener extremos romos o tener un saliente de 5' o 3'; si cada uno de los hilos se separa demasiado, los salientes continuarán recociéndose entre sí y existirán como dos muescas, no como un DSB.
[0180]En algunas formas de realización, se proporcionan en el presente documento métodos para modificar la expresión de uno o más genes (un(os) gen(es) objetivo) y/o proteínas correspondientes o cadena abajo, mediante la administración a una(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor ADN-PK. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma puede crear, por ejemplo, inserciones, eliminaciones, reemplazos, modificaciones o alteraciones en una región genómica objetivo de un gen objetivo de la célula, lo que da como resultado una expresión modificada de gen(es) objetivo. En algunas formas de realización, la inserción, eliminaciones, reemplazo, modificación o alteración pueden dar como resultado la expresión dirigida de una proteína específica, o grupo de proteínas, o de proteínas posteriores. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, eliminaciones o reemplazos en regiones no codificantes o regiones codificantes. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, eliminaciones, reemplazos, modificaciones o alteraciones en una región promotora, región potenciadora y/o cualquier otro elemento regulador de genes, incluido un exón, un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, una región silenciadora, una región aislante, un antirepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (p. ej., poli A mínima), una región conservada, un sitio de unión del factor de transcripción o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma puede crear inserciones, eliminaciones, reemplazos, modificaciones o alteraciones en más de una región objetivo, de forma simultánea o secuencial. En algunas formas de realización, la administración a una(s) célula(s) con un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK puede permitir la expresión génica modificada dirigida en la(s) célula(s). Dicha expresión genética modificada dirigida puede conducir a la expresión de proteínas específicas y proteínas posteriores de las mismas.
[0181]En algunas formas de realización, la expresión de un gen y/o proteína aguas abajo se incrementa en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %,<80>%, 90 %, 1 vez, 1,5- veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con una condición en la que un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma no se administra a una(s) célula(s), o se compara con una condición en la que solo se administra a una(s) célula(s) un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK.
[0182]En algunas formas de realización, la expresión genética de un gen y/o proteína aguas abajo disminuye en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una(s) célula(s), o en comparación con una condición en la que solo se realiza la edición del genoma sistema y no un inhibidor de ADN-PK a una célula.
[0183]La célula de los métodos del presente documento puede ser cualquier célula. En algunas formas de realización, la célula es una célula de vertebrado. En algunas formas de realización, la célula de vertebrado es una célula de mamífero. En alguna forma de realización, la célula de vertebrado es una célula humana.
[0184]La célula puede ser cualquier tipo de célula en cualquier etapa de desarrollo. En algunas formas de realización, la célula puede ser una célula diferenciada, una célula madre totipotente, una célula madre pluripotente, una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria, una célula madre adulta, una célula precursora, una célula madre pluripotente inducida, o cualquier combinación de las mismas. Una célula diferenciada es una célula especializada que realiza una función específica en un tejido. Una célula madre totipotente es una célula indiferenciada de un embrión, feto o adulto que puede dividirse durante períodos prolongados y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de cualquiera de las tres capas germinales de un organismo. Una célula madre pluripotente es una célula indiferenciada de un embrión, feto o adulto que puede dividirse durante períodos prolongados y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de un organismo excepto tejido extraembrionario o placenta. Una célula madre embrionaria es una célula madre indiferenciada que se encuentra en la masa celular interna de un embrión y tiene la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula de cualquiera de las tres capas germinales. Una célula germinal embrionaria es una célula embrionaria que puede dar lugar a células reproductivas, como los espermatozoides o los óvulos. Una célula madre adulta es una célula indiferenciada que se encuentra en tejido diferenciado, es capaz de autorrenovarse y puede diferenciarse en cualquiera de las células del tejido en la que reside. Una célula precursora o progenitora es una célula parcialmente diferenciada que normalmente sólo puede diferenciarse en un tipo de célula (p. ej., una célula unipotente). Una célula madre pluripotente inducida es un tipo de célula madre pluripotente que se genera a partir de una célula adulta diferenciada o parcialmente diferenciada. Véase, por ejemplo, WO/2010/017562.
[0185]Tal como se utiliza en el presente documento, la forma singular "un", "una", "el" y "ella" incluye referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluidas mezclas de las mismas. Por ejemplo, "una o más células" y "una(s) célula(s)" se utilizan indistintamente en el presente documento. De manera similar, en el presente documento se utilizan indistintamente "una o más regiones genómicas objetivo" y "una o más regiones genómicas objetivo".
[0186]Los términos "aproximadamente" y "alrededor de" se utilizan indistintamente en el presente documento. El término "aproximadamente" o "alrededor de", aplicado a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas formas de realización, el término "aproximadamente" o "aproximadamente" se refiere a un rango de valores que caen dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %,<8>%, 7 %,<6>%, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del indicado valor de referencia a menos que se indique lo contrario o sea evidente del contexto (excepto cuando dicho número exceda el<100>% de un valor posible).
[0187]Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente. Se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos (ADN) o ribonucleótidos (ARN), o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, loci (locus) definidos a partir de análisis de ligamiento, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN de interferencias pequeña (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), microARN (miARN), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores. Un polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, se pueden impartir modificaciones a la estructura de nucleótidos antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede verse interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente marcador. El término "ADNmc" significa una molécula de ADN monocatenaria. El término "ODNmc" significa oligodesoxinucleótidos monocatenarios.
[0188]El término "nucleótidos naturales" al que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" al que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoseleloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforomidato y similares. Un oligonucleótido puede incluir un marcador para detección, si se desea.
[0189]El término "ARN sintético" se refiere a ARN diseñado o que no se produce de forma natural.
[0190]Tal como se utiliza en el presente documento, el término "tipo salvaje" es un término de la técnica entendido por personas expertas y significa la forma típica de un organismo, cepa, gen o característica tal como ocurre en la naturaleza, a diferencia de las formas mutantes o variantes.
[0191]Los términos "que no ocurren naturalmente" o "diseñados" se usan indistintamente e indican la participación de la mano del hombre. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que están asociados naturalmente en la naturaleza y tal como se encuentran en la naturaleza.
[0192]"Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar enlaces de hidrógeno con otro ácido nucleico ya sea mediante Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que pueden formar enlaces de hidrógeno (p. ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (p. ej., 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10, siendo 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 % complementarios). "Perfectamente complementario" significa que todos los residuos contiguos de una secuencia de ácido nucleico formarán enlaces de hidrógeno con el mismo número de residuos contiguos en una segunda secuencia de ácido nucleico. "Sustancialmente complementario" como se usa en el presente documento se refiere a un grado de complementariedad que es al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones estrictas.
[0193]Como se usa en el presente documento, "expresión" se refiere al proceso mediante el cual un polinucleótido se transcribe a partir de una plantilla de ADN (tal como en ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso mediante el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Las transcripciones y los polipéptidos codificados pueden denominarse colectivamente "producto genético". Si el polinucleótido deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota.
[0194]Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación, tal como conjugación con un componente marcador. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aminoácido" incluye aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos.
[0195]Un "vector viral" se define como un virus o partícula viral producido de forma recombinante que comprende un polinucleótido que se administrará en una célula huésped, ya sea in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores adenovirales, vectores lentivirales, vectores virales del herpes simple y vectores virales quiméricos y similares. En algunas formas de realización en las que la transferencia de genes está mediada por un vector retroviral, una construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo.
[0196]Algunas formas de realización de la divulgación se refieren a sistemas de vectores que comprenden uno o más vectores, o vectores como tales. Se pueden diseñar vectores para la expresión de transcritos CRISPR (p. ej., transcritos de ácidos nucleicos, proteínas o enzimas) en células procarióticas o eucariotas. Por ejemplo, los transcritos CRISPR se pueden expresar en células bacterianas como Escherichia coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamíferos.
[0197]Las células pueden ser células primarias, células madre pluripotentes inducidas (CMPi), células madre embrionarias (hESC), células madre adultas, células progenitoras o líneas celulares. Las "células primarias" son células extraídas directamente de tejido vivo y colocadas in vitro para su crecimiento. Las células primarias tienen pocas duplicaciones de población y tienen una vida útil finita para las duplicaciones de población in vitro. Las "células madre", las "células madre embrionarias" y las "células madre pluripotentes inducidas" son células no especializadas e indiferenciadas capaces de autorrenovarse y que tienen el potencial de diferenciarse en células de diferentes tipos con funciones especializadas. Las "líneas celulares" incluyen cultivos celulares que se derivan de un tipo de célula o de un conjunto de células del mismo tipo que pueden proliferar indefinidamente. Los ejemplos no limitantes de líneas celulares de mamíferos pueden incluir células c D34, células 293, células HEK, células CHO, células BHK, células CV-1, células Jurkat, células HeLa o cualquier variante de las mismas.
[0198]En algunas formas de realización, un vector es capaz de impulsar la expresión de una o más secuencias en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 y pMT2PC. Cuando se utiliza en células de mamíferos, las funciones de control del vector de expresión normalmente las proporcionan uno o más elementos reguladores. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados se derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus, virus simio 40 y otros descritos en el presente documento y conocidos en la técnica. Otros promotores pueden incluir, por ejemplo, el promotor EF 1 o el promotor EF 1 alfa. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procarióticas como eucariotas,véanse,por ejemplo, los Capítulos 16 y 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.
[0199]Como se usa en el presente documento, los términos "marcado" o "marcado" se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o calorimétricos). En determinadas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. Se conocen en la técnica y pueden usarse diversos métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos). En algunas formas de realización, las etiquetas están unidas mediante brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el posible impedimento estérico. El término "agente o fármaco farmacéutico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
[0200]Como se usa en el presente documento, "sustancialmente puro" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en términos molares es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas formas de realización, una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
[0201]Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En algunas formas de realización, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y 99 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En algunas formas de realización, la especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se detectan en la composición mediante métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Sistema de edición del genoma
[0202]Se pueden utilizar varios tipos de sistemas de ingeniería genómica. Los términos "sistema de edición del genoma", "sistema de edición de genes" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un sistema o tecnología que edita un gen objetivo o la función o expresión del mismo. Un sistema de edición del genoma comprende: al menos un componente de endonucleasa que permite la escisión de una(s) región(es) genómica(s) objetivo (o secuencia(s) objetivo); y al menos un elemento de direccionamiento al genoma que lleva o dirige el componente de endonucleasa a una región genómica objetivo. Los ejemplos de elemento de direccionamiento al genoma incluyen un dominio de unión al ADN (p. ej., proteína de unión al<a>D<n>con dedos de zinc o un dominio de unión al ADN TALE), elementos de ARN guía (p. ej., a Rn guía CRISPR) y elementos de ADN guía (p. ej., ARN guía NgAgo). Los elementos de endonucleasa y orientación genómicas programables permiten una edición precisa del genoma mediante la introducción de roturas del ADN, como roturas de doble hebra (DSB) en loci genómicos específicos. Posteriormente, los DSB reclutan maquinaria de reparación endógena para la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR) al sitio DSB para mediar en la edición del genoma. El "componente endonucleasa" comprende una endonucleasa o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicha endonucleasa.
[0203]El término "endonucleasa" se refiere a cualquier enzima de tipo salvaje, mutante, variante o modificada genéticamente capaz de catalizar la hidrólisis (escisión) de un enlace entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN. Las endonucleasas pueden reconocer y escindir una molécula de ADN o ARN en sus regiones genómicas objetivo. Ejemplos de endonucleasas incluyen una endonucleasa localizada; enzima de restricción tal como FokI; una nucleasa quimérica con dedos de zinc (ZFN) resultante de la fusión de dominios con dedos de zinc diseñados con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como FokI; enzimas Cas y enzimas Cpf. Las endonucleasas químicas en las que un elemento de escisión químico o peptídico se conjuga con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia objetivo específica, dirigiendo así la actividad de escisión a una secuencia específica, están comprendidas en el término "endonucleasa". Ejemplos de enonucleasas químicas incluyen nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula que escinde el ADN, y oligonucleótidos formadores de triplex (TFO).
[0204]Por "variante" se entiende una proteína recombinante obtenida mediante la sustitución de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la proteína original por un aminoácido diferente.
[0205]En algunas formas de realización, las endonucleasas tales como ZFN, TALEN y/o meganucleasas comprenden un dominio de escisión y/o un medio dominio de escisión. El dominio de escisión puede ser homólogo o heterólogo del dominio de unión al ADN. Por ejemplo, se pueden usar un dominio de unión a ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión a ADN de meganucleasa y un dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos pueden obtenerse a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas ejemplares de las que se puede derivar un dominio de escisión incluyen, entre otras, endonucleasas de restricción y endonucleasas homing. Véase, por ejemplo, WO2013/130824. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (p. ej., nucleasa S1; nucleasa de frijol mungo; ADNasa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa HO de levadura; véase también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) pueden usarse como fuente de dominios de escisión y semidominios de escisión.
[0206]Un semidominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se establece anteriormente, que requiera dimerización para la actividad de escisión. En algunas formas de realización, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. En algunas formas de realización, se puede utilizar una única proteína que comprende dos semidominios de escisión. En algunas formas de realización, los dos semidominios de escisión pueden derivar de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma). En algunas formas de realización, cada semidominio de escisión puede derivar de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios objetivo para las dos proteínas de fusión están dispuestos preferentemente, uno con respecto al otro, de manera que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios objetivo coloca los semidominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permite la semidominios de escisión para formar un dominio de escisión funcional, por ejemplo, mediante dimerización. Por tanto, en determinadas formas de realización, los bordes cercanos de los sitios objetivo están separados por 5-50 nucleótidos, 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Cabe señalar que cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede intervenir entre dos sitios objetivo (p. ej., de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En algunas formas de realización, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios objetivo.
[0207]Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse de forma específica a una secuencia al ADN (en un sitio de reconocimiento) y escindir el ADN en el sitio de unión o cerca de él. Ciertas enzimas de restricción (p. ej., tipo IIS) escinden el ADN en sitios eliminados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima Fok I de tipo IIS cataliza la escisión del ADN de doble cadena. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Nacional. Acad. Sci. EE.<u>U. 89:4275-4279; Li y col. (1993) Proc. Nacional. Acad. Sci. EE. UU. 90:2764-2768; Kim y cols. (1994a) Proc. Nacional. Acad. Sci. EE. UU. 91:883-887; Kim y cols. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982.
[0208]En algunas formas de realización, el componente de endonucleasa comprende una(s) proteína(s) de fusión que incluyen un dominio de escisión (o medio dominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión a dedos de zinc, que pueden o no diseñarse. Una enzima de restricción de tipo IIS ejemplar, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaíte et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 95: 10.570-10.575. La porción de la enzima Fok I utilizada en tales proteínas de fusión se considera un semidominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando fusiones con dedos de zinc o TALE-Fok I, se pueden usar dos proteínas de fusión, cada una de las cuales comprende un medio dominio de escisión FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede usar una única molécula polipeptídica que contiene un dominio de unión con dedos de zinc y dos semidominios de escisión de Fok I.
[0209]Enzimas de restricción de tipo IIS ejemplares se describen en la publicación internacional WO 07/014275. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos están contemplados en la divulgación. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.
[0210]En ciertas formas de realización, el dominio de escisión comprende uno o más semidominios de escisión diseñados (también denominados mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de patentes de EE. UU. Nos 20050064474 y 20060188987 y WO 2013/130824. Los semidominios de escisión diseñados a modo de ejemplo de Fok I que forman heterodímeros obligados incluyen un par en el que un primer semidominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de Fok I y un segundo semidominio de escisión incluye mutaciones en los aminoácidos. residuos 486 y 499. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. N° 2008/0131962 y 2011/0201055. Los semidominios de escisión diseñados en este documento se pueden preparar usando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida de semidominios de escisión de tipo salvaje (Fok I) como se describe en las publicaciones de patentes de EE. UU. Nos 20050064474 y 20080131962.
[0211]El término "edición", "ediciones", "editar" y similares se refieren a cualquier tipo de ingeniería, alteración, modificación o modulación (en cada caso que incluye, entre otros, mediante eliminación genética, etiquetado genético, alteración genética, mutación genética, inserción genética, deleción genética, activación genética, silenciamiento genético o knock-in genético).
[0212]Como se usa en el presente documento, "modificación genética", "edición del genoma", "modificación del genoma", "modificación genética" y "edición genética" se refieren a cualquier adición, deleción, knock-out, knock-in, etiquetado, mutación, activación, silenciamiento, modificación y/o alteración de los nucleótidos de una célula. La célula en este contexto puede serin vitro, in vivo o ex vivo.
[0213]Por "región genómica objetivo", "gen objetivo", "objetivo de ADN", "secuencia objetivo de ADN", "secuencia objetivo", "secuencia de nucleótidos objetivo", "sitio objetivo", "objetivo", "sitio de interés", "sitio de reconocimiento", "sitio de reconocimiento de polinucleótidos", "secuencia de reconocimiento", "sitio de escisión" se refieren a una secuencia de polinucleótidos que es reconocida y escindida por un sistema de edición del genoma. Estos términos se refieren a una ubicación distinta del ADN, preferiblemente una ubicación genómica, en la que el sistema de edición del genoma debe inducir una rotura (escisión) del ADN.
[0214]La edición antes mencionada, incluida la ingeniería, alteración, modificación y modulación, puede realizarse de forma simultánea o secuencial. Se puede utilizar cualquier sistema de edición del genoma conocido en la técnica. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa de dedos de zinc (ZFN), un sistema basado en nucleasa basado en efector similar a un activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.
[0215]Los basados en meganucleasa, los basados en ZFN y los basados en TALEN comprenden cada uno al menos un dominio de unión al ADN o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican el dominio de unión al ADN, y logran un direccionamiento o reconocimiento específico de una(s) región(es) genómica(s) objetivo a través de interacciones proteína-ADN. Un sistema basado en CRISPR comprende al menos un elemento de<a>R<n>guía o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de ácido nucleico que codifican el elemento de ARN guía, y logra un direccionamiento o reconocimiento específico de una(s) región(es) genómica(s) objetivo mediante pares de bases directamente con el ADN de la(s) región(es) genómica(s) objetivo. Un sistema basado en NgAgo comprende al menos un elemento de ADN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el elemento de ADN guía, y logra el direccionamiento o reconocimiento específico de una región genómica objetivo a través de pares de bases directamente con el ADN de la(s) región(es) genómica(s) objetivo.
[0216]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasa. Un sistema basado en meganucleasas emplea meganucleasas que son endonucleasas con sitios de reconocimiento grandes (>14 pb), y sus dominios de unión al ADN también son responsables de la escisión de secuencias objetivo. El dominio de unión al ADN de las meganucleasas puede tener una secuencia objetivo de ADN bicatenario de 12 a 45 pb. En algunas formas de realización, la meganucleasa es una enzima dimérica, en la que cada dominio de meganucleasa está en un monómero, o una enzima monomérica que comprende los dos dominios en un único polipéptido. Mediante ingeniería de proteínas se han generado no sólo meganucleasas de tipo salvaje, sino también varias variantes de meganucleasas para cubrir una gran variedad de combinaciones de secuencias únicas. En algunas formas de realización, también se pueden usar meganucleasas quiméricas con un sitio de reconocimiento compuesto por un medio sitio de meganucleasa A y un medio sitio de proteína B. Ejemplos específicos de tales meganucleasas quiméricas que comprenden los dominios proteicos de I-DmoI e I-CreI. Ejemplos de meganucleasas incluyen endonucleasas dirigidas de la familia LAGLIDADG.
[0217]La meganucleasa LAGLIDADG puede ser I-SceI, I-ChuI, I-Crel, I-CsmI, PI-SceI, PI-TliI, PI-MtuI, I-CeuI, I-SceII, 1-SceIII, HO, PI-CivI, PI-CtrI, PI-AaeI, PI-BsuI, PI-DhaI, PI-DraI, PI-MavI, PI-MchI, PI-MfuI, PI-MflI, PI-MgaI, PI-MgoI, PI-MinI, PI -MkaI, PI-MleI, PI-MmaI, PI-MshI, PI-MsmI, PI-MthI, PI-MtuI, PI-MxeI, PI-NpuI, PI-PfuI, PI-RmaI, PI-SpbI, PISspI, PI -FacI, PI-MjaI, PI-PhoI, PI-TagI, PI-ThyI, PI-TkoI, PI-TspI o I-MsoI; o puede ser un mutante funcional o una variante del mismo, ya sea homodimérico, heterodimérico o monomérico. En algunas formas de realización, la meganucleasa LAGLIDADG es un derivado de I-CreI. En algunas formas de realización, la meganucleasa LAGLIDADG comparte al menos un 80 % de similitud con la meganucleasa I-CreI LAGLIDADG natural. En algunas formas de realización, la meganucleasa LAGLIDADG comparte al menos un 80 % de similitud con los residuos 1-152 de la meganucleasa I-CreI LAGLIDADG natural. En algunas formas de realización, la meganucleasa LAGLIDADG puede consistir en dos monómeros que comparten al menos un 80 % de similitud con los residuos 1-152 de la meganucleasa I-CreI LAGLIDADG natural unidos entre sí, con o sin un péptido conector.
[0218]La "meganucleasa LAGLIDADG" se refiere a una endonucleasa homing de la familia LAGLIDADG, como se define en Stoddard et al (Stoddard, 2005), o una variante diseñada que comprende un polipéptido que comparte al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97,5 %, 99 % o más de identidad o similitud con dicha endonucleasa de localización natural. Estas meganucleasas LAGLIDADG diseñadas pueden derivarse de meganucleasas monoméricas o diméricas. Cuando se derivan de meganucleasas diméricas, dichas meganucleasas LAGLIDADG diseñadas pueden ser endonucleasas monocatenarias o diméricas.
[0219]Por "I-CreI" se entiende la meganucleasa I-CreI natural de tipo salvaje que tiene la secuencia del código de acceso de pdb 1g9y.
[0220]Las funciones de reconocimiento y escisión del ADN de las meganucleasas generalmente están entrelazadas en un solo dominio. A diferencia de las meganucleasas, los dominios de unión al ADN de los sistemas basados en ZFN y TALEN son distintos de la endonucleasa para la función de escisión. El sistema basado en ZFN comprende: al menos una proteína con dedos de zinc o una variante de la misma, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína más fina de zinc o una variante de la misma como su dominio de unión al ADN; y un elemento endonucleasa, tal como nucleasa con dedos de zinc (ZFN) o dominio de escisión Fok1. La proteína buscadora de zinc (ZFP) no se produce de forma natural porque está diseñada para unirse a un sitio objetivo de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ana. Rev. Biochem.
70:313-340; Isalan y otros. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct Biol. 10:411-416; Patentes de EE. UU. Nos 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y Publicaciones de Patentes de EE. UU. Nos 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
[0221]Un dominio de unión con dedos de zinc diseñado puede tener una especificidad de unión novedosa, en comparación con una proteína con dedos de zinc natural. Los métodos de ingeniería incluyen, entre otros, diseño racional y varios tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos de dedos de zinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos triplete o cuadruplete está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen al triplete particular o secuencia cuádruple. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses de copropiedad 6.453.242 y 6.534.261.
[0222]Se pueden utilizar varios tipos de métodos de selección con los métodos del presente documento. Se describen métodos de selección ejemplares, que incluyen presentación en fagos y sistemas de dos híbridos, en las patentes de EE. UU. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como el documento WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, se ha descrito una mejora de la especificidad de unión para los dominios de unión con dedos de zinc, por ejemplo, en el documento WO 02/077227. Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios con dedos de zinc y/o las proteínas con dedos de zinc múltiples se pueden unir entre sí, usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse también las patentes estadounidenses números 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Selección de sitios objetivo; los expertos en la técnica conocen las ZFP y los métodos para el diseño y construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que las codifican) y se describen en detalle en las patentes estadounidenses números 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.
[0223]Además, como se describe en estas y otras referencias, los dominios de dedos de zinc y/o las proteínas de dedos de zinc múltiples pueden unirse entre sí usando cualquier secuencia conectora adecuada, incluyendo, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse también las patentes estadounidenses números 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias enlazadoras ejemplares de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.
[0224]Un sistema de nucleasa basado en efector similar al activador de la transcripción (TALEN) se refiere a un sistema de edición del genoma que emplea uno o más dominios de unión al ADN efector similar al activador de la transcripción (TALE) y un elemento de endonucleasa, como el dominio de escisión Fok1. El dominio de unión a ADN-TALE comprende una o más unidades repetidas TALE, cada una de las cuales tiene 30-38 (tal como 31, 32, 33, 34, 35 o 36) aminoácidos de longitud. El dominio de unión TALE-ADN puede emplear una proteína TALE de longitud completa o un fragmento de la misma, o una variante de la misma. El dominio de unión a TALE-ADN puede fusionarse o unirse al dominio de endonucleasa mediante un conector.
[0225]Los términos "sistema basado en CRISPR", "sistema de edición de genes basado en CRISPR", "edición del genoma CRISPR", "edición de genes CRISPR", "edición del genoma basada en endonucleasa CRISPR" y similares se usan indistintamente en el presente documento, y se refieren colectivamente a un sistema de edición del genoma que comprende uno o más elementos de ARN guía; y uno o más elementos de endonucleasa guiada por ARN. El elemento de ARN guía comprende un ARN objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN objetivo. El elemento de endonucleasa guiada por ARN comprende una endonucleasa que es guiada o llevada a una región genómica objetivo mediante un elemento de ARN guía; o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican dicha endonucleasa. Ejemplos del sistema de edición de genes basada en CRISPR incluyen un sistema basado en CRISPR, es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.
[0226]Como se usan en el presente documento, los términos "elemento de ARN guía", "ARN guía", "ARNg", "molécula de ARNg" y "ARN guía sintético" se usan indistintamente y se refieren a la secuencia de polinucleótidos que comprende un ARN objetivo que se hibrida con una secuencia nucleica objetivo o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el ARN objetivo. Un ARN objetivo de ARNg comprende un dominio objetivo que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótidos en una región genómica objetivo. La frase "sustancialmente complementario" significa un grado de complementariedad que es al menos del 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos, o se refiere a dos ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones estrictas.
[0227]Un elemento de ARN guía puede comprender además un ARN activador que es capaz de hibridar con el ARN objetivo, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador. El ARN activador y el ARN objetivo pueden separarse o fusionarse como un único ácido nucleico mediante una secuencia de bucle conector para formar una única molécula de ARNg. Una molécula de ARNg puede comprender varios dominios. Por ejemplo, dicho ARNg comprende, por ejemplo, de 5' a 3': un dominio de direccionamiento (que es complementario a un ácido nucleico objetivo); un primer dominio de complementariedad; un dominio de enlace; un segundo dominio de complementariedad (que es complementario al primer dominio de complementariedad); un dominio proximal; y, opcionalmente, un dominio de cola.VerWO2015048557.
[0228]Un "primer dominio de complementariedad" tiene una complementariedad sustancial con el segundo dominio de complementariedad y puede formar una región dúplex bajo al menos algunas condiciones fisiológicas.
[0229]Un "dominio de enlace" sirve para unir el primer dominio de complementariedad con el segundo dominio de complementariedad de un ARNg unimolecular. El dominio de enlace puede unir el primer y el segundo dominios de complementariedad de forma covalente o no covalente.
[0230]Un "dominio proximal" puede tener una longitud de 3 a 25 nucleótidos o de 5 a 20 nucleótidos de longitud. El dominio proximal puede compartir homología con o derivar de un dominio proximal de origen natural.
[0231]Un "dominio de cola" puede estar ausente o tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud. El dominio de cola puede incluir secuencias que son complementarias entre sí y que, al menos en algunas condiciones fisiológicas, forman una región dúplex.
[0232]El elemento de ARN guía puede formar un complejo con una endonucleasa del elemento de endonucleasa guiada por<a>R<n>, tal como la endonucleasa Cas ("complejo de ARNg/nucleasa"). Un ejemplo de complejo de ARNg/nucleasa es un complejo CRISPR como se describe a continuación con respecto a un sistema basado en CRISR. En algunas formas de realización, el complejo CRISPR comprende una endonucleasa del sistema de endonucleasa guiada por ARN que forma complejo con el ARN objetivo. En algunas formas de realización, el complejo CRISPR comprende una endonucleasa del sistema de endonucleasa guiada por ARN que forma complejo con el ARN objetivo y el ARN activador.
[0233]El dominio de direccionamiento del ARN objetivo promueve el direccionamiento específico o la localización de un complejo de ARNg/nucleasa en una secuencia de nucleótidos objetivo. En algunas formas de realización, el dominio de direccionamiento puede ser de 10 a 30 pb, tal como de 15 a 25 pb, de 18 a 22 pb o de 20 pb.
[0234]En la técnica se conocen métodos para diseñar ARNg, incluidos métodos para seleccionar, diseñar y validar el dominio objetivo. Véase, por ejemplo, WO2015048577, Mali et al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826; Hsu et al., 2013 NATBIOTECHNOL, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 NATBIOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PMID de PubMed: 24463574; Heigwer et al., 2014 NAT METHODS 11 (2): 122-3. doi: 10,1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 BIOINFORMATICS Pub Med PMID: 24389662.
[0235] En algunas formas de realización, se pueden usar endonucleasas guiadas por ARN, tales como una enzima o proteína Cas (p. ej., proteína Cas9 de tipo II) o una enzima o proteína Cpf (p. ej., proteína Cpfl). En algunas formas de realización, también se puede usar una versión modificada de dicha enzima o proteína Cas o Cpf.
[0236] En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas. El sistema CRISPR-Cas comprende: (a) al menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, comprendiendo el elemento de ARN guía un ARN objetivo que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo, y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con el ARN objetivo; y (b) un elemento proteico Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas. El ARN objetivo y los ARN activadores pueden estar separados o fusionados en un solo ARN.
[0237] En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR incluye sistemas CRISPR de Clase 1 y/o CRISPR de Clase 2. Los sistemas de Clase 1 emplean varias proteínas Cas junto con ARN CRISPR (ARNcr) como a Rn objetivo para construir una endonucleasa funcional. Los sistemas CRISPR de clase 2 emplean una única proteína Cas y un ARNcr como ARN objetivo. Los sistemas CRISPR de Clase 2, incluido el sistema basado en Cas9 de tipo II, comprenden una única proteína Cas para mediar en la escisión en lugar del complejo de múltiples subunidades empleado por los sistemas de Clase 1. El sistema basado en CRISPR también incluye un sistema CRISPR de Clase II, Tipo V que emplea una proteína Cpfl y un ARNcr como ARN objetivo.
[0238] La proteína Cas es una nucleasa bicatenaria asociada a CRISPR (Cas). En algunas formas de realización, el sistema CRISPR-Cas comprende una proteína Cas9. En algunas formas de realización, la proteína Cas9 es SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o nickasa D10A. El término "proteína Cas", tal como proteína Cas9, incluye proteína Cas de tipo salvaje o derivados funcionales de la misma (tales como versiones truncadas o variantes de la proteína Cas de tipo salvaje con actividad nucleasa).
[0239] En algunas formas de realización, se pueden usar proteínas Cas9 de especies distintas de S.pyogenesy S.thermophiles.Entre las especies de proteína Cas9 adicionales que se pueden obtener y utilizar en el presente documento se incluyen:Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp.,cycliphilus denitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus; Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus Puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfingens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium dolichum, Corynebacterium matruchotii, obacter shibae, Eubacterium dolichum, gamma proteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemoplzilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicohacter cinaedi, Helicobacter mustelae, llyobacter polytropus, Kingella kingae, lactobacillus crispatus, listeria ivanovii, listeria monocytogenes, bacteria listeriaceae, Methylocystis sp., Metilosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutells, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonassp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp o Verminephrobacter eiseniae.
[0240] En algunas formas de realización, uno o más elementos de un sistema basado en CRISPR se derivan de un sistema CRISPR de tipo I, tipo II o tipo III.
[0241] En algunas formas de realización, uno o más elementos de un sistema basado en CRISPR se derivan de un organismo particular que comprende un sistema CRISPR endógeno, tal comoStreptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Prevotella sp., Acidaminococcus sp.yLachnospiraceae sp.En general, un sistema basado en CRISPR se caracteriza por elementos que promueven la formación de un complejo CRISPR en las regiones genómicas objetivo o en el sitio de una secuencia objetivo (también denominado protoespaciador en el contexto de un sistema CRISPR endógeno). En el contexto de la formación de un complejo CRISPR, "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia para la cual se diseña una secuencia guía para que tenga una complementariedad sustancial, donde la hibridación entre una secuencia objetivo y una secuencia guía promueve la formación de un complejo CRISPR. No se requiere necesariamente una complementariedad total, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CRISPR. Una secuencia objetivo puede comprender cualquier polinucleótido, tal como polinucleótidos de ADN o ARN. En algunas formas de realización, una secuencia objetivo está ubicada en el núcleo o citoplasma de una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la secuencia objetivo puede estar dentro de un orgánulo de una(s) célula(s) eucariótica(s), por ejemplo, mitocondria o cloroplasto.
[0242] Una secuencia o plantilla que puede usarse para la recombinación en el locus objetivo que comprende las secuencias objetivo se denomina "plantilla de edición" o "polinucleótido de edición" o "secuencia de edición". Un polinucleótido molde exógeno puede denominarse molde de edición o molde donante. En algunas formas de realización, se puede usar ADN monocatenario y ADN bicatenario de origen sintético o biológico. A modo de ejemplo no limitante, las plantillas de edición adecuadas incluyen ODNmc, ODNbc, productos de PCR, plásmidos y virus que incluyen VAA, adenovirus, retrovirus, lentivirus, etc. También son posibles plantillas de edición adicionales. En algunas formas de realización, la recombinación es una recombinación homóloga.
[0243]En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas9. El ARN objetivo del sistema CRISPRCas9 comprende un ARN dirigido a CRISPR (ARNcr) y el ARN activador del sistema CRISPR-Cas 9 comprende un ARN CRISPR transactivador (tracARN). El elemento proteico Cas del sistema CRISPR-Cas9 emplea una proteína Cas9. El ARNcr y el ARNtrac pueden separarse o combinarse en una única construcción de ARN mediante una secuencia de bucle conector. Esta construcción de ARN combinada se denomina ARN de guía única (ARNg o ARN guía).
[0244]Con respecto a la información general sobre los sistemas CRISPR-Cas, sus componentes y la entrega de dichos componentes, incluidos métodos, materiales, vehículos de entrega, vectores, partículas, VAA y su fabricación y uso, incluidas las cantidades y formulaciones, se puede encontrar en: Patentes de EE. UU. Nos 8.999.641, 8.993.233, 8.945.839, 8.932.814, 8.906.616, 8.895.308, 8.889.418, 8.889.356, 8.871.445, 8.865.406, 65, 8.771.945 y 8.697.359; Publicaciones de patentes de EE. UU. US 2014-0310830, US 2014-0287938 A1, US 2014-0273234 A1, US2014-0273232 A1, US 2014-0273231, US 2014-0256046 A1, US 2014-0248702 A1, US 2014-0242700 A1, EE. UU. 2014-0242699 A1, EE. UU. 2014-0242664 A1, EE. UU. 2014-0234972 A1, EE. UU. 2014-0227787 A1, EE. UU. 2014-0189896 A1, EE. UU.
2014-0186958, EE. UU. 2014-0186919 A1, EE. UU. 43 A1, EE. UU. 2014-0179770 A1 y US 2014-0179006 A1, US 2014 0170753; las patentes europeas EP 2 784 162 B1 y EP 2 771 468 B1; solicitudes de patente europea EP 2 771 468 (EP13818570.7), EP 2 764 103 (EP13824232.6) y EP 2 784 162 (EP14170383.5); y Publicaciones de Patentes PCT Publicaciones de Patentes PCT WO 2014/093661, WO 2014/093694, WO 2014/093595, WO 2014/093718, WO 2014/093709, WO 2014/093622, WO 2014/093635, WO 2014/093655, WO 2014/093712, WO2014/093701, WO2014/018423, WO 2014/204723, WO 2014/204724, WO 2014/204725, WO 2014/204726, WO 2014/204727, WO 2014/204728, WO 2014/204729 y WO 2016/028682.
[0245]En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf. El "sistema CRISPR-Cpf' comprende: (a) al menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, comprendiendo el ARN guía un ARN objetivo que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a un nucleótido secuencia en un locus del ácido nucleico objetivo; y (b) un elemento proteico Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el elemento proteico Cpf.
[0246]Un ejemplo de un elemento proteico Cpf incluye nucleasas Cpfl, tales comoFrancisellaCpfl (FnCpf1) y cualquier variante de la misma. Véase, por ejemplo, Zetsche et al., "Cpfl is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system", Cell, 163(3): páginas 759-71; y Fonfara et al., "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpfl also processes precursor c RiSp R RNA", Nature 532 (7600): páginas, 517-21. La PAM preferida de Cpf1 es 5'-TTN, que se diferencia de la de Cas9 (3'-NGG) tanto en la ubicación genómica como en el contenido de GC. Es posible que el sistema CRISPR-Cpf no emplee un ARN activador (traARNcr). Tanto Cpfl como sus ARN guía son, en general, más pequeños que sus homólogos SpCas9. El locus Cpfl contiene un dominio alfa/beta mixto, un RuvC-I seguido de una región helicoidal, un RuvC-II y un dominio similar a un dedo de zinc. La proteína Cpfl tiene un dominio de endonucleasa similar a RuvC que es similar al dominio RuvC de Cas9. Además, Cpfl no tiene un dominio de endonucleasa HNH y el N-terminal de Cpfl no tiene el lóbulo de reconocimiento alfa-helicoidal de Cas9. Los loci Cpfl codifican proteínas Cas1, Cas2 y Cas4 más similares a los tipos I y III que a los sistemas de tipo II. Las proteínas de la familia Cpfl se pueden encontrar en muchas especies bacterianas.
[0247]Sin estar vinculado a una teoría particular, el sistema CRISPR-Cpf emplea un complejo Cpfl-ARNcr que escinde el ADN o ARN objetivo mediante la identificación de un motivo adyacente al protoespaciador 5'-YTN-3-(donde "Y" es una pirimidina y "N" es cualquier nucleobase) o 5'-TTN-3 en contraste con el PAM rico en G al que apunta Cas9. Después de la identificación de PAM, Cpfl introduce una rotura bicatenaria de ADN con un extremo adhesivo de 4 o 5 nucleótidos salientes.
[0248]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en NgAgo. El sistema basado en NgAgo comprende al menos un elemento de ADN guía o un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el elemento de ADN guía; y una endonucleasa guiada por ADN. El sistema basado en NgAgo emplea ADN como elemento guía. Su principio de funcionamiento es similar al de la tecnología CRISPR-Cas9, pero su elemento guía es un segmento de ADN guía (ADNd) en lugar de ARNg en la tecnología CRISPR-Cas9. Un ejemplo de endonucleasa guiada por ADN es una endonucleasa Argonaute (NgAgo) deNatronobacterium gregoryi.Véase, por ejemplo, Feng Gao et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute", Nature Biotechnology, (2016): doi:10.1038/nbt.3547.
[0249]Por "enlazador", "enlazador peptídico", "enlazador peptídico" o "espaciador peptídico" se pretende significar una secuencia peptídica que permite la conexión de diferentes monómeros en una proteína de fusión y la adopción de la conformación correcta para dicha actividad de la proteína de fusión y que no altera la actividad de ninguno de los monómeros. Los conectores peptídicos pueden tener varios tamaños, desde 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 a 50 aminoácidos como rango indicativo no limitante o cualquier valor intermedio dentro de este rango.
[0250]Inhibidores de ADN-PK para aumentar la eficiencia de la edición genómica
[0251]La eficiencia de la edición del genoma dirigida se puede aumentar administrando a una célula uno o más compuestos (p. ej., inhibidores de ADN-PK) descritos en el presente documento y un sistema de edición del genoma. Los sistemas de edición del genoma adecuados para su uso incluyen, por ejemplo, un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa con dedos de zinc (ZFN), un sistema basado en nucleasa basado en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo. Los métodos, composiciones y kits de la divulgación proporcionan inhibidores de ADN-PK y/o un sistema de edición del genoma para aumentar la eficiencia de la edición del genoma. En algunas formas de realización, la eficiencia de la edición del genoma HDR aumenta después de la administración a una célula con un inhibidor de ADN-PK.
[0252]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma es un sistema de edición del genoma basado en CRISPR. El sistema de edición del genoma basado en CRISPR puede ser un sistema CRISPR-Cas o variantes del mismo. El sistema CRISPR-Cas puede utilizar cualquier endonucleasa Cas, como las endonucleasas Cas 9 y variantes de las mismas. Los ejemplos de endonucleasas Cas 9 incluyen endonucleasas Cas9 o variantes de las mismas, tales como SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o nickasa CasD10A. La endonucleasa Cas puede ser de tipo salvaje, modificada genéticamente o un mutante de nickasa, o cualquier variación de la misma.
[0253]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye una secuencia CRISPR, una secuencia cr transactivadora (tracr), una secuencia guía y una endonucleasa Cas o cualquier combinación de las mismas.
[0254]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye un ARN que comprende una secuencia CRISPR (ARNcr), un ARN que comprende una secuencia cr (tracr) transactivadora (traARNcr) y una endonucleasa Cas o cualquier combinación de las mismas.
[0255]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR incluye una secuencia CRISPR, una secuencia guía y una endonucleasa Cas o una endonucleasa Cpf, o cualquier combinación de las mismas.
[0256]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf. La nucleasa Cpf es una endonucleasa del sistema CRISPR-Cas de clase 2. Cpf es una endonucleasa única guiada por ARN. La nucleasa Cpf puede ser de tipo salvaje, modificada genéticamente o un mutante de nickasa, o cualquier variación de la misma. Véase, por ejemplo, Zetsche et al., "CPF1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163(3): 759-71. En algunas formas de realización, la nucleasa Cpf es una endonucleasa Cpf 1.
[0257]En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasa. Basado en meganucleasa la edición del genoma utiliza endonucleasas específicas de secuencia que reconocen sitios objetivo de ADN grandes (p. ej., típicamente alrededor de >12 pb). Véase, por ejemplo, el documento US 9.365.964. Las meganucleasas pueden escindir secuencias cromosómicas únicas sin afectar la integridad general del genoma. En algunas formas de realización, la meganucleasa puede ser una endonucleasa localizada. En algunas formas de realización, la meganucleasa puede ser una endonucleasa intrón o una endonucleasa inteína. Las endonucleasas homing pueden pertenecer a la familia LAGLIDADG. Las meganucleasas pueden ser de tipo salvaje, modificadas genéticamente o mutantes de nickasa.
[0258]En algunas formas de realización, el sistema de edición de genes es un sistema basado en nucleasa de dedos de zinc (ZFN). La ZFN es una enzima de restricción artificial diseñada basándose en la fusión entre un dominio de unión al ADN con dedo Zing y un dominio de escisión del ADN. Véase, por ejemplo, el documento US 9.145.565.
[0259]En algunas formas de realización, el sistema de edición de genes es una nucleasa basada en un efector similar a un activador de la transcripción (TALEN). Las TALEN son enzimas de restricción diseñadas mediante ingeniería genética que se obtienen mediante la fusión de un dominio de unión al ADN efector TAL con un dominio de escisión del ADN. Véase, por ejemplo, el documento US 9.181.535.
[0260]En algunas formas de realización, el sistema de edición de genes es un sistema basado en Argonautas. Los sistemas de edición de genes basados en argonauta incluyen una endonucleasa derivada de argonauta y un ADNmc fosforilado en 5'. En algunas formas de realización, el ADNmc fosforilado puede tener una longitud de 10 a 40 nucleótidos, de 15 a 30 nucleótidos o de 18 a 30 nucleótidos (p. ej., aproximadamente 24 nucleótidos). En algunas formas de realización, la endonucleasa Argonauta puede ser cualquier endonucleasa. En algunas formas de realización, la endonucleasa Argonaute se deriva deThermus thermophiles(TtAgo),Pyrococcus furiosus(PfAgo) oNatronobacterium gregoryi(NgAgo). En algunas formas de realización,Natrobacterium gregoryi(NgAgo) es la cepa 2 (es decir, N. gregoryi SP2). En algunas formas de realización, la endonucleasa Argonauta es NgAgo. Véase, por ejemplo, Gao et al., "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute", Nature Biotechnology, mayo de 2016.
