ES2980646T3 - Métodos de tratamiento de infecciones utilizando bacterias - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere en general a composiciones, formas de dosificación y métodos para prevenir y tratar infecciones. Las composiciones incluyen células bacterianas Gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas para reducir la actividad de endotoxina asociada a lipopolisacáridos (LPS), que sorprendentemente tienen una actividad aumentada para desencadenar la producción de citocinas por parte de las células inmunitarias. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de tratamiento de infecciones utilizando bacterias

Antecedentes

Para las infecciones víricas, tales como los virus de la hepatitis B (VHB) y de la inmunodeficiencia humana (VIH), las terapias actuales pueden controlar la replicación vírica, mejorar el estado clínico en la mayoría de pacientes tratados y resultar en una mortalidad y morbilidad reducidas. Sin embargo, la terapia antivírica se ve dificultada por el rebote de la viremia tras la interrupción del tratamiento y la aparición de mutaciones de resistencia a fármaco. La mayoría de pacientes requieren un tratamiento de por vida y raramente se consigue una curación de la infección crónica por VHB o VIH.

Es conocido que las citoquinas y quimioquinas desempeñan un papel importante en la defensa del huésped contra una amplia variedad de infecciones víricas, incluyendo la hepatitis y el VIH. El interferón alfa (IFN-a) está aprobado para el tratamiento de la infección por hepatitis B, y se han implicado varias citoquinas adicionales, incluyendo el interferón gamma (IFN-y), la interleuquina 12 (IL-12), la interleuquina 23 (IL-23), GM-CSF y el factor alfa de necrosis tumoral (TNF-a, por sus siglas en inglés), en la defensa del huésped o el tratamiento de infecciones víricas tales como el virus de la hepatitis y el VIH.

La vacunación preventiva frente a patógenos requiere la provisión de un determinante antigénico frente al patógeno y un adyuvante, que proporciona al sistema inmunitario señales de peligro o sus efectores corriente abajo requeridos para la activación de una respuesta inmunitaria contra el antígeno patogénico. Las vacunas terapéuticas destinadas a tratar una infección preexistente dependen del reconocimiento del huésped de determinantes antigénicos patogénicos en la infección existente y requieren, además, adyuvantes o sus efectos corriente abajo para proporcionar una activación inmunitaria mediada por señales de peligro. En algunos casos, puede resultar posible potenciar las vacunas terapéuticas mediante la provisión de antígenos derivados de patógenos exógenos. Las células inmunitarias de los sistemas inmunitario tanto innato como adaptativo utilizando receptores de reconocimiento de patrones (PRR, por sus siglas en inglés) para detectar el peligro en la forma de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, por sus siglas en inglés). La familia más destacada de PRR comprende receptores de tipo Toll (TLR, por sus siglas en inglés), que se encuentran en esencialmente todas las células inmunitarias. Estos receptores (TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9) responden a los productos presentes en muchos tipos diferentes de patógeno, incluyendo bacterias y virus. La activación de los receptores TLR conduce a una activación tanto directa como indirecta de la función de las células inmunitarias y de las respuestas inmunitarias. La activación directa ocurre mediante la promoción de la maduración, proliferación y diferenciación celular, mientras que la activación indirecta ocurre mediante la inducción de la secreción de citoquinas y quimioquinas. Un décimo TLR (TLR10) puede funcionar como un efector regulatorio negativo de la función inmunitaria.

Debido al papel de los TLR en las respuestas inmunitarias antipatógeno mediadas por huéspedes, se han realizado esfuerzos significativos para producir adyuvantes de agonista de TLR y terapéuticos para infecciones. Se ha producido una amplia diversidad de agonistas de TLR monoespecíficos, purificados o sintéticos y se han sometido a ensayo en contextos preclínicos y clínicos. Los agonistas de TLR se utilizan como adyuvantes en vacunas preventivas. Sin embargo, aunque se ha observado actividad antipatogénica en el contexto de las vacunas terapéuticas, estos esfuerzos se han enfrentado a retos significativos. Entre los problemas encontrados se incluyen tanto la falta de potencia como la excesiva toxicidad, sugiriendo que serán necesarias mejoras adicionales en el tratamiento y, en particular, el tratamiento, de las infecciones existentes utilizando agonistas de TLR.

El documento n.°WO 2014/107365 A1 da a conocer una composición que comprende células bacterianas gramnegativas sustancialmente no viables que muestran una reducción de la actividad de endotoxinas mediadas por lipopolisacárido (LPS) y de la pirogenicidad en comparación con las células bacterianas gram-negativas de tipo salvaje correspondientes.

El documento n.° CN107184613 da a conocer una composición que comprende una cepa bacterianaE. colipara la utilización en el tratamiento de la infección por el VHB.

Sumario

Debido a la necesidad de activación de la respuesta inmunitaria tanto innata como adaptativa para una defensa inmunitaria óptima y debido al hecho de que los patógenos contienen múltiples agonistas de TLR y otros constituyentes relacionados con señales de peligro, está contemplado que sea necesario un enfoque terapéutico de agonistas multi-LTR para una terapia antiinfecciosa, incluyendo antivírica, óptima. Es conocido que las bacterias gram-negativas contienen múltiples agonistas de TLR e inducen respuestas inmunitarias asociadas a agonistas de TLR significativas, incluyendo la secreción de citoquinas. Las bacterias gram-negativas de tipo salvaje, las cuales contienen niveles elevados de lipopolisacárido (LPS) agonista de TLR-4 o endotoxinas, sin embargo, son altamente tóxicas al administrarse por vía intravenosa, en gran medida debido a la inducción de una secreción excesiva de citoquinas por las células inmunitarias. Las bacterias gram-negativas contienen, además, agonistas de los TLR 1/2, 5 Y 9, que pueden contribuir tanto a la estimulación del sistema inmunitario como a toxicidad sistémica.

Es un resultado sorprendente e inesperado de la presente exposición que el tratamiento de bacterias gram-negativas para reducir su actividad de endotoxinas asociadas a LPS, p. ej., con polimixina y glutaraldehído, que puede eliminar las bacterias, mantiene las bacterias intactas y reduce significativamente los niveles de LPS, puede incrementar simultáneamente la capacidad de las bacterias de inducir la secreción de citoquinas por las células inmunitarias humanas. Este es un resultado inesperado por lo menos debido a que se supone que una reducción significativa de LPS también debería conducir a una reducción significativa de la cantidad de cada una de las múltiples citoquinas liberadas por las células inmunitarias expuestas a las bacterias tratadas, en comparación con las bacterias de tipo salvaje, no tratadas.

Inesperadamente, tal como se muestra en la Tabla 1, las bacterias tratadas indujeron niveles más altos de 8 de 9 posibles citoquinas secretadas por las células inmunitarias humanas, en comparación con las bacterias de tipo salvaje, no tratadas, al someterlas a ensayo a las mismas concentraciones de las bacterias (no tratadas y tratadas), a pesar del hecho de que las bacterias tratadas presentaba únicamente 4,94 % del nivel de LPS observado en las bacterias no tratadas. Además, a pesar de la reducción significativa de LPS, las bacterias tratadas indujeron niveles más altos de citoquinas que los agonistas de TLR monoespecíficos (Tabla 2). La reducción de la actividad de endotoxina asociada a LPS por el tratamiento, que puede ser de aproximadamente 75 % a 99 % según medición mediante un ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL, por sus siglas en inglés)in vitrode la actividad con bacterias de tipo salvaje, no tratadas, puede resultar en la reducción de la toxicidad. Sin restringirse a ninguna teoría en particular, está contemplado que la estructura intacta de las células bacterianas tratadas pueda ayudar a bloquear o minimizar la liberación de LPS libre a algún compartimiento del sujeto huésped. Los resultados sugieren que las bacterias tratadas podrían inducir una respuesta inmunitaria superior que las bacterias no tratadas o agonistas monoespecíficos, con toxicidad sistémica reducida, respecto a las bacterias no tratadas.

Los estudios animales confirmaron adicionalmente que dichas bacterias tratadas pueden inhibir las infecciones víricas existentes tanto de VHB como de VIH. Además, en comparación con el tratamiento de referencia (p. ej., entecavir para el VHB), las bacterias tratadas mostraron un efecto inhibidor sostenido y significativo tras la interrupción del tratamiento, aunque el efecto inhibidor inicial puede tardar más tiempo en aparecer. También resulta interesante que, aunque los tratamientos con AINE (p. ej., indometacina) por sí solos no mostraron efectos antivíricos observables, la combinación de un AINE puede incrementar sinérgicamente la eficacia de las bacterias tratadas. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona una composición para la utilización en la prevención o el tratamiento de una infección vírica, en donde la composición comprende una pluralidad de células bacterianas gramnegativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resultan en una reducción de aproximadamente 75 % a 99 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) medida mediante el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LALA) en comparación con células bacterianas gram-negativas de tipo salvaje, no tratadas, en donde las células bacterianas eran células deSalmonellaoEscherichia,y en donde el tratamiento era con polimixina a una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 10 °C y con glutaraldehído.

Las referencias a métodos de tratamiento mediante terapia de la presente descripción deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para la utilización en dichos métodos.

La presente exposición da a conocer un método para el tratamiento de una infección en un paciente que lo necesita, que comprende la administración en el paciente de una cantidad eficaz de una composición que comprende una pluralidad de células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resulta una reducción de por lo menos 75 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS).

La presente exposición da a conocer un método para la prevención de una infección en un paciente que lo necesita, que comprende la administración en el sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende una pluralidad de células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resulta una reducción de por lo menos 90 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) y de un antígeno derivado de patógeno o asociado a patógeno.

La presente exposición da a conocer un método de prevención o tratamiento de una infección en un paciente que lo necesita. El método implica la administración en el paciente de una cantidad eficaz de una composición que comprende una pluralidad de células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resulta una reducción de aproximadamente 75 % a 99 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) (LPS activos) medida mediante el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL), en comparación con células bacterianas gram-negativas de tipo salvaje, no tratadas.

