ES2981438T3 - Novedosos antígenos proteicos de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana expresados en mamíferos - Google Patents

Abstract

Varias realizaciones de la invención se refieren a polipéptidos que comprenden de 1 a 10 o más epítopos de la proteína de la envoltura del VIH y una proteína de fusión, en donde el polipéptido carece del dominio transmembrana de la proteína gp41 del VIH. Dichos polipéptidos pueden expresarse en células de mamíferos, tales como células humanas, para producir, por ejemplo, polipéptidos que son útiles para desarrollar nuevos anticuerpos anti-VIH. Los polipéptidos descritos en este documento y los nuevos anticuerpos desarrollados a partir de ellos son generalmente útiles para diagnósticos médicos, y también pueden ser útiles en el tratamiento profiláctico y terapéutico del VIH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Novedosos antígenos proteicos de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana expresados en mamíferos

La presente solicitud se presenta junto con un Listado de Secuencias electrónico como archivo de texto ASCII a través de EFS-Web. El Listado de Secuencia electrónico se proporciona como un archivo titulado SEQLIST1800393.txt, creado y guardado por última vez el 15 de noviembre de 2018, que tiene un tamaño de 501,813 bytes. La información en el Listado de Secuencias Electrónico se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Campo

La presente divulgación se refiere al campo de las proteínas recombinantes. Algunas realizaciones de la presente divulgación se refieren a polipéptidos recombinantes de la envoltura del VIH que comprenden al menos un epítopo de las proteínas gp120 y gp41 del VIH y una proteína de fusión. La presente divulgación también se refiere a métodos y dispositivos para ensayar una muestra que contiene anticuerpos del VIH.

Antecedentes

El VIH causó una epidemia mundial que provocó la muerte de unos 35 millones de personas debido a enfermedades relacionadas con el SIDA. Se calculó que en 2016 se produjeron unos 1.8 millones de nuevos casos de VIH y que aproximadamente 36.7 millones de personas en todo el mundo están infectadas. El VIH es un miembro de la familia de los retrovirus del subgrupo de lentivirus y tiene dos tipos descritos: VIH-1 y VIH-2. El VIH-1 es más infeccioso y virulento que el VIH-2, y provoca la mayoría de las infecciones por VIH en todo el mundo.

Cada virión del VIH contiene dos copias de ARN que codifican nueve genes y diecinueve proteínas. Las únicas proteínas sobre la superficie de un virión intacto son las glicoproteínas de envoltura codificadas por el genenv.El producto del genenves una proteína precursora de aproximadamente 850 aminoácidos llamada gp160. Esta proteína es escindida por la proteasa celular furina en el retículo endoplásmico en dos productos de escisión gp120 y gp41. Tanto la gp120 como la gp41 existen como trímeros sobre la superficie celular para formar un heterodímero “pico”. La gp41 es una glicoproteína transmembrana que actúa como un ancla para la gp120 extracelular, a la que está unida de forma no covalente. La gp120 contiene sitios de unión para los receptores celulares de los linfocitos y es fundamental para la entrada del virus en las células.

Como únicas proteínas sobre la superficie del virión, la gp120 y la gp41 exponen una serie de epítopos inmunodominantes a los que se dirige el sistema inmunitario del huésped. Las versiones de estas proteínas se han utilizado históricamente en inmunoensayos para capturar y detectar anticuerpos montados contra ellas como confirmación de la infección por VIH.

La gp120 y la gp41 son útiles en vacunaciones, en ensayos de diagnóstico y en el desarrollo de ensayos de diagnóstico. Las gp120 y gp41 recombinantes se producen normalmente en levadura, pero la producción de gp120 y gp41 en levadura es un reto porque las proteínas se pueden plegar de forma incorrecta, agregar y/o acumular modificaciones postraduccionales aberrantes. Adicionalmente, la purificación de gp120 y gp41 a partir de levadura presenta un arduo proceso de múltiples etapas. Por lo tanto, son deseables composiciones y métodos mejorados para producir antígenos gp120 y gp41.

Resumen

La invención se define mediante las Reivindicaciones adjuntas.

La invención se refiere a un polipéptido monomérico recombinante, que comprende un péptido líder, y una proteína de fusión, que comprende al menos un epítopo de la proteína gp120 del VIH, y al menos un epítopo de la proteína gp41 del VIH; en la que la proteína de fusión comprende una región que no está codificada por el VIH, dicha región seleccionada del grupo que consiste en un dominio Fc de un anticuerpo que carece de una región bisagra, y en la que el polipéptido recombinante carece de un dominio de transmembrana, y en la que el polipéptido incluye al menos 4 epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

Un polipéptido recombinante de acuerdo con la presente invención carece de un dominio de transmembrana, dicho dominio de transmembrana tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, o SEQ ID NO:72.

Un polipéptido recombinante de acuerdo con la presente invención puede comprender una pluralidad de epítopos de la proteína de la envoltura del VIH. En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos. En algunas realizaciones, cada epítopo está conectado a otro epítopo por un ligador, cuya secuencia de aminoácidos no está codificada por el VIH. En algunas realizaciones, el ligador que conecta cada epítopo a otro epítopo comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:110 o SEQ ID NO:111.

Un polipéptido puede comprender una pluralidad de epítopos de la proteína de la envoltura del VIH, en la que cada epítopo de la pluralidad de epítopos está conectado a otro epítopo de la pluralidad de epítopos por una secuencia de aminoácidos que no está codificada por el VIH. Por ejemplo, cada epítopo de la pluralidad de epítopos puede estar conectado a otro epítopo de la pluralidad de epítopos mediante un ligador. En algunas realizaciones, cada epítopo de la pluralidad de epítopos puede estar conectado a otro epítopo de la pluralidad de epítopos mediante un ligador, por ejemplo, en el que cada ligador comprende una hélice alfa o una cadena beta. Una pluralidad de epítopos puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos. Un polipéptido que comprende una pluralidad de epítopos puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:22, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, o SEQ ID NO:22.

Un polipéptido puede comprender uno o más epítopos de la proteína gp120 del VIH y uno o más epítopos de la proteína gp41 del VIH.

En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, o SEQ ID NO:106, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105, o SEQ ID NO:106.

En todas las realizaciones, la proteína de fusión del polipéptido recombinante comprende un dominio Fc de anticuerpo. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende un dominio Fc de anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID. NO: 77, o SEQ ID. NO: 80.

En todas las realizaciones, el dominio Fc del anticuerpo de la proteína de fusión carece de un dominio de oligomerización, y el polipéptido recombinante es un monómero.

El polipéptido comprende un epítopo de gp120 del VIH y gp41 del VIH. Un polipéptido puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos de gp120 del VIH y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos de gp41 del VIH.

El polipéptido comprende un péptido líder. En algunas realizaciones, el terminal N de un polipéptido recombinante puede consistir en un péptido líder y el péptido líder es capaz de translocar el polipéptido recombinante fuera de la membrana de la superficie celular de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana) luego de la traducción del polipéptido en la célula de mamífero. En algunas realizaciones, el péptido líder comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:84.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión del polipéptido recombinante es el péptido líder, aunque la proteína de fusión normalmente no es el péptido líder. En las realizaciones en las que la proteína de fusión es el péptido líder, el polipéptido recombinante comprende un epítopo de gp120 del VIH y un epítopo de gp41 del VIH, y el polipéptido recombinante carece del sitio de escisión de la gp120/gp41. Dichos polipéptidos pueden comprender la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID N<o>:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, o SEQ ID NO:38 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, o SEQ ID NO:38.

En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina.

También se divulga una célula que comprende un polipéptido como se describe en el presente documento, en la que la célula es una célula de mamífero tal como una célula humana. La célula puede ser, por ejemplo, una célula CHO, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HEK293, HT-1080, PER.C6, HeLa, o Jurkat.

También se divulga un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de cualquiera de las realizaciones y un promotor ligado de forma operable a la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede estar optimizada en codones para expresión en células de mamífero (tales como células humanas). El promotor puede ser capaz de impulsar la expresión en células de mamífero (tales como las células humanas). La divulgación también se refiere a una célula que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en el presente documento. La célula puede ser una célula de clonación (por ejemplo,E. coli)o una célula de expresión (por ejemplo, una célula CHO, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HEK293, HT-1080, PER.C6, HeLa, o Jurkat).

Algunas realizaciones de la invención se refieren a un dispositivo para ensayar una composición que contiene un anticuerpo anti-VIH, que comprende un soporte sólido y un polipéptido como se describe en el presente documento, en el que el polipéptido está unido de forma covalente o no covalente al soporte sólido. La composición puede comprender un fluido corporal tal como sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo o saliva, por ejemplo, obtenido de un paciente humano. El soporte sólido puede ser un gránulo, una membrana, una placa de microtitulación, un chip de polipéptidos, o la fase sólida de una columna de cromatografía.

