ES2981611T3

ES2981611T3 - Métodos para tratar la artritis reumatoide mediante el uso de la edición del genoma guiada por ARN del gen de HLA

Info

Publication number: ES2981611T3
Application number: ES18791113T
Authority: ES
Inventors: Brian Freed; Kirsten Anderson; Christina Roark; Jennifer Matsuda
Original assignee: National Jewish Health; University of Colorado System; University of Colorado Denver
Current assignee: National Jewish Health; University of Colorado System; University of Colorado Denver
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2024-10-09
Anticipated expiration: 2038-04-25
Also published as: HRP20240806T1; WO2018200635A1; AU2018258061B2; AU2025200803A1; JP2024075603A; US20240327862A1; CA3061614A1; EP3615674A1; JP7457302B2; JP2020517289A; EP3615674A4; US11932867B2; FI3615674T3; DK3615674T3; SI3615674T1; LT3615674T; EP4400175A2; EP4400175A3; HUE069314T2; AU2018258061A1

Abstract

Métodos para prevenir o tratar la artritis reumatoide (AR) en un sujeto mediante la introducción de la mutación DRB1*04:01K71E que es resistente a la AR. El alelo resistente se introduce en el sujeto que padece o está en riesgo de desarrollar AR, utilizando un vector HLA CRISPR/Cas9 que se dirige al codón 71 en el alelo HLA DRB1*04:01, introduciendo una única mutación puntual de A a G en el codón 71 mediante reparación dirigida por homología para alterar la lisina en la posición 71 de la proteína expresada a ácido glutámico. Este alelo modificado se ve afectado en las células madre hematopoyéticas del sujeto, que luego se expanden y se trasplantan nuevamente al paciente. Esta terapia microgénica confiere resistencia a la AR a través de un trasplante autólogo. La invención incluye ácidos nucleicos aislados, vectores, virus recombinantes, células y composiciones farmacéuticas para modificar el alelo HLA DRB1*04:01. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para tratar la artritis reumatoide mediante el uso de la edición del genoma guiada por ARN del gen de HLA

Antecedentes

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad crónica caracterizada por la destrucción autoinmunitaria de las articulaciones y los tejidos circundantes. La susceptibilidad a la enfermedad tiene varios componentes genéticos, pero el locus HLA-DRB1 es claramente el más significativo (Barton A, Worthington J. Genetic susceptibility to rheumatoid arthritis: an emerging picture. Arthritis Rheum 2009;61:1441-46). Varios alelos DR4, en particular DRB1*04:01, *04:04 y *04:05, están fuertemente asociados con la RA, mientras que DRB1*04:02 no lo está (los alelos están designados por la nomenclatura recientemente aceptada por la Organización Mundial de la Salud). [hla.alleles.org], de manera que la familia y los alelos están separados por dos puntos, por lo tanto, DRB1*04:01 corresponde a DRB1*0401 en la literatura anterior). Además, DRB1*01:01, *01:02, *10:01 y *14:02 a veces se han asociado con la RA, particularmente en personas no europeas. Se ha planteado la hipótesis de que estos alelos dispares contribuyen a la RA mediante la presencia de un "epítopo compartido", un conjunto común de aminoácidos en las posiciones 70-74 del surco de unión del péptido. La unión de péptidos a las moléculas HLA-DRB1 está controlada por 6 bolsas, cada una con múltiples aminoácidos polimórficos que crean millones de epítopos potenciales de unión a péptidos. Los alelos HLA aparentemente dispares (por ejemplo, DRB1*04:01 y *16:02) pueden compartir un epítopo que los alelos estrechamente relacionados (por ejemplo, DRB1*04:01 y *04:02) no lo comparten. El concepto de un epítopo compartido en la susceptibilidad a la RA ahora es ampliamente aceptado, aunque la naturaleza exacta del epítopo y su papel en la enfermedad ha sido objeto de considerable debate (Zanelli E, Breedveld FC, de Vries RR. HLA class II association with rheumatoid arthritis: facts and interpretations. Hum Inmunol. 2000;61:1254-61; Weyand CM, Goronzy JJ. Association of MHC and rheumatoid arthritis: HLA polymorphisms in phenotypic variants of rheumatoid arthritis. Arthritis Res 2000;2:212-16). Se ha informado que la presencia de ácido aspártico solo en la posición 70 (D70) tiene un efecto protector (Mattey Dl , Dawes PT, Gonzales-Gay MA, García-Porrua C, Thomson W, Hajeer AH, y otros, HLA-DRB1 alleles encoding an aspartic residue at position 70 protect against development of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2001 ;28:232-39), y las posiciones fuera de los residuos 70-74 también se han implicado en la enfermedad (Debaz H, Olivo A, Vásquez García MN, de la Rosa G, Hernández A, Lina L, y otros, Relevant residues or DR1 third hypervariable region contributing to the expression and to severity of rheumatoid arthritis (RA) in Mexicans. Hum Immunol 1998;59:287-94;De Vries N, Tijssen H, van Riel PL, van de Putte LB. Reshaping the shared epitope hypothesis: HLA-associated risk for rheumatoid arthritis is encoded by amino acid substitutions at positions 67-74 of the HLA-DRB1 molecule. Artritis Reum 2002;46:921-28). Sin embargo, se sabe muy poco acerca de cómo estos epítopos se unen a los autoantígenos citrulinados que están asociados con la RA en la mayoría de los pacientes.

Los presentes inventores han demostrado que relativamente pocos aminoácidos en DRB1*04:01 están asociados con la artritis reumatoide en humanos (Freed y otros, Arthritis Rheum 2011;63(12):3733-39), y que uno de estos (posición 71) puede alterar la unión del péptido para hacer que un alelo susceptible funcione como uno resistente. (Anderson KM, Roark CL, Portas M, Aubrey Mt , Rosloniec EF, Freed BM. A Molecular Analysis of the Shared Epitope Hypothesis: Binding of Arthritogenic Peptides to DRB1*04 Alleles. Arthritis Rheumatology 68:1627-36, 2016; Roark CL, Anderson KM, Aubrey MT, Rosloniec EF, Freed BM. Arthritogenic peptide binding to DRp1*01 alleles correlates with susceptibility to rheumatoid arthritis. J Autoimmunity 72:25, 2016).

La aprobación en Europa de la primera terapia génica obtenida por uniQuire BV para tiparvovec alipógeno (nombre comercial GLYBERA™) para tratar la deficiencia de la lipoproteína lipasa (LPL) fue un hito en la búsqueda de llevar la terapia basada en genes al uso clínico. Tiparvovec (AAV1-LPL(S447X)) incorpora una variante del gen LPL humano intacto, es decir, LPL(Ser447X), en un vector de virus adenoasociado (AAV), que se suministra por vía intramuscular (Gaudet D, Méthot J, Déry S, y otros, Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1 LPL(S447X)) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Ther. 21 de junio de 2012).

El uso de células autólogas modificadas genéticamente con elementos virales o nucleasas capaces de edición genómica puede permitir una mayor seguridad que el suministro intravenoso de virus dirigidos. Los protocolos ex vivo permiten la detección de los genomas de células manipuladas para evaluar la frecuencia de las inserciones virales, roturas de bicatenarias en el ADN (DSB) u otros eventos potencialmente mutagénicos (Li H, Haurigot V, Doyon Y, y otros, In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature. 475(7355):217-21,2011). Los niveles relevantes terapéuticamente de células madre modificadas genéticamente necesarios para lograr resultados clínicos pueden lograrse más fácilmente mediante la expansión de grandes poblaciones de células ex vivo y su introducción nuevamente en el paciente.

Los sistemas CRISPR bacterianos y arqueales se basan en ARNcr en complejo con proteínas Cas para dirigir la degradación o modificación de secuencias complementarias presentes dentro del ADN plasmídico y viral invasor. La reconstitución in vitro del sistema CRISPR tipo II de S. pyogenes se basa en ARNcr fusionado a un ARNtracr normalmente codificado en trans, que es suficiente para dirigir la proteína Cas9 para que escinda de manera específica secuencias de ADN diana que coincidan con el ARNcr.

La naturaleza inflamatoria crónica de la RA puede causar daño a una amplia variedad de sistemas corporales, que incluye las articulaciones, huesos, piel, ojos, pulmones, corazón y vasos sanguíneos. Si bien los nuevos tipos de medicamentos han mejorado drásticamente las opciones de tratamiento, la artritis reumatoide grave aún puede causar discapacidades físicas. Por tanto, existe una necesidad crítica de identificar formas de evitar el desarrollo de RA y disminuir la respuesta inflamatoria de esta enfermedad autoinmunitaria incurable.

Resumen

Los presentes inventores han descubierto que un único residuo de aminoácido en la posición 71 en el alelo HLA DRB1*04:01 explica la diferencia en la unión del péptido entre el alelo DRB1*04:01 (el gen asociado con la susceptibilidad a la artritis reumatoide) y el alelo DRB1*04:02 (el gen que confiere resistencia a la artritis reumatoide). La invención incluye métodos para tratar a un sujeto humano con artritis reumatoide (RA) al dirigirse selectivamente y reemplazar una porción de la secuencia del gen genómico DRB1*04:01 del sujeto que contiene una lisina en la posición 71 en el gen con una secuencia de reemplazo que contiene ácido glutámico en esta posición. El gen DRB1 modificado resultante, tras su expresión, confiere resistencia a la RA en el sujeto, en comparación con el tipo salvaje (gen DRB1 no modificado que codifica una lisina en la posición 71).

Por lo tanto, esta descripción proporciona métodos para modificar una célula eucariota con un sistema de tres componentes que incluye ARN guía complementario al ADN genómico, y una enzima que interactúa con el ARN, y un ácido nucleico molde que contiene al menos una porción del ADN genómico. El ARN guía y la enzima son expresados por la célula. El ARN guía del complejo ARN/enzima se une al ADN genómico complementario y escinde el ADN genómico. La enzima escinde secuencias genómicas dirigidas por las secuencias de a Rn guía. Una porción del ácido nucleico molde se sustituye en el ADN genómico, de esta manera se crea una célula eucariota con genoma alterado. La alteración genómica puede ser una inserción, una eliminación o una sustitución de una secuencia de nucleótidos, que incluye, preferentemente, una sustitución de un único nucleótido en el ADN genómico dirigido. Las secuencias genómicas dirigidas por las secuencias de ARN guía pueden ser secuencias de ADN genómico del antígeno leucocitario humano (HLA). Las secuencias del gen HLA pueden ser un alelo del gen HLA-DRB1 que codifica el antígeno de histocompatibilidad HLA de clase II, la proteína de cadena beta DRB1.

Estos métodos pueden incluir transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que codifica un ARN guía complementario al ADN genómico de la célula eucariota, y transfectar la célula eucariota con un ácido nucleico que codifica una enzima que interactúa con el ARN guía y escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio, y transfectar la célula con el ácido nucleico molde, de manera que la célula exprese el ARN guía y la enzima, el ARN guía se une al ADN genómico complementario, la enzima escinde el ADN genómico de una manera específica del sitio y al menos una porción del molde de ácido nucleico se sustituye en el ADN genómico dirigido para crear una célula eucariota con genoma alterado. Estos métodos pueden incluir alterar genéticamente la célula eucariota mediante la introducción del ácido nucleico que codifica el ARN guía complementario al ADN genómico en el genoma de la célula. Alternativa o adicionalmente, estos métodos pueden incluir alterar genéticamente la célula eucariota mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica una enzima que escinde el ADN genómico en el genoma de la célula. Alternativa o adicionalmente, estos métodos pueden incluir alterar genéticamente la célula eucariota mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica el ADN molde en la célula. Uno cualquiera, o cualquier combinación, de las moléculas de ácido nucleico que codifican el ARN guía complementario al ADN genómico, la enzima que escinde el ADN genómico y/o el ADN molde pueden transfectarse en la célula. De manera similar, una cualquiera, o cualquier combinación, de las moléculas de ácido nucleico que codifican el ARN guía complementario al ADN genómico, la enzima que escinde el ADN genómico y/o el ADN molde pueden insertarse en el genoma de la célula.

En estos métodos, el ARN complementario al ADN genómico puede incluir de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 250 nucleótidos, o de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. En estos métodos, la enzima puede realizar una función deseada, tal como la escisión del ADN genómico y/o la sustitución de una porción del ácido nucleico molde en el ADN genómico dirigido, de una manera específica del sitio cuando el ARN guía se hibrida con el ADN genómico complementario. En estos métodos, el ARN guía y la enzima son preferentemente componentes de un sistema CRISPR bacteriano de tipo II. En estos métodos, la enzima es preferentemente una Cas9, o Cas9 modificada, o un homólogo de la enzima Cas9. En estos métodos, la célula eucariota puede ser una célula de levadura, una célula vegetal o una célula de mamífero. La célula eucariota es preferentemente una célula humana. La célula humana puede ser una célula sanguínea primaria o una población de células sanguíneas. La célula humana puede ser una célula madre/progenitora hematopoyética (HSC). En estos métodos, la célula eucariota puede seleccionarse de una célula sanguínea circulante, una célula sanguínea movilizada, una célula de médula ósea, una célula progenitora mieloide, una célula progenitora multipotente y una célula progenitora de linaje restringido.

