ES2981475T3 - Composiciones selectivas de inhibidor de la señalización IL-6-trans - Google Patents

Abstract

Se puede utilizar un inhibidor selectivo de la transseñalización de IL-6 para tratar diversas enfermedades mediadas por IL-6, incluidas las enfermedades inflamatorias y el cáncer. El inhibidor se puede administrar de forma segura a seres humanos en diversas dosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones selectivas de inhibidor de la señalización IL-6-trans

ANTECEDENTES

IL-6 es una citoquina pleiotrópica producida por células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, p. ej., en respuesta a infección y daño tisular. La IL-6 ejerce sus múltiples actividades biológicas a través de dos vías de señalización principales, la denominada vía clásica ligando-receptor a través del IL-6R unido a la membrana, presente principalmente en los hepatocitos y determinados leucocitos, y una vía de señalizacióntransa través de sIL-6R circulante que procede de la escisión proteolítica del IL-6R unido a la membrana o del corte y empalme alternativo.

En la vía clásica, la IL-6 se une directamente a IL-6R unido a la membrana en la superficie de una gama limitada de tipos de células. El complejo IL-6/IL-6R se asocia con un dímero pre-conformado de la proteína receptora gp130 transductora de señales, lo que provoca cambios estéricos en el homodímero gp130 y, con ello, inicia una cascada de señalización intracelular. La señalización clásica es responsable de los mecanismos de defensa inflamatorios agudos y de funciones fisiológicas cruciales de la IL-6, tales como el crecimiento y las señales regenerativas de las células epiteliales intestinales.

Los dominios extracelulares de IL-6R y gp130 se pueden generar sin los dominios de anclaje a la membrana mediante la traducción de ARNm cortados y empalmados alternativamente, lo que da como resultado variantes de sIL-6R y sgp130. Además, el dominio extracelular de IL-6R puede ser eliminado por proteasas unidas a membrana de la familia una desintegrina y metaloproteasa (ADAM, por sus siglas en inglés) (en seres humanos, ADAM17) para generar sIL-6R. En el proceso de trans-señalización, sIL-6R se une a IL-6, formando un complejo agonista que se une a los dímeros de gp130 trans-membrana presentes en una multitud de tipos de células que no expresan IL-6R unido a membrana; luego, la señalización de IL-6 mediante transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT, por sus siglas en inglés) se induce en células que normalmente no responden a la IL-6. La actividad del complejo IL-6/sIL-6R está controlada normalmente por altos niveles de sgp130 presentes en la circulación que compiten eficazmente con la gp130 unida a la membrana. La señalizacióntransestá implicada principalmente en la inflamación crónica y se ha demostrado que previene que las poblaciones de células T de la mucosa promotoras de enfermedades entren en apoptosis. El documento EP1630232 describe la transfección de células HEK293 con gp130-Fc, la incubación de las células transfectadas durante 24 horas y luego la recolección de gp130-Fc de la colección de células cultivadas.

Sería deseable tener una molécula que imite al inhibidor natural de la señalización trans sgp130, pero con una mayor afinidad de unión y, en consecuencia, una actividad inhibidora más fuerte. Además, sería deseable tener una molécula que pueda administrarse a seres humanos con una toxicidad y un potencial inmunogénico mínimos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado ahora que se puede administrar a seres humanos un inhibidor selectivo de la señalización IL-6-trans sin efectos perjudiciales significativos en un amplio intervalo de dosificación. Este inhibidor está sustancialmente libre de patrones de agregación y glicosilación que están asociados con un potencial inmunogénico. Además, el inhibidor proporciona una semivida favorable en seres humanos.

La invención proporciona un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, los monómeros están enlazados por uno o más puentes disulfuro. Preferiblemente, el dímero está enlazado mediante puentes disulfuro en las posiciones Cys623 y Cys<626>de SEQ ID NO: 1. La invención proporciona también un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros de SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, los monómeros están enlazados por uno o más puentes disulfuro. Preferiblemente, el dímero está enlazado mediante puentes disulfuro en las posiciones Cyss23 y Cyss<26>de SEQ ID NO: 2.

El dímero polipeptídico comprende no más del 6 % de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido. Preferiblemente, el dímero polipeptídico incluye al menos un 52 % de glicanos que tienen uno o más residuos de ácido siálico.

La invención también proporciona una composición que comprende los dímeros polipeptídicos descritos en esta memoria. Preferiblemente, no más del 5 % del dímero polipeptídico en la composición está presente como un agregado oligomérico y/o la composición comprende no más del 10,0 %, 8,0 %, 6,0 o 4,0 % en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido (p. ej., una versión truncada de SEQ ID NO: 1 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 1 o una versión truncada de SEQ ID NO: 2 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 2). Además, los dímeros en composiciones de este tipo pueden incluir las características descritas en el párrafo anterior y descritas con más detalle más adelante.

La invención incluye, además, el uso de dímeros polipeptídicos y composiciones descritas en esta memoria para la fabricación de un medicamento para tratar una afección descrita en esta memoria.

Además, la invención incluye métodos para preparar los dímeros polipeptídicos, que abarcan secuencias de nucleótidos asociadas, vectores de expresión, células que expresan el polipéptido y purificación del polipéptido. En particular, la invención incluye secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es al menos un 90 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de la FIG. 3 o FIG. 7 y más preferiblemente codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Preferiblemente la secuencia de nucleótidos es la secuencia de nucleótidos de la Figura 7

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. muestra la vía de señalizacióntransdeIL-6. sIL-6R generado a partir de ARNm cortado y empalmado alternativamente o la escisión proteolítica es capaz de unirse a IL-6 para formar un complejo IL-6/sIL-6 que se une a gp130 presente en la amplia mayoría de los tipos de células del cuerpo e induce una cascada de señalización intracelular.

La FIG. 2 muestra que un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros de SEQ ID NO: 1 no interfiere en la unión de IL-6 a IL-6R unido a membrana (señalización clásica), pero se une selectivamente al complejo IL-6/sIL-6R y previene la trans- señalización.

La FIG. 3 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la única subunidad gp130-Fc.

La FIG. 4 muestra un mapa del vector de expresión pANTVhG1. Se muestran elementos para la expresión de IgG humana o proteínas de fusión y para la selección en células eucariotas, así como sitios de digestión de enzimas de restricción relevantes (no a escala). Los elementos incluyen: CMV P, un promotor de la expresión de citomegalovirus; secuencias de IgG1 humana: VH, CH1, Bisagra, CH2 y CH3; hIgGI poli A, secuencia de poliadenilación de IgG humana; pAT153; una secuencia de vector de expresión derivada de pBR322 que contiene un origen de replicación y un gen Amp para la resistencia bacteriana contra ampicilina; secuencia de promotor SV40; DHFR, secuencia codificante de dihidrofolato reductasa; secuencias de digestión con enzimas de restricción MluI, HindIII, EagI y SspI; y una secuencia señal consenso murina. No se muestran los detalles de los elementos para la propagación y selección de procariotas.

