ES2981461T3 - Detección y cuantificación de péptidos glicosilados - Google Patents

Detección y cuantificación de péptidos glicosilados Download PDF

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Abstract

Un método de purificación y/o separación de glicopéptidos y cuantificación de los mismos. El método incluye poner en contacto una muestra que comprende glicopéptidos con un sustrato de enriquecimiento hidrófilo en condiciones que permiten que los glicopéptidos se unan al sustrato de enriquecimiento hidrófilo. Los glicopéptidos se eluyen del sustrato de enriquecimiento hidrófilo con un formato de amonio y acetonitrilo (ACN) en solución acuosa para crear una muestra enriquecida de glicopéptidos, que puede someterse a análisis para identificar glicopéptidos específicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

D E S C R IP C IÓ N
D etecc ión y cu a n tif ica c ió n de p é p tid o s g lico s ila d o s
C A M P O DE LA IN V E N C IÓ N
La p re se n te inve nc ión e s tá re la c io n a d a con p ro d u c to s b io fa rm a cé u tico s , y se re fie re a la d e te cc ió n y c u a n tif ica c ió n de la g lico s ila c ió n p o s tra d u cc io n a l in v ivo de p ro te ína s, co m o a n ticu e rp o s te ra p é u tico s y fra g m e n to s de los m ism o s .
A N T E C E D E N T E S
Los a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s te ra p é u tico s (m A b s ) son m o lécu la s h e te ro g é n e a s p ro d u c id a s en c é lu la s de m a m ífe ro s con m u ch a s va r ia n te s de p rod u cto , in c lu ye n d o las v a r ia n te s re su lta n te s de m o d ifica c io n e s p o s tra d u cc io n a le s (P T M ). La g lico s ila c ió n liga d a a N es u n a P T M im p o rta n te en los a n ticu e rp o s te ra p é u tico s . Las a g e n c ia s re g u la d o ra s e x ig en la c a ra c te r iza c ió n de las e s tru c tu ra s de los g lica n o s liga d os a N y la cu a n tif ica c ió n de las g lic o fo rm a s in d iv id u a le s p a ra d e fin ir la ca lid a d d e l p ro d u c to fa rm a cé u tico , d e m o s tra r la c o n s is te n c ia e n tre lo tes y g a ra n tiz a r e l co n tro l de l p ro ce so de fa b ric a c ió n . T ra d ic io n a lm e n te , los g lica n o s liga d os al N d e n tro de los a n ticu e rp o s se cu a n tif ica n lib e ra n d o e n z im á tic a m e n te los g lica n o s d e l a n ticu e rp o se g u id o d e l m a rca d o con re a c tivo s flu o re sce n te s . A lte rn a tiva m e n te , la g lico s ila c ió n p u e d e ca ra c te r iza rs e a n ive l p e p tíd ico a n a liza n d o los g lic o p é p tid o s g e n e ra d o s a p a rtir d e l d ig e rid o tríp tic o de un a n ticu e rp o . S in e m b a rg o , los g lic o p é p tid o s q u e p osee n g lic o fo rm a s h e te ro g é n e a s a m e nu do no se sep a ran b ien m e d ia n te c ro m a to g ra fía líq u id a en fa se in ve rsa (R P L C ), q u e se u sa tra d ic io n a lm e n te p a ra e l m a peo de p ép tid os . A d e m á s, la fra g m e n ta c ió n en la fu e n te in d u c id a p o r la e sp e c tro m e tría de m a sa s (M S ) en línea de la ca d e n a de a zú ca re s en los g lic o p é p tid o s p ue de p ro d u c ir a rte fa c to s de g lic o fo rm a s tru n ca d a s , q ue co m p ro m e te n la c u a n tif ica c ió n p re c isa de la a b u n d a n c ia re la tiva de las d ife re n te s g lic o fo rm a s u sa n d o MS.
K on d o e t al. (J. S ep . Sci. 2010 , 33, 891 -902 ) d iv u lg a un m é to do de e n riq u e c im ie n to de g lic o p é p tid o s p o r d ig e s tió n d o b le y no e sp e c ífica de g lico p ro te ín a s , a p lica n d o la m u e s tra q u e co m p re n d e g lic o p é p tid o s a u n a co lu m n a h id ró fo b a , y luego a p lica n d o el flu jo a u n a c o lu m n a h id ró fila . P a lm isa n o e t al. (N a tu re P ro toco ls , 2010 , 5, 12, 1974 1982) d iv u lg a un m é to d o p ara el e n riq u e c im ie n to se le c tivo de g lic o p é p tid o s q ue co n tie n e n á c id o s iá lico u sa nd o c ro m a to g ra fía de d ió x id o de tita n io . L a rsen e t al. (M o le cu la r & C e llu la r P ro teo m ics , 2005 , 4, 107 -119 ) d iv u lg a un m é to do de c a ra c te r iza c ió n de g lic o p ro te ín a s s e p a ra d a s en g e l u sa n d o d ig e s tió n p ro te o lít ica no e sp e c ífica de d os pasos c o m b in a d a con u n a c o lu m n a de fa se in ve rsa h id ró fo b a y u n a c o lu m n a de p o lvo de g ra fito . A la g e sa n e t al. (A na l B ioana l C he m , 2017 , 409 :529 -538 ) p ro p o rc io n a u n a re v is ión de l im p ac to de d ife re n te s fa se s m ó v ile s sob re el e n riq u e c im ie n to de g lic o p é p tid o s p o r H IL IC zw itte rió n ico .
B R E V E R E S U M E N DE LA IN V E N C IÓ N
La inve nc ión se d e fin e en las re iv in d ica c io n e s a d ju n ta s . En un a sp ec to , la p re se n te inve n c ió n p ro p o rc io n a un m é to do p a ra se p a ra r g lico p é p tid o s , en el q ue el m é to do co m p re n d e : p o n e r en co n ta c to u n a m u e s tra q u e co m p re n d e g lic o p é p tid o s con un su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo en co n d ic io n e s q ue p e rm ita n q ue los g lic o p é p tid o s se unan al su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo ; la va r e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo p a ra e lim in a r c o n ta m in a n te s que no son g lic o p é p tid o s de l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo ; e lu ir los g lic o p é p tid o s de l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo con u n a so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y a ce to n itr ilo (A C N ) en a gu a , c re a n d o de e s te m o do u na m u e s tra de g lic o p é p tid o s e n riq u e c id a ; a p lic a r la m u es tra de g lic o p é p tid o s e n riq u e c id a a u na c o lu m n a de se p a ra c ió n ; y e lu ir los g lic o p é p tid o s de la c o lu m n a de s e p a ra c ió n , se p a ra n d o de e s te m o do los g lic o p é p tid o s de la m u es tra .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo co m p re n d e un su s tra to de c ro m a to g ra fía de e x tra cc ió n en fa se só lid a (SPE).
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo co m p re n d e un m a te ria l so rb e n te a m in o p ro p ílico a base de s ílice .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N en a gu a co m p re n d e a p ro x im a d a m e n te 100 -400 m M de fo rm ia to de a m o n io y a p ro x im a d a m e n te de un 2 ,5 % a a p ro x im a d a m e n te un 10% de A C N en agua.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N co m p re n d e 200 m M de fo rm ia to de a m on io y un 5 % de A C N en agua.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava con u n a so lu c ió n de lava do de á c ido fó rm ico y A C N q ue co m p re n d e de un 0 ,5 % a a p ro x im a d a m e n te un 5% de á c id o fó rm ic o en v o lu m e n y de a p ro x im a d a m e n te un 85 % a a p ro x im a d a m e n te un 95 % de A C N en v o lu m e n con e l re s to de a gu a p a ra e lim in a r los co n ta m in a n te s q u e no son g lico p é p tid o s .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la so lu c ió n de lava do de á c id o fó rm ic o y A C N co m p re n d e un 1% de á c id o fó rm ico , un 9 % de H<2>O, un 90% de A C N en vo lu m e n .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la co lu m n a de se p a ra c ió n co m p re n d e u n a c o lu m n a de in te ra cc ió n h id ró fila (H IL IC ).
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e lu ir e l g lic o p é p tid o de la c o lu m n a de se p a ra c ió n co m p re n d e a d e m á s se p a ra r los g lic o p é p tid o s en u na o m ás fra cc io n e s .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , s e p a ra r los g lic o p é p tid o s en u n a o m ás fra cc io n e s co m p re n d e a p lic a r un g ra d ie n te de fa se m ó v il a la c o lu m n a de se p a ra c ió n .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l g ra d ie n te de la fa se m óvil es 10 m M de fo rm ia to de a m on io , pH 4 ,5 a un 90% de A C N con 10 m M de fo rm ia to de a m on io , pH 4,5.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l g ra d ie n te de la fa se m ó v il es 0 ,05% de T F A en H<2>O o 0 ,045 % de T F A en A C N .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m é to do inc lu ye a d e m á s id e n tif ic a r los g lic o p é p tid o s p re se n te s en u na o m ás de las fra cc io n e s .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m é to d o inc lu ye a d e m á s id e n tif ic a r un g lica n o a so c ia d o con los g lico p é p tid o s p re se n te s en u n a o m ás de las fra cc io n e s .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l g lica n o co m p re n d e un N -g lica no .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , los g lic o p é p tid o s se o b tie n e n a p a rtir de un a n ticu e rp o m o no c lo na l.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l a n ticu e rp o m o n o c lo n a l es de iso tipo IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, o de iso tipo m ixto .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m é to d o inc lu ye a d e m á s d ig e r ir el a n ticu e rp o m o n o c lo n a l con u na p ro te asa .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , la p ro te a sa co m p re n d e trip s in a .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m é to d o inc lu ye a d e m á s re a liza r a n á lis is de e sp e c tro m e tría de m a sa s de los g lic o p é p tid o s e lu id os .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m é to do inc lu ye a d e m á s re a liza r p e rfile s de g lico s ila c ió n a n ive l de g lico p é p tid o de los g lic o p é p tid o s e lu id os .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l m é to d o inc lu ye a d e m á s p re la v a r e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo con una so lu c ió n de a ce to n itr ilo (A C N ) en agua.
En a lg u n a s re a liza c io n e s , el m é to do inc lu ye a d e m á s d ilu ir u n a m u e s tra q ue co m p re n d e g lico p é p tid o s en una so lu c ió n de A C N en a g u a a n te s de l co n ta c to con e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo .
D E S C R IP C IÓ N DE L A S F IG U R A S
La F ig ura 1 m u e s tra un d ia g ra m a e sq u e m á tic o de flu jo de tra b a jo q u e ilus tra los m é to d o s e s tá n d a r a c tu a le s de cu a n tif ica c ió n de g lic o p é p tid o s m e d ia n te c ro m a to g ra fía líqu ida a co p la d a a e sp e c tro m e tría de m a sa s (L C /M S ). La F ig u ra 2 m u e s tra u n a ta b la q u e m u e s tra los re su lta d o s de l m é to do de cu a n tif ica c ió n de g lic o p é p tid o s m o strad o en e l flu jo de tra b a jo de la F ig u ra 1, co m p a ra d o con la c u a n tif ica c ió n de g lica n o s lib e ra d o s ; es d ec ir, u no b a sa d o en la d e te cc ió n de g lic o p é p tid o s y e l o tro b a sa d o en la d e te cc ió n de g lica n o s libe rados .
La F ig u ra 3 m u e s tra un e sp e c tro de m a sa s q ue d e m u e s tra q u e las d is c re p a n c ia s e n tre las cu a n tif ica c io n e s de g lic o fo rm a s m e d ia n te los m é to d o s de g lico p é p tid o y de g lica n o lib e ra d o (ve r la F igura 2) se d e b e n p ro b a b le m e n te a la fra g m e n ta c ió n en la fu e n te de la e s tru c tu ra p rin c ip a l de a zú ca re s p o r M S en el a n á lis is de g lico p é p tid o s , q ue p ro vo ca un a u m e n to de los a rte fa c to s de g lica n o tru n c a d o s (es d ec ir, G 0 F -G lcN A c y G 1 F -G lcN A c ) y una d ism in u c ió n de l g lica n o p rin c ip a l (es d ec ir, G 0 F y G 1F). El m é to do de l g lica n o lib e ra d o cu a n tif ica las g lico fo rm a s p o r la f lu o re sc e n c ia d e l m a rc a d o r u n id o al g lica n o libe ra do , no p o r la señ a l MS.
La F ig ura 4 m u e s tra un d ia g ra m a de flu jo de tra b a jo p a ra los m é to d o s de c u a n tif ica c ió n de g lic o p é p tid o s d ivu lg a d o s en la p rese n te .
La F ig u ra 5 m u e s tra un co n ju n to de c ro m a to g ra m a s H IL IC -U V de p é p tid o s mAb1 q ue m u e s tra n los re su lta d o s de u n a se p a ra c ió n de p é p tid o s mAb1 o b te n id o s de la d ig e s tió n tríp t ic a p o r d o s m é to d o s d ife re n te s .
La F ig u ra 6 m u e s tra un p rim e r p la n o de la p o rc ió n de g lic o p é p tid o de la tra za m o s tra d a en la F ig ura 5 que d e m u e s tra q u e el m é to do N°2 te n ía m e jo r se p a ra c ió n , p ico s m ás n ítid os y m a yo r re lac ió n S /N .
La F ig u ra 7 m u e s tra un c o n ju n to de c ro m a to g ra m a s H IL IC -T IC de g lic o p é p tid o s de mAb1 h a c ie n d o zoo m sob re los g lico p é p tid o s . C om o se m u es tra , e l m é to do N°2 te n ía u na m a yo r re lac ió n S /N de la señ a l de MS.
Las F ig uras 8 A y 8B m u es tra n e sp e c tro s MS1 de g lic o p é p tid o s mAb1 (io ne s M 2+).
La F ig ura 9 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue m u es tra n u na c o m p a ra c ió n de la c u a n tif ica c ió n de g lic o fo rm a s m e d ia n te la se p a ra c ió n de g lic o p é p tid o s en u n a co lu m n a H IL IC con el a n á lis is de g lica n o s libe ra do s . La F ig u ra 10 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue d e m u e s tra n q u e e l se ca d o de los d ig e rid o s p e p tíd ico s p o d ía a yu d a r a c o n c e n tra r los g lico p é p tid o s , p e ro no a fe c ta b a a la señ a l U v ni al % de PA re la tivo de los g lica no s. La F igura 11 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s q ue ilus tran los c a m b io s re a liza d o s p a ra s im p lif ic a r las p re p a ra c io n e s de fa se s m ó v ile s y m e jo ra r la in te g ra c ió n de los p ico s u sa nd o un 0 ,05 % y un 0 ,045 % de T F A en a gu a y A C N , re sp e c tiva m e n te (fa se m óvil de m a pe o de p é p tid o s R P -LC ).