Algunas realizaciones de la invención se refieren a un reactivo de inmunoensayo que comprende un polipéptido como el descrito en el presente documento, en el que el reactivo de inmunoensayo está unido a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido es un gránulo, una membrana, una placa de microtitulación, un chip de polipéptidos, o la fase sólida de una columna cromatográfica.

Algunas realizaciones de la invención se refieren a un método de ensayo de una muestra que contiene un anticuerpo, que comprende poner en contacto la muestra y un polipéptido como se describe en el presente documento y determinar la afinidad de unión entre el anticuerpo y el polipéptido. En algunas realizaciones, la afinidad de unión puede ser, una afinidad de unión relativa, en la que la afinidad de unión es una afinidad de unión relativa porque es relativa a la afinidad de unión de uno o más anticuerpos diferentes.

Algunas realizaciones de la invención se refieren a un método de selección de un anticuerpo anti-VIH a partir de una pluralidad de anticuerpos, que comprende poner en contacto un polipéptido como se describe en el presente documento y una composición que contiene la pluralidad de anticuerpos e identificar un anticuerpo que tiene una alta afinidad de unión con el polipéptido relativo a otros anticuerpos de la composición, seleccionando de esta manera el anticuerpo anti-VIH.

Algunas realizaciones de la invención se refieren al polipéptido monomérico recombinante para uso en la prevención o el tratamiento de una infección por VIH en un paciente humano, que comprende la administración al paciente de un polipéptido recombinante como se describe en el presente documento.

También se divulga un método de selección de muestras biológicas a partir de un suministro de muestras biológicas humanas, que comprende seleccionar a partir de dicho suministro aquellas muestras que no comprenden anticuerpos que formen un complejo antígeno-anticuerpo con un polipéptido recombinante como se describe en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 contiene diagramas esquemáticos de los polipéptidos env_1 a env_38, env_39 a env_42 y env_43 a env_54, que se describen en la sección de ejemplificación y tienen las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:1-38, SEQ ID NO:92 a 94 y SEQ ID NO:95 a 106, respectivamente.

La Figura 2 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:1, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende una pluralidad de epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 3 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:2, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende una pluralidad de epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 4 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:5, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio de tetramerización de p53, y la porción clara comprende una pluralidad de epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 5 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:6, que comprende un dominio de trimerización GCN4 y una pluralidad de epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 6 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:7, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio de trimerización de la clatrina, y la porción clara comprende una pluralidad de epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 7 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:8, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende una pluralidad de epítopos de gp41 del VIH.

La Figura 8 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:9, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende una pluralidad de epítopos de gp41 del VIH.

La Figura 9 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:10, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 10 es una imagen de la estructura prevista de un dímero de polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:13, en la que la porción oscura de la estructura comprende proteínas de fusión como dominios Fc de anticuerpos, y las porciones claras comprenden epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 11 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:14, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y las porciones claras comprenden los epítopos de gp120 del VIH (izquierda) y gp41 del VIH (derecha).

La Figura 12 es una imagen de la estructura prevista de un dímero de polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:15, en la que la porción oscura de la estructura comprende proteínas de fusión como dominios Fc de anticuerpos, y las porciones claras comprenden epítopos de gp120 del VIH (izquierda) y epítopos de gp41 del VIH (derecha).

La Figura 13 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:18, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de gp41 del VIH.

La Figura 14 es una imagen de la estructura prevista de un dímero de polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:19, en la que la porción oscura de la estructura comprende proteínas de fusión como dominios Fc de anticuerpos, y las porciones claras comprenden epítopos de gp41 del VIH.

La Figura 15 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:21, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y las porciones claras comprenden una pluralidad de epítopos de gp41 del VIH y una pluralidad de epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 16 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:22, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y las porciones claras comprenden epítopos de gp120 del VIH y una pluralidad de epítopos de gp41 del VIH.

La Figura 17 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:23, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

La Figura 18 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:24, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

La Figura 19 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:28, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

La Figura 20 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:29, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

La Figura 21 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:30, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

La Figura 22 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:31, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

La Figura 23 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:32, en la que la porción oscura de la estructura comprende epítopos de gp41.

La Figura 24 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:33, en la que la porción oscura de la estructura comprende una proteína de fusión como un dominio Fc de un anticuerpo, y la porción clara comprende epítopos de gp41 del VIH.

La Figura 25 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:34, que comprende epítopos de gp41 del VIH y epítopos de gp120 del VIH.

La Figura 26 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 92, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp41 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 27 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 93, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp41 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de g120 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 28 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 94, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de g41 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 29 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 95, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de g41 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 30 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 96, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de g41 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 31 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 97, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de g41 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 32 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 98, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de p24 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 33 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 99, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de p24 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp120 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 34 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 100, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de p24 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 35 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 101, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de p24 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp120 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 36 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 102, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de p24 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 37 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 103, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de p24 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp120 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 38 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 104, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de p24 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 39 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 105, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de p24 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp120 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 40 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 106, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp41 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp120 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

La Figura 41 es una imagen de geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) al 4-20 % de tris-glicina TGX™ realizados bajo condiciones reductoras (imagen superior) y no reductoras (imagen inferior). Los geles se tiñeron con la tinción de proteínas InstantBlue™. Los carriles de cada gel están numerados del 1 al 9 de izquierda a derecha. El primer carril contiene un marcador de peso molecular, y los carriles 2-9 contienen los polipéptidos env_1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, y 10, que se clonaron y luego se expresaron en células eucariotas. Los polipéptidos env_1, 2, 3, 5, 8, 9, y 10 se expresaron a niveles detectables.

La Figura 42 es una imagen de geles de SDS-PAGE al 4-20% con tris-glicina TGX™ realizados bajo condiciones reductoras (imagen superior) y no reductoras (imagen inferior). Los geles se tiñeron con la tinción de proteínas InstantBlue™. Los carriles de cada gel están numerados del 1 al 9 de izquierda a derecha. El primer carril contiene un marcador de peso molecular, y los carriles 2-9 contienen los polipéptidos env_11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, y 18, que se clonaron y luego se expresaron en células eucariotas. Cada polipéptido fue capaz de expresarse a un nivel detectable.

La Figura 43 es una imagen de una porción de la versión del 19 de octubre de 2017 del Mapa de Epítopos AB de LANL gp160, disponible en https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/ab/gp160.html.

La Figura 44 es una imagen de la estructura prevista de un polipéptido recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 91, en la que la porción de color gris claro comprende los epítopos de gp120 del VIH, la de color gris medio comprende el dominio Fc y del anticuerpo, la de color gris oscuro comprende los epítopos de gp41 del VIH y la de color negro comprende los ligadores.

Descripción detallada

El VIH-1 expresa las proteínas de la envoltura (gp120 y gp41) como una estructura trimérica con la gp41 incrustada en la membrana y la gp120 asentada sobre las respectivas proteínas gp41. Varias realizaciones de la invención incluyen diversas ventajas distintivas para el uso diagnóstico sobre las proteínas de la técnica anterior. Algunos aspectos de las realizaciones se refieren a mejoras creadas mediante el uso de células de mamífero, que permiten una modificación postraduccional correcta que es crucial para los epítopos, en particular para los epítopos de gp120, pero que no es reproducible ni en levadura (por ejemplo,SaccharomycesoPichia)ni enE. coli.Varios aspectos de las realizaciones descritas se refieren al descubrimiento de que los polipéptidos recombinantes de la envoltura del VIH que se producen en células de mamífero y que carecen de un dominio de transmembrana exhiben características mejoradas en relación con las proteínas recombinantes de la envoltura del VIH de longitud completa.

Estos polipéptidos se diseñaron para emular mejor la estructura nativa de la envoltura del VIH y para mejorar la solubilidad y el rendimiento de los polipéptidos recombinantes de la envoltura del VIH en base al hecho de que las versiones de levadura fabricadas hasta la fecha y utilizadas por muchas empresas de diagnóstico requieren detergentes fuertes para solubilizarlos (por ejemplo, dodecil sulfato de sodio) e incluyen proteínas de fusión grandes, irrelevantes para ayudar a la expresión (por ejemplo, superóxido dismutasa). Los polipéptidos del VIH producidos en células de mamífero adoptan una conformación nativa. El uso de varios dominios de fusión, como se describe en el presente documento, también mejora la solubilidad y estabilidad de la envoltura del VIH y ayuda a su purificación.

La estructura de la proteína nativa gp120/gp41 del VIH depende en parte de la incrustación de tres dominios transmembrana de tres subunidades gp41 en una bicapa lipídica, y se desconocía y era impredecible si un polipéptido recombinante de gp120 o gp41 del VIH que careciera de un dominio de transmembrana se podría plegar en un estado similar al nativo. La mayoría de los polipéptidos descritos en el presente documento son solubles en ausencia de detergente y, por tanto, capaces de plegarse en conformaciones tridimensionales de tipo nativo.