[0261]Los inhibidores de ADN-PK pueden ser cualquier inhibidor de ADN-PK. El inhibidor de ADN-PK puede ser cualquier compuesto o sustancia que provoque la inhibición de una ADN-PK. El inhibidor de ADN-PK puede ser un compuesto, una molécula pequeña, un anticuerpo o una secuencia de nucleótidos. En algunas formas de realización, los inhibidores de ADN-PK son compuestos representados por la Fórmula(I),(II),(III-A-1), (IIIA-2),(III-B-1),(III-B-2), (IV),(V A)y(V-B).
[0262]En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(I):
o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, donde cada uno de R1, R2, X, Anillo A, Anillo B y Anillo C independientemente es como se define en otra parte del presente documento.
El anillo A es un sistema de anillos aromáticos seleccionado entre
El anillo B es un sistema de anillos seleccionado entre
en donde el Anillo B está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH, y -Oalquilo C<1-2>;
el Anillo C es un grupo cicloalquilo C<4-6>, heteroarilo de 5-6 miembros o fenilo, en el que el Anillo C está opcionalmente además sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, alquilo C<1-2>, -OH y -Oalquilo C<1-2>;
X es -NH-, -O-, -Oalquilo C<1-4>-, -S- o -CH<2>-;
cada uno de R1 y R2 es, independientemente, hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -N<h>S(O)<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7 en los que R1 y R2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno;
cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -C(O)OH, -C(O)Oalquilo C<1-2>, -CN, -C(O)NHalquilo C<1-2>, -C(O)NH<2>, cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>;
cada R4 es independientemente hidrógeno, alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-10>, arilo de 6-10 miembros, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 4-10 miembros, en donde cada uno de dichos grupos R4 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<1-4>, CN, NO<2>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-6>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C<0>-<4>-O-alquilo Cü<-4>-cicloalquilo C<3-5>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo Cü<-4>-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C<ü>-4-C(O)NH2, C(O)NHalquilo C1-4, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C3-5), CH<2>OR5, alquilo C0-4-C(O)R5, alquilo C0-4-C(O)N(R5)<2>, alquilo C<0-4>-C(O)OR5, alquilo C<0-4>-NHC(O)R5, alquilo C<0-4>-N(R5)<2>, heterociclilo de 5-6 miembros, -O(alquilo C<1>-4)OR5, -OR5 y oxo, y en el que cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales es opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-4>, -OH, -Oalquilo C<1-4>, -Salquilo C<1-4>, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>y -C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>; y
cada R5 independientemente es hidrógeno, alquilo C<1-4>, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde cada R5 independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN, -OH, -Oalquilo C<1-2>, heteroarilo de 5-6 miembros y heterociclilo de 4-7 miembros, o dos grupos R5 junto con el átomo de nitrógeno intermedio opcionalmente forman un anillo de morfolina. anillo de azetidina, anillo de pirrolidina, anillo de piperidina o anillo de piperazina; y R6 es hidrógeno o alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -CH<2>OH, -CN, -OH y -Oalquilo C<1-2>;
R7 es arilo de 6 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>., -CH<2>OH, -CN y -OR; y
cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<1-4>, o R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman opcionalmente un anillo de morfolina, un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de piperazina.
[0263]En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(II)o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:
en donde las variables de Fórmula(II)son cada una independientemente como se describe a continuación.
[0264]En el primer conjunto de variables de Fórmula(II), cada una de las variables de Fórmula(II)es independientemente como se describe anteriormente en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0265]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(II), R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y R2 es hidrógeno. Las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0266]En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1), o(III-B-2), o sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
(III-B-2), en donde las variables de Fórmula(II)son cada una independiente como se describe a continuación.
[0267]En el primer conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), cada una de las variables de(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2)es independientemente como se describe anteriormente en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0268]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al vigésimo séptimo de Fórmula(I).
[0269]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -NHR4 o -OR4; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera del primer o segundo conjunto de variables de(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1), o(III-B-2).
[0270]En el cuarto conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -NHR4; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a tercero de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),o(III-B-2).
[0271]En el quinto conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R1 es -OR4; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a cuarto de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),o(III-B-2).
[0272]En el sexto conjunto de variables de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1)o(III-B-2), R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; R6 es hidrógeno o metilo; y las variables restantes de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables primero a quinto de Fórmula(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),o(III-B-2).
[0273]En otra forma de realización más, los compuestos de la invención están representados por la Fórmula(IV)o sus sales farmacéuticamente aceptables
en donde las variables de Fórmula(IV)son cada una e independientemente como se describen a continuación.
[0274]En el primer conjunto de variables de Fórmula(IV), cada una de las variables de forma independiente es como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0275]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(IV), R1 es hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y las variables restantes de Fórmula(IV)son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0276]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(IV), el Anillo B se sustituye opcionalmente
y las variables restantes de Fórmula(IV)son, cada una e independientemente, como se describe en el primer o segundo conjunto de variables de Fórmula(IV).
[0277]En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un método para editar una o más regiones genómicas objetivo, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula Fórmula(V-A)o(V-B), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos:
en donde cada una de las variables de Fórmula(V-A)o(V-B)es independientemente como se describe a continuación.
[0278]En el primer conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B), cada una de las variables de forma independiente es como se describe en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de la Fórmula(I).
[0279]En el segundo conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B), R3 es hidrógeno, metilo, ciclopropilo, -F, -Cl, -Oalquilo C<1-2>, -NRR' o -CN, en donde cada uno de dicho R3 alquilo es opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y -O(alquilo C<1-2>); cada R4 independientemente es alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y -O(alquilo C<1-2>); y R y R' son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo C<1-2>. Las variables restantes de Fórmula(V-A)o(V-B)son, cada una e independientemente, como se describen en cualquiera de los conjuntos de variables del primero al trigésimo de Fórmula(I).
[0280]En el tercer conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B), cada R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; y R6 es hidrógeno o metilo. Las variables restantes de Fórmula(V-A)o(V-B)son cada una e independientemente como se describen en el primer o segundo conjunto de variables de Fórmula(V-A)o(V-B).
[0281]En otra forma de realización más, los compuestos de la invención están representados por cualquiera de las Fórmulas(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),(III-B-2),(IV),(V-A)y(V-B), o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde cada una de las variables de estas Fórmulas de forma independiente como se representa en las fórmulas estructurales de las Tablas 1 y 2.
[0282]En algunas formas de realización, la divulgación también proporciona un método para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo mediante una vía de reparación dirigida por homología (HDR), el método incluye la administración a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula(I),(II),(III-A-1),(III-A-2),(III-B-1),(III-B-2),(IV),(V-A)y(V-B)o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0283]El sistema de edición del genoma interactúa con uno o varios ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en el que la rotura del ADN se repara al menos en parte mediante una vía HDR.
[0284]En algunas formas de realización, la divulgación también proporciona un método para inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía NHEJ, el método incluye administrar a una o más células que tienen una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula (I), (II), (III-A-1), (III-A-2), (III-B-1), (III-B-2), (IV), (V-A) y (V-B) o sus sales farmacéuticamente aceptables.
[0285] El sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo, lo que da como resultado una rotura del ADN, y en el que se inhibe o suprime la reparación de la rotura del ADN a través de una vía NHEJ.
[0286] En algunas formas de realización, la divulgación también proporciona un método para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas, el método incluye administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto representado por la Fórmula (I), (II), (III-A-1), (III-A-2), (III-B-1), (III-B-2), (IV), (V-A) y (V-B) o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos
[0287] El sistema de edición del genoma interactúa con un ácido nucleico de una o más regiones genómicas objetivo de un gen objetivo, dando como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en el que la edición modifica la expresión de un gen(es) y/o proteína(s) aguas abajo asociada(s) con el (los) gen(es) objetivo.
[0288] En algunas formas de realización, la rotura del ADN incluye una rotura de doble hebra del ADN (DSB).
[0289] En algunas formas de realización, el compuesto es un cocristal que incluye un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I) y un formador de cocristal seleccionado entre ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.
[0290] En algunas formas de realización, la eficacia de editar las regiones genómicas objetivo en una o más células aumenta en comparación con la de una célula o células por lo demás idénticas, pero sin el compuesto.
[0291] En algunas formas de realización, la eficacia de la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con la de otra célula o células idénticas, pero sin el compuesto.
[0292] En algunas formas de realización, la eficacia de inhibir o suprimir la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía NHEJ aumenta en comparación con la de otra célula o células idénticas, pero sin el compuesto.
[0293] En algunas formas de realización, la eficiencia aumenta al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces., 50 veces o 100 veces en comparación con la de células idénticas, pero sin compuesto.
[0294] En algunas formas de realización, la eficacia se mide por la frecuencia de integración de polinucleótidos objetivo. En algunas formas de realización, la eficacia se mide por la frecuencia de mutagénesis dirigida. En algunas formas de realización, la mutagénesis dirigida comprende mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones.
[0295] En algunas formas de realización, la expresión de uno o varios genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con los genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración. Por ejemplo, dicha expresión aumenta al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 1 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración.
[0296] En algunas formas de realización, la expresión de uno o varios genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con los genes objetivo disminuye en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración. Por ejemplo, la expresión genética disminuye al menos en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %,<98>% o 99 % en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración.
[0297] En algunas formas de realización, la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo se elimina sustancialmente en una o más células.
[0298] En algunas formas de realización, la célula está sincronizada en la fase S o G2 del ciclo celular.
[0299] En algunas formas de realización, una o más células que se administran o se ponen en contacto con dicho compuesto tienen una mayor supervivencia en comparación con una o más células que no se han administrado ni se han puesto en contacto con dicho compuesto.
[0300] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en una o más células simultáneamente. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran secuencialmente en una o más células. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se administra en una o más células antes del compuesto. En algunas formas de realización, el compuesto se administra en una o más células antes del sistema de edición del genoma.
[0301] En algunas formas de realización, una o más células son células cultivadas. En algunas formas de realización, una o más células son célulasin vivodentro de un organismo. En algunas formas de realización, la una o más células son célulasex vivode un organismo.
[0302] En algunas formas de realización, el organismo es un mamífero. En algunas formas de realización, el organismo es un ser humano.
[0303] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran por la misma ruta. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran por una ruta diferente. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se administra por vía intravenosa y el compuesto se administra por vía oral.
[0304] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa con dedos de zinc (ZFN), un sistema basado en nucleasa basado en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo.
[0305] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma es un sistema basado en CRISPR. En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.
[0306] En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) al menos un elemento de ARN guía que incluye: (I) un ARN objetivo que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN objetivo; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con el ARN objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas.
[0307] En algunas formas de realización, el ARN objetivo y el ARN activador se fusionan como una sola molécula.
[0308] En algunas formas de realización, la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II. En algunas formas de realización, la proteína Cas9 es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.
[0309] En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) al menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el elemento de ARN guía, el ARN guía que incluye un ARN objetivo que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo; y (b) un elemento proteico Cpf que incluye una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.
[0310] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se administra mediante uno o más vectores.
[0311] En algunas formas de realización, uno o más vectores se seleccionan entre vectores virales, plásmidos o ADNmc.
[0312] En algunas formas de realización, los vectores virales se seleccionan entre vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simple.
[0313] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se administra mediante ARN sintético.
[0314] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se administra mediante una nanoformulación.
[0315] En algunas formas de realización, se proporciona un kit o composición para editar una o más regiones genómicas objetivo. En algunas formas de realización, el kit o composición incluye un sistema de edición del genoma; y un compuesto representado por la Fórmula (I), (II), (III-A-1), (III-A-2), (III-B-1), (III-B-2), (IV), (V-A) y (V-B) o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
[0316] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma del kit o composición es un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa de dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasa basado en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR, o sistema basado en NgAgo. En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma del kit o composición es un sistema basado en CRISPR. En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf.
[0317] En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cas y en donde el sistema CRISPR-Cas incluye: (a) al menos un elemento de ARN guía que incluye: (I) un ARN objetivo que incluye un secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN objetivo; (ii) y un ARN activador que incluye una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con el ARN objetivo, o un ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que incluye una proteína Cas o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cas.
[0318] En algunas formas de realización, la proteína Cas del kit o composición es una proteína Cas9 de tipo II. En algunas formas de realización, la proteína Cas9 del kit o composición es una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas.
[0319] En algunas formas de realización, el sistema basado en CRISPR del kit o composición es un sistema CRISPR-Cpf, y en donde el sistema CRISPR-Cpf incluye: (a) un ARN objetivo que incluye una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en la una o más regiones genómicas objetivo, o un ácido nucleico que incluye una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el ARN objetivo; y (b) un elemento proteico Cpf que incluye una proteína Cpf o un ácido nucleico que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cpf.
[0320] En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma del kit o composición está incluido o empaquetado en uno o más vectores. En algunas formas de realización, uno o más vectores se seleccionan entre vectores virales, plásmidos o ADNmc. En algunas formas de realización, los vectores virales se seleccionan del grupo que consiste en vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simple.
[0321] En algunas formas de realización, la eficiencia de edición del genoma aumentada es aproximadamente 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces, en comparación con una condición en la que no se administra un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma a una(s) célula(s), o en comparación con una condición en la que solo se administra a una célula un sistema de edición del genoma y no un inhibidor de ADN-PK.
Uso de inhibidores de ADN-PK y sistemas de edición del genoma, kits y composiciones de los mismos
[0322] La edición del genoma, en la que se alteran con precisión determinadas regiones genómicas, tiene un gran potencial terapéutico.
[0323] En algunas formas de realización, en el presente documento se proporcionan métodos para editar una o más regiones genómicas objetivo, para reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo a través de una vía HDR, para inhibir o suprimir la reparación mediada por NHEJ de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo, y para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas mediante la administración a una(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK.
[0324] En algunas formas de realización, se proporcionan en el presente documento métodos para modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprenden administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK descrito en el presente documento, en los que el genoma el sistema de edición interactúa con un ácido nucleico de una o más regiones genómicas objetivo de un(os) gen(es) objetivo, lo que da como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un(os) gen(es) aguas abajo y/o proteína(s) asociada(s) con el (los) gen(es) objetivo.
[0325] El sistema de edición del genoma puede ser cualquier sistema de edición del genoma que pueda editar una región genómica objetivo en una(s) célula(s). Los sistemas de edición del genoma ejemplares se describen en detalle anteriormente y pueden incluir, por ejemplo, un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa de dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasa basado en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR., o sistema basado en NgAgo.
[0326] La edición de una o más regiones genómicas objetivo incluye cualquier tipo de manipulación genética o ingeniería del genoma de una célula. La edición de una o más regiones genómicas objetivo puede incluir inserciones, eliminaciones o reemplazos de regiones genómicas en una o más células realizadas por una o más endonucleasas. Las regiones genómicas comprenden el material genético de una célula, como ADN, ARN, polinucleótidos y oligonucleótidos. Las regiones genómicas en una(s) célula(s) también comprenden los genomas de las mitocondrias o cloroplastos contenidos en una(s) célula(s).
[0327] En algunas formas de realización, en el presente documento se proporcionan compuestos para usar en métodos para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección que necesita editar una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) del sujeto, que comprende administrar a una o más células una sistema de edición y un inhibidor de ADN-PK.
[0328] En algunas formas de realización, los métodos proporcionados en el presente documento se usan para modificar la expresión de un gen, una molécula de ARN, una proteína, un grupo de proteínas o proteínas posteriores en una vía. Dicha modificación se puede utilizar para tratar una enfermedad, una disfunción, una homeostasis anormal del organismo, ya sea adquirida o heredada o debida al proceso de envejecimiento. Como se usa en el presente documento, el término "modificar" o "modifica" incluye modular, mejorar, disminuir, aumentar, insertar, eliminar, apartar, incorporar y similares.
[0329] Un experto en la técnica entiende que las enfermedades, ya sean adquiridas o heredadas, u obtenidas de otro modo, implican una desregulación de los mecanismos homeostáticos que incluye la implicación de la función genética o proteica. Con este fin, un experto puede utilizar los métodos proporcionados en el presente documento para modular, modificar, mejorar, disminuir o proporcionar de otro modo una función genética en un sujeto.
[0330] La modificación de la expresión de genes y la consiguiente expresión de proteínas en una o más células se puede lograr mediante los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, mediante edición específica (p. ej., reemplazando, insertando o eliminando, cualquier combinación de los mismos) una secuencia de ácido nucleico en cualquiera de un exón. un intrón, un sitio de inicio de la transcripción, una región promotora, una región potenciadora, una región silenciadora, una región aislante, un antirepresor, un elemento regulador postraduccional, una señal de poliadenilación (p. ej., poli A mínima), una región conservada, un factor de transcripción sitio de unión, o cualquier combinación de los mismos.
[0331] En algunas formas de realización, los compuestos, kits y composiciones proporcionados en el presente documento son para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer. El método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer o una afección relacionada con el cáncer comprende administrar a una(s) célula(s) del sujeto un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma. La administración del inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición del genoma puede ser in vivo o ex vivo.
[0332] El cáncer puede ser de cualquier tipo de cáncer. El cáncer incluye tumores sólidos como los de mama, ovario, próstata, pulmón, riñón, gástrico, colon, testículo, cabeza y cuello, páncreas, cerebro, melanoma y otros tumores de órganos tisulares y cánceres de células sanguíneas, como linfomas y leucemias, incluida la leucemia mielógena aguda, la leucemia linfocítica crónica, la leucemia linfocítica de células T y los linfomas de células B. Los cánceres pueden incluir melanoma, leucemia, astocitoma, glioblastoma, linfoma, glioma, linfoma de Hodgkins, leucemia linfocítica crónica y cáncer de páncreas, mama, tiroides, ovario, útero, testículo, pituitaria, riñón, estómago, esófago y recto.
[0333] En algunas formas de realización, los kits y composiciones proporcionados en el presente documento son para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene uno o más de los siguientes cánceres: leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA., Cáncer anal, Cáncer de apéndice, Astrocitoma cerebeloso o cerebral infantil, Carcinoma de células basales, Cáncer de vías biliares extrahepático (ver colangiocarcinoma), Cáncer de vejiga, Tumor óseo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, Glioma del tronco encefálico, Cáncer cerebral, Tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, tumor cerebral, ependimoma, tumor cerebral, meduloblastoma, tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor cerebral, vía visual y glioma hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, Tumor carcinoide, infancia, tumor carcinoide gastrointestinal, carcinoma de origen primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central primario, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral/glioma maligno infantil, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, condrosarcoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, Cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, cáncer de endometrio, ependimoma, hemangioendotelioma epitelioide (EHE), cáncer de esófago, sarcoma de Ewing de la familia de tumores de Ewing, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de conductos biliares extrahepáticos, cáncer de ojo, melanoma intraocular, cáncer de ojo, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales: extracraneal, extragonadal u ovárico, tumor trofoblástico gestacional, glioma del tronco encefálico, Glioma, astrocitoma cerebral infantil, Glioma, vía visual e hipotalámica infantil, Carcinoide gástrico, Leucemia de células pilosas, Cáncer de cabeza y cuello, Cáncer de corazón, Cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, Cáncer de hipofaringe, Glioma hipotalámico y de las vías visuales, infancia, Melanoma intraocular, Carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), Sarcoma de Kaposi, Cáncer de riñón (cáncer de células renales), Cáncer de laringe, Leucemias, Leucemia linfoblástica aguda (también llamada leucemia linfocítica aguda), leucemia mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), leucemia linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), leucemia mielógena crónica (también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas, cáncer de labio y de cavidad bucal, Liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfomas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfomas de Hodgkin, no Hodgkin (una clasificación antigua de todos los linfomas excepto Hodgkin) Linfoma primario del sistema nervioso central Macroglobulinemia, Waldenstrom, cáncer de mama masculino, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, melanoma de meduloblastoma infantil, melanoma intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma, Mesotelioma maligno en adultos cáncer escamoso de cuello, cáncer escamoso de cuello infantil metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda en adultos, mieloma agudo infantil, mieloma múltiple (cáncer de médula ósea), trastornos mieloproliferativos, mixoma crónico, cáncer de cavidad nasal y de senos paranasales, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer no de pulmón de células pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor epitelial estromal de superficie), tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, Cáncer de páncreas de islote celular, Cáncer de senos paranasales y cavidad nasal, Cáncer de paratiroides, Cáncer de pene, Cáncer de faringe, Feocromocitoma, Astrocitoma pineal, Germinoma pineal, Pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, Adenoma hipofisario, Neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, Blastoma pleuropulmonar, Linfoma del sistema nervioso central primario, Cáncer de próstata, Cáncer de recto, Carcinoma de células renales (cáncer de riñón), Cáncer de pelvis renal y uréter, Cáncer de células de transición, Retinoblastoma, Rabdomiosarcoma, Cáncer de glándulas salivales, Sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel, células de Merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, Carcinoma de células escamosas - ver cáncer de piel (no melanoma), Cáncer escamoso de cuello con primario oculto, metastásico, Cáncer de estómago, Tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, Linfoma cutáneo de células T (Micosis fungoide y síndrome de Sézary), Cáncer testicular, Cáncer de garganta, Timoma, Timoma y carcinoma tímico, Cáncer de tiroides, Cáncer de tiroides, Cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter, Tumor trofoblástico gestacional, Carcinoma de sitio primario desconocido en adulto, Cáncer de sitio primario desconocido en infancia, Uréter y pelvis renal, cáncer de células transicional, cáncer de uretra, cáncer de útero, cáncer de endometrio, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma de vías visuales y hipotalámico, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom o tumor de Wilms (cáncer de riñón).
[0334] En algunas formas de realización, los genes objetivo ejemplares asociados con el cáncer incluyen ABL1, ABL2, ACSL3, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AKAP9, A T1, AKT2, ALDH2, AL, AL017, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1, ATIC, ATM, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPRIA, BRAF, BRCAl, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIPI, BTG1, BUB1B, C12orf9, C15orf21, C15orf55, C16orf75, C2orf44, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CBFA2T1, CBFA2T3, C.BFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CD N2A, CD N2a(pl4), CDN2C, CDX2, CEBPA, CEPl, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHNl, CIC, Cin A, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1 Al, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L2, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CTNNB1, CYLD, D10S170, DAXX, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, D1CER1, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFI, ECT2L, EGFR, E1F4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ETVl, ETV4, ETV5, ETV6, EVIl, EWSR1, EXTl, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM22A, FAM22B, FAM46C, 1ANCA, EANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FBXOl 1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFRIOP, FGFR2, FGFR3, FTI, FIIIT, FIP1L1, FLU, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXL2, FOXOIA, FOX03A, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, IICMOGT-1, IIEAB, HERPUD1, IIEY1, IIIPl, HIST1IT3B, IIIST1II4I, IILF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPA2BI, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, IIRPT2, HSPCA, HSPCB, IDHl, IDH2, IGH, IGK, IGL, IKZFl, IL2, TL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KRAS, KTN1, LAF4, LASPl, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LMOl, LM02, LPP, LRIG3, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MALT1, MAML2, MAP2KL MAP2K2, MAP2K4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECTI, MED12, MEN1, MET, MITF, MKL1, MLF1, MLIII, MLL, MLL2, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH I, NOTCH2, NPMl, NR4A3, NRAS, NSDl, NT5C2, NTRKl, NTRK3, NUMAl, NUP214, NUP98, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB 2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PIIF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG 1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1 A, PRO1073, PSIP2, PTCH, PTEN, PTPN11, RAB5EP, RACl, RAD51L1, RAFl, RALGDS, RANBP17, RAPIGDSI, RARA, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SEPT6, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SSI8, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAT3, STK11, STL, SUFU, SIJZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCLlA, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX 3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF6, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, USP6, VHL, VTUA, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WTX, WWTR1, XPA, XPC, XPOl, YWHAE, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2 o cualquier combinación de los mismos.
[0335] En algunas formas de realización, los compuestos proporcionados en el presente documento se utilizan en el tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno hereditario. El método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección genética o un trastorno hereditario comprende administrar a una(s) célula(s) del sujeto un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición del genoma. La administración del inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición del genoma puede ser in vivo o ex vivo.
[0336] El trastorno hereditario puede resultar de mutaciones o duplicaciones en regiones cromosómicas (p. ej., de mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, cambios de marco, duplicaciones o deleciones cromosómicas). El trastorno hereditario puede ser cualquier trastorno hereditario.
[0337] En algunas formas de realización, el trastorno hereditario es el síndrome de deleción 22q11.2, el síndrome de Angelman, la enfermedad de Canavan, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, el daltonismo, el Cri du chat, el síndrome de Down, la distrofia muscular de Duchenne, la hemocromatosis, la hemofilia, el síndrome de Klinefelter, la neurofibromatosis, fenilcetonuria, enfermedad renal poliquística, síndrome de Prader-Willi, anemia de células falciformes, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Turner, una hemoglobinopatía o cualquier combinación de los mismos.
[0338] En algunas formas de realización, el trastorno hereditario es síndrome de deleción 1p36, síndrome de deleción 18p, deficiencia de 21-hidroxilasa, 47 XXX (síndrome triple X), 47 XXY (síndrome de Klinefelter), porfiria por deficiencia de 5-ALA deshidratasa, deficiencia de ALA deshidratasa, Porfiria por deficiencia de deshidratasa 5-aminolevulínica, síndrome de deleción 5p, Cri du chat (también conocido como síndrome 5p), ataxia telangiectasia (también conocida como AT), deficiencia de alfa 1 -antitripsina (AAT), aceruloplasminemia, acondrogénesis tipo II (ACG2), acondroplasia (ACH), ácido deficiencia de beta-glucosidasa, enfermedad de Gaucher (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3), acrocefalosindactilia (Apert), síndrome de Apert, acrocefalosindactilia (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 5), Síndrome de Pfeiffer, Acrocefalia, Enfermedad de Gaucher cerebral aguda, porfiria aguda intermitente, (AIP) deficiencia de ACY2, enfermedad de Alzheimer (EA), craneosinostosis tipo Adelaida, síndrome de Muenke, poliposis adenomatosa coli, poliposis adenomatosa familiar, poliposis adenomatosa del colon, poliposis adenomatosa familiar (ADP), deficiencia de adenilosuccinato liasa, suprarrenal trastornos de las glándulas, síndrome adrenogenital, adrenoleucodistrofia, síndrome de insensibilidad a los andrógenos (AIS), alcaptonuria (AKU), porfiria ALA deshidratasa, porfiria ALA-D, Deficiencia de ALA deshidratasa, síndrome de Alagille, albinismo, alcaptonuria, alcaptonuria, enfermedad de Alexander, alcaptonuria, ocronosis alcaptonúrica, alcaptonuria, enfermedad por inhibidor de la proteinasa alfa-1, enfisema relacionado con alfa-1, deficiencia de alfa-galactosidasa A, enfermedad de Fabry, síndrome de Alstrom, enfermedad de Alexander (ALX), amelogénesis imperfecta, deficiencia de aminoácido levulínico deshidratasa, deficiencia de aminoacilasa 2, enfermedad de Canavan, enfermedad de Anderson-Fabry, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, anemia sideroblástica hereditaria, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, anemia esplénica y/o familiar, angioqueratoma corporal difuso, angioqueratoma difusa, angiomatosis retinae, enfermedad de von Hippel-Lindau, resistencia a APC, tipo de Leiden, trombofilia del factor V de Leiden, síndrome de Apert, deficiencia de AR, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (cualquier tipo, por ejemplo, CMT1, CMTX, CMT2, CMT4, CMT grave de inicio temprano), aracnodactilia, síndrome de Marfan, ARNSHL, sordera no sindrómica (autosómica recesiva, autosómica dominante, ligada al cromosoma X o mitocondria), Artrooftalmopatía hereditaria progresiva, síndrome de Stickler (p. ej., COL2A1, COL11A1, COL11A2, COL9A1), artrocalasis múltiple congénita, síndrome de Ehlers-Danlos (p. ej., tipo hipermovilidad, tipo artrocalasia, tipo clásico, tipo vascular, tipo cifoescoliosis, tipo dermatosparaxis) Deficiencia de Asp, deficiencia de Aspa, deficiencia de aspartoacilasa, ataxia telangiectasia, síndrome de autismodemencia-ataxia-pérdida del uso intencionado de las manos, síndrome de Rett, ELA juvenil autosómica dominante, síndrome de opitz G/BBB autosómico dominante, forma autosómica recesiva de ELA juvenil tipo 3, lateral amiotrófica esclerosis (cualquier tipo; por ejemplo, ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5, ALS5, ALS6, ALS7, ALs 8, ALS9, ALS10, ALS11, ALS12, ALS13, ALS14, ALS15, ALS16, ALS17, ALS18, ALS19, ALS20, ALS21, ALS22, FTDALS1, FTDALS2, FTDALS3, FTDALS4, FTDALS4, IBMPFD2), pérdida auditiva no sindrómica autosómica recesiva, deficiencia auditiva neurosensorial autosómica recesiva y bocio, síndrome de Pendred, enfermedad de Alexander (AxD), síndrome de Ayerza, hipertensión arterial pulmonar familiar, variante B de la gangliosidosis por hexosaminidasa GM2, enfermedad de Sandhoff, trastorno relacionado con BANF, neurofibromatosis (cualquier tipo, por ejemplo, NF1, NF2, schwannomatosis), síndrome de Beare-Stevenson cutis gyrata, peritonitis paroxística benigna, síndrome de Benjamin, beta-talasemia, deficiencia de BH4, deficiencia de tetrahidrobiopterina, neurofibromatosis acústica bilateral, deficiencia de biotinidasa, cáncer de vejiga, trastornos hemorrágicos, trombofilia del factor V Leiden, síndrome de Bloch-Sulzberger, incontinentia pigmenti, síndrome de Bloom, enfermedades óseas, enfermedad de Bourneville, esclerosis tuberosa, enfermedades cerebrales, enfermedad priónica, cáncer de mama, síndrome de Birt-Hogg-Dubé, Enfermedad de los huesos de cristal, osteogénesis imperfecta, síndrome del pulgar ancho-Hallux, síndrome de Rubinstein-Taybi, diabetes de bronce, hemocromatosis, cirrosis bronceada, atrofia muscular bulboespinal, atrofia muscular espinal y bulbar ligada al cromosoma X, síndrome de Burger-Grutz, deficiencia de lipoproteína lipasa, síndrome de CADASIL familiar, CGD trastorno granulomatoso crónico, displasia campomélica, síndrome de familia cancerosa, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, cáncer de mama, cáncer de vejiga, deficiencia de carboxilasa, deficiencia múltiple de biotinidasa de aparición tardía, síndrome de llanto de gato, síndrome cardiofacial de Caylor, deficiencia de ceramida trihexosidasa, angiomatosis cerebelorretiniana, enfermedad familiar de von Hippel-Lindau, arteriopatía cerebral, síndrome CADASII, ateropatía cerebral autosómica dominante, síndrome CADASII, hiperamonemia cerebroatrófica, síndrome de Rett, síndrome de lipidosis cerebral, enfermedad de Charcot, síndrome CHARGE, Condrodistrofia, síndrome de condrodistrofia, condrodistrofia con sordera neurosensorial, displasia otospondilomegaepifisaria, condrogénesis imperfecta, síndrome de coreoatetosis, automutilación e hiperuricemia, síndrome de Lesch-Nyhan, galactosemia clásica, galactosemia, labio y paladar hendido, síndrome de Stickler, cráneo en hoja de trébol con enanismo tanatofórico, displasia tanatofórica (p. ej., tipo 1 o tipo 2), síndrome de Coffin-Lowry (CLS), síndrome de Cockayne, síndrome de Coffin-Lowry, colagenopatía tipos II y XI, sin poliposis familiar, cáncer colorrectal sin poliposis hereditario, cáncer de colon familiar, poliposis adenomatosa familiar, cáncer colorrectal, completo Deficiencia de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia completa de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, neuropatía por compresión, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, enfermedad del tejido conectivo, síndrome de anomalía conotruncal de la cara, anemia de Cooley, betatalasemia, enfermedad de almacenamiento de cobre, enfermedad de Wilson, enfermedad del transporte de cobre, enfermedad de Menkes, Coproporfiria, coproporfiria hereditaria, Deficiencia de coproporfirinógeno oxidasa, Síndrome de Cowden, Deficiencia de CPX, Disartrosis craneofacial, Síndrome de Crouzon, Disostosis craneofacial, Síndrome de Crouzon, Enfermedad de Crohn, fibroestenosante, Síndrome de Crouzon, Síndrome de Crouzon con acantosis nigricans, Síndrome de Crouzonodermosesquelético, Síndrome de Crouzonodermosesquelético, Síndrome de Cockayne (SC), síndrome de Cowden, síndrome de Curschmann-Batten-Steinert, síndrome de cutis gyrata de Beare-Stevenson, síndrome de cutis gyrata de Beare-Stevenson, deficiencia de D-glicerato deshidrogenasa, hiperoxaluria primaria, síndrome de metáfisis moteada, displasia espondiloepimetafisaria tipo Strudwick, Demencia tipo Alzheimer (DAT), Hipercalciuria genética, Enfermedad de Dent, distrofia muscular (p. ej., tipos Duchenne y Becker), Sordera con bocio, Síndrome de Pendred, Síndrome de sordera-retinitis pigmentosa, Síndrome de Usher, Enfermedad por deficiencia, Fenilalanina hidroxilasa, Enfermedades nerviosas degenerativas, síndrome de Grouchy 1, síndrome de De Grouchy, síndrome de DejerineSottas, porfiria por deficiencia de delta-aminolevulinato deshidratasa, demencia, síndrome CADASII, leucodistrofia desmielinógena, enfermedad de Alexander, síndrome de Ehlers-Danlos dermatoparactico, dermatoparaxis, discapacidades hereditarias del desarrollo, neuropatía motora hereditaria distal (dHMN), neuropatía motora hereditaria distal (p. ej., DHMN-V), deficiencia de DHTR, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, esclerosis difusa del cuerpo globoide, enfermedad de Krabbe, síndrome de Di George, deficiencia del receptor de dihidrotestosterona, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, neuropatía motora hereditaria distal, distrofia miotónica (tipo 1 o tipo 2), atrofia muscular espinal distal (cualquier tipo, incluido, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4, tipo 5, tipo 6), distrofia muscular de Duchenne/Becker, enanismo (cualquier tipo, egacondroplásico, acondroplasia, displasia tanatofórica), síndrome de enanismo-atrofia retiniana-sordera, síndrome de Cockayne, leucodistrofia dismielinogénica, enfermedad de Alexander, distrofia myotonica, distrofia retinae Síndrome de pigmentosa-disostosis, síndrome de Usher, enfermedad de Alzheimer familiar de inicio temprano (EOFAD), enfermedad de Alzheimer (incluyendo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 o tipo 4), enfermedad de Ekman-Lobstein, osteogénesis imperfecta, neuropatía por atrapamiento, neuropatía hereditaria con riesgo de parálisis por presión, protoporfiria eritropoyética (PPE), anemia eritroblástica, beta-talasemia, protoporfiria eritrohepática, deficiencia de 5-aminolevulinato sintetasa eritroide, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, cáncer de ojo, retinoblastoma FA - ataxia de Friedreich, ataxia de Friedreich, FA, anemia de Fanconi, Lesiones y trastornos faciales, trombofilia del factor V Leiden, FALS, esclerosis lateral amiotrófica, neuroma acústico familiar, poliposis adenomatosa familiar, enfermedad de Alzheimer familiar (DAP), esclerosis lateral amiotrófica familiar, esclerosis lateral amiotrófica, disautonomía familiar, hipertrigliceridemia familiar inducida por grasa, deficiencia de lipoproteína lipasa, familiar, hemocromatosis familiar, hemocromatosis, deficiencia de LPL familiar, deficiencia de lipoproteína lipasa, familiar, cáncer de colon familiar sin poliposis, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliserositis paroxística familiar, PCT familiar, porfiria cutánea tardía, neuropatía sensible a la presión familiar, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, hipertensión pulmonar primaria familiar (FPPH), leucoencefalopatía vascular familiar, CADASII, síndrome, FAP, adenomatosa familiar poliposis, EF, disautonomía familiar, deficiencia de ferroquelatasa, enfermedad de ferroportina, hemocromatosis (cualquier tipo, por ejemplo, tipo 1, tipo 2A, tipo 2B, tipo 3, tipo 4, hemocromatosis neonatal, aceruloplasminemia, atransferrinemia congénita, síndrome de grácil) Síndrome de fiebre periódica, Fiebre mediterránea familiar (FMF), síndrome FG, sinostosis coronal asociada a FGFR3, degeneración fibrinoide de astrocitos, enfermedad de Alexander, enfermedad fibroquística del páncreas, enfermedad de Folling, síndrome fra(X), síndrome X frágil, Fragilitas ossium, osteogénesis imperfecta, FRAXA síndrome, ataxia de Friedreich (FRDA), deficiencia de G6PD, enfermedad por deficiencia de galactoquinasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de galactosilceramidasa, enfermedad de Krabbe, lipidosis de galactosilceramida, enfermedad de Krabbe, deficiencia de galactosilcerebrosidasa, lipidosis de galactosilesfingosina, deficiencia de GALC, Deficiencia de GALT, galactosemia, enfermedad similar a Gaucher, enfermedad pseudo-Gaucher, deficiencia de GBA, trastornos cerebrales genéticos, enfisema genético, hemocromatosis genética, hemocromatosis, hepatitis de células gigantes, neonatal, hemocromatosis neonatal, deficiencia de GLA, glioblastoma, retina, retinoblastoma, glioma, retiniano, retinoblastoma, leucodistrofia de células globoides (GCL, GLD), enfermedad de Krabbe, leucoencefalopatía de células globoides, deficiencia de glucocerebrosidasa, glucocerebrosidosis, lipidosis de glucosil cerebrósido, deficiencia de glucosilceramidasa, deficiencia de glucosilceramida beta-glucosidasa, lipidosis de glucosilceramida, aciduria glicérica, hiperoxaluria primaria, glicina encefalia opatía, hiperglicinemia no cetósica, aciduria glicólica, hiperoxaluria primaria, gangliosidosis GM2, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de sordera-bocio, síndrome de Pendred, síndrome de Graefe-Usher, síndrome de Usher, síndrome de Gronblad-Strandberg, pseudoxantoma elástico, hemocromatosis, hemocromatosis, síndrome de Hallgren, Usher síndrome, ictiosis tipo arlequín, enfermedad de Hb S, hipocondroplasia (HCH), coproporfiria hereditaria (HCP), malformaciones de la cabeza y el cerebro, trastornos de la audición y sordera, problemas de audición en niños, HEF2A, HEF2B, hematoporfiria, porfiria, deficiencia de hemo sintetasa, hemocromatosis, enfermedad de hemoglobina M, metahemoglobinemia tipo beta-globina, enfermedad de hemoglobina S, hemofilia, porfiria hepatoeritropoyética (HEP), deficiencia hepática de AGT, hiperoxaluria primaria, síndrome de degeneración hepatolenticular, enfermedad de Wilson, artrooftalmopatía hereditaria, síndrome de Stickler, lipidosis distópica hereditaria, Hemocromatosis hereditaria (HHC), hemocromatosis, telangiectasia hemorrágica hereditaria (HHT), miopatía hereditaria por cuerpos de inclusión, regeneración del músculo esquelético, anemia hereditaria por carga de hierro, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, Neuropatía motora y sensorial hereditaria, Neuronopatía motora hereditaria tipo V, neuropatía motora hereditaria distal, Exostosis múltiples hereditarias, Cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, Síndrome de fiebre periódica hereditaria, Poliposis coli hereditaria, poliposis adenomatosa familiar, Enfisema pulmonar hereditario, Resistencia hereditaria a la proteína C activada, factor V Trombofilia de Leiden, Neuropatía sensorial y autonómica hereditaria tipo III, disautonomía familiar, Paraplejía espástica hereditaria, Parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil, Ataxia espinal hereditaria, Ataxia de Friedreich, Esclerosis espinal hereditaria, Ataxia de Friedreich, Enfermedad de Herrick anemia, OSMED heterocigota, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, displasia otospondilomegaepifisaria heterocigota, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, deficiencia de HexA, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de hexosaminidasa A, enfermedad de Tay-Sachs, deficiencia de la subunidad alfa de hexosaminidasa (cualquier variante, por ejemplo, variante A, variante B), enfermedad de Tay-Sachs, hemocromatosis asociada a HFE, hemocromatosis, h Gp S, progeria, enfermedad de Hippel-Lindau, enfermedad de von Hippel-Lindau, hemocromatosis (HLAH), neuropatía motora hereditaria distal (HMN V), cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC), neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión (HNPP), homocistinuria, deficiencia de ácido oxidasa homogentísico, alcaptonuria, acidura homogentísica, alcaptonuria, porfiria cutánea tarda homocigótica, porfiria hepatoeritropoyética, hiperoxaluria primaria (HP1), hiperoxaluria (HP2), hiperfenilalaninemia (HPA), HPRT - Deficiencia de hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, HSAN tipo III, disautonomía familiar, disautonomía familiar (HSAN3), neuropatía sensorial hereditaria (cualquier tipo, ej., HSN-1, HSN-II, HSN-III), disautonomía familiar, dermatosparaxis humana, enfermedad de Huntington, síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford, progeria, hiperandrogenismo, tipo no clásico debido a deficiencia de 21-hidroxilasa, hiperquilomicronemia, deficiencia familiar de lipoproteína lipasa, familiar, Hiperglicinemia con cetoacidosis y leucopenia, acidemia propiónica, hiperlipoproteinemia tipo I, deficiencia de lipoproteína lipasa, hiperoxaluria familiar, hiperfenilalaninemia primaria, hiperfenilalaninemia, hiperfenilalaninemia, hipocondrodisplasia, hipocondroplasia, hipocondrogénesis, hipocondroplasia, anemia hipocrómica, ligada al cromosoma X anemia sideroblástica, deficiencia de hipoxantina fosforribosiltransferencia (HPRT), síndrome de Lesch-Nyhan, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil (IAHSP), síndrome de ICF, síndrome de inmunodeficiencia, inestabilidad del centrómero y anomalías faciales, hemocromatosis idiopática, hemocromatosis tipo 3, hemocromatosis neonatal idiopática, hemocromatosis, neonatal, hipertensión pulmonar idiopática, trastornos del sistema inmunológico, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, incontinentia pigmenti, enfermedad de Gaucher cerebral infantil, enfermedad de Gaucher infantil, parálisis espástica hereditaria ascendente de inicio infantil, infertilidad, enfisema hereditario, tendencia hereditaria a las parálisis por presión, neuropatía hereditaria con propensión a las parálisis por presión, síndrome de Insley-Astley, displasia otospondilomegaepifisaria, síndrome de porfiria aguda intermitente, porfiria aguda intermitente, poliposis intestinal -síndrome de pigmentación cutánea, síndrome de Peutz-Jeghers, incontinentia pigmenti (IP), trastorno por almacenamiento de hierro, hemocromatosis, isodicéntrico 15, isodicéntrico 15, sordera aislada, sordera no sindrómica, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Joubert, esclerosis lateral primaria juvenil (JPLS)), esclerosis lateral amiotrófica juvenil, gota juvenil, coreoatetosis, síndrome de retraso mental, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de hiperuricemia juvenil, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Jackson-Weiss (JWS), atrofia muscular espinal y bulbar, enfermedad de Kennedy, espinal y atrofia muscular bulbar, atrofia muscular espinal y bulbar de Kennedy, atrofia muscular espinal y bulbar, histiocitosis de querasina, lipoidosis de querasina, tesaurismosis de querasina, glicinemia cetósica, acidemia propiónica, hiperglicinemia cetósica, acidemia propiónica, enfermedades renales, hiperoxaluria primaria, displasia de Kniest, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Kugelberg-Welander, atrofia muscular espinal, demencia lacunar, síndrome CADASIL, acondrogénesis de Langer-Saldino, displasia de Langer-Saldino, enfermedad de Alzheimer de aparición tardía, enfermedad de Krabbe de aparición tardía (LOKD), enfermedad de Krabbe, trastornos del aprendizaje, discapacidad de aprendizaje, Lentiginosis perioral, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofias, leucodistrofia con fibras de Rosenthal, enfermedad de Alexander, leucodistrofia espongiforme, síndrome de Li-Fraumeni (LFS), síndrome de Li-Fraumeni, deficiencia de lipasa D, deficiencia de lipoproteína lipasa, deficiencia familiar de LIPD, deficiencia de lipoproteína lipasa, Lipidosis familiar, cerebrósido, lipidosis, gangliósido, infantil, enfermedad de Tay-Sachs, histiocitosis lipoidea (tipo querasina), deficiencia de lipoproteína lipasa, enfermedades hepáticas familiares, galactosemia, enfermedad de Lou Gehrig, síndrome de Louis-Bar, ataxia telangiectasia, síndrome de Lynch, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, deficiencia de lisil-hidroxilasa, enfermedad de Machado-Joseph, ataxia espinocerebelosa (cualquier tipo, por ejemplo, SCA1, SCA2, SCA3, SCA 18, SCA20, SCA21, SCA23, SCA26, SCA28, SCA29), Cáncer de mama masculino, cáncer de mama, Trastornos genitales masculinos, Neoplasia maligna de mama, cáncer de mama, tumor maligno de mama, cáncer de mama, Tumor maligno de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, cáncer mamario, cáncer de mama, síndrome de Marfan, síndrome del marcador X, síndrome del X frágil, síndrome de Martin-Bell, síndrome del X frágil, síndrome de McCune-Albright, síndrome de McLeod, síndrome de MEDNIK, anemia mediterránea, beta-talasemia, enanismo megaepifisario, displasia otospondilomegaepifisaria, síndrome de Menkea, enfermedad de Menkes, enfermedad de Menkes, retraso mental con anomalías osteocartilaginosas, síndrome de Coffin-Lowry, trastornos metabólicos, enanismo metatrópico tipo II, displasia de Kniest, displasia metatrópica tipo II, displasia de Kniest, metahemoglobinemia (cualquier tipo, por ejemplo, congénita, globina tipo beta, metahemoglobinemia congénita tipo II), acidemia metilmalónica, síndrome de Marfan (MFS), MHAM, síndrome de Cowden, microsíndrome, microcefalia, MMA, acidemia metilmalónica, enfermedad de Menkes (también conocida como MK o MNK), síndrome de monosomía 1p36, enfermedad de la neurona motora, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos del movimiento, síndrome de Mowat-Wilson, mucopolisacaridosis (MPS I), mucoviscidosis, demencia por infarto múltiple, síndrome CADASII, deficiencia múltiple de carboxilasa de aparición tardía, biotinidasa deficiencia, síndrome de hamartoma múltiple, síndrome de Cowden, neurofibromatosis múltiple, distrofia muscular (cualquier tipo, incluido, por ejemplo, tipo Duchenne y Becker), miotonía atrófica, distrofia miotónica, miotonía distrófica, síndrome de Nance-Insley, displasia otospondilomegaepifisaria, condrodisplasia de Nance-Sweeney, displasia otospondilomegaepifisaria, NBIA1, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, síndrome de Neill-Dingwall, síndrome de Cockayne, neuroblastoma retiniano, retinoblastoma, neurodegeneración con acumulación de hierro cerebral tipo 1, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, enfermedades neurológicas, trastornos neuromusculares, neuronopatía motora hereditaria distal, Niemann-Pick, enfermedad de Niemann-Pick, síndrome de Noack, hiperglicinemia no cetósica, encefalopatía por glicina, enfermedad de Gaucher no neuropática, deficiencia de hiperfenilalaninemia hiperfenilcetonúrica, deficiencia de tetrahidrobiopterina, enfermedad no sindrómica, síndrome de noonan, enfermedad de Norrbottnian Gaucher, Ocronosis, Alkaptonuria, síndrome de Ogden, osteogenesis imperfecta (OI), enfermedad de OslerWeber-Rendu, telangiectasia hemorrágica hereditaria, OSMED, displasia otoespondilomegaepifisaria, osteogenesis imperfecta, Osteopsatirosis, osteogenesis imperfecta, osteosclerosis congénita, displasia otoespondilomegaepifisaria, displasia otospondilomegaepifisaria, displasia otospondilomegaepifisaria, oxalosis, hiperoxaluria primaria, oxaluria primaria, hiperoxaluria primaria, neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa, síndrome de Patau (trisomía 13), deficiencia de PBGD, porfiria aguda intermitente, deficiencia de PCC, acidemia propiónica, porfiria cutánea tardía (PCT), enfermedad de PDM, síndrome de Pendred, enfermedad periódica, fiebre mediterránea, peritonitis periódica familiar, síndrome de lentiginosis periorificial, síndrome de Peutz-Jeghers, trastornos del nervio periférico, disautonomía familiar, neurofibromatosis periférica, atrofia muscular peronea, deficiencia peroxisomal de alanina:glioxilato aminotransferasa, hiperoxaluria, síndrome primario de Peutz-Jeghers, enfermedad por deficiencia de fenilalanina hidroxilasa, feocromocitoma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Pierre Robin con condrodisplasia fetal, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, cirrosis pigmentaria, hemocromatosis, síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), neurodegeneración asociada a pantotenato quinasa (PKAN), PKU, fenilcetonuria, plumboporfiria, porfiria por deficiencia de ALA, PMA, enfermedad renal poliquística, displasia fibrosa poliostótica, síndrome de McCune-Albright, poliposis adenomatosa familiar, poliposis intestinal hamartomatosa, síndrome de pólipos y manchas, síndrome de Peutz-Jeghers, deficiencia de porfobilinógeno sintasa, porfiria por deficiencia de ALA, trastorno de porfirina, deficiencia de PPOX, porfiria variegata, síndrome de Prader-Labhart-Willi, síndrome de Prader-Willi, demencia presenil y senil, discinesia ciliar primaria (PCD), hemocromatosis primaria, hemocromatosis, síndrome de hiperuricemia primaria, síndrome de Lesch-Nyhan, demencia degenerativa senil primaria, procolágeno tipo EDS VII, mutante, progeria, Síndrome de progeria de Hutchinson Gilford, síndrome similar a la progeria, síndrome de Cockayne, nanismo progeroide, síndrome de Cockayne, corea progresiva, enfermedad hereditaria crónica (Huntington), enfermedad de Huntington, osteogénesis imperfecta deformante progresiva con esclerótica normal, osteogénesis imperfecta (cualquier tipo, por ejemplo, Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV, Tipo V, Tipo VI, Tipo VII, Tipo VIII), distrofia miotónica proximal (PROMM), acidemia propiónica, deficiencia de propionil-CoA carboxilasa, deficiencia de proteína C, deficiencia de proteína S, protoporfiria, deficiencia de protoporfirinógeno oxidasa, porfiria variegada, distrofia miotónica proximal, distrofia miotónica tipo 2, miopatía miotónica proximal, enfermedad de pseudo-Gaucher, pseudoxantoma elástico, lipidosis psicosina, enfermedad de Krabbe, hipertensión arterial pulmonar, hipertensión pulmonar, pseudoxantoma elástico (PXE)), pseudoxantoma elástico, retinoblastoma (Rb), enfermedad de Recklinghausen, poliserositis recurrente, trastornos de la retina, síndrome de retinitis pigmentosa-sordera, síndrome de Usher, retinoblastoma, síndrome de Rett, RFALS tipo 3, síndrome de Ricker, síndrome de Riley-Day, disautonomía familiar, síndrome de Roussy-Levy, síndrome de Rubinstein-Taybi (RSTS), síndrome de Rett (RTS), síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sack-Barabas, enfermedad de SADDAN, síndrome de la familia de sarcomas de Li y Fraumeni, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome SBLA (sarcoma, mama, leucemia y síndrome de la glándula suprarrenal), síndrome de Li-Fraumeni, atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), schwannoma acústico, bilateral, neurofibromatosis tipo II, síndrome de Schwartz-Jampel, ligado al cromosoma X inmunodeficiencia combinada grave (SCIDX1), SED congénita, displasia espondiloepifisaria congénita, SED Strudwick, displasia espondiloepimetafisaria tipo Strudwick, displasia espondiloepimetafisaria congénita (SEDc), displasia espondiloepimetafisaria (SEMD), SEMD tipo Strudwick, demencia senil, acondroplasia grave con retraso en el desarrollo y acantosis nigricans, enfermedad de SADDAN, síndrome de Shprintzen, síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X de Siderius causado por mutaciones en el gen PHF8, síndrome esqueleto-piel-cerebro, trastornos de la pigmentación de la piel, atrofia muscular espinal (AME), displasia espondilo-meta-epifisaria (SMED) (cualquier tipo, por ejemplo, tipo Studwick, tipo 1), síndrome de Smith-Lemli-Opitz, síndrome de Smith Magenis, porfiria genética sudafricana, parálisis espástica ascendente de inicio infantil, parálisis espástica ascendente hereditaria de inicio infantil, trastornos del habla y la comunicación, esfingolipidosis, Tay-Sachs, enfermedad de Tay-Sachs, espinal y bulbar atrofia muscular, atrofia muscular espinal, atrofia muscular espinal, tipo V distal, neuropatía motora hereditaria distal, atrofia muscular espinal distal con predominio de miembros superiores, neuropatía motora hereditaria distal, ataxia espinocerebelosa, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloepifisaria, colagenopatía (cualquier tipo, por ejemplo, tipos II y XI), displasia espondiloepimetafisaria, displasia espondilometafisaria (DME), displasia espondiloepimetafisaria, degeneración esponjosa del sistema nervioso central, degeneración esponjosa del cerebro, degeneración esponjosa de la sustancia blanca en la infancia, hipertensión pulmonar primaria esporádica, síndrome SSB, síndrome del pelo acerado, enfermedad de Menkes, enfermedad de Steinert, distrofia miotónica, síndrome de distrofia miotónica de Steinert, distrofia miotónica, síndrome de Stickler, accidente cerebrovascular, CADASII, síndrome, síndrome de Strudwick, enfermedad neuronopática subaguda de Gaucher, porfiria genética sueca, porfiria aguda intermitente, porfiria aguda intermitente, displasia del cartílago del queso suizo, displasia de Kniest, enfermedad de Tay-Sachs, TD - enanismo tanatofórico, displasia tanatofórica, t D con fémures rectos y cráneo en forma de hoja de trébol, displasia tanatofórica tipo 2, telangiectasia cerebelo-oculocutánea, ataxia telangiectasia, síndrome de feminización testicular, síndrome de insensibilidad a los andrógenos, deficiencia de tetrahidrobiopterina, síndrome de feminización testicular (TFM), síndrome de insensibilidad a los andrógenos, talasemia intermedia, beta-talasemia, talasemia mayor, beta-talasemia, displasia tanatofórica, trombofilia por deficiencia de cofactor para la proteína C activada, tipo Leiden, trombofilia del factor V Leiden, enfermedad de la tiroides, Neuropatía tomaculosa, neuropatía hereditaria con tendencia a parálisis por presión, deficiencia total de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiencia total de hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Treacher Collins, trias fragilitis ossium, síndrome triple X, síndrome Triplo X, trisomía 21, trisomía X, síndrome de Troisier-Hanot-Chauffard, hemocromatosis, enfermedad de Tay-Sachs (ETS), complejo de esclerosis tuberosa (CET), esclerosis tuberosa, síndrome tipo Turner, síndrome de Noonan, enfermedad por deficiencia de UDP-galactosa-4epimerasa, galactosemia, enfermedad por deficiencia de UDP glucosa 4-epimerasa, galactosemia, deficiencia de UDP glucosa hexosa-1-fosfato uridiltransferasa, galactosemia, sordera indiferenciada, sordera no sindrómica, deficiencia de UPS, porfiria aguda intermitente, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de vejiga, deficiencia de UROD, deficiencia de uroporfirinógeno descarboxilasa, deficiencia de uroporfirinógeno sintasa, porfiria aguda intermitente, síndrome de Usher, deficiencia de UTP hexosa-1-fosfato uridililtransferasa, galactosemia, síndrome de Van Bogaert-Bertrand, síndrome de Van der Hoeve, síndrome velocardiofacial, síndrome de VHL, enfermedad de von Hippel-Lindau, discapacidad visual y ceguera, síndrome de Alstrom, enfermedad de von Bogaert-Bertrand, enfermedad de von Hippel-Lindau, enfermedad de von Recklenhausen-Applebaum, hemocromatosis, enfermedad de von Recklinghausen, neurofibromatosis tipo I, enfermedad de Vrolik, osteogénesis imperfecta, síndrome de Waardenburg, síndrome de Warburg Sjo Fledelius, microsíndrome, enfermedad de Wilson (WD), síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, enfermedad de Werdnig-Hoffmann, atrofia muscular espinal, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wilson, enfermedad de Wilson, síndrome de Wolf-Hirschhorn, enfermedad periódica de Wolff, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller (WZS), xeroderma pigmentoso, retraso mental y macroorquidia ligados al X, síndrome del X frágil, hiperuricemia primaria ligada a X, síndrome de Lesch-Nyhan, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, atrofia del músculo espinal-bulbar ligada al cromosoma X, atrofia muscular espinal y bulbar, defecto de la enzima aciduria úrica ligada al cromosoma X, síndrome de Lesch-Nyhan, X-SCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al X, anemia sideroblástica ligada al X (XLSA), X-SCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al X, anemia sideroblástica ligada al X (XLSA), XSCID, inmunodeficiencia combinada grave ligada al X, síndrome XXX, síndrome triple X, síndrome XXXX, síndrome XXXXX, XXXXX, síndrome XXY, trisomía XXY, síndrome de Klinefelter, síndrome XYY, trastornos de repetición triplete o cualquier combinación de los mismos.