En algunas realizaciones, la composición contiene entre aproximadamente 0,01 y 100 ng de LPS activo por kg de peso corporal del paciente. En algunas realizaciones, la composición contiene entre aproximadamente 0,02 y 20 ng de LPS activo por kg de peso corporal del paciente. En algunas realizaciones, la composición contiene entre aproximadamente 0,1 y 10 ng de LPS activo por kg de peso corporal del paciente.

En algunas realizaciones, la composición contiene entre aproximadamente 2 y 200 ng de LPS activo por cada 1x108 células. En algunas realizaciones, la composición contiene entre aproximadamente 10 y 120 ng de LPS activo por cada 1x108 células. En algunas realizaciones, la composición contiene entre aproximadamente 20 y 100 ng de LPS activo por cada 1x108 células.

En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables han sido tratadas de manera que resulta una reducción de aproximadamente 85 % a 98 % de las endotoxinas asociadas a LPS. En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables han sido tratadas de manera que resulta una reducción de aproximadamente 90 % a 98 % de las endotoxinas asociadas a LPS.

La infección es una infección vírica, tal como por un virus seleccionado de la Tabla A. En algunas realizaciones, la infección vírica es por el virus de la hepatitis B (VHB) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Se proporciona, además, en una realización, una forma de dosis farmacéutica que comprende una pluralidad de células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resulta una reducción de aproximadamente 75 % a 99 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) medida mediante el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL) en comparación con células bacterianas gramnegativas de tipo salvaje, no tratadas, en donde la actividad de endotoxina asociada a LPS es equivalente a aproximadamente 0,7 ng y 7000 ng de LPS activa, preferentemente equivalente a aproximadamente 7 ng a 1400 ng de LPS activa.

En otras realizaciones, también se describen composiciones terapéuticas, vacunas y sus formas de administración.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1A-1D muestra los efectos del tratamiento con entecavir, bacterias tratadas (bacterias señuelo) o su combinación, sobre la inhibición de la producción de ADN del VHBin vivo.

La fig. 2 muestra que las bacterias señuelo, pero no el entecavir, redujeron los niveles de HBeAgin vivo.

La fig. 3A-D muestra los resultados de un estudio a más largo plazo de la inhibición de la producción de ADN del VHBin vivo.

La fig. 4A-D presenta los resultados de la inhibición de la expresión de HBsAgin vivo.

La fig. 5A-D presenta los resultados de la inhibición de la expresión de HBeAgin vivo.

La fig. 6 muestra que la combinación de indometacina y bacterias señuelo (con o sin entecavir) inhibió la expresión de HBeAg en hígados de ratón 27 semanas después de la interrupción del tratamiento.

La fig. 7A-F presenta un análisis inmunohistoquímico de la expresión de HBeAg en hígados de ratón 27 semanas después de la interrupción del tratamiento.

La fig. 8A-C muestra la inhibición de los niveles sanguíneos de VIH mediante el tratamiento de referencia o con bacterias tratadas en ratones humanizados infectados por VIH.

Descripción detallada

La descripción siguiente proporciona realizaciones de ejemplo de la presente tecnología. Sin embargo, debe reconocerse que dicha descripción no pretende ser limitativa del alcance de la presente exposición sino que, por el contrario, se proporciona a modo de descripción de realizaciones ejemplares.

Tal como se utilizan en la presente especificación, los términos, expresiones y símbolos a continuación pretenden de manera general presentar los significados indicados posteriormente, excepto en la medida en que el contexto en que se utilizan indique lo contrario.

Composiciones y métodos para estimular la respuesta inmunitaria

Los ejemplos experimentales de la presente exposición demuestran que las células bacterianas gram-negativas intactas y no viables tratadas para reducir significativamente la actividad de endotoxinas asociadas a LPS inesperadamente presentaban una capacidad incrementada de inducir la secreción de citoquinas por células inmunitarias. Por lo tanto, dichas células bacterianas tratadas resultan adecuadas para proporcionar un medio seguro y eficaz para estimular la respuesta inmunitaria del sujeto. La respuesta inmunitaria podría ser contra infecciones bacterianas, fúngicas, parasitarias o víricas.

Por lo tanto, la presente exposición da a conocer un método de estimulación de la respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesita. Se da a conocer, además, un método para la prevención o el tratamiento de una infección en un paciente que lo necesita. Se da a conocer un método para el tratamiento de la inmunodeficiencia en un paciente que lo necesita. En otra realización, se proporciona un método de vacunación de un sujeto en riesgo de infección.

El método, en algunas realizaciones, implica administrar en el sujeto/paciente una cantidad eficaz de una composición que comprende una pluralidad de células bacterianas tratadas tal como se da a conocer en la presente memoria. Las células bacterianas tratadas, en algunas realizaciones, son células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas para reducir la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) y/o la pirogenicidad.

Los organismos bacterianos candidatos que se utilizan en las composiciones en la presente memoria son gramnegativas y se derivan de aquellos que presentan actividad de endotoxinas asociadas a LPS como organismo de tipo salvaje, es decir, células deSalmonellao deEscherichia.La expresión «bacterias gram-negativas» se refiere a bacterias que no retienen la tinción de pigmento básico inicial (p. ej., violeta de cristal) que es parte del procedimiento conocido como tinción gram. En una tinción gram de ejemplo, en primer lugar se fija las células a un portaobjetos con calor y se tiñen con un pigmento básico (p. ej., violeta de cristal), que es asimilado por bacterias tanto gram-negativas como gram-positivas. A continuación, se tratan los portaobjetos con un mordiente (p. ej., yoduro de Gram), que se une al pigmento básico (p. ej., violeta de cristal) y lo atrapa dentro de la célula. Seguidamente se lavan las células con acetona o alcohol y después se contratiñen con un pigmento secundario de color diferente (p. ej., safranina). Los organismos gram-positivos retienen la tinción violeta inicial, mientras que los organismos gram-negativos resultan decolorados por el lavado con solvente orgánico y, por lo tanto, muestran la contratinción; entre las bacterias gramnegativas se incluyen, aunque sin limitarse a ellas,Escherichia spp., Shigella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Neisseria spp., Haemophilus spp., Aeromonas spp., Francisella spp., Yersinia spp., Klebsiella spp., Bordetella spp., Legionella spp., Corynebacteria spp., Citrobacter spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp.yVibrio spp.

Entre los organismos gram-negativos se encuentran lasEnterobacteriaceae,un familia grande que incluye, junto con muchos simbiontes inocuos, muchos patógenos bien conocidos, tales comoSalmonella, E. coli, Yersinia pestis, KlebsiellayShigella, Proteus, Enterobacter, Serratia,yCitrobacter.Los miembros de la familiaEnterobacteriaceaese denominan enterobacterias, ya que varios miembros viven en los intestinos de los animales.

En una realización, se seleccionaE. colicomo el organismo. Una cepa particular contemplada esE. colicepa 2617 143-312, (Migula) Castellani y Chalmers (ATCC® 13070™). Entre las cepas deE. coliadicionales que pueden utilizarse se incluyen MG1655 (ATCC® 47076) y KY8284 (ATCC® 21272).

Los organismos gram-negativos utilizados en los métodos en la presente memoria no es necesario que sean organismos recombinantes que contienen o expresan ADN foráneo a la forma de tipo salvaje del organismo. Sin embargo, en algunas realizaciones, los organismos pueden modificarse para expresar algunas moléculas no nativas, incluyendo, por ejemplo, antígenos patogénicos o proteínas inmunoestimuladoras.

El término «lipopolisacárido» (LPS) se refiere a grandes moléculas que consiste en un lípido y un polisacárido (glucofosfolípido) unidos mediante un enlace covalente. Los LPS comprenden tres partes: 1) antígeno O, 2) oligosacárido nuclear y 3) lípido A. El antígeno O es un polímero glicano repetitivo unido al oligosacárido nuclear y comprende el dominio más externo de la molécula de LPS. El oligosacárido nuclear se une directamente al lípido A y habitualmente contiene azúcares, tales como heptosa y ácido 3-desoxi-D-manooctulosónico (también conocido como KDO, ceto-desoxioctulosonato). El lípido A es un disacárido de glucosamina fosforilado unido a múltiples ácidos grasos. Los ácidos grasos anclan el l Ps a la membrana exterior bacteriana y el resto del LPS sobresale de la superficie celular.

La actividad de endotoxinas reside en la parte de dominio de lípido A del LPS y, de esta manera, también se denomina «actividad de endotoxinas asociada a LPS». Al ser lisadas las células bacterianas por el sistema inmunitario, se liberan fragmentos de membrana que contienen LPS y lípido A a la circulación, causando fiebre (pirogenicidad) y potencialmente un choque fatal (denominado choque endotóxico o séptico). La toxicidad de los LPS es expresada por el lípido A a través de la interacción con células del sistema inmunitario de los mamíferos, un proceso que conduce a la secreción de citoquinas proinflamatorias, incluyendo el factor alfa de necrosis tumoral (TNFa) y la interleuquina-1beta (IL-1p), que puede presentar consecuencias fatales para el huésped.

La actividad de endotoxina asociada a LPS puede medirse mediante métodos bien conocidos de la técnica, incluyendo, por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL), que utiliza sangre del cangrejo herradura, puede detectar niveles muy bajos de LPS. La presencia de la actividad de endotoxinas resultará en la coagulación del lisado de sangre deLimulusdebido a la amplificación mediante una cascada enzimática. Se encuentran disponibles comercialmente formas de coagulación de gel, turbidimétrica y cromogénica del ensayo LAL.

Los ensayos de actividad de endotoxina basados en el ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) también son conocidos, tales como EndoLISA® de Hyglos, zona de Munich de Alemania. Este ensayo utiliza una proteína fágica específica de LPS unida a la fase sólida para la captura del LPS y que, tras una etapa de lavado, determina la presencia de LPS mediante la adición de factor C recombinante, que al ser activado por el LPS, corta el compuesto que entonces emite fluorescencia. El factor C, presente en el lisado de amebocitos deLimulus,normalmente existe en forma de un zimógeno, y es el cebador de la cascada de coagulación que ocurre en el ensayo LAL.