La proteína nativa del gp120/gp41 del VIH forma una estructura cuaternaria heterooligomérica. La estructura cuaternaria de la proteína nativa gp120/gp41 del VIH se define en parte por su orientación en una membrana, que está fijada por las hélices transmembrana de la subunidad gp41. Los polipéptidos recombinantes de gp120/gp41 del VIH que carecen de una hélice transmembrana carecen de un componente que oriente los monómeros.

I. Polipéptidos

Varias realizaciones de la invención incluyen un polipéptido que comprende al menos un epítopo de la proteína gp120 del VIH y al menos un epítopo de la proteína gp41 del VIH.

La proteína de la envoltura del VIH es preferiblemente la proteína de la envoltura del VIH-1, que es más infecciosa y virulenta que el VIH-2, y causa la mayoría de las infecciones por VIH en todo el mundo. En algunas realizaciones, la proteína de la envoltura del VIH es la proteína de la envoltura del VIH-2.

Los polipéptidos que aparecen en las realizaciones descritas en el presente documento son todos polipéptidos recombinantes, es decir, comprenden dos o más secuencias de aminoácidos que no coexisten en polipéptidos de origen natural. Por lo tanto, los términos “polipéptido” y “polipéptido recombinante” se utilizan en el presente documento indistintamente.

Las únicas proteínas de la superficie de un virión del VIH intacto son las glicoproteínas de la envoltura codificadas por el genenv.El producto del genenves una proteína precursora de aproximadamente 850 aminoácidos denominada gp160, a la que también se hace referencia en el presente documento como proteína de la envoltura del VIH. Las secuencias de aminoácidos de ejemplo de la proteína de envoltura del VIH se exponen en la SEQ ID NO:39-62, y pueden encontrarse otras, por ejemplo, en https://www.hiv.lanl.gov/components/sequence/HIV/search/search.html o en https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/NEWALIGN/align.html (por ejemplo, al seleccionar el “Tipo de alineación” como “Web (todas las secuencias completas)” y el “Año” como “2016”). Las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la envoltura del VIH también se pueden identificar, por ejemplo, al buscar en la base de datos de Proteínas del NCBI “gp160” o “proteína de la envoltura del VIH” (por ejemplo, en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein).

El término “polipéptido” se refiere a una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud, aunque el término “polipéptido”, como se utiliza en las reivindicaciones y las realizaciones descritas en el presente documento, requiere una secuencia de aminoácidos lo suficientemente larga como para contener un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH (es decir, al menos 8 aminoácidos) y una proteína de fusión. El término “dominio”, como se utiliza en el presente documento, se refiere de forma similar a una secuencia de aminoácidos lo suficientemente larga como para plegarse de forma independiente. Un dominio puede contener un epítopo (es decir, al menos 8 aminoácidos), aunque no es necesario que un dominio incluya un epítopo. Un dominio de transmembrana puede incluir 8 o más aminoácidos, y sin embargo un dominio de transmembrana puede no contener un epítopo, por ejemplo, si el dominio no es antigénico.

Un polipéptido de acuerdo con las realizaciones en el presente documento normalmente contiene 200 a 1000 aminoácidos, tales como aproximadamente 200 a aproximadamente 400, aproximadamente 300 a aproximadamente 500, aproximadamente 400 a aproximadamente 600, aproximadamente 500 a aproximadamente 700, aproximadamente 600 a aproximadamente 800, aproximadamente 700 a aproximadamente 900, o aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 aminoácidos. Los aminoácidos de un polipéptido están normalmente conectados por enlaces peptídicos, por ejemplo, porque estos polipéptidos se producen normalmente por la traducción del ARN en un ribosoma.

Un polipéptido de las realizaciones normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 a aproximadamente 100,000 daltons, tales como aproximadamente 20,000 a aproximadamente 40,000, aproximadamente 30,000 a aproximadamente 50,000, aproximadamente 40,000 a aproximadamente 60,000, aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000, aproximadamente 60,000 a aproximadamente 80,000, aproximadamente 70,000 a aproximadamente 90,000, o aproximadamente 80,000 a aproximadamente 100,000 daltons.

Un polipéptido de las realizaciones normalmente tiene un punto isoeléctrico (pI) de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, tal como aproximadamente 5.5 a aproximadamente 8.5, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 7.0 a aproximadamente 9.0, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.0, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 7.0 a aproximadamente 8.0, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.5, aproximadamente 8.0 a aproximadamente 9.0, aproximadamente 8.5 a aproximadamente 9.5, o aproximadamente 9.0 a aproximadamente 10.0.

Los polipéptidos de las realizaciones carecen del dominio de transmembrana gp41, es decir, cada polipéptido carece de las secuencias de aminoácidos codificadas por cualquiera de las SEQ ID NO:63-72. Un polipéptido de una realización puede carecer de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, 67 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos codificada por la SEQ ID NO:63-72. Un polipéptido de una realización puede carecer de una secuencia de aminoácidos que se incruste en una membrana biológica (es decir, una bicapa lipídica). La probabilidad de que una secuencia de aminoácidos se pueda incrustar en una membrana biológica se puede determinar utilizando cualquier número de métodos diferentes conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, cálculos basados en el potencial dependiente de la profundidad Ez (Senes et al., J. Molecular Biology 366(2):436 (2007)).

Un polipéptido de la invención puede carecer del sitio de escisión gp120/gp41 de una proteína de envoltura del VIH de longitud completa.

A. Epítopos de la proteína de la envoltura del VIH

Las realizaciones incluyen un polipéptido que comprende al menos cuatro epítopos de la proteína de la envoltura del VIH. Un polipéptido como se divulga en el presente documento puede incluir al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos de la proteína de la envoltura del VIH. Un polipéptido puede incluir una pluralidad de epítopos de la proteína de la envoltura del VIH. Un polipéptido puede incluir una pluralidad de epítopos de la proteína de la envoltura del VIH, en la que la pluralidad de epítopos comprende al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos.

Un “epítopo”, como el término en la especificación y las Reivindicaciones, se refiere a una secuencia de al menos 8 aminoácidos consecutivos que se puede unir específicamente al sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Un epítopo puede comprender, por ejemplo, al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos.

Un epítopo puede consistir en una secuencia de aminoácidos de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos que se encuentran en una cualquiera de las SEQ ID NO:39-62, que son secuencias de proteínas de la envoltura del VIH, siempre que la secuencia no incluya el terminal N o C de un dominio de transmembrana, que se identifican como la SEQ ID NO:63-72. Un polipéptido de una realización puede comprender una pluralidad de epítopos, en los que cada epítopo de la pluralidad consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos encontrados en una cualquiera de las SEQ ID NO:39-62, siempre que la secuencia no incluya el terminal N o C de un dominio de transmembrana, que se identifican como la SEQ ID NO:63-72. Cada epítopo de una pluralidad de epítopos puede tener una secuencia de aminoácidos diferente o cada epítopo puede tener la misma secuencia de aminoácidos. Un polipéptido de una realización puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos de una proteína de la envoltura del VIH, en la que cada epítopo consiste en una secuencia de aminoácidos de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos que se encuentran en cualquiera de las SEQ ID NO:39-62, siempre que la secuencia no incluya el terminal N o terminal C de un dominio de transmembrana, que se identifican como la SEQ ID NO:63-72.

Se conocen muchas variantes de las proteínas de la envoltura del VIH. De acuerdo con lo anterior, un epítopo puede consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos encontrados en una cualquiera de las SEQ ID NO:39-62, que son secuencias de proteínas de la envoltura del VIH, siempre que la secuencia no incluya el terminal N o terminal C de un dominio de transmembrana, que se identifican como la SEQ ID NO:63-72. Un polipéptido de una realización puede comprender una pluralidad de epítopos, en los que cada epítopo de la pluralidad consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%o 99%de identificación de secuencia con al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos encontrados en una cualquiera de las SEQ ID NO:39-62, siempre que la secuencia no incluya el terminal N o terminal C de un dominio de transmembrana, que se identifican como la SEQ ID NO:63-72. Cada epítopo de una pluralidad de epítopos puede tener una secuencia de aminoácidos diferente o cada epítopo puede tener la misma secuencia de aminoácidos. Un polipéptido de una realización puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos de una proteína de la envoltura del VIH, en la que cada epítopo consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identificación de secuencia con al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos consecutivos encontrados en cualquiera de las SEQ ID NO:39-62, siempre y cuando la secuencia no incluya el terminal N o terminal C de un dominio de transmembrana, que se identifican como la SEQ ID NO:63-72.

En las realizaciones en las que un polipéptido comprende más de cuatro epítopos de la proteína de la envoltura del VIH, los epítopos de la proteína de la envoltura del VIH pueden ser el mismo epítopo o un epítopo diferente.

Un polipéptido (o una pluralidad de epítopos) puede incluir epítopos encontrados en diferentes proteínas de la envoltura del VIH (por ejemplo, diferentes secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO:39-62), o el polipéptido (o la pluralidad de epítopos) puede incluir epítopos que se encuentran cada uno en la misma proteína de la envoltura del VIH.