[0339]En formas de realización, un modulador de control postranscripcional específico está dirigido a la modulación, modificación, mejora o disminución de la actividad mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica. Por ejemplo, los moduladores de control postranscripcional pueden incluir PARN, PAN, CPSF, CstF, PAP, PABP, PAB2, CFI, c F iI, ARN trifosfatasa, ARN gluaniltransferasa, A r N metiltransferasa, SAM sintasa, enzima conjugadora de ubiquitina E2R, proteínas SR SFRS1 a través de SFR11, proteínas hnRNP (p. ej., HNRNPA0, HNRNPA1, HNRNPA1L1, HNRNPA1L2, HNRNPA2, HNRNPA2B1, HNRNPAB, HNRNPB1, HNRNPC, HNRNPCL1, HNRNPD, HNRPDL, HNRNPF, HNRNPH1, HNRNPH2, HNRNPH3, HNRNPK, HNRNPLL, HNRNPM, HNRNPR, HNRNPU, HNRNPUL1, HNRNPUL2, HNRNPUL3, ADAR, Mex 67, Mtr2, Nab2, helicasa de DEAD-box, elF4A, elF4B, elF4E, elF4G, GEF, GCN2, PKR, HRI, PERK, eEF1, eEF2, GCN, eRF3, unión específica de ARE proteínas, EXRN1, DCP1, DCP2, RCK/p54, CPEB, eIF4E, microARN y ARNip, DICER, proteínas Ago, proteínas de desintegración de ARNm mediadas por Nonsence, UPF3A, UPF3BeIF4A3, MLN51, Y14/MAGOH, MG-1, SMG-5, SMG-6, SMG-7 o cualquier combinación de los mismos.
[0340]En algunas formas de realización, las vías genéticas asociadas con el ciclo celular se modulan, mejoran o disminuyen en actividad mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica. Las vías y genes ejemplares asociados con el ciclo celular incluyen ATM, PMS2, FAS-L, MRE11, MLH1, FasR, NBS1, MSH6, Trail-L, RAD50, MSH2, Trail-R, 53BP1, RFC, TNF-Ct, P53. PCNA, TNF-R1, CHKE, MSH3, FADD, E2F1, MutS, homólogo, TRADD, PML, MutL, homólogo, R1P1, FANCD2, exonucleasa, MyD88, SMC1, ADN, polimerasa, delta, IRAK, BLM1, (POLDl, POLD2, POLD3, NIL, BRCA1 y POLD4, -genes, IKK, H2AX, codificación, subunidades), NEKp, ATR, topoisomerasa, 1, kBa, RPA, topoisomerasa, 2, IAP, ATRIP, RNAseHl, caspasa, 3, RAD9, Ligasa, 1, Caspasa, 6, RAD1,<a>D<n>, polimerasa, 1, Caspasa, 7, HUS, ADN, polimerasa, 3, Caspasa, 8,<r>A<d>17, Primasa, Caspasa, 10, RFC, Helicasa, HDAC1, CHK1, hebra simple, unión, HDAC2, TLK1, proteínas, citocromo, C, CDC25, Bxl-xL, STAT3, STATS, DFF45, Vcl-2, ENDO-G, PI3K, Akt, Calpain, Bad, Bax, proteólisis mediada por ubiqiiitina, hipoxia, Proliferación celular, HIF-loc, MAPK, El, HERC1, TRAF6, HIFip, MAPKK, E2, UBE2Q, MEKK1, Refl, MAPKKK, E3, UBE2R, COP!, HSP90, c-Met, UBLE1A, UBE2S, PIFH2, VEGF, HGF, UBLE1B, UBE2U, clAP, PAS, ER, S1/2, UBLEIC, UBE2W, PIAS, ARNT, ATK, UBE2A, UBE2Z, SYVN, VHL, PKC, UBE2B, AFC, LLC, N, NHLRC1, HLF, Paxilin, UBE2C, UBE1, AIRE, EPF, FAK, UBE2A, E6AP, MGRN1, VDU2, Adducin, UBE2E, UBE3B, BRCA1, SUMORESUME, PYK1, UBE2F, Pitufo, FANCL, SENP1, RB, UBE2G1, Picazón, MIDI, Calcineurina, A, RBI, UBE2G2, HERC2, Cdc20, RACK1, Raf-1, UBE2I, HERC3, Cdhl, PTB, A-Raf, UBE2J1, HERC4, Apcl, Hur, B-raf, UBE2J2, UBE4A, Apc2, PHD2, MEK1/2, UBE2L3, UBE4B, Apc3, SSAT2, ERK1/2, UBE2L6, CHIP, Apc4, SSAT1, Ets, UBE2M, CYC4, Apc5, GSK3, Elkl, UBE2N, PPR19, Apc6, CBP, SAP1, UBE20, UIP5, Apc7, FOX04, cPLA2, WWPI, Mdm2, Apc8, FlH-1, WWP2, Parkin, Apc9, TRIP, 12, Trim32, Ape, 10, NEED4, Trim37, Ape, 11, ARFBP1, SIAH-1, Ape, 12, E<d>D1,<p>M<l>, Célula, supervivencia, Célula, ciclo, arresto,<s>M<a>DI, P21, SMAD5,<b>A<x>, SAMD8, MDR, LEF1, DRAIL, IGFBP3, TCF3, GADD45, TCF4, P300, HAT1, PI3, Akt, GF1 o cualquier combinación de los mismos.
[0341]En algunas formas de realización, los genes asociados con la angiogénesis se modulan, mejoran o disminuyen en actividad mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica a una(s) célula(s). Los genes ejemplares y las vías genéticas asociadas con la angiogénesis y las afecciones relacionadas con la angiogénesis incluyen VEGF, VEGFR2, SHC, E2F7, VEGFB, VEGFR3, PI3, VEGFC, Nrp 1, PIP3, EGFDIP3, DAG, GRB2, SOS, Akt, PB, PKC. Ras, RAF1, DAG, eNOS, NO, ERK1, ER2, cPLA2, ME1, MEK2 o cualquier combinación de los mismos.
[0342]En algunas formas de realización, las vías genéticas y/o genes asociados con la función mitocondrial se modulan, mejoran o disminuyen en actividad mediante la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición genómica a una(s) célula(s). Los genes ejemplares y las vías genéticas asociadas con la función mitocondrial incluyen malato deshidrogenasa Aminotransferasa, hidratasa, desacilasa, deshidrogenasa, carboxilasa, mutasa, oxidación de ácidos grasos, Oxidación de leucina, Trastornos de isoleucina (deficiencias de la vía de oxidación de la vía enzimática) Aminotransferasa Aminotransferasa, OCTN2 Cadena ramificada Cadena ramificada, FATP1 -6 aminotransferasa 2, aminotransferasa 2, CPT-1 mitocondrial mitocondrial, CACT isobutil-CoA 2-metilbutil-CoA, CPT-II deshidrogenasa deshidrogenasa, SCAD (cadena ramificada (cadena ramificada, MCAD cetoácido cetoácido, VLCAD deshidrogasa deshidrogenasa, complejo ETF-DH) Complejo), Alfa-ETF Hidratasa Hidratasa, Beta-ETF HMG-CoA liasa 2-metil-3-OH-SCHAD butiril-CoA, LCHAD deshidrogenasa, MTP 3-Oxotiolasa, LKAT,DECR 1, HMGCS2, HMGCL o cualquier combinación de los mismos.
[0343]En algunas formas de realización, las vías genéticas y/o los genes asociados con el daño del ADN o la inestabilidad genómica se modulan, mejoran o disminuyen en actividad. Genes ejemplares y vías genéticas asociadas con vías y/o genes relacionados con el daño del ADN y la inestabilidad genómica incluyen 53BP1, BLM, MBD2, ADN, ligasa, 4, MDC1, H2AX, XLF, SMC1, 53BP1, Rad50, P53, P53, Artemis, Rad27, TdT, APE1, PMS2, APE2, UvrA, RecA, MLH1, NEIL1, UvrB, SSB, MSH6, NEIL2, UvrC, Mrell, MSH2, NEIL3, XPC, Rad50, RFC, XRCC1, Rad23B, Nbsl, PCNA, PNKP, CEN2, CtlP, MSH3, Tdpl, DDB1, RPA, MutS, APTX, XPE, Rad51, MutL, ADN, polimerasa p CSA, Rad52, ADN polimerasa ó, CSB, Rad54, topoisomerasa, 1, ADN, TFT1H, BRCA1, topoisomerasa, 2, PCNA, Xp B, BRCA2, ARNseHI, FEN1, XPD, Exol, Ligasa 1, RFC, XPA, BLM, ADN, polimerasa, 1, PAR, 1, RPA, Topllla, ADN, Ligl, XPG, GEN1, Primasa, Lig3, ERCC1 Yenl Helicasa, UNG, XPF, Slxl, SSBs, MUTY ADN polimerasa ó, Slx4, SMUG ADN polimerasa £, Mus8, MBD4, Emel, Dssl, ASH1L, SETD4, DQT1L, SETD5, EHMT1, SETD6, EHMT2, SETD7, EZH1, SETD8, EZH2, SETD9, MLL, SETDB1, MLL2, SETDB2, MLL3, SETMAR, MLL4, SMYD, 1, MLL5, SMYD2, NSD, 1, SMYD3, PRDM2, SMYD4, SET, SMYD5, SETBP1, SUV39H1, SETD 1A, SUV39H2, SETD 1B, SUV420H1, SETD2, SUV420 H2, SETD3 o cualquier combinación de los mismos.
[0344]En algunas formas de realización, los genes que codifican factores de transcripción de mamíferos se modulan, mejoran, disminuyen o se proporcionan a una célula. Los factores de transcripción humanos ejemplares incluyen AFF4, AFF3, AFF2, AFF1, AR, TFAP2B, TFAP2D, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, JARID2, KDM5D, ARID4A, ARID4B, KDM5A, ARID3A, KDM5B, KDM5C, ARID5B, ARID3B, ARID2, ARID5A, ARID3C, ARID1A, ARID1B, HIF1A, NPAS1, NPAS3, NPAS4, MLXIPL, ARNTL2, MXD1, AHRR, TFE3, HES2, MNT, TCF3, SREBF1, TFAP4, TCFL5, LYL1, USF2, TFEC, AHR, MLX, MYF6, MYF5, SIM1, TFEB, HAND1, HES1, ID2, MYCL1, ID3, TCF21, MXI1, SOHLH2, MYOG, TWIST1, NEUROG3, BHLHE41, NEUROD4, MXD4, BHLHE23, TCF15, MAX, ID1, MYOD1, ARNTL, BHLHE40, MYCN, CLOCK, HEY2, MYC, ASCL1, TCF12, ARNT, HES6, FERD3L, MSGN1, USF1, TAL1, NEUROD1, TCF23, HEYL, HAND2, NEUROD6, HEY1, SOHLH1, MESP1, PTF1A, ATOH8, NPAS2, NEUROD2, NHLH1, ID4, ATOH1, ARNT2, HES3, MLXIP, ASCL3, KIAA2018, OLIG3, NHLH2, NEUROG2, MSC, HES7, ATOH7, BHLHA15, BHLHE22, NEUROG1, FIGLA, ASCL2, OLIG1, TAL2, MITF, SCXB, HELT, ASCL4, MESP2, HES4, SCXA, TCF4, HESS, SREBF2, BHLHA9, OLIG2, MXD3, TWIST2, LOC388553, C13orf38-SOHLH2, CEBPE, XBP1, BATF3, CREB5, CEBPG, ATF3, ATF7, CEBPB, CEBPD, CEBPA, CBFB, CAMTA2, CAMTA1, EBF4, EBF3, EBF1, EBF2, NR2F6, NR2F1, NR2F2, GRHL2, TFCP2L1, GRHL1, TFCP2, UBP1, GRHL3, YBX2, CSDE1, CSDA, YBX1, LIN28A, CARHSP1, CSDC2, LIN28B, NFIX, NFIC, NFIB, NFIA, CUX2, ONECUT2, CUX1, ONECUT1, SATB1, ONECUT3, SATB2, DMRT3, DMRT1, DMRTC2, DMRTA2, DMRTB1, DMRT2, DMRTA1, E2F2, E2F1, E2F3, TFDP2, E2F8, E2F5, E2F7, E2F6, TFDP3, TFDP1, E2F4, NR1H3, NR1H2, ETV1, ETV7, SPI1, ELF4, ETV2, ERF, ELF2, ELK3, ETV3, ELF1, SPDEF, ELK1, ETS1, EHF, ELF5, ETV6, SPIB, FLI1, GABPA, ERG, ETS2, ELK4, ELF3, FEV, SPIC, ETV4, ETV5, FOXN3, FOXC1, FOXJ2, FOXF1, FOXN1, FOXM1, FOXP1, FOXO3, FOXA2, FOXP2, FOXJ1, FOXP4, FOXF2, FOXN4, FOXK2, FOXO1, FOXH1, FOXQ1, FOXK1, FOXI1, FOXD4, FOXA3, FOXN2, B1, FOXG1, FOXR1, FOXL1, FOXC2, FOXE1, FOXS1, FOXL2, FOXO4, FOXD4L1, FOXD4L4, FOXD2, FOXI2, FOXE3, FOXD3, FOXD4L3, FOXR2, FOXJ3, FOXO6, FOXB2, FOXD4L5, FOXD4L6, KIAA0415, FOXA1, FOXP3, GCM2, GCM1, NR3C1, GTF2IRD1, GTF2I, GTF2IRD2B, GTF2IRD2, SOX8, SOX30, PMS1, CIC, TCF7, TOX4, SOX10, HMGXB4, HBP1, TFAM, UBTF, WHSC1, SOX6, HMGXB3, BBX, TOX2, SOX4, SOX21, SOX9, SOX15, SOX5, SOX3, LEF1, HMG20A, SOX13, TCF7L2, SSRP1, TCF7L1, SOX17, SOX14, PINX1, SOX7, SOX11, SOX12, SOX2, SOX1, SRY, SOX18, UBTFL1, UBTFL2, TOX, HMGB1, HMGB2, PBRM1, TOX3, SMARCE1, HMG20B, HMGB3, HMGA2, HMGA1, ARX, HOXA11, MEOX1, DLX6, ISL1, HOXC8, BARX2, ALX4, GSC2, DLX3, PITX1, HOXA9, HOXA10, LHX5, LASS4, ZFHX4, SIX4, VSX1, ADNP, RHOXF1, MEIS3, PBX4, DLX5, HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA5, HOXA6, HOXA13, EVX1, NOBOX, MEOX2, LHX2, LHX6, LHX3, TLX1, PITX3, HOXB6, HNF1B, DLX4, SEBOX, VTN, PHOX2B, NKX3-2, DBX1, NANOG, IRX4, CDX1, TLX2, DLX2, VAX2, PRRX1, TGIF2, VSX2, NKX2-3, HOXB8, HOXB5, HOXB7, HOXB3, HOXB1, MSX2, LHX4, HOXA7, HOXC13, HOXC11, HOXC12, ESX1, BARHL1, NKX2-4, NKX2-2, SIX1, HOXD1, HOXD3, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD13, MNX1, CDX4, BARX1, RHOXF2, LHX1, GSC, MEIS2, RAX, EMX1, NKX2-8, NKX2-1, HLX, LMX1B, SIX3, LBX1, PDX1, LASS5, ZFHX3, BARBL2, LHX9, LASS2, MEIS1, DLX1, HMBOX1, ZEB1, VAX1, NKX6-2, VENTX, HHEX, TGIF2LX, LASS3, ALX3, HOXB13, IRX6., ISL2, PKNOX1, LHX8, LMX1A, EN1, MSX1, NKX6-1, HESX1, PITX2, TLX3, EN2, UNCX, GBX1, NKX6-3, ZHX1, HDX, PHOX2A, PKNOX2, CDX2, DRGX, NKX3-1, PBX3, PRRX2, GBX2, SHOX2, GSX1, HOXD4, HOXD12, EMX2, IRX1, IRX2, SIX2, HOXB9, HOPX, OTP, LASS6, HOXC5, HOXB2, RAX2, EVX2, ZHX3, PROP1, ISX, HOXD8, TGIF2LY, IRX5, SIX5, TGIF1, IRX3, ZHX2, LBX2, NKX2-6, ALX1, GSX2, HOXC9, HOXC10, HOXB4, NKX2-5, SIX6, MIXL1, DBX2, PBX1, SHOX, ARGFX, HMX3, HMX2, BSX, HOXA4, DMBX1, HOXC6, HOXC4, RHOXF2B, PBX2, DUXA, DPRX, LEUTX, NOTO, HOMEZ, HMX1, DUX4L5, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L6, NKX1-1, HNF1A, HSF4, HSFY2, HSFX1, HSFX2, HSFY1, HSF1, LCORL, LCOR, IRF6, IRF1, IRF3, IRF5, IRF4, IRF8, IRF2, IRF7, IRF9, MBD3, BAZ2B, MBD4, SETDB2, MBD1, MECP2, SETDB1, MBD2, BAZ2A, SMAD7, SMAD5, SMAD9, SMAD6, SMAD4, SMAD3, SMAD1, SMAD2, ZZZ3, RCOR1, CDC5L, MYBL2, DNAJC2, TADA2A, RCOR3, MYB, TERF2, DMTF1, DNAJC1, NCOR1, TERF1, MIER3, MYSM1, SNAPC4, RCOR2, TADA2B, MYBL1, TERF1P2, NCOR2, CCDC79, SMARCC1, SMARCC2, TTF1, C11orf9, NFYA, NFYC, NFYB, NRF1, NR4A3, NR4A1, NR4A2, ESR1, NR0B2, NR0B1, PREB, EAF2, SPZ1, TP63, TP73, TP53, PAX6, PAX7, PAX2, PAX4, PAX8, PAX1, PAX3, PAX5, PAX9, SUBI, POU2F2, POU1F1, POU4F3, POU6F2, POU2F3, POU2F1, POU4F2, POU4F1, POU6F1, POU3F2, POU3F1, POU3F4, POU3F3, POU5F1, POU5F1B, PPARD, PPARG, PPARA, PGR, PROX2, NR2E1, NR5A2, NR2C1, NR5A1, NR6A1, ESRRA, NR2C2, RFX3, RFX2, RFX4, RFX1, RFX5, RFX7, RFX6, RFX8, NFATC3, NFKB2, NFATC4, NFATC2, NFAT5, RELB, NFKB1, NFATC1, REL, RELA, RORA, RORC, NR1D2, RORB, RUNX3, RUNX1, SP100, SP140, GMEB2, SP110, AIRE, GMEB1, DEAF1, SP140L, LOC729991- MEF2B, MEF2A, SRF, MEF2D, MEF2B, STAT1, STAT5A, STAT4, STAT6, STAT3, STAT2, STAT5B, TBX21, TBX5, TBX15, TBX18, TBX2, TBX4, TBX22, TBX3, TBR1, TBX19, TBX6, EOMES, T, TBX20, TBX10, MGA, TBX1, TEAD3, TEAD2, TEAD1, TEAD4, CREBL2, NFE2L3, CREB3L3, FOSL2, NFE2L1, CREM, DBP, CREB3, HLF, BACH2, ATF2, NFE2L2, ATF6, CREB1, ATF1, NFE2, FOSB, ATF4, NRL, JUND, JDP2, CREB3L4, BATF, BACH1, CREB3L1, NFIL3, TEF, BATF2, ATF5, FOS, JUNB, DDIT3, FOSL1, JUN, MAF, CREB3L2, MAFA, MAFF, MAFG, MAFK, MAFB, ATF6B, CRX, OTX1, OTX2, THAP3, THAP10, THAP1, PRKRIR, THAP8, THAP9, THAP11, THAP2, THAP6, THAP4, THAP5, THAP7, NR1H4, NR2E3, RARB, HNF4A, VDR, ESRRB, THRA, NR1D1, RARA, ESR2, NR1I3, NR1I2, THRB, NR3C2, HNF4G, RARG, RXRA, ESRRG, RXRB, TSC22D1, TSC22D3, TSC22D4, TSC22D2, TULP3, TULP2, TULP1, TULP4, TUB, ZBTB33, ZBTB32, ZBTB11, MYNN, ZBTB25, PATZ1, ZBTB16, ZBTB24, BCL6, ZBTB47, ZBTB17, ZBTB45, GZF1, ZBTB1, ZBTB46, ZBTB8A, ZBTB7B, BCL6B, ZBTB49, B43, HIC2, ZBTB26, ZNF131, ZNF295, ZBTB4, ZBTB34, ZBTB38, HIC1, ZBTB41, ZBTB7A, ZNF238, ZBTB42, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB40, ZBTB7C, ZBTB37, ZBTB3, ZBTB6, ZBTB44, ZFP161, ZBTB12, BTB48, ZBTB10, ZBED4, ZBED3, ZBED2, C11orf95, ZBED1, IKZF5, ZNF821, ZNF451, ZNF195, ZFX, ZNF263, ZNF200, VIHEP2, WIZ, ZNF582, SNAI2, ZFP64, IKZF2, ZIC2, ZNF800, PRDM1, PRDM6, ZFP112, ZNF275, ZFAT, KLF6, ZFY, ZXDC, GLI2, ZNF532, ZNF37A, ZNF510, ZNF506, ZNF324, ZNF671, ZNF416, ZNF586, ZNF446, ZNF8, ZNF264, REST, MECOM, ZNF213, ZNF343, ZNF302, ZNF268, ZNF10, VIHEP1, ZNF184, F1, SAL4, ZNF516, KLF8, KLF5, ZNF629, ZNF423, CTCF, ZNF500, ZNF174, SALL1, MAZ, ZNF419, OVOL3, ZNF175, ZNF14, ZNF574, ZNF85, SP4, ZKSCAN1, GLI3, GLIS3, KLF3, PRDM4, GLI1, PRDM13, ZNF142, PRDM2, ZNF684, ZNF541, KLF7, PLAGL1, ZNF430, KLF12, KLF9, ZNF410, BCL11A, EGR1, ZFP30, TSHZ3, ZNF549, ZSCAN18, ZNF211, ZNF639, ZSCAN20, GTF3A, ZNF205, ZNF644, IKZF4, CTCFL, ZNF831, SNAI1, ZNF576, ZNF45, TRERF1, ZNF391, RREB1, ZNF133, OVOL2, ZNF436, PLAGL2, GLIS2, ZNF384, ZNF484, VIHEP3, BCL11B, KLF2, ZNF780B, FEZF1, KLF16, ZSCAN10, ZNF557, ZNF337, ZNF317, ZNF426, ZNF331, ZNF236, ZNF341, ZNF227, ZNF141, ZNF304, ZSCAN5A, ZNF132, ZNF20, EGR4, ZNF670, VEZF1, KLF4, ZFP37, ZNF189, ZNF193, ZNF280D, PRDM5, ZNF740, ZIC5, ZSCAN29, ZNF434, ZNF287, ZIM3, PRDM15, ZFP14, ZNF787, ZNF473, ZNF614, PRDM16, ZNF697, ZNF687, OSR1, ZNF514, ZNF660, ZNF300, RBAK, ZNF92, ZNF157, ZNF182, ZNF41, ZNF711, PRDM14, ZNF7, ZNF214, ZNF215, TODOS3, ZNF827, ZNF547, ZNF773, ZNF776, ZNF256, ZSCAN1, ZNF837, PRDM8, ZNF117, ZIC1, FEZF2, ZNF599, ZNF18, KLF10, ZKSCAN2, ZNF689, ZIC3, ZNF19, ZSCAN12, ZNF276, ZNF283, ZNF221, ZNF225, ZNF230, Z NF222, ZNF234, ZNF233, ZNF235, ZNF362, ZNF208, ZNF714, ZNF394, ZNF333, ZNF382, IKZF3, ZNF577, ZNF653, ZNF75A, GFI1, ZNF281, ZNF496, ZNF2, ZNF513, ZNF148, KLF15, ZNF691, ZNF589, ZNF, 12, SP8, OSR2, ZNF367, ZNF22, GFI1B, ZNF219, SALL2, ZNF319, ZNF202, ZNF143, ZNF3, ZSCAN21, ZNF606, SP2, ZNF91, ZNF23, ZNF226, ZNF229, ZNF180, ZNF668, ZNF646, ZNF641, ZNF610, ZNF528, ZNF526, ZNF146, ZNF444, ZNF83, ZNF558, ZNF232, E4F1, ZNF597, INSM2, ZNF30, ZNF507, ZNF354A, ZEB2, ZNF32, KLF13, ZFPM2, ZNF764, ZNF768, ZNF35, ZNF778, ZNF212, ZNF282, PRDM10, SP7, SCRT1, ZNF296, ZNF160, ZNF415, ZNF672, ZNF692, ZNF439, ZNF440, ZNF581, ZNF524, ZNF562, ZNF561, ZNF584, ZNF274, ZIK1, ZNF540, ZNF570, KLF17, ZNF217, ZNF57, ZNF556, ZNF554, KLF11, HINFP, NF24, ZNF596, OVOL1, SP3, ZNF621, ZNF680, BNC2, ZNF483, ZNF449, INSM1, ZNF417, ZNF791, ZNF80, GLIS1, ZNF497, KLF14, ZNF266, ZIC4, ZNF408, ZNF519, ZNF25, ZNF77, ZNF169, ZNF613, ZNF683, ZNF135, ZSCAN2, ZNF575, ZNF491, ZNF620, ZNF619, ZNF354C, ZNF114, ZNF366, ZNF454, ZNF543, ZNF354B, ZNF223, ZNF713, ZNF852, ZNF552, ZFP42, ZNF664, EGR3, ZFPM1, ZNF784, ZNF648, FIZ1, ZNF771, TSHZ1, NF48, ZNF816, ZNF571, ZSCAN4, ZNF594, ZFP3, ZNF443, ZNF792, ZNF572, ZNF707, ZNF746, ZNF322A, ZNF467, ZNF678, ZFP41, HKR1, PLAG1, ZNF329, ZNF101, ZNF716, ZNF708, ZSCAN22, ZNF662, ZNF320, ZNF623, ZNF530, ZNF285, ZFP1, WT1, ZFP90, ZNF479, ZNF445, ZNF74, SP1, SNAI3, ZNF696, IKZF1, ZNF267, ZNF566, ZNF224, ZNF529, ZNF284, ZNF749, ZNF17, ZNF555, ZNF75D, ZNF501, ZNF197, ZNF396, ZFP91, 2, ZNF397, ZSCAN30, ZNF546, ZNF286A, ZKSCAN4, ZNF70, ZNF643, ZNF642, ZSCAN23, ZNF490, ZNF626, ZNF793, ZNF383, ZNF669, ZNF559, ZNF177, ZNF548, MTF1, ZNF322B, ZNF563, ZNF292, ZNF567, ZNF573, ZNF527, ZNF33A, ZNF600, ZKSCAN3, ZNF676, ZNF699, ZNF250, ZNF79, ZNF681, ZNF766, ZNF107, ZNF471, ZNF836, ZNF493, ZNF167, ZNF565, ZNF34, ZNF781, ZNF140, ZNF774, ZNF658, ZNF765, ZNF124, ZNF569, ZNF777, ZNF775, ZNF799, ZNF782, ZNF846, ZNF136, ZKSCAN5, ZNF502, ZFP62, ZNF33B, ZNF512B, ZNF431, ZNF418, ZNF700, ZNF239, ZSCAN16, ZFP28, ZNF705A, ZNF585A, ZNF138, ZNF429, ZNF470, ZNF100, ZNF398, ZNF498, ZNF441, ZNF420, ZNF763, ZNF679, ZNF682, ZNF772, ZNF257, ZNF785, ZSCAN5B, ZNF165, ZNF655, ZNF98, ZNF786, ZNF517, ZNF675, ZNF860, ZNF628, ZNF665, ZNF624, ZNF841, ZNF615, ZNF350, ZNF432, ZNF433, ZNF460, ZNF81, ZNF780A, ZNF461, ZNF181, LOC100287841, ZNF44, ZNF790, ZNF677, ZNF823, ZNF311, ZNF347, ZNF71, ZNF121, ZNF335, ZNF560, ZNF273, ZNF84, ZNF667, ZNF649, ZNF248, ZNF544, ZNF770, ZNF737, ZNF251, ZNF607, ZNF334, ZXDA, ZNF485, ZIM2, PEG3, ZNF192, ZNF442, ZNF813, ZNF26, ZNF69, ZNF583, ZNF568, ZXDB, ZNF480, ZNF587, ZNF808, ZNF43, ZNF28, ZNF627, ZNF789, ZNF536, ZNF534, ZNF652, ZNF521, ZNF358, ZFP2, ZNF814, ZNF551, ZNF805, ZSCAN5C, ZNF468, ZNF616, ZFP57, ZNF155, ZNF783, ZNF425, ZNF580, ZNF611, ZNF254, ZNF625, ZNF134, ZNF845, ZNF99, ZNF253, ZNF90, ZNF93, ZNF486, REPIN1, LOC100131539, NF705D, LOC100132396, ZNF705G, SCRT2, ZNF407, SP9, ZNF579, ZNF880, ZNF630, ZNF844, ZNF469, ZNF717, ZNF865, ZNF492, ZNF688, YY2, ZNF878, ZNF879, ZNF736, ZNF323, ZNF709, ZNF512, ZNF585B, ZNF154, ZNF324B, ZNF564, ZFP82, GLI4, ZNF674, ZNF345, ZNF550, KLF1, YY1, MYST2, ST18, L3MBTL4, MYT1L, MYT1, L3MBTL1, MTA3, GATA1, TRPS1, GATA3, GATA5, GATA4, GATA6, GATAD2B, GATAD1, GATA2, MTA1, ZGLP1, MTA2, RERE, C16orf5, LITAF, PIAS1, PIAS2, PIAS4, ZMIZ1, ZMIZ2, PIAS3, RNF138, NFX1, NFXL1, o cualquier combinación de los mismos.
[0345] En algunas formas de realización, las células se manipulan (p. ej., se convierten o diferencian) de un tipo de célula a otro. En algunas formas de realización, se manipula una célula pancreática para convertirla en una célula de un islote beta. En algunas formas de realización, se manipula un fibroblasto para convertirlo en una célula iPS. En algunas formas de realización, se manipula un preadipocito para convertirlo en una célula de grasa parda. Otras células ejemplares incluyen, por ejemplo, células musculares, células neurales, leucocitos y linfocitos.
[0346] En algunas formas de realización, la célula es una célula enferma o portadora de mutantes. Dichas células pueden manipularse para tratar la enfermedad, por ejemplo, para corregir una mutación, o para alterar el fenotipo de la célula, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa. Por ejemplo, una célula está asociada con una o más enfermedades o afecciones descritas en el presente documento.
[0347] En algunas formas de realización, la célula manipulada es una célula normal.
[0348] En algunas formas de realización, la célula manipulada es una célula madre o célula progenitora (p. ej., iPS, células madre o progenitoras embrionarias, hematopoyéticas, adiposas, de línea germinal, pulmonares o neurales). En algunas formas de realización, la célula manipulada puede ser una célula de cualquiera de las tres capas germinales (es decir, mesodérmica, endodérmica o ectodérmica). En algunas formas de realización, la célula manipulada puede ser de un tejido extraembrionario, por ejemplo, de la placenta.
[0349] En algunas formas de realización, la célula que se manipula se selecciona de fibroblastos, precursores monocíticos, células B, células exocrinas, progenitores pancreáticos, progenitores endocrinos, hepatoblastos, mioblastos o preadipocitos. En algunas formas de realización, la célula se manipula (p. ej., se convierte o se diferencia) en células musculares, células megacariocíticas eritroides, eosinófilos, células iPS, macrófagos, células T, células beta de los islotes, neuronas, cardiomiocitos, células sanguíneas, progenitores endocrinos, progenitores exocrinos, células ductales, células acinares, células alfa, células beta, células delta, células PP, hepatocitos, colangiocitos, angioblastos, mesoangioblastos o adipocitos marrones.