En estos métodos, la molécula de ARN guía puede comprender un dominio de direccionamiento que es complementario a un dominio diana en un locus HLA DRB1*04:01. El ARN guía puede comprender un ácido ribonucleico que contiene al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en pseudouridina, 5-metilcitodina, 2-tiouridina, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5,6-dihidrouridina-5'-trifosfato y 5-azauridina-5'-trifosfato. El ARN guía puede comprender la secuencia de nucleótidos GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1). La secuencia de ARN guía puede ser una fusión de ARNtracr-ARNcr, en cuyo caso, el ARNcr puede comprender la secuencia de nucleótidos GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1).

En estos métodos, el ácido nucleico molde puede comprender una secuencia de nucleótidos complementaria al alelo HLA-DRB1. El ácido nucleico molde puede comprender una secuencia de nucleótidos del alelo HLA-DRB1*04:01 que comprende una mutación puntual de A a G en el codón 71. El ácido nucleico molde sustituido en el locus HLA-DRB1 puede codificar al ácido glutámico en la posición 71 del alelo DRB1*04:01. El ácido nucleico molde puede ser una secuencia de nucleótidos que comienza con G e inmediatamente precede a un motivo NGG reconocido por la enzima Cas. El ácido nucleico molde puede ser un oligodesoxinucleótido monocatenario (ODNmc). El ODNmc puede comprender una modificación de fosforotioato 5' y/o una modificación de fosforotioato 3', y/o tanto una modificación de fosforotioato 5' como una modificación de fosforotioato 3'.

En estos métodos, la molécula de ARN guía y el polipéptido Cas9 pueden introducirse en la célula como un complejo de ribonucleótido formado previamente. Alternativa o adicionalmente, la molécula Cas9 puede introducirse en la célula como un ácido nucleico que codifica una proteína Cas9. Alternativa o adicionalmente, el ARN guía puede introducirse en la célula como un ácido nucleico que codifica el ARN guía, y la proteína Cas9 puede introducirse en la célula como un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9, y la célula expresa el ARN guía y la proteína Cas9. En estos métodos, el ARN guía, la proteína Cas9 y el ácido nucleico molde pueden introducirse en la célula dentro de un virus adenoasociado (AAV) o un lentivirus de integración deficiente (ILDV).

Estos métodos pueden incluir expandir la célula ex vivo después de las etapas de introducción para formar una población aislada de células que comprende el alelo HLA-DRB1, o una porción de este, codificado por el ácido nucleico molde, sustituido en el ADN genómico dirigido. Estos métodos pueden incluir además la administración de la población de células a un sujeto como un autotrasplante de médula ósea.

Esta descripción también proporciona una célula sanguínea de mamífero aislada que comprende una o más modificaciones genómicas en un gen HLA. La modificación genómica puede ser una inserción, una eliminación o una sustitución de una secuencia de nucleótidos, que incluye, preferentemente, una sustitución de un único nucleótido en el ADN genómico dirigido. La modificación genómica puede estar en las secuencias de ADN genómico del antígeno leucocitario humano (HLA). La secuencia del gen HLA modificado puede ser un alelo del gen HLA-DRB1. La modificación genética puede comprender una secuencia de nucleótidos del alelo HLA-DRB1 que comprende una mutación puntual de A a T en el codón 71. La modificación genética puede comprender una secuencia de ADN que codifica un ácido glutámico en la posición 71 del locus DRB1*04:01.

La célula sanguínea de mamífero aislada modificada genéticamente puede ser una célula sanguínea primaria, o es una población de células sanguíneas, o una célula madre/progenitora hematopoyética (HSC), o una célula sanguínea seleccionada del grupo que consiste en una célula sanguínea circulante. célula, una célula sanguínea movilizada, una célula de médula ósea, una célula progenitora mieloide, una célula progenitora multipotente y una célula progenitora de linaje restringido. Estas células sanguíneas de mamíferos aisladas modificadas genéticamente pueden producirse mediante los métodos de modificación de una célula eucariota con un sistema de tres componentes, descritos anteriormente.

Esta descripción también proporciona composiciones que comprenden estas células sanguíneas de mamífero aisladas, modificadas genéticamente. Estas composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas útiles en métodos para tratar o evitar la artritis reumatoide en un sujeto mediante la administración de células sanguíneas de mamífero aisladas, modificadas genéticamente, o las composiciones que las contienen, a un sujeto que necesita dicho tratamiento.

Esta descripción también proporciona una única nucleasa Cas en un complejo con el ARN guía que comprende un ARN activador de CRISPR (ARNcr) que incluye un dominio protoseparador específico de HLA-DRB1. El ARNcr puede ser un ARN transactivador (ARNtracr) o puede comprender un ARN guía único (ARNgu) quimérico artificial que comprende el ARNcr unido al ARNtracr. El ARNcr puede comprender la secuencia de nucleótidos GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1). El ARNcr puede incluir un dominio protoseparador específico de HLA-DRB1 de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 20 nucleótidos. El ARNcr también puede estar unido a un dominio de unión a ARNtracr que comprende de aproximadamente 12 nucleótidos a aproximadamente 20 nucleótidos. El ARNcr puede comprender además al menos una modificación química seleccionada de un nucleótido modificado químicamente que tiene una modificación seleccionada de una modificación de ribosa, una modificación del grupo terminal y una modificación del enlace internucleotídico. El ARNcr puede comprender además un ácido ribonucleico que contiene al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en pseudouridina, 5-metilcitodina, 2-tiouridina, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5,6-dihidrouridina-5'-trifosfato y 5-azauridina-5'-trifo sfato.

Esta descripción también proporciona vectores que comprenden un polinucleótido que codifica la nucleasa Cas9 y un ARN guía que media la unión de la nucleasa Cas9 a un gen HLA-DRB1. En estos vectores, la secuencia de ARN guía puede codificar una fusión de ARNtracr-ARNcr. El vector puede ser un vector de adenovirus, o un vector lentiviral de integración deficiente (IDLV), o un vector espumoviral de integración deficiente (IDFV).

Esta descripción también proporciona métodos para tratar o evitar la artritis reumatoide en un sujeto que incluyen introducir en una célula del sujeto una secuencia de ARN guía que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana dentro de un locus HLA-DRB1, e introducir en la célula del sujeto una proteína Cas9, e introducir en la célula del sujeto un ácido nucleico molde que comprende al menos una porción de un alelo HLA-DRB1. En la célula del sujeto, la secuencia de ARN guía se une a la secuencia de ácido nucleico diana y la proteína Cas9 escinde la secuencia de ácido nucleico diana y una porción del alelo HLA-DRB1 se sustituye en el ácido nucleico diana. De esta manera, la célula del sujeto se modifica genéticamente mediante una inserción, una eliminación o una sustitución de una secuencia de nucleótidos, que incluye, preferentemente, una sustitución de un único nucleótido en el alelo genómico HLA-DRB1 dirigido. La modificación genética puede comprender una secuencia de nucleótidos del alelo HLA-DRB1 que comprende una mutación puntual de A a G en el codón 71. La modificación genética puede comprender una secuencia de ADN que codifica un ácido glutámico en la posición 71 del alelo DRB1*04:01.

En estos métodos de tratamiento o prevención de la artritis reumatoide en un sujeto, el ARN guía, la proteína Cas 9 y el ácido nucleico molde pueden introducirse en la célula mediante transducción viral. El ARN guía, la proteína Cas 9 y el ácido nucleico molde pueden introducirse ex vivo en una célula que se ha aislado del sujeto. Las células modificadas genéticamente en las que una porción del alelo HLA-DRB1 se sustituye en el ácido nucleico diana pueden administrarse al sujeto como un autotrasplante de médula ósea.

Esta descripción también proporciona métodos para fabricar un medicamento que comprende una célula modificada genéticamente de esta descripción para el tratamiento o prevención de la artritis reumatoide.

Esta descripción también proporciona métodos para usar una célula modificada genéticamente de esta descripción, o una composición que comprende esas células, para el tratamiento o la prevención de la artritis reumatoide.

Otras modalidades resultarán evidentes para el experto en la técnica tras la lectura de la presente descripción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un mapa de un plásmido lentiviral que codifica una secuencia guía DRB1*04:01 de esta descripción. La Figura 2 es un mapa de otro plásmido lentiviral que codifica una secuencia guía DRB1*04:01 de esta descripción.

Las Figuras 3A-3D muestran los resultados de la citometría de flujo de clasificación de las células que han perdido la expresión de HLA-DR en el análisis de eficiencia de la transfección in vitro mediante el uso de construcciones CRISPR de esta descripción. La Figura 3A muestra los resultados de la citometría de flujo para las células T2 que expresan DRB1*04:01 que no fueron transfectadas, y la Figura 3B muestra los resultados de la citometría de flujo para las células T2 que expresan DRB1*04:01 que fueron transfectadas mediante el uso de ARN codificado. La Figura 3C muestra los resultados de la citometría de flujo para las células T2 que expresan DRB1*04:01 que se transfectaron con el ARN guía 208/dir de esta descripción, y la Figura 3D muestra los resultados de la citometría de flujo para las células T2 que expresan DRB1*04:01 que se transfectaron con ARN guía 185/inv de esta descripción.

Descripción detallada

Esta descripción proporciona un método para tratar a un sujeto con artritis reumatoide (RA) al dirigir selectivamente y reemplazar una porción de la secuencia del gen HLA DRB1 del sujeto que contiene una lisina en el aminoácido 71 del alelo HLA DRB1*04:01 con un secuencia de reemplazo. El gen DRB1 modificado resultante, que contiene la secuencia de reemplazo, tras la expresión, confiere resistencia al desarrollo y progresión de la RA en el sujeto en comparación con un sujeto que tiene el alelo HLA DRB1*04:01. Preferentemente, la presencia del HLA DRB1*04:01 modificado es adecuada para obviar o reducir la necesidad de medicación u otros tratamientos de la RA en el sujeto, de manera similar a un sujeto que tiene el alelo HLA DRB1*04:02.

La descripción proporciona un método para tratar la RA en un sujeto mediante la introducción en una célula del sujeto uno o más ácidos nucleicos que codifican una nucleasa que se dirige a una porción del gen del antígeno leucocitario humano (HLA)-DRB1 que contiene un alelo asociado con RA, en donde la nucleasa crea una rotura bicatenaria en el gen DRB1; una molécula de ARN guía que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana dentro del locus HLA-DRB1; y un ácido nucleico molde aislado que comprende un ácido nucleico que comprende al menos una porción de un alelo HLA-DRB1, opcionalmente flanqueado por secuencias de ácido nucleico homólogas a las secuencias de ácido nucleico aguas arriba y aguas abajo de la rotura bicatenaria en el gen DRB1, y en donde el gen DRB1 modificado resultante, tras su expresión, confiere resistencia al desarrollo de la RA en el sujeto o una reducción de la progresión de la RA en el sujeto, comparable a un sujeto que expresa el alelo DRB1*04:02. El sujeto al que se administran la(s) célula(s) modificada(s) puede no tener anticuerpos que reconozcan el complejo mayor de histocompatibilidad humano, clase II, proteína DR4 o complejo proteico, como se detecta mediante ensayos ELISA o Bethesda.

Definiciones

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en forma monocatenaria o bicatenaria. Para los fines de la presente descripción, estos términos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como también nucleótidos que están modificados en los restos de base, azúcar y/o fosfato (por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato). Generalmente, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un análogo de A formará un par de bases con T.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de los aminoácidos naturales correspondientes. Tal como se ha usado en todas partes, por sujeto se entiende un individuo. Preferentemente, el sujeto es un mamífero, tal como un primate, y, con mayor preferencia un humano. Los primates no humanos también son sujetos. El término sujeto incluye animales domesticados, tales como gatos, perros, etcétera, ganado (por ejemplo, ganado vacuno, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etcétera) y animales de laboratorio (por ejemplo, hurón, chinchilla, ratón, conejo, rata, gerbo, cobaya, etcétera). Por tanto, en la presente descripción se contemplan usos veterinarios y formulaciones médicas.