Las F ig uras 12A, 12B, 12C y 12D m u es tra n un c o n ju n to de re su lta d o s de e sp e c tro s de m a sa s q ue d e m u e s tra n q u e el c a m b io de fa se m óvil no tu vo n ingún im p a c to sob re la señ a l de M S de los g lic o p é p tid o s (io ne s M 2+). La F igura 13 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s q ue d e m u e s tra n la e s ta b ilid a d en so lu c ió n de los g lico p é p tid o s mAb1 d ilu id o s al 80 % de A C N .
La F igura 14 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s q u e d e m u e s tra n q u e los d ig e rid o s tríp tic o s con g lic o p é p tid o s m al co rta d o s co m p lica n la c u a n tif ica c ió n de los g lic o p é p tid o s p o r UV.
La F ig u ra 15 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s y u n a ta b la q u e d e m u e s tra n q u e con los d a to s de M S en líne a p uede u sa rse E IC p a ra e n c o n tra r e l p o rce n ta je de g lic o p é p tid o s m al co rta d o s en c a d a p ico p a ra a yu d a r a la cu a n tifica c ió n de la g lico fo rm a .
La F ig u ra 16 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s y u n a ta b la q ue d e m u e s tra n q ue la re d ig es tión de m A b2 con tr ip s in a e lim in ó los g lico p é p tid o s m a l c o rta d o s p a ra a yu d a r a la c u a n tif ica c ió n de la g lico fo rm a .
La F igura 17 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s q u e d e m u e s tra n q ue e l fo rm ia to de a m o n io m e jo ró s ig n ifica tiva m e n te la e lu c ió n de g lic o p é p tid o s a p a rtir de S P E H IL IC .
La F ig u ra 18 m u e s tra un c o n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue d e m u e s tra n q u e el se ca d o o la lim p ie za /se ca d o de S P E no tu v ie ro n n in g ún e fe c to sob re la cu a n tif ica c ió n de l g lico p é p tid o m A b 1.
La F ig ura 19 m u e s tra un co n ju n to de tra za s y u n a ta b la q ue d e m u e s tra n cu a n tif ica c io n e s s im ila re s de la g lico fo rm a m A b 3 m e d ia n te a n á lis is de g lic o p é p tid o s y g lica n o s libe ra do s .
Las F ig uras 20 A y 20B m u es tra n un c o n ju n to de tra za s y u n a ta b la q u e d e m u e s tra n cu a n tif ica c io n e s s im ila re s de g lic o fo rm a s u sa n d o d ig e rid o s tr íp tic o s de m A b3 re d u c id a s y no re d u c id a s m e d ia n te a n á lis is de g lic o p é p tid o s y g lica n o s libe ra do s .
La F ig u ra 21 m u e s tra un co n ju n to de tra za s q ue ilus tra n u na c o m p a ra c ió n de la se p a ra c ió n de los g lico p é p tid o s IgG1 e IgG 4, con y sin fu co s ila c ió n .
La F ig ura 22 m u e s tra un d ia g ra m a e sq u e m á tic o de flu jo de tra b a jo q ue ilus tra m é to d o s de cu a n tif ica c ió n de g lic o p é p tid o s q u e inc lu ye n los m é to d o s d ivu lg a d o s en la p rese n te .
D E S C R IP C IÓ N D E T A L L A D A DE LA IN V E N C IÓ N
A n te s de d e s c r ib ir la p re se n te in ve n c ió n , d eb e e n te n d e rs e q u e e s ta inve n c ió n no se lim ita a los m é to d o s y c o n d ic io n e s e xp e rim e n ta le s p a rticu la re s d e sc rito s , ya q u e ta le s m é to d o s y co n d ic io n e s p ue de n va ria r. T a m b ié n d ebe e n te n d e rse q u e la te rm in o lo g ía u sa d a en la p re se n te tie n e ú n ica m e n te el p ro p ó s ito de d e s c r ib ir re a liza c io n e s p a rticu la re s , y no se p re te n d e q ue se a lim ita tiva , ya q u e el a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n e s ta rá lim ita d o ú n ica m e n te p o r las re iv in d ica c io n e s ad ju n tas . C u a le s q u ie ra re a liza c io n e s o c a ra c te rís tic a s de las re a liza c io n e s p ue de n c o m b in a rse e n tre sí, y ta le s co m b in a c io n e s se inc lu ye n e xp re sa m e n te d e n tro d e l a lca n ce de la p re se n te inve nc ión .
A m e no s q ue se d e fin a de o tro m odo, to d o s los té rm in o s té c n ico s y c ie n tíf ico s u sa d o s en la p re se n te tien en el m ism o s ig n ifica d o q ue el e n te n d id o co m ú n m e n te p o r un e xp e rto en la té c n ica a la q ue p e rte n e ce e s ta inve nc ión . C om o se u sa en la p rese n te , e l té rm in o "a p ro x im a d a m e n te ", cu a n d o se u sa en re fe re n c ia a un v a lo r n um é rico e n u m e ra d o p a rticu la r, s ig n ifica q u e e l v a lo r p ue de v a r ia r de l v a lo r e n u m e ra d o en no m ás de l 1%. P o r e je m p lo , com o se u sa en la p rese n te , la e xp re s ió n "a p ro x im a d a m e n te 100" inc lu ye 99 y 101 y to d o s los va lo re s in te rm e d io s (p o r e je m p lo , 99 ,1 ,99 ,2 , 99 ,3 , 99,4, e tc .).
A u n q u e en la p u e s ta p rá c tica o las p ru e b a s de la p re se n te inve n c ió n p ue de u sa rse c u a lq u ie r m é to do y m a te ria l s im ila r o e q u iva le n te a los d e sc rito s en la p rese n te , a h o ra se d e sc rib e n los m é to d o s y m a te ria le s p re fe rid os .
A b re v ia tu ra s u s a d a s en la p re s e n te
P T M s: M o d ifica c io n e s p o s tra d u cc io n a le s
R P -L C -M S /M S : C ro m a to g ra fía líq u id a de fa se in ve rsa y e sp e c tro m e tría de m a sa s en tán de m
m A b: A n ticu e rp o m o no c lo na l
IgG : In m u n o g lo b u lin a G
LC : C a d e n a L ige ra
H C: C a d e n a p e sa d a
M S: E sp e c tro m e tría de m asas
S P E : E x tra cc ió n en fa se só lid a
H IL IC : C ro m a to g ra fía líq u id a de in te ra cc ió n h id ró fila
U V: U ltra v io le ta
T F A : á c id o triflu o ro a c é tic o
A C N : A ce to n itr ilo
D e fin ic io n e s
El té rm in o "a n ticu e rp o ", co m o se u sa en la p re se n te , se re fie re a m o lé cu la s de in m u n o g lo b u lin a c o m p u e s ta s p o r cu a tro c a d e n a s p o lip e p tíd ica s , d o s c a d e n a s p e sa d a s (H ) y d o s c a d e n a s lige ra s (L) in te rco n e c ta d a s p o r e n la ce s d isu lfu ro (es d ec ir, "m o lé cu la s de a n ticu e rp o co m p le ta s "), a s í co m o m u ltím e ro s de las m ism as (p o r e je m p lo , IgM ) o fra g m e n to s de un ión a a n tíg e n o de las m ism as . C a d a ca d e n a p e sa d a e s tá co m p u e s ta p o r u n a reg ión v a r ia b le de ca d e n a p e sa d a ("H C V R " o "V<h>") y u n a reg ión co n s ta n te de ca d e n a p e sa d a (co m p u e s ta p o r los d o m in io s C<h>1, C<h>2 y C<h>3). En v a r ia s re a liza c io n e s , la ca d e n a p e sa d a p ue de s e r un iso tipo IgG. En a lg u n o s caso s, la ca d e n a p e sa d a se s e le cc io n a e n tre IgG 1, IgG 2, IgG 3 o IgG 4. En a lg u n a s re a liza c io n e s , la ca d e n a p e s a d a es de iso tipo IgG1 o IgG 4, in c lu ye n d o o p c io n a lm e n te u na reg ión b isa g ra q u im é ric a de iso tipo IgG 1 /IgG 2 o IgG 4 /IgG 2. C a d a c a d e n a lig e ra e stá c o m p u e s ta de u n a reg ión v a r ia b le de c a d e n a lige ra ("LC V R o "V<l>") y u na reg ión co n s ta n te de c a d e n a lige ra (C<l>). Las re g io n e s V<h>y V<l>p ue de n su b d iv id irse a su ve z en re g io n e s de h ip e rva ria b ilid a d , d e n o m in a d a s re g io n e s d e te rm in a n te s de la co m p le m e n ta rie d a d (C D R ), in te rca la d a s con re g io n e s q u e e s tá n m á s c o n se rva d a s , d e n o m in a d a s re g io n e s m arco (FR ). C a d a V<h>y V<l>se co m p o n e de tre s C D R y cu a tro FR, d is p u e s ta s de e x tre m o te rm in a l a m in o a e x tre m o te rm in a l ca rb o x i en el s ig u ie n te o rd e n : FR1, C D R 1, FR2, C D R 2, FR3, C D R 3, FR4. El té rm in o "a n ticu e rp o " inc lu ye re fe re n c ia r ta n to a in m u n o g lo b u lin a s g lic o s ila d a s co m o no g lico s ila d a s de c u a lq u ie r iso tipo o sub c la se . El té rm in o "a n ticu e rp o " inc lu ye m o lé cu la s de a n ticu e rp o p re p a ra d a s , e xp re sa d a s , c re a d a s o a is la d a s p o r m e d io s re co m b in a n te s , com o a n ticu e rp o s a is la d o s de u n a c é lu la h ué sp ed tra n s fe c ta d a p a ra q u e e xp re se el a n ticu e rp o . P ara u n a re v is ió n de la e s tru c tu ra de los a n ticu e rp o s , c o n s u lta r L e fra nc e t a l.,IM G T u n iq u e n u m b e r in g fo r im m u n o g lo b u lin a n d T c e l l re c e p to r v a ria b le d o m a in s a n d Ig s u p e rfa m ily V -like d o m a in s ,27 (1 ) D ev. C om p. Im m uno l. 55 -77 (2003 ); y M. P otte r,S tru c tu ra l co rre la te s o f im m u n o g lo b u lin d ive rs ity ,2 (1) S urv . Im m u no l. Res. 27 -42 (1983).
El té rm in o a n ticu e rp o ta m b ié n a b a rca el "a n ticu e rp o b ie sp e c ífico ", q u e inc lu ye u n a in m u n o g lo b u lin a h e te ro te tra m é ric a q u e p ue de u n irse a m ás de un e p íto p o d ife re n te . U na m itad de l a n ticu e rp o b ie sp e c ífico , q u e inc luye u na ú n ica ca d e n a p e sa d a y u na ú n ica ca d e n a lige ra y se is C D R , se u ne a un a n tíg e n o o e p íto p o , y la o tra m itad del a n ticu e rp o se u ne a un a n tíg e n o o e p íto p o d ife re n te . En a lg u n o s caso s, el a n ticu e rp o b ie sp e c ífico p ue de u n irse al m ism o a n tíge no , p e ro a e p íto p o s d ife re n te s o a e p íto p o s no so la p a d o s . En a lg u n o s caso s, a m b a s m ita d e s de l a n ticu e rp o b ie sp e c ífico tie n e n c a d e n a s lige ra s id é n tica s p e ro co n se rva n la e sp e c ific id a d d ua l. Los a n ticu e rp o s b ie sp e c ífico s se d e sc rib e n de m a n e ra g e n e ra l en la P ub licac ión de S o lic itu d de P a ten te de E s ta d os U n id os N° 2010 /0331527 (30 de d ic ie m b re de 2010).
El té rm in o "p o rc ión de u n ión a a n tíg e n o " de un a n ticu e rp o (o " fra g m e n to de a n ticu e rp o "), se re fie re a uno o m ás fra g m e n to s de un a n ticu e rp o q ue re tien en la ca p a c id a d de u n irse e sp e c ífica m e n te a un a n tíg e n o . E jem p lo s de fra g m e n to s de u n ión e n g lo b a d o s d e n tro de l té rm in o "p o rc ión de u n ión a a n tíg e n o " de un a n ticu e rp o inc lu ye n (i) un fra g m e n to Fab, un fra g m e n to m o n o va le n te q u e c o n s is te en los d o m in io s V L, V H , C L y C H 1 ; (ii) un fra g m e n to F (ab ')2, un fra g m e n to b iva le n te q u e co m p re n d e d o s fra g m e n to s Fab e n la za d o s p o r un p u e n te d isu lfu ro en la reg ión b isa g ra ; (iii) un fra g m e n to Fd q u e c o n s is te en los d o m in io s V H y C H 1 ; (iv) un fra g m e n to Fv q u e c o n s is te en los d o m in io s V L y V H de un so lo b razo de un a n ticu e rp o , (v) un fra g m e n to d A b (W ard e t al. (1989 ) N a tu re 241 :544-546), q u e c o n s is te en un d o m in io V H , (vi) u na C D R a is la d a , y (v ii) un scF v, q ue c o n s is te en los d o s d o m in io s de l fra g m e n to Fv, V L y VH , u n id o s p o r un c o n e c to r s in té tico p a ra fo rm a r u na ú n ica ca d e n a de p ro te ín a s en la q ue las re g io n e s V L y V H se e m p a re ja n p a ra fo rm a r m o lé cu la s m o n o va le n te s . En e l té rm in o "a n ticu e rp o " ta m b ié n se e n g lo b a n o tras fo rm a s de a n ticu e rp o s de c a d e n a sen c illa , co m o los d ia cu e rp o s , (co n su lta r, p o r e je m p lo , H o llig e r e t at. (1993 ) 90 P N A S U .S .A .
6444 -6448 ; y P o ljak e t at. (1994 ) 2 S tru c tu re 1121 -1123 ).
A d e m á s, los a n ticu e rp o s y los fra g m e n to s de u n ión a a n tíg e n o de los m ism os p ue de n o b te n e rs e u sa nd o té c n ica s e s tá n d a r de A D N re co m b in a n te co m ú n m e n te c o n o c id a s en la té c n ica (co n su lta r S a m b ro o k e t a l., 1989).