Los epítopos de la proteína de la envoltura del VIH son bien conocidos. Los epítopos de la proteína de la envoltura del VIH se pueden seleccionar, por ejemplo, del Mapa de Epítopos AB del gp160 LANL, disponible en https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/ab/gp160.html. Una porción de la versión del 19 de octubre de 2017 del Mapa de Epítopos AB de LANL gp160 se reproduce en la Figura 43, y varias realizaciones de la invención presentan epítopos descritos en el Mapa de Epítopos AB de LANL gp160.

Varios aspectos de la invención se refieren a polipéptidos que contienen epítopos novedosos de la proteína de la envoltura del VIH. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende al menos un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH, en el que el al menos un epítopo incluye un epítopo que no está identificado en el Mapa de Epítopos AB de LANL gp160. Un polipéptido puede incluir, por ejemplo, epítopos o una pluralidad de epítopos en los que cada epítopo es una secuencia de aminoácidos seleccionada al azar de al menos 8 aminoácidos consecutivos que se encuentra en una cualquiera de las SEQ ID NO:39-62.

Un epítopo puede ser un epítopo de la proteína gp120 del VIH o de la proteína gp41 del VIH. Un polipéptido puede comprender un epítopo de la proteína gp120 del VIH y/o de la proteína gp41 del VIH. Una pluralidad de epítopos puede comprender epítopos de la proteína gp120 del VIH y/o de la proteína gp41 del VIH.

Un epítopo de un polipéptido puede estar flanqueado por las secuencias de aminoácidos de una proteína nativa de la envoltura del VIH. Por ejemplo, un polipéptido puede comprender al menos dos epítopos de una proteína de la envoltura del VIH, en los que dos epítopos de los al menos dos epítopos están conectados por la secuencia de aminoácidos nativa de una proteína de la envoltura del VIH.

Un polipéptido puede comprender al menos dos epítopos de una proteína de la envoltura del VIH, en los que dos epítopos de los al menos dos epítopos están conectados por una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en las proteínas de la envoltura del VIH de origen natural. Por ejemplo, un polipéptido puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos, en los que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 de los al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos están conectados por secuencias de aminoácidos que no se encuentran en las proteínas envolventes del VIH de origen natural. Un polipéptido puede comprender al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos, en los que dos epítopos de los al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos están conectados por una secuencia de aminoácidos encontrada en una proteína de la envoltura del VIH de origen natural.

En algunas realizaciones, un polipéptido comprende una pluralidad de epítopos de la proteína de envoltura del VIH, en la que cada epítopo de la pluralidad de epítopos está conectado a otro epítopo de la pluralidad de epítopos por una secuencia de aminoácidos que no está codificada por el VIH. Los términos “ligador” o “espaciador”, se pueden utilizar en el presente documento para referirse a dichas secuencias de aminoácidos que conectan al menos dos epítopos de los polipéptidos recombinantes descritos en el presente documento.

B. Ligadores

Cada epítopo de una pluralidad de epítopos puede estar conectado a otro epítopo de la pluralidad de epítopos mediante un ligador o espaciador. Cada epítopo de una pluralidad de epítopos puede estar conectado a uno o dos epítopos más de la pluralidad de epítopos mediante un ligador o espaciador. Un ligador o espaciador se refiere a una secuencia de aminoácidos diseñada, que normalmente está conectada mediante enlaces peptídicos y que tiene una estructura secundaria definida o está intrínsecamente desordenada. Los términos “ ligador” y “espaciador” se utilizan indistintamente en el presente documento. Un ligador puede comprender una secuencia de aminoácidos que forma una hélice alfa o una cadena beta (por ejemplo, en la que la cadena beta se combina con otras cadenas beta para formar una lámina beta). Un ligador puede comprender una hélice alfa o una lámina beta.

Un ligador puede consistir en una secuencia de aminoácidos consecutivos que tienen una alta propensión a formar una hélice alfa (por ejemplo, alanina), que puede incluir opcionalmente un motivo de cierre de la hélice terminal N (por ejemplo, serina-prolina-glutamato) y/o aminoácidos cargados alternativamente en las posiciones i e i+3/4 (por ejemplo, glutamato en i y lisina en i+3 o i+4). Un ligador de ejemplo que tiene una alta propensión para formar una hélice alfa se expone en la SEQ ID NO:73 (AEAAAKEAA<a k>A).

Un ligador puede consistir en una secuencia de aminoácidos consecutivos que tienen una alta propensión para formar una cadena beta, tal como los aminoácidos “beta-ramificados” (por ejemplo, valina, isoleucina, treonina), aunque otras secuencias de aminoácidos consecutivos que tienen una alta propensión a formar una cadena beta son conocidas en la técnica y se pueden seleccionar, por ejemplo, para diseñar una lámina beta. Un ligador de ejemplo que tiene una alta propensión a formar una cadena beta se expone en la SEQ ID NO:74 (TWIQNPGTKWYQNPGTKIYT). En algunas realizaciones, un polipéptido comprende una lámina beta, en la que al menos dos cadenas beta de la lámina beta están conectadas por una secuencia de aminoácidos que comprende un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH. Por ejemplo, un polipéptido puede comprender una lámina beta que comprende al menos tres cadenas beta en las que una primera cadena beta esté conectada a una segunda cadena beta por una secuencia de aminoácidos que comprende un primer epítopo de la proteína de la envoltura del VIH y una tercera cadena beta esté conectada a una cuarta cadena beta por un segundo epítopo de la proteína de la envoltura del VIH (es decir, en la que la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas beta forman tres o cuatro cadenas beta (por ejemplo, la tercera beta y la primera o segunda cadena beta son la misma cadena beta, o cada una de la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas beta son cadenas beta diferentes), y en la que el primer epítopo y el segundo epítopo pueden tener opcionalmente las mismas o diferentes secuencias de aminoácidos).

Un ligador intrínsecamente desordenado puede consistir en una secuencia de aminoácidos consecutivos que tienen un alto grado de desorden estructural. Los ligadores intrínsecamente desordenados normalmente incluyen al menos una glicina, que carece de un grupo R y, por tanto, tiene más conformaciones accesibles que todos los demás aminoácidos que ocurren de forma natural, y/o al menos una prolina, que tiene un grupo R que forma un anillo con su N de estructura principal y, por tanto, tiene menos conformaciones accesibles que todos los demás aminoácidos presentes de forma natural. La glicina aumenta el desorden estructural al introducir entropía en la estructura secundaria del polipéptido, y la prolina aumenta el desorden estructural al introducir la entropía en la estructura secundaria del polipéptido. Los ligadores intrínsecamente desordenados también pueden incluir otros aminoácidos pequeños (por ejemplo, serina, alanina) y aminoácidos hidrófilos. Los aminoácidos de un ligador intrínsecamente desordenado se pueden seleccionar, por ejemplo, de glicina, prolina, alanina, serina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, lisina, y arginina. Los ligadores intrínsecamente desordenados de ejemplo se incluyen las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:75 (SGSGASGS), SEQ ID NO:76 (PSGP), SEQ ID NO:109 (GGGGSGGGGSGGGGS) o SEQ ID NO:110 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS), aunque la secuencia precisa de aminoácidos de un ligador intrínsecamente desordenado no es particularmente limitante.

Un ligador flexible puede consistir en una secuencia de aminoácidos consecutivos que normalmente incluyen al menos una glicina, al menos una prolina y al menos una serina. Los ligadores flexibles de ejemplo incluyen las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:111 (GGGPS), aunque la secuencia precisa de aminoácidos de un ligador flexible no es particularmente limitante.

Dos epítopos de una pluralidad de epítopos (o de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos) pueden estar conectados por un ligador, en el que el ligador comprende una hélice alfa, una cadena beta, una secuencia intrínsecamente desordenada o una secuencia flexible de aminoácidos. Cada epítopo de una pluralidad de epítopos (o de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 epítopos) puede estar conectado a otro epítopo de la pluralidad de epítopos (o de los al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, o 10 epítopos) por un ligador, en el que el ligador comprende una hélice alfa, una cadena beta, una secuencia intrínsecamente desordenada o una secuencia flexible de aminoácidos.

Un ligador no se encuentra normalmente en las proteínas de la envoltura del VIH que con de origen natural, y un ligador no se encuentra normalmente en la naturaleza, aunque algunas secuencias de aminoácidos de origen natural pueden servir como ligadores adecuados o se pueden utilizar para diseñar ligadores adecuados.

Un ligador puede incluir aproximadamente 1 a 30 aminoácidos, tales como aproximadamente 2 a 25, aproximadamente 3 a 20, aproximadamente 4 a 16, o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 aminoácidos.