La pirogenicidad se refiere a la capacidad de un agente de causar fiebre en el sujeto. La pirogenicidad puede medirse como el incremento de la temperatura rectal en conejos en respuesta a la administración por vía intravenosa de agonistas de TLR, organismos o derivados de los mismos.

Se encuentran disponibles diversos métodos para reducir la actividad de endotoxina y/o la pirogenicidad de los organismos gram-negativos. Entre los métodos se incluye el tratamiento de los organismos con un agente que se une a LPS o que interrumpe su formación.

La reducción de la actividad de endotoxinas o la pirogenicidad se consigue mediante tratamiento de los organismos bacterianos con un antibiótico que inactiva las endotoxinas, que es la polimixina, incluyendo la polimixina B o la polimixina E. Se encuentra comprendido dentro de la técnica determinar la cantidad de antibiótico y las condiciones para el tratamiento. En una realización, la polimixina, ya sea la polimixina B o la E, puede utilizarse a una concentración de aproximadamente 3 microgramos por cada 5.000 microgramos por mililitro. En otra realización, la concentración de polimixina puede ser de entre aproximadamente 200 microgramos y 5.000 microgramos por mililitro. En una realización, el antibiótico se aplica en las bacterias durante 10 minutos a 4 horas o entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 3 horas.

En una realización, las bacterias se cultivan en la presencia de magnesio (Mg) en la forma de MgCh. En una realización, las bacterias se tratan con polimixina en la presencia de MgCh, así como a una temperatura adecuada para mantener la integridad de las bacterias. En una realización, la concentración de MgCh en el medio de cultivo es de entre aproximadamente 0,5 mM y aproximadamente 5,0 mM, o de aproximadamente 2 mM, y la concentración de MgCl<2>en el medio de tratamiento es de entre aproximadamente 5,0 mM y aproximadamente 30 mM, o de aproximadamente 20 mM. La temperatura del medio de tratamiento es de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 10 °C, o de aproximadamente 4 °C. La integridad bacteriana se determina mediante la eficiencia de recuperación en un pellet bien definido tras la centrifugación a 3.000xg durante 10 minutos, y mediante microscopía electrónica o microscopía electrónica con tinción de Gram. En una realización preferente, la recuperación bacteriana tras el tratamiento y el lavado es superior a aproximadamente 80 % y las bacterias presentan una apariencia intacta según la microscopía óptica o electrónica.

La reducción de la actividad de endotoxinas puede conseguirse mediante tratamiento de los organismos bacterianos con un antibiótico que es conocido que interrumpe la biosíntesis de KDO2-lípido IV<a>. Por ejemplo, Goldman et al., J Bacteriol. 170(5):2185-91, 1988 describen agentes antibacterianos, incluyendo el agente antibacteriano III, que inhibe específicamente la actividad de CTP:CMP-3-desoxi-D-mano-octulosonato citidililtransferasa y que resultan útiles para bloquear la incorporación del 3-dexoxi-D-mano-octulosonate (KDO) en el LPS de los organismos gram-negativos. Al interrumpirse la síntesis de LPS, se interrumpe el crecimiento bacteriano. La adición de KDO a la especie precursora de LPS llamada lípido IV<a>es la ruta principal de formación de lípido A-KDO tanto en S.typhimuriumcomo enE. coli..En una realización, el antibiótico es el agente antibacteriano III y las bacterias gram-negativas se tratan con una cantidad adecuada, tal como, por ejemplo, 5 microgramos por mililitro a 500 microgramos por mililitro durante un tiempo adecuado, por ejemplo 2 a 8 horas.

De manera similar, el compuesto alfa-C-(1,5-anhidro-7-amino-2,7-dideoxi-D-mano-heptopiranosil)-carboxilato es conocido que inhibe la 3-desoxi-D-mano-octulosonato citidilitransferasa (CMP-KDO sintetasa), un enzima citoplasmático que activa el 3-desoxi-D-mano-octulosonato (KDO) para la incorporación en LPS (Nature. 1987 10-16;329(6135):162-4). Por lo tanto, el tratamiento de los organismos con el compuesto también puede reducir la actividad de endotoxina asociada a LPS.

La reducción de la actividad de endotoxina puede conseguirse mediante el tratamiento de los organismos con un inhibidor de LPS. Por ejemplo, se ha mostrado que un lipopéptido cíclico bacteriano, la surfactina, se une al lípido A, suprimiendo su actividad (J. Antibiot. 200659(1):35-43).

Además de las endotoxinas asociadas a LPS, otros diversos constituyentes de los organismos gram-negativos pueden inducir o contribuir a pirogenicidad y choque séptico, incluyendo proteínas de membrana externa, fimbrias, pili, lipopéptidos y lipoproteínas (revisión en Jones, M., Int. J. Pharm. Compd., 5(4):259-263, 2001). La pirogenicidad puede medirse mediante un método de conejo, bien conocido de la técnica, que implica la evaluación de la temperatura rectal después de la administración intravenosa de pirógenos putativos.

Se ha encontrado que el tratamiento de un organismo gram-negativo con una combinación de polimixina B y glutaraldehído produjo una reducción de 30 veces en la pirogenicidad, según medición en conejos. En una realización, se utilizaron 1.000 microgramos por mililitro (pg/ml) de polimixina B y glutaraldehído al 1 % para producir una reducción de 30 veces en la pirogenicidad, según medición en conejos. La pirogenicidad se redujo mediante una combinación de reacción de polimixina B con LPS y reactividad del glutaraldehído con LPS y otros constituyentes bacterianos. El glutaraldehído sirve a un doble papel en este contexto, matando también a bacterias.

De esta manera, se da a conocer un método de reducción de la actividad de endotoxinas y la pirogenicidad, y de eliminación de microorganismos gram-negativos mediante el tratamiento de dichas bacterias con una combinación de 1.000 |jg/ml de polimixina B y glutaraldehído al 1 %. En otra realización, las bacterias gram-negativas se tratan con una combinación de polimixina B en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 3 jg/m l y aproximadamente 1.000 jg/m l y glutaraldehído en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 1,0 %. El intervalo de dosis de polimixina B es de entre aproximadamente 100 jg/m l y aproximadamente 1.000 jg/m l y el glutaraldehído se encuentra en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 1,0 %.

Además, pueden tratarse las bacterias gram-negativas, por ejemplo, con un intervalo de dosis de polimixina B de entre aproximadamente 1.000 jg/m l y aproximadamente 3.000 jg/m l y glutaraldehído en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 1,0 %. En otro aspecto, las bacterias gram-negativas pueden tratarse, por ejemplo, con un intervalo de dosis de polimixina B de entre aproximadamente 3.000 jg/m l y aproximadamente 5.000 jg/m l y glutaraldehído en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 2,0%.

En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables presentan una reducción de por lo menos aproximadamente 70 % de la actividad de endotoxina asociada a LPS (p. ej., medida mediante el ensayo LAL) en comparación con bacterias de tipo salvaje no tratadas. En algunas realizaciones, la reducción es de por lo menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97

%, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,98 %. En algunas realizaciones, la reducción no es superior a aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 %, 99,98 % o 99,99 %. En algunas realizaciones, la reducción es de entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 99,99 %, entre aproximadamente

80 % y aproximadamente 99.99 %, entre aproximadamente 90 % y aproximadamente 99,5 % o 99 %, entre aproximadamente 91 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 92 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 93 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 96 %, entre aproximadamente 94,5 % y aproximadamente 95,5 %, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 95 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 96 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 97 % y aproximadamente 99,5 %, o de entre aproximadamente 98 % y aproximadamente 99,9 %, sin limitación.

En algunas realizaciones, resultan preferentes determinados niveles de LPS residual. Por ejemplo, en algunas realizaciones, en una composición de la presente exposición hay aproximadamente 1 a 200 ng de LPS activo por cada 1x108 células. En algunas realizaciones, hay aproximadamente 2 a 200 ng, aproximadamente 5 a 150 ng, aproximadamente 5 a 120 ng, aproximadamente 10 a 120 ng, aproximadamente 20 a 100 ng, aproximadamente 20 a

50 ng, aproximadamente 10 a 50 ng de LPS activo por cada 1*108 células.

En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables presentan una reducción de por lo menos aproximadamente 70 % de la pirogenicidad (p. ej., medida mediante ensayo en conejosin vivo)en comparación con bacterias de tipo salvaje no tratadas. En algunas realizaciones, la reducción es de por lo menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,98 %. En algunas realizaciones, la reducción no es superior a aproximadamente 95 %, 96 %,

97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 %, 99,98 % o 99,99 %. En algunas realizaciones, la reducción es de entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 99,99 %, entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 99.99 %, entre aproximadamente 90 % y aproximadamente 99,5 % o 99 %, entre aproximadamente 91 % y aproximadamente

99 %, entre aproximadamente 92 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 93 % y aproximadamente 97

%, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 96 %, entre aproximadamente 94,5 % y aproximadamente 95,5

%, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 95 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 96 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 97 % y aproximadamente 99,5 %, o de entre aproximadamente 98 % y aproximadamente 99,9 %, sin limitación.

Tal como se ha proporcionado anteriormente, además de las endotoxinas asociadas a LPS, diversos otros constituyentes de los organismos gram-negativos también pueden inducir o contribuir a la pirogenicidad, tales como las proteínas de membrana externa, las fimbrias, pili, lipopéptidos y lipoproteínas. En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables se tratan de manera que la reducción de la pirogenicidad se consigue mediante tanto la reducción de la actividad de endotoxinas asociadas a LPS como la reducción de la pirogenicidad no asociada a LPS, tal como la inactivación, eliminación o bloqueo de proteínas de membrana externa, fimbrias, pili, lipopolipéptidos o lipoproteínas. En algunas realizaciones, la reducción de la pirogenicidad no asociada a LPS es de por lo menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,98 %, En algunas realizaciones, la reducción no es superior a por lo menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 %, 99,98 % o 99,99 %.