La FIG. 5 muestra un mapa del vector de expresión pFER02. Se muestran elementos para la expresión de Péptido 1 y para la selección en células eucariotas, así como sitios de digestión de enzimas de restricción relevantes (no a escala). Los elementos incluyen: CMV P, un promotor de la expresión de citomegalovirus; SEQ ID NO: 2, la secuencia codificante; hIgG1 poli A, secuencia de poliadenilación de IgG humana; pAT153; una secuencia de vector de expresión derivada de pBR322 que contiene un origen de replicación y un gen Amp para la resistencia bacteriana contra ampicilina; secuencia de promotor SV40; DHFR, secuencia codificante de dihidrofolato reductasa; secuencias de digestión con enzimas de restricción MluI, EagI y SspI; y una secuencia señal consenso murina.

La FIG. 6 muestra elementos de la secuencia de nucleótidos del plásmido de expresión pFER02.

La FIG. 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la única subunidad gp130-Fc y la secuencia de nucleótidos optimizada para el uso óptimo de codones en células CHO.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la invención proporciona un dímero de dos monómeros de fusión gp130-Fc (p. ej., dos monómeros de SEQ ID NO: 1). En su forma activa, el polipéptido de SEQ ID NO: 1 existe como un dímero enlazado por dos enlaces disulfuro en Cys623 y Cys<626>(FIG. 2). SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de aminoácidos de un monómero de fusión gp130-Fc que tiene el péptido señal endógeno. El péptido señal se elimina durante la síntesis de proteínas, dando como resultado la producción del polipéptido de SEQ ID NO: 1.

Los dímeros polipeptídicos descritos en esta memoria inhiben selectivamente la señalización trans excesiva (FIG. 1) e inducen la apoptosis de las células T perjudiciales implicadas en múltiples enfermedades inflamatorias. El dímero polipeptídico fija como objetivo y neutraliza los complejos IL-6/sIL-6R y, por lo tanto, se espera que solo inhiba la señalizacióntransde IL-6 en las concentraciones terapéuticas deseadas, dejando la señalización clásica y sus numerosas funciones fisiológicas, así como sus mecanismos de defensa inflamatoria aguda, intactas (FIG. 2). Se cree que el dímero polipeptídico no puede interferir con la señalización clásica de IL-6 debido al impedimento estérico; la porción Fc es incapaz de insertarse en una membrana celular, lo que hace que la porción gp130 no esté disponible para unirse al complejo IL-6/sIL-6R unido a la membrana. Por lo tanto, se espera que el polipéptido tenga una eficacia similar al bloqueo global de IL-6 (p. ej., tocilizumab, sirukumab), pero con menos efectos secundarios.

Los dímeros polipeptídicos descritos en esta memoria comprenden preferiblemente monómeros de gp130-Fc que tienen la secuencia correspondiente a SEQ ID NO:1. En determinadas realizaciones, los monómeros tienen la secuencia correspondiente a SEQ ID NO:2. Los dímeros polipeptídicos descritos en esta memoria comprenden polipéptidos que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. El polipéptido comprende el dominio D6 gp130 (en particular aminoácidos TFTTPKFAQGE: posiciones de aminoácidos 585-595 de SEQ ID NO: 1), AEGA en la región bisagra del dominio Fc (posiciones de aminoácidos 609-612 de SEQ ID NO: 1) y no comprende un enlazador entre la porción gp130 y el dominio Fc. La divulgación proporciona un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros que tienen una secuencia de aminoácidos que al menos identifica un 90 % de la secuencia con la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende el dominio gp130 D6, AEGA en la región bisagra del dominio Fc, y no hay enlazador presente entre la porción gp130 y el dominio Fc. En una realización preferida, la divulgación proporciona un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros que tienen una secuencia de aminoácidos que al menos identifica un 90 % de la secuencia con la SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de aminoácidos comprende el dominio gp130 D6, AEGA en la región bisagra del dominio Fc y no existe enlazador alguno entre la porción gp130 y el dominio Fc, preferiblemente en donde los monómeros están enlazados por uno o más puentes disulfuro, en donde el dímero polipeptídico comprende no más del 6 % de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido, preferiblemente no más de 3 % en moles, más preferiblemente no más de 1 % en moles, incluso más preferiblemente no más de 0,5 % en moles de galactosa-alfa-1,3-galactosa.

Es deseable que los polipéptidos estén sustancialmente libres de restos galactosa-alfa-1,3-galactosa, ya que estos están asociados con una respuesta inmunogénica. Sorprendentemente se encontró que los dímeros de la invención tienen niveles bajos de restos de este tipo. El polipéptido (p. ej., un monómero y/o dímero polipeptídico descrito en esta memoria) contiene no más de 6 % de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido contiene no más de 4 % en moles, 3 % en moles, 2 % en moles, 1 % en moles, 0,5 % en moles, 0,2 % en moles, 0,1 % en moles o incluso un nivel indetectable de galactosa-alfa-1,3-galactosa. (p. ej., medido mediante WAX-HPLC, NP-HPLC o WAX, preferiblemente determinado mediante WAX-HPLC). En otras realizaciones, los polipéptidos contienen menos de 6 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o incluso 0,1 % de galactosa-alfa-1,3-galactosa, con respecto a la cantidad total de glicanos, ya sea en masa o sobre una base molar.

En algunas realizaciones, también es deseable que un polipéptido de la invención esté sialilado, p. ej., para aumentar la semivida de los polipéptidos de la invención. Cada una de las cadenas del polipéptido contiene 10 supuestos sitios de N-glicosilación; nueve sitios de N-glicosilación están ubicados en la porción gp130 y un sitio de N-glicosilación está ubicado en la porción Fc. Por lo tanto, el polipéptido contiene en total 20 sitios de glicosilación. En determinadas realizaciones, una media de al menos el 52 % o al menos el 54 % de glicanos en el polipéptido incluye un residuo de ácido siálico, tal como una media del 52-65 % (p. ej., medido mediante WAX-HPLC, NP-HpLc o WAX, preferiblemente según lo determinado por WAX-HPLC). Preferiblemente, el polipéptido de la invención tiene un peso molecular aproximado de 220 kDa; cada uno de 93 kDA tiene un peso molecular adicional de ~20 kDa derivado de 10 cadenas de N-glicosilación.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona composiciones que comprenden una pluralidad de polipéptidos descritos en esta memoria (p. ej., una pluralidad de monómeros polipeptídicos y/o dímeros polipeptídicos descritos en esta memoria). En algunas realizaciones, una composición comprende una media de al menos 25 % (p. ej., al menos 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38% , 39 % o 40 %) de polipéptidos monosialilados; una media de al menos 10 % (p. ej., al menos 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 % o 25 %) de polipéptidos disialilados; una media de al menos 1 % (p. ej., al menos 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 % o 6 %) de polipéptidos trisialilados; y/o una media de al menos 0,1 % (p. ej., al menos 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 % o 1 %) de glicanos tetrasialilados; con relación a los grupos de glicano en la composición.