C. Proteínas de fusión

Los polipéptidos de las realizaciones comprenden normalmente una proteína de fusión, que comprende una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en las proteínas de la envoltura del VIH de origen natural. Una proteína de fusión puede comprender una región que no está codificada por el VIH, dicha región seleccionada del grupo que consiste en un dominio Fc de un anticuerpo. La proteína de fusión es preferiblemente una secuencia de al menos 20 aminoácidos, tal como al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, o 200 aminoácidos o aproximadamente 20 a 500, aproximadamente 50 a aproximadamente 400, o aproximadamente 75 a aproximadamente 250 aminoácidos, aunque la longitud precisa de la proteína de fusión no es particularmente limitante.

Una “proteína de fusión”, como se utiliza el término en el presente documento, no se refiere a una proteína discreta que está separada de un polipéptido. El término “proteína de fusión” se refiere en cambio a una secuencia de aminoácidos que comprende características estructurales y/o funcionales que son normalmente útiles para la expresión, purificación, oligomerización y/o estabilidad de la proteína. Un gen que codifica un polipéptido codifica normalmente una proteína de fusión en el marco con el resto del polipéptido sin codones de parada entre la proteína de fusión y otras porciones del polipéptido; una proteína de fusión se traduce normalmente del ARNm como parte del polipéptido; y una proteína de fusión se conecta normalmente a las otras porciones de un polipéptido por uno o más enlace(s) de péptido(s) nativo(s).

Una proteína de fusión normalmente tiene propiedades funcionales. Por ejemplo, una proteína de fusión puede funcionar para oligomerizar un polipéptido con otro polipéptido. En algunas realizaciones, una proteína de fusión simplemente aumenta la estabilidad del polipéptido, por ejemplo, un polipéptido puede incluir un dominio Fc de anticuerpo, lo que puede aumentar la estabilidad del polipéptido. La estabilidad se puede referir a la degradación del polipéptido, el plegamiento del polipéptido y/o la agregación del polipéptido, por ejemplo,y una proteína de fusión puede aumentar la vida media de un polipéptido en relación con la degradación, aumentar la estabilidad del plegamiento nativo de un polipéptido (o polipéptido oligomérico), y/o disminuir la propensión del polipéptido a formar agregados.

Una proteína de fusión tiene normalmente una estructura secundaria definida y una estructura terciaria y/o cuaternaria definida. La proteína de fusión puede incluir una porción del dominio Fc de un anticuerpo, por ejemplo, que tiene una estructura secundaria y una estructura terciaria definidas, pero que carece de estructura cuaternaria (por ejemplo, porque el fragmento del dominio Fc carece de una región bisagra y de otros elementos que permiten que un anticuerpo forme dímeros u oligómeros de orden superior).

Una proteína de fusión puede existir como monómero, es decir, la proteína de fusión puede tener una constante de disociación alta para la autoasociación cuando se pliega en su conformación nativa. Una constante de disociación alta (K<d>) puede ser, por ejemplo, >10 mM, >1 mM, o > 100 pM según se determina, por ejemplo, en solución salina tamponada con fosfato a pH 7.

Una proteína de fusión puede comprender un dominio de oligomerización. Un polipéptido oligomérico, tal como un polipéptido dimérico, puede ser superior para desarrollar anticuerpos contra el complejo gp120/gp41 nativo porque el gp120/gp41 nativo existe como un trímero de heterodímeros. Los dominios de oligomerización también son útiles para orientar los polipéptidos y reproduciendo de esta manera la estructura cuaternaria nativa.

Un dominio de oligomerización de ejemplo incluye la secuencia de aminoácidos de un dominio Fc de anticuerpo. Un dominio Fc de anticuerpo puede aumentar la expresión y/o secreción de un polipéptido en una célula de expresión. El uso u omisión de la región bisagra puede formar fusiones Fc diméricas o monoméricas, respectivamente.

Una proteína de fusión de ejemplo es el dominio Fc IgG1 de ratón o el dominio Fc IgG2 de ratón, que carece de la región bisagra y, por lo tanto, no se oligomeriza.

Un dominio Fc monomérico de IgG2 de ratón puede tener la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:77 (APNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCWVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLR

VVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVT

DFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTT KSFSRTPGK) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor del 95 % 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:77.

Un dominio Fc monomérico de IgG1 de ratón puede tener la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:80 (VPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCWVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSV

SELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQIVIAKDKVSLTCMITDFFP

EDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLS HSPG) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 95 % 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:80.

Las proteínas de fusión de ejemplo pueden comprender dominios Fc que carecen de un dominio de oligomerización que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la s Eq ID NO:77 o SEQ ID NO:80, y por lo tanto el polipéptido recombinante es un monómero.

Los dominios Fc también pueden ayudar a la purificación de un polipéptido, ya que los métodos de purificación de polipéptidos que comprenden dominios Fc son bien conocidos.

Las proteínas de fusión de las realizaciones no incluyen la superóxido dismutasa, que se utiliza habitualmente en la preparación de proteínas recombinantes de la envoltura del VIH, es decir, los polipéptidos de la invención carecen de una secuencia de aminoácidos correspondiente a la superóxido dismutasa.

D. Secuencias de péptidos líderes

Los polipéptidos divulgados en el presente documento comprenden normalmente una secuencia de péptidos líder para favorecer la translocación del polipéptido a través de la membrana celular de un vector de expresión, tal como una célula de mamífero, especialmente una célula humana. No obstante, un polipéptido puede carecer de secuencia de péptidos líder, por ejemplo, si la secuencia de péptidos líder se escinde del polipéptido por escisión enzimática o química. Los polipéptidos producidos sintéticamente pueden carecer igualmente de una secuencia de péptidos líder.

Normalmente se incluye una secuencia de péptidos líder en el terminal N de un polipéptido. Una secuencia de péptidos líder es preferiblemente suficiente para translocar el polipéptido fuera de la membrana de superficie celular de una célula eucariota (por ejemplo, una célula de mamífero, tal como una célula humana) luego de la traducción del polipéptido en la célula eucariota, aunque otros motivos de secuencia de un polipéptido también pueden ayudar a la translocación.

Una secuencia de ejemplo del péptido líder tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:84 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS), que es la secuencia del péptido líder de la interleucina-2 humana. Esta secuencia bien caracterizada es capaz de translocar los polipéptidos fuera de las células humanas y de otras células de mamíferos.

En algunas realizaciones, el péptido líder del polipéptido en el presente documento divulgado es la proteína de fusión del polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un epítopo de gp120 del VIH y un epítopo de gp41 del VIH y el polipéptido carece del sitio de escisión de gp120/gp41.

Una secuencia del péptido líder no se deriva normalmente de la proteína de la envoltura del VIH, aunque en algunas realizaciones, la secuencia del péptido líder es la secuencia señal de la proteína de la envoltura del VIH.

E. Etiquetas de afinidad

Un polipéptido puede incluir opcionalmente una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad son útiles para la purificación, y también pueden ser útiles en ensayos que utilicen un polipéptido. Las etiquetas de afinidad de ejemplo incluyen polihistidina, proteína de unión a quitina, proteína de unión a maltosa, etiqueta Strep, glutatión-S-transferasa, etiqueta FLAG, etiqueta V5, etiqueta Myc, etiqueta HA, etiqueta NE, etiqueta Avi, etiqueta Calmodulina, poliglutamato, etiqueta S, etiqueta SBP, etiqueta Softag 1, Softag 3, etiqueta TC, etiqueta VSV, etiqueta Xpress, Isopeptag, SpyTag, SnoopTag, proteína portadora de carboxilo de biotina, etiqueta proteína fluorescente verde, HaloTag, etiqueta Nus y etiqueta tioredoxina, aunque la elección de la etiqueta de afinidad no es especialmente limitante. No obstante, un polipéptido puede carecer de una etiqueta de afinidad, por ejemplo, si la etiqueta de afinidad se elimina después de uso o si el polipéptido se purifica utilizando una estrategia que no requiere una etiqueta de afinidad. Una etiqueta de afinidad de ejemplo es la polihistidina, que normalmente incluye una secuencia de aminoácidos que comprende seis histidinas consecutivas (SEQ ID NO:85). Otra etiqueta de afinidad de ejemplo es la polihistidina que comprende entre 4 y 8 histidinas consecutivas.

F. Secuencias de polipéptidos de ejemplo

Los polipéptidos recombinantes presentados en las realizaciones descritas en el presente documento pueden comprender un péptido líder, una proteína de fusión, al menos un epítopo de la proteína gp120 del VIH y al menos un epítopo de la proteína gp41 del VIH, en los que el polipéptido recombinante carece de un dominio de transmembrana y en los que la proteína de fusión comprende una región no codificada por el VIH.

Un polipéptido del tipo en el presente documento divulgado puede tener la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:105 o SEQ ID NO:106. Un polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:14,

ID NO:106, es decir, en los que la secuencia completa de aminoácidos del polipéptido no es una secuencia de aminoácidos de origen natural.