Las bacterias para la administración según los métodos de la exposición se convierten en no viables o en sustancialmente no viables antes de la administración o después de la administración. Lo que significa «no viable» es que los organismos son eliminados mediante tratamiento con un agente exógeno y/o contienen una mutación que resulta en la incapacidad de los organismos de sobrevivir en un huésped mamífero. Las bacterias sustancialmente no viables son las cepas en las que se ha reducido la viabilidad en por lo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más.

Las bacterias pueden convertirse en no viables mediante tratamiento con un compuesto, tal como la polimixina. La polimixina se une a LPS e interfiere con la integridad membrana a medida que las bacterias se dividen, reduciéndose la viabilidad como consecuencia de la permeabilización de la cubierta celular. En el caso de que se reduzca la viabilidad mediante este método, deben tomarse medidas para evitar la lisis celular y mantener las células intactas. Otro enfoque es cultivar cepas bacterianas con mutaciones condicionales en la ruta de biosíntesis de los LPS, que son suprimidas durante el crecimiento y después transferidas a una condición no permisiva que activa la mutación e interrumpe la biosíntesis de los LPS. En cada caso, el procedimiento aplicado es uno que convierte las bacterias en no viables, determinando en cada contexto el tiempo óptimo de tratamiento o la dosis de compuesto, de manera que la viabilidad se pierda sustancialmente con retención de una integridad significativa de la célula bacteriana. En el caso de que la no viabilidad sea inferior a 100 %, pueden utilizarse bacterias que contengan una mutación que impida la proliferación adicional de las bacterias viables en un huésped de mamífero (p. ej., un auxótrofo de ácido diaminopimélico, tal como describen Bukhari y Taylor, J. Bacteriol. 105(3):844-854, 1971 y Curtiss et al., Immunol. Invest. 18(1-4):583-596, 1989).

Enfermedades y afecciones

Las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente viables tal como se dan a conocer en la presente memoria resultan útiles para fortalecer el sistema inmunitario de un sujeto y, de esta manera, resultan útiles para la prevención o el tratamiento de enfermedades y afecciones mediante una respuesta inmunitaria mejorada. Las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables tal como se dan a conocer en la presente memoria también pueden utilizarse como vacunas o adyuvantes inmunitarios para sujetos en riesgo de desarrollar dichas enfermedades o afecciones.

El término «tratamiento» o «que trata» es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clínicos. Entre los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluirse uno o más de los siguientes: a) inhibición de la enfermedad o afección (p. ej., reducción de uno o más síntomas resultantes de la enfermedad o afección, y/o disminución de la extensión de la enfermedad o afección), b) ralentización o detención del desarrollo de uno o más síntomas clínicos asociados a la enfermedad o afección (p. ej., estabilización de la enfermedad o afección, detención o retraso del agravamiento o progresión de la enfermedad o afección, y/o bloqueo o retraso de la expansión (p. ej., metástasis) de la enfermedad o afección), y/o c) alivio de la enfermedad, es decir, causar la regresión de los síntomas clínicos (p. ej., mejora del estado de enfermedad proporcionando una remisión parcial o total de la enfermedad o afección, potenciando el efecto de otro medicamento, retrasando la progresión de la enfermedad, incrementando la calidad de vida y/o prolongando la supervivencia.

El término «prevención» o «que previene» se refiere a cualquier tratamiento de una enfermedad o afección que provoca que los síntomas clínicos de la enfermedad o afección no se desarrollen. Las células bacterianas pueden administrarse, en algunas realizaciones, en un sujeto (incluyendo un ser humano) en riesgo o que presenta antecedentes familiares de la enfermedad o afección.

El término «sujeto» se refiere a un animal, tal como un mamífero (incluyendo un ser humano) que ha sido o será objeto de tratamiento, observación o experimento. Los métodos indicados en la presente memoria pueden resultar útiles en la terapia humana y/o en aplicaciones veterinarias. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, perro, gato, vaca, oveja y similares. En una realización, el sujeto es un ser humano.

En particular, las células bacterianas actualmente dadas a conocer pueden resultar particularmente adecuadas para el tratamiento de infecciones víricas, tales como aquellas causadas por virus enumerados en la Tabla A, opcionalmente con un agente antiinfeccioso secundario.

Tabla A. Listado de virus.

(continuación)

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En algunas realizaciones, la enfermedad bajo tratamiento es una infección por el VHB. En algunas realizaciones, la enfermedad bajo tratamiento es una infección por el VIH.

Posología y cronograma

En algunas realizaciones, puede determinarse el nivel de actividad de endotoxinas asociadas a LPS de las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que se administran en un sujeto. En alguna realización, la composición administrada contiene entre aproximadamente 0,01 y 200 ng de LPS activo por kg de peso corporal del sujeto.

La expresión «LPS activo» se refiere al LPS en una composición que es capaz de mostrar actividad de endotoxina asociada a LPS, p. ej., medida mediante el ensayo LAL, en el que se considera que 5 a 9 unidades de endotoxina (UE) son equivalentes a 1 ng de LPS activo respecto a una preparación estándar de LPS. La cantidad de LPS activado en una composición puede describirse como el peso de<l>P<s>no inhibido que es capaz de mostrar el mismo nivel de actividad de endotoxina asociada a LPS que la composición.

En algunas realizaciones, la composición (p. ej., la composición que contiene la actividad de endotoxina asociada a LPS de las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables) administrada contiene entre aproximadamente 0,01 y 150 ng de LPS activo por kg de peso corporal del sujeto. En algunas realizaciones, la composición administrada contiene entre aproximadamente 0,02 y 150 ng, entre aproximadamente 0,02 y 100 ng, entre aproximadamente 0,05 y 100 ng, entre aproximadamente 0,05 y 100 ng, entre aproximadamente 0,05 y 50 ng, entre aproximadamente 0,05 y 20 ng, entre aproximadamente 0,1 y 20 ng, entre aproximadamente 0,1 y 10 ng, entre aproximadamente 0,1 y 5 ng, entre aproximadamente 0,2 y 100 ng, entre aproximadamente 0,2 y 50 ng, entre aproximadamente 0,2 y 20 ng, entre aproximadamente 0,2 y 10 ng, entre aproximadamente 0,2 y 5 ng, entre aproximadamente 0,3 y 90 ng, entre aproximadamente 0,4 y 80 ng, entre aproximadamente 0,5 y 70 ng, entre aproximadamente 0,6 y 60 ng, entre aproximadamente 0,7 y 50 ng, entre aproximadamente 0,8 y 40 ng, entre aproximadamente 0,9 y 30 ng, entre aproximadamente 1 y 20 ng, entre aproximadamente 2 y 15 ng, o entre aproximadamente 3 y 12 ng de LPS activo por kg de peso corporal del sujeto,

La cantidad de LPS activo administrada en un sujeto puede variar dependiendo del tipo de sujeto y de la enfermedad. Determinados animales, tales como ratones, ratas y perros, pueden tener la capacidad de aprovechar una cantidad más alta (p. ej., 250 a 500 veces superior a la utilizada en seres humanos y conejos) de LPS activo. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, la composición administrada contiene entre aproximadamente 10 y 100.000 ng de LPS activo por kg de peso corporal del sujeto. En algunas realizaciones, la composición administrada contiene entre aproximadamente 20 y 50.000 ng, entre aproximadamente 30 y 40.000 ng, entre aproximadamente 40 y 30.000 ng, entre aproximadamente 50 y 20.000 ng, entre aproximadamente 0,7 y 10.000 ng, entre aproximadamente 80 y 8.000 ng, entre aproximadamente 90 y 7,000 ng, entre aproximadamente 100 y 6.000 ng, entre aproximadamente 200 y 5.000 ng, o entre aproximadamente 500 y 5000 ng de LPS activo por kg de peso corporal del sujeto.

El número de células bacterianas administrado en el sujeto puede determinarse basándose en la cantidad de LPS activo necesaria y el nivel de actividad de endotoxina de las células bacterianas. El número también puede depender de una variedad de factores, incluyendo la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la vía de administración y la tasa de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular en el sujeto sometido a terapia. Por ejemplo, una dosis puede expresarse como número de células bacterianas descritas en la presente memoria por kilogramo de peso corporal del sujeto (mg/kg). Las dosis de entre aproximadamente 10.000 y 100.000.000 células/kg pueden resultar apropiadas. En algunas realizaciones, entre aproximadamente 100.000 y 10.000.000 células/kg puede resultar apropiado. En otras realizaciones, puede resultar apropiada una dosis de entre 1.000.000 y 5.000.0000 células/kg. La normalización también puede llevarse a cabo basándose en la superficie corporal, expresada en metros cuadrados (m2). En algunas realizaciones, las dosis de entre aproximadamente 10.000 y 100.000.000 células/m2 pueden resultar apropiadas. En algunas realizaciones, pueden resultar apropiadas entre aproximadamente 100.000 y 10.000.000 células/m2. En otras realizaciones, puede resultar apropiada una dosis de entre 1.000.000 y 5.000.0000 células/m2. La normalización respecto al peso corporal del sujeto resulta particularmente útil al ajustar la dosis entre sujetos de tamaño claramente diferente, tal como ocurre al utilizar el fármaco tanto en niños como seres humanos adultos o al convertir una dosis eficaz en un sujeto no humano, tal como un perro, a una dosis adecuada para un sujeto humano.

Las células bacterianas se administran generalmente después del diagnóstico de una enfermedad o afección. En algunas realizaciones, la administración se inicia en las 24 horas siguientes a la infección, o dentro de los 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la infección. En algunas realizaciones, la administración se inicia por lo menos 24 horas después de la infección, o por lo menos 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la infección. En algunas realizaciones, la administración se inicia en cualquier momento antes o después de la infección y puede llevarse a cabo según se requiera.

