ES2981765T3 - Agentes pangenotípicos contra el virus de la influenza y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para inhibir el virus de la influenza A en una muestra. Los aspectos de los métodos incluyen poner en contacto una muestra que comprende ARN viral (ARNv) que tiene un motivo PSL2 con una cantidad eficaz de un agente que se une específicamente al motivo PSL2 para inhibir el virus de la influenza A. También se proporcionan métodos para tratar o prevenir la infección por el virus de la influenza A en un sujeto. También se proporcionan métodos para examinar un agente candidato en cuanto a la capacidad de inhibir el virus de la influenza A en una célula, comprendiendo el método: poner en contacto una muestra con un agente candidato; y determinar si el agente candidato se une específicamente al motivo PSL2 del ARNv. También se proporcionan compuestos y composiciones farmacéuticas que comprenden una secuencia de oligonucleótidos complementaria a una región de ARNv PB2 que encuentran uso en los métodos objeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agentes pangenotípicos contra el virus de la influenza y métodos de uso de los mismos

INTRODUCCIÓN

El virus de la influenza A (IAV) e un virus de ARN segmentado que causa una morbilidad y una mortalidad significativas en todo el mundo. Todos los fármacos antivirales de IAV aprobados actualmente están dirigidos a las proteínas virales, tienen subtipos limitados y se enfrentan al aumento de resistencia antiviral contra todos los miembros de la clase de fármacos.

El genoma del IAV consta de ocho segmentos de ARN viral en sentido negativo (ARNv) monocatenario que codifican un mínimo de 14 proteínas virales conocidas. El ARNv junto con la nucleoproteína (NP) y el complejo polimerasa heterotrimérico, que consta de las proteínas PB2, PB1 y Pa , forma la ribonucleoproteína viral completa (vRNP). Para ser completamente infecciosos, los viriones IAV deben incorporar al menos uno de los vRNP de cada segmento. Cada vRNP interacciona con al menos otro asociado para formar un complejo supramolecular mantenido probablemente por interacciones ARN-ARN intersegmento y/o proteína-ARN hipotetizadas para guiar el proceso de empaquetamiento. SIMONE GIANNECCHINI et al. 2016, ARCHIVES OF VIROLOGY, 154: 821-832, describen oligonucleótidos de fosforotioato (S-ON) derivados de las señales de empaquetamiento en los extremos 3' y 5' del ARN de PB2 viral que se probaron contra el virus de la influenza in vitro. Un S-ON 15-mero derivado del extremo 5' del ARN de PB2 viral, complementario al extremo 3' de su región codificante y designado 5-15b era inhibidor.

RESUMEN

Los aspectos de la presente divulgación proporcionan composiciones pangenotípicas diseñadas para interrumpir un elemento estructural de ARN de IAV, llamado empaquetamiento tallo-bucle 2 (PSL2), dentro de la región de señal de empaquetamiento 5' del segmento de genoma PB2. La interrupción de la estructura PSL2 inhibe drásticamente la IAV. En todos los subtipos de influenza A analizados se conserva PSL2.

La presente invención proporciona un compuesto de oligonucleótido o una sal del mismo, que comprende una secuencia de oligonucleótidos que comprende al menos 8 subunidades de nucleósidos complementarias a una región de un motivo de empaquetamiento tallo bucle 2 (PSL2) de un ARN viral de PB2 (ARNv), en donde el compuesto de oligonucleótido inhibe la producción de virus y en donde la secuencia de oligonucleótidos comprende uno o más nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), y en donde el oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada a partir de:

LNA 9: 5' TACTtactgacaGCC 3' (SEQ ID NO:75);

LNA 8: 5' AGACacgaccaAAAG 3' (SEQ ID NO:74);

LNA14: 5'CGACcaaaagaATTC 3' (SEQ ID NO:81);

LNA 6: 5' CagaCaCGaCCaaAA 3' (SEQ ID NO:72); y

LNA 7: 5' TAcTtaCTgaCagCC 3' (SEQ ID NO:73);

en donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN. Se proporcionan métodos para inhibir el virus de la influenza A en una muestra. Algunos aspectos de los métodos incluyen la puesta en contacto de una muestra que comprende ARN viral (ARNv) que tienen un motivo PSL2 con una cantidad efectiva del compuesto de oligonucleótido mencionado anteriormente que se une específicamente al motivo PSL2 para inhibir el virus de la influenza A. En algunos casos, el ARNv se aísla a partir de un virión o una célula. En algunos casos, el ARNv es un virión. En algunos casos, el ARNv es una célula infectada. También se proporcionan los compuestos de oligonucleótido que se unen específicamente al motivo PSL2 para inhibir el virus de la influenza A para uso en un métodoin vivode inhibición del virus de la influenza A, comprendiendo el método la puesta en contacto de una muestra que comprende ARN viral (ARNv) que tiene un motivo PSL2 con una cantidad efectiva del compuesto de oligonucleótido. También se divulgan métodos de cribado de la capacidad de inhibir el virus de la influenza A en una célula de un agente candidato, comprendiendo el método: puesta en contacto de una muestra con un agente candidato; y determinar si el agente candidato se une específicamente al motivo PSL2 de ARNv. También se proporcionan compuestos y composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos mencionados anteriormente que se utilizan en los métodos en cuestión.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

El artesano experto entenderá que los dibujos descritos a continuación s tienen solo fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.

LaFIG. 1A-FIG. 1Frepresenta estructuras secundarias de ARN de PB2 de tipo salvaje(SEQ ID NO: 1) y ARNv mutantes de empaquetamiento, PB2m757 (SEQ ID NO: 2), m745 (SEQ iD NO: 3), pandémica de 1918 (H1N1) (SEQ ID NO: 4), aviar de ruta alta (H5M=N1) (SEQ ID NO: 5) y porcina de 2009 (H1N1) (SEQ ID NO: 6).

LaFIG. 2,paneles A y B, representa la reactividad de ARNv de PB2 de longitud completa.

LaFIG.3A-FIG.3Erepresenta la interrupción de la reactividad de tipo salvaje (SEQ ID NO: 7) por mutaciones de empaquetamiento defectuoso, PB2m744b (SEQ ID NO: 8), PB2m745 (SeQ ID NO: 9), PB2m55c (SEQ ID NO: 10) y PB2m757 (SEQ ID NO: 11).

LaFIG. 4representa la conservación de la secuencia de nucleótidos que contiene la estructura PSL2. LaFIG.5A-FIG. 5Drepresenta el análisis en 2 dimensiones de mutación y mapeo de la estructura secundaria de ARN PSL2 (FIG. 5C, SEQ ID NO: 12).

LaFIG. 6,paneles A-B, representa el diseño de mutaciones compensatorias a mutantes PB2 de PR8 descritos previamente (panel A, SEQ ID NO: 13).

LaFIG. 7,paneles A-D, representa la mutación sinónima de codones individuales altamente conservados de ARNv de PB2 de PR8 (panel A, SEQ ID NOs: 14-15; panel B, SEQ ID NOs: 16-23 de arriba a abajo).

LaFIG. 8representa una tabla que muestra la nomenclatura del mutante de empaquetamiento de PB2 y los correspondientes sitios de mutación.

LaFIG. 9A-FIG. 9Crepresenta el efecto de la mutación sinónima en la estructura PSL2, PB2m731 (SEQ ID NO: 24), PB2m751 (SEQ ID NO: 25) y PB2m748 (SEQ ID NO: 26).

LaFIG. 10,paneles A-I, representa el efecto de mutaciones compensatorias en mutantes de empaquetamiento defectuoso de PR8 PB2 sobre el empaquetamiento viral y el título.

LaFIG. 11paneles A-D, representa el mapeo químico multidimensional de asociados mutantes de empaquetamiento defectuoso de PB2 y compensatorios (panel B, SEQ ID NO: 27).

LaFIG. 12,paneles a-t, representa el análisis en 2 dimensiones de mutación-mapeo-rescate.

LaFIG. 13representa el diseño de secuencias de cebadores para mutantes de 2 dimensiones de mutaciónmapeo-rescate. Las secuencias corresponden a SEQ ID NOs: 28-43, de arriba a abajo.

LaFIG. 14,paneles A-B, representa que los virus de empaquetamiento defectuoso se atenúanin vivo.LaFIG. 15,paneles A-D, representa la actividad antiviral de ácidos nucleicos bloqueados dirigidos a la estructura de ARN PSL2 (panel A, SEQ ID NO: 44).

LaFIG. 16A-FIG. 16Brepresenta análisis de la unión LNA-ARN.

LaFIG. 17,paneles A-B, muestra el porcentaje de supervivencia y la pérdida de peso de ratones a lo largo del tiempo después de la administración intranasal de una dosis única del compuesto ejemplar LNA9. LaFIG. 18,paneles A-D, muestra la susceptibilidad del virus de la influenza a oseltamivir después de pases seriados bajo presión farmacológica.

LaFIG. 19,paneles A-C, muestra la susceptibilidad del virus de la influenza al compuesto LNA9 ejemplar, incluyendo virus después de pases seriados bajo presión farmacológica y virus resistentes al fármaco.DEFINICIONES

Antes de describir las realizaciones ejemplares con mayor detalle se establecen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y el alcance de los términos utilizados en la descripción.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente alguien con habilidad ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) y Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y (1991) proporcionan al experto el significado general de muchos de los términos utilizados en el presente documento. Aun así, ciertos términos se definen a continuación en aras de la claridad y la facilidad de referencia.

Debe tenerse en cuenta que, tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Por ejemplo, el término "un cebador" se refiere a uno o más cebadores, es decir, un único cebador y múltiples cebadores. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración tiene por objeto servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con el enunciado de elementos de reivindicación o el uso de una limitación "negativa".

El término "muestra", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material o una mezcla de materiales normalmente, aunque no necesariamente en forma fluida, que contiene uno o más componentes de interés.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de una sustancia

(por ejemplo un agente de interés) que produce algún efecto local o sistémico deseado. Las cantidades efectivas de agentes activos varían dependiendo de una variedad de factores que incluyen, entre otros, el peso y la edad del sujeto, la afección que se trata, la gravedad de la afección, la manera de administración y similares, y pueden determinarse fácilmente, por ejemplo, determinarse empíricamente utilizando datos como los proporcionados en la sección experimental a continuación.

El término "muestra", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un material o una mezcla de materiales normalmente, aunque no necesariamente en forma fluida, es decir, acuosa, que contiene uno o más componentes de interés. Las muestras se pueden derivar de una variedad de fuentes, como de una muestra biológica o un sólido, como un tejido o fluido aislado de un individuo, incluyendo, entre otros, por ejemplo plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, semen, líquido linfático, las secciones externas de la piel, vías respiratorias, intestinales y genitourinarias, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos y también muestras de constituyentes de cultivos celularesin vitro(incluyendo, entre otros, el medio condicionado resultante del crecimiento de células en medio de cultivo celular, células supuestamente infectadas por virus, células recombinantes y componentes celulares). Los componentes en una muestra se denominan "analitos" en el presente documento. En muchas realizaciones, la muestra es una muestra compleja que contiene al menos alrededor de 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x10 108, 109, 1010, 1011, 1012 o más especies de analito.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, por ejemplo la unión a antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpos de cadena simple; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión a antígeno, y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y aún es capaz de reticular el antígeno.

Los términos "polipéptido" y "proteína", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados o derivados química o bioquímicamente y polipéptidos con esqueletos peptídicos modificados. El término "proteína de fusión" o los equivalentes gramaticales del mismo se refiere a una proteína compuesta por una pluralidad de componentes polipeptídicos, que aunque no están unidos normalmente en su estado nativo, normalmente están unidos por sus respectivos extremos amino y carboxilo a través de un enlace peptídico para formar un único polipéptido continuo. Las proteínas de fusión pueden ser una combinación de dos, tres o incluso cuatro o más proteínas diferentes. El término polipéptido incluye proteínas de fusión, incluyendo, entre otras, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin residuos de metionina N-terminales; proteínas marcadas inmunológicamente; proteínas de fusión con asociados de fusión detectables, por ejemplo proteínas de fusión que incluyen como un asociado de fusión una proteína fluorescente, p-galactosidasa, luciferasa, etc.; y similares.

En general, los polipéptidos pueden ser de cualquier longitud, por ejemplo mayor que 2 aminoácidos, mayor que 4 aminoácidos, mayor que alrededor de 10 aminoácidos, mayor que alrededor de 20 aminoácidos, mayor que alrededor de 50 aminoácidos, mayor que alrededor de 100 aminoácidos, mayor que alrededor de 300 aminoácidos, normalmente hasta alrededor de 500 o 1000 o más aminoácidos. Los "péptidos" son generalmente mayores que 2 aminoácidos, mayores que 4 aminoácidos, mayores que alrededor de 10 aminoácidos, mayores que alrededor de 20 aminoácidos, normalmente hasta alrededor de 50 aminoácidos. En algunas realizaciones, los péptidos tienen una longitud entre 5 y

30 aminoácidos.

El término "unión específica" se refiere a la capacidad de un agente para unirse preferentemente a un objetivo particular (por ejemplo PSL2) que está presente en una mezcla homogénea de diferentes analitos. En algunos casos, una interacción de unión específica discriminará entre analitos deseables e indeseables en una muestra, por lo general

más de 10 a 100 veces o más (por ejemplo más de aproximadamente 1000 veces). En algunos casos, la afinidad entre un agente de interés y un analito (por ejemplo PSL2) cuando se unen específicamente en un complejo agente de captura/analito es al menos 10-8 M, al menos 10-9 M, normalmente hasta alrededor de 10-10 M. La unión específica puede incluir hibridación, interacciones polipéptido-ácido nucleico o interacciones polipéptido-ácido nucleico o interacciones molécula pequeña-ácido nucleico.

"Oligonucleótido" se refiere a polímeros de subunidades de nucleósido ribosa y/o desoxirribosa que tienen entre alrededor de 2 y alrededor de 200 subunidades contiguas. Las subunidades de nucleósido se pueden unir mediante una variedad de enlaces entre subunidades, incluyendo, entre otros, enlaces fosfodiéster, fosfotriéster, metilfosfonato, fosforamidato P3'^N5', fosforamidato N3'^P5', tiofosforamidato N3'^-P5' y fosforotioato. Además, los "oligonucleótidos" incluyen modificaciones, conocidas por un experto en la materia, del azúcar (por ejemplo sustituciones 2'), de la base (véase la definición de "nucleósido" a continuación), y los extremos 3' y 5'. En realizaciones en las que la fracción de oligonucleótido incluye una pluralidad de enlaces entre subunidades, cada enlace se puede formar utilizando la misma química o una mezcla de químicas de enlace. Los términos "oligonucleótido", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "fragmento de ácido nucleico", "secuencia o segmento de ácido nucleico" o "polinucleótido" se utilizan indistintamente y también se pueden utilizar indistintamente con genes, ADNc, ADN y ARN codificados por un gen.