II. Inmunobiología de la infección por el VIH-1 y el VIH-2

La infección por el VIH hace que el sistema inmunitario responda de varias maneras en función de la salud y la composición genética del huésped. En general, una vez que el VIH penetra en el huésped a través de la infección de las células T CD4+, comienza a replicarse y a producir nuevas partículas virales, que se liberan de las células lisadas en el torrente sanguíneo. En la superficie de estos virus envueltos se encuentran las “Proteínas Asociadas a la Envoltura” gp120 y gp41 en espigas triméricas poco intercaladas. Sin embargo, la proteína gp120 que se encuentra sobre la proteína gp41 tiende a desprenderse del virus (probablemente depende de la cepa), y se considera que este desprendimiento funciona como una proteína señuelo por algunos en el campo. Así la gp41 se expone como la primera diana de superficie inicial para la respuesta de anticuerpos del huésped. De hecho, la gran mayoría de los pacientes VIH+ desarrollan una fuerte respuesta de anticuerpos frente a la fracción gp41, y ésta es la razón por la que las proteínas de la envoltura del pasado utilizadas por muchas empresas de diagnóstico tal como Env13, Env31 y Env70, que se expresan en levadura, consisten esencialmente en la secuencia gp41 con sólo un pequeño fragmento de gp120. Para la mayoría de los pacientes infectados por el VIH y que han montado una respuesta de anticuerpos, esta proteína exhibirá reactividad de anticuerpos alrededor del 90-98 % de las veces. El pequeño porcentaje de pacientes no reactivos exhibe una respuesta de anticuerpos mensurable a la gp120 y/o al antígeno p24.

III. Ácidos nucleicos, células de clonación, y células de expresión

Las realizaciones descritas en el presente documento también incluyen un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en el presente documento. El ácido nucleico puede ser ADN o ARN. El ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en el presente documento comprende normalmente un promotor que está operativamente ligado a la secuencia de nucleótidos. El promotor es preferiblemente capaz de impulsar la expresión constitutiva o inducible de la secuencia de nucleótidos en una célula de expresión de interés. La secuencia de nucleótidos precisa del ácido nucleico no es particularmente limitante siempre que la secuencia de nucleótidos codifique un polipéptido descrito en el presente documento. Los codones se pueden seleccionar, por ejemplo, para que coincidan con el sesgo de codones de una célula de expresión de interés (por ejemplo, una célula de mamífero como una célula humana) y/o por conveniencia durante la clonación. El ADN puede ser un plásmido, por ejemplo, que puede comprender un origen de replicación (por ejemplo, para la replicación del plásmido en una célula procariota).

Varios aspectos de la presente divulgación también se refieren a una célula que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en el presente documento. La célula puede ser una célula de expresión o célula de clonación. Los ácidos nucleicos se clonan normalmente enE. coli,aunque se pueden utilizar otras células de clonación. Si la célula es una célula de expresión, el ácido nucleico es opcionalmente un ácido nucleico de un cromosoma, es decir, en el que la secuencia de nucleótidos está integrada en el cromosoma, aunque entonces el ácido nucleico puede estar presente en una célula de expresión, por ejemplo, como ADN extracromosómico.

Varios aspectos de la presente divulgación incluyen una célula que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipéptido como se describe en el presente documento. La célula es normalmente una célula de expresión. La naturaleza de la célula de expresión no es particularmente limitante. Las células de expresión de mamífero pueden permitir el plegamiento favorable, modificaciones postraduccionales y/o secreción de un polipéptido, aunque se pueden utilizar como células de expresión otras células eucariotas o procariotas. Entre las células de expresión de ejemplo se incluyen las células CHO, BHK, NS0, Sp2/0, COS, C127, HEK, HT-1080, PER.C6, HeLa, y Jurkat.

Una célula de expresión de la invención no es normalmente la levadura, que se utiliza comúnmente como célula de expresión para expresar proteínas recombinantes de la envoltura del VIH. La expresión de las proteínas de la envoltura del VIH en levadura puede dar lugar a un plegamiento incorrecto, agregación y/o acumulación de modificaciones postraduccionales aberrantes, lo que se mitiga al expresar los polipéptidos en el presente documento descritos en células de expresión de mamíferos (especialmente células de expresión humanas).

IV. Ensayos y reactivos

Las realizaciones incluyen un reactivo de inmunoensayo que comprende un polipéptido como se describe en el presente documento para ensayar una composición que contiene un anticuerpo anti-VIH. El reactivo de inmunoensayo puede estar unido a un soporte sólido. Un soporte sólido puede ser, por ejemplo, un gránulo, una membrana, una placa de microtitulación, un chip de polipéptidos o la fase sólida de una columna de cromatografía.

Varias realizaciones incluyen también un dispositivo para ensayar una composición que contiene un anticuerpo anti-VIH. El dispositivo puede ser un dispositivo para determinar si una muestra contiene un anticuerpo anti-VIH (por ejemplo, para determinar si la muestra se puede utilizar en una transfusión o trasplante a un paciente humano). Los ensayos son bien conocidos y normalmente presentan un soporte sólido que ayuda a separar los componentes que se unen directa o indirectamente al soporte sólido de los componentes que no se unen directa o indirectamente al soporte sólido. Un soporte sólido puede ser, por ejemplo, un gránulo, membrana, placa de microtitulación, chip de polipéptidos o la fase sólida de una columna cromatográfica. Un dispositivo puede comprender un polipéptido como el descrito en el presente documento. El polipéptido normalmente está unido de forma covalente o no covalente al soporte sólido.

El término unión “directa”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la conjugación directa de una molécula a un soporte sólido, por ejemplo, una interacción oro-tiol que une un tiol de cisteína de un polipéptido a una superficie de oro. El término unión “ indirecta”, como se utiliza en el presente documento, incluye la unión específica de un polipéptido a otra molécula que está directamente unida a una superficie, por ejemplo, un polipéptido se puede unir a un anticuerpo que está directamente unido a un soporte sólido uniendo de esta manera indirectamente el polipéptido al soporte sólido. El término unión “ indirecta” es independiente del número de moléculas entre el polipéptido y el soporte sólido siempre que cada interacción entre la cadena margarita de moléculas sea una interacción específica o covalente y una molécula terminal de la cadena margarita esté directamente unida al soporte sólido.

El término “unido de forma no covalente”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la unión específica tal como entre un anticuerpo y su antígeno, un ligando y su receptor, o una enzima y su sustrato, ejemplificada, por ejemplo, por la interacción biotina-estreptavidina. La unión específica se refiere generalmente a interacciones con una constante de disociación (K<d>) menor de aproximadamente 100 pM, tal como menor de aproximadamente 10 pM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 100 nM o aproximadamente 10 nM. También se pueden idear ensayos en los que el polipéptido nunca se une al soporte sólido, como en un ensayo de competición.

En un ensayo de ejemplo, un polipéptido unido a un soporte sólido se pone en contacto con una muestra sospechosa de contener un anticuerpo anti-VIH, tal como una muestra de sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, saliva o hisopo de mejilla. A continuación, se lava el soporte sólido con una rigurosidad que no interrumpa significativamente la unión entre el polipéptido y cualquier anticuerpo anti-VIH (por ejemplo, un lavado con solución salina tamponada con fosfato o similar). A continuación, se pone en contacto el soporte sólido con un anticuerpo “secundario” que reconozca el anticuerpo anti-VIH (por ejemplo, un anticuerpo IgG antihumano), en el que el anticuerpo secundario incluya una marca de detección. La etiqueta de detección puede ser un tinte (por ejemplo, para la detección visual), un fluoróforo (por ejemplo, para la detección por fluorescencia), una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante; para la detección visual o por fluorescencia de una señal amplificada), una radiomarcación o cualquier otra etiqueta de detección de uso común en biología molecular o diagnóstico médico. Diferentes variaciones de este ensayo son fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos de una muestra se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido, el polipéptido se puede poner en contacto con los anticuerpos y, a continuación, el polipéptido se puede detectar utilizando un anticuerpo o ligando que reconozca la proteína de fusión o la etiqueta de afinidad del polipéptido.

Las realizaciones también incluyen un método de ensayo de una muestra, que comprende poner en contacto un polipéptido como el descrito en el presente documento con la muestra. Las realizaciones adicionales incluyen un método para determinar si una muestra contiene un anticuerpo anti-VIH, que comprende poner en contacto un polipéptido como se describe en el presente documento con la muestra. Las realizaciones también incluyen un método de ensayo de una muestra, que comprende poner en contacto un polipéptido como se describe en el presente documento con la muestra y determinar la afinidad de unión entre el anticuerpo y el mismo. La muestra puede ser una muestra humana, tal como un fluido corporal obtenido de un humano. La muestra puede ser, por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, saliva o un hisopo de mejilla. La muestra puede comprender sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, saliva o células de la mejilla. La muestra puede ser una muestra de esperma.

VI. Composiciones farmacéuticas

Varias realizaciones de la invención se refieren a composiciones que comprenden un polipéptido descrito en el presente documento. Una composición puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede ser, por ejemplo, una vacuna.

