ES2983129T3 - Proceso y composición para la inseminación de dosis bajas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición para su uso en inseminación artificial a dosis bajas y a un procedimiento para la inseminación artificial de un mamífero hembra utilizando una dosis de esperma procedente de un mamífero macho de la misma especie que es significativamente inferior a la necesaria en ausencia de la composición. El mamífero hembra preferido es una cerda (sus scrofa), y preferiblemente la composición es para su uso en inseminación artificial uterina, y el procedimiento para la inseminación artificial es preferiblemente inseminación uterina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

Proceso y composición para la inseminación de dosis bajas

La presente invención se refiere al uso de una composición para mejorar la fertilidad de unos espermatozoides de verraco para la inseminación artificial, mediante el uso de una dosis de espermatozoides que es significativamente menor que la necesaria en ausencia de la composición. La hembra de mamífero es una cerda (sus scrofa) y, preferiblemente, la composición es para el uso en la inseminación artificial uterina, y el proceso para la inseminación artificial es, preferiblemente, la inseminación uterina.

Estado de la técnica

Para la inseminación artificial convencional de cerdas se usan espermatozoides frescos de verraco en una dosis de aproximadamente 1 a 3 x 109 espermatozoides en un volumen de 100 ml de diluyente, dos veces dentro de las 24 h, en el útero, y son usados espermatozoides congelados en una dosis de aproximadamente 5 x 109 espermatozoides. Por lo tanto, una eyaculación de verraco puede ser dividida en de 5 a 30 dosis de espermatozoides frescos. Habitualmente, esta inseminación artificial convencional es realizado por primera vez alrededor de 24 h antes de la ovulación, cuando se observa el reflejo de inmovilidad.

Mediante el uso de procesos invasivos, por ejemplo, la laparoscopia quirúrgica, pueden depositarse dosis de espermatozoides tan bajas como 1 x 107 espermatozoides descongelados después de su congelación, directamente en el oviducto de la cerda para su fertilización.

La patente US 2012/0329035 A1 describe la unión de PEG a los espermatozoides, por ejemplo, mediante la unión de conjugados de PEG-lectina a los espermatozoides a través del resto de lectina. Los espermatozoides bovinos pueden ser recubiertos con PEG y, opcional y adicionalmente, con anticuerpos que se unen a carbohidratos, con lectinas o yema de huevo.

La patente WO 2009/045555 A1 describe un método para seleccionar espermatozoides portadores del cromosoma X frente a espermatozoides portadores del cromosoma Y, mediante la incubación con una fenoxazina o un compuesto de fenotiazina y un azúcar.

La patente US 5,972,592 A usa la fucosa como un competidor o usa un compuesto de unión a fucosa para reducir la unión de los espermatozoides bovinos al epitelio que tiene fucosa en el aparato reproductor femenino bovino. El ejemplo de referencia A describe que solamente la fucosa y Lewis-a, que es la a-L-fucosa[1-4]-[p-D-galactosa-(1-3)]-D-N-acetilglucosamina, afectaron la unión de los espermatozoides, mientras que la manosa, el ácido siálico, la glucosa, la N-acetilglucosamina o la galactosa no afectaron la unión de los espermatozoides. De manera similar, el ejemplo de referencia B muestra que solo el fucoidano produce la reducción deseada de la unión de los espermatozoides bovinos a los explantes de oviductos.

Srivastava y otros, en el documento The Journal of Experimental Zoology 245:106-110 (1988), describen que los espermatozoides de cobaya procedentes del epidídimo caudal distal y los espermatozoides de conejo fueron incubados con neuraminidasa, lo cual "produjo una reacción acrosómica significativa", la cual se da, por ejemplo, en 33,3 % y 58,3 % de las células en presencia o con la adición posterior de Ca2+. Los espermatozoides capacitados mostraron tasas de fertilización mejoradas en una prueba in vitro con óvulos sin zona.

Goncalves y otros, en el documento Reprod Dom Anim 44, 152-155 (2009), describen que los ovocitos bovinos maduros son fertilizados a tasas mayores cuando los ovocitos se incubaron previamente con NLAUTF y la lectina RCA-1 antes de la inseminación.

La patente US 5,766,632 A se refiere a los seres humanos y describe que las lectinas inmovilizan los espermatozoides, que un dispositivo de cierre cervicouterino recubierto con lectinas libera los espermatozoides en el ambiente vaginal, que las lectinas específicas son útiles para agregar los espermatozoides y que las lectinas suministradas localmente en la vagina son diseñadas para la anticoncepción, para la profilaxis contra enfermedades de transmisión sexual y para el tratamiento de infecciones vaginales tópicas.

La patente US 5135759 A describe un dispositivo FACS y un proceso para la clasificación específica por cromosomas sexuales de los espermatozoides en fracciones que contienen predominantemente espermatozoides portadores del cromosoma X o del cromosoma Y.

La patente WO 2010/0149739 A1 describe un dispositivo FACS y un proceso que usa un láser para desviar secciones de fluido que contienen espermatozoides, para clasificarlas en fracciones que contienen predominantemente espermatozoides portadores del cromosoma X o del cromosoma Y.

Green y otros, en el documento Reproduction 122, 305-315 (2001), describen que los glicanos median la unión de los espermatozoides de verraco a las células epiteliales del oviducto.