Un "ácido nucleico bloqueado" (LNA) es un nucleótido de ARN modificado en el que la fracción de ribosa está modificada con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación 3'-endo, que se encuentra a menudo en los dúplex de forma A. Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con cualquier nucleótido conveniente o análogos de nucleótido, como residuos de ADN o ARN en un oligonucleótido cuando se desee. Los LNA se hibridan con ADN o ARN según las reglas de emparejamiento de Watson-Crick. Tales oligómeros se pueden sintetizar químicamente. En general, la conformación de la ribosa bloqueada potencia el apilamiento de bases y la preorganización de esqueleto para aumentar las propiedades de hibridación (temperatura de fusión) del oligonucleótido.

La divulgación abarca moléculas de ácido nucleico aisladas o sustancialmente purificadas y composiciones que contienen esas moléculas. En el contexto de la presente divulgación, una molécula de ADN o una molécula de ARN "aislada" o "purificada" es una molécula de ADN o una molécula de ARN que existe aparte de su entorno nativo y, por lo tanto, no es un producto de la naturaleza. Una molécula de ADN o una molécula de ARN aislada puede existir en una forma purificada o puede existir en un entorno no nativo como, por ejemplo, una célula huésped transgénica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está sustancialmente exenta de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En una realización, un ácido nucleico "aislado" está exento de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de alrededor de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Los fragmentos y las variantes de las secuencias de nucleótidos divulgadas se incluyen también en la presente divulgación. Por "fragmento" o "porción" se entiende una longitud completa o inferior a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos. Los siARN de la presente divulgación se pueden generar mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo mediante transcripciónin vitro,por vía recombinante o por medios sintéticos. En un ejemplo, los siARN se pueden generarin vitromediante uso de una enzima recombinante, como ARN polimerasa T7 y plantillas de oligonucleótidos de ADN.

Un "ARN interferente pequeño" o "interferente corto" o siARN es un dúplex de ARN de nucleótidos que se dirige a un interés genético. Un "dúplex de ARN" se refiere a la estructura formada por el emparejamiento complementario entre dos regiones de una molécula de ARN. El siARN está "dirigido" a un gen en el sentido de que la secuencia de nucleótidos de la porción dúplex del siARN es complementaria a una secuencia de nucleótidos del gen objetivo. En algunas realizaciones, la longitud del dúplex de siARN es menor que 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el dúplex puede tener una longitud de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la longitud del dúplex es 19 - 25 nucleótidos. La porción dúplex de ARN del siARN puede ser parte de una estructura de horquilla. Además de la porción dúplex, la estructura de horquilla puede contener una porción de bucle colocada entre las dos secuencias que forma el dúplex. El bucle puede variar en longitud. En algunas realizaciones, el bucle puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 nucleótidos. La estructura de horquilla también puede contener porciones salientes 3' o 5'. En algunas realizaciones, el saliente es un saliente 3' o 5' de 0, 1,2, 3, 4 o 5 nucleótidos de longitud.

El término "lípido" se utiliza ampliamente en el presente documento para abarcar sustancias que son solubles en disolventes orgánicos, pero escasamente solubles en agua, si es que lo son. El término lípidos incluye, entre otros, hidrocarburos, aceites, grasas (como ácidos grasos, glicéridos), esteroles, esteroides y formas derivadas de estos compuestos. Los lípidos preferentes son ácidos grasos o sus derivados, hidrocarburos y sus derivados y esteroles, como colesterol. Tal como se utiliza en el presente documento, el término lípido también incluye compuestos anfipáticos que contienen fracciones tanto lipídicas como hidrofílicas. Los ácidos grasos contienen normalmente números pares de átomos de carbono en una cadena lineal (comúnmente 12-24 carbonos) y pueden ser saturados o insaturados, y pueden contener o estar modificados para contener una variedad de grupos sustituyentes. Para simplificar, el término "ácido graso" también abarca derivados de ácidos grasos, como amidas grasas producidas por reacciones de conjugación, por ejemplo con un terminal modificado de un oligonucleótido.

A lo largo de la memoria descriptiva pueden aparecer otras definiciones de términos.

DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES EJEMPLARES

Antes de describir las diversas realizaciones, se debe entender que las enseñanzas de esta divulgación no están limitadas a las realizaciones particulares descritas y, por supuesto, pueden variar como tales. También se debe entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no tiene por objetivo ser limitante, ya que el alcance de las presentes enseñanzas estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas.

Los encabezados de sección utilizados en el presente documento tienen solo fines organizativos y no se deben interpretar como una limitación del tema descrito de ninguna manera. Si bien las presentes enseñanzas se describen en relación con diversas realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas se limiten a tales realizaciones. Por el contrario, las presentes enseñanzas abarcan diversas alternativas, modificaciones y equivalentes, como apreciarán los expertos en la materia.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente alguien con habilidad ordinarios en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento se puedan utilizar en la práctica o prueba de las presentes enseñanzas, ahora se describen algunos métodos y materiales ejemplares.

La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que las presentes reivindicaciones no tienen derecho a antedatar dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que se pueden confirmar de forma independiente.

Como será evidente para los expertos en la materia al leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene componentes discretos y características que pueden separarse o combinarse fácilmente con las características de cualquiera de las demás realizaciones sin apartarse del alcance de las presente enseñanzas. Cualquier método enunciado se puede llevar a cabo en el orden de los eventos enunciados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.

En la siguiente descripción, donde se hace referencia a la invención que abarca un método de tratamiento de una enfermedad utilizando un compuesto, se pretende que dichas referencias se interpreten como relativas al uso de dichos compuestos en dichos métodos para el tratamiento de dicha enfermedad.

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cuando las realizaciones descritas a continuación están fuera del alcance de las reivindicaciones adjuntas, dichas realizaciones sirven solo para ilustrar y poner en contexto la presente invención.

MÉTODOS PARA INHIBIR EL VIRUS DE LA INFLUENZA A

Como se ha resumido anteriormente, los aspectos de la presente divulgación incluyen composiciones pangenotípicas diseñadas para interrumpir un elemento estructural de ARN de IAV, llamado empaquetamiento tallo-bucle 2 (PSL2), dentro de la región de señal de empaquetamiento 5' del segmento de genoma PB2. Se entiende por "pangenotípico" que las composiciones son efectivas en una variedad de tipos diferentes de IAV donde se conserva el elemento estructural PSL2. En algunos casos, las composiciones en cuestión se pueden denominar de amplio espectro. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "amplio espectro" se refiere a la actividad antiviral de una única fracción que es activa contra dos o más virus diferentes, como tres o más, cuatro o más , cinco o más, seis o más, ocho o más, 10 o más virus diferentes. Los dos o más virus diferentes se pueden seleccionar a partir de diferentes subgrupos de virus (por ejemplo grupo 1 de influenza A o grupo 2 de influenza A) o se pueden seleccionar dentro del mismo grupo (por ejemplo dos o más de los virus de influenza A H1, H2, H5, H6, H8 y H9 grupo 1, o dos o más virus de influenza A H3, H4, H7 y H10 grupo 2).

La interrupción de la estructura PSL2 inhibe drásticamente la IAV. En todos los subtipos de influenza A analizados se conserva PSL2. La Figura 1, panel a, muestra un ejemplo de la estructura PSL2 que puede ser objetivo en los métodos en cuestión. La Figura 4 ilustra la conservación de secuencias de nucleótidos de interés que contienen la estructura PSL2. En algunos casos, las composiciones en cuestión tienen actividad de amplio espectro contra los IAV, como una actividad contra 2 o más IAV seleccionados a partir de H1N1, H3N2 y H5N.

Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos para inhibir el virus de la influenza A (IAV) en una muestra. En algunas realizaciones, el método incluye la puesta en contacto de una muestra que comprende ARN viral (ARNv) que tiene un motivo PSL2 con una cantidad efectiva de un agente que se une específicamente al motivo PSL2 para inhibir el virus de la influenza A. En algunos casos, la muestra esin vitro.En ciertos casos, la muestra esin vivo.El ARNv en la muestra puede estar comprendido en un virión. En algunos casos, el ARNv está comprendido en una célula, como una célula infectada con la partícula de virus.

Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos para inhibir el virus de la influenza A (IAV) en una célula. En algunas realizaciones, el método incluye la puesta en contacto de una célula que comprende ARN viral (ARNv) que tiene un motivo PSL2 con una cantidad efectiva de un agente que se une específicamente al motivo PSL2 para inhibir el virus de la influenza A. En algunos casos, la célula esin vitro.En ciertos casos, la célula esin vivo.

En algunas realizaciones, el ARNv en la muestra (por ejemplo célula) comprende ARNv de PB2. Tal como se utiliza en el presente documento, por "ARNv de PB2" se entiende ARN viral (por ejemplo ARN de IAV) que incluye el elemento estructural de ARN conservado llamado empaquetamiento tallo-bucle 2 (PSL2). El agente se puede unir a sitios particulares del motivo PSL2 para interrumpir la estructura general del ARNv inhibiendo el virus de este modo (véase, por ejemplo, la Figura 14). Por ejemplo, la Figura 1 ilustra estructuras secundarias de ARN de PB2 de tipo salvaje y ARNv mutantes de empaquetamiento.

En algunas realizaciones, la puesta en contacto de la muestra (por ejemplo célula) con un agente da lugar al menos a 2 log<10>déficits de título del virus, como al menos 2,5, al menos 3, al menos 3,5, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 log<10>déficits de título del virus. En algunas realizaciones, el agente es un compuesto de oligonucleótido (por ejemplo como se describe en el presente documento) que comprende una secuencia complementaria a un motivo PSL2 del ARNv o una sal del mismo.

En algunos casos de los métodos, la unión (por ejemplo a través de hibridación) del compuesto de oligonucleótido (por ejemplo una de las secuencias descritas anteriormente) a la región de ARNv de PB2 interrumpe la estructura general de ARN secundario del ARNv de PB2. En algunos casos, el compuesto en cuestión se dirige al menos a parte de la región definida por nucleótidos 34-87 en la notación en sentido (-) de la región codificante 5' terminal del ARNv de PB2. En algunos casos, el compuesto en cuestión se dirige al menos a parte de la región definida por nucleótidos 1-14 en la notación en sentido (-) de la región codificante 5' terminal del ARNv de PB2. En algunos casos de los métodos, el método incluye además el reclutamiento de una RNasa al PSL2 para degradar el ARNv.

Los aspectos de la presente divulgación incluyen un método de tratamiento o prevención del virus de la influenza A en un sujeto. En algunas realizaciones, el método comprende la administración a un sujeto que lo necesite de una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un agente activo que se une específicamente a un motivo PSL2 de un ARN viral (ARNv) (por ejemplo como se describe en el presente documento). Como tal, en algunos casos, el sujeto es alguien que ha sido infectado con el virus. En ciertos casos, el sujeto es alguien que está en riesgo de ser infectado o se sospecha que ha sido infectado con el virus. En algunas realizaciones, el ARNv es un ARNv de PB2.

Se puede emplear cualquier protocolo conveniente para la administración del agente a un sujeto. El protocolo particular que se emplea puede variar, por ejemplo, dependiendo del sitio de administración y de que los agentes sean, por ejemplo, oligonucleótidos, anticuerpos, proteínas, péptidos o moléculas pequeñas. Para protocolosin vivose puede emplear cualquier administración conveniente. Dependiendo de la identidad y la afinidad de unión del agente, la respuesta deseada, la manera de administración, por ejemplo local o sistémica, intraocular, periocular, retrobalbar, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, subconjuntiva, intranasal, tópica, colirios, i.v. s.c., i.p., oral y similares, la vida media, el número de células o el tamaño del lecho de injerto o tejido trasplantado, se pueden emplear varios protocolos.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen los agentes en cuestión. En las composiciones se puede utilizar cualquier excipiente, portador, etc. Los portadores farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las composiciones pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones y emulsiones. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, aceites de Ringer lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. La composición del agente también puede estar liofilizada para su posterior reconstitución y uso. La composición también puede incluir un portador como se describe anteriormente. Los ejemplos de portadores que se pueden utilizar incluyen, entre otros, alumbre, micropartículas, liposomas y nanopartículas. Se puede incluir cualquier aditivo conveniente en las composiciones en cuestión para potenciar el suministro del agente activo en cuestión. Los aditivos de interés incluyen potenciadores de la absorción celular, proteínas portadoras, lípidos, portadores dendrímeros, carbohidratos y similares.

En algunos casos, la composición farmacéutica incluye además uno o más agentes activos adicionales. Los agentes activos de interés incluyen un compuesto de oligonucleótido adicional de la presente divulgación y cualquier compuesto o fármaco antiviral de interés conveniente, incluyendo, entre otros, amantadina, rimantadina, zanamivir, oseltamivir, peramivir y similares.

Agentes

Los compuestos de oligonucleótido definidos en la reivindicación 1 se utilizan como agentes del objetivo de interés (por ejemplo PSL2) en los métodos y composiciones en cuestión.

Compuestos de oligonucleótidos

El agente es un oligonucleótido o derivado del mismo o una sal del mismo (por ejemplo una sal farmacéuticamente aceptable). El oligonucleótido es complementario a un segmento particular del motivo PSL2 (por ejemplo como se describe en el presente documento), que comprende al menos 8 subunidades de nucleósido complementarias a una región de un empaquetamiento tallo bucle 2 (PSL2) de un ARN viral (ARNv) de PB2.

En algunos casos, el agente es un compuesto de oligonucleótido que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20 subunidades de nucleósido complementarias a un motivo PSL2 de un ARNv o una sal del mismo. En ciertas realizaciones, uno o más de los enlaces de oligonucleótido se seleccionan a partir de los enlaces metilfosfonato, fosforamidato P3'^N5', fosforamidato N3'^P5', tiofosforamidato N3'^P5', fosforoditioato y fosforotioato. La secuencia de oligonucleótidos incluye uno o más nucleótidos de ácido nucleico bloqueado, como 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más o incluso más.