Es además deseable minimizar el grado en que los polipéptidos se agregan, lo que en esta memoria se denomina oligomerización que da como resultado agregados oligoméricos. "Agregados oligoméricos", como se usa en esta memoria, no se refiere al péptido dimerizado activo. En cambio, la expresión se refiere a un agregado de al menos tres monómeros (p. ej., de SEQ ID NO: 1) o, más típicamente, al menos un dímero de dímeros activos. Sorprendentemente, se encontró que los dímeros peptídicos de la invención presentan bajos niveles de agregación. En determinadas realizaciones, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 %, menos del 1,5 % o incluso menos del 1,0 % del polipéptido está presente como un oligómero. El contenido de oligómero se puede medir, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño-dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS) o SEC-UV.

Preferiblemente, el polipéptido está presente en su forma de longitud completa (p. ej., incluye dos monómeros de longitud completa, p. ej., de SEQ ID NO: 1). Sin embargo, el cultivo celular puede producir una variante truncada denominada en esta memoria forma única de gp130 (SGF, por sus siglas en inglés). SGF es una molécula de dos cadenas unidas covalentemente, una cadena que comprende un monómero de gp130-Fc de longitud completa (p. ej., de SEQ ID NO:1) y una segunda cadena que comprende un monómero de gp130-Fc truncado (p. ej., un truncamiento de SEQ ID NO: 1), cuya segunda cadena incluye el dominio Fc y carece de la mayor parte o la totalidad del dominio gp130 (p. ej., terminado antes de la secuencia de enlazador a la región Fc). Los estudios hasta la fecha demuestran que SGF no tiene un extremo amino heterogéneo. El SGF se puede formar en niveles consistentes en un biorreactor y, una vez formado, los niveles de SGF no cambian fácilmente durante la purificación, el procesamiento o las condiciones de almacenamiento aceleradas. Los niveles de SGF son difíciles de eliminar durante la purificación debido a propiedades físico-químicas similares a las de la forma completa del dímero polipeptídico; por lo tanto, los esfuerzos por eliminar el SGF pueden dar como resultado una reducción significativa del rendimiento. Sorprendentemente, se encontró que los dímeros de la invención casi siempre son de longitud completa. En determinadas realizaciones, la composición de la invención comprende no más de 4,0 % en peso, 3,0 % en peso, 2,0 % en peso o incluso 1,5 % en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido de SEQ ID NO: 1 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 1. En determinadas realizaciones, la composición de la invención comprende no más de 4,0 % en peso, 3,0 % en peso, 2,0 % en peso o incluso 1,5 % en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido de s Eq iD NO: 2 con respecto a polipéptidos de SEQ ID n O: 2.

El polipéptido de la invención se administra típicamente por vía parenteral, tal como por vía intravenosa o subcutánea.

Formulaciones adecuadas incluyen aquellas que comprenden un tensioactivo, particularmente un tensioactivo no iónico tal como un tensioactivo de polisorbato (p. ej., polisorbato 20). Las formulaciones también pueden incluir agentes tampón y azúcares. Un agente tampón ejemplar es histidina. Un azúcar ejemplar es sacarosa. Por lo tanto, una formulación adecuada podría incluir polisorbato 20 (p. ej., 0,01-1 mg/mL, 0,02-0,5 mg/mL, 0,05-0,2 mg/mL), histidina (p. ej., 0,5 mM-250 mM, 1-100 mM, 5-50 mM, 10-20 mM) y sacarosa (p. ej., 10-1000 mM, 20-500 mM, 100 300 mM, 150-250 mM).

Indicaciones

En la inflamación aguda, se ha demostrado que IL-6 induce la respuesta de fase aguda en el hígado, lo que conduce a la liberación de la cascada de proteínas de fase aguda, en particular CRP. Al formar un complejo con sIL-6R desprendido por neutrófilos apoptóticos en el sitio de inflamación y la unión del complejo de señalización trans de IL-6/sIL-6R resultante al transductor de señal gp130 en las células endoteliales, IL-6 induce la expresión de quimioquinas tales como proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-1 y atrae células mononucleares. Esto conduce a la resolución de la inflamación aguda y al inicio de una respuesta inmune adaptativa. Por lo tanto, en la inflamación aguda, IL-6 con el complejo sIL-6R apoya la transición entre la etapa temprana predominantemente neutrofílica de la inflamación y la afluencia más sostenida de células mononucleares que, en última instancia, también conduce a la resolución de la inflamación.

La inflamación crónica, como en la enfermedad de Crohn (CD, por sus siglas en inglés), la colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en inglés), la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) o la psoriasis, se asocia histológicamente con la presencia de células mononucleares, tales como macrófagos y linfocitos, que persisten en el tejido después de haber sido adquiridos para la resolución de la fase inflamatoria aguda. En modelos de enfermedades inflamatorias crónicas, IL-6 parece tener un papel perjudicial al favorecer la acumulación de células mononucleares en el sitio de la lesión, mediante la inducción de la secreción continua de MCP-1, la angioproliferación y las funciones anti-apoptóticas de las células T

La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD, por sus siglas en inglés), concretamente CD o UC, es una inflamación crónica que se produce en el intestino de individuos susceptibles y que se cree que es independiente de un patógeno específico. Las alteraciones de la barrera de la mucosa epitelial con una mayor permeabilidad intestinal conducen a una exposición potenciada del sistema inmunológico de la mucosa a antígenos luminales, lo que provoca una activación inadecuada del sistema inmunológico intestinal en los pacientes. La activación incontrolada de los linfocitos T CD4+ de la mucosa con la consiguiente liberación excesiva de citoquinas proinflamatorias induce inflamación gastrointestinal patógena y daño tisular. Existe consenso en que las principales células inmunitarias activadas implicadas en la patogénesis de la IBD son las células T intestinales y los macrófagos.

Se ha demostrado que IL-6 es una citoquina central en la IBD en seres humanos. Se ha descubierto que los pacientes con CD y UC producen niveles elevados de IL-6 en comparación con los controles, estando los niveles de IL-6 correlacionados con la actividad clínica. También se ha descubierto que los pacientes con CD tienen niveles elevados de sIL-6R y, en consecuencia, del complejo IL-6/sIL-6R en suero. Las células mononucleares de la lámina propia obtenidas de muestras quirúrgicas de colon de pacientes con CD y UC mostraron que tanto las células T CD4+ como los macrófagos produjeron mayores cantidades de IL-6 en comparación con los controles. Se descubrió que sIL-6R se libera mediante la eliminación de la superficie de macrófagos y células mononucleares con una producción incrementada asociada con niveles elevados de IL-6. En pacientes con CD, las células T de la mucosa mostraron una fuerte evidencia de señalizacióntransde IL-6 con activación de STAT3, bcl-2 y bcl-xl. El bloqueo de la señalizacióntransdeIL-6 provocó la apoptosis de las células T, lo que indica que el sistema IL-6/sIL-6R media en la resistencia de las células T a la apoptosis en la CD.

Por lo tanto, en pacientes con IBD, la acumulación adquirida de células T CD4+ que fomentan la enfermedad en la lámina propia conducen a la perpetuación de la inflamación depende de forma crítica de la señalizacióntransantiapoptótica de IL-6/sIL-6R. Se cree que al actuar sobre el complejo IL-6/sIL-6R, el polipéptido descrito en esta memoria es útil en el tratamiento de la CD y otras enfermedades inflamatorias.