Ekhlasi-Hundrieser y otros, en el documento Biol Reprod 73, 536-545 (2005), describen que la adhesina espermática AQN-1 es un receptor candidato para formar un reservorio de espermatozoides en el oviducto de la cerda. Dostalova y otros, en el documento Eur J Biochem 230, 329-336 (1995), Calvete y otros, en el documento Biol Chem 377, 521 527 (1996), describen que las adhesinas espermáticas AQN-1 y AQN-3 muestran una afinidad similar a la AWN por Krueger y Rath, en el documento Reprod Fértil Dev. 12, 113-117, describen que dosis muy bajas de espermatozoides administrados por vía laparotómica en la punta del cuerno uterino dieron lugar a embarazos. Taylor y otros, en el documento Soc Reprod Fertil Supl 66, 83-84 (2009), describen que los espermatozoides porcinos se unen a las células epiteliales uterinas.

Objeto de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar una composición para el uso en la inseminación artificial, especialmente para la inseminación uterina, que permite la fertilización mediante una dosis de espermatozoides significativamente menor. El proceso de inseminación artificial debe evitar cualquier etapa quirúrgica y, preferiblemente, debe comprender o consistir en la aplicación de la dosis de espermatozoides para inseminación mediante la inseminación artificial clásica, por ejemplo, mediante la aplicación en el cuerpo uterino de las cerdas.

Descripción de la invención

El alcance de la protección solicitada se define por las reivindicaciones.

La invención logra el objeto mediante las características de las reivindicaciones, al poner en contacto los espermatozoides con un agente aglutinante, el cuales una lectina, que tiene afinidad por la N-acetilglucosamina (Glc-NAc) y/o afinidad por el ácido siálico, y/o con sialidasa que hidroliza el ácido siálico, antes de introducir los espermatozoides en el útero de la hembra de mamífero. La solicitud pone a disposición una segunda variante, al poner en contacto el útero con un agente aglutinante que posee afinidad por el ácido siálico y/o con un agente que hidroliza el ácido siálico, por ejemplo, antes o simultáneamente a la introducción de los espermatozoides en el útero de la hembra de mamífero. La primera y la segunda variante pueden separarse o combinarse.

En un primer caso, el contacto de los espermatozoides con al menos uno de estos compuestos puede realizarse al proporcionar una composición para la inseminación artificial, también denominada formulación líquida, conteniendo la composición de los espermatozoides, en donde la composición contiene uno de estos compuestos. Preferiblemente, la composición contiene espermatozoides en una dosis que es significativamente menor que la dosis usada para la inseminación artificial convencional.

En un segundo caso, los espermatozoides pueden ponerse en contacto con al menos uno de estos compuestos, separarse de las porciones no unidas de estos compuestos, por ejemplo al mezclar los espermatozoides con al menos uno de estos compuestos y lavar los espermatozoides, por ejemplo mediante centrifugación para recolectar los espermatozoides de la suspensión que contiene el al menos uno de estos compuestos y transferir los espermatozoides a una composición líquida la cual es libre de estos compuestos, cuya composición líquida, por ejemplo, es adecuada para la inseminación, por ejemplo, para su uso como al menos una dosis de inseminación. En un tercer caso, uno de estos compuestos para poner en contacto con los espermatozoides puede proporcionarse como una composición para la administración al aparato genital de la hembra antes o simultáneamente a la introducción de los espermatozoides que están contenidos en una composición líquida separada.

En un cuarto caso, puede proporcionarse un compuesto para poner en contacto con el útero como una composición para la administración al aparato genital de la hembra, especialmente al útero, antes o simultáneamente a la introducción de los espermatozoides que están contenidos en una composición líquida separada.

En un quinto caso, puede proporcionarse un compuesto, para poner en contacto con el útero, en una composición que contenga la dosis de espermatozoides.

En un proceso que comprende la administración de una composición antes de la introducción de los espermatozoides en la hembra, por ejemplo, en donde la composición no contiene espermatozoides, el proceso sirve para preparar a la hembra para la inseminación artificial. En este caso, la inseminación artificial puede ocurrir después de la administración de la composición, por ejemplo, mediante la introducción subsecuente de los espermatozoides en el útero.

La hembra de mamífero es una cerda primeriza o una cerda y los espermatozoides son espermatozoides de verraco, frescos o congelados. En una variante, se usan dosis de espermatozoides de verraco enriquecidas según el sexo, por ejemplo, espermatozoides clasificados específicamente por cromosomas sexuales, ya sean frescos o congelados, preferiblemente descongelados a partir del estado de congelación.

La invención se basa en el descubrimiento de que, al menos en el animal porcino, los espermatozoides fértiles se unen en gran medida al epitelio uterino, especialmente al endometrio, ilustrado por las células epiteliales uterinas, y que la reducción de la unión de los espermatozoides al epitelio uterino da lugar a la fertilización mediante una dosis menor de espermatozoides usados para la inseminación artificial. Para reducir la unión de los espermatozoides al epitelio uterino, puede enmascararse el ligando de unión de los espermatozoides que media la unión al endometrio, por ejemplo al poner en contacto los espermatozoides con un agente aglutinante que tenga afinidad por la N-acetilglucosamina (Glc-NAc) y/o afinidad por el ácido siálico, cuyo agente aglutinante es una lectina, o al poner en contacto los espermatozoides con una enzima que hidroliza el ácido siálico, es decir, una sialidasa para hidrolizar el tenga ainidad por el ácido siálico, cuyo agente aglutinante es una lectina, yo con un agente que hidroliza el ácido siálico. La lectina y la sialidasa son moléculas naturales, es decir, no modificadas químicamente, especialmente no modificadas con un resto de PEG.