Se p re te n d e q u e el té rm in o "a n ticu e rp o h u m a n o " inc lu ya a n ticu e rp o s q ue tie n e n re g io n e s va r ia b le s y co n s ta n te s d e riva d a s de s e cu e n c ia s de in m u n o g lo b u lin a de línea g e rm in a l h um a na . Los m A b s h um a n o s de la inve n c ió n p u e d e n in c lu ir re s id u o s de a m in o á c id o s no c o d ifica d o s p o r se cu e n c ia s de in m u n o g lo b u lin a de la línea g e rm in a l h u m a n a (p o r e je m p lo , m u ta c io n e s in tro d u c id a s p o r m u ta g é n e s is a le a to ria o e sp e c ífica de s itio in v itro o p o r m u ta c ión so m á tica in v ivo ), p o r e je m p lo en las C D R y en p a rtic u la r en la C D R 3. S in e m b a rg o , no se p re te n d e q ue el té rm in o "a n ticu e rp o h um a no ", co m o se u sa en la p re se n te , in c lu ya m A b s en los q ue s e cu e n c ia s de C D R d e riva d a s de la líne a g e rm in a l de o tra e sp e c ie de m a m ífe ro (p o r e je m p lo , ra tón ), se han in je rta d o en se cu e n c ia s FR h um a na s . El té rm in o inc lu ye a n ticu e rp o s p ro d u c id o s re co m b in a n te m e n te en un m a m ífe ro no h um a no , o en c é lu la s de un m a m ífe ro no h um a no . No se p re te n d e q ue e l té rm in o in c lu ya a n ticu e rp o s a is la d o s de o g e n e ra d o s en un su je to hum ano .
C o m o se u sa en la p re se n te e l té rm in o "g lic o p é p tid o /g lico p ro te ín a " es un p é p tid o /p ro te ín a m o d ificad o , d u ra n te o d e sp u é s de su s ín tes is , con ca rb o h id ra to s o g lica n o u n id o s co va le n te m e n te . En c ie rta s re a liza c io n e s , un g lico p é p tid o se o b tie n e a p a rtir de un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l, p o r e je m p lo , a p a rt ir de un d ig e rid o de p ro te a sa de un a n ticu e rp o m o no c lo na l.
C o m o se u sa en la p re se n te e l té rm in o "g lica n o " es un c o m p u e s to q ue co m p re n d e u n a o m ás u n id a d e s de a zú ca r, e n tre las q ue co m ú n m e n te se inc lu ye n g lu co sa (G lc), g a la c to sa (G al), m a n o sa (M an ), fu c o sa (Fuc), N-a ce tilg a la c to s a m in a (G a lN A c), N -a ce tilg lu co sa m in a (G lcN A c) y á c id o N -a ce tiln e u ra m ín ico (N e u N A c) (F ra n k K je ld sen , e t al. A na l C he m . 2003 , 75, 2355 -2361 ). La fra cc ió n de g lica n o en u na g lico p ro te ín a , co m o un a n ticu e rp o m o no c lo na l, es un c a rá c te r im p o rta n te p a ra id e n tif ic a r su fu n c ió n o lo ca liza c ió n ce lu la r. P o r e je m p lo , un a n ticu e rp o m o no c lo na l e sp e c ífico se m o d ifica con u n a fra cc ió n de g lica n o e sp ec ífica .
Se p re te n d e q u e e l té rm in o "c ro m a to g ra fía de in te ra cc ió n h id ró fila " o H IL IC in c lu ya un p ro ce so q ue e m p le a u n a fa se e s ta c io n a ria h id ró fila y u na fa se m óvil o rg á n ic a h id ró fo b a en la q u e los co m p u e s to s h id ró filo s se re tien en d u ra n te m ás tie m p o q u e los co m p u e s to s h id ró fo b o s . En c ie rta s re a liza c io n e s , e l p ro ce so u tiliza u n a fa se m óvil de so lve n te m isc ib le en agua.
El té rm in o "m u e s tra ", co m o se u sa en la p rese n te , se re fie re a u na m e zc la de m o lé cu la s q ue co m p re n d e p o r lo m enos u na m o lé cu la de a na lito , p o r e je m p lo , un g lico p é p tid o , co m o el o b te n id o a p a rtir de un a n ticu e rp o m o no c lo na l, q ue se so m e te a m a n ip u la c ió n de a cu e rd o con los m é to d o s de la inve nc ión , in c lu ye n d o , p o r e je m p lo , sep a rac ión , a ná lis is , e x tra cc ió n , c o n ce n tra c ió n o re a liza c ió n de p erfile s .
Los té rm in o s "a n á lis is " o "a n a liza n d o ", co m o se usan en la p re se n te , se usan in d is tin ta m e n te y se re fie ren a cu a lq u ie ra de los v a r io s m é to d o s de se p a ra c ió n , d e te cc ió n , a is la m ie n to , p u rifica c ió n , s o lu b iliza c ió n , d e te cc ió n y /o ca ra c te r iza c ió n de m o lé cu la s de in te rés (p o r e je m p lo , g lico p ro te ín a ). Los e je m p lo s inc lu ye n , p e ro no se lim itan a, e x tra cc ió n en fa se só lid a , m ic ro e x tra cc ió n en fa se só lid a , e le c tro fo re s is , e sp e c tro m e tría de m a sas, p o r e je m p lo , S P E H IL IC , M A L D I-M S o ESI, c ro m a to g ra fía líqu ida , p o r e je m p lo , de a lto re n d im ie n to , p o r e je m p lo , de fa se inve rsa , fase n o rm a l o e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o , c ro m a to g ra fía líq u id a de p a re s ión icos , e x tra cc ió n líq u id o -líq u id o , p o r e je m p lo , e x tra cc ió n con flu id o a ce le ra d o , e x tra cc ió n con flu id o su p e rc rítico , e x tra cc ió n a s is tid a p o r m ic ro o n d a s , e x tra cc ió n con m e m bran a , e x tra cc ió n soxh le t, p re c ip ita c ió n , c la rifica c ió n , d e te cc ió n e le c tro q u ím ica , t in c ió n , a n á lis is e le m e n ta l, d e g ra d a c ió n de E dm un d, re so n a n c ia m a g n é tica n uc lea r, a n á lis is p o r in fra rro jo s , a n á lis is p o r inye cc ió n en flu jo , e le c tro c ro m a to g ra fía ca p ila r, d e te cc ió n u ltra v io le ta , y c o m b in a c io n e s de los m ism os.
El té rm in o "re a liza c ió n de p e rfile s", co m o se u sa en la p rese n te , se re fie re a cu a lq u ie ra de los v a r io s m é to do s de a n á lis is q ue se usa n en c o m b in a c ió n p a ra p ro p o rc io n a r el co n te n id o , la co m p o s ic ió n o la p ro p o rc ió n c a ra c te rís tica de los g lic o p é p tid o s en u na m u es tra .
Un "su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo ", co m o se u sa en la p re se n te , es un m a te ria l c ro m a to g rá fic o q u e se u ne p re fe re n te m e n te a m a te ria le s h id ró filo s en co n d ic io n e s q u e p e rm ite n la u n ión , p o r e je m p lo , pH , fu e rz a ión ica , e tc. En a lg u n a s re a liza c io n e s , un su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se u sa p a ra S PE .
El té rm in o "su p e rfic ie c ro m a to g rá fica ", co m o se u sa en la p re se n te , inc lu ye u na s u p e rfic ie q u e e s tá e xp u e s ta a u na m u e s tra o a a na lito s . U na s u p e rfic ie c ro m a to g rá fic a p u e d e e s ta r q u ím ic a m e n te m o d ificad a , fu n c io n a liz a d a o a c tiva d a o te n e r u na m ic ro e s tru c tu ra , p o r e je m p lo , un poro . En c ie rta s re a liza c io n e s , la su p e rfic ie c ro m a to g rá fic a p uede s e r h id ró fob a , h id ró fila (p o la r) o ión ica . En o tra s re a liza c io n e s , la s u p e rfic ie c ro m a to g rá fic a es to ta lm e n te porosa , su p e rfic ia lm e n te p o ro sa o no p oro sa .
El té rm in o "n ú c le o c ro m a to g rá fico ", co m o se usa en la p re se n te , inc lu ye un m a te ria l c ro m a to g rá fico , q ue inc lu ye p ero no se lim ita a un m a te ria l o rg á n ico co m o la s ílice , en fo rm a de u n a p a rtícu la , m o n o lito u o tra e s tru c tu ra a d e cu a d a q ue fo rm a u na p arte in te rn a de los m a te ria le s de la inve nc ión . En c ie rto s a sp e c to s , la su p e rfic ie d e l núc leo c ro m a to g rá fico re p re se n ta la su p e rfic ie c ro m a to g rá fic a , o re p re se n ta un m a te ria l e n ca p s u la d o p o r u na su p e rfic ie c ro m a to g rá fica , co m o se d e fin e en la p re se n te . El m a te ria l de s u p e rfic ie c ro m a to g rá fic o p ue de e s ta r d isp u e s to sob re o u n id o o a p a re a d o al n úc leo c ro m a to g rá fic o de ta l m a n e ra q u e sea d is ce rn ib le u na tra n s ic ió n d is c re ta o d is tin ta , o p u e d e e s ta r u n id o al n úc leo c ro m a to g rá fic o de ta l m a n e ra q u e se m e zc le con la su p e rfic ie d e l n úc leo c ro m a to g rá fico , d a n d o co m o re su lta d o u na g ra d a c ió n de m a te ria le s y sin u na s u p e rfic ie in te rn a d is c re ta d e l núc leo . En c ie rto s a sp ec tos , e l m a te ria l de su p e rfic ie c ro m a to g rá fic o p ue de s e r e l m ism o o d ife re n te de l m a te ria l d e l n úc leo c ro m a to g rá fic o y p uede p re s e n ta r p ro p ie d a d e s fís ic a s o f is ic o q u ím ica s d ife re n te s de las de l n úc leo c ro m a to g rá fico , inc lu ye nd o , p e ro no lim ita d a s a, e l v o lu m e n de p oros , el á re a su p e rfic ia l, e l d iá m e tro m e d io de los poros , e l co n te n id o de ca rb o n o o la e s ta b ilid a d h id ro lítica d e l pH.
El té rm in o "h id ró filo ", co m o se u sa en la p re se n te , d e sc rib e q u e tie n e a fin id a d , a tra cc ió n , a dso rc ió n o a b so rc ió n p o r e l agua.
El té rm in o "h id ró fo b o ", co m o se u sa en la p re se n te , d e sc rib e la fa lta de a fin ida d , re pu ls ión o in ca p a c id a d p ara a d s o rb e r o a b s o rb e r agua.
La "e x tra cc ió n en fa se só lid a " o "S P E " es u na té c n ica c ro m a to g rá fic a q u e se u sa a m e n u d o ju n to con el a n á lis is q u ím ico cu a n tita tivo , p o r e je m p lo , la c ro m a to g ra fía líq u id a de a lto re n d im ie n to (H P L C ) o la c ro m a to g ra fía de g a se s (G C ). El o b je tivo de la S P E es a is la r los a n a lito s d ia n a de u na m a triz de m u e s tra c o m p le ja q u e co n tie n e c o n ta m in a n te s no d e se a d o s . Los a n a lito s d ia n a a is la d o s se re cup e ran en u na so lu c ió n q u e se a c o m p a tib le con el a n á lis is cu a n tita tivo . E s ta so lu c ió n fin a l q u e c o n tie n e el co m p u e s to d ia n a p ue de u sa rse d ire c ta m e n te p a ra e l a ná lis is o e va p o ra rs e y re co n s titu irse en o tra so lu c ió n de m e n o r v o lu m e n con el p ro p ó s ito de c o n c e n tra r aún m ás e l co m p u e s to d ia n a , h a c ié n d o lo m ás s u sce p tib le de d e te cc ió n y m e d ic ión .
"C ro m a to g ra fía ", co m o se u sa en la p re se n te , se re fie re al p ro ce so de se p a ra c ió n de u na m ezc la , p o r e je m p lo u na m e zc la q ue c o n tie n e g lico p é p tid o s . Im p lica h a c e r p a s a r u n a m e zc la a tra vé s de u n a fa se e s ta c io n a ria , q u e sep a ra las m o lé cu la s de in te ré s de o tra s m o lé cu la s de la m e zc la y p e rm ite a is la r u n a o m ás m o lé cu la s de in te ré s . Los e je m p lo s de m é to d o s de se p a ra c ió n c ro m a to g rá fic a inc lu ye n la c ro m a to g ra fía de a cc ión ca p ila r, com o la c ro m a to g ra fía en papel, la c ro m a to g ra fía en c a p a fin a (T LC ), la c ro m a to g ra fía en co lu m n a , la c ro m a to g ra fía líqu ida rá p id a de p ro te ín a s (F P LC ), la c ro m a to g ra fía líq u id a en fa se n a n o in ve rtid a , la c ro m a to g ra fía de in te rca m b io ión ico , c ro m a to g ra fía en ge l, co m o la c ro m a to g ra fía de f iltra c ió n en ge l, la c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o , la c ro m a to g ra fía de a fin id a d , la c ro m a to g ra fía líq u id a de a lto re n d im ie n to (H P L C ), la c ro m a to g ra fía líqu ida de in te ra cc ió n h id ró fila (H IL IC ) y la c ro m a to g ra fía líq u id a de a lto re n d im ie n to en fa se in ve rsa (R P -H P LC ), e n tre o tras .
"P o n e r en co n ta c to ", co m o se u sa en la p re se n te , inc lu ye ju n ta r p o r lo m e no s d o s s u s ta n c ia s en so lu c ió n o fa s e só lid a , p o r e je m p lo p o n e r en co n ta c to u n a fa se e s ta c io n a ria de un m a te ria l c ro m a to g rá fic o con u n a m u es tra .