Por lo tanto, el polipéptido de la invención puede tratar afecciones mediadas por IL-6. Las afecciones mediadas por IL-6 incluyen enfermedades inflamatorias o un cáncer. A este respecto, los polipéptidos y las composiciones descritos en esta memoria pueden administrarse a un sujeto que tenga una enfermedad inflamatoria, tal como artritis idiopática juvenil, enfermedad de Crohn, colitis (p. ej., colitis no asociada con IBD, incluyendo colitis por radiación, colitis diverticular, colitis isquémica, colitis infecciosa, enfermedad celíaca, colitis autoinmune o colitis resultante de alergias que afectan al colon), dermatitis, psoriasis, uveítis, diverticulitis, hepatitis, síndrome del intestino irritable (IBS, por sus siglas en inglés), lupus eritematoso, nefritis, enfermedad de Parkinson, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés), enfermedad de Alzheimer, artritis, artritis reumatoide, asma y diversas enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis y vasculitis. En determinadas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en diabetes, gota, síndrome periódico asociado a criopirina y trastorno pulmonar obstructivo crónico.

Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es enfermedad inflamatoria intestinal, preferiblemente en la que el tratamiento induce la remisión de la enfermedad inflamatoria intestinal. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, preferiblemente en la que el tratamiento mantiene la remisión de la enfermedad inflamatoria intestinal. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es artritis reumatoide, psoriasis, uveítis o aterosclerosis. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es colitis no asociada con enfermedad inflamatoria intestinal, preferiblemente en donde la colitis es colitis por radiación, colitis diverticular, colitis isquémica, colitis infecciosa, enfermedad celíaca, colitis autoinmune o colitis resultante de alergias que afectan el colon. Preferiblemente, la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 se selecciona de enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, artritis reumatoide y psoriasis, más preferiblemente de enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

Para enfermedades inflamatorias tales como la enfermedad inflamatoria intestinal, el tratamiento puede incluir la remisión de la afección, el mantenimiento de la remisión de la afección o ambas.

Otras realizaciones proporcionan un método para tratar, reducir la gravedad o prevenir un cáncer, que incluye, pero no se limita a mieloma múltiple, leucemia de células plasmáticas, carcinoma de células renales, sarcoma de Kaposi, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, melanoma, leucemia, linfoma, glioma, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón (que incluye, pero no se limita a cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés; tanto adenocarcinoma como carcinoma de células escamosas)), linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin, plasmocitoma, sarcoma, timoma, cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de cerebro, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, cáncer de estómago, cáncer de esófago, hepatoma, leucemia linfoblástica aguda (ALL, por sus siglas en inglés), T-ALL , leucemia mielógena aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés) y leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), carcinomas salivales u otros cánceres.

Realizaciones adicionales de la presente divulgación proporcionan un método para tratar, reducir la gravedad o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en sepsis, resorción ósea (osteoporosis), caquexia, fatiga relacionada con el cáncer, psoriasis, artritis idiopática juvenil de aparición sistémica, lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés), glomerulonefritis proliferativa mesangial, hipergammaglobulinemia, enfermedad de Castleman, gammapatía IgM, mixoma cardíaco y diabetes autoinmune dependiente de insulina.

Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "tratamiento", "tratar" y "tratando" se refieren a revertir, aliviar, retrasar la aparición o inhibir el progreso de una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de los mismos, como se describe en esta memoria. En algunas realizaciones, el tratamiento se puede administrar después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas. En otras realizaciones, el tratamiento se puede administrar en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo susceptible antes de la aparición de los síntomas (p. ej., a la vista de un historial de síntomas y/o a la vista de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad). El tratamiento también puede continuarse después de que se hayan resuelto los síntomas, por ejemplo, para prevenir o retrasar su recurrencia.

El polipéptido de la invención se puede administrar junto con un segundo agente activo. El segundo agente activo puede ser uno o más de ácido 5-aminosalicílico, azatioprina, 5-mercaptopurina y un corticosteroide. Los regímenes de dosificación para la administración de ácido 5-aminosalicílico, azatioprina, 5-mercaptopurina y corticosteroides son bien conocidos por una persona experta.

Métodos de producción

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un vector, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, así como células que comprenden dicho vector. El ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 se puede clonar en el vector de manera que el péptido señal esté enlazado en marco al extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

El diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se ha de transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etcétera. Las secuencias reguladoras para la expresión de células huésped de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados de LTR retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (p. ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamíferos tales como inmunoglobulina nativa y promotores de actina. La célula huésped puede ser una célula de mamífero, insecto, planta, bacteriana o levadura, preferiblemente la célula es una célula de mamífero tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO). Células CHO ejemplares son células (CHO)/dhfr obtenidas de la Colección Europea de Cultivos Celulares (eCa CC, N° 9406067).

Preferiblemente, la célula huésped es una célula CHO y el ácido nucleico que codifica el polipéptido está optimizado con codones para su uso en células CHO. Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica el polipéptido es la secuencia representada en la FIG. 3 o la FIG. 7.

La divulgación proporciona, además, métodos para producir los polipéptidos de la invención. En una realización, se proporciona un método para producir un dímero que comprende dos monómeros de SEQ ID NO: 1 enlazados por un puente disulfuro, comprendiendo dicho método expresar SEQ ID NO: 1 en células y purificar dicho polipéptido. Preferiblemente, se proporcionan métodos para producir un dímero que comprende dos monómeros de SEQ ID NO: 2 enlazados por un puente disulfuro, comprendiendo dicho método expresar SEQ ID NO: 2 en células y purificar dicho polipéptido. Un experto conoce métodos para introducir vectores de ácidos nucleicos e incluyen, p. ej., electroporación, transfección y similares. Las células transfectadas se cultivan para permitir que las células expresen la proteína deseada. Después se recogen las células y los medios de cultivo y se purifican los dímeros polipeptídicos, p. ej., mediante etapas de cromatografía en columna (p. ej., MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q). El dímero también puede concentrarse y/o tratarse con etapas de reducción/inactivación viral.

Un aspecto adicional de la invención abarca dímeros polipeptídicos producidos mediante los métodos descritos en esta memoria. Preferiblemente, los dímeros tienen las características descritas en esta memoria (p. ej., % de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido, sialilación). Se pueden utilizar dímeros producidos mediante los métodos para preparar composiciones adecuadas. Dichas composiciones tienen preferiblemente las características descritas en esta memoria (p. ej., baja agregación, truncamientos).

EJEMPLIFICACIÓN

Ejemplo 1

Preparación y Caracterización de Péptido 1 (el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en su forma dimerizada activa)

Clonación y Expresión de Péptido 1 en Células CHO/dhfr-

CélulasCHO)/dhfrse obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, N° 9406067). Las células adherentes CHO/dhfr-son deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR), una enzima que cataliza la reducción del folato a dihidrofolato y luego a tetrahidrofolato. Por lo tanto, las células CHO /dhfr-muestran sensibilidad al fármaco antifolato metotrexato (MTX).