En algunas realizaciones, el agente es un oligonucleótido que comprende al menos 7 unidades de desoxirribonucleótido (por ejemplo unidades complementarias a un motivo PSL2) (por ejemplo al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20) y es capaz de reclutar una RNasa. En algunos casos, el oligonucleótido recluta una RNasa para catalizar la degradación del ARNv objetivo en componentes más pequeños. Cualquier método y fracción conveniente para reclutar una RNasa se puede incorporar en los agentes en cuestión (por ejemplo oligonucleótidos). En algunos casos, el agente oligonucleótido incluye además una secuencia que recluta una RNasa de interés. Se entiende que, a menos que se indique lo contrario, una secuencia de oligonucleótidos como se describe en el presente documento incluye secuencias de ADN, secuencias de ARN (por ejemplo donde U puede reemplazar T opcionalmente), secuencias de ARN/ADN mixtas y análogos de las mismas, incluyendo análogos donde uno o más nucleótidos de la secuencia son nucleótidos modificados, como análogos de LNA, y/o análogos donde uno o más enlaces internucleósido están reemplazados, por ejemplo, por un enlace no natural como un enlace fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato o tiofosforamidato.

En algunos casos, la unión (por ejemplo a través de hibridación) del compuesto de oligonucleótido (por ejemplo una de las secuencias descritas anteriormente) a la región de ARNv de PB2 interrumpe la estructura general de ARN secundario del ARNv de PB2.

Las secuencias de oligonucleótido pueden incluir cualquier número conveniente de nucleótidos de ADN, ARN y LNA. En algunos casos de las secuencias de oligonucleótidos descritas en el presente documento, la secuencia es una secuencia de ARN/ADN mixta. En algunos casos de las secuencias de oligonucleótidos descritas en el presente documento, la secuencia es una secuencia de LNA/ADN mixta. En algunos casos de las secuencias de oligonucleótidos descritas en el presente documento, la secuencia es una secuencia de LNA/ARN mixta. En algunos casos de las secuencias de oligonucleótidos descritas en el presente documento, la secuencia incluye solo nucleótidos de LNA. En algunos casos de las secuencias de oligonucleótidos descritas en el presente documento, la secuencia incluye solo nucleótidos de ADN. En algunos casos de las secuencias de oligonucleótidos descritas en el presente documento, la secuencia incluye solo nucleótidos de ARN.

En ciertos casos, el oligonucleótido en cuestión tiene una de las siguientes disposiciones de tipos de nucleótido en la secuencia (por ejemplo una de SEQ ID NOs:45-66):

A-B-A, donde B es una secuencia de 6-8 nucleótidos de ADN y cada A es una secuencia de 3-4 nucleótidos de LNA;

A-B-A, donde B es una secuencia de 7-8 nucleótidos de ADN y cada A es una secuencia de 4 nucleótidos de LNA;

L-D-L-D-L-D-L-D-L, donde cada L es una secuencia de 1 -2 nucleótidos de LNA y cada D es una secuencia de 1-3 nucleótidos de ADN; y

L-D-L-D-L-D-L-D-L, donde cada L es una secuencia de 1 -2 nucleótidos de LNA y cada D es una secuencia de 1 -2 nucleótidos de ADN.

Las secuencias de oligonucleótidos en cuestión pueden incluir además uno o más enlaces internucleósido modificados, como enlaces fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato y/o tiofosforamidato. En cualquier posición conveniente de la secuencia del oligonucleótido en cuestión se puede incluir un internucleósido no natural.

El oligonucleótido tiene una de las siguientes secuencias donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN (es decir, unidades desoxirribonucleótido):

LNA 9: 5' TACTtactgacaGCC 3' (SEQ ID NO:75);

LNA 8: 5' AGACacgaccaAAAG 3' (SEQ ID NO:74);

LNA14: 5'CGACcaaaagaATTC 3' (SEQ ID NO:81);

LNA 6: 5' CagaCaCGaCCaaAA 3' (SEQ ID NO:72); y

LNA 7: 5' TAcTtaCTgaCagCC 3' (SEQ ID NO:73).

La presente divulgación también abarca secuencias mutantes de las secuencias de oligonucleótidos descritas anteriormente. Se entiende que en cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento 1,2, 3, 4 o más de los nucleótidos pueden mutarse para proporcionar una propiedad deseable, como actividad de inhibición potenciada, conjugación a un agente modificante, etc.

En algunos casos, cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento (por ejemplo una de SEQ ID NO: 45-96) está comprendida en una secuencia más larga, por ejemplo incluye nucleótidos 5' y/o 3' adicionales. En ciertos casos, el oligonucleótido en cuestión tiene una longitud de 30 nucleótidos o menos, como una longitud de 25 o menos, 20 o menos, 19 o menos, 18 o menos, 17 o menos, 16 o menos, 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos o 10 nucleótidos o menos.

En algunos casos, el compuesto de oligonucleótido en cuestión comprende una secuencia que tiene una deleción relativa a una de las secuencias descritas en el presente documento (por ejemplo una de SEQ ID NO: 45- 96). Por ejemplo, una secuencia donde se suprimen 1,2 o 3 nucleótidos del terminal 5' y/o 3' de la secuencia, por ejemplo uno de SEQ ID NOs: 45- 96. En algunos casos, a la secuencia de deleción le falta un nucleótido del terminal 5' de uno de SEQ ID NOs: 45- 96. En algunos casos, a la secuencia de deleción le falta un nucleótido del terminal 3' de uno de SEQ ID NOs: 45- 96. En algunos casos, a la secuencia de deleción le faltan dos nucleótidos del terminal 5' de uno de SEQ ID NOs: 45- 96. En algunos casos, a la secuencia de deleción le faltan dos nucleótidos del terminal 3' de uno de SEQ ID NOs: 45- 96.

En ciertos casos, la secuencia de oligonucleótidos puede incluir una mutación diseñada para cubrir polimorfismos de nucleótido único (SNP) en una secuencia de PLS2 objetivo. En algunos casos, el oligonucleótido es una versión modificada de LNA9 con sitios de mutación única que protegen contra secuencias objetivo de PLS2 que contienen un cambio de nucleótido con la secuencia objetivo de LNA9. Se entiende que las mutaciones de SNP de interés se pueden aplicar a cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento. Las secuencias mutadas de interés incluyen, entre otras, las siguientes:

5' TACTTACTGACAGTC 3'(SEQ ID NO:91);

5' TACTTACCGACAGCC 3'(SEQ ID NO:92); y

5' GGATTTCGGATGGCCA 3'(SEQ ID NO:93).

En ciertos casos, el oligonucleótido tiene una de las siguientes secuencias donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN:

LNA9.G74C: 5' TACTtactgacaGTC 3'(SEQ ID NO:94);

LNA9.T80C: 5' TACTtaccgacaGCC 3'(SEQ ID NO:95); y

LNA19.U56C: 5' GGATttcggatggCCA 3'(SEQ ID NO:96).

En ciertos casos, el oligonucleótido tiene una longitud máxima que corresponde a la región particular de la estructura PSL2 (por ejemplo una subregión correspondiente a los nucleótidos 34-87). En ciertos casos, el oligonucleótido tiene una longitud de 20 nucleótidos o menos, como una longitud de 15 nucleótidos o menos, 14 nucleótidos o menos, 13 nucleótidos o menos, 12 nucleótidos o menos, 11 nucleótidos o menos, 10 nucleótidos o menos, 9 nucleótidos o menos, 8 nucleótidos o menos, 7 nucleótidos o menos, o incluso menos.

Los oligonucleótidos se pueden sintetizar químicamente mediante métodos conocidos en la técnica (véase Wagneret al.(1993),supra,y Milliganet al., supra.)Los oligonucleótidos pueden estar modificados químicamente a partir de la estructura de fosfodiéster nativa para aumentar su estabilidad intracelular y su afinidad de enlace. En la bibliografía se han descrito varias modificaciones de este tipo, que alteran la química del esqueleto, los azúcares o las bases heterocíclicas.

Entre los cambios útiles en la química del esqueleto se encuentran fosforotioatos; fosforoditioatos, donde ambos de los oxígenos no puenteantes están sustituidos por azufre; fosforoamiditas; fosfotriésteres de alquilo y boranofosfatos. Los derivados de fosfato aquiral incluyen 3'-O'-5'-S-fosforotioato, 3'-S-5'-O-fosforotioato, 3'-CH2-5'-O-fosfonato, 3'-NH-5'-O-fosforoamidato y tiofosforamidatos. Los ácidos nucleicos peptídicos reemplazan todo el esqueleto de fosfodiéster de ribosa por un enlace peptídico. Las modificaciones de azúcar también se utilizan para potenciar estabilidad y afinidad. Se puede utilizar el a-anómero de desoxirribosa, donde la base está invertida con respecto al p-anómero natural. El 2'-OH del azúcar ribosa se puede alterar para formar azúcares de 2'-O-metilo o 2'-O-alilo, que proporcionan resistencia a la degradación sin afectar a la afinidad. La modificación de las bases heterocíclicas debe mantener un emparejamiento de bases apropiado. Algunas sustituciones útiles incluyen desoxitimidina; 5-metil-2'-desoxicitidina y 5-bromo-2'-desoxicitidina para desoxicitidina. Se ha demostrado que 5- propinil-2'-desoxiuridina y 5-propinil-2'-desoxicitidina aumentan la afinidad y la actividad biológica cuando se sustituyen por desoxitimidina y desoxicitidina respectivamente.

Los agentes oligonucleótidos se pueden derivatizar con cualquier agente modificante conveniente, por ejemplo mediante conjugación del agente modificante con el terminal 5’ y/o 3’ de la secuencia de oligonucleótidos. En algunos casos, el agente modificante es una fracción que potencia la absorción celular (por ejemplo un lípido). Cualquier lípido conveniente se puede conjugar con los oligonucleótidos en cuestión. En algunos casos, el agente modificante es un ácido graso, conectado al terminal 5' o 3' a través de un engarce opcional. El grupo lipídico puede ser un hidrocarburo alifático o ácido graso, incluyendo, entre otros, derivados de hidrocarburos y ácidos grasos, siendo ejemplos los compuestos saturados de cadena lineal que tienen 14-20 carbonos, como ácido mirístico (tetradecanoico), ácido palmítico (hexadecanoico) y ácido esteárico (octadecanoico) y sus correspondientes formas de hidrocarburo alifático, tetradecano, hexadecano y octadecano. Son ejemplos de otros grupos lipídicos adecuados que pueden emplearse los esteroles, como colesterol, y los ácidos grasos e hidrocarburos sustituidos, particularmente formas polifluoradas de estos grupos. El alcance del grupo lipídico incluye derivados como los derivados de amina, amida, éster y carbamato.

En algunos casos, el agente modificante es una secuencia de ácido nucleico que tiene una actividad deseable (por ejemplo reclutamiento de una RNasa, como se describe en el presente documento). En ciertos casos, el agente modificante tiene una actividad de enlace específica que proporciona el suministro del oligonucleótido a un objetivo particular, como una proteína específica de la célula. En algunos casos, el agente modificante es un anticuerpo de interés que se une específicamente a un objetivo de interés específico de la célula. En ciertos casos, el agente modificante de anticuerpo se une específicamente a hemaglutinina (HA).

El agente activo oligonucleótido se puede utilizar en cualquier forma conveniente. En algunos casos, el agente activo oligonucleótido es monocatenario. En algunos casos, el agente activo oligonucleótido es bicatenario. En algunos casos, el agente activo oligonucleótido es un siARN. En algunos casos, el agente activo oligonucleótido es un shARN. En algunos casos, el agente activo oligonucleótido es un ssARN. En algunos casos, uno o más nucleótidos del ssARN se pueden sustituir por nucleótidos de LNA. En algunos casos, el agente activo oligonucleótido es un ssADN. En algunos casos, uno o más nucleótidos del ssADN se pueden sustituir por nucleótidos de LNA.

MÉTODOS o TRATAMIENTO

Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos de tratamiento o prevención del virus de la influenza en un sujeto. Los compuestos de oligonucleótido en cuestión se utilizan como una nueva clase de agentes terapéuticos antivirales que pueden interrumpir eficazmente el empaquetamiento y prevenir por completo enfermedades de otro modo letales in vivo. Como se demostró en la sección de ejemplos, in vivo, la dosificación intranasal de compuestos de oligonucleótido ejemplares dio lugar a una potente eficacia antiviral y evitó la infección letal por IAV en ratones.

Los aspectos del método incluyen la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto en cuestión para tratar al sujeto de una infección o evitar la infección en el sujeto. Por "una cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende la concentración de un compuesto que es suficiente para provocar el efecto biológico deseado (por ejemplo tratamiento o prevención de la afección o enfermedad, infección por el virus de la influenza A). Por "tratamiento" se entiende que se consigue al menos una mejoría de los síntomas asociados a la afección que aflige al huésped, donde la mejoría se utiliza en un sentido amplio para referirse al menos a una reducción de la magnitud de un parámetro, por ejemplo síntoma, asociado a la condición que se trata. Como tal, el tratamiento también incluye situaciones donde la condición patológica, o al menos síntomas asociados a la misma, se inhiben por completo, por ejemplo se evite que se produzcan o se detienen, por ejemplo, se terminan, de modo que el huésped ya no sufre de la afección o al menos de los síntomas que caracterizan la afección. Por lo tanto, el tratamiento incluye: (i) prevención, es decir, reducción del riesgo de desarrollo de síntomas clínicos, incluyendo provocar que no se desarrollen los síntomas clínicos, por ejemplo prevenir la progresión de la enfermedad a un estado nocivo; (ii) inhibición, es decir, detener el desarrollo o el desarrollo posterior de síntomas clínicos, por ejemplo mitigar o inhibir completamente una enfermedad activa (por ejemplo infección); y/o (iii) alivio, es decir, provocar la regresión de los síntomas clínicos. En el contexto de la infección por el virus de la influenza A, el término "tratamiento" incluye cualquiera o todos los siguientes aspectos: reducir el número de células virales en muestras de pacientes, inhibir la replicación de células virales y mejorar uno o más síntomas asociados a una infección.

El sujeto a tratar puede ser alguien que necesite terapia, donde el huésped a tratar es susceptible de tratamiento utilizando el compuesto en cuestión. En algunas realizaciones, el sujeto es alguien sospechoso de tener una infección por el virus de la influenza A. En algunas realizaciones, se diagnostica al sujeto una infección por el virus de la influenza A. Como tal, en algunos casos, el sujeto es alguien que ha sido infectado con el virus.

En ciertos casos, el sujeto es alguien que está en riesgo de ser infectado o se sospecha que ha sido infectado con el virus. En algunas realizaciones, el ARNv es un ARNv de PB2. Los métodos en cuestión se pueden utilizar para prevenir la infección del sujeto con un virus de la influenza A. Por "prevención" se entiende que el sujeto en riesgo de infección por el virus de la influenza A no está infectado a pesar de la exposición al virus bajo condiciones que podrían conducir normalmente a la infección. En algunos casos, la administración del agente activo en cuestión (por ejemplo compuesto de oligonucleótido) protege al sujeto contra la infección durante 1 semana o más, como 2 semanas o más, 3 semanas o más, 1 mes o más, 2 meses o más, 3 meses o más, etc. Se pueden administrar múltiples dosis del compuesto en cuestión según los métodos en cuestión para proporcionar protección al sujeto de la infección durante un periodo de tiempo prolongado. El momento y las cantidades de dosis se pueden determinar fácilmente utilizando métodos convencionales.