La reducción de la unión de los espermatozoides al endometrio fue observado al enmascarar la N-acetilglucosamina (Glc-NAc) y/o el ácido siálico en los espermatozoides y/o en las células endometriales, o al eliminar estas moléculas de los espermatozoides y/o de las células endometriales. Estas observaciones pueden ser interpretadas en el sentido de que, al menos en el animal porcino, la unión de los espermatozoides al endometrio está mediada por la interacción de la N-acetilglucosamina y/o el ácido siálico presentes en los espermatozoides, especialmente en la cabeza del espermatozoide, y también está mediada por el ácido siálico presente en el endometrio.

Como las composiciones y los procesos de acuerdo con la invención permiten la fertilización de una cerda mediante un número significativamente reducido de espermatozoides en comparación con la inseminación artificial convencional, el agente aglutinante que tiene afinidad por la N-acetilglucosamina (Glc-NAc) y/o que tiene afinidad por el ácido siálico, o un agente que hidroliza el ácido siálico, por ejemplo antes o simultáneamente a la introducción de los espermatozoides en el útero de la hembra de mamífero y, en una segunda variante, un agente aglutinante que tiene afinidad por el ácido siálico y/o que tiene afinidad por la p-D(1,3)-galactosamina y/o con un agente que hidroliza el ácido siálico para poner en contacto con el útero, estas composiciones actúan como compuestos farmacéuticos activos para mejorar la fertilización con números menores de espermatozoides en comparación con la inseminación artificial convencional. En consecuencia, la composición es para el uso en mejorar la fertilidad de una dosis de espermatozoides para inseminación artificial, especialmente para la administración al aparato genital de la hembra, por ejemplo, al útero, antes o simultáneamente a la introducción de los espermatozoides, y/o poner en contacto los espermatozoides con la composición, especialmente antes o simultáneamente a la introducción de los espermatozoides en el aparato genital de la hembra, por ejemplo, en el útero, especialmente en el cuerpo uterino corto de una cerda.

En la presente descripción, las dosis administradas de los espermatozoides se refieren a los espermatozoides vivos en la dosis. Preferiblemente, la dosis para la inseminación artificial de acuerdo con la invención es menor en un factor de al menos 5, preferiblemente en un factor de al menos 10, con mayor preferencia en un factor de al menos 20 o al menos en un factor de 30, con mayor preferencia al menos en un factor de 50 o al menos en un factor de 100, en comparación con la dosis para el uso en la inseminación artificial convencional, en donde, en la inseminación convencional los espermatozoides se suspenden en un medio sintético que no contiene el compuesto y en donde, tanto en la dosis de acuerdo con la invención como en la dosis para la inseminación artificial convencional, los espermatozoides son frescos, es decir, no congelados, o congelados. Por ejemplo, para las cerdas (sus scrofa), una dosis para la inseminación artificial convencional contiene aproximadamente de 1 a 3 x 109 para los espermatozoides frescos (Colenbrander y otros, documento Reprod Domest Anim 1, 298-333 (1991)), y aproximadamente 5 x 109 para los espermatozoides congelados los cuales, antes de la inseminación, generalmente se descongelan. Generalmente es preferido que la inseminación se realice al menos 24h antes de la ovulación, por ejemplo, cuando se observa el reflejo de inmovilidad.

Preferiblemente, una dosis para la inseminación artificial puede contener 0,4 x 109, preferiblemente 0,2 x 109, con mayor preferencia 100 x 106 ó 66 x 106, con mayor preferencia 40 x 106 ó 20 x 106 para los espermatozoides frescos, y 1 x 109, preferiblemente 0,5 x 109, con mayor preferencia 250 x 106 ó 165 x 106, con mayor preferencia 100 x 106 ó 50 x 106 para los espermatozoides congelados, respectivamente.

La fertilidad obtenida mediante las composiciones y los procesos de acuerdo con la invención y en la inseminación artificial convencional, respectivamente, se determina preferiblemente como la suma de la tasa de fertilización, la tasa de parto y la tasa de destete, por ejemplo, como se describe en el documento de Vázquez y otros, Theriogenology 63, 536-547 (2005).

Opcionalmente, los espermatozoides son, predominantemente, espermatozoides portadores del cromosoma X, por ejemplo, obtenidos mediante la clasificación específica por cromosomas sexuales.

La dosis puede comprender, por ejemplo, un volumen de 80 a 100 ml.

El agente aglutinante puede estar comprendido, por ejemplo, en la dosis, en una cantidad de 0,1-1 o de 1,0 a 5,0 |jg/ml.

La dosis de espermatozoides contiene al menos un agente aglutinante que presenta afinidad por la N-acetilglucosamina (Glc-NAc) y/o que tiene afinidad por el ácido siálico, cuyo agente aglutinante es una lectina, y/o puede contener una enzima que hidroliza el ácido siálico, es decir, una sialidasa.

Opcionalmente (no forma parte de la invención), el agente aglutinante que posee afinidad por la N-acetilglucosamina (Glc-NAc) y/o que tiene afinidad por el ácido siálico, cuyo agente aglutinante es una lectina, y/o una enzima que hidroliza el ácido siálico, por ejemplo, una sialidasa, puede administrarse al aparato genital de la hembra, por ejemplo, al cuello uterino, preferiblemente al útero, antes de la introducción de los espermatozoides, por ejemplo, mediante la inseminación.