La línea celularCHO/dhfrestá bien caracterizada y testada. La seguridad de la línea celular parental CHO/dhfrcomo sustrato celular para la producción de productos biofarmacéuticos para uso humano fue confirmada por ECACC (Porton Down, Reino Unido) para la esterilidad microbiana, micoplasmas y virus adventicios de acuerdo con 21 CFR.

Selección y Construcción de la Secuencia de ADNc

La secuencia de ADNc del Péptido 1 (la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 1) fue sintetizada como un único fragmento de ADN por GeneArt AG (Regensburg, Alemania) utilizando la secuencia para el dominio extracelular de gp130 (IL6ST, NCBI Gene ID 3572, transcripción variante 1 (NP_002175), aminoácidos 23-617) y dominio Fc de IgG1 humana (IGHG1, NCBI Gene ID 3500, aminoácidos 221-447 según la numeración Kabat EU). La secuencia se optimizó para un uso óptimo de codones en células CHO. Se introdujeron tres mutaciones puntuales bien caracterizadas en la región bisagra inferior de la parte Fc.

La secuencia de ADNc se modificó adicionalmente reemplazando el péptido señal gp130 original por un péptido señal de cadena pesada de IgG de ratón de eficacia conocida en sistemas de expresión de células CHO. El péptido señal se escinde durante la síntesis de proteínas. La presencia de la secuencia IgG1 Cys -Pro-Pro-Cys en la región Fc da como resultado la dimerización de dos subunidades gp130-Fc idénticas a través de los residuos sulfhidrilo en la región Fc, que juntos forman el Péptido 1.

La FIG. 3 presenta la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la subunidad gp130-Fc utilizada para la formación del Péptido 1.

Construcción del Plásmido de Expresión para la Selección del Banco de Células Maestro (MCB)El ADNc del Péptido 1 se clonó en un vector de expresión pANTVhGI (Antitope) que contenía el gendhfrpara la selección del transfectante con MTX (FIG. 4) de la siguiente manera: Primero, el vector de expresión se digirió con las enzimas de restricción MluI y EagI para permitir la inserción de ADNc del Péptido 1. En segundo lugar, la región codificante del Péptido 1 se amplificó por PCR utilizando los cebadores OL1425 y OL1426 (Tabla 1) y se digirió con las enzimas de restricción MluI y EagI. En tercer lugar, los fragmentos digeridos se purificaron en gel y se ligaron entre sí para generar el vector de expresión pFER02 (FIG. 5). El ADNc del Péptido 1 se insertó bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV).

La Tabla 2 presenta la función de los elementos de expresión de pFER02. La FIG. 6 presenta las secuencias de nucleótidos de los elementos de expresión de pFER02.

Tabla 1 Secuencias de Oligonucleótidos Utilizadas para Am plificar la Región Codificante del Péptido 1 para la Clonación en pANTVhG1

Tabla 2 Elementos de Expresión pFER02

Proceso de Selección de Lineas Celulares que Conduce al Clon Productor Final del Péptido 1

El vector pFER02 se linearizó con la enzima de restricción de extremo romo SspI, que tiene un único sitio de reconocimiento ubicado en el gen de la beta-lactamasa. El plásmido linearizado se transfectó en 5 x 106 células CHO/dhfr utilizando transfección mediada por lípidos. Veinticuatro horas después de la transfección, las células transfectadas se seleccionaron en medio complementado con suero de ternero fetal (FCS) dializado al 5 % y metotrexato (MTX) 100 nM. Las células transfectadas se diluyeron en este medio a diversas densidades y se distribuyeron en placas de cultivo de tejidos de fondo plano y 96 pocillos. Luego las células se incubaron en una atmósfera humidificada al 5 % de CO<2>y 37 °C. Se añadió medio de selección de MTX fresco a intervalos regulares durante el tiempo de incubación para garantizar que los niveles de MTX y de nutrientes permanecieran constantes.

Selección Inicial de la Línea Celular con Selección de MTX

Durante varias semanas después de la transfección, se examinaron placas de cultivo de tejidos utilizando un equipo Genetix CloneSelect® Imager y se observó que > 2.000 pocillos tenían colonias en crecimiento activo. Se tomaron muestras de los sobrenadantes de estos pocillos y se analizó el título de Péptido 1 mediante ELISA. En base a los resultados de este ensayo, un total de 105 de los pocillos de mejor expresión se ampliaron en placas de 48 pocillos. Se seleccionaron un total de 83 líneas celulares para su expansión en placas de 6 pocillos o matraces T-25; se tomaron muestras del sobrenadante de cada una de las líneas celulares y se analizó el título de Péptido 1 (ELISA). En base a estos resultados, se seleccionaron 54 de las líneas celulares de mejor expresión con características de crecimiento óptimas para su expansión en matraces T-75 o T-175; se tomaron muestras de los sobrenadantes de los matraces confluentes y se cuantificaron los títulos de Péptido 1 (ELISA). La comparación de los niveles de expresión entre las líneas celulares permitió la identificación de las 38 mejores líneas celulares que se seleccionaron para el análisis de productividad. La productividad se evaluó de la siguiente manera:

Productividad (pg/célula/día) = ((Th-Ti)/((Vh+Vi)2))/tiempo

En que:

Th es el título de cosecha [gg/mL]

Ti es el título inicial [gg/mL]

Vh es el recuento de células viables en el momento de la recolección [x 106 células/mL]

Vi es el recuento inicial de células viables [x 106 células/mL]

El tiempo es el tiempo transcurrido (días) entre Ti y Th.

En base a los resultados de productividad (pg/célula/día), se seleccionaron 13 líneas celulares para la amplificación génica.Amplificación Génica Impulsada por MTXpara la Selección de Líneas Celulares del Péptido 1

Las 13 líneas celulares seleccionadas se eligieron para la primera ronda de amplificación génica mediante presión selectiva en concentraciones crecientes de MTX (0,1-50 M). Después de 7-10 días, se tomaron muestras del sobrenadante de cada uno de los pocillos de cada una de las 13 líneas celulares y se analizó el título del Péptido 1 (ELISA). Se evaluó la productividad de los pocillos de cada una de las líneas celulares con altos niveles de expresión del Péptido 1 (pg/célula/día). Se inició una segunda ronda de amplificación génica con un total de 16 pocillos de líneas celulares que mostraron aumentos significativos en la productividad.

La segunda ronda de amplificación génica se realizó en presencia de concentraciones incrementadas de MTX; se analizó el título de Péptido 1 (ELISA) de los sobrenadantes de cada uno de los cultivos. Se ampliaron los pocillos seleccionados de cada una de las líneas celulares y se evaluó la productividad (pg/célula/día); se identificaron cinco líneas celulares con productividad incrementada en respuesta al aumento de la presión de selección de MTX. Estas cinco líneas celulares avanzaron a una tercera ronda de amplificación génica utilizando presión de selección bajo una concentración incrementada de MTX; se analizó el título de Péptido 1 (ELISA) de los sobrenadantes de cada uno de los pocillos. Se ampliaron los pocillos seleccionados para cada una de las líneas celulares y se evaluó la productividad (pg/célula/día); se seleccionaron cinco líneas celulares que demostraban una alta expresión del Péptido 1.