La administración también puede iniciarse antes de producirse cualquier infección, o antes de diagnosticarse una infección, a modo de vacuna preventiva o prevención.

Terapias de combinación

En una realización, las células bacterianas dadas a conocer en la presente memoria pueden utilizarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales que se están utilizando y/o desarrollando para el tratamiento de infecciones.

En algunas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos adicionales pueden ser inhibidores de enzimas ciclooxigenasa (COX), tales como AINE, incluyendo 6MNA, aspirina, carprofeno, diclofenac, fenoprofeno, flufenamato, flubiprofeno, ibuprofeno, Indometacina, ketoprofeno, ketorolac, meclofenamato, ácido mefenámico, naproxeno, ácido niflúmico, piroxicam, sulfuro de sulindac, suprofeno, tenidap, tolmetina, tomoxiprol, zomepirac, celexocib, etodolac, meloxicam, nimesulida, fluorofosfato de diisopropilo, L745,337, NS398, rofecoxib, SC58125, ácido S-aminosalicílico, ampirona, diflunisal, nabumetona, paracetamol, resveratrol, salicina, salicilaldehído, salicilato sódico, sulfasalazina, sulindac, tamoxifeno, ticlopidina y salicilato de valerilo.

En algunas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos adicionales pueden ser agonistas de puntos de control inmunitario estimulatorios, tales como CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR y ICOS, o antagonistas de puntos de control inmunitario inhibitorios, tales como A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, TIM-3 y VISTA.

Entre los ejemplos no limitativos de uno o más agentes terapéuticos adicionales también se incluyen abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, amplígeno, arbidol, atazanavir, atripla, balavir, cidofovir, combivir, dolutegravir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, ecoliever, famciclovir, fomivirsén, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón de tipo III, interferón de tipo II, interferón de tipo I, interferón, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, nitazoxanida, análogos de nucleósido, norvir, oseltamivir (Tamiflu®), peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconarilo, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir y zidovudina.

En una realización, el agente terapéutico adicional es el interferón alfa.

En algunas realizaciones, entre los organismos gram-negativos se incluyen un polinucleótido que codifica una proteína no bacteriana, tal como, por ejemplo, antígenos específicos víricos o proteínas estimuladoras del sistema inmunitario. En algunas realizaciones, entre los organismos gram-negativos se incluyen un polinucleótido que codifica para un antígeno bacteriano, que puede derivar del mismo organismo bacteriano o de uno diferente, incluyendo organismos gram-positivos u otros patógenos. Tal como se utiliza en la presente memoria, un antígeno es cualquier molécula que puede ser reconocida mediante una respuesta inmunitaria, ya sea por un anticuerpo o ya sea por una célula inmunitaria.

Composiciones farmacéuticas, formas de administración y modos de administración

En la presente exposición se han descrito diversas composiciones que resultan adecuadas para el tratamiento de las enfermedades o afecciones. En una realización, se proporciona una composición o forma de administración que comprende una pluralidad de células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resulta una reducción de aproximadamente 90 % a 99 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) medida mediante el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL) en comparación con células bacterianas gram-negativas de tipo salvaje, no tratadas, en donde la actividad de endotoxina asociada a LPS total es equivalente a aproximadamente entre 0,7 ng y 7.000 ng de LPS activa, entre aproximadamente 7 ng y 7.000 ng de LPS activa, entre aproximadamente 7 ng y aproximadamente 1400 ng de LPS activa, o entre aproximadamente 70 ng y 1400 ng de lPs activa.

Las composiciones pueden utilizare como adyuvantes o modificadores de la respuesta biológica. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones «adyuvante» y «modificador de la respuesta biológica» se refieren a cualquier sustancia que potencia la respuesta inmunitaria a un antígeno. De esta manera, se utiliza un adyuvante o modificador de la respuesta biológica para estimular al sistema inmunitario a responder más vigorosamente a un antígeno foráneo o a un organismo causante de enfermedad o asociado a enfermedad. Sin embargo, en algunas realizaciones, están contempladas para la utilización en los métodos dados a conocer, formas recombinantes de bacterias gram-negativas que expresan, p. ej., proteínas víricas o proteínas de activación inmunitaria humanas, tales como citoquinas o quimioquinas. En una realización alternativa, se mezclan proteínas de activación inmunitaria purificadas, tales como citoquinas o quimioquinas, con los organismos gram-negativos antes de la administración, o se administran antes o después de los organismos gram-negativos.

En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables en la forma de administración presentan una reducción de por lo menos aproximadamente 70 % de la actividad de endotoxina asociada a LPS (p. ej., medida mediante el ensayo LAL) en comparación con bacterias de tipo salvaje no tratadas. En algunas realizaciones, la reducción es de por lo menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,98 %. En algunas realizaciones, la reducción no es superior a aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 %, 99,98 % o 99,99 %. En algunas realizaciones, la reducción es de entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 99,99 %, entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 99,99 %, entre aproximadamente 90 % y aproximadamente 99,5 % o 99 %, entre aproximadamente 91 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 92 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 93 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 96 %, entre aproximadamente 94,5 % y aproximadamente 95,5 %, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 95 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 96 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 97 % y aproximadamente 99,5 %, o de entre aproximadamente 98 % y aproximadamente 99,9 %, sin limitación.

En algunas realizaciones, las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables en la forma de administración presentan una reducción de por lo menos aproximadamente 70 % de la pirogenicidad (p. ej., medida mediante ensayo en conejosin vivo)en comparación con bacterias de tipo salvaje no tratadas. En algunas realizaciones, la reducción es de por lo menos aproximadamente 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,98 %. En algunas realizaciones, la reducción no es superior a aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 %, 99,98 % o 99,99 %. En algunas realizaciones, la reducción es de entre aproximadamente 70 % y aproximadamente 99,99 %, entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 99,99 %, entre aproximadamente 90 % y aproximadamente 99,5 % o 99 %, entre aproximadamente 91 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 92 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 93 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 96 %, entre aproximadamente 94,5 % y aproximadamente 95,5 %, entre aproximadamente 94 % y aproximadamente 97 %, entre aproximadamente 95 % y aproximadamente 98 %, entre aproximadamente 96 % y aproximadamente 99 %, entre aproximadamente 97 % y aproximadamente 99,5 %, o de entre aproximadamente 98 % y aproximadamente 99,9 %, sin limitación.

En algunas realizaciones, la reducción de la pirogenicidad no asociada a LPS es de por lo menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 % o 99,98 %, En algunas realizaciones, la reducción no es superior a por lo menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 %, 99,95 %, 99,98 % o 99,99 %.

En algunas realizaciones, la viabilidad de las bacterias sustancialmente no viables está reducida en por lo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o más.

En algunas realizaciones, la forma de administración incluye entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 1x1010 de tales células bacterianas En algunas realizaciones, la forma de administración incluye entre aproximadamente 100.000 y aproximadamente 1x108 de tales células bacterianas En algunas realizaciones, la forma de administración incluye entre aproximadamente 1000,000 y aproximadamente 1x107 de tales células bacterianas En algunas realizaciones, la forma de administración incluye entre aproximadamente 1x106y aproximadamente 1x108 de tales células bacterianas

En algunas realizaciones, la composición incluye, además, un segundo agente terapéutico/antivírico. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un AINE (fármaco antiinflamatorio no esteroideo). En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un inhibidor de ciclooxigenasa, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en 6MNA, aspirina, carprofeno, diclofenac, fenoprofeno, flufenamato, flubiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolac, meclofenamato, ácido mefenámico, naproxeno, ácido niflúmico, piroxicam, sulfuro de sulindac, suprofeno, tenidap, tolmetina, tomoxiprol, zomepirac, celexocib, etodolac, meloxicam, nimesulida, fluorofosfato de diisopropilo, L745,337, NS398, rofecoxib, SC58125, ácido S-aminosalicílico, ampirona, diflunisal, nabumetona, paracetamol, resveratrol, salicina, salicilaldehído, salicilato sódico, sulfasalazina, sulindac, tamoxifeno, ticlopidina, salicilato de valerilo y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un agonista de un punto de control inmunitario estimulatorio preferentemente seleccionado del grupo que consiste en CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR e ICOS. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un antagonista de un punto de control inmunitario inhibitorio preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, TIM-3 y VISTA.

En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, amplígeno, arbidol, atazanavir, atripla, balavir, cidofovir, combivir, dolutegravir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, ecoliever, famciclovir, fomivirsén, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón de tipo III, interferón de tipo II, interferón de tipo I, interferón, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, nitazoxanida, análogos de nucleósido, norvir, oseltamivir (Tamiflu®), peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconarilo, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es el interferón alfa.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden formularse en una variedad de modos en los métodos descritos en la presente memoria. En una realización, la composición comprende los organismos indicados en toda la memoria y un portador farmacéuticamente aceptable.

La expresión «portadores farmacéuticamente aceptables» se refiere a cualesquiera diluyentes, excipientes o portadores que pueden utilizarse en las composiciones. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de magnesio, sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, crioconservadores, tales como trehalosa y manitol, y lanolina. Se describen portadores farmacéuticos adecuados en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, una obra de referencia estándar en este campo.

Las composiciones se formulan para la administración farmacéutica en un mamífero, preferentemente en un ser humano. Dichas composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en una variedad de modos, incluyendo por vía parenteral. El término «parenteral» tal como se utiliza en la presente memoria incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal.

Las formas inyectables estériles de las composiciones pueden ser una suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse según técnicas conocidas utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden utilizarse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, pueden utilizarse convencionalmente aceites fijos estériles como solvente o medio de suspensión. Con este fin puede utilizarse cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados glicéridos, resultan útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en las versiones polioxietiladas de los mismos. Dichas soluciones o suspensiones oleaginosas pueden contener, además, un diluyente o dispersante alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares utilizados comúnmente en la formulación de formas de administración farmacéuticamente aceptables, incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros surfactantes utilizados comúnmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o intensificadores de biodisponibilidad que se utilizan comúnmente en la preparación de formas de administración sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables también pueden ser utilizados para los fines de la formulación. Las composiciones pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, tal como mediante inyección de bolo o infusión continua.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en monodosis o en múltiples dosis. La composición farmacéutica puede administrarse mediante diversos métodos, incluyendo, por ejemplo, las vías rectal, bucal, intranasal y transdérmica. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica puede administrarse mediante inyección intraarterial, por vía intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular o subcutánea.