En algunos casos, los métodos de tratamiento en cuestión incluyen un paso para determinar o diagnosticar si el sujeto tiene una infección por virus de la influenza A. El paso determinante se puede realizar utilizando cualquier método conveniente. En algunos casos, el paso determinante incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto y el análisis de la muestra para detectar la presencia de células virales. La muestra puede ser una muestra celular. El paso determinante puede incluir la identificación de células virales, incluyendo una mutación particular.

En consecuencia, una variedad de sujetos pueden ser susceptibles de tratamiento utilizando los compuestos y las composiciones farmacéuticas en cuestión descritas en el presente documento. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "sujeto" y "huésped" se utilizan indistintamente. Generalmente, estos sujetos son "mamíferos", siendo de interés los humanos. Otros sujetos pueden incluir mascotas domésticas (por ejemplo perros y gatos), ganado (por ejemplo vacas, cerdos, cabras, caballos y similares), roedores (por ejemplo ratones, conejillos de indias y ratas, por ejemplo como en modelos animales de enfermedad), así como primates no humanos (por ejemplo chimpancés y monos).

La cantidad de compuesto en cuestión administrado se puede determinar utilizando cualquier método conveniente para ser una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para las formas de dosificación unitarias de la presente divulgación dependerán del compuesto concreto empleado y del efecto a conseguir, así como de la farmacodinámica asociada a cada compuesto en el huésped.

En algunas realizaciones, una cantidad efectiva de compuesto en cuestión es una cantidad que oscila entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 50 pg/ml (por ejemplo entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 40 pg/ml, entre alrededor de 30 ng/ml y alrededor de 20 pg/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 10 pg/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 1 pg/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 800 ng/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 700 ng/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 600 ng/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 500 ng/ml, entre alrededor de 50 ng/ml y alrededor de 400 ng/ml, entre alrededor de 60 ng/ml y alrededor de 400 ng/ml, entre alrededor de 70 ng/ml y alrededor de 300 ng/ml, entre alrededor de 60 ng/ml y alrededor de 100 ng/ml, entre alrededor de 65 ng/ml y alrededor de 85 ng/ml, entre alrededor de 70 ng/ml y alrededor de 90 ng/ml, entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 900 ng/ml, entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 800 ng/ml, entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 700 ng/ml, entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 600 ng/ml, entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 500 ng/ml, entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 400 ng/ml o entre alrededor de 200 ng/ml y alrededor de 300 ng/ml).

En algunas realizaciones, una cantidad efectiva de un compuesto en cuestión es una cantidad que oscila entre alrededor de 10 pg y alrededor de 100 mg, por ejemplo entre alrededor de 10 pg y alrededor de 50 pg, entre alrededor de 50 pg y alrededor de 150 pg, entre alrededor de 150 pg y alrededor de 250 pg, entre alrededor de 250 pg y alrededor de 500 pg, entre alrededor de 500 pg y alrededor de 750 pg, entre alrededor de 750 pg y alrededor de 1 ng, entre alrededor de 1 ng y alrededor de 10 ng, entre alrededor de 10 ng y alrededor de 50 ng, entre alrededor de 50 ng y alrededor de 150 ng, entre alrededor de 150 ng y alrededor de 250 ng, entre alrededor de 250 ng y alrededor de 500 ng, entre alrededor de 500 ng y alrededor de 750 ng, entre alrededor de 750 ng y alrededor de 1 pg, entre alrededor de 1 pg y alrededor de 10 pg, entre alrededor de 10 pg y alrededor de 50 pg, entre alrededor de 50 pg y alrededor de 150 pg, entre alrededor de 150 pg y alrededor de 250 pg, entre alrededor de 250 pg y alrededor de 500 pg, entre alrededor de 500 pg y alrededor de 750 pg, entre alrededor de 750 pg y alrededor de 1 mg, entre alrededor de 1 mg y alrededor de 50 mg, entre alrededor de 1 mg y alrededor de 100 mg o entre alrededor de 50 mg y alrededor de 100 mg. La cantidad puede ser una cantidad de dosis única o puede ser una cantidad diaria total. La cantidad diaria total puede oscilar entre 10 pg y 100 mg o puede oscilar entre 100 mg y alrededor de 500 mg o puede oscilar entre 500 mg y alrededor de 1000 mg.

En algunas realizaciones se administra una dosis única del compuesto en cuestión. En algunas realizaciones se administran dosis múltiples del compuesto en cuestión. Cuando se administran múltiples dosis durante un periodo de tiempo, el compuesto en cuestión se puede administrar dos veces al día (qid), diariamente (qd), cada dos días (qod), cada tres días, tres veces por semana (tiw) o dos veces por semana (biw) durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, un compuesto se puede administrar qid, qd, qod, tiw o biw durante un periodo de un día a alrededor de 2 años o más. Por ejemplo, un compuesto se puede administrar en cualquiera de las frecuencias mencionadas anteriormente durante una semana, dos semanas, un mes, dos meses, seis meses, un año o dos años o más, dependiendo de varios factores.

Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos para determinar si un método de tratamiento es efectivo. Por ejemplo, una muestra biológica obtenida a partir de un individuo que ha sido tratado con un método en cuestión se puede analizar para determinar la presencia y/o el nivel de células virales. La evaluación de la eficacia de los métodos de tratamiento en el sujeto puede incluir la evaluación del sujeto antes, durante y/o después del tratamiento, utilizando cualquier método conveniente. Los aspectos de los métodos en cuestión incluyen además un paso de evaluación de la respuesta terapéutica del sujeto al tratamiento.

En algunas realizaciones, el método incluye la evaluación de la condición del sujeto, incluyendo el diagnóstico o la evaluación de uno o más síntomas del sujeto que están asociados a la enfermedad o afección de interés que se está tratando (por ejemplo como se describe en el presente documento). En algunas realizaciones, el método incluye la obtención de una muestra biológica del sujeto y el análisis de la muestra, por ejemplo para detectar la presencia de células virales o componentes de las mismas que están asociados a la enfermedad o afección de interés (por ejemplo como se describe en el presente documento). La muestra puede ser una muestra celular. El (los) paso(s) de evaluación del método en cuestión se pueden realizar en un o más momentos antes, durante y/o tras la administración de los compuestos en cuestión, utilizando cualquier método conveniente. En ciertos casos, el paso de evaluación incluye la identificación y/o la cuantificación de células virales. En ciertos casos, la evaluación del sujeto incluye diagnosticar si el sujeto tiene una infección viral o síntomas de la misma.

MÉTODOS DE CRIBADO

Los aspectos de la presente divulgación también incluyen ensayos de cribado configurados para identificar agentes que se utilizan en los métodos de la invención, por ejemplo como se ha revisado anteriormente. Los aspectos de la presente divulgación incluyen métodos para el cribado de un agente candidato sobre la capacidad de inhibir el virus de la influenza A en una célula. En algunos casos, el método comprende: puesta en contacto de una muestra que comprende ARN viral (ARNv) que comprende un motivo PSL2 con un agente candidato; y determinar si el agente candidato se une específicamente al motivo PSL2. En algunos casos, un agente que se une específicamente a un motivo PSL2 tratará al sujeto que tiene la infección por el virus de la influenza A. Por evaluación o determinación se entiende al menos la predicción de que un compuesto de prueba dado tendrá una actividad deseable, de modo que se desee realizar más pruebas del compuesto en ensayos adicionales, como modelos animales y/o ensayos clínicos.

El agente candidato se selecciona entre: una molécula pequeña, un oligonucleótido, un anticuerpo y un polipéptido. En algunos casos, el paso determinante comprende la detección de un parámetro celular en donde un cambio en el parámetro en la célula en comparación con una célula que no se ha puesto en contacto con el agente candidato indica que el agente candidato se une específicamente al motivo PSL2. En algunos casos, el método de cribado en cuestión es un método de análisis SHAPE (acilación selectiva de 2'-hidroxilo analizada por extensión de cebador). En ciertos casos, el agente candidato es un oligonucleótido.

El cribado de fármacos se puede realizar utilizando un modelo in vitro, una célula animal genéticamente alterado o una proteína PSL2 purificada. Se pueden identificar ligandos que compiten, modulan o imitan la acción de un agente principal. El cribado de fármacos identifica agentes que se unen a sitios particulares del motivo PSL2. Para este propósito se puede utilizar una amplia variedad de ensayos, incluyendo ensayos de unión in vitro etiquetados, ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, inmunoensayos para unión de proteínas y similares. El conocimiento de la estructura en 3 dimensiones de PSL2 derivado de los estudios estructurales descritos en el presente documento también puede dar lugar al diseño racional de pequeños fármacos que inhiben específicamente la actividad de IAV.

El término "agente" tal como se describe en el presente documento describe cualquier molécula, por ejemplo oligonucleótido, proteína o producto farmacéutico, con la capacidad de unirse a PSL2 para inhibir IAV. Generalmente, una pluralidad de mezclas de ensayo se ejecutan en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Normalmente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a una concentración cero o por debajo del nivel de detección.

Los agentes candidatos abarcan numerosas clases químicas, como oligonucleótidos, anticuerpos, polipéptidos y moléculas orgánicas, por ejemplo compuestos orgánicos pequeños que tienen un peso molecular de más de 50 y menos de alrededor de 2.500 daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, en particular enlaces de hidrógeno, e incluyen normalmente al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden frecuentemente estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas y/o poliaromáticas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también se encuentran entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos.

Los agentes candidatos se obtienen a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, se dispone de numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos y oligopéptidos aleatorizados. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles o se producen fácilmente. Además, las bibliotecas y compuestos naturales o producidos sintéticamente se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales, y pueden utilizarse para producir bibliotecas combinatorias. Los agentes farmacológicos conocidos pueden estar sujetos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales. En ciertas realizaciones son de interés compuestos que pasan la barrera hematoencefálica.

Cuando el ensayo de cribado es un ensayo de unión, una o más de las moléculas se pueden unir a un miembro de un sistema productor de señales, por ejemplo una etiqueta, donde la etiqueta puede proporcionar directa o indirectamente una señal detectable. Varias etiquetas incluyen, entre otros: radioisótopos, fluorescentes, quimioluminiscencias, enzimas, moléculas de unión específicas, partículas, por ejemplo partículas magnéticas y similares. Las moléculas de unión específicas incluyen pares, como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específicos, el miembro complementario se etiquetaría normalmente con una molécula que proporciona detección, según procedimientos conocidos.

Se puede incluir una variedad de otros reactivos en el ensayo de cribado. Estos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc., que se utilizan para facilitar la unión proteína-proteína óptima y/o reducir interacciones inespecífica o de fondo. Se pueden utilizar reactivos que mejoran la eficiencia del ensayo, como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. La mezcla de componentes se añade en cualquier orden que proporcione la unión necesaria. Las incubaciones se realizan a cualquier temperatura adecuada, normalmente entre 4 y 40°C. Los periodos de incubación se seleccionan para una actividad óptima, pero también se pueden optimizar para facilitar un cribado rápido de rendimiento elevado. Normalmente será suficiente entre 0,1 y 1 hora.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a aquellos con habilidad ordinaria en la materia una divulgación y descripción completa de cómo hacer y utilizar la presente invención, y no tienen por objetivo limitar el alcance de los que los inventores consideran su invención ni tienen por objetivo representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados Celsius y la presión es atmosférica o próxima a esta. Se pueden utilizar abreviaturas estándar, por ejemplo bp, par(es) de bases; kb, kilobase(s); pl, picolitro(s); s o sec, segundo(s); min, minuto(s); h o hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, kilobase(s); bp, par(es) de bases; nt, nucleótido(s); i.m., (por vía) intramuscular; i.p., (por vía) intraperitoneal; s.c., (por vía) subcutánea; y similares.

Materiales y métodos

Células y virus:se obtuvieron células HEK 293T y MDCK de American Type Culture Collection (Manasass, VA) y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco con 10 % de suero fetal bovino y penicilina-estreptomicina (Gibco). El virus de la influenza A/PR/8/34 (PR8) H1N1 se generó utilizando un sistema genético inverso de ocho plásmidos. Se obtuvo el virus de la influenza A/Hong Kong/8/68 (HK68) H3N2 adaptado en cultivo tisular de ATCC (ATCC-VR-1679). Los virus se cultivaron y se amplificaron en embriones de pollo exentos de patógenos específicos de 10 días de edad a 35°C (Charles River Laboratories; SPAEAS).

Constructos de plásmidos y clonación:se utilizaron plásmidos que contenían los segmentos de PB2 de tipo salvaje de virus de la influenza A/PuertoRico/8/34 (H1N1) [p R8], A/New York/470/2004 (H3N2) [NY470], A/New York/312/2001 (H1N1) [NY312], A/Brevig Mission/1/1918 (H1N1) [1918], A/California/04/2009 (H1N1) [CA09], A/Vietnam/03/2004 (H5N1) [VN1203] y A/Anhui/1/2013 (H7N9). Para la generación de ARNv mutante de empaquetamiento de PR8 se utilizó un kit de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene QuickChange XL (Stratagene) para mutagénesis de un plásmido pDZ que contenía el gen PB2 de PR8. Las secuencias de cada constructo mutado se confirmaron mediante secuenciación automatizada.

Genética inversa y titraciones de virus: se generó el virus de la influenza A/Puerto Rico/8/34 (PR8) utilizando un sistema genético inverso de ocho plásmidos (Hoffman et al., 2000). Brevemente, para producir virus PR8 recombinantes se sometieron a transfección 106 células de un cocultivo de 293T/MDCK con Lipofectamine 3000 (Invitrogen) con 1 ug de cada uno de los ocho segmentos contenidos en plásmidos que utilizan un sistema promotor dual bidireccional Pol I/II para la síntesis simultánea de ARNv genómico y ARNm. Las células se recogieron 24 horas después de la transfección y se inocularon en las cavidades alantoideas de embriones de pollo de 10 días de edad (Charles River, research grade specific-pathogen-free eggs). El rescate de virus recombinantes se evaluó mediante la actividad de hemaglutinación. Cada virus recién rescatado se titró adicionalmente en placa y las mutaciones se confirmaron mediante la secuenciación de genes mutados. Los ensayos en placa se llevaron a cabo en células MDCK confluentes como se describió anteriormente (Szretter et al., 2006). Los ensayos de hemaglutinación (HA) se llevaron a cabo en placas de fondo redondo de 96 pocillos a temperatura ambiente utilizando 50 ul de dilución de virus y 50 ul de suspensiones al 0,5 % de glóbulos rojos de pavo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Cinética de crecimiento viral:la cinética de crecimiento para virus PR8 se determinó mediante inoculación de huevos de gallina de 10 días de edad con 100 unidades formadoras de placa (PFU) del virus. A las 72 h después de la inoculación, se determinó el título del virus en el fluido alantoideo mediante titración de placas en células MDCK.