El término "al menos una porción de un alelo HLA-DRB1" se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene menos del alelo DRB1 de longitud completa. La porción del nucleótido DRB1 puede incluir la secuencia que codifica el codón 71 del alelo DRB1*04:01. La porción puede estar centrada alrededor de la secuencia que codifica el codón 71 del alelo DRB1*04:01. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar o evitar un trastorno asociado con la expresión de una secuencia de polinucleótidos en un sujeto.

Como se describe con mayor detalle en la presente descripción, la presente invención proporciona composiciones para tratar o evitar la RA en un sujeto. Los términos "trata", "tratar", "tratamiento", etcétera, tal como se aplican a una célula, incluyen someter la célula a cualquier tipo de proceso o condición o realizar cualquier tipo de manipulación o procedimiento sobre la célula. Como se aplica a un sujeto, los términos se refieren a proporcionar a un individuo una célula en la que una secuencia de polinucleótidos diana se ha modificado ex vivo de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción. El sujeto habitualmente está enfermo o lesionado, o tiene un mayor riesgo de enfermarse con relación a un miembro promedio de la población y necesita dicha atención, cuidado o manejo. Por ejemplo, el sujeto puede sufrir RA o tener un mayor riesgo de desarrollar RA con relación a un miembro promedio de la población y necesitar dicha atención, cuidado o manejo.

Como se usa en la presente descripción, el término "tratar" y "tratamiento" se refiere a administrar a un sujeto una cantidad efectiva de células con secuencias de polinucleótidos diana modificadas ex vivo de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción de modo que el sujeto tenga una reducción en al menos un síntoma de la enfermedad o una mejora en la enfermedad (por ejemplo, RA), por ejemplo, resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los propósitos de esta invención los resultados clínicos deseados o beneficiosos incluyen, pero no se limitan a, alivio de uno o más síntomas, diminución de la extensión de la enfermedad, estado de la enfermedad estable (es decir, no empeora), retraso o disminución del progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), detectable o indetectable. Tratamiento puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Así, alguien con experiencia en la técnica se da cuenta de que un tratamiento puede mejorar el estado de la enfermedad, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad. Como se usa en la presente, el término "tratamiento" incluye profilaxis. Alternativamente, el tratamiento es "efectivo" si la progresión de una enfermedad se reduce o se detiene. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Entre quienes necesitan tratamiento se incluyen aquellos a los que ya se les ha diagnosticado un trastorno asociado con la expresión de una secuencia de polinucleótidos, así como también aquellos que probablemente desarrollen dicho trastorno debido a susceptibilidad genética u otros factores.

Por "tratamiento," "prevención" o "mejora" de una enfermedad o trastorno se entiende retrasar o evitar la aparición de dicha enfermedad o trastorno (por ejemplo, RA), revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión, agravamiento o deterioro de la progresión o gravedad de una afección asociada con dicha enfermedad o trastorno. En una modalidad, los síntomas de una enfermedad o trastorno se alivian en al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 % o al menos un 50 %.

Un método ilustrativo para tratar o evitar un trastorno asociado con la expresión de una secuencia de polinucleótidos en un sujeto comprende alterar una secuencia de polinucleótidos diana en una célula ex vivo al poner en contacto la secuencia de polinucleótidos con una nucleasa (por ejemplo, una proteína palindrómica corta agrupada regularmente interespaciada asociada a repeticiones (Cas)) y de uno a dos ácidos ribonucleicos, en donde los ácidos ribonucleicos dirigen la nucleasa a, y se hibridan con, un motivo diana de la secuencia de polinucleótidos diana, en donde la secuencia de polinucleótidos diana se escinde y se modifica, e introducir la célula modificada en el sujeto, de esta manera se trata o evita un trastorno asociado con la expresión de la secuencia polinucleotídica.

Modificaciones del gen HLA-DRB1

Las moléculas DRB1 son altamente polimórficas y DRB1*04:01 es el gen asociado con la susceptibilidad a la artritis reumatoide. Por el contrario, DRB1*04:02 es resistente a la artritis reumatoide. Los inventores han identificado un único residuo de aminoácido en la posición 71 que explica la diferencia en la susceptibilidad a la RA entre estos dos alelos. Esta mutación puntual alterará la lisina en la posición 71 a ácido glutámico (DRB1*04:01K71E). Por tanto, en un aspecto, la presente invención se dirige al direccionamiento y modificación de los alelos DRB1*04:01 en un sujeto que padece RA mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción. Varios alelos DR4, en particular DRB1*04:01, *04:04 y *04:05, están fuertemente asociados con la RA, mientras que DRB1*04:02 no lo está. Además, DRB1*01:01, *01:02, *10:01 y *14:02 a veces se han asociado con la RA, particularmente en personas no europeas. Se ha planteado la hipótesis de que estos alelos dispares contribuyen a la RA mediante la presencia de un "epítopo compartido", un conjunto común de aminoácidos en las posiciones 70-74 del surco de unión del péptido.

La identificación del tipo de alelo DR4 de un sujeto con RA puede realizarse fácilmente mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, el ADN del sujeto puede extraerse de leucocitos en sangre completa y las regiones codificantes endógenas pueden analizarse mediante análisis de restricción, análisis directo de secuencia de ADN, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), escisión de desajustes químicos (CMC) y Cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante (DHPLC).

La modificación génica dirigida a la reparación mediante estos métodos de esta descripción puede ser una modificación de un solo nucleótido (es decir, una mutación puntual o SNP). La modificación puede ser una modificación del codón que codifica el aminoácido 71 del alelo DRB1*04:01. La modificación puede ser una modificación que cambia el codón que codifica el aminoácido 71 del alelo DRB1*04:01 de una lisina a un ácido glutámico.

Nucleasas dirigidas

En los métodos para dirigirse y modificar un alelo DRB1*04:01 de esta descripción, el alelo DRB1*04:01 puede ser dirigido directamente por nucleasas para su modificación. En los métodos y composiciones de esta descripción, el uno o más ácidos nucleicos que codifican una nucleasa que se dirige a un alelo DRB1*04:01 para su modificación, por ejemplo en el codón 71, pueden ser una nucleasa asociada a CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, interespaciadas regularmente) (Cas), o una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), o una nucleasa con dedos de zinc (ZFN). Preferentemente, la nucleasa codificada es una nucleasa Cas9.

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y las nucleasas asociadas a CRISPR (Cas) son un sistema para la edición del genoma que usa un ARN corto para guiar una nucleasa hacia el ADN diana. Este sistema se llama tecnología CRISPR. (Mali P, Yang L, Esvelt k M, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church G M. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 15 de febrero de 2013; 339(6121):823-6; Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 25 de septiembre de 2012; 109(39):E2579-86. Publicación electrónica del 4 de septiembre de 2012). El sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) y asociado a CRISPR (Cas) se descubrió en bacterias y funciona como defensa contra el ADN extraño, ya sea viral o plasmídico. En las bacterias, el sistema CRISPR/Cas endógeno se dirige al ADN extraño con un ARN monocatenario corto y complementario (ARN CRISPR o ARNcr) que localiza la nucleasa Cas9 en la secuencia de ADN diana. La secuencia de ADN diana puede estar en un plásmido o integrarse en el genoma bacteriano. El ARNcr puede unirse a cualquier hebra de ADN y Cas9 escinde ambas hebras (rotura bicatenaria, DSB). Una reconstitución in vitro del sistema CRISPR de Streptococcus pyogenes tipo II demostró que el ARNcr fusionado a un ARNtracr normalmente codificado en trans es suficiente para dirigir la proteína Cas9 para que escinda de manera específica secuencias de ADN diana que coincidan con el ARNcr. La naturaleza definida completamente de este sistema de dos componentes le permite funcionar en las células de organismos eucariotas como levaduras, plantas y mamíferos. Al escindir secuencias genómicas a las que se dirigen secuencias de ARN, dicho sistema mejora en gran medida la facilidad de la modificación genética del genoma. La molécula Cas9 puede ser un polipéptido Cas9. El polipéptido Cas9 puede ser un polipéptido Cas9 de Staphylococcus aureus. El polipéptido Cas9 puede ser un polipéptido Cas9 de Streptococcus pyogenes. El polipéptido Cas9 puede ser un polipéptido Cas9 con codones humanos optimizados. La molécula de ARN guía y el polipéptido Cas9 pueden estar asociados en un complejo de ribonucleótidos formado previamente.

Las secuencias dirigidas al ARNcr se transcriben a partir de secuencias de ADN conocidas como protoseparadores. Los protoseparadores están agrupados en el genoma bacteriano en un grupo llamado matriz CRISPR. Los protoseparadores son secuencias cortas (aproximadamente 20 pb) de ADN extraño conocido separadas por una repetición palindrómica breve y mantenidas como un registro para futuros encuentros. Para crear el ARN dirigido a CRISPR (ARNcr), la matriz se transcribe y el ARN se procesa para separar las secuencias de reconocimiento individuales entre las repeticiones. En el sistema Tipo II, el procesamiento de la transcripción de la matriz CRISPR (pre-ARNcr) en ARNcr individuales depende de la presencia de un ARNcr transactivador (ARNtracr) que tiene una secuencia complementaria a la repetición palindrómica. Cuando el ARNtracr se hibrida con la repetición palindrómica corta, desencadena el procesamiento por parte de la ribonucleasa bacteriana específica del ARN bicatenario, ARNasa III. Cualquier ARNcr y ARNtracr pueden unirse a la nucleasa Cas9, que después se activa y es específica de la secuencia de ADN complementaria al ARNcr. (Malí P, Science. 2013supra;Gasiunas G, Proc Natl Acad Sci USA.

2012supra).Por lo tanto, esta descripción incluye un ARNcr aislado que contiene un dominio protoseparador específico de HLA-DRB1 de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 20 nucleótidos. Estos ARNcr aislados pueden comprender la secuencia de nucleótidos: GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1).

Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son nucleasas modificadas genéticamente que han surgido como herramientas potentes para la edición específica de sitio del genoma. Por ejemplo, las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son proteínas híbridas que contienen el dominio de unión al ADN con dedos de zinc presente en los factores de transcripción y el dominio de escisión no específico de la endonucleasa Fok1. (Li y otros, In vivo genome editing restores haemostasis in a mouse model of haemophilia, Nature 26 de junio de 2011; 475(7355):217-21).

Las mismas secuencias dirigidas por el enfoque CRISPR, analizadas anteriormente, también pueden ser dirigidas por el enfoque de nucleasa con dedos de zinc para la edición del genoma. Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son una clase de proteínas de unión al ADN modificadas genéticamente que facilitan la edición dirigida del genoma mediante la creación de roturas bicatenarias en el ADN en ubicaciones especificadas por el usuario. Cada nucleasa con dedos de zinc (ZFN) consiste en dos dominios funcionales: 1) un dominio de unión al ADN que comprende una cadena de módulos de dos dedos, cada uno de los cuales reconoce una secuencia hexámera única (6 pb) de ADN, en donde los módulos de dos dedos se unen para formar una proteína con dedos de zinc, cada uno con especificidad de ^24 pb; y 2) un dominio de escisión de ADN compuesto por el dominio de nucleasa de Fok I. Los dominios de unión y de escisión de ADN se fusionan y reconocen las secuencias genómicas dirigidas, lo que permite que los dominios Fok1 formen una enzima heterodimérica que escinde el ADN mediante la creación de roturas bicatenarias. Las nucleasas con dedos de zinc pueden prepararse fácilmente mediante el uso de técnicas conocidas en la técnica (Wright DA, y otros, Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly. Nat Protoc. 2006; 1(3):1637-52). Las nucleasas con dedos de zinc modificadas genéticamente pueden estimular el direccionamiento de genes en loci genómicos específicos en células animales y humanas. Se ha descrito la construcción de matrices de dedos de zinc artificiales mediante el uso de ensamblaje modular. También se ha descrito el archivo de plásmidos que codifican más de 140 módulos de dedos de zinc bien caracterizados junto con un programa complementario basado en la web para identificar posibles sitios diana de dedos de zinc en un gen de interés. Estos reactivos permiten mezclar y combinar fácilmente módulos y transferir matrices ensambladas a vectores de expresión sin la necesidad de conocimientos especializados de secuencias de dedos de zinc o diseños complicados de oligonucleótidos (Wright DA, Nat Protoc. 2006, supra).Cualquier gen de cualquier organismo puede ser dirigido con un par de ZFN diseñados adecuadamente. El reconocimiento de los dedos de zinc depende únicamente de una coincidencia con la secuencia de ADN diana (Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics Society of America, 2011, 188(4), págs. 773-782).

Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) están surgiendo como una alternativa preferida a las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) para ciertos tipos de edición del genoma. El extremo C del componente TALEN transporta señales de localización nuclear (NLS), lo que permite la importación de la proteína al núcleo. Aguas abajo de las NLS, también está presente un dominio de activación (AD) ácido, que probablemente esté involucrado en el reclutamiento de la maquinaria transcripcional del huésped. La región central alberga una serie de módulos de 34/35 aminoácidos casi idénticos repetidos en tándem. Los residuos en las posiciones 12 y 13 son muy variables y se denominan di-residuos de repetición variable (RVD). Cada RVD en una repetición de un TALE particular determina la interacción con un único nucleótido. La mayor parte de la variación entre TALE se basa en el número (que oscila entre 5,5 y 33,5) y/o el orden de las repeticiones casi idénticas. Las estimaciones mediante el uso de criterios de diseño derivados de las características de los TALE naturales sugieren que, en promedio, puede encontrarse un sitio diana de TALEN adecuado cada 35 pares de bases en el ADN genómico. En comparación con las ZFN, el proceso de clonación de las TALEN es más fácil, la especificidad de las secuencias diana reconocidas es mayor y los efectos no deseados son menores. En un estudio, se demostró que los TALEN diseñados para dirigirse a CCR5 tenían muy poca actividad en el locus CCR2 altamente homólogo, en comparación con los ZFN específicos de CCR5 que tenían una actividad de manera similar en los dos sitios.

Después de la introducción de la nucleasa y el ARN guía en la célula, la nucleasa cataliza una rotura bicatenaria del ADN entre sus sitios de unión. Si se produce una rotura bicatenaria en presencia de, por ejemplo, un plásmido molde (DP), que contiene un tramo de ADN con un brazo de homología izquierda (HL) y un brazo de homología derecha (HR) que tienen secuencias de ADN idénticas a las del ADN cromosómico nativo en 5' y 3' de la región que flanquea el punto de rotura, la recombinación homóloga se produce de manera muy eficiente. En consecuencia, la presente invención incluye la introducción de una secuencia de ácido nucleico que sirve como secuencia molde durante la recombinación homóloga que incluye una porción del alelo DRB1*04:02 que reemplaza, y por lo tanto modifica, una porción del gen DRB1 del sujeto, que incluye, específicamente, la porción que codifica el codón 71.

El ARN guía es un ARN que incluye una secuencia de direccionamiento complementaria al ADN genómico de la célula, preferentemente una secuencia del gen DRB1 en la célula, que puede incluir específicamente una secuencia del alelo DRB1*04:01 en la célula. El ARN guía puede incluir de aproximadamente 10 a aproximadamente 250 nucleótidos, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 nucleótidos. El ARN guía puede incluir la secuencia de nucleótidos: GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1).

El ARN guía puede incluir uno o más nucleótidos modificados químicamente que tienen una modificación seleccionada de un grupo que consiste en una modificación de ribosa, un grupo modificador del extremo y un enlace modificador de internucleótidos. El ARN guía puede incluir un ácido ribonucleico que contiene al menos un nucleótido modificado seleccionado del grupo que consiste en pseudouridina, 5-metilcitodina, 2-tiouridina, 5-metiluridina-5'-trifosfato, 4-tiouridina-5'-trifosfato, 5,6-dihidrouridina-5'-trifosfato y 5-azauridina-5'-trifosfato.

Dentro de los sistemas CRISPR de tipo II, los ARN CRISPR guías cortos (ARNcr) que consisten en unidades "separadoras", escinden directamente el ADN complementario a la secuencia separadora. Dentro de las bacterias, el sistema efector de tipo II consiste en un pre-ARNcr largo transcrito del locus CRISPR que contiene el separador, la proteína Cas9 multifuncional y un ARNtracr importante para el procesamiento del ARNg. Los ARNtracr se hibridan con las regiones repetidas que separan los separadores del pre-ARNcr, lo que inicia la escisión del ARNbc por la ARNasa III endógena, que es seguida por un segundo evento de escisión dentro de cada separador por Cas9, lo que produce ARNcr maduros que permanecen asociados con el ARNtracr y Cas9. La enzima nucleasa usada en los métodos de la presente descripción (como Cas9) desenrolla el dúplex de ADN y busca secuencias que coincidan con el ARNcr para escindir. El reconocimiento de la diana se produce tras la detección de complementariedad entre una secuencia "protoseparador" en el ADN diana y la secuencia separadora restante en el ARNcr. Es importante destacar que Cas9 corta el ADN solo si también está presente un motivo adyacente al protoseparador (PAM) correcto en el extremo 3'. De acuerdo con ciertos aspectos, puede usarse un motivo adyacente al protoseparador diferente. Por ejemplo, el sistema de S. pyogenes requiere una secuencia NGG, donde N puede ser cualquier nucleótido. Los sistemas de S. thermophilus Tipo II requieren NGGNG y NNAGAAW, respectivamente, mientras que diferentes sistemas de S. mutans toleran NGG o NAAR. Los análisis bioinformáticos han generado extensas bases de datos de loci CRISPR en una variedad de bacterias que pueden servir para identificar PAM útiles adicionales y ampliar el conjunto de secuencias dirigidas por CRISPR. En S. thermophilus, Cas9 genera una rotura bicatenaria con extremos romos 3 pb antes del extremo 3' del protoseparador, un proceso mediado por dos dominios catalíticos en la proteína Cas9: un dominio HNH que escinde la hebra complementaria del ADN y un dominio similar a RuvC que escinde la hebra no complementaria. Si bien el sistema de S. pyogenes no se ha caracterizado con el mismo nivel de precisión, la formación de DSB también ocurre hacia el extremo 3' del protoseparador. Si uno de los dos dominios de nucleasa está inactivado, Cas9 funcionará como nickasa in vitro y en células humanas in vivo.

Por lo tanto, el ARN guía usado en los métodos de esta descripción puede ser una fusión de ARNcr-ARNtracr. En estos métodos, las transcripciones de fusión de ARNcr-ARNtracr se expresan a partir de un promotor (tal como el promotor de la polimerasa III humana U6). Dichos ARN guía pueden ser transcritos directamente por la célula. Este aspecto evita ventajosamente la reconstitución de la maquinaria de procesamiento de ARN empleada por los sistemas CRISPR bacterianos. En estos métodos, el ARNcr puede comprender la secuencia de nucleótidos: GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1).

La proteína nucleasa (por ejemplo, la proteína Cas9) puede combinarse con una molécula de ARNg para formar un complejo de ribonucleoproteína (RNP) que se administrará al sujeto o se suministrará en la célula. El suministro directo de un complejo nucleasa-ARNg RNP a las células elimina la necesidad de expresión a partir de ácido nucleico (por ejemplo, la transfección de plásmidos que codifican la nucleasa y el ARNg). También elimina la integración no deseada de segmentos de ADN derivados del suministro de ácido nucleico (por ejemplo, la transfección de plásmidos que codifican la nucleasa y el ARNg). Por lo tanto, este complejo RNP proporciona un enfoque de suministro alternativo para su uso en los métodos de esta descripción, que proporciona acción rápida, recambio rápido, alta tasa de modificación en la diana, efectos fuera de la diana reducidos y menos toxicidad para las células. También puede usarse para suministrar el complejo nucleasa/ARNg a células difíciles de transfectar (por ejemplo, células madre primarias y pluripotentes difíciles de transfectar). Habitualmente se forma un complejo de nucleasa/ribonucleoproteína de ARNg (RNP) antes de la administración (es decir, formado previamente). Cuando están involucrados múltiples (más de uno) complejos de nucleasa/ribonucleoproteína de ARNg (RNP), pueden suministrarse(o administrarse) de forma simultánea o secuencial. Los complejos de nucleasa/ribonucleoproteína de ARNg (RNP) pueden suministrarse a las células mediante electroporación.

Alternativa o adicionalmente, la molécula de nucleasa se introduce en la célula como un ácido nucleico que codifica una proteína nucleasa (por ejemplo, una proteína Cas9). De manera similar, el ARN guía puede introducirse en la célula como un ácido nucleico que codifica el ARN guía. De manera similar, la proteína nucleasa puede introducirse en la célula como un ácido nucleico que codifica la proteína nucleasa, y la célula expresa el ARN guía y la proteína nucleasa. La proteína nucleasa (así como también el ARN guía y/o el ácido nucleico molde) puede introducirse en la célula dentro de un virus adenoasociado (AAV) o un lentivirus con deficiencia de integración.

Secuencia de ácido nucleico molde

Un "ácido nucleico molde" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que puede usarse junto con la nucleasa (por ejemplo, una molécula Cas9) y una molécula de ARN guía para alterar la estructura del ácido nucleico dirigido (por ejemplo, DRB1 de ADN genómico). El ácido nucleico diana se modifica para que tenga parte o toda la secuencia del ácido nucleico molde, típicamente en o cerca del(los) sitio(s) de escisión. Un ácido nucleico molde puede ser monocatenario o bicatenario. El ácido nucleico molde puede ser ADN (por ejemplo, ADN bicatenario), o ADN monocatenario, o ARN (por ejemplo, ARN bicatenario o ARN monocatenario). El ácido nucleico molde puede codificarse en la misma cadena principal del vector (por ejemplo, genoma de AAV, ADN plasmídico) que la nucleasa y/o el ARN guía, y el ácido nucleico molde puede escindirse de la cadena principal del vector in vivo (por ejemplo, es flanqueado por secuencias de reconocimiento de ARN guía). El ADN molde puede estar codificado en un ILDV. El ácido nucleico molde puede ser una secuencia de ácido nucleico exógena. La secuencia de ácido nucleico molde puede ser una secuencia de ácido nucleico endógena (por ejemplo, una región homóloga endógena). El ácido nucleico molde puede ser un oligonucleótido monocatenario correspondiente a una hebra positiva o negativa de una secuencia de ácido nucleico.

La secuencia de ácido nucleico donante o "molde" comprende un ácido nucleico que codifica una porción del alelo DRB1*04:02. La secuencia molde puede estar flanqueada a cada lado por regiones de ácido nucleico que son homólogas al gen DRB1*04. Cada una de estas regiones homólogas puede incluir aproximadamente 20, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más nucleótidos homólogos con el gen DRB1 del sujeto. Cada una de las regiones homólogas que flanquean la secuencia molde puede tener de aproximadamente 200 a aproximadamente 1200 nucleótidos, de aproximadamente 400 a aproximadamente 1000 nucleótidos, o de aproximadamente 600 a aproximadamente 900 nucleótidos. En una modalidad, cada región homóloga tiene entre aproximadamente 800 y aproximadamente 900 nucleótidos. Por lo tanto, cada secuencia de ácido nucleico molde puede incluir una secuencia que reemplaza o modifica el alelo DRB1*04:01 endógeno del sujeto y secuencias flanqueantes 5' y 3' que son homólogas a porciones del gen DRB1.

La secuencia molde se deriva sobre la base del nucleótido, codón, porción o región específica dentro del gen DRB1 del sujeto que está dirigido a reemplazo o modificación. En consecuencia, la longitud de la secuencia molde puede variar. Por ejemplo, cuando se repara una mutación puntual, tal como un cambio en la secuencia que codifica el codón 71 en el alelo DRB1*04, la secuencia molde puede incluir sólo un pequeño número de secuencias de nucleótidos de reemplazo en comparación con, por ejemplo, una secuencia molde diseñada para reemplazar o reparar una porción o región más grande del gen DRB1, tal como una inversión. Por lo tanto, una secuencia molde puede tener cualquier longitud, por ejemplo entre 2 y 10 000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos o arriba), preferentemente entre aproximadamente 100 y 1000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entre ellos), más preferentemente entre aproximadamente 200 y 500 nucleótidos de longitud. El diseño de ácidos nucleicos de secuencia molde se conoce en la técnica (por ejemplo, véase Cermak y otros, Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acid Res. 1 de septiembre de 2011; 39 (17):7879). En métodos ilustrativos de esta descripción, la secuencia molde incluye la secuencia de nucleótidos del codón 71 del alelo DRB1*04:02.

En los métodos de esta descripción, la secuencia génica dirigida para la modificación es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y la secuencia molde incluye una secuencia de ácido nucleico que modifica o reemplaza el SNP con una secuencia que se considera la secuencia génica de "tipo salvaje" o una variación alélica diferente en ese mismo sitio, por ejemplo, la secuencia del alelo DRB1*04:02 en ese mismo sitio. En métodos relacionados de esta descripción, la secuencia génica dirigida para la modificación incluye una eliminación y la secuencia molde, o incluye una secuencia de ácido nucleico que reemplaza la eliminación con una secuencia que no incluye la eliminación, por ejemplo, la secuencia DRB1 de tipo salvaje o la secuencia de alelos DRB1*04:02.

En métodos relacionados de esta descripción, la secuencia génica dirigida para la modificación es una inserción, y la secuencia diana incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una porción del gen DRB1 que elimina la inserción y proporciona la producción de un producto del gen DRB1 funcional.