[0350] En algunas formas de realización, la célula es una célula muscular, una célula megacariocítica eritroide,
[0351] eosinófilos, células iPS, macrófagos, células T, células beta de los islotes, neuronas, cardiomiocitos, células sanguíneas, progenitores endocrinos, progenitores exocrinos, células ductales, células acinares, células alfa, células beta, células delta, células PP, hepatocitos, colangiocitos, o adipocito blanco o marrón.
[0352] En algunas formas de realización, la célula es una célula precursora, una célula pluripotente, una célula totipotente, una célula madre adulta, una célula de masa celular interna, una célula madre embrionaria o una célula iPS.
[0353] En algunas formas de realización, la célula manipulada es una célula cancerosa. En algunas formas de realización, la célula cancerosa puede ser una célula cancerosa de pulmón, una célula cancerosa de mama, una célula cancerosa de piel, una célula cancerosa de cerebro, una célula cancerosa de páncreas, una célula cancerosa hematopoyética, una célula cancerosa de hígado, una célula cancerosa de riñón, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de piel.
[0354] En algunas formas de realización, la célula es una célula muscular, una célula eritroide-megacariocítica, un eosinófilo, una célula iPS, un macrófago, una célula T, una célula beta de los islotes, una neurona, un cardiomiocito, una célula sanguínea, un progenitor endocrino, un progenitor exocrino, una célula ductal, una célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatocito, colangiocito o adipocito blanco o marrón.
[0355] Administración de inhibidores de ADN-PK y sistema de edición de genes a una(s) célula(s)
[0356] La administración a una(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica. La administración puede ser in vitro, ex vivo o in vivo. La administración a una(s) célula(s) de un sistema de edición del genoma y un inhibidor de ADN-PK puede ocurrir simultánea o secuencialmente. En algunas formas de realización, la administración da como resultado que el inhibidor de ADN-PK y los componentes del sistema de edición del genoma ingresen a la membrana celular. En algunas formas de realización, la administración da como resultado que el inhibidor de ADN-PK y los componentes del sistema de edición del genoma ingresen al núcleo celular. En algunas formas de realización, la administración incluye incubar la célula en presencia del inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición del genoma.
[0357] El sistema de edición de genes se puede administrar a una(s) célula(s) mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar cualquier método de administración de proteínas o ácidos nucleicos conocido en la técnica. El sistema de edición de genes se administra (p. ej., se administra) a una célula mediante un ácido nucleico que codifica los componentes del sistema de edición de genes. El sistema de edición de genes puede administrarse a una célula mediante vectores virales o vectores no virales. En algunas formas de realización, se utilizan vectores virales. Los vectores virales pueden ser virus retrovirales (p. ej., leucemia murina, VIH o lentivirales) o de ADN (p. ej., adenovirus, herpes simple y adenoasociados). En algunas formas de realización, se usan métodos de transfección (p. ej., métodos de administración no virales) para introducir el sistema de edición del genoma en una célula. Los métodos de transfección incluyen poner en contacto la célula con DEAE-Dextrano, fosfato cálcico, liposomas o electroporación de un plásmido en una célula. Los métodos adicionales de administración no viral incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o lípido: conjugados de ácido nucleico, ADN desnudo, ARN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN mejorada por agentes. También se puede utilizar la sonoporación utilizando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) para la administración de ácidos nucleicos. En algunas formas de realización, uno o más ácidos nucleicos se administran como ARNm. En algunas formas de realización, se usan ARNm protegidos para aumentar la eficiencia de traducción y/o la estabilidad del ARNm. En algunas formas de realización, se utilizan tapas ARCA (análogo de tapa anti-reversa) o variantes de las mismas. Véanse las patentes estadounidenses US7074596 y US8153773.
[0358] En formas de realización, la endonucleasa (p. ej., Cas, Cpfl y similares) y el ARNg se transcriben a partir de ADN.
[0359] En formas de realización, la endonucleasa (p. ej., Cas, Cpfl y similares) se transcribe a partir de ADN y el ARNg se proporciona como ARN.
[0360] En formas de realización, la endonucleasa (p. ej., Cas, Cpfl y similares) y el ARNg se proporcionan como ARN.
[0361] En formas de realización, la endonucleasa (p. ej., Cas, Cpfl y similares) se proporciona como una proteína y el ARNg se proporciona como ADN.
[0362] En formas de realización, la endonucleasa (p. ej., Cas, Cpfl y similares) se proporciona como proteína y el ARNg se proporciona como ARN.
[0363] Los sistemas de administración de ácidos nucleicos adicionales incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase, por ejemplo, el documento US6008336). La lipofección se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (p. ej., Transfectam™ y Lipofectin™ y Lipofectamine™ RNAiMAX). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para una lipofección eficaz de polinucleótidos con reconocimiento de receptores incluyen los de Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024. La administración puede ser a células (administración ex vivo) o tejidos objetivo (administración in vivo).
[0364] La preparación de complejos de lípido: ácido nucleico, incluidos liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr y col., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Gene Therapy 2:710-722 (1995);
[0365] Los métodos de administración adicionales incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos que se administrarán en vehículos de administración (EDV) EnGeneIC. Estos EDV se administran específicamente a los tejidos objetivo utilizando anticuerpos biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido objetivo y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula objetivo y luego el EDV ingresa a la célula mediante endocitosis. Una vez en la célula, el contenido se libera (ver MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643) Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); Patente de EE. UU. Nos 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).
[0366] En algunas formas de realización, la transfección puede ser transitoria en la que el sistema de edición del genoma transfectado que contiene el plásmido ingresa al núcleo, pero no se incorpora al genoma de la célula durante la replicación. La transfección puede ser estable en la que el plásmido transfectado se integrará en una región genómica de la célula.
[0367] En algunas formas de realización en las que se usa expresión transitoria, se pueden usar sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de lograr una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con tales vectores se han obtenido títulos elevados y niveles elevados de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("VAA") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos objetivo, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); Patente de EE. UU. N° 4.797.368; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); 1351 (1994). La construcción de vectores VAA recombinantes se describe en varias publicaciones, incluyendo la patente de EE. UU. N° 5.173.414, Tratschin et al., Mol., Mol Cell. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984);
[0368] En algunas formas de realización, la administración a una(s) célula(s) de un inhibidor de ADN-PK se realiza cultivando una(s) célula(s) aislada(s) en presencia del inhibidor de ADN-PK y cualquier medio adecuado que permita que el inhibidor de ADN-PK penetran en la membrana celular y/o en el núcleo celular.
[0369] En algunas formas de realización, los inhibidores de ADN-PK se administran a una(s) célula(s) in vitro, in vivo o ex vivo. En alguna forma de realización, el inhibidor de ADN-PK se pone en contacto con una(s) célula(s) durante aproximadamente 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas, 55 horas, 60 horas, 65 horas, 70 horas, 85 horas, 90 horas, 100 horas, 125 horas, 150 horas, 200 horas, o por cualquier período de tiempo intermedio. En algunas formas de realización, el inhibidor de ADN-PK se pone en contacto con una(s) célula(s) durante aproximadamente 1,5 semanas, 2,0 semanas, 2,5 semanas, 3.0 semanas, 3,5 semanas, 4 semanas o cualquier período de tiempo intermedio. El inhibidor de ADN-PK se puede volver a administrar con cambios en el medio de cultivo celular. El inhibidor de ADN-PK puede ponerse en contacto con la célula antes, durante o después de la introducción de los componentes del sistema de edición del genoma.
[0370]En algunas formas de realización, el inhibidor de ADN-PK se administra a una(s) célula(s) a una concentración de aproximadamente 0,1 pM, 0,25 pM, 0,5 pM, 0,75 pM, 1,0 pM, 1,25 pM, 1,50 pM, 1,75 pM, 2,0 pM, 2,5 pM, 3,0 pM, 3,5 pM, 4,0 pM, 4,5 pM, 5,0 pM, 5,5 pM, 6,0 pM, 6,5 pM, 7,0 pM, 7,5 pM, 8,0 pM, 8,5 pM, 9,0 pM, 9,5 pM, 10 pM, 10,5 pM, 11.0 pM, 11,5 pM, 12 pM o cualquier concentración intermedia. La concentración del inhibidor ADN-PK puede modificarse durante el curso de la administración.
[0371]En algunas formas de realización, los componentes de edición de genes se administran en una(s) célula(s) mediante uno o más vectores o en forma de ARN, ARNm o, en el caso del componente de endonucleasa, como proteína purificada o ARNm (p. ej., proteína Cas9). El uno o más vectores pueden incluir vectores virales, plásmidos o ADNmc. Los vectores virales pueden incluir vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simple, o cualquier combinación de los mismos. En algunas formas de realización, los componentes de edición de genes se administran mediante ARN o ARN sintético.
[0372]En algunas formas de realización, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición de genes da como resultado mayores cantidades de resultado de edición de genes de reparación dirigida por homólogos en comparación con una condición inicial en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK. En algunas formas de realización, la administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición de genes da como resultado la supresión de indeles (de NHEJ) ya sea en el objetivo o fuera del objetivo. En algunas formas de realización, la administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición de genes da como resultado una expresión aumentada o disminuida de un gen de interés. La administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición de genes puede dar como resultado la expresión de un gen no endógeno a una célula. En algunas formas de realización, la administración de inhibidores de ADN-PK a una(s) célula(s) junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de un gen de una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una(s) célula(s) junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de un intrón y/o un exón en una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una(s) célula(s) junto con un sistema de edición de genes da como resultado la eliminación completa o parcial, o una modificación de una región no codificante en una(s) célula(s). En algunas formas de realización, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición de genes da como resultado una eliminación simultánea o secuencial, completa o parcial, o una modificación de una región genética codificante y/o no codificante en una células). En algunas formas de realización, la administración de los inhibidores de ADN-PK a una(s) célula(s) junto con un sistema de edición de genes da como resultado una eliminación simultánea o secuencial, completa o parcial, o una modificación de una región genética codificante y/o no codificante en una célula(s), incluido el ADN o ARN extracromosómico. El ADN extracromosómico puede ser ADN mitocondrial, ADN de cloroplasto, ADN circular extracromosómico o ADN extracromosómico viral.
[0373]En algunas formas de realización, la administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición del genoma da como resultado una expresión aumentada o disminuida de un gen de interés. En algunas formas de realización, el aumento o disminución en la expresión de un gen de interés puede ser aproximadamente o entre 2,5 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % en comparación con una condición inicial en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK. En algunas formas de realización, el aumento o disminución de un gen de interés puede ser aproximadamente o entre 0,5 veces, 1,0 veces, 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4 veces., 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en el que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK.
[0374]En algunas formas de realización, la administración de inhibidores de ADN-PK a una célula junto con un sistema de edición del genoma da como resultado un aumento en la edición del genoma. En algunas formas de realización, el aumento en la edición del genoma puede ser aproximadamente o entre 2,5 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % en comparación con un condición inicial en la que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK. En algunas formas de realización, el aumento en la edición del genoma puede ser aproximadamente o entre 0,5 veces, 1,0 veces, 1,5 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en el que a la célula no se le administra un inhibidor de ADN-PK.
[0375]En algunas formas de realización, la administración de un inhibidor de ADN-PK y un sistema de edición de genes a una población celular da como resultado una mayor supervivencia celular en comparación con una condición inicial en la que a una población celular solo se le administra un sistema de edición de genes y no se le administra ADN-PK. inhibidor. En algunas formas de realización, el inhibidor de ADN-PK que da como resultado una mayor supervivencia celular es un compuesto de Fórmula(I), (II), (III-A-1), (III-A-2), (III-B-1), (III-B-2), (IV), (V-A)y(V-B).
[0376] En algunas formas de realización, la célula está sincronizada en la fase del ciclo celular S o G2, ya sea antes, después o durante la administración del inhibidor de ADN-PK. En algunas formas de realización, la célula se sincroniza en la fase del ciclo celular S o G2, ya sea antes, después o durante la introducción de los componentes de edición de genes. La sincronización de la célula en la fase del ciclo celular S o G2 se puede lograr mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo no limitante, los agentes que pueden usarse para sincronizar una célula en la fase del ciclo celular S o G2 incluyen afidicolina, diroxiurea, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina o cualquier combinación de los mismos. (Ver Lin et al. Elife. 15 de diciembre de 2014; 32014). En algunas formas de realización, los agentes para la sincronización celular se pueden administrar en cualquier momento durante el proceso de edición de genes.
[0377] En algunas formas de realización, el inhibidor de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones de uso. En algunas formas de realización, el agente inhibidor de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma incluido en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones de uso es un kit.
[0378] En algunas formas de realización, los inhibidores de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma se incluyen en un kit con instrucciones de uso. El kit puede contener cualquier sistema de edición del genoma y/o inhibidor de a DN-PK e instrucciones de uso. En algunas formas de realización, el inhibidor de ADN-PK es cualquiera de los compuestos representados por la Fórmula Estructural (I). En algunas formas de realización, el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa de dedos de zinc (ZFN), un sistema de nucleasa basado en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo. El sistema de edición del genoma puede proporcionarse en el kit en cualquier forma, por ejemplo, como una construcción de plásmido, vector, ADN o ARN.
[0379] En algunas formas de realización, el inhibidor de ADN-PK y/o un sistema de edición del genoma se administran in vivo. El inhibidor de ADN-PK y el sistema de edición de genes están formulados para que sean compatibles con la vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración se describen anteriormente.
[0380] En algunas formas de realización, la formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, por ejemplo, aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. Alternativamente, o, además, la composición puede comprender un agente que mejore su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que sean efectivas para el fin previsto.
[0381] En algunas formas de realización, el agente inhibidor de ADN-PK y/o el sistema de edición del genoma se administran en terapia combinada, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar afecciones o trastornos patológicos, tales como diversas formas de cáncer y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes se administran sustancialmente de forma contemporánea, ya sea simultánea o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, al inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos preferiblemente todavía es detectable en concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento.
Métodos de detección de edición del genoma
[0382] Se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica para seleccionar células para determinar la eficiencia de la edición del genoma, incluida la eficiencia de NHEJ y/o HDR. Por ejemplo, los métodos de detección pueden incluir amplificación basada en PCR de regiones objetivo seguida de secuenciación o secuenciación profunda de las regiones amplificadas para confirmar la edición del genoma. El genotipado por PCR permite la cuantificación y clasificación de compuestos que estimulan HDR. Otros métodos de detección pueden incluir la secuenciación de próxima generación. Véase, por ejemplo, Bell et al., "A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing", BMC Genomics, 15:1002 (2014).
[0383] Los cebadores de PCR se pueden diseñar para amplificar selectivamente regiones genéticas modificadas y no modificadas, lo que da como resultado amplicones de diferentes longitudes según el estado de modificación genética. A continuación, los amplicones pueden resolverse en un gel y estimarse la eficiencia de HDR mediante densitometría utilizando un Bio-Imager. Alternativamente, se puede utilizar una nueva tecnología de PCR, la PCR digital rápida de gotas (DDPCR), para medir simultáneamente eventos HDR y NHEJ en muestras editadas con genoma. Véase, por ejemplo, Miyaoka et al., "Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effectrs of locus, nuclease, and cell type on genomeeditin", Scientific Reports, 6, 2016. Otros métodos que pueden usarse para detectar células Modificaciones genómicas que incluyen secuenciación de Sanger, secuenciación profunda y RT-PCR.
[0384] En algunas formas de realización, se utiliza una construcción de indicador de semáforo (TLR) para detectar células. La detección de TLR incluye una célula informadora diseñada para expresar un marcador fluorescente tras la edición genómica específica. Tras una selección adecuada, la célula expresa el marcador fluorescente. La cuantificación de las células objetivo apropiadas se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, análisis de citometría de flujo. Véase, por ejemplo, Certo et al. 2011, "Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints", Nature Methods, 8, páginas 671-676 (2011).
Preparación de compuestos de la invención
[0385]Tal como se utilizan en este documento, todas las abreviaturas, símbolos y convenciones son consistentes con los utilizados en la literatura científica contemporánea. Véase, por ejemplo, Janet S. Dodd, ed., The ACS Style Guide: A Manual for Authors and Editors, 2.a ed., Washington, DC: American Chemical Society, 1997. Las siguientes definiciones describen los términos y abreviaturas utilizados en el presente documento:
BPin ésteres de boronato de pinacol
Salmuera solución saturada de NaCl en agua
DCM diclorometano
DIAD diisopropilazodicarboxilado
DIEA diisopropiletilamina
DMA dimetilacetamida
DMF dimetilformamida
DMSO dimetilsulfóxido
DTT ditiotreitol
ESMS espectrometría de masas por electropulverización
Et2O éter etílico
EtOAc acetato de etilo
EtOH alcohol etílico
HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico
HPLC cromatografía líquida de alta resolución
IPA isopropanol
LAH hidruro de litio y aluminio
LC-MS cromatografía líquida-espectrometría de masas
LDA diisoproiletilamida de litio
Me metilo
MeOH metanol
MsCl cloruro de metanosulfonilo
MTBE éter metilt-butílico
NMP N-metilpirrolidina
Pd2(dba)3 tris(dibencilidenacetona)dipaladio(0)
Pd(dppf)Cl2 1,1' bis(difenilfosfino)-ferroceno dicloropaladio
PG grupo protector
Ph fenilo
(racJ-BINAP 2,2'-bis(difenilfosfino)-1, 1 '-binaftilo racémico
RockPhos di-terc-butil(2',4',6'-triisopropil-3,6-dimetoxi-[1,1'-bifenil]-2-il)fosfina
TA o ta temperatura ambiente
SFC cromatografía de fluidos supercríticos
SPhos 2-diciclohexilfosfino-2',6'-dimetoxibifenilo
TBAI Yoduro de tetrabutilamonio
tBu butilo terciario
THF tetrahidrofurano
TEA trietilamina
TMEDA tetrametiletilendiamina
VFos [3-(2-diciclohexilfosfanilfenil)-2,4-dimetoxi-fenil]sulfoniloxisodio
Procedimientos sintéticos generales
[0386]En general, los compuestos de la invención se pueden preparar mediante métodos descritos en el presente documento o mediante otros métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, US2013/0281431 y PCT/US2014/024767 presentados el 12 de marzo de 2014. Preparaciones ejemplares específicas de los compuestos de la invención se describen en la sección de Ejemplificación a continuación.
[0387]En una forma de realización, los métodos para preparar compuestos representados por la Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables emplean el paso de hacer reaccionar el Compuesto (X-1)con el Compuesto (Y-1)en condiciones adecuadas para formar un compuesto representado por la fórmula(I)o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Las variables de Fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describen anteriormente para los Compuestos de la Invención. L1 del Compuesto (X-1)es un grupo saliente tal como un halógeno (p. ej., -F, -Cl, -Br o -I), toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato, y las otras variables del Compuesto (X-1)son cada uno e independientemente como se describe anteriormente para la Fórmula(I). En una forma de realización específica, L1 es -Br, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato. El compuesto(Y-1)es
en el que Ra es -H o dos Ra, junto con el átomo de oxígeno al que están unidos, forman un anillo de dioxolano opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C<1-2>. En una forma de realización concreta, dos Ra, junto con el átomo de oxígeno al que están unidos y con el átomo de boro, forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano. Se puede utilizar cualquier condición adecuada para efectuar acoplamientos cruzados, tales como acoplamientos Csp<2>-Csp<2>, conocidos en la técnica. Las condiciones ejemplares específicas se describen a continuación en la Ejemplificación.
[0388]En otra forma de realización, los compuestos de Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que R1 es -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -NHR4 o -OR4, y las otras variables de fórmula(I)son cada una e independientemente como se describió anteriormente, se preparan empleando el paso de hacer reaccionar el Compuesto(X-2)con el Compuesto(Y-2)en condiciones adecuadas:
Q1 del Compuesto (X-2) es -NH<2>o -OH, y las otras variables del Compuesto (X-2) son cada uno e independientemente como se describe anteriormente para la Fórmula(I). El compuesto (Y-2) es R4-C(O)-L2, R4-OC(O)-L2, NHR4-C(O)-L2, R4S(O)<2>-L2, R4-L2, R4C(O)ORb, o R4-N=C=O, en el que cada R4 es independientemente como se describe para la Fórmula(I); L2 es un halógeno (p. ej., -F, -Cl, -Br o -I), toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato; y Rb es alquilo C<1-4>, tal como metilo o etilo. En una forma de realización específica, L2 es -Br, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato. Se puede utilizar cualquier condición adecuada que efectúe la reacción conocida en la técnica. Las condiciones ejemplares específicas se describen a continuación en la Ejemplificación.
[0389]En otra forma de realización, los compuestos de Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que X es -NH- u -O-, y las otras variables de fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe anteriormente, se preparan mediante los métodos empleando:
(i) hacer reaccionar el Compuesto(X-3)con el Compuesto(Y-3)para formar un compuesto representado por la fórmula(I)o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
o
(ii) hacer reaccionar el Compuesto(X-4)con el Compuesto(Y-4)para formar un compuesto representado por la fórmula(I)o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
[0390]L3 del Compuesto(X-3)es un halógeno (p. ej., -Br, -Cl o -I). L4 del Compuesto(Y-4)es un halógeno (p. ej., -Br, -Cl o -I), toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato. Cada X para los Compuestos(Y-3)y(X-4)es independientemente -NH- u -O-. Las variables restantes de cada uno de los Compuestos(X-3), (X-4), (Y-3)e(Y-4)son cada una e independientemente como se describe anteriormente para la Fórmula(I).En una forma de realización específica, L3 del Compuesto(X-3)es -Br. En otra forma de realización específica, L4 del Compuesto(Y-4)es -Br, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato. Se puede utilizar cualquier condición adecuada para sustituciones nucleófilas conocidas en la técnica. Las condiciones ejemplares específicas se describen a continuación en la Ejemplificación.
[0391]En otra forma de realización, los métodos de la invención emplean el paso de hacer reaccionar el Compuesto(X-5)con R5OH o ROH para formar un compuesto representado por la fórmula(I)o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4,
-NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>o -OR4, o R7; R4 es heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido con al menos un -OR5; R7 es heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido con al menos un -OR; y R, R5 y las otras variables de fórmula(I)son cada una e independientemente como se describe anteriormente para la Fórmula(I),siempre que tanto R como R5 no sean hidrógeno:
Q2 del Compuesto(A-5)es un enlace, -C(O)NH-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)<2>-, -NH-, -alquilo C<1-4>NH-, o -O-. El anillo D del compuesto(A-5)es heteroarilo de 5 a 10 miembros. L5 es un halógeno (p. ej., -Br, -Cl, -F o -I). R de ROH, R5 de R5OH y las variables restantes del Compuesto(X-5)son cada una e independientemente como se describe anteriormente para la Fórmula(I).En una forma de realización específica, L5 es -Br. Se puede utilizar cualquier condición adecuada para sustituciones aromáticas nucleófilas conocidas en la técnica. Las condiciones ejemplares específicas se describen a continuación en la Ejemplificación.
[0392]En otra forma de realización, los compuestos de Fórmula(I)o sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que X es -O-, y las otras variables de fórmula(I)son, cada una e independientemente, como se describe anteriormente, se preparan mediante los métodos que emplean:
hacer reaccionar el Compuesto(X-6)con el Compuesto(Y-6)para formar un compuesto representado por la fórmula(I)o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
[0393]L6 del Compuesto(X-6)es -OH. L7 del Compuesto(Y-6)es -OH. Las variables restantes de cada uno de los Compuestos(X-6)y(Y-6)son cada una e independientemente como se describe anteriormente para la Fórmula(I).Se puede utilizar cualquier condición adecuada para sustituciones nucleofílicas, tales como reacciones de Mitsunobu, conocidas en la técnica. Las condiciones ejemplares específicas se describen a continuación en la Ejemplificación.
[0394]En un ejemplo específico, los compuestos de Fórmula(I), en la que X es -NH-, se pueden preparar como se describe a continuación en el Esquema 1. Por consiguiente, como se muestra en el paso 1-i del Esquema 1, se pueden hacer reaccionar compuestos heteroarílicos de FórmulaA.con morfolina o un análogo de morfolina calentando la mezcla en un disolvente polar no prótico para producir compuestos de FórmulaB.Utilizando un acoplamiento tipo Buchwald/Hartwig catalizado por paladio (p. ej., Pd2(dba)3), asistido por ligando de fosfina, como se muestra en los pasos 1-ii del Esquema 1, se puede hacer reaccionar un compuesto de FórmulaBcon aminociclohexanos de FórmulaCpara producir compuestos de FórmulaD,en la que R1 y R2 son como se describen en otra parte del presente documento. En un ejemplo, cuando se preparan mesociclohexano-1,4-diaminas monoprotegidas de FórmulaE,la eliminación del grupo protector forma compuestos de FórmulaF,como se muestra en el paso 1-iii del Esquema 1. La amina libre resultante puede entonces hacerse reaccionar. con diversos restos que tienen grupos reactivos con aminas (p. ej., R1a-L, donde L es un grupo saliente tal como cloro, bromo, yodo, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato; o donde L es un resto reactivo que contiene carbonilo tal como un grupo activo éster o un grupo isocianato) para producir un compuesto de fórmulaG,como se muestra en el paso 1-iv del Esquema 1. Los compuestos de Fórmula(I),en la que X es -S- se pueden preparar de una manera similar a la descrita en el Esquema 1, empleando una contraparte tiol del Compuesto (C) en condiciones adecuadas.
Ejemplo 1. Preparación general de los compuestos de fórmulaG.
[0395]
[0396]En otro ejemplo, los compuestos de fórmula(I),en la que X es -O-, se pueden preparar como se describe a continuación en los esquemas 2a y 2b. Por consiguiente, como se muestra en el paso 2-i del Esquema 2a, el grupo hidroxilo de los compuestos heteroarilo de FórmulaHse puede proteger para producir compuestos de FórmulaJ,que luego se pueden hacer reaccionar con morfolina o un análogo de morfolina calentando la mezcla en un disolvente polar no prótico para producir compuestos de FórmulaKdespués de la eliminación del grupo protector, como se muestra en los pasos 2-ii y 2-iii del Esquema 2a. Posteriormente, como se muestra en el paso 2-iv del Esquema 2a, un compuesto de FórmulaKpuede hacerse reaccionar con un compuesto de FórmulaLen condiciones suficientes para afectar el desplazamiento SN2 de su grupo saliente (p. ej., donde L es un grupo saliente tal como cloro, bromo, yodo, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato) para producir un compuesto de FórmulaMo FórmulaM,dependiendo de si R1 o R2 es hidrógeno. En aquellos casos en los que R1 o R2 son restos de nitrógeno u oxígeno protegidos, se pueden producir compuestos de la invención mediante la eliminación del grupo protector y la posterior manipulación sintética de la amina/alcohol libre resultante.
Ejemplo 2. Preparación general de los compuestos de fórmulaM, N, RyS.
[0397]
Esquema 2a
[0398]Alternativamente, como se muestra en el Esquema 2b, el grupo hidroxilo de un compuesto de FórmulaOse puede hacer reaccionar con un compuesto de FórmulaLpara producir un bromuro de bicicloheteroarilo fusionado de FórmulaP,que posteriormente se puede hacer reaccionar con morfolina o un análogo de morfolina para producir una compuesto de FórmulaMo FórmulaN.
Esquema 2b
[0399]Alternativamente, como se muestra en el Esquema 2c, los compuestos de la invención en los que el Anillo B es un anillo de dihidropirano se pueden preparar haciendo reaccionar compuestos de FórmulaQcon (3,6-dihidro-2H-piran-4-il)boronatos de dialquilo para producir compuestos de FórmulaR.La reacción se puede realizar bajo un catalizador de Pd, como Pd(dppf) en una condición básica (p. ej., un carbonato metálico, como Na2CO3). Ra en el Esquema 2c es -H o dos Ra, junto con el átomo de oxígeno al que están unidos, forman un anillo de dioxolano opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C<1>-<2>. En una forma de realización concreta, dos Ra, junto con el átomo de oxígeno al que están unidos y con el átomo de boro, forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano.
Esquema 2c
[0400]En otro ejemplo, los compuestos de fórmula(I),en la que X es -CH<2>-, se pueden preparar como se describe a continuación en los esquemas 3A y 3B. Por ejemplo, compuesto(3A-10)donde el Anillo C es un cicloalquilo C<4-6>y X es -CH<2>- se puede preparar como se muestra en el Esquema 3A. En el paso(I), una sustitución aromática nucleofílica del grupo F del Compuesto(3A-1)con el grupo cianuro del Compuesto(3A-2)genera el Compuesto(3A-2).El tratamiento del Compuesto(3A-2)con HCl metanólico forma el Compuesto éster(3A-3),que reacciona en el paso (iii) con una morfolina en condiciones de Buchwald para formar el Compuesto(3A-4).La reducción del compuesto éster(3A-4)con un agente reductor adecuado, tal como hidruro de litio y aluminio, produce el compuesto alcohol primario(3A-5).La cloración del alcohol Compuesto(3A-5)con un agente clorante adecuado, tal como POCE, seguida de una reacción con atrifenilfosfina, forma una sal de Wittig, Compuesto(3A-7).Desprotonación del Compuesto(3A-7)con una base, tal como el Compuesto generador de KOtBu(3A-8).Una reacción del Compuesto (3A-8) con una ciclohexanona apropiadamente sustituida produce el Compuesto alqueno(3A-9). A continuación, se reduce el compuesto alqueno(3A-9)en condiciones de hidrogenación adecuadas, tales como Pd/C con H<2>gaseoso.
[0401]En otro ejemplo, compuesto(3B-4)donde el Anillo C es un sistema de anillos aromático (ya sea fenilo o heteroarilo) y X es -CH<2>- se puede preparar como se muestra en el Esquema 3B. Las condiciones específicas para el Esquema 3B se pueden encontrar en la técnica anterior, por ejemplo, J. Org. Chem. 2014, 79, 4285-4292.
(3B-4)
Esquema 3B
[0402]Alternativamente, los compuestos de la Tabla 2 también se pueden usar para preparar otros compuestos de Fórmula(I), como se ilustra a continuación en la Ejemplificación.
EJEMPLIFICACIÓN
Caracterizaciones analíticas
[0403]Como se usa en el presente documento, el término "Rt(min)" se refiere al tiempo de retención de HPLC, en minutos, asociado con el compuesto. A menos que se indique lo contrario, los métodos de HPLC utilizados para obtener los tiempos de retención informados son los que se describen a continuación:
Método A de HPLC
[0404]
Instrumento:Waters Acquity UPLC, Waters 3100 Espectro de masas
Columna:Waters CSH C18 1,7 um 2,1 x 50 mm
Temperatura:25 °C
Disolvente A:Agua 0,1 % TFA
Disolvente B:Acetonitrilo 0,1 % TFA
Detección:DAD 220-400 nm
Gradiente:
0 min 95 % A, 5 % B
0,6 min 5 % A, 95 % B
0,7 min 5 % A, 95 % B
1,4 min 95 % A, 5 % B
Caudal:0,600 mL/min
Método B de HPLC
[0405]
Instrumento:Aguas Autopure
Columna: Waters Sunfire C185 pm, 4,6x100 mm
Temp:Temperatura ambiente
Disolvente A:Agua 0,1 % TFA
Disolvente B:Acetonitrilo 0,1 % TFA
Detección:Espectro de masas - Waters 3100, DAD (220-400 nm)
Gradiente:
0 min - 98 % A, 2 % B
3.8 min - 2 % A, 98 % B
4.9 min - 2 % A, 98 % B
5,0 min - 98 % A, 2 % B
Caudal: 1,50 mL/min
Método C de HPLC
[0406]
Instrumento:Waters Acquity UPLC, Waters 3100 Espectro de masas
Columna:Waters CSH C<18>1,7 um 2,1 x 50 mm
Temperatura:25 °C
Disolvente A:Agua 0,1 % de TFA
Disolvente B:Acetonitrilo 0,1 % de TFA
Detección:DAD 220-400 nm
Gradiente:
0 min 90 % A, 10 % B
0,6 min 40 % A, 60 % B
0,7 min 90 % A, 10 % B
1,4 min 90 % A, 10 % B
Caudal:0,600 mL/min
Método D de HPLC
[0407]
Instrumento: Waters Acquity UPLC, Waters 3100 Espectro de masas
Columna: Waters UPLC BEH C81,7um 2,1x50mm
Temperatura: 25 °C
Disolvente A: 95/5 Agua (formiato de amonio 50 mM, pH 9)/acetonitrilo
Disolvente B: Acetonitrilo
Detección: DAD 220-400 nm
Gradiente:
0 min 95 % A, 5 % B
0,6 min 5 % A, 95 % B
0,7 min 5 % A, 95 % B
1,4 min 95 % A, 5 % B
Caudal: 0,600 mL/min.
Ejemplo 1: Preparación de compuestos
Preparación del compuesto 1: 2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-amina
4-[(2-clorofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]cidohexanol (1-A)
[0408]
[0409]En un matraz de fondo redondo equipado con un condensador, se añadió una mezcla de 4-aminociclohexan-1-ol (1,219 g, 10,58 mmol), 2,4-diclorofuro[3,2-d]pirimidina (2,000 g, 10,58 mmol), base de Hunig (2,735 g, 3,686 mL, 21,16 mmol) y se calentó iPrOH (26,38 mL) a 100 °C durante 16 h. Se eliminó el disolvente y el residuo bruto se repartió entre EtOAc y NH4Cl acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron para proporcionar un sólido naranja. La RMN 1H (CDCb) muestra el 4-[(2-clorofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexanol limpio y deseado (2,659 g, 9,932 mmol, 93,89 %) junto con EtOAc residual. Se secó al vacío durante la noche y se llevó a cabo tal cual. RMN 1H (400 MHz, CDCla) ó 7,73 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,09 (s, 1H), 4,20 - 4,08 (m, 1H), 3,78 - 3,61 (m, 1H), 2,19 (d, J= 11,5 Hz, 2H), 2,05 (d, J= 10,8 Hz, 2H), 1,66 - 1,45 (m, 4H), 1,45 - 1,30 (m, 2H). ESI-MS m/z cálculo. 267,07745, encontrado 268,15 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,56 minutos.
4-[(2-metilfuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexanol (1-B)
[0410]
[0411]En un tubo de microondas secado en horno bajo N<2>, se disolvió el Compuesto (1-A) en THF anhidro (8,0 mL). Se desgasificó la reacción haciendo burbujear N<2>a través de la solución durante 5 minutos. Se añadió Pd(PPh3)4 (215,9 mg, 0,1868 mmol) y se desgasificó durante dos minutos más. Se añadió con cautela trimetilaluminio (2,107 g, 2,802 ml de 2 M, 5,603 mmol) y la mezcla de reacción se calentó en un baño de perlas de aluminio a 125 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se vertió cuidadosamente en NH4Cl acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con EtOAc (2x) y CH<2>Cl<2>(2,3). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron hasta obtener un semisólido de color naranja. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 12 g, gradiente lineal 0 ^ 30 % de MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar el producto deseado (180,75 mg, 0,7309 mmol, 78,27 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla) ó 7,67 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,91 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,15 (tdt, J = 12,2, 8,1, 4,0 Hz, 1H), 3,70 (ddd, J = 14,7, 10,3, 4,1 Hz, 1H), 2,57 (s, 3H), 2,19 (d, J = 12,7 Hz, 2H), 2,11 - 1,98 (m, 2H), 1,67 (s, 1H), 1,52 (ddd, J = 23,4, 13,0, 3,4 Hz, 2H), 1,35 (ddd, J = 24,1, 12,9, 3,3 Hz, 2H). ESI-MS m/z cálculo. 247,13208, encontrado 248,25 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,46 minutos.
4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexanol (1-C)
[0412]
[0413]A un matraz que contenía Pd(OH)<2>(3,424 g, 4,877 mmol) se añadió el Compuesto (1-B) (2,68 g, 9,754 mmol) en EtOH (270,9 mL) y HCl (11 ml de 2 M, 22,00 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a 50 psi de H<2>en un agitador Parr durante 2 h 10 min. La mezcla de reacción se filtró a través de celite y se concentró. El material se cargó en seco sobre Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 80 g, gradiente lineal 0 % de hexanos ^ 30 % de MeOH/CH<2>Cl<2>). Las fracciones relevantes se combinaron y concentraron para proporcionar 4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexanol (2,15 g, 8,624 mmol, 88,40 %). RMN 1H (400 MHz, MeOH-D4) ó 4,85 - 4,79 (t, J = 9,2 Hz, 2H), 4,24 - 4,12 (m, 1H), 3,63 - 3,51 (m, 1H), 3,42 (t, J = 9,2 Hz, 2H), 2,56 (s, 3H), 2,11 - 1,85 (m, 4H), 1,44 (dq, J = 22,9, 10,4 Hz, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 249,14772, encontrado 250,19 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,46 minutos.
Metanosulfonato de [4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (1-D)
[0414]
[0415]A una suspensión a temperatura ambiente de 4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexanol (2,15 g, 8,624 mmol) y Et3N (2,793 g, 3,847 ml), 27,60 mmol) en CH<2>Ch (223,6 mL) se añadió MsCI (1,087 g, 734,5 pL, 9,486 mmol). Se continuó agitando a temperatura ambiente durante 30 min. La reacción se vertió en NaHCO3 sat. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con CH2Cl2 (2 x 150 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 120 g, gradiente lineal 0 % ^ 10 % MeOH/CH<2>Ch). Se obtuvo metanosulfonato de [4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (2,3269 g, 7,107 mmol, 82,43 %). RMN 1H (300 MHz, CDCla) ó 4,74 - 4,62 (m, 1H), 4,57 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 4,34 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,11 - 3,95 (m, 1H), 3,18 (t, J = 9,0 Hz, 2H), 3,03 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,20 (d, J = 10,4 Hz, 4H), 1,78 (dd, J = 22,4, 10,3 Hz, 2H), 1,34 (dd, J = 22,4, 10,8 Hz, 2H). ESI-MS m/z cálculo. 327,12527, encontrado 328,16 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,52 minutos.
2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-amina
[0416]
[0417]Una suspensión de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (17,4 mg, 0,07524 mmol, Compuesto(1-F):consulte la preparación para el Compuesto 7 a continuación), se calentó metanosulfonato de [4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (49,3 mg, 0,1506 mmol) y Cs2CO3 (73,6 mg, 0,2259 mmol) en dioxano anhidro (1,0 mL) a 110 °C durante 72 h. La mezcla de reacción se vertió en H<2>O y se extrajo con CH<2>Cl<2>. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 12 g, gradiente lineal 0 ^ 10 % de MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar el producto deseado, aunque contenía impurezas residuales. El material se purificó adicionalmente mediante Isco de fase inversa [columna C18 Aq de 50 g; 0 ^ 50 % CH<3>CN/H<2>O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron y concentraron. El residuo se disolvió en CH<2>Cl<2>y se pasó a través de un cartucho Stratospheres SPE para proporcionar 2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidina.-4- amina (12,2 mg, 0,02374 mmol, 31,55 %).<r>M<n>1H (400 MHz, CDCla) ó 9,43 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,58 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,59 (t, J = 9,0 Hz, 2H), 4,52 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,24 - 4,11 (m, 1H), 3,94 - 3,83 (m, 4H), 3,42 - 3,31 (m, 4H), 3,19 (t, J = 9,0 Hz, 2H), 2,48 (s, 3H), 2,21 (d, J = 13,1 Hz, 2H), 1,99 (dd, J = 12,6, 3,6 Hz, 2H), 1,90 - 1,72 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 462,23795, encontrado 463,26 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,5 minutos.
Preparación del Compuesto 2: 5-[4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexoxi]-7-morfolinoquinazolin-4-carbonitrilo
[0418]
[0419]Una suspensión de 5-hidroxi-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (31 mg, 0,1210 mmol, Compuesto(2-A):véase la preparación del Compuesto11a continuación), se calentó metanosulfonato de [4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (80 mg, 0,2444 mmol) y Cs2CO3 (160 mg, 0,4911 mmol) en dioxano anhidro (1,5 mL) a 115 °C. durante 72 h. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y el filtrado se concentró. El residuo bruto se disolvió en una mínima cantidad de DMSO y se purificó mediante Isco de fase inversa [columna C18 Aq de 150 g; 0 ^ 50 % CH<3>CN/H<2>O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron y concentraron. El residuo se disolvió en ChhCh y se pasó a través de un cartucho Stratospheres SPE para proporcionar el producto, cuya pureza es de solo ~75 %. Repurificado mediante Isco en fase normal (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 % ^ 10 % MeOH/CH<2>Cl<2>) para obtener 5-[4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidina-4-il)amino]ciclohexoxi]-7-morfolinoquinazolin-4-carbonitrilo (3,1 mg, 0,005881 mmol, 4,861 %) con una pureza del 92,5 % en peso. RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,08 (s, 1H), 6,83 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,67 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,84 (s, 1H), 4,64 (dd, J = 8,6, 4,2 Hz, 1H), 4,62 - 4,52 (m, 2H), 4,27 - 4,17 (m, 1H), 3,94 - 3,85 (m, 4H), 3,51 - 3,40 (m, 4H), 3,18 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,33 - 2,22 (m, 2H), 2,07 -1,86 (m, 6H). ESI-MS m/z cálculo. 487,2332, encontrado 488,34 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,63 minutos.
Preparación del Compuesto 3: 2-metil-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina
[0420]
[0421]Una suspensión de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (ácido trifluoroacético (1)) (68,78 mg, 0,1992 mmol), metanosulfonato de [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (142,1 mg, 0,4980 mmol) y se calentó Cs2CO3 (324,5 mg, 0,9960 mmol) en dioxano anhidro (3,3 mL) a 110 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se vertió en H<2>O y se extrajo con CH<2>Cl<2>. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na<2>SO<4>), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal de 0 ^ 100 % de CH<2>Cl<2>a 20 % de MeOH/CH<2>Cl<2>) para proporcionar el producto (11,5 mg, 0,02653 mmol, 13,32 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformod) ó 9,45 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,12 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,86 - 6,77 (m, 1H), 6,60 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,79 (d, J = 3,5 Hz, 1H), 4,02 - 3,80 (m, 5H), 3,48 - 3,30 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,32 - 2,20 (m, 2H), 2,07 - 1,95 (m, 2H), 1,94 - 1,76 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 420,2274, encontrado 421,42 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,55 minutos.
Preparación del Compuesto 4: 5-[4-quinazolin-7-il]-7-morfolino-quinazolina-4-carbonitrilo
[0422]
[0423]Una suspensión de 5-hidroxi-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (sal del ácido trifluoroacético) (95,42 mg, 0,2577 mmol), metanosulfonato de [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (220,6 mg, 0,7731 mmol) y Cs2CO3 (420 mg, 1,289 mmol) en DMF anhidra (2,6 mL) se calentó a 80 °C durante 112 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una frita de vidrio y se enjuagó con ChhCh. El filtrado se evaporó y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 100 % de ChhCL a 20 % de MeOH/ChhCh) para proporcionar el producto (41,8 mg, 0,09101 mmol, 35,32 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,08 (s, 1H), 8,06 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,71 - 6,63 (m, 1H), 6,14 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,93 (s, 1H), 4,85 (s, 1H), 4,06 - 3,79 (m, 5H), 3,49 (s, 3H), 3,48 - 3,40 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,34 - 2,21 (m, 2H), 2,13 - 1,85 (m, 6H). ESI-MS m/z cálculo. 445,22263, encontrado 446,35 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,61 minutos.