Limitar la Dilución de Clones

Se realizó una clonación por dilución limitante en las cinco líneas celulares que demostraban la expresión del Péptido 1. Después de una semana de incubación, las placas se examinaron utilizando un equipo Genetix CloneSelect® Imager y se identificaron colonias individuales. Se observó que las tasas de crecimiento de dos líneas celulares durante la clonación por dilución eran particularmente lentas, por lo que se suspendieron estas líneas celulares. En total, de las tres líneas celulares restantes, se seleccionaron 58 colonias clonales para la expansión, primero en placas de 48 pocillos y luego se expandieron sucesivamente a través de placas de 12 pocillos, matraces T-25 y matraces T-75 en ausencia de MTX. Luego se evaluó la productividad de cada uno de los 58 clones seleccionados (pg/célula/día); se seleccionaron 16 clones para adaptación en suspensión y adaptación al crecimiento en un medio químicamente definido.

Adaptación de Líneas Celulares al Cultivo en Suspensión en Medio Químicamente Definido

Las 16 líneas celulares se adaptaron al cultivo en suspensión en un medio químicamente definido de la siguiente manera: las líneas celulares seleccionadas en cultivo adherente se adaptaron primero a la suspensión tanto en medio de crecimiento en suspensión CHO (DMEM con alto contenido de glucosa, que incluye L-glutamina y piruvato de sodio, FCS al 5 % dializado, 20 mg/L de L-prolina, 1 x penicilina/estreptomicina, pluronic F68 al 1 %) y luego en medio de crecimiento en suspensión químicamente definido (CD Opti-CHO® de Life Technologies Ltd. (Paisley, Reino Unido), FCS al 2,5 % dializado, 0,1 x penicilina/estreptomicina, Glutamax® 8 mM).

Una vez adaptadas al cultivo en suspensión, las líneas celulares se destetaron, en etapas, en un medio de crecimiento en suspensión definido químicamente sin suero (CD Opti-CHO®, 0,1 x penicilina/estreptomicina, Glutamax® 8 mM). Se omitió MTX en todos los cultivos en suspensión. Se expandieron las líneas adaptadas y se prepararon bancos de células de semillas. Brevemente, las células se expandieron hasta un volumen total de 300 mL y se recogieron cuando la densidad celular superó 0,85 x 106 células/mL y la viabilidad fue > 90 %. Se sembraron otras 3 x 107 células en un matraz nuevo que contenía 70 mL de medio de crecimiento en suspensión para el análisis de crecimiento y productividad. Las células restantes se recogieron mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen apropiado de medio de congelación para producir una suspensión celular a razón de 1 x 107 células/mL. Los viales se congelaron hasta -80 °C. Luego, el banco de células se transfirió a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Las 16 líneas celulares se refinaron adicionalmente hasta 5 clones después de una adaptación sin suero. Se evaluó el crecimiento de los 5 clones (densidad celular y tiempo de duplicación celular) y la productividad (pg/célula/día), después de lo cual se seleccionaron 3 clones. Se seleccionó un clon para crear un banco de células maestro.

Se llevó a cabo la preparación del banco de células maestro (MCB) y del banco de células de trabajo (WCB). Se utilizó un vial del material previo a la semilla para la preparación de un MCB de 200 viales y un vial de MCB se utilizó para preparar un WCB de 200 viales. En cada caso, se descongeló un vial y se eliminó el medio de criopreservación mediante centrifugación. Las células se resuspendieron y se propagaron en volumen en medio de crecimiento (CD OptiCHO® / L-glutamina 4 mM). Se realizaron cuatro pasajes durante la creación de MCB y seis pasajes durante la creación de WCB.

Cuando se obtuvieron suficientes células, las células se dividieron en partes alícuotas en medio de criopreservación (92,5 % de CD OptiCHO® / 7,5 % de DMSO) en viales de polipropileno (conteniendo cada uno aproximadamente 1.5 x 107 células viables) y se criopreservaron reduciendo la temperatura a -100 °C durante un período de al menos 60 minutos en un proceso de congelación gradual. Los viales se almacenan en un contenedor de llenado automático de nitrógeno líquido en fase de vapor en una zona controlada por GMP.

Descripción del Procedimiento de Fabricación de la Sustancia Farmacológica (SF)

A continuación sigue una breve descripción del procedimiento de fabricación de la SF Péptido 1. Las células de un vial de WCB se reviven y se expanden progresivamente utilizando un medio libre de proteínas antes de la inoculación en un biorreactor de producción. Una vez completado el cultivo celular, las células y los restos celulares se eliminan mediante filtración del cultivo.

La purificación consiste en tres etapas de columna de cromatografía (MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q), una etapa de concentración y diafiltración e incluye dos etapas específicas de reducción/inactivación viral; tratamiento con Triton X-100 (inactivación de virus con envoltura) y una etapa de nanofiltración (eliminación de virus con envoltura y sin envoltura).

Después de la concentración y diafiltración, se añaden los excipientes para la formulación de la SF. El Péptido 1 formulado se filtra a 0,22 pm en recipientes.

La columna Sartobind Phenyl, utilizada en el lote de 10.000 L en lugar de la columna Capto Q, es eficaz para reducir la presencia de oligómeros. Esta columna fue capaz de reducir el nivel de formas oligoméricas de un promedio de 2,7 % a 1 %.

Métodos Analíticos

El análisis de la estructura de los glicanos se llevó a cabo en Procognia Limited (Ashdod, Israel). Se liberaron N-glicanos de la muestra usando PNGasa F y luego se marcaron con 2-aminobenzamida. Los glicanos liberados se trataron con o sin una serie de exoglicosidasas con el fin de generar diferentes formas de glicanos. Los glicanos se separaron mediante análisis de HPLC bidimensional (NP-HPLC y WAX) y se identificaron mediante comparación con una base de datos de tiempo de retención que se construyó utilizando patrones preparados internamente, separados y analizados mediante el mismo análisis de HPLC bidimensional.

Contenido de Ácido Siálico

Se utilizó cromatografía líquida de ultra alta presión (UPLC) para determinar el contenido de ácido siálico y confirmar la identidad del péptido. El método se realizó utilizando una columna Acquity UPLC BEH C18 de 1,7 pm 2,1 x 50 y la siguiente fase móvil: 9:7:84/acetonitrilo: metanol: agua, con un caudal de 0,3 mL/min. Los ácidos siálicos se liberaron de la muestra de ensayo mediante escisión enzimática con sialidasa y luego se derivatizaron con un marcador fluorescente (dihidrocloruro de 1,2 diamino 4,5 metilendioxibenceno (DMB)). La muestra de ensayo marcada se separó mediante UPLC con elución isocrática y detección de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 373 nm y una longitud de onda de emisión de 448 nm. El contenido de ácido siálico en las muestras de ensayo se cuantificó en relación con los patrones de ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) y ácido N- acetilneuramínico (NANA), ejecutados como una curva patrón. El contenido de ácido siálico NGNA y NANA se reseña como pmol de ácido siálico / pmol de proteína.