La composición de la invención contiene un agente aglutinante que presenta afinidad por la N-acetilglucosamina y/o afinidad por el ácido siálico, el agente aglutinante es una lectina o una enzima que hidroliza el ácido siálico, es decir, aceptable, con la unión del espermatozoide a la zona pelúcida, cuya unión generalmente se supone que depende, al menos en parte, de la unión de ligandos que contienen manosa en la zona pelúcida.

La invención se describe ahora con mayor detalle, por vía de ejemplos, con referencia a las figuras, que muestran en

- la Figura 1, una micrografía confocal de espermatozoides porcinos después de 10 min de incubación conjunta con una monocapa de UEC cultivada,

- la Figura 2A, una micrografía confocal de espermatozoides porcinos después del tratamiento previo con ConA, después de 10 min de incubación conjunta con una monocapa de UEC cultivada,

- la Figura 2B, una micrografía confocal de espermatozoides porcinos después del tratamiento previo con WGA, después de 10 min de incubación conjunta con una monocapa de UEC cultivada, y

- la Figura 3A, una micrografía confocal de espermatozoides porcinos sin tratar, después de 10 min de incubación conjunta con fibroblastos fetales porcinos cultivados (fib. fet. porc.),

- en la Figura 3B, una micrografía confocal de espermatozoides porcinos sin tratar, después de 10 min de incubación conjunta con células endoteliales de la aorta porcina (pAEC),

- en la Figura 4A, una micrografía confocal de UEC después del tratamiento previo con sWGA, después de 10 min de incubación conjunta con espermatozoides porcinos, y

- la Figura 4B, una micrografía confocal de UEC después del tratamiento previo con WGA, después de 10 min de incubación conjunta con espermatozoides porcinos.

Ejemplo 1: Mejorar la fertilidad mediante el bloqueo de los sitios de unión de los espermatozoides

De acuerdo con la primera variante, se identificaron y bloquearon los sitios de unión de los espermatozoides que participan en la unión a las células epiteliales uterinas (UEC), luego los espermatozoides se incubaron conjuntamente con las UEC cultivadas, lo que mostró una unión reducida de los espermatozoides a las UEC.

Las UEC confluentes se cultivaron sobre cubreobjetos de vidrio a partir de los cultivos celulares primarios. En total, se recuperaron los úteros de 78 cerdas primíparas Landrace alemana o Edelschwein alemana de entre 8-10 meses de edad y con pesos vivos superiores a 110 kg, para recolectar las células primarias. Todos los animales se mantuvieron y manipularon de acuerdo con las normas alemanas sobre bienestar animal. Se monitoreó el estro natural de las cerdas primerizas y se sacrificaron de acuerdo con el reflejo de inmovilidad, es decir, en el momento en que se habría realizado la inseminación artificial. Las cerdas primerizas se inmovilizaron con electricidad y, subsecuentemente, se sacrificaron mediante desangrado. Tres minutos después del sangrado, se abrió el abdomen y se retiró el úteroin toto.Además, se retiraron los ovarios, los oviductos y el mesometrio, al cortarlos con tijeras esterilizadas, sin dañar el miometrio. Los cuernos uterinos fueron ligados con hilo de sutura y se cortó una sección de 20-25 cm. Las secciones se colocaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril sin Ca++ ni Mg++ (Karl Roth, Karlsruhe, Alemania) que contenía penicilina/estreptomicina al 2 % (P/S; PAA, Pasching, Austria) en una botella de vidrio y se mantuvieron a 5 °C durante 45 min. Después de 45 min a 5 °C, las secciones uterinas se retiraron de la botella y se colocaron sobre un pañuelo de celulosa bajo un sistema de flujo laminar estéril. Se retiró el material de sutura. Cada cuerno se fijó con pinzas hemostáticas estériles, que aseguraban los extremos abiertos y luego se enjuagó el lumen tres veces con 10 ml de PBS estéril, que contenía P/S al 2 %, mediante el uso de una pipeta serológica estéril de 10 ml. Luego se cerró un extremo con una pinza y se insertaron 10 ml de ácido etilendiaminotetraacético y tripsina (EDTA/Try; 10 % (PAA, Pasching, Austria) en PBS sin Ca++/Mg++), mediante una pipeta serológica estéril de 10 ml, en el cuerno y el extremo restante se cerró igualmente con una pinza. El movimiento sutil del cuerno aseguró una distribución equitativa en toda el lumen. La incubación se llevó a cabo en 20 ml de PBS simple fresco que contenía P/S al 2 % a 37 °C durante 15 min. Después de la digestión enzimática, se añadieron 10 ml de PBS, el cuerno se movió sutilmente y el líquido se recogió en un tubo de centrífuga de 50 ml que contenía 5 ml de medio de cultivo celular tibio (D20, 77 % de DMEM, 20 % de FBS, 1 % de piruvato de Na, 1 % de aminoácidos, 1 % de P/S). La suspensión celular fue centrifugada durante 4 min a 209 x g y a TA. Este procedimiento se realizó tres veces por cuerno con una diferencia en el tiempo de digestión a menudo en lugar de 15 min para la segunda y tercera repetición. Después de la centrifugación, el sobrenadante se eliminó mediante aspiración y el sedimento celular se resuspendió suavemente en 500 pl de medio D20 tibio a 37 °C. Las células de ambos cuernos se agruparon y diseminaron sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con colágeno en una placa de cultivo de 6 pocillos y se cultivaron en una incubadora con una saturación de 5 % de CO2 a 37 °C con atmósfera humidificada. Se recubrieron finamente cubreobjetos de vidrio (22 mm de diámetro, Karl Roth, Karlsruhe, Alemania) con colágeno tipo I de cola de rata (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg, Alemania) diluido a 50 pg/ml en ácido acético 0,02 M en PBS estéril (sin Ca++ ni Mg++). Se colocó un cubreobjetos en cada pocillo de la placa de seis pocillos y se añadieron cuidadosamente con una pipeta 600 pl de la solución de colágeno en cada cubreobjetos para formar un menisco convexo y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante una hora. Luego se eliminó el líquido restante mediante aspiración y las matrices fueron usadas para la diseminación de las células. Las células epiteliales uterinas se recolectaron, diseminaron y cultivaron en medio de cultivo celular (D20) que contenía medio Eagle modificado de Dulbecco completo DMEM (que contenía 2 mmol de L-glutamina (Applichem, Darmstadt, Alemania) y 0,1 mmol de p-mercaptoetanol (Sigma Aldrich, Darmstadt, Alemania) complementado con 20 % de suero fetal bovino inactivado por calor, 1 % de aminoácidos no esenciales en medio de Eagle modificado (MEM), 1 % de P/S (todos PAA, Pasching, Austria) y 1 % de piruvato de sodio (Sigma Aldrich, Darmstadt, Alemania). Para la diseminación de las células se añadieron 15 pg/ml de factor de crecimiento de células endoteliales (ECGF, ReliaTech, Wolfsburg, Alemania). Después de dos días, se añadieron a las células 2 ml de medio D20 fresco (que no contenía ECGF) sin retirar el medio antiguo. Esto aseguró la adhesión completa de las células y que no se reemplazado con 2 ml por pocillo de medio resco cada tres días.