Un modo de administración es el modo parenteral, por ejemplo mediante inyección. Entre las formas en las que las composiciones farmacéuticas indicadas en la presente memoria pueden incorporarse para la administración mediante inyección se incluyen, por ejemplo, las suspensiones acuosas o aceitosas, o las emulsiones, con aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón o aceite de cacahuete, así como elixires, manitol, dextrosa o solución acuosa estéril y vehículos farmacéuticos similares.

Entre algunos ejemplos de excipientes adecuados se incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, trehalosa, almidones, goma acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, jarabe y metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir además agentes lubricantes, tales como talco, estearato de magnesio y aceite mineral, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservantes, tales como metil- y propilhidroxi-benzoatos, agentes edulcorantes y agentes saborizantes.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se incluyen para demostrar realizaciones específicas de la exposición. El experto en la materia apreciará que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos siguientes representan técnicas que funcionan bien en la práctica de la exposición y que, de esta manera, puede considerarse que constituyen modos específicos para la práctica de la misma. Sin embargo, el experto en la materia apreciará, a la luz de la presente exposición, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y todavía conseguir un resultado igual o similar sin apartarse del alcance de al exposición.

Ejemplo 1. Caracterización de la eficacia preclínica de un agonista de múltiples receptores de tipo Toll (TLR)

El presente ejemplo somete a ensayo la hipótesis de que una reducción significativa sin la eliminación completa de la actividad de LPS, junto con la eliminación y estabilización de las bacterias gram-negativas no patogénicas puede producir un producto de múltiples TLR que puede inducir con seguridad y eficacia respuestas inmunitarias antitumorales mediante la administración i.v.

Se trataronE. coligram-negativas no patogénicas con polimixina B y glutaraldehído bajo condiciones para matar y estabilizar las células, produciendo una reducción >90 % de la actividad de endotoxinas LPS y de la pirogenicidad («bacterias tratadas», también denominadas «bacterias señuelo», o simplemente «señuelo»). La actividad de endotoxinas y la pirogenicidad se cuantificaron utilizando los ensayos de lisado de amebocitos deLimulusein vivoen conejos. Se evaluó la integridad bacteriana mediante microscopía electrónica y óptica. Se determinó la actividad antitumoral utilizando modelos tumorales singénicos y de xenoinjerto estándares.

Las bacterias tratadas mostraron una reducción de 3 veces de la toxicidadin vivoaguda respecto a las bacterias no tratadas. Inesperadamente, la inducción de la secreción de citoquinas antitumorales por células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) humanas no se vio comprometida respecto a las bacterias no tratadas. El tratamiento con las bacterias tratadas (i.v.) produjo una actividad antitumoral de agente único significativa contra el carcinoma colorrectal murino ortotópico y el carcinoma pancreático murino metastásico.

Se observó una actividad en combinación sinérgica, incluyendo la erradicación de los tumores establecidos, con un índice terapéutico de hasta 10 veces, en combinación con IL-2 o dosis bajas de ciclofosfamida (LDC) en modelos de carcinoma colorrectal murino, con LDC en un modelo de linfoma no de Hodgkin (LNH) murino subcutáneo (s.c.) y con LDC más rituximab en un modelo de LNH humano s.c. También se observó actividad antitumoral sinérgica en combinación con una dosis baja de fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) en un modelo de carcinoma pancreático murino metastásico. Además, se observaron erradicaciones tumorales en combinación con AINE y resultaron potenciadas por la adición de terapia anti-PD1 en un modelo de carcinoma hepatocelular murino s.c. Se mostró que la erradicación tumoral óptica (80 % a 100 %) estaba mediada por células T asesinas naturales (NK), CD4+ y CD8+. Se demostró memoria inmunitaria (80 % a 100 % y parcial), determinada por el rechazo del posterior reto tumoral, tanto en un contexto inmunocompetente como en un contexto de inmunidad solo innata, respectivamente.

Ejemplo 2. Inducción de la secreción de citoquinas por bacterias tratadas

El presente ejemplo examinó la capacidad de las bacterias tratadas de inducir la secreción de citoquinas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana.

Se trataronE. coligram-negativas no patogénicas con polimixina B y glutaraldehído bajo condiciones para matar y estabilizar las células, produciendo una reducción >90 % de la actividad de endotoxinas LPS y pirogenicidad («bacterias tratadas», «bacterias señuelo», o simplemente «señuelo»), ver el Ejemplo 1 y la patente US n.° 9.265.804 B2). La actividad de endotoxinas y la pirogenicidad se cuantificaron utilizando los ensayos de lisado de amebocitos deLimulusein vivoen conejos. Se evaluó la integridad bacteriana mediante microscopía óptica después de la tinción gram.

Se incubaron incrementos de diez veces de 1x10 a 1x108 bacterias no tratadas o tratadas, con 2,5x105 células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana en medio de cultivo RPMI que contenía glutamina 2,5 mM, suero humano al 10 % y penicilina y estreptomicina al 1 %, a 37 °C con 5 % de CO<2>, durante 48 horas. Se recolectaron los sobrenadantes mediante la centrifugación de las placas a 1.000 rpm durante 10 minutos y se almacenaron a -80 °C. Se llevó a cabo un análisis Luminex de los niveles de citoquinas con paneles de citoquinas/quimioquinas humanas en perlas magnéticas HCYTOMAG-60K y HSTCMAG-28SK. Los niveles de citoquinas se interpolaron a partir de una curva patrón utilizando un análisis de regresión no lineal de 5 puntos ajustada con la ecuación = (A+((B-A)/(1+(((B-E)/(E-A))*((x/C)AD))))). Los datos interpolados se normalizaron respecto al control de vehículo o a un control no estimulado, y se analizaron. Se aislaron las PBMC a partir de paquetes de leucaféresis de sangre periférica normal (ALLCells, Alameda, CA) utilizando un gradiente de Ficoll (Ficoll-Paque PLUS, n.° de cat. 17-144-02, densidad: 1,077+/-0,001 g/ml de GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). El vehículo de las bacterias era solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) sin calcio y MgCh 2 mM.

Los resultados presentados son los niveles máximos determinados para cada citoquina utilizando la misma dosis bacteriana no tratada o tratada. Las bacterias tratadas contenían 4,94 % más LPS que las bacterias no tratadas por bacteria individual, medido mediante el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL)in vitro.

Tabla 1. Nivel de citoquinas de PBMC inducidas por bacterias tratadas

Se compararon las actividades de las bacterias tratadas con unos cuantos agonistas de receptor de tipo Toll (TLRa) y LPS aislado. El experimento se llevó a cabo tal como se ha descrito para la Tabla 1. Se obtuvieron agonistas de receptor de tipo Toll (TLRa) de InvivoGen (San Diego, CA) y se titularon en el experimento del modo siguiente: ODN CpG 2006 (n.° tlrl-2006, 0,005 a 5 micromolar), Poly(I:C) (n.° tlrl-pic, 0,001 a 100 microgramos/ml), R848 (n.° tlrl-r848, 0,1 a 100 microgramos/ml) yE. coliLPS (n.° tlrl-pb5lps, 10 a 1*106 picogramos/ml). Se prepararon soluciones madre de agonista de TLR siguiendo las recomendaciones del fabricante a sus límites recomendados de solubilidad y los resultados son los niveles máximos de citoquinas determinados para cada TLRa y las bacterias tratadas. Se presentan los resultados en la Tabla 2, a continuación.

Tabla 2. Inducción de citoquinas en comparación con agonistas de TLR individuales.

Ejemplo 3. Ensayos animales de tratamiento de infección vírica con bacterias tratadas.

El presente ejemplo somete a ensayo las bacterias tratadas, que pueden prepararse tal como se muestra en los Ejemplos 1 y 2 para su actividad en el tratamiento de infecciones víricas en animales.

Los modelos animales de infección de hepatitis B (VHB) utilizados en el presente ejemplo pueden ser cualquiera de los siguientes: el modelo de inyección hidrodinámica, el modelo FVB/N, el modelo de administración de adenovirus, el modelo de virus adenoasociado, el modelo de infección por virus de la hepatitis Woodchuck, el modelo de chimpancé, el modelo Tupaia, el modelo de ratón transgénico para VHB, el modelo VHB-Trimera y el modelo de hígado humanoquimérico. También pueden utilizarse modelos animales de VIH adecuados para someter a ensayo la actividad de las bacterias tratadas en la prevención o el tratamiento de la infección por VIH.

Las formulaciones de bacterias tratadas, con una cantidad total de actividad de LPS medida mediante ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LAL)in vitroen diferentes intervalos, se administran en animales infectados por un virus o que expresan genes víricos. En algunos animales, se utilizan en forma de una terapia de combinación agentes adicionales inmunoestimuladores o antivíricos. Los animales que no recibieron los tratamientos y los animales tratados con otros agentes inmunoestimuladores o antivíricos se utilizaron como control. Se encuentra contemplado que las bacterias tratadas muestran actividades antivíricas eficaces en estos modelos animales.

Ejemplo 4. Inhibición del VHB en ratones.