D e s c rip c ió n g e n era l
Los a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s (M A b s) han su rg id o co m o p ro d u c to s b io fa rm a c é u tic o s e fica ce s c o n tra el c á n c e r y o tra s e n fe rm e d a d e s c ró n ica s d e b id o a la e sp e c ific id a d de e s to s fá rm a c o s h ac ia a n tíg e n o s d ia n a , p o r e je m p lo , a c tiva n d o el s is te m a in m u n ita rio p a ra e lim in a r c é lu la s tu m o ra le s , b lo q u e a n d o la tra n sd u cc ió n de se ñ a le s de las cé lu la s tu m o ra le s p a ra q u e p ro life re n , tra n s p o rta n d o fá rm a c o s a las c é lu la s tu m o ra le s o co m o d ia n a s de ra d ia c ión . La g lico s ila c ió n de las in m u n o g lo b u lin a s in flu ye ta n to en sus p ro p ie d a d e s fis ic o q u ím ica s co m o en sus fu n c io n e s e fe c to ra s m e d ia d a s p o r cé lu la s , co m o la u n ió n y a c tiva c ió n d e l co m p le m e n to . E s tas fu n c io n e s b io ló g ica s p ue de n d e p e n d e r no só lo de la p re se n c ia o a u s e n c ia de o lig o sa cá rid o s liga d os a N, s ino ta m b ié n de la e s tru c tu ra e sp e c ífica de los o lig o sa cá rid o s . A d e m á s, la N -g lico s ila c ió n de los a n ticu e rp o s se ca ra c te r iza de m a n e ra ru tin a ria en la fa b rica c ió n de p ro d u c to s b io fa rm a cé u tico s . En p a rticu la r, el p e rfil de g lica n o s de un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l se d e fin e a v e ce s co m o un a tr ib u to c rítico de ca lid a d , ya q u e p u e d e s e r u na m e d id a de la e fica c ia , la in m u n o g e n ic id a d y las co n d ic io n e s de fa b ric a c ió n . P o r lo tan to , es im p o rta n te q ue los e n fo q u e s de a n á lis is de g lica n o s m u e s tra n a lta se n s ib ilid a d p a ra fa c ilita r u n a ca ra c te r iza c ió n d e ta lla d a . En la fa b rica c ió n de a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s te ra p é u tico s , la N -g lico s ila c ió n e sp e c ífica d e l s itio y la e va lu a c ió n de la o cu p a c ió n de l s itio de N -g lica n o son im p o rta n te s . P o r lo tan to , h ay u na n eces id ad de m é to d o s de a lta e fic ie n c ia /a lta re so lu c ió n p a ra s e p a ra r g lic o p é p tid o s o b te n id o s de a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s . La in ve n c ió n d iv u lg a d a sa tis fa ce e sa neces id ad .
En la p re se n te se d iv u lg a un nue vo m é to do de a n á lis is y cu a n tif ica c ió n de g lic o p é p tid o s en e l q u e se c o m b in a u n a e x tra cc ió n en fa se só lid a (S P E ) con u na co lu m n a de c ro m a to g ra fía líqu ida de in te ra cc ió n h id ró fila (H IL IC ) p ara se p a ra r los p é p tid o s tr íp tic o s g lic o s ila d o s y los no g lico s ila d o s . En va r ia s re a liza c io n e s , e s ta s té c n ica s de sep a ra c ió n se co m b in a n con la d e te cc ió n u ltra v io le ta (U V ) y la d e te cc ió n p o r e sp e c tro m e tr ía de m a sa s (M S ) en líne a p a ra d ilu c id a r las e s tru c tu ra s de los g lica n o s . En a lg u n o s m é to do s , la ca ra c te r iza c ió n de los g lica n o s se b a sa en la libe ra c ión de los g lica n o s de las c a d e n a s p e p tíd ica s y luego a n a liza rlo s p o r se p a ra d o de los p é p tid o s (co nsu lta r, p o r e je m p lo , las F iguras 1-3). D eb ido a q ue los g lica n o s no son a d e cu a d o s p a ra la d e te cc ió n UV, los g lica n o s lib e ra d o s a m e n u d o se m arcan con u n a e tiq u e ta de flu o ró fo ro , p o r e je m p lo , a n tra n ila m id a , á c id o a n tra n ílico o 2 -a m in o p ir id in a , p a ra la d e te cc ió n de f lu o re sc e n c ia o u na m o lécu la , p o r e je m p lo , p ro ca in a m id a , con b a s ic id a d s ig n ific a tiv a co m o p a ra p e rm itir la d e te cc ió n p o r M S. S in e m b a rg o , e s te e n fo q u e de l a n á lis is de g lica n o s só lo p ro p o rc io n a u n a e va lu a c ió n g lo b a l de la g lico s ila c ió n . En p a rticu la r, la in fo rm a c ió n e sp e c ífica de l s itio sob re los g lica n o s se p ie rd e d e b id o a q u e e ste f lu jo de tra b a jo d e p e n d e de un p ro ce d im ie n to de libe ra c ión . P o r el co n tra rio , en el m é to do d ivu lg a d o , los g lic o p é p tid o s a is la d o s se sep aran b a sá n d o se en d ife re n c ia s en la e s tru c tu ra de la g lic o fo rm a d e n tro de la m ism a se p a ra c ió n c ro m a to g rá fic a . A d e m á s, la se p a ra c ió n de g lic o p é p tid o s con d ife re n te s isó m e ro s de g lica n o s , q ue se log ró u sa n d o la c o lu m n a H IL IC , no se o b se rvó u sa n d o m é to d o s de R P -L C e s tá n d a r (co nsu lta r, p o r e je m p lo , las F ig uras 1-3). M e d ia n te la o p tim iza c ió n de las c o n d ic io n e s de p re p a ra c ió n de m u e s tra s p a ra H IL IC , in c lu ye n d o d ilu c ió n , se ca d o al va c ío y /o e x tra cc ió n en fa se só lid a (S P E ), se d e sa rro lló un f lu jo de tra b a jo q ue p e rm ite e l a n á lis is de g lic o p é p tid o s a p a rtir de d ife re n te s tip o s de p re p a ra c io n e s de m u e s tra s de m a pe o p e p tíd ico (co n su lta r, p o r e je m p lo , la F igura 22). C om o se d iv u lg a en la p resen te , los in ve n to re s han d e m o s tra d o q u e el m é to do y e l f lu jo de tra b a jo son a d e cu a d o s p a ra la id e n tifica c ió n y cu a n tifica c ió n de los n ive les re la tivo s de g lic o fo rm a s in d iv id u a le s en un a n ticu e rp o a n ive l de p é p tid o u sa n d o d e te cc ió n U V a co p la d a con d e te cc ió n M S en línea (ver, p o r e je m p lo , las F ig uras 4 y 22).
Los m é to d o s d iv u lg a d o s en la p re se n te inc lu ye n la p u rifica c ió n y /o se p a ra c ió n y /o a n á lis is de g lico p é p tid o s , p o r e je m p lo , g lic o p é p tid o s o b te n id o s de un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l, co m o un a n ticu e rp o q ue ha s ido d ig e rid o con una o m ás p ro te a sa s . Los m é to d o s d iv u lg a d o s p ro p o rc io n a n re su lta d o s m e jo ra d o s de se p a ra c ió n y a n á lis is y la ca p a c id a d de e s tu d ia r g lica n o s m ie n tra s to d a v ía e s tá n e n la za d o s co v a le n te m e n te a sus fra g m e n to s de a n ticu e rp o . Este a ná lis is a n ive l de p é p tid o de las g lico fo rm a s ta m b ié n p ro p o rc io n a le b e n e fic io en la ca ra c te r iza c ió n b io fa rm a c é u tic a de que p u e d e u tiliza rse u n a ú n ica m u e s tra p a ra el m a pe o de p é p tid o s en fa se inve rsa , p o r e je m p lo , u n a d ig e s tió n con trip s in a , y e l m a pe o de g lic o p é p tid o s b a sa d o en H IL IC . A d e m á s, la p re se rva c ió n de l e n la ce e n tre e l g lica n o y e l p é p tid o /p ro te ín a fa c ilita la d e te cc ió n U V y M S b a sa d a en el co m p o n e n te p ro te ín ico d e l g lico p é p tid o , p o r e je m p lo , e lim in a n d o la n e ce s id a d de m a rca r g lica n o s libe rados .
Los m é to d o s de la inve nc ión inc lu ye n p o n e r en co n ta c to u na m u e s tra q ue inc lu ye g lic o p é p tid o s con un su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo en co n d ic io n e s q ue p e rm ita n q ue los g lico p é p tid o s se u nan al su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo . U na v e z ca rg a d a la m u e s tra en e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo , p ue de p a sa rse u na se rie de s o lu c io n e s de lava do y e lu c ió n a d a p ta d a s so b re e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo p a ra s e p a ra r los c o n ta m in a n te s de los g lic o p é p tid o s y, a c o n tin u a c ió n , re c o g e r los g lic o p é p tid o s p a ra su a n á lis is a d ic io n a l. En los m é to d o s de la inve nc ión , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava p a ra e lim in a r los co n ta m in a n te s q u e no son g lic o p é p tid o s de la m u es tra . P o r ta n to , en un g ra d o s ig n ifica tivo los g lic o p é p tid o s se e n riq u e ce n en el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo , co m o en la su p e rfic ie c ro m a to g rá fic a de l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo . En c ie rta s re a liza c io n e s , un su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo co m p re n d e un m a te ria l so rb e n te a m in o p ro p ílico a b ase de sílice . En c ie rta s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo e s tá co n fig u ra d o p a ra la e x tra cc ió n en fa se só lida (S P E ).
Los d isp o s itivo s d ise ñ a d o s p a ra S P E inc lu ye n típ ica m e n te un s o rb e n te c ro m a to g rá fic o (p o r e je m p lo , un su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo , co m o un so rb e n te a m in o p ro p ílico a base de s ílice ) q ue p e rm ite al u su a rio re te n e r p re fe re n te m e n te los co m p o n e n te s o b je tivo , en e s te ca so los g lico p é p tid o s . Los d isp o s itivo s de S P E inc luyen típ ic a m e n te un d e p ó s ito de c o n te n c ió n de m u e s tra s , un m e d io p a ra c o n te n e r e l so rb e n te y un co n d u c to de flu id o s , o b oq u illa , p a ra d ir ig ir los flu id o s q u e sa len d e l d isp o s itivo a re c ip ie n te s de re co g id a a d e cu a d o s . El d isp o s itivo de SPE p u e d e te n e r un fo rm a to de un so lo p oc illo , q ue es co n v e n ie n te y re n ta b le p a ra p re p a ra r un n ú m e ro p e q u e ñ o de m u e s tra s , o un fo rm a to de v a r io s p oc illos , q u e es a d e cu a d o p a ra p re p a ra r un g ran n ú m e ro de m u e s tra s en p ara le lo . Los fo rm a to s de m ú ltip le s p o c illo s se usan co m ú n m e n te con s is te m a s ro b o tiza d o s de d isp e n s a c ió n de flu id o s . Los fo rm a to s de m ú ltip le s p o c illo s típ ico s inc lu ye n los fo rm a to s de p la ca e s tá n d a r de 48, 96 y 384 p oc illos . H ab itu a lm e n te , los f lu id o s se fu e rza n a tra vé s d e l d isp o s itivo de S P E y h ac ia los re c ip ie n te s de re cog ida , ya se a h a c ie n d o va c ío a tra vé s de l d isp o s itivo con un c o le c to r de v a c ío e sp e c ia lm e n te d ise ñ a d o , o u sa n d o la fu e rz a c e n trífu g a o g ra v ita to ria . La fu e rz a ce n trífu g a se g e n e ra c o lo ca n d o e l d isp o s itivo de S P E , ju n to con u na b a n d e ja de re co g id a a de cu a d a , en una c e n trífu g a d is e ñ a d a e sp e c ífica m e n te p a ra e l p ro p ó s ito p re te n d id o . Es ve n ta jo so q u e un d is p o s itivo de S P E te n g a una g ra n ca p a c id a d p a ra re te n e r co m p u e s to s d ia n a de u n a a m p lia v a r ie d a d de p o la rid a d e s c ro m a to g rá fica s , q ue se a cap az de m a n te n e r la re ten c ió n de l co m p u e s to d ia n a a m e d id a q u e los co n ta m in a n te s de la m u e s tra se lavan hasta d e se ch a rse , y q u e p ro p o rc io n e la ca p a c id a d de e lu ir los co m p u e s to s d ia n a en un vo lu m e n de e lu c ió n tan p e q u e ñ o co m o sea p os ib le , m a x im iza n d o de e s te m o do e l g ra d o de c o n ce n tra c ió n de l co m p u e s to d ia n a o b te n id o d u ra n te la S PE .
De a cu e rd o con los m é to d o s d iv u lg a d o s p ue de u sa rse u na v a r ie d a d de d isp o s itivo s de e x tra cc ió n en fa se só lid a . En u n a re a liza c ió n , e l d isp o s itivo S P E se s e le cc io n a del g ru p o q ue c o n s is te en m ic ro p la ca s de e lu c ión , c o lu m n a s c ro m a to g rá fica s , p la cas de ca p a fin a , d isp o s itivo s de lim p ie za de m u e s tra s , c a rtu ch o s de inye cc ió n , p la cas de m ic ro titu la c ió n y d is p o s itivo s p re p a ra to rio s c ro m a to g rá fico s .
Los m a te ria le s so rb e n te s a m in o p ro p ílico s a b a se de s ílice , in c lu ye n d o los m a te ria le s de S P E , son c o n o c id o s en la té c n ica y p ue de n o b te n e rse co m e rc ia lm e n te , p o r e je m p lo de W a te rs C o rp o ra tio n , co m o en fo rm a de u na p la ca de H IL IC S P E G lyco W o rks (co n su lta r, p o r e je m p lo , las P a te n te s de E s ta d os U n id os N° 6.723.236 , 7.052.6 l1 y 7.192.525 ). En a lg u n a s re a liza c io n e s , el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se p re p a ra p a ra la a d ic ión de la m u es tra m e d ia n te lavado , p o r e je m p lo , un p aso de p re la va d o . En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava a n tes d e l co n ta c to con la m u e s tra de g lico p é p tid o . En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava con a gu a (H<2>O ) y /o u n a so lu c ió n de A C N (p o r e je m p lo , A C N en a gua), com o u n a so lu c ió n de A C N de a p ro x im a d a m e n te un 60 % a a p ro x im a d a m e n te un 95 % en vo lu m e n , p o r e je m p lo , u na so lu c ió n de A C N de a p ro x im a d a m e n te un 60% , 65% , 70% , 75% , 80% , 85% , 90 % o 95 % en vo lu m e n , con e l res to de agua.
En los m é to d o s de la inve nc ión , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se p on e en co n ta c to con u n a m u e s tra q ue c o n tie n e g lico p é p tid o p a ra su e n riq u e c im ie n to . C on re sp e c to a la so lu c ió n de m u es tra , in c lu irá los g lico p é p tid o s d is u e lto s en un so lve n te en e l q u e sean so lu b le s los g lico p é p tid o s , y en e l q u e los g lic o p é p tid o s se u n irán al sus tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo . P re fe rib le m e n te , la u n ión es fu e rte , d a n d o co m o re su lta d o la un ión de u n a p a rte sus ta n c ia l de los g lico p é p tid o s . En a lg u n o s caso s, se u n irá n su s ta n c ia lm e n te to d o s los g lico p é p tid o s . En v a r ia s re a liza c io n e s , el so lve n te es u n a so lu c ió n a cu osa , q u e típ ic a m e n te c o n tie n e un ta m p ó n , sal y /o su rfa c ta n te s p a ra s o lu b iliz a r y e s ta b iliz a r los g lico p é p tid o s . En a lg u n a s re a liza c io n e s , la m u e s tra de g lic o p é p tid o s es u n a so lu c ió n de a p ro x im a d a m e n te un 60% de A C N a un 90% de A C N y de un 10% a a p ro x im a d a m e n te un 40 % de a gu a con de a p ro x im a d a m e n te un 0 ,1 % a a p ro x im a d a m e n te un 0 ,5 % de T F A p o r vo lu m e n , co m o a p ro x im a d a m e n te 80 :20 A C N :A g u a (v /v) con un 0 ,2 % de TFA . P uede u sa rse un pH b a jo p a ra m a n te n e r la so lu b ilid a d de l p é p tid o en el so lve n te a lta m e n te o rg á n ico , p o r e je m p lo u na so lu c ió n con un pH p o r d e b a jo de a p ro x im a d a m e n te 6,5, co m o p o r d e b a jo de a p ro x im a d a m e n te 6,5, 6 ,0 , 5 ,5 , 5 ,0 , 4,5, 4 ,0 , 3 ,5 o 3,0.