Para la identificación de las células epiteliales, se eliminó el medio de cultivo celular de las UEC confluentes y las células se lavaron con PBS simple y se fijaron con 1 ml de metanol helado (MeOH; 80 %; Karl Roth, Karlsruhe, Alemania) por pocillo durante 10 min. Se eliminó el metanol y se añadió 1 ml de solución de bloqueo (suero de burro al 2 % en PBS simple) por pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Las células se lavaron subsecuentemente dos veces durante 5 min con PBS simple. Se realizó una tinción con anticuerpos de inmunofluorescencia mediante el uso de un anticuerpo monoclonal de rata específico de células epiteliales (Troma III-s; anti-citoqueratina-19 de rata; Banco de Hibridomas de Estudio de Desarrollo, Iowa, Estados Unidos) como anticuerpo primario, específico para la citoqueratina-19 (KRT-19), la cual es una proteína de filamento intermedio responsable de la integridad estructural de las células epiteliales. El anticuerpo primario fue aplicado en diluciones de 1:100, 1:200 y 1:500 en PBS y Triton (10 x; Merck, Darmstadt, Alemania) a las células fijadas y se incubó durante 24 h en una cámara húmeda a 5 °C. El anticuerpo no unido fue eliminado al lavar las células tres veces con 1 ml de PBS simple por pocillo. Como anticuerpo secundario, se aplicó IgG anti ratón de cabra (H+L), conjugado AlexaFluor® 555, MoBiTec, Gottingen, Alemania) a una dilución 1:2000 y se incubó durante 60 min a 37 °C. El anticuerpo secundario fue eliminado al lavar las células dos veces con 1 ml de PBS simple por pocillo y, para el tercer enjuague, se aplicó 1 ml de triclorhidrato de bisbencimida H 33342 (HOECHST-33342; 0,1 mg/ml en H2O; Sigma Aldrich, Steinheim) y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente. Subsecuentemente, las células fueron fijadas una vez más con MeOH helado (80 %). Para la detección con un microscopio de fluorescencia (Olympus BX 60, Olympus, Hamburgo, Alemania) equipado con una cámara digital de alta resolución (Olympus DP 71, Olympus, Hamburgo, Alemania), se retiraron los cubreobjetos de los pocillos y se colocaron boca abajo en portaobjetos sobre medio de montaje (VectaShield®, Vector Laboratories, California, Estados Unidos) y se fijaron con esmalte de uñas transparente a lo largo del borde exterior. Para la detección se usó luz ultravioleta y un filtro de rodamina (555-565 nm), así como también el campo claro. Este análisis confirmó que las células cultivadas eran UEC.

Se usaron UEC confluentes cultivadas sobre cubreobjetos de vidrio, como se ha descrito anteriormente. Para las comparaciones, se usaron células endoteliales de la aorta porcina (PAEC) confluentes, así como también fibroblastos fetales porcinos (fib. fet.). La especificidad de unión de los espermatozoides porcinos al endometrio porcino fue confirmada mediante la unión reducida a las células de comparación. Los fibroblastos se usaron como un tipo de célula entre especies, pero que no es de superficie, para demostrar si los espermatozoides se unen a cualquier tipo de célula o tejido con la misma intensidad que a las UEC porcinas. Los endotelios de la aorta porcina representan una célula del lumen de un órgano no reproductor. Estos tipos de células se aíslan como se describe en el documento de Boquest y otros, Biol. Reprod 60, 1013-1019 (1999).

Los espermatozoides fueron recolectaros a partir de cuatro verracos verificablemente fértiles (Landrace alemán y Edelschwein alemán). Para garantizar una calidad constante del semen, fue recolectado el semen de los verracos de servicio dos veces por semana regularmente, con intervalos de dos a tres días. La fracción enriquecida en espermatozoides fue recolectada mediante el método de la mano enguantada y cuidadosamente extendida con las mismas partes con medio D20 tibio. La concentración de espermatozoides fue medida mediante el uso de un NukleoCounter® NC-100™ (ChemoMetec A/S, Aller0d, Dinamarca), y la muestra fue examinada para determinar su motilidad, la integridad de la membrana y los cambios morfológicos.