En estos métodos de esta descripción, la secuencia molde puede contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas (por ejemplo, contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica aminoácidos de tipo salvaje o aminoácidos ns-SNP diferentes), a secuencias genómicas en la región de interés, de esta manera se estimula la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Por tanto, las porciones de la secuencia molde que son homólogas a secuencias en la región de interés pueden exhibir de aproximadamente 80 a aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se reemplaza. La homología entre las secuencias molde y genómica es superior al 99 %, por ejemplo, si solo 1 nucleótido difiere entre las secuencias molde y genómica de más de 100 pares de bases contiguos. Una porción no homóloga de la secuencia molde puede contener secuencias no presentes en la región de interés, de manera que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga generalmente está flanqueada por secuencias de entre 50 y 1000 pares de bases, o cualquier número de pares de bases mayor que 1000, que son homólogas o idénticas a secuencias en la región de interés. En otras modalidades, la secuencia molde no es homóloga a la primera secuencia y se inserta en el genoma mediante mecanismos de recombinación no homólogos.

El ácido nucleico molde puede ser un oligodesoxinucleótido monocatenario (ODNmc). El ODNmc puede comprender una modificación de fosforotioato 5'. El ODNmc puede comprender una modificación de fosforotioato 3'. El ODNmc puede comprender una modificación de fosforotioato 5' y una modificación de fosforotioato 3'.

Los ácidos nucleicos molde para modificar el gen DRB1 pueden diseñarse para su uso como oligonucleótido monocatenario (por ejemplo, un oligodesoxinucleótido monocatenario (ODNmc)). Cuando se usa un ODNmc, los brazos de homología 5' y 3' pueden variar a aproximadamente 200 pares de bases (pb) de longitud, por ejemplo, al menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 pb de longitud. También se contemplan brazos de homología más largos para los ODNmc a medida que se continúa la realización de mejoras en la síntesis de oligonucleótidos. Puede prepararse un brazo de homología más largo mediante un método distinto de la síntesis química, por ejemplo, mediante la desnaturalización de un ácido nucleico bicatenario largo y la purificación de una de las hebras, por ejemplo, mediante afinidad por una secuencia específica de hebra anclada a un sustrato sólido.

Células diana

Las técnicas de modificación y direccionamiento de genes mediante el uso de las diferentes nucleasas descritas anteriormente pueden llevarse a cabo mediante el uso de muchas células diana diferentes. Por ejemplo, las células transducidas pueden incluir células endoteliales, hepatocitos o células madre.

Las células se seleccionan mediante el uso de enfoques ex vivo y se introducen nuevamente en el sujeto.

Las células diana del sujeto pueden ser células endoteliales, tales como células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC). Las características que hacen que los BOEC sean atractivos para la modificación y suministro de genes incluyen: (i) capacidad de expandirse a partir de células progenitoras aisladas de la sangre, (ii) célula endotelial madura, estable, fenotipo y senescencia normal (aproximadamente 65 divisiones), (iii) expansión prolífica a partir de una sola muestra de sangre a mil o más BOEC, (iv) resiliencia, que a diferencia de otras células endoteliales, permite la criopreservación y, por lo tanto, dosis múltiples para un solo paciente preparada a partir de un solo aislamiento. Se conocen métodos de aislamiento de BOEC, en los que el cultivo de sangre periférica proporciona un rico suministro de células endoteliales autólogas altamente proliferativas, también denominadas células endoteliales de crecimiento sanguíneo (Bodempudi V, y otros, Blood outgrowth endothelial cell-based systemic delivery of antiangiogenic gene therapy for solid tumors. Cancer Gene Ther. diciembre de 2010; 17(12):855-63).

Los estudios en modelos animales han revelado propiedades de las células endoteliales del crecimiento sanguíneo que indican que son adecuadas para su uso en estrategias de modificación génica ex vivo. Por ejemplo, un hallazgo clave sobre el comportamiento de las células endoteliales del crecimiento sanguíneo canino (cBOEC) es que las cBOEC persisten y se expanden dentro del hígado canino después de la infusión (Milbauer LC, y otros, Blood outgrowth endothelial cell migration and trapping in vivo: a window into gene therapy. Abril de 2009; 153(4):179-89). El tiempo de coagulación de la sangre total (WBCT) en el modelo HA también mejoró después de la administración de cBOEC modificados genéticamente. WBCT cayó de un valor previo al tratamiento de menos de 60 min a más abajo de 40 min y, a veces, a más abajo de 30 min.

En estos métodos, las células diana del sujeto son células eucariotas que pueden ser células madre, y específicamente células madre hematopoyéticas (HSC), ya que las células hematopoyéticas probablemente representan la principal fuente celular de productos del gen DRB1 que presentan péptidos modificados y desencadenan la RA.

La célula (o población de células) puede ser una célula sanguínea primaria, o una población de células sanguíneas primarias. La célula o población de células puede ser una célula de médula ósea, una célula de sangre periférica o una célula generada a partir de una célula madre pluripotente inducida (iPS), una célula madre embrionaria (ES), una célula endotelial, una célula progenitora mieloide, una célula sanguínea circulante, una célula sanguínea movilizada, una célula progenitora multipotente y una célula progenitora de linaje restringido, o una población de cualquiera de estas células. La población de células puede ser una población de células heterogénea o una población de células homogénea.

Las células madre pueden ser células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son un tipo de células madre pluripotentes derivadas artificialmente a partir de una célula no pluripotente, típicamente una célula somática adulta, mediante la inducción de la expresión de genes específicos y factores importantes para mantener las propiedades definitorias de las células madre embrionarias. Se ha demostrado en varios ejemplos que las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son capaces de dirigirse a genes específicos de un sitio mediante nucleasas (Ru, R. y otros, Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells by penetrating TALENs. Cell Regeneration. 2013, 2:5; Sun N, Zhao H. Seamless correction of the sickle cell disease mutation of the HBB gene in human induced pluripotent stem cells using TALENs. Biotechnol Bioeng. 2013. 8 de agosto). Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden aislarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Lorenzo, I M. Generation of Mouse and Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) from Primary Somatic Cells. Stem Cell Rev. agosto de 2013; 9(4):435-50).

En algunos casos, las poblaciones puras de algunos tipos de células pueden no promover suficiente localización e implantación tras la introducción nuevamente de las células transducidas en el sujeto, para proporcionar una expresión extendida y suficiente del gen DRB1 modificado. Por lo tanto, algunos tipos de células pueden cultivarse conjuntamente con diferentes tipos de células para ayudar a promover las propiedades celulares (es decir, la capacidad de las células para injertarse en la médula ósea).

Suministro celular

Los métodos de suministro de ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, la Publicación PCT núm. WO 2012/051343). En los métodos de esta descripción, la nucleasa descrita que codifica ácidos nucleicos puede introducirse en la célula como ADN o ARN, monocatenario o bicatenario y puede introducirse en una célula en forma circular o lineal. En una modalidad, los ácidos nucleicos que codifican la nucleasa se introducen en la célula como ARNm. La secuencia molde puede introducirse en la célula como ADN monocatenario o bicatenario y puede introducirse en una célula en forma circular o lineal. Si se introduce en forma lineal, los extremos de los ácidos nucleicos pueden protegerse (por ejemplo, de la degradación exonucleolítica) mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótido al extremo 3' de una molécula lineal y/o se ligan oligonucleótidos autocomplementarios a uno o ambos extremos (véanse, por ejemplo, Chang y otros, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls y otros, (1996) Science 272:886-889). Los métodos adicionales para proteger los polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de uno o más grupo(s) amino terminal(es) y el uso de enlaces modificados entre los nucleótidos tal como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa.

Los ácidos nucleicos pueden introducirse en una célula como parte de una molécula vector que tiene secuencias adicionales tales como, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican resistencia a antibióticos. Además, los ácidos nucleicos pueden introducirse como ácido nucleico desnudo, como complejos de ácido nucleico con un agente tal como un liposoma o poloxámero, o pueden suministrarse mediante virus (por ejemplo, adenovirus, AAV, herpesvirus, retrovirus, lentivirus). Por lo tanto, esta descripción incluye vectores que pueden codificar una o más nucleasas (por ejemplo, nucleasa Cas9), ARN guía (que puede codificarse como una fusión de ARNtracr-ARNcr) y un ácido nucleico molde. El vector puede ser un vector de adenovirus, un vector lentiviral de integración deficiente (IDLV) o un vector espumoviral de integración deficiente (IDFV).

Los ácidos nucleicos pueden suministrarse ex vivo mediante cualquier medio adecuado. Los métodos para suministrar ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos núms. 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; y 7,163,824.

Puede usarse cualquier sistema de vectores, que incluye, pero no se limita a, vectores plasmídicos, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de herpesvirus y vectores de virus adenoasociados, etcétera. (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; y 7,163,824). Además, cualquiera de estos vectores puede comprender una o más de las secuencias necesarias para el tratamiento de la RA. Por tanto, cuando se introducen uno o más ácidos nucleicos en la célula, las nucleasas y/o los ácidos nucleicos de secuencia molde pueden transportarse en el mismo vector o en vectores diferentes. Cuando se usan múltiples vectores, cada vector puede comprender una secuencia que codifica una nucleasa o una secuencia de ácido nucleico molde. Alternativamente, dos o más de los ácidos nucleicos pueden estar contenidos en un único vector.

Pueden usar métodos convencionales de transferencia de genes basados en virus y no virus para introducir ácidos nucleicos que codifican los ácidos nucleicos en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Los sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico en complejo con un vehículo de suministro tal como un liposoma o poloxámero. Los sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después de su suministro a la célula. Los métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen sonoporación, electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policationes o conjugados de lípidos:ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN mejorada por agentes.

Los sistemas de suministro de ácido nucleico ilustrativos adicionales incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, Massachusetts) y Copernicus Therapeutics Inc, (véase por ejemplo, la Patente de Estados Unidos núm. 6,008,336). La lipofección se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos núms. 5,049,386; 4,946,787; y 4,897,355) y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y lipofectina™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de polinucleótidos con reconocimiento de receptores incluyen los descritos en las publicaciones PCT núms. WO 91/17424 y WO 91/16024.

Los expertos en la técnica conocen bien la preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, que incluye liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípidos (véanse, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese y otros, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr y otros, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy y otros, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao y otros, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad y otros, Cancer Res.

52:4817-4820 (1992); Patente de Estados Unidos núms 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, y 4,946,787).

Los métodos de suministro adicionales incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos que se suministrarán en vehículos de suministro (EDV) EnGenelC. Estos EDV se suministran específicamente a los tejidos diana mediante el uso de anticuerpos biespecíficos en los que un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana, y después los EDV se introducen en la célula mediante endocitosis. Una vez en la célula, el contenido se libera (véase MacDiarmid y otros (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

El uso de sistemas basados en ARN o ADN viral para el suministro de ácidos nucleicos aprovecha procesos altamente evolucionados para dirigir un virus a células específicas del cuerpo y transportar la carga viral al núcleo. Los vectores virales se usan para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a los pacientes (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para el suministro de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, vectores de virus retrovirales, lentivirus, adenovirales, adenoasociados, vaccinia y herpes simple para la transferencia de genes.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse mediante la incorporación de proteínas de envoltura extrañas, lo que expande la población potencial de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que pueden transducir o infectar células que no se dividen y típicamente producen títulos virales elevados. La selección de un sistema de transferencia de genes retroviral puede depender del tejido diana. Los vectores retrovirales comprenden repeticiones terminales largas que actúan en cz's con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR que actúan en cz's mínimas son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que después se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Los vectores retrovirales ampliamente usados incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del simio gibón (GaLV), el virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones (véase, por ejemplo, Buchscher y otros, J. Virol.

66:2731-2739 (1992); Johann y otros, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt y otros, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson y otros, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller y otros, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); documento PCT US94/05700).

En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, pueden usarse sistemas basados en adenovirus. Los vectores basados en adenovirus son capaces de lograr una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con dichos vectores se han obtenido títulos elevados y niveles elevados de expresión. Este vector puede producirse en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adenoasociados ("AAV") también se usan para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, West y otros, Virology 160:38-47 (1987); la patente de Estados Unidos núm. 4,797,368; el documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, que incluye la patente de Estados Unidos núm. 5,173,414; Tratschin y otros, Mol Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin y otros, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski y otros, J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Actualmente están disponibles una variedad de enfoques de vectores virales para la transferencia de genes en ensayos clínicos, que usan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos mediante genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente transductor. pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han usado en ensayos clínicos (Dunbar y otros, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn y otros, Nat. Med.