Preparación del compuesto 5: N-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]-2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-amina
[0424]
[0425]Una suspensión de 4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (ácido trifluoroacético (1)) (73,78 mg, 0,1966 mmol), se calentó metanosulfonato de [4-[(2-metil-6,7-dihidrofuro[3,2-d]pirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (161 mg, 0,4918 mmol) y Cs<2>COa (321 mg, 0,9852 mmol) en DMF anhidro (1,3 mL) a 90 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un tapón de algodón y se enjuagó con CH<2>Cl<2>. El filtrado se evaporó y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 100 % de CH<2>Cl<2>a 20 % de MeOH/CH<2>Cl<2>) para proporcionar el producto (39,9 mg, 0,07938 mmol, 40,38 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d)ó8,58 (s, 1H), 6,80 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,68 (s, 1H), 4,58 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 4,46 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,13 (s, 3H), 3,93 - 3,82 (m, 4H), 3,38 - 3,27 (m, 4H), 3,19 (t, J = 9,1 Hz, 2H), 2,49 (s, 3H), 2,25 - 2,13 (m, 2H), 1,99 - 1,74 (m, 6H). ESl-MS m/z cálculo. 492,2485, encontrado 493,34 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,58 minutos
Preparación del Compuesto 6: N-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]-2-metil-pirimidin-4-amina
[0426]
[0427]Una suspensión de 4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (ácido trifluoroacético (1)) (73,78 mg, 0,1966 mmol), metanosulfonato de [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (140 mg, 0,4906 mmol) y Cs2CO3 (330 mg, 1,013 mmol) en DMF anhidra (1,3 mL) se calentó a 90 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un tapón de algodón y se enjuagó con ChhCh. El filtrado se evaporó y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 100 % de ChhCh a 20 % de MeOH/ChhCh) para proporcionar el producto (20,3 mg, 0,04416 mmol, 22,46 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,58 (s, 1H), 8,12 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,55 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,17 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,69 (s, 1H), 4,12 (s, 3H), 3,94 -3,84 (m, 4H), 3,70 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 3,41 - 3,25 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,21 (d, J = 11,0 Hz, 2H), 1,98 - 1,73 (m, 6H). ESI-M<s>m/z cálculo. 450,23795, encontrado 451,35 (<m>+1)+; Tiempo de retención: 0,57 minutos.
Preparación del Compuesto 7 :4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina
Preparación del compuesto (1-F): 7-morfolinoquinazolin-5-ol
[0428]
[0429]A una solución de 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (1,38 g, 3,927 mmol) en CH<2>Cl<2>(40 mL) se le añadió TFA (12,36 g, 8,351 mL, 108,4 mmol). La mezcla de color rojo anaranjado intenso resultante se agitó a 50 °C durante 4 h, luego a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se evaporó bajo una corriente de N<2>con calor suave. El residuo bruto se llevó directamente al siguiente paso. M+1: 232,32. Tiempo de retención: 0,5
Preparación de metanosulfonato de [4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexilo]
[0430]
[0431]Una suspensión a 0 °C de 2-(4-hidroxiciclohexil)isoindolina-1,3-diona (1,0 g, 4,077 mmol) en Et3N (1,238 g, 1,705 ml, 12,23 mmol) y CH<2>O<2>(6,683 mL) se trató con MsCl (607,1 mg, 410,2 pL, 5,300 mmol) (exotérmico, rxn se calienta -se coloca en un baño de agua a temperatura ambiente). Se continuó agitando mientras se calentaba a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se diluyó con EtOAc y se vertió en H<2>O. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con EtOAc (2 x 50 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron hasta obtener un sólido blanco esponjoso. La RMN 1H muestra el producto deseado limpio, no se requiere purificación; el producto pesa 1,277 g.
Preparación del Compuesto 7: 2-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona
[0432]
[0433]Una suspensión de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (ácido trifluoroacético (1)) (324,7 mg, 0,9405 mmol), metanosulfonato de [4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexil] (760,2 mg, 2,351 mmol), y se calentó Cs2CO3 (1,535 g, 4,712 mmol) en DMF anhidra (5,705 mL) a 90 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y se enjuagó con ChhCh. El filtrado se evaporó y el residuo bruto se cargó en seco sobre Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 30 % de MeOH/ChhCh) para proporcionar el producto (206,5 mg, 0,4414 mmol, 46,93 %) como un sólido tostado. RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,80 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 9,15 (s, 1H), 7,89 - 7,78 (m, 2H), 7,78 - 7,65 (m, 2H), 6,80 (dd, J = 2,3, 0,6 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,30 (tt, J = 12,5, 4,1 Hz, 1H), 3,96 - 3,82 (m, 4H), 3,47 - 3,30 (m, 4H), 2,83 (qd, J = 12,8, 3,4 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 15,0 Hz, 2H), 1,84 - 1,62 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 458,1954, encontrado 459,31 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,66 minutos.
Preparación del Compuesto 8: N-metil-2-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidina-4-carboxamida
Preparación de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina: Compuesto (8-A)
[0434]
[0435]A una solución agitada de 2-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (1,477 g, 3,221 mmol) en MeOH (110 mL) se le añadió hidrazina (2,0 mL, 63,72 mmol). La reacción resultante se selló y se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La mezcla de reacción se concentró. Al residuo bruto se le añadió CH<2>Cl<2>y la suspensión se filtró a través de una frita de vidrio de porosidad media (el sólido se lavó varias veces con CH<2>Cl<2>y se recogió en el mismo matraz). El filtrado se concentró para proporcionar 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (1,0133 g, 3,085 mmol, 95,78 %). Todo el lote se secó al vacío a 50 °C durante 4 días. Se obtuvo 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (1,0133 g, 3,085 mmol, 95,78 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d)ó9,47 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 6,86 - 6,72 (m, 1H), 6,58 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,02 - 3,83 (m, 4H), 3,47 - 3,29 (m, 4H), 2,95 - 2,79 (m, 1H), 2,21 (d, J = 14,0 Hz, 2H), 1,90 - 1,69 (m, 6H). ESI-MS m/z cálculo. 328,1899, encontrado 0,52 (M+1)+; Tiempo de retención: 329,39 minutos.
Preparación de N-metil-2-[[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (Compuesto 8)
[0436]
[0437]Una mezcla de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (33,2 mg, 0,09503 mmol), 2-cloro-N-metilpirimidin-4-carboxamida (18,8 mg, 0,1096 mmol) y Na2CO3 (190 ml de solución 2 M, 0,3800 mmol) en agua (156 mL) se calentó a reflujo (100 °C) en un tubo de microondas sellado. La mezcla resultante se dejó agitar durante la noche. La suspensión bruta se enfrió, se congeló y se secó en el liofilizador. El residuo se cargó en seco sobre celite y se purificó mediante Isco de fase inversa [columna C18 Aq de 150 g; 0 ^ 50 % CH<3>CN/H<2>O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron y concentraron. La muestra se disolvió en una cantidad mínima de CH<2>Cl<2>y se pasó a través de un cartucho de resina Stratospheres PL-HCO3 MP. El filtrado se concentró y se secó al vacío para proporcionar N-metil-2-[[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (32,4 mg, 0,06920 mmol, 72,82 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo) 69,45 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,49 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 4,5 Hz, 1H), 7,32 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,79 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,59 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,86 - 4,70 (m, 1H), 4,15 - 3,96 (m, 1H), 3,96 - 3,78 (m, 4H), 3,49 - 3,33 (m, 4H), 3,00 (d, J = 5,2 Hz, 3H), 2,32 - 2,14 (m, 2H)), 2,10 - 1,96 (m, 2H), 1,96 - 1,74 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 463,2332, encontrado 464,35 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,58 minutos.
Preparación del compuesto (9): 2-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]-N-metilpirimidin-4-carboxamida
Preparación de 4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol: Compuesto (9- A)
[0438]
[0439]A una solución de 4-[4-metoxi-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (100 mg, 0,2622 mmol) en CH<2>Cl<2>(2,667 mL) se le añadió TFA (1,794 g, 1,212 ml, 15,73 mmol). La reacción se selló y se calentó térmicamente a 50 °C durante 16 h. El disolvente se eliminó bajo corriente de N<2>/calor suave. El residuo bruto se llevó directamente a la siguiente reacción. Masa 1: 262,34. Tiempo de retención: 0,55
Preparación de metanosulfonato de [4-(terc-butoxicarbonilamino)ciclohexilo]: Compuesto (9-B)
[0440]
[0441]A una solución de N-(4-hidroxiciclohexil)carbamato de terc-butilo (8,2 g, 38,09 mmol) en DCM (100 mL) se le añadió DIEA (14 ml, 80,38 mmol) y MsCl (3,2 ml, 41,34 mmol). La mezcla se agitó durante 0,5 hy se diluyó con d Cm , se lavó con H2O, se secó sobre Na2SO4, se filtró a través de una capa de gel de sílice y se concentró. Sólido blanquecino recuperado. RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 4,64 (tt, J = 10,8, 4,1 Hz, 1H), 4,40 (s, 1H), 3,48 (s, 1H), 3,02 (s, 3H), 2,25 1,99 (m, 4H), 1,80-1,59 (m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,36-1,13 (m, 2H).
Preparación de N-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato de terc-butilo: Compuesto (9-C)
[0442]
[0443]Una suspensión de 4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (ácido trifluoroacético (1)) (98,4 mg, 0,2622 mmol), metanosulfonato de [4-(terc-butoxicarbonilamino)ciclohexil] (154 mg, 0,5249 mmol), y se calentó Cs2CO3 (427 mg, 1,311 mmol) en DMF anhidra (1,75 mL) a 90 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un tapón de algodón y se enjuagó con CH<2>C L El filtrado se evaporó y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 20 % de MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar terc-butilo N-[4-(4-metoxi-7-morfolino). -quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato. El material en bruto se llevó a la desprotección con Boc. ESI-MS m/z cálculo. 458,25293, encontrado 459,45 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,67 minutos.
Preparación de 4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina: Compuesto (9-F)
[0444]
[0445]A una solución de N-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato de terc-butilo (120,2 mg, 0,2622 mmol) en CH<2>Cl<2>(2,622 mL) se le añadió TFA (896,9 mg, 606,0 ml, 7,866 mmol). La solución resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró y el residuo bruto se purificó mediante Isco en fase inversa [columna C18 Aq de 50 g; 0 ^ 40 % CH<3>CN/H<2>O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron, se concentraron y se secaron con azeótropo de tolueno (2x) y vacío para proporcionar 4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (ácido trifluoroacético (1)) (50 mg, 0,1058 mmol), 40,36 %) (Rendimiento en 3 pasos). ESI-MS m/z cálculo. 358,2005, encontrado 359,36 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,53 minutos.
Preparación de 2-[[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]-N-metil-pirimidin-4-carboxamida: Compuesto (9)
[0446]
Preparación del Compuesto (10): N-[4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato de terc-butilo
[0447]
Reactivos y condiciones: (a) morfolina, DIEA, iPrOH; b) TFA, MCD; (c) metanosulfonato de [4-(tercbutoxicarbonilamino)ciclohexilo], CsCO3, DMF
Paso a
[0448]Una mezcla de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-metilquinazolina (80 mg, 0,22 mmol), morfolina (23 mg, 0,27 mmol), carbonato de cesio (145 mg, 0,45 mmol), Pd(OAc)<2>(5,0 mg, 0,023 mmol) y rac-BINAP (28 mg, 0,045 mmol) en 1,4-dioxano (2 mL) se burbujearon con N<2>y se agitaron a 90 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de Celite y se evaporó. El crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0-5 % de MeOH/DCM. Esto proporcionó 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-metil-quinazolin-7-il]morfolina (50 mg, 61 %). ESI-MSm/zcalc. 365,1, encontrado 366,14 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,58 minutos.
Paso b
[0449]A una solución de 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-metil-quinazolin-7-il]morfolina (180 mg, 0,49 mmol) en DCM (10 mL) se le añadió TFA (1 ml, 12,9 mmol), y la reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se concentró alvacío.El crudo se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 12 g eluyendo con un gradiente de 0 4 % de MeOH/DCM y proporcionó 2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (85 mg, 70 %). (400 MHz, CDCb) ó 9,37 (s, 1H), 6,67 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 3,82 (dd, J = 5,8, 4,0 Hz, 4H), 3,35 - 3,23 (m, 4H), 2,80 (s, 3H).
Paso c
[0450]A una mezcla de 2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (30 mg, 0,12 mmol), se añadió carbonato de cesio (200 mg, 0,62 mmol) en DMF (1 mL) a 70 °C [4-(metanosulfonato de terc-butoxicarbonilamino)ciclohexilo (100 mg, 0,34 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 1 h a 70 °C. A la mezcla se añadió otra porción de metanosulfonato de [4-(tercbutoxi-carbonilamino)-ciclohexil] (100 mg, 0,34 mmol) y se continuó la agitación a 70 °C durante 18 h. La mezcla se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de Celite y se concentró alvacío.El crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de 0-10 % de MeOH/DCM y se recuperó N- [4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato de terc-butilo (2,0 mg, 3,6 %) (Compuesto 10). RMN 1H (400 MHz, cloroformo) 69,32 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 6,50 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,71 (s, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,89 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,63 (s, 1H), 3,42 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 2,84 (s, 3H), 2,17 (d, J = 13,4 Hz, 2H), 1,97 - 1,60 (m, 6H), 1,47 (s, 9H). ESI-MSm/zcalc.
442,26, encontrado 443,2 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,6 minutos.
Preparación del Compuesto 11: N-metil-2-[4-[(7-morfolino-4-oxo-3H-quinazolin-5-il)oxi]ciclohexil]amino]pirimidina-4-carboxamida
Preparación de 5-hidroxi-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (Compuesto (2-A))
[0451]
[0452]A una solución de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (160 mg, 0,4251 mmol) en CH2Cl2 (4,25 mL) se le añadió TFA (1,800 g, 1,216 ml, 15,79 mmol) (las soluciones cambian de amarillo a rojo). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente, después de lo cual la CLEM muestra sólo un pico principal correspondiente a [M+1] del producto deseado. El disolvente se eliminó con calor suave/corriente de N<2>y el residuo bruto se llevó directamente a la siguiente etapa sin manipulación adicional. ESI-MS m/z cálculo. 256,09604, encontrado 257,3 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,62 minutos.
Preparación de N-[4-(4-ciano-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato de terc-butilo (Compuesto (11-A))
[0453]
[0454]Una suspensión de 5-hidroxi-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (ácido trifluoroacético (1)) (157,4 mg, 0,4251 mmol), metanosulfonato de [4-(terc-butoxicarbonilamino)ciclohexil] (312 mg, 1,063 mmol) y Cs2CO3 (694 mg, 2,130 mmol) en DMF anhidra (2,75 mL) se calentó a 90 °C durante 24 h. La mezcla de reacción se filtró al vacío a través de un tapón de celite y se enjuagó con CH<2>Cl<2>. El filtrado se evaporó y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 100 % de CH<2>Cl<2>a 20 % de MeOH/CH2CI2) para proporcionar C24H31N5O4 (192,8 mg, 0,4251 mmol, 100,0 %). Este material bruto se llevó al siguiente paso. ESI-MS m/z cálculo.
453,2376, encontrado 454,41 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,83 minutos.
Preparación de 5-(4-aminociclohexoxi)-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (Compuesto (11-B))
[0455]
[0456]A una solución de N-[4-(4-ciano-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]carbamato de terc-butilo (192,8 mg, 0,4251 mmol) en CH2CI2 (10 mL) se le añadió TFA (1,454 g, 982,4 pL, 12,75 mmol). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 h.
La mezcla de reacción se concentró y el residuo bruto se purificó mediante Isco en fase inversa [columna C18 Aq de 50 g; 0 ^ 40 % CH3CN/H2O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron, se concentraron y se secaron con azeótropo de tolueno (2x) y vacío para proporcionar 5-(4-aminociclohexoxi)-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (ácido trifluoroacético (1)) (47,8 mg, 0,1023 mmol, 24,06 %) (Rendimiento en 3 pasos). ESI-MS m/z cálculo. 353,18518, encontrado 354,41 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,57 minutos.
Preparación de N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-oxo-3H-quinazolin-5-il)oxi]ciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (Compuesto (11))
[0457]
[0458]Una mezcla de 5-(4-aminociclohexoxi)-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo (ácido trifluoroacético (1)) (47,8 mg, 0,1023 mmol), 2-cloro-N-metilpirimidina-4-carboxamida (23 mg, 0,1340 mmol), y Na2CO3 (256,2 pL de 2 M, 0,5124 mmol) en agua (506,7 pL) se calentó a 110 °C en un tubo para microondas sellado y se agitó durante 16 h. LCMS muestra la conversión a un pico importante, aunque corresponde a [M+1] 480,42. Parecía que N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-oxo-3H-quinazolin-5-il)oxi]ciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (o su tautómero) se formó durante la reacción. La suspensión bruta se enfrió hasta temperatura ambiente. Para ayudar a la disolución, se agregaron MeOH/H2O 1:1 (~ 1 mL) y ~ 6-8 gotas de TFA. La solución resultante se cargó directamente en Isco de fase inversa [columna C18 Aq de 50 g; 0 ^ 50 % CH3CN/H2O (modificador TFA)]. Las fracciones correspondientes al producto [M+1] 480,42 se recogieron y se concentraron a presión reducida. La muestra se disolvió en una proporción mínima de CH2Cl2/MeOH 1:1 y se pasó a través de un cartucho de resina Stratospheres PL-HCO3 MP. El filtrado se concentró, dejando una película sólida blanca. La RMN 1H (CDCl3) del material fue consistente con N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-oxo-3H-quinazolin-5-il)oxi]ciclohexil]amino]pirimidina. 4-carboxamida (o su tautómero). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,46 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,87 (dd, J = 5,4, 4,5 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,70 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,76 - 5,31 (m, 1H), 4,72 (s, 1H), 3,99 (dt, J = 8,1, 4,0 Hz, 1H), 3,92 - 3,74 (m, 4H), 3,42 - 3,22 (m, 4H), 2,98 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,32 - 2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,84 (m, 4H), 1,77 (td, J = 13,2, 11,9, 3,2 Hz, 2H). ESI-MS m/z cálculo. 479,2281, encontrado 480,33 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,57 minutos.
Preparación del Compuesto 12: 2-metil-N-[4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]-pirimidin-4-amina
[0459]
Reactivos y condiciones: (a) acetamidina (HCl), K<2>CO<3>y MS 4A, butironitrilo, 130 °C, 22 h, (b) NaH, PMB-OH, DMF; c) TFA, MCD; (d) 2-(4-hidroxiciclohexil)isoindolin-1,3-diona, PPh3, DIAD, THF; (e) morfolina, Pd(OAc)<2>, rac-BINAP, CsCO3, dioxano; (f) NH<2>NH<2>, MeOH; (g) 4-cloro-2-metil-pirimidina, t-butilxfospaladciclo, NaOtBu, tBuOH.
Paso a:
[0460]Una mezcla de 4-bromo-2,6-difluoro-benzaldehído (4 g, 18,1 mmol), acetamidina (ácido clorhídrico (1)) (2,4 g, 25,4 mmol), K<2>CO<3>(3,5 g, 25 mmol) y MS 4A (2,8 g, polvo) en butironitrilo (20,00 mL) se agitó a 130 °C durante 20 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con EtOAc (20 ml), se filtró a través de una capa de celite y se concentró al vacío. El producto bruto se purificó a partir de un cartucho de gel de sílice de 120 g eluyendo con un gradiente de 0-30 % de EtOAc/heptano. Esto proporciona 7-bromo-5-fluoro-2-metilquinazolina (1,35 g, 31 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d) ó 9,47 (s, 1H), 7,89 (dt, J = 1,9, 1,0 Hz, 1H), 7,31 (dd, J = 8,7, 1,6 Hz, 1H), 2,84 (s, 3H).
Paso b:
[0461]A una solución de (4-metoxifenil)metanol (886 mg, 0,8 ml, 6,4 mmol) en DMF (20,00 mL) se le añadió NaH (260 mg, 6,4 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 30 min. A la mezcla se le añadió 7-bromo-5-fluoro-2-metilquinazolina (800 mg, 3,3 mmol) y se continuó agitando durante 1 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc, se lavó con H<2>O, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El crudo se purificó en un cartucho de gel de sílice de 40 g eluyendo con un gradiente de 0-60 % de EtOAc/heptano. Esto proporciona 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-metil-quinazolina (900 mg, 75,5 %). RMN 1H (400 MHz, cloroformo-d)ó9,58 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,74 - 7,65 (m, 1H), 7,43 - 7,37 (m, 2H), 7,06 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,99 - 6,92 (m, 2H), 5,17 (s, 2H), 3,85 (s, 3H), 2,86 (s, 3H).
Paso c:
[0462]A una solución de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2-metilquinazolina (1,2 g, 3,3 mmol) en DCM (10 mL) se le añadió TFA (2,0 ml, 26 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó durante 30 min. La mezcla de reacción se concentró y se purificó a partir de un cartucho de gel de sílice de 40 g eluyendo con un gradiente de EtOAc al 0 100 %/heptano para proporcionar 7-bromo-2-metil-quinazolin-5-ol (450 mg, 56 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) ó 9,60 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 7,56 (dt, J = 1,8, 0,9 Hz, 1H), 7,01 (t, J = 1,3 Hz, 1H), 2,83 (d, J = 0,9 Hz, 3H).
Paso d:
[0463]Una solución de 7-bromo-2-metil-quinazolin-5-ol (200 mg, 0,83 mmol), 2-(4-hidroxiciclohexil)isoindolin-1,3-diona (210 mg, 0,85 mmol) y PPh3 (330 mg, 1,25 mmol) en THF (10 mL) se añadió lentamente DIAD (253 mg, 250 j L, 1,25 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó durante 1 h. La mezcla se concentró al vacío, se purificó a partir de un cartucho de gel de sílice de 12 g eluyendo con un gradiente de 0-70 % de EtOAc/heptano para proporcionar 2-[4-(7-bromo-2-metil-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolina.-1,3-diona (280 mg, 71 %). RMN 1H (400 MHz, c Dc E) 5 10,01 (t, J = 1,1 Hz, 1H), 7,91-7,80 (m, 2H), 7,75-7,68 (m, 2H), 7,03 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,36 (s, 2H), 5,06-4,93 (m, 2H), 4,33 (tt, J = 12,5, 4,2 Hz, 1H), 2,94-2,84 (m, 2H), 2,83-2,78 (m, 2H), 2,37 (s, 3H), 1,87-1,7 (m, 4H).
Paso e:
[0464]Una mezcla de 2-[4-(7-bromo-2-metil-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (280 mg, 0,60 mmol), morfolina (100 pL, 1,1 mmol), cesio Se burbujearon carbonato (400 mg, 1,2 mmol), rac-BINAP (40 mg, 0,06 mmol) y PdOAc<2>(7 mg, 0,03 mmol) en dioxano (5 mL) con N<2>durante 5 min. La mezcla de reacción se selló y se agitó durante la noche a 100 °C. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de Celite y se concentró. El crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con un gradiente de MeOH/DCM al 0-3 % para proporcionar 2-[4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (125 mg, 44 %) RMN 1H (400 MHz, CDCla) 59,7 (s, 1H), 7,88-7,75 (m, 2H), 7,72-7,65 (m, 2H), 6,8 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,55 (s, 2H), 5,03-4,83 (m, 1H), 4,35-4,25 (m, 1H), 3,92-3,83 (m, 4H), 3,42-3,31 (m, 4H), 2,7-2,9 (m, 2H), 2,45-2,3 (m, 2H), 2,37 (s, 3H), 1,80 (m, 4H).
Paso f:
[0465]A una solución de 2-[4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (120 mg, 0,25 mmol) en MeOH (5 mL) se le añadió hidrazina (Agua (1)) (250 mg, 280 pL, 5 mmol) y la mezcla de reacción resultante se agitó a 70 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se concentró al vacío y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (cartucho de 12 g) eluyendo con un gradiente de 0-10 % (NH<3>7M en MeOH/DCM). Esto proporciona 4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (66 mg, 76 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 59,39 (d, J = 0,6 Hz, 1H), 6,72 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,51 (d, J = 2,1, 1H), 4,72 - 4,60 (m, 1H), 3,94 - 3,81 (m, 4H), 3,43 - 3,30 (m, 4H), 2,80 (s, 3H), 2,26 - 2,12 (m, 2H), 1,86 - 1,54 (m, 6H).
Paso g:
[0466]A una mezcla de 4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (66 mg, 0,19 mmol), 4-cloro-2-metilpirimidina (42 mg, 0,32 mmol), t-butil xPhos paladiciclo (13 mg, 0,02 mmol) en t-BuOH (2 mL) se añadió terc-butóxido de sodio (200 pL de solución 2 M en THF, 0,4 mmol) y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de Celite y se concentró. El crudo se purificó por cromatografía en gel de sílice (cartucho de 4 g) eluyendo con un gradiente de MeOH al 0-6 %/DCM y proporcionó 2-metil-N-[4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]-pirimidin-4-amina (20,9 mg, 23,7 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 59,27 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,44 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,19 - 6,05 (m, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,66 (s, 1H), 3,80 (t, J = 4,9 Hz, 5H), 3,29 (dd, J = 6,8, 3,1 Hz, 4H), 2,71 (d, J = 1,9 Hz, 3H), 2,43 (d, J = 1,8 Hz, 4H), 2,14 (d, J = 13,8 Hz, 2H), 2,01 - 1,68 (m, 6H). ESI-MSm/zcalc. 434,24, encontrado 435,28 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,50 minutos.
Preparación del Compuesto 13: N-metil-2-[4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida
[0467]
Preparación de 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-4-metil-quinazolin-7-il]morfolina (Compuesto (13-A))
[0468]Se disolvió 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (100 mg, 0,2592 mmol) en THF (1,3 mL) en atmósfera de N<2>y se enfrió a 0 °C. Se añadió PdCl<2>(dppf)-CH<2>Cl<2>(10,6 mg, 0,01298 mmol), seguido de MeMgBr (110 |jL de una solución 3 M en éter dietílico, 0,3300 mmol) gota a gota. Se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N<2>durante la noche. Este paso se repitió a mayor escala, esta vez utilizando 2-2,5 equivalentes de MeMgBr. Los productos de los dos lotes se combinaron y se vertieron en H<2>O. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con CH<2>Cl<2>(2 x 20 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron hasta obtener un sólido amarillo anaranjado brillante. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 10 % de MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-4-metil-quinazolin-7-il]morfolina (245,0 mg, 0,6705 mmol, 43,12 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,85 (s, 1H), 7,46 - 7,35 (m, 2H), 7,01 - 6,92 (m, 2H), 6,84 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 3,93 - 3,86 (m, 4H), 3,84 (s, 3H), 3,44 - 3,32 (m, 4H), 2,90 (s, 3H). ESI-MS m/z cálculo. 365,17395, encontrado 366,39 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,64 minutos.
Preparación de 4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (Compuesto (13-B))
[0469]
[0470]A una solución de 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-4-metil-quinazolin-7-il]morfolina (245,0 mg, 0,6705 mmol) en CH<2>Cl<2>(6,534 mL) se le añadió TFA (2,0 ml, 25,96 mmoles). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. El disolvente se eliminó bajo corriente de N<2>/calor suave. El residuo bruto se llevó directamente a la siguiente reacción. Masa 1: 246,41. Tiempo de retención: 0,54.
Preparación de 2-[4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (Compuesto (13-C))
[0471]
[0472]Una suspensión de 4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (sal del ácido trifluoroacético) (240,9 mg, 0,6705 mmol), metanosulfonato de [4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexil] (542 mg, 1,676 mmol) y Cs2CO3 (1,10 g, 3,376 mmol) en DMF anhidra (4,2 mL) se calentó a 90 °C durante 5 h. LCMS muestra un progreso parcial. Se agregaron otros 1,5 eq de mesilato y se calentó a 110 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de Celite y se enjuagó con CH<2>CL El filtrado se evaporó y el residuo bruto se cargó en seco sobre Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 ^ 20 % MeOH/CH<2>Cl<2>) para proporcionar 2-[4-(4-metil-7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (127,9 mg, 0,2707 mmol, 40,37 %). R<m>N 1H (300 MHz, cloroformo-d)ó8,89 (s, 1H), 7,91 - 7,77 (m, 2H), 7,77 - 7,65 (m, 2H), 6,82 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,61 - 6,49 (m, 1H), 4,89 - 4,74 (m, 1H), 4,29 (tt, J = 12,4, 3,9 Hz, 1H), 4,00 - 3,79 (m, 4H), 3,44 - 3,31 (m, 4H), 3,27 (s, 3H), 2,77 (qd, J = 13,2, 12,7, 3,0 Hz, 2H), 2,51 - 2,30 (m, 2H), 1,84 - 1,68 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 472,21106, encontrado 473,4 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,66 minutos.
Preparación de 4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (Compuesto (13-D))
[0473]
[0474]A una solución agitada de 2-[4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]isoindolin-1,3-diona (127,9 mg, 0,2707 mmol) en MeOH (10 mL) se le añadió hidrazina. (172 ml, 5,480 mmol). La reacción resultante se selló y se agitó a temperatura ambiente durante 20 h (LCMS muestra que se completó). La mezcla de reacción se concentró. Al residuo bruto se le añadió CH2Cl2. La suspensión se filtró a través de una frita de vidrio de porosidad media (el sólido se enjuagó varias veces con CH<2>Cl<2>y se recogió en el mismo matraz). El filtrado se concentró y el residuo bruto se purificó mediante Isco de fase inversa [columna C18 Aq de 50 g; 0 ^ 50 % CH<3>CN/H<2>O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron y se concentraron a presión reducida para proporcionar el producto (ácido trifluoroacético (1)) (21,9 mg, 0,04798 mmol, 17,72 %). La sal de TFA se llevó directamente a la siguiente reacción. Masa 1: 343,39. Tiempo de retención: 0,52.
Preparación de N-metil-2-[[4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (Compuesto (13))
[0475]
[0476]Una mezcla de 4-(4-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (ácido trifluoroacético (1)) (21,9 mg, 0,04798 mmol), 2-cloro-N-metil-pirimidina-4-carboxamida (12,35 mg, 0,07197 mmol) y Na2CO3 (120 ml de 2 M, 0,2400 mmol) en agua (250 mL) se calentó a reflujo (100 °C) en un tubo de microondas sellado. La mezcla resultante se dejó en agitación durante 72 h. La suspensión bruta se trató con MeOH y unas pocas gotas de TFA, y la solución resultante se purificó mediante Isco de fase inversa [columna C18 Aq de 50 g; 0 ^ 50 % CH<3>CN/H<2>O (modificador TFA)]. Las fracciones relevantes se combinaron y concentraron. La muestra se disolvió en una proporción mínima de MeOH/CH<2>Cl<2>1:1 y se pasó a través de un cartucho de resina Stratospheres PL-HCO3 MP. El filtrado se concentró para proporcionar el producto (5,8 mg, 0,01154 mmol, 24,05 %) en forma de un sólido amarillo pálido. RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,87 (s, 1H), 8,49 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,18 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,79 - 4,69 (m, 1H), 4,03 (ddt, J = 13,1, 7,8, 4,4 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 5,7, 4,1 Hz, 4H), 3,42 - 3,27 (m, 4H), 3,05 (s, 3H), 3,01 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,31 - 2,16 (m, 2H), 2,13 - 2,00 (m, 2H), 2,00 - 1,75 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 477,24884, encontrado 478,44 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,59 minutos.
Preparación del Compuesto 14: 6-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina
Preparación de 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidina (Compuesto (14-A))
[0477]
[0478]A una solución a 0 °C de 4,6-dicloropirimidina (2,0 g, 13,42 mmol) y Et3N (1,494 g, 2,058 ml, 14,76 mmol) en EtOH (40 mL) se añadió 1-metilpiperazina (1,344 g, 1,490 ml, 13,42 mmol). La solución resultante se calentó hasta temperatura ambiente y luego se agitó durante 5 h. La reacción se concentró al vacío y se repartió entre EtOAc y NaOH 1N. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con EtOAc (2 x 30 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se disolvió en hexanos/EtOAc y se dejó reposar durante 5 días, durante los cuales precipitó un material blanquecino (no producto). Se filtró el sólido y se concentró el filtrado para obtener el producto. RMN 1H (CDCb) muestra 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidina limpia y deseada (2,126 g, 9,896 mmol, 73,75 %) RMN 1H (400 MHz, CDCb) ó 8,37 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,67 (s, 4H), 2,56 - 2,41 (m, 4H), 2,34 (s, 3H). ESI-MS m/z cálculo. 212,08287, encontrado 213,14 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,39 minutos.
Preparación de 6-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina (Compuesto (14))
[0479]
[0480]Una suspensión de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (40 mg, 0,1218 mmol), 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1 -il)pirimidina (28,5 mg, 0,1340 mmol), 4-cloro-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidina (28,5 mg, 0,1340 mmol) y NaOtBu (35 mg, 0,3642 mmol) en tBuOH (800 pL) se trató con t-BuXPhos Paladaciclo (8 mg, 0 ,0 l165 mmol). La reacción se selló y se calentó a 100 °C en un baño de perlas de aluminio durante 2 h. El disolvente se eliminó bajo una corriente de N<2>y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 % ^ 10 % MeOH/CH<2>Cl<2>[+0,1 % Et<3>N]). Las fracciones relevantes se combinaron y concentraron para obtener el producto (42,1 mg, 0,07509 mmol, 61,65 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,42 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 8,18 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,44 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 4,85 - 4,62 (m, 2H), 3,97 - 3,74 (m, 5H), 3,60 - 3,55 (m, 4H), 3,45 - 3,27 (m, 4H), 2,52 - 2,46 (m, 4H), 2,33 (d, J = 2,5 Hz, 3H), 2,26 - 2,15 (m, 2H), 2,05 - 1,91 (m, 2H), 1,91 - 1,64 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 504,2961, encontrado 505,44 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,53 minutos.
Preparación del Compuesto 15: N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidina-4-carboxamida
[0481]
[0482]A una suspensión de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (40 mg, 0,1218 mmol), ácido pirimidina-4-carboxílico (23 mg, 0,1853 mmol) y Et3N (102 pL, 0,7318 mmol) en 1,4-dioxano (1,2 mL) se añadió T3P (235 pL de solución al 50 % p/v en acetato de etilo, 0,3693 mmol) gota a gota. La solución resultante se calentó a 50 °C durante 20 h. El disolvente se eliminó bajo una corriente de N<2>y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice [columna de oro Isco de l2 g; gradiente lineal 0 ^ 10 % MeOH/ChhCh (+0,5 % Et<3>N)], pero el material aún contenía impurezas. El material se disolvió/suspendió en 2 mL de DMSO y se purificó mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se disolvió en MeOH/CH<2>CÍ<2>1:1 y se pasó a través de un cartucho de resina Stratospheres PL-HCO3 MP. El filtrado se concentró para proporcionar N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-carboxamida (20,9 mg, 0,04714 mmol, 38,70 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,47 (s, 1H), 9,26 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,97 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 8,12 (dd, J = 5,1, 1,5 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,82 - 6,75 (m, 1H), 6,58 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 4,83 - 4,73 (m, 1H), 4,20 - 4,07 (m, 1H), 3,95 -3,82 (m, 4H), 3,43 - 3,31 (m, 4H), 2,33 - 2,17 (m, 2H), 2,06 - 1,82 (m, 6H). ESI-MS m/z cálculo. 434,20663, encontrado 435,35 (M+1)+; Tiempo de retención: 2,48 minutos.
Preparación de los Compuestos 16: N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]ciclopropanocarboxamida
[0483]
[0484]A una solución de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (40 mg, 0,1218 mmol) en CH<3>CN (1,0 mL) se le añadió K<2>CO<3>(20,21 mg, 0,1462 mmol) seguido de cloruro de ciclopropanocarbonilo (12,73 mg, 11,05 pL). 0,1218 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción rojo-naranja resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró. El residuo bruto se disolvió/suspendió en MeOH/H<2>O 1:1, se filtró a través de Celite y se sometió a HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se disolvió en MeOH/CH<2>Cl<2>1:1 y se pasó a través de un cartucho de resina Stratospheres PL-HCO3 MP. El filtrado se concentró para proporcionar N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]ciclopropanocarboxamida (7,2 mg, 0,01780 mmol, 14,61 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,43 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,78 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,73 - 5,54 (m, 1H), 4,74 (t, J = 3,9 Hz, 1H), 3,97 (ddd, J = 14,9, 6,4, 4,1 Hz, 1H), 3,92 - 3,81 (m, 4H), 3,45 - 3,30 (m, 4H), 2,19 (dd, J = 12,1, 2,7 Hz, 2H), 1,95 - 1,59 (m, 6H), 1,34 (tt, J = 7,7, 4,6 Hz, 1H), 1,03 - 0,91 (m, 2H), 0,79 - 0,68 (m, 2h ). ESI-Ms m/z cálculo. 396,21616, encontrado 397,44 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,58 minutos.
Preparación de los Compuestos 17: N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]furo[3,2-d]pirimidin-4-amina
[0485]
[0486]Una suspensión de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (40 mg, 0,1218 mmol), 4-clorofuro[3,2-djpirimidina (21 mg, 0,1359 mmol) y terc-butóxido de sodio (35 mg, 0,3642 mmol) se desgasificó haciendo burbujear N<2>a través de la mezcla durante 10 min. Se añadió t-BuXPhos Paladaciclo (8 mg, 0,01165 mmol) y la reacción se calentó a 100 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se concentró, se disolvió/suspendió en 2 mL de DMSO, se filtró a través de Celite y se purificó mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se disolvió en MeOH/CH<2>Cl<2>1:1 y se pasó a través de un cartucho de resina Stratospheres PL-HCO3 MP. El filtrado se concentró para proporcionar N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]furo[3,2-d]pirimidin-4-amina (10,5 mg, 0,02116 mmol, 17,38 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,49 (s, 1H), 9,12 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,76 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,82 (dd, J = 2,2, 0,5 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,17 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,83 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 4,45 - 4,29 (m, 1H), 3,94 - 3,90 (m, 4H), 3,45 - 3,39 (m, 4H), 2,30 (d, J = 9,4 Hz, 2H), 2,15 -2,06 (m, 2H), 1,99 - 1,86 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 446,20663, encontrado 447,12 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,55 minutos.
Preparación de los Compuestos 18: 2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexilpirimidin-4-amina
Preparación de 2-cloro-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina
[0487]
Una mezcla de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (110 mg, 0,3349 mmol), 2,4-dicloropirimidina (55 mg, 0,3692 mmol) y Na2CO3 (670 pL de 2 M, 1,340 mmol) en agua (450 pL) se calentó a reflujo en un tubo de microondas sellado durante 16 h, momento en el que el material se había agrupado en una bola grande (se solidifica al enfriar). El sobrenadante se eliminó con una pipeta y el sólido se desmenuzó con una espátula y se lavó con varias porciones de agua. El sólido se disolvió en CH<2>Cl<2>y la solución se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró hasta obtener una espuma de color naranja parduzco. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0 % ^ 20 % MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar 2-cloro-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidina.-4-amina (41,2 mg, 0,09344 mmol, 27,89 %). Rm N 1H (300 MHz, cloroformo-d)ó9,41 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 7,99 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 6,79 (d, (J = 2,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,25 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,24 (d, J = 33,6 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 6,5 Hz, 1H), 4,15 -3,77(m, 5H), 3,45 - 3,29 (m, 4H), 2,34 - 2,15 (m, 2H), 2,07 - 1,93 (m, 2H), 1,93 - 1,70 (m, 6H).
Preparación de 2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina
[0488]
[0489]Una mezcla de 2-cloro-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina (41,2 mg, 0,09344 mmol), 1-metilpiperazina (25 pL, 0,2254 mmol) y base de Hunig (40 pL, 0,2296 mmol) en iPrOH (700 pL) se calentó a 170 °C en el microondas durante 1 h. El i-PrOH se eliminó al vacío. El residuo bruto se disolvió en CH<2>Cl<2>y se vertió en NH4Cl acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con CH<2>Cl<2>. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con NaOH 1N y salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante Isco (columna de oro de 40 g; 0 ^ 60 % de MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar 2-(4-metilpiperazin-1-il)-N-[4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]pirimidin-4-amina (21,6 mg, 0,04152 mmol, 44,44 %). El producto resultante se disolvió en CH3CN, se sometió a reflujo y se reconcentró varias veces para eliminar los disolventes residuales. RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) 69,43 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,89 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 6,85 - 6,72 (m, 1H), 6,57 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 5,68 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,74 (s, 1H), 4,60 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 3,95 - 3,70 (m, 9H), 3,44 - 3,32 (m, 4H), 2,49 - 2,39 (m, 4H), 2,32 (s, 3H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,05 - 1,92 (m, 2H), 1,92 - 1,76 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo.
504,2961, encontrado 505,49 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,53 minutos.
Preparación del Compuesto 19: N-metil-2-[4-(2-metil-7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-pirimidin-4-carboxilamida
[0490]El Compuesto19se preparó como se muestra en el esquema sintético anterior para el Compuesto12,pero empleando el siguiente procedimiento para el paso g:
g) 2-cloro-N-metil-pirimidin-4-carboxamida, t-butóxido de sodio, t-BuXPhos paladaciclo, t- BuOH
[0491]A una mezcla de 4-(2-metil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (80 mg, 0,23 mmol), cloro-N-metilpirimidin-4-carboxamida (68 mg, 0,4 mmol) y t-butil xPhos paladaciclo 20 mg, 0,03 mmol) en t-BuOH (2 mL) se añadió tbutóxido de sodio (250 pL de 2 M, 0,50 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante la noche a 50 °C. La mezcla de reacción se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de Celite y se evaporó. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con un gradiente de 0-10 % de MeOH/DCM para proporcionar el producto deseado. El producto se purificó mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se pasó a través de un SPE PL-HCO3 MP para proporcionar N-metil-2-[4-(2-metil-7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-pirimidin-4-carboxilamidas (13,3 mg, 11,3 %). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 69,17 (s, 1H), 8,28 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,12 (dd, J = 4,8, 0,7 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,94 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,54 (d, J = 4,3 Hz, 1H), 3,82 (dp, J = 13,9, 4,2 Hz, 1H), 3,67 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 3,21 -3,12 (m, 4H), 2,80 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,59 (s, 3H), 2,12 - 1,95 (m, 2H), 1,88 - 1,75 (m, 2H), 1,73 - 1,51 (m, 4H). ESI-MSm/zcalc. 477,25, encontrado 478,3 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,53 minutos.
Preparación del Compuesto 20: 2-metoxi-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)acetamida
[0492]
[0493]Monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (16 mg, 0,118 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (ácido clorhídrico (1)) (35 mg, 0,183 mmol) y ácido 2-metoxiacético (8,8 pL, 0,115 mmol) se combinaron en DMF (0,2 mL) en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó durante 40 minutos. Se añadió 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (25 mg, 0,0761 mmol) y se continuó agitando durante 30 minutos. Se añadió bicarbonato de sodio saturado y la mezcla se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2x) y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre 4 g de gel de sílice usando un gradiente de 0-10 % de metanol/DCM. Se obtuvo 2-metoxi-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)acetamida (10 mg) (rendimiento del 33 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 69,45 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,79 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,52 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,75 (p, J = 3,2 Hz, 1H), 4,06 - 3,93 (m, 1H), 3,94 - 3,84 (m, 6H), 3,45 (s, 3H), 3,42 - 3,33 (m, 4H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 1,93 - 1,61 (m, 6H). ESI-EM m/z = 401,32 (M+1)+.
Preparación de 3-metil-5-[4-quinazolin-7-il]-7-morfolino-quinazolin-4-ona: Compuesto 21
[0494]
Preparación de<7 - f lu o ro -5 - [ (4 -m e to x ife n il)m e to x i] -3 H -q u in a z o l in -4 -o n a :>Compuesto (21-B)
[0495]<A u n a s o lu c ió n d e (4 -m e to x ife n il)m e ta n o l (10 ,69 g, 77 ,39 m m o l) en D M F (200 m L ) a 0 °C s e le a ñ a d ió N a H (6 ,89>g, 172 ,3 m m o l) en p o rc io n e s d u ra n te 5 m in u to s , d e s p u é s s e c a le n tó h a s ta te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 30 m in u to s . m in u to s . L a re a c c ió n se e n fr ió a 0 °C y s e a ñ a d ió e n p o rc io n e s 5 ,7 -d if lu o ro -3 H -q u in a z o lin -4 -o n a (23 ,78 g, 114 ,9 m m o l) d u ra n te 5 m in u to s . L a re a c c ió n se a g itó a e s ta te m p e ra tu ra d u ra n te 30 m in u to s y d e s p u é s s e c a le n tó h a s ta te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te la n o c h e . La re a c c ió n s e c o n s id e ró in c o m p le ta , p o r lo q u e s e a ñ a d ie ro n 0 ,96 m L d e a lc o h o l y 680 m g d e N a H y la re a c c ió n s e a g itó a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 30 m in u to s . L a re a c c ió n to d a v ía s e c o n s id e ró in c o m p le ta , p o r lo q u e se a ñ a d ie ro n o tro s 0 ,96 m l d e a lc o h o l y 680 m g d e N a H y la re a c c ió n s e a g itó a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te la n o c h e . L a re a c c ió n s e d ilu y ó c o n a g u a y e l pH s e a ju s tó a 5 c o n á c id o a c é tic o . E l s ó lid o re s u lta n te s e f i lt ró y s e la v ó co n a g u a y E t2Ü , lu e g o s e s e c ó a l v a c ío p a ra p ro d u c ir 7 - f lu o ro -5 - [ (4 -m e to x ife n il)m e to x i] -3 H -q u in a z o l in -4 -o n a (23 ,45 g,<re n d im ie n to d e l 100 % ). R M N>1<H (400 M H z , D M S O ) 6 8 ,00 (s, 1 H ), 7 ,54 - 7 ,46 (m , 2 H ), 7 ,00 - 6 ,83 (m , 4 H ), 5 ,16 (s, 2 H ),>3 ,76 (s, 3 H ).