La concentración de espermatozoides se determinó mediante el uso de un NukleoCounter® NC-100™ (ChemoMetec A/S, Aller0d, Dinamarca) y la integridad de la membrana fue medida mediante citometría de flujo usando FACScan® con tinción de yoduro de propidio. La motilidad fue determinada mediante el uso de un sistema de análisis de espermatozoides IVOS (Hamilton Thome Biosciences, Beverly, Ma, Estados Unidos). Se descartaron las eyaculaciones con < 70 % de espermatozoides móviles. Luego se extendió el semen a una concentración de 100 x 106 espermatozoides/ml y se lavó dos veces mediante centrifugación (10 min, 800 x g, TA) para eliminar el plasma seminal. Fu descartado el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en medio D20.

Para identificar posibles efectos del plasma seminal, las UEC también se incubaron con espermatozoides del epidídimo de cuatro verracos fértiles conocidos (Edelschwein alemán). Para obtener los espermatozoides del epidídimo, los testículos fueron extirpados mediante castración y los túbulos seminíferos fueron disecados de los testículos y los epidídimos caudales fueron lavados con un medio D20 tibio y los espermatozoides del epidídimo fueron extendidos a 100 x 106 /ml, respectivamente. Por lo tanto, podría excluirse que los componentes del plasma seminal, ya adheridos a la superficie del espermatozoide, influyan en la unión a las UEC. El semen fue diluido a 100 x 106 /ml en medio D20 e incubado con una de las siguientes lectinas: WGA, sWGA o ConA mediante la incubación con una dilución de 1 pl de la lectina en 200 pl de PBS (sin Ca++ ni Mg++) para obtener una concentración de 10 |jg/ml. Se añadieron quince microlitros de esta dilución de lectina a 100 pl de espermatozoides y se incubaron durante 15 min a 37 °C en una incubadora. La lectina no unida se eliminó al lavar (4 min, 800 x g, TA) y resuspender el sedimento en D20.

Como control de la unión, se marcaron espermatozoides porcinos eyaculados con las lectinas WGA, sWGA, ConA o RCA120 marcadas con FITC, mediante el uso de tubos de citómetro de flujo (Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania) preparados con 480 pl de PBS (sin Ca++ ni Mg++) y 3 pl de PI cada uno. Después de completar la incubación, se añadieron 20 pl de solución de espermatozoides-lectina y se incubaron durante diez minutos adicionales a TA. Como control, se trató una alícuota de la suspensión de espermatozoides de forma idéntica sin una lectina. Fue observada una fuerte unión en el análisis de FACS, como se indica más abajo, en donde se enumera el ligando de glicano, por el cual la lectina tiene una afinidad predominante:

Estos resultados muestran que estas lectinas tienen una fuerte unión a los espermatozoides, lo que indica la presencia de N-acetilglucosamina, ácido siálico, manosa y glucosa, y de p-D-Gal-D-galactosamina en los espermatozoides porcinos eyaculados.

El semen, que se incubó previamente con una de las lectinas, se añadió a las UEC confluentes y se analizó mediante microscopía confocal.

Para la incubación conjunta con las UEC, se liberaron 500 pl de espermatozoides, incubados previamente con lectina, en una monocapa de UEC y se observó la actividad de unión bajo un microscopio de contraste de fases (Olympus BX 60, Olympus, Hamburgo, Alemania) equipado con una cámara digital de alta resolución. (Olympus DL 70, Olympus, Hamburgo, Alemania). La densidad de unión fue cuantificada por el área bajo observación y se comparó con los resultados de la incubación de control con espermatozoides sin tratar. Las imágenes (2 repeticiones/verraco y lectina) fueron divididas en campos de 61,6 pm2 y fueron contados los campos con y sin espermatozoides.

La Figura 1 muestra la imagen microscópica de los espermatozoides de control (sin tratar, en medio D20) incubados con las UEC, que muestra una fuerte unión de los espermatozoides a las UEC. Los resultados son mostrados en la Figura 2A para los espermatozoides después de la incubación previa con ConA, en la Figura 2B después de la incubación previa con WGA. Para el control, los espermatozoides se trataron en paralelo, pero sin la lectina. El análisis de la unión de los espermatozoides a la capa de células cultivadas se realizó mediante un método manual de área bajo observación, en donde las imágenes fueron tomadas con un aumento de 200x y se clasificaron en cuadrados de 61,6 pm2 de tamaño. Se cuantificó el área recubierta con y sin espermatozoides. Se tomaron y evaluaron cinco imágenes por verraco. La misma persona realizó la evaluación del área en todos los experimentos. Los espermatozoides de control se unieron a 18050,25 ± 5520,06 pm2, los espermatozoides tratados previamente con WGA se unieron a 2362,87 ± 248,61 pm2 y los espermatozoides tratados previamente con sWGA se unieron a 1684,83 ± 107,94 pm2, mostrando una reducción significativa en la unión a las UEC mediante el tratamiento previo con WGA y sWGA. Los espermatozoides tratados previamente con ConA (afín a la manosa/glucosa) se unieron a 12 718,39 ± 1999,52 pm2, lo que muestra una reducción significativa en la unión, aunque reducida en menor medida que mediante la incubación previa con WGA o sWGA.

La unión de los espermatozoides sin tratar fue repetida mediante el uso de espermatozoides del epidídimo en lugar de espermatozoides eyaculados (control). Se encontró que la intensidad de unión era equivalente.