L uego , se lava el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo p a ra e lim in a r c o n ta m in a n te s , co m o p é p tid o s no g lico s ila d o s q u e no se u nen s ig n ifica tiva m e n te al su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo . T a le s c o n ta m in a n te s p ueden d e se ch a rse . En a lg u n a s re a liza c io n e s , e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava con u na so lu c ió n de á c id o y a ce to n itr ilo (A C N ) en a g u a (H<2>O ), co m o u n a so lu c ió n de á c id o fó rm ic o y /o á c id o tr if lu o ro a c é tic o (TFA ) y a ce to n itr ilo (A C N ) en a g u a (H<2>O). En c ie rta s re a liza c io n e s , la so lu c ió n de á c id o fó rm ic o y A C N en a g u a inc lu ye de a p ro x im a d a m e n te un 0 ,5 % a a p ro x im a d a m e n te un 5% de á c ido fó rm ic o en v o lu m e n y de a p ro x im a d a m e n te un 85% a a p ro x im a d a m e n te un 95% de A C N en v o lu m e n con el re s to de a gu a , p o r e je m p lo a p ro x im a d a m e n te un 0 ,5 % , 1,0% , 1 ,5% , 2 ,0% , 2 ,5 % , 3 ,0% , 3 ,5% , 4 ,0% , 4 ,5 % o 5 ,0 % de á c id o fó rm ic o en v o lu m e n y a p ro x im a d a m e n te un 80% , 85% , 90 % o 95 % de A C N en vo lu m e n . En c ie rta s re a liza c io n e s , la so lu c ió n de T F A y A C N en a gu a inc lu ye de a p ro x im a d a m e n te un 0 ,5 % a a p ro x im a d a m e n te un 5 % de T F A en v o lu m e n y de a p ro x im a d a m e n te un 85 % a a p ro x im a d a m e n te un 95 % de A C N en v o lu m e n con el re s to de a gu a , p o r e je m p lo a p ro x im a d a m e n te un 0 ,5% , 1 ,0% , 1 ,5% , 2 ,0% , 2 ,5 % , 3 ,0 % , 3 ,5% , 4 ,0 % , 4 ,5 % , o 5 ,0 % de T F A en v o lu m e n y a p ro x im a d a m e n te un 80% , 85% , 90% , o 95 % de A C N en vo lu m e n . En c ie rto e je m p lo , la so lu c ió n de lava do es u n a so lu c ió n de á c ido fó rm ic o al 1% , H<2>O al 9% y A C N al 90 % en vo lu m e n . En c ie rto e je m p lo , la so lu c ió n de lava do es u na so lu c ió n de T F A al 1%, H<2>O al 9 % y AC N al 90% en vo lu m e n .
U n a v e z q u e se h a ya n e lim in a d o los co n ta m in a n te s , el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se p on e en co n ta c to con u na so lu c ió n de e lu c ión p a ra e lu ir los g lic o p é p tid o s del su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo . El so rb e n te a m in o p ro p ílico a b ase de s ílice p osee u na su p e rfic ie d é b ilm e n te b á s ica y p o te n c ia l p a ra e l in te rca m b io a n ió n ico . S in e m b a rg o , la re cu p e ra c ió n re la tiva y to ta l de g lic o p é p tid o s a p a rtir de un s o rb e n te a m in o p ro p ílico a b ase de s ílice p od ría s e r p a rticu la rm e n te se n s ib le a las co n d ic io n e s de e lu c ión . U na re cu p e ra c ió n sesg a d a , o e sp e c ia c ió n , p u e d e se r p ro b le m á tic a p a ra un p ro ce d im ie n to de p re p a ra c ió n de m u es tra s . A d e m á s de no p ro p o rc io n a r u n a re p re se n ta c ió n p re c isa de las e sp e c ie s p re se n te s en la m u es tra , p u e d e s e r in d ica tiva de un m é to d o q u e no es ro b u s to y de q u e los p e rfile s de a b u n d a n c ia re la tiva o b te n id o s p ue de n no e s ta r d e te rm in a d o s de m a n e ra re p ro d u c ib le , en p a rtic u la r con re sp e c to a las e sp e c ie s p o b re m e n te re cu p e ra d a s . P o r e je m p lo , p a ra la re cu p e ra c ió n de g lica n o s d e riva tiza d o s , en o p o s ic ió n a los g lic o p é p tid o s o b je to de e s ta d ivu lg a c ió n , se re co m ie n d a q ue se u se a ce ta to de a m o n io en A C N com o so lu c ió n de e lu c ió n . S in e m b a rg o , en el ca so de los g lico p é p tid o s , e l a ce ta to de a m on io en A C N no d a un buen re su ltad o . P o r tan to , los g lic o p é p tid o s se e lu ye n d e l so rb e n te a m in o p ro p ílico a b ase de s ílice con u n a so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N en a gu a . En a lg u n a s re a liza c io n e s , la so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N en a gu a inc lu ye a p ro x im a d a m e n te 100 -400 m M de fo rm ia to de a m o n io y de a p ro x im a d a m e n te un 2 ,5 a a p ro x im a d a m e n te un 10% de A C N , co m o p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 100 m M de fo rm ia to de a m on io , a p ro x im a d a m e n te 150 m M de fo rm ia to de a m on io , a p ro x im a d a m e n te 200 m M de fo rm ia to de a m on io , a p ro x im a d a m e n te 250 m M de fo rm ia to de a m on io , a p ro x im a d a m e n te 300 m M de fo rm ia to de a m on io , a p ro x im a d a m e n te 350 m M de fo rm ia to de a m on io , o a p ro x im a d a m e n te 400 m M de fo rm ia to de a m o n io y a p ro x im a d a m e n te un 2 ,5 % , 3 ,0% , 3 ,5% , 4 ,0 % , 4 ,5 % , 5 ,0% , 5 ,5% , 6 ,0 % , 6 ,5 % , 7 ,0% , 7 ,5% , 8 ,0% , 8 ,5% , 9 ,0% , 9 ,5% , o 10 ,0% , de A C N . En un e je m p lo e sp e c ífico , la so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N en a gu a in c lu ye a p ro x im a d a m e n te 200 m M de fo rm ia to de a m o n io y a p ro x im a d a m e n te un 5 % de A C N .
U na ve z se h a n e lu id o los g lic o p é p tid o s de l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo , la m u e s tra de g lico p é p tid o s e n riq u e c id a re su lta n te se so m e te a se p a ra c ió n a d ic io n a l co m o se in d ica en los m é to d o s re iv in d ica d o s y p uede so m e te rse a a n á lis is a d ic io n a l, p o r e je m p lo c ro m a to g ra fía y /o a n á lis is de e sp e c tro m e tría de m a sas. En los m é to do s de la inve nc ión , la m u e s tra de g lic o p é p tid o s e n riq u e c id a se a p lica a u na c o lu m n a de se p a ra c ió n y p o s te rio rm e n te se e lu ye de la c o lu m n a de s e p a ra c ió n , p o r e je m p lo u sa n d o un g ra d ie n te de fa se m ó v il p a ra re s o lv e r las e sp e c ie s in d iv id u a le s de g lico p é p tid o s .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , se re a liza n g ra d ie n te s de so lve n te , e lu c io n e s e sca lo n a d a s y /o e lu c ión m u ltid im e n s io n a l p a ra e lu ir y /o se p a ra r los g lic o p é p tid o s de la c o lu m n a de se p a ra c ió n . El uso de g ra d ie n te s es b ien co n o c id o en la té c n ica de la c ro m a to g ra fía . El p rin c ip io b ás ico im p lica a d s o rb e r un a n a lito en la c o lu m n a de sep a ra c ió n y luego e lu ir con un g ra d ie n te de so lve n te de d e so rc ió n . El g ra d ie n te se re fie re al c a m b io de p o r lo m e no s u na ca ra c te rís tic a d e l so lve n te , p o r e je m p lo , e l ca m b io en e l pH , la fu e rz a ión ica , la p o la rid a d o la c o n ce n tra c ió n de a lgún a g e n te q ue in flu ya en la fu e rz a de la in te ra cc ió n de un ión .
Los g ra d ie n te s u sa d o s p ue de n s e r g ra d u a le s o p ue de n a ñ a d irse al m ism o ritm o. En u na re a liza c ió n , se e m p le a n d o s o m ás b o lo s de so lve n te de d e so rc ió n q ue va ría n en u na o m ás d im e n s io n e s . P o r e je m p lo , los d o s o m ás b o lo s p u e d e n v a r ia r en pH , fu e rz a ión ica , h id ro fo b ic id a d o s im ila re s . P uede se le cc io n a rse u n a so lu c ió n de lava do , si se usa , de ta l m a n e ra q u e e lim in e los co n ta m in a n te s no d e s e a d o s con u n a p é rd id a o d a ñ o m ín im o p a ra los g lic o p é p tid o s u n id os . Las p ro p ie d a d e s de la so lu c ió n de lava do p ue de n s e r in te rm e d ia s e n tre las de las s o lu c io n e s de m u e s tra y de d e so rc ió n . Los so lven tes , p o r e je m p lo en un g ra d ie n te de e lu c ión , se e lig e n p a ra q u e sean co m p a tib le s con los g lic o p é p tid o s y e l m é to d o de d e te cc ió n fina l. G e n e ra lm e n te , los so lve n te s u sa d o s son so lve n te s co n v e n c io n a le s co n o c id o s . En v a r ia s re a liza c io n e s , los so lve n te s e n tre los q u e p u e d e se le cc io n a rs e un so lve n te a d e cu a d o inc lu ye n h id ró x id o de a m on io , tr ie tila m in a , fo s fa to d ia m ó n ico , c lo ru ro de m e tile no , a ce to n itr ilo (con o sin p e q u e ñ a s ca n tid a d e s de m o d ifica d o re s b á s ico s o á c id os ), m e ta no l (que co n tie n e u na m a yo r c a n tid a d de m od ificad o r, p o r e je m p lo , á c id o a cé tico o tr ie tila m in a , o m e zc la s de a g u a con m e ta no l o a ce to n itr ilo ), a ce ta to de e tilo , c lo ro fo rm o , h exan o , iso p ro p a n o l, a ce to n a , ta m p ó n a lca lino , ta m p ó n de a lta fu e rz a ión ica , ta m p ó n á c id o , á c id o s fu e rte s , bases fu e rte s , m e zc la s o rg á n ica s con á c id o s /b a se s , m e ta no l á c id o o b ás ico , te tra h id ro fu ra n o y agua.
P uede u sa rse c ro m a to g ra fía líqu ida , in c lu ye n d o H P LC , p a ra a n a liz a r e s tru c tu ra s , co m o los g lico p é p tid o s . P ara e s tu d ia r e s ta s e s tru c tu ra s p ue de n u sa rse v a r ia s fo rm a s de c ro m a to g ra fía líqu ida , co m o la c ro m a to g ra fía de in te rca m b io a n ió n ico , la H P LC de fa se inve rsa , la c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o , la c ro m a to g ra fía de in te rca m b io a n ió n ico de a lto re n d im ie n to y la c ro m a to g ra fía de fa se n orm a l (N P), in c lu ye n d o la N P -H P L C (co nsu lta r, p o r e je m p lo , A lp e rt e t al., J. C h ro m a to g r. A 676 :191 -202 (1994 )). La c ro m a to g ra fía de in te ra cc ió n h id ró fila (H IL IC ) es u n a v a r ia n te de la N P -H P L C q ue p ue de re a liza rse con fa se s m ó v ile s p a rc ia lm e n te a cu osa s, lo q ue p e rm ite la se p a ra c ió n en fa se n orm a l de p é p tid o s , ca rb o h id ra to s , á c id os n u c le ico s y m u ch a s p ro te ín a s . El o rde n de e lu c ió n de la H IL IC es de m e no s p o la r a m ás po la r, al co n tra r io q ue en la H P LC de fa s e inve rsa . La H P LC p u e d e re a liza rse , p o r e je m p lo , en un s is te m a H P LC de W a te rs (p o r e je m p lo , e l s is te m a W a te rs 2695 A llia n ce H P LC ), A g ile n t, Perk in E lm er, G ilso n , e tc.
La N P -H P LC , p re fe rib le m e n te la H IL IC , es u na fo rm a p a rticu la rm e n te ú til de H P LC q u e p ue de u sa rse en los m é to d o s d e sc rito s en la p re se n te . La N P -H P L C se p a ra los a n a lito s b a sá n d o se en in te ra cc io n e s p o la re s e n tre los a n a lito s y la fa se e s ta c io n a ria (p o r e je m p lo , e l sus tra to ). El a n a lito p o la r se a so c ia y e s re ten ido p o r la fa se e s ta c io n a ria p o la r. La fu e rz a de a d so rc ió n a u m e n ta con e l in c re m e n to de la p o la rid a d de l a na lito , y la in te ra cc ió n e n tre e l a na lito p o la r y la fa se e s ta c io n a ria p o la r (en re lac ió n con la fa se m ó v il) a u m e n ta e l tie m p o de e lu c ión . El u so de so lve n te s m ás p o la re s en la fa se m óvil d is m in u irá el tie m p o de re te n c ió n de los a na lito s , m ie n tra s q ue los so lve n te s m ás h id ró fo b o s tie n d e n a a u m e n ta r los tie m p o s de re tenc ión .