El virus adenoasociado/virus de la hepatitis B (VAA/VHB) es un VAA recombinante que porta un genoma de VHB humano replicable. Aprovechando las características altamente hepatotrópicas del v Aa de genotipo 8, puede direccionarse eficientemente el genoma de VHB humano a las células hepáticas de ratón. La infección de ratones inmunocompetentes con VAA/VHB puede resultar en viremia de VHB a largo plazo, incluyendo la liberación de viriones de VHB humano, HBsAg y HBeAg en la sangre, lo que imita la infección crónica por el VHB en los pacientes. Puede utilizarse el modelo de VAA/VHB para evaluar la actividadin vivode diversos tipos de agentes anti-VHB. Además, este es un modelo adecuado para la evaluación de moduladores inmunitarios (ver, por ejemplo, Huang et al., Int. J. Onc. v39, páginas 1511-1519, 2011).

rAAV8-1.3HBV, genotipo D, fue adquirido del Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute (número de lote A2018092406). La solución madre vírica de 1*1012 genomas víricos (g.v.)/ml se diluyó a 5*1011 g.v./ml con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) y 1*1011 g.v. Se inyectó VAA/VHB en 200 pl en cada ratón C57BL/6 macho de 5 semanas de edad 31 días antes del inicio de la administración (día -31).

Se recogieron muestras de sangre (~100 pl) en tubos recubiertos con K2-EDTA mediante sangrado submandibular los días -17, -7 y -4. Las muestras se centrifugaron a 7.000 g (4 °C) durante 10 minutos para recoger el plasma. Se prepararon por lo menos 40 pl de muestras de plasma para determinar el nivel de ADN del VHB mediante qPCR, y los niveles de antígeno HBs (HBsAg) y de antígeno HBe (HBeAg) mediante ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés). Las muestras de plasma restantes se almacenaron a -80 °C hasta los ensayos postmórtem. Basándose en los niveles plasmáticos de ADN de VHB, HBsAg, HBeAg y pesos corporales los días -17, -7 y -4, los ratones con niveles de infección vírica cualificados fueron seleccionados y divididos aleatoriamente en 7 grupos de 5 ratones cada uno el día -1. Todos los ratones fueron uniformemente distribuidos en cada grupo, para garantizar que no existían diferencias significativas entre cada grupo en términos de niveles de ADN de VHB, HBsAg, HBeAg y peso corporal el día -4.

Se prepararon bacterias señuelo tal como se ha descrito en el Ejemplo 1 y en la patente US n.° 9.265.804 B2, con un intervalo de actividades de LPS-endotoxina de aproximadamente 2.000 a 6.000 unidades de endotoxina (UE) o aproximadamente 250 a 750 ng de LPS por cada 109 células bacterianas muertas. Los grupos animales eran: no tratados, tratados con entecavir (ETV) a una dosis oral (p.o.) de 0,005 mg/kg diariamente los días 0 a 34, señuelo a una dosis de 2x108 bacterias muertas por cada ratón administrado en la vena de la cola i.v. los días 1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29 y 30, o ETV y señuelo. Se obtuvieron muestras de plasma semanalmente y se analizaron para ADN-VHB, HBsAg y HBeAg tal como se ha descrito anteriormente. Se compararon los niveles de ADN de VHB (copias), HBsAg y HBeAg en los ratones de los grupos tratados con los niveles en el grupo de no tratamiento en cada punto temporal comparable mediante análisis estadístico de Mann-Whitney no paramétrico no emparejado.

La figura 1 demuestra que el tratamiento de referencia (TR) inhibió significativamente la producción de ADN de VHB en 3 días desde el inicio de la administración, reduciendo el nivel plasmático en 5/5 ratones hasta el límite inferior de cuantificación (120 copias/pl de plasma) el día 28 de administración diaria (día 59 después de la infección) (figura 1B). El señuelo también inhibió significativamente la producción de VHB, reduciendo el nivel plasmático en 3/5 ratones hasta el límite inferior de cuantificación el día 28 de administración dos veces a la semana (día 59 después de la infección) (figura 1C). La inhibición del ADN VHB mediante ETV+señuelo fue similar a la de ETV solo, demostrando que no se produjo ninguna interacción antagonista hasta este punto de la administración de compuesto (figura 1D).

No se observó inhibición de la producción de HBsAg o HBeAg con el ETV. Sin embargo, se encontró que el señuelo había inhibido la producción de HBeAg llegado el día 28 de administración (día 59 después de la infección) (figura 2).

Por lo tanto, el presente ejemplo demuestra que, al igual que con el tratamiento de referencia (ETV), las bacterias señuelo también pueden inhibir significativamente la replicación del VHB, aunque las bacterias señuelo requirieron más tiempos para mostrar actividad inhibidora, lo que concuerda con la base inmunitaria del mecanismo de acción del señuelo. Sin embargo, al contrario que el ETV, que solo inhibió el mecanismo de producción de ADN del VHB, las bacterias señuelo presentan la ventaja de inhibir también la producción del antígeno HBe.

Ejemplo 5. Inhibición del VHB a largo plazo

El presente ejemplo se llevó a cabo con el fin de determinar si un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) podría potenciar la actividad antivírica de las bacterias señuelo, en el caso de que la actividad antivírica del señuelo se perdiese después de interrumpirse el tratamiento, y los potenciales efectos tóxicos del ETV, el señuelo y el tratamiento ETV señuelo. El experimento se llevó a cabo tal como se ha descrito en el Ejemplo 4, excepto en que el virus VAA/VHB se inyectó el día -29 respecto al inicio de la administración. Se determinaron los niveles de ADN-VHB, HBsAg y HBeAg en plasma los días -15, -8 y -1 respecto al inicio de la administración el día 0 y se incrementó la dosis de ETV a 0,1 mg/kg. Además, todos los grupos representados en las figuras 3, 4, 5 y 6 recibieron la administración de indometacina (AINE) diariamente (10 |jg/ml en agua de bebida). La administración se llevó a cabo durante 5 semanas, tal como en el Ejemplo 4, determinando semanalmente los niveles plasmáticos de ADN-VHB, HBsAg y HBeAg, así como cada dos semanas durante 27 semanas tras interrumpirse el tratamiento. Se determinó la actividad inhibidora mediante comparación de los grupos tratados en cada punto temporal con el grupo de control (solo indometacina) en el mismo punto temporal, mediante análisis estadístico de Mann-Whitney no paramétrico no emparejado.

Tras el sacrificio, el hígado de cada ratón se dividió en múltiples secciones, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la recolección y se almacenó a -80 °C. Se utilizaron las secciones de hígado para la detección del ADN del VHB y se fijaron secciones adicionales de cada hígado de ratón en formalina tamponada neutra (NBF, por sus siglas en inglés) al 10 % durante aproximadamente 24 horas y después se transfirieron para la deshidratación rutinaria e inclusión en parafina. Los bloques de parafina se seccionaron para la tinción de hematoxilinaeosina (H+E) y análisis patológico, así como para el análisis inmunohistoquímico (IHQ) para HBsAg y HBcAg.

La figura 3A demuestra que la indometacina por sí sola no inhibió la producción de ADN del VHB. Por el contrario, la figura 3 (B, C y D) demuestra que ETV, señuelo o ETV+señuelo inhibió la producción del ADN del VHB, en la presencia de indometacina, de una manera similar a la observada en ausencia de indometacina (figura 1). No se observó pérdida de peso corporal con el tratamiento de ETV. Se observó una pérdida transitoria de peso corporal de 6 % durante la 1a semana de tratamiento con señuelo (± ETV), 1,3 % (sin ETV) y 3,4 % (+ETV) durante un día durante la 2a semana de tratamiento con señuelo, 0,8 % (sin ETV) y 2,0 % (+ETV) durante un día durante la tercera semana de tratamiento y no se observó ninguna pérdida de peso corporal durante la cuarta y quinta semanas de tratamiento con señuelo (± ETV).

La inhibición estadísticamente significativa del ADN del VHB se había perdido en el momento del sacrificio (día 253), 27 semanas después de interrumpirse el tratamiento de ETV (figura 3B), aunque la inhibición se mantuvo estadísticamente significativa el día 253 en los grupos de señuelo (figura 3C) y señuelo+ETV (figura 3D). Lo anterior demuestra que el señuelo presenta un efecto inhibitorio de mayor duración que el ETV.

La indometacina+ETV no inhibieron HBsAg HBeAg en comparación con la indometacina sola (figuras 4A, B y 5A, B). Sin embargo, la adición de señuelo (es decir, indometacina+señuelo o indometacina+señuelo+ETV) inhibió la producción de HBsAg y HBeAg respecto a la indometacina sola (figuras 4A, C, D y 5A, C, D). Debido a que ni el señuelo solo, ni la indometacina sola inhibieron la producción de HBsAg, estos resultados demuestran que hay una interacción sinérgica entre señuelo e indometacina con respecto a la inhibición de HBsAg.

La figura 6 demuestra que, en la presencia de indometacina, el señuelo o señuelo+ETV, pero no ETV solo, inhibían la expresión de HBeAg en los hígados de ratones 27 semanas después de la interrupción del tratamiento. La figura 7 representa el análisis IHG de la expresión de HBcAg en hígado de ratones tratados con vehículo de señuelo (es decir, tampón solo utilizado en la composición de señuelo) y ratones tratados con compuesto. La combinación de indometacina y señuelo, nuevamente, redujeron la expresión de HBcAg en 2 de 5 ratones, respecto a la indometacina sola, y la combinación de indometacina, señuelo y ETV redujo la expresión de HbcAg en 5 de 5 ratones respecto al tratamiento con indometacina+ETV o con indometacina+señuelo.

El presente ejemplo demuestra que los AINE, tales como la indometacina, no son capaces de inhibir el VHB, pero puede potenciar significativamente la actividad antivírica de las bacterias señuelo de una manera sinérgica. En comparación con el tratamiento de referencia, ETV, las bacterias señuelo mostraron efectos del tratamiento más prolongados y más sostenidos. La combinación de señuelo y ETV también resultó en una mejora significativa respecto a cada tratamiento por sí solo, en particular, con respecto a la observación a largo plazo después de interrumpirse el tratamiento.

Ejemplo 6. Inhibición de la infección por VIH.