Preparación de 7-fluoro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3-metil-quinazolin-4-ona: Compuesto (21-C)
[0496]<S e c a rg ó un v ia l p a ra m ic ro o n d a s B io ta g e d e 10 m L e q u ip a d o c o n u n a b a rra a g ita d o ra m a g n é t ic a c o n 7 - f lu o ro ->5 - [(4 -m e to x ife n i l)m e to x i] -3 H -q u in a z o lin -4 -o n a (406 m g, 1 ,352 m m o l) , M e l (193 ,9 m g , 85 ,04 j L, 1 ,366 m m o l) , N a l (20 ,00 m g, 0 ,1334 m m o l) y K 2C O 3 (935 ,9 m g , 6 ,772 m m o l) e n a c e to n a (10 m L ). E l v ia l s e s e lló c o n un ta p ó n d e te f ló n y s e c a le n tó<a 100 °C e n e l m ic ro o n d a s d u ra n te 15 m in u to s . La re a c c ió n se f i lt ró y s e c o n c e n tró>al vacío.<E l re s id u o s e p u r if ic ó e n u n a>c o lu m n a d e g e l d e s í l ic e d e r iv a t iz a d o C 18 d e fa s e in v e rs a u s a n d o C H 3C N a l 10 -50 % (T F A al 0,1 % ) e n H 2O (0 ,1 % T F A ).<L a s f ra c c io n e s d e l p ro d u c to s e c o m b in a ro n , s e n e u tra liz a ro n m e d ia n te la a d ic ió n d e N a H C O>3<(s a t) y se e x tra je ro n co n E tO A c . L o s e x tra c to s o rg á n ic o s s e c o m b in a ro n y se la v a ro n c o n s a lm u e ra , s e s e c a ro n s o b re M g S O>4<, s e f i lt ra ro n y s e>c o n c e n tra ro n p a ra p ro d u c ir 7 - f lu o ro -5 - [ (4 -m e to x ife n il)m e to x i] -3 -m e t i l -q u in a z o lin -4 -o n a (227 m g, 53 ,4 % p ro d u c ir ) . E S I-M Sm/z<c a lc . 314 .10666 , e n c o n tra d o 315.09 (M 1 )>+<.>
Preparación de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3-metil-7-morfolino-quinazolin-4-ona: Compuesto (21-D)
[0497]<U n a s o lu c ió n d e 7 - f lu o ro -5 - [ (4 -m e to x ife n il)m e to x i] -3 -m e t i l -q u in a z o lin -4 -o n a (80 m g, 0 ,25 m m o l) y m o r fo lin a (430>j L, 4 ,9 m m o l) e n N M P a n h id ra (1 m L ) S e c a le n tó a 120 °C d u ra n te 18 h o ra s . L a re a c c ió n se e n fr ió h a s ta te m p e ra tu ra a m b ie n te y s e d ilu y ó c o n a g u a . E l p re c ip ita d o s e f i lt ró y s e la v ó c o n a g u a , d e s p u é s s e s e c ó a l v a c ío p a ra p ro d u c ir 5 - [(4 -<m e to x ife n il)m e to x i] -3 -m e t i l-7 -m o r fo l in o q u in a z o lin -4 -o n a (60 m g, 64 % d e re n d im ie n to ) . E S I-M S>m/z<c a lc . 381 ,16885 , e n c o n tra d o 382 ,21 (M 1 )>+<.>
Preparación de 3-metil-5-[4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexoxi]-7-morfolino-quinazolin-4-ona: Compuesto (21-E)
[0498]<U n a s o lu c ió n d e 5 - [ (4 -m e to x ife n i l)m e to x i] -3 -m e t i l- 7 -m o r fo l in o q u in a z o lin -4 -o n a (60 m g, 0 ,16 m m o l) y T F A (0 ,5 m l, 6 ,5 m m o l) en D C M (1 m L ) s e a g itó a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te la n o c h e . El d is o lv e n te se e lim in ó>al vacío<p a ra p ro d u c ir 5 -h id ro x i-3 -m e t i l -7 -m o r fo l in o -q u in a z o lin -4 -o n a . E S I-M S>m/z<c a lc . 261 ,11133 , e n c o n tra d o 262 ,07 (M 1 )>+<.>
Preparación de 3-metil-5-[4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexoxi]-7-morfolino-quinazolin-4-ona: Compuesto (21)
[0499]<S e c a rg ó un v ia l p a ra m ic ro o n d a s e q u ip a d o c o n u n a b a rra a g ita d o ra m a g n é t ic a co n 5 -h id ro x i-3 -m e t i l -7 -m o r fo l in o ->q u in a z o l in -4 -o n a (60 ,9 m g , 0 ,2331 m m o l) , m e ta n o s u lfo n a to d e [4 - [(2 -m e t i lp ir im id in -4 - i l )a m in o ]c ic lo h e x il ] (200 m g, 0 ,7009<m m o l) y C s>2<C O>3<(380 m g , 1 ,17 m m o l) e n D M F (3 m L). E l v ia l s e s e lló c o n un ta p ó n d e te f ló n d e s e c h a b le y s e c a le n tó en>e l m ic ro o n d a s a 120 °C d u ra n te 10 m in u to s . S e a g re g a ro n 50 m g d e m e ta n o s u lfo n a to d e [4 - [(2 -m e t i lp ir im id in -4 -i l) a m in o ]c ic lo h e x il] y s e c a le n tó e n e l m ic ro o n d a s a 120 °C d u ra n te 10 m in u to s . L a re a c c ió n s e c a le n tó e n e l m ic ro o n d a s a 120 °C d u ra n te 5 m in u to s m á s . L a re a c c ió n se f i lt ró y s e p u r if ic ó e n u n a c o lu m n a d e S iO 2 d e r iv a t iz a d a e n C 18 d e fa s e in v e rs a u s a n d o C H 3C N a l 10 -50 % (0,1 % T F A ) e n H 2O (0 ,1 % T F A ). L a s fra c c io n e s d e l p ro d u c to s e c o m b in a ro n y<n e u tra liz a ro n c o n N a H C O>3<(s a t) y lu e g o s e e x tra je ro n co n E tO A c . L o s e x tra c to s o rg á n ic o s s e c o m b in a ro n y s e la v a ro n c o n s a lm u e ra , s e s e c a ro n s o b re M g S O>4<, s e f i lt ra ro n y se c o n c e n tra ro n p a ra p ro d u c ir 3 -m e t i l- 5 - [4 - [(2 -m e t i lp ir im id in -4 -i l)a m in o ]c ic lo h e x o x i] -7 -m o r fo l in o q u in a z o lin -4 -o n a (32 ,6 m g , re n d im ie n to d e l 30 ,8 % ). R M N>1<H (300 M h z , C D C b ) 6 8 ,08 (d,>J = 5 ,9 H z, 1 H ), 7 ,93 (s, 1H ), 6 ,65 (d , J = 2 ,3 H z, 1 H ), 6 ,48 (d, J = 2 ,2 H z, 1H ), 6 ,18 (d, J = 6 ,1 H z, 1 H ), 5 ,22 (s, 1 H ), 4 ,72 (s, 1H ), 3 ,97 - 3 ,81 (m , 4 H ), 3 ,53 (d , J = 10 ,6 H z, 3 H ), 3 ,40 - 3 ,25 (m , 4 H ), 2 ,52 (s , 3 H ), 2 ,23 (d , J = 12 ,9 H z, 2 H ), 2 ,05 -<1 ,70 (m , 7 H ). E S I-M S>m/z<c a lc . 450 ,23795 , e n c o n tra d o 451 ,33 (M 1 )>+<.>
Preparación del Compuesto 22: ((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)carbamato de etilo.
[0500]
[0501]A una solución enfriada con hielo de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (25 mg, 0,076 mmol) y TEA (32 |jL, 0,230 mmol) en DCM (800 |jL) se le añadió cloroformiato de etilo (10,9 j L, 0,114 mimóles). Se deja revolver durante 30 min. La reacción se diluyó con DCM y se añadió bicarbonato de sodio (acuoso) saturado. La mezcla se hizo pasar a través de un separador de fases y los compuestos orgánicos se concentraron a presión reducida. Se cromatografió sobre una columna de gel de sílice de 4 g usando MeOH/DCM al 0-10 % como eluyente y se purificó adicionalmente mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se pasó a través de un PL-HCO3 MP SPE para proporcionar ((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)carbamato de etilo (2,3 mg, rendimiento del 7 %) se obtuvo. RMN 1H (400 MHz, CDCla) ó 9,41 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,85 - 6,72 (m, 1H), 6,56 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,78 - 4,56 (m, 2H), 4,12 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,96 - 3,82 (m, 4H), 3,66 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 3,46 - 3,31 (m, 4H), 2,25 - 2,08 (m, 2H), 1,90 (dt, J = 12,5, 4,1 Hz, 2H), 1,84 - 1,61 (m, 4H), 1,25 (t, J = 7,1 Hz, 3H). ESI-EM m/z = 401,32 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 23: 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)ciclopropano-1-carboxamida
[0502]
[0503]Monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (16 mg, 0,118 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (ácido clorhídrico (1)) (35 mg, 0,183 mmol) y ácido 1-metilciclopropano-1-carboxílico (12 mg, 0,1199 mmol) se combinaron en DMF (0,2 mL) en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente y se dejaron agitar durante 40 min. Se añadió 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (25 mg, 0,0761 mmol) y se continuó la agitación durante 30 minutos más. Se añadió bicarbonato de sodio saturado y la mezcla se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2x) y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre 4 g de gel de sílice usando un gradiente de 0-10 % de metanol/DCM. Se obtuvo 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)ciclopropano-1-carboxamida (13 mg, rendimiento del 40 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla)ó9,46 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,85 - 6,74 (m, 1H), 6,56 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,67 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,74 (t, J = 3,2 Hz, 1H), 4,04 - 3,80 (m, 5H), 3,47 - 3,32 (m, 4H), 2,28 - 2,14 (m, 2H), 1,96 - 1,83 (m, 2H), 1,83 - 1,51 (m, 4H), 1,35 (s, 3H), 1,19 (q, J = 3,8 Hz, 2H), 0,65 - 0,53 (m, 2H). ESI-EM m/z = 411,31 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 24: 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)ciclopropano-1-carboxamida
[0504]
[0505]En un tubo de microondas de 2 mL, se añadió una mezcla de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (27 mg, 0,082 mmol), 3-bromo-1-metil-pirazol (9,5 pL, 0,0999 mmol), alil(cloro)paladio (0,8 mg, 0,004 mmol), ditercbutil(2',4',6'-triisopropil-3,6-dimetoxi-[1,1'-bifenil]-2-il)fosfano (4 mg, 0,008 mmol) y 2-metilpropan-2-olato de sodio (83 pL de 2 M en tetrahidrofurano, 0,166 mmol) en tBuOH (400 pL) se calentó a 90 °C y se dejó en agitación durante la noche. La reacción se diluyó con DCM y se filtró a través de celite y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se cromatografió sobre 12 g de gel de sílice usando MeOH/DCM al 0-10 % como eluyente para producir 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)-1H-pirazol-3-amina (12,5 mg, 36 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) ó 9,43 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 9,09 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,10 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,53 (t, J = 2,0 Hz, 1H), 4,76 - 4,66 (m, 1H), 3,88 (dt, J = 5,0, 3,0 Hz, 4H), 3,72 (d, J = 1,5 Hz, 3H), 3,49 - 3,33 (m, 5H), 2,18 (dd, J = 13,8, 4,1 Hz, 3H), 1,99 (dt, J = 11,7, 3,7 Hz, 2H), 1,89 - 1,63 (m, 4H). ESI-EM m/z = 409,33 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 25: N-metil-2-[4-(3-metil-7-morfolino-4-oxo-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida
[0506]
Paso a
[0507]A una solución de (4-metoxifenil)metanol (5 ml, 40,1 mmol) en DMF (50 mL) se le añadió NaH (3 g, 75,0 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. A la mezcla se añadió 7-bromo-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona (5 g, 20,6 mmol) y se continuó la agitación durante 2 h a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con H<2>O (100 mL) y se neutralizó con ácido acético hasta pH 5. El precipitado resultante se recogió mediante filtración al vacío, se lavó con H2O, Et2O y se secó al vacío durante la noche. Esto proporcionó [7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3-Hquinazolin-4-ona (7 g, 95 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO)ó8,01 (s, 1H), 7,49 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,36 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,02 - 6,89 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 3,76 (s, 3H).
Paso b
[0508]A una solución de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3H-quinazolin-4-ona (7 g, 19,4 mmol) en DCM (30 mL) se le añadió TFA (15 ml, 194,7 mmol) y la solución resultante se agitó durante 30 min. La mezcla se concentró, se diluyó con H<2>O, se neutralizó con solución de NaHCO3 y se filtró para recoger el sólido. El sólido se secó alvacíodurante la noche para proporcionar 7-fluoro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3H-quinazolin-4-ona (4,5 g, 98 %). RMN 1H (400 MHz, DMSO) ó 8,16 (s, 1H); 7,26 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,03 (d, J=1,8 Hz, 1H), 3,6 (b, 1H).
Paso c
[0509]A una suspensión de NaH (1,9 g, 47,7 mmol) en DMF (30 mL) a 0 °C se añadió lentamente 7-bromo-5-hidroxi-3Hquinazolin-4-ona (5 g, 20,7 mmol) y la mezcla resultante Se agitó a temperatura ambiente durante 20 min. La mezcla se enfrió hasta 0 °C y luego se añadió POMCl (9,4 g, 9 ml, 62,2 mmol). La mezcla se agitó durante 30 min. La mezcla de reacción se vertió en una solución de ácido acético (10 mL) en H<2>O (100 mL). El precipitado se filtró y se disolvió en DCM, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó. El crudo se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 120 g eluyendo con EtOAc al 0-25 %/heptano y proporcionó 2,2-dimetilpropanoato de (7-bromo-5-hidroxi-4-oxo-quinazolin-3-il)metilo (4,5 g, 61 %) RMN 1H (400 MHz, CDCI<3>) 511,35 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 7,39 (t, J = 1,4 Hz, 1H), 7,15 (t, J = 1,5 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 1,23 (d, J = 1,2 Hz, 9H).
Paso d
[0510]A una mezcla de 2,2-dimetilpropanoato de (7-bromo-5-hidroxi-4-oxo-quinazolin-3-il)metilo (3,5 g, 9,85 mmol), PPh3 (4,1 g, 15,8 mmol) y 2-(4-hidroxiciclohexil)isoindolin-1,3-diona (2,8 g, 11,4 mmol) en THF (35 mL) se añadió gota a gota DIAD (3,2 g, 3,1 ml, 15,8 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se concentró y se purificó mediante columna de cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc/heptano. Esto proporcionó 2,2-dimetilpropanoato de [7-bromo-5-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexoxi]-4-oxo-quinazolin-3-il]metilo (4,2 g, 73 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 58,22 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,73 (tt, J = 5,2, 3,7 Hz, 2H), 7,65 - 7,57 (m, 2H), 7,40 (t, J = 1,7 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 1,4 Hz, 2H), 4,65 (s, 1H), 4,16 (tt, J = 12,9, 3,9 Hz, 1H), 2,80 (dt, J = 15,5, 12,0 Hz, 2H), 2,29 (d, J = 14,5 Hz, 2H), 1,74-1,52 (m, 5H), 1,16 (d, J= 1,5 Hz, 9H).
Paso e
[0511]Una mezcla de 2,2-dimetilpropanoato de [7-bromo-5-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexoxi]-4-oxo-quinazolin-3-il]metilo (500 mg, 0,86 mmol), se burbujearon morfolina (83 mg, 85 ml, 1,0 mmol), carbonato de cesio (566 mg, 1,7 mmol), rac-BINAP (107 mg, 0,17 mmol) y 1,4-dioxano (5,0 mL) con N<2>durante 5 min. La mezcla se calentó en el microondas durante 15 min a 150 °C. La mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente, se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de Celite y se concentró. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con DCM al 0-20 %/EtOAc para proporcionar [5-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexoxi]-7-morfolino-4-oxo-quinazolin-2,2-dimetilpropanoato de 3-il]metilo (56 mg, 11 %). ESI-MSm/zcalc. 588,26, encontrado 589,3 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,78 minutos.
Paso f
[0512]A una solución de 2,2-dimetilpropanoato de [5-[4-(1,3-dioxoisoindolin-2-il)ciclohexoxi]-7-morfolino-4-oxoquinazolin-3-il]metilo (56 mg, 0,1 mmol) en MeOH (5 mL) se añadió NH<2>NH<2>(100<j>L, 3,2 mmol) y la solución de reacción resultante se agitó a 70 °C durante 90 min. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la mezcla se concentró y se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 4 g eluyendo con 0-10 % (NH<3>7N/MeOH)/DCM para proporcionar 5-(4-amino-ciclohexoxi)-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona deseada (30 mg, 91 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 57,93 (s,<1>H), 6,64 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,41 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 3,86 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,31 (t, J = 5,0 Hz, 4H), 3,11 (td, J = 8,9, 7,1, 3,4 Hz, 1H), 2,12 (d, J = 13,6 Hz, 2H), 2,03-1,91 (m, 2H), 1,82 (d, J = 10,8 Hz, 2H), 1,58 (t, J = 13,2 Hz, 2H).
Paso g
[0513]Una mezcla de 5-(4-aminociclohexoxi)-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona (30 mg, 0,14 mmol), 2-cloro-N-metilpirimidin-4-carboxamida (30 mg, 0,17 mmol) y se agitó K<2>CO<3>(100 mg, 0,72 mmol) en H<2>O (2 mL) a 100 °C durante 18 h. La mezcla se extrajo con DCM, se secó sobre Na<2>SO<4>, se concentró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con 0-10 % de MeOH/DCM. Esto proporcionó N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-oxo-3H-quinazolin-5-il)oxi]ciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (15 mg, 35,9 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 58,48 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,97 - 7,78 (m, 2H), 7,31 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,93 -3,81 (m, 4H), 3,50 (s, 1H), 3,43 - 3,29 (m, 4H), 3,00 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,29 -2,17 (m, 2H), 2,11 - 1,97 (m, 2H), 1,92 (dq, J = 12,7, 4,2 Hz, 2H), 1,85 - 1,70 (m, 2H).
Paso h
[0514]Una mezcla de N-metil-2-[[4-[(7-morfolino-4-oxo-3H-quinazolin-5-il)oxi]ciclohexil]amino]-pirimidin-4-carboxamida (15 mg, 0,031 mmol), K<2>CO<3>(80 mg, 0,58 mmol) en DMF (1 mL) se añadió Mel (50 j L, 0,80 mmol) y se agitó a 70 °C durante 30 min. El disolvente se evaporó y el producto bruto se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 4 g eluyendo con 0-10 % de MeOH/DCM. El producto recuperado era impuro. El producto se sometió a separación SFC para proporcionar N-metil-2-[[4-(3-metil-7-morfolino-4-oxo-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]pirimidin-4-carboxamida (2 mg, 16,3 %). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 58,47 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,28 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,47 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,32 (s, 1H), 4,67 (s, 1H), 3,99 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 3,92 - 3,80 (m, 4H), 3,50 (s, 3H), 3,37 - 3,23 (m, 4H), 3,01 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,27 - 2,15 (m, 2H), 2,07 - 1,95 (m, 2H)), 1,90 (dd, J = 13,0, 4,2 Hz, 2H), 1,79 (t, J = 12,8 Hz, 2H). ESI-M<s>m/z cálculo. 493,24374, encontrado 494,37 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,6 minuto.
Preparación del Compuesto 26: 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)-1H-imidazol-4-carboxamida
[0515]
[0516]Monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (16 mg, 0,118 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (ácido clorhídrico (1)) (35 mg, 0,183 mmol) y ácido 1-metil-1H-imidazol-4-carboxílico (15 mg, 0,119 mmol) se combinaron en DMF (0,2 mL) en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente y se dejaron agitar durante 40 min. Se añadió 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (25 mg, 0,0761 mmol) y se continuó la agitación durante 30 min más. Se añadió bicarbonato de sodio saturado y la mezcla se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2x) y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. El residuo resultante se purificó por cromatografía sobre 4 g de gel de sílice usando un gradiente de 0-10 % de metanol/DCM para producir 1-metil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil) -1H-imidazol-4-carboxamida (6 mg, 17 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 69,44 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 7,51 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 7,40 - 7,34 (m, 1H), 7,09 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 4,11 (tq, J = 9,9, 6,2, 5,3 Hz, 1H), 3,89 (dd, J = 5,9, 3,9 Hz, 4H), 3,73 (s, 3H), 3,43 - 3,33 (m, 4H), 2,29 - 2,17 (m, 2H), 2,04 - 1,73 (m, 6H). ESI-EM m/z = 433,05 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 27:
Preparación de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-iloxi)pirimidina: Compuesto (27-A)
[0517]
[0518]A una suspensión de NaH (370,1 mg, 9,254 mmol) (60 % en aceite mineral) en DMA (2 ml), enfriada con un baño de hielo, se le añadió una solución de 1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-ol (1 g, 6,321 mmol) en DMA (10 mL) e imidazol (43 mg). Después de agitar a ta durante 30 min, se añadió 2-cloropirimidina (868,7 mg, 7,585 mmol) y la mezcla se agitó durante 30 min a ta durante 2 h, luego a 60 °C durante 1 h. A continuación, se diluyó la reacción con EtOAc, se lavó con H<2>O, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. Se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (40 g de gel de sílice, EtOAc/heptano 0-50 %) para producir 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-iloxi)pirimidina (3,20 g, 6,230 mmol, 98,59 %) que se Se continúa con la siguiente reacción tal como está. r Mn 1H (300 MHz, cloroformo-d) 68,43 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,83 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,06 (tt, J = 6,5, 4,2 Hz, 1H), 4,06 - 3,75 (m, 4H), 1,98 - 1,77 (m, 6H), 1,64 - 1,55 (m, 2H). ESI-MS m/z cálculo. 236,11609, encontrado 237,22 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,72 minutos.
Preparación de 4-pirimidin-2-iloxiciclohexanona: Compuesto (27-B)
[0519]
[0520]A una solución de 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-iloxi)pirimidina (1,10 g, 4,656 mmol) en dioxano (6 mL) se le añadió HCl (7,883 mL de 6 M, 47,30 mmol). Después de agitar durante 2 días, la mezcla de reacción se evaporó, se neutralizó con NaHCO3 acuoso saturado, se extrajo con DCM (3x), se secó con MgSO4, se filtró y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (12 g de gel de sílice, EtOAc/heptano 0-100 %) para rendimiento 4-pirimidin-2-iloxiciclohexanona (800 mg, 4,162 mmol, 89,39 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) 68,56 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,98 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,47 (tt, J = 6,4, 3,3 Hz, 1H), 2,88 -2,62 (m, 2H), 2,51 -2,28 (m, 5H), 2,30 - 2,11 (m, 2H). ESI-MS m/z cálculo.
192,08987, encontrado 193,07 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,6 minutos.
Preparación de compuestos (27-C), (27-D) y (27-E)
[0521]
[0522]A una solución del Compuesto (27-B)(383 mg, 1,993 mmol) en MeOH (2 mL) se le añadió borohidruro de sodio (151 mg, 3,991 mmol). Se observa desprendimiento moderado de gas con un pequeño aumento de temperatura. La reacción se dejó agitar durante 1 hora, luego se inactivó con HCl (6N, 0,70 mL) y se dejó agitar hasta que cesó el desprendimiento de gas. La mezcla se basificó a pH ~8 con NaOH 1N y se extrajo con EtOAc (20 mL). Las fases orgánicas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. Se obtuvieron 248 mg de 4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol. Se purificaron 12 mg de la muestra mediante cromatografía de preparación HPLC (gradiente de CH3CN al 10-90 %/agua) para separar los isómeros cis/trans. Trans-4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol: RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) 68,54 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,95 (t, J= 4,8 Hz, 1H), 5,05 (tt, J = 9,4, 4,0 Hz, 1H), 3,91 - 3,75 (m, 1H), 2,26 1,99 (m, 4H), 1,76 - 1,41 (m, 4H). Cis-4-pirimidin-2-iloxicidohexanol: RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) 68,62 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 7,04 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,21 (tt, J = 5,3, 2,6 Hz, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,85 (p, J = 5,9 Hz, 1H), 2,17 - 2,02 (m, 2H), 1,88 - 1,67 (m, 6H).
Preparación de 7-morfolinoquinazolin-5-ol: Compuesto (1-F)
[0523]
[0524]Una suspensión de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolina (300 mg, 0,8691 mmol), Pd(OAc)<2>(18 mg, 0,08017 mmol) y RuPhos (81,10 mg, 0,1738 mmol) en 1,4-dioxano (5 mL) en un vial para microondas de 20 ml se burbujeó con N<2>. Se añadió morfolina (113,6 mg, 113,7 pL, 1,304 mmol), seguida de terc-butóxido de sodio (250,5 mg, 2,607 mmol). El vial se selló y se calentó a 100 °C durante 19 h. Se añadió NH4Cl acuoso y la mezcla se extrajo con EtOAc (6x). La fase orgánica combinada se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El producto bruto se purificó adicionalmente dos veces mediante cromatografía en gel de sílice (4 g 12 g de gel de sílice, MeOH/DCM 0-10 %) para producir 7-morfolinoquinazolin-5-ol (147 mg, 0,6357 mmol, 73,14 %). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) 6 10,86 (s, 1H), 9,23 (s, 1H), 8,93 (s, 1H), 6,72 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 3,76 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,33 (dd, J = 6,2, 3,4 Hz, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 231,10078, encontrado 232,22 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,49 minutos.
Preparación de metanosulfonato de trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexil): Compuesto (27-F)
[0525]
[0526]Se trató una solución de trans-4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol (80 mg, 0,4119 mmol) (de FC1), TEA (125,1 mg, 172,3 pL, 1,236 mmol) en DCM (5 mL) con cloruro de metanosulfonilo (70,77 mg, 47,82 pL, 0,6178 mmol) durante 1 h. La mezcla de reacción se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía flash (4 g de gel de sílice, EtOAc/DCM 0 30 %) para producir metanosulfonato de trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexilo) (74 mg, 0,2717 mmol, 65,95 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,43 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,86 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,05 (tt, J = 6,6, 3,4 Hz, 1H), 4,78 (tt, J = 7,0, 3,2 Hz, 1H), 2,17 - 1,93 (m, 5H), 1,82 (tdd, J = 13,0, 5,7, 3,5 Hz, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 272,08307, encontrado 273,12 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,76 minutos.
Preparación de 4-[5-cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinazolin-7-il]morfolina: Compuesto (27)
[0527]
[0528]Una mezcla de metanosulfonato de trans-(4-pmmidin-2-iloxiciclohexilo) (58,7 mg, 0,2156 mmol), 7-morfolinoquinazolin-5-ol (40 mg, 0,1730 mmol) y Cs2CO3 (67,64 mg, 0,2076 mmol) en dioxano (1 mL) y DMF (1 mL) se sellaron en un tubo para microondas de 5 mL y se calentaron a 110 °C durante 15 h. La reacción de la mezcla fue concentrada a baja presión. El residuo se disolvió en DCM/MeOH 9:1 y se filtró a través de celite. El filtrado se evaporó y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (2 x 4 g de gel de sílice, MeOH/DCM 0-5 %) para producir 4-[5-cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinazolin-7-il]morfolina (45 mg, 0,0994 mmol, 57,45 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 9,45 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,53 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,93 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,85 - 6,72 (m, 1H), 6,60 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,20 (dq, J = 7,6, 3,7 Hz, 1H), 4,67 (dt, J = 6,3, 3,1 Hz, 1H), 3,99 - 3,79 (m, 4H), 3,51 - 3,15 (m, 4H), 2,38 - 2,06 (m, 4H), 2,11 - 1,78 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 407,19574, encontrado 408,35 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,63 minutos.
Preparación del Compuesto 28 :4-[5-trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinazolin-7-il]morfolina
Preparación de metanosulfonato de cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexil): Compuesto (27-F)
[0529]
[0530]A una solución de cis-4-pirimidin-2-iloxicidohexanol (160 mg, 0,8238 mmol) (FC2) y TEA (250,0 mg, 344,4 pL, 2,471 mmol) en DCM (1078 mL) se le añadió cloruro de metanosulfonilo (140,7 mg, 95,07 pL, 1,228 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se concentró y se cromatografió sobre 12 g de gel de sílice usando EtOAc al 0 ^ 70 %/heptano como eluyente para producir metanosulfonato de cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexilo) (142 mg, 0,5214 mmol, 63,31 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,51 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,93 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,15 (tt, J = 7,9, 3,1 Hz, 1H), 4,97 - 4,70 (m, 1H), 3,04 (s, 3H), 2,38 - 2,04 (m, 4H), 1,95 - 1,68 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 272,08307, encontrado 273,16 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,74 minutos.
Preparaciónde 4-[5-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinazolin-7-il]morfolina:Compuesto (27)
[0531]
[0532]Una mezcla de metanosulfonato de cis-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexilo) (43 mg, 0,1579 mmol), 7-morfolinoquinazolin-5-ol (40 mg, 0,1730 mmol) y Cs2CO3 (67,64 mg, 0,2076 mmol) en dioxano (1 mL) y DMF (1 mL) se sellaron en un tubo para microondas de 5 mL y se calentaron a 110 °C durante 15 h. La reacción de la mezcla fue concentrada a baja presión. El residuo se disolvió en DCM/MeOH 9:1 y se filtró a través de celite. El filtrado se evaporó y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (2 x 4 g de gel de sílice, MeOH/DCM 0-5 %) para producir 4-[5-trans-(4-pirimidin-2-iloxiciclohexoxi)quinazolin-7-il]morfolina (14,5 mg, 0,03203 mmol, 18,51 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformod) ó 9,43 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,54 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,95 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,80 (dd, J = 2,1, 0,8 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,29 - 5,24 (m, 1H), 4,80 - 4,59 (m, 1H), 4,11 - 3,77 (m, 4H)), 3,58 - 3,30 (m, 4H), 2,33 - 2,20 (m, 4H), 2,04 -1,70 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 407,19574, encontrado 408,39 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,62 minutos.
Preparación de los compuestos 29 y 35.
[0533]
Preparación de 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-7-en-8-il)tiazol: Compuesto (29-B)
[0534]Una mezcla de 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-7-en-8-il)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano (2,0 g, 7,5 mmol), 2-bromotiazol (1,27 g, 7,74 mmol), Pd(PPh3)4 (436 mg, 0,377 mmol) y Na2CO3 (7,60 ml de solución 2 M, 15,2 mmol) en dioxano (40 mL) se evacuó y se rellenó con nitrógeno (repetido 2 veces), luego se calentó a 90 °C durante 6 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua, luego se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía flash usando EtOAc y heptano para producir 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-7-en-8-il)tiazol (889 mg, rendimiento 53,0 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,75 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,63 - 6,52 (m, 1H), 4,04 (s, 4H), 3,00 -2,74 (m, 2H), 2,69 -2,38 (m, 2H), 1,94 (t, J = 6,6 Hz, 2H).
Preparación de 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-il)tiazol: Compuesto (29-C)
[0535] Una mezcla de 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]dec-7-en-8-il)tiazol (889 mg, 3,98 mmol) y paladio al 10 % sobre carbón activado (425 mg, 0,399 mmol) en EtOAc (15 mL) se agitó a temperatura ambiente bajo 1 atm de hidrógeno durante la noche. La reacción se filtró a través de Celite y se concentróal vacíopara producir 2-(1,4-dioxaspiro[4,5]decan-8-il)tiazol (860 mg, rendimiento del 93,9 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,70 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 3,99 (s, 4H), 3,11 (tt, J = 11,1, 3,8 Hz, 1H), 2,28 -2,12 (m, 2H), 1,99 - 1,83 (m, 4H), 1,72 (td, J = 13,3, 4,3 Hz, 2H). ESI-MSm/zcalc. 225,08235, encontrado 226,05 (M+1)+.
Preparación de 4-tiazol-2-ilciclohexanona: Compuesto (29-D)
[0536] Una solución de 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-il)tiazol (860 mg, 3,82 mmol) y p-toluenosulfonato de piridinio (1,93 g, 7,68 mmol) en acetona (19 mL) y agua (19 mL) se calentó a reflujo durante la noche. La acetona se eliminóal vacío.La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir 4-tiazol-2-ilciclohexanona (641,5 mg, rendimiento del 90 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 3,53 (tt, J = 10,4, 3,4 Hz, 1H), 2,66 - 2,40 (m, 6H), 2,27 - 2,05 (m, 2H). ESI-MSm/zcalc. 181,05614, encontrado 182,02 (M+1)+.
Preparación de compuestos (29-E) y (29-F)
[0537] A una solución de 4-tiazol-2-ilciclohexanona (564 mg, 3,11 mmol) en MeOH (15 mL) a 0 °C se le añadió NaBH4 (244 mg, 6,32 mmol). La reacción se calentó a temperatura ambiente durante 1 hora. El disolvente se eliminóal vacío.La reacción se diluyó con agua y luego se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir 4-tiazol-2-ilciclohexanol (492 mg, rendimiento del 82,4 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,68 (t, J = 3,2 Hz, 1H), 7,20 (dd, J = 5,3, 3,3 Hz, 1H), 4,11 - 4,01 (m, 1H), 3,70 (tt, J = 10,6, 4,3 Hz, 1H), 3,16 -2,90 (m, 1H), 2,29 - 2,16 (m, 2H), 2,16 -2,05 (m, 2H), 1,73 - 1,56 (m, 2H), 1,54 - 1,35 (m, 2H)). ESI-MSm/zcalc. 183,07178, encontrado 184,0 (M+1)+.
[0538] Se purificó una mezcla detrans-y cis-4-tiazol-2-ilciclohexanol (492 mg, 2,68 mmol) mediante SFC usando CO<2>y EtOH (Et<2>NH al 0,2 %) para dar trans-4-tiazol-2-ilciclohexanol (381 mg, 2,08 mmol) RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,70 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 3,72 (tt, J = 10,6, 4,3 Hz, 1H), 3,02 (tt, J = 11,9, 3,7 Hz, 1H), 2,33 - 2,19 (m, 2H), 2,19 - 2,05 (m, 2H), 1,77 - 1,37 (m, 4H) y cis-4-tiazol-2-ilciclohexanol (65,7 mg, 0,359 mmol) RMN 1H (400 MHz, CDCb) ó 7,70 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,22 (dt, J = 7,2, 3,6 Hz, 1H), 4,08 (s, 1H), 3,11 (tt, J = 10,2, 3,9 Hz, 1H), 2,19 - 2,01 (m, 2H), 2,01 - 1,92 (m, 2H), 1,92 - 1,81 (m, 2H), 1,81 - 1,70 (m, 2H).
Preparación del compuesto (29)
[0539]
[0540] A una solución de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (25 mg, 0,11 mmol), cis-4-tiazol-2-ilciclohexanol (30 mg, 0,16 mmol) y PPh<3>(52 mg, 0,20 mmol) en DCM (1 mL) se añadió azodicarboxilato de di-terc-butilo (45 mg, 0,20 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó en una columna de SiO<2>derivatizada con C18 de fase inversa usando CH<3>CN al 5-50 % (TFA al 0,1 %) en H<2>O (TFA al 0,1 %). Las fracciones del producto se combinaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir 4-[5-(trans-4-tiazol-2-ilciclohexoxi)quinazolin-7-il]morfolina (17,2 mg, 38,5 %). RMN 1H (300 MHz, CDCI<3>) 6 9,42 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,63 - 4,42 (m, 1H), 4,01 - 3,84 (m, 4H), 3,49 - 3,31 (m, 4H), 3,30 - 3,10 (m, 1H), 2,39 (d, J = 9,6 Hz, 4H), 2,04 - 1,58 (m, 4H). ESI-MSm/zcalc. 396,162, encontrado 397,32 (M+1)+.
Preparación del compuesto (35)
[0541]
[0542]A una solución de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (25 mg, 0,11 mmol), trans-4-tiazol-2-ilciclohexanol (25 mg, 0,14 mmol) y PPh3 (46 mg, 0,18 mmol) en DCM (1 mL) se añadió azodicarboxilato de di-terc-butilo (40 mg, 0,18 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se consideró incompleta por lo que se añadieron trans-4-tiazol-2-ilciclohexanol (5 mg), PPh3 (11 mg) y azodicarboxilato de di-terc-butilo (10 mg) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó en una columna de SO<2>derivatizada con C18 de fase inversa usando CH<3>CN al 5-40 % (0,1 % TFA) en H<2>O (0,1 % TFA). Las fracciones del producto se combinaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir 4-(5-((cis-4-(tiazol-2-il)ciclohexil)oxi)quinazolin-7-il)morfolina (14,8 mg, rendimiento del 33,2 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) 69,47 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,74 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 3,3 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 3,96 - 3,84 (m, 4H), 3,51 - 3,38 (m, 4H), 3,31 - 3,16 (m, 1H), 2,42 - 2,27 (m, 2H), 2,22 - 2,05 (m, 4H), 1,96 -1,82 (m, 2H). ESI-MSm/zcalc. 396,162, encontrado 397,26 (M+1)+.
Preparación de los compuestos 30 y 38
Preparación de los compuestos (30-A) y (30-B)
[0543]Los compuestos (30-A)y (30-B)se prepararon de manera similar a la de los compuestos (29-E)y (29-F). Se purificó una mezcla detrans-y cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexanol (465 mg, 2,42 mmol) mediante SFC usando CO<2>y EtOH (0,2 % Et<2>NH) para dar trans-4-(2-metilpirimidina)-4-il)ciclohexanol (331 mg, 1,69 mmol) RMN 1H (300 MHz, CDCb) 6 8,53 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 3,82 - 3,62 (m, 1H), 2,72 (s, 3H), 2,62 (tt, J = 12,0, 3,5 Hz, 1H), 2,23 -2,09 (m, 2H), 2,09 - 1,96 (m, 2H), 1,70 - 1,35 (m, 4H) y cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexanol (71 mg, 0,35 mmol) RMN 1H (300 MHz, CDCb) 68,55 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 4,22 - 4,08 (m, 1H), 2,80 -2,59 (m, 4H), 2,08 -1,61 (m, 8H).
Preparación del Compuesto 30: 4-[5-[cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexoxi]quinazolin-7-il]morfolina
[0544]
[0545]A una solución de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (27,5 mg, 0,12 mmol), trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexanol (35 mg, 0,18 mmol) y PPh3 (56 mg, 0,21 mmol) en DCM (1 mL) se añadió azodicarboxilato de di-terc-butilo (49 mg, 0,21 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó en una columna de SiO<2>derivatizada con C18 de fase inversa usando CH<3>CN al 5-40 % (TFA al 0,1 %) en H<2>O (TFA al 0,1 %). Las fracciones del producto se combinaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir 4-[5-[cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexoxi]quinazolin-7-il]morfolina (18,5 mg, rendimiento del 36,5 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,51 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 8,59 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,96 - 4,82 (m, 1H), 4,03 - 3,82 (m, 4H), 3,51 - 3,30 (m, 4H), 2,90 - 2,77 (m, 1H), 2,75 (s, 3H), 2,44 -2,28 (m, 2H), 2,19 - 1,75 (m, 6H). ESI-MSm/zcalc. 405.21646, encontrado 406.36 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 38:4-[5-[trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexoxi]quinazolin-7-il]morfolina
[0546]
[0547]A una solución de 7-morfolinoquinazolin-5-ol (25 mg, 0,11 mmol), cis-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexanol (33 mg, 0,16 mmol) y PPh3 (52 mg, 0,20 mmol) en DCM (1 mL) se añadió azodicarboxilato de di-terc-butilo (45 mg, 0,20 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice usando EtOAc para producir 4-[5-[trans-4-(2-metilpirimidin-4-il)ciclohexoxi]quinazolin-7-il]morfolina (17 mg, 0,041 mmol, rendimiento del 37 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,41 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 8,57 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,63 - 4,41 (m, 1H), 4,05 - 3,83 (m, 4H), 3,53 - 3,29 (m, 4H), 2,86 - 2,76 (m, 1H), 2,75 (s, 3H), 2,51 -2,33 (m, 2H), 2,25 - 2,10 (m, 2H), 1,96 - 1,62 (m, 6H). ESI-MSm/zcalc. 405.21646, encontrado 406.29 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 31 :4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilato de etilo
[0548]
Preparación del compuesto (31-C)
[0549]A una solución de 7-bromoquinazolin-5-ol (500 mg, 2,22 mmol), 4-hidroxiciclohexanocarboxilato de etilo (516 mg, 3,00 mmol) y PPh3 (937 mg, 3,57 mmol) en DCM (20 mL) se le añadió di-azodicarboxilato de terc-butilo (819 mg, 3,56 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice usando EtOAc y heptano para producir 4-(7-bromoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilato de cis-etilo (585 mg, rendimiento del 69,4 %). Rm N 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,74 (s, 1H), 9,32 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,05 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 4,82 - 4,72 (m, 1H)), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 2,58 - 2,43 (m, 1H), 2,28 -2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,74 (m, 6H), 1,30 (t, J = 7,1 Hz, 3H). ESI-MSm/zcalc. 378,0579, encontrado 379,1 (M+1)+.
Preparación del compuesto (31)
[0550]Se cargó un vial para microondas Biotage de 0,5-2 ml equipado con una barra agitadora magnética con 4-(7-bromoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilato de etilo (100 mg, 0,264 mmol), Pd(OAc)<2>(6 mg, 0,03 mmol) y se burbujeó RuPhos (25 mg, 0,054 mmol) en dioxano (1,6 mL) y nitrógeno a través de la reacción durante 10 minutos. Se añadieron morfolina (36 ml, 0,41 mmol) y Cs2CO3 (258 mg, 0,792 mmol) y el vial se selló con un tapón de teflón desechable. El vial se calentó a 100 °C durante 4,5 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua, luego se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSCM, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía flash usando EtOAc para producir 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilato de etilo (90 mg, rendimiento del 85 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,46 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 6,81 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,83 - 4,66 (m, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 4.01 - 3,83 (m, 4H), 3,51 - 3,29 (m, 4H), 2,48 (tt, J = 10,3, 3,9 Hz, 1H), 2,30 -2,12 (m, 2H), 2,12 - 1,65 (m, 6H), 1,30 (t, J = 7.1 Hz, 3H). ESI-MSm/zcalc. 385.20016, encontrado 386.28 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 32:cis-N-ciclopropil-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexanocarboxamida
[0551]
Preparación del compuesto (32-A)
[0552]Una solución de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilato de etilo (210 mg, 0,545 mmol: Compuesto (31)) y LiOH (20 mg, 0,835 mmol) en MeOH (3 mL) y agua (500 pL). se agitó a 65°C durante 1,5 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y el pH se ajustó a 1 con HCl 6 M. El disolvente se eliminó para producir clorhidrato del ácido 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxílico.