1:1017-102 (1995); Malech y otros, PNAS 94:2212133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica. (Blaese y otros, Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50 % o más para los vectores empaquetados MFG-S. (Ellem y otros, Immunol Immunother.

44(1):10-20 (1997); Dranoff y otros, Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997). Los vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) son sistemas de suministro alternativos de genes basados en el virus adenoasociado de tipo 2 parvovirus defectuoso y no patógeno. Todos los vectores derivan de un plásmido que retiene sólo las repeticiones terminales invertidas de 145 pb de AAV que flanquean el casete de expresión transgénica. La transferencia de genes eficiente y el suministro estable de transgenes debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave de este sistema de vector. (Wagner y otros, Lancet 351: 9117 1702-3 (1998), Kearns y otros, Gene Ther. 9:748-55 (1996)). También pueden usarse otros serotipos de AAV, que incluye AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAVrh.10 y cualquier serotipo de Aa V novedoso en los métodos de esta descripción.

Los vectores adenovirales recombinantes (Ad) con replicación deficiente pueden producirse con títulos elevados e infectar fácilmente varios tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus están modificados genéticamente de manera que un transgén reemplace los genes Ad EI a, EI b y/o E3; subsecuentemente, el vector de replicación defectuosa se propaga en células 293 humanas que suministran la función del gen eliminado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, que incluye células diferenciadas que no se dividen, como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores publicitarios convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para la inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman y otros, Hum. Gene Ther.

7:1083-9 (1998)). Los ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes en ensayos clínicos incluyen Rosenecker y otros, Infection 24:1 5-10 (1996);Sterman y otros, Hum. Gene Ther. 9:71083 1089 (1998);Welsh y otros, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Álvarez y otros, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf y otros, Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman y otros, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

Las células empaquetadoras se usan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Dichas células incluyen 293 células, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales usados en terapia génica habitualmente son generados por una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores típicamente contienen las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la integración subsecuente en un huésped (si corresponde), otras secuencias virales son reemplazadas por un casete de expresión que codifica la proteína que se va a expresar. Las funciones virales que faltan son aportadas en trans por la línea celular empaquetadora. Por ejemplo, los vectores de AAV usados en terapia génica típicamente solo poseen secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que son necesarias para el empaquetamiento y la integración en el genoma del huésped. El ADN viral está empaquetado en una línea celular que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, específicamente, rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también está infectada con adenovirus como ayudante. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la falta de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus puede reducirse, por ejemplo, mediante un tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

Un vector viral puede modificarse para que tenga especificidad por un tipo de célula determinado mediante la expresión de un ligando como una proteína de fusión con una proteína de cubierta viral en la superficie exterior del virus. El ligando se selecciona para que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés (véase, por ejemplo, Han y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), informa que el virus de la leucemia murina de Moloney puede modificarse para expresar heregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano). Esto puede usarse con otros pares de células diana-virus, en los que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, pueden modificarse genéticamente fagos filamentosos para que presenten fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, FAB o Fv) que tengan afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular seleccionado. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a vectores virales, pueden aplicarse los mismos principios a vectores no virales. Dichos vectores pueden modificarse genéticamente para que contengan secuencias de captación específicas que favorezcan la captación por células diana específicas.

Los vectores se suministran a células ex vivo, tales como células explantadas de un sujeto individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donante universal, seguido de la reimplantación de las células en el sujeto, habitualmente después de la selección de células que han incorporado el vector.

Alternativamente, puede administrarse ADN desnudo. La administración puede realizarse mediante cualquiera de las vías usadas normalmente para introducir una molécula en contacto final con sangre o células tisulares, que incluye, pero no se limita a, inyección, infusión y electroporación. Los métodos adecuados para administrar dichos ácidos nucleicos están disponibles y se conocen bien por los expertos en la técnica y, aunque puede usarse más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra vía.

Los vectores adecuados para la introducción de los ácidos nucleicos de esta descripción incluyen vectores de lentivirus no integradores (IDLV). Véase, por ejemplo, Ory y otros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull y otros (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery y otros, (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi y otros, (2000) Nature Genetics 25:217-222; publicación de patente de Estados Unidos núm. 2009/054985.

La administración puede realizarse mediante cualquier medio en el que los polinucleótidos se suministren a las células diana deseadas. Los ácidos nucleicos se introducen en las células de un sujeto que han sido explantadas del sujeto y se introducen nuevamente después de la modificación del gen DRB1.

Las células modificadas son preferentemente células autólogas, es decir, una célula o células tomadas de un sujeto que necesita alterar una secuencia de polinucleótido diana de DRB1 en la célula o células (es decir, el donante y el receptor son el mismo individuo). Las células autólogas tienen la ventaja de evitar cualquier rechazo de las células por motivos inmunológicos. Alternativamente, las células pueden ser heterólogas, por ejemplo tomadas de un donante. El segundo sujeto puede ser de la misma o diferente especie. Típicamente, cuando las células proceden de un donante, procederán de un donante que sea suficientemente compatible inmunológicamente con el receptor, es decir, que no estará sujeto al rechazo del trasplante, para disminuir o eliminar la necesidad de inmunosupresión. En algunas modalidades, las células se toman de una fuente xenogénica, es decir, un mamífero no humano que ha sido modificado genéticamente para ser suficientemente compatible inmunológicamente con el receptor o la especie del receptor. Los métodos para determinar la compatibilidad inmunológica se conocen en la técnica e incluyen tipificación de tejidos para evaluar la compatibilidad donante-receptor para los determinantes HLA y ABO (véase, por ejemplo, Transplantation Immunology, Bach y Auchincloss, Eds. (Wiley, John & Sons, Incorporado en 1994). La administración de células autólogas modificadas puede lograrse ventajosamente tras administrar la población de células modificadas al sujeto como un autotrasplante de médula ósea.

Las células o tejidos pueden eliminarse, expandirse y mantenerse fuera del cuerpo de acuerdo con protocolos estándar bien conocidos en la técnica. Las composiciones pueden introducirse en las células mediante cualquier mecanismo de transferencia de genes como se describe anteriormente, tal como, por ejemplo, suministro de genes mediada por fosfato cálcico, electroporación, microinyección, proteoliposomas o suministro de vectores virales. Las células transducidas pueden después infundirse (por ejemplo, en un portador farmacéuticamente aceptable) o trasplantarse homotópicamente nuevamente al sujeto según métodos estándar para el tipo de célula o tejido. Se conocen métodos estándar para el trasplante o la infusión de diversas células en un sujeto.

En estos métodos, se identifica un alelo DRB1*04:01 en una célula de un sujeto que tiene RA o en riesgo de desarrollar RA, y el alelo DRB1*04 se modifica para parecerse al alelo DRB1*04:02. Por ejemplo, se identifica y modifica una BOEC o iPSC mediante el uso del enfoque de nucleasa descrito anteriormente y una secuencia molde que es idéntica a una porción de un alelo DRB1*04:02 se sustituye en el alelo DRB1*04 en la célula. En una modalidad, la modificación tiene lugar ex vivo, cuando una célula, por ejemplo una BOEC o iPSC, se explanta del sujeto, se modifica y se introduce nuevamente en el sujeto como se describió anteriormente. Después de la modificación, la célula es capaz de producir el producto del gen DRB1*04, que incluye un residuo de ácido glutámico en la posición 71. La expresión del producto del gen DRB1*04 in vivo conduce a una reducción, retraso o inhibición de una respuesta inmunitaria no deseada específica del antígeno o epítopo DRB1, y a una reducción, mejora o supresión de la RA en el sujeto. La respuesta inmunitaria reducida puede ser el resultado de la presentación restringida del MHC Clase II y/o de la presentación de células B, o cualquier otra presentación que conduzca a la inmunogenicidad minimizada o reducida del producto del gen DRB1 modificado.

La reducción en la respuesta autoinmunitaria al producto del gen DRB1 puede medirse in vivo o puede medirse in vitro. Un experto en la técnica está familiarizado con dichas mediciones in vivo o in vitro. Las respuestas inmunitarias pueden monitorearse mediante el uso de, por ejemplo, métodos para evaluar el número y/o función de las células inmunitarias, análisis de tetrámeros, ELISPOT, análisis basado en citometría de flujo de la expresión de citocinas, secreción de citocinas, perfiles de expresión de citocinas, perfiles de expresión génica, perfiles de expresión de proteínas, análisis de marcadores de superficie celular, detección basada en PCR del uso de genes del receptor de células inmunitarias (véase T. Clay y otros, "Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer" Clinical Cancer Research 7:1127-1135 (2001)), etcétera. Las respuestas inmunitarias también pueden monitorearse mediante el uso de, por ejemplo, métodos para evaluar los niveles de proteínas en plasma o suero, proliferación de células inmunitarias y/o ensayos funcionales, etcétera. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también pueden monitorearse mediante la evaluación de la inducción de FoxP3. La reducción de una respuesta inmunitaria no deseada también puede evaluarse mediante la determinación de criterios de valoración clínicos, eficacia clínica, síntomas clínicos, biomarcadores de enfermedades y/o puntuaciones clínicas. Las respuestas inmunitarias tolerogénicas también pueden evaluarse con pruebas de diagnóstico para evaluar la presencia o ausencia de inhibidores.

En estos métodos, las células de un sujeto pueden recolectarse, modificarse y después, almacenarse para la administración futura al sujeto. Las células pueden administrarse en cantidades efectivas, tales como las cantidades efectivas descritas en otros lugares en la presente descripción. La cantidad de células de expresión presentes en las composiciones o formas de dosificación puede variarse de acuerdo con la naturaleza y cantidad del producto del gen DRB1 expresado, el beneficio terapéutico que se va a lograr y otros parámetros similares. Pueden realizarse estudios de determinación de dosis para establecer cantidades terapéuticas óptimas de péptidos DRB1 modificados que las células expresarán. Las células deben expresar un producto del gen DRB1 modificado en una cantidad efectiva para reducir o eliminar significativamente una respuesta inmunitaria a un epítopo de DRB1 tras la administración a un sujeto. Las formas de dosificación pueden administrarse con una variedad de frecuencias. Al menos una administración de las células que expresan DRB1 modificadas puede ser suficiente para generar una respuesta relevante farmacológicamente. Alternativamente, pueden usarse al menos dos administraciones, al menos tres administraciones o al menos cuatro administraciones, o más, de las células que expresan DRB1 modificadas para asegurar una respuesta relevante farmacológicamente.

Los métodos descritos en la presente descripción pueden comprender además expandir la célula modificada, o población de células, ex vivo después de que las células se modifican y antes de la administración a un sujeto. La expansión ex vivo de las células modificadas (por ejemplo, células madre hematopoyéticas modificadas (HSC)) permite un injerto eficiente de las células modificadas y el uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para la detección y la aplicación clínica. Por lo tanto, esta descripción proporciona composiciones y métodos para la expansión eficiente de HSC autólogas, HSC autólogas modificadas genéticamente, ES y HSC derivadas de iPSC. Puede emplearse la metodología de expansión de sangre del cordón umbilical, metodología que usa Delta1 en medio libre de suero enriquecido con factores de crecimiento hematopoyético mediante el uso de sangre periférica CD34+ movilizada obtenida de donantes normales. Estas composiciones y métodos pueden usarse en combinación con uno o más reactivos adicionales para mejorar la supervivencia y proliferación de las células madre/progenitoras hematopoyéticas modificadas. Estas composiciones y métodos pueden emplear cultivos conjuntos de células endoteliales para la expansión mejorada de células en repoblación a largo plazo, que incluye las HSC derivadas de iPSC corregidas.

La expansión ex vivo de HSC autólogas modificadas mejora la seguridad y efectividad de la terapia génica basada en HSC al permitir el trasplante de un mayor número de células repobladoras modificadas apropiadamente para permitir una repoblación rápida y garantizar el predominio de las células modificadas in vivo.

En estos métodos, los agentes que inhiben la diferenciación (por ejemplo, el ligando de Notch) pueden combinarse con composiciones y métodos que mejoran la proliferación y supervivencia de células madre/progenitoras tempranas, de esta manera se logra una expansión ex vivo mediada por Notch mejorada. Puede lograrse una proliferación mejorada de células madre/progenitoras de la sangre del cordón umbilical al combinar el ligando de Notch, Delta1, con el inhibidor del receptor de hidrocarburos aril (SRI) (Boitano y otros, Science 329:1345-8 (2011) o HoxB4 (Watts y otros, Blood 116:5859-66 (2010) y Zhang y otros, PLoS Med 3:e173 (2006)) para mejorar la proliferación y autorrenovación de los precursores hematopoyéticos, y con angiopoyetina 5 para mejorar su supervivencia. Es esencial para la aplicación clínica de la terapia génica la capacidad de expandir a largo plazo las células modificadas y repobladoras, lo que asegura la longevidad del injerto celular corregido.