Con el fin de examinar el potencial de las bacterias señuelo de inhibir la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)in vivo,se reconstituyó un sistema inmunitario humano en ratones hembra inmunodeficientes NOD/Shiscid/IL-2Rynull-specific (NCG) (Charles River) con células madre hematopoyéticas aisladas a partir de sangre de cordón humano. Se realizó un injerto en los ratones con células madre hematopoyéticas CD34+ derivadas de sangre del cordón y células progenitoras (French Blood Institute) tras un tratamiento mieloablativo químico (Manfroi et al., Can. Res. v77, páginas 1097-11072017). La injertación consistió en la inyección intravenosa de 105 células CD34+. Se realizó un seguimiento del nivel de injertación mediante el análisis de las células CD45+ humanas en el total de leucocitos sanguíneos mediante citometría de flujo.

Tras 14 semanas de injertación, los ratones-hu cualificados se inocularon con 80 ng de VIH-1 (NL4-3 HIV1/Clado B; virus con tropismo X4) mediante inyección i.p. Se determinó la viremia en plasma en la semana 5 mediante qRT-PCR. Otros métodos utilizados fueron los descritos en Wenzel et al., J. Virol. Doi: 10. 1 128/JVI.00907-19 (manuscrito aceptado enviado por internet el 2 de agosto de 2019). En el experimento solo se utilizaron ratones VIH con una carga vírica superior a 104 copias/ml. En la semana 5, los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos basándose en su tasa de humanización, carga de VIH y porcentaje de células T CD4+ en sangre.

Los grupos se trataron con vehículo de señuelo i.v. dos veces a la semana durante 5 semanas, terapia antiretrovírica altamente activa (HAART, por sus siglas en inglés, o triterapia), que consistió en 2,4 mg de lamivudina, 2,35 mg de tenofovir disproxilo y 19,2 mg de raltegravir cada día en pellets de alimento durante 6 semanas, o bacterias muertas de señuelo (preparadas tal como se ha descrito en el Ejemplo 4), 6x107 i.v. (vena de la cola) dos veces a la semana durante 5 semanas.

Se recogió sangre (100 j l) cada dos semanas del seno retroorbital en tubos recubiertos con EDTA. Se separó el plasma de las células mediante centrifugación y se incubó durante 30 min a 56 °C para inactivar el VIH previamente a la congelación a -80 °C. Se extrajeron los ARN víricos a partir de 40 j l de plasma inactivado congelado utilizando un dispositivo de purificación de ácidos nucleicos automatizado (Arrow, NorDiag) y un kit de extracción de ARN vírico (DiaSorin, n.° 12-08-02). Se determinó la carga vírica plasmática de VIH mediante qRT-PCR utilizando el kit «Generic HIV Charge Virale» (Biocentric, n.° TR001-440IC, lote 0089/08A). Se fijó el límite de sensibilidad en 1000 copias/ml. Los valores inferiores a dicho umbral se consideraron no detectados. Se determinó la actividad inhibidora mediante comparación de los grupos tratados en cada punto temporal con el grupo de vehículo en el mismo punto temporal, mediante análisis estadístico de Mann-Whitney no paramétrico no emparejado. Los símbolos de asterisco denotan una inhibición estadísticamente significativa.

La figura 8 demuestra que la terapia HAART inhibió los niveles sanguíneos de VIH dos semanas después de iniciar el tratamiento y posteriormente durante tres semanas después de interrumpir el tratamiento (figura 8B). Las bacterias señuelo no inhibieron los niveles de VIH durante el tratamiento, aunque se observó inhibición a partir de las cuatro semanas después de interrumpir el tratamiento, durando once semanas, con la excepción de la semana 19 (figura 8C). La respuesta inhibitoria retardada sugiere que las bacterias señuelo fueron capaces de inducir una respuesta inmunitaria contra la infección por el VIH. Se observó una muerte de ratón en cada grupo: en el grupo de vehículo de señuelo y en el grupo tratado con HAART. No se observaron muertes en el grupo tratado con señuelo.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto habitual en la materia a la que se refiere la presente invención.

La invención descrita ilustrativamente en la presente memoria puede ponerse en práctica convenientemente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no dadas a conocer específicamente en la presente memoria. De esta manera, por ejemplo, los términos "comprende", "incluye", "contiene", etc., deben interpretarse en sentido amplio y sin limitación. Además, los términos y expresiones utilizados en la presente memoria se han utilizado como términos descriptivos y no limitativos, y no hay intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas, o partes de las mismas, sino que se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro de la invención reivindicada.

De esta manera, debe entenderse que, aunque la presente invención no se ha dado a conocer específicamente mediante realizaciones preferentes y características opcionales, el experto en la materia podrá recurrir a la modificación, mejora y variación de la invención realizada en los mismos, y que dichas modificaciones, mejoras y variaciones se considera que están comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Los materiales, métodos y ejemplos proporcionados en la presente memoria son representativos de las realizaciones preferentes, se proporcionan a modo de ejemplo y no pretenden ser limitativos del alcance de la invención.

La invención ha sido descrita en términos amplios y genéricos en la presente memoria. Cada uno de los grupos más estrechos de especie y subgénero comprendidos dentro de la exposición genérica también forman parte de la invención. Lo anterior incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimina cualquier material del género, con independencia de si el material eliminado se indica específicamente en la presente memoria.

Además, en donde se describen características o aspecto de la invención en términos de grupos de Markush, el experto en la materia reconocerá que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

Debe entenderse que, aunque la exposición ha sido descrita junto con las realizaciones anteriores, la descripción y ejemplos anteriormente proporcionados pretenden ser ilustrativos y no limitativos del alcance de la exposición. Otros aspectos, ventajas y modificaciones comprendidos en el alcance de la exposición resultarán evidentes para el experto en la materia a la que se refiere la exposición.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   i.Composición para la utilización en la prevención o el tratamiento de una infección vírica, en donde la composición comprende una pluralidad de células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables que han sido tratadas de manera que resultan en una reducción de aproximadamente 75 % a 99 % de la actividad de endotoxinas asociadas a lipopolisacáridos (LPS) medida mediante el ensayo de lisado de amebocitos deLimulus(LALA) en comparación con células bacterianas gram-negativas de tipo salvaje, no tratadas, en donde las células bacterianas son células deSalmonellaoEscherichia,y en donde el tratamiento es con polimixina a una temperatura de entre aproximadamente 2 °C y aproximadamente 10 °C y con glutaraldehído.
2. 2. Composición para la utilización según la reivindicación 1, en donde la composición contiene entre aproximadamente 0,01 y 100 ng, preferentemente entre aproximadamente 0,02 y 20 ng, más preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 10 ng, de LPS activo por kg de peso corporal del paciente.
3. 3. Composición para la utilización según la reivindicación 1 o 2, en la que la composición contiene entre aproximadamente 2 y 200 ng, preferentemente entre aproximadamente 10 y 120 ng, más preferentemente entre aproximadamente 20 y 100 ng, de LPC activo por cada 1x108 células.
4. 4. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las células bacterianas gram-negativas intactas y sustancialmente no viables han sido tratadas de manera que resultan en una reducción de entre aproximadamente 85 % y 98 %, preferentemente de entre aproximadamente 90 % y 98 %, de las endotoxinas asociadas a LPS.
5. 5. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la infección vírica es por el virus de la hepatitis B (VHB) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
6. 6. Composición para la utilización según la reivindicación 5, en donde la composición comprende, además, un segundo agente terapéutico.
7. 7. Composición para la utilización según la reivindicación 6, en donde el segundo agente terapéutico es un inhibidor de ciclooxigenasa, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en 6MNA, aspirina, carprofeno, diclofenac, fenoprofeno, flufenamato, flubiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, ketorolac, meclofenamato, ácido mefenámico, naproxeno, ácido niflúmico, piroxicam, sulfuro de sulindac, suprofeno, tenidap, tolmetina, tomoxiprol, zomepirac, celexocib, etodolac, meloxicam, nimesulida, fluorofosfato de diisopropilo, L745,337, NS398, rofecoxib, SC58125, ácido S-aminosalicílico, ampirona, diflunisal, nabumetona, paracetamol, resveratrol, salicina, salicilaldehído, salicilato sódico, sulfasalazina, sulindac, tamoxifeno, ticlopidina, salicilato de valerilo y combinaciones de los mismos.
8. 8. Composición para la utilización según la reivindicación 6, en donde el segundo agente terapéutico es un agonista de un punto de control inmunitario estimulatorio preferentemente seleccionado del grupo que consiste en CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR e ICOS, es un antagonista de punto de control inmunitario inhibitorio preferentemente seleccionado del grupo que consiste en A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3,<p>D-1, PD-L1, TIM-3 y VISTA, se selecciona del grupo que consiste en abacavir, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, amplígeno, arbidol, atazanavir, atripla, balavir, cidofovir, combivir, dolutegravir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtide, entecavir, ecoliever, famciclovir, fomivirsén, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, inhibidor de integrasa, interferón de tipo III, interferón de tipo II, interferón de tipo I, interferón, lamivudina, lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, nitazoxanida, análogos de nucleósido, norvir, oseltamivir (Tamiflu®), peginterferón alfa-2a, penciclovir, peramivir, pleconarilo, podofilotoxina, inhibidor de proteasa, raltegravir, ribavirina, rimantadina, ritonavir, piramidina, saquinavir, sofosbuvir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tenofovir disoproxilo, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina, zalcitabina, zanamivir, zidovudina y combinaciones de los mismos, o es interferón alfa o interferón pegilado.
9. 9. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las células bacterianas gram-negativas comprenden un polinucleótido integrado o exógeno codificante de un antígeno específico de patógeno o una proteína estimuladora del sistema inmunitario.
10. 10. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde por lo menos 90 %, 95 % o 100 % de las células bacterianas son no viables.
11. 11.Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la polimixina es polimixina B o polimixina E, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 4 °C.
12. 12.Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el tratamiento es con polimixina B en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 3 pg/ml y aproximadamente 1.000 pg/ml y con glutaraldehído en un intervalo de dosis de entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 1,0 %.