Preparación del compuesto (32)
[0553]A una solución de clorhidrato de ácido 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxílico (46,4 mg, 0,118 mmol), ciclopropanamina (10 pL, 0,14 mmol) y HATU (49 mg, 0,13 mmol) en THF (2 mL) se añadió DIPEA (82 pL, 0,47 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó en una columna de SiO<2>derivatizada con C18 de fase inversa usando CH<3>CN al 5-30 % (TFA al 0,1 %) en H<2>O (TFA al 0,1 %). Las fracciones del producto se combinaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir cis-N-ciclopropil-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexanocarboxamida (27 mg, 56 % de rendimiento). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,47 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 6,81 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,56 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 5,65 (s, 1H), 4,87 - 4,72 (m, 1H), 4,02 - 3,83 (m, 4H), 3,48 - 3,35 (m, 4H), 2,82 - 2,68 (m, 1H), 2,37 - 2,17 (m, 3H), 2,02 -1,68 (m, 8H), 0,90 - 0,75 (m, 2H), 0,59 - 0,41 (m, 2H). ESI-MSm/zcalc. 396,21616, encontrado 397,31 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 33 :2,2-dimetil-N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)ciclopropano-1-carboxamida
[0554]
[0555]Monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (23 mg, 0,170 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (ácido clorhídrico (1) (49 mg, 0,256 mmol) y ácido 2,2-dimetilciclopropanocarboxílico (18 mg, 0,158 mmol) en DMF (280 mL) en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente y se dejaron en agitación durante 40 min. Se añadió 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (35 mg, 0,107 mmol) y se dejó. Se añadió bicarbonato de sodio saturado y se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2x), salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida usando 0-10 % de MeOH/DCM como eluyente y se purificó adicionalmente mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se pasó a través de un SPE PL-HCO3 MP para proporcionar 2,2-dimetil-N-((1s,4s)-4-((7morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)ciclopropano-1-carboxamida (11,5 mg, rendimiento del 25 %). RMN 1H (300 MHz, CDCI<3>) 69,45 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,78 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,57 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,74 (q, J = 3.2 Hz, 1H), 4,05 - 3,84 (m, 5H), 3,46 - 3,31 (m, 4H), 2,19 (dq, J = 9,9, 3,3 Hz, 2H), 1,97 - 1,55 (m, 6H), 1,26 (dd, J = 8,0, 5.3 Hz, 1H), 1,17 (s, 3H), 1,15 (s, 3H), 1,09 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 0,73 (dd, J = 8,0, 4,3 Hz, 1H). ESI-EM m/z = 425,33 (M+1)+
Preparación del Compuesto 34: N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)oxetano-3-carboxamida
[0556]
[0557]Monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (18 mg, 0,133 mmol), 3-(etiliminometilenoamino)-N,N-dimetil-propan-1-amina (ácido clorhídrico (1) (38 mg, 0,198 mmol) y ácido oxetano-3-carboxílico (13 mg, 0,127 mmol) y trietilamina (15 pL, 0,1076 mmol) se combinaron en DMF (1 mL) en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente y se dejaron agitar durante 40 min. 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanamina (27 mg, 0,0822 mmol) y la reacción se dejó agitar durante la noche. Se añadió bicarbonato de sodio saturado y se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (2x), salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía sobre 4 g de gel de sílice usando un gradiente de 0-10 % de metanol/DCM para producir N-((1s,4s)-4-((7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi)ciclohexil)oxetano-3-carboxamida (4 mg, rendimiento del 11 %). RMN 1H (300 MHz, CDCla) 69,42 (s, 1H), 9,08 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,79 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,51 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,95 - 4,72 (m, 5H), 4,10 - 3,84 (m, 5H), 3,70 (tt, J = 8,3, 6,7 Hz, 1H), 3,39 (dd, J = 5,8, 4,0 Hz, 5H), 2,30 -2,15 (m, 3H), 1,98 - 1,58 (m, 4H). ESI-EM m/z = 413,46 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 36: N-[4-(2,4-dimetil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]-2-metil-pirim idin-4-amina
[0558]
Reactivos y condiciones: (a) NH<3>, 90 °C, 22 h; (b) AcCl, DIEA, DCM; (c) NH<3>, EtOH; (d) NaH, PMB-OH, DMF; (e) morfolina, DIEA, iPrOH; f) TFA, Mc D; (g) metanosulfonato de [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexil], CsCO3, DMF
Paso a
[0559]Se agitó una mezcla de 1-(2,4,6-trifluorofenil)etanona (7 g, 40,2 mmol) y amonio (40 g, 665 mmol, 30 % p/p) a 90 °C durante 22 h en un recipiente a presión sellado. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se extrajo con DCM, se secó sobre Na<2>SÜ<4>, se concentró y se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 120 g eluyendo con EtOAc al 0-30 %/heptano. Esto proporcionó 1-(2-amino-4,6-difluorofenil)etanona (5,1 g, 74 %). RMN 1H (400 m Hz , CDCb) ó<6 , 6 6>- 6,27 (m, 2H), 6,19 - 6,11 (m, 2H), 2,59 (dd, J = 8,4, 1,4 Hz, 3H).
Paso b
[0560]A una solución de 1-(2-amino-4,6-difluoro-fenil)etanona (3,1 g, 18,1 mmol) en DCM (30 mL) se le añadió DIEA (3,8 ml, 21,8 mmol) y AcCl (2 ml, 28,1 mmol) a 0 °C. La mezcla se agitó durante 1 h y se concentró. El residuo se diluyó con DCM, se lavó con solución sat. de NaHCO<3>y se concentró alvacío.El residuo blanco se llevó al siguiente paso. Esto proporcionó N-(2-acetil-3,5-difluorofenil)acetamida (3,8 g, 17,8 mmol, 98,4 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 11,66 (s, 1H), 8,39 (ddd, J = 11,7, 2,6, 1,6 Hz, 1H), 6,60 (ddd, J = 12,2, 8,2, 2,6 Hz, 1H), 2,67 (d, J = 8,5 Hz, 3H), 2,24 (s, 3H).
Paso c
[0561]Una mezcla de N-(2-acetil-3,5-difluoro-fenil)acetamida (1,7 g,<8>mmol) y NH<3>2M en EtOH (80 mL de 2 M, 160 mmol) se agitó a 90 °C durante 18 h. La mezcla se concentró alvacíoy se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 40 g con EtOAc al 0-30 %/hex. Esto proporcionó 5,7-difluoro-2,4-dimetilquinazolina (1,2 g, 77 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,40 (ddt, J = 9,3, 2,3, 1,2 Hz, 1H), 7,03 (ddd, J = 11,2, 8,9, 2,4 Hz, 1H), 3,01 (dd, J = 6,0, 0,9 Hz, 3H), 2,83 (s, 3H).
Paso d
[0562]A una solución de (4-metoxifenil)metanol (270 pL, 2,0 mmol) en DMF (5 mL) se le añadió NaH (110 mg, 2,75 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 10 min. A la mezcla se le añadió una solución de 5,7-difluoro-2,4-dimetilquinazolina (350 mg, 1,8 mmol) en DMF (5 mL) y se continuó agitando durante 30 min más. La mezcla se inactivó con H<2>O, se extrajo con DCM, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El crudo se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 40 g eluyendo con un gradiente de 0-40 % de EtOAc/heptano y proporcionó 7-fluoro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2,4-dimetil-quinazolina (300 mg, 37 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,51 - 7,36 (m, 2H), 7,17 (dd, J = 9,4, 2,3 Hz, 1H), 7.07 - 6,91 (m, 2H), 6,76 (dd, J = 10,9, 2,4 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,87 (s, 3H), 2,97 (s, 3H), 2,81 (s, 3H).
Paso e
[0563]Una mezcla de 7-fluoro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2,4-dimetilquinazolina (300 mg, 0,96 mmol), morfolina (300 pL, 3,4 mmol) y DIEA (300 pL, 1,7 mmol) en iPrOH (3 mL) se calentó en el microondas a 160 °C durante 20 min. La mezcla se calentó en microondas durante 30 min a 180 °C y luego 60 min a 190 °C. La mezcla se concentró, se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc al 0-70 %/heptano y proporcionó 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2,4-dimetilquinazolin-7-il]morfolina (60 mg, 0,158 mmol, 16,5 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 7,49 -7,37 (m, 2H), 7,03 - 6,90 (m, 2H), 6,77 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,11 (s, 2H), 3,99 - 3,81 (m, 7H), 3,46 - 3,32 (m, 4H), 2,88 (s, 3H), 2,73 (s, 3H). ESI-MSm/zcalc. 379,1896, encontrado 380,1 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,6 minutos.
Paso f
[0564]A una solución de 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2,4-dimetil-quinazolin-7-il]morfolina (60 mg, 0,16 mmol) en DCM (10 mL) se le añadió TFA (1 ml), 13 mmol), y la solución resultante se agitó durante 1 h. La mezcla se concentró y se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 4 g eluyendo con MeOH al 0-5 %/DCM para proporcionar 2,4-dimetil-7-morfolinoquinazolin-5-ol (37 mg, 90 %). RMN 1H (300 MHz, DMSO) ó 6,69 (s, 2H), 5,76 (s, 1H), 3,74 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,36 (s, 4H), 2,93 (s, 3H), 2,58 (s, 3H).
Paso g
[0565]Una mezcla de 2,4-dimetil-7-morfolino-quinazolin-5-ol (34 mg, 0,13 mmol), metanosulfonato de [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (55 mg, 0,19 mmol) y carbonato de cesio (70 mg, 0,21 mmol) en DMF (1 mL) se agitó a 90 °C durante 20 h. La mezcla se diluyó con DCM, se filtró sobre una capa de Celite y se concentró. El crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con MeOH/DCM al 0-10 % y proporcionó N-[4-(2,4-dimetil-7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-2-metil-pirimidin-4-amina (6,1 mg, 0,013 mmol, 9,9 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 8,13 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,18 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,73 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 3,96 - 3,85 (m, 4H), 3,42 - 3,28 (m, 4H), 3,01 (s, 3H), 2,73 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,32 - 2,19 (m, 2H), 2.08 - 1,73 (m, 9H). ESI-MSm/zcalc. 448,25867, encontrado 449,32 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,5 minutos
Preparación de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi-N-(2-piridil)ciclohexanocarboxamida: Compuesto 37
[0566]
[0567]A una solución de 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilato de etilo (30 mg, 0,078 mmol: Compuesto (30)) y piridin-2-amina (15 mg, 0,16 mmol) en tolueno (0,5 mL) en atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota AlMe<2>Cl (155 pL de 1,0 M, 0,155 mmol). Después de completar la adición, la reacción se calentó a 80 °C durante 30 minutos. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentróal vacío.El residuo se purificó por MPLC en una columna de SiÜ<2>de fase inversa C18 usando CH<3>CN al 5-40 % (TFA al 0,1 %) en H<2>O (TFA al 0,1 %). Las fracciones del producto se combinaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi-N-(2-piridil)ciclohexanocarboxamida (21,8 mg, 63,3 % de rendimiento). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,49 (s, 1H), 9,11 (s, 1H), 8,28 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 8,16 (s, 1H), 7,84 - 7,68 (m, 1H), 7,15 - 7,02 (m, 1H), 6,83 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,59 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,88 - 4,76 (m, 1H), 4,05 - 3,81 (m, 4H), 3,40 (dd, J = 14,8, 10,0 Hz, 4H), 2,59 -2,42 (m, 1H), 2,42 - 2,25 (m, 2H), 2,25 -2,04 (m, 2H), 2,04 - 1,71 (m, 4H). ESI-MSm/zcalc. 433,2114, encontrado 434,33 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 39: N-[4-(7-bromoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-2-metil-pirimidin-4-amina
[0568]
[0569]Se cargó un vial para microondas equipado con una barra agitadora magnética con 7-bromoquinazolin-5-ol (31,3 mg, 0,139 mmol), metanosulfonato de [4-[(2-metilpirimidin-4-il)amino]ciclohexil] (120 mg, 0,421 mmol) y Cs2CO3 (136 mg, 0,417 mmol) en DMF (0,5 mL). El vial se selló y se calentó en el microondas a 120 °C durante 10 minutos. La reacción se consideró incompleta por lo que se calentó en el microondas a 120 °C durante 10 minutos y luego a 140 °C durante 10 minutos. La reacción se filtró y se purificó en una columna de SiO<2>derivatizada en C18 de fase inversa. El producto se neutralizó disolviéndolo en acetato de etilo y lavando con NaHCO3 acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir N-[4-(7-bromoquinazolin-5-il)oxiciclohexil]-2-metil-pirimidin-4-amina (19,3 mg, 32,4 % producir). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,72 (s, 1H), 9,33 (s, 1H), 8,12 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 6,22 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,04 (s, 1H), 4,90 - 4,75 (m, 1H), 3,90 (s, 1H), 2,54 (s, 3H), 2,36 -2,18 (m, 2H), 2,14 - 1,59 (m, 6H). ESI-MSm/zcalc. 413.0851, encontrado 414,17 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 40: N-metil-4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxamida
[0570]
[0571]A una solución de clorhidrato de ácido 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxílico (46,4 mg, 0,118 mmol), metilamina (100 pL de 2M, 0,200 mmol) y HATU (55 mg, 0,14 mmol) en THF (1 mL) y DMF (1 mL) se añadió DIPEA (95 pL, 0,55 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir N-metil-4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxamida (30 mg, 63 % de rendimiento). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 9,47 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 6,83 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,67 - 5,49 (m, 1H), 4,83 - 4,75 (m, 1H), 3,95 - 3,85 (m, 4H), 3,48 - 3,36 (m, 4H), 2,87 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 2,38 -2,24 (m, 3H), 2,11 - 1,84 (m, 4H), 1,83 - 1,67 (m, 2H). ESI-MSm/zcalc. 370.2005, encontrado 371.38 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 41: N-(3-metoxipropil)-4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxamida
[0572]
[0573]A una solución de clorhidrato de ácido 4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxiciclohexanocarboxilico (46 mg, 0,13 mmol), 3-metoxipropan-1-amina (13 mg, 0,15 mmol) y HATU (55 mg, 0,14 mmol) en THF (1 mL) se añadió DIPEA (95 ml, 0,55 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La reacción se concentróal vacíoy el residuo se purificó mediante MPLC en una columna de SiO<2>de fase inversa C18 usando CH<3>CN al 5-50 % (TFA al 0,1 %) en H<2>O (TFA al 0,1 %). Las fracciones del producto se combinaron y neutralizaron con NaHCO3 (sat) y luego se extrajeron con EtOAc. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para producir N-(3-metoxipropil)-4-(7-morfolinoquinazolin-5-il)oxi-ciclohexanocarboxamida (39,4 mg, 69,3 % de rendimiento). RMN 1H (300 MHz, CDCb)ó9,47 (s, 1H), 9,10 (s, 1H), 6,81 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,38 - 6,21 (m, 1H), 4,83 - 4,72 (m, 1H), 3,98 - 3,84 (m, 4H), 3,53 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 3,49 - 3,29 (m, 9H), 2,40 - 2,19 (m, 3H), 2,12 - 1,63 (m, 8H). ESI-MSm/zcalc. 428.24237.
Preparación del Compuesto 42: 2-[[4-(2,4-dimetil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]-N-metilpirim idin-4-carboxamida.
[0574]
Reactivos y condiciones: (a) TFA, DCM; (b) metanosulfonato de [4-[[4-(metilcarbamoil)-pirimidin-2-il]amino]ciclohexil], CsCO3, DMF; (c) morfolina, D iEA, iPrOH
Paso a
[0575]A una solución de 7-fluoro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-2,4-dimetilquinazolina (130 mg, 0,41 mmol) en DCM (1 mL) se le añadió TFA (0,5 ml, 6,5 mmol) y se agitó. Se continuó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se concentró y se purificó en un cartucho de gel de sílice de 12 g eluyendo con MeOH/DCM al 0-4 % para proporcionar 7-fluoro-2,4dimetilquinazolin-5-ol (70 mg, 87 %) RMN 1H (300 MHz), CDCI<3>) 67,00 (ddd, J = 28,8, 9,8, 2,4 Hz, 2H), 3,17 (s, 3H), 2,87 (s, 3H).
Paso b
[0576]Una mezcla de 7-fluoro-2,4-dimetil-quinazolin-5-ol (45 mg, 0,23 mmol), metanosulfonato de [4-[[4-(metilcarbamoil)-pirimidin-2-il]amino]ciclohexil] (120 mg, 0,36 mmol) y carbonato de cesio (200 mg, 0,61 mmol) en d Mf (1 mL) se agitó a 90 °C durante 20 h. La mezcla se diluyó con DCM, se filtró a través de una capa de celite, se concentró y se purificó mediante un cartucho de gel de sílice de 4 g usando MeOH/DCM al 0-5 % para proporcionar 2-[[4-(7-fluoro-2,4-dimetil-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]-N-metilpirimidina-4-carboxamida (10 mg, 10 %). ESI-MSm/zcalc. 424,2, encontrado 425,3 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,55 minutos.
Paso c
[0577]Una mezcla de 2-[[4-(7-fluoro-2,4-dimetil-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]-N-metil-pirimidin-4-carboxamida (10 mg, 0,023 mmol), morfolina (200 j L, 2,3 mmol) y DIEA (400 j L, 2,3 mmol) en iPrOH (0,5 mL) se agitaron a 90 °C durante 3 días. La mezcla se concentró y se purificó mediante HPLC preparatoria C18 (agua/acetonitrilo con modificador TFA). Las fracciones relevantes se secaron y el residuo se pasó a través de un SPE PL-HCO3 MP para proporcionar 2-[[4-(2,4-dimetil-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]amino]-N-metilpirimidina-4-carboxamida (3,2 mg, 25 %). RMN 1H (300 MHz, CDCla) 68,52 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,36 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,55 - 6,47 (m, 1H), 5,19 (s, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,15 - 4,00 (m, 0H), 3,90 (dd, J = 6,0, 3,8 Hz, 4H), 3,43 - 3,32 (m, 4H), 3,11 -2,98 (m, 6H), 2,80 (s, 0H), 2,33 -2,18 (m, 2H), 2,13 - 1,77 (m, 6H). ESI-MSm/zcalc.491,2645, encontrado 492,3 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,54 minutos.
Preparación del Compuesto 43: 2-metoxi-N-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-il)oxiciclohexil]acetamida
Preparación del compuesto (43-A)
[0578]
[0579]A una solución a 0 °C de 4-aminociclohexan-1-ol (5,01 g, 42,19 mmol) en DCM (50 mL) se le añadió DIEA (14,7 ml, 84,39 mmol) seguido de cloruro de 2-metoxiacetilo (4,4 mL, 47,31 mmol) gota a gota. La reacción se agitó durante 5 minutos, luego se retiró el baño de hielo y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, se transfirió la mezcla de reacción a un embudo de separación, se lavó la capa orgánica con HCl 1N, se extrajo la capa acuosa con EtOAc, se combinaron las capas orgánicas, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron hasta obtener un sólido de color marrón para producir 2,4 g de producto bruto. Este producto bruto se disolvió en DCM y se inyectó en una columna ISCO de 80 g, detector ELSD, 0-7 % de MeOH/DCM. Las fracciones deseadas se combinaron y se concentraron al vacío para producir N-(4-hidroxiciclohexil)-2-metoxiacetamida (800 mg). RMN 1H (400 MHz, cloroformod) 66,32 (s, 1H), 3,86 (s, 2H), 3,79 (ddd, J = 11,7, 8,1, 3,9 Hz, 1H), 3,62 (tt, J = 10,5, 3,9 Hz, 1H), 3,41 (d, J = 0,6 Hz, 3H), 2,00 (dtd, J = 11,8, 7,7, 7,1, 3,5 Hz, 4H), 1,47 - 1,35 (m, 2H), 1,31 - 1,17 (m, 2H).
Preparación del compuesto (43-B)
[0580]
[0581]A una solución de N-(4-hidroxiciclohexil)-2-metoxi-acetamida (800 mg, 4,144 mmol) en DCM (9,467 mL) se le añadió DIEA (1,130 g, 1,523 mL, 8,744 mmol) y MsCl (515,0 mg, 348,0 pL, 4,496 mmol). La mezcla se agitó durante 0,5 h y se diluyó con DCM, se lavó con H<2>O, se secó sobre Na2SO4, se filtró a través de una capa fina de gel de sílice, la capa de sílice se lavó con DCM y se concentró. Se obtuvo metanosulfonato de [4-[(2-metoxiacetil)amino]ciclohexil] como un sólido blanquecino (1,09 g, rendimiento del 99,1 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 6,36 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,65 (m, 1H), 3,87 (m, 3H), 3,41 (s, 3H), 3,02 (s, 3H), 2,22 - 2,01 (m, 4H), 1,81 - 1,64 (m, 2H), 1,40 - 1,24 (m, 2H).
Preparación del compuesto (43)
[0582]
[0583]Una mezcla de metanosulfonato de [4-[(2-metoxiacetil)amino]ciclohexil] (75 mg, 0,2827 mmol), 4-metoxi-7-morfolino-quinazolin-5-ol (sal del ácido trifluoroacético: Compuesto (9-A)) (54 mg, 50 % de pureza, 0,07194 mmol) y Cs<2>COa (251 mg, 0,7704 mmol) en DMF se selló en un tubo de microondas de 5 mL y se calentó a 100 °C. Se retiró del fuego y se agitó a temperatura ambiente durante la noche, la mezcla de reacción se filtró, se concentró y se disolvió en DCM y se inyectó en una columna ISCO de 4 g y se eluyó con 0-10 % de MeOH/DCM. Se recogieron las fracciones deseadas, se combinaron y se concentraron para producir 22 mg de producto impuro. Este material se disolvió en MeOH y se purificó en una columna C18 para producir 24 mg de aceite amarillo. Este material se disolvió en DCM y se pasó a través de un cartucho de carbonato Stratospheres para producir una solución transparente que se concentró al vacío y se secó durante la noche a alto vacío para producir 2-metoxi-N-[4-(4-metoxi-7-morfolino-quinazolina)-5-il)oxiciclohexil]acetamida (14 mg, rendimiento del 43,8 %). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ó 8,48 (s, 1H), 7,54 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,04 (s, 3H), 3,79 (s, 2H), 3,75 (m, 5H), 3,35 (m, 4H), 3,30 (s, 3H), 2,01 (m, 2H), 1,84 - 1,53 (m, 6H).
Preparación del Compuesto 44: 2-[[4-[4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-il]oxiciclohexil]amino]-N-metilpirim idina-4-carboxamida
Preparación de 2-[(4-hidroxiciclohexil)amino]-N-metil-pirimidina-4-carboxamida: Compuesto (44-A)
[0584]
[0585]A una mezcla de 2-cloro-N-metil-pirimidin-4-carboxamida (4,5 g, 26,23 mmol), 4-aminociclohexan-1-ol (3 g, 26,05 mmol) en iPrOH (25,00 mL) se le añadió DIEA (6 mL, 34,45 mmol) y refluir durante la noche, luego se concentró para producir 4,2 g (96 %) de 2-[(4-hidroxiciclohexil)amino]-N-metil-pirimidina-4-carboxamida. RMN 1H (300 MHz, CDCb) 58,48 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 7,34 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 3,80 (dtt, J = 39,2, 9,9, 3,8 Hz, 2H), 3,51 (s, 1H), 3,03 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,29-02,00 (m, 4H), 1,65-1,22 (m, 4H).
Preparación de 4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-ol: Compuesto (44-B)
[0586]
[0587]Una solución de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-N,N-dimetil-7-morfolino-quinazolin-4-amina (370 mg, 0,8911 mmol) en DCM (4,456 mL) y TFA (5 ml, 64,90 mmol) se agitó a 50 °C durante 3 h. Después la reacción se concentró hasta sequedad, se trató con bicarbonato de sodio acuoso saturado y se extrajo 3 x EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se concentraron hasta sequedad, se disolvieron en una cantidad mínima de EtOAc y se vertieron en heptano. El precipitado color canela resultante se filtró y se secó para dar 4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-ol como un sólido color canela (240 mg, 0,8749 mmol, 98,20 %) que se usó sin purificación adicional. ESI-MS m/z cálculo. 274,14297, encontrado 275,0 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,55 minutos.
Preparación de metanosulfonato de [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-il]amino]ciclohexil]: Compuesto (44-C)
[0588]
[0589]A una solución de 2-[(4-hidroxiciclohexil)amino]-N-metil-pirimidin-4-carboxamida (4,3 g, 17,18 mmol) en DCM (50 mL) se le añadió DIEA (15 mL, 86,12 mmol) y MsCl (2,8 mL, 36,18 mmol). La solución se agitó durante 3 h, luego se concentró y se purificó en un cartucho de gel de sílice de 80 g con EtOAc al 0-100 %/hex para proporcionar metanosulfonato de [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-il]amino]ciclohexil] (5,2 g, 15,83 mmol, 92,17 %). Rm N 1H (300 MHz, CDCb) 58,49 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,36 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,15 (s, 1H), 4,73 (tt, J = 10,3, 3,8 Hz, 1H), 3,92 (dtd, J = 10,7, 7,5, 3,7 Hz, 1H), 3,11 -2,98 (m, 6H), 2,23 (dq, J = 12,7, 3,1, 2,5 Hz, 4H), 1,92 - 1,63 (m, 4H).
Preparación de 2-[[4-[4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-il]oxiciclohexil]amino]-N-metil-pirimidin-4-carboxamida: Compuesto (44)
[0590]
[0591]4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-ol (75 mg, 0,2734 mmol), metanosulfonato de [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-il]amino]ciclohexil] (125,7 mg, 0,3828 mmol) y carbonato de cesio (267,2 mg, 0,8202 mmol) en DMF (1,367 mL) se agitaron durante la noche en un tubo sellado a 100 °C. Se agregaron otros 0,7 eq. de mesilato y se agitó a 100 °C durante 3 h adicionales. Después la reacción se diluyó con agua y se extrajo 3 x EtOAc. Los compuestos orgánicos combinados se concentraron hasta sequedad y se purificaron mediante cromatografía flash eluyendo con 0 20 % de MeOH en DCM. Las fracciones puras se combinaron, se concentraron y se liofilizaron para producir 2-[[4-[4-(dimetilamino)-7-morfolino-quinazolin-5-il]oxiciclohexil]amino]-N-metilpirimidina-4-carboxamida (19,7 mg, 0,03694 mmol, 13,51 %). RMN 1H (300 MHz, CDCla) ó 8,49 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,76 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,34 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,78 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,13 (s, 1H), 4,55 (s, 1H), 4,06 - 3,78 (m, 5H), 3,31 (dd, J = 14,5, 9,7 Hz, 4H), 3,15 (s, 6H), 3,02 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,12 -2,00 (m, 2H), 1,81 (dd, J = 30,2, 11,2 Hz, 6H). ESI-MS m/z cálculo.
506,2754, encontrado 507,0 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,64 minutos.
Preparación del Compuesto 51: 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona
[0592]
[0593]A una mezcla de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3H-quinazolin-4-ona (1,38 g, 3,821 mmol), t-butóxido (ion sodio (1)) (1,11 g, 11,55 mmol), Pd(oAc)<2>(43 mg, 0,1915 mmol) y RuPhos (176 mg, 0,3772 mmol) se le añadió una solución de morfolina (467 ml, 5,355 mmol) en 1,4-dioxano (16,8 mL) (se añadieron 14 mL primero), luego otros 2,8 mL porque la mezcla no se removió bien). La mezcla resultante se calentó a 100°C durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se repartió entre DCM y NH4Cl acuoso saturado. Las capas se separaron y el agua y los sólidos flotantes se lavaron con DCM. Se combinaron las capas orgánicas y se filtró la capa acuosa. Todas las capas orgánicas se combinaron y se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron para producir 1,3 g de producto. Este material se disolvió en DCM y MeOH y se purificó mediante cromatografía en columna flash (columna de 40 gramos equilibrada con DCM, eluida con MeOH/DCM al 0-10 % durante 20 minutos) para producir 240 mg de sólido blanco. El material sólido de los filtros y las capas acuosas se disolvieron en MeOH/DCM, se combinaron y se concentraron, se redisolvieron en una mezcla de DCM/MeOH y se añadieron 14 g de celite. Esta mezcla se concentró hasta casi sequedad, se cargó en seco en una columna ISCO de 40 g y se eluyó como anteriormente para producir el producto en forma de un sólido blanco (370 mg). Las primeras fracciones de esta columna se concentraron hasta producir producto adicional (480 mg) como un sólido blanquecino. Los materiales puros se combinaron para producir 1,1 gramos de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) ó 11,45 (s, 1H), 7,83 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 7,57 - 7,45 (m, 2H), 6,99 - 6,87 (m, 2H), 6,60 (dd, J = 39,0, 2,3 Hz, 2H), 5,13 (s, 2H), 3,75 (m, 7H), 3,31 (m, 4H).
Preparación del Compuesto 52 :4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina
[0594]
[0595]A una solución de 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (8,0 g, 20,73 mmol) en CH<2>CI<2>(470 mL) se le añadió NaCl (360 mL). La mezcla bifásica resultante se calentó a reflujo (baño de perlas de aluminio a 55 °C) y se añadieron NH<4>OH (100 ml de 30 % p/v, 856,0 mmol) y zinc (45,0 g, 688,0 mmol). El calentamiento se continuó durante 2,5 h. La mezcla se filtró a través de celite y la almohadilla del filtro se lavó con CH<2>Cl<2>y H<2>O. El filtrado se separó en capas acuosa y orgánica. La fase acuosa se extrajo adicionalmente con CH<2>Cl<2>(2x), se lavó con salmuera, se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró. El residuo bruto se cargó en seco sobre Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna Isco de 220 g, gradiente lineal 0%^ 10 % MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar 4-[5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (3,96 g, 10,14 mmol, 48,92 %), ~90-95 % pura. RMN 1H (400 MHz, CDCb) 5 9,42 (s, 1H), 9,09 (s, 1H), 7,41 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,01 - 6,92 (m, 2H), 6,79 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 3,95 - 3,86 (m, 4H), 3,84 (s, 3H), 3,44 - 3,31 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 351,1583, encontrado 352,39 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,63 minutos.
Preparación de 4-[4-metoxi-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina: Compuesto 53
[0596]
[0597]4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (450 mg, 1,166 mmol), metanol (0,236 mL, 5,826 mmol), K<2>CO<3>(322 mg, 2,330 mmol), y DMF (5,0 mL) se combinaron en un recipiente para microondas y se calentaron en el microondas a 150 °C durante 30 minutos, lo que dio como resultado una conversión parcial según lo considerado por LCMS. Calentar nuevamente en el microondas a 175 °C durante 1 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una frita de vidrio y el disolvente se evaporó. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 12 g, gradiente lineal 0 % ^ 10 % MeOH/CH<2>Cl<2>) para proporcionar 4-[4-metoxi-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7- il]morfolina (206 mg, 0,5347 mmol, 45,86 %). Rm N 1H (300 MHz, cloroformo-d) 58,61 (s, 1H), 7,55 - 7,43 (m, 2H), 7,04 - 6,93 (m, 2H), 6,84 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 4,13 (s, 3H), 3,95 - 3,88 (m, 4H), 3,86 (s, 3H), 3,42 - 3,30 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 381,16885, encontrado 382,32 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,65 minutos.
Preparación del Compuesto 54 :4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina
[0598]
[0599]A una suspensión de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona (Compuesto (51): 18,60 g, 47,08 mmol) en tolueno (250 mL) se le añadió W,W-diisopropiletilamina (41,00 ml, 235,4 mmol) seguida de POCE (17,55 ml, 188,3 mmol). La reacción se calentó a 80°C durante 3 horas. La reacción se diluyó con CH<2>Cl<2>y se vertió en NaHCO3 acuoso saturado. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con CH<2>Cl<2>. La capa orgánica combinada se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró hasta dar un sólido amorfo de color naranja. El residuo bruto se cargó en seco sobre Celite y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 40 g, gradiente lineal 0%^ 15 % MeOH/CH<2>Ch) para proporcionar 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenilo) metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (11,977 g, 31,04 mmol, 65,92 %). RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d) ó 8,71 (s, 1H), 7,51 - 7,40 (m, 2H), 7,01 - 6,89 (m, 2H), 6,84 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 3,93 - 3,85 (m, 4H), 3,83 (s, 3H), 3,43 - 3,34 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 385,11932, encontrado 386,32 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,77 minutos.
Preparación del Compuesto 55: 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-quinazolin-4-carbonitrilo
[0600]
[0601]Una mezcla de 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (400 mg, 1,037 mmol), KCN (204 mg, 3,133 mmol), p-toluenosulfonato de sodio (132 mg, 0,6798 mmol), y se selló DMF (7,2 mL) y se calentó a 80 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se repartió entre H<2>O y CH<2>Cl<2>. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo adicionalmente con CH<2>Cl<2>(2 x 20 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron dos veces con agua y una vez con salmuera, se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (columna de oro Isco de 12 g, gradiente lineal 0 % ^ 10 % MeOH/CH<2>Cl<2>) para proporcionar 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolinoquinazolina-4-carbonitrilo (263,5 mg, 0,7000 mmol, 67,51 %). Secado bajo calor/vacío para eliminar DMF residual. RMN 1H (300 MHz, cloroformo-d)ó9,08 (s, 1H), 7,53 - 7,43 (m, 2H), 6,98 - 6,91 (m, 2H), 6,81 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,29 (s, 2H), 3,95 - 3,85 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 3,48 - 3,36 (m, 4H). ESI-MS m/z cálculo. 376,15353, encontrado 377,32 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,81 minutos.
Preparación del Compuesto 56 :4-[4-ciclopropil-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina
[0602]
Preparación del compuesto (56-B)
[0603]Se calentó una solución de 7-fluoro-5-[(4-metoxifen¡l)metox¡]-3H-qu¡nazol¡n-4-ona (5,63 g, 18,8 mmol) y morfolina (33 ml, 380 mmol) en NMP anhidra (60 mL) a 120 °C durante la noche. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua. El precipitado se filtró y se secó al vacío a 55 °C para producir 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona (3,26 g, rendimiento del 47,3 %). RMN 1H (300 MHz, DMSO) ó 11,46 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,51 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,95 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,60 (dd, J = 29,8, 2,1 Hz, 2H), 5,14 (s, 2H), 3,90 - 3,58 (m, 7H), 3,31 (s, 4H).
Preparación del compuesto (56-C)
[0604]A una suspensión de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-7-morfolino-3H-quinazolin-4-ona (2,0 g, 5,4 mmol) en tolueno (25 mL) se le añadió DIPEA (5,69 mL, 32,7 mmol) seguido por POCb (2,54 mL, 27,3 mmol). La reacción se calentó a 80 °C durante 3,5 horas. La reacción se enfrió hasta temperatura ambiente, se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc/DCM. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía flash usando EtOAc y heptanos para producir 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (1,46 g, rendimiento del 69,5 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 8,73 (s, iH), 7,52 - 7,41 (m, 2H), 7,04 - 6,91 (m, 2H), 6,87 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,19 (s, 2H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,86 (s, 3H), 3,48 - 3,35 (m, 4H).
Preparación del compuesto (56)
[0605]A una mezcla de 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (200 mg, 0,520 mmol) y Fe(acac)3 (55 mg, 0,16 mmol) en THF (5 mL) y NMP (0,25 mL) en atmósfera de nitrógeno se añadió gota a gota bromuro de (ciclopropil)magnesio (1,20 mL de 0,5 M, 0,6000 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se consideró incompleta y se añadió gota a gota 1 mL de bromuro de (ciclopropil)magnesio y se continuó agitando a temperatura ambiente durante 5,5 horas. La reacción se vertió en un embudo de decantación que contenía NH4Cl helado y se extrajo con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía flash usando EtOAc y heptanos para producir 4-[4-ciclopropil-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (176 mg, rendimiento del 84,8 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb) ó 8,79 (s, 1H), 7,48 - 7,35 (m, 2H), 7,00 - 6,88 (m, 2H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,93 - 3,85 (m, 4H), 3,84 (s, 3H), 3,48 - 3,28 (m, 5H), 1,35 - 1,22 (m, 2H), 0,99 - 0,86 (m, 2H). ESI-MSm/zcalc.
391,1896, encontrado 392,25 (M+1)+.
Preparación del Compuesto 57: 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-N-metil-7-morfolino-quinazolin-4-amina
[0606]
[0607]A una solución de 4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (500 mg, 1,296 mmol) en 1,4-dioxano (6,480 mL) se le añadió metilamina (3,240 mL de 2 M, 6,480 mmol) en THF. La reacción se calentó durante 15 minutos a 60°C. La reacción se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc (3x). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se concentraron hasta sequedad, se disolvieron en una cantidad mínima de EtOAc y se vertieron en heptanos fríos mientras se agitaba vigorosamente. El ppt de color naranja claro resultante se filtró y se secó durante la noche al vacío a 50 °C para obtener 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-N-metil-7-morfolino-quinazolin-4-amina (378 mg, 0,9638 mmol, 74,36 %). RMN 1H (300 MHz, DMSO) ó 8,22 (s, 1H), 7,88 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 7,48 (dd, J = 9,1, 2,4 Hz, 2H), 7,02 -6,93 (m, 2H), 6,74 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,51 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,33 (s, 2H), 3,77 - 3,71 (m, 7H), 3,28 - 3,18 (m, 4H), 2,92 (d, J = 4,7 Hz, 3H). ESI-MS m/z cálculo. 380,18484, encontrado 381,0 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,73 minutos.
Preparación del Compuesto 58: 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-N,N-dimetil-7-morfolino-quinazolin-4-amina
[0608]
[0609]4-[4-cloro-5-[(4-metoxifenil)metoxi]quinazolin-7-il]morfolina (500 mg, 1,296 mmol), dimetilamina (ácido clorhídrico (1)) (528,4 mg, 563,3 pL, 6,480 mmol) y trietilamina (1,311 g, 1,806 mL, 12,96 mmol) en 1,4-dioxano (6,480 mL) se agitaron a 60 °C durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo 3 x EtOAc. Los compuestos orgánicos combinados se concentraron hasta sequedad, se disolvieron en una cantidad mínima de EtOAc y se vertieron en heptano frío mientras se agitaba vigorosamente. El tan ppt resultante se filtró y se secó durante la noche al vacío a 50 grados C para dar 384 mg (71,4 %) de 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-N,N-dimetil-7-morfolino-quinazolin-4-amina que se llevó a cabo tal cual la siguiente reacción. 5-[(4-metoxifenil)metoxi]-N,N-dimetil-7-morfolino-quinazolin-4-amina (384 mg, 0,9248 mmol, 71,36 %) RMN 1H (300 MHz, DMSO)ó8,21 (s, 1H), 7,42 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 7,05 - 6,94 (m, 2H), 6,79 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,79 - 3,73 (m, 7H), 3,35 - 3,31 (m, 4H), 2,91 (s, 6H). ESI-MS m/z cálculo. 394,2005, encontrado 395,0 (M+1)+; Tiempo de retención: 0,74 minutos.
Preparación de 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3H-quinazolin-4-ona: Compuesto 59
[0610]
[0611]A una solución de (4-metoxifenil)metanol (31,1 g, 225,1 mmol) en DMF (279,9 mL) se le añadió NaH (9,31 g, 232,8 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se añadió 7-bromo-5-fluoro-3H-quinazolin-4-ona (27,33 g, 112,5 mmol) y se continuó la agitación durante 2 h más. Se inactivó añadiendo agua (600 mL), después se añadió AcOH para efectuar la precipitación de un sólido. El sólido se recogió mediante filtración al vacío, se lavó con agua y luego con Et<2>O. El sólido se secó a alto vacío durante la noche hasta obtener 7-bromo-5-[(4-metoxifenil)metoxi]-3H-quinazolin-4-ona (34,32 g, 80,2 %). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ó 12,07 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,55 - 7,42 (m, 2H), 7,37 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,28 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,03 - 6,90 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 3,76 (s, 3H).
Ejemplo 2: Ensayo biológico de compuestos de la invención
A. Ensayo de inhibición de ADN-PK
[0612]Se analizó la capacidad de los compuestos para inhibir la ADN-PK quinasa utilizando un ensayo radiométrico estándar. Brevemente, en este ensayo de quinasa se interroga la transferencia del 33P-fosfato terminal en 33P-ATP a un sustrato peptídico. El ensayo se llevó a cabo en placas de 384 pocilios hasta un volumen final de 50 pL por pocilio que contenía aproximadamente ADN-PK 6 nM, HEPES 50 mM (pH 7,5), MgCh 10 mM, NaCl 25 mM, BSA al 0,01 %, Dt T 1 mM., 10 pg/mL de ADN bicatenario cortado (obtenido de Sigma), 0,8 mg/mL de péptido ADN-PK (Glu-Pro-Pro-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-Phe-Ala-Asp-Leu-Trp-Lys-Lys-Lys, obtenido del American Peptide), y ATP 100 pM. Por consiguiente, los compuestos de la invención se disolvieron en DMSO para preparar soluciones madre iniciales 10 mM. A continuación, se realizaron diluciones seriadas en DMSO para obtener las soluciones finales para el ensayo. Se añadió a cada pocillo una alícuota de 0,75 pL de DMSO o inhibidor en DMSO, seguido de la adición de una solución de sustrato de ATP que contenía 33P-ATP (obtenida de Perkin Elmer). La reacción se inició mediante la adición de ADN-PK, péptido y ADN-ds. Después de 45 min, la reacción se detuvo con 25 ml de ácido fosfórico al 5 %. La mezcla de reacción se transfirió a placas PH de 384 pocillos Multi Screen HTS (obtenidas de Millipore), se dejó que se uniera durante una hora y se lavó tres veces con ácido fosfórico al 1 %. Tras la adición de 50 pL de centelleador de alta eficacia Ultima Gold™ (obtenido de Perkin Elmer), las muestras se contaron en un contador de luminiscencia y centelleo de microplacas Packard TopCount NXT (Packard BioScience). Los valores de Ki se calcularon utilizando macros Solver de Microsoft Excel para ajustar los datos al modelo cinético para una inhibición competitiva de unión estrecha. En las Tablas 1 y 2 siguientes, una Ki inferior a 0,001 micromolar para la inhibición de ADN-PK se indica como "A"; Ki igual o superior a 0,001 micromolar y inferior a 0,01 micromolar para la inhibición de ADN-PK como "B"; Ki igual o superior a 0,01 micromolar y inferior a 0,1 micromolar para la inhibición de ADN-PK como "C"; Ki igual o superior a 0,1 micromolar y inferior a 1 micromolar para la inhibición de ADN-PK para "D"; y Ki igual o mayor que 1 micromolar como "E".
B. Ensayo celular ADN-PK
[0613]La ADN-PK es reclutada y activada por roturas de doble hebra (DSB) en el ADN y desempeña un papel fundamental en el mecanismo de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ). Tras la activación, ADN-PK sufre una rápida autofosforilación en Ser2056. La medida de pDNA-PK (Ser2056) en respuesta a los DSB de ADN proporciona un ensayo de señalización celular para evalúan posibles inhibidores de la quinasa ADN-PK.
[0614]Se utilizó neocarzinostatina (NCS) como radiomimético para inducir DSB de ADN. El ELISA tipo sándwich utilizó la plataforma tecnológica de electroquimioluminiscencia Meso Scale Discovery, que normalmente proporciona una mayor sensibilidad que los formatos ELISA tradicionales. La validación interna ha demostrado que este ensayo permite una medición altamente específica y cuantitativa de pADN-PK (Ser2056).
[0615]Se sembraron células A549 (CPCNP humano) a 25.000 células/pocillo en 100 uL de DMEM (Invitrogen cat# 11995-040) suplementado con 1 % de Pen/Strep (Invitrogen cat# 15070-063) y 10 % de FBS (Hyclone cat# SH30071).
03HI) en placas de 96 pocillos de fondo negro transparente (Costar #3904) y se dejó adherir durante la noche a 37 °C en CO<2>al 5 %. Al día siguiente, los compuestos y las soluciones NCS se preparan añadiendo 100 ul de medio de crecimiento DMEM por pocillo en una placa de pocillos profundos con fondo en V de polipropileno Corning (n.° de catálogo 3357). Se usó el instrumento HP Compound Dilution D300 para agregar compuestos a los pocillos apropiados usando el ajuste logarítmico y el singlete de titulación de 16 puntos.
[0616]La solución DMEM NCS se preparó añadiendo NCS a medio DMEM a 200 ng/ml (concentración de ensayo final, 50 ng/ml). Se añaden 100 ul de la solución DMEM/NCS a los pocillos con los compuestos. A continuación, se añaden inmediatamente 100 ul de esta solución a las células A549. A continuación, las células se incuban durante 15 minutos a 37 °C.