Aislamiento de ARNv empaquetados:para analizar ARNv empaquetado en busca de virus PR8 mutados se inocularon huevos de 10 días de edad con aproximadamente 1000 PFU de virus recombinante y se incubaron 72 h. El fluido alantoideo se recolectó y el sobrenadante se clarificó mediante centrifugación a baja velocidad. El sobrenadante clarificado se colocó después en placas sobre un cojín de sacarosa al 30 % y se ultracentrifugó a 30.000 RPM durante 2,5 h (Beckman Rotor SW41). El virus granulado se resuspendió en PBS y se extrajo con TRIzol (Invitrogen). El ARNv precipitado se resuspendió en un volumen final de 20 ul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y se almacenó a -80°C.

Análisis por qPCR de ARNs empaquetados: aproximadamente 200 ng de ARNv extraídos se transcribieron inversamente utilizando un cebador universal 3' (5'-AGGGCTCTTCGGCCAGCRAAAGCAGG) (SEQ ID NO:97) y transcriptasa inversa (RT) Superscript III (Invitrogen). El producto de RT se diluyó 10.000 veces y se utilizó como plantilla para PCR cuantitativa (qPCR). Después ser llevaron a cabo PCR separadas como se describe anteriormente (Marsh et al., 2007) con cebadores específicos del segmento. La mezcla de reacción de 10 ul contenía 1 ul de producto de RT diluido, una concentración de cebador de 0,5 uM y SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems) que incluía colorante SYBR GreenER, trifosfatos de desoxinucleósido 200 uM, UDG termolábil, tampón SYBR Green Select optimizado y enzima UP de ADN polimerasa AmpliTaq. Las concentraciones relativas de ARNv se determinaron mediante análisis de valores umbral de ciclo, la cantidad total de ARNv se normalizó mediante ecualización del nivel de ARNv de HA y después se calcularon porcentajes de incorporación en relación con los niveles de empaquetamiento de ARNv en peso. Los resultados de empaquetamiento viral representan los niveles promedio de incorporación de ARNv ± desviaciones estándar derivadas de dos purificaciones de virus independientes, con los niveles de ARNv cuantificados por triplicado, n=6.

Infecciones en ratones:grupos de ratones hembra BALB/C de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratory) se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se infectaron por vía intranasal con 50 ul de 1000 PFU del virus PR8 (H1N1) (ATCC) adaptado a ratones de tipo salvaje, virus recombinantes PR8 mutados en PB2 o PBS estéril. Los pesos se midieron diariamente y los animales fueron sacrificados humanamente el día 10 o cuando la pérdida de peso superaba el 20 %. Todos los procedimientos de cuidado animal y experimentales están de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Panel Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford.

Diseño y preparación de ácidos nucleicos bloqueados (LNA):los oligonucleótidos que contienen ácidos nucleicos bloqueados (LNA) se sintetizaron a medida a partir de Exiqon. Las letras mayúsculas indican LNA. Las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN típicos (no bloqueados). Todos los oligonucleótidos contenían enlaces internucleósido fosforotioato. Los LNA se diseñaron para ser complementarios a las diferentes secuencias contenidas en la estructura PSL2 del segmento PB2. Los LNA 8 y 9 están diseñados para contener un tramo de 6-8 nucleótidos de ADN para el reclutamiento de ARNasa-H. Las secuencias de todos los LNA se muestran a continuación.

LNA 1: 5' AccAaaAGaaT 3' (SEQ ID NO:67)

LNA 2: 5' TggCcATcaaT 3' (SEQ ID NO:68)

LNA 3: 5' TagCAtActtA 3' (SEQ ID NO:69)

LNA 4: 5' CCAAAAGA 3' (SEQ ID NO:70)

LNA 5: 5' CATACTTA 3' (SEQ ID NO:71)

LNA 6: 5' CagaCaCGaCCaaAA 3' (SEQ ID NO:72)

LNA 7: 5' TAcTtaCTgaCagCC 3' (SEQ ID NO:73)

LNA 8: 5' AGACacgaccaAAAG 3' -con actividad de RNasa-H (SEQ ID NO:74)

LNA 9: 5' TACTtactgacaGCC 3' -con actividad de RNasa-H (SEQ ID NO:75)

LNA9.2: 5' TACttactgacAGCC 3' (SEQ ID NO:76)

LNA10: 5'ACCaaaagAAT 3' (SEQ ID NO:77)

LNA11: 5' TGGccatcAAT 3' (SEQ ID NO:78)

LNA12: 5'TAGcatacTTA 3' (SEQ ID NO:79)

LNA13: 5'CgacCAaaAGaattC 3' (SEQ ID NO:80)

LNA14: 5'CGACcaaaagaATTC 3' (SEQ ID NO:81)

LNA15: 5'GaTGgCcATcaAttA 3' (SEQ ID NO:82)

LNA16: 5'GATGgccatcaATTA 3' (SEQ ID NO:83)

LNA17: 5'TcTAgCaTActTacT 3' (SEQ ID NO:84)

LNA18: 5'TCTAgcatactTACT 3' (SEQ ID NO:85)

LNA19: 5'GAAttcggatgGCCA 3' (SEQ ID NO:86)

LNA20: 5'GGCCatcaattaGTG 3' (SEQ ID NO:87)

LNA21: 5'TTCGgatggccaTCA 3' (SEQ ID NO:88)

LNA22: 5'AGCCagacagCGA 3' (SEQ ID NO:89)

LNA23: 5'GACAgccagacaGCA 3' (SEQ ID NO:90)

Los siguientes oligonucleótidos se diseñaron para cubrir polimorfismos de nucleótido único (SNP) en la secuencia PSL2. Las siguientes secuencias ejemplares son versiones modificadas de LNA9 con sitios de mutación única que protegerían contra unas pocas cepas de aves y murciélagos cuya secuencia PSL2 contiene un cambio de nucleótido con la secuencia objetivo de LNA9. Se entiende que se puede aplicar un diseño similar a cualquiera de las secuencias descritas en el presente documento.

LNA9.G74C: 5' TACTtactgacaGTC 3'(SEQ ID NO:94)

LNA9.T80C: 5' TACTtaccgacaGCC 3'(SEQ ID NO:95)

LNA19.U56C: 5' GGATttcggatggCCA 3'(SEQ ID NO:96)

Ensayos antivirales:los LNA se reconstituyeron en agua exenta de RNasa a 100 gM, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20°C antes del uso único. Se utilizó Lipofectamine 3000 (Life Technology) para someter a transfección LNA en células a concentraciones finales de 1 gM, 100 nM, 10 nM y 1 nM según el protocolo del fabricante. Para ensayos antivirales profilácticos se sembraron 106 células MDCK en placas de 6 pocillos 24 h antes de ser sometidas a transfección con el LNA indicado. Después se infectaron las células 4 h, 2 h o 1 h después de la transfección con 0,01 MOI de virus PR8 (H1N1) o HK68 (H3N2). Para la evaluación antiviral terapéutica después de infección, las células MDCK se infectaron con PR8 o HK68 como se describe. Después, las LNA se sometieron a transfección 4 h, 2 h o 1 h después de la infección. Después de 48 h tras la infección, se recogió el sobrenadante y se determinó el título viral mediante ensayo en placa.

Transcripción in vitro de ARNv:para cada aislado de tipo salvaje (PR8, 1918, VN1203, NY470, NY312, CA09 y A/Anhui/1/2013 H7N9) y clones mutantes de empaquetamiento PR8 se amplificó el ADNc de PB2 a partir de plásmido utilizando cebadores específicos del segmento bajo un promotor T7. El ADNc amplificado se purificó en gel utilizando un kit de gel de ADN Invitrogen, después se produjeron ARNv mediante transcripciónin vitroutilizando T7-MEGAscript. Los ARNv para SHAPE se purificaron mediante MEGAclear (Thermofisher, n° cat. AM1908) con pureza y longitud verificadas por electroforesis capilar.

Análisis sf-SHAPE de ARNv.se plegó ARNv de PB2 se plegó (NaCI 100 mM; MgCl 2,5 mM; 65°C durante 1 min, 5 min de enfriamiento a temperatura ambiente, 37°C durante 20-30 min) en HEPES 100 mM, pH=8. Se realizó una acilación de 2 min con NMIA (Wilkinson et al., 2006) y extensión de cebador con transcripción inversa (RT) a 45°C durante 1 min, 52°C durante 25 min, 65°C durante 5 min, como se describió previamente (Mortimer y Weeks, 2009). Se utilizó 6FAM para todos los cebadores etiquetados. Las excepciones a estos protocolos eran las siguientes: (i) la purificación de ARN tras acilación se realizó utilizando columnas C&C de ARN (Zymo Research) en lugar de precipitación de etanol; (ii) antes y después la adición del tampón de cebador SHAPE, la mezcla se puso a temperatura ambiente durante 2-5 min, lo que mejoró significativamente los rendimientos de transcripción de RT; (iii) la purificación de ADN se realizó utilizando resina de exclusión por tamaños Sephadex G-50 en formato de 96 pocillos y después se concentró por centrifugación al vacío, dando lugar a una eliminación más significativa del cebador; y (iv) se utilizaron 2 pmol de ARN en las reacciones de secuenciación de ARN ddGTP.

El analizador genético ABI 3100 (capilares de 50 cm llenos de matriz POP6) se ajustó a los siguientes parámetros: tensión 15 kV, T = 60°C, tiempo de inyección=15 s. Se utilizó el programa GeneScan para adquirir los datos para cada muestra, que consistía en ADN purificado resuspendido en 9,75 ul de formamida Hi-Di, a la que se añadieron 0,25 ul de patrón de tamaño interno ROX 500 (ABI Cat. 602912). Los parámetros de PeakScanner se ajustaron a los siguientes parámetros: suavizado=ninguno; tamaño de ventana=25; llamada de tamaño=local southern; ventana basal=51; umbral de pico=15. Los fragmentos 250 y 340 se excluyeron computacionalmente del patrón ROX500 (Akbari et al., 2008). A continuación, los datos de PeakScanner se procesaron en datos SHAPE utilizando FAST (análisis rápidos de trazas SHAPE), un programa personalizado (Pang et al., 2011). FAST corrige automáticamente las diferencias de señal debidas a errores de manejo, se ajusta al decaimiento de la señal y convierte la longitud del fragmento en posición de nucleótido utilizando una escala ddGTP como un patrón de dimensionamiento externo y el método local Southern (Pang et al., 2011 y Pang et al., 2012).

Parámetros de estructura de ARN: inicialmente se probaron parámetros de pendiente e intercepción de 2,6 y -0,8 kcal/mol como se sugirió (Deigan et al., 2009); se encontró que las intersecciones menores más próximas a 0,0 kcal/mol (por ejemplo ~ -0.3) producían una menor cantidad de estructuras menos óptimas (dentro de una diferencia de energía máxima de 10 %). Esta pequeña diferencia de parámetros puede deberse al ajuste preciso obtenido entre los conjuntos de datos experimentales y de control mediante el algoritmo FAST automatizado. En su actual implementación, FAST está integrado en la estructura de ARN, lo que requiere MFC (Microsoft Foundation Classes). Las estructuras de ARN se dibujaron y colorearon utilizando RNA Viz 2 (De Rijk et al., 2003) y se finalizaron en Adobe Illustrator.Diseño de constructos, síntesis de ARN y modificación química para experimentos de mutación y mapeo:las plantillas de ADN bicatenario se prepararon mediante PCR de oligómeros de ADN diseñados mediante un scripts de MATLAB automatizado como se describió previamente (NA_Thermo, available at "https:" followed by "Hgithub." seguido de "com/DasLab/NA_thermo") (Kladwang and Cordero et al., 2011). Los constructos para mutación y mapeo (M2) incluyen todos los mutantes individuales a la contraparte de Watson-Crick. Los mutantes compensatorios para mutación/rescate se diseñaron en base al emparejamiento de bases en la estructura secundaria propuesta (Tian et al., 2014). Las reacciones de transcripciónin vitro,los pasos de purificación y cuantificación de ARN fueron los descritos previamente (Kladwang y Cordero et al., 2011). El mapeo químico unidimensional, la mutación y mapeo (M2) y la mutación/rescate se llevaron a cabo en formato de 96 pocillos como se describió previamente (Kladwang y VanLang et al., 2011; Kladwang y Cordero et al., 2011; Cordero et al., 2013). Brevemente, el ARN se calentó y se enfrió para eliminar la heterogeneidad de la estructura secundaria, después se plegó apropiadamente y se incubó con reactivo SHAPE (5 mg/mL anhídrido 1-metil-7-nitroisatoico (1M7)) (Mortimer y Weeks, 2007); la reacción de modificación se extinguió y el ARN se recuperó mediante perlas magnéticas poly(dT) (Ambion) y el cebador etiquetado con FAM Tail2-A20; el<a>R<n>se lavó dos veces con etanol al 70 % (EtOH) y se resuspendió en ddH<2>O; seguido de transcripción inversa a ADNc y tratamiento con NaOH calentado para eliminar ARN. La biblioteca final de ADNc se recuperó mediante separación de perlas magnéticas, se lavó, se eluyó con formamida Hi-Di (Applied Biosystems) con escala ROX-350, se cargó en un secuenciador de electroforesis capilar (ABI3100). Procesamiento de datos, modelado estructural y depósito de datos: se utilizó el paquete de software HiTRACE versión 2.0 para analizar los datos de CE (tanto la caja de herramientas de MATLAB como el servidor web disponibles (Yoon et al., 2011; Kim et al., 2013)). El alineamiento de trazas, la sustracción de linea base, la asignación de secuencias, el ajuste de perfiles, la corrección de atenuación y la normalización se realizaron como se describió anteriormente (Kim et al., 2009; Kladwang et al., 2014). La asignación de secuencias se realizó manualmente con verificación de escalas de secuenciación. Los modelos de estructura secundaria basados en datos se obtuvieron utilizando el programa Fold del paquete RNAstructure versión 5.4 (Mathews et al., 2004) con pendiente e intercepción de pseudoenergía de 2,6 kcal/mol y -0,8 kcal/mol. Se calcularon matrices de puntuación Z de 2 dimensiones para conjuntos de datos M2 y valores de confianza de bootstrapping en hélice como se describió previamente (Tian et al., 2014; Kladwang y VanLang et al., 2011). Se utilizaron matrices de puntuación Z como energías pseudolibres con una pendiente e intersección de 1,0 kcal/mol y 0 kcal/mol. Se generaron imágenes de estructura secundaria por VARNA (Darty et al., 2009). Todos los conjuntos de datos de mapeo químico, incluyendo mapeo unidimensional, mutación y mapeo y mutación/rescate se han depositado en la base de datos de mapeo de ARN ("http:" seguido de "//rmdb.stanford." seguido de "edu") (Cordero et al., 2012).