Patrón de Sialilación

Intercambio aniónico débil (WAX) - se utilizó HPLC para determinar el % de glicanos neutros, mono-, di-, tri- y tetrasialilados. El método implica la liberación enzimática de los N-glicanos del fármaco con PNGasa, marcaje fluorescente con 2-aminobenzamida (2-AB) y desalación utilizando cartuchos Ludger D1. La separación de glicanos sialilados se realizó mediante WAX-HPLC, utilizando una columna Glyco Sep C con un gradiente de acetonitrilo al 20 %/formiato de amonio 0,5 M a 40 °C. La detección de fluorescencia se configuró en una excitación de 330 nm y una emisión de 420 nm. Paralelamente se realizaron ensayos de un patrón de referencia. El % de glicanos neutros, mono-, di-, tri- y tetra-sialilados se determinó a partir del cromatograma WAX-HPLC y se reseñó.

Pureza, SEC

Se utilizó HPLC de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) para determinar la pureza del fármaco separando los dímeros activos intactos del SGF y las formas oligoméricas (compuestas principalmente por dímeros de dímeros activos). La molécula de dímero activo intacta consiste en las dos subunidades de proteína glicosilada idénticas (el dominio extracelular gp130 condensado a la parte Fc de la cadena pesada de IgG1 humana). Las muestras se separaron en base al peso molecular utilizando una columna de permeación en gel (TSK G3000<swxl>) con un caudal de 1 mL/min y una fase móvil de fosfato de sodio 0,2 M, pH 7,0. El material eluido de la columna se controló a 280 nm. La especie intacta se identifica por su característico tiempo de retención; el%de pureza del dímero activo se expresa como porcentaje del área total del pico integrado.

Formas Oligoméricas

El porcentaje de formas oligoméricas se determina utilizando el método SEC arriba presentado. El porcentaje de formas oligoméricas se expresa como un porcentaje del área total del pico integrado.

Forma única gp130 (SGF)

El porcentaje de SGF se determinó utilizando el método SEC arriba presentado. El porcentaje de SGF se expresa como un porcentaje del área total del pico integrado.

Los resultados de los análisis se proporcionan en la Tabla 3.

��Descripción y Composición del Producto Farmacológico (PF)

El PF es una solución estéril que se ha de administrar mediante infusión i.v. El PF consiste en el Péptido 1 a una concentración de 15 mg/mL en una solución isotónica que contiene L-histidina 25 mM, sacarosa 200 mM y 0,1 mg de polisorbato 20/mL a pH 7,6. Los viales están recubiertos de nitrógeno para protegerlos contra la oxidación. El producto está destinado a un solo uso y almacenamiento a -20 °C hasta su descongelación para su administración clínica.

Composición y Fórmula de Lote

La fórmula del lote para el producto farmacológico se presenta en la Tabla 4.

Tabla 4

Ejemplo 2

Ensayo Clínico 000067 (Dosis Única)

Diseño

Este fue un ensayo de dosis única, controlado con placebo, simple ciego, aleatorizado dentro de la dosis, de grupo paralelo y de aumento de dosis. El ensayo se realizó en dos partes, en donde la Parte 1 incluía sujetos sanos y la Parte 2 incluía pacientes con CD en remisión clínica. El objetivo era examinar la seguridad y tolerabilidad y, si era posible, obtener signos de efectos farmacológicos, después de dosis únicas de Péptido 1.

En la Parte 1, se incluyeron 64 sujetos, de los cuales 48 (44 hombres, 4 mujeres) recibieron tratamiento activo y 16 (todos hombres) recibieron placebo. Se investigaron y administraron siete dosis como infusión i.v. A lo largo de 30 minutos (0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg) o 1 hora (150 mg, 300 mg, 600 mg y 750 mg). Además, 6 sujetos recibieron una dosis s.c. de 60 mg de Péptido 1 y 2 sujetos recibieron una dosis s.c. de placebo. Péptido 1 se administró a razón de 15 mg/mL en histidina 25 mM, sacarosa 200 mM y 0,1 mg/mL de polisorbato 20.

En la Parte 2, se incluyeron 24 pacientes, de los cuales 18 (11 hombres, 7 mujeres) recibieron tratamiento activo (75 mg, 300 mg y 750 mg) y 6 (4 hombres, 2 mujeres) recibieron placebo, todos administrados por i.v.

Resultados

La evaluación PK (siglas inglesas de farmacocinética) después de administraciones i.v. de Péptido 1 mostró proporcionalidad de dosis tanto para el AUC como para la Cmax en el intervalo de 0,75 mg a 750 mg, oscilando las concentraciones de Cmax en plasma de 0,2 a 170 pg/mL (FIG. 3). El aclaramiento fue de aprox. 0,13 L/h, la semivida terminal media de aprox. 4,5 días y el volumen de distribución de aprox. 20 L, indicando este último una cierta distribución extravascular. La administración s.c. de 60 mg de Péptido 1 mostró una Cmax de 1,1 pg/mL a los 2,3 días y una semivida de 5,0 días. Se calculó que la biodisponibilidad después de la administración s.c. de Péptido 1 era de aprox. 50 %.

La administración i.v. de 75, 300 y 750 mg a pacientes con CD en remisión mostró resultados muy similares a los de los sujetos sanos (FIG. 4). El AUC y la Cmax fueron proporcionales a la dosis con concentraciones de Cmax de 16, 76 y 186 pg/mL (16, 77 y 161 pg/mL para sujetos sanos). El aclaramiento fue de aprox. 0,13 L/h, la semivida terminal media de aprox. 4,6 días y el volumen de distribución de aprox. 22 L.

El perfil de seguridad de Péptido 1 fue favorable y se produjeron pocos eventos adversos en todos los grupos de tratamiento, incluyendo el grupo de placebo, siendo todos leves o moderados. No se observaron tendencias aparentes relacionadas con la dosis en la incidencia o frecuencia de eventos adversos. Las infusiones se suspendieron en dos sujetos, uno debido a reacciones leves (Parte 1, grupo de 300 mg) y otro debido a reacciones moderadas (Parte 2, grupo de 75 mg).

No hubo tendencias aparentes relacionadas con la dosis ni cambios relacionados con el tratamiento en los signos vitales, el ECG o los parámetros de química clínica.

Un sujeto sano en el grupo de 300 mg mostró anticuerpos anti-Péptido 1 no neutralizantes emergentes del tratamiento en la visita de seguimiento 5-6 semanas después de la administración.

En general, Péptido fue seguro y bien tolerado cuando se administró por vía intravenosa hasta 750 mg como dosis única i.v. y 60 mg como dosis única s.c.

Ejemplo 3

Ensayo Clínico 000115 (Dosis Múltiple Ascendente)

Diseño

Este fue un ensayo controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado dentro de un grupo de dosis y de grupos paralelos con el objetivo de investigar la seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de múltiples dosis ascendentes de Péptido 1. Las dosis investigadas fueron 75, 300 y 600 mg de Péptido 1 administrado una vez a la semana, durante 4 semanas, mediante infusión i.v. a lo largo de 30 minutos (75 mg) o 1 hora (300 mg y 600 mg).