Varias realizaciones de la invención se refieren a una composición que comprende un polipéptido como se describe en el presente documento para uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por VIH en un paciente humano que comprende la administración al paciente de una composición que comprende un polipéptido como se describe en el presente documento. El término “prevenir”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la profilaxis, que incluye la administración de una composición a un paciente para reducir la probabilidad de que el paciente se infecte por el VIH en relación con un paciente similar que no reciba la composición. El término prevención también incluye la administración de una composición a un grupo de pacientes para reducir el número de pacientes en el grupo que se infectan por el VIH en relación con un grupo de pacientes similar que no recibe la composición.

Varias realizaciones de la invención se refieren a una vacuna para uso en un método de tratamiento o prevención de una infección por VIH en un paciente humano que comprende la administración al paciente de una vacuna de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento.

Un paciente puede estar infectado por el VIH, puede haber estado expuesto al VIH o puede presentar un riesgo elevado de exposición y/o infección por VIH.

VII. Métodos de selección de anticuerpos

Otras realizaciones incluyen un método para ensayar una muestra que contiene un anticuerpo, que comprende poner en contacto la muestra con un polipéptido descrito en el presente documento y determinar la afinidad de unión entre el anticuerpo y el polipéptido. La afinidad de unión puede ser una afinidad de unión relativa, por ejemplo, la afinidad de unión puede ser relativa a la afinidad de unión de uno o más anticuerpos diferentes presentes en la muestra o ensayados de otro modo utilizando un método sustancialmente idéntico. Del mismo modo, la afinidad de unión puede ser una afinidad de unión cuantitativa, por ejemplo, el método puede incluir la determinación de una constante de disociación (K<d>) dentro de un rango deseable de certeza, como ± un orden de magnitud, ±50%, ±10%, etc. El método puede ser un método de maduración de la afinidad de anticuerpos.

Las realizaciones también incluyen un método de selección de un anticuerpo anti-VIH a partir de una pluralidad de anticuerpos. El método puede comprender el contacto de un polipéptido como se describe en el presente documento con una composición que contiene la pluralidad de anticuerpos y la identificación de un anticuerpo que tiene una alta afinidad de unión con el polipéptido en relación con otros anticuerpos de la composición, seleccionando de esta manera el anticuerpo anti-VIH. El método puede ser un método de selección de un anticuerpo anti-VIH que se une específicamente a un determinante antigénico de una secuencia de aminoácidos de la gp120 o de una secuencia de aminoácidos de la gp41, como se describe en el presente documento.

VIII. Métodos de selección de muestras biológicas

También se divulga un método de selección de muestras biológicas de un suministro de muestras biológicas humanas que comprende la selección del suministro de aquellas muestras que comprenden anticuerpos que forman un complejo antígeno-anticuerpo con un polipéptido como se describe en el presente documento. Esto es útil para identificar una muestra seropositiva para retirarla del suministro, particularmente relevante cuando el suministro es de sangre. Las muestras no seleccionadas se pueden emplear para la preparación de productos relacionados con la sangre. Al identificar una muestra positiva al VIH, el método también puede ser útil en el enriquecimiento de muestras positivas.

También se divulga un método de selección de muestras biológicas a partir de un suministro de muestras biológicas humanas que comprende seleccionar del suministro aquellas muestras que no comprenden anticuerpos que formen un complejo antígeno-anticuerpo con el reactivo de inmunoensayo de acuerdo con la invención objeto de estudio. Esto es útil para identificar muestras biológicas útiles para la preparación de productos relacionados con la sangre.

Ejemplificación

Ejemplo 1. Diseño de polipéptidos que comprenden epítopos de la proteína de la envoltura del VIH

Se diseñaron varios polipéptidos que contenían epítopos de la proteína de la envoltura del VIH. Los polipéptidos env_1 a env_4 se diseñaron utilizando los epítopos de células B humanas gp120 derivados del Mapa de Epítopos de la Envoltura gp160 del VIH-1 de LANL (https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/maps/ab/gp160.html) cosidos utilizando secuencias ligadoras alfa helicoidales o de lámina beta. Estas secuencias también se fusionaron a una región CH2/CH3 de IgG murina. En algunas versiones, se incluyó la región bisagra de la IgG, permitiendo de esta manera la formación de un dímero. El polipéptido env_5 se diseñó utilizando la misma secuencia SYN-gp120 fusionada al motivo de tetramerización de p53. El polipéptido env_6 se diseñó utilizando la secuencia SYN-gp120 fusionada al motivo de trimerización de GCN4. El polipéptido env_7 se diseñó utilizando la secuencia SYN-gp120 fusionada con el motivo de trimerización de la clatrina. Los polipéptidos env_8 y env_9 se diseñaron utilizando los epítopos de células B humanas del mapa de epítopos de gp160 del VIH del LANL correspondientes a la gp41 cosidos con ligadores alfa helicoidales designados por “SYN-gp41” y fusionados al dominio CH2/CH3 de IgG con o sin la región bisagra. Los polipéptidos env_10 a env_17 se diseñaron utilizando una secuencia de gp120 del VIH-1 derivada de las secuencias de aminoácidos de las entradas 5TE4 y 5T33 del Banco de Datos de Proteínas (PDB) del RCSB fusionadas al dominio CH2/CH3 de IgG con o sin región bisagra o al bucle V3 de la gp120. Los polipéptidos env_14 a env_17 comprenden además una porción de la secuencia gp41 del VIH-1 derivada de las secuencias de aminoácidos de la entrada 5V8L del Banco de Datos de Proteínas (PDB) del RCSB fusionada al terminal C del dominio CH2/CH3 de IgG siguiendo un ligador alfa-helicoidal. Los polipéptidos env_18 y env_19 se diseñaron utilizando la secuencia gp41 derivada de la entrada 5V8L del PDB fusionada al dominio CH2/CH3 de IgG con o sin una región bisagra, respectivamente. El polipéptido env_20 fue una modificación del polipéptido env_8 con una región epitópica extendida. El polipéptido env_21 era el mismo que el polipéptido env_20 con el dominio SYN-gp120 fusionado en el terminal C. El polipéptido env_22 era una secuencia truncada de gp41 derivada de la secuencia de referencia del NCBI NP_579895 y fusionada a la secuencia SYN-gp120 con un dominio CH2/CH3 de IgG entre las secuencias gp41 y gp120. Los polipéptidos env_23 y env_24 se derivaron de un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-1 y se fusionaron con el dominio CH2/CH3 de IgG en su terminal C o terminal N, respectivamente. Los polipéptidos env_25 a env_27 eran el Clado A, el Clado C y una secuencia consenso correspondiente a un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH. Los polipéptidos env_28 y env_29 corresponden a un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-2 fusionado a un dominio CH2/CH3 de IgG en su terminal N o terminal C, respectivamente. Los polipéptidos env_30 y env_31 corresponden a un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-1 fusionado a un dominio CH2/CH3 de IgG en su terminal N o terminal C, respectivamente. Los polipéptidos env_32 y env_33 corresponden a las mismas secuencias gp41 utilizadas en el polipéptido env_22 con un dominio CH2/CH3 de IgG fusionado en su terminal N o terminal C, respectivamente. El polipéptido env_34 corresponde a la secuencia gp160 derivada de la SEQ ID NO:10 de la Patente EE.UU. No. 6,284,248, que se utilizó como control para los polipéptidos env_35 a env_38. Esta secuencia no incluye la secuencia transmembrana de la envoltura y tiene mutado el sitio de corte gp120/gp41. Los polipéptidos env_35 a env 38 corresponden a secuencias de la envoltura de los clados A, C, AE, y a una secuencia consenso alineada con las secuencias del polipéptido env_34. El polipéptido env_39 se derivó de un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-1 gp120 Clado B fusionado a una secuencia truncada de gp41 derivada de la secuencia de referencia del NCBI NP_579895 con un dominio CH2/CH3 de IgG entre las secuencias gp120 y gp41. El polipéptido env_40 corresponde a las mismas secuencias de la envoltura gp120 del VIH-1, una gp41 truncada fusionada junto con un dominio CH2/CH3 de IgG pero con un ligador más largo. El polipéptido env_41 corresponde a una secuencia truncada de gp41 derivada de la Secuencia de Referencia del NCBI NP_579895 fusionada en su terminal C a un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-1 gp120 con un dominio CH2/CH3 de IgG entre las secuencias gp41 y gp120. Los polipéptidos env_42 a env_44 son similares al polipéptido env_40, pero utilizan una secuencia gp120 de una cepa Clado A, AE y AG, respectivamente. El polipéptido env_45 es similar al polipéptido env_40, pero utiliza una secuencia consenso de gp120. El polipéptido env_46 se derivó de un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-1 gp120 Clado B fusionado a una secuencia de la proteína de la cápside del VIH-1 p24 con un dominio CH2/CH3 de IgG entre las secuencias gp120 y p24. El polipéptido env_47 se derivó de una secuencia de la proteína de la cápside del VIH-1 p24 fusionada a un epítopo de la proteína de la envoltura del VIH-1 gp120 de Clado B con un dominio CH2/CH3 de IgG entre las secuencias p24 y gp120. El polipéptido env_48 es similar al polipéptido env_46 con epítopos seleccionados de la proteína p24 eliminados. El polipéptido env_49 es similar al polipéptido env_47 con epítopos seleccionados de la proteína p24 eliminados. El polipéptido env_50 es similar al polipéptido env_46 con mutaciones seleccionadas de la proteína p24. El polipéptido env_51 es similar al polipéptido env_47 con mutaciones p24 seleccionadas. El polipéptido env_52 es similar al polipéptido env_46 con sustituciones selectas de alanina en la secuencia p24. El polipéptido env_53 es similar al polipéptido env_47 con sustituciones selectas de alanina en la secuencia p24. El polipéptido env_54 corresponde a una secuencia gp41 del VIH-1 fusionada en su terminal C a una proteína gp120 del VIH-1 con un dominio CH2/CH3 de IgG.