Análisis SHAPE de ARNv dirigido a LNA : la plantilla de ADN del segmento PB2 de PR8 se preparó mediante el ensamblaje por PCR de oligómeros de ADN y reacciones de transcripciónin vitro,los pasos de purificación y cuantificación de ARN fueron los descritos anteriormente (Kladwang y VanLang et al., 2011). El mapeo químico unidimensional de SHAPE se realizó en formato de placa de 96 pocillos como se describió anteriormente con la siguiente excepción: una vez que el ARN se desnaturalizó y se volvió a plegar como se describe, se agregaron 100 nM de cada LNA preparado al ARN plegado y se incubó con 5 mg/mL de reactivo SHAPE 1M7 (anhídrido 1 -metil-7-nitroisatoico). La extinción de la modificación, la recuperación de ARN, la resuspensión, la transcripción inversa, la secuenciación de ADNc y el procesamiento de datos se realizaron como se describe, véase Kladwang y VanLang et al., 2011.

Ejemplo 1:

caracterización SHAPE de la señal de empaquetamiento PB2 del segmento IAV identifica la estructura conservada

La acilación selectiva de 2'-hidroxilo analizada por extensión de cebador (SHAPE) y el modelado computacional se aplicaron al ARNv genómico del segmento PB2 de IAV para buscar dominios de ARN estructurados. El ARNv de PB2 transcritoin vitrode longitud completa en sentido (-) de la cepa A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) "PR8" se plegó en solución (Pang et al., 2011) y se interrogó utilizando un reactivo SHAPE electrófilo que reacciona preferentemente con nucleótidos existentes en estados flexibles de cadena simple (Wilkinson et al., 2006)(FIG. 1).Este análisis reveló que gran parte del ARNv de 2341-nt no está estructurado en gran medida(FIG. 2),lo que es coherente con estudios bioinformáticos recientes que encontraron un mayor potencial para la conservación de la estructura secundaria del ARN en el sentido (+) sobre el ARN en sentido (-) para todos los segmentos, incluyendo PB2 (Priore et al., 2012; Moss et al., 2011). Estos estudios previos no analizaron las regiones de codificación terminal (TCR) y en su lugar se detuvieron 80 nucleótidos antes del extremo 5’ de las TCR de PB2. El modelado guiado por SHAPE sugería varias áreas en esta región que contienen estructuras secundarias de ARN estables, sobre todo un motivo de tallo-bucle, llamado empaquetamiento tallo-bucle 2 (PSL2) en el presente documento(FIG. 1A),que comprende nucleótidos 34 87 (notación en sentido (-)). Este segmento incluía un conjunto de nucleótidos que previamente estaban implicados en el empaquetamiento de PB2 a través de un análisis mutacional por medio de un mecanismo no identificado (FIG.

1A-1B,véanse nucleótidos rodeados con un círculo) (Gao et al., 2012; Marsh et al., 2008; Liang et al., 2008; Gog et al., 2007). Apoyando la hipótesis de que estas mutaciones previas actúan a través de la interrupción de la estructura PSL2, el análisis SHAPE de los mutantes rindió diferentes conformaciones que anularon en su totalidad la estructura PSL2 de tipo salvaje (FIG. 1C, FIG. 3).La región de 60 nucleótidos que abarca PSL2 muestra una conservación de secuencia próxima al 100 % al nivel de un único nucleótido entre cepas estacionales y pandémicas de diferentes subtipos y orígenes de especies(FIG. 4),lo que sugiere la existencia de un estricto requisito biológico para mantener una estructura PSL2 intacta. Ya que las diferentes secuencias aguas abajo dentro del ARNv de PB2 podrían alterar la estructura secundaria de PSL2, se exploró la conservación estructural de PSL2 mediante la realización de un análisis SHAPE en ARNv de PB2 de tipo salvaje de longitud completa aislados de una variedad de cepas y subtipos de IAV, incluyendo las cepas aviares H5N1 altamente patógenas y H1N1 pandémicas de 1918. A pesar de la presencia de dos nucleótidos divergentes dentro del tallo-bucle y la divergencia significativa en secuencias flanqueantes, la estructura tallo-bucle PSL2 se recuperó en el modelado guiado por SHAPE de ARN de PB2 en estas diversas especies y subtipos(FIG. 1D-1F).

LaFIG. 1A-FIG. 1Fmuestra el mapeo químico SHAPE realizado en ARNv de PB2 de tipo salvaje de longitud completa en sentido (-). Los colores indican la reactividad SHAPE, que es proporcional a la probabilidad de que un nucleótido sea monocatenario. Todas las estructuras están truncadas para resaltar la estructura de secuencia de extremos 5'. Energía = AG valor de energía libre de estructuras determinadas generado por el algoritmo de modelado deestructura de ARNutilizando los parámetros de energía pseudolibre de SHAPE.(FIG. 1A)Estructura secundaria de ARN de PB2 de tipo salvaje de la cepa A/Puerto Rico/8/1934 "PR8" (H1N1). Los círculos codificados por colores corresponden a sitios de nucleótidos donde se informó que las mutaciones sinónimas afectan al empaquetamiento de PB2 (Gao et al., 2012; Marsh et al., 2011).(FIG. 1B)Eficiencia de empaquetamiento de mutantes sinónimos en (FIG. 1a), determinada mediante qPCR. Resultados realizados por triplicado. Barras de error = ± SD. El cuadro a continuación indica nombre de mutante y cambio mutacional correspondiente. Numeración de nucleótidos mostrada en la orientación genómica sentido (-).(FIG. 1C)Estructuras determinadas por SHAPE de ARNv mutantes de empaquetamiento defectuoso de<PB2, m757 (G44C) y m745 (A80U). Cuadros negros = sitio(s) de mutación sinónima,>(fiG.1D-FIG. 1F)<estructuras>determinadas por SHAPE de PB2 de tipo salvaje de cepas pandémicas y altamente patógenas, incluyendo diferentes subtipos:(FIG. 1D)Pandémica de 1918 (A/Brevig Mission/1/1918 (H1N1)),(FIG. 1E)aviar altamente patógena (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)),(FIG. 1F)'porcina’ pandémica de 2009 (A/California/04/2009 (H1N1)).

LaFIG. 2,paneles A- B, muestra la reactividad SHAPE de ARNv de PB2 de longitud completa.(FIG. 2, panel A)Reactividad SHAPE promedio (tamaño de casilla de ventana = 100 nt) como función de la posición del nucleótido para ARNv de PB2 de longitud completa en sentido (-) de la cepa de IAV A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). La región PSL2 (resaltada en azul, nts 34-86) abarca el dominio de señal de empaquetamiento 5’ que posee una alta densidad de codones cuya tercera posición se conserva, y tiene una de las reactividades SHAPE más bajas dentro del ARNv. La región después de PSL2 está relativamente desestructurada, pero contiene otro sitio potencial para la presencia de la estructura de ARN entre los nucleótidos 1400 y 1500. Curiosamente, un estudio bioinformático de 2011 (ref. 19) también predijo que esta segunda región interna contenía elementos estructurales.(FIG. 2, panel B)Vista ampliada de la región PSL2 de la (FIG. 2a). Tamaño de casilla de ventana = 10 nt.

LaFIG. 3A- FIG. 3Emuestra que las mutaciones de empaquetamiento defectuoso interrumpen la reactividad SHAPE de tipo salvaje. Izquierda: la reactividad SHAPE mutante se representa como cambio sobre WT. La numeración de nucleótidos comienza desde el extremo 5' del ARNv en sentido (-). Las barras naranjas indican el sitio de mutación. Los valores de energía representan AG energía libre de la estructura predicha generada por el algoritmo de modelado deestructura de ARNutilizando los parámetros de energía pseudolibre de SHAPE. Derecha: estructuras determinadas por SHAPE de ARNv de PB2 mutante de longitud completa en sentido (-) de la cepa PR8 (H1N1). Las imágenes están truncadas para resaltar la región terminal 5'.(FIG. 3A)Tipo salvaje. Mutantes de empaquetamiento defectuoso:(FIG.

3B)m744b (AG83, 85UA).(FIG. 3C)m745 (A80U).(FIG. 3D)m55c (CU35, 36UC).(FIG. 3E)m757 (G44C).

LaFIG. 4muestra la conservación de la secuencia de nucleótidos que contiene la estructura PSL2. Representación gráfica de alineamientos de la secuencia de ácidos nucleicos en diversos subtipos y cepas virales de influenza A ("weblogo." seguido de "berkeley" seguido de ".edu"). La altura total representa la conservación de la secuencia en esa posición de nucleótido, mientras que la altura de símbolos dentro de cada posición indica la frecuencia relativa de cada nucleótido en ese sitio. Cuadro negro = región PSL2. Secuencias incluidas en el alineamiento: altamente patógena A/Brevig Mission/1/1918 (H1N1), "gripe porcina" pandémica A/California/04/2009 (H1N1), humana moderna A/New York/470/2004 (H3N2), humana A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), aviar altamente patógena A/Vietnam/03/2004 (H5N1), humana A/Hong Kong/8/1968 (H3N2) y humana A/New York/312/2001 (H1N1). Nucleótidos de ARN numerados en orientación en sentido (-). Alineamiento de secuencia de la región 5' terminal de PB2 correspondiente a las anteriores secuencias. El cuadro azul sombreado abarca el elemento estructural secundario de ARN PSL2. Los puntos negros indican sitios de nucleótidos divergentes.

La estrategia de mutación y mapeo valida la estructura PSL2 y predice nuevos mutantes de empaquetamiento

Para probar aún más el análisis SHAPE de la estructura de ARN PSL2 y descubrir mutaciones informativas adicionales necesarias para las pruebasin vivo, se aplicaron métodos de mapeo químico multidimensional (Kladwang y Das, 2010) al segmento PSL2. En primer lugar, las mediciones de mutación y mapeo (M2) confirmaron la interrupción del patrón de reactividad química tras la mutación sistemática de cada residuo de tallo, incluyendo cambios en nucleótidos que anteriormente se consideraban críticos para el empaquetamiento de PB2 (FIG.5A, véanse campos señalados) (Marsh et al., 2008; Gog et al., 2007). El análisis computacional automatizado basado en estos datos M2 recuperó la estructura PSL2 guiada por SHAPE con confianza elevada(FIG. 1C, FIG. 3, FIG. 5B-FIG.5D),validando adicionalmente el modelo estructural. En segundo lugar, como pruebas predictivas, se diseñaron mutaciones compensatorias para restaurar los pares de bases en la estructura tallo-bucle de tipo salvaje que se interrumpieron por las mutaciones iniciales de empaquetamiento defectuoso(FIG. 6, paneles A-B).De hecho, estas variantes de rescate de mutación restauraron el patrón SHAPE de PSL2, proporcionando una validaciónin vitrode la resolución de pares de bases de la estructura modelada y sugiriendo variantes de secuencia para probar el papel de la estructura PSL2in vivo.

LaFIG. 5A-FIG. 5Dmuestra el análisis en 2 dimensiones de mutación y mapeo (M2) de la estructura secundaria de ARN PSL2.(FIG. 5A)La mutación sistemática de un único nucleótido y el mapeo de accesibilidad química resultante revelan interacciones en la estructura bidimensional de ARN. Accesibilidades químicas, trazadas en escala de grises (negro = máxima reactividad SHAPE) a través de 88 mutaciones individuales con resoluciones de un nucleótido único del elemento PSL2 de PB2 de la cepa PR8. Los picos de reactividad (de izquierda a derecha) corresponden a nucleótidos del extremo 5' a 3' del ARN de PB2. Los sitios de nucleótidos correspondientes a mutaciones de empaquetamiento conocidas (como se informa por Marsh et al., 2008) se indican a la derecha en azul. Las flechas rojas indican sitios mutantes prominentes de empaquetamiento defectuoso predichos por análisis M2.(FIG. 5B)Características fuertes de datos de mutación y mapeo aislados por el análisis de puntuación Z (número de desviaciones estándar de la media de cada residuo). Las puntuaciones Z se calcularon para la reactividad de cada nucleótido restando la reactividad media de este nucleótido en todos los mutantes y dividiéndola entre la desviación estándar (output_Zscore_from_rdat en HiTRACE). Los recuadros muestran el modelo de estructura secundaria guiado por datos de mutación y mapeo. Las señales oscuras resaltan la evidencia de un emparejamiento de nucleótidos estructurado.(FIG. 5C)Estructura secundaria de ARN para la región de la señal de empaquetamiento 5' (nts 30 - 93) derivada de la incorporación de puntuaciones Z en el algoritmo de modelado de laestructura de ARN:estimaciones de confianza de bootstrap dadas como valores porcentuales en verde. Los valores de bootstrap proporcionan indicadores numéricamente precisos de confianza estructural. Los bajos valores de confianza de bootstrap sugieren la existencia de modelos estructurales alternativos.(FIG. 5D)Los valores de apoyo de bootstrap para cada par de bases se muestran como sombreado en escala de grises.

LaFIG. 6muestra el diseño de mutaciones compensatorias a mutantes PB2 de PR8.(FIG. 6, panel A)Los mutantes sinónimos descritos anteriormente (m757, m745, m55c) se mapean en la estructura PSL2.(FIG. 6, panel B)Se diseñaron mutaciones compensatorias (m55c-comp, m745-comp, y m757-comp) en los que se predijo que restaurarían la estructura PSL2 de tipo salvaje basándose en análisis SHAPE y químicos de mutación y mapeo. Los nucleótidos

en cuadro negro indican sitios de mutación compensatoria. Se muestra la orientación de ARNv en sentido (-). En mutaciones en las que se requirió un cambio no sinónimo para restaurar la estructura se indica la alteración en la secuencia de proteínas codificadas.