Se incluyeron veinticuatro (24) sujetos sanos, de los cuales 18 (11 hombres y 7 mujeres) recibieron tratamiento activo y 6 (2 hombres y 4 mujeres) recibieron placebo.

Resultados

La evaluación PK mostró características muy cercanas en el primer y último día de tratamiento, y similares a los resultados del estudio de dosis única. El AUC y la Cmax fueron proporcionales a la dosis después de la primera y cuarta dosis con concentraciones de Cmax de 19, 78 y 148 pg/mL después de la primera dosis, y de 19, 79 y 142 □g/mL después de la cuarta dosis (16, 77 y 161 Dg/mL para dosis únicas en sujetos sanos; FIG. 5). Los valores mínimos correspondientes fueron 0,66, 2,68, 4,56 pg/mL y 0,98, 3,95 y 7,67 pg/mL para los tres niveles de dosis. La semivida terminal media calculada después de la última dosis fue de aprox. 5,5 días.

El perfil de seguridad de Péptido 1 fue favorable y se produjeron pocos eventos adversos en todos los grupos de tratamiento, incluyendo el grupo de placebo, siendo todos leves o moderados. No se observaron tendencias aparentes relacionadas con la dosis en la incidencia o frecuencia de eventos adversos. Un sujeto (grupo de 600 mg) fue retirado debido a reacciones leves a la infusión.

No hubo tendencias aparentes relacionadas con la dosis ni cambios relacionados con el tratamiento en los signos vitales, el ECG o los parámetros de química clínica.

No se detectaron anticuerpos anti-Péptido 1 en ninguno de los sujetos.

En general, Péptido 1 fue seguro y bien tolerado cuando se administró i.v. hasta 600 mg una vez por semana durante 4 semanas.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros gp130-Fc que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en donde los monómeros comprenden los aminoácidos en las posiciones 585-595 de SEQ ID NO: 1, una región bisagra del dominio Fc que comprende los aminoácidos en las posiciones 609-612 de SEQ ID NO:1, y los monómeros no comprenden un enlazador entre la porción gp130 y el dominio Fc, preferiblemente en donde los monómeros están enlazados por uno o más puentes disulfuro, en donde el dímero polipeptídico no comprende no más del 6 % de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido, preferentemente no más de 3 % en moles, más preferentemente no más de 1 % en moles, incluso más preferentemente no más de 0,5 % en moles de galactosa-alfa-1,3-galactosa,

en donde el dímero polipeptídico se puede obtener expresando un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 en células de ovario de hámster chino (CHO), seleccionando una línea celular que produce dicho dímero polipeptídico, cultivando la línea celular en medios de cultivo y recogiendo dichos dímeros polipeptídicos de dichas células y/o medios de cultivo celular, preferiblemente en donde dichos dímeros están purificados y/o concentrados.

2. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1, en donde el dímero polipeptídico comprende glicanos, en donde una media de al menos el 52 %, preferiblemente al menos el 54 % de los glicanos incluye uno o más residuos de ácido siálico, más preferiblemente 52-65 %.

3. El dímero polipeptídico de la reivindicación 1 o 2, en donde los monómeros tienen SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

4. Una composición que comprende el dímero polipeptídico de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:

a. no más del 5 % del dímero polipeptídico está presente como un agregado oligomérico,

b. la composición comprende no más del 4,0 % en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido de SEQ ID NO: 1 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente en donde no más del 3 %, más preferiblemente en donde no más del 1,5 %, lo más preferiblemente en donde no más del 1,0 % del polipéptido está presente como un oligómero o

c. ambos.

5. Una composición que comprende el dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composición de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la composición comprende, además, un tensioactivo.

6. La composición de la reivindicación 5, en donde el tensioactivo es un tensioactivo no iónico, preferentemente en donde el tensioactivo es un tensioactivo de polisorbato, más preferentemente en donde el tensioactivo es polisorbato 20.

7. Una composición que comprende el dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde la composición comprende, además, un agente tampón y un azúcar, preferentemente en donde el agente tampón es histidina, preferentemente en donde el azúcar es sacarosa.

8. El dímero polipeptídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-7 para uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o una afección mediada por IL-6 en un ser humano.

9. El dímero polipeptídico o la composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es enfermedad inflamatoria intestinal, preferiblemente en donde el tratamiento induce la remisión de la enfermedad inflamatoria intestinal.

10. El dímero polipeptídico o la composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, preferiblemente en donde el tratamiento mantiene la remisión de la enfermedad inflamatoria intestinal.

11. El dímero polipeptídico o la composición para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es artritis reumatoide, psoriasis, uveítis o aterosclerosis; o en donde la enfermedad inflamatoria o afección mediada por IL-6 es colitis no asociada con enfermedad inflamatoria intestinal, preferiblemente en donde la colitis es colitis por radiación, colitis diverticular, colitis isquémica, colitis infecciosa, enfermedad celíaca, colitis autoinmune o colitis resultante de alergias que afectan el colon.

12. El dímero polipeptídico o la composición para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde el dímero polipeptídico o la composición se administra por vía parenteral, preferiblemente por vía intravenosa o subcutánea.

13. Un método para producir un dímero polipeptídico que comprende dos monómeros gp130-Fc que tienen al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en donde los monómeros comprenden los aminoácidos en las posiciones 585-595 de SEQ ID NO: 1, una región bisagra del dominio Fc que comprende los aminoácidos en las posiciones 609-612 de SEQ ID NO:1, y los monómeros no comprenden un enlazador entre la porción gp130 y el dominio Fc, preferiblemente en donde los monómeros están enlazados por uno o más puentes disulfuro, comprendiendo dicho método:

- expresar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 en células de ovario de hámster chino (CHO),

- seleccionar una línea celular que produzca dicho dímero polipeptídico, en donde el dímero polipeptídico comprende no más del 6 % de galactosa-alfa-1,3-galactosa por mol de polipéptido, preferiblemente no más del 3 % en moles, más preferiblemente no más de 1 % en moles, incluso más preferentemente no más de 0,5 % en moles de galactosa-alfa-1,3-galactosa,

- cultivar las células de la línea celular en medios de cultivo, y

- recoger dichos dímeros polipeptídicos de dichas células y/o medios de cultivo celular, preferiblemente en donde dichos dímeros están purificados y/o concentrados.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el dímero polipeptídico comprende glicanos, en donde una media de al menos el 52 %, preferiblemente al menos el 54 % de los glicanos incluye uno o más residuos de ácido siálico, más preferiblemente 52-65 %.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en el que los monómeros tienen la SEQ ID NO: 1.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que:

a. no más del 5 % de los dímeros polipeptídicos está presente como un agregado oligomérico,

b. está presente no más del 4,0 % en peso de polipéptidos que son una variación truncada del polipéptido de SEQ ID NO: 1 con respecto a polipéptidos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente en donde no más del 3 %, más preferiblemente en donde no más del 1,5 %, lo más preferiblemente en donde no más del 1,0 % del polipéptido está presente como un oligómero o

c. ambos.