Pueden emplearse células endoteliales activadas por Akt en sistemas de cultivo conjunto para confirmar la expansión de las células modificadas (véase, Butler y otros, Cell Stem Cell 6:251-64 (2011)). La expansión de las células con genes corregidos depende de la activación de la señalización de Notch inducida por las células endoteliales en los precursores hematopoyéticos. Un segundo aspecto crítico para la aplicación clínica es la fidelidad genética y epigenética de las células derivadas en comparación con sus contrapartes normales para garantizar un comportamiento apropiado y la falta de potencial oncogénico in vivo. De manera importante, la evaluación de todo el genoma de las células madre/progenitoras de sangre del cordón umbilical expandidas muestra fidelidad del transcriptoma, la estructura de la cromatina y el metiloma del ADN en comparación con las células primarias aisladas.

La metodología de expansión de sangre del cordón umbilical puede usar Delta1 en medio libre de suero enriquecido con factores de crecimiento hematopoyético mediante el uso de sangre periférica movilizada obtenida de donantes normales. Las condiciones de expansión ex vivo optimizadas mediante el uso de ensayos in vitro establecidos (inmunofenotipado, crecimiento, etcétera) y la capacidad de repoblación in vivo pueden evaluarse mediante el uso del modelo de ratón NSG. Pueden usarse condiciones optimizadas en combinación con composiciones que incluyen SRI (inhibidor del receptor de aril hidrocarburo), proteínas Hox o angiopoyetinas para mejorar la proliferación y supervivencia de células madre/progenitoras tempranas. Pueden evaluarse combinaciones prometedoras en ensayos in vitro de células progenitoras y en el modelo de ratón inmunodeficiente (ratones NSG) y después extenderlas a partir de la expansión de células HSC de individuos normales para evaluar estos métodos para la expansión de células HSC de sujetos con RA.

La fidelidad transcripcional, genética y epigenética de las células expandidas con sus HSC homólogas normales puede evaluarse mediante el uso de enfoques de todo el genoma para evaluar el potencial oncogénico de las células generadas. Después del crecimiento in vivo (después de la infusión), pueden usarse células para determinar si existen aberraciones significativas funcionalmente que mejoren el crecimiento in vivo de cualquier clon(es) afectado(s), de esta manera se permite la expansión selectiva y la detección de células raras.

La administración profiláctica de las células de expresión puede iniciarse antes del inicio de la RA, o la administración terapéutica puede iniciarse después de que la<r>A se haya desarrollado en un sujeto. Puede administrarse una dosis de "mantenimiento" a un sujeto después de que una administración inicial haya dado como resultado una reducción de la respuesta autoinmunitaria de DRB1 en el sujeto, por ejemplo para mantener la supresión de la RA conseguida después de la dosis inicial, para evitar una reacción inmunitaria no deseada en el sujeto, o para evitar que el sujeto se convierta en un sujeto en riesgo de experimentar una respuesta inmunitaria no deseada o un nivel no deseado de una respuesta inmunitaria. La dosis de mantenimiento puede ser la misma dosis que la dosis inicial que recibió el sujeto. Alternativamente, la dosis de mantenimiento puede ser una dosis más baja que la dosis inicial, que incluye, por ejemplo, una dosis de mantenimiento que es aproximadamente %, aproximadamente %, aproximadamente 1^ , aproximadamente A, aproximadamente %, aproximadamente %, aproximadamente 1/10, aproximadamente 1/20, aproximadamente 1/25, aproximadamente 1/50, aproximadamente 1/100, aproximadamente 1/1000, aproximadamente 1/10 000, aproximadamente 1/100 000 o aproximadamente 1/1 000 000 (peso/peso) de la dosis inicial.

En los métodos terapéuticos de esta descripción, las células y composiciones proporcionadas en la presente descripción pueden usarse junto con medios establecidos para tratar la RA. Los protocolos de tratamiento de la RA se conocen en la técnica y generalmente se describen en, por ejemplo, arthritis.org/about-arthritis/types/rheumatoidarthritis/treatment.php. La administración de las células modificadas como se describe en la presente descripción puede realizarse antes, después y/o simultáneamente con los protocolos de tratamiento de RA establecidos y/o variaciones de estos. Por ejemplo, los métodos de esta descripción pueden aumentar la efectividad de los protocolos de tratamiento de RA establecidos (por ejemplo, el grado y/o posibilidad de tratamiento exitoso) y/o reducir los costos o efectos secundarios asociados. Los métodos de esta descripción pueden permitir que los protocolos de tratamiento de la RA establecidos se modifiquen de manera beneficiosa, por ejemplo, para disminuir la frecuencia, duración y/o dosis de la administración del tratamiento de la RA.

Las células modificadas de esta descripción pueden combinarse o administrarse con compuestos inmunosupresores capaces de inducir células T reguladoras adaptativas. En una modalidad, el(los) compuesto(s) inmunosupresor(es) puede(n) incluir, pero no se limitan a, IL-10, TGF-p y/o rapamicina y/u otros compuestos "limus", que incluyen, pero no se limitan a, biolimus A9, everolimus, tacrolimus y zotarolimus, y/o sus combinaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1

Modificación génica ex vivo

Se proporcionan ejemplos de estrategias de modificación génica ex vivo que pueden realizarse sin el uso de vectores virales. Los materiales genéticos se suministran para modificar el alelo DRB1*04:01 para que exprese una proteína que tiene un residuo de ácido glutámico en la posición 71 (DRB1*04:01K71E) en HSC derivadas de un paciente con RA humana mediante el uso de electroporación y nucleasa Cas9.

El uso de células autólogas es una terapia atractiva ya que niveles de proteínas DRB1 relevantes clínicamente pueden producirse más fácilmente mediante la expansión de grandes poblaciones de células ex vivo, seguida de su introducción nuevamente en el paciente. La modificación del codón 71 en los alelos DRB1*04 que residen en HSC derivadas de un paciente con RA grave asociada con el alelo DRB1*04:01 se efectúa mediante el uso de electroporación para introducir en una célula HSC del sujeto (i) una secuencia de ARN guía complementaria a al menos una porción del alelo DRB1*04:01, (ii) una proteína Cas9, (iii) un ácido nucleico molde que comprende al menos una porción de un alelo HLA-DRB1, en donde la secuencia de ARN guía se une a la secuencia del ácido nucleico diana (porción del alelo DRB1*04:01) y la proteína Cas9 escinde la secuencia de ácido nucleico diana, y la porción del alelo HLA-DRB1 en el ácido nucleico molde se sustituye en el ácido nucleico diana.

Es atractivo el uso de métodos libres de virus para derivar células autólogas de diversos fenotipos e introducir de forma estable información genética en el genoma. Estos métodos pueden usarse efectivamente para modificar con éxito el alelo DRB1*04:01 para evitar o tratar la RA en un sujeto.

Un ejemplo de una secuencia a la que puede dirigirse incluye una secuencia dentro del alelo DRB1*04:01 que incluye el codón 71 que codifica un residuo de lisina.

Se usan electroporación (sistema de nucleofección AMAXA) y transfección química (con un reactivo comercial optimizado para este tipo de células) como métodos de transfección para las células HSC. Se introduce en las células un plásmido que contiene el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) mediante el uso de ambos métodos. Las células se analizan mediante microscopía fluorescente para obtener una estimación de la eficiencia de la transfección y las células se observan mediante microscopía óptica ordinaria para determinar la salud de las células transfectadas. Puede usarse cualquier método de transfección que proporcione un equilibrio conveniente entre alta eficiencia de transfección y preservación de la salud celular en las células HSC. Después, el ARN guía y el plásmido de modificación génica se introducen en las células HSC mediante el uso de un método de transfección.

Las HSC con el gen DRB1 modificado se diferencian en células hematopoyéticas y se expanden mediante el uso de protocolos bien establecidos.

Se realiza la caracterización del ADN genómico en los loci DRB1 modificados, así como también de los ARNm y productos de expresión sintetizados por las células HSC, antes y después de la electroporación.

La eficiencia de la transfección para la expresión y secreción de productos del gen DRB1*04 modificados puede evaluarse en los diversos tipos de células antes y después de la transfección. El ADN genómico se aísla de las células antes y después de la transfección. El ADN genómico purificado se usa como molde para la PCR. Los cebadores están diseñados para la amplificación a partir de un cebador específico de DRB1 solo en células no modificadas y la amplificación a partir del cebador específico de modificación solo en células modificadas. La RT-PCR puede detectar y cuantificar específicamente las transcripciones de ARNm DBR1 de células normales y modificadas. También pueden usarse ensayos basados en citometría de flujo para el producto del gen DRB1*04:01 en poblaciones de células tratadas.

Ejemplo 2

Protocolo para la modificación del gen del factor VIII en humanos

Obtención de una muestra de sangre: En el siguiente ejemplo se describe un protocolo para la modificación del alelo DRB1*04:01 en células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC). Primero, se obtiene una muestra de sangre, con 50-100 ml de muestras de sangre del paciente obtenidas mediante venopunción y recolección en dispositivos recolectores de grado médico disponibles comercialmente que contienen reactivos anticoagulantes, se siguen las pautas médicas estándar para flebotomía. Los reactivos anticoagulantes que se usan incluyen heparina, citrato de sodio y/o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Después de la extracción de sangre, todas las etapas se realizan según las prácticas clínicas estándar para una técnica aséptica.

Aislamiento de poblaciones celulares apropiadas a partir de una muestra de sangre: Hebbel y sus colegas describieron en detalle los procedimientos para aislar y cultivar células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOEC) (Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A. & Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest 105, 71-77 (2000)). Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se purifican a partir de muestras de sangre completa mediante centrifugación diferencial mediante el uso de reactivos de separación basados en medios de densidad. Los ejemplos de dichos reactivos de separación incluyen Histopaque-1077, Ficoll-Paque, Ficoll-Hypaque y Percoll. A partir de estas PBMC pueden aislarse múltiples poblaciones de células, que incluye las BOEC. Las PBMC se resuspenden en medio EGM-2 sin procedimientos adicionales de enriquecimiento de subpoblaciones celulares y se colocan en 1 pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta con colágeno tipo I. Esta mezcla se incuba a 37 °C en un ambiente humidificado con 5 % de CO2. El medio de cultivo se cambia diariamente. Después de 24 horas, las células y los restos desprendidos se eliminan mediante el lavado con medio. Este procedimiento deja aproximadamente 20 células endoteliales adheridas más entre 100-200 otras células mononucleares. Estas células mononucleares no endoteliales mueren dentro de las primeras 2-3 semanas de cultivo.

Cultivo celular para el crecimiento de una población de células diana: Las células BOEC se establecen en cultivo durante 4 semanas con cambios diarios de medio pero sin pases. El primer pase ocurre a las 4 semanas, después de una expansión de aproximadamente 100 veces. En la siguiente etapa, se usa tripsina al 0,025 % para pasar células y placas de cultivo de tejidos recubiertas con colágeno I como sustrato. Después de este establecimiento inicial de 4 semanas de las células en cultivo, las BOEC se pasan nuevamente 4 días después (día 32) y 4 días después (día 36), después de lo cual las células deberían sumar 1 millón de células o más.

Modificación génica in vitro: Para afectar la modificación génica en BOEC, las células se transfectan con 0,1-10 microgramos por millón de células de un vector que codifica una nucleasa Cas9, un ácido nucleico molde y un ARN guía que codifica ARNcr que comprende la secuencia codificante GGACCUCGUCUUCGCCCGGCGCC (SEQ ID NO:1) que se dirige al codón 71 en el alelo HLA DRB1*04:01. La transfección se realiza mediante electroporación, transfección mediada por liposomas, transfección mediada por policationes, reactivos patentados para transfección disponibles comercialmente u otros métodos de transfección mediante el uso de protocolos estándar. Después de la transfección, las BOEC se cultivan como se describió anteriormente durante tres días.

Selección de clones con modificación génica: Mediante el uso del método de dilución en serie limitante, las BOEC modificadas se distribuyen en subcultivos clonales y se cultivan como se describió anteriormente. Las células se examinan diariamente para determinar qué subcultivos contienen clones únicos. Tras el crecimiento de los subcultivos hasta una densidad de >100 células por subcultivo, las células se tripsinizan, se resuspenden en medio y se usa un volumen de 1/10 de las células para la PCR de colonias. Las 9/10 células restantes se devuelven al cultivo. Mediante el uso de cebadores que detectan genes DRB1 modificados productivamente, cada 1/10 de volumen de colonias se analiza mediante PCR para detectar modificaciones génicas productivas. Las colonias que exhiben una modificación productiva del gen DRB1 se cultivan adicionalmente para aumentar el número de células. Cada una de las colonias puede seleccionarse para cultivo adicional mediante detección de posibles mutaciones externas nocivas. Las colonias que presentan el menor número de mutaciones externas se seleccionan para su posterior cultivo.