Para probar si la estructura tallo-bucle PSL2 observada en solución era relevante para el empaquetamiento del virus en el medio celular, se clonaron las mismas nueve mutaciones sinónimas presentadas por Gog et al., 2007 y Marsh et al., 2008(FIG. 1A-FIG. 1B, FIG. 7 panel A), así como cuatro nuevas mutaciones caracterizadas por análisis M2(FIG. 7, panel B)en plásmidos pDZ que contenían el gen PB2 de PR8 (Marsh et al., 2008; Liang et al., 2008; Gog et al., 2007)(FIG. 8).Las eficiencias de empaquetamiento de los 9 mutantes previamente conocidos ahora en el fondo de PR8 eran comparables a las descritas originalmente en el virus WSN33 15(FIG. 7, panel C).De estos, se predijo que los mutantes m55c, m757, m745 y m744b mostrarían el deterioro más significativo en función de su ubicación dentro de las regiones de tallo de PSL2(FIG. 1C,FIG. 3A-FIG. 3F,FIG. 7).Por el contrario, las mutaciones publicadas que no tienen ningún efecto sobre el empaquetamiento de PB2 (por ejemplo m731) se mapearon en el bucle apical no estructurado o quedaron fuera de PSL2 y no alteraron su integridad estructural(FIG. 9A)(Marsh et al., 2008). Los tres nuevos mutantes sinónimos (m74-1, m74-2 y m68) identificados por análisis M2 por tener un efecto significativo en la estructurain vitroPSL2(FIG. 5A)mostraron una pérdida significativa en el empaquetamiento de PB2, mientras que los sitios de mutación que dieron lugar a un cambio insignificante en la reactividad SHAPE en comparación con la estructura PSL2 de tipo salvaje dieron niveles de eficiencia de empaquetamiento similares a los de tipo salvaje (por ejemplo m56)(FIG. 7, panel D).

LaFIG.7,muestra mutación sinónima de codones individuales altamente conservados de ARNv de PB2 de PR8.(FIG.

7, panel A)Mutaciones sinónimas previamente publicadas implicadas en el empaquetamiento de PB2. La línea superior es la secuencia de ARNv de PR8 parental (orientación en sentido (+)) y los nucleótidos individuales mutados están en negrita en rojo en la línea inferior. La numeración y nomenclatura de mutaciones introducidas se basan en los informes de Marsh et al., 2008 y Gog et al., 2007. La región resaltada en amarillo indica una secuencia que contiene la estructura PSL2.(FIG. 7, panel B)Diseño de secuencias de cebador para la clonación de mutaciones sinónimas identificadas a partir del análisis M2 (véase Fig. 4a suplementaria) en plásmidos pDZ. Las secuencias están en orientación en sentido (+). Nucleótidos resaltados = sitio de mutación.(FIG. 7, paneles C-D)Eficiencias de empaquetamiento que representan el porcentaje de empaquetamiento de PB2 mutante en relación con PB2 de tipo salvaje para(FIG. 7, panel C)mutantes sinónimos publicados previamente y(FIG. 7, panel D)mutantes sinónimos identificados por análisis M2. Resultados de dos experimentos independientes, ensayos realizados por triplicado (n=6). Las barras de error representan ± SD.

LaFIG.8muestra la nomenclatura del mutante de empaquetamiento de PB2 y los correspondientes sitios de mutación. Gráfico de nomenclatura de mutación que indica nombres y sitio(s) de mutación de: 1) mutaciones sinónimas publicadas previamente implicadas en el empaquetamiento de PB2 (mostrados en azul), basadas en los informes de Marsh et al., 2008 y Gog et al., 2007; y 2) mutantes simples diseñados por la estructura PSL2 (mostrados en negro) y mutantes dobles compensatorios (mostrados en rojo). La numeración y la nomenclatura de mutaciones introducidas se basan en el ARNv genómico en sentido (-). Los casos en los que la mutación da lugar a un cambio en la codificación de proteínas se indican mediante campos sinónimos (SYN) o no sinónimos (Non-SYN).

LaFIG. 9A-FIG. 9Cmuestra el efecto de la mutación sinónima en la estructura PSL2. Izquierda: estructura secundaria de ARN predicha de mutantes de empaquetamiento de PB2 determinada por análisis sf-SHAPE en ARNv de PB2 de longitud completa en sentido (-) a partir de la cepa PR8. Solo para una mayor claridad, la estructura de tipo salvaje se muestra en el cuadro de la esquina superior derecha. Derecha: gráfico de reactividad SHAPE mostrado como cambio de la reactividad mutante sobre el tipo salvaje. Valores de energía y porcentaje de eficiencias de empaquetamiento indicados bajo los encabezamientos de las figuras. Mutantes:(FIG. 9A)m731.(FIG. 9B)m751.(FIG. 9C)m748. El porcentaje de eficiencias de empaquetamiento de incorporación de PB2 para cada uno de los mutantes descritos previamente se resalta en azul.

Las mutaciones compensatorias rescataron no solo el empaquetamiento viral para el segmento PB2(FIG. 10, paneles A-C, FIG. 6, paneles A-B),sino también otros segmentos que se presentaron como afectados por las mutaciones deletéreas, consistentes en el papel jerárquico propuesto de PB2 en el empaquetamiento de IAV (Muramoto et al., 2006; Gao et al., 2012; Marsh et al., 2008)(FIG. 10, paneles D-F).Además de recuperar el empaquetamiento de PB2, las mutaciones compensatorias permitieron rescatar por completo o casi por completo la pérdida de títulos virales causada por las mutaciones defectuosas(FIG. 10, paneles G-I).Algunas mutaciones no sinónimas compensatorias fueron capaces de restaurar el empaquetamiento de PB2 mejor que otras (m745-comp y m55c-comp, en comparación con m757-comp)(FIG. 10, paneles A-C),posiblemente reflejando una restauración incompleta de la función de la proteína PB2 a través de adición exógena. Tal adición exógena era necesaria, ya que algunas mutaciones no sinónimas afectaban tanto a la estructura PSL2 como a la secuencia de proteínas. La prueba más incisiva de la estructura PSL2 procedía de experimentos de empaquetamiento que no requirieron la adición suplementaria de proteína PB2 de tipo salvaje. En base a la enumeración computacional y los experimentos multidimensionales de mutación-rescate (Tian et al., 2014), se descubrió un único par de sustituciones de mutación-rescate que eran sinónimas, obviando la adición de proteínas PB2 de tipo salvaje (m52/m65,FIG. 11, paneles A-B, FIG. 12, panel s, FIG. 13). La realización de cada mutación por separado (m52 y m65) dio lugar a eficiencias de empaquetamiento inferiores al 4 % de incorporación de PB2 y una pérdida de título que excedía 4 log<10>, un deterioro extremo más allá de lo presentado previamente (es decir, log 2) para virus de empaquetamiento defectuoso(FIG. 11, panel C-D, FIG.

7, panel c, FIG. 10).Cuando se introdujeron conjuntamente en una cepa m52/65-comp doblemente mutada que restauraba la estructura PSL2, aunque con una secuencia alterada, las mutaciones compensatorias restauraron tanto la eficiencia de empaquetamiento como el título viral a niveles de tipo salvaje.

LaFIG. 10,paneles A-I, muestra el efecto de mutaciones compensatorias en mutantes de empaquetamiento defectuoso de PB2 de PR8 sobre el empaquetamiento viral y el título.(FIG. 10, paneles A-C)Eficiencias de empaquetamiento de ARNv de PB2 mutantes de empaquetamiento defectuoso y compensatorios. En mutaciones compensatorias en las que se requirió un cambio no sinónimo, se sometió a transfección un plásmido de expresión de la proteína PB2 de tipo salvaje durante el rescate del virus. pWT = plásmido de expresión que codifica para la proteína PB2 de PR8 de tipo salvaje. Valores dados como porcentaje de empaquetamiento de ARNv de PB2 en comparación con el virus PR8 parental wt. Resultados de dos experimentos independientes, ensayos realizados por triplicado (n=6).

(FIG. paneles D-F)Eficiencias de empaquetamiento de virus mutantes de empaquetamiento defectuoso y compensatorios y su efecto sobre el empaquetamiento de otros segmentos que interaccionan, PB1, PA, NP y MX. Ensayos realizados por triplicado (n=6).(FIG. 10, paneles G-I)Título viral por ensayo en placa. Resultados en PFU/mL, ensayos realizados por triplicado.

LaFIG. 11muestra el mapeo químico multidimensional que revela nuevos asociados mutantes de empaquetamiento defectuoso de PB2 y compensatorios.(FIG. 11, panel A)El electroferograma es el resultado de un mapeo sistemático de mutaciones de un único nucleótido con análisis de rescate (mutación-mapeo-rescate) de mutaciones dobles individuales y compensatorias para probar los emparejamientos de bases de modelos guiados por datos 1-D e identificar pares mutantes sinónimos defectuosos en PSL2 y compensatorios exitosos predichos. Accesibilidades químicas, trazadas en escala de grises (negro = máxima reactividad SHAPE) a través de 88 mutaciones individuales con resoluciones de un nucleótido único del elemento PSL2 de PB2 de la cepa PR8. Los picos de reactividad (de izquierda a derecha) corresponden a nucleótidos del extremo 5' a 3' del ARN de PB2. Véase la FIG. 12 para la lista completa de pares de mutación-rescate.(FIG. 11, panel B)Diseño mutacional de mutantes simples m52 (G52U) y m65 (C65A), y el doble par de rescate m52/65 en la estructura PSL2.(FIG. 11, panel C)Eficiencia de empaquetamiento del par de mutación y rescate mutante sinónimo simple y doble. Valores dados como porcentaje de empaquetamiento de ARNv de PB2 en comparación con el virus PR8 parental wt. Resultados de dos experimentos independientes, ensayos realizados por triplicado (n=6).(FIG. 11, panel D)Título viral en PFU/mL, resultados por triplicado. Las barras de error representan ± SD.

LaFIG. 12,paneles a-t, representa el análisis en 2 dimensiones de mutación-mapeo-rescate (M2R). Los resultados de mutación/rescate validan la estructura secundaria de ARN PSL2. Electroferogramas de análisis SHAPE con mutaciones dobles compensatorias para probar emparejamientos de bases a partir de modelos guiados por datos 1-D e identificar pares mutantes defectuosos en PSL2 y compensatorios exitosos. Accesibilidades químicas, trazadas en escala de grises (negro = máxima reactividad SHAPE) a través de 88 mutaciones individuales con resoluciones de un nucleótido único del elemento PSL2 de PB2 de la cepa PR8. Para cada emparejamiento probado se agrupa un "cuarteto" de tipo salvaje, mutante simple 1, mutante simple 2 y mutante doble compensatorio para la comparación.

(FIG. 12, paneles a-r) Pares mutantes y de rescate no sinónimos. Todos los electroferogramas no recuadrados son emparejamientos para los que no se observó interrupción y/o rescate. Los cuadros azules indican mutaciones defectuosas y de rescate exitosas.(FIG. 12, panel s) Doble par de mutación y rescate sinónimo. Cuadro verde = par defectuoso y de rescate sinónimo exitoso.(FIG. 12, panel t) Eficiencia de empaquetamiento para pares mutantes y de rescate no sinónimos. Valores dados como porcentaje de empaquetamiento de ARNv de PB2 en comparación con el virus PR8 parental wt. Resultados de dos experimentos independientes, ensayos realizados por triplicado (n=6). Las barras de error representan ± SD.

LaFIG. 13muestra el diseño de secuencias de cebadores para (M2R) mutantes de 2 dimensiones de mutaciónmapeo-rescate. SEQ ID NOs: (28-43) de arriba a abajo. Secuencias de cebadores utilizadas para clonación mutacional QuickChange de mutantes M2R en plásmidos pDZ. Las secuencias están en orientación en sentido (+). El campo izquierdo indica un cambio de sinónimo (Syn.) o no sinónimo (Non-syn). Nucleótidos resaltados = sitio de mutación. El conjunto de cebadores mutantes en cuadro indica asociados mutantes dobles sinónimos, m52 y m65.

Para probar la relevancia de la estructura PSL2 en un modeloin vivose inocularon por vía intranasal ratones BALB/C de 6-8 semanas de edad con 1000 PFU de virus PR8 de tipo salvaje o de cepas que albergaban mutaciones de las que se predijo que alterarían o restaurarían la estructura PSL2. Los ratones infectados con las mutaciones que interrumpían PSL2, cepa mutante m745 (20 % de eficiencia de empaquetamiento) o el virus de un solo mutante de empaquetamiento gravemente defectuoso, m52 (<4 % de eficiencia de empaquetamiento), mostraron signos clínicos de enfermedad reducidos o nulos, respectivamente, ya sea en la pérdida de peso o en la supervivencia en comparación con el control de PBS(FIG. 14, paneles A-B).Sorprendentemente, la inclusión de mutaciones compensatorias que restauran la estructura PSL2 rescató la patogenicidad viral: los animales infectados con m52/65-comp y m745-comp mostraron perfiles de mortalidad comparables a los de los ratones infectados con PR8 de tipo salvaje(FIG. 14, paneles A-B).Según las pautas de APLAC, todos los ratones se sacrificaron humanamente al alcanzar una pérdida de peso superior al 20 %.

LaFIG. 14 paneles A-Bmuestra que los virus de empaquetamiento defectuoso se atenúanin vivo.Porcentaje de pérdida de peso y supervivencia de ratones infectados con virus mutantes simples que interrumpen PSL2 y dobles compensatorios, que restauran PSL2. Se infectaron ratones hembra BALB/C de 6-8 semanas de edad por vía intranasal con 1000PFU de virus PR8 de tipo salvaje (wt), virus mutantes simples de empaquetamiento defectuoso, m52 y m745, virus mutantes dobles compensatorios, m52/65 y m745-comp, o control de PBS. Los ratones se supervisaron diariamente para determinar el porcentaje de pérdida de peso el día 0 y el porcentaje de supervivencia. Los resultados son un promedio de dos experimentos independientes, 6 ratones por afección.(FIG. 14, panel A)Porcentaje de pérdida de peso.(FIG. 14, panel B)Diagrama de supervivencia de Kaplan-Meir de las cohortes individuales representadas en la (FIG. 14, panel A).

Ejemplo 2:

el diseño terapéutico y orientación de la estructura PSL2 inhiben la infección por IAV in vitro e in vivo

Para explorar el potencial terapéutico de orientación al empaquetamiento viral mediado por PSL2, se diseñaron nueve ácidos nucleicos bloqueados (LNA) que contenían enlaces internucleósido fosforotioato (Vester y Wengel, 2004) contra residuos clave de los que se predijo que alterarían la estructura secundaria general de ARN del elemento y, por lo tanto, inhibirían la producción viral(FIG. 15, panel A).Dos de los LNA diseñados, LNA8 y LNA9, son idénticos en secuencia a LNA6 y LNA7, respectivamente, pero poseen 6-7 nucleótidos de ADN no modificados (no bloqueados) optimizados para la activación de RNasa-H. En primer lugar, para evaluar el impacto que tiene la unión de LNA en la estructura secundaria de ARN PSL2, se realizó la impresión del dedo del pie y el mapeo químico SHAPE en ARNv de PB2 en presencia de los LNA. En corroboración con los resultados del ensayo antiviral, las secuencias codificadas en los LNAs 6-9 exhibieron la mayor capacidad para unirse e interrumpir la estructura PSL2 de tipo salvaje(FIG. 16).