Cada “polipéptido” numerado de env_1 a env_38 corresponde a una SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:38. Cada “polipéptido” numerado de env_39 a env_54 corresponde a una SEQ ID NO:91 a SEQ ID NO:106.

Ejemplo 2. Modelos de polipéptidos recombinantes env

Las estructuras de los polipéptidos env_1 a env_38 y env_39 a env_54 descritos en el Ejemplo 1 y que tienen secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:1-38 y SEQ ID NO:91-106, respectivamente, se predijeron utilizando el software Rosetta dentro de la herramienta de modelado de proteínas Cyrus Biotech o al coser manualmente estructuras conocidas de la PDB utilizando PyMol. Las Figuras 2-40 y 44 se renderizaron en PyMol. Las proteínas de fusión se muestran en gris oscuro, y las secuencias de aminoácidos de la proteína de la envoltura del VIH (que comprenden uno o más epítopos) se muestran en gris claro.

La Figura 2 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3.

La Figura 3 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:4.

La Figura 4 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:5.

La Figura 5 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:6.

La Figura 6 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:7.

La Figura 7 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:20. La Figura 8 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:9.

La Figura 9 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO:12.

La Figura 10 es un modelo de un polipéptido dimérico que es representativo de los polipéptidos diméricos formados a partir de dos polipéptidos monoméricos codificados por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:15.

La Figura 11 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:14 y SEQ ID NO:16.

La Figura 12 es un modelo de un polipéptido dimérico que es representativo de los polipéptidos diméricos formados a partir de dos polipéptidos monoméricos codificados por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:17.

La Figura 13 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:18.

La Figura 14 es un modelo de un polipéptido dimérico que es representativo del polipéptido dimérico formado a partir de dos polipéptidos monoméricos codificados por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:19.

La Figura 15 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:21.

La Figura 16 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:22.

La Figura 17 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:23.

La Figura 18 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, y SEQ ID NO:27.

La Figura 19 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:28.

La Figura 20 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:29.

La Figura 21 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:30.

La Figura 22 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:31.

La Figura 23 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:32.

La Figura 24 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:33.

La Figura 25 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de las subunidades monoméricas codificadas por las secuencias de aminoácidos establecidas en la SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, y SEQ ID NO:38.

La Figura 26 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 92.

La Figura 27 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 93.

La Figura 28 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO 94.

La Figura 29 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>95.

La Figura 30 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>96.

La Figura 31 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos expuesta en<s>E<q>ID NO 97.

La Figura 32 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>98.

La Figura 33 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>99.

La Figura 34 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>100.

La Figura 35 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>101.

La Figura 36 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>102.

La Figura 37 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 103.

La Figura 38 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 104.

La Figura 39 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO 105.

La Figura 40 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID No 106.

La Figura 44 es un modelo de un polipéptido monomérico que es representativo de la subunidad monomérica codificada por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N<o>91.

Ejemplo 3. Clonación y expresión de polipéptidos recombinantes

Los polipéptidos env_1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, y env_18 se clonaron, se expresaron en células de mamífero y se aisló el sobrenadante celular. La proteína del sobrenadante celular se analizó en geles de 4-20 % de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio tris-glicina TGXTM (SDS-PAGE) realizadas bajo condiciones reductoras y no reductoras. Los geles se tiñeron con tinte de proteínas InstantBlueTM. Los polipéptidos env_1,2, 3, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, y 18 se expresaron a niveles detectables (figuras 41 y 42).

Ejemplo 4. Los polipéptidos recombinantes expresados en mamíferos son capaces de detectar anticuerpos del VIH en muestras de donantes mediante ELISA

Se utilizaron ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para determinar que los polipéptidos recombinantes env del VIH expresados en mamíferos son capaces de detectar anticuerpos del VIH en muestras de plasma de donantes a los que les faltaba el antígeno Env13 del VIH expresado en levadura (control). Brevemente, los pocillos de una placa de pocillos múltiples se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente con 50 pl de cada antígeno a la misma concentración molar, incluido el antígeno de control Env13 (levadura). Después de la incubación, las placas se lavaron dos veces con 340 |jl de tampón de lavado y después se bloquearon con tampón de bloqueo durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de bloquear las placas, se aspiró el tampón de bloqueo fuera de los pocillos y se agregaron 5 j l de cada muestra donante a los pocillos junto con 50 j l de diluyente de la muestra. A continuación, se cubrieron las placas y se incubaron durante 45 min a 37 °C. Después, se lavaron las placas 4 veces con 340 j l de tampón de lavado 1x y se agregaron 50 j l de conjugado anti-IgG-HRP a cada pocillo. Se cubrieron las placas y se incubaron de nuevo durante 45 min a 37 °C y se lavaron de nuevo con 340 j l de tampón de lavado 1x. La solución de sustrato se preparó al disolver un comprimido de OPD (20 mg) por 12 ml de tampón de sustrato. Posteriormente, se agregaron 50 j l de solución de sustrato a cada pocillo y la placa se incubó de nuevo durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Por último, se agregaron 15 j l de H2SO44N a cada pocillo para detener la reacción. Los antígenos unidos se cuantificaron al monitorizar la conversión de un sustrato de peroxidasa de rábano picante en producto mediante espectroscopia de absorción a 490 nm. Se analizó un máximo de 337 muestras.

El antígeno de control Env13 (levadura) sólo detectó aciertos positivos en 307 muestras de las 337 probadas. La mayoría de los antígenos env derivados de mamíferos probados fueron capaces de detectar resultados positivos no detectados por el Env13. Todas las muestras que fallaron por el Env13 (levadura) parecían ser muestras de bajo título. Sin embargo, los polipéptidos env derivados de mamíferos fueron capaces de cubrir hasta 4 muestras omitidas por el Env13 (expresado en levadura). Los resultados de la Tabla 1 demuestran que los nuevos polipéptidos recombinantes env derivados de mamíferos permiten la detección de anticuerpos del VIH en muestras de donantes que no fueron detectadas por el antígeno Env13 (levadura) de la técnica anterior.

Tabla 1. Detección de anticuerpos del VIH en muestras de donantes mediante polipéptidos recombinantes del VIH env

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido monomérico recombinante, que comprende

a) un péptido líder, y

b) una proteína de fusión, que comprende

i) al menos un epítopo de la proteína gp120 del VIH, y

ii) al menos un epítopo de la proteína gp41 del VIH;

en el que la proteína de fusión comprende una región que no está codificada por el VIH, dicha región consiste en un dominio Fc de un anticuerpo que carece de una región bisagra,

en el que el polipéptido recombinante carece de un dominio de transmembrana, y

en el que el polipéptido incluye al menos 4 epítopos de la proteína de la envoltura del VIH.

2. El polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos del dominio Fc del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID. NO: 77 o SEQ ID. NO: 80.

3. El polipéptido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido recombinante comprende además una etiqueta de afinidad de polihistidina.

4. El polipéptido recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido líder comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:84.

5. Un reactivo de inmunoensayo que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el reactivo de inmunoensayo está unido a un soporte sólido.

6. Un dispositivo para el ensayo de una composición que contiene un anticuerpo anti-VIH, que comprende un soporte sólido y el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el polipéptido está unido de forma covalente o no covalente al soporte sólido.

7. El dispositivo de la reivindicación 6, en el que el soporte sólido es un gránulo, una membrana, una placa de microtitulación, un chip de polipéptidos, o la fase sólida de una columna de cromatografía.

8. Un método de ensayo de una muestra que contiene un anticuerpo, que comprende:

poner en contacto la muestra y el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y determinar la afinidad de unión entre el anticuerpo y el polipéptido.

9. Un método de selección de un anticuerpo anti-VIH a partir de una pluralidad de anticuerpos, que comprende: poner en contacto

(a) el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y

(b) una composición que contiene la pluralidad de anticuerpos; e

identificar un anticuerpo que tiene una alta afinidad de unión al polipéptido en relación con otros anticuerpos en la composición, seleccionando de esta manera el anticuerpo anti-VIH.

10. Un polipéptido recombinante, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en la prevención de una infección por VIH en un paciente humano, que comprende administrar al paciente el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.