[0617]El tampón de lisis completo se prepara añadiendo un 1 % de inhibidor de fosfatasa (Sigma cat# P2850) y un 1 % de inhibidor de proteasa (Sigma cat# P8340) al tampón de lisis del ensayo celular Lanthascreen (Invitrogen cat# PV5598). El medio de la placa se retiró sacudiendo y secando con palmaditas. Se añaden a cada pocillo 60 uL/pocillo del tampón de lisis completo. A continuación, estas placas se incuban durante al menos 5 minutos en el tampón de lisis a temperatura ambiente para asegurar una lisis completa. En este punto, los lisados se pueden transferir a placas ELISA preparadas.
[0618]Las placas ELISA preparadas se prepararon bloqueando las placas Mesoscale Goat-Anti-Mouse (GAM) con 150 uL/pocillo de Bloqueador A al 3 % (Mesoscale cat # R93-BA) durante una hora a temperatura ambiente con agitación. El anticuerpo de captura se prepara diluyendo el ADN-PK anti-total monoclonal de ratón (AbCAM cat# ab 1832) a 3 pg/ml en bloqueador A al 1 %. Las placas bloqueadas se enjuagaron una vez con 200 pl de D-PBS. Se añadió el anticuerpo de captura (25 ul/pocillo) a cada pocillo y se dejó incubar durante una hora a temperatura ambiente mientras se agitaba. Esto se enjuagó una vez con 200 ul de D-PBS antes de añadir 25 ul del lisado celular preparado de las placas celulares a la placa ELISA GAM de mesoescala. A continuación, se incuba el lisado en las placas durante una hora a temperatura ambiente con agitación. El anticuerpo de detección (antipS2056-ADN-PK de conejo de Epitomics) se prepara en una dilución 1/1000 (hasta una concentración final de 450 ng/mL) en Bloqueador A al 1 %. Las placas GAM se lavan una vez con 200 pL de D-PBS y luego Se añaden a la placa 25 ul/pocillo del anticuerpo de detección. Este se incuba durante una hora a temperatura ambiente con agitación. El Sulfotag se prepara añadiendo anticuerpo Sulfo-Tag Goat-AntiRabbit (Mesoscale cat# R32AB-1) en una dilución 1/500 (1 ug/ml) al 1 % de Bloqueador A. Las placas GAM se lavan con 200 uL de D-PBS y luego se añaden 25 ul de la preparación de Sulfotag a cada pocillo. Una vez incubadas las placas con la solución final, el Sulfotag, durante 1 hora, se lavan una vez con 200uL de D-PBS. El tampón de lectura 1X (n.° de catálogo de mesoescala R32-TC) se elabora diluyendo el tampón 4X en ddH20. Se añaden 150 pL de tampón 1X a cada pocillo de la placa GAM y luego se lee la placa en el Sector Imager 2400. La lectura (electroquimioluminiscencia) se representó frente a la concentración de cada compuesto y las CI50 se generaron utilizando el software Prism (versión GraphPad Prism). 6.0e para Macintosh).
[0619]En las Tablas 1 y 2 siguientes, una CI<50>inferior a 0,10 micromolar para la inhibición de ADN-PK se indica como "A"; CI<50>igual o superior a 0,10 micromolar y inferior a 1,0 micromolar para la inhibición de ADN-PK como "B"; y CI<50>igual o superior a 1,0 micromolar para la inhibición de ADN-PK como "C".
Tabla 1:Datos de caracterización y valores de Ki eCI<50>para ciertos compuestos de la invención
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T l 2:D r riz i n v l r Ki I r i r m l inv n i n
Continuación
Continuación
EJEMPLOS DE EDICION DE GEN
[0620]Los siguientes ejemplos, incluidos los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes de la presente divulgación.
EJEMPLO 3: Materiales y Métodos
[0621]Ensayo de indicador de semáforo (TLR): la línea celular estable HEK293-EGIP (proteína inhibida por fluorescencia verde mejorada) se adquirió de System Biosciences (SBI). La línea celular HEK293-EGIP alberga una secuencia codificante de GFP alterada con un codón de parada y un fragmento genómico de 53 pb del locus AAVS1. Las células se mantuvieron en DMEM (Life Technologies, cat. n° 10313-039) con alto contenido de glucosa (Life Technologies, cat. n° 10313-039) suplementado con FBS al 10 % inactivado por calor (suero fetal bovino, Expression Systems Inc.), Glutamax y Penicilina+ Estreptomicina y cultivados a 37 °C y 5 % CO<2>.
[0622]Transfección celular y tratamiento con inhibidor de NHEJ: las células estables HEK293-EGIP se transfectarán con el vector de plásmido dual dos en uno ARNg/CRISPR-Cas9, donante de reparación de plásmido (ambos plásmidos de System Biosciences). La transfección se realizará mediante el sistema nucleofector Amaxa (Lonza) siguiendo el protocolo del fabricante. Después de 16 horas, las células se tratarán con los compuestos representados por la fórmula(I)en diversas concentraciones, incluidas 1 |<j>M, 2,5 |<j>M, 5 |<j>M y 10 |<j>M de compuesto. La estructura de Scr7 se muestra a continuación:
y puede usarse como control. Los medios se cambiarán después de una incubación adicional de 24 horas. El análisis FACS se realizará 5 días después de la transfección; a continuación, se recolectarán células para el aislamiento del ADN genómico y el genotipado por PCR.
[0623]Clasificación celular y citometría de flujo: para el análisis de citometría de flujo, las células HEK293 se tripsinizarán y se resuspenderán en PBS/tampón FACS BSA al 1 % y se analizarán con un citómetro de flujo Fortessa (Becton Dickinson). Una parte de las células se centrifugará y se utilizará para el aislamiento de ADN genómico.
[0624]Ensayo de viabilidad celular tras el tratamiento con compuestos: para evaluar la toxicidad potencial del tratamiento con inhibidor de NHEJ, la viabilidad celular se evaluará después de la exposición a diferentes concentraciones de compuestos. La viabilidad celular de HEK293-EGIP se determinará mediante el kit CellTiter Glo (Promega). Las células transfectadas con el donante de plásmido se cultivarán en presencia del compuesto (1 uM, 2,5 uM, 5 uM y 10 uM) durante 24, 48 o 72 h y se someterán al ensayo CellTiter Glo. Cada experimento se repetirá tres veces independientes por triplicado. Para mantener células sanas capaces de entrar en S/<g>2, que es necesario para HDR, las células se tratarán con el compuesto a una concentración de 2,5 jiM.
[0625]Aislamiento de ADN genómico, genotipado por PCR y cuantificación en gel: pares de cebadores de PCR especialmente diseñados proporcionarán otro medio para evaluar la edición del genoma mediada por HDR para obtener células positivas para eGFP funcionales. El par de cebadores de PCR de genotipado se muestra a continuación, correspondiente a las SEQ ID NO: 6 y 7. Un producto de PCR de 219 pb corresponde a células no modificadas y un nucleótido de 163 pb corresponde a la modificación mediante HDR. La intensidad de estas bandas en un gel >2,5 % permite la estimación de HDR mediante densitometría utilizando un Bio-Imager. La técnica permite la clasificación relativa de la mejora de HDR mediante inhibidores. Las intensidades medidas para cada carril se normalizarán calculando las proporciones de bandas de PCR correspondientes a las "inserciones" divididas por el "total" (insertadas y sin modificar). El cambio de veces se calculará comparando la proporción de inserciones con compuesto con respecto a las que no tienen compuesto.
EJEMPLO 4: Ensayo para monitorear la eficiencia de HDR
[0626]Se realizarán ensayos para determinar la eficiencia de HDR en células HEK293-EGIP. Para este fin, se utilizará una construcción bicistrónica que se dirija al locus AAVS 1 humano (FIG. 1A). El sistema de vector bicistrónico coexpresa Cas9 con codón humano optimizado impulsado por el promotor EF1, así como un ARN guía personalizado (ARNg) que consiste en una transcripción de ARNcr-ARNtracr quimérico impulsado por el promotor H1. El hspCas9 contiene dos señales de localización nuclear (NLS) en el extremo N-terminal y C-terminal para garantizar la importación eficiente de la proteína hspCas9 al núcleo. El marco de lectura abierto (ORF) de hspCas9 va seguido de un elemento regulador llamado WPRE (elemento regulador postranscripcional del virus Woodchuck) para estimular la expresión génica y estabilizar la transcripción del ARNm.
[0627]La línea celular humana diseñada, EGIP HEK293, se utilizará para monitorear la eficiencia de HDR utilizando el contrato bicistrónico descrito anteriormente y en la Fig. 1A. La línea celular informadora EGIP HEK293 se adquirió de SBI. La línea celular HEK293-EGIP alberga una secuencia codificante de GFP alterada con un codón de parada y un fragmento genómico de 53 pb del locus AAVS1. La línea estable se generó mediante infección lentiviral de células 293T con un promotor EF1alfa para impulsar la expresión de eGFP seguida de selección con puromicina. La secuencia de eGFP se modificó para insertar un inserto de 56 nucleótidos (mayúscula) del sitio de puerto seguro de AAVS1 humano. Esta secuencia contiene un codón de parada (TAA en rojo) después del aminoácido T109 en la secuencia traducida de eGFP. Las secuencias guía a las que se dirige están en negrita. Tras la transfección con la guía y el donante, se cortó el sitio AAVS1 dentro de la eGFP rota y la construcción del donante proporcionó una secuencia homóloga para reparar la eGFP, eliminando el codón de parada y el inserto de AAVS1. Usando este sistema, las células editadas que se someten a reparación de donantes HDR generarán células positivas para GFP. En consecuencia, la cotransfección de Cas9, ARNg dirigido a AAVS1 y un donante de rescate de AAVS1/EGFP restauró la secuencia mediante HDR para dar células GFP+.
[0628]La población de células positivas para GFP será directamente proporcional a la eficiencia de la reparación dirigida por homología.
[0629]Para estos ensayos, se introducirán vectores plantilla de donante Cas9-ARNgss y eGFP dos en uno en las células HEK293 EGIP mediante electroporación utilizando el nucleofector Amaxa (Lonza) para impulsar la síntesis de Cas9-ARNgs y la plantilla del donante eGFP. Los compuestos se agregarán 16 h después de la transfección seguido del cambio de medio 48 horas después. A continuación, se permitirá que las células se propaguen durante 72 horas adicionales antes del análisis FACS.
[0630]La secuencia plantilla del donante HDR contenía un brazo de homología 5' de 266 nucleótidos (en negrita, negro y subrayado) y un brazo de homología 3' de 378 nucleótidos (en cursiva y subrayado) (ver SEQ ID NO: 1 a continuación). Tras la transfección con el ARN guía y la plantilla del donante, se cortará el sitio AAVS1 dentro de la eGFP rota y la construcción del donante proporcionará una secuencia homóloga para reparar la eGFP, eliminando el codón de parada y el inserto de AAVS1.
[0631]La secuencia de plantilla HDR que se utilizará en el ensayo del indicador de semáforo se muestra a continuación (SEQ ID NO: 1):
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACA GCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGG CGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATA TGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCA TTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCT GGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC GACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTAGTGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGT CCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACC GGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTT CAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCT ACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGrG AAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGA CGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGG CCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCT GCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG ATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGTCGAC ACCGGTGATATCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATC CGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAA TGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCT GTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGC GCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTA TCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAA
CATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTT
TCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA
AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCC
TGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGC
TTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGC
TGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGA
GTCCAACCCGGTAAGACACGAGTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCA
GAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACT
AGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGG
TAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGC
AGATTACGCGCAGAAAAAAAG3ATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGAC
GCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTT
CACCTAGATCCTTTTGATCCCCGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTG
GTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTG
ATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGT
AATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCA
AATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTC
TGTAATGAAGGAGAAAAC TCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTC
TGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGT
TATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGC
ATTTCTTTCCAGACTT GT TCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAAT CACTCGCATC
AACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAA
AAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACA
ATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTTCCGGGGATCGC
AGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCA
TAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCT
TTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGC
ACCTGATTGCCCGACATTATC3CGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGG
AATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTA
TTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAAT
GTAACATCAGAGATTTTGAGACACAATTCATCGATGATGGTTGAGATGTGTATAAGAGACAG
ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAG
AAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGA
AACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
(SEQ ID NO: 1)
[0632] Los sitios de cebador utilizados para el ensayo descrito en el presente documento se muestran a continuación. Estos sitios de cebador están ubicados dentro de la secuencia del donante. La reacción de PCR en la plantilla genómica generará un producto de 700 nucleótidos y se espera que NHEJ produzca fragmentos de alrededor de 300 nucleótidos y 400 nucleótidos de longitud. Después del evento HDR, el producto de PCR esperado utilizando la plantilla del donante suministrado es de 644 nucleótidos. Los sitios de cebador utilizados para el ensayo incluyen las siguientes secuencias.
ARN Guía 1: GTCCCTCCCACCCCACAGTG (SEQ ID NO: 2)
ARN Guía 2: GGGGCCACTAGGGACAGGAT (SEQ ID NO: 3)
Cebador directo Surveyor: GCGACGTAAACGGCCACAAG (SEQ ID NO: 4)
Cebador inverso Surveyor: GTCCATGCCGAGAGTGATCC (SEQ ID NO: 5)
Cebador HDR 1: ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC (SEQ ID NO: 6)
Cebador HDR 2: ATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCG (SEQ ID NO: 7)
EJEMPLO 3: Evaluación de inhibidores de ADN-PK para aumentar la eficacia de HDR en la edición del genoma CRISPR
[0633] Las células HEK293-EGIP se nucleofectarán con las siguientes construcciones y se cultivarán como se describe: ARNg-Cas9 de expresión dual únicamente, ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de reparación del donante, ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla del donante y cultivo de las células con compuesto 2,5 mM. 1, y ARNg-Cas9 de expresión dual con plantilla de reparación del donante y cultivo de las células con 2,5 |<j>M del supuesto inhibidor de la ligasa IV Scr7. Las células se pondrán en contacto con compuestos de Fórmula (I) o con Scr7 durante 24 horas.
[0634] Se evaluará la cantidad de células HEK-EGIP editadas con genoma CRISPR en comparación con el ARNg-Cas9 y la condición de plantilla del donante. La adición de los compuestos de Fórmula (I) al medio de cultivo de células HEK293-EGIP nucleofectadas con ARNg-Cas9 y plantilla del donante se evaluará para determinar el aumento en la cantidad de células HEK-EGIP editadas con genoma CRISPR en comparación con el ARNg-Cas9 y el donante. condición de plantilla solamente.
[0635] En algunas formas de realización, el aumento en la mejora del proceso de reparación del ADN utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en presencia de una plantilla de reparación del donante se cuantificará mediante un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). Se realizará un análisis de citometría de flujo 10 días después de la transfección. Los experimentos de citometría de flujo se llevarán a cabo por triplicado.
[0636] En algunas formas de realización, se utilizará el ensayo robusto "Traffic Light Reporter" (TLR) (FIG. 1B) para cuantificar el aumento en la mejora del proceso de reparación del ADN mediado por HDR en el sistema CRISPR-Cas9. En el sistema TLR, la línea celular estable HEK293-EGIP que expresa la proteína fluorescente verde "rota" eGFP se basa en la reparación mediada por HDR para generar eGFP funcional en presencia de una plantilla de donante de ADN (véanse las Figuras 1B y 1C). Como se muestra en el flujo de trabajo experimental en la FIG. 1C, las células positivas para GFP funcionales aparecen a través de la vía HDR donde la inserción de 56 nt se reemplaza con la secuencia de ADN correcta. Cuarenta y ocho horas después de la transfección mediante electroporación, normalmente emergerán células positivas para GFP. El análisis de citometría de flujo se realizará por triplicado.
EJEMPLO 5: Comparación de inhibidores de NHEJ de moléculas pequeñas para aumentar la edición del genoma HDR
[0637] Se llevarán a cabo experimentos adicionales utilizando la línea celular HEK293-EGIP para determinar la eficiencia de HDR después del contacto con un inhibidor de ADN-PK para cualquiera de los compuestos descritos en este documento.
[0638] Para estos experimentos, las células HEK293-EGIP se nucleofectarán solo con una plantilla de donante o con una plantilla de donante y Cas9-ARNgs. Para probar la capacidad de los compuestos descritos en el presente documento para mejorar la edición HDR, a las células que se nucleofectarán con una plantilla del donante sola o con una plantilla del donante y Cas9-ARNgs se les administrará Scr7 o un inhibidor de ADN-PK descrito en el presente documento.
[0639] El estado de recombinación de HDR se determinará mediante la cuantificación y el genotipado de cebadores de PCR de "punto final" tradicionales basados en las intensidades de las bandas de agarosa. Los cebadores produjeron amplicones distintos: una banda de nucleótidos de 219 pb correspondía a células no modificadas y un producto de nucleótidos de 163 pb para el evento HDR. La intensidad de estas bandas en un gel >2,5 % permite la estimación de HDR mediante densitometría utilizando un Bio-Imager. La técnica permite la clasificación relativa de las condiciones para la mejora de HDR mediante inhibidores de NHEJ. A continuación, se muestran los pares de cebadores de PCR de genotipado para estos ensayos.
Cebador HDR 1 ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCC (SEQ ID NO: 6)
Cebador HDR 2 ATGTTGCCGTCCTCCTGAAGTCG (SEQ ID NO: 7)
[0640] La proteína Cas9 y los ARNgs se pueden administrar en forma de ARN sintéticos en lugar de los sistemas de vectores adquiridos en SBI. Además de aumentar la eficiencia de HDR, nuestros experimentos de edición interna del genoma indicaron una mayor viabilidad celular después de la transfección de la proteína ribonucleoproteína (RNP) en comparación con la transfección de ADN. Además, la sincronización celular de la fase S/G2 también puede estimular HDR (Lin S et al. Elife. 15 de diciembre de 2014; 3, 2014). Estas nuevas estrategias y la detección sólida de la edición del genoma, como la PCR de gotas digitales y la secuenciación de próxima generación, se utilizarán para optimizar la edición del genoma con fines terapéuticos y de investigación.
EJEMPLO 6: Evaluación de la administración de compuestos inhibidores de ADN-PK para una mayor edición de genes
[0641] Se realizarán ensayos para determinar la capacidad de un inhibidor de ADN-PK para permitir la edición de un gen objetivo. Para estos ensayos, se evaluará la edición del gen Serpin A1 de la forma M a Z. Para ello, se nucleofectarán células de carcinoma hepatocelular Huh7 con ARNg y proteína Cas9, con o sin una plantilla de reparación del donante en la que se introdujo un sitio KpnI. A continuación, las células nucleofectadas se cultivarán en presencia de DMSO o compuestos inhibidores de ADN-PK 2,5 pM descritos en el presente documento durante tres días, después de lo cual, el ADN genómico se amplificará y evaluará para determinar la introducción del sitio Kpn.
[0642] El ensayo funciona de la siguiente manera: cuando se edita el gen SerpinAl, la endonucleasa Kpn puede digerir el fragmento del gen, lo que da como resultado la aparición de una banda digerida en un gel solo cuando se edita el gen SerpinAl. Por el contrario, cuando SerpinAl no se edita, la endonucleasa Kpn no puede cortar el fragmento del gen y, por lo tanto, no aparecerá una nueva banda digerida en un gel.
[0643] Tal como se utilizan en este documento, todas las abreviaturas, símbolos y convenciones son consistentes con los utilizados en la literatura científica contemporánea. Véase, por ejemplo, Janet S. Dodd, ed., The ACS Style Guide: A Manual for Authors and Editors, 2.a ed., Washington, DC: American Chemical Society, 1997.

Claims (29)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto representado por la siguiente fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el Anillo A es un sistema de anillos aromático seleccionado de
    el Anillo B es un sistema de anillos seleccionado de
    donde el Anillo B está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>; el Anillo C es un grupo cicloalquilo C<4-6>, heteroarilo de 5-6 miembros o fenilo, en el que el Anillo C está opcionalmente además sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, alquilo C<1-2>, -OH y -Oalquilo C<1-2>; X es -NH-, -O-, -Oalquilo C<1-4>-, -S- o -CH<2>-; cada uno de R1 y R2 es, independientemente, hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -N<h>S(O)<2>R4, -NHR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7 en los que R1 y R2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno; cada R3 es independientemente hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -C(O)OH, -C(O)Oalquilo C<1-2>, -CN, -C(O)NHalquilo C<1-2>, -C(O)NH<2>, cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -OH y -Oalquilo C<1-2>; cada R4 es independientemente hidrógeno, alquilo C<3-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-10>, arilo de 6-10 miembros, heteroarilo de 5-10 miembros o heterociclilo de 4-10 miembros, en donde cada uno de dichos grupos R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<3-4>, CN, NO<2>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-6>, alquilo C<0-4>-Cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C<0-4>-C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>), CH<2>OR<5>, alquilo C0-4-C(O)R5, alquilo C0-4-C(O)N(R5)2, alquilo C0-4-<c>(<o>)OR5, alquilo C0-4-NHC(O)R5, alquilo C0-4-N(R5)2, heterociclilo de 5-6 miembros, -O(alquilo C1-4)OR5, -OR5 y oxo, y en el que cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<3-4>, -OH, -Oalquilo C<1-4>, -Salquilo C<1-4>, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>y -C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>; y cada R5 es independientemente hidrógeno, alquilo C<3-4>, fenilo, heteroarilo de 5-6 miembros o heterociclilo de 4-7 miembros, en donde cada R5 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN, -OH, -Oalquilo C<1-2>, heteroarilo de 5-6 miembros y heterociclilo de 4-7 miembros, o dos grupos R5 junto con el átomo de nitrógeno intermedio opcionalmente forman un anillo de morfolina., anillo de azetidina, anillo de pirrolidina, anillo de piperidina o anillo de piperazina; y R6 es hidrógeno o alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, -CH<2>OH, -CN, -OH y -Oalquilo C<1-2>; R7 es arilo de 6 a 10 miembros, heteroarilo de 5 a 10 miembros o heterociclilo de 4 a 7 miembros, cada uno de los cuales está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -Cl, alquilo C<1-2>, -CH<2>OH, -CN y -OR; y cada uno de R y R' independientemente es hidrógeno o alquilo C<3-4>, o R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman opcionalmente un anillo de morfolina, un anillo de azetidina, un anillo de pirrolidina, un anillo de piperidina o un anillo de piperazina.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que: (i) dicho grupo arilo para R4 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre fenilo o naftaleno; el grupo heteroarilo para R4 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol o benzoxazol; y dicho grupo heterociclilo para R4 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina, o isoindolina-1,3-diona; y/o (ii) dicho grupo heterocíclico para los sustituyentes R4 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina, pirrolidina, piperazina, furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol, oxadiazol o tetrazol; y/o (iii) dicho grupo heteroarilo para R5 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre imidazol, triazol, tiazol, piridina o pirimidina, y en el que dicho grupo heterociclilo para R5 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre oxetano, tetrahidrofurano o tetrahidropirano; y/o (iv) el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido o heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido; y/o (v) X es -O- o -NH; y/o (vi)
    está opcionalmente sustituido y seleccionado entre
    y/o (vii) cada R3 independientemente es hidrógeno, -alquilo C<1-4>, halógeno, -Oalquilo C<1-2>, -CN, -cicloalquilo C<3-4>o -NRR', en el que cada uno de dichos R3 alquilo y cicloalquilo independientemente están opcionalmente sustituidos.
  3. 3. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que (i) cada R4 independientemente es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<3-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, cicloalquilo C<3-5>o fenilo; o (ii) cada R4 independientemente es un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1 H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina o isoindolina-1,3-diona; o (iii) en el que cada R4 es independientemente un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre imidazol, pirazol, pirimidina, furopirimidina, oxetano o dihidrofuropirimidina.
  4. 4. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en el que cada R4 independientemente es hidrógeno o un grupo opcionalmente sustituido seleccionado entre alquilo C<1-4>,
    o un grupo anular seleccionado entre cicloalquilo C<3-5>, pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, ¡sotiazol, oxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol o fenilo, en los que X1 es N o CR4d; X2 es N o CR4c, donde X1 y X2 no pueden ser N simultáneamente; cada uno de R4a, R4b y R4c independientemente es hidrógeno, F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3>-<5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, alquilo C(O)OC1-4, alquilo C(O)OC0-4-cicloalquilo C<3-5>, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C<3>-<5>), un grupo heterocíclico seleccionado entre oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina o piperazina, o un grupo heteroarilo seleccionado entre furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol o tetrazol; o R4c y R4a, o R4c y R4b, junto con los átomos intermedios, forman opcionalmente un grupo anular heterocíclico dihidrofurano, dihidropirano o tetrahidropiperidina; R4d es independientemente hidrógeno, F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C2-4, C(O)Oalquilo C1-4, C(O)NH<2>, C(O)NHalquilo C1-4, o C(O)N(alquilo C1-4)2; en donde cada uno de los grupos del anillo R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en F, Cl, Br, CN, NO<2>, alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, alquilo C0-4-O-alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>, alquenilo C<2-4>, alquinilo C<2-4>, C(O)Oalquilo C<1-4>, C(O)Oalquilo C<0-4>-cicloalquilo C<3-5>, C(O)N<h 2>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2, C(O)NH(alquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>), un grupo heterocíclico seleccionado entre oxetano, azetidina, tetrahidrofurano, dihidropirano, tetrahidropirano, morfolina, piperidina o piperazina, y un grupo heteroarilo seleccionado entre furano, oxazol, oxadiazol, pirrol, pirazol, triazol o tetrazol; cada uno de dichos grupos heterocíclico y heteroarilo para R4a, R4b y R4c, y para los sustituyentes de R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, alquilo C<1-4>, -OH, -C(O)alquilo C<1-4>, -C(O)Oalquilo C<1-4>o -C(O)Oalquilo C0-4-cicloalquilo C<3-5>; y en donde cada uno de dichos alquilo y grupos cicloalquilo para R4a, R4b y R4c, y para los sustituyentes de R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F y -OH.
  5. 5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que cada R4 independientemente es alquilo C<1-4>o un grupo anular seleccionado entre cicloalquilo C<3-5>, pirazol, imidazol, oxetano,
    en el que dicho R4 alquilo C<1-4>está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -Br, -Cl, -F y -O(alquilo C<1-4>), y en el que cada uno de dichos grupos anulares R4 está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre el grupo que consiste en -Br, -Cl, -F, alquilo C<3-4>, -CN, -O(alquilo C<1-4>), cicloalquilo C<3-6>, alquilo C0-4-O-alquilo C<1-4>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2 y una piperazina, en donde cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales está opcional e independientemente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, alquilo C<3-4>, -OH y -Oalquilo C<1-4>, opcionalmente en donde dicho R4 alquilo C<1-4>está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F y -O(alquilo C<1-4>), y en donde cada uno de dichos grupos anulares R4 están opcional e independientemente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo C<3-4>, -O(alquilo C<1-4>), alquilo C<0>-4-O-alquilo C<1-4>, C(O)NHalquilo C<1-4>, C(O)N(alquilo C1-4)2 y una piperazina, en donde cada uno de dichos sustituyentes R4 opcionales está opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C<1-4>.
  6. 6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que: (i) cada uno de R1 y R2 es independientemente hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -alquilo C<0>-<4>NHR<4>, -OR4 o R7; y/o (ii) R7 está opcionalmente sustituido y seleccionado entre pirrol, imidazol, pirazol, triazol, tiazol, isotiazol, oxazol, piridina, furopiridina, pirimidina, pirimidinona, pirazina, piridazina, quinolona, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, tetrahidrofurano, oxetano, tetrahidropirano, dihidroisoxazol, pirimidina-2,4(1H,3H)-diona, dihidrofuropirimidina, dihidropiranopirimidina, dihidropirrolopirimidina, tetrahidropiridopirimidina, dihidropiridopirimidina, dihidrofuropiridina, dihidropiridopiridina, tetrahidropteridina o isoindolina-1,3-diona, opcionalmente donde R7 se selecciona de pirimidina, imidazol, pirazol, tiazol, furopirimidina, pirrolopirimidina, bencimidazol, benzotiazol, benzoxazol, oxetano, dihidrofuropirimidina o isoindolina-1,3-diona, además opcionalmente en donde R7 se selecciona de pirimidina, pirazol, furopirimidina, tiazol o isoindolina-1,3-diona.
  7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que: (i) X es -O-; y/o (ii) el Anillo C es cicloalquilo C<4-6>opcionalmente sustituido, opcionalmente en el que el Anillo C es ciclohexano opcionalmente sustituido; o (iii) el Anillo C es heteroarilo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido.
  8. 8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el compuesto está: (i) representado por la siguiente fórmula:
    o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R1 es -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; y R2 es hidrógeno; y/o (ii) representado por la siguiente fórmula:
    o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en la que cada R1 es independientemente -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -NHR4, -OR4 o R7, además opcionalmente -alquilo C<1-4>-NHR<4>, -n Hr 4 o -OR4, además opcionalmente -n Hr4 o -OR4; o (iii) representado por la siguiente fórmula:
    o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en la que cada R1 es independientemente -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -alquilo C<0-4>-NHR<4>, -OR4 o R7, además opcionalmente en donde R1 es -alquilo C<0-4 n>H<r>4 o -OR4, además opcionalmente en donde R1 es -NHR4 o -OR4.
  9. 9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que: (i) cada R3 es independientemente hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; y R6 es hidrógeno o metilo; o (ii)
    está opcionalmente sustituido.
  10. 10. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el Anillo C es fenilo opcionalmente sustituido.
  11. 11. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que: (i) X es -Oalquilo C<1-4>-, opcionalmente en el que el compuesto está representado por la siguiente fórmula:
    o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, -C(O)NHR4, -C(O)OR4, -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -alquilo C<0-4>NHR<4>, -OR4 o R7; y/o (ii)
    está opcionalmente sustituido
    y/o (iii) el compuesto está representado por la siguiente fórmula:
    o es una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en donde: R3 es hidrógeno, metilo, ciclopropilo, -F, -Cl, -Oalquilo C<1-2>, -NRR' o -CN, en donde cada uno de dichos R3 alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y -O(alquilo C<1>-2); cada R4 independientemente es alquilo C<1-4>opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en -F, -OH y -O(alquilo C<1-2>); R y R' son cada uno e independientemente hidrógeno o alquilo C<1-2>, además opcionalmente en donde: cada R3 independientemente es hidrógeno, metilo, -Cl, -OCH<3>, -CN, ciclopropilo, -NHCH<3>o -N(CH3)2; y R6 es hidrógeno o metilo.
  12. 12. El compuesto de la reivindicación 1 seleccionado entre: <i>
    ��� Continuación
    Continuación
    Continuación
    Continuación
    Continuación
    Continuación
    Continuación
    Continuación
    Continuación
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  13. 13. Un compuesto seleccionado entre:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  14. 14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para usar en un método para: (i) potenciar un régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer en un paciente que comprende el paso de administrar a dicho paciente una cantidad eficaz del compuesto o composición farmacéutica que comprende dicho compuesto; o (ii) tratar el cáncer o inhibir el crecimiento de células cancerosas en un paciente, en el que el método comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz del compuesto, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
  16. 16. Un método para: (i) preparar un compuesto representado por la Fórmula (I):
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: las variables de Fórmula (I) son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y en donde el método comprende: hacer reaccionar el Compuesto (X-1) con el Compuesto (Y-1) para formar un compuesto representado por la Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en donde: L1 del Compuesto (X-1) es un halógeno, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato, y las otras variables del Compuesto (X-1) son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y el compuesto (Y-1) es
    en el que Ra es -H o dos Ra, junto con el átomo de oxígeno al que están unidos, forman un anillo de dioxano opcionalmente sustituido con uno o más alquilo C<1>-<2>; o (ii) preparar un compuesto representado por la siguiente fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R1 es -NHC(O)R4, -NHC(O)OR4, -NHC(O)NHR4, -NHS(O)<2>R4, -NHR4 o -OR4; y las otras variables de Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y en el que el método comprende: hacer reaccionar el Compuesto (X-2) con el Compuesto (Y-2) para formar un compuesto representado por la Fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en el que Q1 del Compuesto (X-2) es -NH<2>o -OH, y las otras variables del Compuesto (X-2) son, cada una e independientemente, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y el compuesto (Y-2) es R4-C(O)-L2, R4-O-C(O)-L2, NHR4-C(O)-L2, R4S(O)<2>-L2, R4-L2, R4C(O)ORb, o R4-N=C=O, en el que cada R4 es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-43, L2 es un halógeno, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato, y Rb es alquilo C1-4; o (iii) preparar un compuesto representado por la siguiente fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que X es -NH- o -O-, y las otras variables de Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describen en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y en el que el método comprende: (a) hacer reaccionar el Compuesto (X-3) con el Compuesto (Y-3) para formar un compuesto representado por la Fórmula (l) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    o (b) hacer reaccionar el Compuesto (X-4) con el Compuesto (Y-4) para formar un compuesto representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en donde L3 es un halógeno; L4 es un halógeno, toluenosulfonato, metanosulfonato o trifluorometanosulfonato, y en el que las variables de cada uno de los compuestos (X-3), (X-4), (Y-3) y (Y-4) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; o (iv) preparar un compuesto representado por la siguiente fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R1 es C(O)NHR4, C(O)OR4, NHC(O)R4, NHC(O)OR4, NHC(O)NHR4, NHS(O)<2>R4, NHR4, alquilo C<1-4>-NHR<4>, -OR4 o R7; R2 es hidrógeno; cada uno de R4, independientemente, es heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido con -OR; R7 es independientemente heteroarilo de 5 a 10 miembros sustituido con -OR; R, R5 y las otras variables de fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, siempre que tanto R como R5 no sean hidrógeno, y en donde el método comprende: hacer reaccionar el Compuesto (X-5) con R5OH o ROH para formar un compuesto representado por la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
    en la que: Q2 es un enlace, -C(O)NH-, -C(O)O-, -NHC(O)-, -NHC(O)O-, -NHC(O)NH-, -NHS(O)<2>-, -NH-, -alquilo C<1-4>-NH-, o -O-, el anillo D es heteroarilo de 5-10 miembros; L5 es un halógeno; y R de ROH, R5 de R5OH y las otras variables del Compuesto (X-5) son cada uno e independientemente como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, siempre que tanto R como R5 no sean hidrógeno; o (v) preparar un compuesto representado por la siguiente fórmula:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde X es -O-, y las otras variables de Fórmula (I) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12, y en donde el método comprende:
    en donde L6 es -OH; L7 es -OH; y las variables restantes de cada uno de los Compuestos (X-6) y (Y-6) son cada una e independientemente como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
  17. 17. Un método para: (i) editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en el que la una o más regiones genómicas objetivo se editan, en el que una o más células son células cultivadas o célulasex vivode un organismo, opcionalmente en el que la eficacia de editar las regiones genómicas objetivo en una o más células aumenta en comparación con esa en una o más células idénticas, pero sin el compuesto; o (ii) reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo mediante una vía de reparación dirigida por homología (HDR), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de cualquier una de las reivindicaciones 1 a 13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, dando como resultado una rotura del ADN, y en el que la rotura del ADN se repara al menos en parte mediante una vía HDR, en la que una o más células son células cultivadas o célulasex vivode un organismo, opcionalmente en la que: (a) la eficacia de la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una HDR la vía aumenta en comparación con la de otra célula o células idénticas, pero sin el compuesto; y/o (b) la rotura de ADN comprende una rotura de doble hebra de ADN (DSB); o (iii) inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo mediante una vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, una edición del genoma sistema y un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo, dando como resultado una rotura del ADN, y en el que la reparación de la rotura del ADN a través de una vía NHEJ se inhibe o suprime, en donde la una o más células son células cultivadas o célulasex vivode un organismo, opcionalmente en donde: (a) la eficacia de inhibir o suprimir la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía n HeJ aumenta en comparación con la de otra célula o células idénticas, pero sin el compuesto; y/o (b) la rotura de ADN comprende una rotura de doble hebra de ADN (DSB); o (iv) modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprende: administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo de un gen objetivo, dando como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un gen objetivo gen(es) y/o proteína(s) asociados con el (los) gen(es) objetivo, en donde la una o más células son células cultivadas o célulasex vivode un organismo, opcionalmente en donde: (a) la expresión de un gen(es) aguas abajo (y/o proteína(s) asociada(s) con el (los) gen(es) objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; y/o (b) la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración, opcionalmente en el que dicha expresión aumenta en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 1 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; y/o (c) la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo disminuye en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración, opcionalmente en el que la expresión génica disminuye en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; y/o (d) la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo se elimina sustancialmente en una o más células.
  18. 18. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para usar en un método para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad o afección que necesita editar una o más regiones genómicas objetivo en una(s) célula(s) del sujeto, comprendiendo el método: (i) editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en el que la una o más regiones genómicas objetivo se editan, en el que una o más células son célulasin vivodentro de un organismo, opcionalmente en el que la eficacia de editar las regiones genómicas objetivo en una o más células aumenta en comparación con la de otras regiones genómicas objetivo idénticas célula o células pero sin el compuesto; o (ii) reparar una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo mediante una vía de reparación dirigida por homología (HDR), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de las regiones genómicas objetivo, dando como resultado una rotura del ADN, y en donde la rotura del ADN se repara al menos en parte a través de una vía HDR, en donde una o más células son célulasin vivodentro de un organismo, opcionalmente en las que: (a) la eficiencia de la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de una vía HDR aumenta en comparación con la de células o células idénticas pero sin el compuesto; y/o (b) la rotura de ADN comprende una rotura de doble hebra de ADN (DSB); o (iii) inhibir o suprimir la reparación de una rotura de ADN en una o más regiones genómicas objetivo mediante una vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ), que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con uno o más ácidos nucleicos de una o más regiones genómicas objetivo, dando como resultado una rotura del ADN, y en donde la reparación de la rotura del ADN a través de una vía NHEJ es inhibido o suprimido, en el que una o más células son célulasin vivodentro de un organismo, opcionalmente en el que: (a) la eficacia de inhibir o suprimir la reparación de la rotura del ADN en las regiones genómicas objetivo en una o más células a través de un NHEJ vía aumenta en comparación con la de otra célula o células idénticas pero sin el compuesto; y/o (b) la rotura de ADN comprende una rotura de doble hebra de ADN (DSB); o (iv) modificar la expresión de uno o más genes o proteínas que comprende administrar a una o más células que comprenden una o más regiones genómicas objetivo, un sistema de edición del genoma y el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el sistema de edición del genoma interactúa con un(os) ácido(s) nucleico(s) de una o más regiones genómicas objetivo de un(os) gen(es) objetivo, dando como resultado la edición de una o más regiones genómicas objetivo y en donde la edición modifica la expresión de un(os) gen(es) y/o proteína(s) aguas abajo) asociado(s) con el (los) gen(es) objetivo, en donde la una o más células son célulasin vivodentro de un organismo, opcionalmente en donde: (a) la expresión de un gen(es) y/o proteína(s) aguas abajo asociados con el (los) gen(es) objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; y/o (b) la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo aumenta en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración, opcionalmente en el que dicha expresión aumenta en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 1 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces o 10 veces en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; y/o (c) la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo disminuye en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración, opcionalmente en el que la expresión génica disminuye en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % en comparación con el nivel de expresión inicial en una o más células antes de la administración; y/o (d) la expresión de uno o más genes y/o proteínas aguas abajo asociadas con el o los genes objetivo se elimina sustancialmente en una o más células.
  19. 19. El método de la reivindicación 17 o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso de la reivindicación 18, en el que el compuesto es un cocristal que comprende un compuesto que tiene una estructura de Fórmula (I) y un formador de cocristal seleccionado entre ácido adípico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico o ácido benzoico.
  20. 20. El método de la reivindicación 17 o 19, o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso de la reivindicación 18 o 19, en el que: (i) dicha eficacia se incrementa al menos 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o 100 veces en comparación con la de otra célula o células idénticas, pero sin el compuesto; y/o (ii) dicha eficiencia se mide por la frecuencia de la integración de polinucleótidos objetivo; o (iii) dicha eficiencia se mide por la frecuencia de la mutagénesis dirigida, opcionalmente en donde la mutagénesis dirigida comprende mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones.
  21. 21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-20 o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso de cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que: (i) la célula está sincronizada en la fase S o G2 del ciclo celular; y/o (ii) la una o más células que se administran o se ponen en contacto con dicho compuesto tienen una mayor supervivencia en comparación con una o más células que no se han administrado o se han puesto en contacto con dicho compuesto; y/o (iii) el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran en una o más células: (a) simultáneamente; o (b) secuencialmente, opcionalmente en el que: (I) el sistema de edición del genoma se administra en una o más células antes del compuesto; o (II) el compuesto se administra en una o más células antes del sistema de edición del genoma; y/o (iv) el organismo es un mamífero o un ser humano.
  22. 22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-21 o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso de cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en el que el sistema de edición del genoma y el compuesto se administran mediante: (i) la misma ruta; o (ii) ruta diferente.
  23. 23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-22 o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso de cualquiera de las reivindicaciones 18-22, en el que el sistema de edición del genoma se selecciona de un sistema basado en meganucleasa, una nucleasa con dedos de zinc (ZFN). sistema basado, un sistema de nucleasa basado en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo, opcionalmente en el que el sistema de edición del genoma es un sistema basado en CRISPR.
  24. 24. El método o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para el uso de la reivindicación 23, en el que el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf, opcionalmente en el que: (i) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en el que el sistema CRISPR-Cas comprende: (a) al menos un elemento de ARN guía que comprende: (i) un ARN objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el objetivo ARN; (ii) y un ARN activador que comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con el ARN objetivo o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican la proteína Cas, opcionalmente en el que: (a) dicho ARN objetivo y ARN activador están fusionados como una única molécula; o (b) en el que la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II, además opcionalmente una nickasa SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o D10A, o cualquier combinación de las mismas; o (ii) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf y en el que el sistema CRISPR-Cpf comprende: (a) al menos un elemento de ARN guía o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el elemento de ARN guía, el ARN guía que comprende un ARN objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo; y (b) un elemento proteico Cpf que comprende una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cpf.
  25. 25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 17-24 o el compuesto o sal farmacéuticamente aceptable para uso de cualquiera de las reivindicaciones 18-24, en el que: (i) el sistema de edición del genoma se administra mediante uno o más vectores, opcionalmente en el que el uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc, además opcionalmente en donde los vectores virales se seleccionan del grupo que consiste en vectores virales retrovirales, lentivirales, adenovirales, adenoasociados y de herpes simple; y/o (ii) el sistema de edición del genoma se administra mediante: (a) ARN sintético; o (b) una nanoformulación.
  26. 26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto está representado por la Fórmula (II), (III-A-1), (IIIA-2), (III-B-1), (III-B- 2), (IV), (V-A) o (V-B) o sus sales farmacéuticamente aceptables.
  27. 27. Un kit o composición para editar una o más regiones genómicas objetivo, que comprende: un sistema de edición del genoma; y un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente en el que el sistema de edición del genoma es un sistema basado en meganucleasa, un sistema basado en nucleasa de dedos de zinc (ZFN), una nucleasa basada en efector similar a activador de transcripción (TALEN), un sistema basado en CRISPR o un sistema basado en NgAgo, además opcionalmente en el que el sistema de edición del genoma es un sistema basado en CRISPR.
  28. 28. El kit o composición de la reivindicación 27, en el que el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas o un sistema CRISPR-Cpf, opcionalmente en el que: (i) el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cas y en el que el sistema CRISPR-Cas comprende: (a) al menos un elemento de ARN guía que comprende: (i) un ARN objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican el ARN objetivo; (ii) y un ARN activador que comprende una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse con el ARN objetivo, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN activador; y (b) un elemento de proteína Cas que comprende una proteína Cas o un ácido nucleico que comprende una(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican la proteína Cas, opcionalmente en donde la proteína Cas es una proteína Cas9 de tipo II, además opcionalmente una SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 o nickasa D10A, o cualquier combinación de las mismas; o (ii) en el que el sistema basado en CRISPR es un sistema CRISPR-Cpf, y en el que el sistema CRISPR-Cpf comprende: (a) un ARN objetivo que comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente complementaria a una secuencia de nucleótidos en una o más regiones genómicas objetivo, o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican el ARN objetivo; y (b) un elemento proteico Cpf que comprende una proteína Cpf o un ácido nucleico que comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que codifican la proteína Cpf.
  29. 29. El kit o composición de la reivindicación 27 o 28, en el que el sistema de edición del genoma está incluido o empaquetado en uno o más vectores, opcionalmente en el que uno o más vectores se seleccionan de vectores virales, plásmidos o ADNmc, además opcionalmente en el que el virus los vectores se seleccionan del grupo que consiste en vector viral retroviral, lentiviral, adenoviral, adenoasociado y del herpes simple.
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