C on la N P -H P L C p ue de n u sa rse v a r io s t ip o s de su s tra to s , p o r e je m p lo , p a ra c ro m a to g ra fía en co lu m n a , in c lu ye n d o su s tra to s de s ílice , a m ino , a m ida , c e lu lo sa , c ic lo d e x tr in a y p o lie s tire n o . E jem p lo s de su s tra to s ú tile s, p o r e je m p lo , q ue p u e d e n u sa rse en c ro m a to g ra fía en co lu m n a , in c lu ye n : p o liS u lfo e til A s p a rta m id a (p o r e je m p lo , de P o lyL C ), un su s tra to de su lfo b e ta ín a , p o r e je m p lo , Z IC ® -H IL IC (p o r e je m p lo , de S e Q u a n t), P O R O S ® HS (p o r e je m p lo , de A p p lie d B io sys te m s), P O R O S ® S (p o r e je m p lo , de A p p lie d B io sys te m s), P o liH id ro e til A s p a rta m id a (p o r e je m p lo , de P o lyL C ), Z o rb a x 300 S<c>X (p o r e je m p lo , de A g ile n t), P o lyG L Y C O P L E X ® (p o r e je m p lo , de P o lyLC ), A m id a -80 (p o r e je m p lo , de T o so h a a s), T S K G E L ® A m id a -80 (p o r e je m p lo , de T o so h a a s), P o lih id ro x ie tilo A (p o r e je m p lo , de P o lyLC ), G lico -S e p -N (p o r e je m p lo , de O x fo rd G lyco S c ie n ce s ) y A tla n tis H IL IC (p o r e je m p lo , de W a te rs ). Las c o lu m n a s que p u e d e n u sa rse en los m é to d o s d ivu lg a d o s inc lu ye n co lu m n a s q ue u tilizan u no o m ás de los s ig u ie n te s g rup o s fu n c io n a le s : g ru p o s c a rb a m o ilo , g ru p o s su lfo p ro p ilo , g ru p o s su lfo e tilo (p o r e je m p lo , po li (2 -su lfo e tilo a sp a rta m id a )), g ru p o s h id ro x ie tilo (p o r e je m p lo , po li (2 -h id ro x ie tilo a sp a rta m id a )) y g ru p o s de á c id o su lfó n ico a rom á tico .
La fa se m óvil u sa d a p ue de in c lu ir ta m p o n e s con y s in a g e n te s de e m p a re ja m ie n to ión ico , p o r e je m p lo , a ce to n itr ilo y a gu a . Los a g e n te s de e m p a re ja m ie n to ión ico inc lu ye n fo rm ia to , a ce ta to , T F A y sa les. P ueden usa rse g ra d ie n te s de los ta m p o n e s , p o r e je m p lo , si se usa n d o s ta m p o n e s , la c o n ce n tra c ió n o p o rce n ta je d e l p rim e r tam p ón p u e d e d is m in u ir m ie n tra s q u e la co n ce n tra c ió n o p o rce n ta je de l se g u n d o ta m p ó n a u m e n ta d u ra n te el tra n s c u rso de la c ro m a to g ra fía . P o r e je m p lo , e l p o rce n ta je de l p rim e r ta m p ó n p ue de d is m in u ir de a p ro x im a d a m e n te un 100% , a p ro x im a d a m e n te un 99% , a p ro x im a d a m e n te un 95% , a p ro x im a d a m e n te un 90% , a p ro x im a d a m e n te un 85% , a p ro x im a d a m e n te un 80% , a p ro x im a d a m e n te un 75% , a p ro x im a d a m e n te un 70% , a p ro x im a d a m e n te un 65% , a p ro x im a d a m e n te un 60% , a p ro x im a d a m e n te un 50% , a p ro x im a d a m e n te un 45 % o de a p ro x im a d a m e n te un 40 % a a p ro x im a d a m e n te un 0% , a p ro x im a d a m e n te un 1%, a p ro x im a d a m e n te un 5% , a p ro x im a d a m e n te un 10% , a p ro x im a d a m e n te un 15% , a p ro x im a d a m e n te un 20% , a p ro x im a d a m e n te un 25% , a p ro x im a d a m e n te un 30% , a p ro x im a d a m e n te un 35 % o a p ro x im a d a m e n te un 40 % en el tra n s c u rso de la c ro m a to g ra fía . C om o o tro e je m p lo , el p o rce n ta je d e l se g u n d o ta m p ó n p ue de a u m e n ta r de a p ro x im a d a m e n te un 0% , a p ro x im a d a m e n te un 1%, a p ro x im a d a m e n te un 5% , a p ro x im a d a m e n te un 10% , a p ro x im a d a m e n te un 15% , a p ro x im a d a m e n te un 20% , a p ro x im a d a m e n te un 25% , a p ro x im a d a m e n te un 30% , a p ro x im a d a m e n te un 35 % o a p ro x im a d a m e n te un 40 % a a p ro x im a d a m e n te un 100% , a p ro x im a d a m e n te un 99% , a p ro x im a d a m e n te un 95% , a p ro x im a d a m e n te un 90% , a p ro x im a d a m e n te un 85% , a p ro x im a d a m e n te un 80% , a p ro x im a d a m e n te un 75% , a p ro x im a d a m e n te un 70% , a p ro x im a d a m e n te un 65% , a p ro x im a d a m e n te un 60% , a p ro x im a d a m e n te un 50% , a p ro x im a d a m e n te un 45 % o a p ro x im a d a m e n te un 40 % en e l tra n s c u rso de la m ism a serie . O p c io n a lm e n te , la c o n ce n tra c ió n o el p o rce n ta je de l p r im e r y e l se g u n d o ta m p ó n p ue de n v o lv e r a sus va lo re s in ic ia le s al fin a l de la se rie c ro m a to g rá fica . A m o do de e je m p lo , e l p o rce n ta je de l p rim e r ta m p ó n p u e d e c a m b ia r en c in co p asos d e l 85 % al 63 % al 59 % al 10% al 85% ; m ie n tra s q u e el p o rce n ta je de l se g u n d o ta m p ó n en los m ism os p asos ca m b ia de l 15% al 37 % al 41 % al 90 % al 15% . Los p o rce n ta je s p ue de n c a m b ia r g ra d u a lm e n te co m o un g ra d ie n te linea l o de m a n e ra no linea l (p o r e je m p lo , e sca lo n a d a ). P o r e je m p lo , el g ra d ie n te p ue de se r m u ltifá s ico , p o r e je m p lo , b ifá s ico , tr ifá s ico , e tc . En re a liza c io n e s p re fe rid a s , los m é to d o s d e sc rito s en la p re se n te u san un g ra d ie n te de ta m p ó n de a ce to n itr ilo d e c re c ie n te que co rre sp o n d e a u n a p o la rid a d c re c ie n te de la fa se m óvil sin e l u so de a g e n te s de e m p a re ja m ie n to ión ico.
La te m p e ra tu ra de la c o lu m n a p u e d e m a n te n e rse a u na te m p e ra tu ra co n s ta n te d u ra n te to d a la se rie de c ro m a to g ra fía , p o r e je m p lo , u sa n d o un c a le n ta d o r de c o lu m n a co m e rc ia l. En a lg u n a s re a liza c io n e s , la c o lu m n a se m a n tie n e a u na te m p e ra tu ra e n tre a p ro x im a d a m e n te 18° C y a p ro x im a d a m e n te 70° C, p o r e je m p lo , e n tre a p ro x im a d a m e n te 30° C y a p ro x im a d a m e n te 60° C, e n tre a p ro x im a d a m e n te 40° C y a p ro x im a d a m e n te 50° C, p o r e je m p lo , a a p ro x im a d a m e n te 20° C, a p ro x im a d a m e n te 25° C, a p ro x im a d a m e n te 30° C, a p ro x im a d a m e n te 35° C, a p ro x im a d a m e n te 40° C, a p ro x im a d a m e n te 45° C, a p ro x im a d a m e n te 50° C, a p ro x im a d a m e n te 55° C, a p ro x im a d a m e n te 60° C, a p ro x im a d a m e n te 65° C o a p ro x im a d a m e n te 70° C. U na te m p e ra tu ra p re fe rid a es de a p ro x im a d a m e n te 45° C.
El ca u d a l de la fa se m óvil p ue de e s ta r e n tre a p ro x im a d a m e n te 0 y a p ro x im a d a m e n te 100 m l/m in . P ara las p ro p u e s ta s a n a lítica s , los ca u d a le s va ría n típ ic a m e n te de 0 a 10 m l/m in ; p a ra la H P LC p re p a ra tiva , p ue de n u sa rse ca u d a le s s u p e rio re s a 100 m l/m in . P o r e je m p lo , e l ca u d a l p ue de s e r de a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 , a p ro x im a d a m e n te 1, a p ro x im a d a m e n te 1,5, a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 2,5, a p ro x im a d a m e n te 3, a p ro x im a d a m e n te 3,5, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 4 ,5 o a p ro x im a d a m e n te 5 m l/m in . La su s titu c ió n p o r u n a c o lu m n a q ue te n g a el m ism o e m p a q u e ta m ie n to , la m ism a lon g itu d , p e ro un d iá m e tro m ás p e q u e ñ o re qu ie re u na re d u cc ió n d e l ca u d a l p a ra c o n s e rv a r e l m ism o tie m p o de re te n c ió n y re so lu c ió n de los p ico s q u e los o b s e rva d o s en u n a c o lu m n a de d iá m e tro m á s a ncho . P re fe rib le m e n te , se usa un c a u d a l e q u iva le n te a a p ro x im a d a m e n te 1 m l/m in en u n a co lu m n a de 4 ,6 x100 m m y 5 pm .
El tie m p o de e je cu c ió n p ue de s e r de a p ro x im a d a m e n te 15 a a p ro x im a d a m e n te 240 m in u tos , p o r e je m p lo , de a p ro x im a d a m e n te 20 a a p ro x im a d a m e n te 70 m in u tos , de a p ro x im a d a m e n te 30 a a p ro x im a d a m e n te 60 m in u tos , de a p ro x im a d a m e n te 40 a a p ro x im a d a m e n te 90 m in u tos , de a p ro x im a d a m e n te 50 a a p ro x im a d a m e n te 100 m in u tos , de a p ro x im a d a m e n te 60 a a p ro x im a d a m e n te 120 m in u tos , de a p ro x im a d a m e n te 50 a a p ro x im a d a m e n te 80 m inu tos .
La N P -H P L C p u e d e a ju s ta rse p ara s e r re a liza d a a n a n o e sca la , p o r e je m p lo , u sa n d o c o lu m n a s con un d iá m e tro in te rio r de a p ro x im a d a m e n te 75 pm (co n su lta r, p o r e je m p lo , W u h re r e t a l., A na l. C hem . 76 :833 -838 (2004 ); W u h re r e t a l., In te rna t. J. M ass. S pec. 232 :51 -57 (2004 )).
En c ie rta s re a liza c io n e s , la c o lu m n a de se p a ra c ió n es u na c o lu m n a de se p a ra c ió n de in te ra cc ió n h id ró fila (H IL IC ) y los g lic o p é p tid o s se e lu ye n p o s te rio rm e n te de la c o lu m n a de se p a ra c ió n H IL IC , p o r e je m p lo u sa n d o un g ra d ie n te de fa se m óvil p a ra re s o lv e r las e sp e c ie s in d iv id u a le s de g lico p é p tid o s , p u rifica n d o y /o se p a ra n d o de e ste m o do los g lic o p é p tid o s de la m u es tra . En c ie rto s e je m p lo s , los g lic o p é p tid o s e lu id o s de la H IL IC se se p a ra n en u na o m á s fra cc io n e s . T a le s fra cc io n e s p ue de n u sa rse p a ra a n á lis is p o s te rio re s , co m o e l a n á lis is M S. En c ie rta s re a liza c io n e s , los m é to d o s inc lu ye n id e n tif ic a r los g lic o p é p tid o s y /o g lica n o s p re se n te s en u na o m ás de las fra cc io n e s . En c ie rta s re a liza c io n e s , e l g lica n o es un N -g lica no . En c ie rta s re a liza c io n e s , e l g ra d ie n te de la fa se m óvil es de 10 m M de fo rm ia to de a m on io , pH 4 ,5 a 90 % de A C N con 10 m M de fo rm ia to de a m on io , pH 4,5. En c ie rta s re a liza c io n e s , e l g ra d ie n te de fa se m ó v il es de l 0 ,1 % de T F A en H<2>O p a ra q ue se a d e l 0 ,1 % de T F A en A C N .
El g lic o p é p tid o se o b tie n e de u na p ro te ín a g lico s ila d a , co m o un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l. El a n ticue rp o m o n o c lo n a l g lic o s ila d o p u e d e p re p a ra rse p o r re d u cc ió n , d ig e s tió n e n z im á tica , d e sn a tu ra liza c ió n , fra g m e n ta c ió n , e sc is ió n q u ím ica y u na co m b in a c ió n de las m ism as . Los m é to d o s d iv u lg a d o s en la p re se n te son a p lica b le s a c u a lq u ie r iso tipo de a n ticu e rp o , co m o IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, o de iso tipo m ixto.
La re d u cc ió n es p a ra re d u c ir los e n la ce s d isu lfu ro en d os tio le s en u na p ro te ín a trid im e n s io n a l, co m o un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l. La re du cc ió n p ue de re a liza rse m e d ia n te d e sn a tu ra liza c ió n p o r ca lo r, a ñ a d ie n d o un te n s io a c tiv o o a ñ a d ie n d o un a g e n te d e s n a tu ra liz a n te , p o r e je m p lo , H C l de g u a n id in a (6M ), en p re se n c ia de un a ge n te re d u c to r, p o r e je m p lo , T C E P -H C l. La d e g ra d a c ió n e n z im á tic a es u na d ig e s tió n de la p ro te ín a con u n a p ro te a sa , p o r e je m p lo , tr ip s in a o p ro te a sa I de A c h ro m o b a c te r (L ys-C ). A d e m á s, la g lic o p ro te ín a p ue de d e s n a tu ra liz a rse m e d ia n te c a lo r o p ro d u c to s q u ím ico s , o u n a c o m b in a c ió n de los m ism os . La fra g m e n ta c ió n im p lica e s c in d ir p o rc io n e s de p ro te ín a s de u n a p ro te ín a de u n a ú n ica de m ú ltip le s s u b u n id a d e s de p ro te ína , co m o un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l, con m é to d o s fís ico s , b io ló g ico s o q u ím ico s . P o r e je m p lo , p a ra la fra g m e n ta c ió n de s u b u n id a d e s de a n ticu e rp o s se u sa co m ú n m e n te u n a e n z im a d e g ra d a d o ra de in m u n o g lo b u lin a s de S. p yo g e n e s (IdeS ).