Para el análisis de la unión de los espermatozoides a otras células distintas de las UEC, fue eliminado el medio de cultivo celular de las monocapas confluentes de UEC, fibroblastos fetales porcinos o células endoteliales de la aorta porcina, cada una de las cuales crecía sobre cubreobjetos recubiertos de colágeno, y se aplicaron a cada pocillo 500 pl de suspensión de espermatozoides (100 x 106 /ml), ya fueran espermatozoides eyaculados o del epidídimo caudal. La incubación conjunta se llevó a cabo por hasta 60 min en una incubadora (37 °C, 8 % de CO2), preferiblemente a los diez minutos de incubación, ya que se identificó que este período era suficiente. Subsecuentemente, los espermatozoides restantes fueron eliminado cuidadosamente mediante aspiración y la monocapa fue lavada suavemente con medio de cultivo celular D20 tibio. El cubreobjetos se montó en un portaobjetos con las células y los espermatozoides hacia arriba y se añadió con una pipeta una gotita de 200 pl de D20 sobre el cubreobjetos para proteger las células de la desecación. La unión de los espermatozoides fue observada bajo un microscopio de contraste de fases (Olympus GX 60, Olympus, Hamburgo, Alemania) conectado a una cámara digital de alta resolución (Olympus DP71, Olympus, Hamburgo, Alemania). La documentación de la imagen y el vídeo fue realizada con el software CellP® (Versión 1.0, Olympus, Hamburgo, Alemania). El resultado es representado en la Figura 3A para los fibroblastos fetales porcinos (fib. fet. porc.), en la Figura 3B (las cabezas de los espermatozoides teñidas con Hoechst-33342) para las células endoteliales de la aorta porcina (pAEC). El análisis de la intensidad de unión mostró una intensidad de unión significativamente menor (p=0,002) de los espermatozoides sin tratar a los fibroblastos (3018,4 ± 638,1 pm2) en comparación con las UEC (15923,6 ± 2657,9 pm2), y una intensidad de unión significativamente menor a las pAEC (2797,8 ± 593,4 pm2). Esto muestra que la unión de los espermatozoides a las UEC es específica del tipo de célula.

Estos resultados muestran que el bloqueo de los sitios de unión en el espermatozoide, mediante un agente aglutinante que tiene afinidad por la N-acetilglucosamina y/o afinidad por el ácido siálico, como se ilustra con la lectina WGA y/o por la manosa/glucosa, como se ilustra con la lectina ConA, reduce la unión de los espermatozoides al endometrio y, por tanto, aumenta el número de espermatozoides disponibles para la fertilización, por ejemplo, en el oviducto o la ampolla.

Ejemplo 2: Mejorar la fertilidad mediante el bloqueo de los sitios de unión de los espermatozoides en las UEC

Las UEC confluentes fueron lavados dos veces con 1 ml de PBS (sin Ca++ ni Mg++) y 45 pl de suspensión de lectinas (10 pg/ml) de una de las cuatro lectinas seleccionadas (WGA, sWGA, PNA, ConA) y se incubaron durante se lavaron suavemente con 1 ml de PB sin a++ ni Mg++ y se liberaron 500 j l de espermatozoides 100 x 106 espermatozoides/ml) sobre la monocapa de UEC y se incubaron durante 10 min. La actividad de unión fue observada bajo un microscopio de contraste de fases (Olympus, BX 60, Olympus, Hamburgo, Alemania) equipado con una cámara digital de alta resolución (Olympus DL 70, Olympus, Hamburgo, Alemania) y se estimó la densidad. La Figura 4A muestra una micrografía de las UEC, incubadas previamente con sWGA, después de la incubación con espermatozoides porcinos diluidos en medio D20, la Figura 4B muestra una micrografía de las UEC, incubadas previamente con WGA, después de la incubación con espermatozoides porcinos diluidos en medio D20. La densidad de unión de los espermatozoides fue significativamente menor (p < 0,05) en las UEC incubadas previamente con WGA (afinidad por Glc-NAc/ácido siálico; 5961 ± 309,18 jm 2) en comparación con las células UEC de control sin tratar (17426,81,4 ± 4653,58 jm 2). Además, el tratamiento con sWGA (que tiene afinidad por la Glc-NAc) y ConA (que tiene afinidad por la manosa/glucosa) no afectó significativamente la unión de los espermatozoides.

Este resultado muestra que el bloqueo del ácido siálico en las UEC, por ejemplo, mediante un agente que tenga afinidad por el ácido siálico, o la eliminación del ligando del ácido siálico de las UEC, reduce la unión de los espermatozoides al endometrio y, por tanto, aumenta el número de espermatozoides disponibles para la fertilización, por ejemplo, en el oviducto o la ampolla.

Después de la incubación previa de las UEC con PNA (afinidad por la p-D-(1-3)-D-galactosamina), algunas áreas mostraron una unión masiva de espermatozoides, como se observa con las UEC sin tratar, mientras que otras no se poblaron en absoluto, similar a las UEC tratadas con WGA.

Ejemplo 3: Mejorar la fertilidad mediante el bloqueo o eliminación de los sitios de unión.

Para la fertilización artificial se usaron cerdas. Generalmente, las cerdas fueron inseminadas durante el reflejo de inmovilidad y nuevamente 12 h después, cada vez mediante el uso de 50 x 106, 100 x106, 500 x 106 o 1000 x 106 espermatozoides recién diluidos para la inseminación. Para las comparaciones, se inseminó a un grupo de cerdas de comparación con espermatozoides frescos en una dosis de 3 billones de espermatozoides en un diluyente estándar disponible comercialmente.