Preparación de células para su introducción nuevamente en pacientes mediante condicionamiento y/o crecimiento: Antes de introducir nuevamente las células en los pacientes, las BOEC se expanden en cultivo para aumentar el número de células.

Inyección de BOEC con modificación de genes en pacientes: Las BOEC que se han seleccionado para inyección en pacientes se resuspenden en solución salina estéril a una dosis y concentración apropiadas para el peso y la edad del paciente. La administración de la muestra de células se realiza como un autotrasplante de médula ósea mediante el uso de prácticas clínicas estándar.

Ejemplo 3

Diseño y análisis de Secuencias Guía para el Sistema CRISPR/Cas9

Los inventores usaron CRISPOR (crispor.tefor.net) para diseñar, evaluar y clonar secuencias guía para el sistema CRISPR/Cas9. La secuencia de HLA-DRB1*04:01 se analizó mediante el uso del genoma de Homo sapiens y un motivo adyacente protoseparador (PAM) específico para SpCas 9, donde la secuencia de 20 pares de bases de la guía debe seguirse con n Gg . Se identificaron múltiples secuencias guía con una puntuación de especificidad superior a 50, pero solo tres guías abarcaron la región diana de DRB1*04:01. Una guía tenía un alto contenido de GC y, por lo tanto, se eliminó, pero las otras dos secuencias de guía (185/inv y 208/dir) se seleccionaron para una evaluación adicional:

La Guía 185/inv tuvo una puntuación de especificidad de 70 con 142 errores previstos. La guía 208/dir tuvo una puntuación de especificidad de 68 con 252 errores previstos. Cada guía se clonó en el plásmido lentiCRISPR v2 (plásmido Addgene núm. 52961). Los plásmidos lentivirus v2 DRB1*04:01 185rev y 208dir (Figuras 1 y 2, respectivamente) se cultivaron, purificaron y secuenciaron para su verificación.

Se prepararon partículas lentivirales mediante el uso del reactivo de transfección TransIT-Lenti-LT-1 (Mirus). Brevemente, se sembraron células 293TN a 2,5 * 106 en 10 ml de DMEM sin antibióticos, FCS al 10 % y se incubaron a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se transfectaron (cuando las células tenían un 70 % de confluencia). El ADN plasmídico y el reactivo LT-1 se llevaron a temperatura ambiente y el medio OptiMEM se calentó a 37 °C. Se añadieron gota a gota 15 pl de reactivo LT-1 a 500 pl de OptiMEM en un tubo Eppendorf de 1,5 ml separado. El tubo se mezcló y se incubó durante 5 minutos. Las reacciones de transfección se configuraron en tubos eppendorf de 1,5 ml que contenían 2 pg de ADN lentivector, 3 pg de plásmido auxiliar psPAX2 (Addgene), 1,5 pg de plásmido auxiliar pMD2.G (Addgene) en un volumen final de 50 pl mediante el uso de OptiMEM. Los 50 pl que contenían ADN se añadieron al tubo LT-1 gota a gota, se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, el contenido del tubo se añadió gota a gota a la placa de 10 cm que contenía células 293TN. Las placas se agitaron para mezclarlas y se incubaron a 37 °C durante la noche en un recipiente de contención secundaria. Al día siguiente, se cambió el medio sin alterar las células y se reemplazó con medio nuevo. El día 4, se recogió el sobrenadante y se almacenaron alícuotas de 0,5 ml a -80 °C.

Se transdujeron células T2 que expresaban DRB1*04:01, *01:01, *08:01 o *04:02 con lentivirus mediante el uso de polibreno. Brevemente, 2 * 106 células T2 se sembraron en placas de 6 pocillos en 1 ml de medio. Se añadieron 200 pl de virus al pocillo con 12 pl de polibreno 100X. Las células se incubaron durante 6-10 horas y después se añadieron 3 ml de medio completo para llevar la concentración final de células a 0,5 x 106/ml. Al día siguiente, se añadió puromicina al cultivo a una concentración final de 1 pg/ml. Se cultivaron células resistentes a los antibióticos y se tiñeron con un anticuerpo anti-HLA-DR para buscar la pérdida de expresión de HLA debido a la edición CRISPR/Cas9 y la reparación de uniones de extremos no homólogas.

Se observó pérdida de expresión de HLA-DR en células T2-DRB1*04:01 transducidas con lentivirus 208/dir o 185/inv pero no en las líneas celulares de control. La línea celular DRB1*04:01 no transducida pasó de un 95 % de expresión de HLA-DR a un 20 % o 12 % después de la transducción de lentivirus con la guía 208/dir o la guía 185/inv, respectivamente. Las líneas celulares que expresan T2-DRB1*04:02 y T2-DRB1*08:01 no mostraron pérdida de expresión de HLA-DR, lo que demuestra la especificidad de los ARN guía analizados. También se observó pérdida de expresión de HLA-DR en las células T2-DRB1*01:01 (94 % a 71 % o 23,5 % para 208/dir o 185/inv, respectivamente). Esto era esperado porque DRB1*01:01 tiene solo una diferencia de nucleótidos (en la posición 71) en comparación con DRB1*04:01 en esta región. Por lo tanto, los ARN guía diseñados para DRB1*04:01 también fueron capaces de dirigirse a DRB1*01:01. El alelo DRB1*01:01 también está asociado con la susceptibilidad a la RA.

Se usó citometría de flujo para clasificar la población de células que habían perdido la expresión de HLA-DR. Se preparó y secuenció<a>D<n>genómico a partir de esta población de células tanto para DRB1*04:01 como para DRB1*01:01. La pérdida de expresión se confirmó a nivel de ADN como eliminaciones o inserciones de nucleótidos que provocaron que el gen estuviera fuera de marco y dejara de expresarse. También se secuenciaron las líneas celulares de control DRB1*04:02 y DRB1*08:01 que habían recibido lentivirus CRISPR pero que no mostraron pérdida de expresión de HLA-DR. No se encontraron cambios en la secuencia de ADN, lo que indica que las secuencias de ARN guía son específicas y no causaron la edición Cas9 de DRB1*04:02 o DRB1*08:01.

Ejemplo 4

Expresión HLA-DR después de la edición CRISPR/Cas9

Se usó nucleofección (Lonza) para introducir los ARN guía 208/dir o guía 185/inv y la proteína Cas 9 en líneas celulares. Los ARN guía sintéticos para 208/dir y 185/inv se adquirieron de Synthego. Cada guía más la proteína Synthego Cas9-2NLS se mezcló para formar complejos RNP Cas9:ARNgu en una relación de 1:5,25. Los complejos RNP se nucleofectaron en líneas celulares T2-DRB1*04:01 para evaluar la eficiencia de la edición. Las células no transfectadas (Figura 3A) y el ARNgu codificado (Figura 3B) se analizaron como controles negativos.

La pérdida de expresión de HLA-DR se observó en las células que recibieron las RNP 208/dir:Cas9 (Figura 3C) o las RNP 185/inv:Cas9 (Figura 3D). Las células que recibieron el ARNgu de control negativo no mostraron pérdida de expresión de HLA-DR (Figura 3b ). Adicionalmente, la nucleofección de líneas celulares T2 que expresan DRB1*04:02 y DRB1*08:01 no mostró pérdida de expresión de HLA-DR. Las células T2-DRB1*01:01 mostraron cierta pérdida de expresión de HLA-DR, pero en menor grado que lo observado con la transducción de lentivirus.

Ejemplo 5

Ratones transgénicos

Los inventores también han desarrollado un ratón transgénico que expresa sólo HLA-DRB1*04:01K71E humano para comparar las respuestas de las células T específicas de antígeno a los péptidos artritogénicos en ratones transgénicos HLA-DRB1*04:01 frente a los ratones transgénicos HLA-DRB1*04:01K71E. Estos ratones se usan para demostrar que la mayor susceptibilidad a la RA en individuos que expresan DRp1*04:01 se debe a la presencia de K71, que promueve la unión de péptidos citrulinados y colágeno al interferir con la unión de péptidos nativos. Por lo tanto, los ratones transgénicos que expresan DRp1*04:01K71E no generará respuestas fuertes de células T a los péptidos citrulinados y al colágeno. Este ratón también demuestra que las células madre de ratones trasplantados DRB1*04:01K71E a ratones HLA-DRB1*04:01 no causan la enfermedad de injerto contra huésped.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un métodoex vivopara producir una célula hematopoyética modificada que comprende:

a) introducir en una célula madre/progenitora hematopoyética (HSC) un ácido nucleico molde que comprende al menos una porción de un alelo HLA-DRB1 *04:01, que incluye el codón 71; en donde la secuencia de ácido nucleico del codón 71 del ácido nucleico molde codifica el ácido glutámico, y en donde la célula madre/progenitora hematopoyética comprende un alelo HLA-DRB1 *04:01 genómico que codifica lisina en el codón 71 que está sustituido con el ácido nucleico molde;

b) sustituir al menos el codón 71 del ácido nucleico molde por el codón 71 que codifica lisina en el alelo HLA-DRB1 *04:01 genómico.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula hematopoyética modificada se selecciona de una célula humana, una célula sanguínea primaria, una población de células sanguíneas y una célula madre/progenitora hematopoyética (HSC).

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la célula hematopoyética modificada se selecciona del grupo que consiste en una célula sanguínea circulante, una célula sanguínea movilizada, una célula de médula ósea, una célula progenitora mieloide, una célula progenitora multipotente y una célula progenitora de linaje restringido.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que incluye además introducir una molécula Cas9 y una molécula de ARN guía que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de CGGCCCGCTTCTGCTCCAGG (SEQ ID NO:2), y

CCTGGAGCAGAAGCGGGCCG (SEQ ID NO:3) en las células.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el ácido nucleico molde comprende una secuencia de nucleótidos del alelo HLA-DRB1*04:01 que comprende una mutación puntual de A a G en el codón 71.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la molécula de ARN guía y el polipéptido Cas9 se introducen en la HSC como un complejo de ribonucleótido formado previamente.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la molécula Cas9 se introduce en la HSC como un ácido nucleico que codifica una proteína Cas9.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el ARN guía se introduce en la HSC como un ácido nucleico que codifica el ARN guía, y en donde la proteína Cas9 se introduce en la HSC como un ácido nucleico que codifica la proteína Cas9, y en donde la célula expresa el ARN guía y la proteína Cas9.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el ARN guía, la proteína Cas9 y el ácido nucleico molde se introducen en la HSC dentro de un virus adenoasociado (AAV) o un lentivirus de integración deficiente (ILDV).

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además expandir las HSC ex vivo después de las etapas de introducción para formar una población aislada de células que comprenden el alelo HLA-DRB1 que codifica el ácido glutámico en el codón 71 en el genoma de la célula.

11. Un vector que comprende un polinucleótido que codifica una endonucleasa Cas9 y un ARN guía que media la unión de la endonucleasa Cas9 a un gen HLA-DRB1, en donde el vector se selecciona de un vector de adenovirus, un vector lentiviral de integración deficiente (IDLV) y un vector espumoviral de integración deficiente (IDFV).

12. Una célula para tratar o evitar la artritis reumatoide en un sujeto que lo necesita, que comprende:

un ácido nucleico molde que comprende al menos una porción de un alelo HLA-DRB1 *04:01, que incluye el codón 71;

en donde la secuencia de ácido nucleico del codón 71 de la secuencia de ácido nucleico molde codifica ácido glutámico, y

en donde la célula del sujeto comprende un alelo HLA-DRB1 *04:01 genómico que codifica lisina en el codón 71.

13. La célula de acuerdo con la reivindicación 12, que incluye además un ARN guía, una proteína Cas 9 y un ácido nucleico molde, en donde el ARN guía, la proteína Cas 9 y el ácido nucleico molde se introducen en una célula madre/progenitora hematopoyética mediante transducción viral.

14. La célula de acuerdo con la reivindicación 12, que incluye además un ARN guía, una proteína Cas 9 y un ácido nucleico molde, en donde el ARN guía, la proteína Cas 9 y el ácido nucleico molde se introducen ex vivo en una célula madre/progenitora hematopoyética que se ha aislado del sujeto.

15. Una composición para tratar o evitar la artritis reumatoide en un sujeto que lo necesita, dicha composición comprende: una célula hematopoyética, la célula hematopoyética comprende un alelo HLA-DRB1 *04:01 genómico modificado, en donde el codón 71 del alelo HLA-DRB1 *04:01 genómico modificado codifica el ácido glutámico.