En v a r ia s re a liza c io n e s , un a n ticu e rp o en u na m u e s tra p u e d e tra ta rs e y p re p a ra rse p o r re du cc ió n , d e g ra d a c ió n e n z im á tica , d e sn a tu ra liz a c ió n o fra g m e n ta c ió n a n tes de e n tra r en co n ta c to con el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo . Los m é to d o s p ro p o rc io n a n un m é to d o c ro m a to g rá fic o n o ve d o so p a ra c a ra c te r iz a r la g lico s ila c ió n de p ro te ín a s , p o r e je m p lo , a g e n te s te ra p é u tico s de a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s (m A b), m e d ia n te a ná lis is H IL IC -U V -M S a n ive l de fra g m e n to s y p ép tid o s . En c ie rta s re a liza c io n e s , las m u e s tra s en c u a lq u ie r p a so in te rm e d io p ue de n e s ta r c o n ce n tra d a s , d e sa la d a s o s im ila res .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , los m é to d o s co m p re n d e n a d e m á s la d e te cc ió n de l g lico p é p tid o , p o r e je m p lo u sa nd o la señ a l U V de la p o rc ió n p e p tíd ica d e l g lico p é p tid o . Esto p ue de h ace rse p a ra fra cc io n e s de u n a m u e s tra y p e rm ite la se le cc ió n de fra cc io n e s e sp e c ífica s p a ra a n á lis is p o s te rio re s , p o r e je m p lo , a n á lis is de e sp e c tro m e tr ía de m a sa s (M S). P o r ta n to , en re a liza c io n e s a d ic io n a le s , e l p aso de d e te cc ió n co m p re n d e la e sp e c tro sc o p ia de m a sa s o la c ro m a to g ra fía líq u id a -e sp e c tro s co p ia de m a sa s (L C -M S ). En la a p lica c ió n de la e sp e c tro m e tr ía de m asas p a ra el a n á lis is de b io m o lé cu la s , las m o lé cu la s se tra n s fie re n de las fa se s líq u id a o só lid a a la fa se g a s e o s a y a la fa se de va c ío . C om o m u ch as b io m o lé cu la s son a la v e z g ra n d e s y frá g ile s (las p ro te ín a s son un e je m p lo c la ro ), d o s de los m é to d o s m ás e fica ce s p a ra su tra n s fe re n c ia a la fa se de v a c ío son la ion iza c ió n p o r d e so rc ió n lá se r a s is tid a p o r m atriz (M A L D I) o la ion iza c ió n p o r e le c tro p u lv e riz a c ió n (E S I). Los e xp e rto s en la té c n ica co n o ce n los a sp e c to s d e l u so de e s to s m é to d o s y los re q u is ito s de p re p a ra c ió n de la m u es tra . En g e n e ra l, la ESI es m ás se n s ib le , m ie n tra s q ue la M A L D I es m ás ráp ida . S ig n ifica tiva m e n te , a lg u n o s p é p tid o s se ion izan m e jo r en el m odo M A L D I q ue en el ESI, y v ice v e rsa (G e n o m e T e ch n o lo g y , ju n io 220 , pág . 52). Los m é to d o s y d is p o s itivo s d e l ca n a l de e x tra cc ió n de la p rese n te in ve n c ió n son p a rtic u la rm e n te a d e cu a d o s p a ra p re p a ra r m u e s tra s p a ra el a n á lis is p o r M S , e sp e c ia lm e n te m u e s tra s de b io m o lé c u la s co m o los g lico p é p tid o s . U na v e n ta ja im p o rta n te de la inve n c ió n es que p e rm ite la p re p a ra c ió n de una m u e s tra e n riq u e c id a q u e p ue de a n a liza rse d ire c ta m e n te , sin n e ce s id a d de p asos de p ro ce so in te rm e d io s , p o r e je m p lo , c o n ce n tra c ió n o d e sa la c ió n .
La ESI se re a liza m e zc la n d o la m u e s tra con á c id o vo lá til y so lve n te o rg á n ico e in fu n d ié n d o la a tra vé s de una a g u ja c o n d u c to ra ca rg a d a con a lto vo lta je . Las g o tita s ca rg a d a s q u e son p u lve r iza d a s (o e xp u lsa d a s ) d e sd e el e x tre m o de la a g u ja se d ir ig e n h ac ia e l e sp e c tró m e tro de m a sa s , y se seca n m e d ia n te c a lo r y v a c ío a m e d id a q u e van e n tra n d o .
D e sp u é s de q u e se h ayan se ca d o las g o tas , las m o lé cu la s ca rg a d a s re s ta n te s se d ir ig e n m e d ia n te len tes e le c tro m a g n é tic a s h ac ia e l d e te c to r de m a sa s y se a n a liza n en m asa . En u na re a liza c ió n , la m u e s tra e lu id a se d e p o s ita d ire c ta m e n te d e sd e el c a p ila r en u na b o q u illa de e le c tro p u lv e riz a c ió n , p o r e je m p lo , e l c a p ila r fu n c io n a co m o c a rg a d o r de la m u es tra . En o tra re a liza c ió n , e l p ro p io c a p ila r fu n c io n a co m o d isp o s itivo de e x tra cc ió n y co m o b o q u illa de e le c tro p u lve riza c ió n .
P ara la M A L D I, las m o lé cu la s d e a n a lito (p o r e je m p lo , p ro te ín a s) se d e p o s ita n sob re o b je tivo s m e tá lico s y se co c ris ta liza n con u n a m a triz o rg á n ica . Las m u e s tra s se seca n y se inse rtan en el e sp e c tró m e tro de m asas, y típ ic a m e n te se a n a liza n m e d ia n te d e te cc ió n p o r tie m p o de v u e lo (T O F). En u na re a liza c ió n , la m u e s tra e lu id a se d e p o s ita d ire c ta m e n te d e sd e el c a p ila r sob re e l o b je tivo m e tá lico , p o r e je m p lo , e l p rop io c a p ila r fu n c io n a com o c a rg a d o r de la m u es tra . En u na re a liza c ió n , el a na lito e x tra íd o se d e p o s ita sob re u n a d ia n a de M A L D I, se a ña de u na m a triz de ion iza c ió n M A LD I y la m u e s tra se ion iza y a na liza , p o r e je m p lo , m e d ia n te d e te cc ió n T O F .
En a lg u n a s re a liza c io n e s , se u san o tro s m o do s de ion izac ión , p o r e je m p lo , E S I-M S , e sp e c tro m e tría de m asas de ion iza c ió n p o r tu rb o p u lv e riz a c ió n , e sp e c tro m e tría de m a sa s de ion iza c ió n p o r n a n o p u lve r iza c ió n , e sp e c tro m e tría de m asas de ion izac ión p o r te rm o p u lv e riz a c ió n , e sp e c tro m e tría de m a sa s de ion izac ión p o r p u lve r iza c ió n són ica , S E L D I-M S y M A L D I-M S . En g e n e ra l, u n a v e n ta ja de e s to s m é to d o s es q u e p e rm ite n p u rif ic a r la m u e s tra "ju s to a tie m p o " e in tro d u c irla d ire c ta m e n te en e l m e d io de ion iza c ió n . Es im p o rta n te se ñ a la r que los v a r io s m o do s de ion izac ión y d e te cc ió n in trod uce n sus p ro p ia s lim ita c io n e s en la n a tu ra le za de la so lu c ió n de d e so rc ió n u sada , y es im p orta n te q ue la so lu c ió n de d e so rc ió n sea c o m p a tib le con a m bo s. P or e je m p lo , la m a tr iz de la m u e s tra en m u ch a s a p lica c io n e s d e b e te n e r u n a b a ja fu e rz a ión ica , o re s id ir d e n tro de un in te rva lo de pH p a rticu la r, e tc . En ESI, la sa l en la m u e s tra p u e d e p re v e n ir la d e te cc ió n d is m in u y e n d o la ion izac ión u o b s tru y e n d o la boq u illa . Este p ro b le m a se a b o rd a p re se n ta n d o el a n a lito con p o ca sa l y /o m e d ia n te e l uso de u na sal vo lá til. En e l ca so de M A LD I, e l a n a lito d e b e e s ta r en un so lve n te c o m p a tib le con la fo rm a c ió n de m a n ch a s en la d ia n a y con la m a triz de ion iza c ió n e m p le a d a .
E J E M P L O S
Los s ig u ie n te s e je m p lo s se e xp o n e n p a ra p ro p o rc io n a r a los e xp e rto s en la té c n ica u n a d ivu lg a c ió n y d e sc rip c ió n co m p le ta s de có m o e la b o ra r y u sa r los m é to d o s de la inve nc ión , y no se p re te n d e q ue lim iten el a lca nce de lo q ue los in ve n to re s c o n s id e ra n su inve nc ión . Se han re a liza d o e s fu e rzo s p a ra g a ra n tiz a r la p re c is ió n con re spe cto a los n ú m e ro s u sa d o s (p o r e je m p lo , c a n tid a d e s , te m p e ra tu ra , e tc .), p e ro d eb en te n e rse en c u e n ta a lg u n o s e rro re s y d e s v ia c io n e s e xp e rim e n ta le s . A m e no s q ue se ind iq ue lo co n tra rio , las p arte s son p arte s en peso, e l p eso m o le cu la r es e l peso m o le c u la r m ed io , la te m p e ra tu ra es en g ra d o s ce n tíg ra d o s , la te m p e ra tu ra a m b ie n te es de a p ro x im a d a m e n te 25° C, y la p re s ió n es la a tm o s fé ric a o c e rca n a a la a tm o s fé rica .
E je m p lo 1: C o m p a ra c ió n d e m é to d o s a n te rio re s b a s a d o s en R P L C -U V -M S d e g lic o p é p tid o s y g lic a n o lib era d o .
La F ig ura 1 es un d ia g ra m a e sq u e m á tic o de f lu jo de tra b a jo q ue ilus tra los m é to d o s a c tu a le s de cu a n tifica c ió n de g lico p é p tid o s . El a n ticu e rp o te ra p é u tico se d ig irió con tr ip s in a d e sp u é s de s e r d e sn a tu ra liza d o , re d u c id o y a lq u ila d o . La cu a n tif ica c ió n re la tiva se re a lizó m e d ia n te in te ns id ad d e l p ico (a ltu ra ) de los p icos de m a sa de l g lico p é p tid o . El m é to d o de l g lica n o lib e ra d o c u a n tif ica las g lic o fo rm a s p o r la f lu o re sc e n c ia d e l m a rc a d o r u n id o al g lica n o libe ra do , no p o r la señ a l de M S. La F igura 2 es u na ta b la q u e m u e s tra u n a c o m p a ra c ió n de la cu a n tif ica c ió n re la tiva de cad a g lic o fo rm a cu a n tif ica d a p o r g lica n o s lib e ra d o s (m a rca d o s con un re ac tivo flu o re sc e n te , R a p iF lu o r-M S de W a te rs ) y g lico p é p tid o s . Las p rin c ip a le s d ife re n c ia s en las cu a n tif ica c io n e s e n tre m é to d o s se m u es tra n en las fila s 3, 5, 7 y 8. La F ig u ra 3 es un e sp e c tro de m a sa s q u e d e m u e s tra q u e las d is c re p a n c ia s e n tre las cu a n tif ica c io n e s de g lic o fo rm a s p o r m é to d o s de g lic o p é p tid o s y de g lica n o s lib e ra d o s se d eb en p ro b a b le m e n te a la fra g m e n ta c ió n en la fu e n te de la e s tru c tu ra p rin c ip a l de l a zú c a r p o r M S en e l a n á lis is de g lico p é p tid o s , lo q ue p ro vo ca un a u m e n to de los a rte fa c to s de g lica n o s tru n c a d o s (es d ec ir, G 0 F -G lcN A c y G 1 F -G lcN A c ) y u n a d ism in u c ió n de l g lica n o p rin c ip a l (es d ec ir, G 0 F y G 1F ). Este re su lta d o d e m u e s tra q u e se n eces itan m é to d o s n ue vo s y m e jo ra d o s p a ra e l a n á lis is de g lica n o s a n ive l de p ép tid os .
E je m p lo 2: N u ev o s m é to d o s d e a n á lis is d e g lic o p é p tid o s u s a n d o H IL IC -U V -M S .
Los p é p tid o s de los a n ticu e rp o s te ra p é u tico s se p re p a ra ro n m e d ia n te m é to d o s de m a peo p e p tíd ico re du c ido o no re d u c id o re a liza d o s de m a n e ra ru tina ria . A co n tin u a c ió n , los d ig e rid o s se d ilu ye ro n al 80% de A C N fin a l (v/v) a n tes de l a n á lis is H IL IC -U V -M S .
S is te m a L C: S is te m a A C Q U IT Y I-C lass U P L C ® de W a te rs con d e te c to r P D A (U V)
S is te m a M S: W a te rs X E V O G 2 -S Q T o f o T h e rm o S c ie n tific Q E xa c tive P lus
C o lu m n a: C o lu m n a W a te rs A C Q U IT Y U P L C ® G lyca n BEH A m id e H IL IC
La F ig u ra 5 es un c o n ju n to de c ro m a to g ra m a s H IL IC -U V de p é p tid o s mAb1 q u e m u es tra n los re su lta d o s de u na se p a ra c ió n de p é p tid o s mAb1 o b te n id o s de la d ig e s tió n tríp t ic a m e d ia n te d o s m é to d o s d ife re n te s . El m é to do N°1 u sa fo rm ia to de a m o n io m ie n tra s q ue el m é to do N°2 u sa T F A . Los n ive les re la tivos de las d ife re n te s g lic o fo rm a s se cu a n tif ica ro n m e d ia n te U V u sa n d o el d e te c to r P D A con d e te cc ió n M S en línea. La F ig ura 6 es un p rim e r p la n o de la p o rc ió n de g lico p é p tid o de la tra z a m o s tra d a en la F igura 5 q ue d e m u e s tra q ue e l m é to d o N°2 te n ía m e jo r sep a rac ión , p ico s m ás n ítid os y m a yo r re lac ió n S /N . La F ig u ra 7 es un c o n ju n to de c ro m a to g ra m a s H IL IC -T IC de g lic o p é p tid o s m A b l con zoo m en la p o rc ió n de g lico p é p tid o . C om o se m u es tra , e l m é to do N°2 tu vo u n a m a yo r re lac ió n S /N de la señ a l M S. Las F ig uras 8 A y 8B son e sp e c tro s MS1 de g lic o p é p tid o s m A b l (iones M 2+). La fra g m e n ta c ió n de los g lica n o s en la fu e n te de M S no fu e un fa c to r en la c u a n tif ica c ió n de las g lic o fo rm a s p o r UV. La F ig ura 9 es un co n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue m u es tra n u n a c o m p a ra c ió n de la se p a ra c ió n de g lic o p é p tid o s en u n a co lu m n a H IL IC con el a n á lis is de g lica n o s libe ra do s . P ara m A b l se o b se rva ro n cu a n tif ica c io n e s de g lic o co n fo rm a c ió n s im ila re s m e d ia n te a n á lis is de g lic o p é p tid o s y de g lica n o s libe ra do s . Es im p o rta n te d e s ta c a r q u e no se o b se rva ro n d ife re n c ia s im p o rta n te s en las cu a n tif ica c io n e s de g lic o fo rm a s e n tre los d o s m é to do s , lo q u e d e m u e s tra q u e la se p a ra c ió n en co lu m n a H IL IC e ra v ia b le p a ra el a n á lis is de g lico p é p tid o s . A d e m á s, los n ive les to ta le s de fu co s ila c ió n y g a la c to s ila c ió n fue ro n co h e re n te s e n tre los d o s a ná lis is . Los a rte fa c to s de g lica n o s tru n c a d o s no a fe c ta n a la cu a n tif ica c ió n de g lico p é p tid o s m e d ia n te H IL IC -U V . Esto su g ie re q ue los a rte fa c to s o b se rva d o s p o r el a n á lis is R P LC p rev io se d e b ie ro n a la fra g m e n ta c ió n en o rige n de los g lica n o s in d u c id a p o r M S.