Cada grupo estaba compuesto por 4-6 animales. La administración de todas las composiciones se realizó mediante la inseminación artificial estándar para su depósito en la parte distal del cuerpo uterino.

A un primer grupo de cerdas les fue administrada la dosis de espermatozoides en una composición de 10 jg/ml de WGA en el diluyente estándar,

a un segundo grupo de cerdas se le administró la dosis de espermatozoides en una composición de 1 U/ml de sialidasa obtenida de Vibrio cholerae) en el diluyente estándar,

a un tercer grupo de cerdas se le administró una composición de 100 ml de diluyente estándar que contenía 10 jg/ml de WGA, seguido después de 2 a 20 min por la administración de la dosis de espermatozoides en el diluyente estándar, y

a un cuarto grupo de cerdas se le administró una composición de 100 ml de diluyente estándar que contenía 1 U/ml de sialidasa obtenida de Vibrio cholerae), seguido, después de 2 a 20 min, por la administración de la dosis de espermatozoides en el diluyente estándar.

Además, los espermatozoides del mismo verraco se clasificaron en una fracción que contenía al menos un 90 % de espermatozoides portadores del cromosoma X, mediante el uso de FACS, generalmente la patente US 5135759 A. Los espermatozoides con cromosomas sexuales específicos se usaron sin congelar.

en un quinto grupo de cerdas de control que contenían la dosis de espermatozoides solo en el diluyente estándar,

en un sexto grupo de cerdas que contenían la dosis de espermatozoides en una composición de WGA en el diluyente estándar,

un séptimo grupo de cerdas que contenían la dosis de espermatozoides en una composición de 1 U/ml de sialidasa (obtenida de Vibrio cholerae) en el diluyente estándar,

un octavo grupo de cerdas en una composición de 100 ml de diluyente estándar que contenía 10 jg/ml de WGA, seguido, después de 2 a 20 min, por la administración de la dosis de espermatozoides en el diluyente estándar, y a un noveno grupo de cerdas se le administró una composición de 100 ml de diluyente estándar que contenía 1 U/ml de sialidasa (obtenida de Vibrio cholerae), seguido, después de 2 a 20 min, por la administración de la dosis de espermatozoides en el diluyente estándar.

Después de 36 días, la fertilización se monitoreó mediante diagnosis de ultrasonido.

En los grupos segundo a cuarto, la fertilización aumentó significativamente en comparación con el primer grupo de control.

En los grupos sexto a noveno, la fertilización aumentó significativamente en comparación con el quinto grupo de control, lo que también muestra un fuerte sesgo hacia la descendencia femenina.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Uso de una composición para mejorar la fertilidad de una dosis de espermatozoides de verraco para la inseminación artificial,caracterizado porquela composición comprende al menos un agente aglutinante, el cual es una lectina, cuyo agente aglutinante no se modifica químicamente, que tiene afinidad por la N-acetilglucosamina y/o o afinidad por el ácido siálico, o que comprende sialidasa que no se modifica químicamente para hidrolizar el ácido siálico.

2. Uso, de acuerdo con la reivindicación 1,caracterizado porquela composición contiene espermatozoides de verraco en una dosis que es menor en un factor de al menos 5 en comparación con la dosis para el uso en la inseminación artificial convencional, cuya dosis, para el uso en la inseminación artificial convencional de espermatozoides de verraco frescos, es una dosis de 1 a 3 x 109 espermatozoides, y cuya dosis, para el uso en la inseminación artificial convencional de espermatozoides de verraco congelados, es una dosis de 5 x 109 espermatozoides.

3. Proceso para proporcionar espermatozoides de verraco para el uso en la inseminación artificial, caracterizado porquelos espermatozoides se ponen en contacto con al menos un agente aglutinante, el cual es una lectina, y cuyo agente aglutinante no se modifica químicamente, que tiene afinidad por la N-acetilglucosamina y/o afinidad por el ácido siálico, o se pone en contacto con sialidasa la cual no se modifica químicamente para hidrolizar el ácido siálico antes de la inseminación artificial.

4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 3,caracterizado porquelos espermatozoides de verraco se separan del al menos un agente aglutinante o de la sialidasa antes de la inseminación artificial.

5. Dosis de espermatozoides para la inseminación artificial, que contiene espermatozoides porcinos,caracterizada porcomprender al menos un agente aglutinante, el cual es una lectina, cuyo agente aglutinante no se modifica químicamente, que tiene afinidad por la N-acetilglucosamina y/o afinidad por el ácido siálico, o que contiene sialidasa que no se modifica químicamente para hidrolizar el ácido siálico.

6. Dosis de espermatozoides para la inseminación artificial de acuerdo con la reivindicación 5,caracterizada porquelos espermatozoides porcinos son espermatozoides clasificados específicamente por cromosomas sexuales.

7. Dosis de espermatozoides porcinos para la inseminación artificial de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 6,caracterizada porquelos espermatozoides están contenidos en una dosis que es menor en un factor de al menos 5, preferiblemente al menos 10 o al menos 100, en comparación con la dosis para el uso en la inseminación artificial convencional, cuya dosis, para el uso en la inseminación artificial convencional de espermatozoides de verraco frescos es una dosis de 1 a 3 x 109 espermatozoides, y cuya dosis, para el uso en la inseminación artificial convencional de espermatozoides de verraco congelados es una dosis de 5 x 109 espermatozoides.