LaFIG. 15 , paneles A-Dmuestra ácidos nucleicos bloqueados dirigidos a la estructura de ARN PSL2 que muestran una potente actividad antiviral in vitro e in vivo.(FIG. 15, panel A)Localización de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) complementarios diseñados contra diferentes regiones de la estructura PSL2.(FIG. 15, panel B)Para examinar la actividad antiviral de los LNA, se trataron previamente células MDCK con 100nM de cada LNA designado mediante transfección de lipofectamina durante 1 hora antes de la infección con 0,01 MOI del virus PR8 (H1N1) o del virus A/Hong Kong/8/68 (H3N2). Después de 48 h tras la infección se recogió el sobrenadante y se determinó el título viral mediante ensayo en placa. Resultados de 2 experimentos independientes, ensayos realizados por triplicado (n=6).

(FIG. 15, panel C)Evolución temporal del tratamiento previo (RX) frente al tratamiento posterior a la infección con LNA9 a concentraciones de titración (100nM, 10nM, 1nM). W<t>+ Lipo = infección con control de lipofectamina. Pretratamiento: se trataron células MDCK confluentes en placas de 6 pocillos con LNA92 horas o 4 horas antes de la infección. El sobrenadante tratado se retiró en el momento indicado y las células se infectaron con 0,01 MOI de virus PR8 wt durante una hora. Para el tratamiento posterior a la infección: se infectaron células MDCK con 0,01 MOI de virus PR8 durante una hora, después de lo cual se reemplazó el sobrenadante y se trataron las células con LNA9 a las 2 o 4 horas posteriores a la infección. Se recogió el sobrenadante 48 horas después y se determinaron los títulos virales mediante ensayo en placa por triplicado. La FIG. 15, panel d, muestra los efectos del tratamiento intranasal con LNA en la supervivencia de ratones infectados por virus. Se administró a los ratones por vía intranasal 20ug de LNA9, LNA desordenado o PBS (control no infectado) 12 horas antes de la infección con virus PR8. Todos los ratones recibieron dos tratamientos adicionales a 8hpi y 36hpi (n=7 ratón por afección).

LaFIG. 16A-FIG. 16Bmuestra análisis SHAPE de la unión LNA-ARN.(FIG. 16A)Perfil electroforético de análisis SHAPE realizado en LNA 1,2, 4, 5, 6/8 y 7/9 (100nM) en presencia de ARNv de PB2 de PR8. S1, una pequeña molécula que interacciona con ARN IRES del virus de la hepatitis C, se añadió como control de la unión a ARN. Columnas a la izquierda, reacción sin etiquetar sin reactivo SHAPE, 1M7. Derecha: con reactivo de etiquetado.(FIG. 16B)Perfil electroforético de SHAPE realizado en combinación LNA-ARNv en concentraciones de titración de LNA. Para cada LNA, el conjunto de columnas de la izquierda no tiene reactivo de etiquetado.

A continuación, en un primer experimento piloto para determinar el potencial antiviral de la orientación de PSL2 mediada por LNA en dos subtipos diferentes de IAV, se trataron previamente células MDCK con 100nM de cada LNA y se administraron mediante transfección de Lipofectamine™ durante 1 hora antes de la infección con 0,01 MOI de virus PR8 de tipo salvaje (H1N1) o virus A/Hong Kong/8/68 (HK68) (H3N2) adaptado al cultivo tisular. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se recogieron los sobrenadantes y se midió la producción viral mediante ensayo en placa(FIG. 15, panel B).Los LNA dirigidos solo contra el bucle superior de PSL2 (LNA1, LNA4) tuvieron un efecto reducido o nulo sobre el título viral. Del mismo modo, los LNA 3 y 5, que se dirigen a la base 3' de PSL2, también fallaron en la inhibición de la producción viral. Por el contrario, la cobertura de nucleótidos tanto del bucle superior como de la protuberancia central en LNA6 dio lugar a mas de 2 log<10>déficits de título para PR8(FIG. 15, paneles A-B).LNA8, la copia activada por RNasa-H de LNA6, produjo una actividad antiviral aún mayor contra ambos virus de hasta 3 logs. Lo más sorprendente es que LNA9, la copia activada por RNasa-H de LNA7, poseía la mayor capacidad antiviral, disminuyendo la producción viral en casi 5 logs y 4 logs frente a PR8 y HK68, respectivamente.

Una vez identificados los LNA candidatos óptimos, se investigaron adicionalmente el tiempo de tratamiento y los parámetros de concentración de la actividad antiviral de LNA9. Se trataron células MDCK con una dosis de diluciones de 10 veces mayores de LNA92 o 4 horas antes de la infección o alternativamente 2 o 4 horas después de la infección con 0,01 MOI de virus PR8 de tipo salvaje. Las células pretratadas con el LNA tuvieron la respuesta antiviral más potente (mayor que 4 logs) y mostraron una fuerte inhibición vial (mayor que 2 logs) incluso a la dilución más baja (1nM)(FIG. 15, panel C).Hubo una tendencia a la disminución de la actividad antiviral a medida que aumentaba el tiempo de tratamiento posterior a la infección, pero incluso en el último momento de adición probado, se obtuvo una supresión del título viral mayor que 3 logs.

Ejemplo 3:

experimento de eficacia in vivo: profilaxis de dosis única ampliada

Se trataron previamente ratones hembra Balb/C (5 ratones/grupo) por vía intranasal con una dosis única de 20ug de LNA93 días antes de la infección (día -3) o 1 día antes de la infección (día -1) con una dosis letal de virus PR8 de tipo salvaje. Los ratones se supervisaron diariamente para determinar la pérdida de peso, la puntuación clínica y la supervivencia. La FIG. 17, panel A, muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones a lo largo del tiempo. La FIG. 17, panel B, muestra el porcentaje de pérdida de peso a lo largo del tiempo después de la administración.

Una única administración de 20ug de LNA9 tres días antes de la infección protegió a los ratones de la enfermedad mortal de la gripe. Los ratones de control no tratados se sacrificaron humanamente al perder más del 25 % de pérdida de peso, en un promedio de 5,5 días. Por el contrario, el grupo previo al tratamiento mostraba una pérdida de peso mínima, pocos o ningún signo de enfermedad y se recuperó completamente al peso previo a la infección.

Este resultado demuestra que una dosis única e inhalable de LAN9 administrada días antes de la infección puede proporcionar una protección duradera contra la enfermedad mortal, y sugiere que los compuestos en cuestión pueden ser utilizados en el tratamiento profiláctico durante los brotes de gripe y las pandemias.

Ejemplo 4:

susceptibilidad de los virus de la influenza a oseltamivir y LNA9 después de pases seriados en presencia de fármaco: experimento de selección de fármaco

Oseltamivir (Tamiflu) es el inhibidor de neuraminidasa (NAI) más utilizado y almacenado en el mercado. Al igual que todos los NAI, oseltamivir requiere una redisposición conformacional en la proteína neuraminidasa (NA) viral para alojar el fármaco. Cualquier mutación en la proteína NA que afecte a esta redisposición reduce la afinidad de unión de oseltamivir, reduciendo de este modo la eficacia del fármaco. En particular, el mutante H274Y (también conocido como mutación H275Y según la nomenclatura) se asocia con mayor frecuencia a la resistencia a oseltamivir. La rápida selección de la mutación H274Y en un paciente inmunodeprimido puede conducir al fracaso clínico del fármaco NAI de último recurso, peramivir, lo que sugiere que la selección de virus multirresistentes en huéspedes inmunodeprimidos puede ser más común de lo que se creía anteriormente. Esto, junto con la reciente propagación de virus resistentes a oseltamivir y resistentes a NAI en circulación, indica la necesidad de reevaluar el uso de NAI en general. El desarrollo de las nuevas clases de antivirales es imperativo con el fin de reducir el impacto adverso que las pandemias de influenza actuales y futuras pueden tener en la salud humana.

La región de secuencia en el segmento PB2 que contiene el tallo-bucle PSL2 está altamente conservada en todos los subtipos, cepas y aislados de IAV de una amplia gama de especies hospedadoras, y probablemente refleja un requisito biológico estricto para su preservación. El análisis SHAPE de esta región confirmó el mantenimiento de la estructura PSL2 entre virus estacionales y pandémicos de diferentes subtipos y orígenes de huéspedes, lo que sugiere fuertemente que este elemento estructural podría ser un nuevo objetivo terapéutico pangenotípico (y, por lo tanto, LNA9 tiene un potencial de amplio espectro contra aislados de IAV). Además, dado que los LNA en cuestión se dirigen a un objetivo de ARN genómico viral altamente conservado, que tiene claramente fuertes limitaciones en su capacidad para mutar, se espera que los LNA en cuestión que se dirigen a PSL2 tengan una mayor barrera para el desarrollo de resistencia en comparación con los NAI.

Se investigó la susceptibilidad de los virus de influenza a LNA9 frente a oseltamivir después de pases seriados bajo presión farmacológica. Oseltamivir tenía una IC<50>inicial de 41nM frente a PR8 en el paso 1 del tratamiento farmacológico, según lo determinado mediante un ensayo de reducción en placa. Después de solo seis pasos de virus con cantidades crecientes de fármaco, el IC<50>de oseltamivir saltó a 50uM, un aumento de 1000 veces. Véase la FIG.

18, paneles A-D. En comparación, después de 10 pasos de virus en presencia de LNA9, el IC<50>se mantuvo estable de 18 a 16pM. FIG. 19, paneles A y B.

LNA9 también se puede utilizar para tratar virus resistentes a fármacos. Se generó un mutante resistente a los fármacos del virus A/WSN/33 (H1N1) utilizando un sistema de rescate de virus genético inverso que mutó el gen NA para contener la mutación de resistencia H274Y. Contra este virus, oseltamivir tiene una IC<50>de 53uM. Es importante destacar que LNA9 mantuvo su potencia y eficacia contra el virus WSN H274Y con actividad picomolar. FIG. 19, panel C. Este resultado es una fuerte evidencia para el tratamiento terapéutico de virus resistentes a NAI con LNA dirigidos a PSL2. Este resultado también pone de relieve la actividad de LNA9 frente a diferentes aislados de IAV.

Referencias

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Aunque la anterior invención se ha descrito en detalle a modo de ilustración y ejemplo con el fin de una claridad de comprensión, para aquellos con habilidad ordinaria en la materia es fácilmente evidente que, a la luz de las enseñanzas de esta invención, se pueden realizar ciertos cambios y modificaciones de la misma sin desviarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de oligonucleótido o una sal del mismo, que comprende una secuencia de oligonucleótidos que comprende al menos 8 subunidades de nucleósidos complementarias a una región de un motivo de empaquetamiento tallo bucle 2 (PSL2) de un ARN viral de PB2 (ARNv), en donde el compuesto de oligonucleótido inhibe la producción de virus y en donde la secuencia de oligonucleótidos comprende uno o más nucleótidos de ácido nucleico bloqueado (LNA), y en donde el oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada a partir de:

LNA 9: 5' TACTtactgacaGCC 3' (SEQ ID NO:75);

LNA 8: 5' AGACacgaccaAAAG 3' (SEQ ID NO:74);

LNA14: 5'CGACcaaaagaATTC 3' (SEQ ID NO:81);

LNA 6: 5' CagaCaCGaCCaaAA 3' (SEQ ID NO:72); y

LNA 7: 5' TAcTtaCTgaCagCC 3' (SEQ ID NO:73);

en donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido comprende un enlace internucleósido seleccionado a partir de: enlaces fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato y tiofosforamidato.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido comprende al menos 5 unidades de desoxirribonucleótido y es capaz de reclutar una RNasa.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido comprende LNA 9: 5' TACTtactgacaGCC 3' (SEQ ID NO:75), en donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN.

5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido comprende LNA 8: 5' AGACacgaccaAAAG 3' (SEQ ID NO:74), en donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN.

6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido comprende LNA14:

5'CGACcaaaagaATTC 3' (SEQ ID NO:81) en donde las letras mayúsculas indican nucleótidos de LNA y las letras minúsculas indican nucleótidos de ADN.

7. Un métodoin vitrode inhibición del virus de la influenza A, comprendiendo el método:

puesta en contacto de una muestra que comprende ARN viral (ARNv) que tiene un motivo PSL2 con una cantidad efectiva del compuesto de oligonucleótido de la reivindicación 1.

8. Un compuesto de oligonucleótido o una sal del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso como un medicamento.

9. El compuesto de oligonucleótido o la sal del mismo para el uso según la reivindicación 8, en donde el uso comprende inhibir el virus de la influenza A en una célula mediante puesta en contacto de una célula que comprende ARN viral que tiene un motivo PSL2 con una cantidad efectiva del compuesto de oligonucleótido o la sal del mismo.

10. El método de la reivindicación 7 o el compuesto de oligonucleótido o la sal del mismo para el uso de la reivindicación 9, en donde la puesta en contacto de la muestra o la célula con el compuesto da lugar al menos a 2 log<10>déficits de título del virus y/o el compuesto interrumpe la estructura general del motivo PSL2 del ARNv.

11. El método de la reivindicación 7 o el compuesto de oligonucleótido o la sal del mismo para el uso de la reivindicación 9, en donde el ARNv se aísla a partir de un virión o una célula.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del compuesto de oligonucleótido según la reivindicación 1, que se une específicamente a un motivo PSL2 de un ARN viral (ARNv) para el uso en el tratamiento o la prevención del virus de la influenza A en un sujeto, en donde el tratamiento o la prevención comprende: administración de la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite.

13. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 12, en donde el sujeto está en riesgo de infección por virus de la influenza A y la administración del compuesto de oligonucleótido protege al sujeto contra infección durante 1 semana o más (por ejemplo 2 semanas o más, 3 semanas o más, 1 mes o más, 2 meses o más, 3 meses o más, etc.), opcionalmente en donde la administración comprende la administración semanal, bisemanal o mensual de una dosis efectiva del compuesto de oligonucleótido.

14. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 12, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente activo adicional seleccionado a partir de un segundo agente activo oligonucleótido y un fármaco antiviral.

15. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 12, en donde el sujeto está diagnosticado o es sospechoso de tener una infección por virus de influenza A.