Los d ig e rid o s d ilu id o s p u e d e n c o n c e n tra rs e c o n s e c a d o: S i un d ig e rid o tie n e u na c o n ce n tra c ió n de <0 ,5 m g /m l, la m u e s tra p ue de co n c e n tra rse m e d ia n te se ca d o al v a c ío y v o lv ie n d o a s u s p e n d e r los p é p tid o s se co s en 80:20 de A C N :A g u a (v/v) con un 0 ,2% de T F A a 0 ,5 m g /m l o m ás. P ara m a n te n e r la so lu b ilid a d de l p é p tid o en e l so lve n te a lta m e n te o rg á n ico se re qu ie re un pH ba jo . La F igura 10 es un c o n ju n to de tra za s y u n a ta b la q u e d e m u e s tra n q u e los p é p tid o s se ca d o s a yu d a ro n a c o n c e n tra r los p é p tid o s y es c o h e re n te u sa n d o d ife re n te s c a n tid a d e s de m u e s tra (p o r e je m p lo , 5 -20 pg, a rrib a a la izqu ie rd a ), p e ro no a fe c tó a la señ a l U V (a ba jo a la izq u ie rd a ) ni al % de PA re la tivo (tab la de la d e re ch a ) de los g lica n o s . La F ig ura 11 es un c o n ju n to de tra za s q ue m u es tra n los c a m b io s re a liza d o s p ara s im p lif ic a r las p re p a ra c io n e s de fa se m óvil y m e jo ra r la in te g ra c ió n de los p ico s. La fa se m óvil ca m b ió de l 0 ,1 % de T F A en a g u a /A C N a los m ism os ta m p o n e s de fa se m óvil u sa d o s p a ra el m a pe o de p é p tid o s (0 ,05 % y 0 ,045 % de T F A en a g u a y A C N , re sp e c tiva m e n te ). Las F ig uras 12A, 12B, 12C y 12D son un c o n ju n to de re su lta d o s de e sp e c tro s de m a sa s q u e m u es tra n q ue el c a m b io de fa se m ó v il no tu vo im p ac to sob re la se ñ a l de M S de los g lic o p é p tid o s (iones M 2+). La F ig u ra 13 es un c o n ju n to de tra za s q u e d e m u e s tra n la e s ta b ilid a d en so lu c ió n de los g lic o p é p tid o s mAb1 d ilu id o s en A C N al 80% .
Id e n tific a c ió n d e g lic o p é p tid o s m al c o r ta d o s: La F ig u ra 14 es un c o n ju n to de tra za s q ue m u es tra n q u e los d ig e rid o s con g lic o p é p tid o s m al c o rta d o s co m p lica n la cu a n tif ica c ió n de los g lic o p é p tid o s p o r UV. La F igura 15 es un co n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue d e m u e s tra q ue con los d a to s de M S en líne a p ue de u sa rse c ro m a to g ra fía ión ica de e x tra cc ió n (E IC ) p a ra e n c o n tra r el p o rce n ta je de g lic o p é p tid o s m a l c o rta d o s en ca d a p ico . Se usó la E IC de la d e te cc ió n M S en líne a p a ra c a lc u la r la p ro p o rc ió n de p é p tid o s e rró n e o s con re sp e c to a los g lic o p é p tid o s tríp tico s re g u la re s en c a d a p ico de c o e lu c ió n y p a ra f iltra r la señ a l U V d e b id a a los co rte s e rró n e o s p a ra la cu a n tif ica c ió n de la g lico fo rm a . A lte rn a tiva m e n te , e l d ig e rid o p u e d e v o lv e r a d ig e rirse con tr ip s in a p a ra c o n v e rt ir los co rte s e rró n e o s en g lic o p é p tid o s tríp tic o s re gu la res .
P ara la re d ig e s tió n , se usó el s ig u ie n te p ro to co lo : A u m e n ta r e l pH del d ig e rid o a ~8.0 con b ase de T ris 3 M; A ñ a d ir re lac ió n 1:5 E:S (p /p ) de trip s in a , in c u b a r a 50° C d u ra n te 1 hora ; y A ñ a d ir un 0 ,2 % de T F A (fina l) y d ilu ir al 80% de A C N (fina l) p a ra a n á lis is H IL IC . La F ig ura 16 es un c o n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue d e m u e s tra n q ue la re d ig es tión de m A b2 con tr ip s in a e lim in ó la in te rfe re n c ia de g lic o p é p tid o s m al c o rta d o s p a ra la c u a n tif ica c ió n de g lico fo rm a s .
Los d ig e rid o s c o n ta m in a d o s c o n re a c tiv o s p u e d e n lim p ia rs e c o n e x tra c c ió n en fa s e s ó lid a y c o n c e n tra rs e con s e c a d o: S i un d ig e rid o tie n e u n a co n ce n tra c ió n de <0 ,5 m g /m l, p ue de co n c e n tra rse s e cá n d o lo al v a c ío y v o lv ie n d o a s u s p e n d e r los p é p tid o s se co s en 80 :20 A C N :A g u a (v /v) con un 0 ,2 % de T F A h as ta 0 ,5 m g /m l o m ás. P ara m a n te n e r la so lu b ilid a d de l p é p tid o en e l so lve n te a lta m e n te o rg á n ico se re qu ie re un pH bajo .
El d ig e rid o p ue de lim p ia rse de sa le s, re a c tivo s o d e te rg e n te s m e d ia n te e x tra cc ió n en fa se só lid a (S P E ) y lue g o se ca rse al vac ío .
P laca de p E lu c ió n W a te rs G lyco W o rks H IL IC (N° de p ie za 186002780 ): L a v a r con agua, luego 80 :15 A C N :A g u a (v /v ); A ñ a d ir d ig e rid o p e p tíd ico (d ilu id o al 80 % de A C N , v /v ); L a v a r d os v e c e s con 1 :9 :90 de Á c ido F ó rm ico /A g u a :A C N (v /v ); E lu ir con 200 m M F o rm ia to de a m o n io , 5% de A C N ; S e c a r al v a c ío los g lic o p é p tid o s e lu id o s ; y V o lv e r a s u s p e n d e r en 80 :20 de A C N :A g u a (v /v) con un 0 ,2 % de T F A a 0 ,5 m g/m l.
La F ig ura 17 es un c o n ju n to de tra za s q u e d e m u e s tra n q ue el fo rm ia to de a m o n io m e jo ra s ig n ifica tiva m e n te la e lu c ió n de g lic o p é p tid o s a p a rtir de S P E H IL IC .
La F ig ura 18 es un c o n ju n to de tra za s y u n a ta b la q u e d e m u e s tra n q u e e l se ca d o o la lim p ie za /se ca d o de la S P E no a fe c ta n a la cu a n tif ica c ió n d e l g lico p é p tid o m A b 1.
La F ig u ra 19 es un c o n ju n to de tra za s y u na ta b la q ue d e m u e s tra n cu a n tif ica c io n e s s im ila re s de la g lico fo rm a m A b 3 m e d ia n te a n á lis is de g lic o p é p tid o s y g lica n o s libe ra do s .
Las F ig uras 20 A y 20B son un co n ju n to de tra za s y u n a ta b la q ue d e m u e s tra n cu a n tif ica c io n e s s im ila re s de g lic o fo rm a s u sa n d o d ig e rid o s tr íp tic o s de m A b 3 re d u c id o s y no re d u c id o s m e d ia n te a n á lis is de g lic o p é p tid o s y g lica n o s libe ra do s .
La F igura 21 es un c o n ju n to de tra za s q u e m u e s tra u n a c o m p a ra c ió n de la se p a ra c ió n de los g lico p é p tid o s IgG1 e IgG 4, con y sin fu co s ila c ió n .
El a lca n ce de la p re se n te inve n c ió n no d eb e lim ita rse a las re a liza c io n e s e sp e c ífica s d e sc rita s en la p rese n te . D e h e ch o , v a r ia s m o d ifica c io n e s de la inve nc ión , a d e m á s de las d e sc rita s en la p rese n te , re su lta rá n e v id e n te s p ara los e xp e rto s en la té c n ica a p a rt ir de la d e sc rip c ió n a n te r io r y las fig u ra s a co m p a ñ a n te s . Se p re te n d e q ue ta le s m o d ifica c io n e s fo rm e n p a rte de la inve nc ión en la m e d id a q u e e n tre n d e n tro de l a lca n ce de las re iv in d ica c io n e s ad ju n tas .

Claims (15)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. Un m é to do de se p a ra c ió n de g lico p é p tid o s , q ue co m p re n d e :
p o n e r en co n ta c to u n a m u e s tra q u e c o n tie n e g lic o p é p tid o s con un su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo en co n d ic io n e s q u e p e rm ita n q u e los g lic o p é p tid o s se u nan al su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo ;
la v a r e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo p a ra e lim in a r los co n ta m in a n te s q ue no son g lic o p é p tid o s de l sus tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo ;
e lu ir los g lic o p é p tid o s d e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo con u n a so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y a ce to n itr ilo (A C N ) en a gu a p a ra c re a r u n a m u e s tra de g lic o p é p tid o s e n riq u e c id a ;
a p lic a r la m u e s tra de g lic o p é p tid o s e n riq u e c id a a u n a co lu m n a de se p a ra c ió n ; y
e lu ir los g lic o p é p tid o s de la co lu m n a de s e p a ra c ió n , se p a ra n d o de e s te m o do los g lic o p é p tid o s de la m uestra .
2. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 1, en d o n d e e l su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo co m p re n d e un su s tra to de c ro m a to g ra fía de e x tra cc ió n en fa se só lid a (S P E ).
3. El m é to do de la re iv in d ica c ió n 1 o de la re iv in d ica c ió n 2, en d o n d e el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo co m p re n d e un m a te ria l s o rb e n te a m in o p ro p ílico a b ase de sílice .
4. El m é to d o de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3, en d o n d e la so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N en a gu a co m p re n d e a p ro x im a d a m e n te 100 -400 m M de fo rm ia to de a m o n io y de a p ro x im a d a m e n te un 2 ,5 % a a p ro x im a d a m e n te un 10% de A C N en agua, o en d o n d e la so lu c ió n de fo rm ia to de a m o n io y A C N co m p re n d e a p ro x im a d a m e n te 200 mM de fo rm ia to de a m o n io y a p ro x im a d a m e n te un 5% de A C N en agua.
5. El m é to do de c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, en d o n d e el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava con u n a so lu c ió n de lava do de á c ido fó rm ico y A C N q ue co m p re n d e de a p ro x im a d a m e n te un 0 ,5 % a a p ro x im a d a m e n te un 5 % de á c id o fó rm ic o en v o lu m e n y de a p ro x im a d a m e n te un 85 % a a p ro x im a d a m e n te un 95 % de A C N en vo lu m e n , con e l res to de a gu a p a ra e lim in a r los co n ta m in a n te s q ue no son g lico p é p tid o s ,
o en d o n d e el su s tra to de e n riq u e c im ie n to h id ró filo se lava con u na so lu c ió n de lava do de á c id o fó rm ic o y A C N que co m p re n d e a p ro x im a d a m e n te un 1% de á c ido fó rm ico , a p ro x im a d a m e n te un 9% de H<2>O y a p ro x im a d a m e n te un 90% de A C N en vo lu m e n .
6. El m é to d o de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 5, en d o n d e la c o lu m n a de se p a ra c ió n co m p re n d e u na co lu m n a de in te ra cc ió n h id ró fila (H IL IC ).
7. El m é to do de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 6, en d o n d e e lu ir de los g lic o p é p tid o s de la c o lu m n a de se p a ra c ió n co m p re n d e a d e m á s se p a ra r los g lic o p é p tid o s en u n a o m ás fra cc io n e s .
8. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 7, en d o n d e se p a ra r los g lic o p é p tid o s en u na o m ás fra cc io n e s co m p re n d e a p lic a r un g ra d ie n te de fa se m óvil a la c o lu m n a de sep a rac ión .
9. El m é to d o de la re iv in d ica c ió n 8, en d o n d e e l g ra d ie n te de fa se m ó v il co m p re n d e a p ro x im a d a m e n te 10 m M de fo rm ia to de a m on io , pH 4 ,5 a a p ro x im a d a m e n te un 90 % de A C N con 10 m M de fo rm ia to de a m on io , pH 4,5, o en d o n d e el g ra d ie n te de fa se m óvil co m p re n d e a p ro x im a d a m e n te un 0 ,05 % de T F A en H<2>O o a p ro x im a d a m e n te un 0 ,045 % de T F A en A C N .
10. El m é to do de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 7 a 9, q ue co m p re n d e a d e m á s id e n tif ic a r los g lico p é p tid o s p re se n te s en u n a o m ás de las fra cc io n e s .
11. El m é to do de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 7 a 10, q u e co m p re n d e a d e m á s id e n tif ic a r un g lica n o a so c ia d o con los g lic o p é p tid o s p re se n te s en u n a o m ás de las fra cc io n e s .
12. El m é to do de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 7 a 11, en d o n d e los g lic o p é p tid o s se o b tie n e n a p a rtir de un a n ticu e rp o m o no c lo na l.
13. El m é to do de la re iv in d ica c ió n 12, q ue co m p re n d e a d e m á s d ig e r ir e l a n ticu e rp o m o n o c lo n a l con u n a p ro te asa , o q u e co m p re n d e d ig e rir e l a n ticu e rp o m o n o c lo n a l con u na p ro te a sa en d o n d e la p ro te a sa co m p re n d e trip s in a .
14. El m é to do de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 13, q ue co m p re n d e a d e m á s re a liz a r a n á lis is de e sp e c tro m e tría de m a sa s de los g lic o p é p tid o s e lu id os .
15. El m é to do de cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 14, q ue co m p re n d e a d e m á s re a liza r p e rfile s de g lico s ila c ió n a n ive l de g lic o p é p tid o de los g lic o p é p tid o s e lu id os .
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